JP2016520593A - Ｔｍｐｒｓｓ６ ｉｒｎａ組成物及びその使用方法 - Google Patents

Ｔｍｐｒｓｓ６ ｉｒｎａ組成物及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＲＮＡｉ剤、例えば、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子を標的とする二本鎖ＲＮＡｉ剤、及びＴＭＰＲＳＳ６の発現を阻害するためのこのようなＲＮＡｉ剤の使用方法及びＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患、例えば、β−サラセミア又はヘモクロマトーシスなどの鉄過剰に関連する疾患に罹患している対象の処置方法に関する。

Description

関連出願
本出願は、２０１３年５月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／８２６，１７８号明細書及び２０１３年１２月６日に出願された米国仮特許出願第６１／９１２，９８８号明細書の優先権の利益を主張するものである。本出願は、２０１１年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／５６１，７１０号明細書、及び２０１２年１１月１６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５６０１号明細書に関する。上記の仮特許出願のそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
配列表
本出願は、全体が参照により本明細書に援用される、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含む。２０１４年５月２１日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーの名称は、１２１３０１−００７２０＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは４４９，６２０バイトである。
ＴＭＰＲＳＳ６（膜貫通プロテアーゼ、セリン６）遺伝子は、ＩＩ型セリンプロテアーゼであるマトリプターゼ−２としても知られているＴＭＰＲＳＳ６をコードする。ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子は、主に肝臓で発現されるが、高いレベルのＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡが、腎臓でも見られ、より低いレベルが子宮で見られ、はるかに少ない量が多くの他の組織で検出される（非特許文献１）。ＴＭＰＲＳＳ６は、ヘプシジン活性化因子及びＢＭＰ共受容体ＨＪＶ（ヘモジュベリン）を結合し、タンパク質を分解し、それにより、ヘプシジンレベルの下方制御を引き起こすことによって、鉄ホメオスタシスに役割を果たす。
ＴＭＰＲＳＳ６は、短いＮ末端細胞質内尾部、ＩＩ型膜貫通ドメイン、２つの細胞外ＣＵＢ（補体因子Ｃｌｓ／Ｃｌｒ、ウニ胚成長因子及びＢＭＰ（骨形成タンパク質））ドメインから構成されるステム領域（ｓｔｅｍ ｒｅｇｉｏｎ）、３つのＬＤＬＲ（低比重リポタンパク質受容体クラスＡ）ドメイン、及びＣ末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメインからなる。細胞外ドメインにおけるＮ−グリコシル化のためのコンセンサス部位、及び細胞質内尾部領域における潜在的なリン酸化部位もある。
Ｒａｍｓａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ（２００９），９４（６），８４０−８４９
多くの疾患が、増加したレベルの鉄によって特徴付けられる病態である鉄過剰に関連し得る。鉄過剰は、様々な組織における過剰な鉄沈着を引き起こすことがあり、組織及び臓器障害につながり得る。したがって、鉄過剰に関連する疾患の有効な処置のための方法が、現在必要とされている。
本発明は、ＴＭＰＲＳＳ６を標的とするＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤を含む組成物を提供する。本発明は、ＴＭＰＲＳＳ６発現を阻害し、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患、例えば、サラセミア、例えば、β−サラセミア、又はヘモクロマトーシスなどの鉄過剰に関連する疾患を処置するための本発明の組成物の使用方法も提供する。
したがって、一態様において、本発明は、細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ−２）の発現を阻害することが可能なＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号６、配列番号７、又は配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
センス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾ヌクレオチドであり、
センス鎖が、３’末端において結合されたリガンドにコンジュゲートされる二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
一実施形態において、前記センス鎖のヌクレオチドの全て及び前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾ヌクレオチドである。
一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖が、表１、２、４、５、８、１０、及び１２のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む。
一実施形態において、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、３’末端デオキシ−チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’リン酸又は５’リン酸模倣体を含むヌクレオチド（例えば、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１１／００５８６０号パンフレットを参照）、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオチドからなる群から選択される。
一実施形態において、少なくとも１つの鎖が、少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。別の実施形態において、少なくとも１つの鎖が、少なくとも２つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。別の態様において、本発明は、細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ−２）の発現を阻害することが可能なＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＴＭＰＲＳＳ６をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
各Ｎａ及びＮａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ及びＮｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、及びｎｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し；
Ｎｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされている）
によって表される二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
一実施形態において、ｉが０であり；ｊが０であり；ｉが１であり；ｊが１であり；ｉ及びｊの両方が０であり；又はｉ及びｊの両方が１である。別の実施形態において、ｋが０であり；ｌが０であり；ｋが１であり；ｌが１であり；ｋ及びｌの両方が０であり；又はｋ及びｌの両方が１である。
一実施形態において、ＸＸＸが、Ｘ’Ｘ’Ｘ’に相補的であり、ＹＹＹが、Ｙ’Ｙ’Ｙ’に相補的であり、ＺＺＺが、Ｚ’Ｚ’Ｚ’に相補的である。
一実施形態において、ＹＹＹモチーフが、センス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。
一実施形態において、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフが、５’末端のアンチセンス鎖の１１位、１２位及び１３位に存在する。
一実施形態において、Ｙ’が、２’−Ｏ−メチルである。
一実施形態において、式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩａ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩａ）
によって表される。
別の実施形態において、式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｂ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩｂ）
（式中、各Ｎｂ及びＮｂ’が、独立して、１〜５つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
によって表される。
更に別の実施形態において、式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｃ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩｃ）
（式中、各Ｎｂ及びＮｂ’が、独立して、１〜５つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
によって表される。
一実施形態において、式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｄ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩｄ）
（式中、各Ｎｂ及びＮｂ’が、独立して、１〜５つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各Ｎａ及びＮａ’が、独立して、２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
によって表される。
一実施形態において、二本鎖領域は、１５〜３０ヌクレオチド対長である。別の実施形態において、二本鎖領域は、１７〜２３ヌクレオチド対長である。更に別の実施形態において、二本鎖領域は、１７〜２５ヌクレオチド対長である。一実施形態において、二本鎖領域は、２３〜２７ヌクレオチド対長である。別の実施形態において、二本鎖領域は、１９〜２１ヌクレオチド対長である。別の実施形態において、二本鎖領域は、２１〜２３ヌクレオチド対長である。一実施形態において、各鎖は、１５〜３０のヌクレオチドを有する。別の実施形態において、各鎖は、１９〜３０のヌクレオチドを有する。
一実施形態において、ヌクレオチド上の修飾は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−デオキシ、２’−ヒドロキシル、及びそれらの組合せからなる群から選択される。別の実施形態において、ヌクレオチド上の修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾である。
一実施形態において、リガンドは、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。別の実施形態において、リガンドは、
Figure 2016520593
 である。
一実施形態において、リガンドは、センス鎖の３’末端に結合される。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、以下の概略図
Figure 2016520593
 （式中、ＸがＯ又はＳである）に示されるリガンドにコンジュゲートされている。特定の実施形態において、ＸがＯである。
一実施形態において、剤は、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含む。
一実施形態において、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、１つの鎖の３’末端にある。一実施形態において、鎖は、アンチセンス鎖である。別の実施形態において、鎖は、センス鎖である。
一実施形態において、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、１つの鎖の５’末端にある。一実施形態において、鎖は、アンチセンス鎖である。別の実施形態において、鎖は、センス鎖である。
一実施形態において、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、１つの鎖の５’末端及び３’末端の両方にある。一実施形態において、鎖は、アンチセンス鎖である。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、６〜８つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び３’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は、５’末端又は３’末端のいずれかにおける少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
一実施形態において、二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端の１位における塩基対が、ＡＵ塩基対である。
一実施形態において、Ｙヌクレオチドが、２’−フルオロ修飾を含む。
一実施形態において、Ｙ’ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
一実施形態において、ｐ’＞０である。別の実施形態において、ｐ’＝２である。
一実施形態において、ｑ’＝０であり、ｐ＝０であり、ｑ＝０であり、ｐ’オーバーハングヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡに相補的である。別の実施形態において、ｑ’＝０であり、ｐ＝０であり、ｑ＝０であり、ｐ’オーバーハングヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡに非相補的である。
一実施形態において、センス鎖が、合計で２１のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖が、合計で２３のヌクレオチドを有する。
一実施形態において、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される。
一実施形態において、全てのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、表１、２、４、５、８、１０、及び１２のいずれか１つに列挙されるＲＮＡｉ剤の群から選択される。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、ＡＤ−５９７４３である。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、ＡＤ−６０９４０である。
一態様において、本発明は、細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、
二本鎖ＲＮＡｉ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、
センス鎖が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号６、配列番号７、又は配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、
センス鎖が、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、
アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、
アンチセンス鎖が、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び３’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、
センス鎖が、３’末端において分枝鎖状の二価又は三価リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全て及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾を含む。
別の態様において、本発明は、細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ−２）の発現を阻害することが可能なＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＴＭＰＲＳＳ６をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
各Ｎａ及びＮａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ及びＮｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、及びｎｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり；
Ｎｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされている）
によって表される二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
更に別の態様において、本発明は、細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ−２）の発現を阻害することが可能なＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＴＭＰＲＳＳ６をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎｐ、ｎｑ、及びｎｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
各Ｎａ及びＮａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ及びＮｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり；
Ｎｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされている）
によって表される二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
更なる態様において、本発明は、細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ−２）の発現を阻害することが可能なＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＴＭＰＲＳＳ６をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎｐ、ｎｑ、及びｎｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
各Ｎａ及びＮａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ及びＮｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり；
Ｎｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である）
によって表される二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
別の態様において、本発明は、細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ−２）の発現を阻害することが可能なＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＴＭＰＲＳＳ６をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎｐ、ｎｑ、及びｎｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
各Ｎａ及びＮａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ及びＮｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり；
Ｎｂ上の修飾が、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎｂ’上の修飾が、Ｙ’上の修飾と異なり；
センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である）
によって表される二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
更に別の態様において、本発明は、細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ−２）の発現を阻害することが可能なＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、ＴＭＰＲＳＳ６をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩａ）
（式中：
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎｐ、ｎｑ、及びｎｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
各Ｎａ及びＮａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
ＹＹＹ及びＹ’Ｙ’Ｙ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾が、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり；
センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；
センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である）
によって表される二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
一実施形態において、本発明は、表１、２、４、５、８、１９、及び１２のいずれか１つに列挙されるＲＮＡｉ剤の群から選択されるＲＮＡｉ剤を提供する。
一態様において、本発明は、修飾されたアンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物であって、剤が、細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６の発現を阻害することが可能であり、表１、２、４、５、８、１０、及び１２のいずれか１つに列挙される配列の群から選択されるセンス配列に相補的な配列を含み、ポリヌクレオチドが、約１４〜約３０ヌクレオチド長である組成物を提供する。
本発明は、例えば、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む、細胞、ベクター、宿主細胞、及び医薬組成物も提供する。
ある実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、医薬組成物を用いて投与される。
好ましい実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、溶液中で投与される。あるこのような実施形態において、ｓｉＲＮＡは、非緩衝液中で投与される。一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、水中で投与される。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、プロラミン緩衝液、炭酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝液又はそれらの任意の組合せなどの緩衝液とともに投与される。ある実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
一実施形態において、医薬組成物は、脂質製剤を更に含む。一実施形態において、脂質製剤は、ＬＮＰ、又はＸＴＣを含む。別の実施形態において、脂質製剤は、ＭＣ３を含む。
一態様において、本発明は、細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６発現の阻害方法を提供する。本方法は、細胞を、ＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤、又は本発明の修飾されたアンチセンスポリヌクレオチド剤、又は本発明のベクター、又は本発明の医薬組成物と接触させる工程と；工程（ａ）で産生される細胞を、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それにより、細胞中のＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現を阻害する工程とを含む。
一実施形態において、細胞は、対象中にある。
一実施形態において、対象はヒトである。
一実施形態において、ＴＭＰＲＳＳ６発現は、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は１００％だけ阻害される。
別の実施形態において、ヘプシジン遺伝子発現は、少なくとも約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、又は約５倍増加される。
更に別の実施形態において、血清ヘプシジン濃度は、少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約１００％、約１５０％、約２００％、約２５０％、又は約３００％だけ増加される。
一実施形態において、血清鉄濃度は、少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％又は約１００％だけ低下される。
別の実施形態において、トランスフェリン飽和度パーセントは、少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％又は約１００％だけ減少される。
別の態様において、本発明は、ＴＭＰＲＳＳ６発現によって媒介されるか、又はそれに関連する疾患に罹患している対象の処置方法を提供する。本方法は、治療有効量の本発明のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤、又は本発明の修飾されたアンチセンスポリヌクレオチド剤、又は本発明のベクター、又は本発明の医薬組成物を対象に投与し、それにより、対象を処置する工程を含む。
一態様において、本発明は、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患に罹患している対象の処置方法を提供する。本方法は、治療有効量の二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に皮下投与し、それにより、対象を処置する工程を含み、
二本鎖ＲＮＡｉ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、
センス鎖が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号６、配列番号７、又は配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、
アンチセンス鎖が、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び３’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み，
センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、
センス鎖が、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、
センス鎖が、３’末端において分枝鎖状の二価又は三価リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全て及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾を含む。
一実施形態において、対象はヒトである。
一実施形態において、対象は、鉄過剰に関連する疾患、例えば、遺伝性ヘモクロマトーシス、β−サラセミア（例えば、重症型β−サラセミア及び中間型β−サラセミア）、赤芽球性ポルフィリン症、パーキンソン病、アルツハイマー病又はフリードライヒ運動失調症に罹患している。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ又は約１８ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、又は約３．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、皮下又は静脈内投与される。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２つ以上の用量で投与される。特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、約１２時間に１回、約２４時間に１回、約４８時間に１回、約７２時間に１回、約９６時間に１回、約７日に１回、又は約１４日に１回からなる群から選択される間隔で投与される。特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２週間以下、３週間以下、４週間以下、５週間以下、又はそれ以上にわたって週に１回投与される。
更に別の態様において、本発明は、対象の鉄過剰に関連する疾患の処置方法を提供する。本方法は、治療有効量のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤、又は本発明のベクターを対象に投与し、それにより、対象を処置する工程を含む。
一実施形態において、鉄過剰に関連する疾患は、ヘモクロマトーシスである。別の実施形態において、鉄過剰に関連する疾患は、サラセミア、例えば、β−サラセミア（例えば、重症型β−サラセミア及び中間型β−サラセミア）、又は赤芽球性ポルフィリン症である。更に別の実施形態において、鉄過剰に関連する疾患は、神経疾患、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病又はフリードライヒ運動失調症である。
一実施形態において、対象は、霊長類又はげっ歯類である。別の実施形態において、対象はヒトである。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、又は約２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、皮下又は静脈内投与される。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２つ以上の用量で投与される。特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、約１２時間に１回、約２４時間に１回、約４８時間に１回、約７２時間に１回、約９６時間に１回、約７日に１回、又は約１４日に１回からなる群から選択される間隔で投与される。
一実施形態において、投与により、対象における鉄レベル、フェリチンレベル及び／又はトランスフェリン飽和度レベルが低下される。
一実施形態において、本方法は、対象における鉄レベルを決定する工程を更に含む。
一実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤（又は本発明の医薬組成物）を対象に投与する工程を含む本発明の方法は、更なる薬剤の投与及び／又は他の治療方法と組み合わせて実施される。一実施形態において、本発明の方法は、鉄キレート剤、例えば、デフェリプロン、デフェロキサミン、及びデフェラシロクスを対象に投与する工程を更に含む。
本発明は、以下の詳細な説明及び図面によって更に例示される。
１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのｉＲＮＡ剤ＡＤ−５９７４３の単回用量の投与の後の、野生型マウスの肝臓におけるＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡの相対的レベルを示すグラフである。 １ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのｉＲＮＡ剤ＡＤ−５９７４３の単回用量の投与の後の、野生型マウスの肝臓におけるヘプシジンｍＲＮＡの相対的レベルを示すグラフである。 ０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ又は３．０ｍｇ／ｋｇの用量でのＡＤ−６０９４０、又はＰＢＳのみ（対照）の単回皮下注射の後の様々な時点におけるＣ５７ＢＬ／６マウスにおける肝臓ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ（図３Ａ）、肝臓ヘプシジンｍＲＮＡ（図３Ｂ）のレベルを示す。各データ点が、３匹のマウスの平均値を表す。平均の標準偏差が、エラーバーによって表される。 ０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ又は３．０ｍｇ／ｋｇの用量でのＡＤ−６０９４０、又はＰＢＳのみ（対照）の単回皮下注射の後の様々な時点におけるＣ５７ＢＬ／６マウスにおける血清ヘプシジン（図３Ｃ）、総血清鉄（図３Ｄ）のレベルを示す。各データ点が、３匹のマウスの平均値を表す。平均の標準偏差が、エラーバーによって表される。 ０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ又は３．０ｍｇ／ｋｇの用量でのＡＤ−６０９４０、又はＰＢＳのみ（対照）の単回皮下注射の後の様々な時点におけるＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるトランスフェリン飽和度パーセント（図３Ｅ）のレベルを示す。各データ点が、３匹のマウスの平均値を表す。平均の標準偏差が、エラーバーによって表される。図３Ｆ：投与の１１日後におけるＡＤ−６０９４０の用量に応じた相対的な肝臓ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ濃度を示す。各データ点が、各用量レベルで観察されるＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ濃度の最大の抑制を表す。データを、ヒルの式に当てはめた。 図４Ａ：３週間にわたって週に１回の投与の投与計画と、その後の２１日目におけるマウスの殺処分を示す概略図である。図４Ｂ：図４Ａに示される計画にしたがった、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇの用量でのＡＤ−６０９４０、又はＰＢＳ（対照）の皮下注射を投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける肝臓ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ、肝臓ヘプシジンｍＲＮＡ、及びトランスフェリン飽和度パーセントのレベルを示すグラフである。各バーが、３匹のマウスの平均値を表す。平均の標準偏差が、エラーバーによって表される。図４Ｃ：ＡＤ−６０９４０の用量に応じた相対的な肝臓ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ濃度を示す。データを、ヒルの式に当てはめた。 血清ヘプシジン濃度及び相対的なＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡレベルの間の関係（図５Ａ）、トランスフェリン飽和度パーセント及び相対的なＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡレベルの間の関係（図５Ｂ）、血清ヘプシジン濃度及び相対的なヘプシジンｍＲＮＡレベルの間の関係（図５Ｃ）及びトランスフェリン飽和度パーセント及び血清ヘプシジン濃度の間の関係（図５Ｄ）を示すグラフである。 ３ｍｇ／ｋｇの示されるｉＲＮＡ剤又はＰＢＳ（対照）の単回の皮下投与の後の、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓におけるＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡの相対的レベルを示すグラフである。バーが、３匹のマウスの平均を表し、エラーバーが、平均の標準偏差を表す。 ３週間にわたって週に１回の、０．３ｍｇ／ｋｇ又は１．０ｍｇ／ｋｇの示されるｉＲＮＡ剤、又はＰＢＳ（対照）の皮下投与の後の、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓におけるＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡの相対的レベルを示すグラフである。バーが、３匹のマウスの平均を表し、エラーバーが、平均の標準偏差を表す。 ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＴＭＰＲＳＳ６のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。 ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＴＭＰＲＳＳ６のヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。 ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＴＭＰＲＳＳ６のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。 アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）ＴＭＰＲＳＳ６のヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。 アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）ＴＭＰＲＳＳ６のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。 配列番号１の逆相補配列（配列番号６）を示す。 配列番号２の逆相補配列（配列番号７）を示す。 配列番号３の逆相補配列（配列番号８）を示す。 配列番号４の逆相補配列（配列番号９）を示す。 配列番号５の逆相補配列（配列番号１０）を示す。
本発明は、ＴＭＰＲＳＳ６を標的とするＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤を含む組成物を提供する。本発明は、ＴＭＰＲＳＳ６発現を阻害し、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患、例えば、β−サラセミア又はヘモクロマトーシスを処置するための本発明の組成物の使用方法も提供する。
ＴＭＰＲＳＳ６は、ＨＡＭＰ遺伝子発現の阻害剤として鉄ホメオスタシスに重要な役割を果たす。ＨＡＭＰ遺伝子は、鉄ホメオスタシスの中心的調節因子である肝臓ホルモンヘプシジンをコードする。ヘプシジンは、吸収腸細胞、肝細胞及びマクロファージに主に局在する鉄排出タンパク質フェロポーチン（ＦＰＮ１）に結合する。フェロポーチンの細胞外ドメインへのヘプシジン結合は、フェロポーチンの内在化及び分解をもたらし、したがって、食事に含まれる鉄の腸からの吸収、及びマクロファージ及び肝細胞からの鉄の放出を減少させる。ＨＡＭＰ遺伝子発現は、ＢＭＰ共受容体ヘモジュベリン（ＨＪＶ）によって媒介される、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）／サンズ・オブ・マザーズ・アゲインスト・デカペンタプレジック（Ｓｏｎｓ ｏｆ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ＳＭＡＤ）依存性シグナル伝達カスケードを介して、鉄に応答して刺激され得る。ＨＡＭＰ調節におけるＴＭＰＲＳＳ６の重要な役割は、ＢＭＰ媒介ＨＡＭＰ上方制御の阻害である。ＴＭＰＲＳＳ６は、ＢＭＰ媒介ＨＡＭＰ上方制御に必須であるＢＭＰ共受容体ＨＪＶを切断し；したがって、ＢＭＰシグナル伝達、核へのＳＭＡＤ移行、及びＨＡＭＰ転写活性化を防ぐことによって、ＢＭＰ媒介ＨＡＭＰ上方制御を阻害する。
いくつかのヒト及びマウスの研究により、ＨＡＭＰ調節及び鉄ホメオスタシスにおけるＴＭＰＲＳＳ６の役割が確認された（Ｄｕ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８，Ｖｏｌ．３２０，ｐｐｌ０８８−１０９２；Ｆｏｌｇｕｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２００８，Ｖｏｌ．１１２，ｐｐ２５３９−４５）。研究により、ＴＭＰＲＳＳ６における機能喪失変異が、ヘプシジン発現の上方制御をもたらし、ヘプシジンレベルの上昇、低色素性小球性貧血、低い平均赤血球容積（ＭＣＶ）、低いトランスフェリン飽和度、経口による鉄の不十分な吸収、及び非経口による鉄に対する不完全な応答によって特徴付けられる、鉄剤不応性鉄欠乏性貧血（ＩＲＩＤＡ）と呼ばれる遺伝性鉄欠乏性貧血を引き起こし得ることが示された（Ｆｉｎｂｅｒｇ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２００９，Ｖｏｌ．４６，ｐｐ３７８−８６）。しかしながら、ＨＡＭＰの正の調節因子（例えば、ＢＭＰ１、ＢＭＰ４、及びＨＦＥ）の機能喪失変異は、ヘプシジン発現を下方制御し、鉄過剰症を引き起こすことが示されている（Ｍｉｌｅｔ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎ ２００７，Ｖｏｌ．８１，ｐｐ７９９−８０７；Ｆｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０１１，Ｖｏｌ．１１７，ｐｐ４５９０−９）。遺伝性ヘモクロマトーシス（ＨＨ）と総称される原発性鉄過剰症、大量の無効造血によって特徴付けられる貧血、及び中間型β−サラセミア（ＴＩ）などの鉄過剰（続発性ヘモクロマトーシス）において、血清鉄濃度及び鉄貯蔵の上昇にもかかわらず、ヘプシジンレベルは低い。中間型β−サラセミアのマウスモデルは、ＴＭＰＲＳＳ６発現の低下が、ヘプシジンのレベルの上昇をもたらすことを実証した（Ｆｉｎｂｅｒｇ ２０１０ Ｏｒａｌ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ：“ＴＭＰＲＳＳ６，ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｃ ＢＭＰ／Ｓｍａｄ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｈｅｐｃｉｄｉｎ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｉｒｏｎ Ｌｏａｄｉｎｇ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ β−Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ”．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ２０１０，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．：１６４）。
本発明は、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現を調節するための、ｉＲＮＡ剤、組成物及び方法を記載する。特定の実施形態において、ＴＭＰＲＳＳ６の発現は、ＴＭＰＲＳＳ６特異的ｉＲＮＡ剤を用いて低下又は阻害され、それにより、ＨＡＭＰ発現の増大、及び血清鉄レベルの減少をもたらす。したがって、本発明において取り上げられるｉＲＮＡ組成物を用いたＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現又は活性の阻害は、対象における鉄レベルの低下を目的とする治療のための有用な手法であり得る。このような阻害は、ヘモクロマトーシス又はサラセミア、例えば、β−サラセミア（例えば、重症型β−サラセミア及び中間型β−サラセミア）などの鉄過剰に関連する疾患を処置するのに有用であり得る。
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解され得るように、いくつかの用語がまず定義される。更に、変数の値又は値の範囲が記載されるときは常に、記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図されることに留意されたい。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、その冠詞の文法的目的語の１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は２つ以上の要素、例えば、複数の要素を意味する。
「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「〜を含むがこれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」という語句を意味するために本明細書において使用され、この語句と同義的に使用される。
「又は」という用語は、文脈上明らかに他の意味を示さない限り、「及び／又は」という用語を意味するために本明細書において使用され、この用語と同義的に使用される。
本明細書において使用される際、「ＴＭＰＲＳＳ６」は、ＩＩ型細胞膜セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）遺伝子又はタンパク質を指す。ＴＭＰＲＳＳ６は、マトリプターゼ−２、ＩＲＩＤＡ（鉄剤不応性鉄欠乏性貧血）、膜貫通プロテアーゼセリン６、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ６、及び膜結合モザイクセリンプロテイナーゼマトリプターゼ−２としても知られている。ＴＭＰＲＳＳ６は、約８９９アミノ酸長のセリンプロテアーゼＩＩ型膜貫通タンパクである。ＴＭＰＲＳＳ６は、複数のドメイン、例えば、短い内部領域、膜貫通ドメイン、ウニ精子タンパク質／エンテロペプチダーゼドメイン／アグリン（ＳＥＡ）ドメイン、２つの補体因子／ウニ胚成長因子／ＢＭＰドメイン（ＣＵＢ）、３つのＬＤＬ−Ｒクラスａドメイン（ＬＤＬａ）、及び保存Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ三つ組（ＨＤＳ）を備えたトリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含有する。「ＴＭＰＲＳＳ６」という用語は、ヒトＴＭＰＲＳＳ６（そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：５６６８２９６７に見られる）；マウスＴＭＰＲＳＳ６（そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１２５６５６１５１に見られる）；ラットＴＭＰＲＳＳ６（そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１９４４７４０９７に見られる）；アカゲザルＴＭＰＲＳＳ６（そのアミノ酸及びヌクレオチド配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿００１０８５２０３．２（ＧＩ：２９７２６０９８９）及びＸＭ＿００１０８５３１９．１（ＧＩ：１０９０９４０６１）に見られる）を含む。ＡＧＴ ｍＲＮＡ配列の更なる例が、公開されているデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＯＭＩＭ、及びＭａｃａｃａのゲノムプロジェクトのウェブサイトを用いて、容易に入手可能である。
本明細書において使用される際の「ＴＭＰＲＳＳ６」という用語は、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）などの、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の天然ＤＮＡ配列の変異も指す。例示的なＳＮＰは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰにおいて利用可能なｄｂＳＮＰデータベースに見られる。
本明細書において使用される際、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。
本明細書において使用される際、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチドの命名法を用いて示される配列によって表されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」及び「Ｕ」はそれぞれ、一般に、それぞれ、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルを含むヌクレオチドを表す。「Ｔ」及び「ｄＴ」は、本明細書において同義的に使用され、核酸塩基が、チミン、例えば、デオキシリボチミン、２’−デオキシチミジン又はチミジンであるデオキシリボヌクレオチドを指す。しかしながら、「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」又は「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、以下に更に詳述されるように、修飾ヌクレオチド、又は代理置換部分（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｍｏｉｅｔｙ）も指し得ることが理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルが、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性をそれほど変化させずに他の部分によって置換され得ることを十分に認識している。例えば、限定はされないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドが、アデニン、シトシン、又はウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合し得る。したがって、ウラシル、グアニン、又はアデニンを含むヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドによって置換され得る。このような置換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。
本明細書において同義的に使用される「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、その用語が本明細書において定義されるように、ＲＮＡを含有し、且つＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介してＲＮＡ転写物の標的化された切断を仲介する剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知のプロセスによってｍＲＮＡの配列に特異的な分解を導く。ｉＲＮＡは、細胞、例えば、哺乳動物対象などの対象中の細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６の発現を調節する（例えば阻害する）。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＴＭＰＲＳＳ６標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く一本鎖ＲＮＡを含む。理論に制約されるのを望むものではないが、細胞中に導入される長い二本鎖ＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解されると考えられる（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡをプロセシングして、特徴的な２つの塩基３’オーバーハングを有する１９〜２３塩基対の短干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、ここで、１つ又は複数のヘリカーゼが、ｓｉＲＮＡ二本鎖をほどいて、相補的なアンチセンス鎖が、標的認識を導くことを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ中の１つ又は複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。ここで、一態様において、本発明は、細胞中で生成され、且つ標的遺伝子、すなわち、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子のサイレンシングをもたらすＲＩＳＣ複合体の形成を促進する一本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関する。したがって、「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、上記のＲＮＡｉを指すために本明細書において使用される。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞又は生物に導入される一本鎖ｓｉＲＮＡであり得る。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼＡｒｇｏｎａｕｔｅ ２に結合し、これが、次に、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に、１５〜３０のヌクレオチドであり、化学的に修飾される。一本鎖ｓｉＲＮＡの設計及び試験が、米国特許第８，１０１，３４８号明細書及びＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３−８９４に記載され、それぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。本明細書に記載されるアンチセンスヌクレオチド配列のいずれかが、本明細書に記載されるような又はＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０；：８８３−８９４に記載される方法によって化学的に修飾される一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用され得る。
更に別の実施形態において、本発明は、ＴＭＰＲＳＳ６を標的とする一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子を提供する。「一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子」は、標的ｍＲＮＡ（即ち、ＴＭＰＲＳＳ６）中の配列に相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、ｍＲＮＡに塩基対合し、翻訳機構を物理的に妨害することによって、化学量論的に翻訳を阻害し得る（Ｄｉａｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：３４７−３５５を参照）。あるいは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、標的にハイブリダイズし、ＲＮａｓｅＨ切断イベントによって標的を切断することによって、標的ｍＲＮＡを阻害する。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、約１０〜約３０ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的な配列を有し得る。例えば、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、本明細書に記載されるアンチセンスヌクレオチド配列、例えば、表１、２、４、５、８、１０、及び１２のいずれか１つに示される配列のいずれか１つからの少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、又はそれ以上の連続するヌクレオチドである配列を含み得、又は本明細書に記載される標的部位のいずれかに結合し得る。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、修飾ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はそれらの組合せを含み得る。
別の実施形態において、本発明の組成物、使用及び方法に使用するための「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書において「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」、又は「ｄｓＲＮＡ」と呼ばれる。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡ、すなわち、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子に対する「センス」及び「アンチセンス」配向を有することが示される、２本の逆平行で且つ実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。本発明のある実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書においてＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉと呼ばれる、転写後遺伝子サイレンシング機構による、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの分解を引き起こす。
一般に、ｄｓＲＮＡ分子のそれぞれの鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に記載されるように、それぞれの又は両方の鎖は、１つ又は複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドも含み得る。更に、本明細書において使用される際、「ＲＮＡｉ剤」は、化学的修飾を有するリボヌクレオチドを含んでいてもよく；ＲＮＡｉ剤は、複数のヌクレオチドにおける実質的な修飾を含み得る。このような修飾は、本明細書に開示されるか又は当該技術分野において公知のあらゆるタイプの修飾を含み得る。ｓｉＲＮＡタイプの分子に使用される際のいずれのこのような修飾も、本明細書及び特許請求の範囲の目的のために「ＲＮＡｉ剤」によって包含される。
二本鎖構造を形成する２本の鎖は、１つのより大きいＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、又はそれらは別個のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が、１つのより大きい分子の一部であり、したがって、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖によって結合された場合、結合するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖以外の手段によって共有結合された場合、結合構造は、「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は、同じか又は異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖のヌクレオチドの数から、二本鎖に存在するオーバーハングを引いた数である。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉ剤は、１つ又は複数のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＴＭＰＲＳＳ６標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く２４〜３０のヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。理論に制約されるのを望むものではないが、細胞中に導入される長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解される（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡをプロセシングして、特徴的な２つの塩基３’オーバーハングを有する１９〜２３塩基対短干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、ここで、１つ又は複数のヘリカーゼが、ｓｉＲＮＡ二本鎖をほどいて、相補的なアンチセンス鎖が、標的認識を導くことを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ中の１つ又は複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。本明細書において使用される際、「ヌクレオチドオーバーハング」は、ＲＮＡｉ剤の１本の鎖の３’末端が、他方の鎖の５’末端を越えて延びるか、又はその逆である場合、ＲＮＡｉ剤の二本鎖構造から突出する１つ又は複数の不対ヌクレオチドを指す。「平滑な」又は「平滑末端」は、二本鎖ＲＮＡｉ剤の該当する末端に不対ヌクレオチドが存在しない、即ち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端」ＲＮＡｉ剤は、その全長にわたって二本鎖である、即ち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないｄｓＲＮＡである。本発明のＲＮＡｉ剤は、一方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ剤（即ち、１つのオーバーハング及び１つの平滑末端を有する剤）又は両方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ剤を含む。
「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的な領域を含む二本鎖ＲＮＡｉ剤（例えば、ヒトＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ）の鎖を指す。本明細書において使用される際、「トランスサイレチンをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域」という用語は、ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ配列の一部に実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が、標的配列に完全には相補的でない場合、ミスマッチは、末端領域において最も許容され、存在する場合、一般に、１つ又は複数の末端領域、例えば、５’末端及び／又は３’末端の６、５、４、３、又は２つのヌクレオチド中に存在する。
本明細書において使用される際の「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。
本明細書において使用される際、「切断領域」という用語は、切断部位に直接隣接して位置する領域を指す。切断部位は、標的における、切断が生じる部位である。ある実施形態において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で、切断部位に直接隣接した３つの塩基を含む。ある実施形態において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で、切断部位に直接隣接した２つの塩基を含む。ある実施形態において、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０及び１１によって結合される部位で特異的に生じ、切断領域は、ヌクレオチド１１、１２及び１３を含む。
本明細書において使用される際、特に示されない限り、「相補的な」という用語は、当業者により理解されるように、第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列と関連して記載するのに使用される場合、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、所定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を指す。このような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ここで、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２〜１６時間と、それに続く洗浄を含み得る。生物の内部で起こり得る生理学的に関連した条件などの他の条件を適用することができる。例えば、相補的な配列は、核酸の関連する機能、例えば、ＲＮＡｉを進行させるのに十分である。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適切な条件の組を決定することができるであろう。
配列は、第１及び第２のヌクレオチド配列の全長にわたる、第１のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドとの塩基対合がある場合、互いに対して「完全に相補的」であり得る。しかしながら、第１の配列が、本明細書において第２の配列に対して「実質的に相補的な」と称される場合、２つの配列は、完全に相補的であり得、又は、それらの最終的な適用に最も関連する条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、ハイブリダイゼーションを行うと、それらは、１つ又は複数であるが、一般に、４、３又は２以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションの際に１つ又は複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関してはミスマッチと見なされないものとする。例えば、本明細書に記載される目的のために、２１ヌクレオチド長の一方のオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡは、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含む場合、「完全に相補的な」と称されてもよい。
本明細書において使用される際の「相補的な」配列は、それらのハイブリダイズする能力に関連した上記の要求が満たされる限り、非ワトソン−クリック塩基対及び／又は非天然及び修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含むことができ、又はこのような塩基対から完全に形成され得る。このような非ワトソン−クリック塩基対としては、限定はされないが、Ｇ：Ｕゆらぎ又はフーグスティーン型塩基対が挙げられる。
本明細書における「相補的な」、「完全に相補的な」及び「実質的に相補的な」という用語は、それらの使用の状況から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間で、又はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間で、一致する塩基に関連して使用され得る。
本明細書において使用される際、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に実質的に相補的な」ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）、又は３’ＵＴＲを含む目的のｍＲＮＡ（例えば、ＴＭＰＲＳＳ６をコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＴＭＰＲＳＳ６をコードするｍＲＮＡの連続する部分と実質的に相補的である場合、ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
本明細書において使用される際の「阻害する」という用語は、「低下させる」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」及び他の類似語と同義的に使用され、任意のレベルの阻害を含む。
本明細書において使用される際の「ＴＭＰＲＳＳ６の発現を阻害する」という語句は、任意のＴＭＰＲＳＳ６遺伝子（例えば、マウスＴＭＰＲＳＳ６遺伝子、ラットＴＭＰＲＳＳ６遺伝子、サルＴＭＰＲＳＳ６遺伝子、又はヒトＴＭＰＲＳＳ６遺伝子など）ならびに変異体、（例えば、自然発生変異体）、又はＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の突然変異体の発現の阻害を含む。したがって、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子は、野生型ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子、突然変異体ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子、又は遺伝子組み換えされた細胞、細胞群、又は生物の文脈におけるトランスジェニックＴＭＰＲＳＳ６遺伝子であり得る。
「ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現を阻害する」は、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％，少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％などの、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を含む。
ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現は、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現に関連する任意の変数のレベル、例えば、組織または血清中の、ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡレベル、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質レベル、ヘプシジン ｍＲＮＡレベル、ヘプシジンタンパク質レベル、又は血清脂質レベルに基づいて評価され得る。阻害は、対照のレベルと比較したこれらの変数の１つ又は複数の絶対的又は相対的レベルの低下によって評価され得る。対照のレベルは、当該技術分野において用いられる任意のタイプの対照のレベル、例えば、投与前ベースライン（ｐｒｅ−ｄｏｓｅ ｂａｓｅｌｉｎｅ）レベル、又は非処理又は対照（例えば、緩衝液のみの対照又は不活性な剤の対照など）で処理された同様の対象、細胞、又は試料から測定されるレベルであり得る。
本明細書において使用される際の「細胞を二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させる」という語句は、任意の可能な手段によって細胞を接触させることを含む。細胞を二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させる工程は、細胞をＲＮＡｉ剤とインビトロで接触させる工程又は細胞をＲＮＡｉ剤とインビボで接触させる工程を含む。接触は、直接又は間接的に行われ得る。したがって、例えば、ＲＮＡｉ剤は、方法を個々に行うことによって細胞と物理的に接触されてもよく、あるいは、ＲＮＡｉ剤は、それを後に細胞と接触させるのを可能にするか又はそれを後に細胞と接触させる状況に置かれてもよい。
細胞をインビトロで接触させる工程は、例えば、ＲＮＡｉ剤とともに細胞をインキュベートすることによって行われ得る。細胞をインビボで接触させる工程は、ＲＮＡｉ剤が接触される細胞が位置する組織に後に到達するように、例えば、ＲＮＡｉ剤を、細胞が位置する組織中又は組織の近傍に注入することによって、又はＲＮＡｉ剤を、別の領域、血流又は皮下腔中に注入することによって行われ得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、目的の部位、例えば、肝臓にＲＮＡｉ剤を指向するリガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃ３リガンドを含んでいてもよく、及び／又はそれに結合され得る。インビトロ及びインビボでの接触方法の組合せも可能である。本発明の方法に関連して、細胞はまた、ＲＮＡｉ剤とインビトロで接触され、その後、対象に移植されてもよい。
本明細書において使用される際の「患者」又は「対象」は、ヒト又は非ヒト動物のいずれか、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒトまたはサルを含むことが意図される。最も好ましくは、対象又は患者はヒトである。
本明細書において使用される際の「ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患」は、ＴＭＰＲＳＳ６の発現を阻害することによって、処置又は予防され得る任意の疾患、又は軽減され得る症状を含むことが意図される。ある実施形態において、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患は、鉄レベルの上昇によって特徴付けられる病態である鉄過剰、又は鉄調節異常にも関連する。鉄過剰は、例えば、遺伝性疾患、食事からの鉄摂取の増加、又は過剰な鉄の静脈注射を含む非経口投与される過剰な鉄、及び輸血鉄過剰症によって引き起こされ得る。
ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患としては、限定はされないが、遺伝性ヘモクロマトーシス、特発性ヘモクロマトーシス、原発性ヘモクロマトーシス、続発性ヘモクロマトーシス、重度の若年性ヘモクロマトーシス、新生児ヘモクロマトーシス、鉄芽球性貧血、溶血性貧血、赤血球異形成貧血、鎌型赤血球貧血、異常ヘモグロビン症、サラセミア（例えば、β−サラセミア及びα−サラセミア）、慢性肝疾患、晩発性皮膚ポルフィリン症、赤芽球性ポルフィリン症、無トランスフェリン血症、遺伝性チロシン血症、脳肝腎症候群、特発性肺ヘモジデリン沈着症、腎ヘモジデリン沈着症が挙げられる。
ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患は、過剰な鉄の経口投与、輸血鉄過剰症及び過剰な鉄の静脈注射に関連する疾患を含む。
ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患は、鉄過剰に関連するか又はそれによって引き起こされ得る症状を有する疾患も含む。このような症状としては、肝疾患（肝硬変、癌）、心臓発作又は心不全、糖尿病、変形性関節症、骨粗鬆症、メタボリック・シンドローム、甲状腺機能低下症、性腺機能低下症、及び場合によっては早死にのリスクの増加が挙げられる。一実施形態において、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、フリードライヒ運動失調症、てんかん及び多発性硬化症などの、鉄過剰及び／又は鉄調節異常に関連する神経変性疾患が挙げられる。ＴＭＰＲＳＳ６を標的とするｉＲＮＡ、例えば、表１、２、４、５、８、１０、及び１２のいずれか１つに記載されるｉＲＮＡの投与により、これらの症状の１つ又は複数を処置し、又は鉄レベルの増加によって悪化する疾病又は疾患の発症又は進行を防ぐことができる。
一実施形態において、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患は、β−サラセミアである。β−サラセミアは、β−グロブリン鎖の合成における遺伝的欠損によって特徴付けられる遺伝性疾患の群のいずれか１つである。同型接合状態では、βサラセミア（「重症型サラセミア」）は、重度の、輸血依存性貧血を引き起こす。異型接合状態では、βサラセミア形質（「軽症型サラセミア」）は、軽度ないし中等度の小球性貧血を引き起こす。
「中間型サラセミア」は、疾病の臨床的重症度が、軽症型β−サラセミアの軽度の症状と重症型β−サラセミアとの間辺りである対象をもたらすβ−サラセミアである。診断は、定期的な輸血の必要なく診断の時点で少なくとも６〜７ｇ／ｄＬの十分なヘモグロビン（Ｈｂ）値を維持している患者に基づいた臨床的診断である。
一実施形態において、β−サラセミアは、重症型サラセミアである。別の実施形態において、β−サラセミアは、中間型サラセミアである。
本明細書において使用される際の「治療有効量」は、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾病を処置するために患者に投与される場合、（例えば、既存の疾病又は疾病の１つ又は複数の症状を軽減し、改善し、又は維持することによって）この疾病の処置を行うのに十分な、ＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、ＲＮＡｉ剤が投与される方法、疾病及びその重症度ならびに処置される患者の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、ＴＭＰＲＳＳ６発現によって媒介される病理学的過程の段階、もしあれば、以前の処置又は併用処置のタイプ、及び他の個体特性に応じて変化し得る。
本明細書において使用される際の「予防的に有効な量」は、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾病の症状をまだ生じても又は示してもいないが、この疾病に罹患しやすい可能性のある対象に投与される場合、この疾病又はこの疾病の１つ又は複数の症状を予防又は改善するのに十分な、ＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。疾病の改善は、この疾病の経過を遅らせること又は後から発症する疾病の重症度を軽減することを含む。「予防的に有効な量」は、ＲＮＡｉ剤、薬剤が投与される方法、疾病に罹患する危険度、ならびに処置される患者の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、もしあれば、以前の処置又は併用処置のタイプ、及び他の個体特性に応じて変化し得る。
「治療有効量」又は「予防的に有効な量」はまた、任意の処置に適用される妥当なベネフィット・リスク比（ｂｅｎｅｆｉｔ／ｒｉｓｋ ｒａｔｉｏ）である所望の局所又は全身的作用を生じる、ＲＮＡｉ剤の量を含む。本発明の方法に用いられるｉＲＮＡ剤（ｇｅｎｔ）は、このような処置に適用される妥当なベネフィット・リスク比を得るのに十分な量で投与され得る。
本明細書において使用される際の「試料」という用語は、対象から単離された類似の体液、細胞、又は組織、ならびに対象中に存在する体液、細胞、又は組織の集合体を含む。生体液の例としては、血液、血清及び漿膜液、血漿、脳脊髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織試料は、組織、器官又は局所領域に由来する試料を含み得る。例えば、試料は、特定の器官、器官の部分、あるいはそれらの器官中の体液又は細胞に由来し得る。特定の実施形態において、試料は、肝臓（例えば、全肝臓又は肝臓の特定の部分又は、例えば、肝細胞などの肝臓中の特定のタイプの細胞）に由来し得る。好ましい実施形態において、「対象に由来する試料」は、対象から得られる血液又は血漿を指す。更なる実施形態において、「対象に由来する試料」は、対象から得られる肝臓組織（又はその小部分（ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ））を指す。
ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
対象、例えば、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患、例えば、β−サラセミア（例えば、重症型β−サラセミア及び中間型β−サラセミア）又はヘモクロマトーシスに罹患しているヒトなどの哺乳動物中の細胞などの細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現を阻害する改良された二本鎖ＲＮＡｉ剤、及びこのような二本鎖ＲＮＡｉ剤の使用が本明細書に記載される。
したがって、本発明は、インビボでの標的遺伝子（即ち、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子）の発現を阻害することが可能な化学的修飾を有する二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。本発明の特定の態様において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾される。本発明の他の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの全てが修飾される。「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾される」本発明のｉＲＮＡは、大部分は修飾されるが、完全に修飾されるわけではなく、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下、又は１つ以下の非修飾ヌクレオチドを含み得る。
ＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１２〜３０ヌクレオチド長の範囲であり得る。例えば、各鎖は、１４〜３０ヌクレオチド長、１７〜３０ヌクレオチド長、１９〜３０ヌクレオチド長、２５〜３０ヌクレオチド長、２７〜３０ヌクレオチド長、１７〜２３ヌクレオチド長、１７〜２１ヌクレオチド長、１７〜１９ヌクレオチド長、１９〜２５ヌクレオチド長、１９〜２３ヌクレオチド長、１９〜２１ヌクレオチド長、２１〜２５ヌクレオチド長、又は２１〜２３ヌクレオチド長であり得る。
センス鎖及びアンチセンス鎖は、典型的に、本明細書において「ＲＮＡｉ剤」とも呼ばれる二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成する。ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域は、１２〜３０ヌクレオチド対長であり得る。例えば、二本鎖領域は、１４〜３０ヌクレオチド対長、１７〜３０ヌクレオチド対長、２７〜３０ヌクレオチド対長、１７〜２３ヌクレオチド対長、１７〜２１ヌクレオチド対長、１７〜１９ヌクレオチド対長、１９〜２５ヌクレオチド対長、１９〜２３ヌクレオチド対長、１９〜２１ヌクレオチド対長、２１〜２５ヌクレオチド対長、又は２１〜２３ヌクレオチド対長であり得る。別の例では、二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、及び２７ヌクレオチド長から選択される。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、１つ又は両方の鎖の３’末端、５’末端、又は両方の末端において１つ又は複数のオーバーハング領域及び／又はキャッピング基を含み得る。オーバーハングは、１〜６ヌクレオチド長、例えば、２〜６ヌクレオチド長、１〜５ヌクレオチド長、２〜５ヌクレオチド長、１〜４ヌクレオチド長、２〜４ヌクレオチド長、１〜３ヌクレオチド長、２〜３ヌクレオチド長、又は１〜２ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、１つの鎖が他の鎖より長い結果であるか、又は同じ長さの２つの鎖が互い違いになっている結果であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、又はオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であり得るか、又は別の配列であり得る。第１及び第２の鎖がまた、例えば、ヘアピンを形成するように更なる塩基によって、又は他の非塩基リンカーによって結合され得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域中のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、限定はされないが、２−Ｆ、２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、及びそれらの任意の組合せなどの、２’−糖修飾を含む、修飾又は非修飾ヌクレオチドであり得る。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖上のいずれかの末端のためのオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、又はオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であり得るか、又は別の配列であり得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖における５’−又は３’−オーバーハングは、リン酸化され得る。ある実施形態において、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、ここで、２つのヌクレオチドは、同じか又は異なり得る。一実施形態において、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端に存在する。一実施形態において、この３’−オーバーハングは、アンチセンス鎖中に存在する。一実施形態において、この３’−オーバーハングは、センス鎖中に存在する。
ＲＮＡｉ剤は、その全体的安定性に影響を与えずに、ＲＮＡｉの干渉活性を強化し得る１つのみのオーバーハングを含み得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、あるいは、アンチセンス鎖の３’末端に位置し得る。ＲＮＡｉは、アンチセンス鎖の５’末端（又はセンス鎖の３’末端）又はその逆に位置する平滑末端も有し得る。一般に、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。理論に制約されるのを望むものではないが、アンチセンス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングにおける非対称の平滑末端は、ＲＩＳＣプロセスへのガイド鎖導入に有利に働く。
本発明に取り上げられる核酸のいずれも、参照により本明細書に援用される“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるものなどの当該技術分野において十分に確立された方法によって合成及び／又は修飾され得る。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲート、逆結合（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ））又は３’末端修飾（コンジュゲート、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）；塩基修飾、例えば、安定塩基、不安定塩基、又は広範なパートナーと塩基対合する塩基による置換、塩基の除去（非塩基性ヌクレオチド）、又はコンジュゲート塩基；糖修飾（例えば、２’位又は４’位で）又は糖の置換；及び／又はホスホジエステル結合の修飾又は置換を含む骨格修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態に有用なｉＲＮＡ化合物の具体例としては、限定はされないが、修飾された骨格を含むか又は天然のヌクレオシド間結合を含まないＲＮＡが挙げられる。修飾された骨格を有するＲＮＡとしては、特に、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的のために、及び当該技術分野において時折言及されるように、ヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない、修飾ＲＮＡは、オリゴヌクレオシドであるとみなすこともできる。ある実施形態において、修飾ｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有する。
修飾ＲＮＡ骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート並びに３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、及び、ヌクレオシド単位の隣接する対が、３’−５’〜５’−３’又は２’−５’〜５’−２’に結合する、反転極性を有するものが挙げられる。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，４６９，８６３号明細書；同第４，４７６，３０１号明細書；同第５，０２３，２４３号明細書；同第５，１７７，１９５号明細書；同第５，１８８，８９７号明細書；同第５，２６４，４２３号明細書；同第５，２７６，０１９号明細書；同第５，２７８，３０２号明細書；同第５，２８６，７１７号明細書；同第５，３２１，１３１号明細書；同第５，３９９，６７６号明細書；同第５，４０５，９３９号明細書；同第５，４５３，４９６号明細書；同第５，４５５，２３３号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７６，９２５号明細書；同第５，５１９，１２６号明細書；同第５，５３６，８２１号明細書；同第５，５４１，３１６号明細書；同第５，５５０，１１１号明細書；同第５，５６３，２５３号明細書；同第５，５７１，７９９号明細書；同第５，５８７，３６１号明細書；同第５，６２５，０５０号明細書；同第６，０２８，１８８号明細書；同第６，１２４，４４５号明細書；同第６，１６０，１０９号明細書；同第６，１６９，１７０号明細書；同第６，１７２，２０９号明細書；同第６，２３９，２６５号明細書；同第６，２７７，６０３号明細書；同第６，３２６，１９９号明細書；同第６，３４６，６１４号明細書；同第６，４４４，４２３号明細書；同第６，５３１，５９０号明細書；同第６，５３４，６３９号明細書；同第６，６０８，０３５号明細書；同第６，６８３，１６７号明細書；同第６，８５８，７１５号明細書；同第６，８６７，２９４号明細書；同第６，８７８，８０５号明細書；同第７，０１５，３１５号明細書；同第７，０４１，８１６号明細書；同第７，２７３，９３３号明細書；同第７，３２１，０２９号明細書；及び米国再発行特許第ＲＥ３９４６４号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
内部にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ又は複数の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらとしては、モルホリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から形成された）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分を有する他のものが挙げられる。
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；同第５，１６６，３１５号明細書；同第５，１８５，４４４号明細書；同第５，２１４，１３４号明細書；同第５，２１６，１４１号明細書；同第５，２３５，０３３号明細書；同第５，６４，５６２号明細書；同第５，２６４，５６４号明細書；同第５，４０５，９３８号明細書；同第５，４３４，２５７号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７０，９６７号明細書；同第５，４８９，６７７号明細書；同第５，５４１，３０７号明細書；同第５，５６１，２２５号明細書；同第５，５９６，０８６号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６１８，７０４号明細書；同第５，６２３，０７０号明細書；同第５，６６３，３１２号明細書；同第５，６３３，３６０号明細書；同第５，６７７，４３７号明細書；及び同第５，６７７，４３９号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
他の実施形態において、好適なＲＮＡ模倣体が、ｉＲＮＡにおける使用のために考えられ、ここで、糖及びヌクレオシド間結合の両方、即ち、ヌクレオチド単位の骨格が、新規な基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されている、このようなオリゴマー化合物の１つであるＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖骨格が、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１；及び同第５，７１９，２６２号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。本発明のｉＲＮＡに使用するのに好適な更なるＰＮＡ化合物が、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に記載されている。
本発明に取り上げられるある実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するＲＮＡ及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドを含み、特に、上述した米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ２−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られている］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−及び−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［式中、天然のホスホジエステル骨格は、−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−として表される］、及び上述した米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド骨格を含む。ある実施形態において、本明細書に取り上げられるＲＮＡは、上述した米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ骨格構造を有する。
修飾ＲＮＡは、１つ又は複数の置換された糖部分も含有し得る。本明細書に取り上げられるｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位において、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含むことができ、ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。例示的な好適な修飾は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２を含み、式中、ｎ及びｍが、１〜約１０である。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２’位において、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、ｉＲＮＡの薬力学的特性を向上させる基、又はｉＲＮＡの薬物動態特性を向上させる基、及び同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。ある実施形態において、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られている２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６−５０４）、即ち、アルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、本明細書において以下の実施例に記載される、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、即ち、２’−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２である。
他の修飾は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾を、ｉＲＮＡのＲＮＡにおける他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上又は２’−５’結合ｄｓＲＮＡ中の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行うこともできる。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有し得る。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；同第５，１１８，８００号明細書；同第５，３１９，０８０号明細書；同第５，３５９，０４４号明細書；同第５，３９３，８７８号明細書；同第５，４４６，１３７号明細書；同第５，４６６，７８６号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５１９，１３４号明細書；同第５，５６７，８１１号明細書；同第５，５７６，４２７号明細書；同第５，５９１，７２２号明細書；同第５，５９７，９０９号明細書；同第５，６１０，３００号明細書；同第５，６２７，０５３号明細書；同第５，６３９，８７３号明細書；同第５，６４６，２６５号明細書；同第５，６５８，８７３号明細書；同第５，６７０，６３３号明細書；及び同第５，７００，９２０号明細書が挙げられ、これらのうちのいくつかは、本出願と所有者が同一である。上記のそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
ｉＲＮＡは、核酸塩基（当該技術分野において多くの場合、単に「塩基」と呼ばれる）修飾又は置換も含み得る。本明細書において使用される際、「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、デオキシ−チミン（ｄＴ）、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルアデニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−ダアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなどの他の合成及び天然核酸塩基を含む。更なる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８に開示されるもの；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明に取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらとしては、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換基が、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃だけ増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、例示的な塩基置換であり、特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる場合は尚更である。
上記の修飾核酸塩基並びに他の修飾核酸塩基のいくつかの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書、同第４，８４５，２０５号明細書；同第５，１３０，３０号明細書；同第５，１３４，０６６号明細書；同第５，１７５，２７３号明細書；同第５，３６７，０６６号明細書；同第５，４３２，２７２号明細書；同第５，４５７，１８７号明細書；同第５，４５９，２５５号明細書；同第５，４８４，９０８号明細書；同第５，５０２，１７７号明細書；同第５，５２５，７１１号明細書；同第５，５５２，５４０号明細書；同第５，５８７，４６９号明細書；同第５，５９４，１２１号明細書、同第５，５９６，０９１号明細書；同第５，６１４，６１７号明細書；同第５，６８１，９４１号明細書；同第５，７５０，６９２号明細書；同第６，０１５，８８６号明細書；同第６，１４７，２００号明細書；同第６，１６６，１９７号明細書；同第６，２２２，０２５号明細書；同第６，２３５，８８７号明細書；同第６，３８０，３６８号明細書；同第６，５２８，６４０号明細書；同第６，６３９，０６２号明細書；同第６，６１７，４３８号明細書；同第７，０４５，６１０号明細書；同第７，４２７，６７２号明細書；及び同第７，４９５，０８８号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ又は複数のロックト核酸（ＬＮＡ）を含むように修飾され得る。ロックト核酸は、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドであり、リボース部分は、２’及び４’炭素を結合する追加の架橋を含む。この構造は、３’−ｅｎｄｏ構造的立体配置におけるリボースを有効に「ロックする」。ｓｉＲＮＡにロックト核酸を加えると、血清中のｓｉＲＮＡ安定性が増加し、オフターゲット効果が低下されることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９−４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３−８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５−３１９３）。
ロックト核酸ヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；同第６，６７０，４６１号明細書；同第６，７９４，４９９号明細書；同第６，９９８，４８４号明細書；同第７，０５３，２０７号明細書；同第７，０８４，１２５号明細書；及び同第７，３９９，８４５号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
ＲＮＡ分子の末端に対する潜在的に安定した修飾は、Ｎ−（アセチルアミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−ＮＨＡｃ）、Ｎ−（カプロイル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６）、Ｎ−（アセチル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−ＮＨＡｃ）、チミジン−２’−０−デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ−（アミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−アミノ）、２−ドコサノイル−ウリジン−３”−ホスフェート、逆方向塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｂａｓｅ）ｄＴ（ｉｄＴ）などを含み得る。この修飾の開示は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットに見られる。
Ａ．本発明のモチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明の特定の態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤としては、例えば、それぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される、２０１１年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／５６１，７１０号明細書、又は２０１２年１１月１６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５６９１号明細書に開示される化学的修飾を有する剤が挙げられる。
本明細書及び米国仮特許出願第６１／５６１，７１０号明細書に示されるように、より優れた結果が、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフを、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖中、特に、切断部位又はその近傍に導入することによって得られる。ある実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、あるいは完全に修飾され得る。これらのモチーフの導入により、存在する場合、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の修飾パターンが中断される。ＲＮＡｉ剤は、例えば、センス鎖上で、ＧａｌＮＡｃ誘導体リガンドと任意選択的にコンジュゲートされ得る。得られたＲＮＡｉ剤は、より優れた遺伝子サイレンシング活性を示す。
より詳細には、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖が、ＲＮＡｉ剤の少なくとも１つの鎖の切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフを有するように修飾される場合、ＲＮＡｉ剤の遺伝子サイレンシング活性が優位に向上されたことが意外にも発見された。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、１９ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｄｅｄ ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、センス鎖は、５’末端から７位、８位、９位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２０ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端から８位、９位、１０位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
更に別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端から９位、１０位、１１位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチドセンス鎖及び２３ヌクレオチドアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’末端から９位、１０位、１１位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み；アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ＲＮＡｉ剤の一方の末端が平滑である一方、他方の末端は、２つのヌクレオチドオーバーハングを含む。好ましくは、２つのヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にある。２つのヌクレオチドオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’末端にある場合、末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合があり得、３つのうちの２つのヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端の両方における末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に有する。一実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。一実施形態において、各残基が、独立して、例えば、交互のモチーフ中で、２’−Ｏ−メチル又は３’−フルオロで修飾される。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、リガンド（好ましくは、ＧａｌＮＡｃ３）を更に含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ＲＮＡｉ剤は、少なくとも２５且つ２９以下のヌクレオチド長を有する第１の鎖と、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む、３０ヌクレオチド長以下を有する第２の鎖とを含み；第１の鎖の３’末端及び第２の鎖の５’末端が、平滑末端を形成し、第２の鎖は、その３’末端で第１の鎖より１〜４ヌクレオチド長く、二本鎖領域は、少なくとも２５ヌクレオチド長であり、第２の鎖は、ＲＮＡｉ剤が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させるように、第２の鎖長の少なくとも１９のヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡに十分に相補的であり、ＲＮＡｉ剤のダイサー切断（ｄｉｃｅｒ ｃｌｅａｖａｇｅ）が、第２の鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡを優先的にもたらし、それにより、哺乳動物における標的遺伝子の発現を低下させる。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、リガンドを更に含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、センス鎖の切断部位に存在する。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖も、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含むことができ、モチーフの１つは、アンチセンス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。
１７〜２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有するＲＮＡｉ剤では、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的に、５’末端から１０位、１１位及び１２位の付近である。したがって、３つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて、又は、アンチセンス鎖の５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；又は１３位、１４位、１５位に存在し得る。アンチセンス鎖中の切断部位はまた、５’末端からのＲＮＡｉの二本鎖領域の長さに応じて変化し得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、鎖の切断部位に３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含んでいてもよく；アンチセンス鎖は、鎖の切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを有し得る。センス鎖及びアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する場合、センス鎖及びアンチセンス鎖は、センス鎖における３つのヌクレオチドの１つのモチーフ及びアンチセンス鎖における３つのヌクレオチドの１つのモチーフが、少なくとも１つのヌクレオチドの重複を有し、即ち、センス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、アンチセンス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つと塩基対を形成するように整列され得る。あるいは、少なくとも２つのヌクレオチドが重複してもよく、又は全ての３つのヌクレオチドが重複してもよい。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の２つ以上のモチーフを含み得る。第１のモチーフは、鎖の切断部位又はその近傍に存在してもよく、他のモチーフは、ウイング修飾（ｗｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であり得る。本明細書における「ウイング修飾」という用語は、同じ鎖の切断部位又はその近傍のモチーフから離れた鎖の別の部分に存在するモチーフを指す。ウイング修飾は、第１のモチーフに隣接するか、又は少なくとも１つ又は複数のヌクレオチドによって隔てられている。モチーフが、互いに直接隣接している場合、モチーフの化学構造は、互いに異なり、モチーフが、１つ又は複数のヌクレオチドによって隔てられている場合、化学構造は、同じか又は異なり得る。２つ以上のウイング修飾が存在し得る。例えば、２つのウイング修飾が存在する場合、各ウイング修飾は、切断部位又はその近傍の第１のモチーフに対して１つの端部に又はリードモチーフ（ｌｅａｄ ｍｏｔｉｆ）のいずれかの側に存在し得る。
センス鎖と同様に、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の２つ以上のモチーフを含んでいてもよく、モチーフの少なくとも１つが、鎖の切断部位又はその近傍に存在する。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖に存在し得るウイング修飾と同様の配列で１つ又は複数のウイング修飾を含み得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端又は両方の末端に第１の１つ又は２つの末端ヌクレオチドを含まない。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端又は両方の末端の二本鎖領域内に第１の１つ又は２つの対合ヌクレオチドを含まない。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも１つのウイング修飾を含む場合、ウイング修飾は、二本鎖領域の同じ末端に位置してもよく、１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有し得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも２つのウイング修飾を含む場合、センス鎖及びアンチセンス鎖は、１つの鎖からの２つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の１つの末端に位置して、１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖からの２つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の他方の末端に位置して、１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖からの２つの修飾がリードモチーフの各側に位置して、二本鎖領域中に１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有するように整列され得る。
一実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドが修飾され得る。各ヌクレオチドは、同じ又は異なる修飾で修飾されてもよく、この修飾は、非結合リン酸酸素及び／又は結合リン酸酸素の１つ又は複数の一方又は両方の１つ又は複数の変更；リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの変更；「脱リン（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ）」リンカーによるリン酸部分の大規模な置換；天然の塩基の修飾又は置換；及びリボース−リン酸骨格の置換又は修飾を含み得る。
核酸が、サブユニットのポリマーであるため、例えば、塩基、又はリン酸部分、又はリン酸部分の非結合Ｏの修飾といった修飾の多くは、核酸内の繰り返される位置に存在する。場合によっては、修飾は、核酸中の目的の位置の全てに存在し得るが、多くの場合、そうではない。例として、修飾は、３’又は５’末端位置のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置又は鎖の最後の２、３、４、５、又は１０のヌクレオチドのみに存在してもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、又はその両方に存在してもよい。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域のみに存在してもよく、又はＲＮＡの一本鎖領域のみに存在してもよい。例えば、非結合Ｏ位置におけるホスホロチオエート修飾は、一方又は両方の末端のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置又は鎖の最後の２、３、４、５、又は１０のヌクレオチドのみに存在してもよく、又は二本鎖及び一本鎖領域、特に、末端に存在してもよい。５’末端又は両方の末端が、リン酸化され得る。
例えば、安定性を高めること、オーバーハング中に特定の塩基を含むこと、又は一本鎖オーバーハング、例えば、５’又は３’オーバーハング、又はその両方に修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド代用物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）を含むことが可能であり得る。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含むことが望ましいことがある。ある実施形態において、３’又は５’オーバーハング中の塩基の全て又は一部が、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾されてもよい。修飾は、例えば、当該技術分野において公知の修飾によるリボース糖の２’位における修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりにデオキシリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）又は２’−Ｏ−メチル修飾の使用、及びリン酸基の修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立して、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、２’−ヒドロキシル、又は２’−フルオロで修飾される。鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立して、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロで修飾される。
少なくとも２つの異なる修飾が、典型的に、センス鎖及びアンチセンス鎖に存在する。それらの２つの修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾、又は他のものであり得る。
一実施形態において、Ｎａ及び／又はＮｂは、交互のパターンの修飾を含む。本明細書において使用される際の「交互のモチーフ」という用語は、１つ又は複数の修飾を有するモチーフを指し、各修飾が、１つの鎖の交互のヌクレオチドに存在する。交互のヌクレオチドは、１つおきのヌクレオチドに１つ又は３つおきのヌクレオチドに１つ、又は同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、Ｂ及びＣがそれぞれ、ヌクレオチドに対する１つのタイプの修飾を表す場合、交互のモチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ・・・」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ・・・」、又は「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ・・・」などであり得る。
交互のモチーフに含まれる修飾のタイプは、同じか又は異なり得る。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄがそれぞれ、ヌクレオチド上の１つのタイプの修飾を表す場合、交互のパターン、即ち、１つおきのヌクレオチドにおける修飾は、同じであってもよいが、センス鎖又はアンチセンス鎖のそれぞれが、「ＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＣＡＣＡＣ・・・」「ＢＤＢＤＢＤ・・・」又は「ＣＤＣＤＣＤ・・・」などの交互のモチーフ内の修飾のいくつかの可能性から選択され得る。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖における交互のモチーフの修飾パターンに対してシフトされた、センス鎖における交互のモチーフの修飾パターンを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾の基に対応するか、その逆であるようなシフトであり得る。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二本鎖におけるアンチセンス鎖と対合される場合、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５’から３’へと「ＡＢＡＢＡＢ」から開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へと「ＢＡＢＡＢＡ」から開始され得る。別の例として、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５’から３’へと「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」から開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へと「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」から開始してもよく、それにより、センス鎖とアンチセンス鎖との間の修飾パターンの完全な又は部分的なシフトが存在する。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンを含み、このパターンは、最初に、アンチセンス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンに対するシフトを有し、即ち、センス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドが、アンチセンス鎖における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと塩基対を形成し、その逆も同様である。センス鎖の１位は、２’−Ｆ修飾から開始してもよく、アンチセンス鎖の１位は、２’−Ｏ−メチル修飾から開始してもよい。
センス鎖及び／又はアンチセンス鎖への、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフの導入は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖中に存在する最初の修飾パターンを中断する。センス鎖及び／又はアンチセンス鎖に３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフを導入することによる、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の修飾パターンのこの中断は、標的遺伝子の対する遺伝子サイレンシング活性を意外にも高める。
一実施形態において、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフが、鎖のいずれかに導入される場合、モチーフに隣接するヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾と異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の一部は、「・・・ＮａＹＹＹＮｂ・・・」であり、ここで、「Ｙ」は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾のモチーフの修飾を表し、「Ｎａ」及び「Ｎｂ」は、Ｙの修飾と異なる、モチーフ「ＹＹＹ」に隣接するヌクレオチドの修飾を表し、Ｎａ及びＮｂは、同じか又は異なる修飾であり得る。あるいは、Ｎａ及び／又はＮｂは、ウイング修飾が存在する場合、存在していても又は存在していなくてもよい。
ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含み得る。ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾は、鎖のいずれかの位置の、センス鎖又はアンチセンス鎖又は両方の鎖の任意のヌクレオチドに存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖における全てのヌクレオチドに存在してもよく；各ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖において交互のパターンで存在してもよく；又はセンス鎖又はアンチセンス鎖は、交互のパターンで両方のヌクレオチド間結合の修飾を含み得る。センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖と同じか又は異なっていてもよく、センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンに対するシフトを有し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉは、オーバーハング領域にホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド間結合の修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを、二本鎖領域内の末端の対合ヌクレオチドと結合するために形成され得る。例えば、少なくとも２、３、４、又は全てのオーバーハングヌクレオチドが、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合によって結合されてもよく、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと結合する更なるホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が存在し得る。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在してもよく、３つのヌクレオチドのうちの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。これらの末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、及び／又はアンチセンス鎖の５’末端に存在し得る。
一実施形態において、２つのヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にあり、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在し、３つのヌクレオチドのうちの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端の両方において、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に有し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、標的とのミスマッチ、二本鎖内のミスマッチ、又はそれらの組合せを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域又は二本鎖領域で生じ得る。塩基対は、解離又は融解（例えば、特定の対合の結合又は解離の自由エネルギーに対してであり、最も簡単な手法は、個々の対ごとに対を調べることであるが、類似の又は同様の分析も使用され得る）を促進する傾向に基づいて評価され得る。解離の促進に関して：Ａ：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｇ：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｉ：Ｃが、Ｇ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非正準又は正準以外の対合（本明細書の他の箇所に記載される）が、正準な（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合より好ましく；ユニバーサル塩基を含む対合が、正準な対合より好ましい。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立して選択されるアンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの塩基対のうちの少なくとも１つ、及び二本鎖の５’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するためのミスマッチ対、例えば、非正準又は正準以外の対合又はユニバーサル塩基を含む対合を含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の１位におけるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、及びｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の１、２又は３塩基対のうちの少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の第１の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
一実施形態において、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉ）
（式中：
ｉ及びｊがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ及びｑがそれぞれ、独立して、０〜６であり；
各Ｎａが、独立して、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂが、独立して、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ及びｎｑが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎｂ及びＹが、同じ修飾を有さず；
ＸＸＸ、ＹＹＹ及びＺＺＺがそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表され得る。好ましくは、ＹＹＹが、全て２’−Ｆ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態において、Ｎａ及び／又はＮｂは、交互のパターンの修飾を含む。
一実施形態において、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７〜２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、センス鎖の切断部位又はその近傍に存在し得る（例えば：６位、７位、８位、７位、８位、９位、８位、９位、１０位、９位、１０位、１１位、１０位、１１位、１２位又は１１位、１２位、１３位に存在し得る）。
一実施形態において、ｉが１であり、ｊが０であり、又はｉが０であり、ｊが１であり、又はｉ及びｊの両方が１である。したがって、センス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｂ）；
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｃ）；又は
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｄ）。
センス鎖が、式（Ｉｂ）によって表される場合、Ｎｂは、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が、式（Ｉｃ）として表される場合、Ｎｂは、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が、式（Ｉｄ）として表される場合、各Ｎｂは、独立して、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５又は６である。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
Ｘ、Ｙ及びＺのそれぞれが、互いに同じか又は異なり得る。
他の実施形態において、ｉが０であり、ｊが０であり、センス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉａ）。
センス鎖が、式（Ｉａ）によって表される場合、各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）：
５’ｎｑ’−Ｎａ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ−Ｎ’ａ−ｎｐ’３’（ＩＩ）
（式中：
ｋ及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ’及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
各Ｎａ’が、独立して、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ’が、独立して、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’及びｎｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎｂ’及びＹ’が、同じ修飾を有さず；
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表され得る。
一実施形態において、Ｎａ’及び／又はＮｂ’は、交互のパターンの修飾を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７〜２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；又は１３位、１４位、１５位に存在し得る。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１位、１２位、１３位に存在する。
一実施形態において、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、全て２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態において、ｋが１であり、ｌが０であり、又はｋが０であり、ｌが１であり、又はｋ及びｌの両方が１である。
したがって、アンチセンス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｐ’３’（ＩＩｂ）；
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−ｎｐ’３’（ＩＩｃ）；又は
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎａ’−ｎｐ’３’（ＩＩｄ）。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｂ）によって表される場合、Ｎｂ ’は、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｃ）として表される場合、Ｎｂ’は、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ’は、独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５又は６である。
他の実施形態において、ｋが０であり、ｌが０であり、アンチセンス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’３’（Ｉａ）。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）として表される場合、各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
Ｘ’、Ｙ’及びＺ’のそれぞれが、互いに同じか又は異なり得る。
センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−ヒドロキシル、又は２’−フルオロで修飾され得る。例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロで修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、特に、２’−Ｏ−メチル修飾又は２’−フルオロ修飾を表し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二本鎖領域が２１のヌクレオチドである場合、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の９位、１０位及び１１位に存在するＹＹＹモチーフを含んでいてもよく；Ｙは、２’−Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸＸＸモチーフ又はＺＺＺモチーフを更に含んでいてもよく；ＸＸＸ及びＺＺＺはそれぞれ、独立して、２’−ＯＭｅ修飾又は２’−Ｆ修飾を表す。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の１１位、１２位、１３位に存在するＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含んでいてもよく；Ｙ’は、２’−Ｏ−メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフ又はＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフを更に含んでいてもよく；Ｘ’Ｘ’Ｘ’及びＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ、独立して、２’−ＯＭｅ修飾又は２’−Ｆ修飾を表す。
上の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、及び（Ｉｄ）のいずれか１つによって表されるセンス鎖はそれぞれ、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、及び（ＩＩｄ）のいずれか１つによって表されるアンチセンス鎖と二本鎖を形成する。
したがって、本発明の方法に使用するためのＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含んでいてもよく、各鎖は、１４〜３０のヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二本鎖は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ ’−Ｎａ ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ ’−ｎｑ ’５’
（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
各Ｎａ及びＮａ ’が、独立して、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ及びＮｂ ’が、独立して、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ここで、
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’、及びｎｑが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上に３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表される。
一実施形態において、ｉが０であり、ｊが０であり；又はｉが１であり、ｊが０であり；又はｉが０であり、ｊが１であり；又はｉ及びｊの両方が０であり；又はｉ及びｊの両方が１である。別の実施形態において、ｋが０であり、ｌが０であり；又はｋが１であり、ｌが０であり；ｋが０であり、ｌが１であり；又はｋ及びｌの両方が０であり；又はｋ及びｌの両方が１である。
ＲＮＡｉ二本鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の例示的な組合せは、以下の式を含む：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ ’−Ｎａ ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ ’ｎｑ ’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ ’−Ｎａ ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ ’ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ ’−Ｎａ ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ ’−ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｃ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ ’−Ｎａ ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ−ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｄ）
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）によって表される場合、各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）によって表される場合、各Ｎｂは、独立して、１〜１０、１〜７、１〜５又は１〜４の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、Ｎｂ及びＮｂ ’のそれぞれは、独立して、交互のパターンの修飾を含む。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）中のＸ、Ｙ及びＺのそれぞれは、互いに同じか又は異なり得る。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｙ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＹヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）又は（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｚ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＺヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）又は（ＩＩＩｄ）として表される場合、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｘ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＸヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
一実施形態において、Ｙヌクレオチド上の修飾は、Ｙ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、Ｚヌクレオチド上の修飾は、Ｚ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、及び／又はＸヌクレオチド上の修飾は、Ｘ’ヌクレオチド上の修飾と異なる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾である。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される。更に別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される少なくとも２つの二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能又は切断不可能であり得る。任意選択で、多量体は、リガンドを更に含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又は二本鎖のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上の二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能又は切断不可能であり得る。任意選択で、多量体は、リガンドを更に含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又は二本鎖のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
一実施形態において、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される２つのＲＮＡｉ剤は、５’末端、及び３’末端の一方又は両方で互いに結合され、任意選択で、リガンドにコンジュゲートされる。ＲＮＡｉ剤のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又はＲＮＡｉ剤のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
様々な刊行物に、本発明の方法に使用され得る多量体ＲＮＡｉ剤が記載されている。このような刊行物としては、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７８５８７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号パンフレット、国際公開第２００７／１１７６８６号パンフレット、国際公開第２００９／０１４８８７号パンフレット及び国際公開第２０１１／０３１５２０号パンフレットが挙げられ、それぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
ＲＮＡｉ剤に対する１つ又は複数の炭水化物部分のコンジュゲーションを含むＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤の１つ又は複数の特性を最適化することができる。多くの場合、炭水化物部分は、ＲＮＡｉ剤の修飾サブユニットに結合される。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の１つ又は複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば、炭水化物リガンドが結合される非炭水化物（好ましくは環状の）担体で置換され得る。サブユニットのリボース糖がこのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書において、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。環状担体は、炭素環系であってもよく、即ち、全ての環原子が、炭素原子であり、又は複素環系、即ち、１つ又は複数の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る。環状担体は、単環系であってもよく、又は２つ以上の環、例えば縮合環を含み得る。環状担体は、完全に飽和した環系であってもよく、又は１つ又は複数の二重結合を含み得る。
リガンドは、担体を介してポリヌクレオチドに結合され得る。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格結合点」、好ましくは、２つの「骨格結合点」及び（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー結合点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｏｉｎｔ）」を含む。本明細書において使用される際の「骨格結合点」は、官能基、例えば、ヒドロキシル基、又は一般に、骨格、例えば、リン酸塩、又は修飾リン酸塩、例えば、硫黄を含有する、リボ核酸の骨格中への担体の組み込みに利用可能であり且つそれに適した結合を指す。「テザー結合点」（ＴＡＰ）は、ある実施形態において、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子又はヘテロ原子（骨格結合点を提供する原子と異なる）を指す。この部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖及び多糖であり得る。任意選択で、選択された部分は、介在するテザー（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｔｅｔｈｅｒ）によって環状担体に接続される。したがって、環状担体は、多くの場合、官能基、例えば、アミノ基を含み、又は一般に、構成環への別の化学成分、例えば、リガンドの組み込み又は連結（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）に適した結合を提供する。
ＲＮＡｉ剤は、担体を介してリガンドにコンジュゲートされてもよく、この担体は、環式基又は環式基であり得；好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル（ｐｙｒｉｄａｚｉｎｏｎｙｌ）、テトラヒドロフリル及びデカリンから選択され；好ましくは、環式基は、セリノール骨格又はジエタノールアミン骨格から選択される。
ある特定の実施形態において、本発明の方法に使用するためのＲＮＡｉ剤は、表１、２、４、５、８、１０、及び１２のいずれか１つに列挙される剤の群から選択される剤である。一実施形態において、剤が表１２に列挙される剤である場合、剤には、末端ｄＴが欠如し得る。
本発明は、アンチセンス鎖上に５’リン酸又は５’リン酸模倣体を含む、表１、２、４、５、８、１０、及び１２のいずれか１つに列挙される配列のいずれか１つを含む二本鎖ＲＮＡｉ剤を更に含む（例えば、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１１００５８６０号パンフレットを参照）。更に、本発明は、センス鎖の５’末端に２’−ＯＭｅ基の代わりに２’フルオロ基を含む、表１、２、４、５、８、１０、及び１２のいずれか１つに列挙される配列のいずれか１つを含む二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む。
これらの薬剤は、リガンドを更に含み得る。
一実施形態において、剤は、ＡＤ−６０９４０（センス鎖：ＣｆｓｕｓＧｆｇＵｆａＵｆｕＵｆＣｆＣｆｕＡｆｇＧｆｇＵｆａＣｆａＡｆＬ９６；アンチセンス鎖：ｕｓＵｆｓｇＵｆａＣｆｃＣｆｕＡｆｇｇａＡｆａＵｆａＣｆｃＡｆｇｓａｓｇ）である。
Ａ．リガンド
本発明の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤は、任意選択で、１つ又は複数のリガンドにコンジュゲートされ得る。リガンドは、３’末端、５’末端又は両方の末端において、センス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖に結合され得る。例えば、リガンドは、センス鎖にコンジュゲートされ得る。好ましい実施形態において、リガンドは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。好ましい一実施形態において、リガンドは、ＧａｌＮＡｃリガンドである。特に好ましい実施形態において、リガンドは、ＧａｌＮＡｃ３である：
Figure 2016520593
ある実施形態において、リガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃリガンドは、ＲＮＡｉ剤の３’末端に結合される。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、以下の概略図
Figure 2016520593
 （式中、Ｘが、Ｏ又はＳである）に示されるように、リガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃリガンドにコンジュゲートされる。一実施形態において、ＸがＯである。
様々な構成要素が、本発明のＲＮＡｉ剤に結合され得る。好ましい部分は、介在するテザーを介して直接又は間接的に、好ましくは共有結合で結合されるリガンドである。
好ましい実施形態において、リガンドは、リガンドが組み込まれる分子の分布、標的化又は寿命を変化させる。好ましい実施形態において、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない種と比較して、選択された標的、例えば、分子、細胞又は細胞型、区画、受容体、例えば、細胞若しくは器官の区画、組織、器官又は身体の領域に対する向上した親和性を提供する。選択された標的に対する向上した親和性を提供するリガンドは、標的化リガンドとも呼ばれる。
一部のリガンドは、エンドソーム溶解特性を有し得る。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解及び／又は本発明の組成物、又はその成分の、エンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解リガンドは、ｐＨ依存性の膜活性及び融合性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を示すポリアニオン性ペプチド又はペプチド模倣体であり得る。一実施形態において、エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームのｐＨでその活性立体配座を取る。「活性」立体配座は、エンドソーム溶解リガンドが、エンドソームの溶解及び／又は本発明の組成物、又はその成分の、エンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する立体配座である。例示的なエンドソーム溶解リガンドとしては、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：２９６４−２９７２）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：１５８１−１５８６）、及びそれらの誘導体（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２，１５５９：５６−６８）が挙げられる。一実施形態において、エンドソーム溶解成分は、ｐＨの変化に応じて電荷の変化又はプロトン化を起こす化学基（例えば、アミノ酸）を含み得る。エンドソーム溶解成分は、直鎖状又は分枝鎖状であり得る。
リガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、及び特異性の特性を向上させることができ、得られる天然若しくは修飾オリゴリボヌクレオチド、又は本明細書に記載されるモノマーの任意の組合せを含むポリマー分子及び／又は天然若しくは修飾リボヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性も向上させ得る。
リガンドは、一般に、例えば、取り込みを向上させるための、治療用の修飾因子；例えば、分布を監視するための診断化合物又はレポーター基；架橋剤；及びヌクレアーゼ耐性を与える部分を含み得る。一般的な例としては、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、及びペプチド模倣体が挙げられる。
リガンドは、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク（ＨＤＬ）、又はグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン又はヒアルロン酸）；又は脂質などの天然の物質を含み得る。リガンドはまた、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）などの、組み換え又は合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリアミノ酸は、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジンである。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、又はα−へリックスペプチドが挙げられる。
リガンドはまた、標的基、例えば、細胞又は組織標的剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質、例えば、腎細胞などの特定の細胞型に結合する抗体を含み得る。標的基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、フォレート、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体又はアプタマーであり得る。
リガンドの他の例としては、色素、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ又はキレート剤（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸（ｃｈｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）及びペプチド複合体（例えば、アンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）ペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）、アクリジン−イミダゾール複合体、Ｅｕ３＋テトラアザ大員環複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、又はＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、又はペプチド、例えば、コリガンド（ｃｏ−ｌｉｇａｎｄ）、又は抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、又は骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体に対する特異親和性を有する分子であり得る。リガンドはまた、ホルモン及びホルモン受容体を含んでもよい。リガンドはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース又はアプタマーなどの非ペプチド種を含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、又はＮＦ−κＢの活性化因子であり得る。
リガンドは、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、及び／又は中間径フィラメントを破壊することによって、例えば、細胞骨格を破壊することによって、細胞中へのｉＲＮＡ剤の取り込みを向上させ得る物質、例えば、薬剤であり得る。薬剤は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、又はミオセルビンであり得る。
リガンドは、例えば、炎症反応を活性化することによって、細胞中へのオリゴヌクレオチドの取り込みを増加させ得る。このような効果を与え得る例示的なリガンドとしては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β、又はγインターフェロンが挙げられる。
一態様において、リガンドは、脂質又は脂質ベースの分子である。このような脂質又は脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、身体の標的組織、例えば、非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分配を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得る他の分子も、リガンドとして使用され得る。例えば、ナプロキセン又はアスピリンが使用され得る。脂質又は脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大し、（ｂ）標的細胞又は細胞膜への標的化又は輸送を増大し、及び／又は（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するのに使用され得る。
脂質ベースのリガンドを用いて、標的組織へのコンジュゲートの結合を調節すること、例えば、制御することができる。例えば、より強くＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドは、腎臓に対して標的化される可能性が低く、したがって、身体から除去される可能性が低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドを用いて、コンジュゲートを腎臓に対して標的化することができる。
好ましい実施形態において、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに結合する。好ましくは、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが好ましくは非腎臓組織に分配されるような十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかしながら、親和性は、ＨＳＡ−リガンド結合が反転され得ないほど強力でないのが好ましい。
別の好ましい実施形態において、コンジュゲートが好ましくは腎臓に分配されるように、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか又は全く結合しない。腎細胞を標的とする他の部分も、脂質ベースのリガンドの代わりに又はそれに加えて使用され得る。
別の態様において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性又は非悪性の望ましくない細胞増殖、例えば、癌細胞を特徴とする障害を処置するのに特に有用である。例示的なビタミンは、ビタミンＡ、Ｅ、及びＫを含む。他の例示的なビタミンは、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール又は他のビタミンあるいは癌細胞によって取り込まれる栄養素を含む。ＨＡＳ、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）及び高比重リポタンパク（ＨＤＬ）も含まれる。
別の態様において、リガンドは、細胞透過剤（ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）、好ましくは、らせん状細胞透過剤である。好ましくは、この剤は両親媒性である。例示的な剤は、ｔａｔ又はアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。この剤がペプチドである場合、それは、ペプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチド又は擬ペプチド結合、及びＤ−アミノ酸の使用を含めて修飾され得る。らせん状剤は、好ましくはα−へリックス剤であり、これは、好ましくは、親油性及び疎油性相を有する。
リガンドは、ペプチド又はペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書においてオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと類似した明確な三次元構造に折り畳まれることが可能な分子である。ペプチド又はペプチド模倣体部分は、約５〜５０個のアミノ酸の長さ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個のアミノ酸の長さであり得る。ペプチド又はペプチド模倣体は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、又は疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、構造規制（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチド又は架橋ペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１１）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１２））
も、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を介してペプチド、オリゴヌクレオチド、及びタンパク質を含む大型極性分子を運搬することができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質に由来する配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号１３）及びショウジョウバエアンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）（配列番号１４）は、送達ペプチドとして機能することが可能であることが分かっている。ペプチド又はペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー、又は１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドなどの、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４、１９９１）。好ましくは、組み込まれたモノマー単位を介してｉＲＮＡ剤に結合されたペプチド又はペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、又はＲＧＤ模倣体などのペプチドである。ペプチド部分は、約５つのアミノ酸から約４０個のアミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性又は直接配座特性を高めるためなどの構造修飾を有し得る。後述される構造修飾のいずれも用いられ得る。ＲＧＤペプチド部分は、内皮腫瘍細胞又は乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするのに使用され得る（Ｚｉｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：５１３９−４３，２００２）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、又は肝臓を含む様々な他の組織の腫瘍に対するｉＲＮＡ剤の標的化を促進することができる（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：７８３−７８７，２００１）。好ましくは、ＲＧＤペプチドは、腎臓に対するｉＲＮＡ剤の標的化を促進する。ＲＧＤペプチドは、直鎖状又は環状であり得、特定の組織に対する標的化を促進するために、修飾、例えば、グリコシル化又はメチル化され得る。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドは、ｉＲＮＡ剤を、αＶβ３を発現する腫瘍細胞に送達することができる（Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６−３３６，２００１）。増殖細胞に豊富なマーカーを標的とするペプチドが使用され得る。例えば、ＲＧＤ含有ペプチド及びペプチド模倣体は、癌細胞、特に、インテグリンを示す細胞を標的とすることができる。したがって、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含有する環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、ならびに合成ＲＧＤ模倣体を使用し得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞及び血管新生を制御するのに使用され得る。このタイプのリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、又は他の癌遺伝子、例えば、本明細書に記載される癌遺伝子を標的とする。
「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば、細菌又は真菌細胞などの微生物細胞、あるいはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過することが可能である。微生物細胞を透過するペプチドは、例えば、α−へリックス直鎖状ペプチド（例えば、ＬＬ−３７又はＣｅｒｏｐｉｎ Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシン又はバクテネシン（ｂａｃｔｅｎｅｃｉｎ））、又は１つ若しくは２つの支配的アミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９又はインドリシジン）であり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメイン及びＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。
一実施形態において、標的化ペプチドは、両親媒性α−へリックスペプチドであり得る。例示的な両親媒性α−へリックスペプチドとしては、限定はされないが、セクロピン、リコトキシン（ｌｙｃｏｔｏｘｉｎ）、パラダキシン（ｐａｒａｄａｘｉｎ）、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシジン、セラトトキシン（ｃｅｒａｔｏｔｏｘｉｎ）、エボヤ（Ｓ．ｃｌａｖａ）ペプチド、メクラウナギの腸由来の抗菌性ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン−２、デルマセプチン、メリチン、プレウロシジン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ペプチド、エスクレンチニス−１（ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎｉｓ−１）、及びカエリン（ｃａｅｒｉｎ）が挙げられる。いくつかの因子が、好ましくは、へリックス安定性の完全性を維持するものと考えられる。例えば、最大数のヘリックス安定化残基（例えば、ｌｅｕ、ａｌａ、又はｌｙｓ）が用いられ、最小数のヘリックス不安定化残基（例えば、プロリン、又は環状モノマー単位が用いられる。キャッピング残基が考えられる（例えば、Ｇｌｙが、例示的なＮ−キャッピング残基であり、及び／又はＣ末端アミド化が、へリックスを安定させるために追加のＨ結合を提供するのに使用され得る。ｉ±３位、又はｉ±４位だけ離間された、反対の電荷を有する残基間の塩架橋の形成により、安定性が提供され得る。例えば、リジン、アルギニン、ホモ−アルギニン、オルニチン又はヒスチジンなどのカチオン性残基が、アニオン性残基であるグルタミン酸又はアスパラギン酸と塩架橋を形成し得る。
ペプチド及びペプチド模倣体リガンドとしては、天然又は修飾ペプチド、例えば、Ｄ又はＬペプチド；α、β、又はγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つ又は複数の尿素結合、チオ尿素結合、カルバメート結合、又はスルホニル尿素結合で置換された１つ又は複数のアミド結合、即ち、ペプチド結合を有するペプチド；又は環状ペプチドを有するリガンドが挙げられる。
標的化リガンドは、特定の受容体を標的とすることが可能な任意のリガンドであり得る。例は、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、ＧａｌＮＡｃクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスターなどの糖のクラスター、又はアプタマーである。クラスターは、２つ以上の糖単位の組合せである。標的化リガンドは、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ及びＨＤＬリガンドも含む。リガンドはまた、核酸、例えば、アプタマーに基づき得る。アプタマーは、非修飾であり得、又は本明細書に開示される修飾の任意の組合せを有し得る。
エンドソーム放出剤としては、イミダゾール、ポリ又はオリゴイミダゾール、ＰＥＩ、ペプチド、融合性ペプチド、ポリカルボキシレート、ポリカチオン、マスクオリゴ又はポリカチオン又はアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケタール、オルトエステル、マスク又は非マスクカチオン又はアニオン電荷を有するポリマー、マスク又は非マスクカチオン又はアニオン電荷を有するデンドリマーが挙げられる。
ＰＫ調節剤は、薬物動態学的調節剤（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）を表す。ＰＫ調節剤としては、親油性物質（ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ）、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節剤としては、限定はされないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドも、血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、骨格に複数のホスホロチオエート結合を含む短鎖オリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基又は２０塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンドとして（例えば、ＰＫ調節リガンドとして）本発明に適している。
更に、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーも、ＰＫ調節リガンドとして本発明に適している。
本発明に適した他のリガンドコンジュゲートが、２００４年８月１０日に出願された米国特許出願第１０／９１６，１８５号明細書；２００４年９月２１日に出願された米国特許出願第１０／９４６，８７３号明細書；２００７年８月３日に出願された米国特許出願第１０／８３３，９３４号明細書；２００５年４月２７日に出願された米国特許出願第１１／１１５，９８９号明細書、及び２００７年１１月２１日に出願された米国特許出願第１１／９４４，２２７号明細書に記載されており、これらの文献は、あらゆる目的のために、全体が参照により援用される。
２つ以上のリガンドが存在する場合、リガンドは、全て同じ特性を有してもよく、全て異なる特性を有してもよく、又は一部のリガンドが同じ特性を有する一方、他のリガンドが異なる特性を有する。例えば、リガンドは、標的化特性を有してもよく、エンドソーム溶解活性を有してもよく、又はＰＫ調節特性を有してもよい。好ましい実施形態において、全てのリガンドが、異なる特性を有する。
リガンドは、様々な位置、例えば、３’末端、５’末端、及び／又は内部位置で、オリゴヌクレオチドに結合され得る。好ましい実施形態において、リガンドは、介在するテザー、例えば、本明細書に記載される担体を介してオリゴヌクレオチドに結合される。リガンド又は連結配位子は、モノマーが、成長している鎖に組み込まれるとき、モノマーに存在し得る。ある実施形態において、リガンドは、「前駆体」モノマーが、成長している鎖に組み込まれた後、「前駆体」モノマーへの結合によって組み込まれ得る。例えば、アミノ末端のテザーを例えば有するモノマー（即ち、リガンドが結合されてない）、例えばＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２が、成長しているオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれ得る。その後の作業において、即ち、前駆体モノマーを鎖に組み込んだ後、求電子基を有する、例えば、ペンタフルオロフェニルエステル基又はアルデヒド基を有するリガンドが、その後、リガンドの求電子基を前駆体モノマーのテザーの末端求電子基と結合することによって、前駆体モノマーに結合され得る。
別の例では、クリック化学反応に関与するのに適した化学基を有するモノマーが、例えば、アジド又はアルキン末端のテザー／リンカーに組み込まれ得る。その後の作業において、即ち、前駆体モノマーを鎖に組み込んだ後、相補的な化学基、例えば、アルキン又はアジドを有するリガンドが、アルキン及びアジドを一緒に結合することによって、前駆体モノマーに結合され得る。
二本鎖オリゴヌクレオチドの場合、リガンドが、一方又は両方の鎖に結合され得る。ある実施形態において、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、センス鎖にコンジュゲートされるリガンドを含む。他の実施形態において、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖にコンジュゲートされるリガンドを含む。
ある実施形態において、リガンドは、核酸分子の核酸塩基、糖部分、又はヌクレオシド間結合にコンジュゲートされ得る。プリン核酸塩基又はその誘導体に対するコンジュゲーションは、環内及び環外原子を含む任意の位置に生じ得る。ある実施形態において、プリン核酸塩基の２位、６位、７位、又は８位が、コンジュゲート部分に結合される。ピリミジン核酸塩基又はその誘導体に対するコンジュゲーションも、任意の位置に生じ得る。ある実施形態において、ピリミジン核酸塩基の２位、５位、及び６位が、コンジュゲート部分で置換され得る。ヌクレオシドの糖部分に対するコンジュゲーションは、任意の炭素原子に生じ得る。コンジュゲート部分に結合され得る糖部分の炭素原子の例としては、２’、３’、及び５’炭素原子が挙げられる。１’位も、脱塩基残基中など、コンジュゲート部分に結合され得る。ヌクレオシド間結合も、コンジュゲート部分を有し得る。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートなど）の場合、コンジュゲート部分は、リン原子に直接結合されるか、又はリン原子に結合されたＯ、Ｎ、若しくはＳ原子に結合され得る。アミン含有又はアミド含有ヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）の場合、コンジュゲート部分は、アミン若しくはアミドの窒素原子又は隣接する炭素原子に結合され得る。
ＲＮＡ干渉の分野における任意の好適なリガンドが使用され得るが、リガンドは、典型的に、炭水化物、例えば、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、多糖である。
リガンドを核酸にコンジュゲートするリンカーは、上述されるリンカーを含む。例えば、リガンドは、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合される１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）誘導体であり得る。
一実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、式（ＩＶ）〜（ＶＩＩ）のいずれかに示される構造を含む二価及び三価の分枝鎖状リンカーにコンジュゲートされる：
Figure 2016520593
 式中：
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ及びｑ５Ｃは、各存在に関して独立して０〜２０を表し、反復単位は、同一又は異なっていてもよく；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各々、各存在に関して独立して不在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、各存在に関して独立して不在、アルキレン、置換されたアルキレンであり、ここで、１つ又は複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ又はＣ（Ｏ）のうちの１つ又は複数により中断又は終結されてもよく；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各々、各存在に関して独立して不在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
Figure 2016520593
 Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは、リガンドを表し；即ち、それぞれ、各存在に関して独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、又は多糖であり；
Ｒａが、Ｈ又はアミノ酸側鎖である。
式（ＶＩＩ）のものなどの、三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、ＲＮＡｉ剤とともに使用されて、標的遺伝子の発現を阻害するのに特に有用である：
Figure 2016520593
 式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す。
ＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートする好適な二価及び三価の分枝鎖状結合基の例としては、限定はされないが、以下の化合物が挙げられる：
Figure 2016520593
Figure 2016520593
Figure 2016520593
他の実施形態において、本発明の方法に使用するためのＲＮＡｉ剤は、ＡＤ−５９７４３である。
ＩＩＩ．本発明のｉＲＮＡの送達
細胞、例えば、ヒト対象（例えば、ヘモクロマトーシスなどのＴＭＰＲＳＳ６に関連する障害に罹患している対象などの、ｉＲＮＡ剤を必要とする対象）などの対象中の細胞への本発明のｉＲＮＡ剤の送達は、いくつかの様々な方法で行うことができる。例えば、送達は、細胞を、本発明のｉＲＮＡとインビトロ又はインビボのいずれかで接触させることによって行われ得る。インビボ送達はまた、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって直接行われ得る。あるいは、インビボ送達は、ｉＲＮＡの発現をコードし、それを導く１つ又は複数のベクターを投与することによって、間接的に行われ得る。これらの代替例は、以下に更に説明される。
一般に、核酸分子を（インビトロ又はインビボで）送達する任意の方法は、本発明のｉＲＮＡとともに使用するために適合され得る（例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ａｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．，（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９−１４４及び国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照）。インビボ送達の場合、ｉＲＮＡ分子を送達するために考慮される因子としては、例えば、送達される分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、及び標的組織における送達される分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的効果は、局所投与によって、例えば、組織への直接注入又は移植によって、あるいは製剤を局所的に投与することによって、最小限に抑えられ得る。処置部位への局所投与は、剤の局所濃度を最大にし、剤によって悪影響を受け得るか又は剤を分解し得る、全身組織への剤の曝露を制限し、投与されるｉＲＮＡ分子の総投与量を少なくすることができる。いくつかの研究が、ｉＲＮＡが局所投与される場合の遺伝子産物のノックダウンの成功を示している。例えば、カニクイザルの硝子体内注射によるＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｒｅｔｉｎａ ２４：１３２−１３８）及びマウスの網膜下注射（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０−２１６）は両方とも、加齢性黄斑変性症の実験モデルにおける新血管形成を防ぐことを示した。更に、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内投与が腫瘍容積を減少させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７−２７４）、担癌マウスの生存を延長することができる（Ｋｉｍ，ＷＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３−３５０；Ｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５−５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注入による中枢神経系への局所送達（Ｄｏｒｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５９−６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００２）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１−５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０−１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４−６０２）及び鼻腔内投与による肺への局所送達（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６−４８４；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７−１０６８４；Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０−５５）による成功も示している。疾病の処置のためにｉＲＮＡを全身投与するために、ＲＮＡは、修飾され得るか、あるいは薬剤送達システムを用いて送達され得；両方の方法は、インビボでのエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速な分解を防ぐ働きをする。ＲＮＡ又は医薬担体の修飾は、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化を可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避することもできる。ｉＲＮＡ分子は、細胞取り込みを向上させ、分解を防ぐコレステロールなどの親油基への化学的結合によって修飾され得る。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートされるＡｐｏＢに対するｉＲＮＡを、マウスに全身投与し、肝臓及び空腸の両方においてａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンを得た（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３−１７８）。アプタマーへのｉＲＮＡのコンジュゲートは、前立腺癌のマウスモデルにおける腫瘍増殖を阻害し、腫瘍退縮を仲介することが示されている（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５−１０１５）。代替的な実施形態において、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、又はカチオン性送達システムなどの薬剤送達システムを用いて送達され得る。正に帯電したカチオン性送達システムは、ｉＲＮＡ分子（負に帯電した）の結合を促進し、また、負に帯電した細胞膜における相互作用を向上させて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、又はポリマーは、ｉＲＮＡに結合され得るか、又はｉＲＮＡを包む小胞又はミセル（例えば、Ｋｉｍ ＳＨ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７−１１６を参照）を形成するように誘導され得る。小胞又はミセルの形成は、全身投与される場合のｉＲＮＡの分解を更に防ぐ。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作製し、投与するための方法は、十分当業者の能力の範囲内である（例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ、ＤＲ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１−７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１−１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７−２０５を参照）。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬剤送達システムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）、上記参照；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）、上記を参照）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、「固体核酸脂質粒子」（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１−１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１−３２８；Ｐａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７−１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ａｕｇ １６ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２−４８７）、及びポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１−６７；Ｙｏｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９−１８０４）が挙げられる。ある実施形態において、ｉＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンとともに複合体を形成する。投与のための方法及びｉＲＮＡｓ及びシクロデキストリンの医薬組成物が、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７，４２７，６０５号明細書に見出され得る。
Ａ．ベクターでコードされた本発明のｉＲＮＡ
ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子を標的とするｉＲＮＡは、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．らの国際ＰＣＴ公開番号国際公開第００／２２１１３号パンフレット、Ｃｏｎｒａｄの国際ＰＣＴ公開番号国際公開第００／２２１１４号パンフレット、及びＣｏｎｒａｄの米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照）。発現は、使用される特定の構築物及び標的組織又は細胞型に応じて、一時的（およそ数時間から数週間）であるか又は持続され得る（数週間から数カ月又はそれ以上）。これらの導入遺伝子は、線状構築物、環状プラスミド、又はウイルスベクターとして導入することができ、これらは、組み込み又は非組み込みベクターであり得る。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして継承されるのを可能にするように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
ｉＲＮＡの個々の１つ又は複数の鎖は、発現ベクターにおけるプロモーターから転写され得る。２本の別個の鎖が発現されて、例えば、ｄｓＲＮＡを生成する場合、２つの別個の発現ベクターが、（例えば、トランスフェクション又は感染によって）標的細胞中に共導入され得る。あるいは、ｄｓＲＮＡの各個々の鎖が、同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写され得る。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ステム・ループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって接合される逆方向反復ポリヌクレオチドとして発現される。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターである。真核細胞と適合する発現ベクター、好ましくは、脊椎動物細胞と適合する発現ベクターを用いて、本明細書に記載されるｉＲＮＡの発現のための組み換え構築物を産生することができる。真核細胞の発現ベクターは、当該技術分野において周知であり、多くの商業的供給源から入手可能である。通常、所望の核酸セグメントを挿入するのに好都合な制限部位を含むこのようなベクターが提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、例えば、静脈内又は筋肉内投与によるか、患者から移植された標的細胞に投与した後に患者に再導入することによるか、又は所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段などによる全身送達であり得る。
ｉＲＮＡ発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えば、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）又は非カチオン性の脂質ベースの担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞中にトランスフェクトされ得る。１週間以上の期間にわたる標的ＲＮＡの異なる領域を標的とするｉＲＮＡを介したノックダウンのための複数回の脂質のトランスフェクションも、本発明によって想定される。宿主細胞中へのベクターの導入の成功は、様々な公知の方法を用いて監視され得る。例えば、一過性のトランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカーなどのレポーターを用いて示され得る。エクスビボでの細胞の安定したトランスフェクションは、トランスフェクト細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性などの、特定の環境因子（例えば、抗生物質及び薬剤）に対する耐性を与えるマーカーを用いて確実にすることができる。
本明細書に記載される方法及び組成物とともに用いられ得るウイルスベクター系としては、限定はされないが、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどを含むがこれらに限定されないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）オルソポックス（ｏｒｔｈｏｐｏｘ）、例えば、ワクシニアウイルスベクター又は鳥ポックス、例えばカナリア痘又は鶏痘などのポックスウイルスベクター；及び（ｊ）ヘルパー依存性又は弱毒アデノウイルスが挙げられる。複製欠損ウイルスも有利であり得る。異なるベクターが、細胞のゲノムに組み込まれるか又は組み込まれないであろう。構築物は、必要に応じて、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。あるいは、構築物は、エピソーム複製が可能なベクター、例えばＥＰＶ及びＥＢＶベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組み換え発現のための構築物は、一般に、標的細胞内でのｉＲＮＡの発現を確実にするために、調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを必要とする。ベクター及び構築物について考慮される他の態様が、更に後述される。
ｉＲＮＡの送達に有用なベクターは、所望の標的細胞又は組織におけるｉＲＮＡの発現に十分な調節要素（プロモーター、エンハンサーなど）を含むであろう。調節要素は、構成的発現又は調節性／誘導性発現のいずれかを提供するように選択され得る。
ｉＲＮＡの発現は、例えば、特定の生理的調節因子、例えば、血中グルコースレベル、又はホルモンに対して感受性がある誘導性調節配列を使用することによって、正確に調節され得る（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０−２４）。細胞又は哺乳動物におけるｄｓＲＮＡの発現の制御に好適なこのような誘導性発現系は、例えば、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量化の化学誘導物質、及びイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節を含む。当業者は、ｉＲＮＡ導入遺伝子の目的とする使用に基づいて、適切な調節／プロモーター配列を選択することができるであろう。
ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用され得る。例えば、レトロウイルスベクターが使用され得る（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）を参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの適切なパッケージング及び宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な構成要素を含有する。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、患者への核酸の送達を促進する、１つ又は複数のベクターにクローニングされる。レトロウイルスベクターについての更なる詳細は、例えば、Ｂｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）に見出すことができ、これには、造血幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために、造血幹細胞にｍｄｒ１遺伝子を送達するレトロウイルスベクターの使用が記載されている。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を示す他の参照文献は、Ｃｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１（１９９３）；及びＧｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）である。使用のために考えられるレンチウイルスベクターとしては、例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許第６，１４３，５２０号明細書；同第５，６６５，５５７号明細書；及び同第５，９８１，２７６号明細書に記載されるＨＩＶに基づいたベクターが挙げられる。
アデノウイルスも、本発明のｉＲＮＡの送達における使用のために考えられる。アデノウイルスは、例えば、呼吸上皮に遺伝子を送達するための特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、本来、呼吸上皮に感染し、軽度の疾病を引き起こす。アデノウイルスに基づいた送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、及び筋肉である。アデノウイルスには、非分裂細胞に感染することが可能であるという利点がある。Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３（１９９３）には、アデノウイルスに基づいた遺伝子療法の概説が示されている。Ｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１９９４）は、アカゲザルの呼吸上皮に遺伝子を移送するアデノウイルスベクターの使用を示した。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９９３）；ＰＣＴ公報の国際公開第９４／１２６４９号パンフレット；及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出すことができる。本発明に取り上げられるｉＲＮＡを発現するのに好適なＡＶベクター、組み換えＡＶベクターを構築するための方法、及びベクターを標的細胞中に送達するための方法が、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターも、本発明のｉＲＮＡを送達するのに使用され得る（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号明細書）。一実施形態において、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６若しくはＨ１ ＲＮＡプロモーター、又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する組み換えＡＡＶベクターから、２つの別個の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本発明に取り上げられるｄｓＲＮＡを発現するのに好適なＡＡＶベクター、組み換えＡＶベクターを構築するための方法、及びベクターを標的細胞中に送達するための方法が、全開示内容が参照により本明細書に援用される、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書；国際特許出願番号国際公開第９４／１３７８８号パンフレット；及び国際特許出願番号国際公開第９３／２４６４１号パンフレットに記載されている。
本発明のｉＲＮＡの送達に好適な別のウイルスベクターは、ワクシニアウイルス、例えば、改変ウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）又はＮＹＶＡＣなどの弱毒化ワクシニア、鶏痘又はカナリア痘などの鳥ポックスなどのポックスウイルスである。
ウイルスベクターの指向性は、エンベロープタンパク質又は他のウイルスからの他の表面抗原を用いてベクターをシュードタイピングする（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）ことによって、又は異なるウイルスカプシドタンパク質を必要に応じて置換することによって、改変され得る。例えば、レンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質を用いてシュードタイピングされ得る。ＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようにこのベクターを操作することによって、異なる細胞を標的とするように作製され得る。例えば、全開示内容が参照により本明細書に援用されるＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１−８０１を参照。
ベクターの医薬製剤は、許容できる希釈剤中のベクターを含むことができ、又は遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、組み換え細胞から、完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターが無傷で産生され得る場合、医薬製剤は、遺伝子送達システムを産生する１つ又は複数の細胞を含むことができる。
ＩＶ．本発明の医薬組成物
本発明は、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物及び製剤も含む。一実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡと、薬学的に許容され得る担体とを含有する医薬組成物も本明細書に提供される。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾病又は障害、例えば、ヘモクロマトーシスを処置するのに有用である。このような医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例は、非経口投与を介した、例えば、静脈内（ＩＶ）送達による全身投与用に製剤化される組成物である。別の例は、例えば、持続性ポンプ注入などによる脳への注入による、脳実質への直接送達用に製剤化される組成物である。
本発明のＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物は、例えば、緩衝液を含むか又は含まない溶液、又は薬学的に許容され得る担体を含有する組成物であり得る。このような組成物としては、例えば、水性又は結晶性組成物、リポソーム製剤、ミセル製剤、エマルション、及び遺伝子治療ベクターが挙げられる。
本発明の方法において、ＲＮＡｉ剤は、溶液中で投与され得る。遊離ＲＮＡｉ剤は、非緩衝液、例えば、生理食塩水又は水中で投与され得る。あるいは、遊離ｓｉＲＮＡはまた、好適な緩衝液中で投与され得る。緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、又はリン酸塩、又はそれらの任意の組合せを含み得る。好ましい実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ＲＮＡｉ剤を含有する緩衝液のｐＨ及び浸透圧は、対象に投与するのに好適なように調整され得る。
ある実施形態において、浸透圧が、所望の値、例えば、ヒト血漿の生理学的値（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｖａｌｕｅ）に保持されるように、緩衝液は、溶液の浸透圧を制御するための剤を更に含む。浸透圧を制御するために緩衝液に加えられ得る溶質としては、限定はされないが、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、非代謝ポリマー、ビタミン、イオン、糖、代謝産物、有機酸、脂質、又は塩が挙げられる。ある実施形態において、溶液の浸透圧を制御するための剤は、塩である。特定の実施形態において、溶液の浸透圧を制御するための剤は、塩化ナトリウム又は塩化カリウムである。
本発明の医薬組成物は、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与され得る。
一般に、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、１日当たりレシピエントの体重１キログラムにつき約０．００１〜約２００．０ミリグラムの範囲、一般に、１日当たり体重１キログラムにつき約１〜５０ｍｇの範囲である。例えば、ｄｓＲＮＡは、単回投与当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、又は約５０ｍｇ／ｋｇで投与され得る。
例えば、ＲＮＡｉ剤、例えばｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８．８、９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤、例えばｄｓＲＮＡは、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約５０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約５０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４５ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約４５ｍｇ／ｋｂ、約２〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約４０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約３０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約３０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約２０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約２０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ、又は約１５〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
例えば、ＲＮＡｉ剤、例えばｄｓＲＮＡは、約０．．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤、例えばｄｓＲＮＡは、約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約５０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４５ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約４５ｍｇ／ｋｂ、約２〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約４０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約３０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約３０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約２０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約２０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ、又は約１５〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
例えば、対象に、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は約５０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｉＲＮＡを投与してもよい。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
特定の実施形態において、例えば、本発明の組成物が、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ及び脂質を含む場合、対象には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約９．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇなどの、治療量のｉＲＮＡが投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
本発明の特定の実施形態において、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、修飾（例えば、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフ（剤の切断部位又はその近傍に１つのこのようなモチーフを含む））、６つのホスホロチオエート結合、及びリガンドを含む場合、このような剤は、約０．０１〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。上記の記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図され、例えば、ＲＮＡｉ剤は、約０．０１５ｍｇ／ｋｇ〜約０．４５ｍｇ／ｍｇの用量で対象に投与され得る。
例えば、ＲＮＡｉ剤、例えば、医薬組成物中のＲＮＡｉ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０１７５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０２２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２７５ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０３２５ｍｇ／ｋｇ、０．０３５ｍｇ／ｋｇ、０．０３７５ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０４２５ｍｇ／ｋｇ、０．０４５ｍｇ／ｋｇ、０．０４７５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０５２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５５ｍｇ／ｋｇ、０．０５７５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０６２５ｍｇ／ｋｇ、０．０６５ｍｇ／ｋｇ、０．０６７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０７２５ｍｇ／ｋｇ、０．０７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７７５ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０８２５ｍｇ／ｋｇ、０．０８５ｍｇ／ｋｇ、０．０８７５ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．０９２５ｍｇ／ｋｇ、０．０９５ｍｇ／ｋｇ、０．０９７５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１２５ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．１７５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２２５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．２７５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３２５ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．３７５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４２５ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．４７５ｍｇ／ｋｇ、又は約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。上記の記載される値の中間の値も、本発明の一部であることが意図される。
医薬組成物は、一日１回投与することができ、又はｉＲＮＡは、１日を通して適切な間隔で、２、３以上のサブ用量として投与され、又は更には、連続注入若しくは徐放製剤を介した送達を用いて投与されてもよい。その場合、各サブ用量に含まれるｉＲＮＡは、総一日投与量を達成するように、対応してより少量である必要がある。投与単位はまた、例えば数日間の期間に亘るｉＲＮＡの持続放出を提供する従来の持続放出製剤を使用して、数日間に亘る送達用に配合されてもよい。持続放出製剤は当技術分野にて周知であり、薬剤を特定の部位に送達するのに特に有用であるため、本発明の薬剤と共に使用することができる。この実施形態において、投与単位は、一日用量の対応する倍数を含む。
他の実施形態において、医薬組成物の単回投与は、長続きすることができるため、その後の用量は、３、４、又は５日以下の間隔、あるいは１、２、３、又は４週間以下の間隔で投与される。本発明のある実施形態において、本発明の医薬組成物の単回投与は、週に１回投与される。本発明の他の実施形態において、本発明の医薬組成物の単回投与は、２ヶ月に１回（ｂｉ−ｍｏｎｔｈｌｙ）投与される。
当業者は、非限定的に疾病又は疾患の重篤さ、以前の処置、対象の全体的な健康及び／又は年齢、並びに存在する他の疾病を含む所定の因子が対象を効果的に処置するのに必要な投与量及び時間に影響し得ることを認識するであろう。更に、治療的有効量の組成物による対象の処置は、単一の処置又は一連の処置を含み得る。本発明により包含される個々のｉＲＮＡに関する有効な投与量、及びインビボでの半減期は、従来の方法論を用いて、又は、本明細書の他の箇所に記載されるような適切な動物モデルを使用したインビボでの試験に基づいて概算することができる。
マウス遺伝学の進歩により、ＴＭＰＲＳＳ６の発現の低下から利益を得られ得る鉄過剰に関連する疾患などの、様々なヒトの疾病の研究用の多くのマウスモデルが生成された。このようなモデルは、ｉＲＮＡのインビボ試験のために、並びに治療に有効な用量を決定するために使用され得る。好適なマウスモデルは、当該技術分野において公知であり、これらとしては、例えば、β−サラセミアのモデルとしてのサラセミアＴｈ３／＋マウス（Ｄｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２０１１），１７８（２）：７７４−８３）、遺伝性ヘモクロマトーシスのモデルとしてのＨＦＥノックアウトマウス（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８５：２４９２−２４９７）；先天性赤芽球性ポルフィリン症のモデルとしてのＵｒｏｓ（ｍｕｔ２４８）マウス（Ｇｅｄ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，８７（１）：８４−９２）が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、局所的又は全身的処置が必要かどうか及び処置される部位に応じて、いくつかの方法で投与され得る。投与は、局所投与（例えば、経皮パッチによる）、例えば、噴霧器などによる、粉末又はエアロゾルの吸入又は吹送による経肺投与；気管内、鼻腔内、表皮及び経皮、経口又は非経口投与であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入；例えば、埋め込みデバイスによる皮下投与；又は例えば、実質内、髄腔内若しくは脳室内投与による頭蓋内投与が挙げられる。
ｉＲＮＡは、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）などの特定の組織を標的とするように送達され得る。
局所投与用の医薬組成物及び製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐薬、噴霧剤、液剤及び散剤が挙げられる。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要であり、又は所望され得る。被覆コンドーム、手袋なども有用であり得る。好適な局所製剤は、本発明を特徴付けるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤及び界面活性剤などの局所送達薬剤との混合物であるものを含む。好適な脂質及びリポソームは、中性（例えば、ジオレイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰イオン性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）及び陽イオン性（例えば、ジオレイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。本発明を特徴付けるｉＲＮＡは、リポソーム中に封入されることができ、又はリポソームに対して、特に陽イオン性リポソームに対して錯体を形成することができる。代替的に、ｉＲＮＡは、脂質に対して、特に陽イオン性脂質に対して錯体化されてもよい。好適な脂肪酸及びエステルには、非限定的にアラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ１〜２０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピルＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド又はこれらの薬学的に許容され得る塩が挙げられる）。局所製剤は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載されている。
Ａ．膜分子集合体を含むｉＲＮＡ製剤
本発明の組成物及び方法に使用するためのｉＲＮＡは、膜分子集合体、例えば、リポソーム又はミセル中の送達用に製剤化され得る。本明細書において使用される際、「リポソーム」という用語は、少なくとも１つの二重層、例えば、１つの二重層又は複数の二重層に配置された両親媒性の脂質から構成される小胞を指す。リポソームは、親油性材料及び水性内部から形成される膜を有する単層及び多層小胞を含む。水性部分は、ｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性材料は、水性外部から水性内部を分離し、通常、ｉＲＮＡ組成物を含まないが、場合によっては、含むことがある。リポソームは、作用部位への活性成分の移送及び送達に有用である。リポソーム膜は生体膜と構造が類似しているため、リポソームが組織に付着されると、リポソームの二重層が、細胞膜の二重層と融合する。リポソーム及び細胞の融合が進むにつれて、ｉＲＮＡを含む内部の水性内容物が、細胞に送達され、ここで、ｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに特異的に結合することができ、ＲＮＡｉを仲介することができる。場合によっては、リポソームはまた、例えば、ｉＲＮＡを特定の細胞型に指向するように、特異的に標的化される。
ＲＮＡｉ剤を含有するリポソームは、様々な方法によって調製され得る。一例において、リポソームの脂質成分は、ミセルが脂質成分で形成されるように、洗剤に溶解される。例えば、脂質成分は、両親媒性のカチオン性脂質又は脂質コンジュゲートであり得る。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的な洗剤としては、コール酸塩、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩、及びラウロイルサルコシンが挙げられる。次に、ＲＮＡｉ剤の調製物は、脂質成分を含むミセルに加えられる。脂質におけるカチオン性基は、ＲＮＡｉ剤と相互作用し、ＲＮＡｉ剤の周りで縮合して、リポソームを形成する。縮合の後、洗剤は、例えば透析によって除去されて、ＲＮＡｉ剤のリポソーム製剤が得られる。
必要に応じて、縮合を補助する担体化合物が、例えば、制御添加によって、縮合反応中に加えられ得る。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミン又はスペルミジン）であり得る。縮合を補助するためにｐＨも調整され得る。
送達ビヒクルの構成成分としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込む安定したポリヌクレオチド送達ビヒクルを生成するための方法が、例えば、全内容が参照により本明細書に援用される国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに更に記載されている。リポソーム形成は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３−７４１７，１９８７；米国特許第４，８９７，３５５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５；Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９，１９８３；及びＦｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４に記載される例示的な方法の１つ又は複数の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用するのに適切なサイズの脂質集合体を調製するための一般的に使用される技術としては、超音波処理ならびに凍結融解及び押し出しが挙げられる（例えば、Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１，１９８６を参照）。一貫して小さく（５０〜２００ｎｍ）且つ比較的均一な集合体が所望される場合、顕微溶液化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が使用され得る（Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４）。これらの方法は、ＲＮＡｉ剤の調製物をリポソームにパッケージングするのに容易に適合される。
リポソームは、２つの大きなクラスに分かれる。陽イオン性リポソームは、負に帯電された核酸分子と相互作用して安定な複合体を形成する正に帯電されたリポソームである。正に帯電された核酸／リポソーム複合体は負に帯電された細胞表面に結合し、エンドソーム内に移行される。エンドソーム内の酸性ｐＨによって、リポソームが破裂され、それらの内容物を細胞質内に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
ｐＨ感受性かつ負に帯電されたリポソームは、核酸と複合するのではなく、核酸を捕捉する。核酸及び脂質の両方は同様に帯電されるため、複合体形成ではなく反発が起こる。にも係わらず、いくつかの核酸はこれらのリポソームの水性内部内に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を培養物中の細胞単層に送達するよう使用されている。標的細胞内で外来遺伝子の発現が検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９〜２７４）。
リポソーム組成物の主要な一タイプは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。例えば中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。陰イオン性リポソーム組成物は一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成される一方、陰イオン性膜融合リポソームは、主としてジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。他のタイプのリポソーム組成物は、例えば、大豆ＰＣ、及び卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。他のタイプは、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から形成される。
リポソームを細胞中にインビトロ及びインビボで導入するための他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；国際公開第９３／２４６４０号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；及びＳｔｒａｕｓｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系も試験されて、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性が決定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、シクロスポリン−Ａをマウス皮膚の真皮に送達した。結果はそのような非イオン性リポソーム系が皮膚の異なる層中へのシクロスポリン−Ａの堆積を促進するのに有効であることを示した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４（６）４６６）。
リポソームは、「立体的に安定化された」リポソームも含み、本明細書で使用されるこの用語は、１つ又は複数の特定化脂質を含むリポソームを指し、該特定化脂質は、リポソームに組み込まれた際、そのような特定化脂質を欠いたリポソームと比較して増強された循環寿命をもたらす。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームのベシクル形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つ又は複数の糖脂質を含むもの、又は（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つ又は複数の親水性ポリマーにより誘導体化されているものである。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、当技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、又はＰＥＧ−誘導体化脂質を含む立体的に安定化されたリポソームに関しては、これらの立体的に安定化されたリポソームの増強された循環半減期は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取り込みの低下に由来すると考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
１つ又は複数の糖脂質を含む様々なリポソームが、当技術分野にて既知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、リポソームの血中半減期を改善するモノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシド及びホスファチジルイノシトールの能力を報告している。これらの発見は、Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．により詳説されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）。両方ともＡｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第４，８３７，０２８号明細書及び国際公開第８８／０４９２４号パンフレットは、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧＭ１又は硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（Ｗｅｂｂ ｅｔ ａｌ．）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第９７／１３４９９号パンフレット（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．）に開示されている。
一実施形態において、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームには、細胞膜に融合することができるという利点がある。非カチオン性リポソームは、それほど効率的に細胞膜と融合することができないが、インビボでマクロファージによって取り込まれ、ＲＮＡｉ剤をマクロファージに送達するのに使用され得る。
リポソームの更なる利点としては以下が挙げられる：天然のリン脂質から得られるリポソームは、生体適合性があり且つ生分解性可能であり；リポソームは、広範囲の水溶性及び脂溶性薬剤を組み込むことができ；リポソームは、その内部の区画中に封入されたＲＮＡｉ剤を代謝及び分解から保護することができる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考慮事項は、脂質表面電荷、小胞サイズ及びリポソームの水性容積である。
正に帯電した合成カチオン性脂質である、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を用いて、核酸と自発的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合し、ＲＮＡｉ剤の送達をもたらすことが可能な脂質−核酸複合体を形成する、小さいリポソームを形成することができる（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３−７４１７，１９８７、及びＤＯＴＭＡ及びＤＮＡとのその使用の説明については米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照）。
ＤＯＴＭＡ類似体である、１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、リン脂質と組み合わせて使用して、ＤＮＡ複合小胞を形成することができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、負に帯電したポリヌクレオチドと自発的に相互作用して、複合体を形成する正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む生体組織培養細胞中に高度にアニオン性の核酸を送達するための効果的な薬剤である。十分に正に帯電したリポソームが使用される場合、得られる複合体の正味電荷も正である。このように調製される正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自発的に付着し、細胞膜と融合し、機能性核酸を、例えば、組織培養細胞中に効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質である、１，２−ビス（オレイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分がエーテル結合ではなく、エステルによって結合された点でＤＯＴＭＡとは異なる。
他の報告されているカチオン性脂質化合物としては、２つのタイプの脂質のうちの１つにコンジュゲートされ、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミル−アミド（「ＤＰＰＥＳ」）などの化合物を含む、例えば、カルボキシスペルミンを含む様々な部分にコンジュゲートされたものが挙げられる（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照）。
別のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソームに製剤化されたコレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）による脂質の誘導体化を含む（Ｇａｏ，Ｘ．及びＨｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１を参照）。ポリリジンをＤＯＰＥにコンジュゲートすることによって作製されるリポポリリジンは、血清の存在下におけるトランスフェクションに有効であると報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８，１９９１）。特定の細胞株では、コンジュゲートされたカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物より低い毒性を示し、より効率的なトランスフェクションを提供するとされている。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥ及びＤＭＲＩＥ−ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に好適な他のカチオン性脂質が、国際公開第９８／３９３５９号パンフレット及び国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載されている。
リポソーム製剤は、局所投与に特に適しており、リポソームは、他の製剤に優るいくつかの利点を示す。このような利点としては、投与される薬剤の高い全身性吸収率に関連する副作用の減少、所望の標的における投与される薬剤の蓄積の増加、及びＲＮＡｉ剤を皮膚に投与する能力が挙げられる。ある実施において、ＲＮＡｉ剤を表皮細胞に送達するために、また、真皮組織、例えば、皮膚へのＲＮＡｉ剤の浸透を促進するために、リポソームが使用される。例えば、リポソームは、局所的に適用され得る。リポソームとして製剤化される薬剤の皮膚への局所送達が報告されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５−４１０及びｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２：２５９−２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２−６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ５６：２６７−２７６，１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７−１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２−５２７，１９８３；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１−７８５５，１９８７を参照）。
また、非イオン性リポソーム系、特に、非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系は、皮膚への薬剤の送達におけるそれらの有用性を決定するために調べられた。Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウス皮膚の真皮に薬剤を送達するのに使用された。ＲＮＡｉ剤を含むこのような製剤は、皮膚疾患を処置するのに有用である。
ｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能に作製され得る。このような変形性は、リポソームが、リポソームの平均半径より小さい孔を透過するのを可能にし得る。例えば、トランスフェルソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、変形可能なリポソームの一種である。トランスフェルソームは、表面縁活性化因子、通常、界面活性剤を、標準的なリポソーム組成物に加えることによって作製され得る。ＲＮＡｉ剤を含むトランスフェルソームは、皮膚のケラチノサイトにＲＮＡｉ剤を送達するために、例えば、皮下感染によって送達され得る。無傷の哺乳動物皮膚を横断するために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下で、５０ｎｍ未満の直径をそれぞれ有する一連の微細孔を透過しなければならない。更に、脂質特性のため、これらのトランスフェロソームは、自己最適化（例えば、毛穴の形状に適応可能）、自己修復性であり得、多くの場合、破砕せずにそれらの標的に到達し、多くの場合、自己充填性（ｓｅｌｆ−ｌｏａｄｉｎｇ）であり得る。
本発明に適した他の製剤が、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号明細書；２００８年１月２日に出願された同第６１／０１８，６１１号明細書；２００８年３月２６日に出願された同第６１／０３９，７４８号明細書；２００８年４月２２日に出願された同第６１／０４７，０８７号明細書及び２００８年５月８日に出願された同第６１／０５１，５２８号明細書に記載されている。２００７年１０月３日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号明細書にも、本発明に適した製剤が記載されている。
トランスファーソームは、リポソームの更なる別の一タイプであり、薬物送達ビヒクルの候補として魅力的な、高く変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、脂質小滴として記載することもでき、この脂質小滴は、高く変形可能であるため、小滴よりも小さい孔内を容易に透過することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適合可能であり、例えば自己最適性（皮膚内の孔の形状に適応する）であり、自己修復性であり、しばしば細分化することなくそれらの標的に到達し、また多くの場合、自己負荷性である。トランスファーソームを作製するためには、通常は界面活性剤である表面縁部活性化因子を標準的なリポソーム組成物に加えることが可能である。トランスファーソームは、皮膚に血清アルブミンを送達するのに使用されている。トランスファーソーム仲介による血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注射と同様に効果的であることが示されている。
界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）及びリポソームなどの製剤に広い用途を見出している。天然及び合成の両方の多数の異なるタイプの界面活性剤を分類及び順位付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（「頭部」としても既知）の性質は、製剤中に使用される異なる界面活性剤を類別する最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、この界面活性剤は非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬及び美容製品に広い用途を見出し、広い範囲のｐＨ値に亘って使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル、及びエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミド、及び、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、及びエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどのエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も人気のあるメンバーである。
界面活性剤分子が水中に溶解又は分散した際に負電荷を保有する場合、この界面活性剤は陰イオン性に分類される。陰イオン性界面活性剤には、せっけんなどのカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキルスルフェート及びエトキシル化アルキルスルフェートなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート及びスルホスクシネート、並びにホスフェートが挙げられる。陰イオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーは、アルキルスルフェート及びせっけんである。
界面活性剤分子が水中に溶解又は分散した際に正電荷を保有する場合、この界面活性剤は陽イオン性に分類される。陽イオン性界面活性剤には、第四級アンモニウム塩及びエトキシル化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、最も使用されているこのクラスのメンバーである。
界面活性剤分子が正又は負電荷のいずれかを保有する能力を有する場合、この界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン及びホスファチドが挙げられる。
薬物製品、製剤及びエマルション中での界面活性剤の使用は、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
本発明の方法に使用するためのｉＲＮＡはまた、ミセル製剤として提供され得る。「ミセル」は、分子の全ての疎水性部分が内側を向いて、親水性部分を周囲の水相と接触したままにするように、両親媒性分子が球体構造で配置される、特定のタイプの分子集合体として本明細書において定義される。環境が疎水性である場合、逆の配置が存在する。
経皮膜を介した送達に好適な混合ミセル製剤は、ｓｉＲＮＡ組成物の水溶液、アルカリ金属Ｃ８〜Ｃ２２アルキル硫酸塩、及びミセル形成化合物を混合することによって調製され得る。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容され得る塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシン及びその薬学的に許容され得る塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテル及びその類似体、ポリドカノールアルキルエーテル及びその類似体、ケノデオキシコール酸塩、デオキシコール酸塩、及びそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩の添加と同時に又はその後に加えられてもよい。混合ミセルは、成分の実質的に任意の種類の混合で形成されるが、より小さいサイズのミセルを提供するためには激しい混合で形成される。
一方法において、ｓｉＲＮＡ組成物及び少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩を含有する第１のミセル組成物が調製される。次に、第１のミセル組成物は、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合されて、混合ミセル組成物が形成される。別の方法において、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属アルキル硫酸塩及びミセル形成化合物の少なくとも１つを混合し、続いて、激しく混合しながら残りのミセル形成化合物を加えることによって調製される。
フェノール及び／又はｍ−クレゾールが、混合ミセル組成物に加えられて、製剤を安定化し、細菌増殖から保護してもよい。あるいは、フェノール及び／又はｍ−クレゾールは、ミセル形成成分とともに加えられてもよい。グリセリンなどの等張剤も、混合ミセル組成物の形成後に加えられてもよい。
スプレーとしてのミセル製剤の送達では、製剤は、エアロゾルディスペンサーに入れることができ、ディスペンサーに噴射剤が充填される。圧力下にある噴射剤は、ディスペンサー中で液体形態である。成分の比率は、水相及び噴射剤相が１つになるように、すなわち、１つの相が存在するように調整される。２つの相が存在する場合、例えば、定量弁によって、内容物の一部を投薬する前にディスペンサーを振とうする必要がある。医薬品の投薬用量は、微細なスプレー状で定量弁から噴射される。
噴射剤は、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル及びジエチルエーテルを含み得る。特定の実施形態において、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２テトラフルオロエタン）が使用されてもよい。
必須成分の特定の濃度は、比較的単純な実験によって決定され得る。口腔を介した吸収では、注射又は胃腸管を介した投与のための投与量の、例えば、少なくとも２倍又は３倍に増加させることが望ましいことが多い。
Ｂ．脂質粒子
本発明のｉＲＮＡすなわちｄｓＲＮＡは、脂質製剤中、例えばＬＮＰ中に完全に封入されてもよく、又は他の核酸−脂質粒子を形成してもよい。
本明細書で使用される用語「ＬＮＰ」は、安定な核酸−脂質粒子を指す。ＬＮＰは、典型的には、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、及び粒子の凝集を防止する脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート）を含む。ＬＮＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に延長された循環寿命を有し、かつ遠位部位（例えば、投与部位から物理的に分離された部位）に蓄積するため、全身適用に極めて有用である。ＬＮＰは「ｐＳＰＬＰ」を含み、ｐＳＰＬＰは、ＰＣＴ公開第国際公開第００／０３６８３号パンフレットに示されているように、封入された縮合剤−核酸複合体を含む。本発明の粒子は、典型的には、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ〜約９０ｎｍの平均粒径を有し、かつ実質的に無毒である。加えて、核酸は、本発明の核酸−脂質粒子中に存在する場合、水性溶液中で、ヌクレアーゼによる分解に耐性である。核酸−脂質粒子、及びそれらの調製方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号明細書；米国特許第５，９８１，５０１号明細書；米国特許第６，５３４，４８４号明細書；米国特許第６，５８６，４１０号明細書；米国特許第６，８１５，４３２号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書及びＰＣＴ公開国際公開第９６／４０９６４号パンフレットに開示されている。
一実施形態において、脂質対薬物の比（質量／質量比）（例えば、脂質対ｄｓＲＮＡの比）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、又は約６：１〜約９：１の範囲内であろう。上記の範囲の中間の範囲も、本発明の一部であるものと考えられる。
陽イオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙ）オキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙ）オキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、又は３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）又はその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザネジイル）ジドデカン−２−オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、又はこれらの混合物であってもよい。陽イオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、又は約４０ｍｏｌ％からなり得る。
別の実施形態において、化合物２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランが、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製するのに使用され得る。２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランの合成は、参照により本明細書に援用される、２００８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号明細書に記載されている。
一実施形態において、脂質−ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（モルパーセント）を含み、６３．０±２０ｎｍの粒度及び０．０２７ｓｉＲＮＡ／脂質比を有する。
イオン性／非陽イオン性脂質は、非限定的にジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ）エタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、又はこれらの混合物を含む陰イオン性脂質又は中性脂質とすることができる。非陽イオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、又は約５８ｍｏｌ％であってもよい。
粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、非限定的にＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、又はそれらの混合物を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質とすることができる。ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、又はＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）とすることができる。粒子の凝集を防止するコンジュゲート脂質は、粒子中に存在する全脂質の０ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、又は２ｍｏｌ％とすることができる。
いくつかの実施形態において、核酸−脂質粒子は更に、粒子中に存在する全脂質の例えば約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％又は約４８ｍｏｌ％のコレステロールを含む。
一実施形態において、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）ＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ １４８７）（参照により本明細書に援用される、２００８年３月２６日に出願された米国特許出願第１２／０５６，２３０号明細書を参照）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）が、脂質−ｄｓＲＮＡナノ粒子（すなわち、ＬＮＰ０１粒子）を調製するのに使用され得る。エタノール中のそれぞれの原液が、以下のとおりに調製され得る：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。次に、ＮＤ９８、コレステロール、及びＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６原液は、例えば、４２：４８：１０のモル比で組み合わせられ得る。組み合わされた脂質溶液は、最終的なエタノール濃度が約３５〜４５％であり、最終的な酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭであるようにｄｓＲＮＡ水溶液（例えば酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中）と混合され得る。脂質−ｄｓＲＮＡナノ粒子は、通常、混合時に自然に形成される。所望の粒度分布に応じて、得られるナノ粒子混合物が、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機（ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を用いて、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍのカットオフ）を通して押し出され得る。場合によっては、押し出し工程は省略され得る。エタノール除去及び同時の緩衝液交換は、例えば、透析又は接線流ろ過によって達成され得る。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、又は約ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換され得る。
Figure 2016520593
ＬＮＰ０１製剤が、例えば、参照により本明細書に援用される国際出願公開番号国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレットに記載されている。
更なる例示的な脂質−ｄｓＲＮＡ製剤が、表Ａに記載される。
Figure 2016520593
Figure 2016520593
Figure 2016520593
ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＰＥＧ−ＤＭＧ：ＰＥＧ−ジジミリストイル（ｄｉｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ）グリセロール（Ｃ１４−ＰＥＧ、又はＰＥＧ−Ｃ１４）（２０００の平均分子量を有するＰＥＧ）
ＰＥＧ−ＤＳＧ：ＰＥＧ−ジスチリルグリセロール（Ｃ１８−ＰＥＧ、又はＰＥＧ−Ｃ１８）（２０００の平均分子量を有するＰＥＧ）
ＰＥＧ−ｃＤＭＡ：ＰＥＧ−カルバモイル−１，２−ジミリスチルオキシプロピルアミン（２０００の平均分子量を有するＰＥＧ）
ＬＮＰ（ｌ，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含む製剤が、参照により本明細書に援用される、２００９年４月１５日に出願された国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレットに記載されている。
ＸＴＣを含む製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年１月２９日出願の米国特許仮出願第６１／１４８，３６６号明細書；２００９年３月２日出願の米国特許仮出願第６１／１５６，８５１号明細書；２００９年６月１０日出願の米国特許仮出願第 号明細書；２００９年７月２４日出願の米国特許仮出願第６１／２２８，３７３号明細書２００９年９月３日出願米国特許仮出願第６１／２３９，６８６号明細書、及び２０１０年１月２９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４号明細書に記載されている。
ＭＣ３を含む製剤が、例えば、全内容が参照により本明細書に援用される、２０１０年６月１０日に出願された米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書に記載されている。
ＡＬＮＹ−１００を含む製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年１１月１０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号明細書に記載されている。
Ｃ１２−２００を含む製剤は、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年５月５日出願の米国特許仮出願第６１／１７５，７７０号明細書及び２０１０年５月５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７号明細書に記載されている。
イオン性／カチオン性脂質の合成
本発明の核酸−脂質粒子に使用される、例えば、カチオン性脂質などの化合物のいずれも、実施例により詳細に記載される方法を含む公知の有機合成技術によって調製され得る。全ての置換基は、特に示されない限り、以下に定義されるとおりである。
「アルキル」は、１〜２４個の炭素原子を含有する、直鎖状又は分枝鎖状、非環状又は環状の、飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖状アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどを含む一方；飽和分枝鎖状アルキルは、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルなどを含む。代表的な飽和環状アルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどを含む一方；不飽和環状アルキルは、シクロペンテニル及びシクロヘキセニルなどを含む。
「アルケニル」は、隣接する炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含有する、上で定義されるアルキルを意味する。アルケニルは、シス及びトランス異性体の両方を含む。代表的な直鎖状及び分枝鎖状アルケニルは、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニルなどを含む。
「アルキニル」は、隣接する炭素間に少なくとも１つの三重結合を更に含有する、上で定義される任意のアルキル又はアルケニルを意味する。代表的な直鎖状及び分枝鎖状アルキニルは、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１ブチニルなどを含む。
「アシル」は、結合点における炭素が以下に規定されるオキソ基で置換される、任意のアルキル、アルケニル、又はアルキニルを意味する。例えば、−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、及び−Ｃ（＝Ｏ）アルキニルが、アシル基である。
「複素環」は、飽和、不飽和、又は芳香族のいずれかであり、且つ窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される１又は２つのヘテロ原子（ここで、窒素及び硫黄ヘテロ原子は、任意選択で酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は、任意選択で四級化されていてもよい）を含有する５員〜７員の単環式、又は７員〜１０員の二環式の複素環を意味し、この複素環には、上記の複素環のいずれかがベンゼン環に縮合された二環式の環が含まれる。複素環は、任意のヘテロ原子又は炭素原子を介して結合され得る。複素環は、以下に規定されるヘテロアリールを含む。複素環は、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどを含む。
「任意選択で置換されるアルキル」、「任意選択で置換されるアルケニル」、「任意選択で置換されるアルキニル」、「任意選択で置換されるアシル」、及び「任意選択で置換される複素環」という用語は、置換されるとき、少なくとも１つの水素原子が置換基で置換されることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２つの水素原子が置換される。これに関して、置換基は、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙを含み、式中、ｎが、０、１又は２であり、Ｒｘ及びＲｙが、同じか又は異なっており、独立して、水素、アルキル又は複素環であり、前記アルキル及び複素環置換基のそれぞれが、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ、複素環、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙのうちの１つ又は複数で更に置換され得る。
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを意味する。
ある実施形態において、本発明の方法は、保護基の使用を必要とし得る。保護基の方法は、当業者に周知である（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ，１９９９を参照）。簡潔には、本発明の文脈における保護基は、官能基の望ましくない反応性を低下させるか又はなくす任意の基である。保護基は、官能基に加えられて、特定の反応中のその反応性を遮蔽し、その後、除去されることで、元の官能基が現れ得る。ある実施形態において、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望ましくない反応性を低下させるか又はなくす任意の基である。保護基は、当該技術分野において周知の技術を用いて、加えられ、除去され得る。
式Ａの合成
ある実施形態において、本発明の核酸−脂質粒子は、式Ａ：
Figure 2016520593
 のカチオン性脂質を用いて製剤化され、式中、Ｒ１及びＲ２が、独立して、アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、それぞれが任意選択で置換されていてもよく、Ｒ３及びＲ４が、独立して、低級アルキルであり、又はＲ３及びＲ４が、一緒になって、任意選択で置換される複素環を形成することができる。ある実施形態において、カチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）である。一般に、上の式Ａの脂質は、以下の反応スキーム１又は２によって作製され得、ここで、全ての置換基は、特に示されない限り、上で定義されるとおりである。
Figure 2016520593
 脂質Ａ（式中、Ｒ１及びＲ２が、独立して、アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、それぞれが任意選択で置換されていてもよく、Ｒ３及びＲ４が、独立して、低級アルキルであり、又はＲ３及びＲ４が、一緒になって、任意選択で置換される複素環を形成することができる）は、スキーム１にしたがって調製され得る。ケトン１及び臭化物２は、購入されるか又は当業者に公知の方法にしたがって調製され得る。１及び２の反応により、ケタール３が得られる。アミン４によるケタール３の処理により、式Ａの脂質が得られる。式Ａの脂質は、式５（式中、Ｘが、ハロゲン、水酸化物、ホスフェート、サルフェートなどから選択されるアニオン対イオンである）の有機塩を用いて、対応するアンモニウム塩に転化され得る。
Figure 2016520593
 あるいは、ケトン１の出発材料は、スキーム２にしたがって調製され得る。グリニャール試薬６及びシアン化物７は、購入されるか又は当業者に公知の方法にしたがって調製され得る。６及び７の反応により、ケトン１が得られる。式Ａの対応する脂質へのケトン１の転化は、スキーム１に表される。
ＭＣ３の合成
ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ（すなわち、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）の調製は以下のとおりであった。ジクロロメタン（５ｍＬ）中の（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オール（０．５３ｇ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．５１ｇ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．６１ｇ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．５３ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。溶液を、希塩酸で洗浄し、続いて、希炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機画分を、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を回転蒸発器において除去した。残渣を、１〜５％のメタノール／ジクロロメタン溶出勾配を用いてシリカゲルカラム（２０ｇ）に通した。精製された生成物を含有する画分を組み合わせて。溶媒を除去し、無色油（０．５４ｇ）を得た。ＡＬＮＹ−１００の合成
ケタール５１９［ＡＬＮＹ−１００］の合成を、スキーム３にしたがって行った：
Figure 2016520593
５１５の合成
二口丸底フラスコ（１Ｌ）中で、２００ｍｌの無水ＴＨＦ中のＬｉＡｌＨ４（３．７４ｇ、０．０９８５２ｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、７０ｍＬのＴＨＦ中の５１４（１０ｇ、０．０４９２６ｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下で、００Ｃでゆっくりと加えた。完全に加えた後、反応混合物を室温まで温め、次に、４時間加熱還流させた。反応の進行をＴＬＣによって監視した。（ＴＬＣによる）反応の完了後、混合物を００Ｃに冷却し、飽和Ｎａ２ＳＯ４溶液の慎重な添加によってクエンチした。反応混合物を室温で４時間撹拌し、ろ過して取り除いた。残渣をＴＨＦで十分に洗浄した。ろ液及び洗浄液を混合し、４００ｍＬのジオキサン及び２６ｍＬの濃ＨＣｌで希釈し、室温で２０分間撹拌した。揮発性物質を、減圧下で取り除いて、白色の固体として５１５の塩酸塩を得た。収量：７．１２ｇ １Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）：δ＝９．３４（ｂｒｏａｄ，２Ｈ）、５．６８（ｓ，２Ｈ）、３．７４（ｍ，１Ｈ）、２．６６〜２．６０（ｍ，２Ｈ）、２．５０〜２．４５（ｍ，５Ｈ）。
５１６の合成
２５０ｍＬの二口丸底フラスコ中で、１００ｍＬの乾燥ＤＣＭ中の化合物５１５の撹拌溶液に、ＮＥｔ３を加え（３７．２ｍＬ、０．２６６９ｍｏｌ）、窒素雰囲気下で０℃に冷却した。５０ｍＬの乾燥ＤＣＭ中のＮ−（ベンジルオキシ−カルボニルオキシ）−スクシンイミド（２０ｇ、０．０８００７ｍｏｌ）をゆっくりと加えた後、反応混合物を、室温まで温めた。反応（ＴＬＣによって２〜３時間）の完了後、混合物を、１ＮのＨＣｌ溶液（１×１００ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１×５０ｍＬ）で連続して洗浄した。次に、有機層を、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、粗材料を得て、それを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、粘着性の塊として５１６を得た。収量：１１ｇ（８９％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ＝７．３６〜７．２７（ｍ，５Ｈ）、５．６９（ｓ，２Ｈ）、５．１２（ｓ，２Ｈ）、４．９６（ｂｒ．，１Ｈ）２．７４（ｓ，３Ｈ）、２．６０（ｍ，２Ｈ）、２．３０〜２．２５（ｍ，２Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］−２３２．３（９６．９４％）。
５１７Ａ及び５１７Ｂの合成
シクロペンテン５１６（５ｇ、０．０２１６４ｍｏｌ）を、５００ｍＬの一口丸底フラスコ中で、２２０ｍＬのアセトン及び水（１０：１）の溶液に溶解させ、それに、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（７．６ｇ、０．０６４９２ｍｏｌ）、続いて、４．２ｍＬの、ｔｅｒｔ−ブタノール中のＯｓＯ４（０．２７５ｇ、０．００１０８ｍｏｌ）の７．６％溶液を室温で加えた。反応（約３時間）の完了の後、混合物を、固体Ｎａ２ＳＯ３の添加によってクエンチし、得られた混合物を、室温で１．５時間撹拌した。反応混合物を、ＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈し、水（２×１００ｍＬ）、続いて、飽和ＮａＨＣＯ３（１×５０ｍＬ）溶液、水（１×３０ｍＬ）及び最後に塩水（１×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。粗材料のシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製により、ジアステレオマーの混合物を得て、それを、分取ＨＰＬＣによって分離した。収量：−６ｇの粗５１７Ａ−ピーク−１（白色の固体）、５．１３ｇ（９６％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）：δ＝７．３９〜７．３１（ｍ，５Ｈ）、５．０４（ｓ，２Ｈ）、４．７８〜４．７３（ｍ，１Ｈ）、４．４８〜４．４７（ｄ，２Ｈ）、３．９４〜３．９３（ｍ，２Ｈ）、２．７１（ｓ，３Ｈ）、１．７２〜１．６７（ｍ，４Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ−［Ｍ＋Ｈ］−２６６．３、［Ｍ＋ＮＨ４＋］−２８３．５存在、ＨＰＬＣ−９７．８６％。Ｘ線により確認された立体化学。
５１８の合成
化合物５０５の合成について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物５１８（１．２ｇ、４１％）を無色油として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ＝７．３５〜７．３３（ｍ，４Ｈ）、７．３０〜７．２７（ｍ，１Ｈ）、５．３７〜５．２７（ｍ，８Ｈ）、５．１２（ｓ，２Ｈ）、４．７５（ｍ，１Ｈ）、４．５８〜４．５７（ｍ，２Ｈ）、２．７８〜２．７４（ｍ，７Ｈ）、２．０６〜２．００（ｍ，８Ｈ）、１．９６〜１．９１（ｍ，２Ｈ）、１．６２（ｍ，４Ｈ）、１．４８（ｍ，２Ｈ）、１．３７〜１．２５（ｂｒ ｍ，３６Ｈ）、０．８７（ｍ，６Ｈ）。ＨＰＬＣ−９８．６５％。
化合物５１９の合成のための一般的な手順
ヘキサン（１５ｍＬ）中の化合物５１８（１当量）の溶液を、ＴＨＦ（１Ｍ、２当量）中のＬＡＨの氷冷した溶液に滴下して加えた。完全に加えた後、混合物を、０．５時間にわたって４０℃で加熱し、次に、氷浴上で再度冷却した。混合物を、飽和Ｎａ２ＳＯ４水溶液を用いて慎重に加水分解し、次に、セライトを通してろ過し、還元して油にした。カラムクロマトグラフィーにより、純粋な５１９（１．３ｇ、６８％）が得られ、これは、無色油として得られた。１３Ｃ ＮＭＲ δ＝１３０．２、１３０．１（×２）、１２７．９（×３）、１１２．３、７９．３、６４．４、４４．７、３８．３、３５．４、３１．５、２９．９（×２）、２９．７、２９．６（×２）、２９．５（×３）、２９．３（×２）、２７．２（×３）、２５．６、２４．５、２３．３、２２６、１４．１；エレクトロスプレーＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ４４Ｈ８０ＮＯ２についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値６５４．６、実測値６５４．６。
標準的な又は押し出しフリー（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ）方法のいずれかにより調製された製剤は、同様の方法で特徴付けることができる。例えば、製剤は典型的には視認検査により特徴付けられる。製剤は凝集体又は沈殿物を含まない白みがかった半透明溶液である筈である。脂質−ナノ粒子の粒子サイズ及び粒子サイズ分布は、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＳＡ）を使用した光散乱により測定することができる。粒子は、そのサイズが約２０〜３００ｎｍ、例えば４０〜１００ｎｍである必要がある。粒子サイズ分布は、単峰形である必要がある。製剤中の総ｄｓＲＮＡ濃度、及び捕捉された割合は、色素排除アッセイを用いて概算される。処方されたｄｓＲＮＡのサンプルは、製剤崩壊界面活性剤、例えば０．５％トリトン−Ｘ１００の存在又は不在下、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）などのＲＮＡ結合染料と共にインキュベートされてもよい。製剤中の総ｄｓＲＮＡは、標準的な曲線に対する界面活性剤を含むサンプルからの信号により決定され得る。捕捉された割合は、総ｄｓＲＮＡ含有量から「遊離」ｄｓＲＮＡ含有量（界面活性剤の不在下で信号により測定した）を減算することにより決定される。捕捉されたｄｓＲＮＡのパーセントは、典型的には＞８５％である。ＬＮＰ製剤の場合、粒子サイズは、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、及び少なくとも１２０ｎｍである。好適な範囲は、典型的には少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、又は少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍである。
経口投与用の組成物及び製剤には、散剤又は顆粒、微粒子、ナノ粒子、縣濁剤、又は水若しくは非水性媒体中の液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、薬袋、錠剤又は小型錠剤が挙げられる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤は、所望され得る。いくつかの実施形態では、経口製剤は、本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡが、１種又は複数種の透過促進剤界面活性剤及びキレート剤と共に投与されるものである。好適な界面活性剤には、脂肪酸及び／若しくはエステル又はその塩、胆汁酸及び／又はその塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム及びグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、若しくはモノグリセリド、ジグリセリド、又はこれらの薬学的に許容され得る塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態において、浸透促進剤の組み合わせ、例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が使用される。例示的な１つの組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。更なる浸透促進剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明を特徴付けるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子、又はマイクロ若しくはナノ粒子を形成するために錯体化されたものを含む顆粒形態で経口的に送達され得る。ｄｓＲＮＡ錯体化剤には、ポリ−アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；陽イオン化ゼラチン、アルブミン、澱粉、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び澱粉；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ−誘導体化ポリイミン、プルラン、セルロース及び澱粉が挙げられる。好適な錯体化剤には、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノ（ｃｙｎａｏ）アクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミン及びＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡ用の経口製剤、及びそれらの製剤は、その各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書及び米国特許第６，７４７，０１４号明細書に記載されている。
非経口、実質内（脳内へ）、くも膜下腔内、脳室内又は肝内投与用の組成物及び製剤には、無菌水性溶液を挙げることができ、該無菌水性溶液は、緩衝液、希釈剤、並びに、非限定的に浸透促進剤、担体化合物、及び他の薬学的に許容され得る担体又は賦形剤などの他の好適な添加剤も含み得る。
本発明の医薬組成物は、非限定的に、液剤、乳剤、及びリポソーム含有製剤を含む。これらの組成物は、非限定的に予め形成された液剤、自己乳化型固体及び自己乳化型半固体を含む多様な構成成分から生成され得る。肝癌腫などの肝疾患を処置する際、肝臓を標的とする製剤が特に好ましい。
単位剤形にて都合よく存在し得る本発明の医薬製剤は、医薬産業にて周知の従来の技術に従って調製することができる。そのような技術は、活性成分を医薬担体又は賦形剤と関連させるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体又は微粉化固体担体又は両方と均一かつ親密に関連させた後、必要であれば、製品を成形することにより調製される。
本発明の組成物は、非限定的に錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、坐薬、及び浣腸などの多数の可能な剤形のいずれかに処方され得る。本発明の組成物はまた、水性、非水性又は混合媒体中の懸濁液として処方され得る。水性縣濁液は、更に、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、縣濁液の粘度を増大させる物質を含んでもよい。縣濁液はまた、安定剤を含み得る。
Ｃ．更なる製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして、調製され、製剤化され得る。エマルションは、典型的に、１つの液体が、通常、直径が０．１μｍを超える液滴の形態の別の液体中に分散された不均一系である（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照）。エマルションは、多くの場合、互いに親密に混合され及び分散された２つの非混和性液体相を含む二層系である。一般に、エマルションは、油中水（ｗ／ｏ）又は水中油（ｏ／ｗ）の種類のいずれかであり得る。水性相が微小液滴として塊の油相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、油中水（ｗ／ｏ）エマルションと呼ばれる。代替的に、油相が微小液滴として塊の水性相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、水中油（ｏ／ｗ）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相及び活性薬物に加えて追加の構成成分を含むことができ、該構成成分は、水性相、油相中の溶液として、又はそれ自体が別個の相として存在し得る。必要に応じてエマルション中に乳化剤、安定剤、染料、及び抗酸化剤などの医薬賦形剤も存在し得る。医薬エマルションは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）及び水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合など、３つ以上の相からなる多エマルションであり得る。そのような複合製剤は、多くの場合、単純な二成分エマルションが提供しない所定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルションの個々の油小滴が小さい水小滴を囲い込む多エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球中に囲い込まれた油小滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学的安定性を殆ど又は全く有さないことにより特徴付けられる。多くの場合、エマルションの分散又は不連続相は、外部又は連続相中に良好に分散され、乳化剤の手段、又は製剤の粘度を介してこの形態に維持される。エマルションの相のいずれかは、エマルション型軟膏ベース及びクリームの場合のように半固体又は固体であり得る。エマルションを安定化させる他の手段には、エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用が含まれる。乳化剤は、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、及び微細に分散した固体の４つのカテゴリーに大きく分類され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。
表面活性剤としても知られている合成界面活性剤は、エマルションの製剤化に広範な適用性が見出されており、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。界面活性剤は、通常、両親媒性であり、親水性部分及び疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称されており、製剤の調製の際の界面活性剤の分類及び選択の際の貴重な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なる種類、すなわち、非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両性に分類され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５を参照）。
エマルション製剤中に使用される、天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン及びアカシアが挙げられる。吸収ベースは、無水ラノリン及び親水性ワセリンのように、水を取り入れてｗ／ｏエマルションを形成するが、尚それらの半固体稠度を維持する親水性特性を所有する。微粉化固体は、特に界面活性剤の組み合わせ中、及び粘稠な製剤中で、良好な乳化剤として使用されている。これらには、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム及びコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨潤粘土、顔料、及び炭素などの非極性固体又はトリステアリン酸グリセリルが挙げられる。
非常に多様な非乳化材料もエマルション製剤中に含まれ、エマルションの特性に寄与する。それらには、脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存剤及び抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
親水性コロイド又は親水コロイドには、多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グァーガム、カラヤガム、及びトラガカント）などの天然に存在するゴム及び合成ポリマー、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）、及び合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、及びカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これらは水中に分散し又は水中で膨潤して、分散相の小滴の周囲に強力な界面フィルムを形成することにより、また、外部相の粘度を増大させることにより、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
エマルションは、多くの場合、微生物の増殖を容易に支持し得る炭水化物、タンパク質、ステロール及びホスファチドなどの多数の成分を含むため、これらの製剤は、多くの場合、保存剤を組み込んでいる。製剤に含まれる、通常使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンズアルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、及びホウ酸が挙げられる。抗酸化剤も、通常、エマルション製剤に加えられて、製剤の変質を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどの遊離基スカベンジャー、又はアスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、並びにクエン酸、酒石酸及びレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。
皮膚、経口及び非経口経路を介したエマルション製剤の適用ならびにそれらの製造方法は、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。経口送達用のエマルション製剤は、製剤化の容易さ、ならびに吸収及び生物学的利用能の観点からの有効性のため、非常に広範に使用されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。鉱油基剤の緩下剤、油溶性ビタミン及び高脂肪栄養製剤が、ｏ／ｗ型エマルションとして一般的に経口投与されている材料に含まれる。
ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態において、ｉＲＮＡ及び核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で且つ熱力学的に安定した液体溶液である、水、油及び両親媒性物質の系として定義され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５を参照）。典型的には、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液中に分散した後、十分な量の第四の構成成分、一般に中間の鎖長のアルコールを加えて透明系を形成することにより調製される。従って、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面フィルムにより安定化されている２つの非混和性液体からなる熱力学的に安定な、等方的に透明な分散物として記載されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１８５−２１５）。マイクロエマルションは通常、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤及び電解質を含む３〜５つの構成成分の組み合わせを用いて調製される。マイクロエマルションが油中水（ｗ／ｏ）タイプ又は水中油（ｏ／ｗ）タイプのいずれのものであるかは、使用される油及び界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素尾部の構造及び幾何学的充填（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｐａｃｋｉｎｇ）とに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
状態図を用いる現象論的手法が広範に研究されており、マイクロエマルションを製剤化する方法についての広範な知識を当業者に与えている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５を参照）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、自発的に形成する熱力学的に安定な小滴の製剤中で水不溶性薬物を可溶化する利点を提供する。
マイクロエマルションの調製に使用される界面活性剤には、単独で又は補助界面活性剤との組み合わせで、非限定的に、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、モノラウリン酸テトラグリセロール（ＭＬ３１０）、モノオレイン酸テトラグリセロール（ＭＯ３１０）、モノオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ３１０）、ペンタオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ５００）、モノカプリン酸デカグリセロール（ＭＣＡ７５０）、モノオレイン酸デカグリセロール（ＭＯ７５０）、セスキオレイン酸（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）デカグリセロール（ＳＯ７５０）、デカオレイン酸デカグリセロール（ＤＡＯ７５０）が挙げられる。通常、エタノール、１−プロパノール、及び１−ブタノールなどの短鎖アルコールである補助界面活性剤は、界面活性剤フィルム中に浸透し、その結果、界面活性剤分子間に生成された空隙空間によって不規則フィルムを形成することにより、界面流動性を増大させる役割を果たす。しかしながら、マイクロエマルションは、補助界面活性剤を使用することなく調製されることができ、アルコールフリー自己乳化型マイクロエマルション系は、当技術分野にて既知である。水性相は、典型的には、非限定的に水、薬物の水性溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールの誘導体とすることができる。油相は、非限定的にＣａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ、及びトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油及びシリコーン油などの材料を含むことができる。
マイクロエマルションは、薬物可溶化及び薬物吸収向上の観点から特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗ及びｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む薬物の経口バイオアベイラビリティの向上に提案されている（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書、米国特許第７，０６３，８６０号明細書、米国特許第７，０７０，８０２号明細書、米国特許第７，１５７，０９９号明細書、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬物可溶化の改善、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤誘導による膜流動性及び透過性の変更に起因する薬物吸収の可能な向上、調製の容易さ、固体剤形を超える経口投与の容易さ、臨床的効能の改善、及び毒性の低下の利点を提供する（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書、米国特許第７，０６３，８６０号明細書、米国特許第７，０７０，８０２号明細書、米国特許第７，１５７，０９９号明細書、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３を参照されたい）。多くの場合、マイクロエマルションは、マイクロエマルションの構成成分が周囲温度で一緒にされた際に自発的に形成され得る。このことは、易熱性薬物、ペプチド又はｉＲＮＡを処方する際に特に有利であり得る。マイクロエマルションはまた美容及び医薬用途の両方において活性構成成分の経費送達に有効である。本発明のマイクロエマルション組成物及び製剤が胃腸管からのｉＲＮＡ及び核酸の全身吸収の増大、並びにｉＲＮＡ及び核酸の局部細胞取り込みの改善を促進することが期待される。
本発明のマイクロエマルションはまた、モノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ ３）、ラブラソール（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、及び透過促進剤などの追加の構成成分及び添加剤を含んで、製剤の特性を改善し、かつ本発明のｉＲＮＡ及び核酸の吸収を向上させ得る。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、５つの広いカテゴリーの１つに属するものとして分類され得る−−界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、及び非キレート化非界面活性剤（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスの各々は、上記に論じられている。
ｉｉｉ．微粒子
本発明のＲＮＡｉ剤は、粒子、例えば、微粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって生成され得るが、凍結乾燥、蒸発、流体床乾燥、真空乾燥、又はこれらの技術の組合せを含む他の方法によって生成されてもよい。
ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態において、本発明は、動物の皮膚への、核酸、特にｉＲＮＡの効率的な送達を行うために様々な浸透促進剤を用いる。ほとんどの薬剤が、イオン化及び非イオン化の両方の形態で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂溶性又は親油性の薬剤のみが、細胞膜を容易に横断する。横断される膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬剤でも細胞膜を横断することができることが発見されている。細胞膜をわたる非親油性薬剤の拡散の補助に加えて、浸透促進剤は、親油性薬剤の浸透性も向上させる。
浸透促進剤は、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、及び非キレート非界面活性剤の５つの大きいカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類され得る（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）。浸透促進剤の上記の種類のそれぞれが、以下により詳細に記載される。
界面活性剤（又は「表面活性剤」）は、水溶液に溶解されると、溶液の表面張力又は水溶液と別の液体との間の界面張力を低下させ、粘膜を通るｉＲＮＡの吸収が向上されるという結果を生じる化学物質である。胆汁塩及び脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）；及びＦＣ−４３などのペルフルオロ化合物エマルション（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。
浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸及びそれらの誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１〜２０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル及びｔ−ブチル）、ならびにそれらのモノグリセリド及びジグリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が挙げられる（例えば、Ｔｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４を参照）。
胆汁の生理学的役割には、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進が含まれる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５を参照）。様々な天然の胆汁塩、及びそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって、「胆汁塩」という用語は、胆汁の天然成分のいずれかならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。好適な胆汁塩としては、例えば、コール酸（又はその薬学的に許容され得るナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（グルコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｃｈｏｌａｔｅ））、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、ナトリウムタウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシデート（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３を参照）。
本発明に関連して使用されるキレート剤は、金属イオンとの錯体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、粘膜を通るｉＲＮＡの吸収が向上されるという結果を生じる化合物として定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのキレート剤の使用に関して、ほとんどの特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼが触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、したがって、キレート剤によって阻害されるため、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害剤としても作用するという更なる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。好適なキレート剤としては、限定はされないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレート及びホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９及びβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（例えば、Ｋａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１を参照）。
本明細書において使用される際、非キレート非界面活性剤の浸透促進化合物は、キレート剤又は界面活性剤としてのわずかな活性を示すが、それにもかかわらず、消化器粘膜を通るｉＲＮＡの吸収を促進する化合物として定義され得る（例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３を参照）。この種類の浸透促進剤としては、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−及び１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）；ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が挙げられる。
細胞レベルにおけるｉＲＮＡの取り込みを促進する剤も、本発明の医薬組成物及び他の組成物に加えられ得る。例えば、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）などのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉらの米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリジンなどのポリカチオン性分子（ＬｏｌｌｏらのＰＣＴ出願の国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）も、ｄｓＲＮＡの細胞取り込みを促進することが知られている。市販のトランスフェクション試薬の例としては、特に、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、又はＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−５０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ Ｄ１ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、又はＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。
エチレングリコール及びプロピレングリコールなどのグリコール、２−ピロールなどのピロール、アゾン、ならびにリモネン及びメントンなどのテルペンを含む、他の剤を用いて、投与される核酸の浸透を促進することができる。
ｖ．担体
本発明の所定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み込んでいる。本明細書で使用される「担体化合物」又は「担体」は、不活性（即ち、生物学的活性ｐｅｒｓｅを所有しない）であり得るが、例えば、生物学的に活性な核酸を分解し、又は循環からの核酸の除去を促進することによる、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低下させるインビボでのプロセスによって、核酸であると認識される核酸又はその類似体を指すことができる。核酸及び担体化合物の共投与、典型的には過剰な後者の物質による共投与により、おそらくは共通の受容体に対する担体化合物と核酸との競合に起因して、肝臓、腎臓又は他の循環外リザーバ（ｅｘｔｒａｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）中で回収される核酸の量が実質的に低下し得る。例えば、肝組織内での部分的ホスホロチオエートの回収は、それがポリイノシン酸、デキストラン硫酸塩、ポリシチジル酸（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）又は４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と共投与された際、低下され得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ＆Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３。
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」又は「賦形剤」は、動物に１つ又は複数の核酸を送達するための薬学的に許容され得る溶媒、懸濁剤、又は任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体又は固体とすることができ、計画された投与方法を考慮に入れて、核酸及び医薬組成物の他の所定の構成成分と組み合わされた際に、所望の嵩、稠度などを提供するように選択される。典型的な医薬担体には、非限定的に、結合剤（例えば、α化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、乳糖及び他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウムなど）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、トウモロコシ澱粉、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；錠剤崩壊剤（例えば、澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウムなど）；及び湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
核酸と有害に反応しない、非−非経口投与に薬学的に許容され得る好適な有機又は無機賦形剤も本発明の組成物の処方に使用され得る。薬学的に許容され得る好適な担体には、非限定的に、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
核酸の局所投与用の製剤には、アルコールなどの通常の溶媒中の無菌及び非無菌水性溶液、非水性溶液、又は液体若しくは固体油ベース中の核酸溶液を挙げることができる。溶液は、緩衝剤、希釈剤及び他の好適な添加剤も含み得る。核酸と有害に反応しない、非−非経口投与に薬学的に許容され得る好適な有機又は無機賦形剤を使用し得る。
薬学的に許容され得る好適な賦形剤には、非限定的に、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
ｖｉｉ．他の構成成分
本発明の組成物は更に、医薬組成物中に従来見出される他の補助構成成分も、当技術分野にて確立されたそれらの使用レベルで含有し得る。それ故、例えば、組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬若しくは抗炎症薬剤などの更なる、適合可能な、医薬的に活性な材料を含有することができ、又は、染料、風味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤などの、本発明の組成物の様々な剤形を物理的に処方するのに有用な更なる材料を含有することができる。しかしながら、それらの材料は、加えられた際、本発明の組成物の構成成分の生物学的活性を過度に妨害しない必要がある。製剤は滅菌されてもよく、また所望の場合、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤、例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色料、調味料及び／又は芳香性物質などと混合される。
水性縣濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、縣濁液の粘度を増大させる物質を含み得る。縣濁液は、安定剤も含み得る。
ある実施形態において、本発明に取り上げられる医薬組成物は、（ａ）１つ又は複数のｉＲＮＡ化合物と、（ｂ）非ＲＮＡｉ機構によって機能し、出血性疾患を処置するのに有用な１つ又は複数の剤とを含む。このような剤の例としては、限定はされないが、抗炎症剤、抗脂肪症剤、抗ウイルス剤、及び／又は抗線維症剤が挙げられる。更に、シリマリンなどの、肝臓を保護するのに一般的に使用される他の物質も、本明細書に記載されるｉＲＮＡとともに使用され得る。肝疾患を処置するのに有用な他の剤としては、テルビブジン、エンテカビル、及びテラプレビルなどのプロテアーゼ阻害剤ならびに、例えば、Ｔｕｎｇらの米国特許出願公開第２００５／０１４８５４８号明細書、同第２００４／０１６７１１６号明細書、及び同第２００３／０１４４２１７号明細書；及びＨａｌｅらの米国特許出願公開第２００４／０１２７４８８号明細書に開示されている他の剤が挙げられる。
このような化合物の毒性及び処置効果は、例えば、ＬＤ５０（個体群の５０％の致死量）及びＥＤ５０（個体群の５０％に治療に有効な用量）を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性作用と処置効果との間の用量比は、処置指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。高い処置指数を示す化合物が好ましい。
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトに使用するためのある範囲の投与量を製剤化するのに使用され得る。本発明における本明細書に取り上げられる組成物の投与量は、一般に、ほとんど又は全く毒性を伴わずにＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤形及び用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明に取り上げられる方法に使用される任意の化合物では、治療に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推測され得る。用量は、細胞培養物中で測定して、ＩＣ５０（即ち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物の、又は、適切な場合、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を動物モデル内で達成する（例えば、ポリペプチドの濃度の低下を達成する）ように処方され得る。そのような情報を使用して、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
上記に述べたそれらの投与に加えて、本発明を特徴付けるｉＲＮＡは、鉄過剰により仲介され、かつＴＭＰＲＳＳ６発現を阻害することにより処置され得る病理過程の処置に有効な他の既知の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。いずれの場合でも、投与する医師は、観察された結果に基づいて、当技術分野にて既知の又は本明細書に記載される標準的な有効性の尺度を使用して、ｉＲＮＡの量及び投与時間を調整することができる。
Ｖ．ＴＭＰＲＳＳ６発現の阻害方法
本発明は、細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ−２）の発現の阻害方法を提供する。本方法は、細胞を、細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６の発現を阻害するのに有効な量のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させ、それにより、細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６の発現を阻害する工程を含む。
細胞を二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させる工程は、インビトロ又はインビボで行われ得る。細胞をＲＮＡｉ剤とインビボで接触させる工程は、対象、例えば、ヒト対象内の細胞又は細胞群を、ＲＮＡｉ剤と接触させる工程を含む。インビトロ及びインビボでの接触方法の組合せも可能である。接触は、上述されるように、直接又は間接的に行われ得る。更に、細胞を接触させる工程は、本明細書に記載されるか又は当該技術分野において公知の任意のリガンドを含む標的化リガンドによって行われ得る。好ましい実施形態において、標的化リガンドは、炭水化物部分、例えば、ＧａｌＮＡｃ３リガンド、又はＲＮＡｉ剤を目的の部位、例えば、対象の肝臓に指向する任意の他のリガンドである。
本明細書において使用される際の「阻害する」という用語は、「低下させる」、「サイレンシングする」、「下方制御する」及び他の類似語と同義的に使用され、任意のレベルの阻害を含む。
本明細書において使用される際の「ＴＭＰＲＳＳ６の発現を阻害する」という語句は、任意のＴＭＰＲＳＳ６遺伝子（例えば、マウスＴＭＰＲＳＳ６遺伝子、ラットＴＭＰＲＳＳ６遺伝子、サルＴＭＰＲＳＳ６遺伝子、又はヒトＴＭＰＲＳＳ６遺伝子など）ならびにＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の変異体又は突然変異体の発現の阻害を指すことが意図される。したがって、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子は、野生型ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子、突然変異体ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子、又は遺伝子組み換えされた細胞、細胞群、又は生物の文脈におけるトランスジェニックＴＭＰＲＳＳ６遺伝子であり得る。
「ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現を阻害する」は、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を含む。ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現は、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現に関連する任意の変数のレベル、例えば、ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡレベル、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質レベル、又は脂質レベル、又はレベルの変化に基づいて評価され得る。このレベルは、例えば、対象に由来する試料を含む、個々の細胞又は細胞群中で評価され得る。
阻害は、対照のレベルと比較したＴＭＰＲＳＳ６発現に関連する１つ又は複数の変数の絶対的又は相対的レベルの低下によって評価され得る。対照のレベルは、当該技術分野において用いられる任意のタイプの対照のレベル、例えば、投与前ベースライン（ｐｒｅ−ｄｏｓｅ ｂａｓｅｌｉｎｅ）レベル、又は非処理又は対照（例えば、緩衝液のみの対照又は不活性な剤の対照など）で処理された同様の対象、細胞、又は試料から測定されるレベルであり得る。
本発明の方法のある実施形態において、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％．少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％だけ阻害される。
ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現の阻害は、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子が転写され、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現が阻害されるように（例えば、１つ又は複数の細胞を、本発明のＲＮＡｉ剤と接触させることによって、又は本発明のＲＮＡｉ剤を、細胞が存在する又は存在していた対象に投与することによって）処理されている第１の細胞又は細胞群（このような細胞は、例えば、対象に由来する試料中に存在し得る）によって発現されるｍＲＮＡの量の、そのように処理されていない以外は第１の細胞又は細胞群と実質的に同一の第２の細胞又は細胞群（対照細胞）と比較した際の低下に現れる。好ましい実施形態において、阻害は、以下の式を用いて、対照細胞中のｍＲＮＡのレベルにおけるパーセンテージとして、処理された細胞中のｍＲＮＡのレベルを表すことによって評価される：
Figure 2016520593
あるいは、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現の阻害は、例えば、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質発現、ヘプシジン遺伝子またはタンパク質発現などのＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現、または組織または血清中の鉄レベルに機能的に関連するパラメータの低下に関して評価され得る。ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子サイレンシングは、構造的に又はゲノム工学によって、及び当該技術分野において公知の任意のアッセイによって、ＴＭＰＲＳＳ６を発現する任意の細胞中で測定され得る。肝臓は、ＴＭＰＲＳＳ６発現の主要部位である。発現の他の実質的な部位は、腎臓及び子宮を含む。
ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質の発現の阻害は、細胞又は細胞群によって発現されるＴＭＰＲＳＳ６タンパク質のレベル（例えば、対象に由来する試料中で発現されるタンパク質のレベル）の低下に現れる。ｍＲＮＡの抑制の評価について上で説明されるように、処理された細胞又は細胞群中のタンパク質の発現レベルの阻害は、対照細胞又は細胞群中のタンパク質のレベルにおけるパーセンテージとして同様に表され得る。
ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現の阻害を評価するのに使用され得る対照細胞又は細胞群は、本発明のＲＮＡｉ剤とまだ接触されていない細胞又は細胞群を含む。例えば、対照細胞又は細胞群は、ＲＮＡｉ剤による対象の処理の前に、個々の対象（例えば、ヒト又は動物対象）から得られる。
細胞又は細胞群によって発現されるＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡの発現を評価するために当該技術分野において公知の任意の方法を用いて測定され得る。一実施形態において、試料中のＴＭＰＲＳＳ６の発現のレベルは、転写されたポリヌクレオチド、又はその一部、例えば、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子のｍＲＮＡを検出することによって測定される。ＲＮＡは、例えば、酸フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）又はＰＡＸ遺伝子（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の使用を含む、ＲＮＡ抽出技術を用いて、細胞から抽出され得る。リボ核酸のハイブリダイゼーションを用いる典型的なアッセイ形式としては、核ランオンアッセイ（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｕｎ−ｏｎ ａｓｓａｙ）、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Ｍｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：７０３５）、ノーザンブロット法、インサイチュハイブリダイゼーション、及びマイクロアレイ分析が挙げられる。
一実施形態において、ＴＭＰＲＳＳ６の発現のレベルは、核酸プローブを用いて測定される。本明細書において使用される際の「プローブ」という用語は、特定のＴＭＰＲＳＳ６に選択的に結合することが可能な任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成可能であり、又は適切な生物学的調製から得られる。プローブは、標識されるように特に設計され得る。プローブとして用いられ得る分子の例としては、限定はされないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、及び有機分子が挙げられる。
単離されたｍＲＮＡは、サザン又はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析及びプローブアッセイを含むがこれらに限定されない、ハイブリダイゼーション又は増幅アッセイに使用され得る。ｍＲＮＡレベルを測定するための一方法は、単離されたｍＲＮＡを、ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る核酸分子（プローブ）と接触させる工程を含む。一実施形態において、ｍＲＮＡは、固体表面に固定され、例えば、アガロースゲル上に単離されたｍＲＮＡを流し、ゲルからニトロセルロースなどの膜へとｍＲＮＡを転写することによって、プローブと接触される。代替的な実施形態において、プローブは、固体表面に固定され、ｍＲＮＡは、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイ中で、プローブと接触される。当業者は、ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡのレベルを測定するのに使用するための公知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適合させることができる。
試料中のＴＭＰＲＳＳ６の発現のレベルを測定するための代替的な方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ、１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載される実験実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９−１９３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｑ−Ｂｅｔａ Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ）（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉらの米国特許第５，８５４，０３３号明細書）又は任意の他の核酸増幅方法による、例えば、試料中のｍＲＮＡの（ｃＤＮＡを調製するための）核酸増幅及び／又は逆転写酵素のプロセス、続いて、当業者に周知の技術を用いた増幅分子の検出を含む。これらの検出スキームは、核酸分子がごく少数で存在する場合、核酸分子の検出に特に有用である。本発明の特定の態様において、ＴＭＰＲＳＳ６の発現のレベルは、定量的な蛍光性ＲＴ−ＰＣＲ（即ち、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ）によって測定される。
ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡの発現レベルは、膜ブロット（ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析に使用されるものなど）、又はマイクロウェル、試料チューブ、ゲル、ビーズ又は繊維（又は結合された核酸を含む任意の固体担体）を用いて監視され得る。参照により本明細書に援用される、米国特許第５，７７０，７２２号明細書、同第５，８７４，２１９号明細書、同第５，７４４，３０５号明細書、同第５，６７７，１９５号明細書及び同第５，４４５，９３４号明細書を参照されたい。ＴＭＰＲＳＳ６発現レベルの測定は、溶液中での核酸プローブの使用も含み得る。
好ましい実施形態において、ｍＲＮＡの発現のレベルは、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ又はリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて評価される。これらの方法の使用は、本明細書に提供される実施例に記載され、例示される。
ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質の発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための当該技術分野において公知の任意の方法を用いて測定され得る。このような方法としては、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、流体又はゲル内沈降素反応、吸光分光法、比色分析法、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、（単純又は二重）免疫拡散法、免疫電気泳動、ウエスタンブロット法、放射免疫定量法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが挙げられる。
本明細書において使用される際の「試料」という用語は、対象から単離された類似の体液、細胞、又は組織、ならびに対象中に存在する体液、細胞、又は組織の集合体を含む。生体液の例としては、血液、血清及び漿膜液、血漿、リンパ液、尿、脳脊髄液、唾液、眼液などが挙げられる。組織試料は、組織、器官又は局所領域に由来する試料を含み得る。例えば、試料は、特定の器官、器官の部分、あるいはそれらの器官中の体液又は細胞に由来し得る。特定の実施形態において、試料は、肝臓（例えば、全肝臓又は肝臓の特定の部分又は、例えば、肝細胞などの肝臓中の特定のタイプの細胞）に由来し得る。好ましい実施形態において、「対象に由来する試料」は、対象から得られる血液又は血漿を指す。更なる実施形態において、「対象に由来する試料」は、対象から得られる肝臓組織を指す。
本発明の方法のある実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤が対象内の特定の部位に送達されるように、対象に投与される。ＴＭＰＲＳＳ６の発現の阻害は、対象内の特定の部位からの体液又は組織に由来する試料中のＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ又はＴＭＰＲＳＳ６タンパク質のレベル又はレベルの変化の測定を用いて評価され得る。好ましい実施形態において、部位は肝臓である。部位はまた、上記の部位のいずれか１つからの細胞の小区分（ｓｕｂｓｅｃｔｉｏｎ）又は部分群（ｓｕｂｇｒｏｕｐ）であり得る。部位は、特定のタイプの受容体を発現する細胞も含み得る。
ＶＩ．ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患の処置又は予防方法
本発明は、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子発現によって調節され得る疾病及び病態の処置又は予防方法も提供する。例えば、本明細書に記載される組成物は、鉄過剰に関連する疾患、例えば、サラセミア（例えば、β−サラセミア又はα−サラセミア）、原発性ヘモクロマトーシス、続発性ヘモクロマトーシス、重度の若年性ヘモクロマトーシス、赤芽球性ポルフィリン症、鉄芽球性貧血、溶血性貧血、赤血球異形成貧血、又は鎌型赤血球貧血を処置するのに使用され得る。一実施形態において、ＴＭＰＲＳＳ６ ｉＲＮＡは、異常ヘモグロビン症を処置するのに使用され得る。本発明のＴＭＰＲＳＳ６ ｉＲＮＡは、慢性アルコール依存症などの、他の病態に起因する鉄のレベルの上昇を処置するのにも使用され得る。
サラセミアでは、骨髄が、不十分な量のヘモグロビン鎖を合成し；これが、ひいては、赤血球の産生を減少させ、貧血を引き起こす。α又はβ鎖のいずれかが罹患し得るが、βサラセミアがより一般的である。新生児は、身体が、β鎖を有さないＨｂＦをまだ産生するため、正常であり；生後数ヶ月の間、骨髄がＨｂＡを産生するように切り替わり、症状が現れ始める。
β−サラセミアは、ＨＢＢ遺伝子の非発現（β°）又は低発現（β＋）対立遺伝子のいずれかの突然変異に起因し、β−サラセミアは、遺伝子型に応じて重症度が変化し、軽症型／β−サラセミア形質（β／β°又はβ／β＋）、中間型β−サラセミア（β°／β＋）、及び重症型β−サラセミア（β°／β°又はβ”７β＋）を含む。
中間型サラセミア（ＴＩ）が、典型的に、溶血をほとんど示さない一方、重症型β−サラセミア（ＴＭ）には、典型的に、例えば、貧血及び脾腫を引き起こす十分な溶血；及び骨髄の活動亢進（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｒｉｖｅ）（骨格変化、骨減少症）を引き起こす著しい無効造血、エリスロポエチン合成の増加、肝脾腫、造血剤の摂取（巨赤芽球性貧血）、及び血液中の高尿酸が伴う。本発明のｉＲＮＡ、例えば、ＴＭＰＲＳＳ６ ｉＲＮＡは、典型的に、よりＴＩのようなサラセミアを伴う鉄過剰を処置するのに（例えば、β°／β＋、β／β°又はβ／β＋遺伝子型を有する固体を処置するのに）より適している。
β−サラセミアの症状は、例えば、治療による合併症、例えば、内分泌障害、肝線維症及び心筋繊維化を引き起こす鉄過剰も含む。ＴＭＰＲＳＳ６を標的とするｉＲＮＡ剤の投与は、これらの症状のうちの１つ又は複数を処置するのに有効であり得る。
α−サラセミアは、ＨＢＡ１又はＨＢＡ２遺伝子の非発現（ａ°）又は低発現（ａ＋）対立遺伝子のいずれかの突然変異に起因し、又はサラセミアは、遺伝子型に応じて重症度が変化し、サラセミア形質（−α／αα）、Ｈｂ Ｂａｒｔ型及び胎児水腫（ａ°／ａ°）、軽症型ａ−サラセミア（−−／αα）、（−α／−α）、及びＨｂＨ病（−／−ａ）を含む。より少ないａ−グロビン鎖が産生されると、成人において過剰なβ鎖及び新生児において過剰なγ鎖がもたらされる。過剰なβ鎖は、異常な酸素解離曲線を有する、不安定な四量体（４β鎖のヘモグロビンＨ又はＨｂＨと呼ばれる）を形成する。ＴＭＰＲＳＳ６を標的とするｉＲＮＡ剤の投与は、ａ−サラセミアに罹患している対象における鉄過剰を処置するのに有効であり得る。
ヘモクロマトーシスの症状としては、例えば、腹痛、関節痛、疲労、活力不足、脱力感、皮膚の黒ずみ（「ブロンジング（ｂｒｏｎｚｉｎｇ）」と呼ばれることが多い）、及び体毛の喪失が挙げられる。ＴＭＰＲＳＳ６を標的とするｉＲＮＡ剤の投与は、これらの症状のうちの１つ又は複数を処置するのに有効であり得る。
鉄過剰に関連する他の症状としては、肝疾患（肝硬変、癌）、心臓発作又は心不全、糖尿病、変形性関節症、骨粗鬆症、メタボリック・シンドローム、甲状腺機能低下症、性腺機能低下症、及び場合によっては早死にのリスクの増加が挙げられる。過剰負荷につながる鉄の不適切な使用（ｍｉｓｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）は、アルツハイマー病、若年性パーキンソン病、ハンチントン病、てんかん及び多発性硬化症などの神経変性疾患も促進し得る。ＴＭＰＲＳＳ６を標的とするｉＲＮＡ剤、例えば、表１又は２に記載されるｉＲＮＡの投与により、これらの症状のうちの１つ又は複数を処置し、又は鉄レベルの増加によって悪化する疾病又は疾患の発症又は進行を防ぐことができる。
本発明の方法は、他の薬剤及び／又は他の治療方法、例えば、これらの疾患を処置するのに現在用いられているものなどの、例えば、公知の薬剤及び／又は公知の治療方法と組み合わせて、例えば、鉄過剰に関連する疾患を処置するための、ｉＲＮＡ剤又はその医薬組成物の使用に更に関する。例えば、特定の実施形態において、ＴＭＰＲＳＳ６を標的とするｉＲＮＡ剤は、例えば、鉄キレート剤（例えば、デフェロキサミン）、葉酸、輸血、静脈切開術、潰瘍に対処するための薬剤、胎児のヘモグロビン値を上昇させるための薬剤（例えば、ヒドロキシウレア）、感染症を制御するための薬剤（例えば、抗生物質及び抗ウイルス薬）、血栓状態を処置するための薬剤、又は幹細胞若しくは骨髄移植と組み合わせて投与される。幹細胞移植は、血縁者、例えば、兄弟姉妹などの臍帯に由来する幹細胞を用いることができる。例示的な鉄キレート剤としては、デフェロキサミン、デフェラシロクス（Ｅｘｊａｄｅ）、デフェリプロン、ビタミンＥ、小麦胚芽抽、トコフェルソラン、及びインジカキサンチンが挙げられる。
ｉＲＮＡ剤及び更なる治療剤は、同じ組成物中で、例えば、非経口投与され得、又は更なる治療剤は、別個の組成物の一部として又は本明細書に記載される別の方法によって投与され得る。ｉＲＮＡ剤及び更なる治療剤の投与は、同時に、又は異なる時点で任意の順序であり得る。
本発明のｉＲＮＡ剤の投与は、鉄レベルを低下させ、フェリチンレベルを低下させ、及び／又はトランスフェリン飽和度レベルを低下させ得る。例えば、ｄｓＲＮＡの投与は、血清鉄レベルを低下させ、及び／又は血清フェリチンレベルを低下させ得る。トランスフェリン飽和度レベルは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又はそれ以上だけ低下され得る。別の実施形態において、トランスフェリン飽和度レベルは、投与後７日間、１０日間、２０日間、３０日間、又はそれ以上にわたってより低いままである。
トランスフェリン飽和度レベルは、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、又はそれ以下に低下され得る。別の実施形態において、より低いトランスフェリン飽和度レベルは、投与後７日間、１０日間、２０日間、３０日間、又はそれ以上にわたって維持される。トランスフェリン飽和度は、血清トランスフェリンに結合された鉄の量の尺度であり、血清鉄及び総鉄結合能の比率に相当する。
血清鉄レベルは、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれ以上だけ低下され得る。別の実施形態において、血清鉄レベルは、投与後７日間、１０日間、２０日間、３０日間、又はそれ以上にわたってより低いままである。
本発明のｉＲＮＡ剤の投与は、好ましくは、哺乳動物の血液中、より特定的には血清中、又は１つ又は複数の組織中の鉄レベルの低下をもたらす。ある実施形態において、鉄レベルは、処置前のレベルと比較して、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上だけ低下される。
この文脈における「低下させる」とは、このようなレベルの統計的に有意な低下を意味する。低下は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又はそれ以上であり得、このような障害を有さない個体の正常範囲内であると認められるレベルまで低下されるのが好ましい。
本発明のｉＲＮＡ剤の投与は、血清ヘプシジンレベルを増加させ、及び／又はヘプシジン遺伝子発現を増加させ得る。例えば、ｄｓＲＮＡの投与は、少なくとも約１０％、２５％、５０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、又はそれ以上だけ血清ヘプシジンを増加させ得る。更なる例において、ｄｓＲＮＡの投与は、少なくとも約１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、又はそれ以上だけヘプシジンｍＲＮＡレベルを増加させ得る。
疾病の処置又は予防の有効性は、例えば、疾病の進行、疾病の寛解、症状の重症度、痛みの減少、クオリティ・オブ・ライフ、処置効果を持続させるのに必要な薬剤の用量、疾病マーカーのレベル、又は処置されている若しくは予防の対象とされる所定の疾病に適切な、測定可能な任意の他のパラメータを測定することによって評価され得る。このようなパラメータのいずれか１つ、又はパラメータの任意の組合せを測定することによって処置又は予防の有効性を監視することは、十分当業者の能力の範囲内である。例えば、トランスフェリン飽和度又は血清フェリチンのレベルは、所与の処置計画の有効性について監視され得る。
鉄レベル試験は、典型的に、患者の血液の試料において行われる。鉄レベル試験は、タンパク質トランスフェリンによって運ばれる血清中の鉄の量を測定する。ＴＩＢＣ（総鉄結合能）試験は、トランスフェリンが完全に飽和していた場合に血液が運び得る鉄の量を測定する。トランスフェリンが、肝臓によって産生されるため、ＴＩＢＣは、肝機能及び栄養を監視するのに使用され得る。トランスフェリン試験は、血液中のトランスフェリン（シデロフィリンとも呼ばれる）レベルの直接的尺度である。トランスフェリンの飽和レベルは、血清鉄レベルをＴＩＢＣで除算することによって計算され得る。フェリチン試験は、身体が後に使用するために鉄を貯蔵する血液中のタンパク質のレベルを測定する。
本明細書に記載されるｉＲＮＡ処置は、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患（例えば、血清中の鉄レベル、例えば、３５０μｇ／ｄＬ超、５００μｇ／ｄＬ超、１０００μｇ／ｄＬ超、又はそれ以上の鉄レベルによって示され得るような上昇した鉄レベル）に罹患している個体を処置するのに使用され得る。一実施形態において、血清中の鉄の上昇したレベルは、例えば、乾燥重量で１５、２０、２５、又は３０ｍｇ／ｇを超える。
本明細書に記載されるｉＲＮＡ処置は、血清中の上昇したフェリチンレベル、例えば、３００μｇ／Ｌ超、５００μｇ／Ｌ超、１０００μｇ／Ｌ超、１５００μｇ／Ｌ超、２０００μｇ／Ｌ超、２５００μｇ／Ｌ超、又は３０００μｇ／Ｌ、又はそれ以上のフェリチンレベルによって示され得るような上昇した鉄レベルを有する個体を処置するのにも使用され得る。
本明細書に記載されるｉＲＮＡ処置は、血清中の上昇したトランスフェリンレベル、例えば、４００ｍｇ／ｄＬ超、５００ｍｇ／Ｌ超、１０００ｍｇ／ｄＬ超、又はそれ以上のトランスフェリンレベルによって示され得るような上昇した鉄レベルを有する個体を処置するのに更に使用され得る。
本明細書に記載されるｉＲＮＡ処置は、緩やかに上昇したトランスフェリン飽和度レベル、例えば、４０％、４５％、又は５０％又はそれ以上の飽和レベルによって示され得るような緩やかに上昇した鉄レベルを有する個体を処置するのにも使用され得る。更に、本明細書に記載される処置は、トランスフェリン飽和度のわずかな上昇を有する個体における鉄レベルの上昇を防ぐのにも使用され得る。当業者は、本明細書に記載されるｉＲＮＡによる処置を受けている対象におけるトランスフェリン飽和度レベルを容易に監視し、少なくとも５％又は１０％のトランスフェリン飽和度レベルの低下を測定することができる。
本明細書に記載されるｉＲＮＡ処置は、４００μｇ／ｄＬ超、５００μｇ／ｄＬ超、又は１０００μｇ／ｄＬ超、又はそれ以上のＴＩＢＣ値によって示され得るような上昇した鉄レベルを有する個体を処置するのに使用され得る。
ある実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤による処置を必要とする個体は、減少したヘマトクリット値、減少したヘモグロビン値、増加した赤血球分布幅、増加した数の網状赤血球、減少した数の成熟赤血球、増加した不飽和鉄結合能、減少した無効造血、減少した髄外造血、及び／又は減少したＨＡＭＰ１発現レベルを有する。
患者は、血糖（グルコース）値又はフェトプロテインレベルのアッセイによって、心エコー図（例えば、心機能を調べるため）、心電図（ＥＣＧ）（例えば、心臓の電気的活動を調べるため）、画像検査（ＣＴスキャン、ＭＲＩ及び超音波など）、及び肝機能試験によって更に監視され得る。過剰な鉄染色又は鉄濃度が、肝生検試料において、又は肝臓障害の程度、例えば、肝疾患の病期を確認するために、測定され得る。
処置又は予防の効果は、疾病状態の１つ又は複数のパラメータの統計的に有意な改善がある場合、又は悪化若しくは本来予想されていた症状が発生しないことにより明らかである。一例として、疾病の測定可能なパラメータの少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％又はそれ以上の好ましい変化は、有効な処置を示し得る。所定のｉＲＮＡ薬剤又はその薬剤の製剤の有効性も、当該技術分野において公知であるように、所定の疾病に関して実験動物モデルを用いて判断することができる。実験動物モデルを用いる場合、処置の有効性は、マーカー又は症状の統計的に有意な低下が観察された場合に証明される。
あるいは、有効性は、臨床的に許容される疾病の重症度の評価尺度に基づいて診断の当業者により決定された疾病の重症度の低減により測定することができる。
本明細書において使用される際、「対象」は、ヒト又は非ヒト動物、好ましくは、脊椎動物、より好ましくは、哺乳動物を含む。対象は、トランスジェニック生物を含み得る。最も好ましくは、対象は、ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患に罹患しているか、又はＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患を発症しやすいヒトなどのヒトである。
本発明の方法のある実施形態において、ＴＭＰＲＳＳ６発現は、例えば、少なくとも１週間、２週間、３週間、又は４週間又はそれ以上の長期間にわたって低下される。例えば、場合によっては、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現は、本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤の投与によって、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は１００％だけ抑制される。ある実施形態において、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子は、ｉＲＮＡ剤の投与によって、少なくとも約６０％、７０％、又は８０％だけ抑制される。ある実施形態において、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子は、二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約８５％、９０％、又は９５％だけ抑制される。別の実施形態において、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子は、投与後７日間、１０日間、２０日間、３０日間、又はそれ以上にわたって抑制されたままである。
本発明のＲＮＡｉ剤は、皮下、静脈内、筋肉内、眼内、気管支内、胸膜内、腹腔内、動脈内、リンパ管、脳脊髄、及びそれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の任意の投与方法を用いて、対象に投与され得る。好ましい実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、皮下投与される。
ある実施形態において、投与は、蓄積注射による。蓄積注射は、長期間にわたって持続的にＲＮＡｉ剤を放出し得る。したがって、蓄積注射は、所望の効果、例えば、ＴＭＰＲＳＳ６の所望の阻害、又は治療又は予防効果を得るのに必要な投与頻度を減少させ得る。蓄積注射は、より一貫した血清濃度も提供し得る。蓄積注射は、皮下注射又は筋肉内注射を含み得る。好ましい実施形態において、蓄積注射は、皮下注射である。
ある実施形態において、投与は、ポンプによる。ポンプは、外部ポンプ又は手術により埋め込まれたポンプであってもよい。特定の実施形態において、ポンプは、皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプである。他の実施形態において、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、静脈内、皮下、動脈内、又は硬膜外注入に使用され得る。好ましい実施形態において、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。他の実施形態において、ポンプは、ＲＮＡｉ剤を肝臓に送達する手術により埋め込まれたポンプである。
他の投与方法としては、硬膜外、脳内、脳室内、経鼻投与、動脈内、心臓内、骨内注入、くも膜下腔内、及び硝子体内、及び経肺が挙げられる。投与方法は、局所又は全身的処置が所望されるかどうかに基づいて、及び処置される部位に基づいて選択され得る。投与の経路及び部位は、標的化を促進するように選択され得る。
本方法は、例えば、少なくとも５、より好ましくは７、１０、１４、２１、２５、３０又は４０日間にわたってＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡのレベルを低下させるのに十分な用量でｉＲＮＡ剤を投与する工程と；任意選択で、第２の単回用量のｄｓＲＮＡを投与する工程とを含み、ここで、第２の単回用量は、第１の単回用量が投与された少なくとも５、より好ましくは、７、１０、１４、２１、２５、３０又は４０日後に投与され、それにより、対象内でのＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現を阻害する。
一実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤の用量は、４週間に１回以下、３週間に１回以下、２週間に１回以下、又は週に１回以下投与される。別の実施形態において、投与は、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、又は６ヶ月間、又は１年間又はそれ以上にわたって維持され得る。別の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤の用量は、３週間にわたって週に１回投与される。
一般に、ｉＲＮＡ剤は、免疫系を活性化せず、例えば、ＴＮＦ−α又はＩＦＮ−αレベルなどのサイトカインレベルを増加させない。例えば、本明細書に記載されるものなどのインビトロＰＢＭＣアッセイなどのアッセイによって測定される場合、ＴＮＦ−α又はＩＦＮ−αのレベルの増加は、ＴＭＰＲＳＳ６を標的としないｄｓＲＮＡなどの対照ｄｓＲＮＡで処理された対照細胞の３０％、２０％、又は１０％未満である。
例えば、対象には、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、又は３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡなどの、治療量のｉＲＮＡ剤が投与され得る。ｉＲＮＡ剤は、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、又は２５分間などの期間にわたって、静脈内注射によって投与され得る。投与は、例えば、隔週（即ち、２週間ごと）で１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間又はそれ以上など、定期的に繰り返される。最初の処置計画の後、処置剤は、より少ない頻度で投与され得る。例えば、隔週で３ヶ月間の投与後、投与は、月に１回で６ヶ月間又は１年間又はそれ以上にわたって繰り返され得る。ｉＲＮＡ剤の投与は、例えば、細胞、組織、血液、尿又は患者の他の区画内のＴＭＰＲＳＳ６レベルを、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％又はそれ以上だけ低下させ得る。
ｉＲＮＡ剤の総用量を投与する前に、患者により少ない用量を投与し（５％未満となる用量の注入反応など）、アレルギー反応などの副作用、又は脂質レベル又は血圧の上昇を監視し得る。別の例では、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α又はＩＮＦ−α）レベルの増加などの望ましくない免疫賦活作用に関して患者を監視し得る。
鉄レベルの上昇に関連する多くの疾病は、遺伝性である。したがって、ＴＭＰＲＳＳ６ ｉＲＮＡを必要とする患者が、家族歴を聴取することによって特定され得る。医者、看護師、又は家族の一員などの医療介護提供者が、ＴＭＰＲＳＳ６ ｄｓＲＮＡを処方又は投与する前に、家族歴を聴取することができる。ＴＭＰＲＳＳ６ ｄｓＲＮＡが患者に投与される前に、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子における突然変異を特定するために、ＤＮＡ試験も患者に対して行われ得る。例えば、遺伝性ヘモクロマトーシスの診断は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＢ０７４４２．１（ＧＩ：１８９０１８０、２００８年１０月２３日付の記録）にしたがって、２つのＨＦＥ（ヘモクロマトーシス）遺伝子突然変異Ｃ２８２Ｙ及びＨ６３Ｄを特定することによって確認され得る。
処置又は予防の効果は、疾病状態の１つ又は複数のパラメータの統計的に有意な改善が存在した場合、又は悪化若しくはさもなくば予想されていた症状が発生しないことにより明らかである。一例として、疾病の測定可能なパラメータの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、又はそれを上回る好ましい変化は、有効な処置を示し得る。本発明の特定のｉＲＮＡ剤、又はそのｉＲＮＡ剤の所定の製剤に関する有効性も、当技術分野にて既知のように、所定の疾病に関して実験動物モデルを使用して判断することができる。実験動物モデルを使用する際、処置の有効性は、マーカー又は症状において統計的に有意な低下が観察された場合に証明される。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇ、又は約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
ある実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、約１７ｍｇ／ｋｇ、約１８ｍｇ／ｋｇ、約１９ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２１ｍｇ／ｋｇ、約２２ｍｇ／ｋｇ、約２３ｍｇ／ｋｇ、約２４ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約２６ｍｇ／ｋｇ、約２７ｍｇ／ｋｇ、約２８ｍｇ／ｋｇ、約２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、約３１ｍｇ／ｋｇ、約３２ｍｇ／ｋｇ、約３３ｍｇ／ｋｇ、約３４ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約３６ｍｇ／ｋｇ、約３７ｍｇ／ｋｇ、約３８ｍｇ／ｋｇ、約３９ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４１ｍｇ／ｋｇ、約４２ｍｇ／ｋｇ、約４３ｍｇ／ｋｇ、約４４ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約４６ｍｇ／ｋｇ、約４７ｍｇ／ｋｇ、約４８ｍｇ／ｋｇ、約４９ｍｇ／ｋｇ又は約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
特定の実施形態において、例えば、本発明の組成物が、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ及び脂質を含む場合、対象には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約９．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇなどの、治療量のｉＲＮＡが投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
本発明の特定の実施形態において、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、１つ又は複数の修飾（例えば、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフ（剤の切断部位又はその近傍に１つのこのようなモチーフを含む））、６つのホスホロチオエート結合、及びリガンドを含む場合、このような剤は、約０．０１〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。上記の記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図され、例えば、ＲＮＡｉ剤は、約０．０１５ｍｇ／ｋｇ〜約０．４５ｍｇ／ｍｇの用量で対象に投与され得る。
例えば、ＲＮＡｉ剤、例えば、医薬組成物中のＲＮＡｉ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０１７５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０２２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２７５ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０３２５ｍｇ／ｋｇ、０．０３５ｍｇ／ｋｇ、０．０３７５ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０４２５ｍｇ／ｋｇ、０．０４５ｍｇ／ｋｇ、０．０４７５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０５２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５５ｍｇ／ｋｇ、０．０５７５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０６２５ｍｇ／ｋｇ、０．０６５ｍｇ／ｋｇ、０．０６７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０７２５ｍｇ／ｋｇ、０．０７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７７５ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０８２５ｍｇ／ｋｇ、０．０８５ｍｇ／ｋｇ、０．０８７５ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．０９２５ｍｇ／ｋｇ、０．０９５ｍｇ／ｋｇ、０．０９７５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１２５ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．１７５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２２５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．２７５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３２５ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．３７５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４２５ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．４７５ｍｇ／ｋｇ、又は約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。上記の記載される値の中間の値も、本発明の一部であることが意図される。
対象に投与され得るＲＮＡｉ剤の用量は、望ましくない副作用を避けると同時に、例えば、所望のレベルのＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の抑制（例えば、ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡの抑制、ＴＭＰＲＳＳ６タンパク質の発現、又は脂質レベルの低下に基づいて評価した際の）又は所望の治療又は予防効果を得るために、特定の用量のリスク及びベネフィットを釣り合わせるように調整され得る。
ある実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２つ以上の用量で投与される。反復される又は高頻度の注入を促進することが必要とされる場合、送達デバイス、例えば、ポンプ、半永久的なステント（例えば、静脈内、腹腔内、嚢内又は関節包内）、又はリザーバの埋め込みが望ましいことがある。ある実施形態において、その後の投与の回数又は量は、所望の効果の達成、例えば、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の抑制、又は治療又は予防効果の達成、例えば、鉄過剰の減少に応じて決まる。ある実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、計画にしたがって投与される。例えば、ＲＮＡｉ剤は、週に１回、週に２回、週に３回、週に４回、又は週に５回投与され得る。ある実施形態において、計画は、例えば、１時間ごと、４時間ごと、６時間ごと、８時間ごと、１２時間ごと、毎日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、毎週、隔週、又は毎月での、規則的間隔の投与を含む。他の実施形態において、計画は、狭い間隔の投与、続いて、ＲＮＡｉ剤が投与されないより長い期間を含む。例えば、計画は、比較的短い期間（例えば、約６時間ごと、約１２時間ごと、約２４時間、約４８時間ごと、又は約７２時間ごと）で投与される最初の組の投与、続いて、ＲＮＡｉ剤が投与されないより長い期間（例えば、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、又は約８週間）を含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、最初に１時間ごとに投与され、その後、より長い間隔（例えば、毎日、毎週、隔週、又は毎月）で投与される。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、最初に毎日投与され、その後、より長い間隔（例えば、毎週、隔週、又は毎月）で投与される。特定の実施形態において、より長い間隔は、時間とともに増加し、又は所望の効果の達成に基づいて決定される。特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、第１週の間は１日１回投与され、その後、投与の８日目に週１回投与が開始する。別の特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、第１週の間は１日おきに投与され、その後、投与の８日目に週１回投与が開始する。
ある実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、狭い間隔の投与の「初期投与段階」と、後に続き得る、ＲＮＡｉ剤がより長い間隔で投与される「維持段階」を含む投与計画で投与される。一実施形態において、初期投与段階は、第１週の間、ＲＮＡｉ剤の１日１回の投与を５回含む。別の実施形態において、維持段階は、ＲＮＡｉ剤の週に１回又は２回の投与を含む。更なる実施形態において、維持段階は、５週間継続する。
これらの計画のいずれも、任意選択的に、１回又は複数回の反復で繰り返され得る。反復回数は、所望の効果の達成、例えば、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の抑制、及び／又は治療又は予防効果の達成、例えば鉄レベルの低下又はサラセミア、例えば、β−サラセミア、又はヘモクロマトーシスの症状の減少に応じて決まる。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤をどのように投与するかについて、最終使用者、例えば、介護者又は対象に指示する方法を取り上げる。本方法は、任意選択で、１回又は複数回の用量のｉＲＮＡ剤を最終使用者に提供する工程と、本明細書に記載される投与計画でｉＲＮＡ剤を投与するように最終使用者に指示し、それにより、最終使用者に指示する工程とを含む。
ＶＩＩ．キット
本発明は、ｉＲＮＡ剤のいずれかを使用し、及び／又は本発明の方法のいずれかを行うためのキットも提供する。このようなキットは、１つ又は複数のＲＮＡｉ剤と、使用説明書、例えば、細胞を、ＴＭＰＲＳＳ６の発現を阻害するのに有効な量のＲＮＡｉ剤と接触させることによって、細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６の発現を阻害するための説明書とを含む。キットは、任意選択で、細胞をＲＮＡｉ剤と接触させるための手段（例えば、注射器具）、又はＴＭＰＲＳＳ６の阻害を測定するための手段（例えば、ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ又はＴＴＲタンパク質の阻害を測定するための手段）を更に含み得る。ＴＭＰＲＳＳ６の阻害を測定するためのこのような手段は、例えば、血漿試料などの、対象に由来する試料を得るための手段を含み得る。本発明のキットは、任意選択で、ＲＮＡｉ剤を対象に投与するための手段又は治療有効量又は予防的に有効な量を決定するための手段を更に含み得る。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者により通常に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載したものと同様の又は等価な方法及び材料を、本発明を特徴付けるｉＲＮＡ及び方法の実践又は試験に使用できるが、好適な方法及び材料は下記に記載されている。本明細書に言及した全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。加えて、材料、方法及び実施例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。
材料及び方法
以下の材料及び方法を実施例に使用した。
ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｃａｔ ＃４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成
反応当たり２μｌの１０倍緩衝液、０．８μｌの２５倍ｄＮＴＰｓ、２μｌのランダムプライマー、１μｌの逆転写酵素、１μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び３．２μｌのＨ２Ｏのマスターミックスを、１０μｌの総ＲＮＡに加えた。以下の工程を介して、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃ−１０００又はＳ−１０００サーモサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、ｃＤＮＡを生成した：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５秒間、４℃で保持。
細胞培養及びトランスフェクション
Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％のＦＢＳ、ストレプトマイシン、及びグルタミン（ＡＴＣＣ）が補充されたＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ）中、５％のＣＯ２の雰囲気下、３７℃でほぼコンフルエンスまで増殖させた後、トリプシン処理によりプレートから解放した。ウェル当たり１４．８μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ及び０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ ＃ １３７７８−１５０）を、９６ウェルプレート内のウェルごとに５μｌの各ｓｉＲＮＡ二本鎖に加えることによりトランスフェクションを行い、室温で１５分間インキュベートした。次に、約２×１０４個のＨｅｐ３Ｂ細胞を含む、抗生物質を有さない８０μｌの完全増殖培地を、ｓｉＲＮＡ混合物に加えた。ＲＮＡ精製の前に、細胞を、２４時間インキュベートした。１０ｎＭ及び０．１ｎＭの最終二本鎖濃度で単回投与実験を行った。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｐａｒｔ ＃：６１０−１２）を用いた総ＲＮＡ単離
細胞を採取し、１５０μｌの溶解／結合緩衝液中に溶解させた後、プラットフォームシェーカーを用いて８５０ｒｐｍで５分間混合した（混合速度は、プロセス全体を通して同一であった）。１０マイクロリットルの磁気ビーズ及び８０μｌの溶解／結合緩衝液混合物を丸底プレートに加え、１分間混合した。磁気スタンドを用いて磁気ビーズを捕捉し、ビーズを乱すことなく上清を除去した。上清を除去した後、溶解した細胞を残りのビーズに加え、５分間混合した。上清を除去した後、磁気ビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回洗浄し、１分間混合した。ビーズを再度捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ｂで洗浄し、捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。ビーズを２分間乾燥させた。乾燥後、５０μｌの溶出緩衝液を加え、７５℃で５分間混合した。ビーズを磁石上で５分間捕捉し、精製されたＲＮＡを含有する５０μｌの上清を除去し、新たな９６ウェルプレートに加えた。
リアルタイムＰＣＲ
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ ＃ ０４８８７３０１００１）中で、ウェル当たり、０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ ＃４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌのヒトＴＭＰＲＳＳ６ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ ＃ Ｈｓ００５４２１８４＿ｍ１）及び５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ ＃０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに加えた。ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを用いて、Ｒｏｃｈｅ ＬＣ４８０ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）中で、リアルタイムＰＣＲを行った。特に断りのない限り、各二本鎖を２つの独立したトランスフェクションにおいて試験し、各トランスフェクションを２回アッセイした。
相対的な倍加変化を計算するために、ΔΔＣｔ方法を用いて、リアルタイムデータを分析し、１０ｎＭのＡＤ−１９５５でトランスフェクトした細胞、又は疑似トランスフェクト細胞を用いて行ったアッセイに対して正規化した。
ＡＤ−１９５５のセンス配列及びアンチセンス配列は、センス：５’−ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ−３’（配列番号１５）；及びアンチセンス：５’−ＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ−３’（配列番号１６）である。
Figure 2016520593
Figure 2016520593
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実施例１．オリゴヌクレオチドの設計、特異性及び有効性の予測
転写物
ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／）において注釈付けされたヒト、アカゲザル（アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ））、マウス、及びラットＴＭＰＲＳＳ６転写物を標的とするｓｉＲＮＡを特定するために、ｓｉＲＮＡ設計を行った。設計には、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからの以下の転写物を使用した：ヒト−ＮＭ＿１５３６０９．２；アカゲザル−ＸＭ＿００１０８５２０３．２及びＸＭ＿００１０８５３１９．１；マウス−ＮＭ＿０２７９０２．２；ラット−ＮＭ＿００１１３０５５６．１。高い霊長類／げっ歯類配列分散のため、限定はされないが、ヒト及びアカゲザル転写物のみ；ヒト、アカゲザル、及びマウス転写物のみ；ヒト、アカゲザル、マウス、及びラット転写物のみ；及びマウス及びラット転写物のみと一致する二本鎖を含むバッチを含むいくつかの別個のバッチで、ＳｉＲＮＡ二本鎖を設計した。各設計バッチ（上記）において考慮される、列挙されるヒト転写物及び他の種の転写物と１００％の同一性を共有する全てのｓｉＲＮＡ二本鎖を設計した。
全ての可能な１９量体（１９ｍｅｒ）の特異性を、各配列から予測した。次に、７ヌクレオチドより長い反復がない候補１９量体を選択した。これらの１２５９の候補ヒト／アカゲザル、９１のヒト／アカゲザル／マウス、３７のヒト／アカゲザル／マウス／ラット、及び８１０のマウス／ラットｓｉＲＮＡを、パイソンスクリプト（ｐｙｔｈｏｎ ｓｃｒｉｐｔ）「ＢｒｕｔｅＦｏｒｃｅ．ｐｙ」で実施される包括的な「力まかせ（ｂｒｕｔｅ−ｆｏｒｃｅ）」アルゴリズムを用いて、適切なトランスクリプトーム（ヒト、アカゲザル、マウス、又はラットＮＣＢＩ Ｒｅｆｓｅｑセット内のＮＭ＿及びＸＭ＿レコードのセットとして定義される）に対する包括的検索に使用した。次に、スクリプトが、転写物−オリゴのアライメントを解析して、ｓｉＲＮＡと、あらゆる可能性のある「オフターゲット」転写物とのミスマッチの位置及び数に基づいてスコアを生成した。オフターゲットスコアを重み付けして、分子の５’末端から２〜９位にある、ｓｉＲＮＡの「シード」領域の差異を強調する。力まかせ探索（ｂｒｕｔｅ−ｆｏｒｃｅ ｓｅａｒｃｈ）による各オリゴ−転写物対に、個々のミスマッチスコアを合計することによってミスマッチスコアを与え；２〜９位にあるミスマッチを、２．８とみなし、切断部位１０〜１１位にあるミスマッチを、１．２とみなし、領域１２〜１９のミスマッチを、１．０とみなした。更なるオフターゲット予測を、各オリゴの３つの異なる、シード指向性の６量体から誘導される７量体及び８量体の頻度を比較することによって行った。５’開始点に対して２〜７位からの６量体を用いて、２つの７量体及び１つの８量体を生成した。３’Ａを６量体に加えることによって７量体１を生成し；５’Ａを６量体に加えることによって７量体２を生成し；Ａを６量体の５’及び３’末端の両方に加えることによって、８量体を生成した。ヒト、アカゲザル、マウス、又はラット３’ＵＴＲｏｍｅ（コード領域「ＣＤＳ」の末端が明確に定義されたＮＣＢＩのＲｅｆｓｅｑデータベースからのトランスクリプトームの部分列として定義される）における８量体及び７量体の頻度を予め計算した。８量体の頻度の範囲からの中央値を用いて、８量体の頻度を７量体の頻度に対して標準化した。次に、「ｍｉｒＳｅｅｄＳｃｏｒｅ」を、（（３×標準化された８量体の数値）＋（２×７量体２の数値）＋（１×７量体１の数値））の和を計算することによって計算した。
両方のｓｉＲＮＡ鎖を、計算されたスコアにしたがって、特異性のカテゴリーに割り当てた：３を超えるスコアは、高度の特異性があり、３に等しいスコアは、特異性があり、２．２〜２．８のスコアは中程度の特異性があるとみなした。ｓｉＲＮＡを、アンチセンス鎖の特異性によって並べ替えた。次に、アンチセンスオリゴが、１番目の位置でＧＣを欠き、１３及び１４番目の位置の両方でＧを欠き、シード領域における３以上のＵｓ又はＡｓを有する（高い予測される有効性を有する二本鎖の特性）、ヒト／アカゲザル及びマウス／ラットセットからの二本鎖を選択した。同様に、シード領域における３以上のＵｓ又はＡｓを有していたヒト／アカゲザル／マウス及びヒト／アカゲザル／マウス／ラットセットからの二本鎖を選択した。
センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれにおいて２１及び２３ヌクレオチド長の候補ＧａｌＮＡｃコンジュゲート二本鎖を、（標的転写物との完全な相補性を保ちながら）アンチセンス１９量体の４つの更なるヌクレオチドを３’方向に伸長することによって設計した。センス鎖を、アンチセンス２３量体（２３ｍｅｒ）の最初の２１ヌクレオチドの逆補体として特定した。全ての２３ヌクレオチドにわたって全ての選択される種の転写物との完全な一致を維持する二本鎖を選択した。
ｓｉＲＮＡ配列の選択
合計で３９のセンス及び３９のアンチセンスに由来するヒト／アカゲザル、６のセンス及び６のアンチセンスに由来するヒト／アカゲザル／マウス、３のセンス及び３のアンチセンスに由来するヒト／アカゲザル／マウス／ラット、及び１６のセンス及び１６のアンチセンスに由来するマウス／ラットｓｉＲＮＡ ２１／２３量体オリゴを合成し、ＧａｌＮＡｃコンジュゲート二本鎖に形成した。
修飾二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列が、表１に示され、非修飾二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列が、表２に示される。
Figure 2016520593
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実施例２．インビトロでの単回用量スクリーン
修飾され、コンジュゲートされたＴＭＰＲＳＳ６ ｓｉＲＮＡ二本鎖も、ヒト細胞株Ｈｅｐ３Ｂ内でのトランスフェクションアッセイによって有効性について評価した。ＴＭＰＲＳＳ６ ｓｉＲＮＡを、２つの用量、１０ｎＭ及び０．１ｎＭでトランスフェクトした。これらのアッセイの結果が、表３に示され、データが、陰性対照ｓｉＲＮＡ、ＡＤ−１９５５でトランスフェクトした細胞に対して、ＴＭＰＲＳＳ６を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞中に残るメッセージの割合±標準偏差（ＳＤ）として表される。
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実施例３．ＡＤ−５９７４３を用いたインビボでの単回用量スクリーン
ＡＤ−５９７４３がＴＭＰＲＳＳ６タンパク質の発現を抑制する能力を、ＡＤ−５９７４３の投与後の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓中のＴＭＰＲＳＳ６及びヘプシジンｍＲＮＡのレベルを測定することによって評価した。１、３又は１０ｍｇ／ｋｇの単回用量のＡＤ−５９７４３を、皮下投与し、マウスを３日目又は７日目に殺処分した。肝臓中のＴＭＰＲＳＳ６及びヘプシジンｍＲＮＡのレベルを、上述される方法を用いて、ｑＰＣＲによって測定した。対照群にＰＢＳによる注射を与えた。
ＡＤ−５９７４３の投与後のＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡのレベルが、図１に示され、ＡＤ−５９７４３の投与後のヘプシジンｍＲＮＡのレベルが、図２に示される。結果は、７日目まで持続されるＴＭＰＲＳＳ６転写物のレベルの用量依存的な低下を示す。
実施例４．鉄キレート剤と組み合わされたＴＭＰＲＳＳ６ ｉＲＮＡ剤のインビボでの影響
この試験の目的は、鉄レベルに対する同時投与されるＴＭＰＲＳＳ６特異的ｓｉＲＮＡ及び鉄キレート剤の影響を試験することであった。この試験では、６週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６及びサラセミアＴｈ３／＋マウス（Ｄｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２０１１），１７８（２）：７７４−８３）に、３〜５ｐｐｍの鉄を含有する低鉄食を与えた。マウスに、デフェリプロンを含有する製剤ＡＦ−０１１−４６２７３、２５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量の鉄キレート剤及び以下の構造：オリゴＳｅｑ−センス−ｕＧＧｕＡｕｕｕｃｃｕＡＧＧＧｕＡｃＡｄＴｓｄＴ（配列番号２０９）；オリゴＳｅｑ−アンチセンス−ＵＧｕＡＣＣＣｕＡＧＧＡＡＡｕＡＣｃＡｄＴｓｄＴ（配列番号２１０）を有するｉＲＮＡ剤を静脈内投与した。製剤は、ＭＣ−３／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ ５０／１０／３８．５／１．５も含有していた。肝臓及び脾臓組織を採取し、組織の非ヘム鉄濃度を、既に記載されるように測定した（例えば、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｌｏｏｄ １２１（７）：１２００−８；Ｃｏｏｋ，ＪＤ，ｅｔ ａｌ．．Ｔｉｓｓｕｅ ｉｒｏｎ ｓｔｏｒｅｓ．Ｉｎ：Ｃｏｏｋ ＪＤ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ １．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｐｒｅｓｓ；１９８０．ｐ．１０４−１０９を参照）。
これらの実験の結果は、陰性対照と比べて低下した鉄レベルで、Ｔｈ３／＋マウス中のＡＤ−４６２７３及びデフェリプロンの相加効果を示す。
実施例５．オリゴヌクレオチドの設計、特異性及び有効性の予測
転写物
ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／）において注釈付けされたヒト、カニクイザル（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）；これ以降、「カニクイザル（ｃｙｎｏ）」）、マウス、及びラットＴＭＰＲＳＳ６転写物を標的とするｓｉＲＮＡを特定するために、ｓｉＲＮＡ設計を行った。設計には、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからの以下の転写物を使用した：ヒト−ＮＭ＿１５３６０９．２；マウス−ＮＭ＿０２７９０２．２；ラット−ＮＭ＿００１１３０５５６．１。カニクイザルの場合、転写物の配列は、カニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ゲノムプロジェクト及びＮＣＢＩヌクレオチドデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｍａｃａｑｕｅ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎ／ｐａｇｅ／ｓｐｅｃｉｅｓ／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ｊｓｐ及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／）からそれぞれ入手可能な２つの登録番号：“ＥＮＳＰ０００００３８４９６４［ｍＲＮＡ］遺伝子座＝ｃｈｒ１０：８２４４６４５０：８２４８５４０３：−“及びＦＲ８７４２５３．１から構築される配列の、ヒトＴＭＰＲＳＳ６とのアラインメントによって得られた。高い霊長類／げっ歯類配列分散のため、限定はされないが、ヒト及びカニクイザル転写物のみ；ヒト、カニクイザル、及びマウス転写物のみ；及びヒト、カニクイザル、マウス、及びラット転写物のみと一致する二本鎖を含むバッチを含むいくつかの別個のバッチで、ＳｉＲＮＡ二本鎖を設計した。規定の領域において、各設計バッチ（上記）において考慮される、列挙されるヒト転写物及び他の種の転写物と１００％の同一性を共有するほとんどのｓｉＲＮＡ二本鎖を設計した。場合によっては、アンチセンス鎖：標的ｍＲＮＡ相補的塩基対が、ＧＣ又はＣＧ対であった場合、二本鎖とｍＲＮＡ標的との間のミスマッチが、最初のアンチセンス（最後のセンス）位置において許容された。これらの場合、最初のアンチセンス：最後のセンス対においてＵＡ又はＡＵ対を有する二本鎖を設計した。したがって、二本鎖は、相補性を維持したが、標的に対して不一致であった（Ｕ：Ｃ、Ｕ：Ｇ、Ａ：Ｃ、又はＡ：Ｇ）。
全ての可能な１９量体の特異性を、各配列から予測した。次に、７ヌクレオチドより長い反復がない候補１９量体を選択した。これらの１１２８の候補ヒト／カニクイザル、６９のヒト／カニクイザル／マウス、及び２３のヒト／カニクイザル／マウス／ラットｓｉＲＮＡを、パイソンスクリプト「ＢｒｕｔｅＦｏｒｃｅ．ｐｙ」で実施される包括的な「力まかせ」アルゴリズムを用いて、適切なトランスクリプトーム（ヒト、マウス、又はラットＮＣＢＩ Ｒｅｆｓｅｑセット内のＮＭ＿及びＸＭ＿レコードのセット、及びＮＣＢＩヌクレオチド中のカニクイザルトランスクリプトームセットとして定義される）に対する包括的検索に使用した。次に、スクリプトが、転写物−オリゴのアライメントを解析して、ｓｉＲＮＡと、あらゆる可能性のある「オフターゲット」転写物とのミスマッチの位置及び数に基づいてスコアを生成した。オフターゲットスコアを重み付けして、分子の５’末端から２〜９位にある、ｓｉＲＮＡの「シード」領域の差異を強調する。力まかせ探索による各オリゴ−転写物対に、個々のミスマッチスコアを合計することによってミスマッチスコアを与え；２〜９位にあるミスマッチを、２．８とみなし、切断部位１０〜１１位にあるミスマッチを、１．２とみなし、領域１２〜１９のミスマッチを、１．０とみなした。更なるオフターゲット予測を、各オリゴの３つの異なる、シード指向性の６量体から誘導される７量体及び８量体の頻度を比較することによって行った。５’開始点に対して２〜７位からの６量体を用いて、２つの７量体及び１つの８量体を生成した。３’Ａを６量体に加えることによって７量体１を生成し；５’Ａを６量体に加えることによって７量体２を生成し；Ａを６量体の５’及び３’末端の両方に加えることによって、８量体を生成した。ヒト、カニクイザル、マウス、又はラット３’ＵＴＲｏｍｅ（コード領域「ＣＤＳ」の末端が明確に定義されたＮＣＢＩのＲｅｆｓｅｑデータベースからのトランスクリプトームの部分列として定義される）における８量体及び７量体の頻度を予め計算した。８量体の頻度の範囲からの中央値を用いて、８量体の頻度を７量体の頻度に対して標準化した。次に、「ｍｉｒＳｅｅｄＳｃｏｒｅ」を、（（３×標準化された８量体の数値）＋（２×７量体２の数値）＋（１×７量体１の数値））の和を計算することによって計算した。
両方のｓｉＲＮＡ鎖を、計算されたスコアにしたがって、特異性のカテゴリーに割り当てた：３を超えるスコアは、高度の特異性があり、３に等しいスコアは、特異性があり、２〜２．８のスコアは中程度の特異性があるとみなす。アンチセンス鎖の特異性によって並べ替えた。次に、アンチセンスオリゴが、シード領域における最大ＵＡ含量及び低い全ＧＣ含量を含む、高い予測される有効性を有する二本鎖の特性を有する中程度に（又は高度に）特異的な二本鎖を選択した。
ＧａｌＮａＣコンジュゲート二本鎖について、アンチセンス１９量体（上記）を、標的と相補的な配列（ｔａｒｇｅｔ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の２３ヌクレオチドへと伸長することによって、センス２１量体（２１ｍｅｒ）及びアンチセンス２３量体オリゴを設計した。設計バッチに含まれる全ての種の転写物の相補性を調べた。各二本鎖について、センス２１量体を、アンチセンス鎖の最初の２１ヌクレオチドの逆補体として特定した。
ｓｉＲＮＡ配列の選択
合計で５のセンス及び５のアンチセンスヒト、３２のセンス及び３２のアンチセンスに由来するヒト／カニクイザル、４のセンス及び４のアンチセンスに由来するヒト／カニクイザル／マウス、８のセンス及び８のアンチセンスに由来するヒト／カニクイザル／マウス／ラット、１９のセンス及び１９のアンチセンスに由来するヒト／カニクイザル／ラット、２のセンス及び２のアンチセンスに由来するヒト／マウス、及び１のセンス及び１のアンチセンスに由来するヒト／マウス／ラットｓｉＲＮＡ ２１／２３量体オリゴを合成し、ＧａｌＮＡｃコンジュゲート二本鎖に形成した。
非修飾二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列が、表４に示され、修飾二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列が、表５に示される。
Figure 2016520593
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実施例６．インビトロでの単回用量スクリーン
単回用量及び用量応答試験のための細胞培養及びトランスフェクション
Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％のＦＢＳ、ストレプトマイシン、及びグルタミン（ＡＴＣＣ）を補充したＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ）中で、５％のＣＯ２の雰囲気中で、３７℃でほぼコンフルエンスまで増殖させた後、トリプシン処理によりプレートから解放した。ウェル当たり１４．８μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ及び０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ ＃ １３７７８−１５０）を、９６ウェルプレート内のウェルごとに５μｌのｓｉＲＮＡ二本鎖に加えることによりトランスフェクションを行い、室温で１５分間インキュベートした。次に、約２×１０４個のＨｅｐ３Ｂ細胞を含む、抗生物質を有さない８０μｌの完全増殖培地を、ｓｉＲＮＡ混合物に加えた。ＲＮＡ精製の前に、細胞を、２４時間インキュベートした。１０ｎＭ及び０．１ｎＭの最終二本鎖濃度で実験を行った。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｐａｒｔ ＃：６１０−１２）を用いた総ＲＮＡ単離
細胞を採取し、１５０μｌの溶解／結合緩衝液中に溶解させた後、エッペンドルフサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）を用いて、８５０ｒｐｍで５分間混合した（混合速度は、プロセス全体を通して同一であった）。１０マイクロリットルの磁気ビーズ及び８０μｌの溶解／結合緩衝液混合物を丸底プレートに加え、１分間混合した。磁気スタンドを用いて磁気ビーズを捕捉し、ビーズを乱すことなく上清を除去した。上清を除去した後、溶解した細胞を残りのビーズに加え、５分間混合した。上清を除去した後、磁気ビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回洗浄し、１分間混合した。ビーズを再度捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ｂで洗浄し、捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。ビーズを２分間乾燥させた。乾燥後、５０μｌの溶出緩衝液を加え、７０℃で５分間混合した。ビーズを磁石上で５分間捕捉した。４０μｌの上清を除去し、別の９６ウェルプレートに加えた。
ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｃａｔ ＃４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成
反応当たり、２μｌの１０倍緩衝液、０．８μｌの２５倍ｄＮＴＰ、２μｌのランダムプライマー、１μｌの逆転写酵素、１μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び３．２μｌのＨ２Ｏのマスターミックスを、１０μｌの総ＲＮＡに加えた。以下の工程を介して、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃ−１０００又はＳ−１０００サーモサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、ｃＤＮＡを生成した：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５秒間、４℃で保持。
リアルタイムＰＣＲ
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェル５０プレート（Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ ＃ ０４８８７３０１００１）中で、ウェル当たり、０．５μｌのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ ＃４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌのＴＭＰＲＳＳ６ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ ＃ Ｈｓ００５４２１８４＿ｍ１）及び５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ ＃０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに加えた。ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを用いて、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）中でリアルタイムＰＣＲを行った。要約した表中に特に断りのない限り、各二本鎖を２つの独立したトランスフェクションにおいて試験し、各トランスフェクションを２回アッセイした。
相対的な倍加変化を計算するために、ΔΔＣｔ方法を用いて、リアルタイムデータを分析し、１０ｎＭのＡＤ−１９５５でトランスフェクトした細胞、又は疑似トランスフェクト細胞を用いて行ったアッセイに対して正規化した。
データは、非処理の細胞に対して、ＴＭＰＲＳＳ６を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞中に残るＴＭＰＲＳＳ６メッセージの割合として表される。全てのｓｉＲＮＡを、少なくとも２回トランスフェクトし、ｑＰＣＲ反応を２回行った。データが、表６に示される。
Figure 2016520593
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実施例７．ＴＭＰＲＳＳ６ ｉＲＮＡ剤の単回用量投与のインビボでの影響
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ又は３．０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−６０９４０、又は対照としてＰＢＳのみを単回皮下注射で投与した。３匹のマウスを、様々な時点で、肝臓ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ、肝臓ヘプシジンｍＲＮＡ、血清ヘプシジン、総血清鉄、及びトランスフェリン飽和度パーセントについて、用量ごとに評価した。１．０ｍｇ／ｋｇ又は３．０ｍｇ／ｋｇのＡＤ−６０９４０又はＰＢＳを与えられたマウスを、０日目（処置前）並びに処置の７、１１、１４及び２１日後に評価した。０．３ｍｇ／ｋｇのＡＤ−６０９４０を与えられたマウスを、０日目（処置前）並びに処置の７及び１１日後に評価した。肝臓ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ及び肝臓ヘプシジンｍＲＮＡレベルを、ｑＰＣＲによって測定し、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、ＰＢＳのみを投与されたマウスにおけるｍＲＮＡレベルに対して表した。血清ヘプシジンを、ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって測定した。総血清鉄及びトランスフェリン飽和度パーセント（％ ＴｆＳａｔ）を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ Ｓｅｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定した。各データ点が、３匹のマウスの平均値を表す。平均の標準偏差が、エラーバーによって表される。
ＡＤ−６０９４０の単回用量投与により、対照と比べて肝臓ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡの堅固でかつ持続的な抑制が得られた。ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ濃度が、３．０ｍｇ／ｋｇの用量の投与後、最大で３週間にわたって９０％超だけ抑制された（図３Ａ）。肝臓ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ濃度の抑制の結果として、ヘプシジンｍＲＮＡレベルが、対照と比べて２倍増加し（図３Ｂ）、血清ヘプシジン濃度が、対照と比べて２倍超増加した（図３Ｃ）。更に、総血清鉄（図３Ｄ）が低下し、トランスフェリン飽和度パーセントが、対照と比べて５０％超だけ低下した（図３Ｅ）。総血清鉄及びトランスフェリン飽和度パーセントの低下は、ＡＤ−６０９４０の投与後、最大で３週間にわたって持続した。図３Ｆは、投与の１１日後におけるＡＤ−６０９４０の用量に応じた相対的な肝臓ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ濃度を示す。各データ点が、各用量レベルで観察されるＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ濃度の最大の抑制を表す。データを、ヒルの式に当てはめた。
ＡＤ−６０９４０がヘプシジン及び血清鉄動員を調節する程度は、以前のＨｂｂｔｈ３／＋マウス試験において観察されたものとほぼ同一であり（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１３），１２１（７），１２００−１２０８）、ＡＤ−６０９４０が、β−サラセミアにおいて疾患修飾効果をもたらすための強力なＲＮＡｉ治療剤であることを示す。
実施例８．ＴＭＰＲＳＳ６ ｉＲＮＡ剤の複数回用量投与のインビボでの影響
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−６０９４０、又はＰＢＳのみ（対照として）を、３週間にわたって週に１回、皮下注射で投与し、次に、最後の投与の７日後に殺処分した（図４Ａ）。用量ごとに３匹のマウスを、肝臓ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ、肝臓ヘプシジンｍＲＮＡ、及びトランスフェリン飽和度パーセントについて評価した。肝臓ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ及び肝臓ヘプシジンｍＲＮＡレベルを、ｑＰＣＲによって測定し、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、ＰＢＳのみを投与されたマウスにおけるｍＲＮＡレベルに対して表した。トランスフェリン飽和度パーセント（％ ＴｆＳａｔ）を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ Ｓｅｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定した。各データ点が、３匹のマウスの平均値を表す。平均の標準偏差が、エラーバーによって表される。
１．０ｍｇ／ｋｇのＡＤ−６０９４０の複数回用量投与により、ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ濃度の９０％超の抑制が得られた（図４Ｂ）。対照と比べて、ヘプシジンｍＲＮＡ濃度が、２倍増加し、トランスフェリン飽和度パーセントが、５０％超だけ低下した（図４Ｂ）。図４Ｃは、ＡＤ−６０９４０の用量に応じた相対的な肝臓ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ濃度を示す。データを、ヒルの式に当てはめた。これらのデータは、複数回用量のＥＤ８０が、１．０ｍｇ／ｋｇ未満であることを示す。
この試験は、ＡＤ−６０９４０が、ＴＭＰＲＳＳ６の堅固でかつ持続的な抑制を示し、ヘプシジン誘導及び全身的な鉄制限をもたらすことを実証し、ＡＤ−６０９４０が、β−サラセミアにおいて疾患修飾効果をもたらすための強力なＲＮＡｉ治療剤であることを示す。
実施例９．肝臓ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡレベル及び血清ヘプシジン濃度及びトランスフェリン飽和度パーセントの間の関係
ＡＤ−５９７４３、ＡＤ−６１００２、ＡＤ−６０９４０、及び他のＴＭＰＲＳＳ６ ｉＲＮＡ剤を用いて生成されたデータを、肝臓ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡレベル及び血清ヘプシジンレベル及びトランスフェリン飽和度パーセントの間の関係を評価するために更に分析した。血清ヘプシジン濃度は、ヒルの式を用いて、ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡレベルに対する非線形関係を示した（図５Ａ）。トランスフェリン飽和度パーセントは、線形単回帰式に当てはめたとき、ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡレベルに対する線形関係を示した（図５Ｂ）。ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡレベル及びトランスフェリン飽和度パーセントの間の線形関係は、鉄制限が、ＡＤ−６０９４０によって正確にかつ予想どおりに調節され得ることを示す。血清ヘプシジン濃度及び相対的なヘプシジンｍＲＮＡレベルも、線形単回帰式に当てはめたとき、線形関係を示した（図５Ｃ）。対照的に、トランスフェリン飽和度パーセント及び血清ヘプシジン濃度の間の関係は、非線形であり、ヒルの式に当てはめた（図５Ｄ）。
実施例１０．インビボでの単回用量スクリーン
図６に示されるＴＭＰＲＳＳ６ ｓｉＲＮＡ二本鎖を、ｓｉＲＮＡ二本鎖の投与後に、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓中のＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡのレベルを抑制する能力によって、有効性について評価した。３ｍｇ／ｋｇのＴＭＰＲＳＳ６ ｓｉＲＮＡ二本鎖を単回の皮下投与で投与し、マウスを７日後に殺処分した。肝臓中のＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡのレベルを、上述される方法を用いてｑＰＣＲによって測定した。対照群のマウスには、ＰＢＳの注射を与えた。
ＴＭＰＲＳＳ６ ｓｉＲＮＡ二本鎖の投与後のＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡのレベルが、図６に示される。結果は、ＡＤ−６０９４０、ＡＤ−５９７４３及びＡＤ−６１００２の投与により、最大のサイレンシングをもたらすＡＤ６０９４０による肝臓ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡのかなりの抑制が得られたことを示す。具体的には、ＴＭＰＲＳＳ６ ｓｉＲＮＡ二本鎖ＡＤ−６０９４０は、対照と比べて８０％超だけＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡを減少させた。データは、ＡＤ−５９７４３、ＡＤ−６０９４０、ＡＤ−６１００２、ＡＤ−６０９９４、ＡＤ−６０９９８及びＡＤ−６１００１による処置が、７日目まで維持されるＴＭＰＲＳＳ６転写物のレベルの低下をもたらすことも示す。
実施例１１．インビボでの複数回用量スクリーン
図７に示されるＴＭＰＲＳＳ６ ｓｉＲＮＡ二本鎖を、ｓｉＲＮＡ二本鎖の投与後に、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓中のＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡのレベルを抑制する能力によって、有効性について評価した。０．３ｍｇ／ｋｇ又は１．０ｍｇ／ｋｇのいずれかのＴＭＰＲＳＳ６ ｓｉＲＮＡ二本鎖の皮下投与を、３週間にわたって週に１回投与した。マウスを、最後の投与の７日後に殺処分した。肝臓中のＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡのレベルを、上述される方法を用いて、ｑＰＣＲによって測定した。対照群のマウスに、ＰＢＳの注射を与えた。
ＴＭＰＲＳＳ６ ｓｉＲＮＡ二本鎖の投与後のＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡのレベルが、図７に示される。結果は、ＴＭＰＲＳＳ６ ｓｉＲＮＡ二本鎖ＡＤ−６０９４０の１．０ｍｇ／ｋｇの投与計画により、対照と比べて８０％超だけＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡが減少されることを示す。
実施例１２．ＡＤ−６０９４０の最適化
ＡＤ−６０９４０の投与が、対照と比べて８０％超だけＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡを持続的に減少させたという観察に基づいて、様々な化学的修飾を有するＡＤ−６０９４０の親配列に基づいた更なるｓｉＲＮＡを、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるトランスフェクションによって、１０ｎＭ及び０．１ｎＭでの単回用量スクリーンにおいて有効性について評価した。これらの剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列が、表８に示され、このスクリーンの結果が、表９に示される。表９中のデータは、対照に対して残るメッセージの平均割合として表される。
更に、上記の表４及び５に記載されるｓｉＲＮＡの一部を、センス鎖の５’末端に２’ＯＭｅ修飾を有する２’Ｆを置換し、アンチセンス鎖に５’−リン酸を加えるように修飾した。これらのｓｉＲＮＡ剤も、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるトランスフェクションによって、１０ｎＭ及び０．１ｎＭでの単回用量スクリーンにおいてインビトロ有効性について評価した。これらの剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列が、表１０に示され、このスクリーンの結果が、表１１に示される。表１１中のデータは、対照に対して残るメッセージの平均割合として表される。
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実施例１３．ＡＤ−６０９４０の最適化
ＴＭＰＲＳＳ６を標的とする更なる二本鎖を産生し、以下の材料及び方法を用いて有効性についてインビトロでスクリーニングした。
更なるｓｉＲＮＡの設計、合成、及びインビトロスクリーニング
ｓｉＲＮＡ設計
センス鎖及びアンチセンス鎖の両方について、１９ヌクレオチド長のＴＭＰＲＳＳ６二本鎖を、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿１５３６０９．３に記載されるヒトＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡ配列を用いて設計した。実質的に３２０９ヌクレオチド転写物全体にわたる、７ヌクレオチドより長い反復を含まない３１８０の二本鎖を最初に同定した。次に、全ての３１８０の二本鎖を、各二本鎖位置におけるヌクレオチド対、並びにスクリーニングに使用される用量及び細胞株を評価する線形モデルにしたがって、予測される有効性について採点した。また、二本鎖を、特注の力まかせアルゴリズムを用いて、ヒトＲｅｆＳｅｑ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにおける全ての転写物に対してマッチングさせ、ＴＭＰＲＳＳ６以外の転写物に対する（鎖当たりの）ミスマッチの最低数を採点した。次に、合成され、スクリーニングされる二本鎖を、以下のスキームにしたがって、３１８０から選択した：転写物の５’末端から開始して、最も高い予測される有効性を有し、ＴＭＰＲＳＳ６以外の全ての転写物に対する両方の鎖における少なくとも１つのミスマッチを有し、他の二本鎖組の一部として既に合成及びスクリーニングされていない全ての１０±２ヌクレオチドの「ウインドウ」内で二本鎖を選択した。全ての基準を満たす二本鎖が、所与のウインドウ内で同定されない場合、そのウインドウを飛ばした。３０３の二本鎖を、上記の基準にしたがって選択した。更なる３１の二本鎖も選択した。
３３４ ＴＭＰＲＳＳ６センス鎖及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストが、表１２に示される。
細胞培養及びトランスフェクション
Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７細胞を、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．，ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＢ−８０６４）から入手し、加湿器の付いた培養器（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）（Ｈｅｒａｅｕｓ ＨＥＲＡｃｅｌｌ，Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において、５％のＣＯ２の雰囲気下、３７℃で、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ０１１５）及びペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ２２１３）を含有するように補充されたＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ ＃３０−２００３）中で培養した。
ｄｓＲＮＡのトランスフェクションを、９６ウェルプレート上にウェル当たり１５，０００個の細胞を播種した直後に行い、製造業者によって説明されるように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．Ｎｏ．１１６６８−０１９）を用いて行った。トランスフェクションを４回行い、ｄｓＲＮＡを、１０ｎＭの濃度でトランスフェクトした。
分岐ＤＮＡアッセイ−ＱｕｎａｔｉＧｅｎｅ ２．０（Ｐａｎｏｍｉｃｓ ｃａｔ ＃：ＱＳ００１１）
ＴＭＰＲＳＳ６ ｍＲＮＡの測定のために、ＴＭＰＲＳＳ６についてはＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ ＩＩ Ｋｉｔ及びｂＤＮＡについてはＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ Ｉ Ｅｘｐｌｏｒｅ Ｋｉｔ（それぞれ、Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ，ｃａｔ．Ｎｏ．１５７３５又はＱＧ０００４）の製造業者によって推奨される手順にしたがって、細胞を、トランスフェクションの２４時間後に採取し、５３℃で溶解させた。その後、５０μｌの溶解物を、ヒトＴＭＰＲＳＳ６に特異的なプローブセットを用いてインキュベートし、１０μｌの溶解物を、ヒトＧＡＰＤＨに特異的なプローブセットを用いてインキュベートし、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅのための製造業者のプロトコルにしたがって処理した。化学発光を、ＲＬＵ（相対発光量）としてＶｉｃｔｏｒ２−Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において測定し、ヒトＴＭＰＲＳＳ６プローブセットを用いて得られた値を、各ウェルについてそれぞれのヒトＧＡＰＤＨ値に対して正規化し、次に、３つの関連のない対照ｄｓＲＮＡの平均に関連付けた。
本化合物のインビトロでの有効性が、表１３に示される。
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Claims (101)

  1. 細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号６、配列番号７、又は配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
    前記センス鎖の前記ヌクレオチドの実質的に全て及び前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの実質的に全てが、修飾ヌクレオチドであり、
    前記センス鎖が、３’末端において結合されたリガンドにコンジュゲートされる二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  2. 前記センス鎖の前記ヌクレオチドの全て及び前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの全てが、修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  3. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、表１、２、４、５、８、１０、及び１２のいずれか１つに列挙される前記アンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  4. 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、３’末端デオキシ−チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’リン酸又は５’リン酸模倣体を含むヌクレオチド、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  5. 少なくとも１つの鎖が、少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、いずれかの請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  6. 少なくとも１つの鎖が、少なくとも２つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  7. 細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ−２）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＴＭＰＲＳＳ６をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
    （式中：
    ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
    ｐ、ｐ’、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
    各Ｎａ及びＮａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
    各Ｎｂ及びＮｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、及びｎｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し；
    Ｎｂ上の修飾が、Ｙ上の前記修飾と異なり、Ｎｂ’上の修飾が、Ｙ’上の前記修飾と異なり；
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされている）
    によって表される二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  8. ｉが０であり；ｊが０であり；ｉが１であり；ｊが１であり；ｉ及びｊの両方が０であり；又はｉ及びｊの両方が１である、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  9. ｋが０であり；ｌが０であり；ｋが１であり；ｌが１であり；ｋ及びｌの両方が０であり；又はｋ及びｌの両方が１である、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  10. ＸＸＸが、Ｘ’Ｘ’Ｘ’に相補的であり、ＹＹＹが、Ｙ’Ｙ’Ｙ’に相補的であり、ＺＺＺが、Ｚ’Ｚ’Ｚ’に相補的である、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  11. 前記ＹＹＹモチーフが、前記センス鎖の切断部位又はその近傍に存在する、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  12. 前記Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフが、前記５’末端の前記アンチセンス鎖の１１位、１２位及び１３位に存在する、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  13. 前記Ｙ’が、２’−Ｏ−メチルである、請求項１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  14. 式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩａ）：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩａ）
    によって表される、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  15. 式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｂ）：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩｂ）
    （式中、各Ｎｂ及びＮｂ’が、独立して、１〜５つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
    によって表される、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  16. 式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｃ）：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩｃ）
    （式中、各Ｎｂ及びＮｂ’が、独立して、１〜５つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
    によって表される、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  17. 式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｄ）：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩｄ）
    （式中、各Ｎｂ及びＮｂ’が、独立して、１〜５つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各Ｎａ及びＮａ’が、独立して、２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
    によって表される、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  18. 前記二本鎖領域が、１５〜３０ヌクレオチド対長である、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  19. 前記二本鎖領域が、１７〜２３ヌクレオチド対長である、請求項１８に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  20. 前記二本鎖領域が、１７〜２５ヌクレオチド対長である、請求項１８に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  21. 前記二本鎖領域が、２３〜２７ヌクレオチド対長である、請求項１８に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  22. 前記二本鎖領域が、１９〜２１ヌクレオチド対長である、請求項１８に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  23. 前記二本鎖領域が、２１〜２３ヌクレオチド対長である、請求項１８に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  24. 各鎖が、１５〜３０のヌクレオチドを有する、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  25. 各鎖が、１９〜３０のヌクレオチドを有する、請求項１又は７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  26. 前記ヌクレオチド上の修飾が、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−デオキシ、２’−ヒドロキシル、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  27. 前記ヌクレオチド上の修飾が、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾である、請求項２６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  28. 前記リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項１または７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  29. 前記リガンドが、
    Figure 2016520593
     である、請求項１または７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  30. 前記リガンドが、前記センス鎖の３’末端に結合される、請求項１または７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  31. 以下の概略図
    Figure 2016520593
     （式中、Ｘが、Ｏ又はＳである）に示される前記リガンドにコンジュゲートされている、請求項３０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  32. 少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含む、請求項１または７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  33. 前記ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、１つの鎖の３’末端にある、請求項３２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  34. 前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項３３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  35. 前記鎖が、前記センス鎖である、請求項３３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  36. 前記ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、１つの鎖の５’末端にある、請求項３２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  37. 前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項３６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  38. 前記鎖が、前記センス鎖である、請求項３６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  39. 前記ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、１つの鎖の５’末端及び３’末端の両方にある、請求項３２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  40. 前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項３９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  41. 前記ＲＮＡｉ剤が、６〜８つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項３２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  42. 前記アンチセンス鎖が、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び３’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、前記センス鎖が、５’末端又は３’末端のいずれかにおける少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項４１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ。
  43. 前記二本鎖の前記アンチセンス鎖の５’末端の１位における塩基対が、ＡＵ塩基対である、請求項１または７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  44. 前記Ｙヌクレオチドが、２’−フルオロ修飾を含む、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  45. 前記Ｙ’ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾を含む、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  46. ｐ’＞０である、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  47. ｐ’＝２である、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  48. ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０、及びｐ’オーバーハングヌクレオチドが、前記標的ｍＲＮＡに相補的である、請求項４７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  49. ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０、及びｐ’オーバーハングヌクレオチドが、前記標的ｍＲＮＡに非相補的である、請求項４７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  50. 前記センス鎖が、合計で２１のヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が、合計で２３のヌクレオチドを有する、請求項４１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  51. 少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  52. 全てのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される、請求項５１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  53. 前記ＲＮＡｉ剤が、表１、２、４、５、８、１０、及び１２のいずれか１つに列挙されるＲＮＡｉ剤の群から選択される、請求項１又は７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  54. 前記ＲＮＡｉ剤が、ＡＤ−５９７４３、ＡＤ−６０９４０、及びＡＤ−６１００２からなる群から選択される、請求項１又は７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  55. 前記ＲＮＡｉ剤が、ＡＤ−６０９４０である、請求項１又は７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  56. 細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、
    前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号６、配列番号７、又は配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
    前記センス鎖の前記ヌクレオチドの実質的に全てが、２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、
    前記センス鎖が、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、
    前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの実質的に全てが、２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、
    前記アンチセンス鎖が、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び３’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、
    前記センス鎖が、３’末端において分枝鎖状の二価又は三価リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  57. 前記センス鎖の前記ヌクレオチドの全て及び前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの全てが、修飾を含む、請求項５６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  58. 細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ−２）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＴＭＰＲＳＳ６をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
    （式中：
    ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
    ｐ、ｐ’、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
    各Ｎａ及びＮａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
    各Ｎｂ及びＮｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、及びｎｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、前記修飾が、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり；
    Ｎｂ上の修飾が、Ｙ上の前記修飾と異なり、Ｎｂ’上の修飾が、Ｙ’上の前記修飾と異なり；
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされている）
    によって表される二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  59. 細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ−２）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＴＭＰＲＳＳ６をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
    （式中：
    ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
    それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎｐ、ｎｑ、及びｎｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
    ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
    各Ｎａ及びＮａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
    各Ｎｂ及びＮｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上に３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、前記修飾が、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり；
    Ｎｂ上の修飾が、Ｙ上の前記修飾と異なり、Ｎｂ’上の修飾が、Ｙ’上の前記修飾と異なり；
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされている）
    によって表される二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  60. 細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ−２）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＴＭＰＲＳＳ６をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
    （式中：
    ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
    それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎｐ、ｎｑ、及びｎｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
    ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
    各Ｎａ及びＮａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
    各Ｎｂ及びＮｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上に３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、前記修飾が、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり；
    Ｎｂ上の修飾が、Ｙ上の前記修飾と異なり、Ｎｂ’上の修飾が、Ｙ’上の前記修飾と異なり；
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、前記リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である）
    によって表される二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  61. 細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ−２）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＴＭＰＲＳＳ６をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
    （式中：
    ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
    それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎｐ、ｎｑ、及びｎｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
    ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
    各Ｎａ及びＮａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
    各Ｎｂ及びＮｂ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜１０のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上に３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、前記修飾が、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり；
    Ｎｂ上の修飾が、Ｙ上の前記修飾と異なり、Ｎｂ’上の修飾が、Ｙ’上の前記修飾と異なり；
    前記センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、前記リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である）
    によって表される二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  62. 細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６（マトリプターゼ−２）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＴＭＰＲＳＳ６をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩａ）
    （式中：
    それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎｐ、ｎｑ、及びｎｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
    ｐ、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され；
    各Ｎａ及びＮａ’が、独立して、修飾又は非修飾のいずれかの０〜２５のヌクレオチド又はそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
    ＹＹＹ及びＹ’Ｙ’Ｙ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、前記修飾が、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり；
    前記センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、前記リガンドが、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である）
    によって表される二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  63. 表１、２、４、５、８、１０、及び１２のいずれか１つに列挙されるＲＮＡｉ剤の群から選択されるＲＮＡｉ剤。
  64. 前記ＲＮＡｉ剤が、ＡＤ−５９７４３、ＡＤ−６０９４０、及びＡＤ−６１００２からなる群から選択される、請求項５２に記載のＲＮＡｉ剤。
  65. 細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６の発現を阻害することが可能な修飾されたアンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物であって、前記剤が、表１、２、４、５、８、１０、及び１２のいずれか１つに列挙される配列の群から選択されるセンス配列に相補的な配列を含み、前記ポリヌクレオチドが、約１４〜約３０ヌクレオチド長である組成物。
  66. 請求項１、７、５６、及び５８〜６４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含有するベクター。
  67. 請求項１、７、５６、及び５８〜６４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含有する細胞。
  68. 請求項１、７、５６、及び５８〜６４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤、又は請求項６５に記載の修飾されたアンチセンスポリヌクレオチド剤、又は請求項６６に記載のベクターを含む医薬組成物。
  69. ＲＮＡｉ剤が、非緩衝液中で投与される、請求項６８に記載の医薬組成物。
  70. 前記非緩衝液が、生理食塩水又は水である、請求項６９に記載の医薬組成物。
  71. 前記ｓｉＲＮＡが、緩衝液とともに投与される、請求項６８に記載の医薬組成物。
  72. 前記緩衝液が、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、プロラミン緩衝液、炭酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝液又はそれらの任意の組合せを含む、請求項７１に記載の医薬組成物。
  73. 前記緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項７２に記載の医薬組成物。
  74. 細胞内でのＴＭＰＲＳＳ６発現の阻害方法であって、
    （ａ）前記細胞を、請求項１、７、５６、及び５８〜６４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤、又は請求項６５に記載の修飾されたアンチセンスポリヌクレオチド剤、又は請求項６６に記載のベクター、又は請求項６８〜７３のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させる工程と；
    （ｂ）工程（ａ）で産生される前記細胞を、ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の前記ｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それにより、前記細胞中の前記ＴＭＰＲＳＳ６遺伝子の発現を阻害する工程とを含む方法。
  75. 前記細胞が、対象中にある、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記対象がヒトである、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記ＴＭＰＲＳＳ６発現が、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％又は約１００％だけ阻害される、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. ヘプシジン遺伝子発現が、少なくとも約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍又は約５倍増加される、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の方法。
  79. 血清ヘプシジン濃度が、少なくとも約１０％、約２５％、約５０％、約１００％、約１５０％、約２００％、約２５０％、又は約３００％だけ増加される、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の方法。
  80. 血清鉄濃度が、少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％又は約１００％だけ低下される、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の方法。
  81. トランスフェリン飽和度パーセントが、少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％又は約１００％だけ減少される、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の方法。
  82. ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患に罹患している対象の処置方法であって、治療有効量の請求項１、７、５６、及び５８〜６４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤、又は請求項６５に記載の修飾されたアンチセンスポリヌクレオチド剤、又は請求項６６に記載のベクター、又は請求項６８〜７３のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それにより、前記対象を処置する工程を含む方法。
  83. ＴＭＰＲＳＳ６に関連する疾患に罹患している対象の処置方法であって、治療有効量の二本鎖ＲＮＡｉ剤を前記対象に皮下投与し、それにより、前記対象を処置する工程を含み、
    前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３、配列番号４、又は配列番号５のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号６、配列番号７、又は配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
    前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの実質的に全てが、２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、
    前記アンチセンス鎖が、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び３’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、
    前記センス鎖の前記ヌクレオチドの実質的に全てが、２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、
    前記センス鎖が、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、
    前記センス鎖が、３’末端において分枝鎖状の二価又は三価リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる方法。
  84. 前記センス鎖の前記ヌクレオチドの全て及び前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの全てが、修飾を含む、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記対象がヒトである、請求項８２又は８３に記載の方法。
  86. 前記ヒトが、遺伝性ヘモクロマトーシス、β−サラセミア、又は赤芽球性ポルフィリン症に罹患している、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記ヒトが、β−サラセミアに罹患している、請求項８５に記載の方法。
  88. 前記β−サラセミアが、重症型サラセミアである、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記β−サラセミアが、中間型サラセミアである、請求項８７に記載の方法。
  90. 前記ヒトが、鉄過剰に関連する疾患に罹患している、請求項８５に記載の方法。
  91. 鉄過剰に関連する前記疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病又はフリードライヒ運動失調症である、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ又は約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項８２又は８３に記載の方法。
  93. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、又は約３．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項９２に記載の方法。
  95. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、皮下投与される、請求項９２に記載の方法。
  96. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、静脈内投与される、請求項９２に記載の方法。
  97. 前記ＲＮＡｉ剤が、２つ以上の用量で投与される、請求項９２に記載の方法。
  98. 前記ＲＮＡｉ剤が、約１２時間に１回、約２４時間に１回、約４８時間に１回、約７２時間に１回、及び約９６時間に１回からなる群から選択される間隔で投与される、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記ＲＮＡｉ剤が、２週間以下、３週間以下、４週間以下、５週間以下、又はそれ以上にわたって週に１回投与される、請求項９７に記載の方法。
  100. 鉄キレート剤を前記対象に投与する工程を更に含む、請求項８２又は８３に記載の方法。
  101. 前記鉄キレート剤が、デフェリプロン、デフェロキサミン、及びデフェラシロクスからなる群から選択される、請求項１００に記載の方法。
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