CN1973048A - 末端磷酸根标记的核苷酸和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用标记的底物或底物类似物测定靶的改进方法,所述方法包括在酶-催化的反应中使所述底物或底物类似物进行反应,仅当底物或底物类似物反应时,产生带有独立地可测定信号的标记部分。本发明特别公开了测定样品中核酸的方法,所述方法基于使用末端-磷酸根-标记的核苷酸作为核酸聚合酶的底物。本发明方法使用核苷多磷酸酯、二脱氧核苷多磷酸酯或脱氧核苷多磷酸酯类似物,它们具有连接于末端磷酸根上的生色染料、化学发光或荧光部分、质量标记或电化学标记。当核酸聚合酶使用这些类似物作为底物时,酶-活化的标记将存在于磷酰基转移的无机多磷酸酯副产品中,磷酰基转移的多磷酸酯产品通过磷酸酯酶的断裂导致其上连接的标记中的可测定变化,当聚合酶试验在磷酸酯酶存在下进行时,提供了实时监测RNA或DNA合成和测定靶核酸的方便的方法。
Description
相关申请
本申请要求美国专利申请号10/358,818(2003年2月5日提交)的优先权,所述申请是美国专利申请号10/113,030(2002年4月1日提交)的部分继续申请。
发明的领域
本发明涉及使用标记的底物或底物类似物测定靶的改进方法。其改进包括在酶-催化反应中使底物或底物类似物进行反应,仅当所述底物或底物类似物反应时,所述反应产生带有独立可测定信号的标记的部分。本发明特别涉及测定样品中多核苷酸的方法,所述方法基于使用末端-磷酸根标记的核苷酸,后者包括三个或多个磷酸根作为核酸聚合酶的底物。使用的标记是染料,染料经过化学变化,并且仅仅在聚合酶的作用下变为产生荧光或颜色的试剂。
发明的背景
在具有高度特异性和灵敏度的样品中测定特定核酸或类似物的方法是公知的,所述方法通常要求首先根据存在的特定靶序列或分析物扩增核酸序列,扩增以后测定扩增的序列,并且进行定量。核酸的通常测定体系包括荧光标记测定、与荧光酶相连的测定体系、抗体-介导的标记测定和放射性标记的测定。
广泛使用的测定方法的一个缺点是需要从最终的标记产品或副产品中分离被标记的起始物,所述分离一般需要凝胶电泳或将靶序列固定在用于测定的膜上,但是测定经常需要很多试剂和/或温育步骤。
已知DNA和RNA聚合酶能够识别和使用在三磷酸根部分的γ位具有修饰或替换的核苷。还已知各种聚合酶识别和使用γ-修饰的核苷酸三磷酸酯(NTP′s)的能力看来随连接γ-磷酸酯的部分而变化。一般来说RNA聚合酶比DNA聚合酶更杂乱。
监测在γ-磷酸根修饰的核苷酸存在下从RNA聚合酶合成RNA的比色试验已经被报道过。在该在先报道中,RNA聚合酶反应在γ-修饰的碱性磷酸酯酶抗性核苷三磷酸存在下进行,后者在其γ-磷酸根处被二硝基苯基基团修饰。当RNA聚合酶反应在这样的γ-修饰的NTP作为单核苷三磷酸酯和均聚模板存在下进行时,发现RNA聚合酶能够识别和使用修饰的NTP。但是当聚合酶反应在碱性磷酸酯酶存在下进行时,它消化磷酰基转移的焦磷酸对-硝基苯基酯羟醛产品(aldo-product),形成生色的对-硝基苯基酯,并且报道了吸收的提高。该测定方法的缺点是在碱性磷酸酯酶存在下实时(real-time)的比色试验仅仅能够使用均聚模板进行。
因此提供在杂聚模板存在下测定RNA的方法是有利的,该方法不限于使用单一末端-磷酸根修饰的核苷酸作为唯一的核苷酸(后者基本上对于磷酸酯酶没有活性),该方法允许使用杂聚模板对于RNA合成的实时监测来进行单管试验。
通常试验中的荧光染料通过在标记实体中处于紧临近它们的分子被猝灭,并且当结构变化,并且猝灭剂被移去或者从染料移开,或者成为没有活性的时产生可测定的信号。在这种情况下产生信号。但是因为猝灭不是绝对的,这种试验的动态范围受到限制。
更有利的是该方法能够提供对于RNA的类似试验,其中在末端-磷酸根上的标记的身份是不同的,允许通过RNA聚合酶更好地识别和使用。另外理想的是末端-磷酸根上的标记可以不同,这样可以进行化学发光和荧光测定,或进行还原电位测定,以及进行改进的生色测定,其中测定仅需要简单和常规的仪器,并且增大动态范围。
由于本领域公知在识别和使用末端修饰的核苷酸时DNA聚合酶比RNA聚合酶较少杂乱,其中末端位置上的部分特性能够极大地影响DNA聚合酶对于核苷酸的特性,提供通过监测DNA聚合酶活性来测定DNA的非放射性方法是更理想的,而且DNA的合成和序列测定能够在单管试验中完成实时监测,以及在核苷酸底物的末端-磷酸根上的标记可以包括化学发光、荧光和生色测定,以及通过质量和还原电位进行分析。
发明的概述
本发明涉及使用标记的底物或底物类似物测定靶的改进方法,所述方法包括在酶-催化反应中使底物或底物类似物进行反应,当底物或底物类似物反应时,所述反应产生仅仅带有独立的可测定信号的标记部分。本发明还提供测定核酸序列存在的方法,包括以下步骤:a)进行核酸聚合酶反应,其中反应包括末端-磷酸根-标记的核苷酸的反应,所述反应结果产生标记的多磷酸酯;b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应产生可测定的物种;和c)测定存在的可测定的物种。
本发明中的磷酸酯酶的定义包括能够断裂磷酸单酯、多磷酸和核苷酸,并且释放出无机磷酸盐的任何酶。在本发明的上下文中,这种酶不断裂末端标记的核苷磷酸酯(即末端-磷酸根-标记的核苷酸对磷酸酯酶基本上不反应)。本文中的磷酸酯酶定义特别包括,但是不限于碱性磷酸酯酶(EC 3.1.3.1)、酸性磷酸酯酶(EC 3.1.3.2)。本文中的核苷酸定义包括天然或修饰的核苷磷酸酯。
本发明还提供测定存在的DNA序列的方法,包括以下步骤:a)在末端-磷酸根-标记的核苷酸存在下进行DNA聚合酶反应,该反应结果产生标记的多磷酸酯;b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应产生可测定的物种;和c)测定存在的可测定的物种。
本发明还提供测定存在的核酸序列的方法,包括以下步骤:(a)在至少一种在多磷酸酯链上有四个或多个磷酸根基团的末端-磷酸根-标记的核苷酸存在下进行核酸聚合酶反应,该反应结果产生标记的多磷酸酯;和(b)测定标记的多磷酸酯。
另外本发明涉及测定核酸序列存在的方法,包括以下步骤:(a)在至少一种在多磷酸酯链上有四个或多个磷酸根基团的末端-磷酸根-标记的核苷酸存在下进行核酸聚合酶反应,该反应结果产生标记的多磷酸酯;(b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应产生可测定的物种;和(c)测定存在的可测定的物种。
本发明的另一方面涉及定量核酸的方法,包括以下步骤:(a)进行核酸聚合酶反应,其中的反应包括末端-磷酸根-标记的核苷酸的反应,该反应结果产生标记的多磷酸酯;(b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应产生可测定的附产品物种,其数量基本上和核酸的数量成比例;(c)测定可测定的物种;和(d)使用已知的标准比较测定结果,确定核酸的数量。
本发明还涉及定量DNA序列的方法,包括以下步骤:(a)在末端-磷酸根-标记的核苷酸存在下进行DNA聚合酶反应,该反应结果产生标记的多磷酸酯;(b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应产生可标记的附产品物种,其数量基本上和DNA序列的数量成比例;(c)测定可测定的物种;和(d)使用已知标准比较测定结果,确定DNA的数量。
本发明另一方面涉及测定核酸序列中单一核苷酸性质的方法,所述方法包括以下步骤:(a)在至少一种末端磷酸根-标记的核苷酸存在下进行核酸聚合酶反应,所述反应结果产生标记的多磷酸酯;(b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应产生可测定的物种;(c)测定存在的可测定的物种;和(d)确定掺入的核苷。
本发明还提供确定核酸序列中单一核苷酸身份的方法,所述方法包括以下步骤:(a)在至少一种多磷酸酯链上有四个或多个磷酸根的末端-磷酸根-标记的核苷酸存在下进行核酸聚合反应,所述反应结果反应产生标记的多磷酸酯;(b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应产生可测定的物种;(c)测定存在的所述可测定的物种;和(d)确定掺入的核苷。
本发明还包括核酸测定药盒,其中所述药盒包括:
(a)至少一种或多种如下式的末端-磷酸根-标记的核苷酸:
其中P=磷酸根(PO3)及其衍生物,n是2或更大;Y氧或硫原子;B是含氮的杂环碱基;S是非环部分、碳环部分或糖部分;L是酶-活化的标记,其中含有适合于在天然或修饰的核苷酸的末端磷酸根上形成磷酸酯、硫酯或氨基磷酸酯键的羟基、巯基或氨基;P-L是磷酰基化的标记,当除去磷酸根时,它优选是独立地可测定的。
(b)至少一种DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶;和
(c)磷酸酯酶。
本发明还提供使用磷酸根标记的核苷酸的试验方法,其中在碱基被掺入到核苷酸中释放标记的焦磷酸根以前,该标记是不可测定的,然后通过适当酶如磷酸酯酶的作用进行测定。因为除非碱基被掺入标记,否则是不可测定的,实验能够以均相形式进行,或者在单一容器中进行,不要求多次添加试剂。另外,不需要分离未反应的试剂,这是因为在未反应的核苷酸中的标记不产生信号。而且因为假如碱基被掺入仅产生信号,系统将有大的动态范围,并且假如使用一个或多个,优选四个不同的标记的核苷酸,试验可以是多重的。
本发明提供新的包括下式的染料多磷酸酯的组合物:
染料-(P)n-P
其中当n是2-5时,染料选自荧光的、有色的、发荧光的、生色的、发光的染料或电化学标记;当n是1-5时,染料是发荧光的或发光的部分或电化学标记。
附图的建议说明
图1显示在模板-定向的方法中,于磷酸酯酶存在下通过利用γ-磷酸根-标记的ddGTP中的聚合酶得到的荧光。
图2表示在模板-定向方法中,于磷酸酯酶存在下通过利用γ-磷酸根-标记的ddATP中的聚合酶得到的荧光。
发明的详细说明
本文定义的术语″核苷″是包括嘌呤、去氮杂嘌呤、嘧啶或在1′位或等价位置上连接到糖或糖替代物上的修饰的碱基,如碳环或非碳环的部分,包括2′-脱氧和2′-羟基以及2′,3′-二脱氧形式以及其它的取代。
本文定义的术语″核苷酸″是指核苷的磷酸酯,其中的酯化位点通常是连接到戊糖的C-5位的羟基。
本文定义的术语“寡核苷酸″包括核苷酸或其衍生物的线型低聚体、脱氧核糖核苷、核糖核苷等。在全部说明书中,寡核苷酸是用字母的序列表示的,核苷酸是从左到右的5′-3′的顺序,除非另有说明,其中A是脱氧腺苷,C是脱氧胞苷,G是脱氧鸟苷,T是胸苷。
术语″引物″是指线型寡核苷酸,它以特定的方式退火为单一的核酸序列,并且可以扩增该序列。
术语″靶核酸序列″等是指其序列特性或核苷的顺序或位置由一种或几种本发明的方法确定的核酸。
术语多磷酸根是指两个或多个磷酸根。
术语发光的部分是指仅当活化时产生化学发光信号的化学部分。
本发明涉及测定样品中多核苷酸的方法,其中使用常规的试验通过核酸聚合酶活性监测RNA或DNA的合成。RNA和DNA聚合酶合成寡核苷酸,通过从核苷三磷酸酯(NTP)或脱氧核苷三磷酸(dNTP)将核苷单磷酸酯转移到增长的核苷酸链的3′羟基上来进成,该反应的驱动力是酸酐键的断裂和同时的无机焦磷酸盐的形成。
本发明发现核苷酸的末端-磷酸根的结构修饰没有消除其在聚合酶反应中的功能,寡核苷酸的合成反应包括仅仅在核苷酸的α-和β-磷酰基上的直接变化,使得在末端磷酸根位置有修饰的核苷酸作为核酸聚合酶反应的底物是有价值的。
在某些实施方案中,聚合酶是DNA聚合酶,如DNA聚合酶I、II、或III或DNA聚合酶α-、β-、γ或末端脱氧核苷酸转移酶或末端转移酶。在另一实施方案中,合适的聚合酶包括但是不限于依赖于DNA的RNA聚合酶、引发酶或依赖于RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)。
本发明提供的方法使用核苷多磷酸酯,如脱氧核苷多磷酸酯、二脱氧核苷多磷酸酯、碳环核苷多磷酸酯或非环核苷多磷酸酯类似物,并且带有连接到末端-磷酸根的电化学标记、质量标记或生色染料、化学发光标记或荧光标记。当核酸聚合酶使用这种类似物作为底物时,酶-可活化的标记将存在于磷酰基转移的无机多磷酸酯副产品中。磷酰基转移的多磷酸酯产品通过磷酸酯酶的断裂导致在其上连接的标记中的可测定的变化。应该注意RNA和DNA聚合酶能够识别带有修饰的末端磷酰基的核苷酸,本发明人确信这种原料不是磷酸酯酶的模板。以下的结构式表示本发明中的最相关的分子;即末端-磷酸根-标记的核苷酸,标记的多磷酸酯副产品和酶-活化的标记。
上式中n是1或更大,R1和R2独立地是H、OH、SH、SR、OR、F、Br、Cl、I、N3、NHR或NH2;B是核苷碱基或修饰的杂环碱基;X是O、S或NH;Y是O、S或BH3;L是磷酸酯酶可活化的标记,它可以是生色的、发荧光的、或是化学发光的分子、质量标记或电化学标记。质量标记是适合于质谱仪的小分子量部分,由于质量不同而很容易区别于其它组分。电化学标记是容易氧化或还原的物种。已经发现当n是2或更大时,与当n是1时比较,核苷酸是聚合酶的显著更好的底物。因此在优选的实施方案中,n是2、3或4,R1和R2独立地是H或OH;X和Y是O;B是核苷酸碱基和L是可以生色的、发荧光的或化学发光的分子的标记。
在本文提供的测定核酸序列存在的方法的一个实施方案中,其步骤包括:(a)进行核酸聚合酶反应,其中反应包括末端-磷酸根-标记的核苷酸,其中的聚合酶反应结果产生标记的多磷酸酯;(b)使标记的多磷酸酯和适合于水解磷酸酯的磷酸酯酶反应,产生可测定的物种;和c)通过适当的方式测定可测定物种的存在。在所述实施方案中,用于核酸聚合酶反应的模板可以是杂聚的或均聚的模板。在全部说明书中,通过末端-磷酸根-标记的核苷酸,在将核苷单磷酸酯掺入到增长的核苷酸链中后同时释放的标记的多磷酸酯,可以和磷酸酯酶反应产生可测定的物种。包括在实质上对磷酸酯酶不反应的反应中的其它核苷酸可以例如在末端-磷酸根处被不导致产生可测定物种的部分阻断。在该特定的实施方案中,用于测定的核酸可以包括RNA、天然或合成的寡核苷酸、线粒体或染色体DNA。
本发明进一步提供测定DNA序列存在的方法,其步骤包括:(a)在末端-磷酸根标记的核苷酸存在下进行DNA聚合酶反应,其中反应包括末端-磷酸根-标记的核苷酸,该反应结果产生标记的多磷酸酯;(b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应,产生可测定的物种;和c)测定所述可测定物种的存在。用于测定的DNA序列可以包括从细胞游离出来的DNA、化学处理的DNA例如二硫化物(bisulfite)处理的甲基化DNA或按照本领域公知方法化学或酶促合成的DNA。所述方法包括PCR,并且记载于
DNA结构部分A:DNA的合成和物理分析(Lilley,D.M.J.和Dahlberg,J.E.(Eds.),Methods Enzymol.,211,Academic Press,Inc.,New York(1992)),将其作为本文的参考。DNA序列还包括染色体DNA和天然或合成的寡核苷酸,DNA可以是双-或单-链的。
本发明的方法还包括在聚合酶反应中含有一个或多个附加的测定试剂的步骤。附加的测定试剂可以是能够应答的,在测定时区别于可测定的物种,例如附加的测定试剂可以是抗体。
在聚合酶反应中作为底物加入的合适的核苷酸包括核苷多磷酸酯,例如包括但是不限于脱氧核糖核苷多磷酸酯、核糖核苷多磷酸酯、二脱氧核苷多磷酸酯、碳环核苷多磷酸酯和非环核苷多磷酸酯及其类似物。特别理想的是在多磷酸酯链上含有3、4、5或6个磷酸根基团的核苷酸,其中末端磷酸酯是被标记的。
应该注意,在包括多磷酸酯链上有四个或多个磷酸根的末端-磷酸根-标记的核苷酸的实施方案中,磷酰基转移的标记的多磷酸酯副产品可以不使用磷酸酯酶处理进行测定,其属于本发明期望的范围。例如天然或修饰的核苷碱基,特别是鸟嘌呤能够引起荧光标记的猝灭,因此在末端-磷酸根-标记的核苷酸中,标记可以部分地被碱基猝灭。由于加入核苷单磷酸酯,标记的多磷酸酯副产品由于其提高的荧光度而可以被测定。另外在通过荧光、颜色、化学发光或电化学测定鉴定以前,通过色谱分离方法机械地分离标记的多磷酸酯产品是可能的,此外质谱方法通过质量差别能够用于测定产品。
本发明方法包括在至少一种DNA或RNA聚合酶存在下进行聚合酶反应,合适的核酸聚合酶包括引发霉、端粒酶、末端脱氧核苷酸基转移酶和逆转录酶。需要核酸模板用于进行聚合酶反应,并且可以加入到聚合酶反应溶液中。可以预期在本发明测定方法中的所有的步骤(a)、(b)和(c)能够使用单一的均相的反应混合物同时进行,以及按顺序进行。
在本发明考虑的范围内,核酸聚合酶反应可以包括使用聚合酶的扩增方法。这种方法的实例包括聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)和核酸序列碱基扩增(NASBA)。例如其中靶分子是核酸聚合物如DNA时,它可以通过PCR将γ-磷酸根标记的核苷酸碱基例如腺嘌呤、胸腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或其它氮杂环碱基掺入到DNA分子中而被测定。聚合酶链反应(PCR)方法记载于
Science Vol.239,P.487,1988,(Saiki等),U.S.Patent 4,683,195(Mullis等)和
Molecular Cloning,(第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY(1980)(Sambrook J.等(Eds.)),
Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,Inc.,NY(1999)(Ausubel,F.M.等(Eds.))和
Recombinant DNA Methodology II,Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.,NY,(1995)(Wu,R.(Ed.))。使用PCR通过将用于测定的靶核酸如DNA直接放入含有PCR试剂和适当引物的反应器中来对它进行扩增。通常选择在序列上至少和靶核酸的部分是互补的引物。
应该注意,适合于进行本发明方法的步骤(a)的核酸聚合酶反应还包括扩增核酸序列的各种RCA方法,例如公开于U.S.专利5,854,033(Lizardi,Paul M.)的方法可以作为本文的参考。聚合酶反应还包括基于核酸序列的扩增(NASBA),其中该体系包括RNA而不是DNA的扩增,并且扩增是等温的,发生在同一温度(41℃)。通过NASBA的靶RNA的扩增包括三种酶的协同活性:逆转录酶、RNA酶H和T7 RNA聚合酶,与寡核苷酸引物一起定向到样品靶RNA上,这些酶在四个步骤中催化靶单链RNA的指数式扩增:四个步骤是扩展、降解、DNA合成和环状RNA扩增。
室温-PCR、RCA和NASBA的方法通常需要间接通过定量扩增产品来测定靶核酸的起始数量。一般首先从起始物通过在琼脂凝胶上的电泳分离扩增产品,以便确定成功的扩增,然后使用任何方便的核酸测定体系,如测定荧光标记、酶-联合测定体系、抗体-介导的标记测定和放射性标记测定进行定量。相比之下,本发明的方法在能够测定这些产品以前不需要从原料中分离聚合酶反应产品。例如在本发明中报道分子(荧光,化学发光或生色)或其它有用分子以如下的方式连接核苷酸,使得当被磷酸根结合掩蔽时在某些条件下它是不能测定的。但是随着将核苷酸掺入增长的寡核苷酸链和用磷酸酯酶处理反应,在所述条件下标记又是可以测定的。例如假如1,3-二氯-9,9-二甲基-吖啶-2-酮(DDAO)的三环结构一侧上的羟基连接到核苷酸的末端-磷酸根位置,DDAO在659nm处将不发荧光。一旦核苷单磷酸酯掺入到DNA中,另一产品DDAO多磷酸酯(它在659nm也不发荧光)即是磷酸酯酶的底物,一旦去-磷酰基化形成DDAO,染料部分将变得在659nm处发出荧光,因此是可以测定的。多磷酸酯产品的特定分析能够在聚合酶反应溶液中进行,不需要从原料中分离反应产品,所述方式允许测定,并且能够任选地在聚合反应期间使用常规仪器如光谱仪来定量形成的核酸。
在上述方法中,聚合酶反应步骤可以进一步包括在磷酸酯酶存在下进行聚合酶反应,该反应将多磷酸酯副产品转化为可测定的标记。这样就可以设计方便的试验以测定存在的核酸序列,允许连续监测可测定物种的形成。这表示均相试验方式能够在单一试管中进行。
上述试验方法的一个方式包括,但是不限于在单一类型的、能够传送可测定物种的末端-磷酸根-标记的核苷酸存在下进行聚合酶反应,例如末端-磷酸根-修饰的ATP,其中所有其它核苷酸实质上对磷酸酯酶是没有活性的,但是能够产生非-可测定物种。
在另一试验方式中,聚合酶反应可以在多于一种类型的末端-磷酸根-标记的核苷酸存在下进行,每种类型能够产生单一的可测定物种。例如试验包括第一核苷酸(即腺苷多磷酸酯),它和第一标记结合,当从磷酰基转移的无机多磷酸酯副产品中酶促游离出来时,所述标记在第一波长处发光;并且第二核苷酸(即鸟苷多磷酸酯)结合第二标记,后者在第二波长处发光。理想的是第一和第二波长发射基本上较少重叠或不重叠。在本发明预期的范围内还包括基于核苷酸序列信息的多个同时试验可以在其后基于从多磷酸酯释放的特定标记而衍生得到。
在上述测定核酸序列存在的方法的另一方面中,末端-磷酸根-标记的核苷酸可以用下式(式I)表示:
其中P=磷酸根(PO3)及其衍生物;n是2或更大;Y是氧或硫原子;B是含氮杂环碱基;S是非环部分,碳环部分或糖部分;L是酶-活化的标记,它在天然或修饰的核苷酸中的末端磷酸根上含有适合形成磷酸酯、硫酯或氨基磷酸酯键的羟基、巯基或氨基;P-L是磷酰基化标记,当磷酸酯被除去以后它变为可独立地测定的。
除了磷酸酯水解,很多其它类型的反应是能够生色的、发荧光的或结果产生独立地可测定的标记。例如糖苷酶能够作用于生色糖苷,如作用在X-gal(溴氯吲哚基糖苷)上的β-半乳糖苷酶。蛋白酶和肽酶能够作用于酯和酰胺如N-酰基罗丹明。本发明的其它方面是使用于作为靶的报道分子的那些其它类型的反应。在靶存在下使用底物类似物(它们能够转化为这些酶的报道底物)是本发明公开的方法中的另一个实例。
对于本发明方法的目的,有用的碳环部分记载于Ferraro,M.和Gotor,V.的
Chem Rev.2000,volume 100,4319-48;合适的糖部分记载于Joeng,L.S.等人的
J Med.Chem.1993,vol.356,2627-38;Kim H.O.等人的
J Med.Chem.193,vol.36,30-7;和EschenmosserA.的
Science 1999,vol.284,2118-2124。另外有用的非环部分记载于Martinez,C.I.等人的
Nucleic Acid Research 1999,vol. 27,1271-1274;Martinez,C.I.等人的
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 1997,vol.7,3013-3016;和U.S.Patent5,558,91(Trainer,G.L.)。这些部分的结构表示如下,其中对于所有的部分R可以是H、OH、NHR、F、N3、SH、SR、OR、低级烷基或芳基;对于糖的部分X和Y独立地是O、S或NH;对于酰基部分X=O、S、NH、NR。
碳环部分
糖部分
非环部分
在某些实施方案中,式I中的糖部分可以选自:核糖基、2′-脱氧核糖基、3′-脱氧核糖基、2′,3′二脱氢二脱氧核糖基、2′,3′-二脱氧核糖基、2′-或3′-烷氧基核糖基、2′-或3′氨基核糖基、2′-或3′-氟核糖基、2′-或3′-巯基核糖基、2′或3′烷硫基核糖基、非环、碳环和其它修饰的糖。
而且式I中的碱基可以包括尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、次黄嘌呤、7-脱氮次黄嘌呤、腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2,6-二氨基嘌呤或其类似物。
而且末端磷酸根标记的核苷酸能够用于标记,它将不发射信号,除非并且直到碱基被掺入到核苷酸中,因此释放多磷酸酯,然后能够被酶如磷酸酯酶作用,产生可测定的信号。在这种系统中,当碱基被掺入时,标记将经受化学变化从没有活性(非-可测定的)形式变为(可测定的)形式,因此提供了关于掺入的碱基的性质的情报。因为颜色仅仅依赖于反应而产生,产生的信号基本上没有本底,这样就提供了扩大的试验动态范围。假如需要,两种或多种不同的标记的核苷酸可以被一次性加入,使得试验是多重的。
如下所述标记是生色的或者是发荧光的,但是不必须包括任何猝灭剂。而且当优选用于如本文所述的核苷酸测列或表征试验时,应该理解这些末端磷酸根标记的核苷酸能够和其它的结合分子如抗体或半抗原轭合,允许这种类型的均相亲和试验以多重方式进行。
在一般的试验中,一个或多个末端标记的核苷酸处在反应混合物中,假如存在的话,互补的碱基通过核酸聚合酶被掺入到序列中;这导致释放染料标记的多磷酸酯,然后它能够通过另一酶的作用被测定,优选磷酸酯酶,更优选河虾碱性磷酸酯酶、牛小肠碱性磷酸酯酶、大肠杆菌碱性磷酸酯酶或海洋红嗜热盐菌碱性磷酸酯酶。标记然后能够通过合适的比色或荧光比色方法被测定。
在末端-磷酸根-标记的核苷酸中,连接于末端-磷酸根位置的标记可以选自1,2-二氧杂环丁烷化学发光化合物、荧光染料、生色染料、质量标记和电化学标记。它们允许可测定的物种通过存在的任何一个颜色、荧光发射、化学发光、质量变化、电化学测定或其组合被测定。
式I中的磷酰基化的标记是发荧光的部分,它理想地选自以下(全部以磷酸单酯表示):2-(5′-氯-2′-磷酰氧基苯基)-6-氯-4-(3H)-喹唑啉酮,商品名为ELF 97的固体(Molecular Probes,Inc.)、荧光素二磷酸酯(四铵盐)、荧光素3′(6′)-O-烷基-6′(3′)-磷酸酯、9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(二铵盐)、4-甲基伞形酰基磷酸酯(游离酸)、试卤灵磷酸酯、4-三氟甲基伞形酰基磷酸酯、伞形酰基磷酸酯、3-氰基伞形酰基磷酸酯、9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基磷酸酯、6,8-二氟-4-甲基伞形酰基磷酸酯及其衍生物。所述染料的结构表示如下:
2-(5′-氯-2′-磷酰氧基苯基)-6-氯-4-(3H)-喹唑啉酮
荧光素二磷酸酯 荧光素3′(6′)-O-
烷基-6′(3′)-磷酸酯
9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(二铵盐)
4-甲基伞形酰基磷酸酯
6,8-二氟-4-甲基伞形酰基磷酸酯
4-三氟甲基伞形酰基磷酸酯
伞形酰基磷酸酯
3-氰基伞形酰基磷酸酯
试卤灵磷酸酯
9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基磷酸酯
其中上述式I中的磷酰基标记部分是生色部分,它可以选自以下:5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、3-吲哚氧基磷酸酯、对-硝基苯基磷酸酯及其衍生物。这些生色染料的结构作为磷酸单酯表示如下:
5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(二钠盐)
3-吲哚基磷酸酯(二钠盐)
对-硝基苯基磷酸酯
在末端-磷酸根位置的部分还可以是化学发光化合物,其中它是磷酸酯酶-活化的1,2-二氧杂环丁烷化合物是理想的。1,2-二氧杂环丁烷化合物可以包括,但是不限于2-氯-5-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-(5-氯-)三环[3,3,1-13,7]-癸-1-基)-1-苯基磷酸酯二钠盐,CDP-Star(商品名)(Tropix,Inc.,Bedford,MA)、氯金刚烷-2′-亚基甲氧基苯氧基磷酰基二氧杂环丁烷,CSPD(商品名)(Tropix),和3-(2′-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧杂环丁烷,AMPPD(商品名)(Tropix)。这些市场上可以买到的二氧杂环丁烷化合物分别记载于US专利5,582,980、5,112,960和4,978,614,并且作为本文的参考。
上述方法还包括定量核酸序列的步骤。在一个相关的方面中,可测定的物种能够以实质上和扩增的核酸序列数量成比例的数量产生。定量核酸序列的步骤通过将测定物种得到的光谱和已知光谱进行比较来完成是理想的。
在一个实施方案中,本发明提供定量核酸的方法,包括以下步骤:(a)进行核酸聚合酶反应,聚合酶反应包括核苷酸的反应,它基本上对磷酸酯酶是没有活性的,除了对至少一个末端-磷酸根-标记的核苷酸以外,其中反应结果产生标记的多磷酸酯;(b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应产生可测定的副产品物种,其数量基本上和被定量的核酸的数量成比例;(c)测量可测定的物种;和(d)使用公知的标准比较测定结果,以确定核酸的数量。在定量核酸方法的该实施方案中,被定量的核酸可以是RNA。核酸也可以是天然或合成的寡核苷酸、染色体DNA或DNA。
本发明还提供定量DNA序列的方法,包括以下步骤:(a)在末端-磷酸根-标记的核苷酸存在下进行DNA聚合酶反应,其中反应结果产生标记的多磷酸酯;(b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应产生可测定的副产品物种,其数量基本上和被定量的DNA序列的数量成比例;(c)测量可测定的物种;和(d)使用公知标准比较测量结果以便确定DNA的数量。在该实施方案中,被定量的DNA序列可以包括天然的或合成的寡核苷酸,或从细胞中分离的DNA,包括染色体DNA。
在一个上述定量核酸序列的方法中,聚合酶反应步骤进一步包括在磷酸酯酶存在下进行聚合酶反应,如以上说明书中所述,这将允许核酸聚合酶活性的实时监测,因此允许定量的靶核酸序列的实时测定。
本文提供的用于定量核酸序列方法的末端-磷酸根-标记的核苷酸用上述式I表示。酶-活化的标记通过磷酸酯酶的活性变得可测定,所述磷酸酯酶改变了在标记和天然或修饰的核苷酸的末端-磷酸酯之间的磷酸酯键,其方式是产生可测定的物种。可测定的物种可以通过任何一个颜色、荧光发射、化学发光、质量差别或电化学潜能或其组合的存在而被测定。如上所述酶活化的标记可以是1,2-二氧杂环丁烷化学发光化合物、荧光染料、生色染料、质量标记或电化学标记或其组合。合适的标记是和上述那些相同的。
如在实施例部分将进一步详细描述的,本发明提供测定在靶核酸序列中的单一核苷酸的方法,所述方法包括以下步骤:(a)在至少一种末端磷酸根标记的核苷酸存在下进行核酸聚合酶反应,反应结果产生标记的多磷酸酯;(b)使标记的多磷酸酯和磷酸酯酶反应产生标记的物种;(c)测定存在的标记的物种;和(d)确定被掺入的核苷。在所述实施方案中末端磷酸根-标记的核苷酸在多磷酸酯链中包括四个或多个磷酸酯。
本发明另一方面涉及核酸测定药盒,包括:
a)至少一种或几种下式的末端-磷酸根-标记的核苷酸:
其中P=磷酸根(PO3)及其衍生物;n是2或更大;Y是氧或硫原子;B是含氮杂环碱基;S是非环部分、碳环部分或糖部分;其中L是酶-活化的标记,它在天然或修饰的核苷酸中的末端磷酸根上含有适合形成磷酸酯、硫酯或氨基磷酸酯键的羟基、巯基或氨基;P-L是磷酰基化标记,当磷酸根被除去以后它变为可独立地测定;
b)至少一种DNA聚合酶,RNA聚合酶或逆转录酶;
c)磷酸酯酶。
在上述药盒中末端-磷酸根-标记的核苷酸中的糖的部分包括,但是不限于核糖基、2′-脱氧核糖基、3′-脱氧核糖基、2′,3′-二脱氧核糖基、2′,3′-二脱氢二脱氧核糖基、2′-或3′-烷氧基核糖基,2′-或3′-氨基核糖基、2′-或3′-氟核糖基、2′-或3′-巯基核糖基,2′-或3′-烷硫基核糖基、非环、碳环和其它修饰的糖。
碱基可以是,但是不限于尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、次黄嘌呤、7-脱氮次黄嘌呤、腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2,6-二氨基嘌呤或其类似物。
而且如上所述,酶-活化的标记可以是1,2-二氧杂环丁烷化学发光化合物、荧光染料、生色染料、质量标记、电化学标记或其结合。在核苷酸的末端-磷酸根位置偶联的合适的化合物和上述的那些相同。
实施例
实施例1
制备γ-(4-三氟甲基香豆素基)ddGTP(γCF3香豆素-ddGTP)
将ddGTP(200μl,46.4mM溶液,纯度>96%)和无水二甲基甲酰胺(DMF,2×0.5ml)一起共同蒸发,往其中加入二环己基碳化二亚胺(DCC,9.6mg,5当量),再将混合物和无水DMF(0.5ml)共同蒸发,然后在无水DMF(0.5ml)中处理残留物,将混合物搅拌过夜。还剩余约20%未环化的三磷酸酯(可能是来自环状三甲基磷酸酯在柱上的水解)。向混合物中加入另外2当量DCC,搅拌2小时以后,加入7-羟基-4-三氟甲基香豆素(4-三氟甲基伞形酮,42.7mg,20当量)和三乙胺(26μI,20当量),将混合物在室温下搅拌,2天以后,HPLC(在0.1M三乙基铵乙酸盐(TEAA)中的0-30%乙腈/15分钟,30-50%乙腈/5分钟和50-100%乙腈/10分钟,C18 3.9×150mm柱,流速1ml/分钟)显示在9.7分钟有新的产品和起始的环状三磷酸酯(在254nm下比例为77∶5)。再搅拌混合物1天,P-31 NMR显示γ-标记的核苷-三磷酸酯作为反应混合物的主要成分。
用旋转蒸发器浓缩反应混合物,用水(5×1ml)萃取残留物,HPLC显示纯度在254nm处为82%和在335nm处为81%。用旋转蒸发器浓缩混合的水溶液,并且溶解在水(1ml)中,在1英寸×300cm C18柱上,使用在0.1M三乙基铵碳酸氢盐中的0-30%乙腈(TEAB,pH8.3)/30min和30-50%乙腈/10min、15ml/min流速提纯,将产品峰收集在3个馏分中,除了通过鼓入CO2将TEAB缓冲液的pH降低到6.7以外,使用如上述相同的制备HPLC方法再提纯馏分1。将产品峰浓缩,使用MeOH(2倍)和水(1倍)共同蒸发。将样品溶解在1ml水中,HPLC显示在254处和在335nm处的纯度>99%。UV显示浓度为2.2mM,假设消光系数在322nm处是11,000(报道的对于7-羟基-4-三氟甲基香豆素的β半乳糖苷衍生物,分子探针目录),MS:M-=702.18(计算值702.31),UVλA=253,276 & 322nm。连接到ddGTP的γ-磷酸根上的三氟香豆素染料以322nm的最大激发和约415nm的最大发射发荧光,磷酸酯水解后释放香豆素染料,光谱发生变化,最大激发约为385nm和最大发射约为502nm,这种变化很容易通过样品的荧光测定或颜色变化来测定。γ核苷酸的合成被Arzumanov一般性地描述(A.et al.in J Biol Chem(1996)Oct 4;271(40):24389-94)。
γ-(4-三氟甲基香豆素基)二脱氧鸟苷-5′-三磷酸酯(γCF3香豆素-ddGTP)
实施例2
制备γ-(3-氰基香豆素基)ddATP(γ-CN香豆素-ddATP)
将ddATP(100μl,89mM溶液,>96%)和无水DMF(2×1ml)共同蒸发,往其中加入DCC(9.2mg,5当量),搅拌混合物,再和无水DMF(1ml)共同蒸发,用无水DMF(O.5ml)处理残留物,于室温搅拌反应过夜以后加入7-羟基-3-氰基香豆素(33.3mg,20当量)和TEA(25p.1,20当量)。将混合物于室温下搅拌1天以后在8.1分钟时观察到主要产品(55%,在254nm处)和在10分钟(大约10%)观察到另一次要产品,一天以后没有观察到大的变化。
将反应混合物用旋转蒸发器浓缩,用3×2ml水萃取残留物并且过虑,浓缩水溶液,在C-18上提纯,使用0.1M TEAB中的0-30%乙腈(pH6.7)/30min,30-50%乙腈/10min,流速15ml/min。将主峰收集在3个馏分中,主峰的HPLC(fr.2)显示纯度在254nm处为95.6%,在335nm处为98.1%。用旋转蒸发器(室温)浓缩,将MeOH(2x)及水(1x)共同蒸发,将残留物溶解在0.5ml水中,把5μl样品稀释到1ml进行UV分析,346nm=0.784,假设消光系数为20,000(报道的对于7-乙氧基-3-氰基香豆素的,分子探针目录),浓度=7.84mM,产量=3.92μmol,44%。使用上述同样的方法在C-18柱上再提纯样品。将样品峰收集在3个馏分中,将纯度>98%(254nm)和纯度>99.5%(340nm)的馏分2和3混合,浓缩以后将残留物和MeOH(2x)及水(1x)共同蒸发。将样品溶解在水(1ml)中得到2.77mM的溶液。MS:M-=642.98au(计算值643.00au),UVSA=263 & 346nm,连接到ddATP的γ-磷酸根上的氰基香豆素染料以346nm的最大激发和约411nm的最大发射发荧光。由于磷酸酯水解释放香豆素染料,光谱发生变化,最大激发约为408nm和最大发射约为450nm,这种变化很容易通过测量样品的荧光和颜色变化来测定。γ-核苷酸的合成被Arzumanov,A等人一般性地描述(J Biol Chem.(1996)Oct4;271(40):24389-94)
γ-(3-氰基香豆素基)二脱氧腺苷-5′-三磷酸酯(γ-CN香豆素-ddATP)
实施例3
制备8-9H(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)-二脱氧胸苷-5′-四磷酸酯(ddT4P-DDAO)
将ddTTP(100gel,80mM溶液)和无水二甲基甲酰胺(DMF,2×1ml)共同蒸发,往其中加入二环己基碳化二亚胺(8.3mg.5当量),将混合物再和无水DMF(1ml)共同蒸发,用无水DMF(1ml)处理残留物,将反应物于室温搅拌过夜,HPLC显示出大部分环化的三磷酸酯(-82%)。浓缩反应混合物,用无水乙醚洗涤残留物三次,再溶解于无水DMF中,用旋转蒸发器浓缩致干,用DDAO-单磷酸酯、铵盐(5mg,1.5当量)在200μl无水DMF中浸取残留物,于40℃搅拌一周,HPLC显示形成了新的产品,具有理想的在11.96分钟处的UV特征。(HPLC方法:在0.1M三乙基铵乙酸盐中的0.30%乙腈(pH7)/15min,30-50%乙腈/5min,Novapak C-18 3.9×150mm柱,1ml/min)。LCMS(ES-)也显示M-1峰的主峰834。浓缩反应混合物,在DeltapakC18,19×300mm柱上提纯,使用0.1M TEAB(pH6.7)和乙腈。用HPLC再提纯产品的馏分,按照上述相同的方法。浓缩纯的产品馏分,和MeOH(2x)及水(1x)共同蒸发,将残留物溶解在水(1.2ml)中,得到1.23mM的溶液。HPCL纯度>97.5%(在254nm处),>96%(在455nm处);UVBA=267nm和455nm;MS:M-1=834.04(计算值8.33.95)。
以同样的方式合成并提供了δ-9H(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)-二脱氧胞苷-5′-四磷酸酯(ddC4P-DDAO)、δ-9H(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮二脱氧腺苷-5′-四磷酸酯(ddA4P-DDAO)和δ-9H(1,3-二氯-9,9二甲基吖啶-2-酮-7-基)-二脱氧鸟苷-5′-四磷酸酯(ddG4P-DDAO)。分析这些提纯的化合物得到以下数据:ddC4P-DDAO:UVλA=268nm和454nm;MS:M-1=819.32(计算值818.96);ddA4P-DDAO:UVλA=263nm和457nm;MS:M-1=843.30(计算值842.97);ddG4P-DDAO:UVA=257nm和457nm;MS:M-1=859.40(计算值858.97)。
ddT4P-DDAO
ddC4P-DDAO
ddA4P-DDAO
ddG4P-DDAO
实施例4
制备ε-9H(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)-二脱氧胸苷-5′-五磷酸酯DDAO-ddT-五磷酸酯(ddT5P-DDAO)
A.DDAO焦磷酸酯的制备
将DDAO-磷酸酯二铵盐(11.8μmol)和无水DMF(3×0.25ml)共同蒸发,溶解在DMF(0.5ml)中,往其中加入羰基二咪唑(CDI,9.6mg,5当量),将混合物于室温下搅拌过夜,通过加入MeOH(5F1)除去过量的CDI,搅拌30分钟,往该混合物中加入磷酸二氢三丁基铵(10当量,236ml(0.5M溶液,DMF中),于室温搅拌混合物4天,用旋转蒸发器浓缩反应混合物,在HiPrep 16.10 Q XL柱上提纯残留物,使用0-100%B,使用0.1MTEAB/乙腈(3∶1)作为缓冲液A和使用1M TEAB/乙腈(3∶1)作为缓冲液B。收集主峰(HPLC纯度98%),浓缩并且和甲醇(2x)共同蒸发,将残留物溶解在1ml水中得到5.9mM的溶液,UV/VISλmax=456nm。
B.ddT5P-DDAO的制备
将ddTTP(100μl的47.5mM溶液,水中)和无水DMF(2×1ml)共同蒸发,往其中加入DCC(5当量,4.9mg),将混合物和DMF(1×1ml)共同蒸发,使用无水DMF(0.5ml)处理残留物,于室温搅拌3小时,往其中加入1.03含水的DDAO焦磷酸酯(DMF溶液),和无水DMF(2×1ml)共同蒸发,将混合物浓缩致干,使用200μl无水DMF处理,将混合物于38℃加热2天,浓缩反应混合物,用水稀释,过虑并且在HiTrap 5ml离子交换柱上提纯,使用0-100%A-B,使用2步骤梯度,溶剂A=0.1M TEAB/乙腈(3∶1),溶剂B=1M TEAB/乙腈(3∶1),合并馏分12×13(含有大量产品),浓缩并且和甲醇(2x)共同蒸发,在Xterra RP C-18 30-100mm柱上提纯残留物,使用5柱体积的0.1M TEAB中的0.30%乙腈,和2柱体积的0.1M TEAB中的30-50%乙腈,流速为10ml/min,浓缩含有纯产品的馏分,并且和甲醇(2x)及水(1x)共同蒸发,HPLC纯度(455nm)>99%,UV/VIS=268nm和455nm.MS:M-1=914.03(计算值913.93)。
连接到这些多磷酸酯的γ-磷酸根上的DDAO染料以455nm的最大激发和约608nm的最大发射发荧光,由于磷酸酯水解释放游离染料,光谱发生变化,最大激发约为645nm和最大发射约为659nm,这种变化很容易通过测定样品的荧光和颜色变化来测定。
ddT5P-DDAO
应该注意带有染料或连接于末端磷酸根的其他可测定部分的类似的核苷酸组分也能够使用类似于上述实施例1-4所述的方法制备。它们包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷-四磷酸酯、带有任何天然碱基的核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、次黄嘌呤和尿嘧啶)以及修饰的碱基或修饰的糖。
实施例5
制备乙基-荧光素三磷酸酯
将乙基-荧光素(100mg)和无水乙腈(2倍)共同蒸发,并且再悬浮于无水乙腈(5ml)中,往其中加入磷酰氯(78μl)。于0℃搅拌30分钟以后,加入三当量的吡啶,将混合物温热到室温,于室温搅拌3小时。往反应混合物中加入在DMF中的焦磷酸三丁基铵(0.5M,10当量)和三丁基胺(15当量),搅拌5分钟以后,用15ml 1M三乙基铵碳酸氢盐淬灭。浓缩反应混合物,和甲醇(2倍)共同蒸发,用离子交换色谱法提纯残留物,使用HiPrep16×10 Q XL柱,然后使用反相色谱提纯,使用Xterra C-18 30×100mm柱,得到37.2umol纯的产品,在274nm处有最大入值,M-1=598.99(计算值599)质子和磷NMR光谱对应于结构式如下的乙基-荧光素磷酸酯。
以下的实施例6和7说明在测定核酸的模板-定向方法中,具有连接于末端磷酸根的染料衍生物的二脱氧核苷酸可以通过核酸聚合酶作为底物有效地掺入到增长中的核酸链中。
实施例6
核酸序列的测定,使用掺入γ-磷酸根-标记的ddGTP的聚合酶
在室温下装配(23℃)反应,使用实施例的(1)二脱氧核苷酸。反应含有引物模板组合,该组合含有单一寡核苷酸引物(以SEQ ID NO:1表示),该单一寡核苷酸引物被退火到含有邻近引物的3′末端作为下一个模板的核苷酸的dC或dT的两个不同寡核苷酸模板之一上,这两个模板分别相应于SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
参考图1,对于本实施例中的模板1(SEQ ID NO:2),期望DNA聚合酶利用标记的ddGTP来延长引物。同样对于图1中的模板2(SEQ IDNO:3),期望DNA聚合酶利用ddATP来延长引物,但是不利用标记的ddGTP。
反应条件:70μl含有25mM Tris,pH8.0、5%甘油5mMMgCl2、0.5mM β-乙硫醇、0.01%吐温-20,0.25单位河虾碱性磷酸酯酶、退火到模板(下一个模板核苷酸是dCMP或dTMP)上的100nM引物和2μM ddGTP-CF3-香豆素的反应物,被装配在以时间驱动模式工作的LS-55荧光光谱仪的(Perkin Elmer)石英荧光超-微容器中。
激发和发射波长分别是390nm和500nm,激发狭缝的宽度是5nm,发射狭缝的宽度是15nm,通过加入0.35μl(11单位)基因工程化的用来消除3′-5′外切核酸酶活性和5′-3′外切核酸酶活性并且辨别二脱氧核苷酸的克隆的DNA聚合酶I和0.25mM MnCl2来启动反应。
如图1中所示,对于含有γ标记的ddGTP的反应,仅仅对于引物:模板1测得了染料发射,其中在模板中的下一个核苷酸是dC。通过河虾碱性磷酸酯酶切割磷酰基转移的焦磷酸酯产品导致CF3-香豆素标记的可测定的变化,这样就可以测定核酸。使用引物:模板2没有获得可测定的染料发射。
实施例7
利用聚合酶掺入γ磷酸根-标记的ddATP进行核酸序列的测定
在室温下装配(23℃)反应,使用实施例的(2)二脱氧核苷酸,反应含有引物:模板组合,该组合具有单一的寡核苷酸引物(SEQ IDNO:1),该单一的寡核苷酸引物被退火到含有临近引物的3′末端作为模板核苷酸的dC或dT的两个不同寡核苷酸模板之一上,这两个模板分别对应于SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
参考本实施例中的图2,对于本实施例中的模板2(SEQ ID NO:3),期望DNA聚合酶利用标记的ddATP来延长引物。同样对于图2中的模板1(SEQ ID NO:3),期望DNA聚合酶利用ddGTP来延长引物,但是不利用标记的ddATP。
反应条件:70μl含有25mM Tris,pH8.0、5%甘油5mMMgCl2、0.5mM β-乙硫醇、0.01%吐温-20、0.25单位河虾碱性磷酸酯酶、100nM退火到模板上的引物和2μM ddATP-CN-香豆素的反应物,被装配在LS-荧光光谱仪(Perkin Elmer)以时间驱动模式工作的中的石英荧光超-微容器中。
激发和发射波长分别是410nm和450nm,激发狭缝的宽度是5nm,发射狭缝宽度是15nm,通过加入0.35μl(11单位)基因工程化的用来消除3′-5′外切核酸酶活性和5′-3′外切核酸酶活性并且辨别二脱氧核苷酸的克隆的DNA聚合酶I和0.25mMMnCl2来启动反应。
如图2中所示,对于含有γ标记的ddATP的反应,仅仅对于引物:模板2测到了染料发射,其中在模板中的下一个核苷酸是dT。通过河虾碱性磷酸酯酶切割磷酰基转移的焦磷酸酯产品导致CN-香豆素标记中的可测定的变化,这样就允许测定核酸。使用引物:模板1没有得到可测定的染料发射。
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<160>3
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<210>1
<211>5
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DNA合成的引物
<400>1
atccg 5
<210>2
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DNA模板
<400>2
taggccgctg 10
<210>3
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DNA模板
<400>3
taggctgctg 10
Claims (33)
1.使用标记的底物或底物类似物测定靶的方法,包括在酶-催化的反应中使所述底物或底物类似物进行反应,产生标记的多磷酸酯,仅当底物或底物类似物反应时该标记的多磷酸酯具有独立地可测定的信号,并且其中当靶是核酸时,该标记的多磷酸酯具有三个或多个磷酸根。
2.权利要求1的方法,其中标记的多磷酸酯还经受化学变化,产生可测定的信号。
3.权利要求2的方法,其中所述的化学变化被一种或多种酶催化,产生可测定的信号。
4.权利要求1的方法,其中所述的靶是核酸靶。
5.权利要求1的方法,其中所述的靶是蛋白质。
6.权利要求1的方法,其中标记的底物类似物是末端-磷酸根标记的核苷多磷酸酯。
7.权利要求1的方法,其中所述的酶-催化反应是核酸聚合反应。
8.权利要求1的方法,其中酶-催化反应被磷酸二酯酶催化。
9.权利要求1的方法,其中所述的酶-催化反应被二核苷酸磷酸化酶催化。
10.权利要求1的方法,其中所述的酶-催化反应被连接酶催化。
11.权利要求1的方法,其中所述的多磷酸酯含有两个或多个磷酸根基团。
12.权利要求1的方法,其中所述标记的多磷酸酯以下式表示:
Label-x-(p)n-p
其中Label是可测定的部分,x是O、S、NH或连接基团,n是1-5和p是磷酸根或磷酸根衍生物。
13.权利要求1的方法,其中在所述标记的多磷酸酯中的标记是比色的、发荧光的、生色的、产生荧光的或化学发光的化合物或电化学标记。
14.权利要求2的方法,其中所述标记选自由化学发光的化合物、荧光染料、生色染料、电化学标记或其结合组成的组。
15.权利要求1的方法,其中所述可测定的物种是可通过选自由颜色、荧光发射、化学发光、质量变化、还原/氧化潜能及其组合组成的组中的性质测定的。
16.权利要求13的方法,其中所述的比色标记选自由花青、merro花青、吩_嗪、吖啶酮或硝基苯酚组成的组。
17.权利要求13的方法,其中所述荧光标记选自荧光素、若丹明、花青或merro花青。
18.权利要求14的方法,其中所述标记中产生荧光的部分选自2-(5′-氯-2′-磷酰氧基苯基)-6-氯-4-(3H)-喹唑啉酮、荧光素二磷酸酯、荧光素3′(6′)-O-烷基-6′(3′)-磷酸酯、9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯、4-甲基伞形酰基磷酸酯、试卤灵磷酸酯、4-三氟甲基伞形酰基磷酸酯、伞形酰基磷酸酯、3-氰基伞形酰基磷酸酯、9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基磷酸酯、6,8-二氟-4-甲基伞形酰基磷酸酯及其衍生物。
19.权利要求14的方法,其中所述标记是选自由5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、3-吲哚氧基磷酸酯、对-硝基苯基磷酸酯及其衍生物组成的组的生色部分。
20.权利要求14的方法,其中所述化学发光化合物是磷酸酯酶-活化的1,2-二氧杂环丁烷化合物。
21.权利要求20的方法,其中所述1,2-二氧杂环丁烷化合物选自由2-氯-5-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-(5-氯-)三环[3,3,1-13,7]-癸烷]-1-基)-1-苯基磷酸酯、氯金刚烷基-2′-亚基甲氧基苯氧基磷酰基二氧杂环丁烷,3-(2′-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧杂环丁烷及其衍生物组成的组。
22.权利要求3的方法,其中所述酶选自磷酸酯酶、糖苷酶、多磷酸转移酶、肽酶、氧化酶、过氧化物酶、硫酸酯酶、酯酶及其组合。
23.权利要求2的方法,其中所述的化学变化是由化学水解引起的。
24.权利要求2的方法,其中所述化学变化是由化学水解和酶促作用引起的。
25.权利要求24的方法,其中所述的化学水解是自发的。
26.使用标记的核苷酸类似物测定靶核酸序列的方法,包括通过核酸聚合酶将所述的类似物掺入到与靶序列互补的多核苷酸中,产生既不是焦磷酸酯,也不是单-取代的焦磷酸酯的物种,再经受化学变化产生可测定的信号。
27.权利要求26的方法,其中所述化学变化被一种或多种酶所催化。
28.权利要求26的方法,其中所述物种是带有三个或多个磷酸根基团的标记的多磷酸酯。
29.权利要求26的方法,其中所述物种用下式表示:
Label-x-p-(p)n-p
其中Label是可测定的部分,x是O、S、NH或连接基团,n=1-4和p是磷酸根或磷酸根衍生物。
30.权利要求29的方法,其中连接基团是酶-可移动的连接基团。
31.权利要求29的方法,其中连接基团在除去磷酸根以后自动被除去。
32.含有标记的磷酸的化合物,它包括下式:
Label-(P)n-P
其中label是可测定的部分,选自由荧光的、有颜色的、产生荧光的、发色的、发光的部分或化学发光标记组成的组,以及n是2-5。
33.含有标记的磷酸根的化合物,它包括下式:
Label-(P)n-P
其中label是可测定的部分,选自由产生荧光的、发光的部分或电化学标记组成的组,以及n是1-5。
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