CN110272462B - 制备化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化合物合成方法的改进领域，公开了一种制备化合物的方法。该方法包括：使式(I)、式(II)或式(III)所示线性化合物进行偶联反应，本发明公开的制备环二核苷酸及其类似物的方法具有高效、易操作、条件温和、低成本的优点。

Description

制备化合物的方法
技术领域
本发明涉及化合物合成方法的改进，具体涉及一种制备化合物的方法。
背景技术
环二核苷酸是一种普遍存在于细菌中的第二信使分子。目前已经报道了有c-di-GMP(3’-5’)、c-di-AMP(3’-5’)、cGAMP(3’-5’)这三种细菌来源的环二核苷酸，其都参与调节细菌多种重要的生理活动，包括细胞的分化，生物膜的生成、细胞壁的代谢平衡、细菌的趋化性、细菌的致病因子的产生以及细菌的毒力等。cGAMP(2’-3’)是在真核细胞中首次发现一种新型结构的环二核苷酸，其在免疫通道中扮演着重要的免疫刺激作用。后续的研究发现包括细菌来源和人工合成的环二核苷酸也同样都可以有效刺激免疫反应，并因此建立了一种基于环二核苷酸为免疫佐剂或者免疫刺激剂的治疗方案，其在抗癌、抗病毒、抗菌中都表现出良好的应用前景。
环二核苷酸表现出巨大的潜在药用价值，因此对环二核苷酸及其类似物的合成也成为一个重要的研究内容。目前主要集中在酶工程生物合成、磷酸三酯、亚磷酰胺和氢磷酸几种方法。CN106190999A和CN102245774A提供的酶法虽然可以大规模制备环二核苷酸，但限于酶催化的特异性，无法得到其结构修饰的类似物，因此其很难得到推广应用。CN102199183A和WO2016120305A提供的亚磷酰胺和氢磷酸方法同样可以以较高产率合成得到环二核苷酸及其类似物，但其反应条件苛刻，其对溶剂要求绝对无水(一般需要将所用的溶剂用干燥剂(例如氢化钙)干燥过夜后，蒸馏得到无水溶剂，而且反应的过程中需要在惰性气体氛围保护下进行)，同时由于制备过程中中间体以盐的形式存在，导致其易吸水，不易纯化，且中间体稳定性差，因此在制备过程中增加了对操作的难度，而且在中间体核苷的亚磷酰胺单体的制备过程中所需的三价磷试剂价格高昂，增加了制备成本。因此如何大量制备环二核苷酸及其类似物依旧是需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的合成环二核苷酸及其类似物过程中的纯化不易、反应条件苛刻和中间体不稳定等问题，提供了一种制备化合物的方法。
为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种制备化合物的方法，该方法包括：使式(I)、式(II)或式(III)示线性化合物进行偶联反应，
Figure BDA0001598236480000021
其中：B1、B2、B3、B4、B5和B6各自独立地为环外氨基被保护的鸟嘌呤基、环外氨基被保护的腺嘌呤基、环外氨基被保护的腺嘌呤基、环外氨基被保护的胸腺嘧啶基、尿嘧啶基或环外氨基被保护的人工修饰的碱基；
X1、X2、X3、X4、X5和X6各自独立地为叔丁基二甲基硅甲烷基、苯基二甲基硅甲烷基、叔丁基二苯基硅甲烷基或三异丙基硅甲烷基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为
Figure BDA0001598236480000022
其中R为卤素原子、硝基或甲氧基。
通过上述技术方案，本发明制备环二核苷酸及其类似物在保持较高产率(产率为23-25％)的同时，所用的无水溶剂均按照常规方法干燥即可，不需要绝对无水，另外反应的中间体产物稳定性好，所使用的试剂均为常规试剂，成本较低，因此本发明公开的制备环二核苷酸及其类似物的方法具有高效、易操作、条件温和、低成本的优点。
而且，本发明所制备的线性化合物的纯化只需要将所得到的粗产物用柱层析分离即可以得到纯净的最终产物，而常规使用的亚磷酰胺和氢磷酸的方法得到的中间体由于其以盐的形式存在，极性大，不易柱层析分离，同时其产物容易吸水，而后续的反应对无水条件要求严格。因此本发明还具有纯化容易的优点。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明公开了一种制备化合物的方法，该方法包括：使式(I)、式(II)或式(III)示线性化合物进行偶联反应，
Figure BDA0001598236480000031
Figure BDA0001598236480000041
其中：B1、B2、B3、B4、B5和B6各自独立地为环外氨基被保护的鸟嘌呤基、环外氨基被保护的腺嘌呤基、环外氨基被保护的胞嘌呤基、环外氨基被保护的胸腺嘧啶基、尿嘧啶基或环外氨基被保护的人工修饰的碱基；
X1、X2、X3、X4、X5和X6各自独立地为叔丁基二甲基硅甲烷基、苯基二甲基硅甲烷基、叔丁基二苯基硅甲烷基或三异丙基硅甲烷基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为
Figure BDA0001598236480000042
其中R为卤素原子、硝基或甲氧基。
本发明所述的B1、B2、B3、B4、B5和B6可以为本领域的常规选择，优选为酰基，进一步优选为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基，人工修饰的碱基为硝基吲哚、氨基吲哚、黄嘌呤或次黄嘌呤基团通过硫代、卤代、甲基化方法修饰而得到的碱基。通过将B1、B2、B3、B4、B5和B6通过酰基保护起来，避免鸟嘌呤基、腺嘌呤基、胞嘌呤基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基在反应中被破坏，而且在得到环二核苷酸之后也方便脱去保护基团，通过引入人工修饰的碱基可以合成环二核苷酸的类似物，为环二核苷酸的应用提供了更多可能。
本发明所述的偶联反应条件可以为本领域的常规选择，优选的条件为：在惰性气氛下，将所述线性化合物与缩合剂在第一液态反应介质中进行接触，接触的温度为0-50℃，接触的时间为4-8h。
更优选地，相对于1mol的线性化合物，所述缩合剂的用量为4-5mol，所述第一液态反应介质的用量为22-24L。
更优选地，所述第一液态反应介质为吡啶、二氯甲烷、乙腈、二氧六环和四氢呋喃中的至少一种。
本发明所述的缩合剂可以为本领域的常规选择，优选为1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑、2,4,6-三异丙基苯基砜基-3-硝基1,2,4-三唑、2,4,6-三异丙基苯磺酰氯、三甲基苯磺酰氯、1H-四唑和N-甲基咪唑中的至少一种。
本发明所述的线性化合物的制备方法可以为本领域的常规选择，优选的制备方法为通过磷酸三酯法制得，所述方法还包括：将磷酸三酯法得到的产物溶解于第一有机溶剂中，去除有机溶剂，从而脱除氰乙基的保护基而得到线性化合物。
更优选地，相对于1mol的线性化合物，所述第一有机溶剂的用量为17-20L。
更优选地，所述第一有机溶剂为叔丁胺与乙腈的混合溶液，其中，叔丁胺与乙腈的体积比为1-3：1。
优选地，本发明所述的制备化合物的方法还包括脱除偶联反应的产物的保护基团，以得到环二核苷酸及其类似物。本发明可以制备三种不同结构的环二核苷酸及其类似物，其两个糖环单元通过两个分子间的2’-5’,3’-5’两种不同的磷酸二酯键连接方式相连，构成了三种不同的骨架结构的环二核苷酸及其类似物。分别为(2’-3’)CDNs,(2’-5’)CDNs和(3’-5’)CDNs,如下式(1，2，3)所示结构通式：
Figure BDA0001598236480000051
上述脱除保护基团的方法可以为本领域的常规选择，优选的脱除的方式为：(1)在第一脱保护反应条件下，在第二液态反应介质中，将偶联反应的产物与第一脱保护剂接触，脱去部分类别的保护基团，除去溶剂之后得到产物A，所述部分类别的保护基团包括R1、R2、R3、R4、R5和R6；(2)在第二脱保护反应条件下，将产物A与第二脱保护剂接触，脱去部分类别的保护基团，除去溶剂之后得到产物B，所述部分类别的保护基团包括B1、B2、B3、B4、B5和B6上的保护基团；(3)在第三脱保护反应条件下，将产物B与第三脱保护剂接触，脱去剩余类别的保护基团，所述剩余类别的保护基包括X1、X2、X3、X4、X5和X6。
上述的第一脱保护剂为2-吡啶醛肟和/或N,N,N,N-四甲基胍。第二液态反应介质优选为1,4-二氧六环的水溶液和/或1,4-二氧六环的四氢呋喃溶液，1,4-二氧六环的水溶液中1,4-二氧六环与水的体积比＝0.5-1.5:1，1,4-二氧六环的四氢呋喃溶液中1,4-二氧六环与四氢呋喃的体积比＝0.5-1.5:1。所述第一脱保护反应条件优选为：相对于1克的偶联反应的产物，第一脱保护剂的用量为0.6-0.7克，第二液态反应介质的用量为14-20mL，反应温度为10-30℃，反应时间为20-30小时。
上述的第二脱保护剂优选为氨水、氨甲醇和甲胺乙醇中的至少一种，所述氨水的浓度为25-28重量％，所述氨甲醇的浓度为＝6-8mol/L，所述甲胺乙醇的浓度为＝30-35重量％，所述第二脱保护反应条件优选为：相对于1克的偶联反应的产物，第二脱保护剂的用量为10-20mL，反应温度为50-60℃；反应时间为12-20小时。
上述的第三脱保护剂优选为0.8-1.2mol/L的叔丁基氟化氨的四氢呋喃溶液、三乙胺三氢氟酸和吡啶氢氟酸盐中的至少一种，。所述第三脱保护反应条件优选为：相对于1克的偶联反应的产物，第三脱保护剂的用量为8-12mL，反应温度为10-30℃；反应时间为12-20小时。
本发明可以通过常规的纯化方法对脱除保护基团后的产物进行纯化，优选采用半制备液相分离提纯的方式进行纯化。半制备液相分离的条件包括：流动相A＝乙腈，B＝水，C＝0.8-1.2mol/L三乙胺-醋酸缓冲液，梯度为0-30分钟A从0.1-4体积％到18-22体积％，B从86-90体积％到68-72体积％，C保持8-12体积％，检测波长254nm，流速3-5mL/min。
根据一种优选的实施方式，所述环二核苷酸的制备方法包括：
(1)2-氯苯基二氯磷酸酯、1,2,4-三氮唑和三乙胺在无水二氯甲烷中冰浴反应30-50min后，加入N2-乙酰基-2’-异丙基二甲基硅基-5’-((4,4-二甲氧基)-三苯基)甲基核苷、N2-苯甲酰基-2’-异丙基二甲基硅基-5’-((4,4-二甲氧基)-三苯基)甲基核苷、N2-乙酰基-3’-异丙基二甲基硅基-5’-((4,4-二甲氧基)-三苯基)甲基核苷或N2-苯甲酰基-3’-异丙基二甲基硅基-5’-((4,4-二甲氧基)-三苯基)甲基核苷中的一种，继续在冰浴中反应1.5-2.5h，再加入0.8-1.2mol/L的三乙胺-碳酸缓冲液，萃取浓缩和得到中间体核苷的磷酸二酯盐。
(2)将步骤(1)得到的磷酸二酯盐和第一缩合剂(如1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑)、3-羟基丙腈在无水吡啶中，惰性气体中反应1.5-2.5h后蒸干，有机溶剂(如二氯甲烷)萃取、加入二氯乙酸室温反应后柱层析分离得到中间体5’-OH裸露的核苷磷酸三酯。
(3)将步骤(1)得到的核苷的磷酸二酯盐、步骤(2)得到的核苷磷酸三酯和第二缩合剂(如1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑)，溶解在无水吡啶中，惰性气体保护反应1.5-2.5h后蒸干溶剂，有机溶剂(如二氯甲烷)萃取、加入二氯乙酸低温(冰浴)反应后柱层析分离得到线性二核苷酸中间体。
(4)将线性二核苷酸产物溶于叔丁胺与乙腈的混合溶液(叔丁胺与乙腈的体积比为1-3：1)中搅拌10-60min后，蒸干加入第三缩合剂(如1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑)，无水吡啶溶解后，惰性气体保护反应5-7h后，柱层析分离得到带有保护基的环二核苷酸。
(5)将带有保护基的环二核苷酸溶于含有2-吡啶醛肟和N,N,N,N-四甲基胍的溶液(溶剂可以为1,4-二氧六环与H2O的混合物(1,4-二氧六环与水的体积比＝0.5-1.5:1)或者1,4-二氧六环与四氢呋喃的混合物(1,4-二氧六环的四氢呋喃溶液中1,4-二氧六环与四氢呋喃的体积比＝0.5-1.5:1))中，蒸干后用浓氨水或者氨甲醇溶液(所述氨水的浓度为25-28重量％，氨甲醇的浓度为＝6-8mol/L)处理，最后0.8-1.2mol/L叔丁基氟化氨的四氢呋喃溶液处理后，丙酮沉淀，半制备液相分离得到环二核苷酸。
通过上述技术方案，制备环二核苷酸及其类似物的方法具有高效、易操作、条件温和、低成本的优点。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
所有溶剂、原料和试剂如不特别指明，均为市售分析纯或化学纯。实验中所需的无水溶剂均按常规方法进行干燥，所述无水溶剂的常规干燥方法即为：在敞开的环境中，将所用溶剂与过量的干燥剂(例如硫酸钠)混合放置8h之后，过滤除去干燥剂。
产物分离、鉴别的仪器和方法：薄层层析硅胶GF254为天津思利达公司生产，TLC是在254nm紫外分析，柱层析硅胶为青岛海洋化工公司生产。核磁共振谱仪使用的是BrukerAVANCE 400M，以TMS为内标。高分辨质谱使用的是Varian 7.0T FTMS傅里叶变换等离子回旋共振高分辨质谱，高效液相色谱使用的是Agilent 1100，产物分离使用的是AngelaVenusil ASB C18半制备柱，所述的半制备液相分离条件为：流动相A＝乙腈，B＝水，C＝1mol/L的醋酸-三乙胺缓冲液。梯度0-30分钟A从2体积％到20体积％，B从88体积％到70体积％，C保持10体积％，检测波长254nm,流速4ml/min。
实施例1
(2’-3’)环-鸟苷酸-腺苷酸(即化合物(6)cGAMP(2’-3’)，B3＝腺嘌呤基,B4＝鸟嘌呤基，X1,X2＝OH)
该实施例用于说明本发明提供的2’-5’和3’-5’两种不同的磷酸二酯骨架连接方式。
Figure BDA0001598236480000091
试剂和反应条件：i:二氯苯基二氯磷酸酯，1,2,4-三氮唑，二氯甲烷，1mol/L三乙胺-乙酸缓冲液；ii:1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑，3-羟基丙腈，吡啶；iii：3体积％二氯乙酸的二氯甲烷溶液；iv：1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑，吡啶；v：3体积％二氯乙酸的二氯甲烷溶液；vi：叔丁胺，乙腈；vii：1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑，吡啶；viii：2-吡啶醛肟，N,N,N,N-四甲基胍，1,4-二氧六环，水；ix：28重量％氨水；x：1mol/L叔丁基氟化氨的四氢呋喃溶液。
该合成实施实例中化学物(6)的合成：
(1)向烧瓶中加入1,2,4-三唑(12.25g，180mmol)和三乙胺(18.21g,180mmol)，加入135mL无水CH2Cl2溶解，冰浴下滴加入2-氯苯基二氯磷酸酯(17.67g，72mmol,溶于50mL二氯甲烷中)，搅拌反应1h后，冰浴下滴加入N2-乙酰基-2’-异丙基二甲基硅基-5’-((4,4-二甲氧基)-三苯基)甲基腺苷(购于苏州吉玛基因股份有限公司)(35.48g，45mmol，溶于30mL二氯甲烷)，反应2h后加入135mL的1mol/L的三乙胺-醋酸缓冲液，继续搅拌反应30分钟。停止反应分出有机相用1mol/L的三乙胺-醋酸缓冲液洗三次后无水硫酸钠干燥，除去溶剂，干燥后得化合物(1)43g，不经过分离直接进入下一步反应。
(2)烧瓶中，氩气保护下加入化合物(1)(10.5g,9.67mmol)和1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑(8.60g,29.02mmol)，3-羟基丙腈(1.03g,14.5mmol)40mL无水吡啶溶解后，常温反应两小时后加入10mL水终止反应，旋蒸除去溶剂后加入50mL二氯甲烷溶解，加入60mL的5体积％草酸溶液，分出有机相干燥，过滤，浓缩。加入3体积％二氯乙酸的二氯甲烷溶液20mL，搅拌5min后加入2mL甲醇，加入250mL饱和碳酸氢钠水溶液中和，分出有机相后干燥。过滤，浓缩，柱层析分离得到化合物(2)6.1g。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ9.13(s,1H),8.82(d,J＝6.4Hz,1H),8.09–8.01(m,3H),7.62(t,J＝7.4Hz,1H),7.57–7.46(m,3H),7.33–7.28(m,1H),7.19(t,J＝7.8Hz,1H),6.07(d,J＝11.5Hz,1H),5.92(d,J＝7.8Hz,1H),5.83(d,J＝7.4Hz,1H),5.28–5.22(m,1H),5.19–5.11(m,1H),4.47(dt,J＝14.5,6.1Hz,1H),4.37(d,J＝5.1Hz,1H),3.95(dd,J＝24.8,13.1Hz,1H),3.75(dt,J＝25.6,9.8Hz,1H),2.83(t,J＝6.3Hz,2H),1.78(s,2H),0.76(d,J＝28.4Hz,9H),-0.14(d,J＝18.0Hz,3H),-0.39(d,J＝6.0Hz,3H)；
13C NMR(101MHz,CDCl3)：δ164.46,152.46,150.60,150.35,146.01,143.09,142.94,133.45,133.02,130.95,128.95,128.28,127.91,126.76,125.52,124.25,121.58,116.05,91.33,90.53,87.66,86.34,80.47,80.41,76.72,74.41,73.18,73.13,72.78,63.29,63.23,63.17,62.57,25.76,25.50,25.44,19.69,19.62,17.88,17.80,-5.14,-5.28,-5.43,-5.71；
MALDI-TOF-HRMS：C32H38ClN6O8PSi的相对分子质量为:728.1947，发现[M+Na]+751.1842的峰。
综合以上三组谱图表明合成产物正确。
(3)向烧瓶中加入1,2,4-三唑(12.25g,180mmol)和三乙胺(18.21g,180mmol)，加入135mL无水CH2Cl2溶解，冰浴下滴加入2-氯苯基二氯磷酸酯(17.67g,72mmol,溶于50mL二氯甲烷中)，搅拌反应1h后，冰浴下滴加入N2-乙酰基-3’-异丙基二甲基硅基-5’-((4,4-二甲氧基)-三苯基)甲基鸟苷(购于苏州吉玛基因股份有限公司)(29.74g，45mmol,溶于30mL二氯甲烷)，反应2h后加入135mL 1mol/L的三乙胺-醋酸缓冲液，继续搅拌反应30分钟。停止反应分出有机相用1mol/L的三乙胺-醋酸缓冲液洗三次后无水硫酸钠干燥，除去溶剂，干燥后得化合物(3)41g不经过分离直接进入下一步反应。
(4)将化合物(2)(1.89g，1.83mmol)和化合物(3)(1g，1.46mmol)，1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑(0.86g，2.90mmol)加入到烧瓶中，再加入20mL无水吡啶溶解后常温搅拌，2小时后加入5mL水停止反应，旋蒸除去溶剂，重新加入20mL二氯甲烷溶解，加入5体积％草酸溶液30ml，分出有机相，水洗两次后无水硫酸钠干燥。过滤，除去溶剂，加入3体积％二氯乙酸的二氯甲烷溶液10mL，冰浴下搅拌5min后加入2mL甲醇，继续搅拌，加入150mL饱和碳酸氢钠水溶液中和，分出有机相后干燥，过滤浓缩，柱层析分离得到线性的二核苷产物化合物(4)1.56g。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ12.36(m,1H),11.16–10.48(m,1H),9.02–8.83(m,1H),8.22(dd,J＝28.9,7.2Hz,2H),8.02(d,J＝6.6Hz,2H),7.60(d,J＝6.3Hz,1H),7.50(dd,J＝15.9,8.2Hz,2H),7.46–7.35(m,2H),7.30(d,J＝7.8Hz,1H),7.19(ddd,J＝27.5,17.2,9.6Hz,3H),6.07(dd,J＝31.5,4.7Hz,1H),5.84(dd,J＝11.4,7.5Hz,1H),5.44(d,J＝23.8Hz,1H),5.28(d,J＝27.8Hz,2H),5.01(s,1H),4.85–4.61(m,2H),4.57–4.38(m,2H),4.24(d,J＝28.2Hz,1H),3.95(d,J＝10.9Hz,1H),3.65(d,J＝11.9Hz,1H),2.84(s,1H),2.26(d,J＝3.9Hz,3H),0.93–0.67(m,18H),0.07–-0.33(m,12H)；
13C NMR(101MHz,CDCl3)：δ173.48,173.41,165.14,155.69,152.68,151.37,149.94,149.81,148.74,148.55,148.31,148.14,145.99,142.94,138.98,133.17,133.00,130.97,130.78,130.70,128.85,128.42,128.21,127.94,127.02,126.91,126.59,126.44,125.33,123.95,121.40,121.18,116.29,116.19,99.99,90.29,89.23,88.05,84.87,82.88,81.25,74.74,74.42,70.88,67.41,63.70,61.63,25.60,25.43,24.24,24.16,19.66,17.96,17.89,17.86,-4.86,-4.99,-5.14,-5.21,-5.56；
MALDI-TOF-HRMS：C56H69Cl2N11O16P2Si2的相对分子质量为:1339.3315，发现[M+Na]+1362.3212的峰。
综合以上三组谱图表明合成产物正确。
(5)烧瓶中，加入化合物4(1.15g,0.86mmol)，加入叔丁胺/乙腈(1:1,v/v)16mL,常温搅拌20min后，旋蒸除去溶剂，加入20mL吡啶溶解，加入1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑(1.28g,4.32mmol)，常温反应4h后旋蒸除去溶剂后，柱层析分离得到带有保护基的环二核苷分子产物化合物(5)0.76g。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ12.04(s,1H),10.29(s,1H),8.76(s,1H),8.13–7.99(m,3H),7.71–7.59(m,2H),7.53(dd,J＝13.8,7.4Hz,3H),7.46(d,J＝7.8Hz,2H),7.31(t,J＝7.2Hz,2H),7.25–7.15(m,3H),5.94(d,J＝4.3Hz,1H),5.78(d,J＝3.5Hz,1H),5.75–5.66(m,1H),5.53–5.45(m,2H),5.45–5.37(m,1H),5.16(q,J＝10.2Hz,1H),4.83(dd,J＝19.7,9.6Hz,1H),4.62(dd,J＝9.0,4.8Hz,2H),4.34(td,J＝10.5,6.9Hz,2H),1.90(s,3H),0.79(d,J＝16.0Hz,18H),0.01(s,6H),-0.11(d,J＝26.5Hz,6H)；
13C NMR(101MHz,CDCl3)：δ172.85,164.82,155.51,152.71,151.23,150.08,147.80,147.29,146.11,146.05,146.01,142.65,139.23,133.51,132.86,130.96,130.89,128.84,128.22,127.98,127.22,126.80,125.68,125.61,125.38,125.30,124.04,122.79,121.65,121.56,91.91,89.79,80.98,80.70,80.63,73.12,71.76,71.70,66.00,53.53,25.50,25.45,23.69,17.89,17.82,-5.06,-5.13,-5.34；
MALDI-TOF-HRMS：C53H64Cl2N10O15P2Si2相对分子质量为:1268.2943，发现[M+Na]+为1291.2842的峰。
综合以上三种谱图表明合成产物正确。
(6)烧瓶中加入带有保护基的环二核苷化合物(5)(500mg)后，加入164mg 2-吡啶醛肟和173mg N,N,N,N-四甲基胍，加入1,4-二氧六环/水(1:1,v/v)8mL,常温搅拌过夜后，旋蒸除去溶剂，加入28重量％浓氨水，55℃下搅拌回流过夜后，旋蒸除去溶剂，充分干燥后，加入1mol/L叔丁基氟化氨的四氢呋喃溶液5mL继续常温搅拌24h后，旋蒸除去溶剂。HPLC纯化，得到目标环二核苷分子(6)67mg，产率为25％。
1H NMR(400MHz,D2O)：δ8.13(s,1H),8.08(s,1H),7.72(s,1H),5.84(d,J＝3.7Hz,2H),4.50-4.43(m,Hz,2H),4.43–4.36(m,1H),4.29(s,2H),4.12(s,1H),4.04(s,2H),3.71(d,J＝11.2Hz,1H),3.58(dd,J＝12.7,3.9Hz,1H)；
31P NMR(162MHz,D2O)：δ-0.42；
ESI-TOF-HRMS：C20H24N10O13P2的相对分子质量为:674.1000，发现[M-H]-673.0930的峰。
综合以上三种谱图表明合成产物正确。
实施例2
(3’-5’)环二鸟苷酸(即化合物(11)，(3’-5’)cGAMP)，通式I中，B1,B2＝鸟嘌呤基,X1,X2＝OH)
该实施例用于说明本发明提供的只具有2’-3’这一种磷酸二酯骨架连接方式。
Figure BDA0001598236480000131
试剂和反应条件：i:二氯苯基二氯磷酸酯，1,2,4-三氮唑，二氯甲烷，1mol/L三乙胺-乙酸缓冲液；ii:1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑，3-羟基丙腈，吡啶；iii：3体积％二氯乙酸的二氯甲烷溶液；iv：1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑,，吡啶；v：3体积％二氯乙酸的二氯甲烷溶液；vi：叔丁胺，乙腈；vii：1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑,，吡啶；viii：2-吡啶醛肟，N,N,N,N-四甲基胍，1,4-二氧六环，水；ix：28重量％氨水；x：1mol/L叔丁基氟化氨的四氢呋喃溶液。
该合成实施实例中化学物(11)的合成：
(1)向烧瓶中加入1,2,4-三唑(12.25g,180mmol)和三乙胺(18.21g,180mmol)，加入135mL无水CH2Cl2溶解，冰浴下滴加入2-氯苯基二氯磷酸酯(17.67g,72mmol,溶于50mL二氯甲烷中)，搅拌反应1h后，冰浴下滴加入N2-乙酰基-2’-异丙基二甲基硅基-5’-((4,4-二甲氧基)-三苯基)甲基鸟苷(29.74g,45mmol,溶于30mL二氯甲烷)，反应2h后加入135mL1mol/L的三乙胺-醋酸缓冲液，继续搅拌反应30分钟。停止反应分出有机相用1mol/L的三乙胺-醋酸缓冲液洗三次后用无水硫酸钠干燥，除去溶剂，干燥后得化合物(7)40g不经过分离直接进入下一步反应。
(2)烧瓶中，氩气保护下加入化合物(7)(10g,9.67mmol)和1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑(8.60g,29.02mmol)，3-羟基丙腈(1.03g,14.5mmol)40mL无水吡啶溶解后，常温反应两小时后加入10mL水停止反应，旋蒸除去溶剂后加入50mL二氯甲烷溶解，加入60mL的5％草酸溶液，分出有机相干燥，过滤，浓缩。加入3％二氯乙酸的二氯甲烷溶液20mL，搅拌5min后加入2mL甲醇，加入250mL饱和碳酸氢钠水溶液中和，分出有机相后干燥。过滤，浓缩，柱层析分离得到产品化合物(8)1.7g。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ12.32(s,1H),9.91(s,1H),7.98(s,1H),7.47(dd,J＝7.3,2.4Hz,2H),7.31(dd,J＝11.0,4.5Hz,1H),7.20(t,J＝7.7Hz,1H),5.80(d,J＝6.9Hz,1H),5.30(d,J＝8.1Hz,2H),5.09(t,J＝5.0Hz,1H),4.51(ddd,J＝18.8,10.4,3.8Hz,2H),4.30(s,1H),3.98(dd,J＝12.6,3.1Hz,1H),3.73(d,J＝10.9Hz,1H),3.00–2.80(m,2H),2.32(s,3H),0.74(s,9H),-0.10(s,3H),-0.23(s,3H)；
13C NMR(101MHz,CDCl3)：δ173.41,155.59,148.08,148.01,146.02,145.96,139.53,130.89,128.24,126.77,125.42,125.35,121.90,121.63,116.46,89.33,84.11,78.57,73.41,63.43,63.38,61.26,53.53,25.67,25.38,24.26,19.71,19.64,17.80,-5.20,-5.42；
MALDI-TOF-HRMS：C27H36ClN6O9PSi的相对分子质量为:682.1739.发现[M+Na]+705.1638的峰。
综合以上三组谱图表明合成产物正确。
(3)将化合物(7)(1.76g,1.70mmol)和化合物(8)(0.93g,1.36mmol)，1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑(0.80g,2.70mmol)加入到烧瓶中，再加入20mL无水吡啶溶解后常温搅拌，2小时后加入5mL水停止反应，旋蒸除去溶剂，重新加入20mL二氯甲烷溶解，加入适量5％草酸溶液30mL，分出有机相，水洗两次后用无水硫酸钠干燥。过滤，除去溶剂，加入3％二氯乙酸的二氯甲烷溶液10mL，冰浴下搅拌5min后加入2mL甲醇，继续搅拌，加入饱和碳酸氢钠水溶液150mL中和，分出有机相后干燥，过滤浓缩，柱层析分离得到线性的二核苷产物化合物(9)1.45g。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ12.22(d,J＝29.2Hz,1H),11.90(s,1H),10.20(d,J＝22.0Hz,1H),9.75(d,J＝59.8Hz,1H),8.16(d,J＝46.3Hz,1H),7.75(s,1H),7.53–7.41(m,2H),7.39–7.29(m,2H),7.26–7.16(m,1H),7.05(dd,J＝15.6,7.6Hz,2H),6.73(t,J＝7.7Hz,1H),6.06–5.96(m,1H),5.79(dd,J＝17.3,8.1Hz,1H),5.64(d,J＝31.3Hz,1H),5.46–5.34(m,1H),5.26–5.17(m,1H),5.12(d,J＝3.4Hz,1H),4.84–4.44(m,6H),4.09(dd,J＝20.4,11.8Hz,1H),3.92(dd,J＝26.7,12.2Hz,1H),2.95–2.78(m,2H),2.25(d,J＝11.1Hz,3H),1.96(s,3H),0.69(dd,J＝10.8,8.1Hz,18H),-0.08–-0.33(m,12H)；
13C NMR(101MHz,CDCl3)：δ173.09,172.99,172.86,155.65,155.57,148.50,148.35,148.16,148.08,147.85,147.28,145.87,145.81,145.19,145.12,140.60,138.96,130.98,130.47,128.47,128.27,127.46,127.23,127.13,126.94,126.06,126.00,125.43,125.36,122.83,122.65,121.84,121.59,121.31,116.64,116.44,89.17,88.94,87.92,84.77,81.60,73.81,70.63,68.39,64.09,63.82,63.76,61.84,25.37,25.33,25.30,24.24,23.62,19.82,19.74,17.84,17.78,-4.96,-4.99,-5.08,-5.18,-5.42,-5.46,-5.51,-5.62；
MALDI-TOF-HRMS：C51H67Cl2N11O17P2Si2的相对分子质量:1293.3107.发现[M+Na]+1316.3006的峰。
综合以上三组谱图表明合成产物正确。
(4)烧瓶中，加入化合物(9)(1g,0.76mmol)，加入叔丁胺/乙腈(1:1,v/v)16mL,常温搅拌20min后，旋蒸除去溶剂，加入20mL吡啶溶解，加入1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑(1.13mg,3.80mmol)，常温反应4h后旋蒸除去溶剂后，柱层析分离得到带有保护基的环二核苷分子产物化合物(10)0.72g。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ12.02(s,2H),10.26(s,2H),7.68(s,2H),7.43(d,J＝7.7Hz,2H),7.31(d,J＝7.1Hz,2H),7.23–7.13(m,4H),5.84(dd,J＝9.5,5.1Hz,2H),5.78(d,J＝2.6Hz,2H),5.28(s,2H),5.17(d,J＝9.8Hz,2H),4.64–4.52(m,2H),4.42–4.28(m,2H),1.93(s,6H),0.80(s,18H),-0.01(s,6H),-0.08(s,6H)；
13C NMR(101MHz,CDCl3)：δ172.59,155.36,147.64,147.01,146.03,145.96,139.05,131.01,128.23,127.23,125.50,125.43,122.83,121.34,92.19,73.71,65.72,25.63,25.51,23.57,17.92,-4.98,-5.00；
MALDI-TOF-HRMS:C48H62Cl2N10O16P2Si2的相对分子质量为:1222.2736，发现[M+Na]+1245.2632的峰。
综合以上三组谱图表明合成产物正确。
(5)烧瓶中加入带有保护基的环二核苷化合物(10)500mg后，加入164mg 2-吡啶醛肟和173mg N,N,N,N-四甲基胍，加入1,4-二氧六环/水(1:1,v/v)8mL，常温搅拌过夜后，旋蒸除去溶剂，加入28重量％浓氨水10mL，55℃下搅拌回流过夜后，旋蒸除去溶剂，充分干燥后，加入1mol/L叔丁基氟化氨的四氢呋喃溶液5mL继续常温搅拌24h后，旋蒸除去溶剂。HPLC纯化，得到目标环二核苷分子化合物(11)60mg，产率为23％。
1H NMR(400MHz,D2O)：δ8.02(s,1H),5.90(s,1H),5.04(s,1H),4.47–4.33(m,2H),4.09(d,J＝11.3Hz,1H),2.94(s,1H)；
ESI-TOF-HRMS：C20H24N10O14P2的相对分子质量为:690.0949，发现[M-H]-689.0759、[M-2H]2-344.0319的峰。
综合以上谱图表明合成产物正确。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (13)

1.一种制备化合物的方法，其特征在于，该方法包括：使式(I)、式(II)或式(III)所示线性化合物进行偶联反应，
Figure FDA0004053971730000011
其中：B1、B2、B3、B4、B5和B6各自独立地为环外氨基被保护的鸟嘌呤基、环外氨基被保护的腺嘌呤基、环外氨基被保护的胞嘌呤基、环外氨基被保护的胸腺嘧啶基、尿嘧啶基或环外氨基被保护的人工修饰的碱基；
X1、X2、X3、X4、X5和X6各自独立地为叔丁基二甲基硅甲烷基、苯基二甲基硅甲烷基、叔丁基二苯基硅甲烷基或三异丙基硅甲烷基；
R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为
Figure FDA0004053971730000012
其中R为卤素原子、硝基或甲氧基；
其中，所述偶联反应的方式为：在惰性气氛下，将所述线性化合物与第三缩合剂在第一液态反应介质中进行接触，接触的温度为0-50℃，接触的时间为4-8h；所述第三缩合剂为1-(均三甲苯基-2-砜基)-3-硝基-1,2,4-三唑、2,4,6-三异丙基苯基砜基-3-硝基1,2,4-三唑中的至少一种；第一液态反应介质为吡啶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，B1、B2、B3、B4、B5和B6中的保护基团为酰基，人工修饰的碱基为硝基吲哚、氨基吲哚、黄嘌呤或次黄嘌呤基团通过硫代、卤代或甲基化方法修饰而得到的碱基。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，B1、B2、B3、B4、B5和B6中的保护基团为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，相对于1mol的线性化合物，所述缩合剂的用量为4-5mol，所述第一液态反应介质的用量为22-24L。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述线性化合物通过磷酸三酯法制得，所述方法还包括：将磷酸三酯法得到的产物溶解于第一有机溶剂中，去除有机溶剂，从而脱除氰乙基的保护基而得到线性化合物；所述第一有机溶剂为叔丁胺与乙腈的混合溶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，相对于1mol的线性化合物，所述第一有机溶剂的用量为17-20L。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，叔丁胺与乙腈的体积比为1-3：1。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中，所述方法还包括：脱除偶联反应的产物的至少部分保护基团，所述保护基团包括B1、B2、B3、B4、B5和B6上的保护基团，X1、X2、X3、X4、X5、X6、R1、R2、R3、R4、R5和R6。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，脱除保护基团的方式包括以下步骤：
(1)在第一脱保护反应条件下，在第二液态反应介质中，将偶联反应的产物与第一脱保护剂接触，用于脱除部分类别的保护基团，除去溶剂之后得到产物A，所述部分类别的保护基团包括R1、R2、R3、R4、R5和R6；所述第一脱保护剂为2-吡啶醛肟和/或N,N,N,N-四甲基胍，所述第二液态反应介质为1,4-二氧六环的水溶液和/或1,4-二氧六环的四氢呋喃溶液；
(2)在第二脱保护反应条件下，将产物A与第二脱保护剂接触，脱去部分类别的保护基团，除去溶剂之后得到产物B，所述部分类别的保护基团包括B1、B2、B3、B4、B5和B6上的保护基团；所述第二脱保护剂为氨水、氨甲醇和甲胺乙醇中的至少一种；
(3)在第三脱保护反应条件下，将产物B与第三脱保护剂接触，脱去剩余类别的保护基团，所述剩余类别的保护基包括X1、X2、X3、X4、X5和X6；所述第三脱保护剂为0.8-1.2mol/L的叔丁基氟化氨的四氢呋喃溶液、三乙胺三氢氟酸和吡啶氢氟酸盐中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，1,4-二氧六环的水溶液中1,4-二氧六环与水的体积比＝0.5-1.5:1，1,4-二氧六环的四氢呋喃溶液中1,4-二氧六环与四氢呋喃的体积比＝0.5-1.5:1，所述第一脱保护反应条件为：相对于1克的偶联反应的产物，第一脱保护剂的用量为0.6-0.7克，第二液态反应介质的用量为14-20mL，反应温度为10-30℃，反应时间为20-30小时。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述氨水的浓度为25-28重量％，所述氨甲醇的浓度为＝6-8mol/L，所述甲胺乙醇的浓度为＝30-35重量％，所述第二脱保护反应条件包括：相对于1克的偶联反应的产物，第二脱保护剂的用量为10-20mL，反应温度为50-60℃；反应时间为12-20小时。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，所述第三脱保护反应条件包括：相对于1克的偶联反应的产物，第三脱保护剂的用量为8-12mL，反应温度为10-30℃；反应时间为12-20小时。
13.根据权利要求9-11中任意一项所述的方法，其中，所述方法还包括半制备液相分离提纯环二核苷酸，半制备液相分离的条件包括：流动相A＝乙腈，B＝水，C＝0.8-1.2mol/L三乙胺-醋酸缓冲液，梯度为0-30分钟A从0.1-4体积％到18-22体积％，B从86-90体积％到68-72体积％，C保持8-12体积％，检测波长254nm，流速3-5mL/min。
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