CN109762041A - 含有光敏单元的核酸、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种含有光敏单元的核酸、其制备方法及其应用，属于化学合成技术领域，能够解决现有近红外光响应核酸端基巯基化试剂合成时操作繁琐、反应不温和且效率差的技术问题。该技术方案提供的含有光敏单元的核酸如式(I)所示：其中，n值的范围为1‑15。本发明能够应用于近红外光响应核酸端基巯基化试剂的制备中。
Description
技术领域
本发明属于化学合成技术领域，尤其涉及一种含有光敏单元的核酸、其制备方法及其应用。
背景技术
巯基修饰的核酸(DNA、RNA及其他各种人工核酸)在生物探针制备、生物材料设计、化学生物学以及分子生物学中均具有重要的意义。随着核酸合成技术的成熟及核酸自动合成仪的商业化，人们开发出了多种可用于核酸端基修饰的巯基化试剂，实现了端基含硫核酸的规模化制备。
由于固相合成中巯基不能裸露，因此人们需要对巯基进行保护，目前硫醇修饰的端基化试剂多采用三苯甲基(Trit)或4,4-二甲氧基三苯甲基(DMT) 保护巯基，该类试剂在使用过程中需要使用三氟乙酸或者三氯乙酸等强有机酸脱除保护基。然而，三氟乙酸和三氯乙酸均具有较强的酸性和腐蚀性，极易切除核酸中嘌呤和糖苷之间的化学键，造成核酸序列的脱嘌呤现象，增加了核酸纯化难度和纯化成本。为避免使用强腐蚀性试剂，简化操作流程，降低操作成本，本领域技术人员希望开发含有可以温和脱除保护基的核酸修饰单元，来弥补现有硫醇类端基修饰试剂的缺陷。
发明内容
本发明提出一种含有光敏单元的核酸、其制备方法及其应用，解决了现有近红外光响应核酸端基巯基化试剂合成时操作繁琐、反应不温和且效率差的技术问题。
为了达到上述目的，本发明提供了一种含有光敏单元的核酸，具有如式 (I)所示的结构式：
其中，n值的范围为1-15。
本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的含有光敏单元的核酸的制备方法，包括以下步骤：
制备含硫亚磷酰亚胺酯：以6-溴-7-羟基-4-氯甲基香豆素为起始原料，将其与碘甲烷在无机碱的作用下生成6-溴-7-甲氧基-4-氯甲基香豆素，然后与n-巯基-1-烷基醇在有机碱的作用下生成n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基醇，最后与2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺在有机碱的作用下制备得到n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基-(2-O-氰乙基 -N,N-二异丙基亚磷酰胺酯)，得到含硫亚磷酰亚胺酯；
制备含有光敏单元的核酸：取所述含硫亚磷酰亚胺酯溶于无水乙腈作为端基修饰位试剂与核酸合成，将得到的合成中间产物分散于甲氨水溶液中， 55-75℃下密闭加热后，离心除去不溶物，将溶液浓缩处理，得到含有光敏单元的核酸。
作为优选，制备含硫亚磷酰亚胺酯步骤中，6-溴-7-甲氧基-4-氯甲基香豆素的制备步骤如下：
将6-溴-7-羟基-4-氯甲基香豆素和无水碳酸钾分散在N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌下滴加碘甲烷，并将反应体系升至80℃搅拌12-14小时，随后将反应液倒入冰水中，室温下搅拌1小时过滤，滤饼以乙醚洗涤，再于热乙醇中重结晶，得到6-溴-7-甲氧基-4-氯甲基香豆素。
作为优选，加入的6-溴-7-羟基-4-氯甲基香豆素、无水碳酸钾和碘甲烷的质量比为1.5：4.4：1，溶于N，N-二甲基甲酰胺中的6-溴-7-羟基-4-氯甲基香豆素和无水碳酸钾的浓度分别为0.07g/mL和0.2g/mL。
作为优选，制备含硫亚磷酰亚胺酯步骤中，n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基醇的制备步骤如下：
将n-巯基-1-烷基醇和三丁胺溶于四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加6-溴-7- 甲氧基-4-氯甲基香豆素于四氢呋喃中的溶液，搅拌12-14小时，反应结束后蒸出溶剂，残余物溶于乙酸乙酯中，然后加入饱和氯化铵水溶液，充分搅拌，分离出有机相，再加入饱和氯化钠水溶液，继续搅拌，分出有机相后无水硫酸钠干燥，粗产品经硅藻土过滤浓缩后，以四氢呋喃：正己烷体积比1：4重结晶,得到n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基醇。
作为优选，加入的n-巯基-1-烷基醇、三丁胺和6-溴-7-甲氧基-4-氯甲基香豆素的质量比为3:4:6。
作为优选，制备含硫亚磷酰亚胺酯步骤中，n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基-(2-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺酯)的制备步骤如下：
将n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基醇和无水三乙胺溶于无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺，充分搅拌后再于室温下继续搅拌，滤除不溶物，滤液以饱和碳酸钠溶液洗涤，有机相无水硫酸钠干燥过夜，浓缩得到6-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基-(2-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺酯)。
作为优选，加入的n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基醇、无水三乙胺和2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺的质量比为8:6:5。
本发明还提供了一种利用根据上述技术方案所述的含有光敏单元的核酸在修饰核酸端基中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、本发明采用含硫亚磷酰亚胺酯制备含有光敏单元的核酸，实验表明其在制备时具有很高的反应活性、良好的底物适应性、足够的化学稳定性以及良好的光响应性，为核酸的官能化提供一种更加简洁高效的选择，简化了制备含有光敏单元的核酸的方法，降低了其制备成本，扩大了制备光敏单元的核酸的市场应用。同时修饰巯基后的核酸序列可在近红外光照射下以很高的效率脱除保护基，释放出高活性的巯基，为核酸端基修饰提供了新的选择。
2、本发明提供的含有光敏单元的核酸的制备方法简单易操作，以6-溴 -7-羟基-4-氯甲基香豆素为原料，将其作为光可降解单元，通过简单的醚化和酯化等标准的有机单元反应即可制备得到目标产物，在极大降低了合成成本的同时保留了光可降解的高效性。该方法路线简明，操作便捷，中间体及产物的纯化方式简单，可以实现高效大量制备目标产物，为核酸的5’端巯基修饰提供了一种成本可控，简单高效的亚磷酰亚胺酯试剂合成方法。
附图说明
图1为本发明实施例提供的含硫亚磷酰亚胺酯的核磁共振氢谱图；
图2为本发明实施例提供的含硫亚磷酰亚胺酯的核磁共振碳谱图；
图3为本发明实施例提供的含硫亚磷酰亚胺酯的质谱图；
图4为本发明实施例提供的含有光敏单元的核酸的核磁共振氢谱图；
图5为本发明实施例提供的含有光敏单元的核酸的核磁共振碳谱图；
图6为本发明实施例提供的含有光敏单元的核酸的质谱图；
图7为本发明含有光敏单元的核酸光照前后以及对照核酸的不同核酸序列的HPLC谱图；
图8为本发明含有光敏单元的核酸光照前的质谱图；
图9为本发明含有光敏单元的核酸光照后的质谱图；
图10为本发明不含有光敏单元的对照核酸的质谱图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例还提供了一种根据上述实施例所述的含有光敏单元的核酸的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备含硫亚磷酰亚胺酯：以6-溴-7-羟基-4-氯甲基香豆素为起始原料，将其与碘甲烷在无机碱的作用下生成6-溴-7-甲氧基-4-氯甲基香豆素，然后与n-巯基-1-烷基醇在有机碱的作用下生成n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基醇，最后与2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺在有机碱的作用下制备得到n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺酯)，得到含硫亚磷酰亚胺酯，
本步骤中，所得含硫亚磷酰亚胺酯具有如式(Ⅱ)所示的结构式：
S2：制备含有光敏单元的核酸：取所述含硫亚磷酰亚胺酯溶于无水乙腈作为端基修饰位试剂与核酸合成，将得到的合成中间产物分散于甲氨水溶液中，55-75℃下密闭加热后，离心除去不溶物，将溶液浓缩处理，得到含有光敏单元的核酸。
本步骤中，所得含有光敏单元的核酸，具有如式(I)所示的结构式：
其中，n值的范围为1-15。
上述实施例在制备含有光敏单元的核酸时，以6-溴-7-羟基-4-氯甲基香豆素为起始原料，通过简单的醚化和酯化等标准的有机单元反应即可制备n- (6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺酯)，反应操作不涉及强酸、强碱、强氧化剂及强还原剂的使用，最终产物具有良好的化学稳定性，可直接用于核酸自动合成仪上，简化了制备含有光敏单元的核酸的方法，降低了其制备成本，并且修饰巯基后的核酸序列可在紫外光照射下以很高的效率脱除保护基，释放出高活性的巯基，为核酸端基修饰提供了新的选择。需要说明的是，n的取值范围为1-15范围内的正整数，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14等。
在一优选实施例中，制备含硫亚磷酰亚胺酯的步骤中，6-溴-7-甲氧基-4- 氯甲基香豆素的制备步骤如下：
将6-溴-7-羟基-4-氯甲基香豆素和无水碳酸钾分散在N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌下滴加碘甲烷，并将反应体系升至80℃搅拌12-14小时，随后将反应液倒入冰水中，室温下搅拌1小时过滤，滤饼以乙醚洗涤，再于热乙醇中重结晶，得到6-溴-7-甲氧基-4-氯甲基香豆素。
上述实施例中，以6-溴-7-羟基-4-氯甲基香豆素为原料，通过在无水碳酸钾和N，N-二甲基甲酰胺作用下，利用碘甲烷对6-溴-7-羟基-4-氯甲基香豆素中7位上的羟基进行甲醚化，基于在一优选实施例中，加入的6-溴-7- 羟基-4-氯甲基香豆素、无水碳酸钾和碘甲烷的质量比为1.5：4.4：1，溶于 N，N-二甲基甲酰胺中的6-溴-7-羟基-4-氯甲基香豆素和无水碳酸钾的浓度分别为0.07g/mL和0.2g/mL的参数限定以及条件限定，准确得到6-溴-7-甲氧基-4-氯甲基香豆素。
在一优选实施例中，制备含硫亚磷酰亚胺酯的步骤中，n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基醇的制备步骤如下：
将n-巯基-1-烷基醇和三丁胺溶于四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加6-溴-7- 甲氧基-4-氯甲基香豆素于四氢呋喃中的溶液，搅拌12-14小时，反应结束后蒸出溶剂，残余物溶于乙酸乙酯中，然后加入饱和氯化铵水溶液，充分搅拌，分离出有机相，再加入饱和氯化钠水溶液，继续搅拌，分出有机相后无水硫酸钠干燥，粗产品经硅藻土过滤浓缩后，以四氢呋喃：正己烷体积比1：4重结晶,得到n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基醇。
上述实施例中，利用6-溴-7-甲氧基-4-氯甲基香豆素在有机碱作用下对 n-巯基-1-烷基醇中的巯基进行醚化保护，基于在一优选实施例中，加入的n- 巯基-1-烷基醇、三丁胺和6-溴-7-甲氧基-4-氯甲基香豆素的质量比为3:4:6 对参数的限定以及反应条件限定，能够准确制备得到n-(6-溴-7-甲氧基-4- 硫甲基香豆素)-1-烷基醇。需要说明的是，上述步骤中，先后加入饱和氯化铵水溶液目的在于温和地调节萃取体系中水溶液的pH值，减少乳化情况的发生，促进有机相和水相的分相；加入饱和饱和氯化钠水溶液，其目的在于降低有机相中的水含量，简化后续处理。
在一优选实施例中，制备含硫亚磷酰亚胺酯的步骤中，n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺酯)的制备步骤如下：
将6-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基醇和无水三乙胺溶于无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺，充分搅拌后再于室温下继续搅拌，滤除不溶物，滤液以饱和碳酸钠溶液洗涤，有机相无水硫酸钠干燥过夜，浓缩得到n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺酯)。
上述实施例中，利用n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基醇在有机碱作用下与2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺发生酯化反应，基于在一优选实施例中，加入的n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基醇、无水三乙胺和2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺的质量比为8:6:5 对参数的限定以及反应条件限定，能够准确制备得到n-(6-溴-7-甲氧基-4- 硫甲基香豆素)-1-烷基-(2-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺酯)。需要说明的是，反应条件先在冰浴条件下加入2-O-氰乙基-N，N-二异丙基氯代亚磷酰胺充分搅拌后再于室温下继续搅拌，其目的在于避免温度过高造成2-O-氰乙基 -N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺的分解，简化后续的分离纯化步骤。
反应流程示意如下：
制备n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基-(2-O-氰乙基-N,N- 二异丙基亚磷酰胺酯)(n＝6)的反应流程示意如下：
制备含有光敏单元的核酸：
本发明实施例还提供了一种利用如上实施例所述的含有光敏单元的核酸在修饰核酸端基中的应用。本实施例中的含有光敏单元的核酸基于n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺酯)制备得到，该端基化试剂表现出较好的化学稳定性和光敏感性，可直接用于核酸在合成仪上的修饰，具有极高的便利性。所制备得到的含有光敏单元的核酸序列可在近红外光照射下以很高的效率脱除保护基，释放出高活性的巯基，为核酸端基修饰提供了新的选择。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的含有光敏单元的核酸、其制备方法及其应用，下面将结合具体实施例进行描述。
实施例1
含硫亚磷酰亚胺酯的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：取14克6-溴-7-羟基-4-氯甲基香豆素和40克无水碳酸钾分散在200毫升N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌下滴加9.1克碘甲烷，反应体系升至80° C搅拌12小时，随后将反应液倒入1000毫升冰水中，室温下搅拌1小时过滤，滤饼以20毫升乙醚洗涤，再于30毫升热乙醇中重结晶，得到12.1克6-溴-7- 甲氧基-4-氯甲基香豆素，淡黄色固体，收率82％；
步骤二：3.0克6-巯基-1-己醇和4.0克三丁胺溶于50毫升四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加6.0克6-溴-7-甲氧基-4-氯甲基香豆素于20毫升四氢呋喃中的溶液，搅拌12小时，反应结束后蒸出溶剂，残余物溶于100毫升乙酸乙酯中，向其中加入200毫升饱和氯化铵水溶液，搅拌1小时。分离出有机相，再向其中加入100毫升饱和氯化钠水溶液，继续搅拌1小时，分出有机相后无水硫酸钠干燥，粗产品经硅藻土过滤(1厘米厚)，滤液浓缩后得到黄色油状产物，以四氢呋喃-正己烷(体积比1：4)重结晶两次，得到5.4克淡黄色粉末状固体，收率67％；
步骤三：4.0克6-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-己醇和3克无水三乙胺溶于100毫升无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加2.5克2-O-氰乙基-N,N- 二异丙基氯代亚磷酰胺，反应于冰浴下搅拌1小时候再于室温下继续搅拌2小时，滤除不溶物，滤液以饱和碳酸钠溶液洗涤。有机相无水硫酸钠干燥过夜，浓缩溶剂得到6-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-己基-(2-O-氰乙基-N, N-二异丙基亚磷酰胺酯)4.1克，收率66％。
上述制备的含硫亚磷酰亚胺酯，即上述式(I)化合物的核磁共振氢谱检测结果如图1所示：
1H-NMR(CH3OD,400MHz):δ＝1.28-1.37(m,CH2,4H), 1.43-1.53(m,CH2,2H),1.56-1.63(m,CH2,2H),2.52-2.55(m,CH2S, 2H),3.49-3.53(m,CH2O,2H),3.85(s,ArCH2S,2H),3.96(s,CH3O, 3H),6.27(s,ArH,1H),7.02(s,ArH,1H),8.01(s,ArH,1H).
上述制备的含硫亚磷酰亚胺酯，即上述式(I)化合物的核磁共振碳谱检测结果如图2所示：
13C-NMR(CH3OD,100MHz):δ＝19.01,25.09,28.19,28.74, 31.56,32.09,56.04,61.45,100.13,101.17,111.57,112.48,129.08, 152.31,154.87,159.8,161.0.
上述制备的含硫亚磷酰亚胺酯，即上述式(I)化合物的质谱检测结果如图3所示：
ESI-MS:C17H21BrO4S,calc 400.0344,402.0323,found 423.02292(M+Na+),425.02079(M+Na+)。
实施例2
含有光敏单元的核酸的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：700毫克6-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-己基-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺酯)溶于10毫升无水乙腈中，氮气保护下转移至 ABI 394核酸合成仪的端基修饰位试剂瓶中。输入核酸序列：5’CCT AGA TTC AGT TCA ACT TA 3’，执行1μmol量级的合成。
步骤二：合成完毕后将固相载体取出，分散在1毫升5％-32％甲氨水溶液中， 55-75℃下密闭加热1-4小时，离心去除不溶物，溶液浓缩即得到粗产物。
目标产物通过高效液相色谱分离，并通过MALDI-TOF进行结构信息表征。
上述制备的含有光敏单元的核酸的核磁共振氢谱检测结果如图4所示：
1H-NMR(CDCl3,100MHz):δ＝1.24-1.26(m,CH2,8H), 1.34-1.35(d,CH3,12H),2.46-2.50(m,CH2CN,2H),2.74-2.78(m, CH2S,2H),3.47-3.54(m,CHN,1H),3.67-3.68(m,CH2O,2H),3.94 (s,CH3O,3H)，4.08-4.11(m,CH2,2H),6.20-6.21(m,ArH,1H)， 6.83-6.84(m,ArH,1H),7.84-7.85(m,ArH,1H).
上述制备的含有光敏单元的核酸的核磁共振碳谱检测结果如图5所示：
13C-NMR(CH3OD,100MHz):δ＝19.01,23.51,25.09,26.07, 28.19,28.74,31.54,32.09,37.96,54.02,56.04,61.45,90.67,100.13, 101.17,111.57,112.48,129.08,152.31,154.87,159.8,161.0.
上述制备的含有光敏单元的核酸的质谱检测结果如图6所示：
ESI-MS:C26H38BrN2O5PS,calc 600.1424,602.1402,found 601.1493(M+H+),603.1481(M+H+)。
含有光敏单元的核酸的光敏性检测试验：
试验方法：将按照实施例2的方法获取到含有光敏单元的核酸序列溶解在0.01-0.1M、pH 4.8-8.5的磷酸钠缓冲溶液中，配制成1-500μM的浓度，置于离心管中。采用808nm光纤激光器，光功率密度为1-50mW/cm2，照射时间1-15分钟。光解完毕的样品通过高效液相色谱分离。分别检测含有光敏单元的核酸光照射前后(其DNA序列依次如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示)，以及以未进行端基修饰的核酸(其序列如SEQ ID No.3所示)的质谱(如图8-10所示)和HPLC谱图(如图7所示)。
含有光敏单元的核酸光解过程如下：
计算上述三组中分子量，数据结果如表1所示：
表1分子量数据结果
上述内容中，有机分子的结构和纯度均由核磁共振氢谱(1H-NMR)、碳谱 (13C-NMR)和电喷雾电离(ESI-MS)来确定，脱氧核糖核酸的结构信息及光降解过程由基质辅助激光电离解析-飞行时间质谱(MALDI-TOF)来确定，反应效率由高效液相色谱(HPLC)来确定。
核磁型号为Bruker AMX 400Spectrometer(400MHz)，所用溶剂为氘代二甲亚砜(CDCl3和CH3OD)，带TMS内标；ESI质谱型号为Agilent 6510 Q-TOF，检测模式为阴离子模式；MALDI-TOF质谱型号为Shimadazu Biotech Axima Performance，检测模式为阴离子模式；高效液相色谱型号为Waters 2695，检测柱型号为XBriage Oligonucleotides BEH C18(2.1mm×50mm； Column2.5μm)，淋洗条件如表2所示：
表2淋洗条件
试验结果：
如图7所示，含有光敏单元的核酸光照前、后及对照核酸的HPLC谱图中，其出峰时间依次为20.29分钟、8.87分钟和11.44分钟。
Claims (9)
1.含有光敏单元的核酸，其特征在于，具有如式(I)所示的结构式：
其中，n值的范围为1-15。
2.根据权利要求1所述的含有光敏单元的核酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备含硫亚磷酰亚胺酯：以6-溴-7-羟基-4-氯甲基香豆素为起始原料，将其与碘甲烷在无机碱的作用下生成6-溴-7-甲氧基-4-氯甲基香豆素，然后与n-巯基-1-烷基醇在有机碱的作用下生成n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基醇，最后与2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺在有机碱的作用下制备得到n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺酯)，得到含硫亚磷酰亚胺酯；
制备含有光敏单元的核酸：取所述含硫亚磷酰亚胺酯溶于无水乙腈作为端基修饰位试剂与核酸合成，将得到的合成中间产物分散于甲氨水溶液中，55-75℃下密闭加热后，离心除去不溶物，将溶液浓缩处理，得到含有光敏单元的核酸。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，制备含硫亚磷酰亚胺酯步骤中，6-溴-7-甲氧基-4-氯甲基香豆素的制备步骤如下：
将6-溴-7-羟基-4-氯甲基香豆素和无水碳酸钾分散在N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌下滴加碘甲烷，并将反应体系升至80℃搅拌12-14小时，随后将反应液倒入冰水中，室温下搅拌1小时过滤，滤饼以乙醚洗涤，再于热乙醇中重结晶，得到6-溴-7-甲氧基-4-氯甲基香豆素。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，加入的6-溴-7-羟基-4-氯甲基香豆素、无水碳酸钾和碘甲烷的质量比为1.5：4.4：1，溶于N，N-二甲基甲酰胺中的6-溴-7-羟基-4-氯甲基香豆素和无水碳酸钾的浓度分别为0.07g/mL和0.2g/mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，制备含硫亚磷酰亚胺酯步骤中，n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基醇的制备步骤如下：
将n-巯基-1-烷基醇和三丁胺溶于四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加6-溴-7-甲氧基-4-氯甲基香豆素于四氢呋喃中的溶液，搅拌12-14小时，反应结束后蒸出溶剂，残余物溶于乙酸乙酯中，然后加入饱和氯化铵水溶液，充分搅拌，分离出有机相，再加入饱和氯化钠水溶液，继续搅拌，分出有机相后无水硫酸钠干燥，粗产品经硅藻土过滤浓缩后，以四氢呋喃：正己烷体积比1：4重结晶,得到n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基醇。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，加入的n-巯基-1-烷基醇、三丁胺和6-溴-7-甲氧基-4-氯甲基香豆素的质量比为3:4:6。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，制备含硫亚磷酰亚胺酯步骤中，n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺酯)的制备步骤如下：
将n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基醇和无水三乙胺溶于无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺，充分搅拌后再于室温下继续搅拌，滤除不溶物，滤液以饱和碳酸钠溶液洗涤，有机相无水硫酸钠干燥过夜，浓缩得到n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基-(2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺酯)。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，加入的n-(6-溴-7-甲氧基-4-硫甲基香豆素)-1-烷基醇、无水三乙胺和2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺的质量比为8:6:5。
9.利用根据权利要求1所述的含有光敏单元的核酸在核酸端基修饰中的应用。
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