CN109879922A - 含有光敏单元的核酸、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种含有光敏单元的核酸、其制备方法及其应用，属于化学合成技术领域，能够解决现有光响应核酸端基巯基化试剂合成时操作繁琐、反应不温和且效率差的技术问题。该技术方案提供的含有光敏单元的核酸如式(I)所示：其中，n值的范围为1‑15。本发明能够应用于硫醇类端基修饰试剂的制备中。
Description
技术领域
本发明属于化学合成技术领域，尤其涉及一种含有光敏单元的核酸、其制备方法及其应用。
背景技术
巯基修饰的核酸(DNA、RNA及其他各种人工核酸)在生物探针制备、生物材料设计、化学生物学以及分子生物学中均具有重要的意义。随着核酸合成技术的成熟及核酸自动合成仪的商业化，人们开发出了多种可用于核酸端基修饰的巯基化试剂，实现了端基含硫核酸的规模化制备。
由于固相合成中巯基不能裸露，因此人们需要对巯基进行保护，目前硫醇修饰的端基化试剂多采用三苯甲基(Trit)或4,4-二甲氧基三苯甲基(DMT) 保护巯基，该类试剂在使用过程中需要使用三氟乙酸或者三氯乙酸等强有机酸脱除保护基。然而，三氟乙酸和三氯乙酸均具有较强的酸性和腐蚀性，极易切除核酸中嘌呤和糖苷之间的化学键，造成核酸序列的脱嘌呤现象，增加了核酸纯化难度和纯化成本。为避免使用强腐蚀性试剂，简化操作流程，降低操作成本，本领域技术人员希望开发含有可以温和脱除保护基的核酸修饰单元，来弥补现有硫醇类端基修饰试剂的缺陷。
发明内容
本发明提出一种含有光敏单元的核酸、其制备方法及其应用,解决了现有光响应核酸端基巯基化试剂合成时操作繁琐、反应不温和且效率差的技术问题。
为了达到上述目的，本发明提供了一种含有光敏单元的核酸，其特征在于，具有如式(I)所示的结构式：
其中，n值的范围为1-15。
本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的含有光敏单元的核酸的制备方法，包括以下步骤：
制备含硫亚磷酰亚胺酯：以n-巯基-1-烷基醇为起始原料，将其与4,5- 二甲氧基-2-硝基苯基-乙基氯在有机碱的作用下反应生成n-(4,5-二甲氧基 -2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇，随后将其与2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺在有机碱的作用下反应生成n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)- 乙基硫醚-1-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺烷基醇酯)，得到含硫亚磷酰亚胺酯；
制备含有光敏单元的核酸：取所述含硫亚磷酰亚胺酯溶于无水乙腈作为端基修饰位试剂与核酸合成，将得到的合成中间产物分散于甲氨水溶液中， 55-75℃下密闭加热后，离心除去不溶物，将溶液浓缩处理，得到含有光敏单元的核酸。
作为优选，制备含硫亚磷酰亚胺酯步骤中，4,5-二甲氧基-2-硝基苯基- 乙基氯的制备步骤如下：
将六水合三氯化铁分散于乙醇中，冰浴搅拌下一次性加入粉末状活性炭，升至室温下充分搅拌，随后加入35％水合肼和4,5-二甲氧基-2-硝基苯乙酮，将反应液于室温下充分搅拌后滴加1M盐酸溶液，滤除不溶物后将滤液浓缩并重新溶于乙酸乙酯中，加入饱和食盐水洗涤，分出有机相、无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发有机相，得到(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙醇；
将所得(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙醇溶于氯仿中，冰浴搅拌下滴加二氯亚砜，室温下充分搅拌后加热回流，旋蒸除去溶剂，得到4,5-二甲氧基 -2-硝基苯基-乙基氯的油状液体。
作为优选，加入的六水合三氯化铁、活性炭和4,5-二甲氧基-2-硝基苯乙酮的质量比为1:20:80，溶于乙醇中的六水合三氯化铁的浓度为0.25mg/mL, 加入的乙醇和35％水合肼的体积比为20:1。
作为优选，制备含硫亚磷酰亚胺酯步骤中，以n-巯基-1-烷基醇为起始原料，将其与4,5-二甲氧基-2-硝基苯基-乙基氯在有机碱的作用下反应生成 n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇的具体步骤如下：
将n-巯基-1-烷基醇和三丁胺溶于氯仿中，冰浴搅拌下滴加(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基氯体系中，充分搅拌下，加入饱和碳酸氢钠水溶液，充分搅拌，分离出有机相，再向其中加入饱和氯化铵水溶液，继续搅拌，分出有机相后无水硫酸钠干燥，得到粗产品，然后将粗产品经硅藻土过滤，得到n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇。
作为优选，加入的n-巯基-1-烷基醇、三丁胺和(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基氯的质量比为3:5:5。
作为优选，制备含硫亚磷酰亚胺酯步骤中，将n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇与2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺在有机碱的作用下反应生成n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-(2-O- 氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺烷基醇酯)的具体步骤如下：
将n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇和无水三乙胺溶于无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺，反应于冰浴下搅拌1小时后于室温下再继续搅拌2小时，滤除不溶物，滤液用饱和碳酸钠溶液洗涤，将有机相用无水硫酸钠干燥后，得到n-(4,5- 二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺烷基醇酯)。
作为优选，加入的n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇、无水三乙胺和2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺的质量比为5:3:4。
本发明还提供了一种利用如上技术方案所述的含有光敏单元的核酸在修饰核酸端基中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、本发明采用含硫亚磷酰亚胺酯制备含有光敏单元的核酸，实验表明其在制备时具有很高的反应活性、良好的底物适应性、足够的化学稳定性以及良好的光响应性，为核酸的官能化提供一种更加简洁高效的选择，简化了制备含有光敏单元的核酸的方法，降低了其制备成本，扩大了制备光敏单元的核酸的市场应用。同时修饰巯基后的核酸序列可在紫外光照射下以很高的效率脱除保护基，释放出高活性的巯基，为核酸端基修饰提供了新的选择。
2、本发明提供的含有光敏单元的核酸的制备方法简单易操作，在极大降低了合成成本的同时保留了光可降解的高效性，通过简单的醚化和酯化等标准的有机单元反应即可制备得到目标产物。该方法路线简明，操作便捷，中间体及产物的纯化方式简单，可以实现高效大量制备目标产物，为核酸的5’端巯基修饰提供了一种成本可控，简单高效的亚磷酰亚胺酯试剂合成方法。
附图说明
图1为本发明实施例提供的含硫亚磷酰亚胺酯的核磁共振氢谱图；
图2为本发明实施例提供的含硫亚磷酰亚胺酯的核磁共振碳谱图；
图3为本发明实施例提供的含硫亚磷酰亚胺酯的质谱图；
图4为本发明实施例提供的含有光敏单元的核酸的核磁共振氢谱图；
图5为本发明实施例提供的含有光敏单元的核酸的核磁共振碳谱图；
图6为本发明实施例提供的含有光敏单元的核酸的质谱图；
图7为本发明含有光敏单元的核酸光照前后以及对照核酸的不同核酸序列的HPLC谱图；
图8为本发明含有光敏单元的核酸光照前的质谱图；
图9为本发明含有光敏单元的核酸光照后的质谱图；
图10为本发明不含有光敏单元的对照核酸的质谱图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种根据上述实施例所述的含有光敏单元的核酸的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备含硫亚磷酰亚胺酯：以n-巯基-1-烷基醇为起始原料，将其与 4,5-二甲氧基-2-硝基苯基-乙基氯在有机碱的作用下反应生成n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇，随后将其与2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺在有机碱的作用下反应生成n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)- 乙基硫醚-1-(2-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺烷基醇酯)，得到含硫亚磷酰亚胺酯；
本步骤中，所得含硫亚磷酰亚胺酯具有如式(Ⅱ)所示的结构式：
其中，n值的范围为1-15。
S2：制备含有光敏单元的核酸：取所述含硫亚磷酰亚胺酯溶于无水乙腈作为端基修饰位试剂与核酸合成，将得到的合成中间产物分散于甲氨水溶液中，55-75℃下密闭加热后，离心除去不溶物，将溶液浓缩处理，得到含有光敏单元的核酸。
本步骤中，所得含有光敏单元的核酸，具有如式(I)所示的结构式：
其中，n值的范围为1-15。
上述实施例在制备含有光敏单元的核酸时，以n-巯基-1-烷基醇为起始原料，通过简单的醚化和酯化等标准的有机单元反应即可制备n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺烷基醇酯)，反应操作不涉及强酸和强氧化剂的使用，最终产物具有良好的化学稳定性，可直接用于核酸自动合成仪上，简化了制备含有光敏单元的核酸的方法，降低了其制备成本，并且修饰巯基后的核酸序列可在紫外光照射下以很高的效率脱除保护基，释放出高活性的巯基，为核酸端基修饰提供了新的选择。需要说明的是，n的取值范围为1-15范围内的正整数，例如2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14等。
在一优选实施例中，制备含硫亚磷酰亚胺酯的步骤中，4,5-二甲氧基-2- 硝基苯基-乙基氯的制备步骤如下：
将六水合三氯化铁分散于乙醇中，冰浴搅拌下一次性加入粉末状活性炭，升至室温下充分搅拌，随后加入35％水合肼和4,5-二甲氧基-2-硝基苯乙酮，将反应液于室温下充分搅拌后滴加1M盐酸溶液，滤除不溶物后将滤液浓缩并重新溶于乙酸乙酯中，加入饱和食盐水洗涤，分出有机相、无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发有机相，得到(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙醇；
将所得(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙醇溶于氯仿中，冰浴搅拌下滴加二氯亚砜，室温下充分搅拌后于70℃加热回流，旋蒸除去溶剂，得到4,5- 二甲氧基-2-硝基苯基-乙基氯的油状液体。
上述实施例中以4,5-二甲氧基-2-硝基苯乙酮为原料，经由两步反应得到4,5-二甲氧基-2-硝基苯基-乙基氯，从而对后续操作中的n-巯基-1-烷基醇进行醚化保护，上述反应中选择在冰浴条件下分别加入粉末状活性炭来增强三氯化铁催化水合肼的还原能力，同时避免生成泥装铁盐沉淀，简化后续操作步骤；低温下加入二氯亚砜可使得羟基高效转化为相应氯化物，同时避免复杂的后处理和纯化过程。需要说明的是，本实施例得到的4,5-二甲氧基 -2-硝基苯基-乙基氯可不经纯化直接用于下一步反应中。
在一优选实施例中，加入的六水合三氯化铁、活性炭和4,5-二甲氧基 -2-硝基苯乙酮的质量比为1:20:80，溶于乙醇中的六水合三氯化铁的浓度为 0.25mg/mL,加入的乙醇和35％水合肼的体积比为20:1。本实施例中对上述反应中的具体参数条件进行了限定，目的在于通过参数限定可准确获得所预期制备得到的中间产物。
在一优选实施例中，制备含硫亚磷酰亚胺酯的步骤中，以n-巯基-1-烷基醇为起始原料，将其与4,5-二甲氧基-2-硝基苯基-乙基氯在有机碱的作用下反应生成n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇的具体步骤如下：
将n-巯基-1-烷基醇和三丁胺溶于氯仿中，冰浴搅拌下滴加(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基氯体系中，充分搅拌下，加入饱和碳酸氢钠水溶液，充分搅拌，分离出有机相，再向其中加入饱和氯化铵水溶液，继续搅拌，分出有机相后无水硫酸钠干燥，得到粗产品，然后将粗产品经硅藻土过滤，得到n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇。
上述实施例给出了4,5-二甲氧基-2-硝基苯基-乙基氯在有机碱作用下对n-巯基-1-烷基醇的醚化保护，基于在一优选实施例中，加入的n-巯基-1- 烷基醇、三丁胺和(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基氯的质量比为3:5:5这一参数限定以及冰浴条件下加入中间产物，可避免(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基氯再较高温度下可能导致的分解，有助于简化后续的纯化步骤，降低操作成本。需要说明的是，本实施例中所使用的有机碱优选为三丁胺，当然，如果操作允许，本领域技术人员可对有机碱进行合理替换。
在一优选实施例中，制备含硫亚磷酰亚胺酯的步骤中，将n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇与2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺在有机碱的作用下反应生成n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚 -1-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺烷基醇酯)的具体步骤如下：
将n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇和无水三乙胺溶于无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺，反应于冰浴下搅拌1小时后于室温下再继续搅拌2小时，滤除不溶物，滤液用饱和碳酸钠溶液洗涤，将有机相用无水硫酸钠干燥后，得到n-(4,5- 二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺烷基醇酯)。
上述实施例中列出了利用n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1- 烷基醇在有机碱作用下通过与2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺发生酯化反应，该反应条件温和，基于在一优选实施例中，加入的n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇、无水三乙胺和2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺的质量比为5:3:4这一参数限定以及反应条件限定，可准确得到目标产物。该反应后处理几乎不产生废弃物，可直接用于核酸合成仪，并且可以在低功率紫外光照下实现良好的保护基脱除，具有良好的商业化前景。
反应流程示意如下：
制备n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-(2-O-氰乙基-N,N- 二异丙基亚磷酰胺烷基醇酯)：
制备含有光敏单元：
本发明实施例还提供了一种利用如上实施例所述的含有光敏单元的核酸在修饰核酸端基中的应用。本实施例中的含有光敏单元的核酸基于6-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺烷基醇酯) 制备得到，该端基化试剂表现出较好的化学稳定性和光敏感性，可直接用于核酸在合成仪上的修饰，具有极高的便利性。所制备得到的含有光敏单元的核酸序列可在紫外光照射下以很高的效率脱除保护基，释放出高活性的巯基，为核酸端基修饰提供了新的选择。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的含有光敏单元的核酸、其制备方法及其应用，下面将结合具体实施例进行描述。
实施例1
含硫亚磷酰亚胺酯的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：制备4,5-二甲氧基-2-硝基苯基-乙基氯
50毫克六水合三氯化铁分散于200毫升乙醇中，冰浴搅拌下一次性加入 1.0克粉末状活性炭，升至室温下搅拌2小时。随后加入10毫升35％水合肼和 4.0克4,5-二甲氧基-2-硝基苯乙酮，反应液在室温下搅拌1小时后向其中滴加20毫升1M盐酸溶液，滤除不溶物。滤液浓缩后重新溶于50毫升乙酸乙酯中，加入200毫升饱和食盐水洗涤，分出有机相，无水硫酸钠干燥。旋转蒸发有机相，得到4.0克(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙醇(淡黄色固体)，收率96％；
将4.0克(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙醇溶于50毫升氯仿中，冰浴搅拌下滴加2.4克二氯亚砜，室温下搅拌1小时后加热回流2小时，旋蒸除去溶剂，剩余油状液体不经纯化可直接用于下一步反应。
步骤二：制备n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇
2.4克6-巯基-1-己醇和4.0克三丁胺溶于50毫升氯仿中，冰浴搅拌下滴加4.0克(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基氯于20毫升氯仿中的溶液，搅拌 12小时。向体系中加入300毫升饱和碳酸氢钠水溶液，搅拌1小时。分离出有机相，再向其中加入100毫升饱和氯化铵水溶液，继续搅拌1小时，分出有机相后无水硫酸钠干燥。粗产品经硅藻土过滤(1厘米厚)，滤液浓缩结晶即可得到 3.1克淡黄色粉末状固体，收率50％。
步骤三：制备n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-(2-O-氰乙基 -N,N-二异丙基亚磷酰胺烷基醇酯)
2.5克6-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-己醇和1.5克无水三乙胺溶于50毫升无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加2.1克2-O-氰乙基-N,N- 二异丙基氯代亚磷酰胺。反应于冰浴下搅拌1小时候再于室温下继续搅拌2小时，滤除不溶物，滤液以饱和碳酸钠溶液洗涤。有机相无水硫酸钠干燥。得到 6-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺己醇酯)，2.7克，收率66％。
上述制备的含硫亚磷酰亚胺酯，即上述式(I)化合物的核磁共振氢谱检测结果如图1所示：
1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ＝1.22-1.47(m,CH2,8H),1.53-1.58 (m,CH3,3H),2.18-2.34(m,CH2,2H),3.54-3.58(m,CH2O,2H),3.89 (s,CH3O,1H)，3.95(s,CH3O,2H)，4.82-4.85(m,CH,1H),7.31(s, ArH,1H),7.41(s,ArH,1H).
上述制备的含硫亚磷酰亚胺酯，即上述式(I)化合物的核磁共振碳谱检测结果如图2所示：
13C-NMR(CDCl3,100MHz):δ＝23.23,25.29,28.60,29.24, 31.80,32.60,38.65,52.50,62.90,107.22,110.53,134.56,141.56, 147.57,151.36.
上述制备的含硫亚磷酰亚胺酯，即上述式(I)化合物的质谱检测结果如图3所示：
ESI-MS:C16H25NO5S,calc 343.1453,found 382.1278(M+K+), 383.1366(M+K++H+)。
实施例2
含有光敏单元的核酸的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：取700毫克6-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-(2-O- 氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺己醇酯)溶于10毫升无水乙腈中，氮气保护下转移至ABI 394核酸合成仪的端基修饰位试剂瓶中。输入核酸序列：5’CCT AGA TTC AGT TCA ACT TA 3’，采用DMT保留的合成模式，执行1μmol量级的合成。
步骤二：合成完毕后将固相载体取出，分散在1毫升的5％-32％甲氨水溶液中，55-75℃下密闭加热1-4小时，离心去除不溶物，溶液浓缩即得到粗产物。目标产物通过高效液相色谱分离，并通过MALDI-TOF进行结构信息表征。
上述制备的含有光敏单元的核酸的核磁共振氢谱检测结果如图4所示：
1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ＝1.22-1.47(m,CH2+CH3,14H), 1.53-1.58(m,CH3,3H),2.18-2.34(m,CH2,2H),2.67-2.76(m, CH2CN,2H),3.19-3.52(m,CH2OP,2H),3.54-3.58(m,CH2O,2H), 3.89(s,CH3O,1H)，3.95-4.10(m,CH,2H),3.95(s,CH3O,2H)， 4.82-4.85(m,CH,1H),7.31(s,ArH,1H),7.41(s,ArH,1H).
上述制备的含有光敏单元的核酸的核磁共振碳谱检测结果如图5所示：
13C-NMR(CDCl3,100MHz):δ＝19.37,20.05,22.96,23.21, 25.57,28.66,29.13,30.16,31.66,38.50,45.35,46.29,56.50,58.19, 59.92,60.44,63.61,66.24,107.22,110.49,116.97,134.41,137.41, 141.56,147.59,153.35.
上述制备的含有光敏单元的核酸的质谱检测结果如图6所示：
ESI-MS:C25H42N3O6PS,calc543.2532,found 562.2545 (M+H++NH4 +),566.2207(M+Na+)。
含有光敏单元的核酸的光敏性检测试验：
试验方法：将按照实施例2的方法获取到含有光敏单元的核酸序列溶解在0.01-0.1M、pH 4.8-8.5的磷酸钠缓冲溶液中，配制成1-500μM的浓度，置于离心管中。采用中教金源公司CEL-HXF300型氙灯，加装350-380nm滤光片，光功率密度为20mW/cm2，照射时间2分钟后，分别检测含有光敏单元的核酸光照射前后(其DNA序列依次如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示)，以及以未进行端基修饰的核酸(其序列如SEQ ID No.3所示)的质谱(如图 8-10所示)和HPLC谱图(如图7所示)。
含有光敏单元的核酸光解过程如下：
计算上述三组中分子量，数据结果如表1所示：
表1 分子量数据结果
上述内容中，有机分子的结构和纯度均由核磁共振氢谱(1H-NMR)、碳谱 (13C-NMR)和电喷雾电离(ESI-MS)来确定，脱氧核糖核酸的结构信息及光降解过程由基质辅助激光电离解析-飞行时间质谱(MALDI-TOF)来确定，反应效率由高效液相色谱(HPLC)来确定。
核磁型号为Bruker AMX 400 Spectrometer(400MHz)，所用溶剂为氘代二甲亚砜(CDCl3)，带TMS内标；ESI质谱型号为Agilent 6510 Q-TOF，检测模式为阴离子模式；MALDI-TOF质谱型号为Shimadazu Biotech Axima Performance，检测模式为阴离子模式；高效液相色谱型号为Waters 2695，检测柱型号为XBriage Oligonucleotides BEH C18(2.1mm×50mm；Column 2.5μm)，淋洗条件如表2所示：
表2 淋洗条件
试验结果：
如图7所示，含有光敏单元的核酸光照前、后及对照核酸的HPLC谱图中，其出峰时间依次为20.29分钟、8.87分钟和11.44分钟。
Claims (9)
1.含有光敏单元的核酸，其特征在于，具有如式(I)所示的结构式：
其中，n值的范围为1-15。
2.根据权利要求1所述的含有光敏单元的核酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备含硫亚磷酰亚胺酯：以n-巯基-1-烷基醇为起始原料，将其与4,5-二甲氧基-2-硝基苯基-乙基氯在有机碱的作用下反应生成n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇，随后将其与2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺在有机碱的作用下反应生成n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺烷基醇酯)，得到含硫亚磷酰亚胺酯；
制备含有光敏单元的核酸：取所述含硫亚磷酰亚胺酯溶于无水乙腈作为端基修饰位试剂与核酸合成，将得到的合成中间产物分散于甲氨水溶液中，55-75℃下密闭加热后，离心除去不溶物，将溶液浓缩处理，得到含有光敏单元的核酸。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，制备含硫亚磷酰亚胺酯步骤中，4,5-二甲氧基-2-硝基苯基-乙基氯的制备步骤如下：
将六水合三氯化铁分散于乙醇中，冰浴搅拌下一次性加入粉末状活性炭，升至室温下充分搅拌，随后加入35％水合肼和4,5-二甲氧基-2-硝基苯乙酮，将反应液于室温下充分搅拌后滴加1M盐酸溶液，滤除不溶物后将滤液浓缩并重新溶于乙酸乙酯中，加入饱和食盐水洗涤，分出有机相、无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发有机相，得到(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙醇；
将所得(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙醇溶于氯仿中，冰浴搅拌下滴加二氯亚砜，室温下充分搅拌后加热回流，旋蒸除去溶剂，得到4,5-二甲氧基-2-硝基苯基-乙基氯的油状液体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，加入的六水合三氯化铁、活性炭和4,5-二甲氧基-2-硝基苯乙酮的质量比为1:20:80，溶于乙醇中的六水合三氯化铁的浓度为0.25mg/mL,加入的乙醇和35％水合肼的体积比为20:1。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，制备含硫亚磷酰亚胺酯步骤中，以n-巯基-1-烷基醇为起始原料，将其与4,5-二甲氧基-2-硝基苯基-乙基氯在有机碱的作用下反应生成n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇的具体步骤如下：
将n-巯基-1-烷基醇和三丁胺溶于氯仿中，冰浴搅拌下滴加(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基氯体系中，充分搅拌下，加入饱和碳酸氢钠水溶液，充分搅拌，分离出有机相，再向其中加入饱和氯化铵水溶液，继续搅拌，分出有机相后无水硫酸钠干燥，得到粗产品，然后将粗产品经硅藻土过滤，得到n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，加入的n-巯基-1-烷基醇、三丁胺和(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基氯的质量比为3:5:5。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，制备含硫亚磷酰亚胺酯步骤中，将n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇与2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺在有机碱的作用下反应生成n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺烷基醇酯)的具体步骤如下：
将n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇和无水三乙胺溶于无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺，反应于冰浴下搅拌1小时后于室温下再继续搅拌2小时，滤除不溶物，滤液用饱和碳酸钠溶液洗涤，将有机相用无水硫酸钠干燥后，得到n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺烷基醇酯)。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，加入的n-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)-乙基硫醚-1-烷基醇、无水三乙胺和2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺的质量比为5:3:4。
9.利用根据权利要求1所述的含有光敏单元的核酸在修饰核酸端基中的应用。
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