CN109970832A

CN109970832A - 一种炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体及其制备方法

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Publication number: CN109970832A
Application number: CN201910342000.2A
Authority: CN
Inventors: 刘明哲; 王诗宇
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2019-04-09
Filing date: 2019-04-26
Publication date: 2019-07-05
Anticipated expiration: 2039-04-26
Also published as: CN109970832B

Abstract

本发明属于医药技术领域，公开了炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物的合成方法及其应用。本发明将脱氧腺苷的N6位进行羧基化，再经过炔基修饰得到中间体，经过5'端羟基的保护和2'端亚磷酰胺化两步反应得到炔基修饰脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物。通过DNA的固相合成，将其定点导入到寡聚核苷酸中得到特定位点炔基修饰的寡聚核苷酸。本发明将炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物应用于寡聚核苷酸炔基修饰，方法简单，产率可观。为后续DNA的功能化提供了新的思路和有价值的中间体，应用前景广泛。

Description

一种炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物,尤其涉及腺嘌呤碱基部位炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物,本发明还涉及所述含炔基修饰的腺苷亚磷酰胺单体化合物的制备方法及其应用。

背景技术

近年来伴随着核酸化学合成技术的发展，学术界及产业界报道了一系列化学修饰的寡核苷酸衍生物。寡核苷酸的化学修饰包括对糖环的、碱基部位的修饰、磷酸二酯骨架的修饰，或将具有特定功能的化学结构替代天然核苷等等。这些修饰方法及所报道的寡核苷酸衍生物为反义核苷酸，核酸适配体，小干扰RNA等核酸类仿生药物的研发及基于核酸的生物医学诊断提供了重要的物质基础。

另一方面，随着“绿色化学”逐渐走进人们的视野，并逐渐成为有机合成化学领域的研究热点。如何减少有毒副产物的产生，受到化学研究工作者的高度重视。2001年，化学家K.B.Sharpless等引入“点击反应”概念。“点击反应”具有副产物毒性小，反应速度快，操作简单，反应条件温和且反应产率高等一系列优点。“点击反应”共有四种类型，分别是环加成反应，亲核开环反应，非醇醛的羰基化学以及碳碳多键的加成反应。其中叠氮端炔环加成反应，可以在一价铜离子催化下，快速将端炔与叠氮基偶联生成区域选择性的1,4-二取代-1,2,3-三氮唑，并具有很好的生物正交性。因此，该反应已经被广泛用于有机合成及化学生物学领域。本发明设计一类新型的炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体，并通过DNA固相合成技术制备炔基修饰的寡核苷酸，为将来通过环加成“点击反应”实现DNA分子的功能化提供新的途径和分子工具。

目前关于寡聚核苷酸的碱基修饰共分为两类，一类是基于天然碱基的结构进行化学修饰，另一类是基于非天然碱基的结构进行化学修饰。近些年来关于非天然碱基的化学修饰的文献报道较多，其中碱基部位炔基修饰的脱氧核苷类似物也有一些报道。例如德国奥斯纳布吕克大学F.See la等报道了脱氧腺苷的碱基位置8号位N，7号位去N并在碱基7号位引入炔基修饰物的脱氧腺苷亚磷酰胺单体。但是含非天然碱基脱氧核苷的合成方法复杂、步骤多，成本高，制约了其在DNA标记及功能化方面的实际应用。所以本发明选择廉价易得的含天然碱基的脱氧腺苷作为底物，设计合成一种新型炔基修饰脱氧腺苷亚磷酰胺化合物及炔基修饰的寡核苷酸DNA。本发明的炔基修饰脱氧腺苷亚磷酰胺化合物的合成路线短，方法简便，成本低廉，可用于基于点击反应的DNA标记和功能化，在核酸类仿生药物的研发及基于核酸的生物医学诊断方面具有较好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物及炔基修饰的寡核苷酸DNA。

本发明首先公开了一种炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物,其为式I所示结构的化合物：

其中：

R₁为H，C₁-C₄烷基；

R₂为H，C₁-C₄烷基；

R₃为4,4'-二甲氧基三苯基或4-甲氧基三苯基；

所述炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物中，进一步优选：

R₁为H，甲基，乙基或异丙基；

R₂为H，甲基，乙基或异丙基；

R₃为4,4'-二甲氧基三苯基。

本发明还公开了一种制备炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物的制备方法,包括以下步骤：

(1)碘乙酸和脱氧腺苷水合物发生亲电取代反应得到N1-羧甲基腺苷；

(2)N1-羧甲基腺苷经过Dimroth重排得到N6-羧甲基腺苷；

(3)N6-羧甲基腺苷与炔丙胺或2位烷基取代的炔丙胺经过酰胺化反应得到炔基修饰的脱氧腺苷；

(4)在无水、无氧环境、氮气保护和催化剂存在的条件下，炔基修饰的脱氧腺苷经过与4,4'-二甲氧基三苯基氯保护反应得到5'端保护的炔基修饰脱氧腺苷；

(5)在无水、无氧惰性气体保护和催化剂存在的条件下，5'端保护的炔基修饰脱氧腺苷经过亚磷酰胺化得到炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体；

本发明使用上述炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物，通过DNA合成仪制备炔基修饰的寡核苷酸DNA。利用公知的DNA固相合成技术可以将炔基修饰脱氧腺苷导入到DNA的任意位置。

上述炔基修饰寡核苷酸DNA链中,含炔基修饰的脱氧腺苷的数目为1个或1个以上，最多可以与碱基数目相同，所述的炔基修饰的脱氧腺苷化合物可以位于寡聚核苷酸链的任意位置。

本发明涉及反应及后处理简单，产率高，原料易得。利用本发明制备的炔基修饰DNA可以通过点击反应连接荧光分子等功能分子，在生物医药技术领域具有较好的应用前景。

附图说明

图1炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体的合成路线；

图2炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体的质谱图；

图3炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体的核磁氢谱图；

图4为炔基修饰的寡核苷酸DNA质谱图。

具体实施方式

本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的,不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。本发明以市售的脱氧腺苷为原料，经碘乙酸亲电取代反应，Dimroth重排，与炔丙胺的酰胺缩合反应得到N6位炔基修饰的腺苷。之后经DMT(4,4'-双甲氧基三苯甲基)保护反应，及亚磷酰胺化反应得到目标产物，炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体，即5'-二甲氧基三苯基-N6-(N-炔丙基)氨甲酰甲基脱氧腺苷，3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]亚磷酰胺(化合物5)。上述合成路线如图1所示。

实施例1：腺嘌呤碱基位置炔基修饰的亚磷酰胺单体的合成

1.N1-羧甲基-脱氧腺苷(化合物1)的制备

将pH＝7.0,0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液5ml倒入10ml圆底烧瓶中。向圆底烧瓶内加入1500mg碘乙酸，然后加入脱氧腺苷400mg，微热溶解。使用5mol/L NaOH溶液调节pH值，使pH＝7.0。此时反应液中析出大量无机盐白色絮状固体，继续加热至50℃，固体消失。水浴锅回流反应，温度设置到50℃，反应8h。反应结束后，溶液由橙黄色变为无色再变为粉红色。使用5mol/L HCl调节溶液pH值至pH＝3。将反应液加入到预冷却(-5℃)的丙酮溶液中，析出固体，过滤，干燥后得到产物340mg，产率74.1％。¹H-NMR(600MHz，D₂O)δ＝8.45(s，1H)，δ＝8.38(s，1H)，δ＝6.46(dd，J＝4.76Hz，1H)，δ＝5.03(dt，J＝5.48Hz，1H)，δ＝5.00(d，J＝5.31Hz，1H)，δ＝4.96(dt，J＝5.48Hz，1H)，δ＝4.85(d，J＝1.24Hz，2H)，δ＝4.10(t，J＝7.05Hz，1H)，δ＝3.72，3.74(ddd,J＝6.94Hz,2H)，δ＝2.82(dt，J＝13.18Hz，1H)，δ＝2.56(dd，J＝5.59Hz，1H).MS(ESI-TRAP⁺)，理论值[M]310.1，C₁₂H₁₆N₅O₅；测量值[M]⁺310.2.

2.N6-羧甲基脱氧腺苷(化合物2)的制备

取100mg化合物1于单口圆底烧瓶(10ml)中，用5ml纯净水溶解。配制5mol/L的NaOH溶液，调整pH值到pH＝11.0。加热回流，温度设置为80℃，反应2小时。冷却静置至室温，调节pH值，使pH＝3，真空旋蒸使溶液体积减小到原来的三分之一。利用阴离子(Cl^-)交换柱提纯后将收集的粗产品水溶液加入到冷却的-5℃丙酮溶液中，析晶。将得到的固体用离心，再用丙酮洗涤，真空干燥，得到灰色固体，即N6-羧甲基脱氧腺苷(化合物2)，65mg。产率：66％。¹H-NMR(600MHz，D₂O)δ＝8.32(s，1H)，δ＝8.08(s，1H)，δ＝6.43(dd，J＝4.86Hz，1H)，δ＝5.01(d，J＝5.49Hz，1H)，δ＝4.88(qd，J＝5.55Hz，1H)，δ＝4.58(dt，J＝5.67Hz，1H)，δ＝4.11(s，J＝5.49Hz，1H)，δ＝4.05(d，J＝5.12Hz，2H)，δ＝3.71，3.77(d，J＝5.12Hz，2H)，δ＝2.78(d，J＝9.53Hz，1H)，δ＝2.52(dd，J＝5.68Hz，1H).MS(ESI-TRAP⁺)，理论值[M]309.1，C₁₂H₁₅N₅O₅；测量值[M+H]⁺310.2.

3.N6-(N-炔丙基)氨甲酰甲基脱氧腺苷(化合物3)的制备

取900mg化合物2于烧瓶中，加入炔丙胺0.65ml，加入10ml无水DMF溶解，再加入0.6ml无水DIPEA(4-二甲氨基吡啶)，0℃下反应15分钟，再加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐，转移到室温继续反应24小时。反应结束后，旋蒸除去溶剂。加入少量甲醇溶解，抽滤得到滤液。将产物的甲醇溶液于0℃下滴加到乙醚溶液中，析晶。得到粗产物用乙醚洗涤3次，烘干后得到产物741mg。产率：73.6％。¹H-NMR(600MHz，d₆-DMSO)δ＝8.54(d，J＝3.83Hz，1H)，δ＝8.36(s，1H)，δ＝8.06(s，1H)，δ＝6.38(dd，J＝4.94Hz，1H)，δ＝5.21(d，J＝5.49Hz，1H)，δ＝4.95(t，J＝7.05Hz，1H)，δ＝4.40(qd，J＝5.56Hz，1H)，δ＝4.35(dd，J＝5.11Hz，2H)，δ＝3.99(m，3H)，δ＝3.72(ddd，J＝6.97Hz，2H)，δ＝2.65(dt，J＝13.19Hz，1H)，δ＝2.51(m，2H).MS(ESI-TRAP⁺)，理论值[M]346.2，C₁₅H₁₈N₆O₄；测量值[M+K]⁺384.4.

4. 5'-(4,4'-二甲氧基三苯基)-N6-(N-炔丙基)氨甲酰甲基脱氧腺苷(化合物4)的制备

取20ml无水吡啶于50ml双颈瓶中，加入741mg化合物3与870mg DMT-Cl(4，4'-二甲氧基三苯甲基氯)，室温条件下，氩气保护反应24小时。反应结束后，旋蒸除去吡啶，加入10ml二氯甲烷溶解，再加入10ml 10％碳酸氢钠溶液萃取3次后，接收有机相，加入适量无水硫酸钠干燥后，经抽滤，旋蒸，得到粗产品。通过硅胶柱提纯得到产物，565mg。产率：40％。¹H-NMR(600MHz，CDCI₃)δ＝8.54(s，1H)，δ＝8.33(s，1H)，δ＝7.20-7.40(m，5H)，δ＝7.16(m，4H)，δ＝6.85(m，4H)，δ＝6.36(d，J＝0.92Hz，1H)，δ＝4.81(d，J＝5.23Hz，1H)，δ＝4.38(m，3H)，δ＝4.21(dt，J＝5.56Hz，1H)，δ＝3.96(dd，J＝21.22Hz，4H)，δ＝3.77(s，6H)，δ＝2.63(dt，J＝13.18Hz，1H)，δ＝2.49(ddd，J＝13.18Hz，1H)，δ＝2.43(s，1H).MS(ESI-TRAP⁺)，理论值[M]648.7，C₃₆H₃₆N₆O₆；测量值[M+H]⁺649.8，[M+Na]⁺671.8.

5. 5'-二甲氧基三苯基-N6-(N-炔丙基)氨甲酰甲基脱氧腺苷，3'-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]亚磷酰胺(化合物5)的制备

取565mg的化合物4于50ml双颈瓶中，加入5ml无水二氯甲烷溶解，置于0℃低温反应釜内。取无水DIPEA(4-二甲氨基吡啶)1.7ml加入到上述反应液中，氩气保护，缓慢滴加2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺0.34ml后，转移到室温反应5小时。反应结束后，旋干溶剂，加入20ml无水二氯甲烷，用10ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤，再换成10ml饱和氯化钠洗涤。加入适量无水硫酸钠干燥，抽滤旋干，通过硅胶柱提纯，得到产物495mg，产率：67％。所得化合物5经核磁和质谱表征，结果如图2和图3所示。¹H-NMR(600MHz，CDCI₃)δ＝8.61(s，1H)，δ＝8.26(s，1H)，δ＝7.29-7.39(m，5H)，δ＝7.17(m，4H)，δ＝6.88(m，4H)，δ＝6.33(d，J＝4.94Hz，1H)，δ＝5.02(td，J＝5.17Hz，1H)，δ＝4.38(d，J＝5.12，2H)，δ＝4.24(m，3H)，δ＝3.98(d，J＝3.95Hz，2H)，δ＝3.91(dd，J＝4.30Hz，2H)，δ＝3.76(s，6H)，δ＝3.57(hept，J＝6.51Hz，2H)，δ＝2.89(ddd，J＝12.95Hz，1H)，δ＝2.70(m，3H)，δ＝2.42(s，1H)，δ＝1.22(dd，J＝24.96Hz，12H).MS(ESI-TRAP⁺)，理论值[M]848.7，C₄₅H₅₃N₈O₇P；测量值[M+H]⁺849.8，[M+Na]⁺871.8.

实施例2炔基修饰DNA的合成

本发明使用上述炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物，通过DNA合成仪合成并经高效液相色谱仪纯化得到炔基修饰的寡核苷酸DNA。产物经质谱确认，如图4所示。

本发明中使用的寡核苷酸序列如下：

DNA：5'-AAAA^*AAAAAAAAAAAAATT-3'

其中A^*表示脱氧腺苷的炔基修饰位点。

序列表

<110> 沈阳药科大学

<120> 一种炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体及其制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(1)

<220>

<221> modified_base

<222> (4)

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 1

aaanaaaaaa aaaaaaaatt 20

Claims

1.一种炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物,其特征在于,结构如式I所示：

其中：

R₁选自氢，C₁-C₄烷基；

R₂选自氢，C₁-C₄烷基；

R₃为4,4'-二甲氧基三苯基或4-甲氧基三苯基。

2.按照权利要求1所述炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物，其特征在于：R₁为氢，甲基，乙基或异丙基。

3.按照权利要求1所述炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物，其特征在于：R₂为氢，甲基，乙基或异丙基。

4.按照权利要求1或2所述的炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物，其特征在于，R₃为4,4'-二甲氧基三苯基或者4-甲氧基三苯基。

5.一种制备权利要求1所述的炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物的方法,其特征在于,包括：

(2)N1-羧甲基腺苷经过Dimroth重排得到N6-羧甲基腺苷；

(4)在无水、无氧环境、氮气保护和催化剂存在的条件下，炔基修饰的脱氧腺苷经过4,4'-二甲氧基三苯基氯保护反应得到5'端保护的炔基修饰的脱氧腺苷；

(5)在无水、无氧惰性气体保护和催化剂存在的条件下，5'端保护的炔基修饰脱氧腺苷经过亚磷酰胺化得到炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体。

6.按照权利要求5所述的制备方法,其特征在于，步骤(5)所述催化剂为四氮唑。

7.权利要求1-4中任何一项所述的炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物在制备寡聚核苷酸中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，权利要求1-4中任何一项所述的炔基修饰的脱氧腺苷亚磷酰胺单体化合物可以通过DNA合成仪合成炔基修饰的寡聚核苷酸。

9.按照权利要求7或8所述的应用,其特征在于，所述的炔基修饰的寡聚核苷酸中，炔基修饰的脱氧腺苷为1个或多个。

10.按照权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述的炔基修饰的脱氧腺苷位于寡聚核苷酸链的任意位置。