CN111269967B - 含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体在错配碱基识别中的应用 - Google Patents

含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体在错配碱基识别中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体在错配碱基识别中的应用，属于非天然寡聚核苷酸应用技术领域。本发明将含有丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体构建到人工脱氧核糖核酸中，将天然核酸中部分磷酸二酯键替换为丁二酰胺键，并以此作为探针序列，来检测其互补序列中碱基错配的情况，利用熔点测定实验对含有T‑C的错配单元进行检测，取得了良好的效果，为设计新型检测单元提供了新的研究思路。

Description

含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体在错配碱基识别 中的应用
技术领域
本发明属于非天然寡聚核苷酸应用技术领域，具体涉及一种含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体在错配碱基识别中的应用。
背景技术
单碱基错配是单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)的一种，是导致 DNA突变损伤重要类型之一。如何实现对单碱基错配的检测，对于从分子水平上阐明多种疾病形成的原因，实现基因水平的治疗都具有重要的理论和现实意义。发展具有高灵敏度、高选择性的单碱基错配检测方法是近年来研究的热点领域。常用的单碱基错配检测方法包括凝胶电泳、荧光检测、SPR和质谱检测等。
非天然寡聚核苷酸在基因治疗、生物探针以及生物材料等领域有着极其重要的应用，为了调节核酸的化学和生物稳定性以及各种相关的物理化学性质，人们对核苷中的化学结构进行不同程度的修饰。其中基于磷酸二酯键的化学修饰对于改善核酸的化学和生物学稳定性、调节核酸识别等物理化学性质具有重要意义。近年来人们通过对天然DNA进行化学修饰的到人工DNA，将其用于单碱基错配的检测，取得了良好的效果。
现有技术可以通过荧光、电化学、石英微天平及表面增强拉曼等检测手段检测单碱基错配，但是检测基本原理基于错配碱基的双链DNA在热稳定性上的差异。现有的实验方法多通过引入金属络合物和有机配体，以及采用人工修饰DNA来作为检测单元等手段，来对单碱基错配进行检测。引入金属络合物及某些特定结构的配体对于某些特定碱基错配均表现除了很好的检测灵敏度，但是对于某些特殊类型错配组合，如T-C碱基的特异性错配鲜有报道。通过对核酸骨架进行修饰可以实现对某些特定碱基错配组合的识别，但是成本相对较高。
发明内容
本发明的目的是提供含有丁二酰胺结构的人工脱氧核糖核酸(deoxynucleotides,DNA)，并将其应用于错配碱基识别中，该类人工DNA可对T-C类错配碱基表现出很高的选择性识别。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体在错配碱基识别中的应用。
在上述方案的基础上，将所述含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体构建到人工脱氧核糖核酸中，并以此作为探针来识别靶序列中的碱基错配。
在上述方案的基础上，所述含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体化学结构如下：
Figure BDA0002389460930000021
一种识别错配碱基的人工脱氧核糖核酸，所述人工脱氧核糖核酸序列中含有含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体，所述含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体化学结构如下：
Figure BDA0002389460930000022
使用上述人工脱氧核糖核酸识别错配碱基的方法，是将含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体构建到人工脱氧核糖核酸中，并以此作为探针序列，通过测量探针序列和靶标序列形成DNA双链的熔点温度和熔解过程中的焓变来检测碱基的错配。
一种检测T-C碱基错配的方法，以待测序列的互补序列作为探针序列，在探针序列合成过程中，将待测位点TT碱基用含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体替换，合成含丁二烯胺胺结构的探针序列；测量含丁二烯胺胺结构的探针序列和待测序列形成DNA双链的熔点温度和熔解过程中的焓变；当检测到双链的熔点温度降低≥15℃，或解离熵变降低≥50 kJ/mol时，即可认定为待检测序列中存在T-C碱基错配；
所述含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体化学结构如下：
Figure BDA0002389460930000023
本发明技术方案的优点：
在本发明中，将含有丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体构建到人工脱氧核糖核酸中，将天然核酸中部分磷酸二酯键替换为丁二酰胺键，并以此作为探针序列，来检测其互补序列中碱基错配的情况，利用熔点测定实验对含有T-C的错配单元进行检测，取得了良好的效果，为设计新型检测单元提供了新的研究思路。
附图说明
图1为化合物1的1H-NMR谱图，横坐标为化学位移(chemical shift)，量纲为ppm，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图2为化合物1的ESI质谱谱图，横坐标为质荷比(mass charge ratio)，量纲为a.u.，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图3为化合物2的1H-NMR谱图，横坐标为化学位移(chemical shift)，量纲为ppm，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图4为化合物2的ESI质谱谱图，横坐标为质荷比(mass charge ratio)，量纲为a.u.，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图5为化合物3的1H-NMR谱图，横坐标为化学位移(chemical shift)，量纲为ppm，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图6为化合物3的ESI质谱谱图，横坐标为质荷比(mass charge ratio)，量纲为a.u.，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图7为空白序列DNA的保留时间，横坐标是样品在色谱柱上的保留时间，量纲是分钟 (min)，mAU是毫吸光度单位(m Absorbance Unit)；
图8为含有丁二酰胺结构DNA的保留时间，横坐标是样品在色谱柱上的保留时间，量纲是分钟(min)，mAU是毫吸光度单位(m Absorbance Unit)；
图9为空白序列DNA的分子量，横坐标为质荷比(mass charge ratio)，量纲为a.u.，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图10为3’端含有丁二酰胺结构DNA的分子量，横坐标为质荷比(mass chargeratio)，量纲为a.u.，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图11 为3’端含有丁二酰胺结构DNA的分子量，横坐标为质荷比(mass chargeratio)，量纲为a.u.，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图12 为3’和5’端均含有丁二酰胺结构DNA的分子量，横坐标为质荷比(masscharge ratio)，量纲为a.u.，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图13不同序列在S1核酸酶降解下的凝胶电泳色谱，其中1.空白序列；2.空白序列+S1 核酸酶；3.序列1；4.序列1+S1核酸酶；5.序列2；6.序列2+S1核酸酶；7.序列3；8.序列3+S1核酸酶；9.DNA marker；
图14含有丁二酰胺单元的人工DNA与空白DNA的熔点数据，横坐标为熔解温度(℃)，纵坐标为DNA解离程度，无实际量纲；
图15为图14中A部分的局部放大图；
图16为含有丁二酰胺结构DNA对错配碱基的识别中的焓变，横坐标为错配序列的分类，纵坐标为DNA解离过程的焓变，量纲是千焦每摩尔(kJ/mol)；
图17为探针DNA与错配DNA形成双链的熔点(Tm)曲线；横坐标为DNA融解温度，量纲为摄氏度(℃)；纵坐标为归一化之后的DNA样品的紫外吸光度；
图18为图17中B部分的局部放大图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明中仪器型号及缓冲液配比，如下：
紫外-可见光谱仪型号为Varian Cary 100。
PBS缓冲液的配制方法为：称取8.0g NaCl，0.2g KCl，1.42g Na2HPO4，0.27gKH2PO4于1000mL容量瓶中，加入800mL去离子水，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至1000mL，高温高压条件下灭菌处理，室温下保存备用。
本发明中，有机分子的结构和纯度均由核磁共振氢谱(1H-NMR)和电喷雾电离(ESI-MS)来确定，DNA的结构信息由基质辅助激光电离解析-飞行时间质谱(MALDI-TOF)来确定。
核磁型号为Bruker AMX 400Spectrometer(400MHz)，所用溶剂为氘代氯仿(CDCl3)和氘代二甲亚砜(d6-DMSO)，带TMS内标；ESI质谱型号为Agilent 6510Q-TOF，检测模式为阴离子模式；MALDI-TOF质谱型号为Shimadazu Biotech Axima Performance,检测模式为阴离子模式；高效液相色谱型号为Waters 2695，检测柱型号为XBriageOligonucleotides BEH C18 (2.1mm×50mm；Column
Figure BDA0002389460930000042
2.5um)，淋洗条件如表1所示：
表1
Figure BDA0002389460930000041
Figure BDA0002389460930000051
实施例1
本发明获得了一种非天然寡聚核苷酸的修饰试剂，即含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体，化学结构如下：
Figure BDA0002389460930000052
该单体的合成路线如下：
Figure BDA0002389460930000053
具体步骤：
(a)10mmol齐夫多定溶于50mL无水吡啶中，室温下加入10-20mmol 4,4-二甲氧基三苯基氯甲烷的10mL吡啶溶液，室温下搅拌1-12h；反应液浓缩除去溶剂后加入50mL四氢呋喃，1mL水和1mL三乙胺，氮气保护下85℃反应1-8h，浓缩除去有机溶剂；油状产物溶于100mL乙酸乙酯中，用100mL饱和氯化铵和100mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥；粗产品可直接用于下一步；
将上述制备的产物5-(4,4-甲氧基三苯基甲醚)-3-氨基-β-胸苷10mmol溶于40mL二氯甲烷中，冰浴搅拌下加入10-18mmol丁二酸酐，室温下搅拌1-12h；所得产物以异丙醚重结晶即可得到白色粉末状固体，为化合物1；收率87％。
化合物1的核磁共振氢谱数据如下：
1H-NMR(CDCl3,400MHz):1.51(s,5-Me,3H),2.17-2.36(m,2’H,2H),3.30-3.50 (m,5’H,2H),3.70-3.74(m,3’H,1H),3.75-3.78(m,MeO-,6H),5.29(m,4’H,1H)，6.23-6.25(m,1’H,1H),6.82-6.84(m,ArH,4H),7.23-7.31(m,ArH,9H),7.41-7.58(m,6H,1H)。
化合物1的ESI质谱数据如下：
Formula C35H37N3O9,Calc 643.21，Found 666.25(M+Na+)。
(b)10mmol化合物1，5-20mmol 5'-氨基-β-胸苷，和5-20mmol二环己基碳二酰亚胺，室温下继续搅拌1-24h；加入100mL饱和碳酸氢钠洗涤，有机相无水硫酸钠干燥；产品柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷/乙酸乙酯＝50:1-1:1(体积比)；产品为淡黄色固体粉末，5.18g，即化合物2；收率60％。
化合物2的核磁共振氢谱数据如下：
1H-NMR(d6-DMSO,400MHz):1.36(s,5-Me,3H),2.30-2.51(m,COCH2CH2CO,4H),2.61-2.77(m,2’H,2H),3.40-3.44(m,5’H,2H),3.76-3.79(m,MeO-,6H),4.00(s,3’H,1H),4.70-4.74(m,4’H,1H)，6.30--6.35(m,1’H,1H),6.80-7.40(m,ArH,14H),9.94(s,-COOH,1H)。
化合物2的ESI质谱数据如下：
Formula C45H50N6O12,Calc 866.35,Found 889.35(M+Na+)。
(c)3mmol化合物2和1-3g无水三乙胺溶于30mL无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加3-6mmol 2-O-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺；反应于冰浴下搅拌1h后再于室温下继续搅拌2h，滤除不溶物，滤液以饱和碳酸钠溶液洗涤；有机相无水硫酸钠干燥过夜；浓缩溶剂得到5'端含有4,4-二甲氧基三苯甲基醚和3'端含有2-O-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺的脱氧胸苷(dT)-脱氧胸苷(dT)2.0g(化合物3)，收率65％。
化合物3的核磁共振氢谱数据如下：
1H-NMR(d6-DMSO,400MHz):1.40(s,5-Me,3H),1.76(s,5-Me,3H)1.96-2.11(m,2’H,4H), 2.28-2.32(m,COCH2CH2CO,4H),3.13-3.24(m,3’H,2H),3.25-3.28(m,4’H,2H),3.67-3.83(m, MeO-,6H),3.84-4.43(m,5’H,4H),6.08-6.10(m,1’H,1H)，6.17-6.20(m,1’H,1H),6.83-7.51(m, ArH,14H),8.00-8.27(m,6H,2H),11.27-11.31(m,CONH,1H)。
化合物3的ESI质谱数据如下：
Formula C54H67N8O13P,Calc 1066.44，Found 1065.44(M-H+)，1066.44(M+)。
实施例2
将含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体用于DNA合成过程
合成路线如下：
Figure BDA0002389460930000071
具体步骤：
(d)800mg双胸苷试剂(含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体)溶于 3mL无水乙腈中，氮气保护下转移至ABI394核酸合成仪的端基修饰位试剂瓶中。输入核酸序列：5’-TTC CAC TTA CCA GAT TGA TT-3’，执行1μmol量级的合成；
(e)合成完毕后将固相载体取出，分散在1mL 5-32％甲氨水溶液中，55-75℃下密闭加热1-4h，离心去除不溶物，溶液浓缩即得到粗产物；目标产物通过高效液相色谱分离，并通过MALDI-TOF进行结构信息表征。DNA序列、分子量及HPLC保留时间如表2所示：
表2
Figure BDA0002389460930000072
注：斜体部分含有丁二酰胺结构脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体
实施例3
含有丁二酰胺结构的双胸苷试剂在构建抗酶切人工核酸中的应用
1、含有丁二酰胺结构的双胸苷试剂修饰在人工核酸5’端的合成方法
Figure BDA0002389460930000081
2、含有丁二酰胺结构的双胸苷试剂修饰在人工核酸3’端的合成方法
Figure BDA0002389460930000082
抗酶切人工核酸的合成方法，具体步骤为：
步骤a：800毫克试剂溶于3毫升无水乙腈中，氮气保护下转移至ABI 394核酸合成仪的端基修饰位试剂瓶中。输入核酸序列：5’-TTC CAC TTA CCA GAT TGA TT-3’，执行1μmol 量级的合成。
步骤b：合成完毕后将固相载体取出，分散在1毫升5-32％甲氨水溶液中，55-75℃下密闭加热1-4小时，离心去除不溶物，溶液浓缩即得到粗产物。目标产物通过高效液相色谱分离，并通过MALDI-TOF进行结构信息表征。
表3.DNA序列和分子量
Figure BDA0002389460930000083
Figure BDA0002389460930000091
注：斜体部分含有丁二酰胺结构脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体
3、含有丁二酰胺单元双胸苷结构DNA对外切酶的酶解实验
选用了S1核酸酶，该酶是单链特异性的核酸内切酶，它可以将DNA或者RNA降解成为酸可溶性5’-P核苷酸，最终核酸的90％以上会被降解，其酶切顺序为从3’端或者5’端依次进行酶切。
表4S1核酸酶的使用方法
Figure BDA0002389460930000092
将样品(表3中的核酸序列)分别与S1核酸酶按照上述表格的体积混合均匀，置于恒温下振荡(30℃，500rpm)，振荡反应30min，然后在75℃下灭活10min，降至室温，加入15μL甲酰胺溶液，采用聚丙烯酰胺变性胶进行表征，结果如图13所示。
实验证实，空白序列以及只在序列的一端引入丁二酰胺键的DNA(序列1和2)在加入S1 核酸酶之后可以完全被切割成单核苷，由于酶切后的序列太短，在300V的凝胶电泳条件下，通道2、4、6的核酸条带完全迁移到了凝胶最底部，因此在凝胶中无法观察到DNA条带，而在序列的两端同时引入丁二酰胺键后(序列3)，其DNA的凝胶条带与未加S1核酸酶的序列一致。该酶切实验结果表明，丁二酰胺键的引入可以提高传统DNA对某些核酸酶的抗性。
4、含有丁二酰胺单元双胸苷结构DNA与互补序列的热稳定性实验
将2OD DNA样品用高速离心机离心处理3min，然后加入50μL的超纯水，涡旋混匀后离心，取1μL样品加入150-200μL超纯水，混合均匀后利用紫外-可见光谱进行浓度标定。测试的波长范围是220-320nm，记录260nm处的紫外吸收值，根据朗伯比尔定律A＝εbC即可计算出DNA溶液的浓度。将8μmol/L的DNA样品与探针序列按照等摩尔比在1×PBS缓冲液中进行组装，浓度为4μmol/L，总体积为800μL，组装温度为95℃，组装时间为5min，自然冷却恢复至室温即可认为DNA双链结构组装完成，将组装完成的DNA溶液置于4℃冰箱中保存备用。
通过紫外可见光谱仪进行DNA组装体熔点的表征，如图14所示。仪器参数设置如下：波长为260nm，温度范围为10-80℃，温度变化速度为1℃/min，每个样品循环测试2次，测试结束后温度恢复至25℃。
表5.含有丁二酰胺结构DNA的熔点
Figure BDA0002389460930000101
实施例4
本发明提供一种含有丁二酰胺结构的人工脱氧核糖核酸(DNA)，该人工DNA为引入丁二酰胺结构来替代磷酸二酯键的人工DNA检测序列，对于T-C类碱基错配具有很强的特异性识别。天然DNA结构(A)以及含有丁二酰胺结构DNA结构(B)，如下所示：
Figure BDA0002389460930000102
本发明所提供的含有丁二酰胺结构的人工脱氧核糖核酸，识别错配碱基的方法是，将含有丁二酰胺结构的人工脱氧核糖核酸作为探针序列，来识别靶标序列中碱基错配。其检测方法为，通过变温紫外-可见光谱测量探针序列和靶标序列形成DNA双链的熔点温度(melting temperature,Tm)和熔解过程中的焓变(ΔH)来检测探针序列对错配碱基的识别，可以20kJ/mol 的熔解焓变来识别T-C碱基错配。含有丁二酰胺单元DNA对错配碱基的识别中的焓变。
含有丁二酰胺结构的人工脱氧核糖核酸识别错配碱基
1、样品配置测定方法
将2OD DNA样品用高速离心机离心处理3min，然后加入50μL的超纯水，涡旋混匀后离心，取1μL样品加入150-200μL超纯水，混合均匀后利用紫外-可见光谱进行浓度标定。测试的波长范围是220-320nm，记录260nm处的紫外吸收值，根据朗伯比尔定律A＝εbC即可计算出DNA溶液的浓度。将8μmol/L的DNA样品与探针序列按照等摩尔比在1×PBS缓冲液中进行组装，浓度为4μmol/L，总体积为800μL，组装温度为95℃，组装时间为5min，自然冷却恢复至室温即可认为DNA双链结构组装完成，将组装完成的DNA溶液置于4℃冰箱中保存备用。探针序列、互补序列以及含有错配碱基的序列如表6所示：
表6
Figure BDA0002389460930000111
注：m代表含有错配碱基的序列，TT代表含有丁二酰胺结构的位点，下划线代表错配位点。
2、熔点测定方法及熔点数据
通过紫外可见光谱仪进行DNA组装体熔点的表征。仪器参数设置如下：波长为260nm，温度范围为10-80℃，温度变化速度为1℃/min，每个样品循环测试2次，测试结束后温度恢复至25℃。探针DNA与错配DNA形成双链的熔点(Tm)和焓变(ΔH)，如表7所示。
表7
Figure BDA0002389460930000112
图17显示了探针DNA与错配DNA形成双链的熔点(Tm)曲线，可以看出，对于错配的T碱基或者G碱基，其每条错配DNA序列的焓变值基本相同，证明该类结构修饰对于T-T和 T-G错配碱基的识别无法精准确定错配碱基的数量；但是对于错配的C碱基，每引入一个T-C 碱基错配，其解离焓变较T-G和T-T错配降低约为20kJ/mol，继续引入T-C碱基错配可在原有基础上进一步降低约20kJ/mol的解离焓。综合熔点变化和焓变值的数据分析，可以得出如下实验结论：在检测序列中以丁二酰胺单元取代磷酸二酯键单元，对取代位点处的T-C碱基具有特异性的识别能力。
目前对于T类错配碱基识别中，单个T-G错配的焓变降低一般在3-34kJ/mol之间，单个 T-T错配的焓变降低一般在30kJ/mol左右，而单个T-C错配的焓变降低一般在8-12kJ/mol，但是在使用本发明方法对T-G和T-T碱基错配检测时可以观察到约40kJ/mol的焓降，而对 T-C碱基错配进行检测时，单个错配的焓降约为60kJ/mol，而且第二个T-C错配碱基的识别可在原有基础上继续降低20kJ/mol。由此可见，丁二酰胺结构的引入对于特异性识别T-C碱基错配具有重要价值，当检测到双链的熔点降低≥15℃，或者解离焓降低≥50kJ/mol时，即可认证为待检测序列中存在T-C碱基错配。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (5)

1.含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体在T-C碱基错配识别中的应用；
所述含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体化学结构如下：
Figure FDA0003912408330000011
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将所述含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体构建到人工脱氧核糖核酸中，并以此作为探针来识别靶序列中的碱基错配。
3.一种识别错配碱基的人工脱氧核糖核酸，其特征在于，所述人工脱氧核糖核酸序列中含有含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体，所述含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体化学结构如下：
Figure FDA0003912408330000012
4.使用权利要求3所述人工脱氧核糖核酸识别T-C碱基错配的方法，其特征在于，是将含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体构建到人工脱氧核糖核酸中，并以此作为探针序列，通过测量探针序列和靶标序列形成DNA双链的熔点温度和熔解过程中的焓变来检测T-C碱基的错配。
5.一种检测T-C碱基错配的方法，其特征在于，以待测序列的互补序列作为探针序列，在探针序列合成过程中，将待测位点TT碱基用含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体替换，合成含丁二酰 胺结构的探针序列；测量含丁二酰 胺结构的探针序列和待测序列形成DNA双链的熔点温度和熔解过程中的焓变；当检测到双链的熔点温度降低≥15℃，或解离熵变降低≥50kJ/mol时，即可认定为待检测序列中存在T-C碱基错配；
所述含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体化学结构如下：
Figure FDA0003912408330000021
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含双酰胺键脱氧核糖核酸的构建及其在错配碱基识别中的应用研究;吕环芳;《CNKI硕士学位论文数据库》;20200501;全文 *

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