NO316866B1 - Funksjonelle terpyridin-metallkomplekser, fremgangsmater for fremstilling derav og oligonukleotidkonjugater med terpyridin-metallkomplekser, forbindelse for anvendelse i en terapeutisk fremgangsmate, farmasoytisk preparat og anvendelse av en forbindelse t - Google Patents

Funksjonelle terpyridin-metallkomplekser, fremgangsmater for fremstilling derav og oligonukleotidkonjugater med terpyridin-metallkomplekser, forbindelse for anvendelse i en terapeutisk fremgangsmate, farmasoytisk preparat og anvendelse av en forbindelse t Download PDF

Info

Publication number
NO316866B1
NO316866B1 NO19970886A NO970886A NO316866B1 NO 316866 B1 NO316866 B1 NO 316866B1 NO 19970886 A NO19970886 A NO 19970886A NO 970886 A NO970886 A NO 970886A NO 316866 B1 NO316866 B1 NO 316866B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
alkyl
compound according
aryl
aralkyl
compound
Prior art date
Application number
NO19970886A
Other languages
English (en)
Other versions
NO970886D0 (no
NO970886L (no
Inventor
Dieter Huesken
Heinz Moser
Robert Haner
Jonathan Hall
Uwe Pieles
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of NO970886D0 publication Critical patent/NO970886D0/no
Publication of NO970886L publication Critical patent/NO970886L/no
Publication of NO316866B1 publication Critical patent/NO316866B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/40—Rare earth chelates

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører cykliske terpyridin-lantanidkomplekser med 8 N-
atomer og 10 C-atomer i makrocyklusen som i terpyridindelen inneholder en funksjonell gruppe, en fremgangsmåte for sammensetning gjennom kondensasjon av ter-pyridinhydraziner med pyridin-2,6-dialdehyder eller -ketoner, koplinger av disse komplekser med oligonukleotider og fremgangsmåter for sekvensspesifikk spaltning av RNA ved anvendelse av disse koplinger. Oppfinnelsen vedrører også forbindelser for anvendelse i terapeutiske fremgangsmåter, farmasøytiske preparater og anvendelse til fremstilling av et legemiddel.
Den hydrolytiske spaltning av RNA under katalytisk innvirkning av metallioner har
lenge vært kjent. Spaltningen foregår hovedsakelig i det uparede område av RNA som på engelsk betegnes med "loops". WJ. Krzyzosiak et al., Biochemistry 27:5771-5777
(1988) foreslår her anvendelse av bleidiacetat. G.J. Murakawa et al. Nucleic Acid Research 17:5361-5375 (1989), beskriver anvendelse av kopperkomplekser av 1,10-fenantroliner, J. Ciesiolka et al., Eur. J. Biochem. 182:445-450 (1989) beskriver europiumtriklorid for samme anvendelsesformål for spaltning av tRNA<Pne>. C.S. Chow et al. anvender i J. Chem. Soc., bind 112, s. 2839 til 2841 (1990) for samme RNS ruthenium- og rhodium-komplekser med fenantrolinligander. I Biochemistry, bind 29, s.2515-2523 beskriver L.S. Behlen et al. tRNA<Pne->mutanter med blydiacetat. Videre beskriver N. Hayashi et al. i Inorg. Chem., bind 32, s.5899-5900 (1993) at for spaltning av tRNA egner også lantanidmetallkomplekser seg.
Det er videre beskrevet av D. Magda et al. i J. Am. Chem. Soc, bind 116, 7439-7440
(1994) at konjugater av europium(III)-teksafyrin og oligonukleotider med DNA-
byggestener muliggjør spaltning av et mål-RNA, idet det fremkommer i området av teksafyrinkompleksene i RNA/oligonukleotid-kompleksene en spaltning av omtrent 30%. Ulempen ved disse teksafyrin-kompleksene er også at hydroksypropyl må i tillegg også bindes i liganden slik at dette muliggjør en tilstrekkelig oppløselighet. Videre er imingruppene til liganden hydrolysedyktige, slik at virksomheten i vandige omgivelser forekommer relativt raskt og består av en for kort oppholdstid for terapeutisk anven-
delse. Gjennom hydrolyse av liganden blir til og med metallet frigjort, hvilket kan fremkalle alvorlige toksiske problemer og uspesifikke spaltninger av RNA. Videre er det svake Lewis-syrer, fordi en ladning av Eu-kationet nøytraliseres av en ligand og derfor foreligger et to ganger ladet kompleks. De beskrevne komplekser er i tillegg bare tilgjengelige ved hjelp av syntetisk kostbare fremgangsmåter.
Det er kjent, at oppkomsten i celler av fysiologisk skadelige polypeptider følger av dannelse av mRNA som styres av genene. For bekjempelse, henholdsvis hindring av sykdommer er det derfor ønskelig med midler, som forhindrer virkningen av mRNA. Særlig skal det oppnås, at mRNA ødelegges ved irreversibel spaltning på definert sted at informasjonsinnholdet derved går tapt. Det er videre ønskelig, å holde bruddstykker i beredskap ved en sekvensspesifikk spaltning av RNA-kjeder, som kan anvendes for raskere oppbygging av oligonukleotider i "antisens-området" for diagnostiske formål (biosensorer) eller for terapien av sykdommer under påvirkning av stoffskifteprosesser i cellen.
Det ble nå funnet, at oligonukleotider, hvis sekvens er komplementær til en mål-RNA og er bundet til et terpyridin-lantanid-kompleks, er kraftig virksomme og det kan oppnås sekvensspesifikke spaltninger i en mål-RNA.
En gjenstand for foreliggende oppfinnelse er forbindelser med formel I
hvor
R\ er H eller en substituent og R5 en enverdig funksjonell gruppe eller
Ri er en enverdig funksjonell gruppe og R5 er H eller en spaltning, hvorved den funksjonelle gruppe er bundet direkte eller via en gruppe Z til pyridinringen og gruppen Z betyr en rest valgt fra gruppen bestående av Ci-C20_alkylen, C2-Ci2~alkenylen, C2-Ci2_alkinylen, Cs-Cg-cykloalkylen, Cg-C^-aryten og C7-Ci2-aralkylen som eventuelt er avbrutt av -0-, -S-, -NR12-, -C(0)-0- eller -C(0)-NRi2-,
R-2 og R7 uavhengig av hverandre betyr H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-C12-aralkyl, Cg-Cig-aryl eller halogen,
R3 og R<j uavhengig av hverandre er H, Cj^-alkyl, C7-Ci2-aralkyl eller Cg-Cig-aryl,
R4 står for H, Ci-C20-alkyl, Cs-Cg-cykloalkyl, C6-Ci2-aryl eller C7-Ci2-aralkyl,
Rl2 betyr H eller Ci-Cg-alkyl,
Me står for et lantanidmetall eller yttrium,
Y står for et anion av en syre,
n betyr tallene 2 eller 3, og
m betyr tallene 1,2 eller 3,
hvorved restene alkyl, cykloalkyl, aralkyl, aryl og gruppen Z er usubstituert eller substituert med Ci-C4-alkoksy, F, Cl, Br, -CN, Ci-C4-alkyl eller -NO2.
Rj og R5 som substituent er foretrukket Cj^-alkyl, Ci-C4-alkoksy, Cj- C\ 2- Brzlkyl eller Cg-Cig-aryl, C4-Ci2-heteroaryl med O, S, N som heteroatomer, Ci-C4-alkyltio, di(Ci-C4-alkyl)amino, halogenid, sulfonamid og karboksamid.
R\ og R5 er fortrinnsvis bundet i p-stilling til N-atomet i pyridinringen.
R2» *V3» ^6°S ^7 Detvr som a^cyl foretrukket metyl eller etyl, som alkoksy foretrukket metoksy eller etoksy, som aralkyl foretrukket benzylen eller fenyletylen og som aryl foretrukket naftyl og særlig benzyl. I en foretrukken utførelsesform betyr R2 og R7 og R3 og Rg alkyl. Særlig betyr R2 og R7 H så vel som R3 og Rg Cj-C4-alkyl, og helt spesielt metyl. Når det gjelder R2, R3, R6 og R7, kan det også handle om C4-C12-heteroaryl med O, S, N som heteroatomer. Eksempler er pyridyl, tiazolyl, imidazolyl, oksazolyl, furanocyl, pyrrolyl, tiofenyl. Videre kan det handle om Ci-C4-alkyltio, halogenid, di(Ci-C4-alkyl)amino, sulfonamid og karboksamid.
R4 inneholder som alkyl fortrinnsvis 1 til 12, særlig foretrukket 1 til 8 og spesielt 1 til 4 C-atomer. Noen eksempler på alkyl er metyl, etyl og isomerene av propyl, butyl, pentyl, heksyl, heptyl, oktyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, heksadecyl, oktadecyl, nonadecyl og eikocyl.
R4 inneholder som cykloalkyl foretrukket S eller 6 ringkarbonatomer. Noen eksempler på cykloalkyl er cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cykloheksyl, cyklopentyl og cyklooktyl.
R4 som aryl er fortrinnsvis naftyl og særlig fenyl. Når R4 er aralkyl, handler det fortrinnsvis om benzyl eller fenyletyl.
En foretrukken undergruppe for R4 er H, Cj-C^alkyl, særlig metyl, så vel som fenyl eller benzyl.
R\ hhv. R5 betyr som alkyl foretrukket metyl eller etyl, som alkoksy foretrukket metoksy eller etoksy, som aryl foretrukket naftyl eller fenyl, og som aralkyl foretrukket fenyl eller fenyletyl. Foretrukket betyr Ri henholdsvis R5 H, metyl, etyl, metoksy eller etoksy.
Innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse er den enverdige, funksjonelle gruppe fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av -ORio> -SR10» -NCO, -NCS, -NHRi 1,
-C(0)ORi 1 -C(0)SH, -C(0)NHRi 1, -C(0)C1, -C(S)SRi j, -C(S)NHRi 1, -C(S)ORii, -SO3R1 h -SO2NHR11, -S02C1, -P(0)(OH)2, -P(0)(OH)-NHRi ls -P(S)(SH)2, -P(S)(SH)-NHRn, -P(S)(OH)2, -P(S)(OH)-NHRn, -P(0)(SH)2, -P(0)(SH)-NHRn, hvorved Rio betyr H, -C(0)NH2, -C(S)NH2, -C^Cg-alkyl, -CxH2x-NH2, -CxH2x-SH eller -(CxH2xO)y-H og Ri 1 betyr H, -Ci-Cg-alkyl, -CxH2x-NH2, -CxH2x-SH eller -(CxH2xO)y-H og x er lik et tall fra 2 til 6 og y er lik et tall fra 1 til 20. Særlig foretrukket er den funksjonelle gruppe valgt fra gruppen bestående av -ORiq, -SRjo» -NCO, -NCS, NHRi i, -C(0)ORn og -P(0)(OH)2 spesielt utvalgt fra gruppen bestående av -NCS, -C(0)ORi 1 og -P(0)(OH)2.
En foretrukken undergruppe av forbindelser med formel I er slike, hvori R2 og R7 står for H, R3 og Rg betyr Ci-C4-alkyl, R4 betyr H, Ci-C4-alkyl, fenyl eller benzyl, Ri betyr en enverdig, funksjonell gruppe som er bundet over Ci-C3-alkylen, C3-alkinylen, fenylen eller C7-aralkylen, fortrinnsvis C2-C3-alkylen eller fenylen, og R5 er H, metyl eller metoksy eller R5 er en enverdig, funksjonell gruppe som er bundet over C1-C3-alkylen, C3-alkinylen, fenylen eller Cy-aralkylen, fortrinnsvis C2-C3-alkylen eller fenylen og Rj er H, metyl eller metoksy.
Med et lantanidmetall forstås innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse alle lantanider, dvs. lantan (La), cer (Ce), praseodym (Pr), neodym (Nd), promethium (Pm), samarium (Sm), europium (Eu), gadolinium (Gd), terbium (Tb), dysprosium (Dy), holmium (Ho), erbium (Er), thulium (Tm), ytterbium (Yb) og lutetium (Lu). Foretrukket er La, Ce, Nd, Eu og Gd, spesielt La og Eu, helt spesielt foretrukket Eu.
Egnede anioner for komplekssaltene kan for eksempel velges fra følgende gruppe: halogenid (f.eks. Cl", Br og I"), anionet av en oksygensyre, BF4", PFg", SiFg" og AsFg".
Når det gjelder anionene av oksygensyrer kan det for eksempel dreie seg om sulfat, fosfat, perklorat, perbromat, perjodat, antimonat, arsenat, nitrat, karbonat, anionet av en Ci-Cg-karboksylsyre som f.eks. formiat, acetat, propionat, butyrat, benzoat, fenylacetat, mono-, di- eller triklor- eller -fluoracetat, sulfonater som for eksempel metylsulfonat, etylsulfonat, propylsulfonat, butylsulfonat, trifluormetylsulfonat (triflat), fenylsulfonat eller benzylsulfonat som eventuelt er substituert med Ci-C4-alkyl, C]-C4-alkoksy eller halogen, særlig fluor, klor eller brom, som f.eks. tosylat, mesylat, brosylat, p-metoksy-eller p-etoksyfenylsulfonat, pentafluorfenylsulfonat eller 2,4,6-triisopropylsulfonat, og fosfonater som f.eks. metylfosfonat, etylfosfonat, propylfosfonat, butylfosfonat, fenyl-fosfonat, p-metylfenylfosfonat og benzylfosfonat. Egnede anioner er også tartrat, citrat og laktat. Foretrukne anioner innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse er F-, Cl", Br, I-, PFg-, SbFg", BF4-, B(Ph)4", acetat, NO3-, sulfat og fosfat, særlig foretrukne anioner er Cl", acetat og NC«3'.
De ovenfor angitte foretrukne valg og forklaringer, spesielt av substituentene, i forbindelsen med formel (I), gjelder tilsvarende også for de i det følgende beskrevne forbindelser med formel (V).
En ytterligere gjenstand for foreliggende oppfinnelse er forbindelser med formel V.
hvor
R-2 og R7 uavhengig av hverandre betyr H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-C12-aralkyl, Cg-Cig-aryl eller halogen,
R3 og Rg uavhengig av hverandre er H, Ci-C4-alkyl, C7-C12-aralkyl eller Cg-Cig-aryl,
R4 står for H, Ci-C2()-alkyl, Cf-Cg-cykloalkyl, Cg-Ci2-aryl eller C7-C12-aralkyl,
hvorved restene alkyl, cykloalkyl, aralkyl og aryl er usubstituerte eller er substituert med Ci-C4-alkoksy, F, Cl, Br, -CN, Ci-C4-alkyl eller -NO2,
Me står for et lantanidmetall eller yttrium,
Y står for et anion av en syre,
n betyr tallene 2 eller 3, og
m betyr tallene 1, 2 eller 3,
R9 er en rest med formel VI
og Rg betyr H eller en substituent eller
Ro. betyr H eller en substituent og Rg betyr en rest med formel VL
p, q og r uavhengig av hverandre står for 0 eller 1,
X og X<1> uavhengig av hverandre betyr en rest fra gruppen bestående av Ci-C20-alkylen, C2-Ci2-alkenylen, C2-Ci2-aH£inylen, -(CxH2xO)y-, hvori x er lik et tall fra 2 til 6 og y er lik et tall fra 1 til 20, C5-Cg-<cy>kloalkylen, Cg-C^-arylen og C7-Ci2-<a>ralkylen som er usubstituert eller substituert med Ci-C4-alkoksy, F, Cl, Br, -CN, Ci-C4-alkyl eller
-NC-2,
A og A' uavhengig av hverandre betyr -0-, -S-, -S-S-, -NR^-CO-NR^-, -NR12CS-NRi2-s -NR12-, -NRi2-C(0)-0-, -C(0)0-, -C(0)S-, -C(0)NR12, -C(S)S-, -C(S)0-, -C(S)NR12, -S02NR12-, -SO2-, -P(0)(OH)0-, -P(S)(SH)S-, -P(S)(SH)0-, -P(S)(OH)0-, -P(0)(SH)S-, -P(0)(OH)S-, -P(0)(SH)0-, -P(0)(OH)-NRi2-, -P(S)(SH)-NR12-. -P(S)(OH)-NR12-, -P(0)(SH)-NR12-, -HP(0)0-, -HP(S)S-, -HP(0)NRi2- eller
-HP(S)NRi2-, hvorved R12 står for H eller Cj-Cg-alkyl og
oligo er en naturlig, modifisert eller syntetisk sekvens av naturlige, modifiserte eller syntetiske desoksynukleosider eller peptidnukleinsyrebyggestener, som er bundet via en nukleinbase, en intemukleotidisk bro eller et sukker og hvis indre områder er komplementært, fortrinnsvis fullstendig komplementært til en mål-RNA.
Derved står q foretrukket for 1.
For Rg og R9 som substituent gjelder tilsvarende definisjoner og fortrinn som er angitt ovenfor for R5 henholdsvis Ri-
Mål-RNA betyr innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse at det i målet må foreligge en RNA-sekvens. I overensstemmelse med dette kan polyribonukleinsyrer (RNA) foreligge. Foretrukket handler det om m-RNA (bud-RNA), pre-m-RNA (forløper-m-RNA), t-RNA (transfer-RNA), sn-RNA (small nuclear RNA), r-RNA (ribosomal RNA) og viral RNA. Det kan imidlertid også foreligge blandingssekvenser av RNA og polydesoksyribonukleinsyrer (DNA), for eksempel chimærene RNA-DNA (Okazaki-fragment). RNA oppviser så mange byggestener, at det kan dannes et kompleks (dobbelt-streng) med oligonukleotidet.
Innenfor rammen av oppfinnelsen skal det med det indre område av en sekvens forstås, at for eksempel opp til 5, fortrinnsvis opp til 3 og særlig foretrukket 1 eller 2 av de ytre nukleotidbyggestenene i sekvensen ikke må være komplementær med mål-RNA. Dette kan for så vidt være en fordel, da det terpyridin-lantanid-kompleks som er bundet på enden av sekvensen, kan være mer bevegelig og dermed mer effektivt.
Oligo-nukleotidet kan være delvis eller fullstendig oppbygget av naturlige DNA-byggestener som er komplementære til mål-RNA, eller fullstendig oppbygget av unaturlige, syntetiske nukleotider som likeledes er komplementære til mål-RNA, hvorved delvis betyr, at naturlige DNA-byggestener i oligonukleotidsekvensen til mål-RNA er erstattet med likeledes komplementære, unaturlige, syntetiske nukleotider. Syntetiske byggestener omfatter modifikasjonene av naturlige byggestener i nukleinbasen, furanoseringen og/eller brogruppene i oligonukleotidene. Syntetiske byggestener anvendes vanligvis for å forsterke kompleksdannelsen i dupleksstrukturer og/eller å forhøye oligonukleotidenes stabilitet like overfor den nedbygging som forårsakes av for eksempel nukleaser. Modifiserte nukleosider er blitt kjent i området "Antisens-teknologi" for syntesen eller modifikasjonen av komplementære oligonukleotider i stort antall og forklares derfor ikke nærmere her (se f.eks. E. Uhlmann et al., Chemical Reviews, bind 90, nr. 4, s.543-584
(1990).
Som modifikasjoner kommer anvendelser i nukleinbasedelen (f.eks. substitusjoner, utelatelse av substituenter), i nukleotidbrogruppen (f.eks. omdannelse av fosforsyreester-gruppen eller deres erstatning med andre brogrupper) og i furanoseringen (f.eks. substitusjoner på 2-hydroksylgruppen, erstatning av furanose-O-atomet, erstatning av furanoseringen med mono- eller bikarbacykliske ringer, erstatning av furanoseringen ved åpenkjedede strukturer) på tale.
Valget og rekkefølgen av byggestenene i oligonukleotidets sekvens bestemmes ved den nødvendige dupleksdannelse med en mål-RNA. Også arten og stedet for sammenknytningen med terpyridin-lantanid-komplekset kan påvirke valget og rekke-følgen av byggestenene.
Antallet byggestener i oligonukleotidet bestemmes slik, at det foregår en hybridisering med mål-RNA. Oligonukleotidene kan for eksempel inneholde 5-100, foretrukket 5-50, spesielt foretrukket 8-30 og helt spesielt 10-25 byggestener. Pardannelsen med det område som forhøyer mål-RNA (parende nukleotidbyggestener) er fortrinnsvis anordnet i oligonukleotidet midlere sekvensrekkefølge, for eksempel mellom sekvensens fjerde siste, eller tredje siste, eller andre siste eller siste byggestener. Når det gjelder oligonukleotider med opp til 20 byggestener, befinner den parende byggesten seg fortrinnsvis i området fra fjerde til syvende byggesten.
Oligonukleotidene er fortrinnsvis oppbygget av nukleosider i furinrekken og pyrimidinrekken. Særlig foretrukket av 2'-desoksy-2-aminoadenosin, 2'-desoksy-5-metylcytidin, 2'-desoksyadenosin, 2'-desoksycytidin, 2-desoksyuridin, 2'-desoksyguanosin og 2'-thymidin. Helt spesielt foretrukket er 2'-desoksyadenosin (A), 2'-desoksycytidin (C), 2'-desoksyguanosin (G) og 2'-thymidin (T). Modifiserte byggestener avledes fortrinnsvis av naturlige nukleosider fra purinrekken og pyrimidinrekken, særlig foretrukket fra adenosin, cytidin, guanosin, 2'-aminoadenosin, S-metylcytosin, thymidin og de foran nevnte desoksyderivater. Når det gjelder nukleosider, kan det også dreie seg om 2'-modifiserte ribonukleosider.
I en helt foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er det oligonukleotid som er komplementært til en mål-RNA oppbygget av naturlige desoksynukleosider, særlig foretrukket fra gruppen 2-desoksyadenosin (A), 2'-desoksycytidin (C), 2'-desoksyguanosin (G) og 2-thymidin (T) eller av komplementære, unaturlige, syntetiske byggestener. Innenfor oppfinnelsens ramme er slike modifiserte nukleosider særlig foretrukket, som øker oligonukleotidets stabilitet overfor nukleaser.
Oligonukleotidet kan også bestå av sekvenser av peptidnukleinsyrer (PNA), hvorved ter-pyridin-lantanid-komplekset fortrinnsvis er bundet til nukleinbasen, amino- eller karboksylenden. For oppbyggingen av PNA-sekvensen gjelder de samme foretrukne forbindelser som for oligonukleotidene. Eksempler på PNA'er finnes i Science, bind 254, sider 1497 til 1500.
Ter-pyridin-lantanid-komplekset er fortrinnsvis bundet over en brogruppe til N-, S- eller O-atomer i 3'- eller 5'-endegruppene i oligonukleotidsekvensen. Det kan imidlertid også være bundet til C-, N- eller O-atomer fra nukleinbaser i eller på enden av sekvensen, til 2-stillinger i furanoseringen, til 0-, S- eller N-atomer i eller på enden av sekvensen eller til O-, S- eller N-atomer i nukleotidbrogruppen i sekvensen. Arten av binding avhenger av terpyridin-lantanid-komplekset og arten av dettes funksjonelle grupper. En brogruppe kan for eksempel være en omdannet, funksjonell gruppe, som på sin side kan være bundet direkte eller via en forbindelsesgruppe til terpyridin-lantanid-komplekset og/eller oligonukleotidet. Bindingen til oligonukleotidet kan være ionogen og foretrukket kovalent. Terpyridin-lantanid-komplekset kan også være bundet til 6'-karbonatomet i en karbacyklisk nukleotidanalog.
Når det gjelder X og X' som bestanddeler av broen mellom terpyridin-lantanid-kompleks og oligonukleotid kan det i tilfellet av Xq eller Xq' dreie seg om en direkte binding eller i tilfellet av Xj eller Xi1 dreie seg om en toverdig, åpenkjedet eller cyklisk hydrokarbongruppe med 1 til 22 C-atomer, som er uavbrutt eller er avbrutt med rester fra gruppen -S-, -NR12-, -C(0)-0-, -C(0)-NRi2-, eller en polyoksaalkylenrest med 1 til 12 oksaalkylenenheter og 2 eller 3 C-atomer i alkylen. I hydrokarbongruppen kan det for eksempel dreie seg om lineært eller forgrenet Ci-C22-alkylen, foretrukket Cj-Ci8-alkylen, særlig foretrukket Q-Ci^-alkylen °S helt spesielt foretrukket Cj-Cg-alkylen, om C3-C8-cykloalkylen, foretrukket C5- eller Cg-cykloalkylen, om Cg-Ci 2-arylen eller om C7-Ci2_aralky^n- Noen eksempler på toverdige hydrokarbongrupper er metylen, etylen, 1,2- eller 1,3-butylen, 1,2-, 1,3- eller 1,4-butylen, 1,2-, 1,3-, 1,4- eller 1,5-pentylen, 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5- eller 1,6-heksylen, 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6- eller 1,7-heptylen, 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7- eller 1,8-oktylen og isomerene av nonylen, decylen, undecylen, dodecylen, tridecylen, tetradecylen, pentadecylen, heksadecylen, heptadecylen, oktadecylen, nonadecylen og eikocylen, cyklopentylen, cykloheksylen, naftylen og spesielt fenylen, benzylen og fenyletylen. Noen eksempler på polyoksaalkylener er etylenoksy, bisetylenoksy, trisetylenoksy, tetraetylenoksy og 1,2-propoksy. Særlig foretrukket er brogrupper i hvilke X har betydningen Ci-C3-alkylen, C3-alkinylen, fenylen eller Cy-aralkylen, særlig foretrukken betydningen C2-C3-alkylen eller fenylen. Særlig foretrukket er også brogrupper i hvilke X' er Cj^o-alkylen, spesielt C1-C1 Q-alkylen.
Den toverdige gruppe A er fortrinnsvis -NR12-CS-NR12- e^er -C(0)NRi 2-, spesielt
-NH-CS-NH- eller -C(0)NH-.
Foretrukne forbindelser med formel V er slike i hvilke A' ikke er tilstede eller betyr
-P(0)(OH)0-.
Foretrukne forbindelser med formel V er slike i hvilke R2 og R7 uavhengig av hverandre betyr H eller Ci-C4-alkyl.
Fordelaktig betyr R3 og Rg uavhengig av hverandre H eller Ci-C4-alkyl.
I en annen foretrukken utførelsesform står R4 for H eller Ci-C20-aUcyl-
De forbindelser som foretrekkes i sammenheng med egnede lantanider og anioner er allerede nevnt. De gjelder også for forbindelsene med formel V.
En ytterligere gjenstand for foreliggende oppfinnelse er mellomprodukter ved fremstilling av forbindelser med formel I. Dette er forbindelsene med formel II
hvor
Ri betyr H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-C12-aralkyl eller Qj-Ci<g-a>ryl eller en enverdig, funksjonell gruppe, hvorved den funksjonelle gruppe er bundet direkte eller over en gruppe Z til pyridinringen og gruppen Z står for en rest valgt fra gruppen bestående av Ci-C20-alkylen, C2-Ci2-<a>lkenylen, C2-Ci2-<a>lkinylen, C5-C8-cykloalkylen, Cg-C^-arylen og C7-Ci2-aralkylen som eventuelt er avbrutt av -O-, -S-,
-NR12-, -C(0)-0- eller -C(0)-NR12-,
R2 og R7 uavhengig av hverandre betyr H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-C12-aralkyl, Cg-Cig-aryl eller halogen, og
R3 og Rg uavhengig av hverandre betyr H, Ci-C4-alkyl, C7-C12-<a>ralkyl eller Cg-Ci<g>-aryl,
Ri 2 betyr H eller C1 -Cg-alkyl,
hvorved restene alkyl, cykloalkyl, aralkyl, aryl og gruppen Z er usubstituert eller er substituert med Ci-C4-alkoksy, F, Cl, Br, -CN, Ci-C4-alkyl eller -NO2.
Ytterligere mellomprodukter ved fremstillingen av forbindelser med formel I og likeledes en gjenstand for foreliggende oppfinnelse er forbindelser med formel HI,
hvor
R5 er en enverdig, funksjonell gruppe som er bundet til pyridinringen over C2-C20-alkylen, hvorved den funksjonelle gruppe er valgt fra gruppen bestående av -C(0)-ORi2. -C(0)-NHR12> -SO2-R12 og -SO2-NHR12, hvorved R12 er H eller Ci-Cg-alkyl, og R4 står for H eller Ci-C20-alkyl.
For disse mellomprodukter gjelder det som er angitt foretrukket for sluttproduktet på tilsvarende måte.
En ytterligere gjenstand for foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsene med formel I, idet et terpyridin med formel II
kondenseres med et pyridindialdehyd eller pyridindiketon med formelen HI i nærvær av et salt med formel IV
hvor Ri, R2, R3, R4, R5, Rg, R7, Me, Y, n og m har de betydninger som er angitt foran, spesielt ved definisjonen av de foretrukne trekk og forklaringer til forbindelsene med formel (I).
Fremgangsmåten kan for eksempel gjennomføres slik, at forbindelsene med formlene n, III og IV oppløses foretrukket i ekvivalente mengder i et løsningsmiddel og så omsettes med hverandre ved forhøyede temperaturer. Hensiktsmessig medanvendes kondensasjonskatalysatorer, f.eks. konsentrerte mineralsyrer, særlig saltsyre, eller sure ionevekslere. Det kan være hensiktsmessig å tilsette vannbindende midler, eller åfjeme reaksjons vannet fra reaksjonsblandingen.
Reaksjonstemperaturen kan for eksempel oppgå til f.eks. 40 til 220°C, foretrukket 50-150°C.
Som løsningsmidler anvendes med fordel organiske, polare, aprotiske løsningsmidler. Egnede løsningsmidler er f.eks. vann og polare, aprotiske løsningsmidler, som fortrinnsvis er blandbare med vann. Eksempler på slike løsningsmidler er alkoholer (metanol, etanol, n- eller i-propanol, butanol, etylenglykol, propylenglykol, etylenglykolmonom-etyleter, dietylenglykol, dietylenglykolmonometyleter), etere (dietyleter, dibutyleter, tetrahydrofuran, dioksan, etylenglykoldimetyleter, etylenglykoldietyleter, dietylenglykoldietyleter, trietylenglykoldimetyleter), halogenerte hydrokarboner (metylenklorid, kloroform, 1,2-dikloretan, 1,1,1-trikloretan, 1,1,2,2-tetrakloretan, klorbenzen), karboksylsyreestere og laktoner (eddiksyreetylester, propionsyremetylester, benzoesyreetylester, 2-metoksyetylacetat, y-butyrolakton, 5-valerolakton, pivalolakton), N-alkylerte karboksylsyreamider og -laktamer (N,N-dimetylformamid, N,N-dietylformamid, N,N-dimetylacetamid, tetrametylurea, heksametylfosforsyretriamid, N-metyl-y-butyrolaktam, N-metyl-e-kaprolaktam, N-metylpyrrolidon), sulfoksider (dimetylsulfoksid, tetrametylensulfoksid), sulfoner (dimetylsulfon, dietylsulfon, trimetylensulfon, tetrametylensulfon), tertiære aminer (trimetylamin, trietylamin, N-metylpiperidin, N-metylmorfolin, pyridin), substituerte benzener (klorbenzen, o-diklorbenzen, 1,2,4-triklorbenzen, nitrobenzen, toluen, xylen) ognitriler (acetonitril, propionitril, benzoenitril, fenylacetonitril).
Metallsaltene med formel IV er vanligvis kjente og for en stor del i handelen.
Fremstillingen av de nye forbindelser med formel II som inneholder en funksjonell gruppe, kan foregå analogt med de fremgangsmåter som er beskrevet av E.C. Constable i Polyhedron, bind 7, nr. 24, sider 2531 til 2536 (1988), hvorved funksjonelle grupper eventuelt utstyres med beskyttelsesgrupper.
Forbindelsene med formlene II og HI med eller uten funksjonelle grupper er for en stor del kjente eller de kan fremstilles ved hjelp av kjente, henholdsvis analoge fremgangsmåter. Forbindelser med formel HI, hvor R4 står for H, R5 for C2-Ci8-alkylen-X5 og X5 betyr -C(0)-OR, -C(0)-NHR, -SO2-R eller -SO2-NHR, så vel som hvor R er H eller Ci-Cg-alkyl, er nye og kan oppnås på følgende måter: under palladiumkatalyse alkenyleres en tilsvarende 3-halogen-pyridin-l,5-dikarboksylsyreester med et alken med formelen CH2=CH-Ci-Ci6-alkylen-karboksylsyreester, alkengruppen hydreres for eksempel katalytisk, reduseres deretter til tilsvarende 1,5-dihydroksymetylpyridinalkyl-karboksylsyreester, hydroksymetylgruppene oksideres til aldehydgrupper og estergruppen hydrolyseres eventuelt til karboksylsyregruppen eller estergruppen amideres til karboksylsyreamid.
Forbindelsene med formel HI hvor R4 står for Ci-C^-alkyl, R5 står for C2-C18-alkylen-Xs og X5 betyr -C(0)-OR, -C(0)-NHR, -SO2-R eller -S02-NHR, så vel som hvor R er H eller Ci-Cg-alkyl, er nye og kan oppnås på følgende måte: under palladiumkatalyse alkenyleres et tilsvarende 3-halogen-l,5-dihydroksymetylpyridin som for eksempel er beskyttet med acetyl (kan oppnås ved reduksjon av den tilsvarende 3,5-dikarboksylsyremetylester) med et alken med formelen CH2=CH-Ci-Ci6-alkylen- - karboksylsyreester, alkengruppen hydreres for eksempel katalytisk, hydroksylgruppene avbeskyttes og oksideres eventuelt til tilsvarende 3,5-pyridinaldehyd, hvis aldehydgrupper kan Cj-C^-alkyleres med for eksempel Grignard-reagenser, estergruppen hydrolyseres eventuelt til karboksylsyregruppe eller estergruppen amideres til karboksylsyreamid, og de sekundære alkoholgruppene oksideres til ketogrupper.
En ytterligere gjenstand for oppfinnelsen er en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel V, idet en forbindelse med formel I
(a) omsettes med en forbindelse med formel Via
hvor
A" betyr én egnet, enverdig, funksjonell gruppe som er valgt fra gruppen bestående av
-OR10, -SRio, -NCO, NCS, NHRi1. -C(0)ORi i, -C(0)SH, -C(0)NHRi lf -C(0)C1, -C(S)SRii, <->C(S)NHRii, -C(S)ORii, -SO3R11, -SO2NHR11, -S02C1, -P(0)(OH)2, -P(0)(OH)-NHR! 1, -P(S)(SH)2, -P(S)(SH)-NHRn, -P(S)(OH)2, -P(S)(OH)-NHRi 1, -P(0)(SH)2, -P(0)(SH)-NHRi!, -P(0)(OH)H, -P(0)(NHRi i)H, -P(S)(SH)H, -P(S)(NHRii)H, -P(S)(OH)H, -P(0)(SH)H, hvorved Ri0 betyr H, -C(0)NH2, -C(S)NH2, -Ci-Cg-alkyl, -CxH2x-NH2, -CxH2x-SH eller -(CxH2xO)y-H og Ri 1 betyr H, -Ci-Cg-alkyl, -Cx<H>2x-NH2, -CxH2x-SH eller -(CxH2xO)y-H og x er lik et tall fra 2 til 6 og y er lik et tall fra 1 til 20, X' betyr en rest som er usubstituert eller usubstituert med Ci-C4-alkoksy, F, Cl, Br, -CN, Ci-C4-alkyl eller -NO2, hvilken rest er valgt fra gruppen bestående av Ci-C20-alkylen, C2-Ci2-alkenylen, C2-Ci2-alkinyle<n,> -(CxH2xO)y-, hvor x er lik et tall fra 2 til 6 og y er lik et tall fra 1 til 20, Cs-Cg-cykloalkylen, Cg-C^-arylen og C7-Ci2-aralkylen, A* betyr -O-, -S-, -S-S-, -NR12-CO-NR12-, -NRi2CS-NRi2-, -NRi2-, -NRi2-C(0)-0-, -C(0)0-, -C(0)S-, -C(0)NRi2, -C(S)S-, -C(S)0-, -C(S)NRi2, -SO2NR12-, -S02-, -P(0)(OH)0-, -P(S)(SH)S-, -P(S)(SH)0-, -P(S)(OH)0-, -P(0)(SH)S-, -P(0)(OH)S-, -P(0)(SH)0-, -P(0)(OH)-NRi2-, -P(S)(SH)-NRi2-, -P(S)(OH)-NRi2-, -P(0)(SH)-NR12-, -HP(0)0-, -HP(S)S-, -HP(0)NRi2- eller -HP(S)NRi2-, hvorved R!2 står for H eller Ci-Cg-alkyl, og
oligo er en naturlig, modifisert eller syntetisk sekvens av naturlige, modifiserte eller syntetiske desoksynukleosider eller peptidnukleinsyrebyggestener, som er bundet over en nukleinbase, en intemukleotidisk bro eller et sukker og hvis indre områder er komplementært til en mål-RNA, eller
(b) omsettes med en forbindelse med formel VIb
hvor
A" og oligo har de betydninger som er beskrevet i (a).
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for fremstilling av oligonukleotidkonjugatene kan for eksempel gjennomføres slik, at et eventuelt funksjonalisert oligonukleotid oppløses i et løsningsmiddel eller en løsningsmiddelblanding og så tilsettes det terpyridin-lantanid-kompleks som bærer den ene, egnede funksjonelle gruppe, og reaksjonsblandingen så las utreagere eventuelt under omrøring. Det dannede konjugat kan deretter renses på i og for seg kjent måte og om ønsket isoleres.
Reaksjonstemperaturen kan for eksempel være 0 til 120°C, foretrukket 20 til 80°C. Særlig foretrukket gjennomføres reaksjonen ved romtemperatur. Er sammenknyttingen en forestrings-, omestrings- eller amideringsreaksjon, kan tilsvarende karboksylsyregrupper på forhånd aktiveres på kjent måte, for eksempel ved reaksjon med karbodiimider og N-hydroksysuksinimid.
Reaktantene anvendes hensiktsmessig i molare forhold. Et overskudd at katalysator eller oligonukleotid kan imidlertid anvendes.
For rensing kan de vanlige fremgangsmåter anvendes, fordelaktig f.eks. dialyse, elektroforese og kromatografiske fremgangsmåter som liøytrykksvæskekromatografi (HPLC), omvendt-HPLC, affinitetskromatografi, ionevekslerkromatografi og gelkromatografi.
De eventuelt funksjonaliserte oligonukleotider som skal anvendes, kan på i og for seg kjent måte fremstilles ved hjelp av automatiserte syntesizere, som er i handelen. Nukleosider for syntese av dem er kjente, delvis i handelen eller kan fremstilles ved hjelp av analoge fremgangsmåter.
Teipyridin-oligonukleotid-konjugatene ifølge oppfinnelsen egner seg fremragende for spesielt sekvensspesifikk spaltning av RNA-sekvenser, hvorved på grunn av deres evne til katalytisk virkning bare overraskende små mengder må anvendes.
En ytterligere gjenstand for oppfinnelsen er en fremgangsmåte for spaltning av fosfatnukleotidbroene i ribonukleinsyrer under fysiologiske betingelser og under innvirkning av et syntetisk terpyridin-lantanid-kompleks, som er karakterisert ved at a) mål-RNA komplekseres med et oligonukleotid, hvis indre sekvens er komplementær med mål-RNA, og til hvilken er terpyridin-lantanid-kompleks er bundet, og b) så las reagere og spaltes.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan gjennomføres in vivo ved avlevering av oligonukleotidene eller in vitro under sammenføring av en mål-RNA og et oligonukleotid som skal anvendes ifølge oppfinnelsen.
Fysiologiske betingelser er kjente for fagmannen og omfatter for eksempel gjennomføringen av fremgangsmåten i vandig medium og i et pH-område fra 5 til 9, foretrukket 5-8 og særlig foretrukket 5-7,5, hvorved det vandige medium videre kan inneholde inerte bestanddeler, for eksempel salter av alkalimetaller eller jordalkalimetaller, og spesielt buffersystemer.
Fremgangsmåten kan gjennomføres ved en temperatur fra f.eks. 0 til 100°C, foretrukket 20-50X og spesielt 30-40X.
I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen foregår spaltningen ved en omestring av fosfatbrobindingen under dannelse av et bruddstykke med en 2,,3'-cyklisk fosfatendegruppe og et ytterligere bruddstykke med en 5'-hydroksylendegruppe. Det cykliske fosfat kan deretter hydrolyseres videre.
Terpyridin-oligonukleotid-konjugatene ifølge oppfinnelsen kan anvendes som legemidler. De har i tillegg en høy stabilitet overfor en nedbrytning med nukleaser. Særlig overraskende er deres utmerkede paring med komplementære nukleinsyrestrenger av RNA-typen. I tillegg viser de et uventet høyt cellulært opptak. Oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen egner seg derfor særlig for antisens-teknologien, dvs. for inhibering av ekspresjonen av uønskede proteinprodukter ved binding til egnede, komplementære nukleotidsekvenser av mRNA (EP 266 099, WO 87/07300 og WO 89/08146). De kan anvendes forbehandling av infeksjoner og sykdommer for eksempel ved blokkeringen av ekspresjonen av bioaktive proteiner på nukleinsyretrinnet (f.eks. onkogener).
En annen gjenstand for oppfinnelsen gjelder også oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen for anvendelse i en terapeutisk fremgangsmåte for behandling av sykdommer hos varmblodige, medregnet mennesker, ved inaktivering av nukleotidsekvenser i kroppen. Doseringen ved tilførsel til varmblodige på ca. 70 kg kroppsvekt kan f.eks. være 0,01-1000 mg/dag. Tilførselen foregår fortrinnsvis i form av farmasøytiske preparater parenteralt, f.eks. intravenøst eller intrapeirtonealt. For parenteral tilførsel egner seg i første rekke vandige løsninger av et vannløselig aktivt stoff, f.eks. et vannløselig, fysiologisk godtagbart salt, eller vandige suspensjoner av slike aktive stoffer, som inneholder viskositetsøkende midler som f.eks. natriumkarboksymetylcellulose, sorbitol og/eller dekstran og eventuelt stabilisatorer. Derved kan det aktive stoff foreligge, eventuelt sammen med hjelpestoffer, også i form av et lyofilisat og før tilførselen brakt i oppløsning ved tilsetning ved egnede løsningsmidler. Konjugatene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes ved hjelp av inhalasjon eller i en liposomal tilførselsform.
Konjugatene ifølge oppfinnelsen kan også finne anvendelse for diagnostiske formål eller som molekylarbiologjske hjelpemidler som sekvensspesifikke endoribonukleaser.
En ytterligere gjenstand for oppfinnelsen gjelder en vandig blanding og spesielt et farmasøytisk preparat på basis av en vandig oppløsning eller suspensjon, som inneholder en virksom mengde av forbindelsene med formel V alene eller sammen med andre aktive stoffer, vann som farmasøytisk bærermateriale, fortrinnsvis i en signifikant mengde og eventuelt hjelpestoffer.
De farmakologisk virksomme forbindelser ifølge oppfinnelsen kan anvendes i form av preparater for parenteral tilførsel eller i form av infusjonsløsninger. Slike oppløsninger er fortrinnsvis isotone, vandige løsninger eller suspensjoner, hvorved disse for eksempel når det gjelder lyofiliserte preparater, som inneholder den aktive substans alene eller sammen med et bærermateriale, f.eks. mannitol, kan fremstilles før bruk. De farmasøytiske preparater kan være sterilisert og/eller inneholde hjelpestoffer, f.eks. konserverings-, stabiliserings-, fornetnings- og/eller emulgeringsmidler, løselighetsformidlere, salter for regulering av det osmotiske trykk og/eller buffere. De farmasøytiske preparater, som om ønsket kan inneholde ytterligere farmakologisk aktive stoffer, som f.eks. antibiotika, fremstilles på i og for seg kjent måte, f.eks. ved hjelp av konvensjonelle oppløsnings- eller lyofiliseringsrfemgangsmåter, og inneholder ca. 0,1% til 90%, spesielt fra ca. 0,5% til ca. 30%, f.eks. 1% til 5% aktive stoffer.
På tegningene er det som eksempel vist strukturene av hybrider av et antisens-oligonukleotid og et substrat-RNA-molekyl.
Foreliggende oppfinnelse vedrører en forbindelse, kjennetegnet ved at den har formel I
hvor
Ri betyr H, Ci-C^alkyl, Ci-C4-aIkoksy, C7-C12-aralkyl, Cg-Cig-aryl, C4-C12-heteroaryl med O, S eller N som heteroatomer, Ci-C4-alkyltio, di(Ci-C4-alkyl)amino, halogenid, sulfonamid eller karboksamid og R5 en enverdig, funksjonell gruppe eller
Ri betyr en enverdig, funksjonell gruppe og R5 betyr H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-Ci2-aralkyl, Cg-Cig-aryl, C4-Ci2-heteroaryl med O, S eller N som heteroatomer, Ci-C4-alkyltio, di(Ci-C4-alkyl)amino, halogenid, sulfonamid eller karboksamid,
hvorved den funksjonelle gruppe er direkte eller via en gruppe Z bundet til pyridinringen og gruppen Z betyr en rest valgt fra gruppen bestående av Ci-C20_al'cylen, C2-Ci2-alkenylen, C2-Ci2-alkinylen, Cs-Cg-cykloalkylen, Cg-C^-arylen og C7-Ci2-aralkylen, hvilken rest eventuelt er avbrutt av -O-, -S-, -NRi2-, -C(O)-0- eller -C(0)-NRi2-,
R2°S R7 uavhengig av hverandre betyr H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-C12-aralkyl, Cg-Cig-aryl, halogen, C4-Ci2-heteroaryl med O, S eller N som heteroatomer, Ci-C4-alkyltio, di(Ci-C4-alkyl)amino, sulfonamid eller karboksamid,
R3 og Rg uavhengig av hverandre er H, Ci-C4-alkyl, C7-C12-aralkyl, Cg-Cig-aryl, halogen, C4-Ci2-heteroaryl med O, S eller N som heteroatomer, Ci-C4-alkyltio, di(Ci-C4-alkyl)amino, sulfonamid eller karboksamid,
R4 står for H, Ci-C2()-alkyl} Cg-Cg-cykloalky<l,> Cg-C^-aryl eller C7-C12-aralkyl,
Ri 2 betyr H eller Ci-Cg-alkyl,
Me står for et lantanidmetall eller yttrium,
Y står for et anion av en syre,
n betyr tallene 2 eller 3, og
m betyr tallene 1, 2 eller 3,
hvorved restene alkyl, cykloalkyl, aralkyl, aryl og gruppen Z er usubstituert eller substituert med Ci-C4-alkoksy, F, Cl, Br, -CN, Ci-C4-alkyl eller -NO2.
Den vedrører også en forbindelse med formel V
kjennetegnet ved at
R2 og R7 uavhengig av hverandre betyr H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-Ci2-aralkyl, Cg-Cig-aryl, halogen, C4-Ci2-heteroaryl med 0, S eller N som heteroatomer, Ci-C4-alkyltio, di(Ci-C4-alkyl)amino, sulfonamid eller karboksamid,
R3 og R5 uavhengig av hverandre er H, Ci~C4-alkyl, C7-Ci2-aralkyl, Cg-Ci<g->aryl, halogen, C4-Ci2-heteroaryl med O, S eller N som heteroatomer, Ci-C4-alkyltio, di(Ci-C4-alkyl)amino, sulfonamid eller karboksamid,
R4 står for H, Ci -C2()-alkyl, C5-Cg-cykloalkyl, Cg-C^-aryl eller C7-Ci2-aralkyl,
hvorved restene alkyl, cykloalkyl, aralkyl og aryl er usubstituerte eller substituert med Ci-C4-alkoksy, F, CL Br, -CN, Ci-C4-alkyl eller -NO2,
Me står for et lantanidmetall eller yttrium,
Y står for et anion av en syre,
n betyr tallene 2 eller 3, og
m betyr tallene 1,2 eller 3,
R9 betyr en rest med formel VI
og Rg betyr H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-Ci2-aralkyl, Cg-Cig-aryl, C4-Ci2-heteroaryl med O, S eller N som heteroatomer, Ci-C4-alkyltio, di(Ci-C4-alkyl)amino, halogenid, sulfonamid eller karboksamid, eller
R9 betyr H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-<C>i2-aralkyl, Cg-Cig-aryl, C4-C12-heteroaryl med O, S eller N som heteroatomer, Ci-C4-alkyltio, di(Ci-C4-alkyl)amino, halogenid, sulfonamid eller karboksamid og Rg betyr en rest med formel VI,
p, q og r uavhengig av hverandre står for 0 eller 1,
X og X' uavhengig av hverandre betyr en usubstituert eller med Ci-C4-alkoksy, F, Cl, Br, -CN, Ci-C4-alkyl eller -NO2 substituert rest valgt fra gruppen bestående av C1-C20-alkylen, <C>2-Ci2-alkenyIen, C2-Ci2-alkinylen, -(CxH2xO)y-, hvor x er lik et tall fra 2 til 6 og y er lik et tall fra 1 til 20, C5-Cg-cykloalkylen, C6-Ci2-arylen og C7-C12-aralkylen,
A og A' uavhengig av hverandre betyr -O-, -S-, -S-S-, -NRi2-CO-NRi2-, -NR12-CS-NR12-, -NR12-, -NRi2-C(0)-0-, -C(0)0-, -C(0)S-, -C(0)NRi2, -C(S)S-, -C(S)0-, -C(S)NRi2, -S02NR12-, -S02-, -P(0)(OH)0-, -P(S)(SH)S-, -P(S)(SH)0-, -P(S)(OH)0-, -P(0)(SH)S-, -P(0)(OH)S-, -P(0)(SH)0-, -P(0)(OH)-NRi2-, -P(S)(SH)-
NRi2-, -P(S)(0H)-NRi2-, -P(0)(SH)-NR12-, -HP(0)0-, -HP(S)S-, -HP(0)NRi2- eller
-HP(S)NRi2-, hvorved Ri2 står for H eller Ci-Cg-alkyl, og
oligo er en naturlig, modifisert eller syntetisk sekvens av naturlige, modifiserte eller syntetiske desoksynukleosider eller peptidnukleinsyrebyggestener, som er bundet over en nukleinbase, en intemukleotidisk bro eller et sukker og hvis indre område er komplementært til en mål-RNA.
Videre vedrører oppfinnelsen en forbindelse med formel II
kjennetegnet ved at
Ri betyr H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoks<y>, C7-C12-aralkyl eller Cg-Cig-<a>ryl eller en enverdig, funksjonell gruppe, hvorved den funksjonelle gruppe er direkte eller over en gruppe Z bundet til pyridinringen, og gruppen Z står for en eventuelt med -O-, -S-,
-NR12-, -C(0)-0- eller -C(0)-NRi2- avbrutt rest som er valgt fra gruppen bestående av Ci-C20-&lkylen, C2-Ci2-alkenylen, <C>2-Ci2-alkinylen, Cs-Cg-cykloalkylen, Cg-C^-arylen og C7-Ci2-<a>ralkylen}
R2 og R7 uavhengig av hverandre betyr H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-C12-aralkyl, Cg-Cig-aryl eller halogen, og
R3 og R5 uavhengig av hverandre betyr H, Ci-C4-alkyl, C7-Ci2-araIkyl eller C6-C16-aryl,
Ri 2 betyr H eller Ci-Cg-alkyl,
hvorved restene alkyl, cykloalkyl, aralkyl, aryl og gruppen Z er usubstituert eller substituert med Ci-C4-alkoksy, F, Cl, Br, -CN, Ci-C4-alkyl eller -N02.
Foreliggende oppfinnelse vedrører også forbindelser med formel HI,
kjennetegnet ved at
R5 er en enverdig, funksjonell gruppe som er bundet til pyridinringen over C2-C20-alkylen, hvorved den funksjonelle gruppe er valgt fra gruppen bestående av -C(0)-ORj2,
-C(0)-NHRi2, -S02-Ri2 og -SO2-NHR12, hvorved R12 er H eller Ci-Cg-alkyl, og R4 står for H eller Ci-C2o-alkyl. Videre vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel I, kjennetegnet ved at et terpyridin med formel II kondenseres med et pyridindialdehyd eller pyridindiketon med formelen EI
i nærvær av et salt med formel TV
Me<n+>(Y<m->)n/m (r<y>), hvor Ri, R2, R3, R4, R5, Rg, R7, Me, Y, n og m har de foran angitte betydninger.
Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel (V) ovenfor kjennetgnet ved at en forbindelse med formel (I) ovenfor (a) omsettes med en forbindelse med formel Via
hvor
A" betyr en egnet, enverdig, funksjonell gruppe som er utvalgt fra gruppen bestående av
-OR10, -SR10, -NCO, -NCS, -NHRi 1, -C(0)ORi 1, -C(0)SH, -C(0)NHRi 1, -C(0)C1, -C(S)SRn, -C(S)NHRn, -C(S)ORn, -SO3R11, -S02NHRi 1, -S02C1, -P(0)(OH)2, -P(0)(OH)-NHRii, -P(S)(SH)2, -P(S)(SH)-NHR! lf -P(S)(OH)2, -P(S)(OH)-NHRn> -P(0)(SH)2, -P(0)(SH)-NHRn, -P(0)(OH)H, -P(0)(NHRi i)H, -P(S)(SH)H, -P(S)(NHRi OH, -P(S)(OH)H, -P(0)(SH)H, hvorved Rio er H, -C(0)NH2, -C(S)NH2, -Ci-C6-alkyl, -CxH2x-NH2, -CxH2x-SH eller -(CxH2xO)y-H og Ri 1 er H, -Ci-C6-alkyl, -CxH2x-NH2, -CxH2x-SH eller -(CxH2xO)y-H, og x er lik et tall fra 2 til 6 og y er lik et tall fra 1 til 20, X' betyr en usubstituert eller med Ci-Cij-alkoksy, F, CL Br, -CN, Ci-C4-alkyl eller -NO2 substituert rest valgt fra gruppen bestående av Ci-C20-alkylen, C2-Ci2-alkenylen, C2-Ci2-alkinylen, -(CxH2xO)y-, hvor x er lik et tall fra 2 til 6 og y er lik et tall fra 1 til 20, C5-C8-cykloalkylen, Cg-C^-arylen og C7-Ci2-aralkylen, A' betyr -O-, -S-, -S-S-, -NRi2-CO-NR12-, -NR12-CS-NR12-, -NRi2-, -NRi2-C(0)-O-, -C(0)0-, -C(0)S-, -C(0)NRi2, -C(S)S-, -C(S)0-, -C(S)NRi2-, -S02NRi2-, -S02-, -P(0)(OH)0-, -P(S)(SH)S-, -P(S)(SH)0-, -P(S)(OH)0-, -P(0)(SH)S-, -P(0)(OH)S-, -P(0)(SH)0-, -P(0)(OH)-NR12-, -P(S)(SH)-NRi2-, -P(S)(OH)-NRi2-, -P(0)(SH)-NR12-, -HP(0)0-, -HP(S)S-, -HP(0)NRi2- eller -HP(S)NRi2-, hvorved R12 står for H eller Ci-Cg-alkyl, og
oligo er en naturlig, modifisert eller syntetisk sekvens av naturlige, modifiserte eller syntetiske desoksynukleosider eller peptidnukleinsyrebyggestener, som er bundet over en nukleinbase, en intemukleotidisk bro eller et sukker og hvis indre område er komplementært til et mål-RNA, eller
(b) omsettes med en forbindelse med formel VIb
hvor
A" og oligo har de betydninger som er beskrevet i (a).
Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte for spaltning av fosfatnukleotidbroen i ribonukleinsyrer under fysiologiske betingelser og under innvirkning av et konjugat av metallkompleks og oligonukleotid, kjennetegnet ved at (a) mål-RNA komplekseres med en forbindelse ifølge ett av kravene 19-39 og (b) så las reagere og spaltes.
Oppfinnelsen vedrører videre en forbindelse med formel (V) i henhold til det ovenstående for anvendelse i en terapeutisk fremgangsmåte for behandling av sykdommer hos varmblodige innbefattet mennesker ved inaktivering av nukleotidsekvenser i kroppen.
Videre vedrører oppfinnelsen et farmasøytisk preparat på basis av en vandig løsning eller suspensjon, kjennetegnet ved at det inneholder en virksom mengde av forbindelsene med forme] (V) ifølge det ovenstående, alene eller sammen med andre aktive stoffer, vann som farmasøytisk bærermateriale og eventuelt hjelpestoffer.
Endelig angår oppfinnelsen anvendelse av en forbindelse med formel (V) ifølge det ovenstående til fremstilling av et legemiddel forbehandling av sykdommer hos varmblodige innbefattet mennesker ved inaktivering av nukleotidsekvenser i kroppen. Fig. 1 viser skjematisk et hybrid av en substrat-RNA (linje betegnet med "5"') og et antisens-oligonukleotid (linje betegnet med "3"'), til hvilket et kompleks ifølge oppfinnelsen (betegnet med "Ln") er bundet (såkalt konjugat). Den angitte nummerering refererer til substrat-RNAs nukleotidbyggestener, hvorved nummereringen foregår slik, at substrat-RNA's nukleotid, som er komplementært til antisens-oligonukleotidets nukleotid, til hvilket komplekset er bundet, betegnes som "0". Den videre nummerering foregår da oppadstigende (+1, +2 osv.) i substrat-RNA's 3'-retning, henholdsvis nedadgående (-1,-2 osv.) i substrat-RNA's 5'-retning. Fig. 2 viser skjematisk et hybrid av en konkret substrat-RNA (CD-1352, se eksempler) og et antisens-oligonukleotid-konjugat ifølge oppfinnelsen (linje betegnet med "3"'). Substrat-RNA's nukleotid med kraftig trykk (her: G) er komplementært med det nukleotid i antisens-oligonukleotid-konjugatet, til hvilket komplekset er bundet.
De etterfølgende eksempler forklarer oppfinnelsen.
A. FREMSTILLING AV UTGANGSFORBINDELSER FOR TERPYRIDIN-LANTANID-KOMPLEKSENE
Eksempel Al: Fremstilling av terpyridin-bis-hydrazinforbindelser
a) Til en løsning av 6-acetyl-2-brompyridin (100 mmol) i 200 ml metanol tilsettes under avkjøling med et isbad 40 ml av en 2 N vandig kaliumhydroksidløsning. Etter tilsetning
av det tilsvarende substituert benzaldehyd (400 mmol) fjernes kjølebadet og blandingen omrøres videre i fire timer ved romtemperatur. Produktet frafiltreres, vaskes tre ganger med vann og to ganger med kald metanol og tørkes i høyvakuum.
Ifølge denne forskrift fremstilles forbindelsene a.1 ( Ry fenyl-4-OCH3, MS 317.7), a.2 ( R\ : fenyl-4-N02, MS 333.6), a.3 ( Ry fenyl-3-N02, MS 334), a.4 ( Ry fenyl-2-N02, MS 334) og a.5 (Ri: fenyl). b) Den a,B-umettede karbonylforbindelse fra (a) (30 mmol), l-(2-brompyridylkarbonylmetyl)-pyridinjodid (12,1 g, 30 mmol) og ammoniumacetat (13,9 g,
180 mmol) anbringes i en kolbe og tilsettes 100 ml eddiksyre. Blandingen kokes på tilbakeløp. Etter to timer avkjøles til romtemperatur, frafiltreres og det således oppnådde produkt tørkes i høyvakuum.
Etter denne anvisning fremstilles forbindelsene b.l ( R\: fenyl-4-OCH3, MS 497.1), b.2 (Ri: fenyI-4-N02, MS 512),b.3 ( Ry. fenyl-3-N02, MS 513), b.4 ( Ry fenyl-2-N02, MS 512) og b.5(Ri: fenyl).
Til en løsning av titantetraklorid (30 mmol) i 75 ml tetrahydrofuran (abs.) tilsettes ved romtemperatur under argonatmosfære porsjonsvis litiumaluminiumhydrid £22 mmol).
Den oppnådde suspensjon omrøres i 20 minutter ved romtemperatur og avkjøles deretter til 0°C. Forbindelsen b.2 (10 mmol) tilsettes og suspensjonen omrøres i 30 minutter ved romtemperatur. Etter forsiktig dråpevis tilsetning av 50 ml vann ved 0°C tilsettes 25 ml av en 25%-ig, vandig ammoniakkløsning. Blandingen tilsettes 150 ml kloroform og filtreres over Celite. Den vandige fase fraskilles og ekstraheres tre ganger med kloroform. Alle organiske faser forenes, vaskes én gang med vann, tørkes over natriumsulfat og konsentreres. Etter denne forskrift fremstilles forbindelsen b.6 (R]: fenyl-4-NH2, MS 482.5). Analogt fremstilles forbindelsene b.7 ( R\ : fenyl-3-NH2, MS 482) ogb.8 (Ri: fenyl-2-N02, MS 482). c) Den tilsvarende dibromterpyridinforbindelse fra (b) (10 mmol) oppløses i 30 ml metylhydrazin og oppvarmes i 17 timer under tilbakeløp. Etter avkjøling til romtemperatur inndampes og resten opptas i 20 ml metanol. Produktet frafiltreres og tørkes i høy-vakuum.
Ifølge denne forskrift fremstilles forbindelsene c.l ( Ry fenyl-4-OCH3, MS 427), c.2 ( Ry fenyl-4-NH2, MS 412.5), c.3 ( Ry fenyl-3-NH2, MS 412), c.4 ( Ry fenyl-2-NH2, MS412)ogc.5 (Ri: fenyl).
Metoksyforbindelsen c.l (10 mmol) suspenderes i 100 ml kloroform og tilsettes under avkjøling med isbad i løpet av 20 minutter en 1-molar løsning av bortribromid (50 mmol) i metylenklorid. Suspensjonen oppvarmes under tilbakeløp i fem dager. Etter avkjøling til romtemperatur helles blandingen på 300 ml isvann og ansyres med 200 ml 2 N vandig saltsyre. Etter ekstraksjon med eter (to ganger) innstilles den vandige fase på pH 9,0 med 10%-ig, vandig natriumkarbonatløsning og omrøres i 30 minutter. Det utfelte produkt c.6 ( Ry fenyl-4-OH, MS 413,5) frafiltreres og tørkes i høyvakuum.
Eksempel A2: Fremstilling av 3-[4'-(2',6'-diformylpyridin)]propionsyre
a) 3,5 g 4-brompyridin-2,6-karboksylsyredimetylester, 390 mg tritolylfosfin, 9,3 ml akrylsyretert.butylester, 7,1 ml trietylamin, 30 ml dimetylformamid og 287 mg
palladiumacetat blandes og oppvarmes til 110°C. Etter 90 minutter avkjøles reaksjonsblandingen til romtemperatur, fortynnes med eter/metylenklorid (1:1) og utristes med NH4CI/H2O. Den organiske fase tørkes med Na2SC«4, inndampes på en rotasjonsfordamper og tørkes i høyvakuum.
250 mg palladium på aktivt kull (5%) og 2,5 g av den ovenfor oppnådde forbindelse oppløses i 250 ml metanol og hydreres over natten ved romtemperatur i H2 -atmosfære. Produktet filtreres gjennom Hyflo, filtratet inndampes på en rotasjonsfordamper og tørkes ved romtemperatur i høyvakuum.
5,0 g av den ovenfor oppnådde forbindelse oppløses i 50 ml metanol og 50 ml tetrahydrofuran. Etter avkjøling til 0°C tilsettes til nevnte løsning 1,1 g NaBIfy. Etter 50 minutters forløp tilsettes ytterligere 1,1 g NaBIfy og etter 130 minutter ytterligere 0,5 g NaBH4- Etter i alt 165 minutter oppvarmes til romtemperatur. Blandingen avkjøles til 0°C. Etter 3,5 timer tilsettes ytterligere 1,1 g NaBFty. Etter seks timer inndampes til et volum på 60 ml. Deretter tildryppes en mettet ammoniumkloridløsning, ekstraheres fire
ganger med CH2C12, de organiske faser vaskes én gang med ammoniumkloridløsning, tørkes med Na2SC*4, frafiltreres og inndampes.
19,8 g av den ovenfor oppnådde forbindelse oppløses i 300 ml dioksan. Deretter tilsettes 16,2 g selendioksid. Reaksjonsblandingen oppvarmes til 100°C og omrøres, etter 45 minutter avkjøles til romtemperatur. Etter ytterligere to timers omrøring filtreres reaksjonsblandingen og inndampes på en rotasjonsfordamper. 4,7 g av den ovenfor oppnådde forbindelse tilsettes til 17,2 ml iskald trifluoreddiksyre. Etter omsetningen til syre inndampes blandingen ved 0°C.
b) 5 g 4-brompyridin-2,6-dikarboksylsyredimetylester oppløses i 175 ml tetrahydrofuran ved romtemperatur. Deretter tilsettes 75 ml metanol. Det avkjøles til 0°C, tilsettes
porsjonsvis i løpet av 45 minutter 3,44 g natriumborhydrid og blandingen får oppvarmes til romtemperatur. Etter én time tildryppes 30 ml aceton i løpet av 10 minutter. Reaksjonsblandingen oppvarmes i løpet av én time under tilbakeløp, reaksjonsblandingen inndampes deretter til tørrhet på en rotasjonsfordamper. Resten innrøres ved romtemperatur i 50 ml pyridin. Til denne tilsettes 0,1 g 4-dimetylaminopyridin og deretter avkjøles til 0°C. I løpet av 30 minutter tildryppes 34,4 ml eddiksyreanhydrid. Suspensjonen får lov å varme seg opp til romtemperatur. 50 ml teh^ydrofuran tilsettes. Etter omrøring over natten ved romtemperatur filtreres reaksjonsblandingen og vaskes to ganger med hver gang 50 ml tetrahydrofuran. Filtratet konsentreres på en rotasjonsfordamper. Ved krystallisasjon oppnås 4-brom-2,6-di(acetoksymetyl)pyridin. (Smeltepunkt: 66-69°C).
0,982 g 4-brom-2,6-m(acetoksymetyl)pyridin, 1,5 g3-(tributylstaimyl)-akrylsyreetylester og 176 mg palladiumtetrakis(trifenylfosfin) oppløses i 25 ml dioksan og oppvarmes til 90°C. Etter 90 minutter avkjøles reaksjonsblandingen. Det faste produkt fraskilles og omkrystalliseres fra heksan/eddikester. MS 321 (M<+>).
2,74 g av den ovenfor oppnådde forbindelse og 70 mg Wilkinsons-katalysator oppløses i 150 ml benzen. 12,2 ml trietylsilan tilsettes og løsningen oppvarmes på tilbakeløp. 270 mg katalysator trietylsilan i overskudd tilsettes porsjonsvis i løpet av én time. Produktet renses kromatografisk. MS 323.
267 mg natrium oppløses i 50 ml etanol. 7,2 ml av denne løsning tilsettes til en løsning av 1,845 g av den ovenfor oppnådde forbindelse i 35 ml etanol. Etter 2,5 timers omrøring ved romtemperatur filtreres reaksjonsblandingen gjennom silikagel, og filtratet inndampes til tørrhet. Produktet tørkes over natten i høyvakuum. NMR (CDCI3) S 7,0 (2H,s), 4,7 (2H,s), 4,7 (4H,s), 4,1 (2H,q), 2,9 (2H,t), 1,2 (3H,t).
1,27 g av den ovenfor oppnådde forbindelse oppløses i 30 ml dioksan. Dertil settes 714 mg selendioksid. Reaksjonsblandingen oppvarmes og filtreres etter to timer gjennom vatt. Filtratet inndampes til tørrhet. Resten opptas i eddikester/metylenklorid (5%) og filtreres over silikagel.
iHNMR^DC^) 8 10,1 (2H,s), 8,0 (2H,s), 4,1 (2H,q), 3,1 (2H,t), 2,7 (2H,t), 1,2 (3H,t).
Til en løsning av 45 ml eter og 350 mg av den ovenfor oppnådde forbindelse tilsettes ved 0°C 13 ml av en på forhånd tilberedt løsning (0,949 g kopperbromid.dimetylsulfid i 10 ml eter, avkjølt til 0°C, 5,9 ml metyllitium). Etter 5,5 timers omrøring ved romtemperatur avkjøles til 0°C. Det tilsettes 2 ml iseddik i 8 ml eter og 8 ml etantiol. Etter omrøring over natten ved romtemperatur tilsettes 60 ml vann og utristes fire ganger med metylenklorid. Den organiske fase fortørkes med Na2S04, filtreres, inndampes på en rotasjonsfordamper og renses ved kromatografi. MS 266 (M+H)<+>.
Til en løsning av 4,5 ml metylenklorid + oksalylklorid tilsettes ved -78°C 0,5 ml DMSO. Etter 15 minutter tilsettes denne løsning til en løsning av 193 mg av den ovenfor oppnådde forbindelse i 4 ml metylenklorid. Etter to timer ved -78°C tilsettes 1,5 ml trietylamin. Etter 30 minutters omrøring ved 0°C tilsettes 15 ml vann og utristes fire ganger med dietyleter. Den organiske fase fortørkes med Na2SC>4, inndampes på en rotasjonsfordamper og renses ved kromatografi. 0,464 g av den ovenfor oppnådde forbindelse og 5 ml 4 N HC1 oppvarmes sammen til 50°C. Etter 90 minutter avkjøles reaksjonsblandingen til romtemperatur og fortynnes med isvann. Det krystallinske produkt oppnås.
Eksempel A3: Fremstilling av ytterligere terpyridin-bis-hydrazinforbindelser og 2,6-dikarbonyIpyirdmforbindelser
1. Fremstilling av 2,6-dikarbonylforbindelsen (f)
(a) Fremstilling av forbindelsen (d):
0,3 g (1,4 mmol) 2,6-di(hydroksymetyl)-4-brompyridin, 0,25 g (2,8 mmol) sarkosin og 0,11 g (2,8 mmol) NaOH tilsettes til en løsning av 15 ml metanol og 15 ml vann. Det arbeides under nitrogen ved et trykk på 250 bar. Det oppvarmes til 100°C og får koke så lenge, til det ikke kan fastslås noe 2,6-di(hydroksymetyl)-4-brompyridin. Etter to dager er reaksjonen avsluttet. Den brune reaksjonsblanding inndampes og produktet renses kromatografisk (elueringsmiddel: 20-80% MeOH/CH2Cl2). Det oppnås en gul olje. ^H-NMR (MeOH): 5 6,6 (2H)s; 4,5 (4H)s; 3,8 (2H)s; 3,1 (2H)s; 3,0 (3H)s.
(b) Fremstilling av forbindelsen (e):
Det fremstilles en suspensjon av 4,5 g av det råprodukt (d) som er oppnådd ovenfor, i 450 ml metanol og oppvarmes til koking. Til denne suspensjon tilsettes 6 ml konsentrert svovelsyre, slik at det oppnås en klar løsning. Denne oppvarmes i tre timer under tilbakeløp. Løsningen får avkjøle seg, det tilsettes 5 g kaliumkarbonat og omrøres i ti minutter. Det tilstedeværende faststoff frafiltreres og løsningsmidlet fjernes på en rotasjonsfordamper. Deretter renses råproduktet over en silikagelsøyle (silikagel 44 g; elueringsmiddel 1:9:50 eddiksyre/metanol/metylenklorid). Det oppnås et gult, krystallinsk faststoff.
<i>H-NMR (MeOD): 8 6,8 (2H)s; 4,6 (4H)s; 3,7 (2H)s; 3,7 (3H)s; 3,2 (3H)s.
(c) Fremstilling av forbindelsen (f):
En løsning av forbindelsen (e) (0,557 g, 2,31 mmol) som er oppnådd som ovenfor, i 8 ml pyridin/dioksan (1:1) oppvarmes til koking. Til den oppnådde gule løsning tilsettes 1,54 g selendioksid (13,7 mmol) og oppvarmes i fire timer under tilbakeløp (ifølge DC er det ikke lenger noe edukt tilstede). Blandingen får avkjøles til romtemperatur, opptas i ~ 100 ml aceton/metylenklorid (1:9), filtreres over en liten silikagelsøyle og ettervaskes med det samme løsningsmiddel. Den oppnådde klare, gule løsning inndampes på en rotasjonsfordamper og råproduktet renses ved hjelp av søylekromatografi (elueringsmiddel aceton/metylenklorid 1:40). Det oppnås et hvitt faststoff.
<i>H-NMR (CDC13): 8 10,1 (2H)s; 7,3 (2H)s; 4,2 (2H)s; 3,8 (3H)s; 3,2 (3H)s.
2. Fremstilling av 2,6-dikarbonylpyirdinforbindelsen (k)
(a) Fremstilling av forbindelsen (g):
580 mg kaliumtertiærbutylat (5,17 mmol) i 20 ml dimetylsulfoksid anbringes under argon i en 100 ml Sulvier-kolbe og det tilsettes porsjonsvis 1 g cheliklam-syredimetylester (4,7 mmol) (lett eksoterm reaksjon). Etter ti minutter tildryppes langsomt 1,04 ml bromeddiksyretertiærbutylester (7,05 mmol) i 2 ml dimetylsulfoksid til løsningen og omrøres i tre timer. Etterat reaksjonen er stanset med isvann, utristes reaksjonsblandingen tre ganger med 20 ml dietyleter. De forenede eterfaser vaskes én gang
med 30 ml vann og tørkes deretter med natriumsulfat. Løsningen inndampes på enn rotasjonsfordamper og tørkes i høyvakuum. Det oppnås hvit/gulaktige krystaller, som renses over en silikagelsøyle (70 g Kieselgel 60 F, Merck 9385; elueringsmiddel metanol/diklormetan 1:100). Det oppnås hvite krystaller.
<i>H-NMR (CDCI3): 6 7,8 (2H)s; 4,7 (2H)s; 4,0 (6H)s; 1,5 (9H)s.
(b) Fremstilling av forbindelsen (h):
1,17 g (3,6 mmol) av den forbindelse (g) som er fremstilt ovenfor, oppløses i 65 ml dimetoksyetan og avkjøles til 0°C. Derpå tilsettes 680 mg (18 mmol) NaBIfy i små porsjoner. Det omrøres i 15 minutter ved 0°C. Deretter får reaksjonsblandingen varme seg opp til romtemperatur. Etter tre timer avkjøles reaksjonsblandingen igjen til 0°C. Det tilsettes 12 ml aceton og omrøres deretter i 15 minutter. Blandingen oppvarmes til romtemperatur og filtreres. Løsningsmidlet inndampes på rotasjonsfordamper og tørkes deretter i høyvakuum. Råproduktet fra den første reaksjonen oppløses i 55 ml pyridin og avkjøles til 0°C. Det tilsettes 6,8 ml (72 mmol) eddiksyreanhydrid og 44 mg (0,36 mmol) dimetylaminopyridin. Blandingen for varmes opp til romtemperatur. Det fortynnes nå med vann og utristes tre ganger med dietyleter. De organiske faser tørkes med Na2SC>4 og inndampes på en rotasjonsfordamper. Deretter tørkes i høyvakuum. Det
blir tilbake en brun olje. Produktet renses ved hjelp av søylekromatografi (100 g silikagel, elueringsmiddel: 1% metanol i CH2CI2). Det rene produkt oppnås. <i>H-NMR (CDCI3): 5 6,8 (2H)s; 5,2 (4H)s; 4,6 (2H)s.
(c) Fremstilling av forbindelsen (i):
170 mg (0,48 mmol) av det edukt (h) som ble oppnådd ovenfor, oppløses i 6,5 ml metanol og avkjøles til 0°C. Det tilsettes 1,7 ml 32%-ig ammoniakkløsning og omrøres i 1,5 timer. Reaksjonsblandingen inndampes på en rotasjonsfordamper og tørkes i høy-vakuum. Det oppnås en gul gel, som renses ved hjelp av søylekromatografi (20 g Kieselgel 60 F, Merck nr. 9385, elueringsmiddel metanol/diklormetan 1:15). Som sluttprodukt foreligger et hvitt faststoff.
<i>H-NMR (CD3OD): 8 7,0 (2H)s; 4,8 (2H)s; 4,5 (4H)s; 1,5 (9H)s.
(d) Fremstilling av forbindelsen (j):
I en 25 ml's spisskolbe oppløses 260 ul oksalylklorid (3,0 mmol) i 6 ml diklormetan under argon og avkjøles til -78°C. Deretter tilsettes 370 ul dimetylsulfoksid (5,25 mmol). Reaksjonsblandingen omrøres i 15 minutter ved -78°C. Så tilsettes en løsning av den forbindelse (i) (200 mg, 0,75 mmol) som er oppnådd som ovenfor, i 2 ml diklormetan/200 ul dimetylsulfoksid (temperaturkontroll!). Etter to timers omrøring ved
-78°C stanses reaksjonen med 1,04 ml trietylamin (2,5 mmol) i 2 ml diklormetan. Det omrøres ytterligere 15 minutter ved 0°C. Reaksjonsblandingen inndampes på en rota-
sjonsfordamper og tørkes i høyvakuum. Det oppnås brune krystaller, som filtreres ved hjelp av Kieselgel 60 F (løsningsmiddel: heksan:eddiksyreetylester 2:1).
<t>ø-NMR (CDCI3): 6 10,1 (2H)s; 7,6 (2H)s; 4,7 (2H); 1,5 (9H)s.
(e) Fremstilling av forbindelsen (k):
65 mg av den forbindelse (j) som er oppnådd som ovenfor, omrøres i 14 ml 4 N saltsyreløsning ved romtemperatur i 1,5 timer. Reaksjonsblandingen inndampes til tørrhet i en rotasjonsfordamper og tørkes i høyvakuum. Det oppnås lett gulaktige krystaller som råprodukt.
<i>H-NMR (CD3OD): 8 7,4 (2H)s; 5,1 (2H)s.
3. Fremstilling av terpyridin-bis-hydrazinforbindelsen (o)
(a) Fremstilling av forbindelsen (m):
11,49 g (205 mmol) KOH pulveriseres. Dette anbringes sammen med 20 g (164 mmol) 4-hydroksybenzaldehyd og 1,66 g (4,09 mmol) Aliquat 336 i et kar. Det omrøres med en halvankeromrører, avkjøles i isbad og tildryppes forsiktig 14,24 ml (164 mmol) 3-brompropanol. Reaksjonsblandingen oppvarmes til 100°C. Den mørkebrune suspensjon omrøres over natten ved 100°C under argon. Til reaksjonsblandingen tilsettes 250 ml CH2CI2. Det røres videre. Den oppnådde suspensjon filtreres over Hyflo, inndampes og tørkes i høyvakuum. Råproduktet renses kromatografisk i to deler med flash-søyler (elueringsmiddel: 2% THF/CH2CI2), hvorved sluttproduktet oppnås.
<i>H-NMR (CDCI3): 5 9,9 (lH)s; 7,8 (2H)d; 7,0 (2H)d; 4,2 (2H)t; 3,9 (2H)m; 2,1 (2H)m; l,9(lH)s.
(b) Fremstilling av forbindelsen (n):
13 g av den forbindelse (m) (0,072 mol) som er oppnådd som ovenfor, 28,86 g 2-acetyl-6-brompyridin (0,144 mol), 63,72 g acetamid (1,08 mol) og 41,58 g ammoniumacetat (0,54 mol) anbringes i en kolbe og omrøres i to timer ved 180°C. Den brune suspensjon får avkjøles til 120°C og det tildryppes en løsning av 140 g natriumhydroksidpastiller i 300 ml vann. Reaksjonsblandingen kokes i to timer. Det dannes en mørkebrun gummi, som befris fra det overstående løsningsmiddel ved hjelp av dekantering og vaskes enda én gang med vann. Den svarte, gummiaktige substans oppløses i så lite iseddik som nød-vendig. Til den varme løsning tilsettes den ekvivalente mengde bromhydrogen (48% i vann) og får stå over natten. De lysegule krystaller avsuges, tilsettes vann og innstilles på pH-verdien 7-8 med 4 normal kaliumhydroksidløsning. Den gule suspensjon ekstraheres tre ganger med diklormetan. Den organiske fase filtreres gjennom vatt, inndampes på en rotasjonsfordamper og tørkes i høyvakuum. Råproduktet omkrystalliseres med etanol. Det oppnås gule krystaller. (c) Fremstilling av forbindelsen (o):
6,38 g av den forbindelse (n) som er oppnådd som ovenfor, tilsettes til 88 ml metylhydrazin. Det oppvarmes til 85°C og omrøres i to timer. Etter avkjøling tilsettes 150 ml MeOH, slik at produktet faller ut. Suspensjonen avfiltreres og de oppnådde krystaller tørkes.
<i>H-NMR (DMSO): 5 8,5 (2H)s; 7,8(4H)m; 7,7 (2H)t; 7,2 (2H)d; 7,1 (2H)d; 4,6 (2H)t; 4,1 (2H)t; 3,5 (2H)m; 3,3 (6H)s; 1,9 (2H)m.
4. Fremstilling av teipyridin-bis-hydrazinforbindelsen (q)
(a) Fremstilling av forbindelsen (p):
2,6 g antracen-9-karbaldehyd (12,5 mmol), 5 g 2-acetyl-6-brompyridin (25 mmol), 11,2 g acetamid (187,5 mmol) og 7,1 g ammoniumacetat (93,7 mmol) anbringes i en kolbe. Den dannede brune løsning oppvarmes i to timer under tilbakeløp (badtemperatur 180°C). Etterat blandingen var avkjølt til 110°C, tildryppes 33 g i 71 ml vann oppløste natriumhydroksidpastiller (0,83 mol). Reaksjonsblandingen oppvarmes ytterligere to timer under tilbakeløp og avkjøles deretter til 90°C. Den overstående løsning avdekanteres, og det gjenværende faststoff vaskes to ganger med vann. Den svarte masse oppløses i 25 ml eddiksyre. Det tilsettes 1,75 ml 48%-ig bromhydrogenløsning og blandingen får stå i fem dager. Nå avfiltreres suspensjonen og det oppnådde grønne bunnfall vaskes med dietyleter. Krystallene suspenderes i vann, som innstilles på pH-verdien 8 med 2 normal kaliumhydroksidløsning og utristes med diklormetan. Etter tørking av den organiske fase med natriumsulfat, inndamping på en rotasjonsfordamper og tørking i vakuum oppnås en grønn masse. Denne omkrystalliseres med omtrent 400 ml etanol. De oppnådde krystaller opptas i en etanol/diklormetanblanding og utristes to ganger med en mettet ammoniumkarbonatløsning. De organiske faser tørkes over natriumsulfat, innroteres og tørkes i høyvakuum. Råproduktet renses gjennom en søyle (elueringsmiddel heksan:eddiksyreetylester 9:1). Det oppnås grønn-brune krystaller. (b) Fremstilling av forbindelsen (q):
1,43 g (2,5 mol) av den forbindelse (p) som er fremstilt som ovenfor, tilsettes til 50 ml metylhydrazin og kokes på tilbakeløp over natten. Det oppstår en mørkebrun løsning. Løsningsmidlet inndampes på en rotasjonsfordamper. Produktet suspenderes i varm metanol og filtreres deretter. Det oppnås 400 mg grønne krystaller. Disse
omkrystalliseres fra CH3CN. Først klarfiltreres, avkjøles og avfiltreres. Deretter tørkes i høyvakuum og det oppnås grønne krystaller. Disse renses igjen ved omkrystallisasjon fra CH3CN. Det oppnås igjen grønne krystaller. Moderluten inndampes likeledes. Det faller ut 1 g brune krystaller. Disse omkrystalliseres likeledes fra CH3CN og tørkes deretter i høyvakuum. Det oppnås lysebrune krystaller.
Elementæranalvse:
5. Fremstilling av 2,6-dikarbonylforbindelsen (r):
118 ul (1,38 mmol) oksalylklorid under argon i 2 ml CH2CI2 avkjøles til -78°C. Deretter tildryppes forsiktig 195 ul (2,75 mmol) DMSO. Reaksjonsblandingen omrøres i 15 minutter ved -78°C. Deretter oppløses 100 mg (0,458 mmol) 2,6-di(hydroksymetyl)-4-brompyridin i 100 ul DMSO og tilsettes 1 ml CH2C12. Denne løsning tilsettes til reaksjonsblandingen. Det omrøres i én time ved -78°C. Nå tilsettes 381 ul (2,75 mmol) Et3N og omrøres i 15 minutter ved 0°C. Det inndampes og oppløses i H2O og CH2CI2. De to faser ekstraheres. Den vandige fase vaskes to ganger med CH2CI2. Den organiske fase
filtreres gjennom vatt. Det inndampes og tørkes i høyvakuum. Det oppnås lysebrune krystaller.
<i>H-NMR (CDCI3): 6 10,1 (2H)s; 8,7 (2H)s.
6. Fremstilling av terpyridin-bis-hydrazinforbindelsen (s):
72 mg av den forbindelse b.5 (0,16 mmol) som er oppnådd som under eksempel Al(b), opptas i 480 mg butylhydrazin (5,44 mmol) og oppvarmes til 110°C under argon. Suspensjonen kokes over natten. Etterat reaksjonsblandingen er avkjølt fortynnes med dietyleter og metanol og befris fra faststoff ved hjelp av en filtrering. Filtratet oppkonsentreres på en rotasjonsfordamper. Ved tilsetning av metanol foretas en utfelling. Krystallene avfiltreres fra den kalde løsning og ettervaskes med litt metanol. Produktet tørkes i svakt vakuum. Det oppnås beige krystaller.
B. FREMSTILLING AV TERPYRIDIN-LANTANID-KOMPLEKSER
Eksempel Bl:
1. ) 1 mmol av den tilsvarende terpyridin-bis-hydrazinforbindelse fra eksempel Al(c) opptas under argon i 60 ml absolutt metanol, tilsettes lantanid(m)acetat (1 mmol) og oppvarmes i ti minutter under tilbakeløp. Til denne løsning tilsettes etter hverandre 1,2 mmol av den tilsvarende 2,6-dikarbonylforbindelse og 5 mmol konsentrert, vandig saltsyre. Det kokes i to dager. Etter avkjøling til romtemperatur avfiltreres produktet og tørkes i høyvakuum. Etter denne forskrift fremstilles forbindelsene 1.1 til 1.28 i tabell 1. 2. ) 1 mmol av den tilsvarende terpyridin-bis-hydrazinforbindelse fra eksempel Al(c) opptas under argon i 60 ml absolutt metanol, tilsettes lantanid(m)klorid (1 mmol) og oppvarmes i ti minutter under tilbakeløp. Til denne løsning tilsettes etter hverandre 1,2 mmol av den forbindelse som ble oppnådd i eksempel A2(a). Det kokes over natten. Etter avkjøling til romtemperatur avtrekkes løsningsmidlet og produktet oppnås ved omkrystallisasjon fra dimetylsulfoksid og toluen. Etter denne forskrift fremstilles forbindelsene 1.29 til 1.32 i tabell 1. Analogt oppnås forbindelsene 1.33 til 1.44 i tabell 1.
3.) Fremstilling av terpyridin-lantanid-komplekser med ytterligere substituenter R5
(a) Fremstilling av forbindelsen 1.45:
168 mg av den substans c.5 (0,423 mmol) som er oppnådd som i eksempel Al(c) tilsettes til 20 ml tørr metanol og oppvarmes til koking. Nå tilsettes 155 mg europiumtrikloridheksahydrat (0,423 mmol) og den gule suspensjon omrøres i 15 minutter. Etter tilsetning av 100 mg av den substans (f) (0,423 mmol) som er oppnådd som i eksempel Al(c) i 15 ml tørr metanol kokes suspensjonen over natten under argon på tilbakeløp. Etterat reaksjonsblandingen er avkjølt til romtemperatur, filtreres denne og 2/3 av løsningsmidlet i den oppnådde gule løsning avtrekkes. Ved hjelp av dietyleter utfelles orange-fargede krystaller fra løsningen og avfiltreres gjennom et milliporefilter. Faststoffet tørkes i høyvakuum. Det oppnås orange-fargede krystaller.
Analogt oppnås de forbindelser 1.46 til 1.58 som er angitt i tabell 1.
(b) Fremstilling av forbindelsen 1.59:
10 mg (0,0116 mmol) av forbindelse 1.45 som er oppnådd som ovenfor, tilsettes til 5 ml vann og oppvarmes på tilbakeløp. Det oppstår en gul løsning. Etter tre dager filtreres reaksjonsblandingen gjennom Acradisk. Det inndampes og tørkes i høyvakuum. Det oppnås et gult faststoff.
4.) Fremstilling av terpyridin-lantanid-komplekser med ytterligere substituenter R5
(a) Fremstilling av forbindelsen 1.60:
48 mg av den substans c.5 (0,12 mmol) som er oppnådd som i eksempel Al(c) oppvarmes i 7,5 ml metanol under argon og tilbakeløp. Nå tilsettes 44 mg europiumtrikloirdheksahydrat (0,12 mmol) og det kokes i 15 minutter med tilbakeløp. Etterat den forbindelse (k) som er oppnådd som i eksempel A3.2(e), i 2,5 ml metanol er tilsatt, holdes løsningen i 45 minutter under koking. Den avkjølte suspensjon avfiltreres gjennom et filter og den klare, gule løsning oppkonsentreres på en rotasjonsfordamper til ca, 2 ml. Av denne utfelles et gult bunnfall ved hjelp av dietyleter, som så vaskes én gang med en løsning av dietyleter/metanol 1:1 og to ganger med dietyleter. Resten tørkes under høyvakuum. Det oppnås gule krystaller. (b) Fremstilling av forbindelsen 1.61:
Forbindelsen 1.61 fremstilles fra forbindelsen 1.60 analogt med fremstillingen av forbindelse (1.59) fra forbindelse (1.45).
5.) Fremstilling av terpyridin-lantanid-komplekser med ytterligere substituenter R\
(a) Fremstilling av forbindelsen 1.62:
136 mg av den i eksempel A3.3(c) oppnådde forbindelse (o) (5,94 mmol) oppløses i 400 ml tørr metanol og oppvarmes under argon til tilbakeløp. Så tilsettes 1,53 g europiumtrikloridheksahydrat (5,94 mmol) og reaksjonsblandingen kokes i 0,5 time på tilbakeløp. Deretter tilsettes 2,6-diacetylpyridin (5,94 mmol), som er oppløst i 100 ml tørr metanol, og 2 dråper konsentrert saltsyre til den oppnådde, klare gule løsning. Denne reaksjonsblanding kokes i åtte dager under tilbakeløp. Etter avkjøling til romtemperatur avfiltreres suspensjonen gjennom et hydrofilter. Den oppnådde klare, gule løsning oppkonsentreres på en rotasjonsfordamper. Ved hjelp av dietyleter oppnås en utfelling. Bunnfallet vaskes én gang med en blanding av dietyleter/metanol 1:1 og to ganger med dietyleter. Resten tørkes i høyvakuum. Det oppnås et orange-farget faststoff. 6.) Fremstilling av terpyridin-lantanid-komplekser med ytterligere substituenter R5 (a) Fremstilling av forbindelsen 1.63: 96 mg av den forbindelse c.2 (0,234 mmol) som er oppnådd som i eksempel Al.(c), opp-løses i 20 ml tørr metanol og oppvarmes under argon til tilbakeløp. Så tilsettes 60 mg europiumtrikloridheksahydrat (0,234 mmol) og reaksjonsblandingen kokes i 0,5 time på tilbakeløp. Deretter tilsettes 50 mg av den forbindelse (r) (0,234 mmol) som er oppnådd som i eksempel A3.5, som er oppløst i 15 ml tørr metanol, og 2 dråper konsentrert saltsyre til den oppnådde klare, gule løsning. Denne reaksjonsblanding får koke over natten under tilbakeløp. Etter avkjøling til romtemperatur avfiltreres den mørkerøde suspensjon gjennom et hydrofilter. Den oppnådde klare, røde løsning oppkonsentreres på en rotasjonsfordamper, og ved hjelp av dietyleter oppnås en utfelling. Bunnfallet vaskes én gang med en blanding av dietyleter/metanol 1.1 og to ganger med dietyleter. Resten tørkes under høyvakuum. Det oppnås et mørkerødt faststoff.
7.) Fremstilling av terpyridin-lantanid-komplekser med ytterligere substituenter R\, henholdsvis R5
(a) Fremstilling av forbindelsene 1.64 til 1.74:
I analogi med de ovenfor beskrevne reaksjoner, eksempelvis for fremstilling av forbindelsene 1.62 og 1.63, fremstilles de forbindelser 1.64 til 1.74 som er oppført i tabell 1, fra de tilsvarende substituerte 2,6-dikarbonylpyridin-forbindelser og de tilsvarende substituerte terpyridin-bis-hydrazinforbindelser.
Eksempel B2: Fremstilling av isotiocyanatderivater
Til en suspensjon av 4,4 mmol natriumbikarbonat og 2,5 mmol tiofosgen i 4 ml kloroform tilsettes en løsning av det tilsvarende kompleks i tabell 1. Blandingen røres kraftig ved romtemperatur i 2,5 timer. Kloroformfasen fraskilles og vaskes én gang med vann. Alle vandige faser forenes og tørkes. De således oppnådde produkter 2.1 til 2.15 i tabell 2 videreanvendes uten ytterligere rensing. Analogt fremstilles de tilsvarende isotiocyanatforbindelser fra ytterligere forbindelser i tabell 1, som inneholder primære aminogrupper som substituenter.
C. FREMSTILLING AV AMINONUKLEOTIDENE
Ca. 30 mg av "controled pore glass" (CPG)-fastfasen innveies i et Standard Applied Biosystem-reaksjonskar for en 1,5 umol-syntese. CPG-fastfasen (1) bærer den beskyttede 3'-byggestenen (i eksemplet, dC) til det aminonukleotid som skal syntetiseres.
For oligomeriseringen anvendes fosforamidittene (6), (7), (8) og (9).
For den senere tilknytning av metallkompleksene via aminofunksjonen anvendes atskilte fosforamiditter (10), (11), (12), (13), (14), (15) og (16).
Fremstillingseksempler for fosforamiditter (14), (15) og (16):
- Fremstilling av utgangsforbindelse (14a) (n = 3, R = H):
4,0 g 3-amino-l-propanol, 3,28 g 4-metoksytrifenylklormetan og 35 ml pyridin anbringes i en vannfri kolbe. Ved romtemperatur og under argon omrøres i 4,5 timer. Løsningsmidlet inndampes. Resten tilsettes én gang toluen og to ganger acetonitril og innroteres eventuelt. Resten oppløses i metylenklorid og vaskes to ganger med mettet natriumhydrogenkarbonatløsning. De vandige faser ekstraheres tre ganger med metylenklorid. De organiske faser forenes, tørkes over natriumsulfat og konsentreres. Deretter renses råproduktet ved hjelp av flash-kromatografi (silikagel).
(Elueringsmiddel: eddikester/heksan = 1:2). Det oppnås en gul olje.
<i>H-NMR: 8 i CDC13, OCH3 = 3,65.
Utgangsforbindelsene (15a) (n = 4, R = H) og (16a) (n = 5, R = H) fremstilles analogt fra 4-amino-1 -butanol, henholdsvis 5-amino-l-pentanol.
<i>H-NMR: 8i CDCI3, OCH3 = 3,65 (15a) hhv. 3,65 (16a).
- Fremstilling av fosforamiditt (14):
Under argon anbringes 1,99 g N,N-diisopropylammoniumtetrazolid og 3,5 g 2-cyanoetyl-N,N,N\N'-tetraisopropyl-fosfordiamiditt i 150 ml metylenklorid. I løpet av 20 minutter tildryppes en løsning av den forbindelse (14a) som er oppnådd som ovenfor, i 120 ml metylenklorid. Den fine, gule suspensjon omrøres i 4,5 timer. Deretter fortynnes med 250 ml metylenklorid og vaskes to ganger med mettet natriumhydrogenkarbonatløs-ning. De vandige faser ble ekstrahert tre ganger med metylenklorid. De organiske faser forenes, tørkes over natriumsulfat og konsentreres. Deretter renses råproduktet ved hjelp av flash-kromatografi (silikagel) (elueringsmiddel: eddikester/heksan = 1:4 + 0,5% N-metylmorfolin). Det oppnås en gul olje.
31p-NMR: 5 i CDCI3,146,9).
Fosforamidittene (15) og (16) fremstilles analogt fra de forbindelser (15a) hhv. (16a) som er oppnådd som ovenfor.
<31>P-NMR: 8 i CDCI3, 146,9 (15) hhv. 147,0 (16).
Syntesesyklusene gjennomføres med Syntheseautomat 394 fra Applied Biosystem med
én forandring (koplingstid for fosforamidittene i desoksy-rekken (6), (7), (8) og (9) er to minutter, for amidittene (10) og (11) er ti minutter, for (12) er tiden fem minutter og for (13) 40 minutter; (13) anvendes i hundre gangers overskudd) ifølge standardprotokollen til Firma Applied Biosystem (User Manual Version 2.0 (1992). For konjugasjon av de oppnådde oligonukleotider med metallkompleksene avspaltes de aktuelle beskyttelses grupper under standardbetingelser.
Som ytterligere reagenser i handelen anvendes:
0,1 M fosforamiditt
Tetrazol/acetonitril: 4%, 96%
Tert-butylfenoksyeddiksyreanhydird/pyridii^ 10%, 10%, 80% N-metylimidazoVtetrahydrofuran: 16%, 84%
Trikloreddiksyre/dimetylklormetan: 2%, 98%
Jo(<y>vann/pyridir^tefrahydrofuran: 3%, 2%, 20%, 75%
Følgende amino-oligonukleotider syntetiseres:
hvorved T står for thymin, hvorved T står for thymin, D. FREMSTILLING AV TERPYRIDIN-LANTANID-OLIGONUKLEOTID-KONJUGATENE Eksempel Dl: Fremstilling av konjugater, i hvilke oligonukleotidet er bundet til lantanidkompleksets terpyridindel (a) 0,2 mg av det tilsvarende aminooligonukleotid oppløses i 150 ul pyridin/vann/trietylamin (90:15:1). Etter tilsetning av 1 mg av det tilsvarende isotiocyanatkompleks i tabell 2 får blandingen stå i én time ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen dialyseres én gang mot en 0,1 molar kaliumkloirdløsning og tre ganger mot vann. Produktet renses med omvendt-fase-HPLC (gradient: fra 0% til 30% acetonitril i 0,05 M trietylammoniumacetat i 90 minutter) på en Nucleosil-Ci g-søyle eller ved ioneveksler-HPLC (gradient: 10 minutter 20% av en IM kaliumkloridløsning og 80% av en 20 mM kaliumfosfatløsning pH 6,0, som inneholder 20% acetonitril; så i løpet av 60 minutter på 80% kaliumkloridløsning) ved 60°C på en PVDI.400GA-søyle, 5 fim gir de rene konjugater 3.1 til 3.13,3.18 og 3.21 i tabell 3. (b) 3 mg av det tilsvarende aminooligonukleotid suspenderes i 200 ul DMSO/100 ul N-metylmorfolin. Etter tilsetning av 1 mg av det tilsvarende isotiocyanatkompleks (se tabell 2 så vel analogt fremstilte isotiocyanatkomplekser fra tilsvarende forbindelser i tabell 1) får blandingen stå i to-tre timer ved romtemperatur. Produktet spaltes fra den faste fase ved behandling med 32% vandig ammoniakk og fullstendig avbeskyttet (tre timer ved romtemperatur). Rensing ved hjelp av omvendt-fase-HPLC gir forbindelsene 3.26 til 3.44 i tabell 3.
Eksempel D2: Fremstilling av konjugater, i hvilke oligonukleotidet er bundet til lantanidkompleksets pyridindel
(a) En løsning av 3 umol av det tilsvarende karboksylsyrederivat 1.29 til 1.32 (tabell 1) i 200 ul dimetylsulfoksid tilsettes 3,3 umol dicykloheksylkarbodiimid og 3,3 umol N-hydroksysuksinimid og får stå i 16 timer ved romtemperatur. Etter tilsetning av 100
umol N,N-diisopropyletylamin tilsettes 0,2 mg av det tilsvarende aminooligonukleotid. Etter fire dager ved romtemperatur dialyseres to ganger mot 50 mM trietyl-ammoniumhydrogenkarbonat og to ganger mot vann. Rensing med omvendt-fase-HPLC
(se Dl(a)) gir forbindelsene 3.14 til 3.17,3.19,3.20 og 3.22 til 3.25 i tabell 3.
(b) En løsning av 3 umol av det tilsvarende karboksylsyrederivat (se også tabell 1) i 200
ul dimetylsulfoksid tilsettes 3,3 umol dicykloheksylkarbodiimid og 3,3 umol N-hydroksysuksinimid og får stå i 16 timer ved romtemperatur. Etter tilsetning av 3 mg aminooligonukleotid tilsettes 100 ul N-metylmorfoIin. Etter tre dager ved romtemperatur vaskes to ganger med DMSO og én gang med vann. Produktet spaltes fra fastfasen ved behandling med 32% vandig ammoniakk og avbeskyttes fullstendig (tre timer ved romtemperatur). Rensing ved omvendt-fase-HPLC gir forbindelsene 3.45 til 3.49 i tabell 3.
Ph-4-691: fenyl-4-N(H)C(S)-oligo 691
Ph-4-821: fenyl-4-N(H)C(S)-oligo 821 Ph-4-823: fenyl-4-N(H)C(S)-oligo 823
Ph-3-NH-691: fenyl-3-N(H)C(S)-oligo 961
Ph-2-NH-691: fenyl-2-N(H)C(S)-oligo 961
Ph-4-1759: fenyl-4-N(H)C(S)-oligo 1759
Ph-4-1760: fenyl-4-N(H)C(S)-oligo 1760
Ph-4-1761: fenyl-4-N(H)C(S)-oligo 1761
Ph-3-1759: fenyl-3-N(H)C(S)-oligo 1759
Ph-3-1760: fenyl-3-N(H)C(S)-oligo 1760
Ph-3-1761: fenyl-3-N(H)C(S)-oligo 1761
Ph-2-1759: fenyl-2-N(H)C(S)-oligo 1759
Ph-2-1760: fenyl-2-N(H)C(S)-oligo 1760
Ph-2-1761: fenyl-2-N(H)C(S)-oligo 1761
A-691: -4-CH2CH2C(0)-oligo 691
A-821: -4-CH2CH2C(0)-oligo 821
A-823: -4-CH2CH2C(0)-oligo 823
A-940: -4-CH2CH2C(0)-oligo 940
A-1759: -4-CH2CH2C(0)-oligo 1759
A-I 757: -4-CH2CH2C(0)-oligo 1757
B-691: -4-CH2CH2C(0)-oligo 691
Omvendtfase-HPLC retensjonstid (minutter)
E. FREMSTILLING AV SUBSTRAT-RNA (MÅL-RNA)
Eksempel El: Substrat-RNA-syntese
Omtrent 30 mg av "controled pore glass" (CPG) fastfase innveies i et Standard Applied Biosystem reaksjonskar for en 1,5 umol-syntese. CPG-fastfasen (1) bærer den beskyttede 3'-byggesten (i eksemplet, rC) til den RNA som skal syntetiseres.
For oUgomeriseringen anvendes fosforamidittene (2), (3), (4) og (5).
Syntesecyklene gjennomføres med Syntheseautomat 394 fra Applied Biosystem med en forandring (koplingstid for fosforamiditten i ribo-rekken oppgår til ti minutter) ifølge standardprotokollen til firma Applied Biosystem (User Manual Version 2.0 (1992) 1.0 uMol Cyclus, Appen. 1-41).
Som andre reagenser i handelen anvendes:
0,1 M fosforamiditt
Tetrazol/acetonitril: 4%, 96%
Tert-burylfenoksyeddiksyrearmydrid/pyirdin/tetrahy 10%, 10%, 80% N-metylimidazol/tetrahydrofuran: 16%, 84%
Trikloreddiksyre/dimetylklormetan: 2%, 98%
JodVvann/pyridin/teti^ydrofuran: 3%, 2%, 20%, 75%
Følgende substrat-RNA'er syntetiseres:
Eksempel E2: Avspaltning av fastfasen (CPG) og avbeskyttelse av basen
Fastfasen (1,5 umol-syntese) tilsettes 800 ul ammoniakkmettet etanol og inkuberes ved romtemperatur over natten. Den ammoniakkmettede etanol fremstilles fra én del etanol og tre deler ammoniakk 33%. Etter inkubasjonen avdekanteres den ammoniakkmettede, etanoliske løsning, CPG ettervaskes med ammoniakalsk etanol og de forenede løsninger lyofiliseres.
Eksempel E3: Avbeskyttelse av tertiærbutyl-dimetylsilyl (TBDMS)-beskyttelsesgruppen
Den lyofiliserte probe tilsettes 800 ul 1 M tetrabutylammoniumfluorid-tetrahydrofuran (TBAF/THF)-løsning. Proben blandes intensivt i 30 minutter. Inkubasjonen foregår i 24 timer ved romtemperatur under lysutelukkelse. RNA blandes med 50 mM trietylamin-hydrogenkarbonat (TAHC)-løsning pH 7,0 (1 + 1) og dialysen direkte ved 4°C. (Vann har Nanopure-kvalitet).
Eksempel E4: Dialyse
Det dialyseres tre ganger mot 7,5 mM TAHC-løsning pH 7,0. (Løsningen fremstilles med vann av Nanopure-kvalitet, innstilles på pH 7,0 med C02 og forhåndsavkjøles til 4°C). Proben lyofiliseres og opptas med dietylpyrokarbonat-behandlet [Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Habor Laboratory Press (1989)] og autoklavert H20 (DEPC-H20). En aliquot anvendes for konsentrasjonsbestemmelse ved 260 nm. I den videre omgang med RNA arbeides alltid RNase- og fremmedmetallione-fritt.
Eksempel E5:5'-endemarkering av substrat-RNA med <33>[<p>]y_ATP
For enzymatisk kinasereaksjon inkuberes 100 pmol RNA fra den ovenstående synteseprotokoll i 200 ul volumer ved 37°C i 20 minutter. Reaksjonsløsningen inneholder 0,5 ul T4-polynukleotidkinase (Promega, 10 Units/ul), 2 ul kinasebuffer (50 mM tris-HCl pH 7,5,10 mM MgCl2, 5 mM 1,4 ditio-DL-treitol, 0,1 mM spermidin) og 0,5 ul 33[P]y-ATP (Amersham, >1000 Ci/mmol, 10uCi/ul).
Deretter tilsettes 138 ul tris-HCl/EDTA (10 mM/1 mM, pH 7,5), 2 ul glykogen (35 mg/ml) og 40 ul NH4CH3COO (10 M). Etter tilsetning av 600 ul etanol avkjøles proben i 30 minutter ved -20°C og sentrifugeres deretter i 20 minutter ved 4°C. Pelleten lyofiliseres, tilsettes 15 ul oppdragsbuffer (0,025% bromfenolblått, 0,025% xylencylanol i en blanding 1:1 av 80% formamid og 7 M urea, 20 mM sitronsyre, 1 mM EDTA), denatureres i ett minutt ved en temperatur på 95°C, stilles straks på is og overføres til en 1,0 cm x 1 mm brønn for den gelelektroforetiske oppdeling. Den gelelektroforetiske oppdeling gjennomføres i to timer ved 55 Watt etter et forløp på 40 minutter ved 55 Watt.
Eksempel E6: Rensing og isolering av den kinaserte substrat-RNA
For den gelelektroforetiske oppdeling av kinasereaksjonen fremstilles en 12%-ig polyakrylamidgel (1 mm x 30 cm x 40 cm). Polymerisasjonsreaksjonen gjennomføres i 170 ml. Hertil blandes 51 ml akrylamidløsning (40% akrylamid/bis-akrylamid 10:1), 17 ml TBE-buffer (0,89 M tris-(hydroksymetyl)-aminometan, 0,89 M borsyre, 0,02 M etylendiamin-tetraeddiksyre) og 71,4 g urea med en tilsvarende mengde H2O. Polymerisasjonen startes med 170 ul ammoniumperoksydisulfat-løsning (25% v/vol) og 170 ul TEMED (N,N,N\NMetrametyletylendiamin). Gelen kan anvendes etter én time. Som løpebuffer anvendes ti ganger fortynnet TBE-buffer.
Etter den gelelektroforetiske oppdeling påvises den kinaserte RNA ved hjelp av en pålagt røntgenfilm og skjæres ut av gelen. I en elektroelueringsapparatur (Schleicher og Schuell) elueres RNA fra gelstykket under pålegging av 100 V (3,3 V/cm). Som elueringsbuffer anvendes ti ganger fortynnet TBE-buffer.
Den isolerte RNA i 360 ul eluat tilsettes 40 ul NaCH3COO (3M pH 5,2) og 1 ml etanol. Proben avkjøles i 20 minutter ved -20°C og sentrifugeres deretter i 20 minutter ved 4°C. Pelleten opptas lyofilisert med 30 ul H2O. Løsningen måles ifølge Czerenkow-protokollen i en gnistteller og innstilles på 1200 cpm/ul.
F. SPALTNINGSFORSØK MED TERPYRIDIN-LANTANID-OLIGONUKLEOTIDKONJUGATER
Eksempel Fl: Substrat-RNA-spaltning med oligonukleotid-lantanid-kompleks-konjugater
For den gelelektroforetiske oppdeling og identifiseringen av RNA-produkter etter spaltningsreaksjonen fremstilles en 12%-ig Long Ranger gel (AT Biochem, modifisert polyakrylamidgel) (0,4 mm x 30 cm x 40 cm). Polymerisasjonsreaksjonen gjennomføres i 90 ml. Hertil blandes 21 ml Long Ranger-løsning (50%), 11 ml TBE-buffer (0,89 M tris-(hydroksymetyl)-aminometan, 0,89 M borsyre, 0,02 M etylendiamintetraeddiksyre)
og 37 g urea med den tilsvarende mengde H2O. Polymerisasjonen startes med 450 ul ammoniumperoksydisulfatløsning (10% v/vol) og 45 (il TEMED. Gelen kan anvendes etter én time. Som løpebuffer anvendes 16,66 ganger fortynnet TBE-buffer. Oppdelingen foregår i løpet av 75 minutter ved 60 Watt. Etter den gelelektroforetiske oppdeling påvises henholdsvis opptelles, de markerte spaltningsprodukter (RNA-oligomerer) ved hjelp av en pålagt røntgenfilm eller ved hjelp av Phosphorimager.
Spaltningsreaksjonen gjennomføres i 10 ul volumer. Til 1 pl substrat-RNA (12000 cpm) tilpipetteres 1 ul oligonukleotidkonjugat (10 uM), 4 ul tris-HCl-buffer (50 mM/pH 7,4
ved 37°C) og den tilsvarende mengde H2O. Denne blanding oppvarmes i ett minutt til 85°C og inhiberes deretter i 16 timer ved 37°C. Reaksjonen avsluttes ved tilsetning av 5
ul oppdragsbuffer (0,025% bromfenolblått, 0,025% xylencylanol i en l:l-blanding av 80% formamid med 7 M urea, 20 mM sitronsyre og 1 mM EDTA. For den gelelektroforetiske oppdeling denatureres 7,5 ul av proben i ett minutt ved 95°C, stilles straks på is og påføres i en gelbrønn.
Substrat-RNA-konsentrasjonen vurderes som 25-gangers overskudd som følger: Ved
100 pmol råprodukt av RNA og et utbytte på 10% ved gelrensingen befinner sluttkon-sentrasjonen seg ifølge den beskrevne protokoll på 0,04 mM av substrat-RNA og 1 mM oligonukleotidkonjugat i reaksjonsblandingen.
Dersom terpyridin-lantanid-komplekset anvendes som sammenlikning, behøves det 400 mM kompleks for å oppnå omtrent samme spaltning. Derved handler det om et 10.000-gangers overskudd av kompleks til substrat-RNA.
Eksempel F2: Inkubasjon av substrat-RNA CG-690 med oligonukleotid-europiumkompleks-konjugatforbindelse nr. 3.2
Spaltningsreaksjonen foregår prinsipielt som beskrevet i eksempel Fl.
(80% utgangsmateriale uspaltet)
Hovedspaltningsprodukter
(I 15%)
Ytterligere spaltningsprodukter
(E 5%)
Eksempel F3: Inkubasjon av substrat-RNA CG-690 med oligonukleotid-lantankompleks-konjugatforbindelse nr. 3.15
Spaltningsreaksjonen foregår prinsipielt som beskrevet i eksempel Fl.
(80% utgangsmateriale uspaltet)
Hovedspaltningsprodukter <£ 20%)
Eksempel F4: Inkubasjon av substrat-RNA CG-1352 med oligonukleotid-europiumkompleks-konjugatforbindelse nr. 3.14
Spaltningsreaksjonen foregår prinsipielt som beskrevet i eksempel Fl.
(<5% utgangsmateriale uspaltet)
Hovedspaltningsprodukt (>70%)
Restspaltningsprodukter
(125%)
Eksempel F5: Ytterligere spaltninger av substrat-RNA CG-1352 med oligonukleotid-terpyridinmetallkompleks-konjugater
Ytterligere spaltningsreaksjoner gjennomføres i prinsipp som beskrevet i eksempel Fl. Tabell 4 viser resultatene av ytterligere spaltninger av substrat-RNA CG-1352 med for-skjellige terpyridin-metallkompleks-oligonukleotid-konjugater fra tabell 3. Angivelsen "+3" betyr, at hovedspaltningen foregår mellom nukleotidene +3 og +4 i substrat-RNA (se også fig. 1 og fig. 2 så vel som forklaringer i disse). Det erkjennes, at spaltningen i de viste tilfeller fortrinnsvis finner sted ved stilling +3.

Claims (48)

1. Forbindelse, karakterisert ved at den har formel I hvor Ri betyr H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-C12-aralkyl, C6-Ci6-aryl, C4-C12-heteroaryl med O, S eller N som heteroatomer, Ci-C4-alkyltio, di(Ci-C4-alkyl)amino, halogenid, sulfonamid eller karboksamid og R5 en enverdig, funksjonell gruppe eller Ri betyr en enverdig, funksjonell gruppe og R5 betyr H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-C12-aralkyl, Cg-Cig-aryl, C4-Ci2-heteroaryl med O, S eller N som heteroatomer, Ci-C4-alkyltio, di(Ci-C4*alkyl)amino, halogenid, sulfonamid eller karboksamid, hvorved den funksjonelle gruppe er direkte eller via en gruppe Z bundet til pyridinringen og gruppen Z betyr en rest valgt fra gruppen bestående av Ci~C20-al'cylen) C2-C12-alkenylen, C2-Ci2-alkinylen, Cf-Cg-cykloalkylen, Cg-C^-arylen og C7-Ci2-aralkylen, hvilken rest eventuelt er avbrutt av -O-, -S-, -NR12-, -C(0)-0- eller -C(0)-NRi2-,;R.2 og R7 uavhengig av hverandre betyr H, Cj-C^alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-C12-aralkyl, Cg-Cig-aryl, halogen, C4-Ci2-heteroaryl med O, S eller N som heteroatomer, Ci-C4-alkyltio, di(Ci-C4-alkyl)amino, sulfonamid eller karboksamid, R3 og Rg uavhengig av hverandre er H, Cj-C4-alkyI, C7-C12-aralkyl, Cg-Cig-aryl, halogen, C4-Ci2-heteroaryl med O, S eller N som heteroatomer, Ci-C4-alkyltio, di(Ci-C4-alkyl)amino, sulfonamid eller karboksamid, R4 står for H, Ci-C20*alkyl, Cs-Cg-cykloalkyl, Cg-Ci2-aryl eller C7-C12-<a>ralkyl, Ri2 betyr H eller Ci-Cg-alkyl, Me står for et lantanidmetall eller yttrium, Y står for et anion av en syre, n betyr tallene 2 eller 3, og m betyr tallene 1,2 eller 3, hvorved restene alkyl, cykloalkyl, aralkyl, aryl og gruppen Z er usubstituert eller substituert med Ci-C4-alkoksy, F, Cl, Br, -CN, Ci-C4-alkyl eller -NO2.
2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at Ri erH, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-C12-aralkyl, Cg-Cig-aryl, og R5 er en enverdig, funksjonell gruppe eller Ri er en enverdig, funksjonell gruppe og R5 er H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-C12-aralkyl eller Cg-Cig-<a>ryl.
3. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at gruppen Z betyr C1-C3-alkylen, C3-alkinylen, fenylen eller C7-aralkylen.
4. Forbindelse ifølge ett av kravene 1-3, karakterisert ved at gruppen Z er C2-C3-alkylen eller fenylen.
5. Forbindelse ifølge ett av kravene 1-3, karakterisert ved at R2 og R7 uavhengig av hverandre betyr H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-C12-aralkyl, Cg-Cig-aryl eller halogen.
6. Forbindelse ifølge ett av kravene 1-5, karakterisert ved atR2ogR7 uavhengig av hverandre betyr H eller Ci-C4-alkyl.
7. Forbindelse ifølge ett av kravene 1-6, karakterisert ved atR3 0gRg uavhengig av hverandre er H, Ci-C4-alkyl, C7-C12-aralkyl eller Cg-Cig-aryl.
8. Forbindelse ifølge ett av kravene 1-7, karakterisert ved at R3 og Rg uavhengig av hverandre er H eller Ci-C4-alkyl.
9. Forbindelse ifølge ett av kravene 1-8, karakterisert ved atR4 står for H eller Ci-C20-alkyl.
10. Forbindelse ifølge ett av kravene 1-9, karakterisert ved at den enverdige, funksjonelle gruppe er valgt fra gruppen bestående av -ORiø, -SRios -NCO, NCS, NHRi 1, -C(0)ORi 1, -C(0)SH, -C(0)NHRi h -C(0)C1, -C(S)SRi 1, -C(S)NHRi 1, -C(S)ORn, -SO3R11, -S02NHRi 1, -S02C1, -P(0)(OH)2) -P(0)(OH)-NHRi 1, -P(S)(SH)2, -P(S)(SH)-NHRn, -P(S)(OH)2, -P(S)(OH)-NHRn, -P(0)(SH)2, -P(0)(SH)-NHRi 1, -P(0)(OH)H, -P(0)(NHRi i)H, -P(S)(SH)H, -P(S)(NHR! !)H, -P(S)(OH)H, -P(0)(SH)H, hvorved Rio betyr H, -C(0)NH2, -C(S)NH2, -Ci-Cg-alkyl»-CxH2x-NH2, -CxH2x-SH eller-(Cx<H>2xO)y-H, Ri 1 betyr H, -Ci-Cg-alkyl, -CXH2X-NH2, -CXH2X-SH eller -(CxH2xO)y-H og x er lik et tall fra 2 til 6 og y er lik et tall fra 1 til 20.
11. Forbindelse ifølge krav 10, karakterisert ved at Ri q står for H.
12. Forbindelse ifølge ett av kravene 1-11, karakterisert ved at den funksjonelle gruppe er valgt fra gruppen bestående av -OH, -SH, -NCO, -NCS, -NHRi i, -C(0)ORnog-P(0)(OH)2.
13. Forbindelse ifølge ett av kravene 1-12, karakterisert ved at den funksjonelle gruppe er valgt fra gruppen bestående av -NCS, -C(0)ORi \ og -P(0)(OH)2.
14. Forbindelse ifølge ett av kravene 1-13, karakterisert ved at lantanidmetallet er La, Ce, Nd, Eu eller GD.
15. Forbindelse ifølge ett av kravene 1-14, karakterisert ved at lantanidmetallet er La eller Eu.
16. Forbindelse ifølge ett av kravene 1-15, karakterisert ved at lantanidmetallet er Eu.
17. Forbindelse ifølge ett av kravene 1-16, karakterisert ved at anionet er F", Cl", Br, I-, PFg", SbF6-, BF4-, B(Ph)4", acetat, NO3-, sulfat eller fosfat.
18: Forbindelse ifølge ett av kravene 1-17, karakterisert ved at anionet er Cl", acetat eller N03".
19. Forbindelse med formel V karakterisert ved at R2 °å R7 uavhengig av hverandre betyr H, C\-C4-alkyl, Ci^-<a>lkoksy, C7-C12-aralkyl, Cg-Ci g-aryl, halogen, C4-Ci2-heteroaryl med O, S eller N som heteroatomer, Ci-C4-alkyltio, di(Ci-C4-alkyl)amino, sulfonamid eller karboksamid, R3 og R5 uavhengig av hverandre er H, C\-C4-alkyl, C7-Ci2-aralkyl, Cg-Cig-aryl, halogen, C4-Ci2-heteroaryl med O, S eller N som heteroatomer, Ci-C4-alkyltio, di(Ci-C4-alkyl)amino, sulfonamid eller karboksamid, R4 står for H, Ci-C20-alkyl> Cs-Cg-cykloalkyl, Cg-Cn-aryl eller C7-C12-aralkyl, hvorved restene alkyl, cykloalkyl, aralkyl og aryl er usubstituerte eller substituert med Ci-C4-alkoksy, F, Cl, Br, -CN, Ci-C4-alkyl eller-NO2, Me står for et lantanidmetall eller yttrium, Y står for et anion av en syre, n betyr tallene 2 eller 3, og m betyr tallene 1,2 eller 3, R9 betyr en rest med formel VI og Rg betyr H, Cj-C^alkyl, Ci-C^alkoksy, C7-<C>12-aralkyl, Cg-Ci<g->aryl, C4-C12-heteroaryl med O, S eller N som heteroatomer, Ci-C4-alkyltio, di(Ci-C4-alkyl)amino, halogenid, sulfonamid eller karboksamid, eller R9 betyr H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-C12-aralkyl, Cg-Cie<->aryl, C4-C12-heteroaryl med O, S eller N som heteroatomer, Ci-C4-alkyltio, di(Ci-C4-alkyl)amino, halogenid, sulfonamid eller karboksamid og Rg betyr en rest med formel VI, p, q og r uavhengig av hverandre står for 0 eller 1, X og X' uavhengig av hverandre betyr en usubstituert eller med Ci-C4-alkoksy, F, Cl, Br, -CN, Ci-C4-alkyl eller -NO2 substituert rest valgt fra gruppen bestående av C1-C20-alkylen, C2-Ci2-aIkenyIen, C2-Ci2-aIkinyIen, -(Cx<H>2xO)y-, hvor x er lik et tall fra 2 til 6 og y er lik et tall fra 1 til 20, Cs-Cg-cykloalkylen, Cg-C^-arylen og C7-C12-aralkylen, A og A' uavhengig av hverandre betyr -O-, -S-, -S-S-, -NR12-CO-NR12-, -NR12-CS-NR12-, -NR12-, -NR12-C(0)-0-, -C(0)0-, -C(0)S-, -C(0)NR12, -C(S)S-, -C(S)0-, -C(S)NR12, -S02NR12-, -S02-, -P(0)(OH)0-, -P(S)(SH)S-, -P(S)(SH)0-, -P(S)(OH)0-, -P(0)(SH)S-, -P(0)(OH)S-, -P(0)(SH)0-, -P(0)(OH)-NR12-, -P(S)(SH)-NR12-, -P(S)(OH)-NRi2-, -P(0)(SH)-NR12-, -HP(0)0-, -HP(S)S-, -HP(0)NRi2- eller -HP(S)NRi2-, hvorved R}2 står for H eller Ci-Cg-alkyl, og oligo er en naturlig, modifisert eller syntetisk sekvens av naturlige, modifiserte eller syntetiske desoksynukleosider eller peptidnukleinsyrebyggestener, som er bundet over en nukleinbase, en internukleotidisk bro eller et sukker og hvis indre område er komplementært til en mål-RNA.
20. Forbindelse ifølge krav 19, karakterisert ved at Ri 9 er en rest med formel VI og Rg betyr H, Ci-C4-alkyl, C\-C4-alkoksy, C7-C12-aralkyl eller Cg-Ci g-aryl, eller Ro, betyr H, Ci -C4-alkyl, Ci-C4-alkoks<y>, C7-C12-aralkyl eller Cg-Ci g-aryl, og Rg betyr en rest med formel VL og p, q og r uavhengig av hverandre står for 0 eller 1.
21. Forbindelse ifølge krav 19 eller 20, karakterisert ved at q står for 1.
22. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-21, karakterisert ved atR2 eller R7 uavhengig av hverandre betyr H, C\-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-C12-aralkyl, Cg-Cjg-aryl, eller halogen.
23. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-22, karakterisert ved atR2 eller R7 uavhengig av hverandre betyr H eller Ci-C4-alkyl.
24. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-23, karakterisert ved at R3 og Rg uavhengig av hverandre betyr H, Ci-C4-alkyl, C7- C\ 2-& 3dkyl eller Cg-Cig-aryl.
25. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-24, karakterisert ved atR3 eller Rg uavhengig av hverandre betyr H eller Ci-C4-alkyl.
26. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-25, karakterisert ved atR4 står for H eller Ci-C20-alkyl.
27. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-26, karakterisert ved at lantanidmetallet er La, Ce, Nd, Eu eller GD.
28. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-27, karakterisert ved at lantanidmetallet er La eller Eu.
29. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-28, karakterisert ved at lantanidmetallet er Eu.
30. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-29, karakterisert ved at anionet er F", Cl", Br, I-, PFg", SbFg", BF4-, B(Ph)4", acetat, NO3-, sulfat eller fosfat.
31. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-30, karakterisert ved at anionet er Cl", acetat eller NO3-.
32. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-31, karakterisert ved at anionet er Cl".
33. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-32, karakterisert ved at X betyr Ci-C3-alkylen, C3-alkinylen, fenylen eller Cy-aralkylen.
34. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-33, karakterisert<y>ed at X er C2-C3-alkylen eller fenylen.
35. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-34, karakterisert ved at A betyr -NRi 2-CS-NR12- eller -C(0)NRi2.
36. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-35, karakterisert ved at A betyr -NH-CS-NH- eller -C(0)NH.
37. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-36, karakterisert ved at X'betyr Ci-<C>20-alkylen.
38. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-37, karakterisert ved at X'betyr Ci-Cio-alkylen.
39. Forbindelse ifølge ett av kravene 19-38, karakterisert ved at A' ikke er tilstede eller betyr -P(0)(OH)0-.
40. Forbindelse med formel n karakterisert ved at R\ betyr H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-Ci2-aralkyI eller Cg-Ci g-aryl eller en enverdig, funksjonell gruppe, hvorved den funksjonelle gruppe er direkte eller over en gruppe Z bundet til pyridinringen, og gruppen Z står for en eventuelt med -O-, -S-, -NR i 2; -C(0)-0- eller -C(0)-NRi 2- avbrutt rest som er valgt fra gruppen bestående av Ci-C20-alkylen, C2-Ci2-alkenylen, C2-Ci2-alkinylen, Cs-Cg-cykloalkylen, Cg-Ci 2-arylen og C7-Ci2-aralkylen,
R.2 og R7 uavhengig av hverandre betyr H, Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, C7-C12-aralkyl, Cg-Cig-aryl eller halogen, og R3 og Rg uavhengig av hverandre betyr H, Ci-C4-alkyl, C7-C12-aralkyl eller Cg-Cig-aryl, Ri 2 betyr H eller Cj-Cg-alkyl, hvorved restene alkyl, cykloalkyl, aralkyl, aryl og gruppen Z er usubstituert eller substituert med Ci-C4-alkoksy, F, Cl, Br, -CN, Ci-C4-alkyl eller -NO2.
41. Forbindelser med formel DL karakterisert ved at R5 er en enverdig, funksjonell gruppe som er bundet til pyridinringen over C2-C20-alkylen, hvorved den funksjonelle gruppe er valgt fra gruppen bestående av -C(0)-ORi2>-C(0)-NHRi 2, -SO2-R12 og -SO2-NHR12, hvorved R\ 2 er H eller Ci-Cg-alkyl, og R4 står for H eller Ci-C20-alkyl.
42. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel I, karakterisert ved at et terpyridin med formel II kondenseres med et pyridindialdehyd eller pyridindiketon med formelen IQ i nærvær av et salt med formel IV hvor Ri, R2, R3, R4, R5, Rg, R7, Me, Y, n og m har de foran angitte betydninger.
43. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel (V) ifølge ett av kravene 19-39, karakterisert ved at en forbindelse med formel (I) ifølge ett av kravene 1-18 (a) omsettes med en forbindelse med formel Via hvor A" betyr en egnet, enverdig, funksjonell gruppe som er utvalgt fra gruppen bestående av -OR10, -SR10, -NCO, -NCS, -NHRi 1, -C(0)ORi 1, -C(0)SH, -C(0)NHRii, -C(0)C1, -C(S)SRU, -C(S)NHRU, -C(S)ORU, -SO3R11, -S02NHRn, -S02C1, -P(0)(OH)2, -P(0)(OH)-NHRi 1. "P(S)(SH)2, -P(S)(SH)-NHRi 1, -P(S)(OH)2, -P(S)(OH)-NHRi 1, -P(0)(SH)2, -P(0)(SH)-NHRn, -P(0)(OH)H, -P(0)(NHRi i)H, -P(S)(SH)H, -P(SXNHRi i)H, -P(S)(OH)H, -P(0)(SH)H, hvorved Rio er H, -C(0)NH2, -C(S)NH2, -Ci-C6-alkyl, -CxH2x-NH2, -Cx<H>2x-SH eller -(Cx<H>2xO)y-H og Ri 1 er H, -Ci-C6-alkyl, -CxH2x-<N>H2, -CxH2x-SH eller -(CxH2xO)y-H, og x er lik et tall fra 2 til 6 og y er lik et tall fra 1 til 20, X' betyr en usubstituert eller med Ci-C4-aIkoksy, F, Cl, Br, -CN, Ci-C4-alkyl eller -N02 substituert rest valgt fra gruppen bestående av Ci-C2o-alkylen, C2-Ci2-alkenylen, C2-Ci2-alkinylen, -(CxH2x0)y-, hvor x er lik et tall fra 2 til 6 og y er lik et tall fra 1 til 20, Cs-Cg-cykloalkylen, Cg-C^-arylen og C7-C12-aralkylen, A' betyr -O-, -S-, -S-S-, -NR^-CO-NR^-, -NRi2-CS-NRi2-, -NR12-, -NRi2-C(0)-O-, -C(0)0-, -C(0)S-, -C(0)NRl2, -C(S)S-, -C(S)0-, -C(S)NRi2-, -S02NRi2-, -S02-, -P(0)(OH)0-, -P(S)(SH)S-, -P(S)(SH)0-, -P(S)(OH)0-, -P(0)(SH)S-, -P(0)(OH)S-, -P(0)(SH)0-, -P(0)(OH)-NR12-, -P(S)(SH)-NR12-, -P(S)(OH)-NR12-, -P(0)(SH)-NR12-, -HP(0)0-, -HP(S)S-, -HP{0)NR12- eller -HP(S)NRi2-, hvorved Ri2 står for H eller Ci-Cg-alkyl, og oligo er en naturlig, modifisert eller syntetisk sekvens av naturlige, modifiserte eller syntetiske desoksynukleosider eller peptidnukleinsyrebyggestener, som er bundet over en nukleinbase, en intemukleotidisk bro eller et sukker og hvis indre område er komplementært til et mål-RNA, eller (b) omsettes med en forbindelse med formel VTb hvor A" og oligo har de betydninger som er beskrevet i (a).
44. Fremgangsmåte ifølge krav 43, karakterisert ved at Ri q står for H.
45. Fremgangsmåte for spaltning av fosfatnukleotidbroen i ribonukleinsyrer under fysiologiske betingelser og under innvirkning av et konjugat av metallkompleks og oligonukleotid, karakterisert ved at (a) mål-RNA komplekseres med en forbindelse ifølge ett av kravene 19-39 og (b) så las reagere og spaltes.
46. Forbindelse med formel (V) ifølge ett av kravene 19-39 for anvendelse i en terapeutisk fremgangsmåte for behandling av sykdommer hos varmblodige innbefattet mennesker ved inaktivering av nukleotidsekvenser i kroppen.
47. Farmasøytisk preparat på basis av en vandig løsning eller suspensjon, karakterisert ved at det inneholder en virksom mengde av forbindelsene med formel (V) ifølge ett av kravene 19-39 alene eller sammen med andre aktive stoffer, vann som farmasøytisk bærermateriale og eventuelt hjelpestoffer.
48. Anvendelse av en forbindelse med formel (V) ifølge ett av kravene 19-39 til fremstilling av et legemiddel for behandling av sykdommer hos varmblodige innbefattet mennesker ved inaktivering av nukleotidsekvenser i kroppen.
NO19970886A 1994-09-02 1997-02-27 Funksjonelle terpyridin-metallkomplekser, fremgangsmater for fremstilling derav og oligonukleotidkonjugater med terpyridin-metallkomplekser, forbindelse for anvendelse i en terapeutisk fremgangsmate, farmasoytisk preparat og anvendelse av en forbindelse t NO316866B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH269394 1994-09-02
PCT/EP1995/003409 WO1996007668A1 (de) 1994-09-02 1995-08-30 Funktionelle terpyridin-metallkomplexe, verfahren zu deren herstellung und oligonukleotid-konjugate mit terpyridin-metallkomplexen

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO970886D0 NO970886D0 (no) 1997-02-27
NO970886L NO970886L (no) 1997-04-25
NO316866B1 true NO316866B1 (no) 2004-06-07

Family

ID=4239459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19970886A NO316866B1 (no) 1994-09-02 1997-02-27 Funksjonelle terpyridin-metallkomplekser, fremgangsmater for fremstilling derav og oligonukleotidkonjugater med terpyridin-metallkomplekser, forbindelse for anvendelse i en terapeutisk fremgangsmate, farmasoytisk preparat og anvendelse av en forbindelse t

Country Status (15)

Country Link
US (1) US5925744A (no)
EP (1) EP0778844B1 (no)
JP (1) JPH10505354A (no)
AT (1) ATE229969T1 (no)
AU (1) AU695749B2 (no)
CA (1) CA2197788A1 (no)
CY (1) CY2435B1 (no)
DE (1) DE59510515D1 (no)
DK (1) DK0778844T3 (no)
ES (1) ES2191060T3 (no)
FI (1) FI970740A (no)
HU (1) HU217774B (no)
NO (1) NO316866B1 (no)
PT (1) PT778844E (no)
WO (1) WO1996007668A1 (no)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU739391B2 (en) * 1996-07-03 2001-10-11 President And Fellows Of Harvard College Oligonucleotide linker and techniques involving immobilized and linked oligonucleotides
US6376664B1 (en) * 1999-03-17 2002-04-23 The Ohio State University Cyclic bis-benzimidazole ligands and metal complexes thereof
US6407089B1 (en) 1999-12-23 2002-06-18 Trinapco Inc. Triazatrinaphthyrins and the use thereof
EP1244665B1 (en) * 1999-12-23 2005-08-10 Trinapco, Inc Triazatrinaphthyrins and the use thereof
GB0007764D0 (en) * 2000-03-30 2000-05-17 Bp Chem Int Ltd Polymerisation catalyst
FR2810406B1 (fr) * 2000-06-15 2002-09-20 Cis Bio Int Nouveaux cryptates de terre rare peu sensibles a l'extinction de fluorescence
WO2007125173A2 (en) 2006-05-03 2007-11-08 Baltic Technology Development, Ltd. Antisense agents combining strongly bound base - modified oligonucleotide and artificial nuclease
ES2668555T3 (es) 2008-05-27 2018-05-18 Dako Denmark A/S Composiciones y métodos para la detección de aberraciones cromosómicas con tampones de hibridación novedosos
US9303287B2 (en) 2009-02-26 2016-04-05 Dako Denmark A/S Compositions and methods for RNA hybridization applications
US20110151457A1 (en) 2009-12-22 2011-06-23 Elitech Holding B.V. Hypertheromostable endonuclease iv substrate probe
EP2761028A1 (en) 2011-09-30 2014-08-06 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods using formamide
EP2768974B1 (en) 2011-10-21 2017-07-19 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods
CN114315702A (zh) * 2022-02-11 2022-04-12 南京邮电大学 一种基于低维镧系金属配合物X射线激发闪烁体Eu-TPC及其制备方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4806463A (en) * 1986-05-23 1989-02-21 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides
EP0266099A3 (en) * 1986-10-28 1990-09-19 The Johns Hopkins University Oligonucleoside alkyl or arylphosphonate derivatives capable of crosslinking with or cleaving nucleic acids
DE68925278T2 (de) * 1988-02-26 1996-09-19 Worcester Found Ex Biology Hemmung von htlv-iii durch exogene oligonukleotide
US5559207A (en) * 1989-03-06 1996-09-24 Board Of Regents, University Of Texas Texaphyrin metal complex mediated ester hydrolysis
US5760191A (en) * 1993-02-05 1998-06-02 Nycomed Imaging As Macrocyclic complexing agents and targeting immunoreagents useful in therapeutic and diagnostic compositions and methods

Also Published As

Publication number Publication date
DE59510515D1 (de) 2003-01-30
EP0778844A1 (de) 1997-06-18
FI970740A0 (fi) 1997-02-21
AU3474495A (en) 1996-03-27
JPH10505354A (ja) 1998-05-26
ATE229969T1 (de) 2003-01-15
FI970740A (fi) 1997-02-21
DK0778844T3 (da) 2003-03-31
NO970886D0 (no) 1997-02-27
ES2191060T3 (es) 2003-09-01
CA2197788A1 (en) 1996-03-14
NO970886L (no) 1997-04-25
PT778844E (pt) 2003-04-30
AU695749B2 (en) 1998-08-20
WO1996007668A1 (de) 1996-03-14
US5925744A (en) 1999-07-20
HU217774B (hu) 2000-04-28
EP0778844B1 (de) 2002-12-18
CY2435B1 (en) 2004-11-12
HUT77933A (hu) 1998-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
MacKellar et al. Synthesis and physical properties of anti-HIV antisense oligonucleotides bearing terminal lipophilic groups
Langkjær et al. UNA (unlocked nucleic acid): a flexible RNA mimic that allows engineering of nucleic acid duplex stability
JP3050595B2 (ja) オリゴヌクレオチド類似体
US6593466B1 (en) Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof
US6147200A (en) 2&#39;-O-acetamido modified monomers and oligomers
AU777049B2 (en) Xylo-LNA analogues
SG171914A1 (en) Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
JP2002543214A (ja) Ｌ−リボ−ｌｎａ類縁体
NO316866B1 (no) Funksjonelle terpyridin-metallkomplekser, fremgangsmater for fremstilling derav og oligonukleotidkonjugater med terpyridin-metallkomplekser, forbindelse for anvendelse i en terapeutisk fremgangsmate, farmasoytisk preparat og anvendelse av en forbindelse t
Seela et al. Palindromic oiigonucleotides containing 7-deaza-2'-deoxyguanosine: solid-phase synthesis of d [(p) GG* AATTCC] octamers and recognition by the endodeoxyribonnclease EcoRI
JPH07502749A (ja) Ｒｎａを調節するための組成物と方法
Asseline et al. Synthesis and physicochemical properties of oligonucleotides built with either α-L or β-L nucleotides units and covalently linked to an acridine derivative
WO2020002469A1 (en) Methods and reagents for cross-linking cellular dna and rna via strain-promoted double-click reactions
WO2011115513A2 (en) A cytosine analogue, a method of preparation of a cytosine analogue, a dna methyltransferase 1 inhibitor, a method for dna methylation inhibition, the use of the analogue in the treatment of diseases associated with deviations from normal dna methylation
HUT77034A (hu) Ribonukleinsavak hasítására szolgáló oligonukleotid konjugátumok, készítmények és eljárás
Korotkovs et al. Molecular construction of sulfonamide antisense oligonucleotides
Ferrer et al. Preparation of Oligonucleotides Containing 5-Bromouracil and 5-Methylcytidine.
EP0436582A1 (en) Phosphorothioate and normal oligodeoxynucleotides with 5&#39;-linked acridine
Khattab et al. Improved Targeting of the Flanks of a DNA Stem Using α-Oligodeoxynucleotides.-The Enhanced Effect of an Intercalator
CN117624266A (zh) 一种肝靶向化合物及其寡核苷酸缀合物、偶联方法与应用
WO2004048376A1 (ja) 二環性ナフチリジンヌクレオシド
JP2021059518A (ja) ヌクレオチド修飾固相担体、ｄｎａ鎖及びｒｎａ鎖修飾担体の製造方法、並びにｄｎａ及びｒｎａの製造方法
Walker THE SYNTHESIS OF OLIGORIBONUCLEOTIDES AND THE SYNTHESIS AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF ALKYLATED NUCLEIC ACID COMPONENTS.
Koga et al. Synthesis of telomere-mimic carbocyclic 5′-nor oligodeoxynucleotides
Joglekar TRIPLEX-FORMING BRANCHED OLIGONUCLEOTIDES

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees