JP3050595B2 - オリゴヌクレオチド類似体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、オリゴヌクレオチド類似体における１個ま
たはそれ以上のヌクレオチド間リン酸ジエステル結合が
硫黄をベースとした結合（sulfur based linkage）に置
換されている新規な化合物に関する。

背景技術 治療手段のために有効な物質のレパートリーとしては
主に比較的低分子量の有機化合物が挙げられる。最近、
そのレパートリーも拡大され、効能、特性および安定性
を備えた蛋白質化合物を含むようになった。今や、例え
ば核酸のような他の種類の生物高分子の治療上の潜在能
力が注目されている。

核酸はペンダントのアデニン（Ａ）、グアニン
（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）〔または同
族のラウシル（Ｕ）〕塩基グループを有する線状のホス
ホペントースポリマーである。ペントースはリボース
（RNA）または２′−デオキシリボース（DNA）でありう
る。これらは選択性に関して高い潜在能力を有するため
治療上魅力的な候補である。この高い選択性は核酸の良
く知られたアンチパラレルで２本鎖のらせん構造（また
は二重型）を形成する能力に基づくものであり、そして
その構造的相補性は相対する鎖の塩基の間の水素結合の
形成（ワトソン−クリック塩基対）によるものである。
相補性は相対する鎖に関してＧとＣとの、およびＡとＴ
（またはＵ）とのペアリングとして定義される。完全な
相補性を有する二重らせん構造は熱力学的に好ましい。
短鎖〔20未満の残基またはヌクレオチド（nt）〕のオリ
ゴヌクレオチドの場合、たった一つの不適当なペアリン
グまたはミスマッチが有意に二重らせん構造を不安定化
させることができる。したがって、原則として３×10⁹n
tのヒトゲノム（ヒトの遺伝物質の全体）における単一
の部位を16〜20ntのオリゴヌクレオチドで選択的にアド
レスすることができる。これは一般に従来の低分子量の
薬剤で達成しうるものより実質的に大きな選択性であ
る。この程度の潜在的な選択性があるならば、形質発現
のレベルにおいて治療効果を発揮するというアプローチ
を考慮することができる。遺伝物質の宿主系への組込み
により作用するウイルス剤の場合、組込みおよび複製に
含まれる多くの段階の１つを阻止することを考えること
ができる。

核酸を相補的にアドレスされた治療剤として使用する
試みの多くは一重鎖ターゲットを含んでいた。このよう
なターゲットにはメッセンジャーRNA（mRNA）および一
重鎖ウイルスゲノムがある。このような場合、試薬の核
酸はターゲットに対し相補的であり、「アンチセンス試
剤（anti−sense reagents）」と呼ばれる。このような
薬剤を使用して特異的な効果を発揮させる方法を本明細
書では「アンチセンスターゲッティング（anti−sense
targeting）」（参考文献１〜３、32）と称する。

ごく最近では、第２の高特異的モードの核酸結合が研
究されている。二重鎖DNAの特定配列が第３の鎖と結合
して三重らせんまたは三重鎖を形成することが見い出さ
れた（参考文献４）。三重鎖形成にはいわゆるフーグス
ティーン型の水素結合を形成する追加の塩基との三重の
塩基対の形成が含まれる。本明細書では、このようなモ
ードで結合するよう企画された試薬を「三重鎖試薬」と
称し、そしてこのような試薬を使用して特異的な効果を
発揮させる方法を「三重鎖ターゲッティング（triplex
targeting）」と称する。三重鎖ターゲッティングアプ
ローチの利点は二重鎖ゲノムDNAを直接アドレスするこ
とができることである。不利な点は、少なくともこの時
点で、すべての配列がこの様にして処理することができ
るわけではないということである。単一の不変性オリゴ
デオキシヌクレオチドの合成の容易さおよび化学的安定
性のため、アンチセンス試剤としてのこれらの使用の広
汎な研究がなされている。このアプローチはとりわけヒ
ト免疫不全ウイルス（HIV）、ラウス肉腫ウイルスおよ
びｃ−myc腫瘍遺伝子発現に対してインビトロにおいて
様々な成功を伴なって使用されている（参考文献28）。

単オリゴデオキシヌクレオチドアンチセンス試剤は２
つの方法のうち一方または両方においてその効果を発揮
することができる。これらは二重鎖形成によりそのター
ゲットと単純に結合することができ、そのため機能的な
一重鎖ターゲットの有効濃度を減少させる。別法とし
て、ターゲットが一重鎖RNAの場合、RNA/DNAハイブリッ
ドは内在リボヌクレアーゼＨ（RNアーゼＨ）の基質とし
て作用することができる。RNアーゼＨはリン酸ジエステ
ル結合の加水分解によりRNA/DNAハイブリッドのRNA鎖を
切断する酵素である。RNアーゼＨの媒介により、薬剤そ
れ自体は切断されないためすべてのターゲットがハイブ
リッドに作用するのに必要なものより低い濃度でアンチ
センス試剤を取り扱うことができ、そして各分子はター
ゲットの多くの分子の切断を導くことができる。

オリゴデオキシヌクレオチドのアンチセンス試剤とし
ての機能を改良するべく、多くの構造変形のアプローチ
が研究されている。ある種の変形には薬剤／ターゲット
二重鎖を安定化するために、または付着部位でターゲッ
トを切断するために化学的付加物の付着が含まれる。フ
レキシブルなつなぎ鎖により付着されたアクリジン誘導
体がインターカレーションによる二重鎖の熱力学的安定
性を改良することがわかっている（参考文献５）。同様
に、つなぎ鎖でつながれたソラレン（psoralens）を有
するオリゴデオキシヌクレオチドは共有結合的にターゲ
ットと架橋結合し、次いで二重鎖の照射を行なうことが
できる（参考文献６）。架橋結合はまた、つなぎ鎖でつ
ながれたアルキル化剤の使用により達成することができ
る（参考文献７）。つなぎ鎖でつながれたエチレンジア
ミン四酢酸（EDTA）／鉄（参考文献８）または1,10−フ
ェナントロリン／銅（参考文献９）を有するオリゴデオ
キシヌクレオチドの使用によるターゲットの切断がイン
ビトロで証明されている。これらの目的のための他の付
着が数多く記載されている。輸送を改良するためにポリ
（Ｌ−リシン）を用いての機能化が採用されている（参
考文献31）。

しかしながら、インビボでのオリゴデオキシヌクレオ
チドのアンチセンス試剤としての使用は２つの根本的な
問題により制限される。第一の問題は小さな一重鎖オリ
ゴデオキシヌクレオチドはエンドヌクレアーゼにより急
速に消化されるということである。結果として、インビ
ボで高濃度を維持するのが困難となる。第２の問題はオ
リゴデオキシヌクレオチドがヌクレオチド残基あたり大
よそ１個の完全な負の電荷を有して高く帯電しているこ
とである。このことは一般に膜を通しての輸送率の減少
をもたらし、ある場合には作用の最終部位への接近が制
限される。これらの２つの効果が結合して比較的低い生
体利用率（bioavailability）を与える。

オリゴデオキシヌクレオチドの末端への（上述したよ
うな）化学的機能性の取りつけは幾つかの場合において
ヌクレアーゼ耐性を高めることができる。リボフラノシ
ル環への塩基の取りつけによりβ−体からα−体に変化
されたα−オリゴデオキシヌクレオチドは平行鎖の二重
鎖を形成し、ヌクレアーゼ耐性の増加を示す（参考文献
10）。

安定性および輸送の問題を解決するためのアプローチ
の幾つかにおいて、結合の中心のリン原子はそのままで
あるが付着原子が置換または修飾されている。Ｏ−アル
キルリン酸トリエステルは電荷がないがもとの結合より
もかさ高く、幾らか化学的安定性の減少を示す（参考文
献11、12）。ホスホロチオエートジエステルはもとの結
合と同型構造であり、ヌクレアーゼ耐性の増加を示す
が、また帯電している（参考文献13）。メチルホスホネ
ートは電荷がなく相当親油性であるが、完全に置換され
たハイブリッドはRNアーゼＨの基質ではない（参考文献
14）。

これらの類似体に伴なう根本的な困難性の１つは、す
べてリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子の１
つのシングル置換から由来するという事実である。リン
原子が結合内でプロキラルなので、１個の酸素の非特異
的置換はキラル中心を形成し、これによりジアステレオ
マー対の生成をもたらす。各々の追加的な非特異的置換
は存在するジアステレオマーの数を倍にする。これらの
ジアステレオマーは分析を複雑にする異なった物理特性
を有し、そしてある場合には幅広く異なったハイブリッ
ド形成能力を有することがわかっている（参考文献3
4）。したがって、多数の結合置換を有するオリゴデオ
キシヌクレオチド類似体は一般に幅広く異なった生物学
的効能を有することのできる種の複合混合物である。

ジアステレオマー混合物の問題は、リン酸ジエステル
結合中の両方の架橋酸素が同じ化学グループと置換する
ことにより回避することができる。この方針に沿ってホ
スホロジチオエートジエステルが研究されている（参考
文献15）。しかしながら、ホスホロチオエート結合のよ
うにこの部分はまだ帯電している。

より広範囲にわたる変形を含むアプローチもまた報告
されている。リン酸ジエステル結合と炭素中心の、中性
カルバメートとの置換が研究されている（参考文献16、
17）。カルバメート結合は平面性であるためその導入は
ジアステレオマーを生成しないが、しかし完全に調査さ
れていない結果ではあるが、リン酸ジエステルの四面体
形態からの逸脱を示すことは確かである。少なくとも１
つの誘導体が相補性ターゲットを用いて二重鎖を形成す
ることができることがわかっている。カルバメートのヌ
クレアーゼ感受性およびRNアーゼＨを活性化する能力は
まだ報告されていない。

最近の研究の幾つかは部分的なリン酸ジエステル結合
置換を有するオリゴデオキシヌクレオチドに興味が向け
られている。この根本理由は所望の特性（例えばヌクレ
アーゼ耐性、ハイブリッド安定性、RNアーゼＨ活性な
ど）のバランスのとれたプロフィールを工学的に作り出
すことができうるかもしれないということである。これ
らの研究は有用ではあるが上記したような問題の一般的
な解決はもたらしそうもない。

幾つかの類似体では、生物学的効果が非連続特異的方
法において発揮するという観察により状況はさらに複雑
になる（参考文献18、19）。これらの効果の原因は不明
のままである。

アンチセンス試剤としてのオリゴデオキシヌクレオチ
ドの機能を高めるための試みにおいて調査された変形の
上記記載は代表的なものであって決して網羅しているわ
けではない。この主題の分野を取り扱っている２つの最
近のレビュー（参考文献１、２）および１つのモノグラ
フ（参考文献32）が包括的である。

一連の天然由来のスルファモイルモノヌクレオシド抗
生物質および幾つかの合成的類似体が開示されている
（参考文献21〜24）。さらに、天然オリゴヌクレオチド
との結合を形成することのできるサブユニット間の結合
グループとしてスルフィド、スルホキシドおよびスルホ
ンを含むDNAの類似体が開示されている（参考文献3
3）。P³²オリゴヌクレオチドのβ−崩壊はスルフェート
が結合したオリゴヌクレオチドを与えることが予想され
るが、しかしこのようなサルフェートが結合したオリゴ
ヌクレオチドは報告されていない。

本発明者らはオリゴヌクレオチド類似体における１個
以上のヌクレオチド間リン酸ジエステル結合が硫黄をベ
ースとした結合に置換されている一連の新規な化合物を
開発した。この結合はリン酸ジエステルと同型の構造で
あり、そして同数の電子を持っている。本発明者らは合
成的に容易であり、化学的耐性、ヌクレアーゼ耐性があ
り、そして二重鎖形成をサポートすることのできる結合
を見い出した。

本発明の化合物は核酸機能の治療コントロールのため
のアンチセンス試剤および三重鎖剤として優れた潜在能
力を有する。さらに、このような化合物は抗ウイルス剤
としての潜在能力およびハイブリッド形成プローブとし
ての実用性を有する。

発明の開示 本発明によれば、式 （式中、ＡはＨ、OH、OR₈、OQまたはハロゲンであり、 Ｂは天然由来の核酸塩基または合成的に修飾された核
酸塩基であり、 ＹはRNまたはＯであり、 ＺはR₇NまたはＯであり、 ＭはＳ（＝Ｏ）＝Ｏ、Ｐ（＝Ｏ）−O^-、Ｐ（＝Ｏ）−
S^-、Ｐ（＝Ｓ）−S^-、Ｐ（＝Ｏ）−OR₃、Ｐ（＝Ｏ）−R
₉、Ｐ（＝Ｏ）−SR₄またはＰ（＝Ｏ）−NR₅R₆（ただ
し、少なくとも１個のＭはＳ（＝Ｏ）＝Ｏであり、そし
てＭがＳ（＝Ｏ）＝Ｏである時、ＹおよびＺのうち１個
だけがＯである）であり、 ｎは１またはそれより大きいものであり、 ＲはＨまたはアルキルであり、 R₁はH₂PO₃、H₃P₂O₅、H₄P₃O₇およびこれらの適当な
塩、Ｈまたは保護基であり、 R₂はH₂PO₃、H₃P₂O₅、H₄P₃O₇およびこれらの適当な
塩、Ｈまたは保護基であり、 R₃はアルキルまたはシアノエチルであり、 R₄はＨまたはアルキルであり、 R₅はＨまたはアルキルであり、 R₆はＨまたはアルキルであり、 R₇はＨまたはアルキルであり、 R₈はアルキルであり、 R₉はアルキルまたはシアノエチルであり、そしてＱは
保護基である） を有する化合物が提供される。

本発明の別の見地によれば、式 （式中、ＡはＨ、OH、OR₂、OQまたはハロゲンであり、 Ｂは天然由来の核酸塩基または合成的に修飾された核
酸塩基であり、 ＹはRNまたはＯであり、 ＺはR₁NまたはＯであり、 Ｘは適当な脱離基であり、 Ｑは保護基であり、 ＲはＨまたはアルキルであり、 R₁はＨまたはアルキルであり、そして R₂はアルキルまたは である） を有する中間体化合物が提供される。

さらに、本発明によればアンチセンス試剤、三重鎖剤
および抗ウイルス剤が提供される。

本発明の別の現地によれば、ハイブリッド形成プロー
ブが提供される。

図面の簡単な説明 図1:修飾オリゴデオキシヌクレオチド9a:9c（丸）お
よび各々の鎖にスルファメート結合のみを含む２つのオ
リゴデオキシヌクレオチド9b:9d（四角）の融解曲線を
示す。緩衝剤はpH7.0で200mMのナトリウムを含んだ。

図2:図2aにdC、Ｔ、dGおよびdAからなる標準的な混合
物のHPLCクロマトグラムを示す。図2bにオリゴデオキシ
ヌクレオチド9cの長期の消化から得られた生成物混合物
HPLCクロマトグラムを示す。使用したHPLC条件は以下の
様である：ガード付C18 Rainin分析用カラム（4.6mm×2
5mm）、流速1.0ml/分、50mMのKH₂PO₄/水（溶媒Ａ）中に
おける10％水／メタノール（溶媒Ｂ）のグラジエント
〔０〜20分（3.0％溶媒B/溶媒Ａ）、20〜40分（３〜40
％溶媒B/溶媒A;直線）、40〜45分（40％溶媒B/溶媒
Ａ）〕。

図3:この図はNSi Iによるスルファメートまたはホス
フェートの結合されたオリゴヌクレオチドの切断を図解
する20％変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグ
ラフ写真である。

図4:pH7.5で0mMのマグネシウムＨの緩衝剤中における
α（AsA）対ポリウリジンの融解曲線を示す。

発明の詳細な説明 アンチセンス試剤としての機能を高めるためオリゴデ
オキシヌクレオチド類似体中におけるリン酸ジエステル
結合を置換する従来の試みはすべて部分的な解決にすぎ
ない。完全に満足ゆくプロフィールの特性を有するリン
酸ジエステル置換は１つもない。本発明者らはある化合
物が満たすかどうかの、アンチセンス、抗ウイルスおよ
び三重鎖機能のような優れた機能をもたらすような化学
的、生化学的および構造的基準のリストを作成した。結
合は、１）リン酸ジエステルと同型の構造（同数の電子
をもち、電子配置が同じ）;2）ヌクレアーゼ耐性;3）生
理学的pHにおいて帯電していない;4）アラキル;5）生理
学的条件下で化学的に安定;6）合成的に容易である；そ
して７）分析可能であるべきである。

本発明者らはこれらの基準をすべて満たす少なくとも
１つの新規な硫黄中心の結合を有する化合物を開発し
た。これらの結合はスルファメートエステルである。概
念上、これらはリン酸ジエステルと等電子配置であり、
そして同数の電子をもつスルフェートジエステルから由
来するものである。架橋酸素の何れかを窒素と置換する
ことによりスルファメートエステルが得られる。本発明
者らは合成的に容易であり、化学的耐性、ヌクレアーゼ
耐性があり、そして二重鎖形成をサポートすることので
きるヌクレオチド間スルファメート結合を見い出した。

本発明の新規な化合物は式 （式中、ＡはＨ、OH、OR₈、OQまたはハロゲンであり、 Ｂは天然由来の核酸塩基または合成的に修飾された核
酸塩基であり、 ＹはRNまたはＯであり、 ＺはR₇NまたはＯであり、 ＭはＳ（＝Ｏ）＝Ｏ、Ｐ（＝Ｏ）−O^-、Ｐ（＝Ｏ）−
S^-、Ｐ（＝Ｓ）−S^-、Ｐ（＝Ｏ）−OR₃、Ｐ（＝Ｏ）−R
₉、Ｐ（＝Ｏ）−SR₄またはＰ（＝Ｏ）−NR₅R₆（ただ
し、少なくとも１個のＭはＳ（＝Ｏ）＝Ｏであり、そし
てＭがＳ（＝Ｏ）＝Ｏである時、ＹおよびＺのうち１個
だけがＯである）であり、 ｎは１またはそれより大きいものであり、 ＲはＨまたはアルキルであり、 R₁はH₂PO₃、H₃P₂O₅、H₄P₃O₇およびこれらの適当な
塩、Ｈまたは保護基であり、 R₂はH₂PO₃、H₃P₂O₅、H₄P₃O₇およびこれらの適当な
塩、Ｈまたは保護基であり、 R₃はアルキルまたはシアノエチルであり、 R₄はＨまたはアルキルであり、 R₅はＨまたはアルキルであり、 R₆はＨまたはアルキルであり、 R₇はＨまたはアルキルであり、 R₈はアルキルであり、 R₉はアルキルまたはシアノエチルであり、そしてＱは
保護基である） により表わされる。

塩基（Ｂ）に関する限り、根本的な制限は考えられな
い。天然由来のヌクレオチド塩基だけでなく合成的に修
飾された核酸塩基例えばイノシン、デアザアデノシンな
ども含まれる。好ましくはＢは天然由来のヌクレオチド
塩基のアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウ
ラシルである（参考文献30、33）。＝ 糖に関しては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌク
レオチドおよびジデオキシリボヌクレオチドはすべて可
能である。ハロゲン置換（Ａはハロゲンである）を有
し、糖配置の変化した糖（例えばアラビノシドおよびα
−リボシド）もまた企画されうる（参考文献30）。

上記化合物において、ｎは少なくとも１であるが、ｎ
が200までのものは標準的な方法により入手しうる。ｎ
が200より大きい化合物は連結技術により製造されう
る。

ヌクレオチド間結合（Ｍ）に関しては、本発明者らは
たった１つの硫黄ベース結合を有する化合物の製造およ
び完全置換化合物の製造を証明した。本発明の少なくと
も１つの硫黄ベース結合が実質的に化合物の少なくとも
１つの末端の近くである化合物は特に有用であることが
予想される。このような化合物は実質的にエキソヌクレ
アーゼ活性から保護されるであろう。硫黄ベース結合で
完全に置換されていない化合物はＭで定義づけられるよ
うな結合（DNA、RNAおよび当業者に公知の合成的に修飾
されたヌクレオチドにおいて見い出されるようなもの）
を含有する。リンベース結合の部分的な置換をある程度
有する物質が本発明者らが開発した方法により入手しう
ることは理解されよう。その上、混合リボース構造（例
えばリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの両
方を含有する一重鎖）を有する化合物を製造することが
できる。

Ｒ置換基がアルキルの場合、５以下の炭素原子からな
るアルキルが有用であると予想される。

さらに、二重鎖の安定化、架橋またはターゲット配列
の切断のために、あるいは輸送を容易にするために本発
明の化合物に化学的付加物を付着させてもよい（上文参
照。参考文献５〜９、31）。

リン酸ジエステル結合とは違って、スルファメートは
方向性を有する。この結合は化合物末端に関して２方向
のうち１方向に配向されうる。この２つの形態は窒素が
結合している硫黄の３′側または５′側にあるかどうか
で３′−NSOまたは５′−NSOと称される。

（合成） 概念上、２個の置換基をもつスルファメートはヒドロ
キシ化合物とスルファモイル−Ｘ（ここでＸは適当な脱
離基である）の反応（スキーム１）またはアミノ化合物
とアルコキシスルホニル−Ｘの反応（スキーム２）によ
り製造することができる。一般に、脱離基（Ｘ）は容易
に置換されるような基（例えばハライド、アジド、スル
ホネートなど）である。還元硫黄試薬（例えばスルフィ
ニル基）との等量反応次いで酸化という方法もまた企画
されうる。

これらのルートの何れも、本出願の主題であるスルフ
ァメートの結合したオリゴヌクレオチド誘導体の製造の
ためには実行可能なものである。本発明者らは特に有効
なスキーム１の一態様を見い出した。この方法におい
て、５′−Ｎ−（Ｘ−スルホニル）−５′−アミノ−
５′−デオキシヌクレオシド中間体をヒドロキシ含有の
ヌクレオシドまたはヒドロキシ含有のオリゴヌクレオチ
ドと反応させると３′−NSOスルファメート結合誘導体
が得られる。

この方法において、Ｘは適当な脱離基例えばハライ
ド、スルホネートまたはアジド基であり、好ましくはア
ジド基である。同様にして、５′−NSOスルファメート
結合誘導体は３′−Ｎ−（Ｘ−スルホニル）−３′−ア
ミノ−３′−デオキシヌクレオシドをヒドロキシ含有の
ヌクレオシドまたはヒドロキシ含有のオリゴヌクレオチ
ドと反応させることによって製造することができる。

これらの方法は一般に塩基の存在下で行なうことがで
きるが、金属イオンで容易にすることもまたできる。

これらの方法において鍵となる中間体であるＮ−（Ｘ
−スルホニル）−アミノ−デオキシヌクレシドは好都合
には適当なアミノ−デオキシヌクレオシドと二官能性ス
ルホン化剤Ｘ−SO₂−Ｘ′の反応によって製造すること
ができる。例えば、Ｘ＝アジドの場合、Ｎ−（アジドス
ルホニル）−アミノ−デオキシヌクレオシドはアミノ−
デオキシヌクレオシドをアジドスルホニルクロライドと
反応させることにより製造される。

これらのＮ−（Ｘ−スルホニル）−アミノ−デオキシ
ヌクレオシド中間体はまたアミノ含有ヌクレオシドまた
はアミノ含有オリゴヌクレオシドと反応して本出願の主
題でもあるスルファミドの結合したオリゴヌクレオチド
誘導体を与えることができる。

本発明の中間体は式 （式中、ＡはＨ、OH、OR₂、OQまたはハロゲンであり、 Ｂは天然由来の核酸塩基または合成的に修飾された核
酸塩基であり、 ＹはRNまたはＯであり、 ＺはR₁NまたはＯであり、 Ｘは適当な脱離基であり、 Ｑは保護基であり、 ＲはＨまたはアルキルであり、 R₁はＨまたはアルキルであり、そして R₂はアルキルまたは である）を有する化合物である。

本発明のスルファメート結合をより大きな化合物に挿
入するための計画は所望する置換の程度に依存する。単
一の部位またはほんの少しの部位における導入の場合、
ブロック−ダイマー（block−dimer）アプローチが好ま
しい。このアプローチにおいては、ヌクレオシドホスホ
ラミジット（phosphoramidites）による単ヌクレオチド
の段階的な添加（３′から５′へ成長）に基づく自動オ
リゴヌクレオチド合成の標準的な化学技術が採用される
（参考文献39）。合成の所定の点において、通常の試薬
のかわりに、本発明のブロック−ダイマーのホスホラミ
ジット、５′−ジメトキシトリチルで保護されたスルフ
ァメート結合ジヌクレオシド３′−ホスホラミジットが
使用される。このことはスルファメートの結合した２種
のヌクレオチドの、成長鎖の５′−末端への付加をもた
らす。本発明のブロックマルチマー（block multi−me
r）によりｎ回連続したスルファメート結合が導入され
る。

本発明のブロックマルチマーのホスホラミジット化合
物は式 （式中、ＡはＨ、OH、OR₄、OQまたはハロゲンであり、 Ｂは天然由来の核酸塩基または合成的に修飾された核
酸塩基であり、 ｎは少なくとも１であり、 R₁はアルキルであり、 R₂はジアルキルアミノ、モルホリノ、ピペリジノまた
はピロリドノであり、 R₃はアルキルであり、 R₄はアルキルであり、 ＹはRNまたはＯであり、 ＺはRNまたはＯであり、 ＲはＨまたはアルキルであり、 Ｑは保護基であり、そして Ｖは保護基である） で表わされる。

５以下の炭素原子からなるアルキルを有するＲ、R₁、
R₃およびR₄置換基が有用であると予想される。

Ｖは塩基性条件下で開裂することのできる保護基例え
ばシアノエチルおよびメチルである。

本発明のすべての化合物において、Ｑはアルキルある
いはアシル、トリアルキルシリル、シアノエチルまたは
テトラヒドロピランから選択される保護基である。

Ａ置換基が酸素を含む場合、３つのレベルの保護を想
到することができる。第１のケースとして、保護基Ｑは
Ｖに関するものと同じような条件下で切断を受けやすい
であろう。第２の可能性は安定性の理由からＶを除去す
るために使用される脱保護条件に対してＱを安定にする
ことである。最後のケースはＱはまったく除去されな
い、例えばアルキル基であろう。

スルファメート結合の安定性の問題は本アプローチに
おいて重要なものである。第１に、この結合は以下のサ
イクリング条件すなわち、１）適当な強酸を用いての
５′−トリチル基の除去、２）テトラゾール活性化ホス
ホラミジットとのカップリングおよび３）塩基性条件下
におけるヨウ素を用いての酸化の繰り返しの処理に耐え
うるものでなければならない。本発明者らはこれらの条
件下の繰り返しの処理に完全に安定なヌクレオチド結合
を見い出した。第２に、この結合は樹脂から新生オリゴ
ヌクレオチドを切断するのに、そしてヌクレオチド塩基
から保護基を除去するのに要求される条件に耐えうるも
のでなければならない。塩基の保護は一般にアシル化
（Ｃ、Ａについてはベンゾイル化、Ｇについてはイソブ
チリル化）により環の外にあるアミノ基をブロックする
ことを含む。樹脂からの切断および塩基−脱保護は両方
とも一般に濃アンモニア水で処理することにより行なわ
れる。樹脂からの切断は室温で急速に起こるが、完全な
塩基の脱保護には高められた温度におけるより長期の処
理が必要とされる。スルファメート結合はこの濃アンモ
ニア水を用いての長期の処理に対して完全に耐性があ
る。

ブロックダイマーアプローチを使用して、１〜多数の
スルファメート結合を有する化合物のオリゴヌクレオチ
ド類似体を製造することができる。（３′−末端におけ
る）最初の結合がスルファメートではなく、そして連続
のスルファメートを導入することができないということ
が唯一の制限である（これらの制限はそれぞれ、樹脂の
結合したスルファメートブロックダイマーを出発物質と
して使用することにより、またはブロックマルチマーの
使用により克服しうる）。

すべてのヌクレオチド間結合がスルファメートで置換
されうる化合物の合成のため、異なった計画が採用され
る。ここでは段階的な合成が好ましい。合成は５′−
３′方向に単一のヌクレオチドユニットを一度に加える
ことにより行なわれる。３′−位の保護された５′−ア
ジドスルホンアミドモノマーはその場で活性化され、成
長オリゴヌクレオチドの３′−ヒドロキシルに加えられ
る。

鎖合成のこの方向は通常の自動オリゴデオキシヌクレ
オチド合成において採用されるものの逆である。したが
ってこの２つの方法はわずかに両立できない。しかしな
がら、所望によりスルファメートまたはリン酸ジエステ
ルの何れかを加えることのできるサイクルを考えること
は可能である。例えば、５′−位の保護された３′−ア
ジドスルホンアミドモノマーを用いてスルファメート結
合を所望の点に取り入れることが可能である。これは伸
長方向が３′から５′であることの結果であり、同じ方
向がホスホラミジット伸長において使用される。

一般に、活性化モノマーアプローチは、ａ）すべての
可能な配列をアドレスすることができること；および
ｂ）16の試薬と対照して必要なのはわずか４つである、
という点でブロックダイマーアプローチより優れてい
る。

（実用性） 本発明の化合物はこれらの化合物が他の系におけるア
ンチセンス機能と相互関係があることがわかっている物
理的特性を実質的に示しているようにアンチセンス試剤
としての用途（すなわち治療上の）を見い出せる。同様
に、本発明者らは、これらの試薬が三重鎖ターゲッティ
ング用途において機能することができると予想してい
る。

他の可能な治療用途がある。例えば、２′,5′−オリ
ゴアデノシンのスルファメート類似体は抗ウイルス特性
を示すことが予想されうる（参考文献26）。

スルファメートの置換されたオリゴデオキシヌクレオ
チドが他の類似体で観察されるものと同じ非連続の特異
的抗ウイルス効能を幾らか示すことが予想されうる（参
考文献18、19）。

研究分野においても多くの潜在的な用途がある。スル
ファメート結合系はハイブリッド形成プローブとして、
突然変異誘発のための試薬として、そして蛋白質／核酸
相互作用の研究のための構造類似体として有用でありう
る。スルファメート結合置換は触媒RNA系に取り込まれ
る場合に有用な特性を与えることができる（参考文献3
5）。

ＭがＳ（＝０）＝０であり、そしてＹおよびＺの両方
がＯであるオリゴヌクレオチド類似体化合物についても
同様の実用性が予想される。

（二重鎖形成） アンチセンス試剤として機能するために、本発明の化
合物は相補的配列を認識する（ハイブリッド形成、アニ
ーリング、二重鎖形成）能力を維持しなければならな
い。短鎖のオリゴヌクレオシドに関しては、これは二重
鎖形成を伴なうUV吸収の変化を観察することにより容易
にアッセイされうる。一般に、260nmにおける吸収は温
度の関数として測定される。

二重鎖形成における単一のリン酸ジエステル結合をス
ルファメートと置換する効果を研究するために、それぞ
れ単一のスルファメート結合を有する一対の修飾された
相補的18−マーをその対応する対の非修飾の18−マーと
比較した。この２つの対はわずかに同一の融解曲線（滑
らかなＳ−曲線）を示し、修飾対の曲線がほんの少し低
温側に移動している。吸収変化の程度が同一で、曲線の
形が殆んど同一であることは二重鎖がスルファメート結
合により殆んど動じず、そして単一のドメイン融解が起
こることを示唆している。転移温度がわずかに低いこと
は、これらの条件下で修飾された二重鎖がその非修飾の
ものよりわずかに安定性が低いことを示している。

すべてのスルファメート結合を有するＴ−ホモポリマ
ーの短鎖のdAホモポリマー（リン酸ジエステルを有す
る）へのアリーニングを明らかにするための試みは不成
功であった。このことは幾分困惑させるが、同じ現象が
カルバメートおよびメチルホスホネートで観察された：
オリゴTs（およびUs）はあまり、またはまったくポリＡ
にアニーリングしないが、他の塩基を有する配列はよく
アニーリングする（参考文献17、20）。このことは結合
が帯電していない場合のオリゴTsの特有性かもしれな
い。

スルファメートの結合したアデノシンダイマーのポリ
Ｕへのアニーリングが明らかにされている。ここで、そ
の相互作用は非常に強く、転移温度はその対応する非修
飾のアデノシンダイマーより数10゜高かった。

（ヌクレアーゼ耐性） インビボでの安定性のためには、アンチセンス試剤は
段階的な様式で何れかの末端から消化するエキソヌクレ
アーゼと鎖の真ん中で開裂するエンドヌクレアーゼに対
して耐性があることが望ましい。

エキソヌクレアーゼ耐性を試験するために、単一のス
ルファメート結合を有する本発明の化合物を幾つかエキ
ソヌクレアーゼ、ヘビ毒ホスホジエステラーゼおよびア
ルカリ性ホスファターゼ（分析を容易にするため）の混
合物での長期の処置に付した。それぞれの場合におい
て、スルファメート結合は完全にその構成要素のヌクレ
オシドに消化された化合物の残りと一緒に（二量体とし
て）そのまま再生した。

エンドヌクレアーゼ耐性はNsi 1制限エンドヌクレア
ーゼ認識配列を含む短鎖の二重鎖オリゴマーの切断を調
べることによって試験した。このエンドヌクレアーゼは
通常、互い違いの様式でその認識配列内で両方の鎖を切
断する。何れかの、または両方の鎖中の切断部位におけ
るリン酸ジエステル結合の置換は変化した鎖中の切断に
対する耐性を付与した。

実施例 実施例１ N₆−ベンゾイル−３′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル
−５′−スルファモイルアジド−２′,5′−ジデオキシ
アデノシンの製造 100mlの無水ジメチルホルムアミド（DMF）中における
8.9g（24ミリモル）の５′−アジド−N₆−ベンゾイル−
２′,5′−ジデオキシアデノシン（参考文献36の記載に
従って製造することができる）、5.4g（35ミリモル）の
ｔ−ブチルジメチルシリルクロライドおよび3.3g（48ミ
リモル）のイミダゾールの混合物を室温（RT）で20時間
撹拌した。溶媒を真空下で除去し、その残留物を半飽和
ブラインおよびEtOAc（２×200ml）に分配した。合一し
た有機相をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥
し、そして蒸発させた。20〜40％のEtOAc/DCMを用いる
シリカ〔EMサイエンス社製シリカゲル（240〜400メッシ
ュ）〕上におけるクロマトグラフィーによる精製により
11.1gの５′−アジド−N₆−ベンゾイル−３′−Ｏ−ｔ
−ブチルジメチルシリル−２′,5′−ジデオキシアデノ
シンを白色の泡状物として得た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ11.25（br,1H）,8.78（s,1
H）,8.71（s,1H）,8.05（m,2H）,7.5−7.7（m,3H）,6.5
2（t,1H,J＝7Hz）,4.72（m,1H）,4.02（m,1H）,3.67（d
d,1H,J＝13,7Hz）,3.56（dd,1H,J＝13,5Hz）,3.09（m,1
H）,2.43（m,1H）,0.92（s,9H）,0.14（s,6H）。

69mlのエタノールおよび3.0mlの酢酸中における5.08g
（10.4ミリモル）の５′−アジド−N₆−ベンゾイル−
３′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−２′,5′−ジデ
オキシアデノシンおよび2.1gの10％Pd/Cの混合物を１気
圧の水素下で４時間撹拌した。スラリーをメタノールで
洗浄しながらセライトを通して濾過した。ｐ−トルエン
スルホン酸一水和物（1.97g,10.4ミリモル）を加え、混
合物を撹拌して溶解した。溶液を蒸発させ、得られた固
形物をシリカ上でクロマトグラフィー処理（１〜12％メ
タノール/DCM）して4.63gの５′−アミノ−N₆−ベンゾ
イル−３′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−２′,5′
−ジデオキシアデンシン,p−トルエンスルホネート塩を
得た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ8.76（s,1H）,8.74（s,1
H）,8.05（d,2H,J＝8Hz）,7.67（t,1H,J＝8Hz）,7.57
（t,2H,J＝8Hz）,7.48（d,2H,J＝8Hz）,7.11（d,2H,J＝
8Hz）,6.53（t,1H,J＝7Hz）,4.68（m,1H）,4.01（m,1
H）,3.06（m,2H）,2.56（m,1H）,2.39（m,1H）,2.29
（s,3H）,0.93（s,9H）,0.15（s,6H）。

10mlの無水アセトニトリルおよび20mlの無水DCM中に
おける4.24g（6.88ミリモル）の５′−アミノ−N₆−ベ
ンゾイル−３′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−
２′,5′−ジデオキシアデノシンおよび４Åのモレキュ
ラーシーブス（〜5g）の混合物を窒素下で２時間撹拌し
た。0.93ml（6.68ミリモル）のトリエチルアミンを加え
た後、混合物を５分間撹拌し、そして0.42mlのクロロス
ルホニルアジド（1M/アセトニトリル）を加えた。反応
混合物を１時間撹拌した後、スラリーを濾過し、濾液を
水およびEtOAc（２×100ml）に分配した。合一した有機
相をブラインで洗浄し、乾燥しそして蒸発させた。シリ
カ上におけるクロマトグラフィー（１〜３％MeCH/DCM）
による精製により0.89gのN₆−ベンゾイル−３′−Ｏ−
ｔ−ブチルジメチルシリル−５′−スルファモイルアジ
ド−２′,5′−ジデオキシアデノシンを白色の泡状物と
して得た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ11.22（br,1H）,9.28（br,
1H）,8.75（s,1H）,8.05（d,2H,J＝8Hz）,7.66（t,1H,J
＝8Hz）,7.56（t,2H,J＝8Hz）,6.52（t,1H,J＝8Hz）,4.
67（m,1H）,4.00（m,1H）,3.07（m,1H）,2.34（m,1H）,
0.93（s,9H）,0.15（s,6H）。IR（KBr）3400,3080,295
0,2930,2880,2860,2130,1700,1610,1585,1510,1370,117
0cm^-1。

実施例２ N₆−ベンゾイル−３′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル
−５′−スルファモイルアジド−２′,5′−ジデオキシ
シチジンの製造 12.09g（35.1ミリモル）の５′−アジド−N₆−ベンゾ
イル−２′,5′−ジデオキシシチジン（参考文献36の記
載に従って製造することができる）、7.94g（52.7ミリ
モル）のｔ−ブチルジメチルシリルクロライドおよび4.
78g（70.3ミリモル）のイミダゾールの混合物を70mlの
無水DMF中において窒素下、室温で20時間撹拌した。DMF
を真空下で除去し、得られた混合物をDCM中に溶解し、
そして直接シリカカラムにかけた。25％EtOAc/DCM溶液
を用いて、生成物をカラムから溶離した。生成物を含有
するフラクションを蒸発させて13.35gの５′−アジド−
N₆−ベンゾイル−３′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル
−２′,5′−ジデオキシシチジンを白色の泡状物として
得た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ11.32（br,1H）,8.18（d,1
H,J＝8Hz）,8.01（m,2H）,7.63（m,1H）,7.56（t,2H,J
＝7Hz）,7.39（d,1H,J＝8Hz）,6.20（t,1H,J＝7Hz）,4.
38（m,1H）,3.96（m,1H）,3.68（dd,1H,J＝13.6Hz）,3.
61（dd,1H,J＝13.5Hz）,2.30（m,1H）,0.88（s,9H）,0.
10（s,6H）。

130mlのエタノールおよび5mlの酢酸中における6.88g
（15ミリモル）の５′−アジド−N₆−ベンゾイル−３′
−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−２′,5′−ジデオキ
シシチジンおよび3.0gの10％Pd/Cの混合物を１気圧の水
素下で４時間撹拌した。スラリーをメタノールで洗浄し
ながらセライトを通して濾過した。ｐ−トルエンスルホ
ン酸一水和物（2.85g,15ミリモル）を加え、混合物を撹
拌して溶解した。溶液を蒸発させ、得られた固形物をシ
リカ上でクロマトグラフィー処理（１〜12％メタノール
/DCM）して6.32gの純粋な５′−アミノ−N₆−ベンゾイ
ル−３′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−２′,5′−
ジデオキシシチジン,p−トルエンスルホネート塩を黄か
っ色の固形物として得た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ8.31（d,1H,J＝8Hz）,8.02
（d,2H,J＝8Hz）,7.64（m,1H）,7.52（m,4H）,7.38（d,
1H,J＝8Hz）,7.12（d,2H,J＝8Hz）,6.19（t,1H,J＝6.5H
z）,4.43（m,1H）,3.97（m,1H）,3.02（m,2H）,2.30
（m,5H）,0.89（s,9H）,0.11（s,6H）。

30mlの50％無水DCM/アセトニトリル中における3.40g
（5.63ミリモル）の５′−アミノ−N₆−ベンゾイル−
３′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−２′,5′−ジデ
オキシシチジン ｐ−トルエンスルホネート塩および４
Åのモレキュラーシーブス（〜5g）の混合物を窒素下で
１時間撹拌した。０゜まで冷却した後、0.78ml（5.63ミ
リモル）のトリエチルアミンを加え、撹拌を10分間継続
した。最後に、3.9ml（3.9ミリモル）のクロロスルホニ
ルアジド（1M/アセトニトリル）を加え、冷浴を取り外
し、そして反応混合物を25時間撹拌した。スラリーを濾
過し、濾液を半飽和ブラインおよび300mlのEtOAcに分配
した。有機相をブラインで洗浄し、乾燥し、蒸発させ
た。シリカ上におけるクロマトグラフィー（１〜４％メ
タノール/DCM）による精製により２種の不純物を含む0.
99gの生成物を得た。さらにクロマトグラフィー処理す
ることにより純粋なN₆−ベンゾイル−３′−Ｏ−ｔ−ブ
チルジメチルシリル−５′−スルファモイルアジド−
２′,5′−ジデオキシシチジンを白色の泡状物として得
た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ11.27（br,1H）,9.30（br,
1H）,8.21（d,1H,J＝8Hz）,8.01（m,2H）,7.62（m,1
H）,7.50（t,2H,J＝8Hz）,7.37（d,1H,J＝8Hz）,6.17
（t,1H,J＝6.5Hz）,4.39（m,1H）,3.95（m,1H）,3.35
（m,2H）,2.27（m,2H）,0.89（s,9H）,0.10（s,6H）。

実施例３ ３′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−N₄−ｉ−ブチリ
ル−O₆−（４−ニトロフェネチル）−５′−スルファモ
イルアジド−２′,5′−ジデオキシグアノシンの製造 参考文献37に記載の方法により、5.00g（17.5ミリモ
ル）の２′−デオキシグアノシン（Sigma社製）、63ml
の無水DCM、13mlの無水ピリジンおよび9.3ml（88ミリモ
ル）のイソブチルクロライドを用いて10.34gの粗製N₄,
（３′,5′−Ｏ）−トリ−ｉ−ブチリル−２′−デオキ
シグアノシンを得た。

10.34g（〜17ミリモル）の粗製N₄,（３′,5′−Ｏ）
−トリ−ｉ−ブチリル−２′−デオキシグアノシンを70
mlの無水DCM中に窒素下で溶解した後、8.91g（34ミリモ
ル）のトリフェニルホスフィンおよび5.68g（34ミリモ
ル）の４−ニトロフェネチルアルコールを加え、撹拌し
ながら溶解した。０℃まで冷却した後、5.3ml（34ミリ
モル）のジエチルジアゾジカルボキシレートを５分間に
わたって加えた。冷浴を取り外し、反応混合物を18時間
撹拌した。反応混合物のTLC（10％メタノール/DCM）は
まだ出発物質が幾らか存在していることを示した。トリ
フェニルホスフィン（4.45g）、４−ニトロフェネチル
アルコール（5.30g）およびジエチルジアゾジカルボキ
シレート（2.65ml）を逐次的に加え、混合物をさらに１
時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、その残留物を次の反応
に直接使用した。サンプルをシリカ上におけるクロマト
グラフィー（１〜５％メタノール/DCM）により精製して
N₄,（３′,5′−Ｏ）−トリ−ｉ−ブチリル−O₆−（４
−ニトロフェネチル）−２′−デオキシグアノシンを白
色の泡状物として得た。

NMR（300MHz,CDCl₃）δ8.17（d,2H,J＝8Hz）,8.07（b
r,1H）,7.97（s,1H）,7.53（d,2H,J＝8Hz）,6.36（dd,1
H,J＝7,6Hz）,5.43（m,1H）,4.84（t,2H,J＝7Hz）,4.54
（dd,1H,J＝12,5Hz）,4.39（m,2H）,3.33（t,2H,J＝7H
z）,2.5−3.1（m,5H）,1.39（d,6H,J＝7Hz）,1.32（d,6
H,J＝7Hz）,1.26（d,3H,J＝7Hz）,1.24（d,3H,J＝7H
z）。

粗製N₄,（３′,5′−Ｏ）−トリ−ｉ−ブチリル−O₆
−（４−ニトロフェネチル）−２′−デオキシグアノシ
ン（〜17ミリモル）を400mlのメタノール中に溶解し、4
00mlの27％水酸化アンモニウムを加えた。混合物がくも
ったのでメタノール（100ml）を加えて反応を均一にし
た。室温で20時間撹拌した後、溶媒を蒸発させ、その残
留物を100mlのDCMに取った。ヘキサンを十分に加えたと
ころ溶液がくもった。一晩放置した後、明るい黄色の結
晶を集めて5.83gのN₄−ｉ−ブチリル−O₆−（４−ニト
ロフェネチル）−２′−デオキシグアノシンを得た。二
度目の結晶化により追加の物質が得られ、全部で8.60g
のN₄−ｉ−ブチリル−O₆−（４−ニトロフェネチル）−
２′−デオキシグアノシンとなった。

NMR（300MHz,20％d₄−メタノール/CDCl₃）δ8.18（d,
2H,J＝9Hz）,8Z17（s,1H）,7.57（d,2H,J＝9Hz）,6.38
（t,1H,J＝7Hz）,4.84（t,2H,J＝7Hz）,4.72（m,1H）,
4.07（q,1H,J＝4Hz）,3.83（ddd,2H,J＝33,12,4Hz）,3.
33（t,2H,J＝7Hz）,2.75−2.9（m,2H）,2.44（ddd,1H,J
＝14,7,4Hz）,1.37（d,6H,J＝8Hz）。

75mlの無水ピリジン中における7.28g（14.9ミリモ
ル）のN₄−ｉ−ブチリル−O₆−（４−ニトロフェネチ
ル）−２′−デオキシグアノシンの溶液を窒素下で０℃
まで冷却した。2.84g（14.9ミリモル）のｐ−トルエン
スルホニルクロライドを加えた後、反応混合物を０℃で
２時間、次いで５℃で18時間撹拌した。ピリジンを蒸発
させ、残留物を水およびEtOAcに分配した。有機相をブ
ラインで洗浄し、乾燥し、そして蒸発させて6.22gを得
た。シリカ上におけるクロマトグラフィー（１〜５％メ
タノール/DCM）による精製により4.08gのN₄−ｉ−ブチ
リル−O₆−（４−ニトロフェネチル）−５′−Ｏ−ｐ−
トルエンスルホニル−２′−デオキシグアノシンを白色
の泡状物として得た。

（300MHz,20％d₄−DMSO）δ10.34（br,H）,8.24（s,1
H）,8.19（d,2H,J＝8Hz）,7.67（d,2H,J＝8Hz）,7.61
（d,2H,J＝8Hz）,7.22（d,2H,J＝8Hz）,6.38（t,1H,J＝
7Hz）,5.46（d,1H,J＝5Hz）,4.82（t,2H,J＝7Hz）,4.64
（m,1H）,4.33（ddd,2H,J＝26,12,8Hz）,3.97（m,1H）,
3.35（t,2H,J＝7Hz）,2.82（m,2H）,2.27（s,3H）,1.12
（d,3H,J＝7Hz）,1.10（d,3H,J＝7Hz）。

21mlの無水DFM中における4.08g（6.35ミリモル）のN₄
−ｉ−ブチリル−O₆−（４−ニトロフェネチル）−５′
−Ｏ−ｔ−トルエンスルホニル−２′−デオキシグアノ
シンおよび467ml（9.52ミリモル）のリチウムアジド（K
odak社製）の溶液を100℃まで３時間加熱した。溶媒を
真空下で除去した。残留物を水およびEtOAcに分配し
た。有機相をブラインで洗浄し、乾燥しそして蒸発させ
て3.95gの粗生成物を得た。シリカ上におけるクロマト
グラフィー（１〜10％ メタノール/DCM）による精製に
より、極性の少ない物質が1.47gと極性の多い物質が419
mg得られた。極性の少ない物質の方は白色の泡状物で
５′−アジド−N₄−ｉ−ブチリル−O₆−（４−ニトロフ
ェネチル）−２′,5′−ジデオキシグアノシンであるこ
とがわかった。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ10.40（br,1H）,8.41（s,1
H）,8.18（d,2H,J＝8Hz）,7.64（d,2H,J＝8Hz）,6.37
（t,1H,J＝7Hz）,5.46（d,1H,J＝4Hz）,4.79（t,2H,J＝
7Hz）,4.63（m,1H）,3.97（m,1H）,3.86（dd,1H,13,8H
z）,3.53（dd,1H,J＝13.5Hz）,3.36（t,2H,J＝7Hz）,3.
05（m,1H）,2.84（m,1H）,2.28（ddd,1H,J＝14,6,3H
z）,1.12（d,6H,J＝8Hz）。

５′−アジド−N₆−ベンゾイル−３′−Ｏ−ｔ−ブチ
ルジメチルシリル−２′,5′−ジデオキシシチジンと同
様にして、1.47g（2.87ミリモル）の５′−アジド−N₄
−ｉ−ブチリル−O₆−（４−ニトロフェネチル）−
２′,5′−ジデオキシグアノシン、0.65g（4.3ミリモ
ル）のｔ−ブチルジメチルシリルクロライド、0.39g
（5.7ミリモル）のイミダゾールおよび10mlの無水DMFを
使用して、シリカ上におけるクロマトグラフィー処理
（10％ EtOAc/DCM）の後1.49gの５′−アジド−３′−
Ｏ−ｔ−ブチルメチルシリル−N₄−ｉ−ブチリル−O₆−
（４−ニトロフェネチル）−２′,5′−ジデオキシグア
ノシンを白色の泡状物として得た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ10.40（br,1H）,8.40（s,1
H）,8.18（d,2H,J＝9Hz）,7.65（d,2H,J＝9Hz）,6.35
（t,1H,J＝7Hz）,4.78（t,2H,J＝7Hz）,4.73（m,1H）,
3,94（m,1H）,3.84（dd,1H,J＝13,8Hz）,3.56（dd,1H,J
＝13,5Hz）,3.31（t,2H,J＝7Hz）,3.10（m,1H）,2.82
（m,1H）,2.29（m,1H）,1.10（d,6H,J＝7Hz）,0.89（s,
9H）,0.14（s,3H）,0.12（s,3H）。

100mg（0.159ミリモル）の５′−アジド−３′−Ｏ−
ｔ−ブチルジメチルシリル−N₄−ｉ−ブチリル−O₆−
（４−ニトロフェネチル）−２′,5′−ジデオキシグア
ノシン、0.064ml（0.64ミリモル）の1,3−プロパンジチ
オール、0.089ml（0.64ミリモル）のトリエチルアミン
および1mlのメタノールの混合物を窒素下、室温で４日
間撹拌した。0.5mlの酢酸を加えた後、反応混合物を真
空下で濃縮した。シリカ上におけるクロマトグラフィー
（１〜15％メタノール/DCM）による精製により121mgの
酢酸塩の生成物を得た。この物質を飽和炭酸カリウムお
よびEtOAcに分配した。有機相を乾燥し、蒸発させて91m
gの５′−アミノ−３′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリ
ル−N₄−ｉ−ブチリル−O₆−（４−ニトロフェネチル）
−２′,5′−ジデオキシグアノシンを得た。

NMR（300MHz,CDCl₃）δ8.17（d,2H,J＝8Hz）,7.98
（s,1H）,7.90（br,1H）,7.52（d,2H,J＝8Hz）,6.28
（t,1H,J＝7Hz）,4.80（t,2H,J＝7Hz）,4.71（m,1H）,
3.93（q,1H,J＝4Hz）,3.32（t,2H,J＝7Hz）,3.04（dd,1
H,J＝14,4Hz）,2.93（dd,1H,J＝14,6Hz）,2.84（m,1
H）,2.39（m,1H）,1.28（d,6H,J＝7Hz）,0.93（s,9H）,
0.13（s,3H）,0.11（s,3H）。

2mlの無水DCM中における90mg（0.15ミリモル）の５′
−アミド−３′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−N₄−
ｉ−ブチリル−O₆−（４−ニトロフェネチル）−２′,
5′−ジデオキシグアノシンの溶液を窒素下、室温で0.1
1mlのクロロスルホニルアジド（1M/アセトニトリル）を
加えながら撹拌した。１時間撹拌した後、溶液を半飽和
ブラインおよびEtOAcに分配した。有機相をブラインで
洗浄し、乾燥し、そして蒸発させた。残留物をシリカ上
におけるクロマトグラフィー（１〜３％メタノール/DC
M）により精製して18mgの３′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチ
ルシリル−N₄−ｉ−ブチリル−O₆−（４−ニトロフェニ
チル）−５′−スルファモイルアジド−２′,5′−ジデ
オキシグアノシンを得た。

NMR（300MHz,CDCl₃）δ8.67（br,1H）,8.46（t,1H,J
＝6Hz）,8.16（d,2H,J＝8H）,7.81（s,1H）,7.54（d,2
H,J＝8Hz）,6.17（dd,1H,J＝8,6Hz）,4.87（m,3H）,4.1
7（m,1H）,3.57（m,1H）,3.34（t,2H,J＝7Hz）,2.98
（m,1H）,2.65（m,1H）,2.25（m,1H）,1.27（d,3H,J＝7
Hz）,1.26（d,3H,J＝7Hz）,0.93（s,9H）,0.16（s,3
H）,0.14（s,3H）。

実施例４ ３′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５′−スルファ
モイルアジド−５′−デオキシチミジンの製造 190mlの無水DMF中における25.0g（93.6ミリモル）の
５′−アジド−５′−デオキシチミジン（参考文献36の
記載に従って製造することができる）、21.1g（140ミリ
モル）のｔ−ブチルジメチルシリルクロライドおよび1
2.7g（187ミリモル）のイミダゾールの溶液を窒素下、
室温で18時間撹拌した。DMFを真空下で除去した。油状
物をエーテル（500ml）および1N NaOH（２×300ml）に
分配した。水相を氷で冷却し、650mlの1N HClを加え
た。生成物をEtOAc（２×750ml）で抽出し、そして有機
相をブラインで洗浄し、乾燥し、蒸発させた。高真空下
に24時間放置すると、油状物が結晶化して27.9gの５′
−アジド−３′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５′
−デオキシチミジンを白色の固形物を得た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ11.34（br,1H）,7.50（s,1
H）,6.16（t,1H,J＝7Hz）,4.36（m,1H）,3.84（m,1H）,
3.55（m,2H）,2.34（m,1H）,2.05（m,1H）,1.79（s,3
H）,0.86（s,9H）,0.08（s,6H）。

200mlのEtOAc中における15.0g（39.3ミリモル）の
５′−アジド−３′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−
５′−デオキシチミジンおよび4.0gの10％Pd/Cの混合物
を１気圧の水素下で4.5時間激しく撹拌した。スラリー
をメタノールで洗浄しながらセライトを通して濾過し
た。濾液を蒸発させて15.5gの濃厚な油状物（溶媒を幾
らか含む）を得た。サンプルをシリカ上におけるクロマ
トグラフィー（２〜10％メタノール/DCM）により精製し
て純粋な５′−アミノ−３′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチル
シリル−５′−デオキシチミジンを白色の固形物として
得た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ7.64（s,1H）,6.13（dd,1
H,J＝8,6Hz）,4.37（m,1H）,3.65（m,1H）,2.78（m,2
H）,2.21（m,1H）,2.01（ddd,1H,J＝12,6,4Hz）,1.79
（s,3H）,0.89（s,9H）,0.08（s,6H）。

150mlのヘキサメチルジキシラザン（HMDS）中におけ
る5.52gの５′−アミノ−３′−Ｏ−ｔ−ブチルジメチ
ルシリル−５′−デオキシチミジンおよび168mgの硫酸
アンモニウムの混合物を窒素下で加熱して溶解した。室
温で18時間撹拌した後、スラリーを２時間80℃まで加熱
した。HMDSを真空下で除去して濃厚な油状物を得、これ
を窒素下で45mlの無水アセトニトリル中に溶解した。こ
の溶液を滴下ロートに加え、前もって０℃まで冷却され
た10mlのクロロスルホニルアジド（1M/アセトニトリ
ル）に25分間かけて滴下した。添加後、冷浴を取り外
し、混合物を１時間撹拌した。反応混合物を200mlの半
飽和ブラインに注ぎ込み、EtOAc（２×200ml）で抽出し
た。合一した有機相をブラインで洗浄し、乾燥し、そし
て蒸発させて5.29gの固形物を得た。シリカ上における
クロマトグラフィー（１〜５％メタノール/DCM）による
精製により3.70gのかなり純粋な３′−Ｏ−ｔ−ブチル
ジメチルシリル−５′−スルファモイルジアジド−５′
−デオキシチミジンを黄かっ色の泡状物として得た。

NMR（300MHz,CDCl₃）δ8.57（br,1H）,7.02（s,1H）,
6.88（br,1H）,5.75（t,1H,J＝8Hz）,4.49（m,1H）,4.0
4（m,1H）,3.48（m,2H）,2.72（m,1H）,2.18（m,1H）,
1.92（s,3H）,.89（s,9H）,.11（m,6H）。

実施例５ ３′−Ｏ−アセチル−５′−スルファモイルアジド−
５′−デオキシチミジンの製造 1.00g（3.53ミリモル）の５′−アミノ−３′−Ｏ−
アセチル−５′−デオキシチミジン（参考文献38の記載
に従って製造することができる）および94mgの硫酸アン
モニウムの混合物を20mlのHMDS中において、窒素下、室
温で18時間撹拌した。スラリーを24時間ゆるやかに加熱
（60℃）した。HMDSを−78℃でトラップ中に真空除去し
た。アセトニトリル（40ml）を窒素下で加えて均一な溶
液を得た。5.0mlのクロロスルホニルアジド（1.0M/アセ
トニトリル）を反応に加え、混合物を15時間撹拌した。
水（50ml）を加え、生成物をEtOAc（２×150ml）で抽出
した。有機相をブラインで洗浄し、乾燥し、蒸発させて
0.89gの固形物を得た。シリカ上におけるクロマトグラ
フィー（１〜５％メタノール/DCM）による精製により0.
64gの純粋な３′−Ｏ−アセチル−５′−スルファモイ
ルジアジド−５′−デオキシチミジンを泡状物として得
た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ11.40（Br,1H）,9.31（Br,
1H）,7.59（s,1H）,6.17（dd,1H,J＝7.5,6.5Hz）,5.14
（m,1H）,4.03（m,1H）,3.44（m,2H）,2.47（m,1H）,2.
25（m,1H）,2.07（s,3H）,1.80（s,3H）;IR（film）320
0,2920,2840,2135,1730,1685,1365,1240,1170cm^-1;マス
スペクトル（FAB）実測値388.98m/z,計算値（C₁₂H₁₆N₆O
₇Sとして）389.08（Ｍ＋Ｈ） 実施例６ ５′−ジメトキシトリチル−３′−スルファモイルアジ
ド−３′−デオキシチミジンの製造 25mlのエタノール中における2.17gの３′−アジド−
３′−デオキシチミジン（Aldrich社製）および0.91gの
10％Pd/Cのスラリーを１気圧の水素下で４時間激しく撹
拌した。混合物をセライトを通して濾過し、メタノール
で洗浄し、そして濾液を蒸発させた。シリカ上における
クロマトグラフィー（２〜40％メタノール/DCM）による
精製により1.72gの３′−アミノ−３′−デオキシチミ
ジンを明るい黄色の固形物として得た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ7.76（s,1H）,6.07（t,1H,
J＝6Hz）,4.97（m,1H）,3.5−3.7（m,3H）,3.39（q,1H,
J＝7Hz）,3.33（br,2H）,1.9−2.15（m,2H）,1.77（s,3
H）。

10mlのメタノール中における1.04gの３′−アミノ−
３′−デオキシチミジン、0.90mlのトリエチルアミンお
よび1.5mlのエチルトリフルオロアセテートの溶液を窒
素下、室温で20時間撹拌した。蒸発させることにより生
成物を得、これは精製することなしに使用した。サンプ
ルをシリカ上におけるカラムクロマトグラフィー（１〜
20％メタノール/DCM）に付して純粋な３′−トリフルオ
ロアセアミド−３′−デオキシチミジンを得た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ11.33（br1H）,9.84（br,1
H）,7.76（s,1H）,6.26（t,1H,J＝7Hz）,5.15（t,1H,J
＝5Hz）,4.47（m,1H）,3.89（m,1H）,3.6（m,2H）,2.27
（m,2H）,1.78（s,3H）。

ピリジン中における粗製３′−トリフルオロアセアミ
ド−３′−デオキシチミジンの溶液に1.2mlのトリエチ
ルアミン、0.10gのN,N−ジメチルアミノピリジンおよび
2.2gのジメトキシトリチルクロライドを窒素下で加え
た。18時間撹拌した後、溶媒を蒸発させた。暗色の油状
物を半飽和重炭酸塩およびEtOAcに分配した。有機相を
ブラインで洗浄し、乾燥し、そして蒸発させた。シリカ
上におけるクロマトグラフィー（１〜７％メタノール/D
CM）による精製により2.18gの純粋な５′−ジメトキシ
トリチル−３′−トリフルオロアセトアミド−３′−デ
オキシチミジンを黄色の固形物として得た。

NMR（300MHz,CDCl₃）δ8.89（br,1H）,8.31（d,1H,J
＝7Hz）,7.65（s,1H）,7.2−7.45（m,9H）,6.84（d,4H,
J＝9Hz）,6.51（t,1H,J＝7Hz）,4.72（m,1H）,4.09（m,
1H）,3.78（s,6H）,3.53（m,2H）,2.45（m,2H）,1.64
（s,3H）。

メタノール中における1.54gの５′−ジメトキシトリ
チル−３′−トリフルオロアセトアミド−３′−デオキ
シチミジンの溶液を室温でアンモニアガスで飽和した。
反応容器を４日間密閉した。溶媒を蒸発させた後、残留
物をシリカ上におけるクロマトグラフィー（１〜10％メ
タノール/DCM）により精製して1.17gの３′−アミノ−
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−デオキシチミジ
ンを得た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ7.51（s,1H）,7.2−7.45
（m,9H）,6.88（d,4H,J＝8Hz）,6.14（t,1H,J＝6Hz）,
3.74（s,6H）,3.68（m,1H）,3.50（q,1H,J＝7Hz）,3.33
（br,2H）,3.21（m,2H）,2.21（m,1H）,2.03（m,1H）,
1.47（s,3H）。

実施例４と同様にして、605mgの３′−アミノ−５′
−Ｏ−ジメトキチトリチル−３′−デオキシチミジン、
20mlのHMDS、0.78mlのクロロスルホニルアジド（1M/ア
セトニトリル）および6mlの無水アセトニトリルを使用
して（１〜５％メタノール/DCMを用いるシリカ上での精
製後）、217mgの５′−ジメトキチトリチル−３′−ス
ルファモイルアジド−３′−デオキシチミジンを明るい
オレンジ色の固形物として得た。

NMR（300MHz,CDCl₃）δ7.58（s,1H）,7.2−7.4（m,9
H）,6.85（d,4H,J＝9Hz）,6.55（t,1H,J＝7Hz）,4.31
（m,1H）,4.23（m,1H）,3.78（s,6H）,3.50（dd,1H,J＝
11,3Hz）,3.39（dd,1H,J＝11,3Hz）,2.46（m,2H）,1.47
（s,3H）。

実施例７ スルファメートの結合したダイマーｄ（AsT）の製造 7mlの乾燥アセトニトリル中における480mgの実施例４
で得られた化合物および493mgのN₆−ベンゾイル−５′
−ジメトキシトリチル−２′−デオキシアデノシン（Al
drich社製）の混合物を幾らかの４Åモレキュラーシー
ブスと一緒に２時間撹拌した。0.17mlのトリエチルアミ
ンを反応に加え、そして18時間撹拌した。混合物を濾過
し、蒸発させた。シリカ上におけるクロマトグラフィー
（１〜７％メタノール/DCM）による精製により621mgの
（DMTO）A^BzsT（OTBDMS）を白色の固体として得た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ11.33（s,1H）,11.23（br,
1H）,8.58（s,1H）,8.57（s,1H）,8.51（br,1H）,8.05
（m,2H）,7.5−7.7（m,4H）,7.34（m,2H）,7.21（m,7
H）,6.80（dd,4H,J＝8Hz）,6.52（t,1H,J＝7Hz）,6.14
（t,1H,J＝7Hz）,5.28（m,1H）,4.37（m,2H）,3.81（m,
1H）,3.71（s,6H）,3.29（m,4H）,3.14（dd,1H,J＝17,5
Hz）,2.78（m,1H）,2.26（m,1H）,2.04（m,1H）,1.77
（s,3H）,0.87（s,9H）,0.09（s,6H）。マススペクトル
（FAB）1075.47m/z（Ｍ＋Ｈ）、計算値（C₅₄H₆₂N₈O₁₂SS
i＋Ｈとして）1075.40。IR（CH₂Cl₂）3380,3180,3060,2
960,2930,2860,1695,1610,1585,1510,1360,1180,1250cm
^-1。

完全に保護されたダイマーの（DMTO）A^BzsT（OTBDM
S）を１時間間隔での４つの等しいアリコートで全部で6
mlの1Mフッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム/THF（Al
drich社製）で処理した（ここで小さなｓはスルファメ
ート結合を意味する）。最後の添加が終了した後、反応
混合物を１時間撹拌した。溶液を1Mリン酸二水素ナトリ
ウムおよび酢酸エチル（EtOAc）に分配した。有機相を
ブラインで洗浄し、乾燥し、そして蒸発させた。粗生成
物をシリカ上におけるクロマトグラフィー（１〜７％メ
タノール/DCM）処理して420mgの（DMTO）A^BzsT（OH）を
固形物として得た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）x11.31（br,1H）,11.22（br,
1H）,8.58（s,2H）,8.47（br,1H）,8.03（m,2H）,7.45
−7.7（m,4H）,7.34（m,2H）,7.20（m,7H）,6.81（dd,4
H,J＝8,5Hz）,6.52（t,1H,J＝7Hz）,6.14（t,1H,J＝H
z）,5.39（d,1H,J＝5Hz）,5.29（m,1H）,4.38（m,2H）,
4.17（m,1H）,3.80（m,1H）,3.72（s,6H）,3.3（m,4
H）,3.14（m,1H）,2.79（m,1H）,2.4（m,1H）,2.15（m,
1H）,1.76（s,3H）。IR（KBr）3400,3180,3055,2955,29
30,2830,1690,1610,1580,1510,1360,1250,1180cm^-1。マ
ススペクトル（FAB）961.66（Ｍ＋Ｈ）、計算値（C₄₈H
₄₈N₈O₁₂S＋Ｈとして）961.07。

5mlのアセトニトリル中における102mgの（DMTO）A^Bzs
T（OH）の溶液に0.22mlのジクロロ酢酸を加えた。オレ
ンジ色の溶液を室温で15分間撹拌した。反応溶液を半飽
和重炭酸塩中に注いだ後、生成物をEtOAC（２×40ml）
で抽出した。合一した有機相をブラインで洗浄し、乾燥
し、そして蒸発させた。シリカ上におけるクロマトグラ
フィー（１〜10％メタノール/DCM）による精製により68
mgの（HO）A^BzsT（OH）を得た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ11.33（br,1H）,11.26（b
r,1H）,8.77（s,1H）,8.70（s,1H）,8.47（br,1H）,8.0
6（d,2H,J＝8Hz）,7.66（t,1H,J＝8Hz）,7.59（s,1H）,
7.55（d,2H,J＝8Hz）,6.52（t,1H,J＝7Hz）,6.18（t,1
H,J＝7Hz）,5.41（d,1H,J＝5Hz）,5.32（t,1H,J＝5H
z）,5.23（m,1H）,4.25（m,1H）,4.19（m,1H）,3.82
（m,1H）,3.65（m,2H）,3.0−3.3（m,3H）,2.78（m,1
H）,2.0−2.3（m,2H）,1.79（s,3H）。IR（KBr）3420,1
690,1620,1585,1360,1175cm^-1。マススペクトル（FAB）
測定値659.23（Ｍ＋Ｈ）、計算値（C₂₇H₃₀N₈O₁₀S＋Ｈと
して）659.19。

3mlのメタノール中における31mgの（HO）A_BzsT（OH）
のスラリーを室温においてアンモニアガスで飽和した。
反応を密閉し、４時間55℃まで加熱した。溶媒を蒸発さ
せた。シリカ上におけるクロマトグラフィー（メタノー
ル/DCMグリジエント）による精製により19mgのｄ（As
T）を得た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ〔部分スペクトル〕8.34
（s,1H）,8.14（s,1H）,7.35（s,1H）,7.41（br,2H）,
6.37（dd,1H,J＝9,6Hz）,6.17（t,1H,J＝7Hz）,5.67（b
r,1H）,5.39（d,1H,J＝5Hz）,5.18（m,1H）,4.2（m,2
H）,3.81（m,1H）,3.63（m,2H）,3.19（m,1H）,3.01
（m,1H）,2.66（m,1H）,2.18（m,1H）,1.78（s,3H）。

実施例８ スルファメートエステルの結合したdA−ヌクレオシドダ
イマーｄ（AsT）の製造 0.5mlのアセトニトリル中における57mg（0.10ミリモ
ル）の実施例１で得られた化合物および65mg（0.10ミリ
モル）のN₆−ベンゾイル−５′−ジメトキシトリチル−
２′−デオキシアデノシン（Aldrich社製）の混合物を
窒素下、室温で撹拌した。0.028ml（0.2ミリモル）を加
え、反応混合物を20時間撹拌した。混合物を蒸発させ、
シリカ上において精製（１〜３％メタノール/DCM）した
後、87mgの完全に保護されたダイマーの（DMTO）A^BzsA
^Bz（OTBDMS）を得た。

NMR〔部分スペクトル〕（300MHz,d₆−DMSO）δ11.23
（br,2H）,8.66（s,1H）,8.65（s,1H）,8.58（s,1H）,
8.56（s,1H）,8.56（br,1H）,8.04（d,4H,J＝8Hz）,7.5
−7.7（m,6H）,7.15−7.35（m,9H）,6.77（dd,4H,J＝8,
6Hz）,6.53（t,1H,J＝7Hz）,6.47（t,1H,J＝7Hz）,5.27
（m,1H）,4.64（m,1H）,4.34（m,1H）,4.01（m,1H）,3.
68（s,6H）,3.02（m,1H）,2.78（m,1H）,2.36（m,1H）,
0.91（s,9H）,0.15（s,6H）。

51mgの（DMTO）A^BzsA^Bz（OTBDMS）を窒素下、１時間
間隔での３つのアリコートを全部で1.5mlの1Mフッ化テ
トラ−ｎ−ブチルアンモニウム/THFを加えて処理した。
フッ化物試薬の最後の添加の終了後、反応混合物を室温
で１時間撹拌した。反応溶液を1Mリン酸二水素ナトリウ
ムおよびEtOAcに分配した。有機相をブラインで洗浄
し、乾燥し、そして蒸発させた。シリカ上におけるカラ
ムクロマトグラフィー（１〜６％メタノール/DCM）によ
る精製により36mgの純粋な（DMTO）ｄ（A^BzsA^Bz）（O
H）を得た。

NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ11.22（br,2H）,8.67（s,1
H）,8.65（s,1H）,8.58（br,2H）,8.54（br,1H）,8.05
（d,4H,J＝7Hz）,7.5−7.7（m,6H）,7.33（m,2H）,7.2
（6,7H）,6.79（dd,4H,J＝7Hz）,6.52（t,1H,J＝7Hz）,
6.47（t,1H,J＝7Hz）,5.53（d,1H,J＝5Hz）,5.37（m,1
H）,4.45（m,1H）,4.34（m,1H）,4.01（m,1H）,3.69
（s,6H）,3.1−3.5（m,5H（est.））,2.7−2.95（m,2
H）,2.38（m,1H）。

21mgの（DMTO）（A^BzsA^Bz）（OH）を密閉容器中、室
温で３日間、3mlの飽和NH₃/MeOHで処理した。溶媒を蒸
発させ、その残留物を1mlの80％HOAc/水と一緒に室温で
45分間撹拌した。室温で真空ポンプ／回転蒸発器および
水浴を用いて溶媒を蒸発した。HPLC〔C8 Rainin 10mm×
25cmカラム（ガード付）、グラジエント＝10〜60％MeOH
/水（直線）、流速＝3.5ml/分、試料を20％MeOH/水に溶
解した。6cは21.2分で溶離した〕により純粋なｄ（As
A）が得られた。

NMR〔部分スペクトル〕（300MHz,d₄−MeOH,すべての
化学シフトは3.30のMeOHと相対的）δ8.23（s,1H）,8.2
0（s,1H）,8.19（s,1H）,8.11（s,1H）,6.37（m,2H）,
5.22（d,1H,J＝6Hz）,4.59（m,1H）,4.33（m,1H）,4.16
（dd,1H,J＝7,4Hz）,3.74（dq,2H,J＝13,3Hz）,3.47
（m,2H）,2.85−3.0（m,2H）,2.69（ddd,1H,J＝13,6,1.
5Hz）,2.37（ddd,1H,J＝13,6,3Hz）。

実施例９ リボヌクレオシドの２′−または３′−位に結合された
スルファメートを有するオリゴヌクレオチド〔（（Ph）
3CO）〔rU〕sT（OTBDMS）〕の製造 2.5mlの無水アセトニトリル中における200mgの５′−
トリチルウリジン（Sigma社製）および189mgの３′−Ｏ
−ｔ−ブチルジメチルシリル−５′−スルファモイルア
ジド−５′−デオキシチミジン（実施例４で得られたも
の）の溶液に窒素下で0.11mlのトリエチルアミンを加え
た。室温で20時間撹拌した後、溶媒を蒸発させ、そして
残留物をシリカ上におけるクロマトグラフィー（１〜７
％メタノール/DCM）により精製して81mgの主生成物をTL
C上で１点として得た。分析用HPLCは50:50混合物の生成
物を示した。分取用HPLC〔ガード付C8 10×25mmカラム
（Rainin）グラジエント:25分間にわたって80〜90％の
メタノール/0.1M重炭酸トリエチルアンモニウム、流速
＝4ml/分、サンプル:10〜15mg/注入〕により純粋な
（（Ph）3CO）〔rU〕sT（OTBDMS）（２′−位結合）お
よび純粋な（（Ph）3CO）〔rU〕sT（OTBDMS）（３′−
位結合）が得られた。

２′−位結合：保持時間＝16.61分;NMR（300MHz,d₆−
DMSO）δ11.47（br,1H）,11.34（br,1H）,8.39（br,1
H）,7.69（d,1H,J＝8Hz）,7.25−7.4（m,15H）,6.15（d
d,1H,J＝7,6Hz）,5.93（d,1H,J＝4Hz）,5.71（m,1H）,
5.49（d,1H,J＝8Hz）,5.01（m,1H）,4.42（m,1H）,4.36
（m,1H）,3.99（m,1H）,3.78（m,1H）,3.23（m,2H）,2.
25（m,1H）,2.03（m,1H）,1.77（s,3H）,0.87（s,9H）,
0.09（s,6H）。

３′−位結合：保持時間＝18.15分;NMR（300MHz,d₆−
DMSO）δ11.46（br,1H）,11.33（br,1H）,8.37（br,1
H）,7.65（d,1H,J＝9Hz）,7.35−7.5（m,16H）,6.13（d
d,1H,J＝8,6Hz）,6.07（br,1H）,5.79（d,1H,J＝6Hz）,
4.87（m,1H）,4.47（m,1H）,4.34（m,1H）,4.29（m,1
H）,3.80（m,1H）,3.1−3.4（m,7H）,2.24（m,1H）,2.0
3（m,1H）,1.76（s,1H）,0.87（s,9H）,0.08（s,6H）。

実施例10 スルファメートエステルの結合したブロックダイマーホ
スホラミジット〔（DMTO）A^BzsT（OP（OCH₂CH₂CN）Ｎ
（iPr₂））〕の製造 294mgの（DMTO）A^BzsT（OH）を3mlの乾燥DCMに溶解し
た後、116μの２−シアノエチルN,N,N′,N′−テトラ
イソプロピルホスホロジアミジット（Aldrich社製）お
よび31mgのジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド塩
（等量のテトラゾールとジイソプロピルアミンを混合す
ることにより製造した）を加え、混合物を１時間撹拌し
た。TLC（10％メタノール/DCM）によれば反応は完了し
ていなかった。さらに60μの4dおよび15mgのテトラゾ
ール塩を加え、撹拌をさらに１時間継続した。反応溶液
を半飽和重炭酸塩およびEtOAcに分配した。有機相をブ
ラインで洗浄し、乾燥し、そして蒸発させた。生成物を
シリカ上におけるクロマトグラフィー（0.5％ピリジン
とともに１〜５％メタノール/DCM）処理して452mgの準
純粋な（DMTO）A^BzsT（OP（OCH₂CH₂CN）Ｎ（iPr₂））を
得た。この物質を3mlのDCMに溶解し、これを150mlのペ
ンタンに−78℃で撹拌しながら加えた。沈殿物を濾過
し、集めた。この操作を１回繰り返した。乾燥ピリジン
（２×）、次いで乾燥トルエンから白色の固形物を蒸発
させた。（DMTO）A^BzsT（OP（OCH₂CH₂CN）Ｎ（iPr₂））
を白色の固形物として得た（さらに精製することなしに
用いた）。

³¹P NMR（300MHz,d₆−DMSO）δ151.133（ｓ）,150.59
6（ｓ）（15−21ppmにおける少量の不純物）;¹H NMR（3
00MHz,d₆−DMSO）δ11.33（br,1H）,11.21（br,1H）,8.
58（s,2H）,8.52（br,1H）,8.03（m,2H）,7.1−7.7
（ｍ）,6.80（m,4H）,6.52（t,1H,J＝7Hz）,6.15（t,1
H,J＝7Hz）,5.18（m,1H）,4.46（m,1H）,4.37（m,1H）,
3.9−4.1（ｍ）,2.88（t,2H,J＝6Hz）,2.77（q,2H,J＝6
Hz）,2.2（m,1H）,1.76（s,3H）,1.17（ｍ）。マススペ
クトル（FAB）測定値1161.76（Ｍ＋Ｈ），計算値（C₅₇H
₆₅N₁₀O₁₃PS＋Ｈとして）1161.43。

実施例11 単一のスルファメート結合を有するオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドの製造 オリゴデオキチヌクレオチド^５′ｄ（GCGTGCATGC〔As
T〕CGTACG）^３′（9c）はCODER自動DNA合成器で１ミク
ロモルスケールでＸの入口に置いた0.1Mアセトニトリル
溶液中における（実施例10で得られた）ブロックダイマ
ーホスホラミジット（（DMTO）A^BzsT（OP（OCH₂CH₂CN）
Ｎ（iPr₂）））を用いての標準的なプロトコルにより合
成した。27％水酸化アンモニウムを用いて１時間かけて
ゆっくりと溶離しながらオリゴマーを固体の支持体から
切断した。この溶液を密閉した容器に入れ、４時間55℃
まで加熱した。回転蒸発器で蒸発させた後、粗生成物を
直線状グラジエントの５〜15％アセトニトリル/0.1M酢
酸トリエチルアンモニウム（TEAA）を用いるHPLC（C8カ
ラム,10mm×25cm）により精製した。油状の生成物を50
％エタノール／水から蒸発させて、白色の粉末を得た。
精製した生成物は9.00分の保持時間（C8分析用10cmカラ
ム,1.0ml/分,15分間にわたる５〜20％CH₃CN/0.1M TEA
A）を有した。5.0 ODs 9c/mlの水（滅菌）を含むストッ
ク溶液を調製し、フリーザーに保存した。

実施例12 単一のスルファメート結合を有する１対のオリゴデオキ
シリボヌクレオチドのアニーリング 使用した緩衝剤はpH7.00で、200mMの塩化ナトリウム
および0.1mMのEDTAを含む10mMのリン酸ナトリウム水溶
液である。参照用細胞はこの緩衝剤を含んだ。相補的鎖
（それぞれ1.5μＭ）を15℃でアニールし、次に260nmに
おけるUV吸収を温度が75℃まで上昇（0.4℃／分）する
にしたがって測定した。得られた融解曲線を図１に示
す。ダイヤモンド形の印はオリゴヌクレオチド対9a:9c
（Tm＝68℃と推定した）のデータであり、そして正方形
の印はオリゴヌクレオチド対9b:9d（Tm:72℃と推定し
た）のデータである〔オリゴヌクレオチド配列9a,9bお
よび9dについては下記を参照〕。

実施例13 単一のスルファメート結合を有するオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ耐性の証明 使用した酵素ストック溶液は1.8ユニット/mlのSVP
（ホスホジエステラーゼI,Sigma社製）および147ユニッ
ト/mlのAP（アルカリ性ホスファターゼ,Sigma社製）で
ある。使用した緩衝剤溶液はトリス（100mM,pH9）およ
びMgCl₂（50mM）である。消化は1.5mlのエッペンドルフ
管中において0.1絶対ユニットの実施例14で得られた化
合物を25.6μのトリス緩衝剤,27μのMgCl₂緩衝剤,1
0μのSVPストック溶液および13.6μのAPストック溶
液とともに37℃で18時間インキュベートすることにより
行なった。次に、10μの2.5M酢酸ナトリウム、次いで
250μのエタノールを加えた。30分間、−78℃まで冷
却し、遠心分離（12K rpm,10分）した後、上澄み液を
エタノールで1mlに希釈して、再び遠心分離した。上澄
み液を集め、高速真空で蒸発させた。残留物を1.0mlの
滅菌水に再溶解し、分析するまでに４゜で保存した。図
2aにdC,T,dGおよびdAの標準混合物をHPLCクロマトグラ
ムを示す。図2bにオリゴデオキシヌクレオチド9cの長期
の消化から得られた生成物混合物HPLCクロマトグラムを
示す。スルファメートエステル結合を有するODNが長時
間消化される場合、ブロックダイマーがそのまま現われ
ることがわかる。別に合成した全体的に脱保護されたブ
ロックダイマーｄ（AsT）（実施例19参照）のサンプル
のHPLCクロマトグラムにより、〔AsT〕とラベルしたピ
ークが合成物質と同じ保持時間を有することが確認され
た。このことはスルファメートエステル結合がエキソヌ
クレアーゼに対して非常に耐性があることを示してい
る。

実施例14 単一のスルファメート結合を有するオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドの二重鎖のエンドヌクレアーゼ耐性の証明 オリゴヌクレオチド9aは実施例11（9c）の記載のよう
にして合成した。オリゴヌクレオチド9bおよび9dは当業
者によく知られている標準方法により合成した。追加の
配列は次のようである。

４つのオリゴマー鎖9a〜9d（10〜100ピコモル末端）
のそれぞれを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（10ユニッ
ト）を用いてγ−³²P ATP（3000 Ci/ミリモル）で５′
−末端を標識した。鎖をフェノール：クロロホルム抽
出、クロロホルム抽出、エーテル抽出および２回連続の
エタノール沈殿により精製した。過剰のATPを標準プロ
トコルに従ってNACS Prepacカラム（BRL社製）を用いて
除去した。

５′−末端が標識された一重鎖オリゴマー（12,000cp
m、〜１ピコモル）を50mMのトリス−HCl（pH8.0）、10m
MのMgCl₂および100mMのNaClを含む11μの緩衝剤中に
おいてその未標識補体（10ピコモル）にアニールした。
混合物を15分間、80℃まで加熱し、次いで60分間ゆっく
りと室温まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼNsi I
（10ユニット/1μ）および７μの酵素反応乾燥剤を
それぞれのアニールしたサンプルに加えた。二重鎖DNA
およびNsi I混合物を37℃で60分間放置した。10μの
7.5M酢酸アンモニウム、１μのtRNAおよび90μの10
0％エタノールを添加して、サンプルをエタノール沈殿
した。サンプルを室温下、14,000rpmで15分間遠心分離
し、上澄み液を除去し、そしてDNAペレットを真空乾燥
した。サンプルを80％脱イオン化ホルムアミド、0.1％
キシレンアノールおよび0.1％ブロモフェノールブルー
を含む３μのホルムアミド色素中で再び懸濁し、そし
て20％変性ポリアクリルアミドゲル上にのせた。サンプ
ルを２時間、2000Vの電気泳動にかけた。ゲルを−70℃
で８〜24時間、Kodak XARフィルムにさらした。その結
果を図３に示す。レーン１および２はそれぞれ鎖9cおよ
び9dにアーニルされた鎖9aを含み；レーン３および４は
それぞれ鎖9cおよび9dにアニールされた鎖9bを含み；レ
ーン５および６はそれぞれ鎖9bおよび9aにアニールされ
た鎖9cを含み、レーン７および８はそれぞれ鎖9bおよび
9aにアニールされた鎖9dを含む。−Ｓ−はスルファメー
ト結合を示し、そして−Ｐ−はリン酸ジエステル結合を
示す。

実施例15 ポリＵを用いたスルファメートの結合のＡ−ヌクレオシ
ドダイマーのアニーリング 使用した緩衝剤は塩化マグネシウムおよびトリス（塩
基）の10mM溶液で、そして0.1M HClでpH7.5に調整し
た。参照用細胞はこの緩衝剤を含んだ。サンプル細胞は
1.00mlの緩衝剤中、0.660 ODユニットのポリＵ（Sigma
社製）および0.330 ODユニットのｄ−AsAを含んだ。細
胞を0.6℃で１時間平衡化し温度を１℃／分で傾斜させ
た。融解曲線を図４に示す。35％の淡色効果を伴ないTm
は15〜18℃と推定した。その対応する天然のリン酸ジエ
ステルダイマー、ｄ−ApAの報告された文献値は7.6℃で
ある（参考文献25）。本実施例により、スルファメート
結合（複数可）だけを含むオリゴデオキシヌクレオチド
がハイブリッド形成されてその相補的未修飾体となりう
ることおよびそのハイブリッドがより大きな安定性を有
しうることが証明される。

実施例16 リボヌクレオチドの２′−位または３′−位に結合され
た場合におけるスルファメートの安定性の証明 3mlの27％水酸化アンモニウム中における1mgの３′−
位に結合された（（Ph）3CO）〔rU〕ST（OTBDMS）（実
施例９で得た）の溶液を密閉した容器中、室温で24時間
インキュベートした。溶媒を蒸発させた。残留物をHPLC
〔ガード付C18 Rainin分析用カラム（4.6mm×25cm）、
流速1.5ml/分および15分間にわたる直線状グラジエント
の80〜90％メタノール／水〕により分析した結果、12.3
75分におけるピークの何れも２′−位に結合された
（（Ph）3CO）〔rU〕sT（OTBDMS）（保持時間11.110
分）に変換されたものではない。２′−位に結合された
（（Ph）3CO）〔rU〕sT（OTBDMS）の1mgのサンプルを同
様に処理した場合もまた、平衡化はまったく見られなか
った。このことはスルファメートの結合したオリゴリボ
ヌクレオチド誘導体が切断および移動に関して塩基安定
性であることを証明している。

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20. 1989年４月16〜21日に英国シェフィールドで開かれ
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おいてC.Blonskiにより提示されたポスター。

21. D.A.Shuman,R.K.Robins,およびM.J.Robins,J.Amer.
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22. G.R.Gough,D.N.Nobbs,J.C.Middleton,F.Penglis−C
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23. K.Isono.M.Uramoto,H.Kusakabe,N.Miyata,T.Koyam
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24. M.UbukataおよびK.Isono,Tet.Lett.,27,3907−3908
（1986年）。

25. P.S.Miller,K.N.Fang,N.S.Kondo,およびP.O.P.Ts′
o,J.Amer.Chem.Soc.,93,6657−6665（1971年）。

26. Charachon,G.,Sobol,R.W.Bisbal,C.,Salehzada,T.,
Silhol,M.,Charubula,R.,Pfleiderer,W.,Lebleu,B.およ
びSubadolnik,Biochemistry,29,2550−2555（1990
年）。

27. Zamecnik,P.R.,Goodchild,J.,Taguchi,Y.およびSar
in,P.S.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,83,（1986年）pp.10
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28. Harel−Bellan,A.Ferris,D.K.,Vinocour,M.,Holt,
J.T.,およびFarrar,W.L.,J.Immunol.,140,（1988年）24
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29. Walder,R.Y.,およびWalder,J.A.（1988年）Proc.Na
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31. Lamaitre,M.,Bayard,B.およびLeblew,B.（1987年）
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33. S.Benner,WO 89/12060。

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36. I.Yamamoto,M.Sekine,およびT.Hata,J.Chem.Soc.,P
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37. Charubala,Uhlmann,Beter,およびPfleiderer,Synth
esis,965（1984年）。

38. T.−S.Lin,J.Pharm.Sci.,73,1568−1570（1984
年）。

39. Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approac
h,Ed.by M.J.Gait,IRL Press Ltd.,Washington,DC（198
4年）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/12 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07H 19/06,19/16 C07H 21/02,21/04 A61K 31/7125,48/00 A61P 31/12 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式 （式中、ＡはＨ、OH、OR₈、OQまたはハロゲンであり、 Ｂは天然由来の核酸塩基または合成的に修飾された核酸
   塩基であり、 ＹはRNまたはＯであり、 ＺはR₇NまたはＯであり、 ＭはＳ（＝Ｏ）＝Ｏ、Ｐ（＝Ｏ）−O^-、Ｐ（＝Ｏ）−
   S^-、Ｐ（＝Ｓ）−S^-、Ｐ（＝Ｏ）−OR₃、Ｐ（＝Ｏ）−R
   ₉、Ｐ（＝Ｏ）−SR₄またはＰ（＝Ｏ）−NR₅R₆（ただ
   し、少なくとも１個のＭはＳ（＝Ｏ）＝Ｏであり、そし
   てＭがＳ（＝Ｏ）＝Ｏである時、ＹおよびＺのうち１個
   だけがＯである）であり、 ｎは１またはそれより大きいものであり、 ＲはＨまたはアルキルであり、 R₁はH₂PO₃、H₃P₂O₅、H₄P₃O₇およびこれらの適当な塩、
   Ｈまたは保護基であり、 R₂はH₂PO₃、H₃P₂O₅、H₄P₃O₇およびこれらの適当な塩、
   Ｈまたは保護基であり、 R₃はアルキルまたはシアノエチルであり、 R₄はＨまたはアルキルであり、 R₅はＨまたはアルキルであり、 R₆はＨまたはアルキルであり、 R₇はＨまたはアルキルであり、 R₈はアルキルであり、 R₉はアルキルまたはシアノエチルであり、そしてＱは保
   護基である） を有する化合物。
2. 【請求項２】式 （式中、ＡはＨ、OH、OR₂、OQまたはハロゲンであり、 Ｂは天然由来の核酸塩基または合成的に修飾された核酸
   塩基であり、 ＹはRNまたはＯであり、 ＺはR₁NまたはＯであり、 Ｘは適当な脱離基であり、 Ｑは保護基であり、 ＲはＨまたはアルキルであり、 R₁はＨまたはアルキルであり、そして R₂はアルキルであるが、ただし ＹおよびＺのうち１個だけがＯである） を有する化合物。
3. 【請求項３】式 （式中、ＡはＨ、OH、OR₂、OQまたはハロゲンであり、 Ｂは天然由来の核酸塩基または合成的に修飾された核酸
   塩基であり、 ＹはRNまたはＯであり、 ＺはR₁NまたはＯであり、 Ｘは適当な脱離基であり、 Ｑは保護基であり、 ＲはＨまたはアルキルであり、 R₁はＨまたはアルキルであり、そして R₂はアルキルであるが、ただし ＹおよびＺのうち１個だけがＯである） を有する化合物。
4. 【請求項４】式 （式中、ＡはＨ、OH、OR₄、OQまたはハロゲンであり、 Ｂは天然由来の核酸塩基または合成的に修飾された核酸
   塩基であり、 ｎは少なくとも１であり、 R₁はアルキルであり、 R₂はジアルキルアミノ、モルホリノ、ピペリジノまたは
   ピロリドノであり、 R₃はアルキルであり、 R₄はアルキルであり、 ＹはRNまたはＯであり、 ＺはRNまたはＯであり、 ＲはＨまたはアルキルであり、 Ｑは保護基であり、そして Ｖは保護基であるが、ただし ＹおよびＺのうち１個だけがＯである） を有する化合物。