CN116253766A - 一种环二核苷酸2’,3’-cGAMP的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种环二核苷酸2’,3’‑cGAMP的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)将化合物1与TIPDS‑Cl2反应得到化合物2；(2)将化合物2与氯甲酸苄酯反应得到化合物3；(3)将化合物3进行选择性脱保护反应得到化合物4；(4)将化合物4与化合物5反应得到化合物6；(5)将化合物6脱保护，得到化合物7；(6)将化合物7与双(二异丙基氨基)(2‑氰基乙氧基)膦反应得到化合物8，之后脱保护得到所述环二核苷酸2’,3’‑cGAMP。本发明提供的制备方法具有制备步骤少，制备过程简单，收率高的优点，适合大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于有机合成领域，具体涉及一种环二核苷酸2’,3’-cGAMP的制备方法，尤其涉及一种收率高的环二核苷酸2’,3’-cGAMP的制备方法。
背景技术
近年来的研究表明，cGAS-cGAMP-STING是细胞天然免疫机制的重要通路，环二核苷酸2’,3’-cGAMP作为细胞天然免疫中的第二信使分子，在细胞质中由cGAS(环磷酸鸟苷-腺苷合成酶)被激化后催化ATP和GTP而生成。2’,3’-cGAMP与STING蛋白结合，进而引发细胞天然免疫响应。天然免疫机制在抗肿瘤、抗病毒等方面发挥着重要作用，因此2’,3’-cGAMP在肿瘤免疫治疗、DNA病毒/逆转录病毒感染治疗、肿瘤的放射治疗等方面应用前景广阔，关于其激活免疫相应的机制，也在不断深入的研究之中，其体外的生物合成以及类似物化学合成的研究也具有非常重要的意义。
有关2’,3’-cGAMP及其类似物生物合成的报道，收率比较低；化学合成方面，近年的报道多集中在一锅法合成，中间步骤生成的产物，不做分离纯化，处理之后即用作下一步，每步反应的时间都不长，最后用溶剂结晶得到粗产品的盐，耗时短。但此类一锅法产物多为毫克级，产率较低，所需反应条件相对比较苛刻，试剂等级要求高，中间过程不可控，此类操作可以短时间内合成少量的环二核苷酸，但放大规模合成不具优势。因此，开发一种过程可控，可规模化生产的，成本低廉，产率高且稳定的路线和工艺，有着非常重要的意义。
CN106190999A公开了一种运用生物酶催化法高效制备、纯化环二核苷酸cGAMP的方法，利用基因工程技术首先高效量产生物酶，即环二核苷酸cGAMP合成酶，然后运用该生物酶催化合成高效、专一性环二核苷酸cGAMP，提供大规模、高产率、低成本、条件温和、快速简便的制备环二核苷酸cGAMP的方法，然而其采用生物试剂进行制备，对制备条件的要求较高。
李兴丰研究了2’,3’-cGAMP及其类似物的合成方法(2',3'-cGAMP及其类似物的合成研究)，以腺苷和鸟苷为起始原料，通过优化反应参数，经9步反应合成制备2’,3’-cGAMP，然而其总产率过低，难以进行大规模应用。
由于目前环二核苷酸2’,3’-cGAMP的合成制备具有重要价值，而目前的制备方法存在着产率不高，制备方法复杂等问题。因此，如何提供一种制备简单、收率高的环二核苷酸2’,3’-cGAMP的制备方法，成为了亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种环二核苷酸2’,3’-cGAMP的制备方法，尤其提供一种收率高的环二核苷酸2’,3’-cGAMP的制备方法。本发明提供的制备方法具有制备步骤少，制备过程简单，收率高的优点，适合大规模生产。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种环二核苷酸2’,3’-cGAMP的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将化合物1与TIPDS-Cl2(1,3-二氯-1,1,3,3-四异丙基二甲硅氧醚)反应得到化合物2；
(2)将化合物2与氯甲酸苄酯反应得到化合物3；
(3)将化合物3进行选择性脱保护反应得到化合物4；
(4)将化合物4与化合物5反应得到化合物6；
(5)将化合物6脱保护，得到化合物7；
(6)将化合物7与双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦反应得到化合物8，之后脱保护得到所述环二核苷酸2’,3’-cGAMP。
反应路线如下：
上述制备方法通过采用TIPDS-Cl2对化合物1保护，然后氯甲酸苄酯将2’位裸露羟基保护起来，之后进行选择性脱保护，5’位裸露后的羟基直接与三价磷酰胺活性中间体反应再经氧化后得到磷酸二酯化合物，能够以高收率形成第一个磷酸酯碱；之后采用两个羟基位点与双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦反应形成第二个磷酸酯键，避免了现有方法中先将一个羟基位点转化为磷酸酯基团或带磷基团，再与另一羟基进行缩合的方法，避免了对水分的敏感问题，提高了整体反应的收率。
优选地，步骤(1)所述化合物1与TIPDS-Cl2的摩尔比为1:(1-1.2)。
优选地，步骤(1)所述反应的温度为20-30℃，时间为12-24h。
优选地，步骤(2)所述化合物2与氯甲酸苄酯的摩尔比为1:(1-1.2)。
优选地，步骤(2)所述反应的温度为20-30℃，时间为3-5h。
优选地，步骤(3)所述选择性脱保护反应的温度为20-30℃，时间为0.3-0.7h。
优选地，步骤(4)所述化合物4和化合物5的摩尔比为1:(1.3-1.7)。
优选地，步骤(4)所述反应的温度为20-30℃。
优选地，步骤(4)所述反应的时间为12-24h。
优选地，步骤(6)所述化合物6与双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦的摩尔比为1:(1.5-2.5)。
优选地，步骤(6)所述反应的温度为20-30℃。
优选地，步骤(6)所述反应的时间为12-24h。
其中，步骤(1)所述化合物1与TIPDS-Cl2的摩尔比可以是1:1、1:1.05、1:1.1、1:1.15或1:1.2等，步骤(1)所述反应的温度可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等，时间可以是12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h等，步骤(2)所述化合物2与氯甲酸苄酯的摩尔比1:1、1:1.05、1:1.1、1:1.15或1:1.2等，步骤(2)所述反应的温度可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等，时间可以是3h、3.5h、4h、4.5h或5h等，步骤(3)所述选择性脱保护反应的温度可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等，时间可以是0.3h、0.4h、0.5h、0.6h或0.7h等，步骤(4)所述化合物4和化合物5的摩尔比可以是1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6或1:1.7等，步骤(4)所述反应的温度可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等，时间可以是12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h等，步骤(6)所述化合物6与双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦的摩尔比可以是1:1.5、1:1.7、1:1.9、1:2.1、1:2.3或1:2.5等，步骤(6)所述反应的温度可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等，时间可以是12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。
步骤(5)和步骤(6)中涉及的脱保护过程均为本领域常规反应过程，申请人在此不做过多限定。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种环二核苷酸2’,3’-cGAMP的制备方法，通过采用TIPDS-Cl2对化合物1保护以及采用两个羟基位点与双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦反应形成第二个磷酸酯键的方案，显著提高了整体反应的收率，制备步骤少，制备过程简单，适合大规模生产。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1
本实施例提供了一种环二核苷酸2’,3’-cGAMP的制备方法，具体步骤如下：
第一步：制备化合物2
称取5.0g N2-异丁酰基鸟苷一水合物(5.0g，14.15mmol，1.0eq)加入吡啶(25mL)减压浓缩成油状物，重复这个操作两遍除去水分，然后溶于吡啶(50mL)中，滴1,3-二氯-1,1,3,3-四异丙基二甲硅氧醚(4.9g，15.57mmol，1.1eq)，25℃搅拌15h。减压浓缩除去吡啶，加入二氯甲烷(100mL)溶解，加入饱和碳酸氢钠溶液洗，水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液除去大部分溶剂，然后滴入乙醚中，25℃搅拌半小时，过滤，减压干燥得到6g白色护体，收率：71％。
第二步：制备化合物3
称取化合物2(6.0g，10.07mmol，1.0eq)加入到二氯甲烷(100mL)，然后降温至0℃，加入4-二甲氨基吡啶(1.48g，12.08mmol，1.2eq)，称取氯甲酸苄酯(4.9g，11.08mmol，1.1eq)溶于二氯甲烷(100mL)，滴入上述体系中，然后25℃搅拌4小时。加入饱和碳酸氢钠溶液洗，水洗，饱和氯化铵溶液洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压干燥得到7.3g白色固体，直接用于下一步。
第三步：制备化合物4
将上步得到的化合物3(7.3g，10.07mmol，1.0eq)加入二氯甲烷(100mL)，然后加入氟化氢吡啶溶液(3.7g，22.15mmol，2.2eq)，25℃搅拌30分钟。水洗两次，加入饱和碳酸氢钠溶液洗，无水硫酸钠干燥，过滤，柱层析纯化得到5.8g白色固体，两步收率：77％。
第四步：制备化合物6
将上步得到的化合物4(2.4g，3.17mmol，1.0eq)和化合物5(4.7g，4.76mmol，1.5eq)加入无水乙腈(50mL)，加入5g活化过的4A粉末分子筛氮气保护下25℃搅拌2小时，然后加入四氮唑(0.34g，4.76mmol，1.5eq)搅拌15h。加入5M过氧化叔丁醇溶液(1.9mL)反应半小时，过滤，滤液降温至0℃，加入40％亚硫酸氢钠水溶液(10mL)淬灭，25℃搅拌5分钟，过滤，滤液浓缩至干，加入乙酸乙酯(100mL)溶解，5％碳酸氢钠水溶液洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，柱层析纯化得到4.8g淡黄色固体，收率：91％。
第五步：制备化合物7
称取化合物6(6.0g，3.63mmol，1.0eq)加入无水甲醇(50mL)，然后加入含水量70％的10％湿钯碳(1.2g)，25℃氢化搅拌15h，过滤，滤液浓缩至干，溶于二氯甲烷(30mL)，加入含量6％二氯乙酸的二氯甲烷溶液(78g)，25℃搅拌1小时，加入二氯甲烷(100mL)稀释，5％碳酸氢钠水溶液洗，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，柱层析纯化得到3.7g淡黄色固体，收率：83％。
第六步：制备化合物8
称取化合物7(2.2g，1.81mmol，1.0eq)和化合物双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(1.09g，3.62mmol，2.0eq)加入无水乙腈(50mL)，然后加入5g活化的4A粉末分子筛氮气保护下25℃搅拌2小时，然后分批4次缓慢加入四氮唑(254mg，3.62mmol，2.0eq)，加完25℃搅拌2小时，然后再次加入四氮唑(127mg，1.81mmol，1.0eq)，25℃搅拌15h。加入5M过氧化叔丁醇溶液(1.1mL)反应半小时，过滤，滤液降温至0℃，加入40％亚硫酸氢钠水溶液(10mL)淬灭，25℃搅拌5分钟，过滤，滤液浓缩至干，加入乙酸乙酯(100mL)溶解，5％碳酸氢钠水溶液洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干，高压制备液相分离纯化得到1.77g白色固体，收率：74％。
第七步：制备化合物(2’,3’-cGAMP)
称取化合物8(1.5g，1.31mmol，1.0eq)加入无水乙腈(20mL)，然后加入叔丁胺(8.2g，113mmol，100eq)，氮气保护下25℃搅拌2小时，反应液浓缩至干，加入无水乙腈(50mL)反复浓缩三次，然后加入38.5％甲胺甲醇溶液(50mL)25℃搅拌4小时，反应液浓缩至干，加入无水甲醇(60mL)浓缩至干，然后再次加入二氯甲烷(60mL)浓缩至干，溶于无水吡啶(20mL)和三乙胺(10mL)混合溶液中，浓缩至干，重复此项操作三次将叔丁胺盐转化成三乙胺盐，得到的油状物加入吡啶(10mL)中，氮气保护升温至50℃，然后加入三乙胺(30mL)和三乙胺三氢氟酸盐(5.3g，45mmol，40eq)搅拌15h。反应液冷却至25℃，缓慢滴入丙酮(300mL)，25℃搅拌30分钟，过滤，丙酮淋洗，固体粗品通过高压制备液相纯化得到570mg白色固体，收率：75％。
表征数据如下：1H-NMR(D2O,400MHz):3.92-3.93(m,1H),4.15(m,3H),4.29(s,2H),4.44(s,1H),4.54—4.61(m,1H),4.89(s,1H),5.63(s,1H),5.83(d,J＝5.2Hz,1H),5.99(s,1H),7.74(s,1H),8.13(s,1H),8.28(s,1H)。
对比例1
本对比例提供了一种环二核苷酸2’,3’-cGAMP的制备方法，参考现有文献报道方法(1)Gao P,Ascano M,Wu Y,Barchet W,Gaffney BL,Zillinger T,Serganov AA,Liu Y,Jones RA,Hartmann G,Tuschl T,Patel DJ；Cyclic[G(2’,5’)pA(3’,5’)p]Is theMetazoan Second Messenger Produced by DNA-Activated Cyclic GMP-AMPSynthase.Cell,2013,153(5):1094–1107)。
具体步骤如下：
文献报道的“一锅法”策略，应用在2`,3`-cGAMP的合成上。如上所示，先将一个保护的亚磷酰胺单体水解，再脱除DMTr保护，得到的亚磷酸不用分离和纯化，淬灭反应之后，浓缩蒸除溶剂后，用到下一步与另一分子的亚磷酰胺单体缩合，生成线状的二聚体，反应在2分钟内完成，也不用纯化和分离，减压蒸除溶剂之后，再经过氧化和脱保护，生成氧化的线状二聚体，淬灭反应之后，蒸除溶剂，既用到下一步环合。反应液经过淬灭，萃取，得到的产品最后经过脱保护得到目标产物的三乙胺盐；粗品用制备高效液相纯化，冻干之后得纯品，总收率5％。
实验过程中，由于反应条件敏感，经过多次重复，依然无法取得优秀的结果，尤其是线性二聚体环合这一步，仅仅只能在LCMS中观察到少量的产品；用作最后脱保护，几乎无法得到目标产物。
由此也可以发现，本发明提供的方法，相比现有方法，更适用于常规生产中，更加适合工业化要求。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的环二核苷酸2’,3’-cGAMP的制备方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种环二核苷酸2’,3’-cGAMP的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将化合物1与TIPDS-Cl2反应得到化合物2；
(2)将化合物2与氯甲酸苄酯反应得到化合物3；
(3)将化合物3进行选择性脱保护反应得到化合物4；
(4)将化合物4与化合物5反应得到化合物6；
(5)将化合物6脱保护，得到化合物7；
(6)将化合物7与双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦反应得到化合物8，之后脱保护得到所述环二核苷酸2’,3’-cGAMP；
反应路线如下：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述化合物1与TIPDS-Cl2的摩尔比为1:(1-1.2)；
优选地，步骤(1)所述反应的温度为20-30℃，时间为12-24h。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述化合物2与氯甲酸苄酯的摩尔比为1:(1-1.2)；
优选地，步骤(2)所述反应的温度为20-30℃，时间为3-5h。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述选择性脱保护反应的温度为20-30℃，时间为0.3-0.7h。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述化合物4和化合物5的摩尔比为1:(1.3-1.7)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述反应的温度为20-30℃。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述反应的时间为12-24h。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述化合物6与双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦的摩尔比为1:(1.5-2.5)。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述反应的温度为20-30℃。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述反应的时间为12-24h。
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