HU217774B - Funkcionális terpiridin-fémkomplexek, eljárás előállításukra valamint alkalmazásuk - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya az (I) általános képletű vegyületek, amelyképletben R1 jelentése hidrogénatom, fenil- vagy antracenilcsoport, R5jelentése hidrogénatom, halogénatom vagy –C(O)R11 általános képletűcsoport, amely utóbbi csoport egy Z csoporton keresztül kapcsolódik apiridingyűrűhöz, és a Z csoport jelentése adott esetben oxigénatommalvagy –NR12 általános képletű csoporttal megszakított, 1– 20 szénatomosalkiléncsoport, R2 és R7 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom,R3 és R6 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, 1–4 szénatomosalkilcsoport, R4 jelentése hidrogénatom, 1–20 szénatomos alkil- vagyfenilcsoport, R11 jelentése hidrogénatom vagy 1–6 szénatomosalkilcsoport, R12 jelentése 1–6 szénatomos alkilcsoport, Men+jelentése lantanidafém-ion vagy ittriumion, Y jelentése egy savanionja, n értéke 2 vagy 3, és m értéke 1, 2 vagy 3, ahol afenilcsoportok szubsztituálatlanok vagy 1–4 szénatomosalkoxicsoporttal szubsztituáltak. ŕ

Description

A találmány tárgyát gyűrűs terpiridin-lantanida komplexek, amelyek a makrociklusban 8 nitrogénatomot és 10 szénatomot, a terpiridinrészben pedig egy funkciós csoportot tartalmaznak, eljárás azok előállítására terpiridil-hidrazinoknak piridin-2,6-dialdehidekkel vagy -ketonokkal történő kondenzációjával és alkalmazásuk képezi.

Az RNS fémionokkal katalizált hidrolitikus hasítása már régóta ismert. A hasítás alapvetően az RNS nem párosodott (nem hibridizált) tartományaiban történik; ezeket a tartományokat angol nyelven „loops”-nak nevezik. W. J. Krzyzosiak et al., Biochemistry, 27., 5771-5777. (1988) erre a célra ólom-diacetát alkalmazását javasolja. G. J. Murakawa et al., Nucleic Acid Research, 17., 5361-5375. (1989) az 1,10-fenantrolinok rézkomplexeinek felhasználását írja le. J. Ciesiolka et al., Eur. J. Biochem., 182., 445-450. (1989) hasonló célra, a tRNS^Phe hasítására az európium-trikloridot ajánlja. C. S: Choww et al., J. Am. Chem. Soc., 112., 2839-2841. (1990) ugyanezen RNS esetében fenantrolin-ligandumokkal képzett ruténium- és ródiumkomplexeket alkalmazott. L. S. Behlen et al., Biochemistry,

29., 2515-2523. a tRNS^Phe esetében az ólom-diacetátot említette. Továbbá N. Hayashi et al., Inorg. Chem., 32., 5899-5900. (1993) leírta, hogy a tRNS hasítására a lantanidafém-komplexek is megfelelőek.

A fentieken túl D. Magda et al., J. Am. Chem. Soc.,

116., 7439-7440. (1994) közleményében leírta, hogy az európium(III)-texaphyrin és DNS építőkövekből álló oligonukleotidok konjugátumai egy cél-RNS-t hasítani képesek, ahol az RNS/oligonukleotid komplex texaphyrinkomplexeinek tartományában csupán csak mintegy 30%-os hasítást figyeltek meg. Ezeknek a texaphyrinkomplexeknek hátránya, hogy a kielégítő oldékonyság ezekkel csak akkor érhető el, ha pótlólag hidroxi-propil-ligandumokat is kapcsolunk hozzájuk. Ezen túlmenően a ligandumok iminocsoportjai a hidrolízissel szemben érzékenyek, ezért ezek hatékonysága vizes közegben viszonylag gyorsan csökken, illetve terápiás alkalmazásuk esetében a tartózkodási idő túlságosan csekély. A ligandumok hidrolízisének következtében a fém felszabadul, ami komoly toxicitási problémákat okozhat és az RNS nem specifikus hasadását eredményezheti. Továbbá ezek gyenge Lewis-savak, mivel az Eu-kation egyik töltését egy ligandum semlegesíti, ezért egy kétszeres töltésű komplex jön létre. Ráadásul a leírt komplexek csak költséges szintetikus eljárásokkal hozzáférhetők.

Ismeretes, hogy a fiziológiailag káros polipeptidek a sejtekben az mRNS gének által irányított képződésének eredményeként keletkeznek. Ezért a betegségek leküzdésére, illetve megelőzésére olyan szerek kívánatosak, amelyek az mRNS hatását megakadályozzák. Ez különösképpen úgy érhető el, hogy az mRNS-t meghatározott helyeken végrehajtott irreverizibilis hasítással elbontjuk, ezáltal annak információtartalma veszendőbe megy. Kívánatos továbbá, hogy az RNS-láncok szekvenciaspecifikus hasítása révén rendelkezésre álljanak olyan kisebb töredékek (RNS-darabok), amelyeket az „antisense” régióban oligonukleotidok gyorsabb felépítése révén diagnosztikai célra (bioszenzorként) vagy a sejtekben végbemenő anyagcserefolyamatok befolyásolásával betegségek gyógyítására használhatunk fel.

Azt találtuk, hogy az olyan oligonukleotidok, amelyek szekvenciája egy cél RNS-sel komplementer, és amelyekhez egy terpiridin-lantanida komplex kapcsolódik, igen hatékonyak, és velük egy cél RNS-ben szekvenciaspecifikus hasítások érhetők el.

A találmány tárgyát képezik az I általános képletű vegyületek, amelyekben

Rí jelentése hidrogénatom, fenil- vagy antracenilcsoport, és

R_s jelentése hidrogénatom, halogénatom vagy

-C(O)R_n általános képletű csoport, mely utóbbi csoport egy Z csoporton keresztül kapcsolódik a piridingyűrűhöz, és a

Z csoport jelentése adott esetben oxigénatommal vagy -NR₁₂ általános képletű csoporttal megszakított, 1-20 szénatomos alkiléncsoport,

R₂ és R₇ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom,

R₃ és R₆ jelentése egymástól függetlenül 1-4 szénatomos alkilcsoport,

R₄ jelentése hidrogénatom, 1 -20 szénatomos alkil- vagy fenilcsoport,

R,i jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport,

R₁₂ jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport,

Meⁿ⁺ jelentése egy lantanidafém-ion vagy ittriumion,

Y jelentése egy sav anionja, n értéke 2 vagy 3, és m értéke 1, 2 vagy 3, ahol a fenilcsoportok szubsztituálatlanok vagy 1 -4 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituáltak.

R, előnyösen fenil- vagy antracenilcsoportot jelent.

R₅ előnyösen halogénatomot jelent.

R] és R₅ előnyösen a nitrogénatomhoz képest parahelyzetben kapcsolódnak a piridingyűrűkhöz.

R₃ és Rg jelentése alkilcsoportként előnyösen metilvagy etilcsoport. R₃ és Rg jelentése különösen előnyösen metilcsoport.

R₄ jelentése alkilcsoportként előnyösen 1-12 szénatomos, különösen előnyösen 1-8 szénatomos és kiváltképpen 1-4 szénatomos alkilcsoport. Néhány példa az alkilcsoportokra a metil- és etilcsoport, továbbá a propil-, butil-, pentil-, hexil-, heptil-, oktil-, nonil-, decil-, undecil-, dodecil-, tridecil-, tetradecil-, pentadecil-, hexadecil-, oktadecil-, nonadecilés eikozilcsoport (ikozilcsoport), továbbá ezek izomeijei.

Egy előnyös alcsoport az R₄ jelentését tekintve a hidrogénatom vagy 1 -4 szénatomos alkil-, különösen metilcsoport, továbbá a fenilcsoport.

R_b illetve R₅ jelentése előnyösen hidrogénatom.

Az I általános képletű vegyületek előnyben részesített alcsoportját jelentik azok a vegyületek, amelyekben R₂, R₇, R₃ és R₆ jelentése a fenti, R₄ jelentése hidrogénatom, 1 -4 szénatomos alkil- vagy fenilcsoport.

A találmány szerint egy lantanidafém alatt valamennyi lantanidát értjük, azaz a lantánt (La), cériumot

HU 217 774 Β (Ce), prazeodímiumot (Pr), neodímiumot (Nd), prométiumot (Pm), szamáriumot (Sm), európiumot (Eu), gadolíniumot (Gd), terbiumot (Tb), diszpróziumot (Dy), holmiumot (Ho), erbiumot (Er), túliumot (Tm), itterbiumot (Yb) és lutéciumot (Lu). Előnyösek ezek közül a La, Ce, Nd, Eu és Gd, különösen a La és Eu, kiváltképpen előnyös az Eu.

A komplexsókhoz a megfelelő anionokat az alábbi csoportból választhatjuk ki: halogenidek (például CE, Br~ és E), egy oxisav anionja, továbbá [tetrafluoroborát(III)]-ion, [hexafluoro-foszfát(V)]-ion, [hexafluoro-szilikát(IV)]-ion és [hexafluoro-arzenát(V)]-ion.

Oxisavak anionjaként szóba jöhetnek például a -szulfát, -foszfát, -perklorát, -perbromát, -perjodát, -antimonát, -arzenát, -nitrát, -karbonát, egy 1-8 szénatomos karbonsav anionja, mint például -formiát, -acetát, -propionát, -butirát, -benzoát, -fenil-acetát, -mono-, -divagy -triklór- vagy -fluor-acetát, -szulfonát, mint például -metánszulfonát, -etánszulfonát, -propánszulfonát, -butánszulfonát, trifluor-metánszulfonát (triflát), adott esetben 1-4 szénatomos alkil-, 1-4 szénatomos alkoxicsoporttal vagy halogénatommal, különösen fluor-, klór- vagy brómatommal szubsztituált -benzolszulfonát, vagy metilcsoporttal, illetve több metilcsoporttal szubsztituált -benzolszulfonát, mint például para-toluolszulfonát (tozilát), 2,4,6-trimetil-benzolszulfonát (mezitilénszulfonát), 4-bróm-benzolszulfonát („brozilát”), 4metoxi- vagy 4-etoxi-benzolszulfonát, pentafluor-benzolszulfonát vagy 2,4,6-triizopropil-benzolszulfonát és -foszfonátok, mint például metilfoszfonát, etilfoszfonát, propilfoszfonát, butilfoszfonát, fenilfoszfonát, 4-metilfenilfoszfonát és benzilfoszfonát. Megfelelő anionok a -tartarát, -citrát és a -laktát. A találmány szerint előnyös anionok a fluorid-, klorid-, bromid-, jodid-, [hexafluoro-foszfát(V)]-ion, [hexafluoro-antimonát(III)]-ion, [tetrafluoro-borát(III)]-ion, [tetrafenil-borát(III)]-ion, acetát-, nitrát-, szulfát- és foszfátionok, különösen előnyös anionok a klorid-, az acetát- és a nitrátionok.

Az I általános képletű vegyületekre, különösen azok szubsztituenseire vonatkozóan fentebb megadott előnyök és magyarázatok megfelelő módon érvényesek a következőkben ismertetendő V általános képletű vegyületekre is.

A találmány egy további tárgyát képezik az V általános képletű vegyületek, amelyekben R₂ és R₇ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, R₃ és R^ jelentése egymástól függetlenül 1-4 szénatomos alkilcsoport,

R₄ jelentése hidrogénatom, 1 -20 szénatomos alkil- vagy fenilcsoport, ahol a fenilcsoportok szubsztituálatlanok vagy 1 -4 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituáltak lehetnek,

Meⁿ⁺jelentése egy lantanidafém-ion vagy ittriumion, Y jelentése egy sav anionja, n értéke 2 vagy 3, és m értéke 1, 2 vagy 3,

R₉ jelentése a VI általános képletű maradék, és R₈ jelentése hidrogénatom, vagy R₉ jelentése hidrogénatom vagy fenilcsoport, és R₈ jelentése egy VI általános képletű maradék, p, q és r értéke egymástól függetlenül 0 vagy 1,

X és X’ jelentése egymástól függetlenül 1 -20 szénatomos alkilén- vagy feniléncsoport,

A és A’jelentése egymástól függetlenül -NR₁₂-COvagy -NR₁₂-CS- általános képletű csoport, ahol R₁₂ jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, és Oligo jelentése természetes, módosított vagy szintetikus molekularész (szekvencia) természetes, módosított vagy szintetikus dezoxinukleozidokból vagy peptidnukleinsav építőkövekből felépítve, amely egy nukleinbázison, egy nukleotidok közötti hídon vagy egy cukron keresztül kapcsolódik, és amelynek belső tartománya komplementer, előnyösen teljes mértékben komplementer egy cél-RNS-sel, q értéke előnyösen 1.

Az R₈- és R₉-csoportokra mint szubsztituensekre az R_sre, illetve az R_rre fentebb meghatározottak, és az előnyök is egyaránt érvényesek.

A találmány szerint a cél-RNS azt jelenti, hogy abban egy RNS-szekvenciának jelen kell lennie. Ennek megfelelően poliribonukleinsavakról lehet szó. Előnyösen szóba jöhetnek a következők: mRNS (hírvivő RNS), pre-mRNS (a hírvivő RNS előanyaga), tRNS (transzfer RNS), snRNS (kicsiny, sejtmagi RNS), rRNS (riboszomális RNS) és virális RNS. Előfordulhatnak azonban kevert szekvenciák is RNS-ből és polidezoxiribonukleinsavakból (DNS), például az RNS-DNS kimérák (Okazaki-fragmentumok). Az RNS olyan sok építőkőből épül fel, hogy az oligonukleotiddal egy kettős szálú komplex képződhet.

A szekvencia belső tartományán a találmány szerint azt kell érteni, hogy például a szekvencia öt, előnyösen három és különösen előnyösen egy-két külső nukleotid építőkövének a cél-RNS-sel nem kell komplementernek lennie. Ennek előnye különösen akkor mutatkozik meg, amikor a szekvencia végéhez kötött terpiridinlantanida komplex mozgékonyabb és ezáltal hatékonyabb lehet.

Az oligonukleotidok részben vagy egészben a célRNS-sel komplementer, természetes DNS-építőkövekből vagy teljesen a cél-RNS-sel ugyancsak komplementer, nem természetes szintetikus nukleotidokból vannak felépítve, ahol a „részben” kifejezés azt jelenti, hogy a cél-RNS oligonukleotidszekvenciájában lévő természetes DNS-épitőköveket ugyancsak komplementer, nem természetes szintetikus nukleotidokkal helyettesítettük. A szintetikus építőkövek esetében módosítást hajtunk végre a természetes építőkövek nukleinbázisában, füranózgyűrűjében és/vagy az oligonukleotidok áthidaló csoportjában. A szintetikus építőköveket általában azért használjuk, hogy a duplexstruktúra komplexálóképességét erősítsük és/vagy az oligonukleotidok stabilitását fokozzuk például a nukleázok által kiváltott lebontással szemben. Az (úgynevezett) „antisense-technológiá”-ban a komplementer oligonukleotidok szintézisének céljára módosított nukleozidok jelentős számban ismeretesek, ezért ezekre itt nem térünk ki [lásd például: E. Uhlmann et al., Chemical Reviews, 90. (4), 543-584. (1990)].

Módosításokként szóba jöhetnek a következők: a nukleinbázisrészben például szubsztitúciók vagy

HU 217 774 Β szubsztituensek elhagyása, a nukleotidáthidaló csoportokban például a foszforsav-észter-csoportok átalakítása vagy más áthidaló csoporttal történő helyettesítése, a furanózgyűrű esetében pedig például szubsztitúció a 2’-hidroxicsoporton, a furanóz oxigénatomjának helyettesítése más atommal, a furanózgyűrű helyettesítése mono- vagy biciklusos, csak szénatomokat tartalmazó gyűrűkkel, végül a furanózgyűrű helyettesítése nyílt láncú struktúrákkal.

Az oligonukleotidok szekvenciáiba való beépítésre szánt építőkövek kiválasztását és a beépítés sorrendjét a cél-RNS-sel végbemenő duplexképződés szükségessége határozza meg. A terpiridin-lantanida komplexszel való kapcsolódás helye és módja is befolyásolhatja az építőkövek kiválasztását (megválasztását) és a beépítés helyét.

Az oligonukleotidokban az építőkövek számát úgy célszerű meghatározni, hogy a hibridizáció a cél-RNSsel bekövetkezhessen. Az oligonukleotidok például 5 és 100, előnyösen 5 és 50, különösen 8 és 30 és kifejezetten előnyösen 10 és 25 közötti számú építőkövet tartalmazhatnak. A cél-RNS-sel történő párképződést erősítő tartomány (a párképző nukleotid építőkövek tartománya) előnyösen az oligonukleotidok középső szekvenciatartományában helyezkedik el, például mindig a szélről számított negyedik vagy mindig a harmadik vagy mindig a második vagy mindig a szekvenciák utolsó építőkövei közötti részben. Például ha egy oligonukleotid 20 építőkőből áll, akkor a párképző építőkövek előnyösen a negyedik és a tizenhetedik építőkő közötti tartományban helyezkednek el.

Az oligonukleotidok előnyösen a purin-, illetve a pirimidinsorba tartozó nukleozidokból épülnek fel. Különösen előnyösek ezek közül a 2’-dezoxi-2-aminoadenozin, a 2’-dezoxi-5-metil-citidin, 2’-dezoxi-adenozin, 2’-dezoxi-citidin, 2’-dezoxi-uridin, 2’-dezoxi-guanozin és a 2’-timidin. Kifejezetten előnyösek a 2’-dezoxi-adenozin (A), a 2’-dezoxi-citidin (C), a 2’-dezoxiguanozin (G) és a 2’-timidin (T). A módosított építőköveket előnyösen a purin- és a pirimidinsorba tartozó természetes nukleozidokból, különösen előnyösen az adenozinból, citidinből, guanozinból, 2-amino-adenozinból, 5-metil-citozinból, timidinből és az előzőekben megnevezett dezoxiszármazékokból vezethetjük le. A nukleozidok esetében 2’-módosított ribonukleozidokról is szó lehet.

A találmány egyik kifejezetten előnyös kiviteli módja esetében egy cél-RNS-sel komplementer oligonukleotid természetes dezoxinukleozidokból, különösen előnyösen a 2’-dezoxiadenozinból (A), a 2’-dezoxicitidinből (C), a 2’-dezoxiguanozinból (G) és a 2’-timidinből (T) álló csoport tagjaiból vagy komplementer, nem természetes szintetikus építőkövekből épül fel. A találmány szerint azok a módosított nukleoziok előnyösek különösen, amelyek az oligonukleotidok nukleázokkal szembeni stabilitását növelik meg.

Az oligonukleotidok állhatnak peptid-nukleinsavszekvéne iákból is, amely esetben a terpiridin-lantanida komplex előnyösen a nukleinbázishoz, annak aminovagy karboxiesoportjához kapcsolódik. A peptid-nukleinsav(PNS)-szekvenciákra ugyanazok az előnyök érvényesek, mint az oligonukleotidokra. A peptid-nukleinsavakra az alábbi közleményben találunk példákat: Science, 254., 1497-1500.

A terpiridin-lantanida komplex előnyösen egy áthidalócsoporton keresztül kapcsolódik az oligonukleotidszekvenciában lévő 3’- vagy 5’-végcsoportok nitrogén-, kén- vagy oxigénatomjához. Kapcsolódhat azonban a szekvenciában vagy annak végén elhelyezkedő nukleinbázisok szén-, nitrogén- vagy oxigénatomjához, a furanózgyűrű 2'-helyzetében, a szekvenciában vagy annak végén lévő oxigén-, kén- vagy nitrogénatomokhoz vagy a szekvenciához kapcsolódó nukletodáthidaló csoport oxigén-, kén- vagy nitrogénatomjához. A kötés jellege a terpiridin-lantanida komplextől és funkciós csoportjainak jellegétől függ. Egy áthidalócsoport lehet például egy átalakított funkciós csoport, amely a maga részéről közvetlenül vagy egy vegyületcsoporton keresztül a terpiridin-lantanida komplexhez és/vagy az oligonukleotidhoz kapcsolódhat. Az oligonukleotiddal kialakított kötés lehet ionos vagy előnyösen kovalens. A terpiridin-lantanida komplex egy karbociklusos nukleotidanalóg 6'-szénatomjához is kapcsolódhat.

Az X és X’ mint a terpiridin-lantanida komplex és az oligonukleotid közötti híd alkotórészei az X_f) vagy az X’_o esetében egy közvetlen kötést vagy az X_t vagy az X’, esetében egy 1-22 szénatomos bivalens, nyílt láncú vagy gyűrűs szénhidrogéncsoportot jelenthetnek, amely megszakítatlan vagy az alábbi csoport tagjai által megszakított lehet: kénatom (—S—), -NR₁₂-, -C(O)-Ovagy -C(O)-NR₁₂-, továbbá egy 1-12 oxi-alkilénegységekből álló poli(oxi-alkilén)-maradékot vagy 2 vagy 3 szénatomos alkiléncsoportot is jelenthetnek. A szénhidrogéncsoportok esetében szó lehet például egyenes vagy elágazó szénláncú, 1-22 szénatomos alkilén-, előnyösen 1-18 szénatomos alkilén-, különösen előnyösen 1-12 szénatomos alkilén- és kifejezetten előnyösen 1-8 szénatomos alkilén, 3-8 szénatomos cikloalkilén-, előnyösen 5 vagy 6 szénatomos cikloalkilén-, 6-12 szénatomos arilén- vagy 7-12 szénatomos aril-alkilén-csoportokról. A bivalens szénhidrogéncsoportokra néhány példa: metilén-, etilén-, 1,2- vagy

1.3- propilén-, 1,2-, 1,3- vagy 1,4-butilén-, 1,2-, 1,3-,

1.4- vagy 1,5-pentilén-, 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5- vagy 1,6hexilén-, 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6- vagy 1,7-heptilén-, 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7- vagy 1,8-oktiléncsoport és a nonilén, decilén, undecilén, dodecilén, tridecilén, tetradecilén, pentadecilén, hexadecilén, heptadecilén, oktadecilén, nonadecilén és az eikozilén izomerjei, továbbá a ciklopentilén-, ciklohexilén-, naftilén- és különösen a feniléncsoport, valamint a fenil-metilén- és a fenil-etilén-csoport. A poli(oxi-alkilén)-csoportokra néhány példa: etilén-oxi-, bisz(etilén-oxi)-, trisz(etilénoxi)-, tetraetilén-oxi- és 1,2-propoxicsoport. Különösen előnyösek azok az áthidalócsoportok, amelyekben az X jelentése 1-3 szénatomos alkilén-, 3 szénatomos alkinilén, fenilén- vagy 7 szénatomos aril-alkilén-, különösen előnyösek a 2-3 szénatomos alkilén- vagy a feniléncsoportok. Különösen előnyösek még azok az áthidalócsoportok, amelyekben X’ jelentése 1-20 szénatomos alkilén-, különösen 1-10 szénatomos alkiléncsoport.

HU 217 774 Β

Az A bivalens csoport jelentése előnyösen az -NR₁₂-CS-NR₁₂- vagy a -C(O)-NR₁₂- általános képletű, különösen pedig a tioureilén- (-NH-CS-NH-) vagy a karbamoilén- [-C(O)-NH-] csoport.

Az V általános képletű vegyületek közül azok előnyösek, amelyekben az A’ hiányzik vagy jelentése P(O)(OH)O- csoport.

Az V általános képletű vegyületek közül azok előnyösek, amelyekben R₂ és R₇ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport.

R₃ és R₆ jelentése előnyösen egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoport.

Egy másik előnyös kiviteli mód esetében R₄ jelentése hidrogénatom vagy 1-20 szénatomos alkilcsoport.

A megfelelő lantanidákkal és anionokkal kapcsolatos előnyöket az előzőekben már megneveztük. Az ott leírtak érvényesek az V általános képletű vegyületekre is.

A találmány tárgyát képezik az I általános képletű vegyületek előállításának köztitermékei is. Ezek a II általános képletű vegyületek, amely képletben R[ jelentése hidrogénatom, fenil- vagy antracenilcsoport, ahol a fenilcsoport adott esetben 1 -4 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált,

R₂ és R₇ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, R₃ és R₆ jelentése egymástól függetlenül 1-4 szénatomos alkilcsoport,

R₁₂ jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, ahol az alkil-, cikloalkil-, aril-alkil-, aril- és a Z csoportok szubsztituálatlanok vagy fluor-, klór- vagy brómatommal, illetve 1-4 szénatomos alkil-, 1-4 szénatomos alkoxi-, ciano- vagy nitrocsoporttal szubsztituáltak, azoknak a vegyületeknek a kivételével, ahol R₂ és R₇ jelentése hidrogénatom, R₃ és R₆ jelentése -CH₃csoport, és R, jelentése hidrogénatom vagy 4-fenilcsoport, vagy ahol R, jelentése hidrogénatom, R₂ és R₇ jelentése 4-fenilcsoport, és R₃ és R₆ jelentése hidrogénatom vagy -CH₃-csoport.

Ugyancsak a találmány tárgyát képezik az I általános képletű vegyületek előállításának további köztitermékei is, amelyek a III általános képlettel jellemezhetők, amely képletben

R₅ jelentése egy 2-20 szénatomos alkiléncsoporton keresztül a piridingyűrűhöz kapcsolódó egy vegyértékű, -C(O)-OOR₁₂ általános képletű funkciós csoport, amely képletben az R₁₂ jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, és

R₄ jelentése hidrogénatom vagy 1 -20 szénatomos alkilcsoport.

Ezekre a köztitermékekre a végtermékre megadott előnyök a megfelelő módon érvényesek.

A találmány további tárgyát képezi egy eljárás az I általános képletű vegyületek előállítására, amely abban áll, hogy egy II általános képletű terpiridint és egy III általános képletű piridil-dikarbaldehidet vagy diacil-piridint egy IV általános képletű só jelenlétében kondenzációs reakcióba viszünk, amely képletekben R,, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, Me és Y jelentése, illetve n és m értéke azonos az előzőekben meghatározottakkal, különösen azokkal a meghatározásokkal, előnyökkel és magyarázatokkal, amelyeket az I általános képletű vegyületekkel kapcsolatban adtunk meg.

Az eljárást például úgy lehet kivitelezni, hogy a II, III és IV általános képletű vegyületeket, előnyösen ekvimoláris mennyiségben véve, egy oldószerben feloldjuk, és a komponenseket megnövelt hőmérsékleten egymással reagáltatjuk. Eközben célszerűen a kondenzációt elősegítő katalizátorokat, például tömény ásványi savakat, elsősorban sósavat vagy savas ioncserélőket alkalmazunk. Célszerű lehet egyidejűleg vízmegkötő szer(ek) hozzáadása a reakcióelegyhez, illetve a reakcióban képződő víz reakcióelegyből történő eltávolítása.

A reakció hőmérséklete 40 °C és 220 °C, előnyösen 50 °C és 150 °C közötti értéket vehet fel.

Oldószerként előnyösen használhatunk szerves, poláris, aprotikus oldószereket. Megfelelő oldószer például a víz és a poláris, aprotikus oldószerek, különösen azok, amelyek vízzel elegyíthetők. Ilyen oldószerek például az alkoholok (metanol, etanol, normál, és izopropil-alkohol, butanol, etilénglikol, propilénglikol, etilénglikol-monometil-éter), éterek (dietil-éter, dibutiléter, tetrahidrofürán, 1,4-dioxán, etilénglikol-dimetiléter, etilénglikol-dietil-éter, dietilénglikol-dietil-éter, trietilénglikol-dimetil-éter), halogénezett szénhidrogének (metilén-diklorid, kloroform, 1,2-diklór-etán, 1,1,1-triklór-etán, 1,1,2,2-tetraklór-etán, klór-benzol), karbonsav-észterek és laktonok [etil-acetát, metil-propionát, etil-benzoát, etil-(2-metoxi)-acetát, 4-butanolid, 5-pentanolid, 2,2-dimetil-3-propanolid], N-alkil-karbonsavamidok és laktámok (Ν,Ν-dimetil-formamid, N,N-dietil-formamid, Ν,Ν-dimetil-acetamid, 1,1,3,3-tetrametil-karbamid, hexametil-foszfortriamid, N-metil-y-butirolaktám, N-metil-Z-kaprolaktám, N-metil-2-pirrolidon), szulfoxidok (dimetil-szulfoxid, tetrametilén-szulfoxid), szulfonok (dimetil-szulfon, dietil-szulfon, trimetilén-szulfon, tetrametilén-szulfon), tercier aminok (trimetil-amin, trietil-amin, N-metil-piperidin, 4-metil-morfolin, 4-metil-tetrahidro-l,4-oxazin, piridin), szubsztituált benzolszármazékok (klór-benzol, 1,2-diklór-benzol, 1,2,4-triklór-benzol, nitro-benzol, toluol, xilol) és nitrilek (acetonitril, propionitril, benzonitril, fenil-ecetsav-nitril).

A IV általános képletű fémsók általánosan ismertek és jelentős részben a kereskedelmi forgalomban beszerezhetők.

AII általános képletű új, egy funkciós csoportot tartalmazó vegyületek előállítása az E. C. Constable, Polyhedron, Bánd 7, Nr. 24, 2531-2536 (1988) közleményben leírt eljárás szerint történik, ahol a funkciós csoport adott esetben védőcsoporttal védett lehet.

AII és III általános képletű, funkciós csoport nélküli vagy azt tartalmazó vegyületek jelentős részben ismertek vagy ismert, illetve analóg eljárásokkal előállíthatok. Azok a III általános képletű vegyületek, amelyekben R₄ jelentése hidrogénatom, R₅ jelentése pedig egy 2-18 szénatomos alkilén-X₅ általános képletű csoport, amely képletben az X₅ jelentése -C(O)-OR, -C(O)-NHR, —SO₂-R vagy -SO₂-NHR, továbbá az R jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkil5

HU 217 774 Β csoport, újak, és a következő módon állíthatók elő: egy megfelelő 3-halogén-piridin-1,5-dikarbonsav-észtert palládiumkatalízissel egy CH₂=CH-C,-C₁₆-alkilén-karbonsav-észter képletű alkénnel alkilezünk, az alkéncsoportot például katalitikusán hidrogénezzük, majd az 1,5-dikarbonsav-észter-csoportokat hidroximetil-csoporttá redukálva egy l,5-di(hidroxi-metil)-piridin-alkil-karbonsav-észtert nyerünk, azután a hidroxi-metil-csoportokat aldehidcsoportokká oxidáljuk, és adott esetben az észtercsoportokat karbonsavvá hidrolizáljuk vagy az észtercsoportokat karbonsavamidokká amidáljuk.

Azokat a III általános képletű vegyületeket, amelyekben az R₄ jelentése 1-12 szénatomos alkilcsoport, R₅ jelentése pedig egy 2-18 szénatomos alkilén-X₅ általános képletű csoport, és X₅ jelentése -C(O)-OR, -C(O)-NHR, -SO₂-R vagy -SO₂-NHR általános képletű csoport, amelyben R jelentése hidrogénatom vagy 1 -6 szénatomos alkilcsoport, újak, és a következő módon állíthatók elő: egy megfelelő 3halogén-l,5-di(hidroxi-metil)-piridint (előállítható a megfelelő 3,5-dikarbonsav-metil-észter redukciójával), amelyben a hidroxi-metil-csoportok például acetilcsoporttal védettek, palládiumkatalízissel reagáltatjuk egy CH₂=CH-C,-C₁₆-alkilén-karbonsav-észter képletű alkénnel, az alkéncsoportot például katalitikusán hidrogénezzük, a védőcsoportoktól megfosztott hidroxi-metil-csoportokat adott esetben a megfelelő

3,5-piridin-dialdehiddé oxidáljuk, amelynek az aldehidcsoportjait például Grignard-reagensekkel (1-12 szénatomosokkal) alkilezhetjük, az észtercsoportokat adott esetben karbonsavvá hidrolizáljuk vagy az észtercsoportokat karbonsavamidokká amidáljuk, és a szekunder hidroxicsoportokat oxocsoportokká oxidáljuk.

A találmány tárgya továbbá eljárás az V általános képletű vegyületek előállítására, amely abban áll, hogy egy I általános képletű vegyületet

a) egy Via általános képletű vegyülettel, amely képletben

A’ ’ jelentése egy megfelelő, egy vegyértékű funkciós csoport, amelyet az alábbi képletű, illetve általános képletű csoportok közül választunk ki: -OR[₀, -SR₁₀, -NCO, -NCS, -NHR_lb -C(O)OR_lb -C(O)SH, -C(O)NHR,„ -C(O)C1, -C(S)SR„, -C(S)NHR_Ib -C(S)OR„, -SO₃R_]b -SO₂NHR_lb -SO₂C1, -P(O)(OH)₂, -P(O)(OH)NHR,„ -P(S)(SH)₂, -P(S)(SH)NHR_lb -P(S)(OH)₂, -P(S)(OH)-NHR_lb -P(O)(SH)₂,

-P(O)(SH)-NHR_lb -P(O)(OH)H, -P(O)(NHR_n)H, -P(S)(SH)H, -P(S)(NHR_n)H, -P(SO)(OH), -P(O)(SH)H, amely képletekben R₁₀ jelentése hidrogénatom, karbamoil-, tiokarbamoil- vagy 1-6 szénatomos alkil-, illetve -C_xH_2xNH₂, -C_xH_2xSH vagy (C_xH_2xO)_y-H általános képletű csoport, és

R₁₍ jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilvagy -C_xH_2x-NH₂, -C_xH_2x-SH vagy -(C_xH_2xO)_y-H általános képletű csoport, és x értéke 2-től 6-ig terjedő szám, és y értéke 1-től 20-ig terjedő szám,

X’ jelentése egy szubsztituálatlan vagy 1-4 szénatomos alkoxi-, 1-4 szénatomos alkil-, ciano- vagy nitrocsoporttal, illetve fluor-, klór- vagy brómatommal szubsztituált, az alábbi csoportok közül kiválasztott csoport: 1-20 szénatomos alkilén-, 2-12 szénatomos alkenilén-, 2-12 szénatomos alkinilén-, illetve a -(C_xH_2xO)_y- általános képletű csoport, amely képletben x értéke 2-től 6-ig terjedő szám, és y értéke 1-től 20-ig teijedő szám, továbbá idetartoznak még az 5-8 szénatomos cikloalkilén-, 6-12 szénatomos arilén- és a 7-12 szénatomos aril-alkilén-csoportok is,

A’ jelentése oxigén- vagy kénatom, továbbá az -S-S, -NR₁₂-CO-NR₁₂-, -NR₁₂-CS-NR₁₂-,

-NR,2- -NR₁₂-C(O)O-, -C(O)-O-,

-C(O)S-, -C(O)NR₁₂-, -C(S)S-, -C(S)O-, -C(S)NR₁₂-, -so₂nr₁₂-, -so,-, -P(O)(OH)O-, -P(S)(SH)S-, -P(S)(SH)O-, -P(S)(OH)O-, -P(O)(SH)S-, P(O)(SH)S-, -P(O)(OH)S-, -P(O)(SH)O-, -P(O)(OH)-NR₁₂-, -P(S)(SH)-NR₁₂-, -P(S)(OH)-NR₁₂-,-P(O)(SH)-NR₁₂-, -HP(O)O-, -HP(S)S-, -HP(O)NR₁₂- vagy -HP(S)NR₁₂- képletű, illetve általános képletű csoport, amely képletekben

R,₂ jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, és az

Oligo jelentése egy természetes, módosított vagy szintetikus dezoxinukleozidokból vagy peptid-nukleinsav építőkövekből felépített (előállított) szekvencia, amely egy nukleinbázison, egy nukleotidok közötti hídon vagy egy cukron keresztül kapcsolódik, és amelynek belső tartománya egy cél-RNS-sel komplementer, vagy

b) egy VIb általános képletű vegyülettel, amely képletben

A” és Oligo jelentése azonos az a) pontban megadottakkal, reagáltatjuk.

Az oligonukleotid-konjugátumok előállítására szolgáló, találmány szerinti eljárást például úgy lehet kivitelezni, hogy egy adott esetben funkcionalizált oligonukleotidot egy oldószerben vagy oldószerkeverékben feloldunk, azután hozzáadunk egy megfelelő funkciós csoportokat hordozó terpiridin-lantanida komplexet, és a reakcióelegyet adott esetben keverés közben reagálni hagyjuk. A képződött konjugátumot azután önmagában ismert módon megtisztítjuk és kívánt esetben elkülönítjük.

A reakció hőmérséklete például 0 °C-tól 120 °C-ig, előnyösen 20 °C-tól 80 °C-ig teijedhet. Különösen előnyös, ha a reakciót szobahőmérsékleten kivitelezzük.

Ha a kapcsolási reakció észterezés, átészterezés vagy amidálás, a megfelelő karboxicsoportot előzőleg ismert módon aktiválhatjuk, például reagáltathatjuk karbodiimiddel és N-hidroxi-szukcinimiddel.

A reaktánsokat célszerűen ekvimoláris mennyiségben visszük reakcióba. Lehetséges azonban az is, hogy a katalizátort vagy az oligonukleotidot fölöslegben vesszük.

HU 217 774 Β

A tisztítást a szokásos módszerekkel, például előnyösen dialízissel, elektroforézissel és kromatográfiás eljárásokkal végezzük; ez utóbbiak közé tartozik a nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC), a fordított fázisú HPLC, az affmitáskromatográfia, az ioncserés kromatográfia és a gélkromatográfia.

Az alkalmazandó, adott esetben funkcionalizált oligonukleotidot önmagában ismert módon, automata szintetizátor segítségével, amely a kereskedelemben beszerezhető, állíthatjuk elő. Az ehhez a szintézishez szükséges nukleozidok ismertek, részben megvásárolhatók vagy analóg eljárásokkal előállíthatók.

A találmány szerinti terpiridin-oligonukleotid-konjugátumok kitűnően felhasználhatók különösen RNSszekvenciák szekvenciaspecifikus hasítására, amikor is a katalitikus hatás kifejtéséhez meglepő módon csak igen kicsiny mennyiségben kell ezeket alkalmazni.

A találmány tárgya továbbá eljárás a ribonukleinsavak foszfát-nukleotid hídjának hasítására fiziológiás körülmények között és egy terpiridin-lantanida komplex behatására, azzal jellemezve, hogy a) a cél-RNS-t egy olyan oligonukleotiddal komplexáljuk (visszük komplexkötésbe), amelynek belső szekvenciája a cél-RNSsel komplementer és egy terpiridin-lantanida komplexhez kapcsolódik, és b) azután reagálni hagyjuk és elhasítjuk.

A találmány szerinti eljárást in vivő az oligonukleotid beadásával vagy in vitro egy cél-RNS és egy találmány szerint alkalmazandó oligonukleotid elegyítésével lehet kivitelezni.

A fiziológiás körülmények a szakember számára közismertek és tulajdonképpen azt jelentik, hogy a reakciót vizes közegben és a pH 5-9 közti tartományban, előnyösen pH 5-8 és különösen előnyösen 5-7,5 pHértékek között hajtjuk végre, és a vizes közeg további inért alkotóelemeket is tartalmazhat, például alkálifémsókat vagy alkáliföldfémsókat és különösen pufferrendszereket.

Az eljárást a 0 °C és 100 °C, előnyösen a 20 °C és 50 °C és különösen 30 °C és 40 °C közötti hőmérsékleti tartományban lehet végrehajtani.

A találmány szerinti eljárás során a hasítás úgy történik, hogy a foszfáthídkötés átésztereződik, ennek következtében egy 2’,3’-gyűrűs foszfátvégcsoportot tartalmazó töredék és egy másik, 5’-hidroxivégcsoportot tartalmazó töredék keletkezik. A gyűrűs foszfátcsoport azután tovább hidrolizálhat.

A találmány szerinti terpiridin-lantanida komplexek gyógyszerként nyernek alkalmazást. Ezek a nukleázok által kiváltott lebontással szemben rendkívül stabilak. Különösen meglepő, milyen kitűnő párképződést mutatnak az RNS-típusú komplementer nukleinsavszálakkal. Ezenfelül váratlanul könnyen veszik fel a sejtek ezeket az anyagokat. A találmány szerinti oligonukleotidok ezért különösen alkalmasak az antisense-technológia céljára, azaz a nemkívánatos proteintermékek keletkezésének megakadályozására azáltal, hogy az mRNS megfelelő komplementer nukleotidszekvenciájához kötődnek (EP 266,099, WO 87/07300 és WO 89/08146). Ezek az anyagok felhasználhatók fertőzések és megbetegedések kezelésére például azért, mivel bioaktív proteinek expresszióját a nukleinsavak (például onkogének) szintjén blokkolni képesek.

A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti vegyületek felhasználása betegségek kezelésére szolgáló terápiás eljárásban meleg vérűeknél, ideértve az embert is azáltal, hogy a testben nukleotidszekvenciákat inaktiválni képesek. Meleg vérűek esetében 70 kg testtömegnél például a napi dózis 0,01 mg és 1000 mg közötti érték lehet. Az adagolás előnyösen gyógyszerkészítmény formájában parenterálisan, például intravénásán vagy intraperitoneálisan történhet. A parenterális adagolás céljára elsősorban a vízben oldódó hatóanyagok vizes oldata, például vízoldható, fiziológiailag elfogadható só vizes oldata alkalmas vagy a hatóanyagok olyan vizes szuszpenziója, amely viszkozitást fokozó (növelő) szert, például nátrium-karboxi-metil-cellulózt, szorbitot és/vagy dextránt és adott esetben stabilizátorokat is tartalmaz. Ilyenkor a hatóanyag, adott esetben a segédanyagokkal együtt, liofilizátum formájában állhat rendelkezésre, amelyet a beadás előtt megfelelő oldószerrel oldatba viszünk. A találmány szerinti konjugátumokat inhalációval vagy liposzomális adagolási forma segítségével juttathatjuk be a szervezetbe.

A találmány szerinti konjugátumokat diagnosztikai célra vagy mint szekvenciaspecifikus endoribonukleázokat molekuláris biológiai segédanyagként használhatjuk fel.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy vizes összetétel és különösen egy vizes oldaton vagy szuszpenzión alapuló gyógyszerkészítmény, amely az V általános képletű vegyületek hatékony mennyiségét egyedül vagy egyéb hatóanyagokkal és adott esetben segédanyagokkal és előnyösen szignifikáns mennyiségű vízzel mint gyógyszerészeti vivőanyaggal együtt tartalmazza.

A találmány szerinti farmakológiailag hatékony vegyületeket parenterálisan adható készítmények vagy infúziós oldatok formájában alkalmazhatjuk. Az ilyen oldatok előnyösen izotóniás vizes oldatok vagy szuszpenziók, és ezeket például liofilizált készítmények esetében, amelyek a hatóanyagot egyedül vagy egy hordozóanyaggal, például mannittal együtt tartalmazzák, közvetlenül a felhasználás előtt állítjuk elő. A gyógyszerkészítményeket sterilezhetjük és/vagy segédanyagokat, például konzerváló, stabilizáló, vázképző és/vagy emulgeálószert, oldódást elősegítő adalékot, az ozmotikus nyomást szabályozó sókat és/vagy puffereket adhatunk hozzájuk. A gyógyszerkészítmények kívánt esetben további farmakológiailag aktív anyagot, például antibiotikumokat tartalmazhatnak, és azokat önmagában ismert módon, például a szokásos oldásos vagy liofilizációs eljárásokkal állíthatjuk elő, és ezek a készítmények mintegy 0,1%-tól 90%-ig, különösen mintegy 0,5%-tól mintegy 30%-ig, például 1%-tól 5%-ig terjedő mennyiségű hatóanyago(ka)t tartalmaznak.

A mellékelt rajzokon bemutatjuk például egy antisense-oligonukleotid és egy szubsztrát RNS-molekulából képződött hibrid szerkezetét.

Az 1. ábra sematikusan mutatja egy hibrid szerkezetét, amely egy szubsztrát-RNS-ből (az „5”’-vel jelölt vo7

HU 217 774 Β nal) és egy antisense-oligonukleotidból (a „3 ”’-vel jelölt vonal) keletkezik, és amelyhez a találmány szerint egy komplex (az „Ln” jellel jelölve) kapcsolódik (az úgynevezett konjugátum). A feltüntetett számozás a szubsztrát-RNS nukleotid építőköveire vonatkozik, és a számozás elve az, hogy a szubsztrát-RNS azon nukleotidját, amely az antisense-oligonukleotid nukleotidjával komplementer, és amelyhez a komplex kapcsolódik, „0”-val jelöljük. A további számozás ezután a 3’-irányban növekvő (+1, +2 és így tovább), míg a szubsztrát-RNS 5’irányában csökkenő (-1, -2 és így tovább).

A 2. ábra egy konkrét szubsztrát-RNS-ből (CG-1352, lásd a példákat) és egy találmány szerinti antisense-oligonukleotid konjugátumból (a „3”’-vel jelölt vonal) keletkezett hibrid sematikus ábrázolása. A szubsztrát-RNS vastagon nyomott nukleotidja (itt: G) komplementer az antisense oligonukleotidkonjugátum azon nukleotidjával, amelyhez a komplex kapcsolódik.

A találmányt az itt következő példák szemléltetik.

A. A terpiridin-lantanida komplexek kiindulási anyagainak előállítása

Al. példa: Terpiridin-bisz-hidrazino-vegyületek előállítása

a) 100 mmol 6-acetil-2-bróm-piridin 200 ml metanollal készített oldatához jeges fürdővel történő hűtés mellett 40 ml 2 M vizes kálium-hidroxid-oldatot adunk. Miután az elegyhez hozzáadtuk a megfelelő benzaldehid 400 mmol-nyi mennyiségét, a hűtőfürdőt eltávolítjuk, és az elegyet 4 órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük. A terméket leszűrjük, háromszor mossuk vízzel és kétszer mossuk metanollal, végül erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk.

Ugyanezen eljárás szerint állítjuk elő a következő, a általános képletű vegyületeket is: al. R,=4-metoxi-fenil-csoport; molekulatömeg: 317,7, a2. R,=4-nitro-fenil-csoport; molekulatömeg: 333,6, a3. R) =3-nitro-fenil-csoport; molekulatömeg: 334, a4. R₁=2-nitro-fenil-csoport; molekulatömeg: 334, a5. R] = fenilcsoport.

b) Egy lombikban összekeverünk 30 mmol α,β-telítetlen karbonilvegyületet (a), 12,1 g (30 mmol) l-(6acetil-2-bróm)-piridin-jodidot, 13,9 g (180 mmol) ammónium-acetátot és 100 ml ecetsavat, és az elegyet visszafolyató hűtő alatt forraljuk. Két óra eltelte után az elegyet lehűtjük szobahőmérsékletre, leszűrjük, és a kapott terméket erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk.

Ugyanezzel az eljárással állítjuk elő a következő, b általános képletű vegyületeket is: bl. R,=4-metoxi-fenil-csoport; molekulatömeg: 497,1, b2. R| =4-nitro-fenil-csoport; molekulatömeg: 512, b3. R| =3-nitro-fenil-csoport; molekulatömeg: 513, b4. R, =2-nitro-fenil-csoport; molekulatömeg: 512, b5. R, =fenilcsoport.

mmol titán-tetraklorid 75 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készített oldatához szobahőmérsékleten, argongáz-atmoszférában részletekben hozzáadunk 22 mmol lítium-[tetrahidrido-aluminát(III)]-at. A kapott szuszpenziót 20 percen keresztül keverjük szobahőmérsékleten, azután lehűtjük 0 °C-ra. Hozzáadjuk a b2. jelű vegyület 10 mmol-nyi mennyiségét, és a szuszpenziót 30 percen keresztül szobahőmérsékleten keverjük. Ezután 0 °C-on óvatosan cseppenként 50 ml vizet és 25 ml 25%-os vizes ammóniagáz-oldatot adunk hozzá. A reakcióelegyet 150 ml kloroformmal háromszor extraháljuk. A szerves fázisokat egyesítjük, egyszer vízzel mossuk, nátrium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószer fő tömegét ledesztilláljuk. Ugyanezen eljárás szerint állítjuk elő a következő b általános képletű vegyületet is:

b6. Ri=4-amino-fenil-csoport; molekulatömeg: 482,5. Analóg módon állítjuk elő a következő vegyületeket: b7. R,=3-amino-fenil-csoport; molekulatömeg: 482, és b8. Rj =2-amino-fenil-csoport; molekulatömeg: 482.

c) A megfelelő dibróm-terpiridin-vegyületből 10 mmol mennyiséget feloldunk 30 ml metil-hidrazinban, és az oldatot visszafolyató hűtő alatt 17 órán keresztül forraljuk. Lehűtjük szobahőmérsékletre, a metil-hidrazin feleslegét ledesztilláljuk, és a maradékot feloldjuk 20 ml metanolban. A kivált terméket kiszűrjük és erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk.

Ugyanezen eljárás szerint állítjuk elő a következő c általános képletű vegyületeket is: cl. Rj =4-metoxi-fenil-csoport; molekulatömeg: 427, c2. R, =4-amino-fenil-csoport; molekulatömeg: 412,5, c3. R, =3-amino-fenil-csoport; molekulatömeg: 412, c4. R₁=2-amino-fenil-csoport; molekulatömeg: 412, c5. Rj= fenilcsoport.

A c 1. jelű metoxivegyületből 10 mmol mennyiségűt elszuszpendálunk 100 ml kloroformban, és jeges fürdővel végzett hűtés mellett, 20 perc alatt hozzáadjuk 50 mmol mennyiségű bór(III)-bromid 1 M metiléndikloridos oldatát. Ezután a szuszpenziót 5 napon keresztül forraljuk visszafolyató hűtő alatt, azután lehűtjük szobahőmérsékletre, hozzáöntjük 300 ml vízhez, és az elegyet 200 ml 2 M vizes sósavoldattal megsavanyítjuk. A kapott elegyet kétszer extraháljuk dietil-éterrel, azután a vizes fázis pH-értékét 10%-os vizes nátriumkarbonát-oldattal pH 9-re beállítjuk és 30 percig keverjük. A kivált c6. jelű terméket (R, =4-hidroxi-fenil-csoport; molekulatömeg: 413,5) leszűrjük és erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk.

A2. példa: 3-[4’-(2’,6’-Diformil-piridin)]-propionsav

a) 3,5 g dimetil-(4-bróm-piridin)-2,6-dikarboxilátot, 390 mg tri(metil-fenil)-foszfint, 9,3 ml terc-butilakrilátot, 7,1 ml trietil-amint, 30 ml Ν,Ν-dimetil-formamidot és 287 mg palládium-diacetátot összekeverünk, és a keveréket felmelegítjük 110 °C-ra. 90 perc eltelte után az elegyet lehűtjük szobahőmérsékletre, hígítjuk dietil-éter/metilén-diklorid (1:1) arányú elegyével és ammónium-klorid vizes oldatával extraháljuk. A szerves fázist nátrium-szulfáton megszárítjuk, és forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk az oldószert. A maradékot erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk.

Elemi analízis:

számított: C: 59,81%, H: 5,96%, N: 4,36%; talált: C: 59,8%, H: 6,0%, N: 4,1%.

HU 217 774 Β

250 mg aktív szénre lecsapott palládiumkatalizátort és 2,5 g fenti vegyületet elegyítünk 250 ml metanollal, és az elegyet szobahőmérsékleten, hidrogéngáz-atmoszférában éjjelen át hidrogénezzük. Az elegyet Hyflo-rétegen át leszűrjük, a szűrletből az oldószert forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk, és a maradékot erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk.

Elemi analízis:

számított: C: 59,43%, H: 6,55%, N:4,33%; talált: C: 59,3%, H: 6,6%, N: 4,3%.

5,0 g fentiekben leírt vegyületet feloldunk 50 ml metanol és 50 ml tetrahidrofurán elegyében, az oldatot lehűtjük 0 °C-ra és 1,1 g nátrium-[tetrahidrido-borát(III)]-t adunk hozzá. 50 perc eltelte után további 1,1 g nátrium-[tetrahidrido-borát(III)]-t adunk hozzá, majd 130 perc eltelte után még 0,5 g nátrium-[tetrahidridoborát(III)]-t adunk a reakcióelegyhez. Az összesen 165 perc reakcióidő eltelte után az elegyet szobahőmérsékletre felmelegítjük, azután ismételten lehűtjük 0 °Cra és még 1,1 g nátrium-[tetrahidrido-borát(III)]-t adunk hozzá. 6 óra reakcióidő után az oldószerből annyit desztillálunk le, hogy az elegy térfogata 60 ml legyen. Ekkor telített, vizes ammónium-klorid-oldatot csepegtetünk hozzá, metilén-dikloriddal négyszer extraháljuk, a szerves fázist egyszer mossuk vizes ammónium-klorid-oldattal, végül nátrium-szulfáton megszárítjuk, a szárítószert kiszűijük, és az oldószert ledesztilláljuk.

Elemi analízis:

számított: C: 62,90%, H: 7,92%, N: 5,24%; talált: C: 63,0%, H: 7,9%, N: 5,2%.

19,8 g fentebb előállított vegyületet feloldunk 300 ml 1,4-dioxánban, és az oldathoz 16,2 szelén-dioxidot adunk. Az elegyet felmelegítjük 100 °C-ra, ezen a hőmérsékleten keverjük 45 percig, azután lehűtjük szobahőmérsékletre és ezen a hőmérsékleten további két órán keresztül keveijük. Az elegyet szüljük, és a szűrletből az oldószert ledesztilláljuk.

Elemi analízis:

számított: C: 63,87%, H: 6,51%, N: 5,32%; talált: C: 64,14%, H: 6,53%, N: 5,43%.

4,7 g fentebb előállított vegyületet hozzáadunk 17,2 ml jéggel lehűtött trifluor-ecetsavhoz. A reakció végbemenetele után az elegyből az illó anyagokat 0 °Con ledesztilláljuk.

Elemi analízis:

számított: C: 57,97%, H: 4,38%, N: 6,76%; talált: C: 57,55%, H: 4,21%, N: 6,61%.

b) 5 g dimetil-(4-bróm-piridin)-2,6-dikarboxilátot feloldunk szobahőmérsékleten 175 ml tetrahidrofuránban, és az oldathoz hozzáadunk 75 ml metanolt. A kapott oldatot lehűtjük 0 °C-ra és 45 perc alatt részletekben hozzáadunk 3,44 g nátrium-[tetrahidrido-borát(III)] reagenst, és a reakcióelegyet engedjük felmelegedni szobahőmérsékletre. Egy óra eltelte után 30 ml acetont csepegtetünk hozzá 10 perc alatt, azután a reakcióelegyet 1 órán keresztül forraljuk visszacsepegő hűtő alatt, végül az oldószert forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk. A maradékhoz hozzáadunk 50 ml piridint, 0,1 g 4-(dimetilaminoj-piridint, az elegyet lehűtjük 0 °C-ra és 30 perc alatt hozzácsepegtetünk 34,4 ml ecetsavanhidridet. A kapott szuszpenziót engedjük felmelegedni szobahőmérsékletre és 50 ml tetrahidrofuránt adunk hozzá. A reakcióelegyet éjjelen át keveijük szobahőmérsékleten, a csapadékot leszűrjük és kétszer mossuk 50-50 ml tetrahidrofuránnal. A szűrletből az oldószert forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk. Atkristályosítás után megkapjuk a 4-bróm-2,6-di(acetoxi-metil)-piridint.

Olvadáspont: 66-69 °C.

0,982 g 4-bróm-2,6-di(acetoxi-metil)-piridint, 1,5 g etil-3-[tributil-ón(IV)]-akrilátot és 176 mg palládiumtetrakisz(trifenil-foszfin)-t feloldunk 25 ml 1,4-dioxánban, és az oldatot felmelegítjük 90 °C-ra. 90 percig tartó reakcióidő elteltével a reakcióelegyet lehűtjük, a szilárd terméket elkülönítjük és hexán/etil-acetát elegyből átkristályosítjuk.

Tömegspektrum: M⁺ = 321.

2,74 g fenti vegyületet és 70 mg Wilkinson-féle katalizátort [trisz(trifenil-foszfín)-ródium(I)-klorid] feloldunk 150 ml benzolban, hozzáadunk 12,2 ml trietilszilánt, és az oldatot visszafolyató hűtő alatt forraljuk. 270 mg katalizátort fölöslegben vett trietil-szilánban részletekben hozzáadunk 1 óra leforgása alatt. A terméket kromatográfiával tisztítjuk.

Molekulatömeg: 323.

267 mg nátriumfémet feloldunk 50 ml etanolban. Ebből az oldatból 7,2 ml-t véve ahhoz hozzáadjuk 1,845 g fenti vegyület 35 ml etanollal készített oldatát, és az elegyet 2,5 órán keresztül keverjük szobahőmérsékleten. A reakcióelegyet szilikagélen átszűijük, és a szűrletből az oldószert ledesztilláljuk. A terméket éjjelen át erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk. Ή-NMR-spektrum (CDC1₃): δ 7,0 (2H, s), 4,7 (4H, s),

4,1 (2H, q), 2,9 (2H, t), 1,2 (3H,t).

1,27 g fenti vegyületet feloldunk 30 ml 1,4-dioxánban, és az oldathoz 714 mg szelén-dioxidot adunk. A reakcióelegyet melegítjük és 2 óra eltelte után vattán átszűrjük. A szűrletből az oldószert ledesztilláljuk, a maradékot 5% metilén-dikloridot tartalmazó etil-acetátban felvesszük és szilikagélen szűrjük.

H-NMR-spektrum (CDC1₃): δ 10,1 (2H, s), 8,0 (2H, s),

4,1 (2H, q), 3,1 (2H, t), 2,7 (2H, t), 1,2 (3H, t).

350 mg fentebb előállított vegyület 45 ml dietiléterrel készített oldatához 0 °C hőmérsékleten 13 ml mennyiséget adunk a következő, előre elkészített oldatból: 0,949 réz-bromiddimetil-szulfid feloldva 10 ml dietil-éterben, lehűtve 0 °C-ra és hozzáadva 5,9 ml metil-lítium. 5,5 óra reakcióidő elteltével, amely alatt az elegyet szobahőmérsékleten keverjük, az elegyet lehűtjük 0 °C-ra, hozzáadunk 2 ml etil-acetátot, 8 ml dietil-étert és 8 ml etán-tiolt. Éjjelen át szobahőmérsékleten keverjük, azután hozzáadunk 60 ml vizet és metilén-dikloriddal négyszer extraháljuk. A szerves fázist nátrium-szulfáton megszárítjuk, leszűrjük, és az oldószert forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk, végül a maradékot kromatográfiával tisztítjuk.

Tömegspektrum: (M+H)⁺=266.

4,5 ml metilén-diklorid és oxalil-klorid oldatához -78 °C-on hozzáadunk 0,5 ml dimetil-szulfoxidot. 15 perces keverés után ehhez az elegyhez hozzáadjuk 193 ml fenti vegyület 4 ml metilén-dikloriddal készített

HU 217 774 Β oldatát. Az elegyet két órán keresztül keverjük -78 °Con, azután 1,5 ml trietil-amint adunk hozzá. 30 percen át 0 °C-on végzett keverés után 15 ml vizet adunk a reakcióelegyhez és dietil-éterrel négyszer extraháljuk. A szerves fázist nátrium-szulfáton megszárítjuk, az oldószert forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk, és a maradékot kromatográfiával tisztítjuk.

Elemi analízis:

számított: C: 63,87%, H: 6,51%, N: 5,32%; talált: C: 63,96%, H: 6,55%, N: 5,45%.

0,464 g fenti vegyületet 5 ml 4 M vizes sósavoldattal 50 °C-ra felmelegítünk. 90 perc eltelte után a reakcióelegyet lehűtjük szobahőmérsékletre és jeges vízzel elegyítjük. A terméket kristályos anyagként kapjuk meg. Elemi analízis:

számított: C: 61,27%, H: 5,57%, N: 5,95%; talált: C: 61,2%, H: 5,5%, N: 6,2%.

A3. példa: További terpiridin-bisz-hidrazino-vegyületek és 2,6-dikarbonil-piridin-vegyületek előállítása

1. Az f jelű dikarbonilvegyüleí előállítása

a) Ad jelű vegyület előállítása

2.6- Di(hidroxi-metil)-4-[N-(karboxi-metil)-N-metilj-amino-piridin (d)

0,3 g (1,4 mmol) 4-bróm-2,6-di(hidroxi-metil)-piridint, 0,25 g (2,8 mmol) szarkozint és 0,11 g (2,8 mmol) nátrium-hidroxidot feloldunk 15 ml metanol és 15 ml víz elegyében. 25 MPa nyomáson, nitrogéngáz-atmoszférában dolgozunk. Az elegyet 100 °C-ra melegítjük és addig forraljuk, amíg a 4-bróm-2,6-di(hidroxi-metil)piridin már nem mutatható ki. Két nap eltelte után a reakció befejeződik. A barna reakcióelegyből az oldószert ledesztilláljuk, és a terméket kromatográfiával tisztítjuk (kifejlesztőelegy: metanol/metilén-diklorid 20:80). A tisztítás után sárga olajat kapunk.

Ή-NMR-spektrum (metanol): δ 6,6 (2H, s), 4,5 (4H, s), 3,8 (2H, s), 3,1 (2H, s), 3,0 (3H, s).

b) Az e jelű vegyület előállítása

2.6- Di(hidroxi-metil)-4-[N-(metoxi-karbonil-metil)-N-metil]-amino-piridin (e)

A d jelű, fentebb előállított nyerstermékből 5,4 g-ot elszuszpendálunk 450 ml metanolban, és a szuszpenziót forrásig melegítjük. Hozzáadunk 6 ml tömény kénsavat, ekkor tiszta oldat keletkezik. Az oldatot 3 órán keresztül forraljuk visszafolyató hűtő alatt. Az elegyet hagyjuk lehűlni szobahőmérsékletre, hozzáadunk 5 g kálium-karbonátot és 10 percig keverjük. A kivált szilárd anyagot szűrjük, és a szűrletből az oldószert ledesztilláljuk. A kapott nyersterméket szilikagéloszlopon tisztítjuk (44 g szilikagél; kifej lesztőelegy: ecetsav/metanol/metilén-diklorid 1:9:50). Sárga, szilárd, kristályos terméket kapunk.

Ή-NMR-spektrum (MeOD): δ 6,8 (2H, s), 4,6 (4H, s),

3,7 (2H, s), 3,7 (3H, s), 3,2 (3H, s).

c) Az f jelű vegyület előállítása

4-[N-(metoxi-karbonil-metil)-N-metil]-amino-piridin-2,6-dikarbaldehid (f)

Az előzőleg előállított e jelű vegyületből 0,557 g-ot (2,31 mmol) feloldunk 8 ml piridin/l,4-dioxán (1:1) arányú elegyben, és azt forrásig melegítjük. A keletkezett sárga oldathoz 1,54 g (13,7 mmol) szelén-dioxidot adunk, és a reakcióelegyet 4 órán keresztül forraljuk visszafolyató hűtő alatt (ekkorra a vékonyrétegkromatogramon már nem mutatható ki a kiindulási vegyület). Az elegyet engedjük lehűlni szobahőmérsékletre, hozzáadunk mintegy 100 ml aceton/metilén-diklorid (1:9) arányú elegyet, egy kis szilikagéloszlopon átszűrjük és ugyanazzal az oldószerrel utánmossuk. A kapott tiszta, sárga oldatból az oldószert forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk, és a nyers terméket oszlopkromatográfiával megtisztítjuk (kifejlesztőelegy: aceton/metilén-diklorid (1:40). Fehér, szilárd anyagot kapunk.

Ή-NMR-spektrum (CDC1₃): δ 10,1 (2H, s), 7,3 (2H, s), 4,2 (2H, s), 3,8 (3H, s), 3,2 (3H, s).

2. A k jelű 2,6-dikarbonil-piridin-vegyületek előállítása

a) A g jelű vegyület előállítása

2.6- Di(metoxi-karbonil)-4-[(terc-butoxi-karbonil)metilj-oxi-piridin (g)

580 mg (5,17 mmol) kálium-terc-butilát és 20 ml dimetil-szulfoxid elegyéhez egy 100 ml-es (szulfiiráló) lombikban argongáz-atmoszférában részletekben hozzáadunk 1 g (4,7 mmol) dimetil-chelidamátot [4-hidroxi2,6-di(metoxi-karbonil)-piridin], ekkor enyhén exoterm reakció lép fel. 10 perc eltelte után 2 ml dimetil-szulfoxidban feloldott 1,04 ml (7,05 mmol) (terc-butil)bróm-acetátot adunk az oldathoz lassú csepegtetés közben, és az elegyet 3 órán keresztül keveijük. A reakcióelegyet ezután jeges vízzel elegyítjük és háromszor extraháljuk 20-20 ml dietil-éterrel. Az egyesített dietiléteres fázist egyszer 30 ml vízzel mossuk és nátriumszulfáton megszárítjuk. Az oldószert forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk, és a terméket erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk. Fehéres-sárgás kristályokat nyerünk, amelyeket szilikagéloszlopon tisztítunk (70 g szilikagél 60 F, Merck 9385; kifej lesztőelegy: metanol/metilén-diklorid 1:100). Fehér kristályokat kapunk.

Ή-NMR-spektrum (CDC1₃): δ 7,8 (2H, s), 4,7 (2H, s), 4,0 (6H, s), 1,5 (9H, s).

b) Ah jelű vegyület előállítása

2.6- Di(acetoxi-metil)-4-[(terc-butoxi-karbonil)metilj-oxi-piridin (h)

A fentebb előállított g jelű vegyületből 1,17 g-ot (3,6 mmol) feloldunk 65 ml dimetoxi-etánban, és az oldatot lehűtjük 0 °C-ra, azután kis részletekben hozzáadunk 680 mg (18 mmol) nátrium-[tetrahidrido-borát(III)]-t. A reakcióelegyet 15 percig 0 °C-on keverjük, azután engedjük felmelegedni szobahőmérsékletre. 3 óra eltelte után a reakcióelegyet ismét lehűtjük 0 °Cra, hozzáadunk 12 ml acetont és 15 percig keverjük. Ezután az elegyet szobahőmérsékletre femelegítjük és leszűrjük. A szűrletből az oldószert forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk, és a terméket erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk. Az első reakcióból származó nyersterméket feloldjuk 55 ml piridinben, lehűtjük 0 °C-ra, majd hozzáadunk 6,8 ml (72 mmol) ecetsavanhidridet és 44 mg 4-(dimetil-amino)-piridint. Ezután a reakcióelegyet engedjük felmelegedni szobahőmérsék10

HU 217 774 Β letre, vízzel hígítjuk és dietil-éterrel háromszor extraháljuk. A szerves fázist nátrium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk. A terméket erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk. A termék barna olajként marad vissza, amelyet oszlopkromatográfiával tisztítunk (100 g szilikagél; kifejlesztőelegy: 1% metanolt tartalmazó metiléndiklorid). Ekkor tiszta terméket kapunk.

Ή-NMR-spektrum (CDC1J: δ 6,8 (2H, s), 5,2 (4H, s),

4,6 (2H, s).

c) Az i jelű vegyület előállítása

2,6-Di(hidroxi-metil)-4-[(terc-butoxi-karbonil)metil]-oxi-piridin (i)

A fentebb előállított h jelű vegyületből 170 mg-ot (0,48 mmol) feloldunk 6,5 ml metanolban, és az oldatot lehűtjük 0 °C-ra. Ezután hozzáadunk 1,7 ml 32%-os ammóniaoldatot, és az elegyet másfél órán keresztül keverjük. A reakcióelegyet, az oldószert és az illő anyagokat forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk, és a maradékot erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk. Sárga színű gélt kapunk, amelyet oszlopkromatográfiával megtisztítunk (20 g szilikagél 60 F, Merck 9385; kifejlesztőelegy: metanol/metilén-diklorid 1:15). A tiszta végtermék fehér, szilárd anyag.

Ή-NMR-spektrum (CD₃OD): δ 7,0 (2H, s), 4,8 (2H, s),4,5(4H, s), 1,5 (9H, s).

d) A j jelű vegyület előállítása

4-[ (Terc-butoxi-karbonil)-metil]-oxi-piridin-2,6dikarbaldehid (j)

Egy 25 ml-es csúcsos lombikba beadunk 260 μΐ (3,0 mmol) oxalil-kloridot és 6 ml metilén-dikloridot, azután argongáz-atmoszférában lehűtjük az oldatot -78 °C-ra. Hozzáadunk 370 pl (5,25 mmol) dimetilszulfoxidot, és a reakcióelegyet -78 °C-on keverjük 15 percen keresztül. Ekkor hozzáadjuk a fentebb előállított i jelű vegyület 200 mg (0,75 mmol) mennyiségének 2 ml metilén-diklorid és 200 pl dimetil-szulfoxid elegyével készített oldatát, közben a hőmérsékletet állandóan ellenőrizzük. A reakcióelegyet 2 órán keresztül keveijük -78 °C-on, majd 2 ml metilén-dikloridban oldott 1,04 ml (2,5 mmol) trietil-aminnal a reakciót leállítjuk. Az elegyet még 15 percig keveijük 0 °C-on, azután az illő anyagokat forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk, és a maradékot erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk. Barna kristályokat kapunk, amelyeket 60 F típusú szilikagélen átszűrünk (oldószer: hexán/etil-acetát 2:1).

Ή-NMR-spektrum (CDC1₃): δ 10,1 (2H, s), 7,6 (2H, s),4,7(2H), 1,5 (9H, s).

e) A k jelű vegyület előállítása 4-(Karboxi-metil)-oxi-piridin-2,6-dikarbaldehid (k) 65 mg fentebb előállított j jelű vegyületet 14 ml

M vizes sósavoldattal keverünk szobahőmérsékleten másfél órán keresztül. Ezután a reakcióelegyből forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk az illékony anyagokat, és a maradékot erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk. A nyersterméket enyhén sárgás kristályok formájában kapjuk meg.

Ή-NMR-spektrum (CD₃OD): δ 7,4 (2H, s),

5,1 (2H, s).

3. A terpiridin-bisz-hidrazino-vegyület (o) előállítása

a) Az m jelű vegyület előállítása

4-(3-Hidroxi-propil)-oxi-benzaldehid (m)

11,49 g (205 mmol) kálium-hidroxidot elporítunk és összekeverjük 20 g (164 mmol) 4-hidroxi-benzaldehiddel és 1,66 g (4,09 mmol) Aliquat 336 reagenssel (trikapril-metil-ammónium-klorid). A keveréket félanker keverővei keverve jeges fürdővel lehűtjük és óvatosan hozzácsepegtetünk 14,24 ml (164 mmol) 3-brómpropanolt. A reakcióelegyet felmelegítjük 100 °C-ra, és a kapott sötétbarna szuszpenziót éjjelen át ezen a hőmérsékleten keverjük argongáz-atmoszférában. Azt követően a reakcióelegyhez 250 ml metilén-dikloridot adunk, és a keverést folytatjuk. A szuszpenziót Hyflorétegen át leszűrjük, a szűrletből az oldószert ledesztilláljuk, és a maradékot erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk. A nyersterméket két részletben tisztítjuk flash-oszlopkromatográfiával (kifejlesztő oldószerelegy: 2% tetrahidrofuránt tartalmazó metilén-diklorid), ekkor megkapjuk a végterméket.

Ή-NMR-spektrum (CDC1J : δ 9,9 (1H, s), 7,8 (2H, d), 7,0 (2H, d), 4,2 (2H, t), 3,9 (2H, m), 2,1 (2H, m), 1,9 (1H, s).

b) Az n jelű vegyület előállítása

4-[4-(3-Hidroxi-propoxi)-fenil]-2,6-di(6-bróm-2-piridil)-piridin (n) g (0,072 mmol) a fentiek szerint előállított m jelű vegyületet, 28,86 g (0,144 mmol) 2-acetil-6-brómpiridint, 63,72 g (1,08 mmol) acetamidot és 41,58 g (0,54 mmol) ammónium-acetátot helyezünk egy lombikba, és az elegyet 2 órán keresztül 180 °C-on keverjük. A barna szuszpenziót engedjük lehűlni 120 °C-ra és hozzácsepegtetjük 140 g szemcsés nátrium-hidroxid 300 ml vízzel készített oldatát. A reakcióelegyet 2 órán keresztül forraljuk, ekkor sötétbarna, gumiszerű anyagot kapunk. Az oldószereket dekantálással eltávolítjuk, és a gumiszerű anyagot egyszer átmossuk vízzel. A fekete, gumiszerű terméket az éppen szükséges mennyiségű etil-acetátban feloldjuk, a forró oldathoz ekvivalens mennyiségű vizes hidrogén-bromid-oldatot (48%-os) adunk és éjjelen át állni hagyjuk. A világossárga kristályokat szívatással szűrjük, vízzel elkeverjük és 4 M vizes kálium-hidroxid-oldattal a pH-t 7-8 értékek közé beállítjuk. A kapott sárga szuszpenziót metilén-dikloriddal háromszor extraháljuk. A szerves fázist vattán átszűrjük, az oldószert forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk, és a maradékot erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk. A nyersterméket etanolból átkristályosítva sárga, kristályos anyagot kapunk.

Tömegspektrum:

számított csúcs: 543 m/z (M+H+), talált csúcs: 542 m/z (M+H+).

c) Az o jelű vegyület előállítása

4-[4-(3-Hidroxi-propoxi)-fenil]-2,6-di[6-(metil-hidrazino)-2-piridil]-piridin (o)

6,38 g fentebb előállított n jelű vegyületet 88 ml metil-hidrazinnal elegyítünk, felmelegítjük 85 °C-ra és azon a hőmérsékleten 2 órán keresztül keverjük. Lehűlés után 150 ml metanolt adunk hozzá, ekkor a termék

HU 217 774 Β kiválik az oldatból. A szuszpenziót leszűrjük, és a kapott kristályokat megszárítjuk.

Ή-NMR-spektrum (DMSO): 8,5 (2H, s), 7,8 (4H, m),

7,7 (2H, t), 7,2 (2H, d), 7,1 (2H, d), 4,6 (2H, t), 4,1 (2H, t), 3,5 (2H, m), 3,3 (6H, s), 1,9 (2H, m).

4. A terpiridin-bisz-hidrazino-vegyület (q) előállítása aj A p jelű vegyület előállítása

4-(9-Antracenil)-2,6-di(6-bróm-2-piridil)-piridin (p)

2,6 g (12,5 mmol) antracén-9-karbaldehidet, 5 g (25 mmol) 2-acetil-6-bróm-piridint, 11,2 g (187,5 mmol) acetamidot és 7,1 g (93,7 mmol) ammónium-acetátot egy lombikban összekeverünk, és a keletkezett barna oldatot 2 órán keresztül forraljuk visszafolyató hűtő alatt (a fürdő hőmérséklete 180 °C). Miután az elegy hőmérséklete 110 °C-ra csökkent, hozzácsepegtetjük 33 g (0,83 mól) szemcsés nátrium-hidroxid 71 ml vízzel készített oldatát. A reakcióelegyet további 2 órán keresztül forraljuk visszafolyató hűtő alatt, majd lehűtjük 90 °C-ra. A folyadékot dekantáljuk, a visszamaradó szilárd anyagot vízzel kétszer mossuk, és a fekete masszát feloldjuk 25 ml ecetsavban. Hozzáadunk 1,75 ml 48%-os vizes hidrogén-bromid-oldatot, és az elegyet 5 napon át állni hagyjuk. A szuszpenziót leszűrjük, és a kapott zöld színű csapadékot dietil-éterrel mossuk. A kristályokat elszuszpendáljuk vízben, és az elegy pH-értékét 2 M vizes kálium-hidroxid-oldattal 8-ra beállítjuk, azután metiléndikloriddal extraháljuk. A szerves fázist nátrium-szulfáton megszárítjuk, az oldószert forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk, és a maradékot csökkentett nyomáson megszárítjuk. A kapott zöld anyagtömeget 400 ml etanolból átkristályosítjuk. A kapott kristályokat felvesszük etanol/metilén-diklorid elegyben és azt ammónium-karbonát-oldattal kétszer extraháljuk. A szerves fázist nátrium-szulfáton megszárítjuk, az oldószert forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk, és a maradékot csökkentett nyomáson megszárítjuk. A nyersterméket oszlopkromatográfiával tisztítjuk (kifej lesztőelegy: hexán/etilacetát 9:1). Zöldesbama, kristályos anyagot kapunk. Tömegspektrum:

számított csúcs: 568 m/z (M+H+), talált csúcs: 569 m/z (M + H⁺).

b) A q jelű vegyület előállítása

4-(9-Antracenil)-2,6-di[6-(metil-hidrazino)-2-piridilj-piridin (q)

1,43 g (2,5 mmol) fentebb előállított p jelű vegyületet 50 ml metil-hidrazinnal visszafolyató hűtő alatt forralunk éjjelen át, ekkor sötétbarna oldat keletkezik. Az oldószert rotációs bepárlókészülékben ledesztilláljuk, a visszamaradt terméket forró metanolban elszuszpendáljuk, majd leszűrjük. 400 mg zöld színű, kristályos anyagot kapunk, amelyet acetonitrilből átkristályosítunk. Először élesre szűrjük az oldatot, azután lehűtjük, végül a csapadékot kiszűrjük. A zöld színű kristályokat erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk, majd acetonitrilből ismét átkristályosítjuk. Ugyancsak zöld színű, kristályos anyagot kapunk. Az anyalúgból az oldószer egy részének ledesztillálása után 1 g barna színű, kristályos anyag válik ki, amelyet szintén acetonitrilből átkristályosítunk és erősen csökkentett nyomáson megszárítunk. A kapott termék világosbarna, kristályos anyag.

Elemi analízis:

számított: C: 74,83%, H: 5,47%, N: 19,70; talált: C: 74,76%, H: 5,55%, N: 19,42%.

5. Az r jelű 2,6-dikarbonil-vegyület előállítása

4-Bróm-2,6-piridm-dikarbaldehid (r)

Argongáz-atmoszférában 2 ml metilén-dikloridhoz hozzáadunk 118 pl (1,38 mmol) oxalil-kloridot, és az oldatot lehűtjük -78 °C-ra. Ezután óvatosan hozzácsepegtetünk 195 pl (2,75 mmol) dimetil-szulfoxidot, és a reakcióelegyet 15 percen keresztül keverjük -78 °C-on. Ezt követően 100 mg (0,458 mmol) 4-bróm-2,6-di(hidroximetil)-piridint adunk hozzá 100 pl dimetil-szulfoxiddal készített oldat formájában és még 1 ml metilén-dikloridot is hozzáadunk. Az elegyet -78 °C-on keverjük 1 órán keresztül, azután 381 pl (2,75 mmol) trietil-amint adunk hozzá, és a keverést 0 °C-on folytatjuk még 15 percen keresztül. Az oldószert ledesztilláljuk, és a maradékot feloldjuk metilén-diklorid és víz elegyében. Mindkét fázist extraháljuk, a vizes fázist metilén-dikloriddal kétszer mossuk. Az egyesített szerves fázisokat vattán átszűrjük, az oldószert ledesztilláljuk, és a maradékot erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk. Világosbarna, kristályos anyagot kapunk.

Ή-NMR-spektrum (CDC1₃): δ 10,1 (2H, s), 8,7 (2H, s).

6. Az s jelű terpiridin-bisz-hidrazino-vegyület előállítása

2,6-Di[(6-butil-hidrazino)-2-piridil]-4-feml-piridin (s)

Ί2 mg (0,16 mmol) az A1 .b) példa szerint előállított b5. jelű vegyületet 480 mg (5,44 mmol) butil-hidrazinnal argongáz-atmoszférában 110 °C-ra felmelegítjük, és a szuszpenziót éjjelen át forraljuk. A reakcióelegyet szobahőmérsékletre engedjük lehűlni és dietiléterrel és metanollal történő hígítás után a kivált kristályos anyagot kiszűrjük. A szűrletből az oldószer egy részét forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk, a koncentrátumhoz metanolt adva a terméket kicsapjuk. A kristályos anyagot a lehűtött oldatból kiszűrjük és kevés metanollal mossuk. Csökkentett nyomáson megszárítjuk a terméket, amely bézs színű, kristályos anyag. Tömegspektrum:

számított csúcs: 482 m/z (M + H⁺), talált csúcs: 481 m/z (M+H+).

B. Terpirídin-lantanida komplexek előállítása Bl. példa

1. Az Al.c) példa szerint előállított 1 mmol megfelelő terpiridin-bisz-hidrazino-vegyületet argongáz-atmoszférában feloldjuk 60 ml vízmentes metanolban, hozzáadunk 1 mmol lantán(III)-acetátot, és az elegyet 10 percig forraljuk visszafolyató hűtő alatt. Ehhez az oldathoz egymást követően 1,2 mmol megfelelő 2,6-dikarbonilvegyületet és 5 mmol vizes sósavoldatot adunk, majd az elegyet 2 napon keresztül forraljuk. Az elegy szobahőmérsékletre történt lehűtése után a terméket kiszűrjük és erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk.

Ugyanezzel az eljárással állítjuk elő az 1. táblázat 1.1-tői 1.28-ig terjedő vegyületeit is.

2. Az Al.c) példa szerint előállított megfelelő terpiridinbisz-hidrazino-vegyületből 1 mmol mennyiségűt feloldunk 60 ml vízmentes metanolban, hozzáadunk 1 mmol

HU 217 774 Β lantán(III)-kloridot és visszafolyató hűtő alatt 10 percig forraljuk. Ehhez az oldathoz egymást követően 1,2 mmol A2.a) példa szerint előállított vegyületet adunk, és éjjelen át forraljuk a reakcióelegyet. Szobahőmérsékletre történt lehűlés után az oldószert ledesztilláljuk, és a terméket dimetil-szulfoxidból és toluolból átkristályosítjuk.

Ugyanezzel az eljárással állítjuk elő az 1. táblázat 1.29-től 1.32-ig terjedő vegyületeit is. Az 1. táblázat 1.33-tól 1.44-ig terjedő vegyületeit analóg módon állítjuk elő.

3. További R-szubsztituenseket tartalmazó terpiridin-lantanida komplexek előállítása

a) Az 1.45 jelű vegyület előállítása

Az Al.c) eljárás szerint előállított c5. vegyületből 168 mg-ot (0,423 mmol) feloldunk 20 ml vízmentes metanolban, és az elegyet forrásig melegítjük. Hozzáadunk 155 mg (0,423 mmol) európium(III)-klorid-víz (1:6)-ot, és a kapott sárga szuszpenziót 15 percen keresztül keverjük. Miután 100 mg (0,423 mmol) Al.c) példa szerint előállított f jelű vegyület 15 ml metanollal készített oldatát hozzáadtuk, a kapott szuszpenziót éjjelen át forraljuk argongáz-atmoszférában visszafolyató hűtő alatt. A szobahőmérsékletre hűlt reakcióelegyet leszűrjük, és a kapott sárga oldatból az oldószer % részét ledesztilláljuk. A maradék oldatból dietil-éter segítségével narancsszínű, kristályos anyagot kapunk, amelyet (egy) Millipore-szűrőn leszűrünk. A szilárd anyagot erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk. Narancssárga, kristályos terméket kapunk.

Tömegspektrum:

számított csúcs: 821 m/z (M-CU), talált csúcs: 821 m/z (M-Cl ).

Analóg módon állítjuk elő az 1. táblázat 1.46-tól

1.5 8-ig terjedő vegyületeit is.

b) Az 1.59 jelű vegyület előállítása mg (0,0116 mmol) fentebb előállított 1.45 jelű vegyületet 5 ml vízzel visszafolyató hűtő alatt forralunk, ekkor sárga oldat keletkezik. Három nap eltelte után a reakcióelegyet Acradisken keresztül leszűijük, az oldószert ledesztilláljuk, és a maradékot erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk. Sárga színű, szilárd anyagot kapunk.

4. További R₅-szubsztituenseket tartalmazó terpiridin-lantartida komplexek előállítása

a) Az 1.60 jelű vegyület előállítása

Az Al.c) példa szerint előállított c5. jelű vegyületből 48 mg-ot (0,12 mmol) feloldunk argongáz-atmoszférában 7,5 ml metanolban, és az oldatot visszafolyató hűtő alatt forraljuk. Hozzáadunk 44 mg (0,12 mmol) európium(III)-klorid-víz (1:6)-ot, és az elegyet 15 percen keresztül visszafolyató hűtő alatt forraljuk. Ezután az A3.2.e) példa szerint előállított k jelű vegyületet 2,5 ml metanolban oldva hozzáadjuk, és az oldatot 45 percen át forraljuk. A lehűlt szuszpenziót leszűrjük, és a kapott tiszta, sárga színű oldatból az oldószert forgó bepárlókészülékben ledesztilláljuk úgy, hogy az elegy végső térfogata 2 ml legyen. Ehhez dietil-étert adva kicsapjuk a terméket, amelyet a szűrőn egyszer dietil-éter/metanol (1:1) arányú eleggyel, kétszer pedig dietil-éterrel mosunk, végül erősen csökkentett nyomáson megszárítunk. Sárga színű, kristályos anyagot kapunk.

Tömegspektrum:

számított csúcs: 807 m/z (M-C1~), talált csúcs: 809 m/z (M-C1-).

b) Az 1.61 jelű vegyület előállítása

A vegyületet az 1.60 jelű vegyületből állítjuk elő analóg módon, ahogyan az 1.59 jelű vegyületet előállítottuk az 1.45 jelű vegyületből.

Tömegspektrum:

számított csúcs: 1056 m/z M-3C1^- + 2(C₈H₇O₄)-, talált csúcs: 1055 m/z M-3C1- + 2(C₈H₇O₄)-.

5. Terpiridin-lantanida komplexek előállítása egyéb R i-szubsztituensekkel

a) Az 1.62 jelű vegyület előállítása

136 mg (5,94 mmol) az A3.3.c) példában előállított o jelű vegyületet feloldunk 400 ml vízmentes metanolban, és argongáz-atmoszférában visszafolyató hűtő alatt forraljuk. Ezután hozzáadunk 1,53 g (5,94 mmol) európium(III)-klorid-víz (1:6)-ot, és a reakcióelegyet fél órán keresztül forraljuk visszafolyató hűtő alatt. Azután hozzáadjuk 1 g (5,94 mmol) 2,6-diacetil-piridin 100 ml vízmentes metanollal készített oldatát, és a keletkezett tiszta sárga oldathoz hozzáadunk 2 csepp tömény vizes sósavoldatot. Végül a reakcióelegyet 8 napon keresztül visszafolyató hűtő alatt forraljuk. Miután az elegy lehűlt szobahőmérsékletre, a kapott szuszpenziót egy Hydrofiltren keresztül leszűijük, A kapott tiszta, sárga színű oldatból az oldószer túlnyomó részét ledesztilláljuk, és a maradék oldatból a terméket dietiléterrel kicsapjuk. A csapadékot egyszer mossuk dietiléter/metanol (1:1) arányú elegygyel és kétszer dietiléterrel, azután erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk. Narancsszínű, szilárd anyagot kapunk. Tömegspektrum:

számított csúcs: 822 m/z (M-Cl^-), talált csúcs: 822 m/z (M-CU).

6. Terpiridin-lantanida komplexek előállítása egyéb R ₃-szubsztituensekkel

a) Az 1.63 jelű vegyület előállítása mg (0,234 mmol), az Al.c) példa szerint előállított c2. jelű vegyületet feloldunk 20 ml vízmentes metanolban és argongáz-atmoszférában visszafolyató hűtő alatt forraljuk. Ezután 60 mg (0,234 mmol) európium(III)klorid-víz (1:6)-ot adunk hozzá, és a reakcióelegyet még fél órán keresztül forraljuk visszafolyató hűtő alatt. Azután 50 mg (0,234 mmol), az A3.5. példa szerint előállított r jelű vegyületet adunk hozzá, amelyet előzőleg 15 ml vízmentes metanolban oldottunk fel, majd a kapott tiszta, sárga színű oldathoz hozzáadunk két csepp tömény vizes sósavoldatot. A reakcióelegyet éjjelen át viszszafolyató hűtő alatt forraljuk, majd miután lehűlt szobahőmérsékletre, Hydrofilteren keresztül leszűrjük a sötétvörös oldatot. A kapott tiszta, vörös színű oldatból az oldószer túlnyomó részét ledesztilláljuk, és a maradék oldatból a terméket dietil-éterrel kicsapjuk. A csapadékot egyszer mossuk dietil-éter/metanol (1:1) arányú eleggyel és kétszer mossuk dietil-éterrel, végül erősen csökkentett nyomáson megszárítjuk. Sötétvörös, szilárd anyagot kapunk. Tömegspektrum:

számított csúcs: 813 m/z (M-Cl), talált csúcs: 812 m/z (M-Cl ).

HU 217 774 Β

7. További Rilletve R₅-szubsztituenseket tartalmazó terpiridin-lantanida komplexek előállítása

a) Az 1.64-től 1.74-ig terjedő vegyületek előállítása A fentebb ismertetett reakciókkal analóg módon, például az 1.62 és 1.63 jelű vegyületek előállításához hasonlóan állítjuk elő az 1. táblázatban felsorolt 1.64től 1.74-ig terjedő számú vegyületeket a megfelelően szubsztituált 2,6-dikarbonil-piridin-vegyületekből és a megfelelően szubsztituált terpiridin-bisz-hidrazino-ve5 gyületekből.

1. táblázat

Az A általános képletű vegyületek adatai

A vegyület száma	Ln3+	Rí	r4	r5	Molekulatömeg (M-Cl-) számított-'talált
1.1	La	Ph	H	H	706/705
1.2	La	Ph-4-ΟΗ	H	H	722,4/722,3
1.3	La	Ph-4-OCH3	H	H	736,4/735,6
1.4	La	Ph-4-NH2	H	H
1.5	La	Ph	ch3	H	734,4/734,4
1.6	La	Ph-4-ΟΗ	CHj	H	750,4/750,9
1.7	La	Ph-4-OCH3	ch3	H	764,5/765,0
1.8	La	Ph-4-NHj	ch3	H	749,5/749,5
1.9	Eu	Ph	H	H	719,4/718,9
1.10	Eu	Ph-4-ΟΗ	H	H	735,4/735,8
1.11	Eu	Ph4-OCH3	H	H	749,5/749,3
1.12	Eu	Ph-4-ΝΗ,	H	H	734,5/734,5
1.13	Eu	Ph	ch3	H	747,5/747
1.14	Eu	Ph4-OH	ch3	H	763,5/763,7
1.15	Eu	Ph-4-OCH3	ch3	H	777,5/777,3
1.16	Eu	Ph-4-NH2	ch3	H	762,5/762,5
1.17	Ce	Ph-4-NH2	ch3	H	750,7/749,3
1.18	Pr	Ph4-NH2	ch3	H	751,4/750,9
1.19	Nd	Ph-4-NH2	ch3	H	754,8/752,7
1.20	Gd	Ph-4-NH2	ch3	H	767,8/766,3
1.21	Tb	Ph-4-NH2	ch3	H	769,5/768,7
1.22	Dy	Ph-4-NH2	ch3	H	773,1/773,2
1.23	Ho	Ph4-NH,	ch3	H	775,5/774,4
1.24	Er	Ph-4-NH2	ch3	H	777,8/776,8
1.25	Tm	Ph-4-NH2	CHj	H	779,5/778,8
1.26	Yb	Ph-4-NH2	CHj	H	783,6/783,0
1.27	Lu	Ph-4-NH2	CHj	H	785,5/784,7
1.28	Y	Ph-4-NH2	ch3	H	699,4/698,1
1.29	La	H	H	CH2CH2COOH
1.30	Eu	H	H	ch2ch2cooh
1.31	La	Ph	H	ch2ch2cooh*
1.32	Eu	Ph	H	ch2ch2cooh**
1.33	Ce	Ph	H	ch2ch2cooh	911/912
1.34	Pr	Ph	H	ch2ch2cooh	782/781
1.35	Nd	Ph	H	ch2ch2cooh	915/915
1.36	Gd	Ph	H	ch2ch2cooh	1060/1059
1.37	Tb	Ph	H	ch,ch2cooh	1062/1062

HU 217 774 Β

1. táblázat (folytatás)

A vegyület száma	Ln3+	Ki	r4	r5	Molekulatömeg ( M CI ) számított/talált
1.38	Dy	Ph	H	ch2ch,cooh	1066/1065
1.39	Ho	Ph	H	ch2ch2cooh	1068/1068
1.40	Er	Ph	H	ch2ch2cooh	1070/1070
1.41	Tm	Ph	H	ch2ch2cooh	905/903
1.42	Yb	Ph	H	ch2ch2cooh	1076/1076
1.43	Lu	Ph	H	CH2CH2COOH	911/908
1.44	Y	Ph	H	ch2ch2cooh	922/922
1.46	Ce	Ph	H	N(CH3)CH2C(O)OCH3	1071/1071
1.47	Pr	Ph	H	N(CH3)CH2C(O)OCH3	1072/1071
1.48	Nd	Ph	H	N(CH3)CH2C(O)OCH3	1075/1073
1.49	Gd	Ph	H	N(CH3)CH2C(O)OCH3	1089/1091
1.50	Tb	Ph	H	N(CH3)CH2C(O)OCH3	1091/1092
1.51	Dy	Ph	H	N(CH3)CH2C(O)OCH3	1094/1094
1.52	Ho	Ph	H	N(CH3)CH2C(O)OCH3	1097/1097
1.53	Er	Ph	H	N(CH3)CH2C(O)OCH3	1099/1099
1.54	Tm	Ph	H	N(CH3)CH2C(O)OCH3	1101/1102
1.55	Yb	Ph	H	N(CH3)CH2C(O)OCH3	1104/1102
1.56	Lu	Ph	H	N(CH3)CH2C(O)OCH3	1107/1104
1.57	Y	Ph	H	N(CH3)CH2C(O)OCH3	1020/1020
1.58	La	Ph	H	N(CH3)CH2C(O)OCH3	1071/1070
1.64	Eu	Ph4-NH2	Bu	H	888/888
1.65	Eu	Ph-4-NH2	Ph	H	847/849
1.66	Eu	Ph-4-NH2	Ph-4-OCHj	H	947/948
1.67	Eu	Ph-4-NCS	Bu	H	889/892
1.68	Eu	Ph-4-NCS	Ph	H
1.69	Eu	Ph-4-NCS	Ph-4-OCHj	H	1085/1086***
1.70	Eu	9-antracenil	H	CH2CH2C(O)OCH3	906/908
1.71	Eu	Ph-2-ΝΗ,	CH,	H	763/762
1.72	Eu	Ph-2-NHj	CH,	H	805/804
1.73	Eu	Ph-3-NH2	CH3	H	Ί2ΊΠ29
1.74	Eu	Ph-3-NH2	CH3	H	805/804

Ph: fenil(cn), Bu: butil * számított (+2DMS0): C: 45,81, H: 4,16, N: 11,55, Cl: 10,96;

talált: C: 45,3, H: 4,3, N: 11,8, Cl: 10,6.

*♦ számított (+2DMSO+4H₂O): C: 42,11, H: 4,58, N: 10,62, Cl: 10 talált: C: 42,2, H: 4,6, N: 10,6, Cl: 9,í *** Ellenion: THA^- (C₈H₇O)

B2. példa: Izotiocianátszármazékok előállítása

4,4 mmol nátrium-hidrogén-karbonát és 3,5 ml tiofoszfén 4 ml kloroformmal készített szuszpenziójához hozzáadjuk az 1. táblázat megfelelő komplexének oldatát, és az elegyet erőteljesen keveijük szobahőmérsékleten 2,5 órán keresztül. A kloroformos fázist elválasztjuk és egyszer vízzel mossuk. Az összes vizes fázist egyesítjük, és a vizet ledesztilláljuk. Az így kapott termékeket (a 2. táblázat 2.1-től 2.15-ig terjedő számú vegyületeket) további tisztítás nélkül felhasználtuk. Hasonló módon állítottuk elő a megfelelő izotiocianátvegyületeket az 1. táblázat primer aminocsoportot tartalmazó vegyületeiből is.

HU 217 774 Β

2. táblázat

A vegyület száma	Ln3+	Rí	R4	r5	Molekulatömeg (M-C1-) számított/talált
2.1	Ce	Ph-NCS	CH3	H	792,7/792,7
2.2	Pr	Ph-NCS	ch3	H	793,5/791,2
2.3	Gd	Ph-NCS	ch3	H	809,9/807,4
2.4	Tb	Ph-NCS	ch3	H	811,5/811,7
2.5	Dy	Ph-NCS	ch3	H	815,1/815,9
2.6	Ho	Ph-NCS	ch3	H	817,5/816,2
2.7	Er	Ph-NCS	ch3	H	819,9/819,0
2.8	Tm	Ph-NCS	ch3	H	821,5/820,1
2.9	Yb	Ph-NCS	ch3	H	825,6/826,4
2.10	Lu	Ph-NCS	ch3	H	827,6/825,5
2.11	Y	Ph-NCS	ch3	H	741,5/740,2
2.12	La	Ph-NCS	ch3	H	791,5/792,1
2.13	Eu	Ph-NCS	ch3	H	804,6/804,7
2.14	La	Ph-NCS	H	H
2.15	Eu	Ph-NCS	H	H

C. példa: Amino-oligonukleotidok előállítása

Egy Standard Applied Biosystem-reakcióedénybe bemérünk mintegy 30 mg „ellenőrzött pórusú üveg” (‘controlled poré glass’, CPG) szilárd fázist, amely

1,5 μπιοί szintéziséhez elegendő. A CPG szilárd fázis (1) hordozza a szintetizálandó amino-oligonukleotid védett 3’-építőkövét. Az oligomerizációhoz a 6, 7, 8 és 9 képletű foszforamiditvegyületeket használjuk fel. A fémkomplexek későbbi, az aminocsoporton keresztül történő kapcsolásához külön foszoramiditvegyületeket használunk fel, melyek a következők: 10, 11, 12, 13, 14, 15 és 16. Az utóbbi három származék a B általános képlettel jellemezhető, amelyben az R jelentése és az n értéke a következő:

14: n=3, R=PN(izopropil)₂OCH₂CH₂CN

15: n=4, R=PN(izopropil)₂OCH₂CH₂CN

16: n=5, R=PN(izopropil)₂OCH₂CH₂CN

Előállítási példa a 14, 15 és 16 számú foszfoamiditvegyületek előállítására

A 14a (n = 3, R = H) kiindulási vegyület előállítása 4,0 g 3-amino-l-propanolt, 3,28 g 4-metoxi-trifenil-klór-metánt és 35 ml piridint teszünk egy kiszárított lombikba, és az elegyet argongáz-atmoszférában keverjük 4,5 órán keresztül szobahőmérsékleten. Az oldószert ledesztilláljuk, a maradékot egyszer toluollal, kétszer pedig acetonitrillel elegyítjük, és mindhárom esetben ledesztilláljuk az alkalmazott oldószert. A maradékot feloldjuk metilén-dikloridban, és az oldatot telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal kétszer mossuk. A vizes fázist metilén-dikloriddal háromszor extraháljuk. A szerves fázisokat egyesítjük, nátrium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert ledesztilláljuk. A nyersterméket szilikagélen flash-kromatográfiával tisztítjuk. (Kifejlesztőelegy: etil-acetát/hexán 1:2.) A termék sárga olaj.

Ή-NMR-spektrum (CDC1₃): δ 3,65 (OCtf₅).

A 15a (n=4, R=H) és a 16a (n=5, R=H) kiindulási vegyületeket analóg módon állítjuk elő 4-amino-1butanolból, illetve 5-amino-l-pentanolból. Ή-NMR-spektrum (CDC1₃): δ 3,65 (OCT/₃) (15a) és 3,65 (OCtfj)(16a).

A 14 foszforamidit előállítása

1,99 g Ν,Ν-diizopropil-ammónium-tetrazolidot és

3,5 g 2-(ciano-etil)-N,N,N’,N’-tetraizopropil-foszfordiamiditot adunk 150 ml metilén-dikloridhoz argongázatmoszférában, majd 20 perc alatt hozzácsepegtetjük a fentebb előállított 14a jelű vegyület 120 ml metiléndikloriddal készített oldatát. A finom sárga szuszpenziót 4,5 órán keresztül keverjük, azután 250 ml metiléndikloriddal hígítjuk és kétszer kimossuk telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal. A vizes fázist metilén-dikloriddal háromszor extraháljuk, a szerves fázisokat egyesítjük, nátrium-szulfáton megszárítjuk, és az oldószert ledesztilláljuk. A nyersterméket szilikagélen flash-kromatográfiával tisztítjuk. (Kifejlesztőelegy: etil-acetát/hexán 1:4 + 0,5% N-metil-morfolin.) Sárga olajat kapunk.

^3,P-NMR-spektrum (CDC1₃): δ 146,9.

A 15 és 16 jelű foszforamiditvegyületeket analóg módon állítjuk elő a fentebb előállított 15a és 16a vegyületekből.

^3lP-NMR-spektrum (CDC1₃): δ 146,9 (15); δ 147,0 (16).

A szintézisciklusokat az Applied Biosystem 394 típusú szintetizálóautomatájával hajtjuk végre változtatásokkal (a dezoxisorozat 6, 7, 8 és 9 foszforamiditjeinek kapcsolási ideje 2 perc, a 10 és 11 amiditek esetében a kapcsolási idő 10 perc, a 12 vegyület esetében 5 perc és a 13 vegyületnél 40 perc, és a 13 vegyületet százszoros feleslegben vittük be a reakcióba) az Applied Biosystem cég standard protokoll] ához képest [Felhasználói

HU 217 774 Β kézikönyv, 2.0 verzió (1992), 1,0 μπιοί ciklus, Appen. 1-41], A kapott oligonukleotidokból a védőcsoportokat a fémkomplexekkel történő konjugáció előtt standard körülmények között eltávolítjuk.

A következő, kereskedelmi forgalomban beszerezhető reagenseket alkalmaztuk:

0,1 M foszforamidit Tetrazol/acetonitril (4:96) Terc-butil-fenoxi-ecetsavanhidrid/piridin/tetrahidrofurán (10:10:80) N-metil-imidazol/tetrahidrofurán (16:84) Triklór-ecetsav/metilén-diklorid (2:98)

Jód/víz/piridin/tetrahidrofurán (3:2:20:75)

A következő amino-oligonukleotidokat szintetizáljuk:

(821) 5’-GAC TGG CGA GAT* CGG CAG TCG

GCT AG-3’, ahol a T* jelenti a C képletű molekularészt, és T jelentése timin (823) 5’-GAC TGG CGA GAT* CGG CAG TCG GCT AG-3 ’, ahol a T* jelenti a D képletű molekularészt, és T jelentése timin (940) 5’-GAC TGG CGA GAT CGG CAG T*CG GCT AG-3’, ahol a T* jelenti az E képletű molekularészt (691) 3’-GA TCG GCT GAC GGC TAG AGC-0 O (1759) 5’-H₂N(CH₂)₃OP(O)₂-CGA GAT CGG CAG TCG GCT AG-3’ (1760) 5’-H₂N(CH₂)₄OP(O)₂-CGA GAT CGG CAG TCG GCT AG-3’ (1761) 5’-H₂N(CH₂)₅OP(O)₂-CGA GAT CGG CAG TCG GCT AG-3’ és (1757) 5’-H₂N(CH₂)₆OP(O)₂-GGA GAT CGG CAG TCG GCT AG-3’

D. példa: Terpiridin-lantanida-oligonukleotid-konjugátumok előállítása

Dl. példa: Olyan konjugátumok előállítása, amelyekben az oligonukleotid a lantanidakomplex terpiridinrészéhez kötődik

a) 0,2 mg megfelelő amino-oligonukleotidot feloldunk 150 μΐ piridin/víz/trietil-amin (90:15:1) arányú oldószerelegyben, hozzáadunk 1 mg, a 2. táblázatban feltüntetett megfelelő izocianátokomplexet, és az elegyet szobahőfokon 1 órán keresztül keverjük. A reakcióelegyet egyszer 0,1 M kálium-klorid-oldattal szemben, háromszor pedig vízzel szemben dializáljuk. A terméket fordított fázisú HPLC-vel egy Nucleosil-Ci₈-oszlopon (eluens: 0,05 M

P nh₂ (F) /¼ o- o trietil-ammónium-acetát-oldat, amely 0%-tól 30%-ig terjedő mennyiségű acetonitrilt tartalmaz; időtartam: 90 perc) vagy ioncserés HPLC-vel, 60 °C-on, PVDI.4000A oszlopon, 5 pm (eluens: 20% 1 M káliumklorid-oldat és 80% 20 nM kálium-foszfát-oldat, pH 6,0 elegye, amely 20% acetonitrilt tartalmaz, ezzel 10 percig eluálunk, azután pedig 60 percen keresztül 80%-os kálium-klorid-oldattal végezzük az elúciót) tisztítjuk, ekkor megkapjuk a 3. táblázat 3.1-től 3.13-ig terjedő, továbbá a 3.18 és 3.21 jelű tiszta konjugátumokat. b) 3 pmol megfelelő karbonsavszármazékot (lásd az 1. táblázatot is) feloldunk 200 pl dimetil-szulfoxidban, az oldathoz hozzáadunk 3,3 pmol diciklohexil-karbodiimidet és 3,3 pmol N-hidroxi-szukcinimidet, majd az elegyet 16 órán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Hozzáadunk 3 mg amino-oligonukleotidot, azután 100 pl N-metil-morfolint. 3 napi állás után kétszer dimetil-szulfoxiddal és egyszer vízzel mossuk. A terméket a szilárd fázisról 32%-os vizes ammóniaoldattal lehasítjuk, és a védőcsoportokat teljesen eltávolítjuk (3 óra szobahőmérsékleten). Fordított fázisú HPLC-vel tisztítva megkapjuk a 3. táblázat 3.45-3.49 számú vegyületeit.

3. táblázat

A G általános képletű vegyületek adatai

A vegyület száma	Ln3+	r4	R,		Molekulatömeg számitott/talált	Retenciós idő**
3.1	La	CH3	Ph-4-691	H	7082/7093
3.2	Eu	CHj	Ph-4-691	H	7095/7090
3.3	Ce	CH3	Ph-4-691	H		27,4
3.4	Pr	ch3	Ph-4-691	H		42,5*
3.5	Gd	ch3	Ph-4-691	H		27,0
3.6	Tb	ch3	Ph-4-691	H		27,7
3.7	Dy	ch3	Ph-4-691	H		27,6

HU 217 774 Β

3. táblázat (folytatás)

A vegyület száma	Ln3 +	r4	R,		Molekulatömeg számított/talált	Retenciós idő**
3.8	Ho	CHj	Ph-4-691	H		26,7
3.9	Er	CHj	Ph-4-691	H		27,2
3.10	Tm	CHj	Ph-4-691	H		27,5
3.11	Yb	CHj	Ph-4-691	H		28,8
3.12	Lu	CHj	Ph-4-691	H		27,9
3.13	Y	CHj	Ph-4-691	H		27,4
3.14	Eu	H	-Fenil	A 691	7060/7065
3.15	La	H	-Fenil	A-691	7048/7072
3.16	Eu	H	H	A-691
3.17	La	H	H	A-691
3.18	Eu	CHj	Ph-4-821	H	9843/9853
3.19	La	H	-Fenil	A-821	9800/9800
3.20	Eu	H	-Fenil	A-821	9813/9839
3.21	Eu	CHj	Ph-4-823	H	9842/9861
3.22	La	H	-Fenil	A-823		35,6*
3.23	Eu	H	-Fenil	A-823	9811/9826
3.24	La	H	-Fenil	A-940	9757/9829
3.25	Eu	H	-Fenil	A-940	9770/9794
3.26	Eu	CHj	Ph-3-691	H	7092/7117
3.27	Eu	CHj	Ph-4-1759	H	7050/7043
3.28	Eu	CHj	Ph-4-1760	H	7064/7071
3.29	Eu	CHj	Ph-4-1761	H	7078/7078
3.30	Eu	H	Ph-4-691	H	7067/7066
3.31	La	H	Ph-4-691	H	7078/7060
3.32	Eu	CHj	Ph-3-1759	H	7053/7058
3.33	Eu	CHj	Ph-3-1760	H	7067/7064
3.34	Eu	CHj	Ph-3-1761	H	7081/7085
3.35	Eu	CHj	Ph-2-691	H	7096/7098
3.36	Eu	CHj	Ph-2-1759	H	7053/7055
3.37	Eu	CHj	Ph-2-1760	H	7067/7065
3.38	Eu	CHj	Ph-2-1761	H	7081/7083
3.39	Eu	H	Ph-4-1759	H	7025/7030
3.40	Dy	H	Ph-4-1759	H	7036/7043
3.41	Gd	H	Ph-4-1759	H	7031/7034
3.42	Dy	H	Ph-3-1759	H	7036/7038
3.43	Gd	H	Ph-3-1759	H	7031/7029
3.44	Eu	H	Ph-3-1759	H	7025/7026
3.45	Eu	H	-Fenil	A-1759	7018/7021

HU 217 774 Β

3. táblázat (folytatás)

A vegyület száma	Ln3+	r4	R,	r8	Molekulatömeg számított/talált	Retenciós idő**
3.46	Eu	H	-Fenil	A-1757	7100/7123
3.47	Gd	H	-Fenil	A-691	7065/7217
3.48	Tb	H	-Fenil	A-691	7078/7067
3.49	Eu	H	-Fenil	B-691	7075/7097

Ph-4-691: -Fenil-4-N(H)C(S)-oligo 691

Ph-4-821: - Fenil-4-N(H)C(S)-oligo 821

Ph-4-823: -Fcnil-4-N(H)C(S)-oligo 823

Ph-3-NH-691: -Fenil-3-N(H)C(S)-oligo 691

Ph-2-NH-691: -Fcnil-2-N(H)C(S)-oligo 691

PÜ4I759: -Fenil-4-N(H)C(S)-oligo 1759

Ph-4-1760: -Fenil-4-N(H)C(S)-oligo 1760

Ph-4-1761: -Fenil-4-N(H)C(S)-oligo 1761

Ph-3-1759: -Fcml -3-N(H)C(S)-oligo 1759

Ph-3-1760: -Fcml 3-N(H)C(S)-oligo 1760

Ph-3-1761: -Fenil-3-N(H)C(S)-oligo 1761

Ph-2-1759: - Fenil-2-N(H)C(S)-oligo 1759

Ph-2-1760: -Fenil-2-N(H)C(S)-oligo 1760

Ph-2-1761: -FcniI 2-N(H)C(S)-oligo 1761

A-691: -4-CH₂CH₂C(0)-oligo 691

A-821: -4-CH₂CH₂C(O)-oligo 821

A-823: -4-CH₂CH₂C(O)-oligo 823

A-940: -4-CH₂CH₂C(O)-oligo 940

A-1759: -4-CH₂CH₂C(0)-oligo 1759

A-1757: -4-CH₂CH₂C(O)-oligo 1757

B-691: -4-N(CH₃)CH₂C(O)-oligo 691 ** A retenciós idők ioncserélő HPLC-re vonatkoznak.

* A retenciós idők (két, egy csillaggal jelölt érték) fordított fázisú HPLC-re vonatkoznak.

E. példa: A szubsztrát-RNS (cél-RNS) előállítása El. példa: Szubsztrát-RNS szintézise

Mintegy 30 mg ‘ellenőrzött pórusú üveg’ (‘controlled poré glass’, CPG) szilárd fázist mérünk be egy 40 Standard Applied Biosystem-reakcióedénybe 1,5 pmol méretű szintézishez. A CPG szilárd fázis (1) a szintetizálandó RNS védett 3’-építőkövét (a példában rC) hordozza. Az oligomerizációhoz a 2, 3, 4 és 5 képletű foszforamiditeket használjuk fel. A szintézisciklusokat 45 az Applied Biosystem 394 típusú szintetizáló automatájának segítségével, bizonyos eltéréssel (a ribosor foszforamiditjeinek kapcsolási ideje 10 perc) az Applied Biosystem cég standard előírása szerint kivitelezzük [User Manual Version 2.0 (1992), 1 pMol Cyclus, 50 Appen. 1-41].

Ugyancsak felhasználjuk az alábbi, kereskedelmi forgalomban beszerezhető reagenseket:

0,1 M foszforamidit

Tetrazol/acetonitril: 4%, 96% 55 (Terc-butil-fenoxi)-ecetsavanhidrid/piridin/tetrahidrofurán: 10%, 10%, 80% N-Metil-imidazol/tetrahidrofurán: 16%, 84% Triklór-ecetsav/metilén-diklorid: 2%, 98% Jód/víz/piridin/tetrahidrofurán: 3%, 2%, 20%, 75% 60

A következő szubsztrát-RNS molekulákat szintetizáljuk:

CG-690 5’r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGC CAC UCU AC)

CG-1352 5’r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGC UGA CUG AC)

E2. példa: Lehasítás a szilárd fázisról (CPG) és a bázisról a védőcsoportok lehasitása

Az 1,5 pmol méretű szintézis szilárd fázisát 800 pl, ammóniagázzal telített etanollal elegyítjük és éjjelen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az ammóniagázzal telített etanolt egy rész etanolból és három rész 33%-os ammóniaoldatból állítjuk elő. Az inkubációt követően az ammóniagázzal telített etanolt dekantáljuk, a CPG szilárd fázist ammóniát tartalmazó etanollal utánmossuk, és az egyesített oldatokat liofilizáljuk.

E3. példa: A (terc-butil)-dimetil-szilil-védőcsoport (TBDMS) lehasitása

A líofilizált kísérleti anyagot 800 pl 1 M tetrabutilammónium-fluorid/tetrahidrofurán (TBAF/THF) oldattal elegyítjük, és az elegyet 30 percen keresztül intenzíven keverjük. Az inkubációt 24 órán keresztül végez19

HU 217 774 Β zük szobahőmérsékleten, fénytől védve. Az RNS-t 50 mmol (trietil-amin)-hidrogén-karbonát- (TAHC) oldattal [pH=7,0 (1 + 1)] elkeverjük és 4 °C-on közvetlenül dializáljuk (a víz Nanopuré minőségű).

E4. példa: Dialízis

A dialízist háromszor hajtjuk végre pH 7,0-ás

7,5 mmol TAHC-oldattal szemben. (Az oldatot Nanopuré minőségű vízzel készítjük, szén-dioxid-gázzal pH 7,0 értékre beállítjuk és előzetesen lehűtjük 4 °C-ra.) A reakció termékét liofilizáljuk, azután dietil-oxidiformiáttal kezelt, majd autoklávozott vízzel (DEPC-H₂O) oldatba visszük [Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]. Az oldat egy aliquot részéből a koncentrációt 260 nm-nél meghatározzuk. A továbbiakban az RNSsel minden esetben Rn-áz enzimtől és idegen fémionoktól mentes közegben dolgozunk.

E5. példa: A szubsztrát-RNS 5 '-végének jelölése ³³[P]y—ATP-vel

Az enzimatikus kinázreakcióhoz a fenti szintézisből származó 100 pmol RNS-t 20 μΐ térfogatban 37 °C-on 20 percig inkubálunk. A reakcióközeg összetétele: 0,5 μΐ T4-polinukleotid-kináz-oldat (Promega, 10 egység/μΐ), 2 μΐ kináz-pufferoldat (50 mmol Trishidroklorid pH 7,5, 10 mmol MgCl₂, 5 mmol 1,4-ditioDL-treit, 0,1 mmol spermidin) és 0,5 μΐ ³³[Ρ]γ-ΑΤΡ (Amersham, >3 · 10³ Bq/μΐ).

Ezután 138 μΐ Tris-HCl/EDTA oldatot (10 mmol/ 1 mmol, pH 7,5), 2 μΐ glikogénoldatot (35 mg/ml) és 40 μΐ ammónium-acetát-oldatot (10 M) adunk az elegyhez. Továbbá hozzáadunk még 600 μΐ etanolt, az elegyet lehűtjük -20 °C-ra és 20 percig centrifugáljuk 4 °C-on. Az üledéket liofilizáljuk, hozzáadunk 15 μΐ pufferoldatot (összetétel: 0,025% bróm-fenolkék, 0,025% Xylen Cyanol feloldva 80%-os formamidoldat és 7 M karbamidoldat 1:1 arányú keverékében, 20 mmol citromsav, 1 mmol EDTA), 1 percig denaturáljuk 95 °C-on, azonnal jég-víz fürdőbe állítjuk és a gélelektroforetikus elválasztáshoz felvisszük egy 1,0 cm χ 1 mm méretű csíkra. A gélelektroforetikus elválasztást 2,5 órán keresztül végezzük 55 watt teljesítménnyel, miután előzőleg 40 percen át előfuttatást végzünk 55 watt teljesítménnyel.

E6. példa: A kinázzal emésztett szubsztrát-RNS tisztítása és izolálása

A kinázreakció komponenseinek gélelektroforetikus elválasztásához elkészítünk egy 1 mm χ 30 cm χ 40 cm méretű poliakrilsavamid gélréteget. A polimerizációs reakciót 170 ml térfogatban hajtjuk végre. Ehhez az alábbi összetevőket vesszük: 51 ml akrilsavamid-oldat (40%, akrilsavamid/bisz-akrilsavamid 10:1), 17 ml TBE-puffer [0,89 M trisz(hidroxi-metil)-amino-metán, 0,89 M bórsav, 0,02 M etilén-diamin-tetraecetsav] és 71,4 g karbamid a megfelelő mennyiségű vízzel összekeverve. A polimerizációt 170 μΐ ammónium-peroxi-diszulfát-oldattal (25%-os tömeg/térfogat szerint) és 170 μΐ ammónium-peroxi-diszulfát-oldattal (25%-os tömeg/térfogat szerint) és 170 μΐ TEMED- (Ν,Ν,Ν’,Ν’tetrametilén-etilén-diamin) oldattal indítjuk be. A gél egy óra eltelte után kész a felhasználásra. Futtatópufferként tízszeresére hígított TBE-pufferoldatot alkalmazunk. A gélelektroforetikus elválasztás után a kinázzal emésztett RNS-t a rétegre helyezett röntgenfilmmel detektáljuk, és a megfelelő géldarabokat a gélrétegből kivágjuk. Egy Schleicher és Schüll elektroelúciós készülékben az RNS-t a gélből eluáljuk 100 V mellett (3,3 V/cm). Elúciós pufferoldatként tízszeresére hígított TBE-pufferoldatot alkalmazunk.

Az izolált RNS-t 360 μΐ eluátumban 40 μΐ nátriumacetát-oldattal (3 M, pH 5,2) és 1 ml etanollal elegyítjük, az elegyet lehűtjük -20 °C-ra és 20 percig centrifugáljuk 4 °C-on. Az üledéket liofilizálás után feloldjuk 30 μΐ vízben, és a kapott oldat aktivitását a Cserenkovprotokoll szerint szcintillációs számlálóban megmérjük, és az aktivitás értékét 12 000 cmp/μΐ értékre állítjuk be.

F. példa: Hasítási kísérletek terpiridin-lantanidaoligonukleotid-konjugátumokkal

FI. példa: Szubsztrát-RNS hasítása oligonukleotidlantanida komplexkonjugátumokkal

Az RNS-termékek hasítás utáni gélelektroforetikus elválasztásához és azonosításához egy 0,4 mmx30 cmx40 cm méretű 12%-os Long Rangergélréteget (AT Biochem, módosított poliakrilsavamid gél) készítünk. A polimerizációs reakciót 90 ml térfogatban kivitelezzük. Ehhez összekeverünk 21 ml Long Ranger-oldatot (50%), 11 ml TBE-pufferoldatot [0,89 M trisz(hidroxi-metil)-amino-metán, 0,89 M bórsav, 0,02 M etilén-diamin-tetraecetsav] és 37 g karbamidot a megfelelő mennyiségű vízzel. A polimerizációs reakciót 450 μΐ ammónium-peroxi-diszulfát-oldattal (10% tömeg/térfogat szerint) és 45 μΐ TEMED-oldattal indítjuk be. A gél 1 óra eltelte után alkalmas a felhasználásra. Futtató pufferoldatként 16,66-szorosra hígított TBE-pufferoldatot alkalmazunk. Az elválasztást 75 percen át végezzük 60 W teljesítménnyel. A gélelektroforetikus elválasztás után a jelzett hasítási termékeket (RNS-oligomereket) a rétegre helyezett röntgenfilmmel vagy ‘Phosphorimager’-rel detektáljuk és aktivitásukat meghatározzuk.

A hasítási reakciót 10 μΐ térfogatban kivitelezzük.

μΐ szubsztrát-RNS-hez (aktivitása 12 000 cpm) 1 μΐ oligonukleotid-konjugátum-oldatot (10 μΜ), 4 μΐ Trisz-pufferoldatot (50 mM, pH 7,4, 37 °C-on) és a megfelelő mennyiségű vizet adjuk hozzá. Az oldatot 1 percig 85 °C-on tartjuk, azután 16 órán keresztül 37 °C-on inkubáljuk. A reakciót úgy állítjuk le, hogy 5 μΐ felvivő pufferoldatot adunk hozzá (összetétele: 0,025% bróm-fenolkék, 0,025% Xylen Cyanol feloldva 80%-os formamidoldat és 7 M karbamidoldat 1:1 arányú elegyében, 20 mM citromsav és 1 mM EDTA). A gélelektroforetikus elválasztáshoz és 7,5 μΐ-es mintát 95 °C-on denaturálunk, azonnal jeges fürdőbe állítjuk és egy géltasakba helyezzük.

A szubsztrát-RNS koncentrációját (25-szörös feleslegben vesszük) a következő módon becsüljük meg: 100 pM nyers termék RNS esetében és a géltisztításnál

HU 217 774 Β

10%-os kitermelést feltételezve a leírt protokoll szerint a reakcióelegyben a szubsztrát-RNS végkoncentrációja 0,04 mM, az oligonukleotidkonjugátumé 1 mM. Összehasonlításképpen : ha csak terpiridin-lantanida komplexet használunk, akkor ugyanakkora hasítási érték eléréséhez 400 mM komplex szükséges. Ez azt jelenti, hogy a szubsztrát-RNS-hez képest a komplexet 10 000szeres fölöslegben kell vennünk.

F2. példa: A CG-690 szubsztrát-RNS inkubációja a 3.2 számú oligonukleotid-európium komplexkonjugátummal

A hasítási reakció lényegében úgy történik, amint az FI. példában leírtunk.

(80% hasítatlan kiindulási anyag)

CG-690 5’r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGC CAC UCU AC)

Fő hasítási termékek: (Σ 15%)

5’r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGC CAC

UCU Acp)

5’r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGC CAC

UCUcp)

5’r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGC Ccp)

5’r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGcp) További hasítási termékek: (Σ 5%)

5’r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGCcp)

5’r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU Ccp)

F3. példa: A CG-690 szubsztrát-RNS inkubációja a 3.15 számú oligonukleotid-lantán komplexkonjugátummal

A hasítási reakció lényegében úgy történik, ahogyan azt az F1. példában leírtuk.

(80% hasítatlan kiindulási anyag)

CG-690 5’r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGC CAC UCU AC)

Fő hasítási termékek: (Σ 20%)

5’r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGC CAC

UCUcp)

5’r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGC Ccp) (cp=2 ’ ,3 ’ -ciklofoszfát)

F4. példa: A CG-1352 szubsztrát-RNS inkubációja a 3.14 számú oligonukleotid-európium komplexkonjugátummal

A hasítási reakció lényegében úgy történik, ahogyan azt az FI. példában leírtuk.

(<5% hasítatlan kiindulási anyag)

CG-1352 5’r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU

CGC UGA CUG AC)

Fő hasítási termékek: (>70%)

5’(CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGC UGcp) Maradék hasítási termékek: (Σ 25%)

5’(CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGC Ucp)

5’r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGC

UGAcp)

5’r(CUA GCC GAC VGC CGA VCU CGC VGA

Ccp)

5’r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGC UGA

CUcp)

5’r(CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGC UGA CUGcp)

F5. példa: A CG—1352 szubsztrát-RNS további hasításai oligonukleotid-terpiridin fémkomplex-konjugátumokkal

A további hasítási reakciók is lényegében ugyanúgy történnek, ahogyan azt az FI. példában leírtuk. A további hasítási kísérletek eredményeit a 4. táblázat foglalja össze; itt tüntetjük fel a CG-1352 szubsztrát-RNS hasítási reakcióinak eredményeit, amelyeket a 3. táblázatban megadott különböző terpiridin-fémkomplex-oligonukleotid-konjugátumokkal végzünk. A „+3” adat azt jelenti, hogy a fő hasítási lépés a szubsztrát-RNS +3 és +4 nukleotidja között történik (lásd az 1. és a 2. ábrát és az azokhoz fűzött magyarázatokat is). Látható, hogy ezekben az esetekben a hasítás előnyösen a +3 pozícióban megy végbe.

4. táblázat

Fő hasítási termékek (vastagbetűs adatok) a CD-1352 szubsztrát-RNS esetében. Minden esetben feltüntetjük az alkalmazott konjugátumot is (lásd a 3.

táblázatot)

3.2	3.1	3.3	3.6	3.11	3.7
+3G	+3G	+3G	+3G	+3G	+3G
3.8	3.9	3.10	3.12	3.5	3.13
+ 3G	+3G	+ 3G	+3G	+3G	+3G
3.4	3.30	3.31	3.26	3.27	3.28
+3G	+3G	+3G	+3G	+3G	+3G
3.29	3.32	3.33	3.34	3.35	3.36
+3G	+3G	+3G	+3G	+3G	+3G
3.37	3.38	3.39	3.40	3.41	3.44
+3G	+3G	+3G	+3G	+3G	+3G
3.42	3.43	3.15	3.48	3.49	3.45
+3G	+3G	+3G	+3G	+3G	+3G

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (34)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Az (I) általános képletű vegyületek, amelyek képletében

   Rí jelentése hidrogénatom, fenil- vagy antracenilcsoport,

   R₅ jelentése hidrogénatom, halogénatom vagy -C(O)R₍₁ általános képletű csoport, amely utóbbi csoport egy Z csoporton keresztül kapcsolódik a piridingyűrűhöz, és a

   Z csoport jelentése adott esetben oxigénatommal vagy -NR₁₂ általános képletű csoporttal megszakított, 1-20 szénatomos alkiléncsoport,

   R₂ és R₇ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom,

   R₃ és R₆ jelentése egymástól függetlenül 1-4 szénatomos alkilcsoport,

   HU 217 774 Β

   R₄ jelentése hidrogénatom, 1 -20 szénatomos alkil- vagy fenilcsoport,

   Rj j jelentése hidrogénatom vagy 1 -6 szénatomos alkilcsoport,

   Rj2 jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport,

   Meⁿ⁺ jelentése lantanidafém-ion vagy ittriumion,

   Y jelentése egy sav anionja, n értéke 2 vagy 3, és m értéke 1, 2 vagy 3, ahol a fenilcsoportok szubsztituálatlanok vagy 1 -4 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituáltak.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti vegyületek, ahol az R₅ jelentése hidrogénatom vagy -C(O)Rj, általános képletű csoport, amely utóbbi csoport egy Z csoporton keresztül kapcsolódik a piridingyűrűhöz, és a Z csoport jelentése adott esetben oxigénatommal vagy -NR,₂ általános képletű csoporttal megszakított 1-20 szénatomos alkiléncsoport.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy a Z csoport jelentése 1-3 szénatomos alkiléncsoport.
4. 4. Az 1-3. igénypontok egyike szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy a Z csoport jelentése 2-3 szénatomos alkiléncsoport.
5. 5. Az 1-4. igénypontok egyike szerinti vegyületek, azzal jellemezve, hogy R₄ jelentése hidrogénatom vagy 1 -20 szénatomos alkilcsoport.
6. 6. Az 1-5. igénypontok egyike szerinti vegyület, amelyben a lantanidafém lantán, cérium, neodímium, európium vagy gadolínium.
7. 7. Az 1-6. igénypontok egyike szerinti vegyület, amelyben a lantanidafém lantán vagy európium.
8. 8. Az 1-7. igénypontok egyike szerinti vegyület, amelyben a lantanidafém európium.
9. 9. Az 1-8. igénypontok egyike szerinti vegyület, amelyben az anion fluorid-, klorid-, bromid-, jodid-, [hexafluoro-foszfát(V)]-, [hexafluoro-antimonát(V)]-, [tetrafluoro-borát(III)]-, [tetrafenil-borát(III)]-, acetát-, nitrát-, szulfát- vagy foszfátion.
10. 10. Az 1-9. igénypontok egyike szerinti vegyület, amelyben az anion klorid-, acetát- vagy nitrátion.
11. 11. Az (V) általános képletű vegyületek, amelyek képletében

    R₂ és R₇ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, R₃ és R₆ jelentése egymástól függetlenül 1-4 szénatomos alkilcsoport,

    R₄ jelentése hidrogénatom, 1-20 szénatomos alkil- vagy fenilcsoport, ahol a fenilcsoportok szubsztituálatlanok vagy 1 -4 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituáltak,

    Meⁿ⁺jelentése egy lantanidafém-ion vagy ittriumion,

    Y jelentése egy sav anionja, n értéke 2 vagy 3, és m értéke 1, 2 vagy 3,

    R₉ jelentése egy (VI) általános képletű maradék, és R₈ jelentése hidrogénatom vagy R₉ jelentése hidrogénatom vagy fenilcsoport, és R₈ jelentése egy (VI) általános képletű maradék, p, q és r értéke egymástól függetlenül 0 vagy 1,

    X és X’ jelentése egymástól függetlenül 1 -20 szénatomos alkilén-, 2-12 szénatomos alkenilén-, 2-12 szénatomos alkinilén- vagy feniléncsoport,

    A és A’ jelentése egymástól függetlenül -NR,₂-COvagy -NRj₂-CS általános képletű csoport, ahol Rj₂ jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, és

    Oligo jelentése egy természetes, módosított vagy szintetikus molekularész (szekvencia), amely természetes, módosított vagy szintetikus dezoxinukleozidokból vagy peptid-nukleinsav építőelemekből épül fel, és amely egy nukleinbázison, egy nukleotidok közötti hídon vagy egy cukron keresztül kapcsolódik, és amelynek belső tartománya egy cél-RNS-sel komplementer.
12. 12. A 11. igénypont szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy

    R₉ jelentése egy (VI) általános képletű maradék, és Rj jelentése hidrogénatom, vagy

    R₉ jelentése hidrogénatom vagy fenilcsoport, és R₈ jelentése egy (VI) általános képletű maradék, amely képletben p, q és r értéke egymástól függetlenül 0 vagy 1.
13. 13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy q értéke 1.
14. 14. A 11-13. igénypontok egyike szerinti vegyületek, azzal jellemezve, hogy R₂ és R₇ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom.
15. 15. A 11-14. igénypontok egyike szerinti vegyületek, azzal jellemezve, hogy R₃ és lejelentése egymástól függetlenül 1 -4 szénatomos alkilcsoport.
16. 16. A 11-15. igénypontok egyike szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy R₄ jelentése hidrogénatom vagy 1-20 szénatomos alkilcsoport.
17. 17. A 11-16. igénypontok egyike szerinti vegyület, amelyben a lantanidafém lantán, cérium, neodímium, európium vagy gadolínium.
18. 18. A 11-17. igénypontok egyike szerinti vegyület, amelyben a lantanidafém lantán vagy európium.
19. 19. A 11-18. igénypontok egyike szerinti vegyület, amelyben a lantanidafém európium.
20. 20. A 11-19. igénypontok egyike szerinti vegyület, amelyben az anion fluorid-, klorid-, bromid-, jodid-, [hexafluoro-foszfát(V)]-, [hexafluoro-antimonát(V)]-, [tetrafluoro-borát(III)]-, [tetrafenil-borát(III)]-, acetát-, nitrát-, szulfát- vagy foszfátion.
21. 21. A 11-20. igénypontok egyike szerinti vegyület, amelyben az anion klorid-, acetát- vagy nitrátion.
22. 22. A 11-21. igénypontok egyike szerinti vegyület, amelyben az anion kloridion.
23. 23. A 11-22. igénypontok egyike szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy X jelentése 1-3 szénatomos alkilén-, 3 szénatomos alkinilén- vagy feniléncsoport.
24. 24. A 11-23. igénypontok egyike szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy X jelentése 2-3 szénatomos alkilén- vagy feniléncsoport.
25. 25. A 11-24. igénypontok egyike szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy A jelentése -C(O)NRj₂- általános képletű csoport.
26. 26. A 11-25. igénypontok egyike szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy X’ jelentése 1-20 szénatomos alkiléncsoport.

    HU 217 774 Β
27. 27. A 11-26. igénypontok egyike szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy X’ jelentése 1-10 szénatomos alkiléncsoport.
28. 28. A (II) általános képletű vegyületek, amelyek képletében

    R[ jelentése hidrogénatom, fenil- vagy antracenilcsoport, ahol a fenilcsoport adott esetben 1 -4 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált,

    R₂ és R₇ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, R₃ és R₆ jelentése egymástól függetlenül 1-4 szénatomos alkilcsoport,

    R₁₂ jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, ahol az alkil-, cikloalkil-, aril-alkil-, aril- és a Z csoportok szubsztituálatlanok vagy 1-4 szénatomos alkoxi-, 1-4 szénatomos alkil-, ciano- vagy nitrocsoporttal, illetve fluor-, klór- vagy brómatommal szubsztituáltak, azoknak a vegyületeknek a kivételével, ahol R₂ és R₇ jelentése hidrogénatom, R₃ és lejelentése -CH₃-csoport, és Rj jelentése hidrogénatom vagy 4-fenilcsoport, vagy ahol R_t jelentése hidrogénatom, R₂ és R₇ jelentése 4-fenilcsoport, és R₃ és R₆ jelentése hidrogénatom vagy -CH₃-csoport.
29. 29. A (III) általános képletű vegyület, amely képletben

    R₅ jelentése egy 2-20 szénatomos alkiléncsoporton keresztül a piridingyűrűhöz kapcsolódó, egy vegyértékű -C(O)-OR₁₂ általános képletű funkciós csoport, ahol

    R₁₂ jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, és

    R4 jelentése hidrogénatom vagy 1-20 szénatomos alkilcsoport.
30. 30. Eljárás az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (II) általános képletű terpiridinszármazékot egy (III) általános képletű 2,6-diformil- vagy 2,6-diacil-piridinnel egy (IV) általános képletű só jelenlétében kondenzációs reakcióba viszünk, amely képleteben

    Rj, R₂, R₃, R4, R₅, Rf,, R₇, Meⁿ⁺ és Y jelentése, illetve n és m értéke azonos az 1. igénypontban meghatározottakkal.
31. 31. Eljárás a 11 - 27. igénypontok egyike szerint (V) általános képletű vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1-10. igénypontok egyike szerinti (I) általános képletű vegyületet

    a) egy (Via) általános képletű vegyülettel visszük reakcióba, amely képletben A” jelentése egy egy vegyértékű funkciós csoport, amelyet a következő képletű, illetve általános képletű csoportok közül választunk ki: -OR,₀, -SR₁₀, -NCO, -NCS, -NHR,„ -C(O)OR_n, -C(O)SH, -C(O)NHR,„ -C(O)C1, -C(S)SR„,

    -C(S)NHR_lb -C(S)OR„, -SO₃Rh, -SO₂NHR_h, -SO₂C1, -P(O)(OH)₂, -P(O)(OH)-NHR_u, -P(S)(SH)₂, -P(S)(SH)-NHR_n, -P(S)(OH)₂, -P(S)(OH)-NHRh, -P(O)(SH)₂,

    -P(O)(SH)-NHR_h, -P(O)(OH)H,

    -P(O)(NHR_I1)H, -P(S)(SH)H, -P(S)(NHR„)H,

    -P(S)(OH)H, -P(O)(SH)H, ahol

    R|₀ jelentése hidrogénatom, karbamoil-, tiokarbamoil-, 1-6 szénatomos alkil-, illetve

    -C_xH_2x-NH₂, -C_xH_2x-SH vagy -(C_xH_2xO)_y-H általános képletű csoport, és

    Rn jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkil-, illetve -C_xH_2x-NH₂, -C_xH_2x-SH vagy -(C_xH_2xO)_y-H általános képletű csoport, és x értéke 2-től 6-ig terjedő egész szám, és y értéke 1-től 20-ig terjedő egész szám,

    X' egy szubsztituálatlan vagy egy fluor-, klór- vagy brómatommal, illetve 1-4 szénatomos alkoxi-, 1-4 szénatomos alkil- vagy nitrocsoporttal szubsztituált maradék, amelyet az 1-20 szénatomos alkilén-, 2-12 szénatomos alkenilén-, 2-12 szénatomos alkinilén- vagy a -(C_xH_2xO)_y- általános képletű csoport, amely képletben x értéke 2-től 6-ig terjedő egész szám, és y értéke 1-től 20-ig terjedő egész szám, továbbá az 5-8 szénatomos cikloalkilén-, 6-12 szénatomos arilén- és a 7-12 szénatomos aril-alkiléncsoportok közül választunk ki,

    A’ jelentése oxigén- vagy kénatom, illetve a következő képletű vagy általános képletű csoport: -S-S, -NR₁₂-CO-NR₁₂-, -NR_I2-CS-NR₁₂-, -NR₁₂-, -NR₁₂-C(O)-O-, -C(O)O-,

    -C(O)S-, -C(O)NR₁₂-, -C(S)S-, -C(S)O-, -C(S)NR₁₂, -SO₂NR₁₂, -SO,-, -P(O)(OH)O-, -P(S)(SH)S-, -P(S)(SH)O-, -P(S)(OH)O-, -P(O)(SH)S-, -P(O)(OH)S-, -P(O)(SH)O-, -P(O)(OH)-NR„, -P(S)(SH)-NR_i2-, -P(S)(OH)-NR₁₂-, -P(O)(SH)-NR₁₂-, -HP(O)O-, -HP(S)S-, -HP(O)NR_I2- vagy -HP(S)NR₁₂- csoport, ahol

    R₁₂ jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, és az

    Oligo jelentése egy természetes, módosított vagy szintetikus molekularész (szekvencia), amely módosított vagy természetes, vagy szintetikus dezoxinukleozidokból vagy peptid-nukleinsav építőkövekből épül fel, és amely egy nukleinbázison, egy nukleotidok közötti hídon vagy egy cukron keresztül kapcsolódik, és amelynek belső tartománya egy cél-RNS-sel komplementer, vagy

    b) egy (VIb) általános képletű vegyülettel viszünk reakcióba, amely képletben

    A” és Oligo jelentése az a) részben leírtakkal megegyező.
32. 32. Eljárás a 31. igénypont szerint, azzal jellemezve, hogy R₁₀ jelentése hidrogénatom.
33. 33. Eljárás ribonukleinsavak foszfát-nukleotid hídjainak hasítására fiziológiás körülmények között egy fémkomplexből és oligonukleotidból álló konjugátum behatására, azzal jellemezve, hogy a) a cél-RNSsel és egy 11 -27. igénypontok egyike szerinti vegyülettel komplexet képezünk, azután b) reagáltatjuk és hasítjuk.
34. 34. Gyógyászati készítmény vizes oldat vagy szuszpenzió formájában, amely a 11 -27. igénypontok egyike szerinti (V) általános képletű vegyületek hatékony mennyiségét egyedül vagy más hatóanyagokkal és vízzel mint gyógyszerészeti vivőanyaggal és adott esetben segédanyagokkal együtt tartalmazza.