ES2891738T3 - Incorporación de nucleósidos trifosfato no naturales o modificados a células a través de transportadores de ácido nucleico trifosfato - Google Patents

Incorporación de nucleósidos trifosfato no naturales o modificados a células a través de transportadores de ácido nucleico trifosfato Download PDF

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Abstract

Un microorganismo procariota genomanipulado que comprende al menos un ácido nucleico no natural, que comprende al menos un par de bases no naturales (UBP) y un ácido nucleico heterólogo que codifica un transportador de nucleósido trifosfato (NTT), en donde: (a) el microorganismo procariota genomanipulado es Escherichia coli; (b) el al menos un UBP comprende un primer nucleótido no natural y un segundo nucleótido no natural que han sido incorporados al microorganismo genomanipulado por el NTT e incorporados en el al menos un ácido nucleico no natural dentro del microorganismo genomanipulado por una maquinaria celular; (c) el NTT comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica al SEQ ID NO:1; y (d) el primer nucleótido no natural es dTPT3 o d5SICS, y el segundo nucleótido no natural es dNaM.

Description

DESCRIPCIÓN
Incorporación de nucleósidos trifosfato no naturales o modificados a células a través de transportadores de ácido nucleico trifosfato
Referencia cruzada
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. N.° de serie 61/977.439, presentada el 9 de abril de 2014, y la solicitud provisional de EE.UU. N.° de serie 61/977.430, presentada el 9 de abril de 2014.
Declaración con respecto a la investigación con fondos federales
La presente invención se realizó con financiación del Gobierno concedida por los National Institutes of Health mediante la subvención GM060005. El gobierno posee ciertos derechos sobre la invención.
Referencia a un listado de secuencias
La presente solicitud contiene un Listado de secuencias que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII mediante EFS-Web. Dicha copia en ASCII, creada el 9 de abril de 2015, se denominad 46085_701_601_Seqlist_ST25.txt y tiene 96 KB de tamaño.
Antecedentes de la invención
Se registran grandes cantidades de información genética esencial para las actividades vitales de los organismos vivos como secuencias compuestas por nucleobases de ácidos nucleicos. A diferencia de las proteínas que están compuestas por 20 tipos de aminoácidos, la diversidad química y física de los ácidos nucleicos está limitada por solo 4 bases (2 pares de bases) en los ácidos nucleicos naturales. Dichos ácidos nucleicos permiten la autorreplicación usándose a sí mismos como molde y la transmisión de información genética de ADN a ADN, de ADN a ARN y/o de ARN a proteína. Los nucleótidos naturales se emparejan a través de dos o tres enlaces de hidrógeno (A:T/U, G: C) y este emparejamiento permite la replicación y transmisión de la información genética. In vitro, el alfabeto genético natural de dos letras se ha expandido con nucleótidos no naturales sintetizados químicamente que forman pares de bases no naturales (UBP, por sus siglas en inglés).
Para crear un organismo con un alfabeto genético expandido, los nucleósidos trifosfato no naturales primero deben estar disponibles dentro de la célula. Se ha sugerido que esto podría lograrse mediante la difusión pasiva de nucleósidos libres en el citoplasma seguida de su conversión en el trifosfato correspondiente a través de la ruta de rescate de nucleósidos. Algunos ácidos nucleicos no naturales se fosforilan por la nucleósido cinasa de D. melanogaster, y las monofosfato cinasas parecen ser más específicas. Sin embargo, la sobreexpresión de E. coli de nucleósido difosfato cinasa endógena da como resultado un crecimiento celular deficiente.
Benner et al. han diseñado pares de bases novedosos basados en diferentes combinaciones de enlaces de hidrógeno a partir de pares de bases naturales, por ejemplo, los pares de bases isoG:isoC y k:X (Piccirilli et al., 1990; Piccirilli et al., 1991; Switzer et al., 1993). Sin embargo, isoG forma un par de bases con T a través de la tautomería ceto-enol entre las posiciones 1 y 2; isoC y K no son sustratos de polimerasas debido a una sustitución del grupo amino en la posición 2; y los derivados nucleosídicos de isoC son químicamente inestables.
También se han desarrollado pares de bases que tienen patrones de enlaces de hidrógeno diferentes de los del emparejamiento de bases naturales y que son capaces de eliminar el emparejamiento de bases con bases naturales por impedimento estérico. Por ejemplo, Ohtsuki et al. (2001) e Hirao et al. (2002) diseñaron 2-amino-6-dimetilaminopurina (X), 2-amino-6-tienilpurina (S) y piridin-2-ona (Y). Sin embargo, la incorporación de Y frente a X mostró una baja selectividad.
Kool et al. sintetizaron derivados de A y T (4-metilbencimidazol (Z) y 9-metil-1-H-imidazo[(4,5)-b] piridina (Q), respectivamente) que carecen de enlaces de hidrógeno. Se encontró que estos pares de bases se incorporaron en el ADN de una manera complementaria por el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I derivada de E. coli. También se muestra que se incorporan otros pares de bases que incluyen A:F, Q:T y Z:T [Morales y Kool, 1999]. Otros ejemplos incluyen 7-(2-tienil)-imidazo[4,5-b]piridina (Ds) y pirrolo-2-carbaldehído (Pa).
En un esfuerzo por desarrollar un tercer par de bases ortogonal, se han diseñado más de 100 bases hidrófobas, sintetizadas como trifosfato y fosforamidita, y caracterizadas en el laboratorio de Floyd Romesberg. También se ha generado un gran número de pares de bases hidrófobas, incluyendo pirrolopiridina (PP) y C3-metilisocarboestirilo (MICS) (Wu et al., 2000). Sin embargo, estas bases se emparejaron entre sí independientemente del ajuste de forma, dando como resultado la incorporación de PP:PP y MICS:MICS en el ADN; y el alargamiento no procedió sustancialmente después de la incorporación de dichas combinaciones de bases formadas sin ningún ajuste de forma. No se encontró que se requirieran enlaces de H ni una gran superficie aromática para la estabilidad de los pares de bases en el ADN dúplex o la replicación mediada por polimerasa para algunos UBP, por ejemplo, un autopar de 3fluorobenceno (3FB).
El desarrollo de un tercer par de bases de ADN no naturales y un alfabeto genético expandido es un objetivo central de la biología sintética y química y aumentaría la diversidad funcional de los ácidos nucleicos, proporcionaría herramientas para su etiquetado específico de sitio, aumentaría el potencial de información del ADN y sentaría las bases de un organismo semisintético. En el presente documento se describe una clase recientemente desarrollada de UBP que se forma entre nucleótidos que llevan nucleobases hidrófobas (ilustrado por el par formado entre d5SICS y dNaM (d5SICS-dNaM)), que se amplifica mediante PCR y se transcribe de manera eficiente, y cuyo mecanismo único de replicación se ha caracterizado completamente a través de estudios cinéticos (Lavergne et al., Chem. Eur. J. (2012) 18:1231-1239; Seo et al., J. Am. Chem. Soc. (2009) 131:3246-3252) y estudios estructurales (Betz et al., J. Am. Chem. Soc. (2013) 135: 18637-18643; Malyshevet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2012) 109:12005-12010). Hasta ahora, no existía ningún organismo vivo capaz de incorporar y propagar información no natural.
La limitación de tener solo cuatro componentes de bases diferentes (nucleótidos) en ácidos nucleicos estándar restringe sus funciones y potencial, en comparación con los 20 aminoácidos diferentes en las proteínas naturales. Los UBP y las células que incorporan de manera estable los UBP descritos en el presente documento ofrecen numerosas ventajas y pueden aplicarse a una amplia gama de biotecnologías. Tener un tercer par de bases que se replica en los rangos de los naturales podría aumentar significativamente la densidad de información en la misma longitud de ADN y hacer del ADN una alternativa más atractiva para el almacenamiento de información. Más importante aún, un tercer UBP podría expandir la codificación del ADN para aminoácidos no naturales, proporcionando acceso a proteínas (incluyendo agentes terapéuticos de proteínas) con propiedades únicas que no están disponibles usando los 20 naturales.
Zhang et al. (Biochemistry. 31 de enero de 2006; 45(4):1087-98) informan sobre el desarrollo de un par de análogos de nucleósidos fluorescentes (FuPmR y dFuPmR) para el análisis en tiempo real del transporte de nucleósidos a las células vivas mediante microscopía confocal.
Fisher et al. (J Bacteriol. agosto de 2013;195(15):3381-6) informan sobre el transportador de nucleótidos Npt1 de Chlamydia trachomatis.
Sumario de la invención
La invención proporciona un microorganismo procariota genomanipulado que comprende al menos un ácido nucleico no natural que comprende al menos un par de bases no naturales (UBP) y un ácido nucleico heterólogo que codifica un transportador de nucleósido trifosfato (NTT), en el que:
(a) el microorganismo procariota genomanipulado es Escherichia coli;
(b) el al menos un UBP comprende un primer nucleótido no natural y un segundo nucleótido no natural derivados de un primer nucleósido trifosfato no natural y un segundo nucleósido trifosfato no natural que se han incorporado al microorganismo genomanipulado por el NTT e incorporado en el al menos un ácido nucleico no natural dentro del microorganismo genomanipulado por una maquinaria celular;
(c) el NTT comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 85 % idéntica al SEQ ID NO:1; y
(d) el primer nucleótido no natural es dTPT3 o d5SICS, y el segundo nucleótido no natural es dNaM, como se expone en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, la célula comprende un alfabeto genético expandido.
En algunas realizaciones, el alfabeto genético expandido comprende el UBP.
En algunas realizaciones, el UBP se incorpora de manera estable en un ácido nucleico de la célula.
En algunas realizaciones, el UBP no se reconoce eficazmente por una ruta de reparación del ADN de la célula.
En el presente documento también se desvela un ácido nucleico heterólogo que codifica un transportador de nucleótidos trifosfato (NTT), una polimerasa o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la célula comprende además al menos un UBP molde que comprende un primer ácido nucleico molde no natural.
En algunas realizaciones, el primer ácido nucleico molde no natural es capaz de emparejarse por bases con el primer ácido nucleico no natural.
En algunas realizaciones, el emparejamiento de bases comprende un emparejamiento de bases hidrófobas.
En algunas realizaciones, el emparejamiento de bases no comprende enlaces de hidrógeno.
En algunas realizaciones, la célula comprende una incorporación reforzada de un nucleótido no natural, una incorporación reforzada de un nucleótido no natural en un ácido nucleico de la célula o una menor degradación de un ácido nucleico no natural en comparación con una célula de tipo silvestre respectiva.
En algunas realizaciones, la célula comprende una incorporación reforzada del primer ácido nucleico no natural en comparación con una célula sin el NTT heterólogo.
En algunas realizaciones, el NTT heterólogo se une al primer ácido nucleico no natural
En algunas realizaciones, la célula comprende además un segundo ácido nucleico no natural.
En algunas realizaciones, la célula incorpora el segundo ácido nucleico no natural.
En algunas realizaciones, el NTT heterólogo transporta el segundo ácido nucleico no natural a la célula.
En algunas realizaciones, el al menos un UBP molde comprende además un segundo ácido nucleico molde no natural. En algunas realizaciones, el segundo ácido nucleico molde no natural es capaz de emparejarse por bases con el segundo ácido nucleico no natural.
En algunas realizaciones, el primer ácido nucleico molde no natural es capaz de emparejarse por bases con el segundo ácido nucleico molde no natural.
En algunas realizaciones, el primer ácido nucleico no natural es capaz de emparejarse por pares con el segundo ácido nucleico no natural.
En algunas realizaciones, el primer ácido nucleico no natural es diferente del segundo ácido nucleico no natural. En algunas realizaciones, el primer ácido nucleico no natural es el mismo que el segundo ácido nucleico no natural. En algunas realizaciones, el al menos un UBP molde comprende al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 UBP molde.
En algunas realizaciones, el al menos un UBP molde está presente en al menos un ácido nucleico heterólogo.
En algunas realizaciones, el al menos un ácido nucleico heterólogo comprende al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 ácidos nucleicos heterólogos.
En algunas realizaciones, el al menos un UBP molde se introduce en la célula por transfección, lipofección, inyección, vector viral o electroporación.
En algunas realizaciones, el UBP comprende el primer ácido nucleico molde no natural.
En algunas realizaciones, el UBP comprende el segundo ácido nucleico no natural.
En algunas realizaciones, el UBP que comprende el segundo ácido nucleico no natural comprende el segundo ácido nucleico molde no natural.
En algunas realizaciones, el UBP comprende al menos 2 UBP.
En algunas realizaciones, los al menos 2 UBP comprenden al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 UBP.
En algunas realizaciones, los al menos 2 UBP comprenden un primer UBP y un segundo UBP, en los que el primer UBP comprende: el primer ácido nucleico no natural y el primer ácido nucleico molde no natural o el primer ácido nucleico no natural y el segundo ácido nucleico molde no natural; y en los que el segundo UBP comprende: el segundo ácido nucleico no natural y el segundo ácido nucleico molde no natural, o el segundo ácido nucleico no natural y el primer ácido nucleico molde no natural; o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el al menos un UBP molde está formado fuera de la célula.
En algunas realizaciones, el primer o segundo ácido nucleico no natural es desoxirribonucleósido.
En algunas realizaciones, el primer o segundo ácido nucleico no natural es un ribonucleósido.
En algunas realizaciones, el primer o segundo ácido nucleico no natural es nucleósido trifosfato.
En algunas realizaciones, el primer o segundo ácido nucleico no natural comprende un grupo de azúcar modificado
En algunas realizaciones, el primer o segundo ácido nucleico no natural se selecciona del grupo que consiste en uno cualquiera de los enumerados en el Anexo A, y cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la célula comprende al menos una modificación genética.
En algunas realizaciones, la al menos una modificación genética comprende una polimerasa heteróloga, una polimerasa mutante, una alteración de una nucleotidasa de la célula, una alteración de una fosfatasa de la célula o una combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, la célula está en contacto con un inhibidor de fosfatasa o un inhibidor de nucleotidasa.
En algunas realizaciones, el NTT heterólogo es de NTT2 de Phaeodactylum tricornutum (Pt).
En algunas realizaciones, el UBP no se elimina eficazmente por la célula.
En algunas realizaciones, la eliminación comprende actividad de nucleasa 3'-5'.
En algunas realizaciones, la eliminación comprende la escisión de nucleótidos por la célula.
En algunas realizaciones, el UBP no se elimina eficazmente de la célula después de un crecimiento durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 o 50 o más duplicaciones.
En algunas realizaciones, el UBP no se elimina eficazmente de la célula después de un crecimiento durante aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 o 24 horas; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 días; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses; o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 50 años de crecimiento.
En algunos casos desvelados en el presente documento, el primer o segundo ácido nucleico no natural comprende una base no natural.
En algunos casos, la base no natural se selecciona del grupo que consiste en 2-aminoadenin-9-ilo, 2-aminoadenina, 2-F-adenina, 2-tiouracilo, 2-tio-timina, 2-tiocitosina, 2-propilo y derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-aminoadenina, 2-amino-propil-adenina, 2-aminopiridina, 2-piridona, 2'-desoxiuridina, 2-amino-2'-desoxiadenosina 3-desazaguanina, 3-desazaadenina, 4-tio-uracilo, 4-tio-timina, uracil-5-ilo, hipoxantin-9-ilo (I), 5-metilcitosina, 5-hidroximetil-citosina, xantina, hipoxantina, 5-bromo y 5-trifluorometil uracilos y citosinas; 5-halouracilo, 5-halocitosina, 5-propinil-uracilo, 5-propinil citosina, 5-uracilo, 5-sustituido, 5-halo, pirimidinas 5-sustituidas, 5-hidroxicitosina, 5-bromocitosina, 5-bromouracilo, 5-clorocitosina, citosina clorada, ciclocitosina, arabinósido de citosina, 5-fluorocitosina, fluoropirimidina, fluorouracilo, 5,6-dihidrocitosina, 5-yodocitosina, hidroxiurea, yodouracilo, 5-nitrocitosina, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo y 5-yodouracilo, derivados de 6-alquilo de adenina y guanina, 6-azapirimidinas, 6-azo-uracilo, 6-azocitosina, azacitosina, 6-azo-timina, 6-tio-guanina, 7-metilguanina, 7-metiladenina, 7-desazaguanina, 7-desazaguanosina, 7-desaza-adenina, 7-desaza-8-azaguanina, 8-azaguanina, 8-azaadenina, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo y adeninas y guaninas sustituidas por 8-hidroxilo; N4-etilcitosina, purinas sustituidas por N-2, purinas sustituidas por N-6, purinas sustituidas por O-6, aquellas que aumentan la estabilidad de la formación de dúplex, ácidos nucleicos universales, ácidos nucleicos hidrófobos, ácidos nucleicos promiscuos, ácidos nucleicos de tamaño expandido, ácidos nucleicos fluorados, pirimidinas tricíclicas, fenoxazina citidina([5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), pinzas G, fenoxazina citidina (9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido [3',2':4,5]pirrolo [2,3-d]pirimidin-2-ona), 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metitio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxacético, ácido uracil-5-oxacético, 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w y 2,6-diaminopurina y aquellos en los que la base de purina o pirimidina se reemplaza por un heterociclo.
En algunos casos, la base no natural se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000006_0001
en los que R es un grupo funcional
En algunos casos, el grupo funcional se selecciona del grupo que consiste en una etiqueta de afinidad tal como biotina, fluoróforo, alquilo, alquenilo, alquinilo, fenilo, benilo, halo, hidroxilo, carbonilo, aldehído, haloformilo, éster de carbonato, carboxilato, carboxilo, éster, metoxi, hidroperoxi, peroxi, éter, hemiacetal, hemicetal, acetal, cetal, ortoéster, metilendioxi, éster de ortocarbonato, carboxamida, amina primaria, amina secundaria, amina terciaria, ketamina primaria, ketamina secundaria, aldimina primaria, aldimina secundaria, imida, azida, azo, cianato, isocianato, nitrato, nitrilo, isonitrilo, nitrosooxi, nitro, nitroso, piridilo, sulfhidrilo, sulfuro, disulfuro, sulfinilo, sulfino, sulfo, tiocianato, isotiocianato, carbonotioílo, fosfino, fosfono, fosfato, borono, boronato, borino, borinato y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el primer o segundo ácido nucleico no natural comprende un resto de azúcar no natural.
En algunas realizaciones, el resto de azúcar no natural se selecciona del grupo que consiste en una modificación en la posición 2': OH; alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3 , OCF3 , SOCH3, SO2CH3, ONO2 , NO2, N3 , NH2F; O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo; O-alquenilo, S-alquenilo, N-alquenilo; O-alquinilo, S-alquinilo, N-alquinilo; O-alquil-O-alquilo, 2'-F, 2 -OCH3, 2'-O(CH 2 ) 2 OCH 3 , en los que el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1-C10, alquenilo C2-C10, alquinilo C2-C10 sustituidos o sin sustituir, -O[(CH2)n O]mCH 3 , -O(CH 2 )nOCH 3 , -O(CH2)n NH2, -O(CH2)n CH3, -O(CH2) n -ONH2 y -O(CH2) n ON[(CH2) n CH 3 )] 2 , en los que n y m son de 1 a aproximadamente 10; y/o una modificación en la posición 5': 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), una modificación en la posición 4', 4'-S, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalante, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico no natural comprende una cadena principal no natural.
En algunas realizaciones, la cadena principal no natural se selecciona del grupo que consiste en fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosfotriéster, aminoalquilfosfotriéster, fosfonatos C1-C10, fosfonato de 3'-alquileno, fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforoamidatos, fosforamidato de 3'-amino, aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos.
En algunas realizaciones, la célula está en contacto con un ácido nucleico natural.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico natural se selecciona del grupo que consiste en ATP, UTP, CTP, GTP, ADP, UDP, CDP, GDP, AMP, UMP, CMP, GMP, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dADP, dTDP, dCDP, dGDP, dAMP, dTMP, dCMP, dGMP, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dADP, dTDP, dCDP, dGDP, dAMP, dTMP, dCMP, dGMP y cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico natural se selecciona del grupo que consiste en ATP, UTP, CTP, GTP y cualquier combinación de los mismos.
En algunos casos desvelados en el presente documento, el NTT es de una bacteria.
En algunos casos, la bacteria es Phaeodactylum tricornutum, Thalassiosira pseudonana o Protochlamydia amoebophila.
En algunos casos desvelados en el presente documento, el NTT comprende una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente un 60 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 22 o 24.
En algunos casos desvelados en el presente documento, el NTT se codifica por un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente un 60 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 22 o 24.
En algunos casos, el NTT se codifica por una secuencia de ácido nucleico con al menos aproximadamente un 60 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21,23, 25 o 28.
En algunas realizaciones, la célula comprende un vector que comprende el ácido nucleico heterólogo.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo se incorpora al genoma de la célula.
En el presente documento también se desvela un ácido nucleico heterólogo que codifica una polimerasa.
En algunos casos, la polimerasa es una polimerasa mesófila o una polimerasa termófila.
En algunos casos, se altera la polimerasa.
En algunos casos, la polimerasa es deficiente en exonucleasa 3'-5'.
En algunos casos, la polimerasa se selecciona del grupo que consiste en ADN polimerasa, ARN polimerasa y transcriptasa inversa.
En algunos casos, la polimerasa se selecciona del grupo que consiste en 029, B103, GA-1, PZA, 015, BS32, M2Y, Nf, G1, Cp-1, PRD1, PZE, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17, ThermoSequenase®, 9°Nm™, Therminator™, Tne, Tma, Tfl, Tth, Tli, fragmento Stoffel, ADN polimerasa Vent™ y Deep Vent™, ADN polimerasa KOD, Tgo, JDF-3, Pfu, Taq, ADN polimerasa T7, PGB-D, ADN polimerasa UlTma, ADN polimerasa I de E. coli, ADN polimerasa II DP1I/DP2 de arqueas, ADN polimerasa 9°N, a Dn polimerasa Taq, ADN polimerasa Phusion®, ADN polimerasa Pfu y ADN polimerasa RB69.
En algunos casos, la polimerasa es una transcriptasa inversa de un retrovirus.
En algunos casos, el retrovirus es de VIH, HTLV-I, HTLV-II, FeLV, FIV, SIV, AMV, MMTV o MoMuLV.
En algunos casos, la alteración comprende una alteración que surge de la evolución dirigida.
En algunas realizaciones, la célula comprende además una alteración en un ácido nucleico homólogo.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico homólogo codifica una nucleotidasa, una nucleótido fosfatasa o una combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico homólogo comprende un gen que codifica una nucleótido fosfatasa, y en el que la nucleótido fosfatasa se selecciona del grupo que consiste en: polinucleótido fosfatasa; actividad de nucleótido fosfatasa, que actúa sobre nucleótidos libres; apirasa de nucleótido trifosfatasa; ATP-difosfatasa; adenosina difosfatasa; ADPasa; ATP difosfohidrolasa nucleósido difosfato fosfatasa; nucleósido-difosfatasa; tiaminpirofosfatasa; UDPasa; inosina difosfatasa; adenosina difosfatasa; IDPasa; ADPasa; adenosinpirofosfatasa; guanosina difosfatasa; guanosina 5'-difosfatasa; inosina 5'-difosfatasa; uridina difosfatasa; uridina 5'-difosfatasa; nucleósido difosfatasa de tipo B; GDPasa; CDPasa; nucleósido 5'-difosfatasa; nucleósido difosfatasa de tipo L; NDPasa; nucleósido difosfato fosfohidrolasa; y cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico homólogo codifica una nucleótido fosfatasa, y en el que la nucleótido fosfatasa se selecciona del grupo que consiste en cualquiera de las enumeradas en la Tabla 4 o 5.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico homólogo codifica una nucleotidasa, y en el que la nucleotidasa se selecciona del grupo que consiste en una 5'-nucleotidasa, 3'-nucleotidasa o una combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico homólogo codifica una nucleotidasa, y en el que la nucleotidasa se selecciona del grupo que consiste en cualquiera de las enumeradas en la Tabla 2 o 3.
En algunas realizaciones, la alteración comprende una pérdida o disminución de la función de un gen codificado por el ácido nucleico homólogo.
En algunas realizaciones, la alteración comprende una alteración que surge de la evolución dirigida.
En algunas realizaciones, la célula está en contacto con una fosfatasa o un inhibidor de nucleotidasa.
En algunas realizaciones, el inhibidor de fosfatasa o nucleotidasa se selecciona del grupo que consiste en fluoruro de sodio, ortovanadato de sodio, beta-glicerofosfato, pirofosfato y sales de los mismos, fosfato de potasio (KPi), fosfato (Pi), oligomicina, aniones de pirofosfato (PPi), iones amonio hexafosfato de inositol y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el inhibidor de fosfatasa o nucleotidasa está presente en una concentración de 0,1 pM a 500 mM, 0,1 mM a 500 mM, 0,2 mM a 250 mM, 0,25 mM a 200 mM, 1,0 mM a 150 mM, 2,5 mM a 125 mM, 5 mM a 100 mM, 25 mM a 75 mM o de 40 mM a 60 mM.
En el presente documento también se desvela un método para producir una célula modificada genéticamente que comprende: proporcionar una célula que exhibe un nivel de incorporación de tipo silvestre de un primer nucleótido no natural; e introducir un NTT heterólogo en la célula, mejorando así el nivel de incorporación del primer nucleótido no natural en comparación con el nivel de incorporación del primer nucleótido no natural a la célula que exhibe un nivel de incorporación de tipo silvestre del primer nucleótido no natural.
En algunos casos, la célula que exhibe un nivel de incorporación de tipo silvestre del primer nucleótido no natural no comprende el NTT heterólogo.
En algunos casos, el método comprende además poner en contacto la célula que comprende un NTT heterólogo con el primer nucleótido no natural.
En el presente documento también se desvela un método que incorpora un ácido nucleico no natural en una célula, que comprende poner en contacto una célula que comprende un NTT heterólogo con un primer ácido nucleico no natural; y cultivar la célula durante un período de tiempo; en el que el NTT heterólogo transporta el primer ácido nucleico no natural a la célula
En el presente documento también se desvela un método para genomanipular una célula que comprende: poner en contacto una célula que comprende un NTT heterólogo con un líquido, comprendiendo el líquido una concentración de un ácido nucleico no natural y una concentración de un ácido nucleico natural; cultivar la célula durante un período de tiempo; aumentar la relación de la concentración del ácido nucleico no natural con respecto a la concentración del ácido nucleico natural; y repetir los puntos (b) y (c) una o más veces.
En algunos casos, después de una o más repeticiones de los puntos (b) y (c), la célula comprende una incorporación reforzada de un nucleótido no natural, una incorporación reforzada de un nucleótido no natural en un ácido nucleico de la célula o una menor degradación de un ácido nucleico no natural en comparación con la célula de tipo silvestre respectiva.
En algunos casos, la célula que comprende el NTT heterólogo comprende además al menos un UBP molde que comprende un primer ácido nucleico molde no natural.
En algunos casos, el primer ácido nucleico molde no natural es capaz de emparejarse por bases con el primer ácido nucleico no natural.
En el presente documento también se desvela un método para fabricar una célula con un alfabeto genético expandido, que comprende: poner en contacto un primer ácido nucleico no natural con una célula, comprendiendo la célula un NTT heterólogo, y al menos un UBP molde que comprende un ácido nucleico molde no natural; y cultivar la célula durante un período de tiempo, en el que la base de ácido nucleico molde no natural es capaz de emparejarse por bases con el primer ácido nucleico no natural.
En algunos casos, la célula que comprende el NTT heterólogo comprende una incorporación reforzada del primer ácido nucleico no natural en comparación con una célula sin el NTT heterólogo.
En algunos casos, se forma un UBP dentro de la célula que comprende el NTT heterólogo.
En algunos casos, el UBP formado dentro de la célula comprende el primer ácido nucleico no natural incorporado. En algunos casos, el método comprende además determinar la presencia del UBP que comprende el primer ácido nucleico no natural incorporado.
En algunos casos, el método comprende además aislar el UBP que comprende el primer ácido nucleico no natural de la célula.
En algunos casos, el método comprende además determinar la cantidad del primer ácido nucleico no natural presente dentro de la célula.
En algunos casos, el método comprende además comparar la cantidad del primer ácido nucleico no natural presente dentro de la célula con la cantidad del primer ácido nucleico no natural presente dentro de una célula de tipo silvestre correspondiente.
En algunos casos, el contacto comprende poner en contacto un líquido que contiene el primer ácido nucleico no natural con la célula y en el que el método comprende además determinar la cantidad del primer ácido nucleico no natural presente en el líquido después del período de tiempo en comparación con el tipo silvestre respectivo.
En algunos casos, el período de tiempo es de 1 hora o más.
En algunos casos, la célula comprende al menos una modificación genética.
En algunos casos, la al menos una modificación genética comprende una polimerasa heteróloga, una polimerasa mutante, una alteración de una nucleotidasa de la célula, una alteración de una fosfatasa de la célula o una combinación de las mismas.
En algunos casos, el método comprende además añadir un inhibidor de fosfatasa o un inhibidor de nucleotidasa.
En algunos casos, la célula es una célula procariota.
En algunos casos, la célula es de Phaeodactylum tricornutum, Thalassiosira pseudonana o Protochlamydia amoebophila.
En algunos casos, la célula es una célula eucariota.
En algunos casos, la célula es E. coli.
En algunos casos, el NTT heterólogo es de NTT2 de Phaeodactylum tricornutum (Pt), NTT2 de Thalassiosirapseudonana (Tp), NTT2 de Protochlamydia amoebophila (Pam), NTT5 de Protochlamydia amoebophila (Pam), o una combinación de los mismos.
En algunos casos, el NTT heterólogo es un transportador de nucleótidos 1 (NTT1), transportador de nucleótidos 2 (NTT2), transportador de nucleótidos 3 (NTT3), transportador de nucleótidos 4 (NTT4), transportador de nucleótidos 5 (NTT5), transportador de nucleótidos 6 (NTT6), transportador de nucleótidos 7 (NTT7), transportador de nucleótidos 8 (NTT8), o una combinación de los mismos.
En algunos casos, el método comprende además poner en contacto la célula con un segundo ácido nucleico no natural. En algunos casos, el NTT heterólogo transporta el segundo ácido nucleico no natural a la célula.
En algunos casos, el al menos un UBP molde comprende además un segundo ácido nucleico molde no natural.
En algunos casos, el primer ácido nucleico molde no natural es capaz de emparejarse por bases con el segundo ácido nucleico molde no natural.
En algunos casos, el segundo ácido nucleico molde no natural es capaz de emparejarse por bases con el segundo ácido nucleico no natural.
En algunos casos, el primer ácido nucleico no natural es capaz de emparejarse por pares con el segundo ácido nucleico no natural.
En algunos casos, el primer ácido nucleico no natural es diferente del segundo ácido nucleico no natural.
En algunos casos, el primer ácido nucleico no natural es el mismo que el segundo ácido nucleico no natural.
En algunos casos, el al menos un UBP molde comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 UBP molde.
En algunos casos, el al menos un UBP molde está presente en la célula antes del contacto con el primer o segundo ácido nucleico no natural.
En algunos casos, el al menos un UBP molde está presente en al menos un ácido nucleico heterólogo.
En algunos casos, el al menos un ácido nucleico heterólogo comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 ácidos nucleicos heterólogos.
En algunos casos, el al menos un UBP molde se introduce en la célula por transfección, lipofección, inyección, vector viral o electroporación.
En algunos casos, la célula forma un UBP que comprende el primer ácido nucleico no natural incorporado.
En algunos casos, el UBP que comprende el segundo ácido nucleico no natural incorporado comprende además el primer ácido nucleico molde no natural.
En algunos casos, la célula forma un UBP que comprende el segundo ácido nucleico no natural incorporado.
En algunos casos, el UBP que comprende el segundo ácido nucleico no natural incorporado comprende además el segundo ácido nucleico molde no natural.
En algunos casos, la célula forma un UBP que comprende el primer ácido nucleico no natural incorporado y el segundo ácido nucleico no natural incorporado.
En algunos casos, el UBP se forma dentro de la célula.
En algunos casos, el primer o segundo ácido nucleico no natural es desoxirribonucleósido.
En algunos casos, el primer o segundo ácido nucleico no natural es un ribonucleósido.
En algunos casos, el primer o segundo ácido nucleico no natural es nucleósido trifosfato.
En algunos casos, el primer o segundo ácido nucleico no natural comprende un grupo de azúcar modificado.
En algunos casos, el resto de azúcar no natural se selecciona del grupo que consiste en una modificación en la posición 2': OH; alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3 , OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2F; O-alquilo, S-alquilo, N-alquilo; O-alquenilo, S-alquenilo, N-alquenilo; O-alquinilo, S-alquinilo, N-alquinilo; O-alquil-O-alquilo, 2'-F, 2 -OCH3, 2'-O(CH 2 ) 2 OCH 3 , en los que el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1-C10, alquenilo C2-C10, alquinilo C2-C10 sustituidos o sin sustituir, -O[(CH2)n O]mCH3, -O(CH2)nOCH3, -O(CH2)n NH2 , -O(CH2)n CH3 , -O(CH2)n-ONH2 y -O(CH2)nON[(CH2)n CH3)]2 , en los que n y m son de 1 a aproximadamente 10; y/o una modificación en la posición 5': 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), una modificación en la posición 4', 4'-S, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalante, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y cualquier combinación de los mismos.
En algunos casos, el primer o segundo ácido nucleico no natural comprende un grupo de bases modificado.
En algunos casos, el grupo de bases modificado se selecciona del grupo que consiste en
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en los que R es un grupo funcional.
En algunos casos, el grupo funcional se selecciona del grupo que consiste en una etiqueta de afinidad tal como biotina, fluoróforo, alquilo, alquenilo, alquinilo, fenilo, benilo, halo, hidroxilo, carbonilo, aldehído, haloformilo, éster de carbonato, carboxilato, carboxilo, éster, metoxi, hidroperoxi, peroxi, éter, hemiacetal, hemicetal, acetal, cetal, ortoéster, metilendioxi, éster de ortocarbonato, carboxamida, amina primaria, amina secundaria, amina terciaria, ketamina primaria, ketamina secundaria, aldimina primaria, aldimina secundaria, imida, azida, azo, cianato, isocianato, nitrato, nitrilo, isonitrilo, nitrosooxi, nitro, nitroso, piridilo, sulfhidrilo, sulfuro, disulfuro, sulfinilo, sulfino, sulfo, tiocianato, isotiocianato, carbonotioílo, fosfino, fosfono, fosfato, borono, boronato, borino, borinato y combinaciones de los mismos.
En algunos casos, el primer o segundo ácido nucleico no natural comprende una cadena principal no natural.
En algunos casos, la cadena principal no natural se selecciona del grupo que consiste en fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosfotriéster, aminoalquilfosfotriéster, fosfonatos C1-C10, fosfonato de 3'-alquileno, fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforoamidatos, fosforamidato de 3-amino, aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos.
En algunos casos, el método comprende además poner en contacto la célula con uno o más nucleótidos trifosfato naturales.
En algunos casos, el uno o más nucleótidos trifosfato naturales comprenden dATP, dTTP, ATP, TTP, UTP o cualquier mezcla de los mismos.
En algunos casos, el primer o segundo ácido nucleico no natural se selecciona del grupo que consiste en uno cualquiera de los enumerados en el Anexo A, y cualquier combinación de los mismos.
En algunos aspectos, en el presente documento se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende un UBP, en el que el UBP se formó dentro de una célula.
En algunos casos, el UBP se selecciona del grupo que consiste en uno cualquiera de los enumerados en el Anexo A, y cualquier combinación de los mismos.
En el presente documento también se desvela una proteína NTT heteróloga aislada que comprende un ácido nucleico no natural unido a la misma.
En algunos casos, el ácido nucleico no natural unido al mismo se selecciona del grupo que consiste en uno cualquiera de los enumerados en el Anexo A.
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos, las reivindicaciones y en la descripción del presente documento. Otras características, objetos y ventajas de las realizaciones de la invención que se desvelan y se contemplan en el presente documento resultarán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra la estructura de d5SICS-dNaM con un par de bases natural (dC-dG) que se muestra con fines comparativos.
La figura 2 representa datos relacionados con la estabilidad e incorporación de nucleósidos trifosfato; y un análisis de composición de nucleótidos d5SICS y dNaM en los medios y fracciones citoplasmáticas de células que expresan PtNTT2. 3P, 2P, 1P y 0P corresponden a trifosfato, difosfato, monofosfato y nucleósido, respectivamente. [3P] = la concentración intracelular total de trifosfato.
La figura 3A representa una construcción de pINF de ejemplo y un esquema de un experimento de replicación in vivo. Las regiones de homología se representan mediante sombreado. (Y = 5SICS y X = NaM). B = biotina. La figura 3B representa una curva de crecimiento de células que albergan pINF a las que se han añadido d5SICSTP y dNaMTP. EP = electroporación.
La figura 3C representa un cromatograma de iones totales LC-MS/MS del contenido global de nucleósidos en pINF y pUC19 registrado en el modo monitorización dinámica de reacciones múltiples (DMRM, por sus siglas en inglés). Se propagaron pINF y pUC19 (control) en E. coli en presencia o ausencia de trifosfatos no naturales y con o sin inducción de Pín TT2. El recuadro muestra una expansión de 100 veces del eje de recuento de masa en la región d5SICS.
La figura 3D representa un análisis por desplazamiento en gel de fragmentos de PCR que demuestran la biotinilación en presencia del UBP, trifosfatos no naturales e inducción de transportador. B = biotina. SA = estreptavidina. A la izquierda se muestra una escalera de ADN de 50 pb.
La figura 3E representa un análisis de secuenciación de Sanger que demuestra la retención del UBP, como lo demuestra una terminación abrupta en la reacción de secuenciación en la posición de incorporación del UBP (indicada con una flecha).
La figura 4 representa datos relacionados con la estabilidad intracelular del UBP. Se transformó C41(DE3)-pACS de E. coli con pINF y se cultivó después de proporcionar una dosis única de d5SICSTP y dNaMTP en los medios. La retención de UBP (cuadrados), la DO600 (rombos) y la cantidad relativa de d5SICSTP y dNaMTP en los medios (círculos de color blanco y de color negro, respectivamente; 100 % = 0,25 mM), se determinaron en función del tiempo.
La figura 5 muestra que PtNTT2 es significativamente más activo en la captación de [a-32P]-dATP en comparación con otros transportadores de nucleótidos. Se muestran los datos sin procesar (izquierda) y procesados (derecha). La radiactividad relativa corresponde al número total de recuentos producidos por cada muestra.
La figura 6A representa el análisis por HPLC de trifosfatos no naturales (3P) de dNaM y d5SICS de un cultivo bacteriano en crecimiento en presencia o ausencia de fosfato de potasio (KPi).
La figura 6B representa perfiles de composición de trifosfatos no naturales de dNaM y d5SICS de un cultivo bacteriano en crecimiento en presencia o ausencia de KPi.
La figura 7A representa datos sin procesar (izquierda) y procesados (derecha) que inhiben la captación de [a-32P]-dATP en las células en presencia de las concentraciones de KPi indicadas. El NTT de Rickettsia prowazekii (RpNTT2) se usó como control negativo: su señal de fondo se restó de las de PtNTT2 (barras de color negro) y TpNTT2 (barras de color blanco). La radiactividad relativa corresponde al número total de recuentos producidos por cada muestra.
La figura 7B representa un gráfico que muestra el % de composición de [a-32P]-dATP en presencia o ausencia de KPi 50 mM en medios de células que expresan los NTT indicados.
La figura 8A representa un gráfico de la captación total de sustrato radiactivo (izquierda) y el contenido de trifosfato intracelular total (derecha) en los puntos temporales indicados en función de la concentración de IPTG. La radiactividad relativa corresponde al número total de recuentos producidos por cada muestra.
La figura 8B representa las curvas de crecimiento y la captación de [a-32P]-dATP por células bacterianas transformadas con el plásmido pCDF-1b-PtNTT2 (pACS) en función de la concentración de IPTG.
La figura 9A representa imágenes TLC (inferior) de [a-32P]-dATP en los medios en función del tiempo y sus cuantificaciones (superior). M se refiere a una mezcla de los tres compuestos [3P, 2P y 1P] que se usó como patrón de TLC. La posición etiquetada "Inicio" corresponde a la posición de la mancha de muestra en la placa de TLC. La figura 9B representa imágenes TLC (inferior) de [a-P]-dATP en lisados celulares en función del tiempo y sus cuantificaciones (superior). M se refiere a una mezcla de los tres compuestos [3P, 2P y 1P] que se usó como patrón de TLC. La posición etiquetada "Inicio" corresponde a la posición de la mancha de muestra en la placa de TLC. La figura 10 muestra representaciones esquemáticas del plásmido pINF, construido a partir de pUC19 reemplazando dT505 por dNaM, y del plásmido pCDF-1b que codifica PtNTT2 (pACS). dX y dY corresponden a dNaM y un análogo de d5SICS. cloDF = origen de replicación del plásmido pCDF-1b; Sm = gen de resistencia a la estreptomicina; AmpR = gen de resistencia a la ampicilina; ori = origen de replicación de ColEI; MCS = sitio de clonación múltiple; lacZa = gen del fragmento de p-galactosidasa.
La figura 11A ilustra un gráfico de calibración del desplazamiento de estreptavidina (SAS, por sus siglas en inglés) en función de la fracción del molde que contiene el UBP.
La figura 11B ilustra y datos sin procesar representativos de muestras de SAS analizadas por triplicado. SA = estreptavidina.
La figura 12A representa gráficos del % de los estados de fosforilación de 3P (color negro), 2P (color gris oscuro), 1P (color gris claro) y 0P (color blanco) de los nucleósidos trifosfato no naturales indicados en la composición. La composición al final de la recuperación de 1 h se muestra a la derecha de cada gráfico.
La figura 12B representa un análisis de restricción de plásmidos pINF y pACS purificados de E. coli, linealizados con la endonucleasa de restricción Ndel y separados en un gel de agarosa al 1 %. Para cada punto temporal, los datos por triplicado se muestran en tres carriles y el control sin transformar se muestra en el cuarto carril más a la derecha. Las relaciones molares de los plásmidos pINF/pACS se muestran en la parte superior de cada carril. La figura 12C representa un gráfico que muestra el número de duplicaciones de pINF en función del tiempo. La disminución a partir de ~50 h se debe a la pérdida del plásmido pINF que también da como resultado un aumento del error.
Las figuras 13 A-H representan trazas de secuenciación en bruto para fragmentos de PCR generados a partir del plásmido pINF propagado en E. coli en diferentes puntos temporales. Se muestran datos por triplicado. La posición del nucleótido no natural se indica con una flecha.
Descripción detallada
Como se ilustra en el presente documento, d5SICSTP y dNaMTP pueden incorporarse eficazmente a E. coli por el transportador 2 de Phaeodactylum tricornutum (PtNTT2), y la maquinaria de replicación de E. coli puede incorporar eficazmente estos trifosfatos no naturales en el ADN dentro del entorno celular para formar pares de bases de ADN no naturales.
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que se pueden amplificar pares de bases no naturales (UBP) particulares que incluyen, pero sin limitación, (d)5SICS-(d)NaM y (d)TPT3-(d)NaM con la eficiencia y fidelidad similares a las de los pares de bases naturales (Malyshev etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2012) 109:12005-12010; Li et al., J. Am. Chem. Soc. (2014) 136:826-829). Por lo tanto, en el presente documento se desvelan métodos, composiciones y kits, para aumentar el alfabeto genético de una célula o de un organismo. Además, en el presente documento se desvelan composiciones, por ejemplo, células, que comprenden un alfabeto genético expandido, por ejemplo, células que propagan de manera estable un alfabeto genético expandido. Además, en el presente documento se desvelan composiciones, por ejemplo, células, que comprenden un alfabeto genético expandido, en las que ni la presencia de trifosfatos no naturales ni la replicación del UBP representan una carga de crecimiento significativa en las células.
Además, la presente divulgación se refiere a construcciones genéticas, células modificadas y métodos para incorporar e incorporar nucleótidos naturales y no naturales en ácidos nucleicos de una célula viva. Los aspectos de la invención facilitan el etiquetado y la modificación de células vivas. Los nucleótidos no naturales incorporados a las células por las células modificadas y los métodos descritos en el presente documento pueden formar UBP in vivo y estos UBP pueden replicarse a través de uno o más ciclos de replicación de la célula. Por primera vez, se describe una célula que incorpora de manera estable dentro de sus ácidos nucleicos celulares, nucleótidos distintos de A, G, T y C, por ejemplo, (d)5SICS y (d)NaM. En el presente documento también se desvelan métodos para incorporar un nucleótido no natural en un ácido nucleico usando, como molde, un ácido nucleico que contiene un primer nucleótido no natural de modo que un segundo ácido nucleico no natural se incorpore en un sitio complementario al primer nucleótido no natural. Por ejemplo, dichos métodos para incorporar un nucleótido no natural en un ácido nucleico pueden comprender efectuar la transcripción, la replicación, la transcripción inversa o la traducción de nucleótidos no naturales en aminoácidos no naturales.
Además, en el presente documento se desvelan composiciones, por ejemplo, células, que conservan un UBP, por ejemplo, cuando se encuentran disponibles trifosfatos no naturales en un medio de crecimiento de las células. Los métodos, composiciones y kits, pueden utilizar una captación celular mejorada de ácidos nucleicos, por ejemplo, a través de una incorporación celular mejorada de ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos que experimentan una captación celular mejorada pueden ser uno o más nucleótidos no naturales. En algunos casos, los ácidos nucleicos que experimentan una captación celular mejorada pueden ser uno o más nucleótidos no naturales y no un ácido nucleico natural. En algunos casos, los ácidos nucleicos que experimentan una captación celular mejorada pueden ser uno o más nucleótidos no naturales y uno o más nucleótidos naturales. En algunos casos, los ácidos nucleicos que experimentan una captación celular mejorada pueden ser uno o más nucleótidos no naturales y uno o más primeros nucleótidos naturales, pero no uno o más segundos nucleótidos naturales. En algunos casos, los ácidos nucleicos que experimentan una captación celular mejorada pueden ser uno o más primeros nucleótidos no naturales y uno o más nucleótidos naturales, pero no uno o más segundos nucleótidos no naturales.
Los métodos, composiciones y kits, pueden utilizar una o más enzimas endógenas o exógenas para integrar de manera estable ácidos nucleicos no naturales, por ejemplo, nucleósidos trifosfato no naturales. Los métodos, composiciones y kits, pueden utilizar una o más enzimas endógenas o exógenas para copiar un ácido nucleico homólogo para formar un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico no natural. Por ejemplo, se pueden utilizar enzimas endógenas o exógenas, por ejemplo, polimerasas endógenas o exógenas, para replicar el ADN genómico para formar un UBP dentro de una célula. Los métodos, composiciones y kits, pueden utilizar una o más enzimas endógenas o exógenas para copiar un ácido nucleico celular que comprende un u Bp para formar una copia de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico no natural. Por ejemplo, se pueden utilizar polimerasas endógenas o exógenas para replicar el ADN genómico que contiene un UBP dentro de una célula. Los métodos, composiciones y kits, también pueden utilizar un UBP que no se escinde de manera eficaz por las rutas de reparación del ADN.
Ácidos nucleicos
Un ácido nucleico (por ejemplo, también denominado en el presente documento como ácido nucleico diana, secuencia de nucleótidos diana, secuencia de ácido nucleico de interés o región de ácido nucleico de interés) puede ser de cualquier fuente o composición, tal como ADN, ADNc, ADNg (ADN genómico), ARN, ARNic (ARN inhibidor corto), ARNi, ARNt o ARNm, por ejemplo, y puede estar en cualquier forma (por ejemplo, lineal, circular, superenrollado, monocatenario, bicatenario y similares). Los ácidos nucleicos pueden comprender nucleótidos, nucleósidos o polinucleótidos. Los ácidos nucleicos pueden comprender ácidos nucleicos naturales y no naturales. Un ácido nucleico también puede comprender ácidos nucleicos no naturales, tales como análogos de ADN o ARN (por ejemplo, que contienen análogos de bases, análogos de azúcar y/o una cadena principal no nativa y similares). Se entiende que la expresión "ácido nucleico" no se refiere ni infiere una longitud específica de la cadena polinucleotídica, por lo que los polinucleótidos y oligonucleótidos también se incluyen en la definición. Los nucleótidos naturales de ejemplo incluyen, sin limitación, ATP, UTP, CTP, GTP, ADP, UDP, CDP, GDP, AMP, UMP, CMP, GMP, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dADP, dTDP, dCDP, dGDP, dAMP, dTMP, dCMP y dGMP. Los desoxirribonucleótidos naturales de ejemplo incluyen dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dADP, dTDP, dCDP, dGDP, dAMP, dTMP, dCMP y dGMP. Los ribonucleótidos naturales de ejemplo incluyen ATP, UTP, CTP, GTP, ADP, UDP, CDP, GDP, AMP, UMP, CMP y GMP. Para el RNA, la base de uracilo es uridina. Un ácido nucleico a veces es un vector, plásmido, fago, secuencia de replicación autónoma (ARS, por sus siglas en inglés), centrómero, cromosoma artificial, cromosoma artificial de levadura (por ejemplo, YAC) u otro ácido nucleico capaz de replicarse o replicarse en una célula huésped. Un ácido nucleico no natural puede ser un análogo de ácido nucleico. Un ácido nucleico no natural puede proceder de una fuente extracelular. Un ácido nucleico no natural puede estar disponible para el espacio intracelular de un organismo proporcionado en el presente documento, por ejemplo, un organismo modificado genéticamente.
Ácidos nucleicos no naturales
Un análogo de nucleótido, o nucleótido no natural, comprende un nucleótido que contiene algún tipo de modificación de los restos de base, azúcar o fosfato. Una modificación puede comprender una modificación química. Las modificaciones pueden ser, por ejemplo, del grupo 3'OH o 5'OH, de la cadena principal, del componente de azúcar o de la base de nucleótidos. Las modificaciones pueden incluir la adición de moléculas enlazadoras de origen no natural y/o de enlaces cruzados intercatenarios o intracatenarios. En un aspecto, el ácido nucleico modificado comprende la modificación de uno o más del grupo 3'OH o 5'OH, la cadena principal, el componente de azúcar o la base de nucleótidos y/o la adición de moléculas enlazadoras de origen no natural. En un aspecto, una cadena principal modificada comprende una cadena principal a la cadena principal de fosfodiéster. En un aspecto, un azúcar modificado comprende un azúcar distinto de la desoxirribosa (en el ADN modificado) o distinto de la ribosa (ARN modificado). En un aspecto, una base modificada comprende una base distinta de adenina, guanina, citosina o timina (en el ADN modificado) o una base distinta de adenina, guanina, citosina o uracilo (en el ARN modificado).
El ácido nucleico puede comprender al menos una base modificada. Las modificaciones en el resto de la base incluirían modificaciones naturales y sintéticas de A, C, G y T/U, así como diferentes bases de purina o pirimidina. En algunas realizaciones, una modificación es una forma modificada de adenina, guanina citosina o timina (en el ADN modificado) o una forma modificada de adenina, guanina citosina o uracilo (ARN modificado).
Una base modificada de un ácido nucleico no natural incluye, pero sin limitación, uracil-5-ilo, hipoxantin-9-ilo (I), 2-aminoadenin-9-ilo, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil-citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente, 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Determinados ácidos nucleicos no naturales, tales como pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas por N-2, purinas sustituidas por N-6, purinas sustituidas por O-6, 2-aminopropiladenina, 5-propiluracilo, 5-propinilcitosina, 5-metilcitosina, aquellas que aumentan la estabilidad de la formación de dúplex, ácidos nucleicos universales, ácidos nucleicos hidrófobos, ácidos nucleicos promiscuos, ácidos nucleicos de tamaño expandido, ácidos nucleicos fluorados, pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas por N-2, N-6 y 0-6, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo, otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo, 5-halocitosina, 5-propinilo (-CeC-CI1/4) uracilo, 5-propinil citosina, otros derivados de alquinilo de ácidos nucleico de pirimidina, 6-azo uracilo, 6-azocitosina, 6-azotimina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo, otros uracilos y citosinas 5-sustituidas, 7-metilguanina, 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina, 8-azaadenina, 7-desazaguanina, 7-desazaadenina, 3-desazaguanina, 3-desazaadenina, pirimidinas tricíclicas, fenoxazina citidina([5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), pinzas G, fenoxazina citidina (por ejemplo, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona), aquellos en los que la base de purina o pirimidina se reemplaza por otros heterociclos, 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina, 2-piridona, , azacitosina, 5-bromocitosina, bromouracilo, 5-clorocitosina, citosina clorada, ciclocitosina, arabinósido de citosina, 5-fluorocitosina, fluoropirimidina, fluorouracilo, 5,6-dihidrocitosina, 5-yodocitosina, hidroxiurea, yodouracilo, 5-nitrocitosina, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo y 5-yodouracilo, 2-amino-adenina, 6-tioguanina, 2-tio-timina, 4-tiotimina, 5-propinil-uracilo, 4-tio-uracilo, N4-etilcitosina, 7-desazaguanina, 7-desaza-8-azaguanina, 5-hidroxicitosina, 2'-desoxiuridina, 2-amino-2'-desoxiadenosina, y los descritos en las Patentes de EE.UU. N.° 3.687.808; 4.845.205; 4.910.300; 4.948.882; 5.093.232; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121; 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985; 5.681.941; 5.750.692; 5.763.588; 5.830.653 y 6.005.096; WO 99/62923; Kandimalla et al., (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813; The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; Englisch et al., Angewandte Chemie, Edición Internacional, 1991, 30, 613; y Sanghvi, Capítulo 15, Antisense Research and Applications, Crookeand Lebleu Eds., CRC Press, 1993, 273-288. Pueden encontrarse modificaciones de bases adicionales, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N.° 3.687.808; Englisch et al., Angewandte Chemie, Edición Internacional, 1991, 30, 613; y Sanghvi, Capítulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke y Lebleu ed., CRC Press, 1993.
Los ácidos nucleicos no naturales que comprenden diversas bases heterocíclicas y diversos restos de azúcar (y análogos de azúcar) están disponibles en la materia, y el ácido nucleico puede incluir una o varias bases heterocíclicas distintas de los cinco componentes de bases principales de los ácidos nucleicos de origen natural. Por ejemplo, la base heterocíclica puede incluir grupos uracil-5-ilo, citosin-5-ilo, adenin-7-ilo, adenin-8-ilo, guanin-7-ilo, guanin-8-ilo, 4-aminopirrolo [2.3-d] pirimidin-5-ilo, 2-amino-4-oxopirolo [2,3-d] pirimidin-5-ilo, 2-amino-4-oxopirrolo [2.3-d] pirimidin-3-ilo, en los que las purinas se unen al resto de azúcar del ácido nucleico a través de la posición 9, las pirimidinas a través de la posición 1, las pirrolopirimidinas a través de la posición 7 y las pirazolopirimidinas a través de la posición 1.
Los análogos de nucleótidos también pueden modificarse en el resto de fosfato. Los restos de fosfato modificados incluyen, pero sin limitación, aquellos que se pueden modificar de modo que el enlace entre dos nucleótidos contenga un fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosfotriéster, aminoalquilfosfotriéster, metilo y otros alquil fosfonatos incluyendo fosfonatos de 3'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos. Se entiende que este enlace fosfato o fosfato modificado entre dos nucleótidos puede ser a través de un enlace 3'-5' o un enlace 2'-5', y el enlace puede contener polaridad invertida tal como 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácidos libres. Numerosas patentes de Estados Unidos enseñan cómo hacer y usar los nucleótidos que contienen fosfatos modificados e incluyen, pero sin limitación, 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; y 5.625.050.
Los ácidos nucleicos no naturales pueden incluir 2',3'-didesoxi-2',3'-dideshidro-nucleósidos (documento PCT/US2002/006460), derivados de ADN y ARN 5'-sustituidos (documento PCT/US2011/033961; Saha et al., J. Org Chem., 1995, 60, 788-789; Wang et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9, 885-890; y Mikhailov et al., Nucleosides & Nucleotides, 1991, 10(1-3), 339-343; Leonid et al., 1995, 14(3-5), 901-905; y Eppacher et al., Helvetica Chimica Acta, 2004, 87, 3004-3020; PCT/JP2000/004720; PCT/JP2003/002342; PCT/JP2004/013216; PCT/JP2005/020435; PCT/JP2006/315479; PCT/JP2006/324484; PCT/JP2009/056718; PCT/JP2010/067560), o monómeros 5'-sustituidos preparados como el monofosfato con bases modificadas (Wang et al., Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids, 2004, 23 (1 y 2), 317-337).
Los ácidos nucleicos no naturales pueden incluir modificaciones en la posición 5' y la posición 2' del anillo de azúcar (documento PCT/US94/02993), tales como nucleósidos 2'-O-protegidos 5'-CH2-sustituidos (Wu et al., Helvetica Chimica Acta, 2000, 83, 1127-1143 y Wu et al., Bioconjugate Chem. 1999, 10, 921-924). Los ácidos nucleicos no naturales pueden incluir dímeros de nucleósidos unidos a amida que se han preparado para su incorporación en oligonucleótidos en los que el nucleósido unido en 3' en el dímero (5' a 3') comprende un 2 -OCH3 y un 5'-(S)-CH3 (Mesmaeker et al., Synlett, 1997, 1287-1290). Los ácidos nucleicos no naturales pueden incluir nucleósidos modificados con 5 '-CH (u O) 2'-sustituidos (documento PCT/US92/01020). Los ácidos nucleicos no naturales pueden incluir monómeros y dímeros de ADN y Ar N de 5'-metilenfosfonato (Bohringer et al., Tet. Lett., 1993, 34, 2723-2726; Collingwood et al., Synlett, 1995, 7, 703-705; y Hutter et al., Helvetica Chimica Acta, 2002, 85, 2777-2806). Los ácidos nucleicos no naturales pueden incluir monómeros de 5'-fosfonato que tienen una sustitución en 2' (documento US2006/0074035) y otros monómeros de 5'-fosfato modificados (documento WO1997/35869). Los ácidos nucleicos no naturales pueden incluir monómeros de metilenofosfonato 5'-modificados (documentos EP614907 y EP629633). Los ácidos nucleicos no naturales pueden incluir análogos de ribonucleósidos 5' o 6'-fosfonato que comprenden un grupo hidroxilo en la posición 5' y/o 6' (Chen et al., Phosphorus, Sulfur and Silicon, 2002, 777, 1783-1786; Jung et al., Bioorg. Med. Chem., 2000, 8, 2501-2509; Gallier et al., Eur. J. Org. Chem., 2007, 925-933; y Hampton et al., J. Med. Chem., 1976, 19(8), 1029-1033). Los ácidos nucleicos no naturales pueden incluir monómeros y dímeros de desoxirribonucleósido 5'-fosfonato que tienen un grupo 5'-fosfato (Nawrot et al., Oligonucleotides, 2006, 16(1), 68-82). Los ácidos nucleicos no naturales pueden incluir nucleósidos que tienen un grupo 6'-fosfonato en el que la posición 5' y/o 6' está sin sustituir o sustituida por un grupo tio-terc-butilo (SC(CH3)3) (y análogos del mismo); un grupo metilenamino (CH2NH2) (y análogos del mismo) o un grupo ciano (CN) (y análogos del mismo) (Fairhurst et al., Synlett, 2001, 4, 467-472; Kappler et al., J. Med. Chem., 1986, 29, 1030-1038; Kappler et al., J. Med. Chem., 1982, 25, 1179­ 1184; Vrudhula et al., J. Med. Chem., 1987, 30, 888-894; Hampton et al., J. Med. Chem., 1976, 19, 1371-1377; Geze et al., J. Am. Chem. Soc, 1983, 105(26), 7638-7640; y Hampton et al., J. Am. Chem. Soc, 1973, 95(13), 4404-4414).
Los ácidos nucleicos no naturales también pueden incluir modificaciones del resto de azúcar. Los ácidos nucleicos de la invención pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que el grupo azúcar se ha modificado. Dichos nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir una estabilidad de nucleasa mejorada, una afinidad de unión aumentada o alguna otra propiedad biológica beneficiosa. En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos comprenden un resto de anillo de ribofuranosa químicamente modificado. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluyendo los grupos sustituyentes 5' y/o 2'; puente de dos átomos del anillo para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA); reemplazo del átomo de oxígeno del anillo ribosilo por S, N(R) o C(Ri)(R2) (R = H, alquilo C1-C12 o un grupo protector); y combinaciones de los mismos. Se pueden encontrar ejemplos de azúcares modificados químicamente en los documentos WO2008/101157, US2005/0130923 y WO2007/134181.
Un ácido nucleico modificado puede comprender azúcares modificados o análogos de azúcar. Por lo tanto, además de ribosa y desoxirribosa, el resto de azúcar puede ser pentosa, desoxipentosa, hexosa, desoxihexosa, glucosa, arabinosa, xilosa, lixosa o un grupo ciclopentilo "análogo" de azúcar. El azúcar puede estar en forma de piranosilo o furanosilo. El resto de azúcar puede ser el furanósido de ribosa, desoxirribosa, arabinosa o 2'-O-alquilribosa, y el azúcar puede estar unido a las respectivas bases heterocíclicas en configuración anomérica [alfa] o [beta]. Las modificaciones de azúcar incluyen, pero sin limitación, análogos de 2'-alcoxi-ARN, análogos de 2'-amino-ARN, 2'-fluoro-ADN y quimeras 2'-alcoxi o amino-ARN/ADN. Por ejemplo, una modificación de azúcar puede incluir 2'-O-metiluridina o 2'-O-metil-citidina. Las modificaciones de azúcar incluyen desoxirribonucleósidos sustituidos con 2'-O-alquilo y ribonucleósidos de tipo 2'-O-etilenglicol. Se conoce la preparación de estos azúcares o análogos de azúcar y los respectivos "nucleósidos" en los que dichos azúcares o análogos están unidos a una base heterocíclica (base de ácido nucleico). También se pueden realizar modificaciones del azúcar y combinarlas con otras modificaciones.
Las modificaciones del resto de azúcar incluyen modificaciones naturales de la ribosa y la desoxirribosa, así como modificaciones no naturales. Las modificaciones de azúcar incluyen, pero sin limitación, las siguientes modificaciones en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, en las que el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C i a C10, alquilo o alquenilo C2 a C10 y alquinilo sustituidos o sin sustituir. Las modificaciones de azúcar en 2' también incluyen, pero sin limitación, -O[(CH2) n O] m CH3 , -O(CH2) n OCH3, -O(CH2) n NH2 , -O(CH2) n CH3, -O(CH2) n ONH2 y -O(CH2) n ON[(CH2) n CH3)]2, en las que n y m son de 1 a aproximadamente 10.
Otras modificaciones en la posición 2' incluyen, pero sin limitación: alquilo inferior C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo, O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3 , SO2CH3 , ONO2, NO2, N3, NH2 , heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalante, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. También pueden producirse modificaciones similares en otras posiciones sobre el azúcar, particularmente, la posición 3' del azúcar en el nucleótido del extremo 3' o en oligonucleótidos enlazados en 2'-5' y la posición 5' del nucleótido del extremo 5'. Los azúcares modificados también incluyen aquellos que contienen modificaciones en el oxígeno del anillo puenteado, tal como CH2 y S. Los análogos de azúcar del nucleótido pueden tener también miméticos de azúcar tales como restos de ciclobutilo en lugar de azúcar pentofuranosilo. Existen numerosas patentes de Estados Unidos que enseñan la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas y que detallan y describen varias modificaciones de bases, tales como las Patentes de EE.UU. N.° 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121, 5.596.091; 5.614.617; 5.681.941; y 5.700.920.
Los ejemplos de ácidos nucleicos que tienen restos de azúcar modificados incluyen, sin limitación, ácidos nucleicos que comprenden grupos de sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2 -OCH3 y 2'-O(CH 2 ) 2 OCH 3 . El sustituyente en la posición 2' también se puede seleccionar de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-(alquilo C1-C10), OCF3, O(CH2)2SCH3 , O(CH2)2-O-N(R m )(R n ) y O-CH2-C(=O)-N(R m )(R n ), en la que cada R m y R n es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o sin sustituir.
En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos de la presente invención incluyen uno o más ácidos nucleicos bicíclicos. En determinadas realizaciones de este tipo, el ácido nucleico bicíclico comprende un puente entre los átomos del anillo de ribosilo 4' y 2'. En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos proporcionados en el presente documento incluyen uno o más ácidos nucleicos bicíclicos en los que el puente comprende un ácido nucleico bicíclico 4' a 2'. Los ejemplos de dichos ácidos nucleicos bicíclicos 4' a 2' incluyen, pero sin limitación, una de las fórmulas: 4'-(CH 2 )-O-2' (LNA); 4'-(CH 2 )-S-2'; 4'-(CH 2 ) 2 -O-2' (ENA); 4'-CH(CH 3 )-O-2' y 4'-CH(CH 2 OCH 3 )-O-2', y análogos de los mismos (véase, la Patente de eE.UU. N.° 7.399.845); 4'-C(CH 3 )(CH 3 )-O-2' y análogos del mismo, (véase los documentos WO2009/006478, WO2008/150729, US2004/0171570, la Patente de EE.UU. N.° 7.427.672, Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 209, 74, 118-134 y el documento WO2008/154401). Véanse también, por ejemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; Oram et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; las Patentes de EE.UU. N.° 4.849.513; 5.015.733; 5.118.800; 5.118.802; 7.053.207; 6.268.490; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; 6.525.191; 6.670.461; y 7.399.845; las Publicaciones Internacionales N.° WO2004/106356, WO1994/14226, WO2005/021570, WO2007/090071 y WO2007/134181; las Publicaciones de Patente de EE.UU. N.° US2004/0171570, US2007/0287831 y US2008/0039618; las Solicitudes Provisionales de EE.UU. N.° 60/989.574, 61/026.995, 61/026.998, 61/056.564, 61/086.231, 61/097.787 y 61/099.844; y las Solicitudes Internacionales N.° PCT/US2008/064591, PCT US2008/066154, PCT US2008/068922 y PCT/DK98/00393.
En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos pueden comprender ácidos nucleicos unidos. Los ácidos nucleicos pueden unirse entre sí usando cualquier enlace entre ácidos nucleicos. Las dos clases principales de grupos de enlace entre ácidos nucleicos se definen por la presencia o ausencia de un átomo de fósforo. Los enlaces entre ácidos nucleicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero sin limitación, fosfodiésteres, fosfotriésteres, fosfonatos de metilo, fosforamidato y fosforotioatos (P=S). Los grupos de enlace entre ácidos nucleicos que no contienen fósforo representativos incluyen, pero sin limitación, metilenometilimino (-CH2-N(CH3)-O-CH2-), tiodiéster (-O-C(O)-S-), tionocarbamato (-O-C(O)(NH)-S-); siloxano (-O-Si(H)2-O-); y N,N*-dimetilhidrazina (-CH2-N(CH3)-N(CH3)). En determinadas realizaciones, los enlaces entre ácidos nucleicos que tienen un átomo quiral se pueden preparar como una mezcla racémica, como enantiómeros separados, por ejemplo, alquilfosfonatos y fosforotioatos. Los ácidos nucleicos no naturales pueden contener una única modificación. Los ácidos nucleicos no naturales pueden contener múltiples modificaciones dentro de uno de los restos o entre diferentes restos.
Las modificaciones de fosfato de la cadena principal con respecto al ácido nucleico incluyen, pero sin limitación, fosfonato de metilo, fosforotioato, fosforamidato (puenteado o no puenteado), fosfotriéster, fosforoditioato, fosfoditioato y boranofosfato, y pueden usarse en cualquier combinación. También pueden usarse otros enlaces no fosfato.
En algunas realizaciones, las modificaciones de la cadena principal (por ejemplo, enlaces internucleotídicos de fosfonato de metilo, fosforotioato, fosforoamidato y fosforoditioato) pueden conferir actividad inmunomoduladora sobre el ácido nucleico modificado y/o mejorar su estabilidad in vivo.
Puede unirse un derivado de fósforo (o grupo de fosfato modificado) al azúcar o resto análogo de azúcar y puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfonato, fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato o similares. Se pueden encontrar polinucleótidos de ejemplo que contienen enlaces fosfato modificados o enlaces no fosfato en Peyrottes et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848; Chaturvedi et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24:2318-2323; y Schultz et al., (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973; Matteucci, 1997, "Oligonucleotide Analogs: an Overview" en Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (Chadwick y Cardew, ed.) John Wiley and Sons, Nueva York, NY; Zon, 1993, "Oligonucleoside Phosphorothioates" en Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Humana Press, págs. 165-190; Miller et al., 1971, JACS 93:6657-6665; Jager et al., 1988, Biochem. 27:7247-7246; Nelson et al., 1997, JOC 62:7278-7287; la Patente de EE.UU. N.° 5.453.496; y Micklefield, 2001, Curr. Med. Chem. 8: 1157-1179.
La modificación de la cadena principal puede comprender reemplazar el enlace fosfodiéster con un resto alternativo tal como un grupo aniónico, neutro o catiónico. Los ejemplos de dichas modificaciones incluyen: enlace internucleosídico aniónico; modificación de fosforamidato de N3' a P5'; ADN de boranofosfato; prooligonucleótidos; enlaces internucleosídicos neutros tales como fosfonatos de metilo; ADN unido a amida; enlaces metilen(metilimino); enlaces formacetal y tioformacetal; cadenas principales que contienen grupos sulfonilo; oligos morfolino; ácidos nucleicos peptídicos (PNA, por sus siglas en inglés); y oligos de guanidina desoxirribonucleica cargados positivamente (DNG, por sus siglas en inglés) (Micklefield, 2001, Current Medicinal Chemistry 8: 1157-1179). Un ácido nucleico modificado puede comprender una cadena principal quimérica o mixta que comprende una o más modificaciones, por ejemplo, una combinación de enlaces fosfato tal como una combinación de enlaces fosfodiéster y fosforotioato.
Los sustitutos del fosfato pueden ser, por ejemplo, enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos de heteroátomos mixtos y de alquilo o cicloalquilo o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; sulfuro, cadenas principales de sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metilen formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otros que tienen partes componentes mezcladas de N, O, S y CH2. Numerosas patentes de Estados Unidos desvelan cómo fabricar y usar estos tipos de reemplazos de fosfato e incluyen, pero sin limitación, Patentes de EE.UU. N.° 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439. Se entiende también que en un sustituto de nucleótido se pueden reemplazar los restos de azúcar y de fosfato del nucleótido, mediante, por ejemplo, un enlace de tipo amida (aminoetilglicina) (ANP). Las patentes de EE.UU. N.° 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262 enseñan cómo hacer y usar las moléculas de ANP. Véase también Nielsen et al., Science, 1991,254, 1497-1500. También existe posibilidad de unir otros tipos de moléculas (conjugados) a nucleótidos o análogos de nucleótidos para potenciar, por ejemplo, la captación celular. Los conjugados se pueden enlazar químicamente con el nucleótido o análogos de nucleótidos. Dichos conjugados incluyen, pero sin limitación, restos de lípidos tales como un resto de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. KY. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EM5OJ, 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, dihexadecil-rac-glicerol o 1-di-O-hexadecil-rac-glicero-S-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), un resto de palmitilo (Mishra et al., Biochem. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237) o un resto de octadecilamina o hexilaminocarbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937). Numerosas patentes de Estados Unidos enseñan la preparación de dichos conjugados e incluyen, pero sin limitación, las Patentes de EE.UU. N.° 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717, 5.580.731; 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124 5.118.802 5.138.045 5.414.077 5.486.603 5.512.439 5.578.718 5.608.046 4.587.044 4.605.735; 4.667.025 4.762.779 4.789.737 4.824.941 4.835.263 4.876.335 4.904.582 4.958.013 5.082.830 5.112.963; 5.214.136 5.082.830 5.112.963 5.214.136 5.245.022 5.254.469 5.258.506 5.262.536 5.272.250 5.292.873; 5.317.098 5.371.241, 5.391.723 5.416.203 5.451.463 5.510.475 5.512.667 5.514.785 5.565.552 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941.
Ácidos nucleicos para incorporación celular
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos que experimentan una captación celular mejorada comprenden nucleótidos trifosfato. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos que experimentan una captación celular mejorada comprenden nucleótidos difosfato. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos que experimentan una captación celular mejorada comprenden nucleótidos monofosfato. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos que experimentan una captación celular mejorada comprenden nucleósidos. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos que experimentan una captación celular mejorada no comprenden nucleótidos difosfato. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos que experimentan una captación celular mejorada no comprenden nucleótidos monofosfato. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos que experimentan una captación celular mejorada no comprenden nucleósidos.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos que experimentan una captación celular mejorada comprenden análogos de ácidos nucleicos, por ejemplo, ácidos nucleicos no naturales. En algunas realizaciones, la captación mejorada del transporte activo de ácidos nucleicos utiliza transportadores de nucleótidos trifosfato (NTT), por ejemplo, de bacterias intracelulares obligadas o plástidos de algas. En algunas realizaciones, los métodos, composiciones y kits incorporan nucleótidos naturales y/o no naturales en un organismo o célula.
Se pueden incorporar a las células diversos nucleótidos naturales y no naturales. Un ejemplo de un par de nucleótidos trifosfato no naturales que pueden transportarse a las células y que pueden emparejarse por bases para formar un UBP cuando se incorporan a los ácidos nucleicos con las células, incluye un trifosfato de (d)5SICS ((d)5SICSTP) y un trifosfato de (d)NaM ((d)NaMTP). Un ejemplo de un par de nucleótidos trifosfato no naturales que pueden transportarse a las células y que pueden emparejarse por bases para formar un UBP cuando se incorporan a los ácidos nucleicos con las células, incluye un trifosfato de (d)TPT3 ((d)TPT3TP) y un trifosfato de (d)NaM ((d)NaMTP), que puede amplificarse por PCR con una eficiencia y fidelidad similares a las de un par de bases naturales. En algunas realizaciones, (d)TPT3 comprende un enlazador de propargilamina (TPT3PA). Un ejemplo de un par de nucleótidos trifosfato no naturales que pueden transportarse a las células y que pueden emparejarse por bases para formar un UBP cuando se incorporan a los ácidos nucleicos con las células, incluye un trifosfato de (d)TPT3PA y un trifosfato de un par de NaMA-dNaM que puede amplificarse por PCR con una eficiencia y fidelidad similares a las de un par de bases naturales. Dichos nucleótidos no naturales pueden tener un resto de azúcar ribosa o desoxirribosa. Las estructuras de 5SICS, d5SICS, NAM y dNaM, nucleótidos no naturales, se muestran a continuación.
Figure imgf000018_0001
El transportador de nucleótidos trifosfato puede incorporar otros tipos de nucleótidos no naturales a las células, tales como (d)TPT3, (d)TPT3PA, (d)FTPT3, (d)NaM, (d)5SICS, (d)FEMO, (d)FIMO, (d)MMO2 y combinaciones de los mismos, en los que (d) significa que la nucleobase puede unirse a una desoxirribosa o una ribosa. Las estructuras de las nucleobases de estos nucleótidos trifosfato no naturales se muestran a continuación.
Figure imgf000019_0001
en las que la línea ondulada identifica un punto de unión a la (desoxi)ribosa o al azúcar ribosa y R indica un enlazador de propargilamina. El azúcar puede fosforilarse (es decir, para formar un nucleótido trifosfato).
También se puede transportar diversos nucleótidos trifosfato de origen natural mediante los métodos descritos en el presente documento. Los nucleótidos trifosfato de origen natural incluyen los nucleótidos trifosfato de ribosa o desoxirribosa que tienen adenosina, guanina, citosina, timina o uracilo.
Los ejemplos de otros tipos de nucleótidos trifosfato modificados o no naturales que también pueden transportarse a las células incluyen aquellos con 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metitio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxacético, ácido uracil-5-oxacético, 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w y 2,6-diaminopurina.
Las estructuras de TPT3, dTPT3, NAM y dNaM, nucleótidos no naturales, se muestran a continuación.
Figure imgf000019_0002
Los ácidos nucleicos (o UDP) de ejemplo que se pueden usar, por ejemplo, para la incorporación a las células, también pueden incluir una o más de las estructuras de ácido nucleico representadas en el Anexo A , en el que la línea ondulada identifica un punto de unión al resto de azúcar, tal como una (desoxi)ribosa o ribosa.
También se pueden transportar a las células diversos nucleótidos de origen natural, así como otros nucleótidos modificados o no naturales, mediante los métodos descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos incorporados pueden ubicarse dentro de una región de una célula o un compartimento celular. En algunas realizaciones, la región o compartimento de una célula puede incluir una membrana, un orgánulo y/o el citosol. Por ejemplo, las membranas pueden incluir, pero sin limitación, membrana nuclear, membrana plasmática, membrana del retículo endoplásmico, pared celular, membrana celular y/o membrana mitocondrial. En algunas realizaciones, las membranas pueden incluir una membrana completa o un fragmento de una membrana. Por ejemplo, los orgánulos pueden incluir, pero sin limitación, el nucleolo, núcleo, cloroplasto, plástido, retículo endoplasmático, retículo endoplasmático rugoso, retículo endoplasmático liso, centrosoma, aparato de Golgi, mitocondria, vacuola, acrosoma, autofagosoma, centríolo, cilio, aparato de mancha ocular, glicosoma, glioxisoma, hidrogenosoma, lisosoma, melanosoma, mitosoma, miofibrilla, parentosoma, peroxisoma, proteasoma, ribosoma, vesícula, carboxisoma, clorosoma, flagelo, magenetosoma, nucleoide, plásmido, tilacoide, mesosomas, citoesqueleto y/o vesículas. En algunas realizaciones, los orgánulos pueden incluir una membrana completa o un fragmento de una membrana. Por ejemplo, el citosol puede estar encapsulado por la membrana plasmática, la membrana celular y/o la pared celular.
Propiedades de emparejamiento de bases de ácidos nucleicos
Un ácido nucleico no natural puede formar un par de bases con otro ácido nucleico. En algunas realizaciones, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable es un ácido nucleico no natural que puede formar un par de bases con otro ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico natural o no natural. En algunas realizaciones, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable es un ácido nucleico no natural que puede formar un par de bases con otro ácido nucleico no natural (par de bases de ácidos nucleicos no naturales (UBP)). Por ejemplo, un primer ácido nucleico no natural puede formar un par de bases con un segundo ácido nucleico no natural. Por ejemplo, un par de nucleótidos trifosfato no naturales que pueden emparejarse por bases cuando se incorporan a ácidos nucleicos incluyen un trifosfato de (d)5SICS ((d)5sIcSTP) y un trifosfato de (d)NaM ((d)NaMTP). Por ejemplo, un par de nucleótidos trifosfato no naturales que pueden emparejarse por bases cuando se incorporan a ácidos nucleicos incluyen un trifosfato de (d)TPT3 ((d)TPT3TP) y un trifosfato de (d)NaM ((d)NaMTP). Dichos nucleótidos no naturales pueden tener un resto de azúcar ribosa o desoxirribosa. En algunas realizaciones, un ácido nucleico no natural no forma sustancialmente un par de bases con un ácido nucleico natural (A, T, G, C). En algunas realizaciones, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable puede formar un par de bases con un ácido nucleico natural.
En algunas realizaciones, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable es un ácido nucleico no natural que puede formar un UBP, pero no forma sustancialmente un par de bases con cada uno de los cuatro ácidos nucleicos naturales. En algunas realizaciones, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable es un ácido nucleico no natural que puede formar un UBP, pero no forma sustancialmente un par de bases con uno o más ácidos nucleicos naturales. Por ejemplo, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable puede no formar sustancialmente un par de bases con A, T y C, pero puede formar un par de bases con G. Por ejemplo, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable puede no formar sustancialmente un par de bases con A, T y G, pero puede formar un par de bases con C. Por ejemplo, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable puede no formar sustancialmente un par de bases con C, G y A, pero puede formar un par de bases con T. Por ejemplo, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable puede no formar sustancialmente un par de bases con C, G y T, pero puede formar un par de bases con A. Por ejemplo, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable puede no formar sustancialmente un par de bases con A y T, pero puede formar un par de bases con C y G. Por ejemplo, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable puede no formar sustancialmente un par de bases con A y C, pero puede formar un par de bases con T y G. Por ejemplo, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable puede no formar sustancialmente un par de bases con A y G, pero puede formar un par de bases con C y T. Por ejemplo, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable puede no formar sustancialmente un par de bases con C y T, pero puede formar un par de bases con A y G. Por ejemplo, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable puede no formar sustancialmente un par de bases con C y G, pero puede formar un par de bases con T y G. Por ejemplo, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable puede no formar sustancialmente un par de bases con T y G, pero puede formar un par de bases con A y G. Por ejemplo, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable puede no formar sustancialmente un par de bases con, G, pero puede formar un par de bases con A, T y C. Por ejemplo, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable puede no formar sustancialmente un par de bases con, A, pero puede formar un par de bases con G, T y C. Por ejemplo, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable puede no formar sustancialmente un par de bases con, T, pero puede formar un par de bases con G, A y C. Por ejemplo, un ácido nucleico no natural integrado de manera estable puede no formar sustancialmente un par de bases con, C, pero puede formar un par de bases con G, T y A.
A modo de ejemplo, los nucleótidos no naturales capaces de formar un par de bases no naturales (UBP) de ADN o ARN en condiciones in vivo pueden incluir 5SICS, d5SICS, NAM, dNaM y combinaciones de los mismos.
SECUENCIAS/ACTIVIDADES DIANA
Un reactivo de nucleótidos a veces puede comprender una secuencia de nucleótidos diana. Una secuencia de "ácido nucleico diana", como se usa en el presente documento, codifica un ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína de interés, y puede ser una secuencia de ribonucleótidos o una secuencia de desoxirribonucleótidos. Un ácido nucleico diana a veces es un ácido ribonucleico no traducido y a veces es un ácido ribonucleico traducido. Un ácido ribonucleico no traducido puede incluir, pero sin limitación, un ácido ribonucleico interferente pequeño (ARNip), un ácido ribonucleico de horquilla corta (ARNhc), otro ácido ribonucleico con capacidad de interferencia de ARN (ARNi), un ácido ribonucleico no codificante o una ribozima. Una secuencia de nucleótidos diana traducible (por ejemplo, una secuencia de ribonucleótidos diana) a veces codifica un péptido, polipéptido o proteína, que a veces se denominan en el presente documento "péptidos diana", "polipéptidos diana" o "proteínas diana".
Una secuencia de nucleótidos traducible generalmente se encuentra entre un codón de inicio (AUG en ácidos ribonucleicos y ATG en ácidos desoxirribonucleicos) y un codón de terminación (por ejemplo, UAA (ocre), UAG (ámbar) o UGA (ópalo) en ácidos ribonucleicos y TAA, TAG o TGA en ácidos desoxirribonucleicos), y algunas veces se hace referencia en el presente documento como un "marco de lectura abierto" (ORF, por sus siglas en inglés). Una secuencia de nucleótidos traducible (por ejemplo, ORF) a veces se codifica de forma diferente en un organismo (por ejemplo, la mayoría de los organismos codifican CTG como leucina) que en otro organismo (por ejemplo, C. tropicalis codifica CTG como serina). En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos traducible se altera para corregir diferencias de código genético alternativo (por ejemplo, uso de codones) entre un organismo donante de nucleótidos y un organismo receptor de nucleótidos (por ejemplo, organismo genomanipulado). En determinadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos traducible se altera para mejorar; (i) el uso de codones, (ii) la eficacia transcripcional, (iii) la eficacia traduccional, (iv) similares y combinaciones de los mismos.
Cualquier péptido, polipéptido o proteína, o una actividad catalizada por uno o más péptidos, polipéptidos o proteínas puede codificarse por una secuencia de nucleótidos diana y puede seleccionarse por un usuario. Las proteínas representativas incluyen transportadores (por ejemplo, transportadores de nucleótidos trifosfato), enzimas (por ejemplo, polimerasas, maquinaria de replicación y similares, por ejemplo) y proteínas unidas a la membrana, e incluyen polipéptidos tanto de origen natural como expresados de manera exógena.
Las actividades representativas (por ejemplo, enzimas o combinaciones de enzimas que están asociadas funcionalmente para proporcionar una actividad) incluyen actividad del transportador de nucleótidos trifosfato y actividad de la polimerasa,
En el presente documento se enumeran polipéptidos específicos (por ejemplo, enzimas) útiles para las realizaciones descritas en el presente documento. Una proteína o polipéptido a veces es de origen intracelular (por ejemplo, se encuentra en el núcleo, el citosol o el espacio intersticial de las células huésped in vivo) y a veces es una proteína de la membrana celular in vivo. En algunas realizaciones (descritas anteriormente y con más detalle en lo sucesivo), una modificación genética puede dar como resultado una modificación (por ejemplo, aumento, aumento sustancial, disminución o disminución sustancial) de una actividad diana.
Actividad del transportador de nucleótidos trifosfato
Los cloroplastos son orgánulos característicos de las plantas, poseen una envoltura de dos membranas y surgieron por una endosimbiosis primaria entre un huésped protozoario y una cianobacteria (planta superior, algas verdes, algas rojas y glaucofita). Sin embargo, la absorción de un alga roja o verde por un huésped no fotosintético a través de un proceso llamado endosimbiosis secundaria dio lugar a más grupos de eucariotas quiméricos complejos (cloraraqueos, cromalveolatos). Por consiguiente, el orgánulo fotosintético resultante exhibe cuatro membranas delimitadoras. Hasta ahora, el conocimiento sobre los flujos metabólicos a través de las membranas de plástidos complejos es limitado. La caracterización bioquímica de las proteínas portadoras de plástidos implicadas en el suministro de energía (transportadores de nucleótidos, NTT) y en el transporte de intermediarios del metabolismo del almidón proporcionó información sobre la comunicación celular a través de las membranas de la envoltura de los plástidos primarios y complejos.
Aparte de los transportadores de nucleótidos plastidiales (NTT), que median en el transporte de ATP en contraintercambio con ADP y otros desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos, también están presentes proteínas estructuralmente relacionadas en algunas especies bacterianas vivas intracelulares. Las diferentes características bioquímicas de los NTT especializados permiten que estas bacterias intracelulares aprovechen los intermedios metabólicos de la célula huésped. La bacteria endosimbiótica Protochlamydia amoebophila, por ejemplo, posee cinco NTT esenciales no solo para el suministro de energía mediante el contraintercambio de ATP/ADP, sino también para la captación de componentes de ADN y ARN y derivados de nucleótidos de la célula huésped. Además, en la Protochlamydia amoebophila se eliminaron las vías biosintéticas correspondientes durante la evolución.
Una célula puede contener, o puede modificarse para contener, un transportador de nucleótidos trifosfato que facilita el transporte de los nucleótidos no naturales a través de la membrana celular y de otras membranas de modo que los nucleótidos no naturales estén disponibles para la maquinaria celular para su incorporación en los ácidos nucleicos de la célula. Por lo tanto, los UBP pueden formarse dentro de los ácidos nucleicos de la célula. Además, ni la presencia de trifosfatos no naturales ni la replicación del UBP representan una carga de crecimiento significativa. Los UBP no se escinden de manera eficaz por las vías de reparación del ácido nucleico y, por lo tanto, pueden conservarse siempre que los trifosfatos no naturales estén disponibles en el medio de crecimiento. Por lo tanto, la célula resultante es el primer organismo en propagar de manera estable un alfabeto genético expandido.
Determinados tipos de transportadores de nucleótidos trifosfato son más eficaces que otros. Por ejemplo, los transportadores de nucleótidos trifosfato de algunos tipos de diatomeas o algas son útiles para transportar nucleótidos trifosfato naturales y/o no naturales a las células sin degradación o pérdida de los nucleótidos trifosfato, particularmente cuando las células y los nucleótidos trifosfato se mantienen en presencia de fosfato de potasio.
Los nucleótidos no naturales se transportan al interior de las células mediante un transportador de nucleótidos trifosfato. Como se ilustra en el presente documento, se puede emplear diversos transportadores de nucleótidos trifosfato para transportar los nucleótidos no naturales a las células. Los ejemplos de transportadores de nucleótidos trifosfato que pueden emplearse incluyen los de diatomeas tales como Phaeodactylum tricornutum, Thalassiosira pseudonana y/o Protochlamydia amoebophila.
Los plástidos de diatomeas dependen de la captación de nucleótidos por un sistema de incorporación especializado en sus membranas que interconecta la formación de nucleótidos citosólicos y el consumo de nucleótidos en el orgánulo. Debido a que los plástidos de diatomeas están rodeados por cuatro membranas, mientras que los plástidos primarios poseen solo dos, las diatomeas tienen transportadores adicionales en las membranas adicionales.
Los ejemplos de transportadores de nucleótidos trifosfato que pueden emplearse incluyen los de Phaeodactylum tricornutum con números de acceso NCBI EEC44449.1 (GI:217404502, proteína NTT1, PHATRDRAFT_49533); EEC49227.1 (GI:217409295, proteína NTT2, PHATRDRAFT_45145); EEC43534.1 (GI:217403582, proteína NTT3, PHATRDRAFT_50189); ACI65362.1 (GI:209582741, proteína NTT4, PHATR_46794); EEC50831.1 (GI:217410902, proteína NTT5, PHATRDRAFT_54110); XP_002182967.1 (GI:219125393, proteína NTT6, PHATRDRAFT_54907).
Un transportador de nucleótidos trifosfato 2 de Phaeodactylum tricornutum (PtNTT2; EEC49227.1, GI:217409295) que tiene la siguiente secuencia SEQ ID NO: 1
1 MRPYPTIALI SVFLSAATRI SATSSHQASA LPVKKGTHVP
41 DSPKLSKLYI MAKTKSVSSS FDPPRGGSTV APTTPLATGG
81 ALRKVRQAVF PIYGNQEVTK FLLIGSIKFF IILALTLTRD
121 TKDTLIVTQC GAEAIAFLKI YGVLPAATAF IALYSKMSNA
161 MGKKMLFYST CIPFFTFFGL FDVFIYPNAE RLHPSLEAVQ
201 AILPGGAASG GMAVLAKIAT HWTSALFYVM AEIYSSVSVG
241 LLFWQFANDV VNVDQAKRFY PLFAQMSGLA PVLAGQYVVR
281 FASKAVNFEA SMHRLTAAVT FAGIMICIFY QLSSSYVERT
321 ESAKPAADNE QSIKPKKKKP KMSMVESGKF LASSQYLRLI
361 AMLVLGYGLS INFTEIMWKS LVKKQYPDPL DYQRFMGNFS
401 SAVGLSTCIV IFFGVHVIRL LGWKVGALAT PGIMAILALP
441 FFACILLGLD SPARLEIAVI FGTIQSLLSK TSKYALFDPT
481 TQMAYIPLDD ESKVKGKAAI DVLGSRIGKS GGSLIQQGLV
521 FVFGNIINAA PVVGVVYYSV LVAWMSAAGR LSGLFQAQTE
561 MDKADKMEAK TNKEK
Un transportador de nucleótidos trifosfato 2 de Phaeodactylum tricornutum con el SEQ ID NO:1 se codifica por un ácido nucleico con la siguiente secuencia de ADNc SEQ ID NO:2
i ATGAGACCAT ATCCGACGAT TGCCTTGATT TCGGTTTTTC
41 TTTCGGCGGC GACTCGTATT TCGGCCACTT CCTCTCATCA
81 AGCAAGTGCA CTTCCTGTCA AAAAGGGAAC GCATGTCCCG
121 GACTCTCCGA AGTTGTCAAA GCTATATATC ATGGCCAAAA
161 CCAAGAGTGT ATCCTCGTCC TTCGACCCCC CTCGGGGAGG
201 CAGTACTGTT GCGCCAACTA CACCGTTGGC AACCGGCGGT
241 GCGCTCCGCA AAGTGCGACA AGCCGTCTTT CCCATCTACG
281 GAAACCAAGA AGTCACCAAA TTTCTGCTCA TCGGATCCAT
321 TAAATTCTTT ATAATCTTGG CACTCACGCT CACGCGTGAT
361 ACCAAGGACA CGTTGATTGT CACGCAATGT GGTGCCGAAG
401 CGATTGCCTT TCTCAAAATA TACGGGGTGC TACCCGCAGC
441 GACCGCATTT ATCGCGCTCT ATTCCAAAAT GTCCAACGCC
481 ATGGGCAAAA AAATGCTATT TTATTCCACT TGCATTCCTT
521 TCTTTACCTT TTTCGGGCTG TTTGATGTTT TCATTTACCC
561 GAACGCGGAG CGACTGCACC CTAGTTTGGA AGCCGTGCAG
601 GCAATTCTCC CGGGCGGTGC CGCATCTGGC GGCATGGCGG
641 TTCTGGCCAA GATTGCGACA CACTGGACAT CCGCCTTATT
681 TTACGTCATG GCGGAAATAT ATTCTTCCGT ATCGGTGGGG
721 CTATTGTTTT GGCAGTTTGC GAACGACGTC GTCAACGTGG
761 ATCAGGCCAA GCGCTTTTAT CCATTATTTG CTCAAATGAG
801 TGGCCTCGCT CCAGTTTTAG CGGGCCAGTA TGTGGTACGG
841 TTTGCCAGCA AAGCGGTCAA CTTTGAGGCA TCCATGCATC
881 GACTCACGGC GGCCGTAACA TTTGCTGGTA TTATGATTTG
921 CATCTTTTAC CAACTCAGTT CGTCATATGT GGAGCGAACG
961 GAATCAGCAA AGCCAGCGGC AGATAACGAG CAGTCTATCA
1001 AACCGAAAAA GAAGAAACCC AAAATGTCCA TGGTTGAATC
1041 GGGGAAATTT CTCGCGTCAA GTCAGTACCT GCGTCTAATT
1081 GCCATGCTGG TGCTGGGATA CGGCCTCAGT ATTAACTTTA
1121 CCGAAATCAT GTGGAAAAGC TTGGTGAAGA AACAATATCC
1161 AGACCCGCTA GATTATCAAC GATTTATGGG TAACTTCTCG
1201 TCAGCGGTTG GTTTGAGCAC ATGCATTGTT ATTTTCTTCG
1241 GTGTGCACGT GATCCGTTTG TTGGGGTGGA AAGTCGGAGC
1281 GTTGGCTACA CCTGGGATCA TGGCCATTCT AGCGTTACCC
1321 tttttt gctt GCATTTTGTT GGGTTTGGAT AGTCCAGCAC
1361 GATTGGAGAT CGCCGTAATC TTTGGAACAA TTCAGAGTTT
1401 GCTGAGCAAA ACCTCCAAGT ATGCCCTTTT CGACCCTACC
1441 ACACAAATGG CTTATATTCC TCTGGACGAC GAATCAAAGG
1481 TCAAAGGAAA AGCGGCAATT GATGTTTTGG GATCGCGGAT
1521 TGGAAAGAGT GGAGGCTCAC TGATCCAGCA GGGCTTGGTC
1561 TTTGTTTTTG GAAATATCAT TAATGCCGCA CCTGTAGTAG
1601 GGGTTGTCTA CTACAGTGTC CTTGTTGCGT GGATGAGCGC
1641 AGCTGGCCGA CTAAGTGGGC TTTTTCAAGC ACAAACAGAA
1681 ATGGATAAGG CCGACAAAAT GGAGGCAAAG ACCAACAAAG
1721 AAAAGTAG
Un transportador de nucleótidos trifosfato 2 de Protochlamydia amoebophila (cepa UWE25), se denomina PamTTT2 y tiene la siguiente secuencia SEQ ID NO:3
1 MSQQESEFGK LRAFFWP1HG HEVKKVLPMM LMLFLICFNY
41 SILRNVKDAI VVTAKASGAE VIPFIKVWVL LPTAVLFTLI
81 FTKLSNRFSQ EKVFYIVIST FLLFFGSFTY IFYPLRDVLH
121 PHQLCDYLET ILPAGFKGLI AMFRNWSFTL FYVICELWGS
161 IVLTVLFWGF ANEITKMTEA RRFYSMLGVI ASFAATIAGI
201 IANLLSNDQS WEQTLNILMV AVIVSGTIAM VIFRWMNKNV
241 NGPEFQEFH EAKRIQKMKK RLSIRESFTY LANSKYLICI
281 AVLVISYNLV INLVEIVWKD QLRQLYSSAL DYNRYMNNMT
321 SAVGIIATIT SLFMSTMITR FGWTRTALVT PTIMLVTSVG
361 FFAFMLFRND LADPVYILTG TTPLTIAVFF GAAQVCMSKA
401 CKYSVFDSTK EMAFIPLDYE SKLKGKAAID GVGSRLGKSG
441 GSL1HQSLLM IFATVSSSAP YVAVILIGVI IVWMLCVRSL
481 GKQFAAIIGE KAREDIGEST PRTSEEQVLH PLKAAS
Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos para la proteína PamTTT2 anterior se proporciona a continuación como el SEQ ID NO:4
1 ATGTCTCAAC AAGAATCAGA GTTTGGTAAA TTGAGGGCAT
41 TTTTTTGGCC TATTCACGGC CATGAAGTCA AAAAAGTGCT
81 GCCGATGATG TTGATGCTAT TTTTGATTTG TTTCAACTAT
121 AGTATTTTAC GCAATGTTAA AGATGCTATT GTTGTGACTG
161 CTAAGGCTTC AGGGGCTGAA GTTATTCCAT TTATTAAAGT
201 ATGGGTGCTG TTACCCACGG CAGTCTTATT TACTTTAATT
241 TTTACTAAGT TGTCTAACCG TTTTAGCCAA GAAAAAGTTT
281 TTTATATTGT CATTTCTACA TTTTTGCTAT TTTTTGGTTC
321 GTTTACTTAT ATTTTTTATC CTTTACGTGA CGTACTACAT
361 CCTCATCAAC TATGCGATTA CTTAGAAACG ATTTTACCAG
401 CGGGATTTAA AGGATTAATT GCCATGTTCC GTAATTGGTC
441 ATTTACTTTG TTTTATGTAA TTTGTGAACT TTGGGGCAGT
481 ATTGTTTTAA CTGTCCTTTT TTGGGGATTT GCGAATGAAA
521 TCACAAAAAT GACTGAAGCT CGTCGTTTTT ATAGTATGCT
561 TGGTGTCATT GCAAGTTTTG CCGCGACGAT AGCAGGAATC
601 ATAGCCAATC TTCTTTCTAA TGATCAAAGT TGGGAACAGA
641 CTTTAAATAT TCTCATGGTT GCTGTAATTG TAAGTGGAAC
681 GATAGCCATG GTTATTTTTC GTTGGATGAA TAAAAATGTA
721 CTCAATGGCC CAGAATTCCA AGAATTCCAT GAAGCAAAAC
761 GCATTCAAAA AATGAAAAAA AGATTATCGA TCCGAGAAAG
801 TTTTACCTAT CTCGCTAATT CTAAATATCT TATTTGTATT
841 GCAGTTTTAG TTATTTCTTA TAATCTTGTC ATTAACTTAG
881 TTGAAATTGT ATGGAAAGAC CAGCTTCGCC AACTTTATTC
921 GTCAGCCCTT GATTATAATC GCTATATGAA TAACATGACA
961 TCAGCAGTCG GAATTATTGC CACAATCACA TCCTTATTTA
1001 TGTCTACAAT GATTACTCGG TTTGGATGGA CACGGACAGC
1041 TCTAGTAACA CCGACTATTA TGCTTGTCAC AAGTGTGGGA
1081 TTTTTTGCTT TTATGCTATT TCGAAATGAT TTGGCTGATC
1121 CTGTTTATAT ATTAACAGGA ACGACACCTT TAACTATAGC
1161 CGTCTTTTTT GGTGCAGCTC AAGTCTGCAT GAGTAAAGCC
1201 TGTAAGTATT CTGTTTTTGA TTCTACAAAA GAAATGGCTT
1241 TTATCCCTCT GGATTATGAA AGTAAATTGA AAGGAAAAGC
1281 TGCGATTGAT GGTGTGGGTT CTCGTCTTGG TAAATCGGGC
1321 GGTTCCTTAA TTCATCAAAG TTTATTGATG ATTTTTGCAA
1361 CTGTTAGCTC CAGCGCTCCT TATGTAGCTG TGATCTTAAT
1401 TGGCGTTATC ATTGTTTGGA TGCTCTGCGT ACGTTCATTA
1441 GGTAAGCAAT TTGCTGCTAT TATTGGGGAA AAGGCTCGAG
1481 AAGATATTGG TGAATCTACT CCAAGAACGA GTGAAGAGCA
1521 AGTTTTACAT CCCTTAAAAG CTGCATCTTAA
Un ejemplo de un transportador de nucleótidos trifosfato 3 de Protochlamydia amoebophila (cepa UWE25), se denomina PamTTT3 y tiene la siguiente secuencia SEQ ID NO:5
1 MSQTPTGSRE FSPWRSNLWP VHRYELKKLI PMLLIFFFIS
41 FDYNILRTLK DSLLITAKSS GAEVIPFVKV WAMFPGAILM
81 TLLFTWLSNR LSREIVFYLI TSLFLSYFFI FTFILYPIRD
121 I1HPHATADY LETILPIGFK GLVAMFRYWT FTIFYVMSEL
161 WGSTVLFVLF WGFANQVTKI SEAKRFYGLF GVGANLSGIF
201 AGQASVYCCQ FNKQNDLGIL GSDPWYQSLV MMVSLILLSG
241 ALVLALFRWM NVEVLTDKRF YDPSSVKTEG EAKGKLSLKQ
281 SFSYLLRSNY LLCIALIVIS YNLVINLTEV LWKHQVRELY
321 PDPNDYTLYM NHIVSIIGVV ATLS SLFVSG NAIRKFGWTT
361 TALITPIILA VTSLGFFSFF FLKKASPEIF LSFSGVTPLV
401 LVVFFGTAQN ILSRGAKYSV FDATKEMSFV PLNPESKLVG
441 KAAIDGVCSR LGKSGGSVVH QSLLLLFSTI NASAPYVAIV
481 LFAVILVWAM AIRVLGKQFN ELTSQVENNE TSGTLMTPIR
521 AVNILSDTIL KEQKAV
Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos para la proteína PamTTT3 anterior se proporciona a continuación como el SEQ ID NO:6
1 ATGTCACAGA CACCAACAGG GTCCCGTGAA TTTAGTCCAT
41 GGCGGAGCAA TCTTTGGCCC GTTCATCGCT ATGAGCTTAA
81 AAAACTCATC CCAATGTTGT TAATATTCTT TTTTATTTCT
121 TTTGATTACA ACATATTACG TACTTTAAAA GACTCACTAC
161 TTATAACTGC AAAATCTTCA GGTGCTGAGG TCATTCCTTT
201 TGTAAAGGTT TGGGCTATGT TCCCTGGAGC TATTTTAATG
241 ACCCTTTTGT TCACTTGGTT GTCTAATCGC CTGTCAAGAG
281 AAATCGTTTT TTACCTTATC ACTTCTCTTT TTTTATCTTA
321 TTTTTTTATT TTCACTTTTA TTCTCTATCC TATTCGAGAT
361 ATTATCCATC CTCACGCAAC TGCTGACTAT CTTGAAACAA
401 TTTTACCGAT TGGATTTAAA GGGCTAGTTG CGATGTTTCG
441 TTACTGGACT TTTACTATTT TCTATGTGAT GTCAGAACTT
481 TGGGGAAGTA CTGTTTTATT TGTCTTATTT TGGGGTTTTG
521 CTAATCAAGT GACTAAAATT AGTGAGGCAA AAAGATTTTA
561 CGGTCTGTTT GGGGTAGGTG CTAATCTTTC GGGTATTTTC
601 GCAGGACAAG CTTCTGTGTA CTGTTGTCAA TTTAATAAGC
641 AGAACGATTT GGGAATCCTT GGTAGTGATC CATGGTATCA
681 ATCATTAGTG ATGATGGTTT CTTTAATTTT ATTATCGGGT
721 GCTTTAGTTT TAGCTTTATT TCGTTGGATG AATGTAGAAG
761 TCTTAACCGA TAAACGTTTT TATGATCCTT CTTCGGTTAA
801 AACAGAAGGA GAAGCTAAAG GTAAGCTTTC TCTAAAGCAA
841 AGCTTTTCCT ATCTTCTTCG CTCTAATTAC TTACTTTGTA
881 TTGCTCTTAT TGTTATTTCT TATAACCTAG TTATTAACCT
921 CACAGAAGTT TTATGGAAAC ATCAAGTCCG AGAGCTATAT
961 CCTGATCCTA ATGATTATAC TTTATATATG AATCATATCG
1001 TATCCATTAT TGGGGTAGTA GCGACCTTAA GTTCCCTTTT
1041 CGTATCAGGA AATGCGATTC GCAAATTTGG GTGGACCACT
1081 ACTGCTTTAA TTACACCTAT CATTTTAGCT GTAACAAGTT
1121 TGGGCTTTTT CTCCTTTTTC TTCCTTAAAA AGGCATCTCC
1161 CGAAATTTTC TTATCTTTTT CCGGAGTAAC TCCTTTGGTT
1201 TTAGTGGTTT TCTTTGGAAC TGCTCAAAAC ATATTGAGTC
1241 GAGGAGCTAA ATACTCTGTA TTTGATGCCA CTAAAGAAAT
1281 GAGTTTTGTT CCTTTAAATC CTGAATCCAA ACTCGTTGGA
1321 AAAGCGGCGA TTGATGGAGT TTGTTCTCGC CTCGGAAAAT
1361 CGGGTGGATC TGTGGTTCAT CAGAGCCTTC TACTTTTGTT
1401 TTCTACAATT AATGCAAGTG CCCCTTATGT AGCTATCGTC
1441 TTGTTCGCCG TAATTCTAGT CTGGGCAATG GCAATTCGCG
1481 TTTTAGGTAA ACAATTTAAT GAATTGACAA GTCAGGTAGA
1521 AAACAATGAA ACTTCTGGGA CATTGATGAC TCCTATTCGA
1561 GCTGTTAATA TTCTTTCAGA CACAATTTTG AAAGAACAGA
1601 AAGCTGTATA A
Un ejemplo de un transportador de nucleótidos trifosfato 5 de Protochlamydia amoebophila (cepa UWE25), se denomina PamTTT5 y tiene la siguiente secuencia SEQ ID NO:7
1 MKNQQNSVSS TLLILKKRSL ILFQFFLIII VYHTLKDLKD
41 TIVITASDAG AEIIPFIKIW GMLPLAICAS YFFAKFYNKF
81 GREKTFYIFS SFLLVNYLFF AFVLYPFRKF FYLENVADYL
121 HMILPVGAKG FVAMVSYWHY TLFYLTAELW SMLILSILFW
161 GYVSDTTSLV EAKKFYPLCM FVGNMAGIIS GQLSHFLCQH
201 LSDFMSWERT LQWMIGIVCV CGLLIMIINR RLALTTDFSA
241 IKQKVKKQIA PSSFKDNVMD VLRTGPLLCI AVLVVGFGLT
281 TNLIEVIWKE NIRQLHPTPQ AYNAYINQLT SLIGTGAVCI
321 ALLSSWIFRK FTWTQIALTT PLCLLITSSA FFSSLLMPKE
361 LLAEIASFFQ FSPTQLIVTL GSICYVFSMS AKYTIFDTSK
401 EIAFLSIETE KRTYAKSVID SIGSRLGKSG ASCFYQFLLI
441 AFGIASEHIL LIGVVSIIMI GISIFATKKL GGQLSGKNEN
481 HRFIEASHG
Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos para la proteína PamTTT5 anterior se proporciona a continuación como el SEQ ID NO:8
1 ATGAAAAATC AACAAAATTC TGTATCTTCT ACCTTACTAA
41 TCTTAAAAAA GCGTAGCTTG ATCCTATTTC AATTTTTTCT
81 AATTATCATT GTTTATCATA CATTAAAAGA CCTCAAAGAT
121 ACGATTGTTA TCACAGCAAG TGATGCAGGT GCAGAGATCA
161 TTCCTTTTAT TAAAATTTGG GGAATGCTTC CTCTTGCCAT
201 TTGTGCTAGT TATTTTTTTG CTAAATTTTA TAATAAATTT
241 GGAAGAGAAA AAACATTTTA TATTTTTAGC TCTTTCTTAC
281 TAGTTAACTA TCTTTTCTTT GCTTTTGTAT TATATCCATT
321 CCGCAAGTTT TTTTATTTAG AAAATGTTGC AGATTATTTA
361 CATATGATTT TACCTGTTGG AGCGAAAGGG TTTGTTGCCA
401 TGGTAAGCTA TTGGCATTAC ACTCTATTTT ATTTAACGGC
441 AGAATTATGG TCGATGCTCA TTCTATCTAT CCTTTTTTGG
481 GGTTATGTGA GTGATACGAC TTCTTTAGTA GAAGCCAAAA
521 AATTTTACCC CCTCTGTATG TTCGTTGGAA ATATGGCAGG
561 AATTATTTCT GGTCAGCTCT CTCATTTCTT ATGTCAACAT
601 TTGTCTGATT TCATGTCATG GGAAAGAACC CTGCAATGGA
641 TGATTGGTAT TGTCTGTGTT TGCGGCCTTT TAATTATGAT
681 TATTAATAGA CGGCTGGCTC TTACAACTGA TTTTTCGGCA
721 ATTAAACAAA AAGTAAAAAA ACAAATAGCT CCCTCTTCTT
761 TCAAAGATAA TGTTATGGAT GTTTTAAGAA CAGGTCCCTT
801 ACTTTGTATA GCTGTATTGG TAGTGGGGTT TGGACTGACA
841 ACGAATCTAA TTGAAGTTAT TTGGAAAGAA AATATTAGGC
881 AACTACACCC GACACCTCAA GCCTACAATG CTTATATTAA
921 TCAATTGACT TCTTTAATTG GGACTGGTGC TGTTTGTATA
961 GCCTTGTTAT CAAGCTGGAT TTTTAGAAAG TTTACTTGGA
1001 CGCAAATTGC CCTCACAACC CCTTTATGTT TATTAATCAC
1041 AAGCTCTGCT TTTTTTTCAT CGCTTCTTAT GCCTAAAGAG
1081 CTGTTAGCGG AAATTGCTTC TTTTTTTCAG TTTTCCCCAA
1121 CTCAATTGAT AGTGACACTA GGATCTATTT GCTATGTTTT
1161 TAGCATGTCT GCGAAGTACA CAATTTTTGA TACTAGTAAA
1201 GAAATAGCTT TTCTTTCTAT TGAAACAGAA AAAAGAACGT
1241 ATGCTAAATC TGTAATTGAT AGCATTGGCT CTCGTTTGGG
1281 AAAATCTGGC GCTTCTTGTT TTTATCAATT TCTTCTTATT
1321 GCCTTTGGAA TTGCTTCCGA ACATATTTTA TTAATTGGAG
1361 TTGTATCCAT TATAATGATT GGAATTTCGA TTTTTGCTAC
1401 GAAAAAATTG GGTGGGCAGC TGTCTGGTAA AAATGAAAAC
1441 CATCGCTTTA TAGAAGCTTC CCATGGATAA
Un ejemplo de un transportador de nucleótidos trifosfato 2 de Thalassiosira pseudonana, se denomina TpTTT2, y tiene la siguiente secuencia SEQ ID NO:9
1 MKTSCTIQRR VKSISSKHSI IDTHHSTSRR LSVILLFFLL
41 HSSAEMLFAS ATGNHNANTS PPPANIPMIS TNNKSCMMRR
81 TRSQSRRDSS RSPDSVASAN VVGRGGDGGT IMGAKSVFQT
121 ASKALPPNTV SSTASGSVSK ASRLRTVLFP IQNDEMKKFL
161 LIGSIKFFVI LALTLTRDNK DTMVVTECGA EAIAFLKIYG
201 VLPSATLFIA LYSKMATIFD KKTLFYATCI PFFAFFFLFD
241 AIIYPNRNVI QPSLESVQRV MRITADSSGA MSIFAKLFAN
281 WTSALFYIVA EVYSSVSVGI LFWQYANDVV SVSQAKRFYP
321 LFAQMSGLAP IVAGQYVVRY ASRANDFEES LHRLTWMVSF
361 SGVMICLFYK WSNEYNDQTS GGLNGGIEDG VKETKVVKKK
401 KAKMSMRDSA KFLASSEYLR LIAALVVGYG LSINFTDIMW
441 KSIVKRQYPD PLDYQRFMGN FSSVVGLSTC IVIFLGVHAI
481 RILGWRMGAL ATPAVMAILA FPYFSSILVG LDSPGSLRIA
521 VIFGTIQCLL SKTAKYALFD PTTQMAYIPL DDESKIKGKA
561 AIEVLGSRIG KSGGSLIQQG LVLVFGNIIN AAPALVVLYY
601 SVLAWWVYSA NRLGSLFLAK TAMQEETKEH QK
Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos para la proteína TpTTT2 anterior se proporciona a continuación como el SEQ ID NO:10
1 ATGAAAACAT CTTGTACAAT CCAACGTCGT GTCAAATCCA 41 TCTCATCCAA ACACAGTATC ATCGACACAC ACCACTCTAC 81 TTCTCGCCGT TTAAGTGTCA TCCTACTCTT CTTTCTACTA 121 CACTCCTCGG CAGAGATGCT ATTTGCTTCC GCCACGGGCA 161 ATCACAACGC CAATACATCA CCACCACCTG CGAATATTCC 201 CATGATTAGC ACTAACAACA AATCATGTAT GATGCGACGA 241 ACCAGGAGTC AATCACGACG AGATAGCAGC CGTTCGCCTG 281 ATTCGGTGGC CTCGGCCAAT GTTGTTGGGA GGGGCGGCGA 321 TGGGGGTACC ATTATGGGTG CCAAGAGTGT CTTCCAGACT
361 GCTTCGAAAG CATTACCTCC CAACACTGTG TCGTCCACAG 401 CAAGCGGCAG TGTATCCAAA GCATCGCGCC TACGAACGGT 441 CCTCTTCCCC ATTCAAAATG ACGAGATGAA GAAGTTTCTC 481 TTGATTGGAA GTATCAAGTT CTTTGTAATT CTAGCGTTGA 521 CACTCACGAG AGATAATAAG GATACAATGG TGGTTACCGA 561 GTGTGGAGCT GAGGCCATCG CTTTTCTAAA GATCTACGGA 601 GTACTACCAT CCGCCACACT CTTCATAGCA CTCTACTCGA 641 AAATGGCCAC TATCTTTGAC AAAAAGACCT TATTCTACGC 681 CACGTGCATT CCATTCTTTG CATTCTTCTT CTTATTCGAT 721 GCAATCATCT ATCCTAACCG GAATGTCATT CAGCCTTCCT 761 TAGAGAGTGT TCAGCGTGTC ATGAGAATCA CAGCCGATTC 801 ATCGGGTGCC ATGTCCATCT TTGCAAAGTT GTTCGCCAAT 841 TGGACGTCGG CCTTGTTTTA TATTGTAGCA GAGGTATACT 881 CGTCTGTTTC AGTGGGGATA TTGTTCTGGC AGTATGCCAA 921 TGATGTGGTG TCTGTCTCGC AAGCAAAACG ATTTTACCCA 961 CTCTTTGCAC AGATGAGTGG ACTTGCCCCC ATTGTGGCTG 1001 GACAGTATGT GGTACGATAT GCTAGTAGAG CCAATGACTT 1041 TGAAGAATCA TTGCATAGGT TGACGTGGAT GGTATCCTTT 1081 TCGGGAGTGA TGATTTGTCT GTTTTACAAG TGGAGCAATG 1121 AGTACAATGA TCAGACGTCT GGAGGGTTAA ATGGGGGAAT 1161 TGAGGATGGA GTAAAAGAGA CGAAGGTGGT GAAGAAAAAG 1201 AAAGCCAAAA TGTCAATGAG GGATTCAGCC AAGTTTTTGG 1241 CTTCATCCGA GTATTTGAGA CTGATTGCTG CTTTGGTTGT 1281 GGGATATGGT CTGTCGATCA ACTTTACAGA TATAATGTGG 1321 AAATCAATCG TCAAGAGACA ATATCCCGAT CCTCTCGACT 1361 ATCAACGTTT CATGGGGAAC TTTTCATCAG TAGTTGGATT 1401 GTCTACGTGC ATCGTTATCT TTCTCGGTGT ACATGCTATT 1441 CGTATACTAG GCTGGCGAAT GGGTGCCCTA GCGACTCCAG 1481 CCGTCATGGC AATCTTGGCA TTCCCTTACT TCTCGAGCAT 1521 TCTCGTTGGG TTGGACAGTC CAGGTAGTTT ACGAATTGCA 1561 GTGATCTTTG GTACTATTCA ATGCCTGCTT AGTAAGACAG 1601 CAAAGTATGC CCTGTTCGAT CCGACAACTC AAATGGCCTA 1641 CATTCCTTTG GATGACGAAT CAAAGATCAA GGGAAAGGCA 1681 GCAATAGAAG TACTTGGTTC TCGGATTGGA AAAAGTGGTG 1721 GTTCGTTGAT ACAACAAGGT CTTGTGTTGG TGTTTGGGAA 1761 CATTATCAAT GCTGCTCCCG CGTTGGTTGT TCTTTACTAC 1801 TCAGTGTTGG CGTGGTGGGT GTACTCAGCA AATCGGCTCG 1841 GATCATTGTT CTTGGCAAAG ACAGCTATGC AAGAGGAAAC 1881 AAAAGAGCAC CAGAAGTAG
Un ejemplo de un transportador de nucleótidos trifosfato 3 de Simkania negevensis, se denomina SnTTT3, y tiene la siguiente secuencia SEQ ID NO:11
1 MSSTEYEKST WTQKIWPIRR FELKKVLPLL ILKFLVSMVY
41 ATLTLIKDPL VVTAKHSGAE VIPVLKGWIV FPLSILCAIG
81 YSKLSNHFKR STLFYGIITA FLAIVLIYGF VLYPNMGILT
121 PSDSANLLTA KFGEKYTHWI AVYRNW1HSL FFVTTELWGQ
161 VVIFLLYWGF ANHICQVKEA KRSYTLFIAA GDLATILAGP
201 LTYYYGKKFL GQSYALTLQS LLGYVLVCGL LIMAVYWWMN
241 RYVLTDKRYY DPSVTKQTVN QKTKLSLRDS IRHIFSSKYL
281 LAIAVLVVGC ALTINMVEVT WKAHLKMQYP TTADYQMFMG
321 RVTTIVGVVA LITVFFLGGN FLRRFGWHFS AQITPWAIGI
361 TGGVFFLLCL LKPYLGSFAH YVGLTPLMMI VIFGAFQNIT
401 SKVVKYSFFD STKEMAYIPL DPESKVKGKA AIDMVGSRLG
441 KSSSSWLQIG LIELVGTGSV ISITPYLLPI VLGAALYWSY
481 SVRYLNKELS VREETLLEEE EAKKRAGELQ PEPEPAT
Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos para la proteína SnTTT3 de Simkania negevensis anterior se proporciona a continuación como el SEQ ID NO:12
1 ATGAGTAGTA CCGAATATGA GAAGTCCACA TGGACTCAAA
41 AAATCTGGCC AATAAGGCGC TTTGAACTTA AGAAAGTCCT
81 TCCTCTTTTA ATCCTTAAAT TTCTAGTCTC TATGGTTTAT
121 GCCACTCTCA CCTTAATCAA GGATCCCCTT GTGGTGACGG
161 CAAAACATTC TGGAGCAGAA GTCATTCCAG TTCTAAAAGG
201 TTGGATTGTT TTCCCCTTAT CGATTCTTTG TGCTATTGGT
241 TACTCAAAGT TAAGCAACCA CTTCAAACGT TCCACCCTCT
281 TTTACGGAAT CATTACAGCT TTCCTAGCTA TTGTTCTTAT
321 CTACGGCTTC GTTTTGTATC CCAATATGGG AATTCTCACA
361 CCAAGCGACT CTGCAAACTT GTTAACAGCT AAATTTGGGG
401 AAAAATACAC ACACTGGATT GCAGTTTATC GGAATTGGAT
441 CCATTCTCTC TTTTTCGTCA CCACAGAGCT TTGGGGGCAA
481 GTTGTCATTT TCCTCCTCTA CTGGGGATTT GCCAACCACA
521 TTTGCCAAGT GAAAGAAGCT AAAAGATCTT ACACTCTTTT
561 CATCGCTGCA GGCGATTTAG CAACGATCTT GGCTGGTCCA
601 CTTACCTATT ACTACGGAAA AAAGTTTCTA GGACAAAGCT
641 ATGCTCTCAC TCTTCAATCC CTACTAGGAT ATGTCTTAGT
681 CTGCGGGCTA CTCATCATGG CAGTCTATTG GTGGATGAAT
721 CGATATGTCC TAACAGACAA A CGGTACTAC GATCCATCAG
761 TGACGAAGCA AACAGTCAAC CAAAAGACCA AACTCTCTCT
801 GCGTGATAGT ATCCGGCATA TCTTTTCATC AAAGTATCTC
841 CTTGCTATTG CGGTCCTCGT TGTCGGTTGC GCTCTCACCA
881 TCAACATGGT AGAAGTCACC TGGAAAGCTC ACTTAAAGAT
921 GCAATACCCA ACAACTGCTG ATTACCAAAT GTTCATGGGG
961 CGAGTCACAA CTATTGTTGG AGTTGTTGCC CTCATCACTG
1001 TATTCTTCTT AGGAGGAAAC TTCCTGAGAC GGTTTGGATG
1041 GCACTTCAGT GCTCAAATCA CCCCATGGGC GATTGGAATC
1081 ACAGGTGGTG TTTTCTTTTT ACTCTGCCTT TTGAAGCCCT
1121 ATCTCGGGTC TTTCGCTCAT TATGTTGGAC TCACCCCTCT
1161 TATGATGATT GTCATCTTTG GAGCCTTCCA AAATATCACT
1201 AGTAAAGTCG TCAAATACTC GTTCTTTGAT TCGACGAAAG
1241 AAATGGCTTA TATTCCACTA GACCCTGAAT CTAAAGTGAA
1281 AGGAAAAGCA GCCATCGACA TGGTCGGTTC AAGATTGGGT
1321 AAGTCGAGCT CCTCCTGGCT ACAAATTGGC TTGATTGAAC
1361 TAGTTGGGAC TGGTTCGGTG ATCTCAATCA CTCCTTATCT
1401 ACTGCCTATC GTTCTAGGTG CCGCCCTCTA TTGGAGCTAC
1441 TCTGTACGCT ACCTCAATAA AGAGCTTTCT GTGCGTGAAG
1481 AAACACTCCT CGAGGAAGAA GAAGCTAAGA AAAGAGCGGG
1521 AGAGCTTCAG CCTGAACCTG AGCCTGCCAC TTGA
Un solo emparejamiento incorrecto de nucleótidos dio como resultado una sustitución de aminoácidos en la posición 248 de la secuencia SEQ ID NO:11 en la que la arginina (R), que es un aminoácido básico, se reemplaza por un triptófano (W), que es un aminoácido no polar/hidrófobo. Este transportador de nucleótidos trifosfato 3 mutante de Simkania negevensis tiene la siguiente secuencia SEQ ID NO:13
1 MSSTEYEKST WTQKIWPIRR FELKKVLPLL ILKFLVSMVY
41 ATLTLIKDPL VVTAKHSGAE VIPVLKGWIV FPLSILCAIG
81 YSKLSNHFKR STLFYGIITA FLAIVLIYGF VLYPNMGILT
121 PSDSANLLTA KFGEKYTHWI AVYRNW1HSL FFVTTELWGQ
161 VVIFLLYWGF ANHICQVKEA KRSYTLFIAA GDLATILAGP
201 LTYYYGKKFL GQSYALTLQS LLGYVLVCGL LIMAVYWWMN
241 RYVLTDKWYY DPSVTKQTVN QKTKLSLRDS IRHIFSSKYL
281 LAIAVLVVGC ALTINMVEVT WKAHLKMQYP TTADYQMFMG
321 RVTTIVGVVA LITVFFLGGN FLRRFGWHFS AQITPWAIGI
361 TGGVFFLLCL LKPYLGSFAH YVGLTPLMMI VIFGAFQNIT
401 SKVVKYSFFD STKEMAYIPL DPESKVKGKA AIDMVGSRLG
441 KSSSSWLQIG LIELVGTGSV ISITPYLLPI VLGAALYWSY
481 SVRYLNKELS VREETLLEEE EAKKRAGELQ PEPEPAT
Un ejemplo de un transportador de nucleótidos trifosfato 2 de Simkania negevensis, se denomina SnTTT2, y tiene la siguiente secuencia SEQ ID NO:14
1 MSTQTDVSFS KWRSFLWPIQ GREIKKFLPL LLIYALICLN
41 YSVLKVAKDT LVITAPGSGA EAIPFIKVWV ILPMALLVTY
81 LFTRLFNRFS QEQVFYIMIG SFISFFALFA FVLYPLRDFL
121 HPHDTADKLQ AMLPQGFQGL IAIFRNWSYT LFYVMSELWG
161 TAIMSVLFWG FTNEIISVGE AKRYYGILSV GANIATIFSG
201 YITTFLSLQV IDMSFIFGPD RWGQSLGLVT CVVVAAGLLI
241 MALFRWYNKR VINRDAVLLK MKQDHTETKK TMKMGMRKNF
281 AYLAKSKYLI CIAVLVVAFN VGINMVEIIW KDQIKELYPN
321 PNDFIVYMGK VMSAIGWVAT FVGLFLSSNL IRRLGWTVSA
361 LITPVALLVT GVFFFGFILF KNNPTLVGWT AAIGFTPLAL
401 GVLFGTIQNV MSRACKYTLF DSTKEIAFIP LSPESKLKGK
441 AAIDGVGSRV GKSGGSIVHG GLLMLFGSVS LSAPYVGLIL
481 LAVVFGWIGA ARSLGRQFNL LTTHHEKLEI NEEAQPSEKK
521 PLLESV
Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos para la proteína SnTTT2 de Simkania negevensis anterior con el SEQ ID NO:13 se proporciona a continuación como el SEQ ID NO:15.
1 ATGTCAACAC AGACTGATGT GAGTTTCAGT AAATGGCGCT
41 CATTTTTGTG GCCAATTCAA GGAAGAGAAA TTAAAAAATT
81 TCTTCCTCTT CTCCTGATTT ACGCTCTCAT TTGTCTTAAC
121 TATAGCGTCT TAAAAGTCGC AAAAGACACA CTTGTCATTA
161 CAGCCCCTGG ATCAGGCGCA GAAGCAATCC CGTTTATCAA
201 GGTCTGGGTC ATTCTCCCCA TGGCACTCCT CGTAACTTAT
241 CTCTTTACTC GCCTCTTCAA TCGATTTAGC CAAGAACAAG
281 TGTTTTACAT CATGATCGGG AGCTTCATTT CGTTTTTCGC
321 TCTATTTGCA TTTGTCCTCT ACCCCTTGCG AGATTTTCTT
361 CATCCTCATG ACACAGCTGA TAAATTACAA GCCATGCTTC
401 CACAGGGATT CCAAGGGCTC ATAGCCATTT TCCGTAACTG
441 GTCCTATACC CTCTTTTATG TGATGTCTGA GCTATGGGGA
481 ACCGCTATTA TGTCTGTCCT CTTTTGGGGA TTCACAAATG
521 AAATTATTTC TGTAGGTGAG GCCAAAAGGT ATTATGGAAT
561 TCTCAGTGTA GGGGCCAATA TTGCAACTAT TTTTTCAGGG
601 TACATCACCA CCTTTCTCTC TTTGCAAGTG ATTGACATGT
641 CATTCATTTT TGGACCTGAC CGCTGGGGAC AATCATTAGG
681 TCTTGTGACA TGTGTTGTTG TTGCAGCAGG TCTCCTTATT
721 ATGGCCCTTT TCAGATGGTA CAACAAGCGA GTCATTAATC
761 GTGATGCAGT ACTATTAAAA ATGAAACAAG ACCACACAGA
801 AACGAAGAAG ACCATGAAAA TGGGAATGCG TAAGAATTTT
841 GCTTACCTTG CAAAATCAAA GTATTTAATT TGCATTGCAG
881 TTCTGGTTGT TGCATTCAAT GTTGGAATCA ACATGGTCGA
921 AATTATCTGG AAAGATCAAA TCAAAGAACT GTATCCCAAT
961 CCCAACGATT TTATTGTTTA TATGGGGAAG GTCATGAGTG
1001 CAATTGGTTG GGTTGCAACA TTTGTCGGAC TATTTCTCAG
1041 TAGTAATTTA ATCAGGCGCT TAGGATGGAC TGTCAGCGCC
1081 TTAATCACTC CTGTTGCTCT CCTCGTAACA GGTGTTTTCT
1121 TTTTCGGATT CATTCTCTTT AAAAACAACC CTACATTAGT
1161 GGGTTGGACA GCCGCCATAG GATTTACACC TCTTGCACTA
1201 GGGGTTCTCT TTGGGACAAT CCAAAATGTG ATGTCTCGAG
1241 CATGTAAATA CACCTTATTT GACTCTACAA AAGAAATAGC
1281 GTTTATCCCC CTTAGCCCTG AGTCCAAGCT AAAAGGAAAA
1321 GCTGCAATTG ATGGAGTAGG CTCTCGCGTT GGAAAGTCCG
1361 GAGGGTCGAT TGTTCATGGT GGACTACTGA TGCTCTTCGG
1401 CTCCGTTTCT CTCAGCGCAC CTTACGTCGG CTTGATCTTA
1441 CTCGCCGTTG TTTTCGGTTG GATTGGTGCA GCTCGTTCAC
1481 TCGGGAGACA ATTTAATCTC CTTACGACGC ATCATGAAAA
1521 ACTCGAGATT AACGAGGAGG CACAGCCCTC CGAAAAAAAG
1561 CCCTTACTTG AATCCGTTTA A
Un ejemplo de un transportador de nucleótidos trifosfato de Rickettsia prowazekii, se denomina RPTlc1, y tiene la siguiente secuencia SEQ ID NO:16
1 MSTSKSENYL SELRKIIWPI EQYENKKFLP LAFMMFCILL
41 NYSTLRSIKD GFVVTDIGTE SISFLKTYIV LPSAVIAMII
81 YVKLCDILKQ ENVFYVITSF FLGYFALFAF VLYPYPDLVH
121 PDHKTIESLS LAYPNFKWFI KIVGKWSFAS FYTIAELWGT
161 MMLSLLFWQF ANQITKIAEA KRFYSMFGLL ANLALPVTSV
201 VIGYFLHEKT QIVAEHLKFV PLFVIMITSS FLIILTYRWM
241 NKNVLTDPRL YDPALVKEKK TKAKLSFIES LKMIFTSKYV
281 GYIALLIIAY GVSVNLVEGV WKSKVKELYP TKEAYTIYMG
321 QFQFYQGWVA IAFMLIGSNI LRKVSWLTAA MITPLMMFIT
361 GAAFFSFIFF DSVIAMNLTG ILASSPLTLA VMIGMIQNVL
401 SKGVKYSLFD ATKNMAYIPL DKDLRVKGQA AVEVIGGRLG
441 KSGGAIIQST FFILFPVFGF IEATPYFASI FFIIVILWIF
481 AVKGLNKEYQ VLVNKNEK
Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos para la proteína RPTlc1 de Rickettsia prowazekii anterior se proporciona a continuación como el SEQ ID NO: 17
1 ATGAGTACTT CCAAAAGTGA AAATTATCTT TCAGAACTAA
41 GAAAGATAAT TTGGCCTATA GAACAATATG AAAATAAGAA
81 GTTTTTGCCA CTTGCATTTA TGATGTTCTG TATTTTATTA
121 AACTACTCAA CTCTTCGTTC AATTAAAGAC GGTTTTGTAG
161 TAACAGATAT AGGTACAGAA TCGATAAGTT TTTTAAAAAC
201 ATATATAGTA CTACCTTCTG CTGTAATTGC TATGATAATT
241 TATGTTAAGC TATGTGATAT TTTAAAGCAA GAAAACGTAT
281 TTTATGTTAT TACTTCATTT TTTTTAGGGT ATTTTGCATT
321 ATTTGCCTTT GTTCTTTACC CATATCCTGA TTTAGTCCAC
361 CCTGATCATA AAACTATAGA ATCTTTAAGT TTAGCTTATC
401 CTAATTTCAA ATGGTTTATA AAAATAGTTG GTAAATGGAG
441 TTTTGCATCT TTTTATACTA TTGCCGAGCT TTGGGGAACA
481 ATGATGCTTA GTTTATTATT TTGGCAATTT GCTAATCAAA
521 TTACTAAAAT CGCTGAAGCT AAACGTTTCT ACTCAATGTT
561 TGGTTTACTT GCGAATTTAG CATTGCCTGT AACATCAGTG
601 GTTATTGGAT ATTTTCTACA CGAAAAAACT CAAATAGTTG
641 CAGAACATTT AAAATTTGTA CCTTTATTTG TTATAATGAT
681 AACAAGTAGT TTCTTAATAA TATTAACATA TAGATGGATG
721 AATAAAAATG TTCTAACTGA TCCTAGACTA TATGATCCAG
761 CATTAGTAAA AGAAAAAAAA ACTAAAGCTA AATTGTCGTT
801 CATAGAAAGT TTAAAAATGA TCTTTACTTC GAAATATGTA
841 GGTTATATTG CATTATTAAT TATTGCTTAT GGTGTTTCAG
881 TAAATTTAGT TGAAGGTGTT TGGAAATCCA AAGTAAAAGA
921 ATTATATCCG ACAAAGGAGG CTTATACCAT ATATATGGGT
961 CAGTTCCAAT TTTATCAGGG TTGGGTTGCA ATTGCTTTTA
1001 TGCTGATAGG TAGTAATATT TTAAGAAAAG TATCATGGCT
1041 AACTGCAGCT ATGATCACTC CATTAATGAT GTTCATAACA
1081 GGTGCGGCAT TTTTTTCATT TATATTTTTT GATAGCGTTA
1121 TTGCAATGAA TTTAACCGGC ATCCTTGCTT CAAGTCCTTT
1161 AACACTTGCT GTTATGATCG GTATGATTCA AAATGTTTTA
1201 AGTAAAGGTG TGAAATATTC TTTATTTGAT GCAACTAAAA
1241 ATATGGCGTA TATTCCACTT GATAAGGATT TACGAGTCAA
1281 AGGGCAAGCT GCCGTTGAAG TTATCGGAGG AAGGCTCGGT
1321 AAATCAGGCG GTGCTATTAT TCAATCTACA TTCTTTATTT
1361 TATTTCCTGT ATTTGGTTTT ATAGAGGCGA CTCCTTATTT
1401 TGCTTCTATA TTCTTTATAA TAGTAATATT ATGGATATTT
1441 GCAGTTAAAG GTTTAAATAA AGAGTATCAA GTTTTGGTAA
1481 ATAAAAATGA AAAATAG
Otro ejemplo de un transportador de nucleótidos trifosfato de Rickettsia prowazekii, se denomina RPTlc2, y tiene la siguiente secuencia SEQ ID NO:18
1 MNIVDSNCTI WHKARNSKFR HIVWPIRSYE LTKFIPMTLL
41 MFFILLNQNL VRSIKDSFVV TLISSEVLSF IKLWGEMPMG
81 VLFVILYSKL CNIMTTEQVF RIITSTFLFF FAIFGFILFP
121 YKEFFHPNPE LINQYIIVLP HLKWFLIIWG QWSLVLFYIM
161 GELWPVIVFT LLYWQLANKI TKVEEAPRFY SFFTLFGQTN
201 LLFSGTVIIY FAKSEHFLLP LFAHLNDTNE ILLKSFITVI
241 LISGLICLAL HKLIDKSVVE ADKNIKFKNQ RTDILKLSLL
281 ESAKIILTSR YLGFICLLVM SYSMSINLIE GLWMSKVKQL
321 YPATKDFISY HGEVLFWTGV LTLVSAFLGS SLIRIYGWFW
361 GAIITPIMMF VAGVMFFSFT IFEQHLGNIV NTLGYSSPLV
401 IIVFIGGLWH VFAKSVKYSL FDATKEMVYI PLDNEIKTKG
441 KAAVDVMGAK IGKSIGAIIQ FISFSIFPNA VHNDIAGLLM
481 VTFIIVCILW LYGVKVLSQN YNKMIKR
Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos para la proteína RPTlc2 de Rickettsia prowazekii anterior se proporciona a continuación como el SEQ ID NO:19
1 ATGAATATAG TAGATTCTAA CTGTACAATT TGGCATAAAG
41 CAAGAAATAG TAAATTTAGG CATATAGTAT GGCCAATTAG
81 ATCGTATGAA TTAACAAAAT TCATCCCGAT GACTTTATTA
121 ATGTTTTTTA TTTTACTTAA TCAAAATTTA GTGCGTAGTA
161 TTAAAGATAG TTTTGTTGTT ACATTAATTA GTTCAGAAGT
201 ATTAAGTTTT ATAAAACTTT GGGGTGAAAT GCCGATGGGG
241 GTTTTATTTG TTATTCTTTA TTCTAAACTC TGTAATATTA
281 TGACCACAGA GCAAGTTTTT AGGATAATTA CCAGTACCTT
321 TTTATTTTTC TTTGCAATTT TTGGTTTTAT TTTATTCCCA
361 TACAAAGAGT TTTTTCATCC TAACCCTGAA TTAATTAATC
401 AATATATCAT TGTTCTGCCT CACTTAAAGT GGTTTTTAAT
441 AATTTGGGGA CAATGGAGTT TAGTATTATT TTATATAATG
481 GGTGAGTTAT GGCCTGTTAT AGTTTTTACT CTTTTATATT
521 GGCAGCTTGC AAATAAAATC ACCAAAGTCG AAGAAGCACC
561 AAGATTTTAC TCATTTTTTA CTTTATTTGG ACAAACTAAT
601 TTGCTCTTCT CAGGCACTGT AATTATTTAT TTTGCTAAGA
641 GCGAACATTT TTTATTACCT TTATTTGCTC ATTTAAATGA
681 CACAAATGAA ATTCTTTTAA AATCATTCAT CACAGTTATT
721 TTAATATCAG GATTAATTTG TTTAGCTCTC CATAAGCTAA
761 TTGATAAATC AGTTGTAGAA GCTGATAAAA ATATAAAATT
801 TAAAAACCAA AGAACAGATA TATTAAAATT AAGCTTGCTC
841 GAAAGTGCAA AAATAATCTT AACGTCTAGA TATCTTGGTT
881 TTATTTGTCT TCTCGTAATG TCTTATTCTA TGAGTATTAA
921 CCTAATAGAA GGATTGTGGA TGTCAAAAGT AAAACAACTC
961 TATCCTGCTA CAAAGGATTT TATATCATAT CACGGTGAAG
1001 TATTGTTTTG GACTGGAGTG TTAACTTTAG TTAGTGCATT
1041 TTTAGGCAGT AGTTTAATTA GAATTTATGG CTGGTTTTGG
1081 GGGGCTATTA TAACACCGAT TATGATGTTT GTAGCAGGGG
1121 TTATGTTTTT TTCATTCACA ATTTTTGAAC AACACTTAGG
1161 AAATATAGTA AATACTCTTG GCTATAGTTC TCCACTTGTC
1201 ATTATAGTTT TTATTGGTGG ACTTTGGCAT GTATTTGCTA
1241 AATCTGTAAA GTATTCCCTT TTCGATGCTA CTAAAGAAAT
1281 GGTGTATATT CCACTAGATA ATGAAATTAA GACTAAAGGT
1321 AAAGCAGCAG TTGATGTTAT GGGTGCTAAA ATTGGTAAGT
1361 CAATAGGTGC TATTATTCAA TTCATATCCT TTAGTATCTT
1401 TCCAAATGCT GTACATAACG ACATAGCAGG CTTATTGATG
1441 GTTACTTTTA TTATCGTATG TATATTATGG CTATATGGAG
1481 TGAAAGTTTT ATCACAAAAT TATAATAAAA TGATAAAACG
1501 TTAA
Otro ejemplo de un transportador de nucleótidos trifosfato de Rickettsia prowazekii, se denomina RPTlc3, y tiene la siguiente secuencia SEQ ID NO:20
i MLPPKIFFEK VKEIIWPIER KELKLFIPMA LMMLCILFNF
41 GALRSIKDSL VVPSMGAEII SFLKLWLVLP SCVIFTILYV
81 KLSNKLNFEY IFYSIVGTFL LFFLLFAYII YPNQDIYHPN
121 DAMINNLIAS YPNLKWFIKI GSKWSYALMY IFSELWSAVV
161 INLMFWQFAN HIFDTAKAKR FYPVLGMVGN IGLIIAGSVL
201 VFFSSGQYII DSELLTDSYN SSSNNSIMLQ PIISIIVTAG
241 IIAMFLFRII NKFILTNSIN VLDVKKVAAK TKTKLALIES
281 IKLI1HSKYI GRIALLIICY GLLINIVEGP WKAKIKELHP
321 NTVDYVNFMG MFNIWMGISC VTFMIIGSNI LRRLGWLISA
361 LLTPIMLSIT GFMFFIFIIF IEEIGTCFGD FNLLYVAIIV
401 GAIQNILSKS SKYSLFDSTK EMAYIPLSLE LRTKGKAAVE
441 VIGTKFGKSL GAFIQSLIFI IIPTATFDSI IIYLLVIFIV
481 MMNLWIWNII KLNKEYIKLC Q
Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos para la proteína RPTlc3 de Rickettsia prowazekii anterior se proporciona a continuación como el SEQ ID NO:21
1 ATGTTACCGC CTAAAATTTT CTTTGAAAAA GTTAAAGAAA
41 TAATTTGGCC TATAGAAAGG AAAGAATTAA AGCTATTTAT
81 ACCAATGGCT TTAATGATGT TATGTATCCT GTTTAATTTT
121 GGGGCTTTAA GATCTATTAA AGATAGTTTA GTAGTACCCT
161 CTATGGGGGC TGAAATTATT AGTTTCTTAA AATTATGGTT
201 AGTGCTACCC TCGTGCGTAA TTTTTACGAT ACTTTACGTT
241 AAACTTAGTA ATAAATTAAA TTTTGAATAT ATTTTCTATA
281 GTATAGTCGG TACTTTTTTA CTATTTTTCT TATTATTTGC
321 CTATATTATT TATCCAAATC AAGATATTTA TCATCCTAAT
361 GATGCAATGA TAAATAATTT AATTGCTTCA TACCCTAATT
401 TAAAGTGGTT TATTAAAATA GGTAGTAAAT GGAGTTATGC
441 GCTAATGTAT ATTTTCTCAG AATTATGGAG TGCAGTAGTT
481 ATAAACTTAA TGTTTTGGCA ATTTGCTAAT CACATTTTTG
521 ATACTGCTAA AGCTAAACGA TTTTATCCTG TTCTTGGGAT
561 GGTTGGTAAT ATCGGTCTTA TAATAGCAGG CAGCGTACTT
601 GTTTTTTTTT CAAGTGGGCA GTACATCATT GATTCAGAAT
641 TATTAACGGA TTCTTATAAT TCATCTTCTA ACAATTCTAT
681 CATGCTTCAG CCAATCATAT CAATTATTGT TACTGCAGGA
721 ATAATTGCTA TGTTTTTATT TAGAATAATA AATAAATTTA
761 TTTTAACTAA TTCTATAAAT GTTTTAGATG TAAAAAAAGT
801 TGCTGCTAAA ACAAAAACAA AACTTGCATT AATTGAAAGT
841 ATAAAATTAA TAATTCATTC AAAATATATA GGTCGTATTG
881 CATTATTAAT AATCTGTTAT GGATTACTAA TAAATATAGT
921 TGAAGGACCT TGGAAAGCGA AAATAAAAGA ATTACATCCA
961 AATACTGTAG ATTATGTTAA TTTTATGGGC ATGTTTAATA
1001 TTTGGATGGG GATCTCATGT GTTACTTTCA TGATAATAGG
1041 TAGTAATATT CTTAGAAGGC TTGGTTGGCT CATTTCTGCA
1081 TTATTAACTC CTATTATGTT ATCTATTACA GGCTTCATGT
1121 TTTTTATCTT TATAATTTTT ATTGAAGAAA TAGGTACATG
1161 TTTTGGTGAT TTTAATCTTC TATATGTAGC GATTATTGTC
1201 GGAGCAATTC AGAATATACT TAGTAAATCG TCTAAATATT
1241 CATTATTCGA TTCAACAAAA GAAATGGCAT ATATTCCTTT
1281 ATCTTTAGAA CTGAGAACTA AGGGAAAAGC CGCTGTAGAG
1321 GTAATAGGAA CGAAATTTGG TAAATCACTT GGAGCATTTA
1361 TCCAGTCTTT GATATTTATT ATTATTCCAA CGGCTACCTT
1401 TGATTCTATT ATAATATATT TACTAGTAAT TTTTATAGTG
1441 ATGATGAATT TATGGATTTG GAATATTATA AAATTAAATA
1481 AGGAATATAT AAAGCTGTGT CAATAA
Otro ejemplo de un transportador de nucleótidos trifosfato de Rickettsia prowazekii, se denomina RPTlc4, y tiene la siguiente secuencia SEQ ID NO:22
1 MTINASNIEN SFSKINSHFS KLTDYIWPIK RHEISKFLFI
41 TLLMFCILFI QNLIRALKDS IVTTMIGAET ISFLKFWGVM
81 PSAFLITVIY VKLVNRMKAE NIFYLIISIF LTFFALFAYV
121 IFPNHEMLHL RPVTVHNLTA SLPNLKWFIL LLSKWSFSLF
161 YIIAELWPNV VFALLFWQFV NNITTVEESK RFYPLFGLLS
201 QTGIYLAGHF LENLSNINYY VTNKFALQSS FHTLSIQIIL
241 TIVLILGIVS IKTFWLLNHK VLDKKHMALL RFKTKNKSIT
281 IAKSFQMILS SRHIRLIATL LICYGIAINL VEGPWKAAAT
321 KIYKTPTEYA AFIGSYLSYT GVFTIFFVLL GSNIVRRMGW
361 FTSAVITPSI VFITGILFFA VNNFEGFAGL IIANFILTDP
401 ALVAITIGAI QNVLSKSSKY TLFDSTKEMA YVPLEPEIKI
441 SGKAAADVIG TKLGKSGSAF LQSLIFIILP SASYQSISIC
481 LMIIFILTCV TWIWATKELN KEYKNSIKFS QK
Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos para la proteína RPTlc4 de Rickettsia prowazekii anterior se proporciona a continuación como el SEQ ID NO:23
1 ATGACGATTA ACGCCAGTAA TATAGAAAAT TCTTTTTCTA
41 AAATCAATAG CCATTTTTCT AAGCTTACAG ATTATATCTG
81 GCCTATAAAA CGCCACGAAA TTTCTAAGTT TTTATTCATT
121 ACATTATTAA TGTTCTGTAT TTTATTTATT CAAAATCTCA
161 TCAGAGCTTT AAAAGATAGT ATTGTTACTA CTATGATAGG
201 TGCTGAGACT ATATCATTTT TGAAATTTTG GGGCGTGATG
241 CCGTCAGCAT TCTTAATAAC TGTTATATAT GTTAAACTTG
281 TCAATAGGAT GAAAGCAGAA AATATATTTT ATCTTATTAT
321 ATCAATTTTT TTAACATTCT TTGCTTTGTT TGCATACGTT
361 ATTTTCCCAA ATCATGAAAT GCTGCATTTA AGGCCTGTAA
401 CCGTGCATAA TTTAACGGCA AGTTTACCGA ATTTAAAATG
441 GTTTATACTT CTTTTATCAA AATGGAGTTT TTCACTATTT
481 TATATAATAG CCGAATTATG GCCAAATGTA GTTTTTGCAT
521 TACTGTTTTG GCAGTTTGTG AATAATATTA CTACAGTAGA
561 AGAATCGAAA AGATTTTATC CATTATTTGG TTTACTTAGT
601 CAAACAGGTA TTTATTTAGC AGGACATTTT TTAGAAAATC
641 TAAGTAATAT AAATTATTAT GTCACTAATA AATTTGCATT
681 GCAATCGTCT TTTCATACAC TTTCTATACA AATTATACTA
721 ACTATAGTAT TAATTTTAGG CATAGTATCG ATAAAAACTT
761 TTTGGTTACT TAATCATAAA GTACTAGACA AAAAGCATAT
801 GGCATTACTC AGGTTCAAAA CAAAAAATAA ATCTATTACT
841 ATTGCTAAAA GTTTTCAGAT GATTCTATCG TCAAGACACA
881 TTAGATTAAT TGCAACTTTG CTTATCTGCT ATGGCATTGC
921 AATTAATTTA GTAGAAGGCC CTTGGAAAGC AGCAGCAACT
961 AAAATTTATA AAACTCCAAC CGAATATGCA GCTTTTATAG
1001 GAAGTTATTT AAGCTACACT GGAGTATTTA CTATTTTCTT
1041 TGTTCTACTT GGTTCCAATA TAGTTAGAAG AATGGGCTGG
1081 TTTACTTCAG CTGTGATCAC ACCTTCAATA GTTTTTATTA
1121 CCGGTATATT ATTTTTTGCT GTTAATAATT TTGAAGGCTT
1201 TGCTGGCTTA ATAATAGCAA ATTTTATTTT GACCGATCCT
1241 GCTTTAGTTG CTATAACAAT AGGTGCTATT CAAAATGTAC
1281 TTAGTAAATC AAGCAAATAT ACTTTATTTG ATTCTACAAA
1321 AGAAATGGCT TATGTTCCTT TAGAACCAGA AATCAAAATA
1361 AGTGGTAAGG CTGCTGCCGA CGTTATAGGT ACAAAACTCG
1401 GTAAATCCGG TAGTGCATTT TTACAATCAT TAATATTTAT
1441 AATATTACCT TCTGCTAGTT ATCAATCTAT TTCAATCTGT
1481 TTAATGATTA TATTTATCCT CACTTGCGTA ACTTGGATTT
1521 GGGCTACTAA AGAACTAAAT AAAGAATATA AAAATTCTAT
1561 TAAATTTTCT CAAAAATAA
Otro ejemplo de un transportador de nucleótidos trifosfato de Rickettsia prowazekii, se denomina RPTlc5, y tiene la siguiente secuencia SEQ ID NO:24
i MLSTSPSRSF KNKFRAAFWP VHNYELGKFI PISALMFCIL
41 FNQNILRILK DSILISEISA EIAGFAKVYC VTPVAALFVI
81 IYAKMINHLT FEKIFYYLSA FFISCFILFA FVIYPN1HIF
121 HVHPDTLSDW MNKYPHFKWY ISLVGNWGYI VYYSLAELWP
161 NIFYVLLFWQ FTNELTTTEE AKRFYTLFSL FGNSSLILVG
201 FLMMNLSSED TIIKKFISIS DSKITLVQVS TTIIAIVAII
241 CCLLVRFISK YIFTNPLFYH KTKSSRSTAQ RMGLIKSFKY
281 IVKSKYLWLL LICSAAFGFA INLVEAVWKA KIKELYPTVN
321 TYAEFNSLYI LWTGVAIIVM TilGNNVMRM HNWFVAAVIS
361 PVIIMVTGVL FFGLIVFDQQ ILSLFDGAIL MSPLALAVSI
401 GGIQNILAKG TKYSIWDTSR EMLYIPLDDE LKTKGKAAVD
441 VISAKVGKSS SGLVQSIIFT LVPNATFTSI SPILMVVFTF
481 VCFAWIYAVR KIYFEYQKIA
Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos para la proteína RPTlc5 de Rickettsia prowazekii anterior se proporciona a continuación como el SEQ ID NO:25
1 ATGCTAAGTA CCTCACCGTC ACGATCGTTT AAAAACAAAT
41 TTAGAGCAGC ATTTTGGCCT GTGCATAATT ATGAACTTGG
81 GAAATTTATT CCGATCAGCG CCTTAATGTT TTGTATTTTA
121 TTTAATCAAA ATATTTTGCG AATCTTAAAG GATAGTATTT
161 TAATCTCTGA GATTAGTGCA GAAATAGCAG GATTTGCTAA
201 AGTTTACTGC GTTACACCTG TAGCTGCTTT GTTTGTTATT
241 ATTTATGCTA AAATGATCAA TCATTTGACA TTTGAAAAAA
281 TCTTTTATTA TTTAAGTGCA TTTTTTATAA GCTGTTTTAT
321 TTTATTTGCC TTTGTGATTT ATCCTAATAT TCATATTTTT
361 CATGTACATC CTGATACACT ATCAGACTGG ATGAACAAAT
401 ATCCTCATTT TAAGTGGTAT ATCTCATTAG TAGGTAATTG
441 GGGTTATATA GTATATTATA GTCTTGCCGA GCTTTGGCCT
481 AATATTTTTT ACGTATTATT ATTTTGGCAG TTTACTAATG
521 AACTTACTAC TACCGAAGAA GCAAAAAGAT TTTATACTCT
561 CTTTTCGCTA TTCGGTAATT CTTCCTTAAT ATTAGTCGGC
601 TTTTTAATGA TGAATTTATC ATCGGAAGAT ACTATTATTA
641 AGAAATTTAT AAGTATTTCA GATAGTAAAA TCACTTTAGT
681 TCAAGTATCA ACGACGATTA TAGCAATTGT TGCAATCATT
721 TGTTGTTTGT TAGTTAGGTT TATTAGCAAG TACATTTTTA
761 CTAATCCATT ATTTTATCAT AAAACAAAAA GCAGTAGATC
801 AACTGCACAA CGGATGGGAC TAATTAAAAG CTTTAAATAT
841 ATTGTGAAAT CAAAATATTT ATGGCTACTT TTAATTTGTT
881 CTGCAGCTTT CGGATTTGCT ATAAACTTAG TCGAAGCAGT
921 ATGGAAAGCA AAAATTAAGG AATTATATCC GACTGTAAAT
961 ACCTACGCTG AATTCAATAG TCTGTATATA CTTTGGACAG
1001 GCGTTGCGAT AATTGTTATG ACAATTATCG GTAATAACGT
1041 CATGCGTATG CATAATTGGT TTGTAGCCGC AGTTATTTCC
1081 CCAGTGATAA TAATGGTGAC AGGTGTTTTG TTCTTTGGAC
1121 TAATTGTATT TGATCAACAA ATTTTATCAT TATTTGATGG
1161 CGCGATTTTA ATGTCACCTC TTGCACTTGC TGTTTCTATT
1201 GGCGGTATTC AGAATATTTT AGCCAAAGGC ACTAAATATT
1241 CTATATGGGA TACTTCAAGA GAAATGTTAT ATATACCACT
1281 TGATGATGAA CTTAAAACAA AGGGTAAAGC AGCAGTTGAT
1321 GTTATAAGTG CAAAAGTTGG AAAATCCTCT AGTGGTCTTG
1361 TACAATCCAT TATTTTTACT TTAGTGCCAA ATGCGACCTT
1401 TACCTCAATC TCGCCGATTT TAATGGTAGT ATTTACGTTC
1441 GTATGCTTTG CTTGGATTTA TGCAGTAAGA AAAATATATT
1481 TTGAATATCA AAAAATAGCC TGA
Los ejemplos de transportadores de nucleótidos trifosfato que se pueden emplear incluyen los de la Tabla 1 :
T l 1 - Tr n r r n l i rif f m l
Figure imgf000040_0001
continuación
Figure imgf000041_0001
Una secuencia de un plásmido pACS con una secuencia del gen PtNTT2 (pACS_PtNTT2) corresponde al SEQ ID NO:28.
Secuencia del plásmido pACS con la secuencia del gen PÍNTT2 en mayúsculas (SEQ ID NO:28 >pACS_PtNTT2: ggggaattgtgagcggataacaattcccctgtagaaataattttgtttaactttaataaggagatataccATGAGACCATTTCCG ACGATTGCCTTGATTTCGGTTTTTCTTTCGGCGGCGACTCGCATTTCGGCAACTTCCT CTCATCAAGCAAGTGCACTTCCTCTCAAAAAGGGAACGCATGTCCCGGACTCTCCG AAGTT GT C AA AGCT AT AT AT C AT GGC C AA AACC AAG AGT GT AT C CTCGTCCTTCG AC CCCCCTCGGGGAGGCAGTACTGTTGCACCAACTACACCGTTGGCAACCGGCGGTGC GCTCCGCAAAGTGCGACAAGCCGTCTTTCCCATCTACGGAAACCAAGAAGTCACCA AATTTCTGCTCATCGGATCCATTAAATTCTTTATAATCTTGGCACTCACGCTCACGCG TGATACCAAGGACACGTTGATTGTCACGCAATGTGGTGCCGAAGCGATTGCCTTTCT C A A A A T A T ACGGGGTGCT ACCCGCAGCGACCGCATTT ATCGCGCTCT ATTCC A A A A T GT CC AACGCC A T GGGC A A A A A A A T GCT A TTTTA TTC C A C TT GCATTCCTTT CTTT ACC TTTTTCG G G CTG TTTG ATG TTTTCATTTACCCG AACG CG G AG CG ACTG CACCCTAG TT TGGAAGCCGTGCAGGCAATTCTCCCGGGCGGTGCCGCATCTGGCGGCATGGCGGTT CTG G CCAAG ATTG CG ACACAC TG G AC ATC G G C C TTATTTTAC G TC ATG G C G G AAAT ATATTC TTC C G TATC G G TG G G G CTATTG TTTTG G CAG TTTG CG AACG ACG TCG TCAA CG TG G ATCAG G CCAAG CG CTTTTATCCATTATTTG CTCAAATG AG TG G CCTCG CTCC AG TTTTAG CG G G CCAG TATG TG G TACG G TTTG CCAG CAAAG CG G TCAACTTTG AG G C ATC C ATG CATCG ACTCACG G CG G CCG TAACATTTG CTG G TATTATG ATTTG CATCT TTT ACC AAC TC AG TTCG T C A T A TG T GGAGC G AAC G G AATC AGC AAAG C C AG C G G C A G A TA A C G A G C A G TC TA TC A A A C C G A A A A A G A A G A A A C C C A A A A TG TC C A TG G TTG AATC G G G G AAATTTCTCG CG TCAAG TCAG TACCTG CG TCTAATTG CCATG CTG G TG C TG G G A TA C G G C C TC AG TATTAAC TTTAC C G AAATC ATG TG G AAAAG C TTG G TG AAG A A A C A A TA TC C A G AC C C G C TAG ATTATC AAC G ATTTATG G G TAAC TTC TC G TC AG C G G TT GGTTT GAGC AC A T GC A T T GTT A T T T T CTTCGGTGT GC AC GT G ATC CGTTT GTT GG GGT G GAAAGTCGGAGCGTTGGCT ACACCT GGGAT CAT GGCC A T T CT AGCGTT ACCC TTTTTTGCTTGCATTTTGTTGGGTTTGGATAGTCCAGCACGATTGGAGATCGCCGTA
A T CTTT GGAAC A A T T C AG A G TTT GCT G AGC AA A A C C TC C A A G T A T GC CCTTTT CGAC C CT ACC AC AC A A A T GGCTTAT A T T CCTCT GG AC G AC G AAT C A A A G G TC A A A G G A A A AGC GGC A A T T G AT GTTTT GGGAT CGC G G ATT GGC A A G AG T GG AG G CT CACT GATCC AG CAG G G CTTG G TCTTTG TTTTTG G AAATATC ATTAATG C C G C AC C TG TAG TAG G G G TTGTCTACTACAGTG TCCTTG TTG CG TG G ATG AG CG CAG CTG G CCG ACTAAG TG G G C TTTTT C AAG C AC A A A C A G A A A T GG A T AAGGCC GAC A A A A T GG AGGC A A A G A C C A A CAAAGAAAAGTAGttaacctaggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttga ggggttttttgctgaaacctcaggcatttgagaagcacacggtcacactgcttccggtagtcaataaaccggtaaaccagcaatagacataa gcggctatttaacgaccctgccctgaaccgacgaccgggtcatcgtggccggatcttgcggcccctcggcttgaacgaattgttagacatta tttgccgactaccttggtgatctcgcctttcacgtagtggacaaattcttccaactgatctgcgcgcgaggccaagcgatcttcttcttgtccaa gataagcctgtctagcttcaagtatgacgggctgatactgggccggcaggcgctccattgcccagtcggcagcgacatccttcggcgcgat tttgccggttactgcgctgtaccaaatgcgggacaacgtaagcactacatttcgctcatcgccagcccagtcgggcggcgagttccatagc gttaaggtttcatttagcgcctcaaatagatcctgttcaggaaccggatcaaagagttcctccgccgctggacctaccaaggcaacgctatgt tctcttgcttttgtcagcaagatagccagatcaatgtcgatcgtggctggctcgaagatacctgcaagaatgtcattgcgctgccattctccaa attgcagttcgcgcttagctggataacgccacggaatgatgtcgtcgtgcacaacaatggtgacttctacagcgcggagaatctcgctctctc atgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaatagctagctcactcggtcgctacgctccgggcgtgagactgcggcgggc gctgcggacacatacaaagttacccacagattccgtggataagcaggggactaacatgtgaggcaaaacagcagggccgcgccggtgg cgtttttccataggctccgccctcctgccagagttcacataaacagacgcttttccggtgcatctgtgggagccgtgaggctcaaccatgaat ctgacagtacgggcgaaacccgacaggacttaaagatccccaccgtttccggcgggtcgctccctcttgcgctctcctgttccgaccctgc cgtttaccggatacctgttccgcctttctcccttacgggaagtgtggcgctttctcatagctcacacactggtatctcggctcggtgtaggtcgtt cgctccaagctgggctgtaagcaagaactccccgttcagcccgactgctgcgccttatccggtaactgttcacttgagtccaacccggaaa agcacggtaaaacgccactggcagcagccattggtaactgggagttcgcagaggatttgtttagctaaacacgcggttgctcttgaagtgtg cgccaaagtccggctacactggaaggacagatttggttgctgtgctctgcgaaagccagttaccacggttaagcagttccccaactgactta accttcgatcaaaccacctccccaggtggttttttcgtttacagggcaaaagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgat cttttctactgaaccgctctagatttcagtgcaatttatctcttcaaatgtagcacctgaagtcagccccatacgatataagttgtaattctcatgtt agtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagct aacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcgggg agaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgag agagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtct tcggtatcgtcgtatcccactaccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctga tcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcc cgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccg ctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatg ggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagt taatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccacc acgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgc caatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgt tttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttact ggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatct cgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaaattaatacgactcactata
En algunos casos desvelados en el presente documento, un transportador de nucleótidos trifosfato procede de bacterias, plantas o algas. En algunos casos, un transportador de nucleótidos trifosfato es TpNTTI, TpNTT2, TpNTT3, TpNTT4, TpNTT5, TpNTT6, TpNTT7, TpNTT8 (T. pseudonana), PtNTT1, PtNTT2, PtNTT3, PtNTT4, PtNTT5, PtNTT6 (P. tricornutum), Gs Nt T (Galdieria sulphuraria), AtNTT1, AtNTT2 (Arabidopsis thaliana), CtNTT1, CfNTT2 (Chlamydia trachomatis), PamNTT1, PamNTT2 (Protochlamydia amoebophila), CcNTT (Caedibacter caryophilus), PpNTT1 (Rickettsia prowazekii).
Como se usa en el presente documento, el término "transportador" se refiere a un gran grupo de proteínas transportadoras de membrana que transportan nucleótidos (y particularmente nucleótidos no naturales o modificados) a través de las membranas de las células y/o vesículas. Los transportadores de nucleósidos pueden abarcar, pero sin limitación, transportadores de nucleósidos equilibrados (ENT) y transportadores de nucleósidos concentrados (CNT). El término también abarca los transportadores de aniones orgánicos (OAT) y los transportadores de cationes orgánicos (OCT). El transportador de nucleósidos puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que comprende, pero sin limitación, CNT1, CNT2, CNT3, ENT1, ENT2, OAT1, OAT3 y OCT1.
El transportador de nucleótidos trifosfato (NTT) es como se define en las reivindicaciones. En el presente documento también se desvela un transportador de nucleótidos trifosfato que tiene al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 22 o 24, o fragmentos de las mismas. Un transportador de nucleótidos trifosfato también puede tener una o más sustituciones de aminoácidos, de modo que no sean idénticos a aquellos con cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 22 o 24.
Uno o más ácidos nucleicos pueden codificar uno o más transportadores de nucleótidos trifosfato que tienen al menos aproximadamente un 40, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 22 o 24. El uno o más ácidos nucleicos que codifican el uno o más transportadores de nucleótidos trifosfato también pueden tener una o más sustituciones de nucleótidos, de modo que no sean idénticos a aquellos con cualquiera de las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 22 o 24. A pesar de tales sustituciones de nucleótidos, los transportadores de nucleótidos trifosfato pueden codificar cualquiera de las proteínas transportadoras de nucleótidos trifosfato descritas en el presente documento.
Uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más transportadores de nucleótidos trifosfato pueden tener al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25 o 28. Los transportadores de nucleótidos trifosfato también pueden tener una o más sustituciones de nucleótidos, de modo que no sean idénticos a aquellos con cualquiera de las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23, 25 o 28. A pesar de tales sustituciones de nucleótidos, los transportadores de nucleótidos trifosfato pueden codificar cualquiera de las proteínas transportadoras de nucleótidos trifosfato descritas en el presente documento.
La invención incluye NTT que incorporan ácidos nucleicos no naturales a la célula. En algunas realizaciones, los NTT se pueden modificar de manera que el sitio de unión de nucleótidos del NTT se modifique para reducir la inhibición de la entrada estérica del ácido nucleico no natural en el sitio de unión de nucleótidos. En algunas realizaciones, los NTT se pueden modificar para proporcionar una mayor interacción con una o más características no naturales de los ácidos nucleicos no naturales. Dichos NTT se pueden expresar o genomanipular en células para incorporar de manera estable un UBP a las células. Por consiguiente, la divulgación incluye composiciones que incluyen un NTT heterólogo o recombinante y métodos de uso del mismo.
Los NTT se pueden modificar usando métodos pertenecientes a la ingeniería de proteínas. Por ejemplo, el modelado molecular se puede realizar basándose en estructuras cristalinas para identificar las ubicaciones de los NTT donde se pueden realizar mutaciones para modificar una actividad diana o un sitio de unión. Un residuo identificado como diana para el reemplazo se puede reemplazar por un residuo seleccionado usando modelado de minimización de energía, modelado de homología y/o sustituciones conservadoras de aminoácidos, tal como se describe en Bordo et al., J. Mol. Biol. 217: 721-729 (1991) y Hayes et al., Proc Natl Acad Sci, USA 99: 15926-15931 (2002).
Puede usarse cualquiera de diversos NTT en un método o composición expuesta en el presente documento incluyendo, por ejemplo, enzimas basadas en proteínas aisladas de sistemas biológicos y variantes funcionales de las mismas. Se entenderá que la referencia a un NTT particular, tal como los que se ilustran a continuación, incluye variantes funcionales del mismo a menos que se indique de otro modo. En algunas realizaciones, un NTT es un n Tt de tipo silvestre. En algunas realizaciones, un NTT es un NTT modificado o mutante.
También se pueden usar NTT con características para mejorar la entrada de ácidos nucleicos no naturales en las células y para coordinarse con nucleótidos no naturales en la región de unión de nucleótidos. En algunas realizaciones, un NTT modificado tiene un sitio de unión de nucleótidos modificado. En algunas realizaciones, un NTT modificado o de tipo silvestre tiene una especificidad relajada por un ácido nucleico no natural.
También se pueden usar polimerasas con características para mejorar la entrada de ácidos nucleicos no naturales en las regiones del sitio activo y para coordinarse con nucleótidos no naturales en la región del sitio activo. En algunas realizaciones, una polimerasa modificada tiene un sitio de unión de nucleótidos modificado.
En algunas realizaciones, un NTT modificado tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que es al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99.99 % de la especificidad del NTT de tipo silvestre hacia el ácido nucleico no natural. En algunas realizaciones, un NTT modificado o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende un azúcar modificado que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad del NTT de tipo silvestre hacia un ácido nucleico natural y/o el ácido nucleico no natural sin el azúcar modificado. En algunas realizaciones, un NTT modificado o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende una base modificada que es al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99.99 % de la especificidad del NTT de tipo silvestre hacia un ácido nucleico natural y/o el ácido nucleico no natural sin la base modificada. En algunas realizaciones, una polimerasa modificada o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende un trifosfato que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad del NTT de tipo silvestre hacia un ácido nucleico que comprende un trifosfato y/o el ácido nucleico no natural sin el trifosfato. Por ejemplo, un NTT modificado o de tipo silvestre puede tener una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende un trifosfato que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad del NTT de tipo silvestre hacia el ácido nucleico no natural con un difosfato o monofosfato, o sin fosfato, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, un NTT modificado o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural y una especificidad por un ácido nucleico natural que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad del NTT de tipo silvestre hacia el ácido nucleico natural. En algunas realizaciones, un NTT modificado o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende un azúcar modificado y una especificidad por un ácido nucleico natural que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad del NTT de tipo silvestre hacia el ácido nucleico natural. En algunas realizaciones, un NTT modificado o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende una base modificada y una especificidad por un ácido nucleico natural que es al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,99 % de la especificidad del NTT de tipo silvestre hacia el ácido nucleico natural.
Los NTT se pueden caracterizar según su velocidad de disociación de los ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, un NTT tiene una velocidad de disociación relativamente baja para uno o más ácidos nucleicos naturales y no naturales. En algunas realizaciones, un NTT tiene una velocidad de disociación relativamente alta para uno o más ácidos nucleicos naturales y no naturales. La velocidad de disociación es una actividad de un NTT que puede ajustarse para sintonizar las velocidades de reacción en los métodos expuestos en el presente documento.
Los NTT de fuentes nativas o variantes de los mismos se pueden cribar usando un ensayo que detecta la incorporación de un ácido nucleico no natural que tenga una estructura particular. Por ejemplo, los NTT se pueden cribar para determinar la capacidad de incorporar un ácido nucleico no natural o UBP; por ejemplo, (d)5SICSTP, (d)NaMTP, (d)TPT3TP, (d)TPT3TP-(d)NaMTP UBP o (d)5SICSTP-(d)NaMTP UBP. Puede usarse un NTT, por ejemplo, un NTT heterólogo, que muestra una propiedad modificada para el ácido nucleico no natural en comparación con el NTT de tipo silvestre. Por ejemplo, la propiedad modificada puede ser, por ejemplo, Km, kcat, Vmáx, la incorporación de NTT en presencia de un ácido nucleico no natural (o de un nucleótido de origen natural), la longitud de lectura promedio del molde por una célula con el NTT en presencia de un ácido nucleico no natural, la especificidad del NTT por un ácido nucleico no natural, la velocidad de unión de un ácido nucleico no natural o la velocidad de liberación del producto, o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la propiedad modificada es una reducción de Km para un ácido nucleico no natural y/o un aumento de kcat/Km o Vmáx/Km para un ácido nucleico no natural. De manera similar, el NTT tiene opcionalmente una mayor velocidad de unión de un ácido nucleico no natural, una mayor velocidad de liberación de producto y/o una mayor velocidad de incorporación de células, en comparación con un NTT de tipo silvestre.
Al mismo tiempo, un NTT puede incorporar ácidos nucleicos naturales, por ejemplo, A, C, G y T, a la célula. Por ejemplo, un NTT muestra opcionalmente una actividad de incorporación específica para un ácido nucleico natural que es al menos aproximadamente un 5 % tan alta (por ejemplo, 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 % o más), como en un NTT de tipo silvestre correspondiente. Opcionalmente, el NTT presenta una kcat/Km o Vmáx/Km para un nucleótido de origen natural que es al menos aproximadamente un 5 % tan alta (por ejemplo, aproximadamente un 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o un 100 % o más) como en el NTT de tipo silvestre.
Los NTT usados en el presente documento que pueden tener la capacidad de incorporar un ácido nucleico no natural de una estructura particular también se pueden producir usando un enfoque de evolución dirigida. Puede usarse un ensayo de síntesis de ácido nucleico para cribar variantes de NTT que tengan especificidad por cualquiera de diversos ácidos nucleicos no naturales. Por ejemplo, las variantes de NTT pueden cribarse para determinar la capacidad de incorporar un ácido nucleico no natural o UBP; por ejemplo, (d)5SICSTP, (d)NaMTP, (d)TPT3TP, (d)TPT3TP-(d)NaMTP UBP o (d)5SICSTP-(d)NaMTP UBP en ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, tal ensayo es un ensayo in vitro, por ejemplo, que usa una variante de NTT recombinante. En algunas realizaciones, tal ensayo es un ensayo in vivo, por ejemplo, que expresa una variante de NTT en una célula. Dichas técnicas de evolución dirigida se pueden usar para cribar variantes de cualquier NTT adecuado para la actividad hacia cualquiera de los ácidos nucleicos no naturales expuestos en el presente documento.
Actividad de la polimerasa
Una función particularmente útil de una polimerasa es catalizar la polimerización de una hebra de ácido nucleico usando como molde un ácido nucleico existente. Se describen otras funciones útiles en otras partes del presente documento. Los ejemplos de polimerasas útiles incluyen ADN polimerasas y ARN polimerasas.
La capacidad de mejorar la especificidad, la capacidad de procesamiento u otras características de los ácidos nucleicos no naturales de las polimerasas sería muy deseable en diversos contextos en los que, por ejemplo, se desea la incorporación de ácidos nucleicos no naturales, incluyendo la amplificación, secuenciación, marcado, detección, clonación de ADN y muchas otras. La presente divulgación proporciona polimerasas con propiedades modificadas para ácidos nucleicos no naturales, métodos para preparar dichas polimerasas, métodos para usar dichas polimerasas y muchas otras características que resultarán evidentes tras una revisión completa de lo siguiente.
La divulgación incluye polimerasas que incorporan ácidos nucleicos no naturales en una copia de molde en crecimiento, por ejemplo, durante la amplificación del ADN. En algunos casos, las polimerasas se pueden modificar de modo que el sitio activo de la polimerasa se modifique para reducir la inhibición de la entrada estérica del ácido nucleico no natural en el sitio activo. En algunos casos, las polimerasas se pueden modificar para proporcionar complementariedad con una o más características no naturales de los ácidos nucleicos no naturales. Dichas polimerasas se pueden expresar o genomanipular en células para incorporar de manera estable un UBP en las células. Por consiguiente, la divulgación incluye composiciones que incluyen una polimerasa heteróloga o recombinante y métodos de uso de la misma.
Las polimerasas se pueden modificar usando métodos pertenecientes a la ingeniería de proteínas. Por ejemplo, el modelado molecular se puede realizar basándose en estructuras cristalinas para identificar las ubicaciones de las polimerasas en las que se pueden realizar mutaciones para modificar una actividad diana. Un residuo identificado como diana para el reemplazo se puede reemplazar por un residuo seleccionado usando modelado de minimización de energía, modelado de homología y/o sustituciones conservadoras de aminoácidos, tal como se describe en Bordo et al., J. Mol. Biol. 217: 721-729 (1991) y Hayes et al., Proc Natl Acad Sci, USA 99: 15926-15931 (2002).
Puede usarse cualquiera de diversas polimerasas en un método o composición expuesta en el presente documento incluyendo, por ejemplo, enzimas basadas en proteínas aisladas de sistemas biológicos y variantes funcionales de las mismas. Se entenderá que la referencia a una polimerasa particular, tal como las que se ilustran a continuación, incluye variantes funcionales de la misma a menos que se indique de otro modo. En algunos casos, una polimerasa es una polimerasa de tipo silvestre. En algunos casos, una polimerasa es una polimerasa modificada o mutante.
También se pueden usar polimerasas con características para mejorar la entrada de ácidos nucleicos no naturales en las regiones del sitio activo y para coordinarse con nucleótidos no naturales en la región del sitio activo. En algunos casos, una polimerasa modificada tiene un sitio de unión de nucleótidos modificado.
En algunos casos, una polimerasa modificada tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que es al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,99 % de la especificidad de la polimerasa de tipo silvestre hacia el ácido nucleico no natural. En algunos casos, una polimerasa modificada o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende un azúcar modificado que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad de la polimerasa de tipo silvestre hacia un ácido nucleico no natural y/o el ácido nucleico no natural sin el azúcar modificado. En algunos casos, una polimerasa modificada o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende una base modificada que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad de la polimerasa de tipo silvestre hacia un ácido nucleico natural y/o el ácido nucleico no natural sin la base modificada. En algunos casos, una polimerasa modificada o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende un trifosfato que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad de la polimerasa de tipo silvestre hacia un ácido nucleico que comprende un trifosfato y/o el ácido nucleico no natural sin el trifosfato. Por ejemplo, una polimerasa modificada o de tipo silvestre puede tener una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende un trifosfato que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,99 % de la especificidad de la polimerasa de tipo silvestre hacia el ácido nucleico no natural con un difosfato o monofosfato, o sin fosfato, o una combinación de los mismos.
En algunos casos, una polimerasa modificada o de tipo silvestre tiene una especificidad relajada por un ácido nucleico no natural. En algunos casos, una polimerasa modificada o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural y una especificidad por un ácido nucleico natural que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad de la polimerasa de tipo silvestre hacia el ácido nucleico natural. En algunos casos, una polimerasa modificada o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende un azúcar modificado y una especificidad por un ácido nucleico natural que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad de la polimerasa de tipo silvestre hacia el ácido nucleico natural. En algunos casos, una polimerasa modificada o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende una base modificada y una especificidad por un ácido nucleico natural que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad de la polimerasa de tipo silvestre hacia el ácido nucleico natural.
La ausencia de actividad de exonucleasa puede ser una característica de tipo silvestre o una característica impartida por una variante o polimerasa genomanipulada. Por ejemplo, un fragmento exo minos Klenow es una versión mutada del fragmento Klenow que carece de actividad de exonucleasa de corrección de errores 3' a 5'.
El método de la divulgación puede usarse para expandir el rango de sustrato de cualquier ADN polimerasa que carezca de una actividad de corrección de errores de exonucleasa 3' a 5' intrínseca o donde se ha deshabilitado una actividad de corrección de errores de exonucleasa 3' a 5', por ejemplo, a través de mutación. Los ejemplos de ADN polimerasas incluyen polA, polB (véase, por ejemplo, Parrel & Loeb, Nat. Struc. Biol. 2001) polC, polD, polY, polX y transcriptasas inversas (RT) pero preferentemente son polimerasas procesivas de alta fidelidad (documento PCT/GB2004/004643). En algunos casos, una polimerasa modificada o de tipo silvestre carece sustancialmente de actividad de exonucleasa de corrección de errores 3' a 5'. En algunos casos, una polimerasa modificada o de tipo silvestre carece sustancialmente de actividad de exonucleasa de corrección de errores 3' a 5' para un ácido nucleico no natural. En algunos casos, una polimerasa modificada o de tipo silvestre tiene una actividad de exonucleasa de corrección de errores 3' a 5'. En algunos casos, una polimerasa modificada o de tipo silvestre tiene una actividad de exonucleasa de corrección de errores 3' a 5' para un ácido nucleico natural y carece sustancialmente de actividad de exonucleasa de corrección de errores 3' a 5' para un ácido nucleico no natural.
En algunos casos, una polimerasa modificada tiene una actividad de exonucleasa de corrección de errores 3' a 5' que es al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la actividad de exonucleasa de corrección de errores de la polimerasa de tipo silvestre. En algunos casos, una polimerasa modificada tiene una actividad de exonucleasa de corrección de errores 3' a 5' para un ácido nucleico no natural que es al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la actividad de exonucleasa de corrección de errores de la polimerasa de tipo silvestre con respecto a un ácido nucleico natural. En algunos casos, una polimerasa modificada tiene una actividad de exonucleasa de corrección de errores 3' a 5' para un ácido nucleico no natural y una actividad de exonucleasa de corrección de errores 3' a 5' para un ácido nucleico natural que es al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la actividad de exonucleasa de corrección de errores de la polimerasa de tipo silvestre con respecto a un ácido nucleico natural. En algunos casos, una polimerasa modificada tiene una actividad de exonucleasa de corrección de errores 3' a 5' para un ácido nucleico natural que es al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la actividad de exonucleasa de corrección de errores de la polimerasa de tipo silvestre con respecto al ácido nucleico natural.
En un aspecto relacionado, la divulgación proporciona métodos para fabricar una polimerasa modificada que incluyen modelar estructuralmente una polimerasa precursora, por ejemplo, una ADN polimerasa, identificar una o más características de estabilidad del complejo o interacción de nucleótidos que afectan a la estabilidad del complejo o el acceso o unión de nucleótidos en el sitio activo o una característica de complementariedad para un análogo de nucleótido en el sitio activo, y mutar la polimerasa precursora para incluir o eliminar estas características. Por ejemplo, la polimerasa se puede mutar para mejorar el acceso estérico del nucleótido no natural al sitio activo o para mejorar las interacciones carga-carga o hidrófobas entre el nucleótido no natural y la polimerasa. Los métodos también incluyen determinar si la polimerasa modificada resultante muestra un aumento de incorporación de un nucleótido o nucleótido no natural en una copia de ácidos nucleicos en crecimiento en comparación con la polimerasa precursora.
Las polimerasas se pueden caracterizar según su velocidad de disociación de los ácidos nucleicos. En algunos casos, una polimerasa tiene una velocidad de disociación relativamente baja para uno o más ácidos nucleicos naturales y no naturales. En algunos casos, una polimerasa tiene una velocidad de disociación relativamente alta para uno o más ácidos nucleicos naturales y no naturales. La velocidad de disociación es una actividad de una polimerasa que puede ajustarse para sintonizar las velocidades de reacción en los métodos expuestos en el presente documento.
Las polimerasas se pueden caracterizar según su fidelidad cuando se usan con un ácido nucleico natural y/o no natural particular o colecciones de ácido nucleico natural y/o no natural. La fidelidad generalmente se refiere a la precisión con la que una polimerasa incorpora los ácidos nucleicos correctos en una cadena de ácido nucleico en crecimiento al fabricar una copia de un molde de ácido nucleico. La fidelidad de la ADN polimerasa se puede medir como la relación de incorporaciones de ácidos nucleicos naturales y no naturales correctas con respecto a incorrectas cuando los ácidos nucleico naturales y no naturales están presentes, por ejemplo, a concentraciones equivalentes, para competir por la síntesis de la hebra en el mismo sitio en el complejo binario de ácido nucleico polimerasa-hebra-molde. La fidelidad de la ADN polimerasa se puede calcular como la relación de (kcat/Km) para el ácido nucleico natural y no natural y (kcat/Km) para el ácido nucleico natural y no natural incorrecto; donde kcat y Km son parámetros de Michaelis-Menten en la cinética enzimática en estado estacionario (Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism, 2a ed., pág. 350, W. H. Freeman & Co., Nueva York). En algunos casos, una polimerasa tiene un valor de fidelidad de al menos aproximadamente 100, 1000, 10.000, 100.000 o 1x106, con o sin actividad de corrección de errores.
Las polimerasas de fuentes nativas o variantes de las mismas se pueden cribar usando un ensayo que detecta la incorporación de un ácido nucleico no natural que tenga una estructura particular. En un ejemplo, las polimerasas se pueden cribar para determinar la capacidad de incorporar un ácido nucleico no natural o UBP; por ejemplo, (d)5SICSTP, (d)NaMTP, (d)TPT3TP, (d)TPT3TP-(d)NaMTP UBP o (d)5SICSTP-(d)NaMTP UBP. Puede usarse una polimerasa, por ejemplo, una polimerasa heteróloga, que muestra una propiedad modificada para el ácido nucleico no natural en comparación con la polimerasa de tipo silvestre. Por ejemplo, la propiedad modificada puede ser, por ejemplo, Km, kcat, Vmáx, la capacidad de procesamiento de polimerasa en presencia de un ácido nucleico no natural (o de un nucleótido de origen natural), la longitud de lectura promedio del molde por la polimerasa en presencia de un ácido nucleico no natural, la especificidad de la polimerasa por un ácido nucleico no natural, la velocidad de unión de un ácido nucleico no natural, la velocidad de liberación de producto (pirofosfato, trifosfato, etc.), la velocidad de ramificación o cualquier combinación de los mismos. En un caso, la propiedad modificada es una reducción de Km para un ácido nucleico no natural y/o un aumento de kcat/Km o Vmáx/Km para un ácido nucleico no natural. De manera similar, la polimerasa tiene opcionalmente una velocidad aumentada de unión de un ácido nucleico no natural, una velocidad aumentada de liberación de producto y/o una velocidad de ramificación disminuida, en comparación con una polimerasa de tipo silvestre.
Al mismo tiempo, una polimerasa puede incorporar ácidos nucleicos naturales, por ejemplo, A, C, G y T, en una copia de ácido nucleico en crecimiento. Por ejemplo, una polimerasa muestra opcionalmente una actividad específica para un ácido nucleico natural que es al menos aproximadamente un 5 % tan alta (por ejemplo, 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 % o más), como en una polimerasa de tipo silvestre correspondiente y una capacidad de procesamiento con ácidos naturales en presencia de un molde que es al menos un 5 % tan alta (por ejemplo, 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 % o más) como en la polimerasa de tipo silvestre en presencia del ácido nucleico natural. Opcionalmente, la polimerasa presenta una kcat/Km o Vmáx/Km para un nucleótido de origen natural que es al menos aproximadamente un 5% tan alta (por ejemplo, aproximadamente un 5%, 10%, 25%, 50%, 75% o 100% o más) como en la polimerasa de tipo silvestre.
Las polimerasas usadas en el presente documento que pueden tener la capacidad de incorporar un ácido nucleico no natural de una estructura particular también se pueden producir usando un enfoque de evolución dirigida. Puede usarse un ensayo de síntesis de ácido nucleico para cribar variantes de polimerasa que tengan especificidad por cualquiera de diversos ácidos nucleicos no naturales. Por ejemplo, las variantes de polimerasa se pueden cribar para determinar la capacidad de incorporar un ácido nucleico no natural o UBP; por ejemplo, (d)5SICSTP, (d)NaMTP, (d)TPT3TP, (d)TPT3TP-(d)NaMTP UBP o (d)5SICSTP-(d)NaMTP UBP en ácidos nucleicos. En algunos casos, tal ensayo es un ensayo in vitro, por ejemplo, que usa una variante de polimerasa recombinante. En algunos casos, tal ensayo es un ensayo in vivo, por ejemplo, que expresa una variante de polimerasa en una célula. Dichas técnicas de evolución dirigida se pueden usar para cribar variantes de cualquier polimerasa adecuada para la actividad hacia cualquiera de los ácidos nucleicos no naturales expuestos en el presente documento.
Las polimerasas modificadas de las composiciones descritas pueden ser opcionalmente una ADN polimerasa de tipo 029 modificada y/o recombinante. Opcionalmente, la polimerasa puede ser una polimerasa 029, B103, GA-1, PZA, 015, BS32, M2Y, Nf, G1, Cp-1, PRD1, PZE, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722 o L17 modificada o recombinante.
Las polimerasas de ácido nucleico generalmente útiles en la invención incluyen ADN polimerasas, ARN polimerasas, transcriptasas inversas y formas mutantes o alteradas de las mismas. Las ADN polimerasas y sus propiedades se describen en detalle en, entre otros lugares, DNA Replication 2a edición, Kornberg y Baker, W. H. Freeman, Nueva York, N. Y. (1991). Las ADN polimerasas convencionales conocidas útiles en la invención incluyen, pero sin limitación, ADN polimerasa de Pyrococcus furiosus (Pfu) (Lundberg et al., 1991, Gene, 108: 1, Stratagene), ADN polimerasa de Pyrococcus woesei (Pwo) (Hinnisdaels et al., 1996, Biotechniques, 20:186-8, Boehringer Mannheim), ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth) (Myers y Gelfand 1991, Biochemistry 30:7661), ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus (Stenesh y McGowan, 1977, Biochim Biophys Acta 475:32), ADN polimerasa de Thermococcus litoralis (Tli) (también denomianda ADN polimerasa Vent™, Cariello et al., 1991, Polynucleotides Res, 19: 4193, New England Biolabs), ADN polimerasa 9°Nm™ (New England Biolabs), fragmento Stoffel, Thermo Sequenase® (Amersham Pharmacia Biotech Reino Unido), Therminator™ (New England Biolabs), ADN polimerasa de Thermotoga marítima (Tma) (Diaz y Sabino, 1998 Braz J Med. Res, 31 :1239), ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) (Chien et al., 1976, J. Bacteoriol, 127: 1550), DNA polymerase, ADN polimerasa de Pyrococcus kodakaraensis KOD (Takagi et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:4504), ADN polimerasa JDF-3 (de thermococcus sp. JDF-3, solicitud de patente WO/0132887), ADN polimerasa de Pyrococcus GB-D (PGB-D) (también denominada A d N polimerasa Deep Vent™, Juncosa-Ginesta et al., 1994, Biotechniques, 16:820, New England Biolabs), ADN polimerasa UlTma (del termófilo Thermotoga marítima; Diaz y Sabino, 1998 Braz J. Med. Res, 31 :1239; PE Applied Biosystems), ADN polimerasa Tgo (de thermococcus gorgonarius, Roche Molecular Biochemicals), ADN polimerasa I de E. coli (Lecomte y Doubleday, 1983, Polynucleotides Res. 11 :7505), ADN polimerasa T7 (Nordstrom et al., 1981, J. Biol. Chem.
256:3112) y ADN polimerasa II DP1I/DP2 de arqueas (Cann et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14250). Se contemplan tanto polimerasas mesófilas como las polimerasas termófilas. Las ADN polimerasas termófilas incluyen, pero sin limitación, ThermoSequenase®, 9°Nm™, Therminator™, Taq, Tne, Tma, Pfu, Tfl, Tth, Tli, fragmento Stoffel, ADN polimerasa Vent™ y Deep Vent™, ADN polimerasa KOD, Tgo, JDF-3 y mutantes, variantes y derivados de las mismas. También se contempla una polimerasa que es un mutante deficiente en exonucleasa 3'. Las transcriptasas inversas útiles en la invención incluyen, pero sin limitación, transcriptasas inversas de VIH, HTLV-I, HTLV-II, FeLV, FIV, SIV, AMV, MMTV, MoMuLV y otros retrovirus (véanse Levin, Cell 88:5-8 (1997); Verma, Biochim Biophys Acta.
473:1-38 (1977); Wu et al., CRC Crit Rev Biochem. 3:289-347(1975)). Los ejemplos adicionales de polimerasas incluyen, pero sin limitación, ADN polimerasa 9°N, ADN polimerasa Taq, ADN polimerasa Phusion®, ADN polimerasa Pfu, ADN polimerasa RB69, KOD ADN polimerasa y ADN polimerasa VentR® (Gardner et al. (2004) "Comparative Kinetics of Nucleotide Analog Incorporation by Vent Dn A Polymerase, J. Biol. Chem., 279(12), 11834-11842; Gardner y Jack "Determinants of nucleotide sugar recognition in an archaeon DNA polymerase" Nucleic Acids Research, 27(12) 2545-2553). Las polimerasas aisladas de organismos no termófilos pueden ser inactivables por calor. Son ejemplos las ADN polimerasas de fagos. Se entenderá que las polimerasas de cualquiera de diversas fuentes pueden modificarse para aumentar o disminuir su tolerancia a condiciones de alta temperatura. En algunos casos, una polimerasa puede ser termófila. En algunos casos, una polimerasa termófila puede ser inactivable por calor. Las polimerasas termófilas son normalmente útiles para condiciones de alta temperatura o en condiciones de termociclado tales como las empleadas para las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Además, dichas polimerasas se pueden usar para aplicaciones de secuenciación y/o amplificación de ADN, incluyendo aplicaciones en tiempo real, por ejemplo, en el contexto de amplificación o secuenciación que incluyen la incorporación de residuos de ácidos nucleicos no naturales en el ADN por la polimerasa. En otros casos, el ácido nucleico no natural que se incorpora puede ser el mismo que un residuo natural, por ejemplo, cuando un marcador u otro resto del ácido nucleico no natural se elimina por la acción de la polimerasa durante la incorporación, o el ácido nucleico no natural puede tener una o más características que lo distinguen de un ácido nucleico natural.
Actividad de ribonucleótido reductasa
Una función particularmente útil de una ribonucleótido reductasa (RNR), también conocida como (ribonucleósido difosfato reductasa) es catalizar la formación de desoxirribonucleótidos a partir de ribonucleótidos. Los desoxirribonucleótidos pueden usarse entonces, por ejemplo, en la síntesis de polimerización de ADN de una hebra de ácido nucleico usando un ácido nucleico existente como molde. Se describen otras funciones útiles en otras partes del presente documento. Los sustratos naturales para una RNR pueden incluir ADP, GDP, CDP y UDP. La actividad natural cataliza la conversión de 2'-desoxirribonucleósido difosfato en ribonucleósido difosfato.
Los ejemplos de ribonucleótido reductasas útiles incluyen CDP reductasa; ribonucleósido difosfato reductasa; UDP reductasa; ADP reductasa; nucleósido difosfato reductasa; ribonucleósido 5'-difosfato reductasa; ribonucleótido difosfato reductasa; y 2'-desoxirribonucleósido-difosfato:tiorredoxina oxidada 2'-oxidorreductasa.
La capacidad de mejorar la especificidad, la capacidad de procesamiento u otras características de los ácidos nucleicos no naturales de las ribonucleótido reductasas sería muy deseable en diversos contextos en los que, por ejemplo, se desea la incorporación de ácidos nucleicos no naturales, incluyendo la amplificación, secuenciación, marcado, detección, clonación de ADN y muchas otras. La presente divulgación proporciona ribonucleótido reductasas con propiedades modificadas para ácidos nucleicos no naturales, métodos para fabricar dichas ribonucleótido reductasas, métodos para usar dichas ribonucleótido reductasas y muchas otras características que resultarán evidentes tras una revisión completa de lo siguiente.
La divulgación incluye ribonucleótido reductasas que catalizan la formación de desoxirribonucleótidos a partir de ribonucleótidos, por ejemplo, para su uso durante la síntesis o amplificación de ADN. En algunos casos, las ribonucleótido reductasas se pueden modificar de modo que el sitio activo de las ribonucleótido reductasas se modifique para reducir la inhibición de la entrada estérica del ácido nucleico no natural en el sitio activo. En algunos casos, las ribonucleótido reductasas se pueden modificar para proporcionar complementariedad con una o más características no naturales de un ácido nucleico no natural. En algunos casos, las ribonucleótido reductasas se pueden modificar para proporcionar complementariedad con una o más características naturales de un ácido nucleico no natural. Dichas ribonucleótido reductasas se pueden expresar o genomanipular en células para incorporar de manera estable un UBP en las células. Por consiguiente, la divulgación incluye composiciones que incluyen ribonucleótido reductasas heterólogas o recombinantes y métodos de uso de las mismas.
Las ribonucleótido reductasas se pueden modificar usando métodos pertenecientes a la ingeniería de proteínas. Por ejemplo, el modelado molecular se puede realizar basándose en estructuras cristalinas para identificar las ubicaciones de las ribonucleótido reductasas en las que se pueden realizar mutaciones para modificar una actividad diana. Un residuo identificado como diana para el reemplazo se puede reemplazar por un residuo seleccionado usando modelado de minimización de energía, modelado de homología y/o sustituciones conservadoras de aminoácidos, tal como se describe en Bordo et al., J Mol Biol 217: 721-729 (1991) y Hayes et al., Proc Natl Acad Sci, USA 99: 15926­ 15931 (2002).
Puede usarse cualquiera de diversos ribonucleótido reductasas en un método o composición expuesta en el presente documento incluyendo, por ejemplo, enzimas basadas en proteínas aisladas de sistemas biológicos y variantes funcionales de las mismas. Se entenderá que la referencia a una ribonucleótido reductasa particular, tal como las que se ilustran a continuación, incluye variantes funcionales de la misma a menos que se indique de otro modo. En algunos casos, una ribonucleótido reductasa es una polimerasa de tipo silvestre. En algunos casos, una ribonucleótido reductasa es una ribonucleótido reductasa modificada o mutante.
Ribonucleótido reductasas, con características para mejorar la conversión de ácidos nucleicos de desoxirribonucleótidos trifosfato naturales y/o no naturales en ribonucleótidos trifosfato naturales y/o no naturales. También se pueden usar ribonucleótido reductasas, con características para coordinarse con nucleótidos no naturales en la región del sitio activo. En algunos casos, una ribonucleótido reductasa modificada tiene un sitio de unión de nucleótidos modificado. En algunos casos, una ribonucleótido reductasa modificada o de tipo silvestre tiene una especificidad relajada por un ácido nucleico no natural.
En algunos casos, una ribonucleótido reductasa modificada tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad de la ribonucleótido reductasa de tipo silvestre hacia el ácido nucleico no natural. En algunos casos, una ribonucleótido reductasa modificada o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende un azúcar modificado que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad de la ribonucleótido reductasa de tipo silvestre hacia un ácido nucleico natural y/o el ácido nucleico no natural sin el azúcar modificado. En algunos casos, una ribonucleótido reductasa modificada o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende una base modificada que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad de la ribonucleótido reductasa de tipo silvestre hacia un ácido nucleico natural y/o el ácido nucleico no natural sin la base modificada. En algunos casos, una ribonucleótido reductasa modificada o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende un trifosfato que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad de la ribonucleótido reductasa de tipo silvestre hacia un ácido nucleico que comprende un trifosfato y/o el ácido nucleico no natural sin el trifosfato. Por ejemplo, una ribonucleótido reductasa modificada o de tipo silvestre puede tener una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende un trifosfato que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad de la ribonucleótido reductasa de tipo silvestre hacia el ácido nucleico no natural con un difosfato o monofosfato, o sin fosfato, o una combinación de los mismos
En algunos casos, una ribonucleótido reductasa modificada o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural y una especificidad por un ácido nucleico natural que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad de la ribonucleótido reductasa de tipo silvestre hacia el ácido nucleico natural. En algunos casos, una ribonucleótido reductasa modificada o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende un azúcar modificada y una especificidad por un ácido nucleico natural que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad de la ribonucleótido reductasa de tipo silvestre hacia el ácido nucleico natural. En algunos casos, una ribonucleótido reductasa modificada o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende una base modificada y una especificidad por un ácido nucleico natural que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,99 % de la especificidad de la ribonucleótido reductasa de tipo silvestre hacia el ácido nucleico natural. En algunos casos, una ribonucleótido reductasa modificada o de tipo silvestre tiene una especificidad por un ácido nucleico no natural que comprende un trifosfato y una especificidad por un ácido nucleico natural que comprende un trifosfato que es al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,99 % de la especificidad de la ribonucleótido reductasa de tipo silvestre hacia el trifosfato de ácido nucleico natural.
En un aspecto relacionado, la divulgación proporciona métodos para fabricar una ribonucleótido reductasa modificada que incluyen modelar estructuralmente una ribonucleótido reductasa precursora, por ejemplo, una ribonucleótido reductasa de ADN, identificar una o más características de estabilidad del complejo o interacción de nucleótidos que afectan a la estabilidad del complejo o el acceso o unión de nucleótidos en el sitio activo o una característica de complementariedad para un análogo de nucleótido en el sitio activo, y mutar la ribonucleótido reductasa precursora para incluir o eliminar estas características. Por ejemplo, la ribonucleótido reductasa se puede mutar para mejorar el acceso estérico del nucleótido no natural al sitio activo o para mejorar las interacciones carga-carga o hidrófobas entre el nucleótido no natural y la ribonucleótido reductasa. Los métodos también incluyen determinar si la ribonucleótido reductasa modificada resultante muestra un aumento de incorporación de un nucleótido o nucleótido no natural en una copia de ácidos nucleicos en crecimiento en comparación con la ribonucleótido reductasa precursora.
Las ribonucleótido reductasas se pueden caracterizar según su velocidad de disociación de los ácidos nucleicos. En algunos casos, una ribonucleótido reductasa tiene una velocidad de disociación relativamente baja para uno o más ácidos nucleicos naturales y no naturales. En algunos casos, una ribonucleótido reductasa tiene una velocidad de disociación relativamente alta para uno o más ácidos nucleicos naturales y no naturales. La velocidad de disociación es una actividad de una ribonucleótido reductasa que puede ajustarse para sintonizar las velocidades de reacción en los métodos expuestos en el presente documento.
Las ribonucleótido reductasas de fuentes nativas o variantes de las mismas se pueden cribar usando un ensayo que detecta la incorporación de un ácido nucleico no natural que tenga una estructura particular. En un ejemplo, las ribonucleótido reductasas se pueden cribar para determinar la capacidad de incorporar un ácido nucleico no natural o UBP; por ejemplo, (d)5SICSTP. (d)NaMTP. (d)TPT3TP. íd)TPT3TP-íd)NaMTP UBP o íd)5SICSTP-íd)NaMTP UBP. Puede usarse una ribonucleótido reductasa, por ejemplo, una ribonucleótido reductasa heteróloga, que muestra una propiedad modificada para el ácido nucleico no natural en comparación con la ribonucleótido reductasa de tipo silvestre. Por ejemplo, la propiedad modificada puede ser, por ejemplo, Km, kcat, Vmáx, la capacidad de procesamiento de ribonucleótido reductasa en presencia de un ácido nucleico no natural (o de un nucleótido de origen natural), la velocidad de renovación de la ribonucleótido reductasa en presencia de un ácido nucleico no natural, la especificidad de la ribonucleótido reductasa por un ácido nucleico no natural, la velocidad de unión de un ácido nucleico no natural, la velocidad del producto (pirofosfato, trifosfato, etc.), o cualquier combinación de los mismos. En un caso, la propiedad modificada es una reducción de Km para un ácido nucleico no natural y/o un aumento de kcat/Km o Vmáx/Km para un ácido nucleico no natural. De manera similar, la ribonucleótido reductasa tiene opcionalmente una velocidad aumentada de unión de un ácido nucleico no natural y/o una velocidad aumentada de liberación de producto, en comparación con una ribonucleótido reductasa de tipo silvestre.
Al mismo tiempo, una ribonucleótido reductasa puede procesar ácidos desoxirribonucleicos naturales, por ejemplo, dA, dC y dG, en ácidos desoxirribonucleicos naturales. Por ejemplo, una ribonucleótido reductasa muestra opcionalmente una actividad específica para un ácido nucleico natural que es al menos aproximadamente un 5 % tan alta (por ejemplo, 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 % o más), como en una ribonucleótido reductasa de tipo silvestre correspondiente y una kcat que es al menos 5 % tal como (por ejemplo, 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 % o más) como en la ribonucleótido reductasa de tipo silvestre en presencia del ácido nucleico natural. Opcionalmente, la ribonucleótido reductasa presenta una kcat/Km o Vmáx/Km para un nucleótido de origen natural que es al menos aproximadamente un 5 % tan alta (por ejemplo, aproximadamente un 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o 100 % o más) como en la ribonucleótido reductasa de tipo silvestre.
Las ribonucleótido reductasas usadas en el presente documento que pueden tener la capacidad de incorporar un ácido nucleico no natural de una estructura particular también se pueden producir usando un enfoque de evolución dirigida. Puede usarse un ensayo de síntesis de ácido nucleico para cribar variantes de ribonucleótido reductasa que tengan especificidad por cualquiera de diversos ácidos nucleicos no naturales. Por ejemplo, las variantes de ribonucleótido reductasa se pueden cribar para determinar la capacidad de incorporar un ácido nucleico no natural o UBP; por ejemplo, (d)5SICSTP, (d)NaMTP, (d)TPT3TP, (d)TPT3TP-(d)NaMTP UBP o (d)5SICSTP-(d)NaMTP UBP en ácidos nucleicos. En algunos casos, tal ensayo es un ensayo in vitro, por ejemplo, que usa una variante de ribonucleótido reductasa recombinante. En algunos casos, tal ensayo es un ensayo in vivo, por ejemplo, que expresa una variante de ribonucleótido reductasa en una célula. Dichas técnicas de evolución dirigida se pueden usar para cribar variantes de cualquier ribonucleótido reductasa adecuada para la actividad hacia cualquiera de los ácidos nucleicos no naturales expuestos en el presente documento.
CÉLULAS GENOMANIPULADAS
Los métodos y composiciones (por ejemplo, ácidos nucleicos y reactivos) descritos en el presente documento se pueden usar para generar microorganismos genomanipulados, por ejemplo, una célula viva que incorpora y replica al menos un nucleótido no natural o al menos un UBP dentro de su entorno celular. La célula empleada puede transformarse genéticamente con un casete de expresión que codifica una proteína heteróloga, por ejemplo, un transportador de nucleótidos trifosfato capaz de transportar nucleótidos trifosfato no naturales a la célula y/o una polimerasa con alta fidelidad por un ácido nucleico no natural, de modo que los nucleótidos no naturales pueden incorporarse en ácidos nucleicos celulares y pueden, por ejemplo, formar UBP en condiciones in vivo. Las células pueden comprender una actividad mejorada para la captación de ácidos nucleicos no naturales. Las células pueden comprender una actividad mejorada para la incorporación de ácidos nucleicos no naturales. Las células pueden comprender una actividad de polimerasa mejorada para ácidos nucleicos no naturales.
Por consiguiente, mediante la práctica de un método de la divulgación, se genera una célula viva que incorpora dentro de sus ácidos nucleicos al menos un nucleótido no natural y/o al menos un UBP. El UBP puede incluir un par de nucleótidos con emparejamiento de bases entre sí no naturales capaces de formar el UBP en condiciones in vivo, cuando los nucleótidos con emparejamiento de bases entre sí no naturales, como sus respectivos trifosfatos, se incorporan a la célula por la acción de un transportador de nucleótidos trifosfato. La célula puede transformarse genéticamente mediante un casete de expresión que codifica un transportador de nucleótidos trifosfato de modo que el transportador de nucleótidos trifosfato se exprese y esté disponible para transportar los nucleótidos no naturales a la célula. La célula puede transformarse genéticamente mediante un casete de expresión que codifica una polimerasa de modo que la polimerasa se exprese y esté disponible para incorporar nucleótidos no naturales en los ácidos nucleicos de la célula. La célula puede ser una célula procariota o eucariota. El par de nucleótidos con emparejamiento de bases entre sí no naturales, como sus respectivos trifosfatos, puede ser un trifosfato de (d)5SICS ((d)5SICSTP) y un trifosfato de (d)NaM ((d)NaMTP). El par de nucleótidos con emparejamiento de bases entre sí no naturales, como sus respectivos trifosfatos, puede ser un trifosfato de (d)TPT3 ((d]TPT3TP) y un trifosfato de (d)NaM ((d)NaMTP).
La célula puede comprender un UBP molde. Un UBP molde puede ser un UBP presente en un ácido nucleico dentro de la célula que comprende un primer y un segundo ácido nucleico molde no natural. Los ácidos nucleicos molde no naturales pueden emparejarse por bases con los ácidos nucleicos no naturales incorporados. Por ejemplo, un ácido nucleico incorporado puede formar un UBP mediante el emparejamiento de bases con un ácido nucleico molde no natural presente en la célula. En algunas realizaciones, el UBP molde está formado fuera de la célula. En algunas realizaciones, el UBP molde se introduce en la célula, tal como por transfección, electroporación o similares.
Las células pueden ser células transformadas genéticamente con un ácido nucleico, por ejemplo, un casete de expresión que codifica un transportador de nucleótidos trifosfato capaz de transportar dichos nucleótidos no naturales al interior de la célula. Una célula puede comprender un transportador de nucleótidos trifosfato heterólogo, donde el transportador de nucleótidos trifosfato heterólogo puede transportar nucleótidos trifosfato naturales y no naturales a la célula. Una célula puede comprender una polimerasa heteróloga, donde la polimerasa heteróloga tiene actividad para un ácido nucleico no natural.
Un método también puede incluir poner en contacto una célula transformada genéticamente con las respectivas formas trifosfato de nucleótidos no naturales, en presencia de fosfato de potasio y/o un inhibidor de fosfatasas o nucleotidasas. Durante o después de dicho contacto, la célula puede ponerse en un medio de soporte vital adecuado para el crecimiento y la replicación de la célula. La célula puede mantenerse en el medio de soporte vital de modo que las respectivas formas trifosfato de nucleótidos no naturales se incorporen en los ácidos nucleicos dentro de las células y a través de al menos un ciclo de replicación de la célula. El par de nucleótidos con emparejamiento de bases entre sí no naturales como un trifosfato respectivo, puede comprender un trifosfato de (d)5SlCS ((dJSSJCSTP) y un trifosfato de (d)NaM ((d)NaMTP). El par de nucleótidos con emparejamiento de bases entre sí no naturales como un trifosfato respectivo, puede comprender un trifosfato de (d)TPT3 ((d)TPT3TP) y un trifosfato de (d)NaM ((d)NaMTP). La célula puede ser E. coli, y el (d)5SICSTP y (d)NaMTP o (d)TPT3TP y (d)NaMTP pueden incorporarse eficientemente a E. coli mediante, por ejemplo, el transportador PfNTT2, en el que una polimerasa de E. coli, tal como Pol I, puede usar eficientemente los trifosfatos no naturales para replicar el ADN, incorporando así nucleótidos no naturales y/o UBP en ácidos nucleicos celulares dentro del entorno celular.
Mediante la práctica de un método de la divulgación, el experto en la materia puede obtener una población de células vivas y en propagación que tenga al menos un nucleótido no natural y/o al menos un UBP dentro de al menos un ácido nucleico mantenido dentro de al menos al menos algunas de las células individuales, en la que el al menos un ácido nucleico se propaga de manera estable dentro de la célula, y en la que la célula expresa un transportador de nucleótidos trifosfato adecuado para proporcionar captación celular de formas trifosfato de uno o más nucleótidos no naturales cuando se pone en contacto con (por ejemplo, cultivado en presencia de) el nucleótido o nucleótidos no naturales en un medio de soporte vital adecuado para el crecimiento y la replicación del organismo.
Después del transporte a la célula por el transportador de nucleótidos trifosfato, los nucleótidos de emparejamiento de bases no naturales se incorporan a los ácidos nucleicos dentro de la célula mediante maquinaria celular, por ejemplo, las ADN y/o ARN polimerasas de la propia célula, una polimerasa heteróloga o un polimerasa que se ha desarrollado usando evolución dirigida (Chen y Romesberg, FEBS Lett. (2014) 588(2):219-29). Los nucleótidos no naturales pueden incorporarse en ácidos nucleicos celulares tales como ADN genómico, ARN genómico, ARNm, ARN estructural, microARN y ácidos nucleicos de replicación autónoma (por ejemplo, plásmidos, virus o vectores).
Las células genomanipuladas se pueden generar mediante la introducción de ácidos nucleicos, por ejemplo, ácidos nucleicos heterólogos, en las células. Cualquier célula descrita en el presente documento puede ser una célula huésped y puede comprender un vector de expresión. En el presente documento se desvela que la célula huésped es una célula procariota. En el presente documento también se desvela que la célula huésped es E. coli. En algunas realizaciones, una célula comprende uno o más polinucleótidos heterólogos. Los reactivos de ácido nucleico se pueden introducir en microorganismos usando diversas técnicas. Los ejemplos no limitantes de métodos usados para introducir ácidos nucleicos heterólogos en diversos organismos incluyen; transformación, transfección, transducción, electroporación, transformación mediada por ultrasonidos, bombardeo de partículas y similares. En algunos casos, la adición de moléculas portadoras (por ejemplo, compuestos de bis-bencimdazolilo, por ejemplo, véase la Patente de EE.UU. N.° 5.595.899) puede aumentar la captación de ADN en las células, aunque normalmente es difícil de transformar mediante métodos convencionales. Los métodos convencionales de transformación están fácilmente disponibles para el experto y se pueden encontrar en Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning: a Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
La transformación genética se puede obtener usando la transferencia directa de un casete de expresión, en, pero sin limitación, plásmidos, vectores víricos, ácidos nucleicos virales, ácidos nucleicos de fagos, fagos, cósmidos y cromosomas artificiales, o a través de la transferencia de material genético en las células o portadores tales como liposomas catiónicos. Dichos métodos están disponibles en la materia y se adaptan fácilmente para su uso en el método descrito en el presente documento. Los vectores de transferencia pueden ser cualquier construcción de nucleótidos usada para entregar genes a las células (por ejemplo, un plásmido), o como parte de una estrategia general para entregar genes, por ejemplo, como parte de un retrovirus o adenovirus recombinante (Ram et al. Cancer Res. 53:83-88, (1993)). Se describen medios apropiados para la transfección, incluyendo vectores virales, transfectantes químicos o métodos físico-mecánicos, tales como electroporación y difusión directa de ADN, en, por ejemplo, Wolff et al., Science, 247, 1465-1468, (1990); y Wolff, Nature, 352, 815-818, (1991).
Por ejemplo, un transportador de nucleótidos trifosfato o una molécula de ácido nucleico de polimerasa, un casete de expresión y/o un vector se pueden introducir en una célula mediante cualquier método incluyendo, pero sin limitación, transformación mediada por calcio, electroporación, microinyección, lipofección, bombardeo de partículas y similares.
Una célula puede comprender nucleótidos trifosfato no naturales incorporados en uno o más ácidos nucleicos dentro de la célula. Por ejemplo, la célula puede ser una célula viva capaz de incorporar al menos un nucleótido no natural dentro del ADN o ARN mantenido dentro de la célula. La célula también puede incorporar al menos un UBP que comprende un par de nucleótidos con emparejamiento de bases entre sí no naturales en ácidos nucleicos dentro de la célula en condiciones in vivo, en la que los nucleótidos con emparejamiento de bases entre sí no naturales, por ejemplo, sus respectivos trifosfatos, se incorporan al célula por la acción de un transportador de nucleótidos trifosfato, cuyo gen está presente (por ejemplo, se introdujo) en la célula por transformación genética. Por ejemplo, tras la incorporación en el ácido nucleico mantenido dentro de una célula, (d)5SICS y (d)NaM pueden formar un UBP estable que puede propagarse de manera estable por la maquinaria de replicación del ADN de un organismo, por ejemplo, cuando se cultiva en un medio de soporte vital que comprende (d)5SICS y (d)NaM. Por ejemplo, tras la incorporación en el ácido nucleico mantenido dentro de una célula, (d)TPT3 y (d)NaM pueden formar un UBP estable que puede propagarse de manera estable por la maquinaria de replicación del ADN de un organismo, por ejemplo, cuando se cultiva en un medio de soporte vital que comprende (d)TPT3 y (d)NaM.
Las células pueden ser capaces de replicar un ácido nucleico no natural. En el presente documento se desvela un método para generar una célula viva con ácidos nucleicos que incorporan y/o replican al menos un nucleótido no natural y/o al menos un UBP que comprende un par de nucleótidos con emparejamiento de bases entre sí no naturales, en los ácidos nucleicos de la célula en condiciones in vivo. Dichos métodos pueden incluir transformar genéticamente la célula con un casete de expresión que codifica un transportador de nucleótidos trifosfato capaz de transportar a la célula, como un trifosfato respectivo, uno o más nucleótidos no naturales en condiciones in vivo. Como alternativa, se puede emplear una célula que se haya transformado genéticamente previamente con un casete de expresión que pueda expresar un transportador de nucleótidos trifosfato codificado. El método también puede incluir poner en contacto o exponer la célula genéticamente transformada al fosfato de potasio y las respectivas formas de trifosfato de al menos un nucleótido no natural (por ejemplo, dos nucleótidos con emparejamiento de bases entre sí capaces de formar el UBP) en un medio de soporte vital adecuado para el crecimiento y la replicación de la célula, y mantener la célula transformada en el medio de soporte vital en presencia de las formas respectivas de trifosfato de al menos un nucleótido no natural (por ejemplo, dos nucleótidos con emparejamiento de bases entre sí capaces de formar el UBP) en condiciones in vivo, a través de al menos un ciclo de replicación de la célula.
Las células pueden comprender un ácido nucleico no natural propagado de manera estable. En el presente documento se desvela una población de células vivas y en propagación, que comprende dentro de los ácidos nucleicos de al menos algunas de las células individuales de la población al menos un nucleótido no natural (por ejemplo, dos nucleótidos con emparejamiento de bases entre sí capaces de formar el UBP) o al menos un UBP, como un componente propagado de manera estable del ADN de la célula, en la que la célula se transforma genéticamente con un transportador de nucleótidos trifosfato adecuado para proporcionar la captación celular de formas trifosfato del par de nucleótidos no naturales. La población de células puede cultivarse en presencia de las formas trifosfato respectivas del par de nucleótidos no naturales, en un medio de soporte vital adecuado para el crecimiento y la replicación del organismo.
Una célula puede comprender un ácido nucleico no natural incorporado de manera estable. Algunas realizaciones comprenden una célula (por ejemplo, como E. coli) que incorpora de manera estable nucleótidos distintos de A, G, T y C dentro de los ácidos nucleicos mantenidos dentro de la célula. Por ejemplo, los nucleótidos distintos de A, G, T y C pueden ser (d)5SICS, (d)TPT3 y (d)NaM, que tras su incorporación a los ácidos nucleicos de la célula, pueden formar un UBP estable dentro de los ácidos nucleicos. En un aspecto, los nucleótidos no naturales y los UBP se pueden propagar de manera estable por el aparato de replicación del organismo, cuando un organismo transformado con el gen del transportador de trifosfato, se cultiva en un medio de soporte vital que incluye fosfato de potasio y las formas trifosfato de (d)5SICS, (d)TPT3 y (d)NaM.
Una célula puede comprender un alfabeto genético expandido. Una célula puede comprender un ácido nucleico no natural incorporado de manera estable. En algunas realizaciones, una célula con un alfabeto genético expandido comprende un ácido nucleico no natural que puede formar un par de bases (pb) con otro ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico natural o no natural. En algunas realizaciones, una célula con un alfabeto genético expandido comprende un ácido nucleico no natural que está unido por hidrógeno a otro ácido nucleico. En algunas realizaciones, una célula con un alfabeto genético expandido comprende un ácido nucleico no natural que no está unido por hidrógeno a otro ácido nucleico con el que está emparejado por bases. En algunas realizaciones, una célula con un alfabeto genético expandido comprende un ácido nucleico no natural que se empareja por bases con otro ácido nucleico mediante interacciones hidrófobas. En algunas realizaciones, una célula con un alfabeto genético expandido comprende un ácido nucleico no natural que se empareja por bases con otro ácido nucleico a través de interacciones sin enlaces de hidrógeno. Una célula con un alfabeto genético expandido puede ser una célula que puede copiar un ácido nucleico homólogo para formar un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico no natural. Una célula con un alfabeto genético expandido puede ser una célula que comprende una base de ácido nucleico no natural emparejada con otro ácido nucleico no natural (UBP).
Las células pueden formar UBP a partir de los nucleótidos no naturales incorporados en condiciones in vivo. En algunas realizaciones, el fosfato de potasio y/o los inhibidores de las actividades de fosfatasa y/o nucleotidasa pueden facilitar el transporte de ácidos nucleicos no naturales. Los métodos incluyen el uso de una célula que expresa un transportador de nucleótidos trifosfato heterólogo. Cuando una célula de este tipo se pone en contacto con uno o más nucleótidos trifosfato, los nucleótidos trifosfato se transportan a la célula. La célula puede estar en presencia de fosfato de potasio y/o inhibidores de fosfatasa y nucleotidasa. Los nucleótidos trifosfato no naturales se pueden incorporar a los ácidos nucleicos dentro de la célula mediante la maquinaria natural de la célula y, por ejemplo, se pueden emparejar por bases entre sí para formar los UBP dentro de los ácidos nucleicos de la célula.
En algunas realizaciones, se puede incorporar un UBP en una célula o población de células cuando se expone a trifosfatos no naturales. En algunas realizaciones, un UBP puede incorporarse en una célula o población de células cuando se expone de manera sustancialmente consistente a trifosfatos no naturales. En algunas realizaciones, la replicación de un UBP no da como resultado una tasa de crecimiento sustancialmente reducida. En algunas realizaciones, la expresión de replicación de una proteína heteróloga, por ejemplo, un transporte de nucleótidos trifosfato no da como resultado una tasa de crecimiento sustancialmente reducida.
En algunas realizaciones, la inducción de la expresión de un gen heterólogo, por ejemplo, un NTT, en una célula puede dar como resultado un crecimiento celular más lento y una mayor captación de ácido nucleico natural y/o no natural en comparación con el crecimiento y la captación de una célula sin inducción de expresión del gen heterólogo. En algunas realizaciones, la inducción de la expresión de un gen heterólogo, por ejemplo, un NTT, en una célula puede dar como resultado un mayor crecimiento celular y una mayor captación de ácido nucleico natural y/o no natural en comparación con el crecimiento y la captación de una célula sin inducción de expresión del gen heterólogo.
En algunas realizaciones, la inducción de la expresión de un gen heterólogo, por ejemplo, un NTT, en una célula tratada con una primera concentración de un reactivo de inducción puede dar como resultado un crecimiento celular más lento y una mayor captación de ácido nucleico natural y/o no natural en comparación con el crecimiento y la captación de una célula sin inducción de expresión del gen heterólogo. En algunas realizaciones, la inducción de la expresión de un gen heterólogo, por ejemplo, un NTT, puede dar como resultado un mayor crecimiento celular y una mayor captación de ácido nucleico natural y/o no natural en comparación con el crecimiento y la captación de una célula tratada con una primera concentración de un reactivo de inducción.
En algunas realizaciones, se incorpora un UBP durante una fase de crecimiento logarítmico. En algunas realizaciones, se incorpora un UBP durante una fase de crecimiento no logarítmico. En algunas realizaciones, se incorpora un UBP durante una fase de crecimiento sustancialmente lineal. En algunas realizaciones, un UBP se incorpora de manera estable en una célula o población de células después del crecimiento durante un período de tiempo. Por ejemplo, un UBP puede incorporarse de manera estable en una célula o población de células después del crecimiento durante al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 o 50 o más duplicaciones. Por ejemplo, un UBP puede incorporarse de manera estable en una célula o población de células después del crecimiento durante al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas de crecimiento. Por ejemplo, un UBP puede incorporarse de manera estable en una célula o población de células después del crecimiento durante al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 días de crecimiento. Por ejemplo, un UBP puede incorporarse de manera estable en una célula o población de células después del crecimiento durante al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses de crecimiento. Por ejemplo, un UBP puede incorporarse de manera estable en una célula o población de células después del crecimiento durante al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 50 años de crecimiento.
En algunas realizaciones, un UBP no se reconoce eficazmente por las rutas de reparación del ADN de una célula. En algunas realizaciones, un UBP no se elimina eficazmente por una célula. En algunas realizaciones, un UBP no se escinde eficazmente por una célula. En algunas realizaciones, un UBP no se elimina eficazmente de una célula o población de células después de un período de tiempo. Por ejemplo, un UBP no se puede eliminar eficazmente de una célula o población de células después del crecimiento durante al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 o 50 o más duplicaciones. Por ejemplo, un UBP no se puede eliminar eficazmente de una célula o población de células después del crecimiento durante al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas de crecimiento. Por ejemplo, un UBP no se puede eliminar eficazmente de una célula o población de células después del crecimiento durante al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 días de crecimiento. Por ejemplo, un UBP no se puede eliminar eficazmente de una célula o población de células después del crecimiento durante al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses de crecimiento. Por ejemplo, un UBP no se puede eliminar eficazmente de una célula o población de células después del crecimiento durante al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 50 años de crecimiento.
Por lo tanto, se puede generar un organismo que albergue de manera estable un alfabeto genético expandido.
Tipos de células
Se pueden usar muchos tipos de células/microorganismos, por ejemplo, para transformación o genomanipulación. La invención proporciona un microorganismo procariota genomanipulado que es Escherichia coli, como se expone en las reivindicaciones. También se desvelan células que pueden ser procariotas o eucariotas. Por ejemplo, la célula puede ser un microorganismo tal como una célula bacteriana, una célula fúngica, una levadura o un protozoo unicelular. Como alternativa, la célula puede ser una célula eucariota, tal como una célula animal, vegetal o humana cultivada. La célula puede estar presente en un organismo tal como una planta o un animal.
En algunos casos, un microorganismo genomanipulado es un organismo unicelular, a menudo capaz de dividirse y proliferar. Un microorganismo puede incluir una o más de las siguientes características: aerobio, anaerobio, filamentoso, no filamentoso, monoploide, dipoide, auxótrofo y/o no auxótrofo. En determinados casos, un microorganismo genomanipulado es un microorganismo procariota (por ejemplo, una bacteria) y, en determinados casos, un microorganismo genomanipulado es un microorganismo no procariota. En algunos casos, un microorganismo genomanipulado es un microorganismo eucariota (por ejemplo, levadura, hongos, amebas). En algunos casos, un microorganismo genomanipulado es un hongo. En algunos casos, un organismo genomanipulado es la levadura.
Se puede seleccionar cualquier levadura adecuada como microorganismo huésped, microorganismo genomanipulado, organismo modificado genéticamente o fuente de un polinucleótido heterólogo o modificado. Las levaduras incluyen, pero sin limitación, levadura Yarrowia (por ejemplo, Y. lipolytica (anteriormente clasificada como Candida lipolytica)), levadura Candida (por ejemplo, C. revkaufi, C. viswanathii, C. pulcherrima, C. tropicalis, C. utilis), levadura Rhodotorula (por ejemplo, R. glutinus, R. graminis), levadura Rhodosporidium (por ejemplo, R. toruloides), levadura Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae, S. bayanus, S. pastorianus, S. carlsbergensis), levadura Cryptococcus, levadura Trichosporon (por ejemplo, T. pullans, T. cutaneum), levadura Pichia (por ejemplo, P. pastoris) y levadura Lipomyces (por ejemplo, L. starkeyii, L. lipoferus). En algunos casos, una levadura adecuada es del género Arachniotus, Aspergillus, Aureobasidium, Auxarthron, Blastomyces, Candida, Chrysosporuim, Chrysosporuim Debaryomyces, Coccidiodes, Cryptococcus, Gymnoascus, Hansenula, Histoplasma, Issatchenkia, Kluyveromyces, Lipomyces, Lssatchenkia, Microsporum, Myxotrichum, Myxozyma, Oidiodendron, Pachysolen, Penicillium, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Rhodotorula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Scopulariopsis, Sepedonium, Trichosporon o Yarrowia. En algunos casos, una levadura adecuada es de la especie Arachniotus flavoluteus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aureobasidium pullulans, Auxarthron thaxteri, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida famata, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lambica, Candida lipolytica, Candida lustitaniae, Candida parapsilosis, Candida pulcherrima, Candida revkaufi, Candida rugosa, Candida tropicalis, Candida utilis, Candida viswanathii, Candida xestobii, Chrysosporuim keratinophilum, Coccidiodes immitis, Cryptococcus albidus var. diffluens, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neofomans, Debaryomyces hansenii, Gymnoascus dugwayensis, Hansenula anomala, Histoplasma capsulatum, Issatchenkia occidentalis, Isstachenkia orientalis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces thermotolerans, Kluyveromyces waltii, Lipomyces lipoferus, Lipomyces starkeyii, Microsporum gypseum, Myxotrichum deflexum, Oidiodendron echinulatum, Pachysolen tannophilis, Penicillium notatum, Pichia anomala, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinus, Rhodotorula graminis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Scopulariopsis acremonium, Sepedonium chrysospermum, Trichosporon cutaneum, Trichosporon pullans, Yarrowia lipolytica o Yarrowia lipolytica (anteriormente clasificada como Candida lipolytica). En algunos casos, una levadura es una cepa de Y. lipolytica que incluye, pero sin limitación, las cepas At Cc 20362, ATCC8862, ATCC18944, ATCC20228, ATCC76982 y LGAM S(7)1 (Papanikolaou S. y Aggelis G., Bioresour. Technol. 82(1):43-9 (2002)). En determinados casos, una levadura es una levadura de la especie Candida (es decir, Candida spp.). Puede usarse cualquier especie Candida adecuada y/o modificarse genéticamente para la producción de un ácido dicarboxílico graso (por ejemplo, ácido octanodioico, ácido decanodioico, ácido dodecanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido hexadecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido eicosanodioico). En algunos casos, las especies Candida adecuadas incluyen, pero sin limitación, Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida famata, Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lambica, Candida lipolytica, Candida lustitaniae, Candida parapsilosis, Candida pulcherrima, Candida revkaufi, Candida rugosa, Candida tropicalis, Candida utilis, Candida viswanathii, Candida xestobii y cualquier otra levadura de Candida spp. descrita en el presente documento. Los ejemplos no limitantes de cepas de Candida spp. incluyen, pero sin limitación, las cepas sAA001 (ATCC20336), sAA002 (ATCC20913), sAA003 (ATCC20962), sAA496 (US2012/0077252), sAA106 (US2012/0077252), SU-2 (ura3-/ura3-), H5343 (beta oxidación bloqueada; Patente de EE.UU. N.° 5648247). Se puede utilizar cualquier cepa adecuada de levadura de Candida spp. como cepas precursoras para modificación genética.
Los géneros, especies y cepas de levadura están a menudo tan estrechamente relacionados en contenido genético que pueden ser difíciles de distinguir, clasificar y/o nombrar. En algunos casos, las cepas de C. lipolytica e Y. lipolytica pueden ser difíciles de distinguir, clasificar y/o nombrar y, en algunos casos, pueden considerarse el mismo organismo. En algunos casos, diversas cepas de C.tropicalis y C.viswanathii pueden ser difíciles de distinguir, clasificar y/o nombrar (por ejemplo, véase Arie et al., J. Gen. Appl.Microbiol., 46, 257-262 (2000). Algunas cepas de C. tropicalis y C.viswanathii obtenidas de la ATCC, así como de otras fuentes comerciales o académicas, pueden considerarse equivalentes e igualmente adecuadas para los casos descritos en el presente documento. En algunos casos, se considera que algunas cepas precursoras de C.tropicalis y C. viswanathii difieren solo en el nombre.
Se puede seleccionar cualquier hongo adecuado como microorganismo huésped, microorganismo genomanipulado o fuente de un polinucleótido heterólogo. Los ejemplos no limitantes de hongos incluyen, pero sin limitación, hongos Aspergillus (por ejemplo, A. parasiticus, A. nidulans), hongos Thraustochytrium, hongos Schizochytrium y hongos Rhizopus (por ejemplo, R. arrhizus, R. oryzae, R. nigricans). En algunos casos, un hongo es una cepa de A. parasiticus que incluye, pero sin limitación, la cepa ATCC24690 y, en determinados casos, un hongo es una cepa de A. nidulans que incluye, pero sin limitación, la cepa ATCC38163.
Se puede seleccionar cualquier procariota adecuado como microorganismo huésped, microorganismo genomanipulado o fuente de un polinucleótido heterólogo. Se pueden seleccionar bacterias gramnegativas o grampositivas. Los ejemplos de bacterias incluyen, pero sin limitación, bacterias Bacillus (por ejemplo, B. subtilis, B. megaterium), bacterias Acinetobacter, bacterias Norcardia, bacterias Xanthobacter, bacterias Escherichia (por ejemplo, E. coli (por ejemplo, las cepas DH10B, Stbl2, DH5-alfa, DB3, DB3.1), DB4, DB5, JDP682 y ccdA-over (por ejemplo, la Solicitud de Ee .UU. N.° 09/518.188))), bacterias Streptomyces, bacterias Erwinia, bacterias Klebsiella, bacterias Serratia (por ejemplo, S. marcessans), bacterias Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa), bacterias Salmonella (por ejemplo, S. typhimurium, S. typhi), bacterias Megasphaera (por ejemplo, Megasphaera elsdenii). Las bacterias también incluyen, pero sin limitación, bacterias fotosintéticas (por ejemplo, bacterias verdes no de azufre (por ejemplo, bacterias Choroflexus (por ejemplo, C. aurantiacus), bacterias Chloronema (por ejemplo, C. gigateum)), bacterias verdes del azufre (por ejemplo, bacterias Chlorobium (por ejemplo, C. limicola), bacterias Pelodictyon (por ejemplo, P. luteolum), bacterias púrpuras del azufre (por ejemplo, bacterias Chromatium (por ejemplo, C. okenii)) y bacterias púrpuras no del azufre (por ejemplo, bacterias Rhodospirillum (por ejemplo, R. rubrum), bacterias Rhodobacter (por ejemplo, R. sphaeroides, R. capsulatus), y bacterias Rhodomicrobium (por ejemplo, R. vanellii).
Se pueden utilizar células de organismos no microbianos como microorganismo huésped, microorganismo genomanipulado o fuente de un polinucleótido heterólogo en el que esta no es una realización de la invención. Los ejemplos de dichas células incluyen, pero sin limitación, células de insecto (por ejemplo, Drosophila (por ejemplo, D. melanogaster), Spodoptera (por ejemplo, células Sf9 o Sf21 de S. frugiperda) y Trichoplusa (por ejemplo, células High-Five); células de nematodo (por ejemplo, células de C. elegans); células de ave; células de anfibio (por ejemplo, células de Xenopus laevis); células de reptil; células de mamífero (por ejemplo, células NIH3T3, 293, CHO, COS, VERO, C127, BHK, Per-C6, de melanoma de Bowes y HeLa); y células vegetales (por ejemplo, Arabidopsis thaliana, Nicotania tabacum, Cuphea acinifolia, Cuphea aequipetala, Cuphea angustifolia, Cuphea appendiculata, Cuphea avigera, Cuphea avigera var. pulcherrima, Cuphea axilliflora, Cuphea bahiensis, Cuphea baillonis, Cuphea brachypoda, Cuphea bustamanta, Cuphea calcarata, Cuphea calophylla, Cuphea calophylla subsp. mesostemon, Cuphea carthagenensis, Cuphea circaeoides, Cuphea confertiflora, Cuphea cordata, Cuphea crassiflora, Cuphea cyanea, Cuphea decandra, Cuphea denticulata, Cuphea disperma, Cuphea epilobiifolia, Cuphea ericoides, Cupheaflava, Cuphea flavisetula, Cuphea fuchsiifolia, Cuphea gaumeri, Cuphea glutinosa, Cuphea heterophylla, Cuphea hookeriana, Cuphea hyssopifolia (brezo mexicano), Cuphea hyssopoides, Cuphea ignea, Cuphea ingrata, Cuphea jorullensis, Cuphea lanceolata, Cuphea linarioides, Cuphea llavea, Cuphea lophostoma, Cuphea lutea, Cuphea lutescens, Cuphea melanium, Cuphea melvilla, Cuphea micrantha, Cuphea micropetala, Cuphea mimuloides, Cuphea nitidula, Cuphea palustris, Cuphea parsonsia, Cuphea pascuorum, Cuphea paucipetala, Cuphea procumbens, Cuphea pseudosilene, Cuphea pseudovaccinium, Cuphea pulchra, Cuphea racemosa, Cuphea repens, Cuphea salicifolia, Cuphea salvadorensis, Cuphea schumannii, Cuphea sessiliflora, Cuphea sessilifolia, Cuphea setosa, Cuphea spectabilis, Cuphea spermacoce, Cuphea splendida, Cuphea splendida var. viridiflava, Cuphea strigulosa, Cuphea subuligera, Cuphea teleandra, Cuphea thymoides, Cuphea tolucana, Cuphea urens, Cuphea utriculosa, Cuphea viscosissima, Cuphea watsoniana, Cuphea wrightii y Cuphea lanceolata).
Los microorganismos o células usados como organismos huésped o fuente de un polinucleótido heterólogo están disponibles comercialmente. Los microorganismos y células que se describen en el presente documento, y otros microorganismos y células adecuados están disponibles, por ejemplo, en Invitrogen Corporation, (Carlsbad, CA), la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, Virginia) y la Agricultural Research Culture Collection (NRRL; Peoria, Illinois). Los microorganismos huésped y los microorganismos genomanipulados pueden proporcionarse en cualquier forma adecuada. Por ejemplo, dichos microorganismos pueden proporcionarse en cultivo líquido o cultivo sólido (por ejemplo, medio a base de agar), que puede ser un cultivo primario o se puede haber pasado (por ejemplo, diluido y cultivado) una o más veces. Los microorganismos también pueden proporcionarse en forma congelada o seca (por ejemplo, liofilizados). Los microorganismos se pueden proporcionar a cualquier concentración adecuada.
Estabilización de ácidos nucleicos para la incorporación celular
Se ha descubierto que el transporte activo a través de un transportador de nucleótidos trifosfato es óptimo cuando los nucleótidos trifosfato no naturales transportados son suficientemente estables, por ejemplo, estables en medios de cultivo. La caracterización preliminar de ácidos nucleicos no naturales, por ejemplo, d5SICSTP y dNaMTP, indicó que se degradan en presencia de E. coli en crecimiento activo (figura 6B). Se observó un comportamiento similar con [a-32P]-dATP, y los productos de desfosforilación detectados por cromatografía de capa fina para [a-32P]-dATP o por HPLC y MALDI para d5SICSTP y dNaMTP (figura 6A), sugirieron que la descomposición estaba mediada por fosfatasas. Se observó una degradación mínima o negligente en el medio gastado, lo que sugiere que la descomposición puede tener lugar dentro del periplasma. No se observó ninguna mejora en la estabilidad en cultivos de mutantes de deleción de un solo gen de BW25113 de E. coli que carecen de una fosfatasa periplásmica específica (según lo identificado por la presencia de una secuencia líder del extremo N de tipo Sec), incluyendo phoA, ushA, appA, aphA, yjjX, surE, yfbR, yjjG, yfaO, mutT, nagD, yggV, yrfG o ymjB, lo que sugiere que la descomposición puede tener lugar como resultado de la actividad de múltiples fosfatasas.
Las células que expresan el transportador de nucleótidos trifosfato se pueden modificar de diversas formas diferentes para facilitar la incorporación de nucleótidos trifosfato y/o mejorar la estabilidad de los nucleótidos trifosfato. Por ejemplo, las células pueden modificarse mediante deleción o alteración, por ejemplo, mutación, de uno o más genes que codifican una fosfatasa o una nucleotidasa. Dichas modificaciones pueden aumentar la estabilidad de los nucleótidos trifosfato que pueden ser incorporados por el transportador de nucleótidos trifosfato. Las células pueden modificarse mediante la deleción de uno o más genes que codifican fosfatasas tales como una nucleotidasa 5' o 3'.
Una nucleotidasa es una enzima hidrolítica que cataliza la hidrólisis de un nucleótido en un nucleósido y un fosfato. Por ejemplo, convierte el adenosina monofosfato en adenosina y la guanosina monofosfato en guanosina. La nucleotidasa que se modifica o se elimina de la célula puede ser una 5'-nucleotidasa (tal como EC 3.1.3.5) o una 3'-nucleotidasa (tal como EC 3.1.3.6). En algunas realizaciones, puede ser más útil modificar o eliminar un gen que codifica una 5'-nucleotidasa para mejorar la estabilidad de los nucleótidos trifosfato que pueden ser incorporados por el transportador de nucleótidos trifosfato.
Las células también pueden modificarse mediante la deleción de uno o más genes que codifican una 5'-nucleotidasa (acceso de ENZYME: EC 3.1.3.5), tal como uno o más genes en la Tabla 2.
Tabla 2 - 5'-Nucleotidasas
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Las células también pueden modificarse mediante la deleción de uno o más genes que codifican una 3'-nucleotidasa, tales como uno o más genes en la Tabla 3.
Tabla 3 - 3'-Nucleotidasas
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Una célula que expresa un transportador de nucleótidos trifosfato se puede modificar para reducir o eliminar la actividad de una o más fosfatasas. Las células también se pueden modificar mediante la deleción de uno o más genes que codifican fosfatasas tales como fosfatasa alcalina. Otros ejemplos de genes que pueden modificarse para tener pérdida de función incluyen phoA, ushA, appA, aphA, yjjX, surE, yfbR, yjjG, yfaO, mutT, nagD, yggV, yrfG, ymfB o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, las células tienen mutaciones de pérdida de función en más de un gen de fosfatasa.
Las células también pueden modificarse mediante la deleción de uno o más genes que codifican una actividad de polinucleótido fosfatasa. Las células también se pueden modificar mediante la deleción de uno o más genes que codifican una actividad de nucleótidos fosfatasa, actuando sobre nucleótidos libres. Las células también pueden modificarse mediante la deleción de uno o más genes que codifican una nucleótido trifosfatasa (NTPasas), apirasa; ATP-difosfatasa; adenosina difosfatasa; ADPasa; ATP difosfohidrolasa, o cualquier combinación de las mismas, tales como uno o más genes en la Tabla 4.
Tabla 4 - Polinucleótidos fosfatasa
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Las células también pueden modificarse mediante la deleción de uno o más genes que codifican una nucleósido difosfato fosfatasa; nucleósido-difosfatasa; tiaminpirofosfatasa; UDPasa; inosina difosfatasa; adenosina difosfatasa; IDPasa; ADPasa; adenosinpirofosfatasa; guanosina difosfatasa; guanosina 5'-difosfatasa; inosina 5'-difosfatasa; uridina difosfatasa; uridina 5'-difosfatasa; nucleósido difosfatasa de tipo B; GDPasa; CDPasa; nucleósido 5'-difosfatasa; nucleósido difosfatasa de tipo L; NDPasa; nucleósido difosfato fosfohidrolasa o cualquier combinación de las mismas, tales como uno o más de los genes enumerados en la Tabla 5.
Tabla 5 - Nucleósido difosfato fosfatasas
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Se descubrió que la estabilidad extracelular de los ácidos nucleicos naturales, por ejemplo, dATP, aumentaba significativamente en presencia de fosfato de potasio (KPi) en el medio de crecimiento. KPi inhibió significativamente la desfosforilación de trifosfatos no naturales (figura 6). Tal adición de fosfato de potasio puede suprimir la expresión de la fosfatasa o inhibir la actividad de la fosfatasa (figura 7). Al igual que con el trifosfato natural, la adición de fosfato de potasio aumentó significativamente la estabilidad extracelular de d5SICSTP y dNaMTP (figura 6) en más de 2 veces. También se puede determinar la captación de [a-32P]-dATP de medios que contienen KPi 50 mM en función de la inducción del transportador, por ejemplo, con IPTG (figura 8). La inducción de IPTG 1 mM dio como resultado una captación máxima de [a-32P]-dATP (figura 8A).
Pueden emplearse inhibidores de fosfatasas para aumentar la estabilidad de uno o más ácidos nucleicos naturales y/o no naturales. De esta manera, se pueden emplear inhibidores de fosfatasas para facilitar la incorporación y transporte intracelular de ácidos nucleicos. Se puede determinar la captación de [a-32P]-dATP de medios que contienen KPi 50 mM en función de la inducción del transportador, por ejemplo, con IPTG (figura 8).
El fosfato de potasio puede facilitar dicho transporte. En algunas realizaciones, un inhibidor de fosfatasa, por ejemplo, KPi, facilita la incorporación y el transporte intracelular de ácidos nucleicos a un pH. En algunas realizaciones, un inhibidor de fosfatasa, por ejemplo, KPi, facilita la incorporación y el transporte intracelular de ácidos nucleicos a pH aproximadamente neutro. Tal pH neutro puede estar entre aproximadamente un pH de 4,5 a un pH de 8,5, o entre aproximadamente un pH de 6,8 y aproximadamente un pH de 7,6, o entre aproximadamente un pH de 7,0 y aproximadamente un pH de 7,4.
En algunas realizaciones, un inhibidor de fosfatasa, por ejemplo, KPi, facilita la incorporación y el transporte intracelular de ácidos nucleicos a una concentración. Puede emplearse diversas concentraciones de inhibidor de fosfatasa, por ejemplo, KPi. Por ejemplo, el inhibidor de fosfatasa, por ejemplo, KPi, puede estar presente en una concentración de 0,1 mM a 500 mM, o de 0,2 mM a 250 mM, o de 0,25 mM a 2 O0 mM, o de 1,0 mM a 150 mM, o de 2,5 mM a 125 mM, o de 5 mM a 100 mM, o de 25 mM a 75 mM, o de 40 mM a 60 mM de fosfato de potasio. Como se ilustra, el inhibidor de fosfatasa 50 mM, por ejemplo, KPi, parece ser suficiente para el contacto inicial de las células y los nucleótidos trifosfato no naturales (figura 7B). Pueden emplearse inhibidores de fosfatasa, ya sea con la adición de fosfato de potasio o sin la adición de fosfato de potasio.
En algunas realizaciones, se puede usar la alteración de una nucleotidasa o fosfatasa, o la adición de un inhibidor de fosfatasa, por ejemplo, KPi, para aumentar la semivida de un nucleótido trifosfato natural y no natural. Por ejemplo, se puede usar la alteración de una nucleotidasa o fosfatasa, o la adición de un inhibidor de fosfatasa para aumentar la semivida de un ácido nucleico natural y/o un ácido nucleico no natural en al menos aproximadamente 0,5, 1,0, 1,5, 2.0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 3,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más horas.
En algunas realizaciones, se puede usar la alteración de una nucleotidasa o fosfatasa, o la adición de un inhibidor de la fosfatasa, por ejemplo, KPi, para aumentar la estabilidad de un ácido nucleico natural y/o un ácido nucleico no natural de manera que la concentración intracelular de ácido nucleico natural o no natural sea al menos el valor Km del ácido nucleico natural o no natural para una polimerasa. Por ejemplo, puede usarse la alteración de una nucleotidasa o fosfatasa, o la adición de un inhibidor de fosfatasa para aumentar la estabilidad de los nucleótidos trifosfato naturales y no naturales de manera que su concentración intracelular sea de al menos aproximadamente 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3.0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 3,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15.0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más veces el valor Km del ácido nucleico natural o no natural para una polimerasa.
Kits
Se pueden proporcionar en forma de kit diversas combinaciones de los componentes expuestos anteriormente con respecto a mezclas de reacción y métodos de reacción de ejemplo. Tal kit puede incluir componentes individuales que están separados entre sí, por ejemplo, que se transportan en recipientes o paquetes separados. Un kit puede incluir una o más subcombinaciones de los componentes expuestos en el presente documento, estando la una o más subcombinaciones separadas de otros componentes del kit. Las subcombinaciones pueden combinarse para crear una mezcla de reacción expuesta en el presente documento (o combinarse para realizar una reacción expuesta en el presente documento). En casos particulares, una subcombinación de componentes que está presente en un recipiente o paquete individual es insuficiente para realizar una reacción expuesta en el presente documento.
Sin embargo, el kit en su conjunto puede incluir una colección de recipientes o paquetes cuyo contenido se puede combinar para realizar una reacción expuesta en el presente documento.
Un kit puede incluir un material de envasado adecuado para albergar el contenido del kit. El material de envasado se puede construir mediante métodos bien conocidos, preferentemente para proporcionar un entorno estéril y libre de contaminantes. Los materiales de envasado empleados en el presente documento pueden incluir, por ejemplo, los que se utilizan habitualmente en kits comerciales vendidos para su uso con sistemas de secuenciación de ácidos nucleicos. Los materiales de envasado de ejemplo incluyen, sin limitación, vidrio, plástico, papel, láminas y similares, capaces de contener dentro de límites fijos un componente expuesto en el presente documento.
El material de envasado puede incluir una etiqueta que indique un uso particular de los componentes. El uso del kit que se indica en la etiqueta puede ser uno o más de los métodos expuestos en el presente documento según sea apropiado para la combinación particular de componentes presentes en el kit. Por ejemplo, una etiqueta puede indicar que el kit es útil para un método de síntesis de un polinucleótido o para un método de determinación de la secuencia de un ácido nucleico.
Las instrucciones para el uso de los reactivos o componentes envasados también se pueden incluir en un kit. Las instrucciones incluirán normalmente una expresión tangible que describa los parámetros de reacción, tales como las cantidades relativas de componentes del kit y muestra a mezclar, períodos de tiempo de mantenimiento para mezclas de reactivo/muestra, temperatura, condiciones de tampón y similares.
Se entenderá que no todos los componentes necesarios para una reacción particular necesitan estar presentes en un kit particular. Más bien, se pueden proporcionar uno o más componentes adicionales de otras fuentes. Las instrucciones proporcionadas con un kit pueden identificar el uno o más componentes adicionales que se proporcionarán y dónde se pueden obtener.
De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, se proporciona un kit que es útil para incorporar de manera estable un ácido nucleico no natural en un ácido nucleico celular, por ejemplo, usando los métodos proporcionados por la presente divulgación para preparar células genomanipuladas. En un caso, un kit de la divulgación incluye una célula genomanipulada y uno o más ácidos nucleicos no naturales.
En otro caso, un kit de la divulgación incluye un cebador que se une a una porción de una molécula de ácido nucleico que contiene un ácido nucleico no natural. En otro caso, el kit incluye una micromatriz que contiene cebadores que se unen a una porción de una molécula de ácido nucleico que contiene un ácido nucleico no natural y al menos un fragmento de un gen diana de interés. En algunos casos, se pueden proporcionar muchos reactivos en un kit de la divulgación, solo algunos de los cuales deben usarse juntos en una reacción o procedimiento particular. Por ejemplo, se pueden proporcionar múltiples cebadores, de los cuales solo dos son necesarios para una aplicación particular.
En otro caso, el kit de la divulgación proporciona una célula y una molécula de ácido nucleico que contiene un gen heterólogo para su introducción en la célula y de ese modo proporcionar una célula genomanipulada. Por ejemplo, la divulgación proporciona en este párrafo vectores de expresión que comprenden el ácido nucleico de cualquiera de los casos descritos anteriormente en el presente documento. En un caso, el vector de expresión anterior comprende además una secuencia reguladora recombinante unida operativamente a la secuencia polinucleotídica.
Reactivos de ácidos nucleicos y herramientas
Un reactivo de ácido nucleico a veces comprende uno o más ORF. Un ORF puede proceder de cualquier fuente adecuada, a veces de ADN genómico, ARNm, ARN de transcripción inversa o ADN complementario (ADNc) o una biblioteca de ácidos nucleicos que comprende uno o más de los anteriores, y es de cualquier especie de organismo que contenga una secuencia de ácido nucleico de interés, proteína de interés o actividad de interés. Los ejemplos no limitantes de organismos a partir de los cuales se puede obtener un ORF incluyen bacterias, levaduras, hongos, seres humanos, insectos, nematodos, bovinos, equinos, caninos, felinos, ratas o ratones, por ejemplo. En algunas realizaciones, un reactivo de ácido nucleico, reactivo de proteína, reactivo de fragmento de proteína u otro reactivo descrito en el presente documento se aísla o se purifica.
Un reactivo de ácido nucleico a veces comprende una secuencia de nucleótidos adyacente a un ORF que se traduce junto con el ORF y codifica una etiqueta de aminoácido. La secuencia de nucleótidos que codifica la etiqueta se localiza en 3' y/o 5' de un ORF en el reactivo de ácido nucleico, codificando así una etiqueta en el extremo C o N de la proteína o péptido codificado por el ORF. Se puede utilizar cualquier etiqueta que no anule la transcripción y/o traducción in vitro y puede seleccionarse apropiadamente por el experto. Las etiquetas pueden facilitar el aislamiento y/o la purificación del producto de ORF deseado de los medios de cultivo o fermentación.
Una etiqueta a veces se une específicamente a una molécula o resto de una fase sólida o un marcador detectable, por ejemplo, por lo que tiene utilidad para aislar, purificar y/o detectar una proteína o péptido codificado por el ORF. En algunas realizaciones, una etiqueta comprende uno o más de los siguientes elementos: FLAG (por ejemplo, DYKDDDDKG) (SEQ ID NO:42), V5 (por ejemplo, GKPIPNPLLGLDST) (SEQ ID NO:43), c-MYC (por ejemplo, EQKLISEEDL) (SEQ ID NO: 44), HSV (por ejemplo, QPELAPEDPED) (SEQ ID NO: 45), hemaglutinina de influenza, HA (por ejemplo, YPYDVPDYA) (SEQ ID NO: 46)" VSV-G (por ejemplo, YTDIEMNRLGK) (SEQ ID NO: 47), glutatión-S-transferasa bacteriana, proteína de unión a maltosa, una etiqueta de unión a estreptavidina o avidina (por ejemplo, sistema de biotinilación pcDNA™ 6 BioEase™ Gateway® (Invitrogen)), tiorredoxina, p-galactosidasa, VSV-glucoproteína, una proteína fluorescente (por ejemplo, proteína verde fluorescente o una de sus muchas variantes de color (por ejemplo, amarillo, rojo, azul)), una secuencia de polilisina o poliarginina, una secuencia de polihistidina (por ejemplo, His6) u otra secuencia que quela un metal (por ejemplo, cobalto, cinc, cobre) y/o una secuencia rica en cisteína que se une a una molécula que contiene arsénico. En determinadas realizaciones, una etiqueta rica en cisteína comprende la secuencia de aminoácidos CC-Xn-CC, en la que X es cualquier aminoácido y n es de 1 a 3, y la secuencia rica en cisteína a veces es CCPGCC. En determinadas realizaciones, la etiqueta comprende un elemento rico en cisteína y un elemento de polihistidina (por ejemplo, CCPGCC (SEQ ID NO: 48) e His6).
Una etiqueta a menudo se une convenientemente a un compañero de unión. Por ejemplo, algunas etiquetas se unen a un anticuerpo (por ejemplo, FLAG) y, a veces, se unen específicamente a una molécula pequeña. Por ejemplo, una etiqueta de polihistidina quela específicamente un metal bivalente, tal como níquel, cobre, cinc y cobalto; una etiqueta de polilisina o poliarginina se une específicamente a un dedo de cinc; una etiqueta de glutatión S-transferasa se une al glutatión; y una etiqueta rica en cisteína se une específicamente a una molécula que contiene arsénico. Las moléculas que contienen arsénico incluyen agentes LUMIO™ (Invitrogen, California), tal como FlAsH™ (EDT2[4',5'-bis(1,3,2-ditioarsolan-2-il)fluoresceína-(1,2-etanoditiol)2]) y reactivos ReAsH (por ejemplo, las Patentes de e E.UU. N.° 5.932.474; 6.054.271; 6.451.569; y 6.008.378; la Publicación de Patente de EE.UU. N.° US2003/0083373; y la Publicación Internacional N.° WO99/21013). Dichos anticuerpos y moléculas pequeñas a veces se unen a una fase sólida para el aislamiento conveniente de la proteína o péptido diana.
Una etiqueta a veces comprende una secuencia señal o una secuencia señal de localización. Se puede incorporar una secuencia señal en el extremo N de una proteína diana o péptido diana, y algunas veces se incorpora en el extremo C. Los expertos conocen ejemplos de secuencias señal, se incorporan fácilmente a un reactivo de ácido nucleico y, a menudo, se seleccionan de acuerdo con el organismo en el que se realiza la expresión del reactivo de ácido nucleico. Una secuencia señal en algunas realizaciones localiza una proteína o péptido traducido en una membrana celular. Los ejemplos de secuencias señal incluyen, pero sin limitación, una señal de direccionamiento del núcleo (por ejemplo, secuencia del receptor de esteroides y secuencia del extremo N del antígeno T grande del virus SV40); una señal de direccionamiento mitocondrial (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que forma una hélice anfipática); una señal de direccionamiento del peroxisoma (por ejemplo, una secuencia del extremo C en YFG de S. cerevisiae); y una señal de secreción (por ejemplo, secuencias del extremo N de invertasa, factor alfa de emparejamiento, PHO5 y SUC2 en S.cerevisiae; múltiples secuencias del extremo N de proteínas de B. subtilis (por ejemplo, Tjalsma et al., Microbiol.Molec. Biol. Rev. 64: 515-547 (2000)); una secuencia señal de alfa amilasa (por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 6.288.302); una secuencia señal de pectato liasa (por ejemplo, la Patente de EE.Uu . N.° 5.846.818); una secuencia señal de precolágeno (por ejemplo, la Patente de EE.Uu . N.° 5.712.114); una secuencia señal OmpA (por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 5.470.719); una secuencia señal beta lam (por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 5.389.529); una secuencia señal de B. brevis (por ejemplo, la Patente de EE.u U. N.° 5.232.841); y una secuencia señal de P. pastoris (por ejemplo, la Patente de e E.UU. N.° 5.268.273).
A veces, una etiqueta está directamente adyacente a la secuencia de aminoácidos codificada por un ORF (es decir, no hay una secuencia intermedia) y, a veces, una etiqueta está sustancialmente adyacente a una secuencia de aminoácidos codificada por ORF (por ejemplo, hay una secuencia intermedia presente). Una secuencia intermedia a veces incluye un sitio de reconocimiento para una proteasa, que es útil para escindir una etiqueta de una proteína o péptido diana. En algunas realizaciones, la secuencia intermedia se escinde por el Factor Xa (por ejemplo, sitio de reconocimiento I (E/D)GR), la trombina (por ejemplo, sitio de reconocimiento LVPRGS), la enterocinasa (por ejemplo, sitio de reconocimiento DDDDK), la proteasa t Ev (por ejemplo, sitio de reconocimiento ENLYFQG) o la proteasa PreScission™ (por ejemplo, sitio de reconocimiento LEVLFQGP), por ejemplo.
Una secuencia intermedia a veces se denomina en el presente documento "secuencia enlazadora" y puede tener cualquier longitud adecuada seleccionada por el experto. Una secuencia enlazadora a veces tiene una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 aminoácidos y, a veces, una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 aminoácidos. El experto puede seleccionar la longitud del enlazador para preservar sustancialmente la función de la proteína o péptido diana (por ejemplo, una etiqueta puede reducir la función de la proteína o péptido diana a menos que esté separada por un enlazador), para mejorar la disociación de una etiqueta de una proteína o péptido diana cuando está presente un sitio de escisión de proteasa (por ejemplo, la escisión se puede mejorar cuando está presente un enlazador) y para mejorar la interacción de un producto de etiqueta/proteína diana con una fase sólida. Un enlazador puede tener cualquier contenido de aminoácidos adecuado y, a menudo, comprende una mayor proporción de aminoácidos que tienen cadenas laterales relativamente cortas (por ejemplo, glicina, alanina, serina y treonina).
Un reactivo de ácido nucleico a veces incluye un codón de terminación entre un elemento de etiqueta y un elemento de inserción u ORF, que puede ser útil para traducir un ORF con o sin la etiqueta. Las moléculas de ARNt mutantes que reconocen codones de terminación (descritas anteriormente) suprimen la terminación de la traducción y, por lo tanto, se denominan "ARNt supresores". Los ARNt supresores pueden dar como resultado la inserción de aminoácidos y la continuación de la traducción más allá de los codones de terminación (por ejemplo, la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 60/587.583; Eggertsson, et al., (1988) Microbiological Review 52(3):354-374, y Engleerg-Kukla, et al. (1996) en Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, Capítulo 60, págs. 909-921, Neidhardt, et al. eds., ASM Press, Washington, DC). Se conocen varios ARNt supresores, incluyendo, pero sin limitación, supresores supE, supP, supD, supF y supZ, que suprimen la terminación de la traducción del codón de terminación ámbar; supresores supB, glT, supL, supN, supC y supM, que suprimen la función del codón de terminación ocre y supresores glyT, trpT y Su-9, que suprimen la función del codón de terminación ópalo. En general, los ARNt supresores contienen una o más mutaciones en el bucle anticodón del ARNt que permite que el ARNt se empareje por bases con un codón que normalmente funciona como un codón de terminación. El ARNt mutante se carga con su residuo de aminoácidos afín y el residuo de aminoácidos afín se inserta en el polipéptido de traducción cuando se encuentra el codón de terminación. Se han identificado mutaciones que mejoran la eficacia de los supresores de terminación (es decir, aumentan la lectura del codón de terminación). Estas incluyen, pero sin limitación, mutaciones en el gen uar (también conocido como gen prfA), mutaciones en el gen ups, mutaciones en los genes sueA, sueB y sueC, mutaciones en los genes rpsD (ramA) y rpsE (spcA) y mutaciones en el gen rplL.
Por lo tanto, un reactivo de ácido nucleico que comprende un codón de terminación ubicado entre un ORF y una etiqueta puede producir un ORF traducido solo cuando no hay ARNt supresor presente en el sistema de traducción, y puede producir una fusión de ORF-etiqueta traducida cuando un ARNt supresor está presente en el sistema. El ARNt supresor se puede generar en células transfectadas con un ácido nucleico que codifica el ARNt (por ejemplo, un adenovirus de replicación incompetente que contiene el gen supresor de ARNt-Ser humano se puede transfectar en células, o se puede transfectar un YAC que contiene un gen supresor de ARNt de levadura o bacteriano en células de levadura, por ejemplo). El experto dispone de vectores para sintetizar ARNt supresor y para traducir ORF con o sin una etiqueta (por ejemplo, el kit Tag-On-Demand™ (Invitrogen Corporation, California); Tag-On-Demand™ Suppressor Supernatant Instruction Manual, Versión B, 6 de junio de 2003; Tag-On-Demand™ Gateway® Vector Instruction Manual, Versión B, 20 de junio de 2003; y Capone et al., EMBO J., 4:213, 1985).
Un ácido nucleico o reactivo de ácido nucleico puede comprender determinados elementos, por ejemplo, elementos reguladores, a menudo seleccionados de acuerdo con el uso pretendido del ácido nucleico. Cualquiera de los siguientes elementos puede incluirse o excluirse de un reactivo de ácido nucleico. Un reactivo de ácido nucleico, por ejemplo, puede incluir uno o más o todos los siguientes elementos nucleotídicos: uno o más elementos promotores, una o más regiones no traducidas 5' (5'UTR), una o más regiones en las que puede insertarse una secuencia de nucleótidos diana (un "elemento de inserción"), una o más secuencias de nucleótidos diana, una o más regiones no traducidas 3' (3'UTR) y uno o más elementos de selección. Se puede proporcionar un reactivo de ácido nucleico con uno o más de tales elementos y se pueden insertar otros elementos en el ácido nucleico antes de que el ácido nucleico se introduzca en el organismo deseado. En algunas realizaciones, un reactivo de ácido nucleico proporcionado comprende un promotor, 5'UTR, 3'UTR opcional y uno o más elementos de inserción mediante los cuales se inserta (es decir, se clona) una secuencia de nucleótidos diana en el reactivo de ácido nucleotídico. En determinadas realizaciones, un reactivo de ácido nucleico proporcionado comprende un promotor, uno o más elementos de inserción y 3'UTR opcional y una secuencia de nucleótidos diana/5'UTR se inserta con un 3'UTR opcional. Los elementos pueden disponerse en cualquier orden adecuado para la expresión en el sistema de expresión elegido (por ejemplo, expresión en un organismo elegido, o expresión en un sistema acelular, por ejemplo), y en algunas realizaciones, un reactivo de ácido nucleico comprende los siguientes elementos en la dirección 5' a 3': (1 ) un elemento promotor, 5'UTR y uno o más elemento de inserción; (2) un elemento promotor, 5'UTR y secuencia de nucleótidos diana; (3) un elemento promotor, 5'UTR, uno o más elementos de inserción y 3'UTR; y (4) un elemento promotor, 5'UTR, secuencia de nucleótidos diana y 3'UTR.
Los reactivos de ácido nucleico, por ejemplo, casetes de expresión y/o vectores de expresión, pueden incluir diversos elementos reguladores, incluyendo promotores, potenciadores, secuencias de inicio de la traducción, secuencias de terminación de la transcripción y otros elementos. Un "promotor" es generalmente una secuencia o secuencias de ADN que funcionan cuando se encuentran en una ubicación relativamente fija con respecto al sitio de inicio de la transcripción. Por ejemplo, el promotor puede estar cadena arriba del segmento de ácido nucleico del transportador de nucleótidos trifosfato. Un "promotor" contiene los elementos centrales necesarios para la interacción de bases de la ARN polimerasa y los factores de transcripción y puede contener elementos cadena arriba y elementos de respuesta. "Potenciador" generalmente se refiere a una secuencia de ADN que funciona sin una distancia fija desde el sitio de inicio de la transcripción y puede estar en 5' o 3'' con respecto a la unidad de transcripción. Además, los potenciadores pueden estar dentro de un intrón, así como dentro de la secuencia codificante. Normalmente, tienen entre 10 y 300 pb de longitud y funcionan en cis. Los potenciadores tienen la función de aumentar la transcripción de los promotores cercanos. Los potenciadores, como los promotores, a menudo también contienen elementos de respuesta que median en la regulación de la transcripción. Los potenciadores a menudo determinan la regulación de la expresión.
Como se ha indicado anteriormente, los reactivos de ácido nucleico también pueden comprender una o más 5' UTR y una o más 3' UTR. Por ejemplo, los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (por ejemplo, levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos o nucleadas) y células huésped procariotas (por ejemplo, virus, bacteria) pueden contener secuencias que señalan la terminación de la transcripción que puede afectar a la expresión del ARNm. Estas regiones se pueden transcribir como segmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica la proteína del factor tisular. Las regiones no traducidas 3'' también incluyen sitios de terminación de la transcripción. En algunas realizaciones preferidas, una unidad de transcripción comprende una región de poliadenilación. Un beneficio de esta región es que aumenta la probabilidad de que la unidad transcrita sea procesada y transportada como ARNm. La identificación y el uso de señales de poliadenilación en construcciones de expresión están bien establecidos. En algunas realizaciones preferidas, se pueden usar señales de poliadenilación homólogas en las construcciones transgénicas.
Una 5' UTR puede comprender uno o más elementos endógenos con respecto a la secuencia de nucleótidos de la que se origina, y algunas veces incluye uno o más elementos exógenos. Una 5' UTR puede originarse a partir de cualquier ácido nucleico adecuado, tal como ADN genómico, ADN plasmídico, ARN o ARNm, por ejemplo, de cualquier organismo adecuado (por ejemplo, virus, bacteria, levadura, hongos, planta, insecto o mamífero). El experto puede seleccionar elementos apropiados para la 5' UTR basándose en el sistema de expresión elegido (por ejemplo, expresión en un organismo elegido o expresión en un sistema acelular, por ejemplo). Una 5' UTR a veces comprende uno o más de los siguientes elementos conocidos por el experto: secuencias potenciadoras (por ejemplo, transcripcionales o traduccionales), sitio de inicio de la transcripción, sitio de unión del factor de transcripción, sitio de regulación de la traducción, sitio de inicio de la traducción, sitio de unión del factor de traducción, sitio de unión de proteínas accesorias, sitios de unión del agente de regulación de la retroalimentación, caja Pribnow, caja TATA, elemento -35, caja E (elemento de unión de hélice-bucle-hélice), sitio de unión a ribosomas, replicón, sitio interno de entrada a ribosomas (IRES, por sus siglas en inglés), elemento silenciador y similares. En algunas realizaciones, un elemento promotor puede aislarse de manera que todos los elementos 5' UTR necesarios para la regulación condicional adecuada estén contenidos en el fragmento del elemento promotor, o dentro de una subsecuencia funcional de un fragmento del elemento promotor.
Una 5' UTR en el reactivo de ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos potenciadora de la traducción. Una secuencia de nucleótidos potenciadora de la traducción a menudo se encuentra entre el promotor y la secuencia de nucleótidos diana en un reactivo de ácido nucleico. Una secuencia potenciadora de la traducción a menudo se une a un ribosoma, a veces es una secuencia de ribonucleótidos de unión a ARNr 18S (es decir, una secuencia de unión al ribosoma 40S) y, a veces, es una secuencia interna de entrada al ribosoma (IRES). Un IRES generalmente forma un armazón de ARN con estructuras terciarias de ARN colocadas con precisión que entran en contacto con una subunidad ribosómica 40S a través de una serie de interacciones intermoleculares específicas. Se conocen ejemplos de secuencias potenciadoras de ribosomas y pueden identificarse por el experto (por ejemplo, Mignone et al., Nucleic Acids Research 33: D141-D146 (2005); Paulous et al., Nucleic Acids Research 31: 722-733 (2003); Akbergenov et al., Nucleic Acids Research 32: 239-247 (2004); Mignone et al., Genome Biology 3(3): reviews0004.1-0001.10 (2002); Gallie, Nucleic Acids Research 30: 3401-3411 (2002); Shaloiko et al., DOI: 10.1002/bit.20267; y Gallie et al., Nucleic Acids Research 15: 3257-3273 (1987)).
Una secuencia potenciadora de la traducción a veces es una secuencia eucariota, tal como una secuencia consenso de Kozak u otra secuencia (por ejemplo, secuencia de pólipos hidroides, número de acceso de GenBank U07128).
Una secuencia potenciadora de la traducción a veces es una secuencia procariota, tal como una secuencia consenso Shine-Dalgarno. En determinadas realizaciones, la secuencia potenciadora de la traducción es una secuencia de nucleótidos viral. Una secuencia potenciadora de la traducción a veces es de una 5' UTR de un virus vegetal, tal como el virus del mosaico del tabaco (TMV), el virus del mosaico de la alfalfa (AMV); el virus del grabado del tabaco (ETV); el virus Y de la patata (PVY); el virus del mosaico del nabo (poty) y el virus del mosaico transmitido por semillas de guisantes, por ejemplo. En determinadas realizaciones, se incluye una secuencia omega de aproximadamente 67 bases de longitud del TMV en el reactivo de ácido nucleico como una secuencia potenciadora de la traducción (por ejemplo, desprovista de nucleótidos de guanosina e incluye una región central poli (CAA) de 25 nucleótidos de longitud).
Una 3' UTR puede comprender uno o más elementos endógenos con respecto a la secuencia de nucleótidos de la que se origina, y algunas veces incluye uno o más elementos exógenos. Una 3' UTR puede originarse a partir de cualquier ácido nucleico adecuado, tal como ADN genómico, ADN plasmídico, ARN o ARNm, por ejemplo, de cualquier organismo adecuado (por ejemplo, un virus, bacteria, levadura, hongos, planta, insecto o mamífero). El experto puede seleccionar elementos apropiados para la 3' UTR basándose en el sistema de expresión elegido (por ejemplo, expresión en un organismo elegido, por ejemplo). Una 3' UTR a veces comprende uno o más de los siguientes elementos conocidos por el experto: sitio de regulación de la transcripción, sitio de inicio de la transcripción, sitio de terminación de la transcripción, sitio de unión del factor de transcripción, sitio de regulación de la traducción, sitio de terminación de la traducción, sitio de inicio de la traducción, sitio de unión del factor de traducción, sitio de unión a ribosomas, replicón, elemento potenciador, elemento silenciador y cola de poliadenosina. Una 3' UTR a menudo incluye una cola de poliadenosina y algunas veces no, y si hay una cola de poliadenosina presente, se pueden añadir o eliminar uno o más restos de adenosina (por ejemplo, se pueden añadir o restar aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45 o aproximadamente 50 restos de adenosina).
En algunas realizaciones, se puede usar la modificación de una 5' UTR y/o una 3' UTR para alterar (por ejemplo, aumentar, añadir, disminuir o eliminar sustancialmente) la actividad de un promotor. La alteración de la actividad promotora puede, a su vez, alterar la actividad de un péptido, polipéptido o proteína (por ejemplo, la actividad enzimática, por ejemplo), mediante un cambio en la transcripción de la secuencia o secuencias de nucleótidos de interés a partir de un elemento promotor unido operativamente que comprende la 5' o 3' UTR modificada. Por ejemplo, un microorganismo se puede genomanipular mediante modificación genética para expresar un reactivo de ácido nucleico que comprende una 5' o 3' UTR modificada que puede añadir una actividad novedosa (por ejemplo, una actividad que normalmente no se encuentra en el organismo huésped) o aumentar la expresión de una actividad existente aumentando la transcripción de un promotor homólogo o heterólogo unido operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés (por ejemplo, secuencia de nucleótidos homóloga o heteróloga de interés), en determinadas realizaciones. En algunas realizaciones, un microorganismo puede genomanipularse mediante modificación genética para expresar un reactivo de ácido nucleico que comprende una 5' o 3' UTR modificada que puede disminuir la expresión de una actividad al disminuir o eliminar sustancialmente la transcripción de un promotor homólogo o heterólogo unido operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés, en determinadas realizaciones.
La expresión de un transportador de nucleótidos trifosfato a partir de un casete de expresión o vector de expresión puede controlarse mediante cualquier promotor capaz de expresarse en células procariotas o eucariotas. Normalmente se requiere un elemento promotor para la síntesis de ADN y/o la síntesis de ARN. Un elemento promotor a menudo comprende una región de ADN que puede facilitar la transcripción de un gen particular, proporcionando un sitio de inicio para la síntesis de ARN correspondiente a un gen. Los promotores generalmente están ubicados cerca de los genes que regulan, están ubicados cadena arriba del gen (por ejemplo, 5' del gen) y están en la misma hebra de ADN que la hebra codificante del gen, en algunas realizaciones. En algunas realizaciones, un elemento promotor puede aislarse de un gen u organismo e insertarse en conexión funcional con una secuencia de polinucleótidos para permitir la expresión alterada y/o regulada. Un promotor no nativo (por ejemplo, un promotor que normalmente no está asociado con una secuencia de ácido nucleico determinada) usado para la expresión de un ácido nucleico, a menudo se denomina promotor heterólogo. En determinadas realizaciones, se puede insertar un promotor heterólogo y/o una 5'UTR en conexión funcional con un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una actividad deseada como se describe en el presente documento. Las expresiones "unido operativamente" y "en conexión funcional con", como se usan en el presente documento con respecto a los promotores, se refieren a una relación entre una secuencia codificante y un elemento promotor. El promotor está unido operativamente o en conexión funcional con la secuencia codificante cuando la expresión de la secuencia codificante a través de la transcripción se regula o se controla por el elemento promotor. Las expresiones "unido operativamente" y "en conexión funcional con" se utilizan indistintamente en el presente documento con respecto a los elementos promotores.
Un promotor a menudo interactúa con una ARN polimerasa. Una polimerasa es una enzima que cataliza la síntesis de ácidos nucleicos usando un reactivo de ácido nucleico preexistente. Cuando el molde es un molde de ADN, se transcribe una molécula de ARN antes de que se sintetice la proteína. Las enzimas que tienen actividad polimerasa adecuadas para su uso en los presentes métodos incluyen cualquier polimerasa que sea activa en el sistema elegido con el molde elegido para sintetizar la proteína. En algunas realizaciones, un promotor (por ejemplo, un promotor heterólogo) también denominado en el presente documento como elemento promotor, se puede unir operativamente a una secuencia de nucleótidos o un marco de lectura abierto (ORF). La transcripción del elemento promotor puede catalizar la síntesis de un ARN correspondiente a la secuencia de nucleótidos o secuencia de ORF unida operativamente al promotor, lo que a su vez conduce a la síntesis de un péptido, polipéptido o proteína deseados.
Los elementos promotores a veces muestran capacidad de respuesta al control regulador. A veces, los elementos promotores también pueden regularse por un agente selectivo. Es decir, la transcripción de elementos promotores a veces se puede activar, desactivar, regular positivamente o regular negativamente, en respuesta a un cambio en las condiciones o señales ambientales, nutricionales o internas (por ejemplo, promotores inducibles por calor, promotores regulados por luz, promotores regulados por retroalimentación, promotores influenciados por hormonas, promotores específicos de tejido, promotores influenciados por oxígeno y el pH, promotores que responden a agentes selectivos (por ejemplo, kanamicina) y similares, por ejemplo). Los promotores influenciados por señales ambientales, nutricionales o internas frecuentemente están influenciados por una señal (directa o indirecta) que se une al promotor o cerca de este y aumenta o disminuye la expresión de la secuencia diana bajo ciertas condiciones.
Los ejemplos no limitantes de agentes selectivos o reguladores que pueden incluir en la transcripción de un elemento promotor utilizado en las realizaciones descritas en esta invención incluyen, sin limitación, (1) segmentos de ácido nucleico que codifican productos que proporcionan resistencia contra compuestos de otro modo tóxicos (por ejemplo, antibióticos); (2) segmentos de ácido nucleico que codifican productos que por lo demás están ausentes en la célula receptora (por ejemplo, productos esenciales, genes de ARNt, marcadores auxotróficos); (3) segmentos de ácido nucleico que codifican productos que suprimen la actividad de un producto génico; (4) segmentos de ácido nucleico que codifican productos que pueden identificarse fácilmente (por ejemplo, marcadores fenotípicos tales como antibióticos (por ejemplo, p-lactamasa), p-galactosidasa, proteína verde fluorescente (GFP), proteína amarilla fluorescente (YFP), proteína roja fluorescente (RFP), proteína cian fluorescente (CFP) y proteínas de la superficie celular); (5) segmentos de ácido nucleico que se unen a productos que de otro modo son perjudiciales para la supervivencia y/o la función celular; (6) segmentos de ácido nucleico que de otro modo inhiben la actividad de cualquiera de los segmentos de ácido nucleico descritos en los N.° 1-5 anteriores (por ejemplo, oligonucleótidos no codificantes); (7) segmentos de ácido nucleico que se unen a productos que modifican un sustrato (por ejemplo, endonucleasas de restricción); (8) segmentos de ácido nucleico que pueden usarse para aislar o identificar una molécula deseada (por ejemplo, sitios de unión a proteínas específicos); (9) segmentos de ácido nucleico que codifican una secuencia de nucleótidos específica que de otro modo puede no ser funcional (por ejemplo, para la amplificación por PCR de subpoblaciones de moléculas); (10) segmentos de ácido nucleico que, cuando están ausentes, confieren directa o indirectamente resistencia o sensibilidad a compuestos particulares; (11) segmentos de ácido nucleico que codifican productos que son tóxicos o convierten un compuesto relativamente no tóxico en un compuesto tóxico (por ejemplo, timidina cinasa de herpes simple, citosina desaminasa) en las células receptoras; (12) segmentos de ácido nucleico que inhiben la replicación, la división o la heredabilidad de las moléculas de ácido nucleico que los contienen; y/o (13) segmentos de ácido nucleico que codifican funciones de replicación condicional, por ejemplo, replicación en determinados huéspedes o cepas de células huésped o bajo ciertas condiciones ambientales (por ejemplo, temperatura, condiciones nutricionales y similares). En algunas realizaciones, el agente regulador o selectivo se puede añadir para cambiar las condiciones de crecimiento existentes a las que está sujeto el organismo (por ejemplo, crecimiento en cultivo líquido, crecimiento en un fermentador, crecimiento en placas de nutrientes sólidos y similares, por ejemplo).
En algunas realizaciones, la regulación de un elemento promotor puede usarse para alterar (por ejemplo, aumentar, añadir, disminuir o eliminar sustancialmente) la actividad de un péptido, polipéptido o proteína (por ejemplo, la actividad enzimática, por ejemplo). Por ejemplo, un microorganismo se puede genomanipular mediante modificación genética para expresar un reactivo de ácido nucleico que puede añadir una actividad novedosa (por ejemplo, una actividad que normalmente no se encuentra en el organismo huésped) o aumentar la expresión de una actividad existente aumentando la transcripción de un promotor homólogo o heterólogo unido operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés (por ejemplo, secuencia de nucleótidos homóloga o heteróloga de interés), en determinadas realizaciones. En algunas realizaciones, un microorganismo puede genomanipularse mediante modificación genética para expresar un reactivo de ácido nucleico que puede disminuir la expresión de una actividad al disminuir o eliminar sustancialmente la transcripción de un promotor homólogo o heterólogo unido operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés, en determinadas realizaciones.
Los ácidos nucleicos que codifican proteínas heterólogas, por ejemplo, transportadores de nucleótidos trifosfato, pueden insertarse o emplearse con cualquier sistema de expresión adecuado. En algunas realizaciones, un reactivo de ácido nucleico a veces se integra de manera estable en el cromosoma del organismo huésped, o un reactivo de ácido nucleico puede ser una deleción de una porción del cromosoma huésped, en determinadas realizaciones (por ejemplo, organismos genéticamente modificados, en los que la alteración del genoma huésped confiere la capacidad de mantener selectiva o preferencialmente el organismo deseado portador de la modificación genética). Dichos reactivos de ácido nucleico (por ejemplo, ácidos nucleicos u organismos modificados genéticamente cuyo genoma alterado confiere un rasgo seleccionable al organismo) pueden seleccionarse por su capacidad para guiar la producción de una proteína o molécula de ácido nucleico deseada. Cuando se desee, el reactivo de ácido nucleico se puede alterar de modo que los codones codifiquen (i) el mismo aminoácido, usando un ARNt diferente al especificado en la secuencia nativa, o (ii) un aminoácido diferente al normal, incluyendo aminoácidos no convencionales o no naturales (incluyendo aminoácidos marcados de forma detectable).
La expresión recombinante se logra de manera útil usando un casete de expresión que puede formar parte de un vector, tal como un plásmido. Un vector puede incluir un promotor unido operativamente a un ácido nucleico que codifica un transportador de nucleótidos trifosfato. Un vector también puede incluir otros elementos necesarios para la transcripción y la traducción como se describe en el presente documento. Un casete de expresión, un vector de expresión y las secuencias en un casete o vector pueden ser heterólogos con respecto a la célula con la que se ponen en contacto los nucleótidos no naturales. Por ejemplo, una secuencia transportadora de nucleótidos trifosfato puede ser heteróloga con respecto a la célula.
Puede producirse diversos vectores de expresión procariotas y eucariotas adecuados para portar, codificar y/o expresar transportadores de nucleótidos trifosfato. Dichos vectores de expresión incluyen, por ejemplo, pET, pET3d, pCR2.1, pBAD, pUC y vectores de levadura. Los vectores pueden usarse, por ejemplo, en diversas situaciones in vivo e in vitro. Los ejemplos no limitantes de promotores procariotas que pueden usarse incluyen promotores SP6, T7, T5, tac, bla, trp, gal, lac o maltosa. Los ejemplos no limitantes de promotores eucariotas que pueden usarse incluyen promotores constitutivos, por ejemplo, promotores virales tales como promotores CMV, SV40 y RSV, así como promotores regulables, por ejemplo, un promotor inducible o reprimible tal como un promotor tet, un promotor hsp70 y un promotor sintético regulado por CRE. Los vectores para la expresión bacteriana incluyen pGEX-5X-3, y para la expresión eucariota incluyen pCIneo-CMV. Los vectores virales que pueden emplearse incluyen los relacionados con lentivirus, adenovirus, virus adenoasociado, virus del herpes, virus variolovacunal, virus de la polio, virus del SIDA, virus trófico neuronal, Sindbis y otros virus. También son útiles las familias virales que comparten las propiedades de estos virus que las hacen adecuadas para su uso como vectores. Los vectores retrovirales que pueden emplearse incluyen los descritos en Verma, American Society for Microbiology, págs. 229-232, Washington, (1985). Por ejemplo, dichos vectores retrovirales pueden incluir el virus de la leucemia murina de Maloney, MMLV, y otros retrovirus que expresan propiedades deseables. Normalmente, los vectores virales contienen genes tempranos no estructurales, genes tardíos estructurales, un transcrito de ARN polimerasa III, repeticiones terminales invertidas necesarias para la replicación y encapsidación, y promotores para controlar la transcripción y replicación del genoma viral. Cuando se genomanipulan como vectores, los virus normalmente tienen uno o más de los genes tempranos eliminados y se inserta un gen o casete génico/promotor en el genoma viral en lugar del ácido nucleico viral eliminado
Clonación
Se puede utilizar cualquier estrategia de clonación conveniente conocida en la técnica para incorporar un elemento, tal como un ORF, en un reactivo de ácido nucleico. Se pueden utilizar métodos conocidos para insertar un elemento en el molde independientemente de un elemento de inserción, tal como (1) escindir el molde en uno o más sitios de enzimas de restricción existentes y ligar un elemento de interés y (2) añadir sitios de enzimas de restricción al molde hibridando cebadores oligonucleotídicos que incluyen uno o más sitios de enzimas de restricción adecuados y amplificando mediante reacción en cadena de la polimerasa (descrita con mayor detalle en el presente documento). Otras estrategias de clonación aprovechan uno o más sitios de inserción presentes o insertados en el reactivo de ácido nucleico, tal como un sitio de hibridación de cebador oligonucleotídico para PCR, por ejemplo, y otros descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, se puede combinar una estrategia de clonación con manipulación genética tal como recombinación (por ejemplo, recombinación de un reactivo de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico de interés en el genoma del organismo a modificar, como se describe adicionalmente en el presente documento). En algunas realizaciones, el uno o más ORF clonados pueden producir (directa o indirectamente) transportadores de nucleótidos trifosfato y/o polimerasas modificados o de tipo silvestre, mediante genomanipulación de un microorganismo con uno o más ORF de interés, cuyo microorganismo comprende actividades alteradas de la actividad del transportador de nucleótidos trifosfato o la actividad de polimerasa.
Un ácido nucleico se puede escindir específicamente poniendo en contacto el ácido nucleico con uno o más agentes de escisión específicos. Los agentes de escisión específicos a menudo se escinden específicamente de acuerdo con una secuencia de nucleótidos particular en un sitio particular. Los ejemplos de agentes de escisión específicos de enzimas incluyen, sin limitación, endonucleasas (por ejemplo, DNasa (por ejemplo, DNasa I, II); RNasa (por ejemplo, RNasa E, F, H, P); la enzima Cleavase™; ADN polimerasa Taq; ADN polimerasa I de E. coli y endonucleasas específicas de estructura eucariota; endonucleasas FEN-1 murinas; endonucleasas de restricción de tipo I, II o III tales como Acc I, Afl III, Alu I, Alw44 I, Apa I, Asn I, Ava I, Ava II, BamH I, Ban II, Bcl I, Bgl I, Bgl II, Bln I, Bsm I, BssH II, BstE II, Cfo I, CIa I, Dde I, Dpn I, Dra I, EcIX I, EcoR I, EcoR I, EcoR II, EcoR V, Hae II, Hae II, Hind II, Hind III, Hpa I, Hpa II, Kpn I, Ksp I, Mlu I, MIuN I, Msp I, Nci I, Nco I, Nde I, Nde II, Nhe I, Not I, Nru I, Nsi I, Pst I, Pvu I, Pvu II, Rsa I, Sac I, Sal I, Sau3A I, Sca I, ScrF I, Sfi I, Sma I, Spe I, Sph I, Ssp I, Stu I, Sty I, Swa I, Taq I, Xba I, Xho I); glicosilasas (por ejemplo, uracil-ADN glicolsilasa (UDG), 3-metiladenina ADN glicosilasa, 3-metiladenina ADN glicosilasa II, pirimidina hidrato-ADN glicosilasa, FaPy-ADN glicosilasa, ADN glicosilasa con emparejamiento incorrecto a timina, hipoxantina-ADN glicosilasa, 5-Hidroximetiluracil ADN glicosilasa (HmUDG), 5-Hidroximetilcitosina ADN glicosilasa o 1,N6-eteno-adenina ADN glicosilasa); exonucleasas (por ejemplo, exonucleasa III); ribozimas y DNAzimas. La muestra de ácido nucleico puede tratarse con un agente químico o sintetizarse usando nucleótidos modificados, y el ácido nucleico modificado puede escindirse. En ejemplos no limitantes, el ácido nucleico de muestra puede tratarse con (i) agentes alquilantes tales como metilnitrosourea que generan varias bases alquiladas, incluyendo N3-metiladenina y N3-metilguanina, que se reconocen y se escinden por alquil purina ADN glicosilasa; (ii) bisulfito de sodio, que provoca la desaminación de residuos de citosina en el ADN para formar residuos de uracilo que pueden escindirse por uracil N-glicosilasa; y (iii) un agente químico que convierte la guanina en su forma oxidada, 8-hidroxiguanina, que puede escindirse mediante formamidopirimidina ADN N-glicosilasa. Los ejemplos de procesos de escisión química incluyen, sin limitación, alquilación (por ejemplo, alquilación de ácido nucleico modificado con fosforotioato); escisión de la labilidad ácida del ácido nucleico que contiene P3'-N5'-fosforamidato; y tratamiento de ácido nucleico con tetróxido de osmio y piperidina.
En algunas realizaciones, el reactivo de ácido nucleico incluye uno o más sitios de inserción de recombinasa. Un sitio de inserción de recombinasa es una secuencia de reconocimiento en una molécula de ácido nucleico que participa en una reacción de integración/recombinación mediante proteínas de recombinación. Por ejemplo, el sitio de recombinación para la recombinasa Cre es loxP, que es una secuencia de 34 pares de bases compuesta por dos repeticiones invertidas de 13 pares de bases (que sirven como sitios de unión de recombinasa) que flanquean una secuencia central de 8 pares de bases (por ejemplo, Sauer, Curr. Opin. Biotech. 5:521-527 (1994)). Otros ejemplos de sitios de recombinación incluyen secuencias attB, attP, attL y attR y mutantes, fragmentos, variantes y derivados de las mismas, que se reconocen por la proteína de recombinación A Int y por el factor de integración del huésped (IHF) de proteínas auxiliares, FIS y escisionasa (Xis) (por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 5.888.732; 6.143.557; 6.171.861; 6.270.969; 6.277.608; y 6.720.140; las Sol. de Patente de EE.UU. N.° 09/517.466 y 09/732.914; la Publicación de Patente de EE.UU. N.° US2002/0007051; y Landy, Curr. Opin. Biotech. 3:699-707 (1993)).
Los ejemplos de ácidos nucleicos de clonación de recombinasa se encuentran en los sistemas Gateway® (Invitrogen, California), que incluyen al menos un sitio de recombinación para clonar moléculas de ácido nucleico deseadas in vivo o in vitro. En algunas realizaciones, el sistema utiliza vectores que contienen al menos dos sitios de recombinación de sitio específico diferentes, a menudo basados en el sistema lambda del bacteriófago (por ejemplo, att1 y att2), y se mutan de los sitios de tipo silvestre (att0). Cada sitio mutado tiene una especificidad única para el sitio att de su compañero afín (es decir, el sitio de recombinación del compañero de unión) del mismo tipo (por ejemplo, attB1 con attP1 o attL1 con attR1) y no reaccionará de forma cruzada con los sitios de recombinación del otro tipo mutante o con el sitio att0 de tipo silvestre. Las diferentes especificidades de sitio permiten la clonación o el enlace direccional de las moléculas deseadas, proporcionando así la orientación deseada de las moléculas clonadas. Los fragmentos de ácido nucleico flanqueados por sitios de recombinación se clonan y se subclonan usando el sistema Gateway® reemplazando un marcador seleccionable (por ejemplo, ccdB) flanqueado por sitios att en la molécula de plásmido receptora, a veces denominado vector de destino. A continuación, se seleccionan los clones deseados mediante la transformación de una cepa huésped sensible a ccdB y la selección positiva de un marcador en la molécula receptora. Se pueden usar estrategias similares para la selección negativa (por ejemplo, el uso de genes tóxicos) en otros organismos tales como timidina cinasa (TK) en mamíferos e insectos.
Un reactivo de ácido nucleico a veces contiene uno o más elementos de origen de replicación (ORI, por sus siglas en inglés). En algunas realizaciones, un molde comprende dos o más ORI, en el que uno funciona de manera eficiente en un organismo (por ejemplo, una bacteria) y otro funciona de manera eficiente en otro organismo (por ejemplo, un eucariota, como una levadura, por ejemplo). En algunas realizaciones, un ORI puede funcionar eficazmente en una especie (por ejemplo, S. cerevisiae, por ejemplo) y otro ORI puede funcionar eficazmente en una especie diferente (por ejemplo, S. pombe, por ejemplo). Un reactivo de ácido nucleico también incluye a veces uno o más sitios de regulación de la transcripción.
Un reactivo de ácido nucleico, por ejemplo, un casete de expresión o un vector, puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto marcador. Se usa un producto marcador para determinar si un gen se ha entregado a la célula y si una vez entregado se está expresando. Los genes marcadores de ejemplo incluyen el gen lacZ de E. coli que codifica la p-galactosidasa y la proteína verde fluorescente. En algunas realizaciones, el marcador puede ser un marcador seleccionable. Cuando dichos marcadores seleccionables se transfieren con éxito a una célula huésped, la célula huésped transformada puede sobrevivir si se pone bajo presión selectiva. Hay dos categorías distintas de regímenes selectivos que se usan ampliamente. La primera categoría se basa en el metabolismo de una célula y el uso de una línea celular mutante que carece de la capacidad de crecer independientemente de un medio complementado. La segunda categoría es la selección dominante que se refiere a un esquema de selección usado en cualquier tipo de célula y no requiere el uso de una línea celular mutante. Normalmente, estos esquemas usan un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que tienen un gen nuevo expresarían una proteína que transmite resistencia al fármaco y sobrevivirían a la selección. Los ejemplos de dicha selección dominante usan los fármacos neomicina (Southern etal., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982)), ácido micofenólico, (Mulligan et al.,. Science 209: 1422 (1980)) o higromicina, (Sugden, et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985)).
Un reactivo de ácido nucleico puede incluir uno o más elementos de selección (por ejemplo, elementos para la selección de la presencia del reactivo de ácido nucleico y no para la activación de un elemento promotor que puede regularse selectivamente). Los elementos de selección a menudo se utilizan usando procesos conocidos para determinar si un reactivo de ácido nucleico está incluido en una célula. En algunas realizaciones, un reactivo de ácido nucleico incluye dos o más elementos de selección, en el que uno funciona de manera eficiente en un organismo y otro funciona de manera eficiente en otro organismo. Los ejemplos de elementos de selección incluyen, pero sin limitación, (1) segmentos de ácido nucleico que codifican productos que proporcionan resistencia contra compuestos de otro modo tóxicos (por ejemplo, antibióticos); (2) segmentos de ácido nucleico que codifican productos que por lo demás están ausentes en la célula receptora (por ejemplo, productos esenciales, genes de ARNt, marcadores auxotróficos); (3) segmentos de ácido nucleico que codifican productos que suprimen la actividad de un producto génico; (4) segmentos de ácido nucleico que codifican productos que pueden identificarse fácilmente (por ejemplo, marcadores fenotípicos tales como antibióticos (por ejemplo, p-lactamasa), p-galactosidasa, proteína verde fluorescente (GFP), proteína amarilla fluorescente (y Fp ), proteína roja fluorescente (RFP), proteína cian fluorescente (CFP) y proteínas de la superficie celular); (5) segmentos de ácido nucleico que se unen a productos que de otro modo son perjudiciales para la supervivencia y/o la función celular; (6) segmentos de ácido nucleico que de otro modo inhiben la actividad de cualquiera de los segmentos de ácido nucleico descritos en los N.° 1-5 anteriores (por ejemplo, oligonucleótidos no codificantes); (7) segmentos de ácido nucleico que se unen a productos que modifican un sustrato (por ejemplo, endonucleasas de restricción); (8) segmentos de ácido nucleico que pueden usarse para aislar o identificar una molécula deseada (por ejemplo, sitios de unión a proteínas específicos); (9) segmentos de ácido nucleico que codifican una secuencia de nucleótidos específica que de otro modo puede no ser funcional (por ejemplo, para la amplificación por PCR de subpoblaciones de moléculas); (10) segmentos de ácido nucleico que, cuando están ausentes, confieren directa o indirectamente resistencia o sensibilidad a compuestos particulares; (1 l) segmentos de ácido nucleico que codifican productos que son tóxicos o convierten un compuesto relativamente no tóxico en un compuesto tóxico (por ejemplo, timidina cinasa de herpes simple, citosina desaminasa) en las células receptoras; (12) segmentos de ácido nucleico que inhiben la replicación, la división o la heredabilidad de las moléculas de ácido nucleico que los contienen; y/o (13) segmentos de ácido nucleico que codifican funciones de replicación condicional, por ejemplo, replicación en determinados huéspedes o cepas de células huésped o bajo ciertas condiciones ambientales (por ejemplo, temperatura, condiciones nutricionales y similares).
Un reactivo de ácido nucleico puede ser de cualquier forma útil para la transcripción y/o traducción in vivo. Un ácido nucleico a veces es un plásmido, tal como un plásmido superenrollado, a veces es un cromosoma artificial de levadura (por ejemplo, YAC), a veces es un ácido nucleico lineal (por ejemplo, un ácido nucleico lineal producido por PCR o por digestión de restricción), a veces es monocatenario y, a veces, bicatenario. A veces, un reactivo de ácido nucleico se prepara mediante un proceso de amplificación, tal como un proceso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o un proceso de amplificación mediado por transcripción (TMA). En la TMA, se usan dos enzimas en una reacción isotérmica para producir productos de amplificación detectados por emisión de luz (por ejemplo, Biochemistry, 25 de junio de 1996; 35(25):8429-38). Se conocen procesos de PCR estándar (por ejemplo, Patentes de EE.UU. N.° 4.683.202; 4.683.195; 4.965.188; y 5.656.493), y generalmente se realizan en ciclos. Cada ciclo incluye la desnaturalización por calor, en la que se disocian los ácidos nucleicos híbridos; enfriamiento, en el que se hibridan los oligonucleótidos cebadores; y extensión de los oligonucleótidos por una polimerasa (es decir, polimerasa Taq). Un ejemplo de un proceso cíclico de PCR es tratar la muestra a 95 °C durante 5 minutos; repetir cuarenta y cinco ciclos de 95 °C durante 1 minuto, 59 °C durante 1 minuto, 10 segundos y 72 °C durante 1 minuto 30 segundos; y a continuación tratar la muestra a 72 °C durante 5 minutos. Con frecuencia se realizan múltiples ciclos usando un termociclador disponible comercialmente. Los productos de amplificación por PCR a veces se almacenan durante un tiempo a una temperatura inferior (por ejemplo, a 4 °C) y a veces se congelan (por ejemplo, a -20 °C) antes del análisis.
Fragmentación de ácidos nucleicos
En determinadas realizaciones, un ácido nucleico puede provenir de una biblioteca o puede obtenerse a partir de ADN genómico digerido enzimáticamente, cizallado o sometido a sonicación (por ejemplo, fragmentado) de un organismo de interés. En algunas realizaciones, el ácido nucleico sometido a fragmentación o escisión puede tener una longitud nominal, promedio o media de aproximadamente 5 a aproximadamente 10.000 pares de bases, de aproximadamente 100 a aproximadamente 1.000 pares de bases, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 pares de bases, o de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10000 pares de bases. Los fragmentos se pueden generar mediante cualquier método adecuado en la materia, y la longitud promedio, media o nominal de los fragmentos de ácido nucleico se puede controlar seleccionando un procedimiento de generación de fragmentos apropiado por parte de un experto en la materia. En algunas realizaciones, el ADN fragmentado puede seleccionarse por tamaño para obtener fragmentos de ácido nucleico de un rango de tamaño particular.
El ácido nucleico puede fragmentarse mediante diversos métodos conocidos por el experto en la materia, que incluyen, sin limitación, procesos físicos, químicos y enzimáticos. En el documento US2005/0112590 se describen ejemplos de dichos procesos. El experto en la materia puede seleccionar determinados procesos para generar fragmentos escindidos no específicamente o fragmentos escindidos específicamente. Los ejemplos de procesos que pueden generar un ácido nucleico de muestra de fragmento escindido no específicamente incluyen, sin limitación, poner en contacto el ácido nucleico de muestra con un aparato que expone el ácido nucleico a la fuerza de cizallamiento (por ejemplo, pasar el ácido nucleico a través de una aguja de jeringa; uso de una prensa francesa); exponer el ácido nucleico de muestra a irradiación (por ejemplo, radiación gamma, rayos X, radiación UV; el tamaño de los fragmentos pueden controlarse mediante la intensidad de la irradiación); hervir ácido nucleico en agua (por ejemplo, produce aproximadamente 500 fragmentos de pares de bases) y exponer el ácido nucleico a un proceso de hidrólisis de ácido y base.
Amplificación
Un ácido nucleico adecuado para su uso en las realizaciones descritas en el presente documento a veces se amplifica mediante cualquier proceso de amplificación conocido en la materia (por ejemplo, PCR, RT-PCR y similares). La amplificación de ácidos nucleicos puede ser particularmente beneficiosa cuando se usan organismos que normalmente son difíciles de cultivar (por ejemplo, de crecimiento lento, que requieren condiciones de cultivo especializadas y similares).
Los métodos de ejemplo para amplificar ácidos nucleicos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Mullis et al., (1986) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51 pt. 1:263; Cleary et al., (2004) Nature Methods 1:241; y las Patentes de EE.UU. N.° 4.683.195 y 4.683.202), PCR anclada, RACE Pc R, reacción en cadena de ligadura (LCR, por sus siglas en inglés) (Landegran et al., (1988) Science 241:1077-1080; y Nakazawa et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:360-364), replicación de secuencia autosostenida (Guatelli et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
87:1874), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:1173), Q-Beta Replicasa (Lizardi et al., (1988) BioTechnology 6:1197), PCR recursiva (Jaffe et al., (2000) J. Biol. Chem. 275:2619; y Williams et al., (2002) I Biol. Chem. 277:7790), los métodos de amplificación descritos en las Patentes de EE.UU. N.° 6.391.544; 6.365.375; 6.294.323; 6.261.797; 6.124.090; y 5.612.199, amplificación isotérmica (por ejemplo, amplificación por círculo rodante (RCA, por sus siglas en inglés), amplificación por círculo rodante hiperramificado (HRCA, por sus siglas en inglés), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA, por sus siglas en inglés), amplificación dependiente de helicasa (HDA, por sus siglas en inglés), PWGA, reacciones en cadena de polimerasa y/o ligasa, de ciclo térmico (PCR) o isotérmicamente (por ejemplo, RCA, hRCA, SDA, HDA, PWGA) o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia.
En algunas realizaciones, se puede realizar una reacción de amplificación limitada, también conocida como preamplificación. La preamplificación es un método en el que se produce una cantidad limitada de amplificación debido a que se realiza un pequeño número de ciclos, por ejemplo, 10 ciclos. La preamplificación puede permitir cierta amplificación, pero detiene la amplificación antes de la fase exponencial y normalmente produce aproximadamente 500 copias de la secuencia o secuencias de nucleótidos deseadas. El uso de la preamplificación también puede limitar las inexactitudes asociadas con los reactivos agotados en las reacciones de PCR estándar.
Secuenciación
La secuenciación se puede lograr mediante métodos clásicos de secuenciación de Sanger, que se conocen en la técnica. En algunas realizaciones, la secuenciación se puede realizar usando métodos de secuenciación de alto rendimiento, algunos de los cuales permiten la detección de un nucleótido secuenciado inmediatamente después o tras su incorporación en una hebra en crecimiento, por ejemplo, detección de secuencia en tiempo sustancialmente real o en tiempo real. En algunos casos, la secuenciación de alto rendimiento genera al menos 1.000, al menos 5.000, al menos 10.000, al menos 20.000, al menos 30.000, al menos 40.000, al menos 50.000, al menos 100.000 o al menos 500.000 lecturas de secuencia por hora; siendo cada lectura de al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 120 o al menos 150 bases por lectura (o 500 - 1000 bases por lectura).
Los métodos de secuenciación de alto rendimiento pueden incluir, pero sin limitación, secuenciación paralela masiva de la firma (MPSS, por sus siglas en inglés, Lynx Therapeutics), secuenciación con polonio, pirosecuenciación 454, secuenciación Illumina (Solexa), secuenciación SOLiD, secuenciación de semiconductores iónicos, secuenciación de nanoesferas de ADN, secuenciación de molécula única HelioscopeTM, secuenciación SMRTTM de molécula única, secuenciación en tiempo real de molécula única (RNAP, por sus siglas en inglés), secuenciación de ADN Nanopore y/o secuenciación por hibridación, por ejemplo, un método no enzimático que usa una micromatriz de ADN o secuenciación de Sanger con microfluidos.
Homología e identidad
Además de las secuencias promotoras reguladas, secuencias reguladoras y polinucleótidos codificantes proporcionados en el presente documento, un reactivo de ácido nucleico puede incluir una secuencia polinucleotídica un 80 % o más idéntica a la anterior (o a las secuencias complementarias). Es decir, una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80 % o más, 81 % o más, 82 % o más, 83 % o más, 84 % o más, 85 % o más, 86 % o más, 87 % o más, 88 % o más, 89 % o más, 90 % o más, 91 % o más, 92 % o más, 93 % o más, 94 % o más, 95 % o más, 96 % o más, 97 % o más, 98 % o más o un 99 % o más idéntica a una secuencia de nucleótidos descrita en el presente documento. El término "idéntica", como se usa en el presente documento, se refiere a dos o más secuencias de nucleótidos que tienen sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos cuando se comparan entre sí. Una prueba para determinar si dos secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos son sustancialmente idénticas es determinar el porcentaje de secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos idénticas compartidas.
Los cálculos de identidad de secuencia se pueden realizar de la siguiente manera. Las secuencias se alinean con fines comparativos óptimos (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para la alineación óptima y las secuencias no homólogas se pueden descartar para fines comparativos). La longitud de una secuencia de referencia alineada para fines comparativos es a veces un 30 % o más, 40 % o más, 50 % o más, a menudo un 60 % o más, y más a menudo un 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más o un 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. Los nucleótidos o aminoácidos en las correspondientes posiciones de nucleótidos o polipéptidos, respectivamente, se comparan a continuación entre las dos secuencias. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido o aminoácido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, se considera que los nucleótidos o aminoácidos son idénticos en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias va en función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se introducen para la alineación óptima de las dos secuencias.
La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden realizarse usando un algoritmo matemático. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos se puede determinar usando el algoritmo de Meyers y Miller, CABIOS 4: 11-17 (1989)), que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de restos ponderados PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando algoritmo de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970), que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en la dirección de Internet www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y una ponderación por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderación por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando el programa GAP en el paquete software GCG (disponible en la dirección de Internet www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y una ponderación de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y una ponderación de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un conjunto de parámetros que se usa con frecuencia es una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por apertura de hueco de 12, una penalización por extensión de hueco de 4 y una penalización por hueco de cambio de marco de 5.
La identidad de secuencia también se puede determinar mediante ensayos de hibridación realizados en condiciones rigurosas. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1 % a 50 °C. Otro ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1 % a 55 °C. Un ejemplo adicional de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1 % a 60 °C. A menudo, las condiciones de hibridación rigurosas son la hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1 % a 65 °C. Más a menudo, las condiciones de rigurosidad son fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7 % a 65 °C, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 1 % a 65 °C.
Definiciones
Como se usa en el presente documento, a menos que se indique de otro modo, el artículo "un/una" significa uno o más, a menos que se indique explícitamente de otro modo. Como se usa en el presente documento, a menos que se indique de otro modo, expresiones tales como "contener", "que contiene", "incluir", "que incluye", y similares significan "que comprende". Como se usa en el presente documento, a menos que se indique de otro modo, el término "o" puede ser conjuntivo o disyuntivo. Como se usa en el presente documento, a menos que se indique de otro modo, cualquier realización puede combinarse con cualquier otra realización. Como se usa en el presente documento, a menos que se indique de otro modo, algunas realizaciones de la invención en el presente documento contemplan intervalos numéricos. Cuando los intervalos están presentes, los intervalos incluyen los puntos extremos del intervalo. Además, cada subintervalo y valor dentro del intervalo está presente como si estuviera escrito explícitamente.
Los términos "amplificar", "amplificación", "reacción de amplificación" o "que amplifica", como se usan en el presente documento, se refieren a cualquier proceso in vitro para multiplicar las copias de una secuencia diana de ácido nucleico. La amplificación a veces se refiere a un aumento "exponencial" del ácido nucleico diana. Sin embargo, la "amplificación", como se usa en el presente documento, también puede referirse a aumentos lineales en los números de una secuencia diana seleccionada de ácido nucleico, pero es diferente a una etapa de extensión de cebador único de un solo paso.
Como se usa en el presente documento, "nucleósido bicíclico" se refiere a un nucleósido que tiene un resto de azúcar que comprende un anillo de azúcar (incluyendo, pero sin limitación, furanosa) que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar para formar un segundo anillo. En determinadas realizaciones, el puente conecta el carbono 4' con el carbono 2' de un grupo de anillo de azúcar de 5 miembros en la posición del anillo de azúcar.
Como se usa en el presente documento, la expresión "reacciones de escisión complementarias" se refiere a reacciones de escisión que se realizan en el mismo ácido nucleico usando diferentes reactivos de escisión o alterando la especificidad de escisión del mismo reactivo de escisión de manera que se generen patrones de escisión alternos del mismo ácido nucleico o proteína diana o de referencia. En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos de interés se pueden tratar con uno o más agentes de escisión específicos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más agentes de escisión específicos) en uno o más recipientes de reacción (por ejemplo, el ácido nucleico de interés se trata con cada agente de escisión específico en un recipiente separado).
La expresión "ADN polimerasa", como se usa en el presente documento, incluye ADN polimerasas que se han modificado, por ejemplo, mediante un proceso natural tal como un procesamiento postraduccional, o un proceso no natural, tal como modificación química. Dichas modificaciones pueden producirse en la cadena principal del péptido, las cadenas laterales de los aminoácidos o el extremo N o C. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilaciones, acilaciones, ADP-ribosilaciones, amidaciones, unión covalente de flavinas, grupos hemo, nucleótidos o derivados de nucleótidos, lípidos o derivados de lípidos, ciclaciones, puentes disulfuro, metilaciones y desmetilaciones, enlaces de cistina, formilaciones, Y-carboxilaciones, glucosilaciones, hidroxilaciones, fosforilaciones y la adición de aminoácidos mediada por ARNt.
El término "genomanipulado", como se usa en el presente documento, cuando se refiere a un microorganismo o célula, se refiere a un organismo o célula modificada que incluye una o más actividades distintas de una actividad presente en un microorganismo o célula utilizada como punto de partida para la modificación (por ejemplo, microorganismo/célula huésped u organismo/célula no modificada). Los microorganismos genomanipulados normalmente surgen como resultado de una modificación genética, normalmente introducida o seleccionada por un experto en la técnica usando técnicas fácilmente disponibles. Los ejemplos no limitantes de métodos útiles para generar una actividad alterada incluyen, introducir un polinucleótido heterólogo (por ejemplo, integración de ácidos nucleicos o genes, también denominada "knock n"), eliminar un polinucleótido endógeno, alterar la secuencia de una secuencia de ácido nucleico endógeno existente (por ejemplo, mutagénesis dirigida), alteración de una secuencia de ácido nucleico endógeno existente (por ejemplo, knock-out y mutagénesis mediada por transposones o elementos de inserción), selección de una actividad alterada en la que la selección provoca un cambio en una actividad de origen natural que puede heredarse de manera estable (por ejemplo, provoca un cambio en una secuencia de ácido nucleico en el genoma del organismo o en un ácido nucleico epigenético que se replica y pasa a las células hijas), mutagénesis basada en PCR y similares.
La expresión "modificación genética", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier adición, eliminación o alteración de ácido nucleico adecuada que facilite el transporte, por ejemplo, la incorporación, de un ácido nucleico diana en un microorganismo genomanipulado. Las modificaciones genéticas incluyen, sin limitación, la inserción de uno o más nucleótidos en un ácido nucleico nativo de un organismo huésped en una o más ubicaciones, la eliminación de uno o más nucleótidos en un ácido nucleico nativo de un organismo huésped en una o más ubicaciones, la modificación o sustitución de uno o más nucleótidos en un ácido nucleico nativo de un organismo huésped en una o más ubicaciones, la inserción de un ácido nucleico no nativo en un organismo huésped (por ejemplo, la inserción de un vector de replicación autónoma) y la eliminación de un ácido nucleico nativo en un organismo huésped (por ejemplo, la eliminación de un vector).
El término ácido nucleico "heterólogo", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que no está presente en un microorganismo huésped en algunas realizaciones. En determinadas realizaciones, un polinucleótido heterólogo está presente en una cantidad diferente (por ejemplo, un número de copias diferente) que en un microorganismo huésped, lo que puede lograrse, por ejemplo, introduciendo más copias de una secuencia de nucleótidos particular en un microorganismo huésped (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos particular puede estar en un ácido nucleico autónomo del cromosoma huésped o puede insertarse en un cromosoma). Un ácido nucleico heterólogo es de un organismo diferente en algunas realizaciones, y en determinadas realizaciones, es del mismo tipo de organismo pero de una fuente externa (por ejemplo, una fuente recombinante). Como se usa en el presente documento, el término "heterólogo" cuando se usa en referencia a una proteína, promotor o ácido nucleico se refiere a una proteína, promotor o ácido nucleico que se ha manipulado de alguna manera. Por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo, una región codificante heteróloga o un promotor heterólogo incluye un ácido nucleico, una región codificante o un promotor que normalmente no está en la especie a la que se ha introducido o que normalmente no está unido a los ácidos nucleicos a los que está unido. Por lo tanto, un ácido nucleico o proteína heteróloga incluye un ácido nucleico o proteína que es nativa de un tipo de organismo pero que se ha alterado de alguna manera (por ejemplo, se ha colocado en una ubicación cromosómica diferente, ha mutado, se ha añadido en múltiples copias, se ha unido a un promotor no nativo o elemento potenciador, etc.). Los genes heterólogos incluyen secuencias génicas que comprenden formas de ADNc de un gen. Las regiones codificantes heterólogas se pueden distinguir de las regiones codificantes endógenas, por ejemplo, cuando las regiones codificantes heterólogas se unen a secuencias de nucleótidos que comprenden elementos reguladores tales como promotores que no se encuentran asociados de forma natural con la región codificante, o cuando las regiones codificantes heterólogas están asociadas con porciones de un cromosoma que no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, genes expresados en locus en los que la proteína codificada por la región codificante no se expresa normalmente). De manera similar, los promotores heterólogos pueden ser promotores que están unidos a una región codificante a la que no están unidos en la naturaleza.
El término "aislado", como se usa en el presente documento, se refiere al material eliminado de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si se produce de forma natural, o una célula huésped si se expresa exógenamente) y, por lo tanto, se altera "por la mano del hombre" con respecto a su entorno original.
Como se usa en el presente documento, "nucleósido modificado" se refiere a un nucleósido que comprende al menos una modificación en comparación con los nucleósidos de ARN o ADN de origen natural. Dicha modificación puede estar en el resto de azúcar y/o en las nucleobases.
El término "mutagénesis", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier modificación de un ácido nucleico (por ejemplo, reactivo de ácido nucleico o cromosoma huésped, por ejemplo) que se usa posteriormente para generar un producto en un huésped u organismo modificado. Los ejemplos no limitantes de mutagénesis incluyen deleción, inserción, sustitución, reordenamiento, mutaciones puntuales, mutaciones supresoras y similares. Los métodos de mutagénesis se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles para el experto. En el presente documento se describen ejemplos no limitantes de métodos de mutagénesis y también se pueden encontrar en Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning: a Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. Se puede realizar otro ejemplo no limitante de mutagénesis usando un kit "QuickChange" de Stratagene (San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante.
La expresión "secuencia nativa", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de nucleótidos no modificada que se encuentra en su entorno natural (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que se encuentra en un organismo).
Una "modificación de ácido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere a una alteración, normalmente una alteración química, que está presente en la molécula de ácido nucleico modificada en comparación con la molécula de ácido nucleico de origen natural o común. Se puede haber realizado una modificación en cualquier componente del ácido nucleico, por ejemplo, en la cadena principal, el componente de azúcar o la base. A modo de ejemplo, un ácido nucleico modificado puede tener una cadena principal de fosforotioato, en lugar de la cadena principal de fosfodiéster de origen natural. A menudo se realizan modificaciones de este tipo en los ácidos nucleicos que se van a usar en terapia. Las modificaciones y los ácidos nucleicos modificados se describen con más detalle en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, "nucleobase" se refiere a la porción de base heterocíclica de un nucleósido. Las nucleobases pueden ser de origen natural, pueden modificarse, pueden no tener similitud con las bases naturales y pueden sintetizarse, por ejemplo, mediante síntesis orgánica. En determinadas realizaciones, una nucleobase puede comprender cualquier átomo o grupo de átomos capaz de unirse por enlaces de hidrógeno a una base de otro ácido nucleico o carecer por completo de enlaces de hidrógeno. En determinadas realizaciones, una nucleobase no natural puede no obtenerse a partir de una nucleobase natural. En determinadas realizaciones, una nucleobase no natural puede ser una nucleobase sintética. Cabe señalar que las nucleobases no naturales no necesariamente poseen propiedades básicas, sin embargo, se denominan nucleobases por simplicidad. Cuando se hace referencia a una nucleobase, una "(d)" indica que la nucleobase se puede unir a una desoxirribosa o una ribosa.
Como se usa en el presente documento, "nucleósido" se refiere a un compuesto que comprende un resto de nucleobase y un resto de azúcar. Los nucleósidos incluyen, pero sin limitación, nucleósidos de origen natural (como se encuentran en el ADN y el ARN), nucleósidos abásicos, nucleósidos modificados y nucleósidos que tienen bases miméticas y/o grupos de azúcar. Los nucleósidos se pueden modificar con cualquiera de diversos sustituyentes. Un nucleósido puede ser un compuesto glucósido formado a través de un enlace glucosídico entre una base de ácido nucleico y un grupo reductor de un azúcar. Cabe señalar que la expresión "base de ácido nucleico" pretende abarcar adenina, guanina, citosina, timina, uracilo y también derivados de los mismos. El tipo de derivado anterior no está limitado de ningún modo.
El término "nucleótido" se refiere a un compuesto en el que el resto de azúcar del nucleósido anterior forma un éster con ácido fosfórico, más preferentemente un mono, di o trifosfato éster. El resto de azúcar de tal nucleósido o nucleótido puede ser ribofuranosilo, 2'-desoxirribofuranosilo o ribofuranosilo 2'-sustituido que tiene un sustituyente en la posición 2'. Asimismo, el resto de ácido fosfórico puede ser ácido tiofosfórico. Concretamente, los restos de azúcar y ácido fosfórico pueden estar en la misma forma que se encuentran en los nucleósidos, nucleótidos o derivados de los mismos conocidos. Se puede usar un ribonucleótido cuyo resto de azúcar es ribofuranosilo como miembro que constituye el ARN. Se puede usar un desoxirribonucleótido cuyo resto de azúcar es desoxirribofuranosilo como miembro que constituye el ADN. Un nucleótido puede ser un nucleósido que comprende además un grupo de enlaces fosfato. Los nucleótidos pueden incluir nucleósidos que contienen un resto de fosfato. Como se usa en el presente documento, los "nucleósidos unidos" pueden estar o no unidos mediante enlaces fosfato y, por lo tanto, incluyen "nucleótidos unidos".
Los términos "sondas" o "cebadores", como se usan en el presente documento, se refieren a oligonucleótidos que hibridan de una manera específica de bases con una hebra complementaria de una molécula de ácido nucleico. Las sondas pueden incluir cebadores, que pueden ser una sonda oligonucleotídica monocatenaria que puede actuar como punto de inicio de la síntesis o amplificación de ADN dirigida por molde usando métodos que incluyen, pero sin limitación, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de la ligasa (LCR) para la amplificación de una secuencia diana. Los oligonucleótidos, como se describen en el presente documento, pueden incluir segmentos o fragmentos de secuencias de ácido nucleico, o sus complementos. En algunas realizaciones, los segmentos de ADN pueden tener entre 5 y 10.000 bases contiguas, y pueden variar de 5, 10, 12, 15, 20 o 25 nucleótidos a 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 o 10.000 nucleótidos. Además de ADN y ARN, las sondas y cebadores pueden incluir ácidos nucleicos polipeptídicos (PNA), como se describe en Nielsen et al., Science 254: 1497-1500 (1991). Una sonda o cebador puede comprender una región de secuencia de nucleótidos que se hibrida con al menos aproximadamente 15, normalmente aproximadamente 20-25, y en determinadas realizaciones aproximadamente 40, 50, 60 o 75, nucleótidos consecutivos de una molécula de ácido nucleico.
El término "proteína", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que tiene una secuencia de aminoácidos unida por enlaces peptídicos. Este término incluye proteínas de fusión, oligopéptidos, péptidos, péptidos cíclicos, polipéptidos y derivados polipeptídicos, tanto nativos como recombinantes, y también incluye fragmentos, derivados, homólogos y variantes de los mismos.
El término "purificado", como se usa en el presente documento, con referencia a moléculas no se refiere a pureza absoluta. En su lugar, "purificado" se refiere a una sustancia en una composición que contiene menos especies de sustancias de la misma clase (por ejemplo, especies de ácidos nucleicos o proteínas) distintas de la sustancia de interés en comparación con la muestra de la que se originó. "Purificado", si es un ácido nucleico o una proteína, por ejemplo, se refiere a una sustancia en una composición que contiene menos especies de ácidos nucleicos o especies de proteínas distintas del ácido nucleico o la proteína de interés en comparación con la muestra de la que se originó. Algunas veces, una proteína o ácido nucleico es "sustancialmente puro", lo que indica que la proteína o ácido nucleico representa al menos el 50 % de proteína o ácido nucleico basado en la masa de la composición. Con frecuencia, una proteína o ácido nucleico sustancialmente puro es al menos el 75 % basado en la masa de la composición y, a veces, al menos el 95 % basado en la masa de la composición.
Como se usa en el presente documento, una "secuencia señal" o "secuencia señal de localización" se refiere a una secuencia que localiza una proteína o péptido traducido en un componente de un sistema.
La expresión "agente de escisión específico", como se usa en el presente documento, se refiere a un agente, a veces un producto químico o una enzima que puede escindir un ácido nucleico en uno o más sitios específicos.
Como se usa en el presente documento, la expresión "condiciones rigurosas" se refiere a condiciones para la hibridación y el lavado. Las condiciones rigurosas se conocen por los expertos en la materia y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6 (1989). Se describen métodos acuosos y no acuosos en esa referencia y pueden usarse cualesquiera.
Como se usa en el presente documento, "resto de azúcar" significa un anillo de azúcar natural o modificado.
Como se usa en el presente documento, "vector" se refiere a cualquier portador que contenga ADN exógeno. Por lo tanto, los vectores son agentes que transportan el ácido nucleico exógeno a una célula sin degradación e incluyen un promotor que produce la expresión del ácido nucleico en las células a las que se entrega. Los vectores incluyen, pero sin limitación, plásmidos, ácidos nucleicos virales, virus, ácidos nucleicos de fagos, fagos, cósmidos y cromosomas artificiales.
Ejemplos
Debe entenderse que los siguientes ejemplos no deben interpretarse como limitantes de la metodología, protocolos y composiciones particulares, etc., descritos en el presente documento y, como tal, pueden variar. Los siguientes términos usados en el presente documento tienen el propósito de describir realizaciones particulares únicamente, y no pretenden limitar el alcance de las realizaciones desveladas en el presente documento.
Ejemplo 1:
Preparación de C41(DE3)-pACS electrocompetente
Se cultivó durante una noche un solo clon de C41(DE3)-pACS de E. coli recién transformado en medio 2xYT (3 ml) complementado con estreptomicina (50 pg/ml) y KPi (50 mM). Después de la dilución 100 veces en el mismo medio (300 ml) y un crecimiento a 37 °C a una DO600 de 0,20, se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM para inducir la expresión de PtNTT2. Después de 40 min, los cultivos se enfriaron rápidamente a 0 °C, se lavaron con agua estéril (3 x 150 ml) y se suspendieron de nuevo en glicerol al 10 % (1,5 ml).
Electroporación y recuperación
Se mezcló una alícuota de células C41(DE3)-pACS electrocompetentes (50 pl) con pINF (2 pl, 400 ng) y se sometió a electroporación en una cubeta con un espacio de 0,2 cm. Se añadió medio 2xYT calentado previamente (0,95 ml, 50 |jg/ml de estreptomicina, IPTG 1 mM, KPi 50 mM) y, después de la mezcla, se eliminaron 45 j l y se combinaron con 105 j l del mismo medio (dilución de 3,3 veces) complementado con 0,25 mM de dNaMTP y d5SICSTP. Se dejó que la mezcla resultante se recuperara durante 1 h a 37 °C con agitación (210 rpm).
Crecimiento y análisis
Después de la recuperación, las células se centrifugaron, se eliminó el medio gastado (0,15 ml) y se analizó la composición de nucleótidos por HPLC (figura 12A). Las células se suspendieron de nuevo en medio 2xYT recién preparado (1,5 ml, 50 pg/ml de estreptomicina, 100 pg/ml de ampicilina, IPTG 1 mM, KPi 50 mM, dNaMTP 0,25 mM, d5SlCSTP 0,25 mM) y se cultivaron a 37 °C con agitación (250 rpm). En puntos temporales definidos, se determinó la DO600, se eliminaron las alícuotas (100 pl) y se centrifugaron (8000 rfu durante 5 min, 4 °C). El medio gastado se analizó para determinar la composición de nucleótidos mediante HPLC y se recuperó pINF mediante purificación en columna de centrifugación (Zymo Research Corp.). La retención del UBP se caracterizó por amplificación por PCR y electroforesis en gel o secuenciación como se describe a continuación. Los datos representan el promedio de tres experimentos independientes. No se observó ningún producto de PCR cuando se añadió pINF sin electroporación, eliminando el plásmido no amplificado como fuente del producto de PCR (figura 12B).
Materiales
Se obtuvieron 2xYT, 2xYT-agar, IPTG, ampicilina y estreptomicina en Fisher Scientific. Se usaron ampicilina y estreptomicina a 100|jg/ml y 50 jg/ml, respectivamente. Construcciones de pET-16b que contienen los transportadores de nucleótidos, pET16b-PpNTT2, cepa C41(DE3) de E. coli. Plásmidos pUC19 Thermo Scientific y pCDF-1b EMD Millipore. Los plásmidos se purificaron usando el kit PureLink Quick Plasmid DNA Miniprep (Life Technologies). Las ADN polimerasas OneTaq, DeepVent, Q5 Hot Start High-Fidelity y todas las endonucleasas de restricción se obtuvieron en New England Biolabs. En general, las reacciones de PCR se dividieron en múltiples alícuotas seguidas en tiempo real usando 05x Sybr Green I (Life Technologies); después de la PCR, las alícuotas se recombinaron, se purificaron mediante una columna de centrifugación (DNA Clean and Concentrator-5; Zymo Research, Irvine, CA) con elución en 20 j l de agua, a continuación se separaron en un gel de agarosa, seguido de la escisión de la banda y la recuperación (kit de recuperación de ADN en gel Zymoclean), eluyendo con 20 j l de agua a menos que se indique de otro modo. Los geles PAGE se tiñeron con 1x Sybr Gold (Life Technologies) durante 30 min, los geles de agarosa se vertieron con 1x Sybr Gold. Los geles se visualizaron usando un Molecular Imager Gel Doc XR+ equipado con un filtro 520DF30 (Bio-Rad) y se cuantificaron con el software Quantity One (Bio-Rad). Las secuencias de los oligonucleótidos de ADN de ejemplo usados se muestran en la Tabla 8. Los oligonucleótidos naturales se adquirieron en una fuente comercial. La concentración de ADNbc se midió mediante unión de colorante fluorescente (kit de ensayo Quant-iT dsDNA HS, Life Technologies), a menos que se indique de otro modo. La concentración de ADNmc se determinó mediante absorción de UV a 260 nm usando un NanoDrop 1000 (Thermo Scientific). [a-32P]-dATP (25 jC i). Placas de TLC Bakerflex® prerrecubiertas de polietileniminocelulosa (0,5 mm). dNaM fosforamidita, nucleósidos de dNaM y d5SICS. Los nucleósidos libres de dNaM y d5SICS se convirtieron en los correspondientes trifosfatos en condiciones de Ludwig. Después de la purificación mediante cromatografía de intercambio aniónico (DEAE Sephadex A-25) seguida de HPLc de fase inversa (C18) y elución a través de una columna Dowex 50WX2-sodio, ambos trifosfatos se liofilizaron y se mantuvieron a -20 °C hasta su uso. El análogo de d5SICSTP dTPT3TP y el análogo de dNaMTP biotinilado dMMO2SSBI0 TP4 se prepararon como se ha informado previamente. Se realizó un análisis por espectrometría de masas MALDI-TOF.
Construcción de plásmidos de expresión de NTT
El gen PtNTT2 se amplificó a partir del plásmido pET-16b-PtNTT2 usando los cebadores PtNTT2-fwd y PtNTT2-rev; el gen TpNTT2 se amplificó a partir del plásmido pET-16b-TpNTT2 usando los cebadores TpNTT2-fwd y TpNTT2-rev. Se generó un fragmento lineal de pCDF-1b usando los cebadores pCDF-1b-fwd y pCDF-1b-rev. Los fragmentos se purificaron. A continuación, el fragmento de pCDF-1b (100 ng, 4,4 x 10'14 mol) y el fragmento de PtNTT2 (78 ng, 4,4 x 10'14 mol) o TpNTT2 (85 ng, 4,4 x 10'14 mol) se ensamblaron usando clonación de extensión de polimerasa circular sin restricción en tampón de reacción 1x OneTaq, MgSO4 ajustado a 3,0 mM, 0,2 mM de dNTP y 0,02 U /jl de ADN OneTaq en las siguientes condiciones de ciclo térmico: Desnaturalización inicial (96 °C, 1 min); 10 ciclos de desnaturalización (96 °C, 30 s), hibridación touchdown (54 °C a 49,5 °C durante 30 s (-0,5 °C por ciclos)), extensión de 68 °C durante 5 min y extensión final (68 °C, 5 min). Tras la finalización, las muestras se purificaron y se usaron para la transformación por choque térmico de XL10 de E. coli. Se seleccionaron colonias individuales en agar LB que contenía estreptomicina y se ensayaron mediante PCR de colonias con los cebadores PtNTT2-fwd/rev o TpNTT2-fwd/rev. La presencia de los genes NTT se confirmó mediante secuenciación y doble digestión con endonucleasas de restricción ApaI/EcoO109I con el siguiente patrón esperado: pCDF-1b-PtNTT2 (2546/2605 pb), pCDF-1b-TpNTT2 (2717/2605 pb), pCDF-1b (1016/2605 pb). La secuencia de nucleótidos completa del plásmido pCDF-1b/PtNTT2 (es decir, pACS) se proporciona como SEQ ID NO:1.
Ejemplo 2: Protocolo general para cuantificar la captación de nucleósidos trifosfato
Condiciones de crecimiento
Se cultivó C41(DE3) de E. coli recién transformada con pCDF-1b-PtNTT2 en 2xYT con estreptomicina durante una noche, a continuación se diluyó (1:100) en medio 2xYT recién preparado (1 ml de cultivo por captación con [a-32P]-dATP; 2 ml de cultivo por captación con d5SICSTP o dNaMTP) complementado con fosfato de potasio (KPi) 50 mM y estreptomicina. Un control negativo con el transportador inactivo pET-16b-RpNTT2 se trató de forma idéntica excepto que se usó ampicilina en lugar de estreptomicina. Las células se cultivaron a una DO600 de ~0,6 y se indujo la expresión mediante la adición de IPTG (1 mM). Se dejó crecer el cultivo durante una hora más (DO600 final ~1,2) y a continuación se analizó directamente para determinar la captación como se describe a continuación usando un método adaptado de Haferkamp, et al.
Preparación de la fracción de medio
Se añadieron dNaMTP o d5SICSTP (10 mM cada uno) al medio hasta una concentración final de 0,25 mM. Las células se incubaron con el sustrato con agitación a 37 °C durante 30 min y a continuación se sedimentaron (8.000 rfu durante 5 min, 4 °C). Se mezcló una alícuota de la fracción de medio (40 j l ) con acetonitrilo (80 j l) para precipitar las proteínas y a continuación se incubó a TA durante 30 min. Las muestras se analizaron inmediatamente por HPLC o se almacenaron a -80 °C hasta el análisis. El análisis comenzó con centrifugación (12.000 rfu durante 10 min, TA), a continuación el sedimento se desechó, y el sobrenadante se redujo a ~20 jl, se suspendió de nuevo en TEAB 0,1 M al 95 %, pH 7,5; acetonitrilo al 5 %, a un volumen final de 50 j l y se analizó por HPLC.
Preparación de la fracción citoplasmática
Para analizar la desfosforilación intracelular de nucleósidos trifosfato no naturales, los sedimentos celulares se sometieron a 3 x 100 j l de lavados de KPi enfriado con hielo (50 mM). A continuación, los sedimentos se suspendieron de nuevo en 250 j l de KPi enfriado con hielo (50 mM) y se lisaron con 250 j l de tampón de lisis L7 del kit PureLink Quick Plasmid DNA Miniprep (NaOH 200 mM, SDS al 1 % p/v), después de lo cual la solución resultante se incubó a TA durante 5 min. Se añadió tampón de precipitación N4 (350 jl, acetato de potasio 3,1 M, pH 5,5) y la muestra se mezcló hasta homogeneidad. Después de la centrifugación (>12.000 rfu durante 10 min, TA), se aplicó el sobrenadante que contenía los nucleótidos no naturales a una columna de extracción en fase sólida C18 lavada previamente con acetonitrilo (1 ml) y TEAB 0,1 M al 95 %, pH 7,5; acetonitrilo al 5 % (1 ml). A continuación, la columna se lavó con TEAB 0,1 M al 95 %, pH 7,5; se eluyeron acetonitrilo al 5 % y los nucleótidos con 1 ml de acetonitrilo al 50 %:bicarbonato de trietilamonio (TEAB) al 50 % 0,1 M (pH 7,5). El eluyente se redujo a ~50 j l y su volumen se ajustó a 100 j l con TEAB 0,1 M al 95 %, pH 7,5; acetonitrilo al 5 % antes del análisis por HPLC.
HPLC
Se aplicaron muestras a una columna LC (3 jm C18 300 A, 250 x 4,6 mm) y se sometieron a un gradiente lineal del 0-40 % con TEAB 0,1 M al 20 %, pH 7,5; acetonitrilo al 80 % durante 40 min a un caudal de 1 ml/min. Cuantificación
La serie de inyecciones incluía dos muestras de control adicionales que contenían 5 nmol de dNaMTP o d5SICSTP. Las áreas bajo los picos que correspondían a trifosfato, difosfato, monofosfato y nucleósido libre (confirmadas por MALDI-TOF) se integraron tanto para el control como para las muestras desconocidas. Después de la integración de los picos, la relación del pico desconocido con respecto al pico de control ajustado por la pérdida de la etapa de extracción (62 % y 70 % de pérdida para dNaM y d5SICS, respectivamente), proporcionó una medida de la cantidad de cada uno de los restos en un muestra. Para determinar las concentraciones relativas de nucleótido no natural dentro de una célula, la cantidad de nucleótido no natural incorporado se dividió a continuación por el volumen de células, que se calculó a partir del volumen de una sola célula de E. coli de (1 jm 3) multiplicado por el número de células en cada cultivo (DO600 de 1,0 igual a 1 x 109 células por ml). Se usó una muestra de RpNTT2 como control negativo y se restó su señal para tener en cuenta cualquier lavado incompleto de especies de nucleótidos del medio.
d X T P (jm o l)
[dXTP] = __________________________________—____-____________________________ vo lum en ce lu la r (1 x 10_9 j l cé lu la_1) x núm ero de células (2,4 x 109)
Captación de dATP
Para analizar la desfosforilación intracelular de dATP, después de la inducción de un NTT, se inició una reacción de captación mediante la adición de dATP (enriquecido con [a-32P]-dATP) a una concentración final de 0,25 mM, seguida de incubación a 37 °C con agitación durante 30 min. A continuación, se centrifugó un cultivo (8.000 rfu durante 5 min, TA). El sobrenadante se analizó mediante cromatografía de capa fina (TLC), mientras que los sedimentos celulares se lavaron 3 veces con KPi enfriado con hielo (50 mM, 100 j l) para eliminar el exceso de sustrato radiactivo, se lisaron con NaOH (0,2 M, 100 j l ) y se centrifugaron (10.000 rfu durante 5 min, TA) para sedimentar los desechos celulares, antes de analizar el sobrenadante (1,5 j l ) por TLC.
Análisis por TLC
Se aplicaron muestras (1 j l ) en una placa de TLC de polietileniminacelulosa de 0,5 mm y se eluyeron primero con formiato de sodio (0,5 M, pH 3,0) durante 30 s, a continuación con formiato de sodio (2,5 M, pH 3,0) durante 2,5 min y finalmente con formiato de sodio (4,0 M, pH 3,0) durante 40 min. Las placas se secaron usando una pistola de calor y se cuantificaron mediante software de imagenología e imagenología de fósforo.
Ejemplo 3: Métodos desarrollados para la extracción de nucleótidos de células para el análisis por HPLC
Para minimizar el efecto de los protocolos de lisis y extracción de trifosfato sobre la descomposición del nucleósido trifosfato dentro de la célula, se descubrió el siguiente procedimiento de extracción que condujo a una recuperación inesperadamente más alta con un grado bajo de descomposición (Tabla 9). Las células se cultivaron, se lavaron y a continuación se añadieron 5 nmol de dNaMTP o d5SICSTP a los sedimentos, que a continuación se sometieron a diversos tipos de extracciones, incluyendo agua hirviendo, etanol caliente, metanol frío, congelación y descongelación, lisozima, perlas de vidrio, NaOH, ácido tricloroacético (TCA) con freón y ácido perclórico (PCA) con KOH. La recuperación y la composición del control se cuantificaron por HPLC. Se encontró que el Método 3, es decir, la lisis celular con NaOH (Tabla 6), era inesperadamente eficaz y reproducible. Los sedimentos se suspendieron de nuevo en KPi enfriado con hielo (50 mM, 250 j l) antes de la adición de NaOH para disminuir la desfosforilación después de la lisis celular (Método 4).
Tabla 6 - Métodos de extracción
Figure imgf000082_0001
Ejemplo 4: Construcción de pINF
Preparación del inserto no natural
Se preparó el oligonucleótido TK-1-dNaM que contenía dNaM usando síntesis de ADN en fase sólida con fosforamiditas de síntesis de ADN ultra-suave sobre soportes ultra-suaves de CPG (1 jm ol) y un sintetizador de ácido nucleico. Después de la síntesis, el oligonucleótido d MT-ON se desprotegió mediante tratamiento con hidróxido de amoniaco concentrado a 50 °C durante una noche, se purificó y a continuación se sometió a PAGE al 8 % en urea 8 M. El gel se visualizó mediante sombreado UV, se cortó la banda correspondiente a 75 mer y se recuperó el ADN mediante extracción por trituración y remojo, filtración (0,45 jm ) y desalación final sobre Sephadex G-25. La concentración de oligonucleótido monocatenario se determinó mediante absorción UV a 260 nm (donde el coeficiente de extinción de dNaM a 260 nm se asumió igual al de dA). A continuación, se amplificó TK-1-dNaM (4 ng) mediante PCR en las siguientes condiciones: 1 x tampón de reacción OneTaq, MgSO4 ajustado a 3,0 mM, 0,2 mM de dNTP, 0,1 mM de dNaMTP, 0,1 mM del análogo de d5SICSTP dTPT3TP, 1 jM de cada uno de los cebadores pUC19-fusionfwd y pUC19-fusion-rev, y 0,02 U /jl de ADN polimerasa OneTaq (en un total de 4 reacciones de 50 j l) en las siguientes condiciones de ciclo térmico: Desnaturalización inicial (96 °C, 1 min) seguida de 12 ciclos de desnaturalización (96 °C, 10 s), hibridación (60 °C, 15 s) y extensión (68 °C, 2 min). Se realizó una PCR similar sin trifosfatos no naturales para obtener un inserto completamente natural en condiciones similares para la construcción del plásmido de control natural. Las reacciones se sometieron a purificación en columna de centrifugación y a continuación el producto de PCR diana (122 pb) se purificó mediante un gel de agarosa al 4 %.
Linealización de pUC19
Se amplificó pUC19 (20 ng) por PCR en las siguientes condiciones: 1 x tampón de reacción Q5, MgSO4 ajustado a 3,0 mM, 0,2 mM de dNTP, 1 jM de cada cebador pUC19-lin-fwd y pUC19-lin-rev, y 0,02 U /jl de ADN polimerasa Q5 Hot Start High-Fidelity (en un total de 4 reacciones de 50 j l con una reacción que contiene 0,5 x Sybr Green I) en las siguientes condiciones de ciclo térmico: Desnaturalización inicial (98 °C, 30 s); 20 ciclos de desnaturalización (98 °C, 10 s), hibridación (60 °C, 15 s) y extensión (72 °C, 2 min); y extensión final (72 °C, 5 min). El producto de PCR deseado (2611 pb) se purificó mediante un gel de agarosa al 4 %.
Ensamblaje por PCR de pINF y el plásmido de control natural
Se amplificó un fragmento lineal a partir de pUC19 usando los cebadores pUC19-lin-fwd y pUC19-lin-rev. El producto resultante (800 ng, 4,6 x 10-13 mol) se combinó con el inserto natural o no natural (véase anteriormente) (56 ng, 7,0 x 10-13 mol) y se ensambló por PCR de extensión de superposición circular en las siguientes condiciones: 1x tampón de reacción OneTaq, MgSO4 ajustado a 3,0 mM, 0,2 mM de dNTP, 0,1 mM de dNaMTP, 0,1 mM del análogo de d5SICSTP dTPT3TP y 0,02 U /jl de ADN polimerasa OneTaq (en un total de 4 reacciones de 50 j l con una reacción que contiene 0,5 x Sybr Green I) usando las siguientes condiciones de ciclo térmico: Desnaturalización inicial (96 °C, 1 min); 12 ciclos de desnaturalización (96 °C, 30 s), hibridación 62 °C, 1 min) y extensión (68 °C, 5 min); extensión final (68 °C, 5 min); y enfriamiento lento (68 °C a 10 °C a una velocidad de -0,1 °C/s). El producto de la Pc R se analizó mediante digestión por restricción en agarosa al 1 % y se usó directamente para la transformación de E. coli. Se usó el análogo de d5SICS dTPT3 emparejado con dNaM y dTPT3TP en lugar de d5SICSTP ya que el ADN que contiene dTPT3-dNaM se amplifica mejor por PCR que el ADN que contiene d5SICS-dNaM, y esto facilitó la construcción de pINF de alta calidad (contenido de UBP >99 %).
Ejemplo 5: Replicación de pINF en E. coli
Preparación de células electrocompetentes
Las células C41(DE3) se transformaron mediante choque térmico con 200 ng de plásmido pACS, y los transformantes se seleccionaron durante una noche en agar 2xYT complementado con estreptomicina. Se cultivó durante una noche un solo clon de C41(DE3)-pACS recién transformado en medio 2xYT (3 ml) complementado con estreptomicina y KPi (50 mM). Después de una dilución de 100 veces en el mismo medio 2xYT recién preparado (300 ml), las células se cultivaron a 37 °C hasta que alcanzaron una DO600 de 0,20, momento en el que se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM para inducir la expresión de PtNTT2. Las células se cultivaron durante 40 min más y a continuación se detuvo el crecimiento mediante enfriamiento rápido en hielo-agua con agitación intensiva. Después de la centrifugación en una centrífuga enfriada previamente (2400 rfu durante 10 min, 4 °C), se eliminó el medio gastado y las células se prepararon para la electroporación mediante lavado con agua estéril enfriada con hielo (3 x 150 ml). Después del lavado, las células se resuspendieron en glicerol al 10 % helado (1,5 ml) y se dividieron en alícuotas de 50 pl. Las células se congelaron para almacenarlas para su uso posterior. Se usaron células recién preparadas y se pueden usar células congeladas.
Electroporación y recuperación
La alícuota de células se mezcló con 2 pl de plásmido (400 ng), se transfirió a una cubeta de electroporación con un espacio de 0,2 cm y se sometió a electroporación usando un Gene Pulser de Bio-Rad de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (tensión 25 kV, condensador 2,5 pF, resistencia 200 O, constante de tiempo 4,8 ms). Se añadió medio 2xYT calentado previamente (0,95 ml, estreptomicina, IPTG 1 mM, KPi 50 mM) y, después de la mezcla, se tomaron 45 pl y se combinaron con 105 pl del mismo medio (dilución de 3,33 veces) complementado con 0,25 mM de dNaMTP y d5SICSTP.
Crecimiento y análisis
Después de la recuperación, las células se centrifugaron (4000 rfu durante 5 min, 4 °C), el medio gastado (0,15 ml) se eliminó y se analizó la composición de nucleótidos por HPLC. Las células se suspendieron de nuevo en medio 2xYT recién preparado (1,5 ml, estreptomicina, ampicilina, IPTG 1 mM, KPi 50 mM, dNaMTP 0,25 mM, d5SICSTP 0,25 mM) y se cultivaron durante una noche a 37 °C mientras se agitaban (250 rpm), dando como resultado una dilución de 10 veces en comparación con el medio de recuperación o una dilución de 33,3 veces en comparación con las células transformadas originalmente. Se tomaron alícuotas (100 pl) después de 15, 19, 24, 32, 43, 53, 77, 146 h, se determinó la DO600 y las células se centrifugaron (8000 rfu durante 5 min, 4 °C). El medio gastado se analizó para determinar la composición de nucleótidos por HPLC y las mezclas de plásmidos pINF y pACS se purificaron mediante recuperación por columna giratoria, se eluyeron en 30 pl de agua y se analizaron mediante digestión por restricción. La retención del UBP en el plásmido pINF se cuantificó mediante un ensayo de movilidad por desplazamiento en gel de biotina y secuenciación.
Se extendió medio de transformación (10 pl) sobre 2xYT-agar que contenía estreptomicina con diluciones de 10 veces y 50 veces para determinar las unidades formadoras de colonias viables después del crecimiento durante una noche a 37 °C para calcular el número de moléculas de pINF transformadas. La transformación, la recuperación y el crecimiento se realizaron de manera similar para el plásmido de control natural. Además, se analizó un control negativo y se trató de manera similar a la transformación de pINF excepto que no se sometió a electroporación (figura 11). No se observó crecimiento en las muestras de control negativo después de al menos 6 días. No se detectó amplificación por PCR del control negativo. Por lo tanto, el plásmido pINF no amplificado se transportó a través del crecimiento celular y posteriormente se detectó erróneamente como el plásmido propagado.
Ejemplo 6: Medición de fidelidad
Biotinilación de ADN por PCR
Se amplificaron mezclas purificadas de plásmidos pINF y pACS (1 ng) de experimentos de crecimiento (figuras 3 y 4) mediante PCR en las siguientes condiciones: 1x tampón de reacción OneTaq, MgSO4 ajustado a 3,0 mM, 0,3 mM de dNTP, 0,1 mM del análogo de dNaMTP biotinilado dMMO2SSBIOTP, 0,1 mM de d5SICSTP, 1 pM de cada uno de los cebadores pUC19-seq-fwd y pUC19-seq-rev, 0,02 U/pl de ADN polimerasa OneTaq y 0,0025 U/pl de ADN polimerasa DeepVent en un volumen total de 25 pl en un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX Connect (Bio-Rad) en las siguientes condiciones de ciclo térmico: Desnaturalización inicial (96 °C, 1 min); 10 ciclos de desnaturalización (96 °C, 30 s), hibridación 64 °C, 30 s) y extensión (68 °C, 4 min). Los productos de PCR se purificaron como se describe en Materiales, y los dúplex de ADN biotinilados resultantes (5 pl, 25-50 ng) se mezclaron con estreptavidina (1 pl, 1 pg/pl, Promega) en tampón de fosfato (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM), se incubaron durante 30 min a 37 °C, se mezclaron con 5x tampón de carga no desnaturalizante y se cargaron en PAGE no desnaturalizante al 6 %. Después del ciclo a 110 V durante 30 min, se visualizó y cuantificó el gel. El fragmento resultante (194 pb) con las regiones de cebador subrayadas y el nucleótido no natural en negrita (X = dNaM o su análogo biotinilado dMMO2SSBI0) se muestra a continuación (SEQ ID NO:26).
5 ’-GCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGA AATT GTTATCCGCT C ACAXTT CC AC AC AAC AT ACG AGCCGGAAGC AT AAAGTGT AA AGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCC CGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAG
Calibración por desplazamiento de estreptavidina
Para construir una curva de calibración entre el desplazamiento de estreptavidina (SA) y la fracción de secuencias con UBP en la población (UBP), se desarrolló un método de PCR en el que la reacción se enriqueció con DeepVent. El método mejoró la fidelidad con la que se amplificó el ADN que contenía d5SICS-dMMO2SSBI0 La calibración se realizó en condiciones similares. Para cuantificar la retención neta del UBP, se prepararon nueve mezclas del molde TK-1-dNaM y su equivalente natural con una relación conocida de natural y no natural, se sometieron a biotinilación por PCR y se analizaron mediante un ensayo de desplazamiento de movilidad en PAGE no desnaturalizante al 6 %. Para la calibración, las mezclas del molde TK-1-dNaM y su equivalente natural con una relación conocida de moldes no naturales y naturales (0,04 ng) se amplificaron en condiciones similares durante nueve ciclos de PCR con cebadores de fusión a pUC19 y se analizaron de manera similar a las muestras de los experimentos de crecimiento descritos en el presente documento. Los experimentos se realizaron por triplicado y el desplazamiento de estreptavidina (SAS, %) se representó en función del contenido de UBP (UBP, %) y los datos se ajustaron a una ecuación lineal:
Ecuación 1: SAS = 0,77xUBP 2,0 R2 = 0,999.
donde UBP corresponde a la retención de UBP (%) en las muestras analizadas después de la replicación celular y se calculó a partir del desplazamiento de SAS usando la Ecuación 1.
Cálculo de la amplificación plasmídica
Las células se pusieron en placas sobre 2xYT-agar que contenía ampicilina y estreptavidina después de la transformación con pINF, y se contaron las colonias después del crecimiento durante una noche a 37 °C. Se asumió que las células transformadas contenían una molécula de plásmido. Los recuentos de colonias correspondieron a la cantidad original de plásmido que se absorbió por las células. Después del crecimiento durante una noche (figura 4), los plásmidos se purificaron a partir de un volumen del cultivo celular y se cuantificaron. Dado que el ADN plasmídico purificado representa una mezcla de plásmido pINF y pACS, se realizó un análisis de restricción de digestión con NdeI exonucleasa que linealizó ambos plásmidos seguido de gel de agarosa al 1 %. A continuación se proporciona un ejemplo de cálculos para el punto temporal de 19 h con uno de cada tres triplicados.
Ejemplo del cálculo de la amplificación plasmídica después de 19 h:
Parámetros conocidos (o medidos):
Número de colonias después de la transformación (10 |jl de cultivo en placa) 1750 ± 200 Dilución para el experimento de crecimiento, veces 33,3
Volumen de cultivo purificado para extracción plasmídica, j l 100
Volumen de elución, j l 30
Fracción de pINF en la mezcla plasmídica total, % 43
Concentración plasmídica total, ng jl-1 2,97 Desplazamiento de biotina, % 74,2
Cálculo de la concentración plasmídica antes del crecimiento:
175 m oléculas ^ l 1
5,3 m oléculas ^ l 1
33,3
Cálculo de la cantidad de plásmido en 100 pl de medio después del crecimiento (19 h):
Cantidad de pINF:
2,97 ng |jl-1 x 43 % x 30 pl = 38 ng
Número de moléculas de pINF:
— — — :----- ------------^ — :—— x 6,02 x 1023 m oléculas m o l-1 = 1,3 x 1010 m oléculas 2686 pb x 660 g m ol 1 *5pb 1
Concentración plasmídica:
1,3 x 1010 m oléculas
-------------------- ------------ = 1,3 x 108 m oléculas u.Z 1
1 0 0 ^1 ,
Cálculo de amplificación (A), el número de duplicación (n), retención (F) y fidelidad (f)
1,3 x 108 m oléculas u /_1
A = -----------------— ;------- r — = 2,4 x 107
5,3 m oléculas v i
n = log2(2,4 x 107) = 24,5
0,742 - 0,020
F = 0,772 = 93’5%
/ = 0,93524,5 = 99,7 %
Dado que la recuperación del plásmido durante la purificación es inferior al 100 %, los cálculos subestiman el nivel de amplificación (A) y, por lo tanto, el número de duplicaciones (n).
La fidelidad (retención por duplicación) está relacionada con la retención del UBP (F) como
f n = F
y, dado que n = log2(A), la fidelidad se calculó como
f = Fñ.
Ejemplo 7: Medición de la fidelidad por secuenciación (figura 3E)
Generación de fragmentos para secuenciación
Las mezclas purificadas de los plásmidos pINF y pACS (1 ng) después del crecimiento durante una noche se amplificaron mediante PCR en las siguientes condiciones: 1 x tampón de reacción OneTaq, MgSO4 ajustado a 3,0 mM, 0,2 mM de dNTP, 0,1 mM de dNaMTP, 0,1 mM del análogo de d5SICSTP dTPT3TP, 1 pM de cada uno de los cebadores pUC19-seq2-fwd y pUC19-seq-rev (véase a continuación), y 0,02 U/pl de ADN polimerasa OneTaq en un volumen total de 25 pl en las siguientes condiciones de ciclo térmico: desnaturalización (96 °C, 1 min); y 10 ciclos de desnaturalización (96 °C, 30 s), hibridación 64 °C, 30 s) y extensión 68 °C, 2 min. Los productos se purificaron mediante columna de centrifugación, se cuantificaron para medir la concentración de ADN y a continuación se secuenciaron como se describe a continuación. A continuación se muestra el fragmento de secuenciación (304 pb) con las regiones de cebador subrayadas y el nucleótido no natural en negrita (X = dNaM).
5 ’ -GCT GC AAGGC G A T T A AGTTGGGT AACGC C AGGGTTTTCC C AG T C AC G AC
GTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTC
G AC CT GC AGGC A T GC AAG C TT GGCGT A A T C A T GGT C A T AG CT GTTTCCTGT GT G A A A
TT GTT ATCC GCT C AC AXTTC C AC AC A A C A T ACG AGC CGG AAG C A T A A A G T GT A A A G
CCTG GGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCG
CTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAG (SEQ ID NO:27).
Secuenciación de Sanger
Las reacciones de secuenciación por ciclos (10 pl) se realizaron en un ciclador térmico rápido 9800 (Applied Biosystems) con la mezcla de secuenciación por ciclos (0,5 (pl) del kit de secuenciación por ciclos BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) que contenía 1 ng de molde y 6 pmol del cebador de secuenciación pUC19-seq-rev en las siguientes condiciones de ciclo térmico: desnaturalización inicial (98 °C, 1 min); y 25 ciclos de desnaturalización (96 °C, 10 s), hibridación (60 °C, 15 s) y extensión (68 °C, 2,5 min). Tras la finalización, los terminadores de colorante residuales se eliminaron de la reacción. Los productos se eliminaron por elución de las perlas con agua desionizada y se secuenciaron directamente. Las trazas de secuenciación se recogieron y se analizaron con software de imagenología.
Análisis de las trazas de secuenciación de Sanger
Se analizaron las trazas de secuenciación de Sanger para determinar la retención del UBP. Brevemente, la presencia de un nucleótido no natural conduce a una terminación brusca del perfil de secuenciación, mientras que la mutación a un nucleótido natural da como resultado una "lectura". El alcance de esta lectura después de la normalización se correlaciona inversamente con la retención de un UBP. Las trazas de secuenciación sin procesar se analizaron ajustando primero los puntos de inicio y parada para el software de análisis de secuenciación y a continuación determinando la intensidad de señal promedio individualmente para cada canal (A, C, G y T) para los picos dentro de los puntos definidos. Esto se hizo por separado para las partes del trazo de secuenciación antes (sección L) y después (sección R) del nucleótido no natural. La relación R/L después de la normalización (R/L)norm para el declive de secuenciación y la lectura en la muestra de control no amplificada (R/L = 0,55(R/L)norm + 7,2, corresponde al porcentaje de las secuencias naturales en el conjunto (Malyshev et al.). Por lo tanto, una retención global (F) de la incorporación del UBP durante la PCR se calculó como:
Figure imgf000086_0001
Se produjo más del 20 % de lectura en la dirección del cebador pUC19-seq2-fwd usando un plásmido de control pINF. Se realizó la secuenciación de la dirección opuesta (pUC19-seq-rev) y se usó para medir la fidelidad y la retención de UDP en función del crecimiento (Tabla 7). Las trazas de secuenciación sin procesar se muestran en la figura 3F.
Tabla 7 - Retención de UBP % ^ en función del crecimiento
Figure imgf000086_0003
T l - n i li n l i m l
Figure imgf000086_0002
continuación
Figure imgf000087_0001
Ejemplo 8: Incorporación de polimerasa de ácidos nucleicos no naturales
Se añaden mezclas de reacción de prueba a los pocilios de una placa de múltiples pocilios, en la que cada pocilio contiene moldes de ADN cebados adheridos al fondo de los pocillos. Las mezclas de reacción de prueba contienen una variante de polimerasa y un ácido nucleico no natural, un ácido nucleico no natural que tiene (1) un resto de base que complementa la posición apropiada del molde para que se produzca una extensión precisa y (2) un resto biotinilado unido al resto de azúcar. Después de un tiempo de incubación suficiente para que se produzca la extensión (por ejemplo, para una reacción de control que tiene una polimerasa de reactividad conocida con el ácido nucleico no natural), la mezcla de reacción se elimina, los pocillos de la placa se lavan para eliminar los ácidos nucleicos no naturales residuales y se añade un reactivo de desarrollo a los pocillos. El reactivo de desarrollo incluye una molécula de estreptavidina marcada que es capaz de unirse a moléculas de ácido nucleico unidas a los fondos de los pocillos que tienen incorporado el ácido nucleico no natural. El marcador de la molécula de estreptavidina es cualquiera de una diversidad conocida en la materia. La placa se lava de nuevo para eliminar las moléculas de estreptavidina marcadas no unidas. A continuación, el marcador se detecta usando un lector de placas de múltiples pocillos. La presencia de señal de la estreptavidina marcada indica una polimerasa que tiene la capacidad de incorporar un ácido nucleico no natural. Se usa el mismo ensayo para determinar la cinética u otros parámetros cuantitativos variando el tiempo de reacción o la concentración de los reactivos en fase líquida. Se realizan cribados similares para otros ácidos nucleicos no naturales mediante una modificación menor de los reactivos ilustrados anteriormente.
Ejemplo 9: Incorporación de polimerasa de TPT3, (d)FTPT3, (d)NaM, (d)5SICS, (d)FEMO, (d)FIMO y/o (d)MMO2 en ADN
Se incuba polimerasa (15 pg/ml) a 30 °C en tampón (TRIS 50 mM pH 7,5, Tween 20 al 0,05 %, MgSO46 mM, EDTA 1 mM, NaCl 50 mM) con ADN 20 nM. Se toma una alícuota de tiempo cero para cada concentración y a continuación se añade TPT3, (d)FTPT3, (d)NaM, (d)5SICS, (d)FEMO, (d)FIMO y/o (d)MMO2 a una concentración final de 10, 5, 2 o 1 pM para iniciar la reacción. Los tubos se incuban a 30 °C y se toman alícuotas en 0,33, 0,66, 1, 2, 5 y 15 min de los 4 tubos de reacción para la inactivación y el análisis en gel de urea acrilamida al 15 %. Se añaden dNTP 1 mM a los tubos de reacción restantes y, después de 10 minutos más, se toma una alícuota para el análisis en gel (captura).
A continuación, se toma una fotografía del gel resultante de la reacción de extensión de polimerasa anterior. Los resultados muestran que el cebador cambia a una banda más grande a lo largo del tiempo, con un aumento en la cantidad de la banda más grande con el tiempo. La banda más grande demuestra la adición de (d)TPT3, (d)FTPT3, (d)NaM, (d)5SICS, (d)FEMO, (d)FIMO y/o (d)MMO2 al ADN (es decir, extensión por una base). Después de la adición de dNTP naturales, la polimerasa es capaz de extender el cebador hasta el final del molde demostrando que la adición de (d)TPT3, (d)FTPT3, (d)NaM, (d)5SICS, (d)FEMO, (d)FIMO y/o (d)MMO2 no crea un cebador bloqueado en 3' y que la polimerasa es capaz de extender el cebador con ácidos nucleicos naturales y no naturales. La incorporación es más rápida a concentraciones más altas (10 pM) que a concentraciones más bajas (1 pM) y muestra una dependencia del tiempo indicativa de una incorporación enzimática genuina.
Los resultados demuestran el sorprendente hallazgo de que la polimerasa puede tener reactividad de extensión de cebador selectiva para (d)TPT3, (d)FTPT3, (d)NaM, (d)5SICS, (d)FEMO, (d)FIMO y/o (d)MMO2 y ácidos nucleicos naturales.
Ejemplo 10: Creación de una célula con un alfabeto genético expandido
Los experimentos descritos en el presente documento ilustran la expresión basada en plásmidos de ocho NTT diferentes en C41(DE3) de E. coli (Tabla 9A). Se examinó la captación de [a-32P]-dATP como sustituto de los trifosfatos no naturales (figura 5). El dATP se transportó eficientemente a las células por los NTT de Phaeodactylum tricornutum (PtNTT2) y Thalassiosira pseudonana (TpNTT2). Inesperadamente, se descubrió que los NTT de Protochlamydia amoebophila (PamNTT2 y PamNTT5) también incorporaban dATP. Tanto PamNTT2 como PamNTT5 exhibieron una captación medible de dATP (figura 5). PtNTT2 mostró la mayor actividad, y tanto éste como TpNTT2 tienen una amplia especificidad, lo que los convierte en supuestos NTT para incorporar nucleótidos trifosfato.
La replicación de ADN que contiene d5SICS-dNaM se ha validado in vitro con diferentes polimerasas, pero más con las polimerasas de la familia A, tal como el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli (Pol I). Mientras que la mayoría del genoma de E. coli se replica por Pol III, se diseñó un plásmido que se centró en la replicación del UBP por Pol I. El plásmido accesorio (pACS) se obtuvo a partir de pCDF-1b insertando el gen PtNTT2 (figura 10). El plásmido de información (pINF) se obtuvo a partir de pUC19 reemplazando dT505 (numeración estándar del mapa de pUC19 disponible para descargar en http://www.thermoscientificbio.com/uploadedFiles/Resources/pUC18-pUC19-map. pdf) por dNaM. Esto coloca al UBP de 362 nt cadena abajo del origen de ColE1 (figura 10). El plásmido pINF (es decir, el plásmido de información) se construyó a partir de pUC19 reemplazando dT505 por dNaM usando síntesis en fase sólida y PCR de extensión circular (figura 3A y figura 10). El par dA-dT en la posición 505 se reemplazó por dNaM emparejado frente a un análogo de d5SICS (dTPT3). Esto posiciona el UBP cadena abajo del origen de replicación de ColE1 donde la replicación de la hebra principal está mediada por Pol I, y dentro del sitio de procesamiento Okazaki de TK-1, donde también se espera que la síntesis de la hebra retardada esté mediada por Pol I. El pINF sintético se construyó usando el análogo de d5SICS porque debería reemplazarse eficazmente por d5SICS si la replicación se produce in vivo y, por lo tanto, hace posible diferenciar el pINF replicado in vivo del pINF sintético.
Para determinar si E. coli puede usar los trifosfatos no naturales incorporados para propagar de manera estable pINF, las células C41(DE3) se transformaron primero con un plásmido pCDF-1b que codificaba PtNTT2 (en lo sucesivo denominado pACS, para el plásmido accesorio, figura 10, y véase el SEQ ID No. 1, a continuación) y se cultivaron en medio que contenía 0,25 mM tanto de trifosfatos no naturales, KPi 50 mM como IPTG 1 mM para inducir la producción del transportador. A continuación, las células se transformaron con pINF y, después de un período de recuperación de 1 h, los cultivos se diluyeron 10 veces con el mismo medio complementado con ampicilina y se monitorizó el crecimiento mediante la turbidez del cultivo (figura 3A y Tabla 9A y B).
Tabla 9A
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Tabla 9B
Figure imgf000088_0001
Como controles, las células también se transformaron con pUC19, o se cultivaron sin IPTG o sin los trifosfatos no naturales. El crecimiento fue más lento en presencia de IPTG, probablemente debido a los efectos de la inducción del transportador. Sin embargo, la adición de d5SICSTP y dNaMTP dio como resultado solo una ligera disminución en el crecimiento en ausencia de pINF, y eliminó un retraso de crecimiento en presencia de pINF (figura 3B). Esto indica que los trifosfatos no naturales no son tóxicos y son necesarios para la replicación eficaz de pINF.
Para determinar si pINF se propaga con retención del UBP, se recuperó el plásmido de las células después de 15 h de crecimiento. La introducción del UBP dio como resultado solo una pequeña reducción en el número de copias de plásmido (<2 veces, Tabla 9B), y basándose en la cantidad de plásmido recuperado y la eficiencia de transformación, pINF se amplificó 2 * 107 veces durante el crecimiento (~24 duplicaciones).
Para determinar el nivel de retención de UBP, el plásmido recuperado se digirió, se desfosforiló en nucleósidos individuales y se analizó mediante LC-MS/MS. Si bien la detección y cuantificación de dNaM fueron excluidas por su escasa eficiencia de fragmentación y los bajos recuentos de iones de producto sobre el fondo, la señal para d5siCS se pudo observar claramente (figura 3C). Se construyeron curvas de calibración externa usando el nucleósido no natural y se validaron determinando su relación con respecto a dA en oligonucleótidos sintéticos (Tabla 7). Usando la curva de calibración resultante, se determinó que la relación de dA con respecto a dSSICS en pINF recuperado fue de 1106 a 1, que cuando se compara con la relación esperada de 1325 a 1, sugiere la presencia de aproximadamente un UBP por plásmido. No se detectó d5SICS en experimentos de control en los que no se indujo el transportador, ni cuando los trifosfatos no naturales no se añadieron al medio, ni cuando se usó pUC19 en lugar de pINF (figura 3C), lo que demuestra que su presencia es resultado de la replicación del UBP y no por una inserción errónea de los trifosfatos no naturales frente a un nucleótido natural. Es importante destacar que, como el pINF sintético contenía un análogo de d5SICS, y d5SICS solo se proporcionó como un trifosfato añadido al medio, su presencia en pINF confirma la replicación in vivo.
A continuación, la región de pINF que rodea al nucleótido 505 se amplificó por PCR en presencia de d5SICSTP y un análogo de dNaMTP biotinilado. El análisis por desplazamiento en gel de estreptavidina mostró que el 67 % del ADN amplificado contenía biotina (figura 3D). No se observó ningún desplazamiento en los experimentos de control en los que no se indujo el transportador, ni cuando los trifosfatos no naturales no se añadieron al medio, lo que demuestra que el desplazamiento requería la incorporación de trifosfatos no naturales. De manera similar, no se observó ningún desplazamiento en gel con ADN aislado de células de control tratadas de manera idéntica transformadas con pUC19, lo que demuestra que el desplazamiento se debe a la retención del UBP y no a la inserción errónea de los trifosfatos no naturales frente a un nucleótido natural. Basándose en una curva de calibración construida a partir de los desplazamientos observados con los productos de amplificación de mezclas controladas de ADN que contienen dNaM o su equivalente completamente natural (Métodos), el desplazamiento en gel observado corresponde a una retención de UBP del 86 %, que a su vez corresponde a una fidelidad (retención por duplicación) del 99,4 % (0,994 = 0,86).
Para confirmar la alta retención del UBP, se amplificó por PCR la misma región de pINF en presencia de d5SICSTP y dNaMTP, y los productos se analizaron mediante secuenciación de Sanger (figura 3E). La presencia de UBP provocó una terminación abrupta en la reacción de secuenciación y, por lo tanto, el nivel de retención de UBP puede cuantificarse a partir de la relación de las amplitudes de los picos en el cromatograma antes y después del sitio de incorporación de UPB. Los cromatogramas de secuenciación de pINF aislado de cultivos desarrollados sin inducción de PtNTT2 o sin adición de los trifosfatos no naturales no mostraron terminación. Por el contrario, los cromatogramas de los productos de amplificación de pINF aislado de células cultivadas con inducción de PtNTT2 y con trifosfatos no naturales añadidos mostraron una terminación abrupta en la posición esperada. Con un límite inferior de detección de lectura estimado en el 5 % (correspondiente a una retención del 95 %), esto pone un límite inferior del 99,7 % en la fidelidad de la replicación de UBP. Las estimaciones de fidelidad de ambos conjuntos de experimentos corresponden a una tasa de error de ~10-3, que es comparable a la tasa de error intrínseca de algunas polimerasas con ADN natural.
La alta retención del UBP durante un período de crecimiento de 15 h indica que no se escinde de manera eficaz por las rutas de reparación del ADN. Para apoyar aún más esta conclusión, se repitieron los experimentos, pero se monitorizó la retención de UBP, el crecimiento celular y la descomposición del trifosfato no natural durante hasta 6 días (figura 4).
A las 15 y 19 h de crecimiento, los cultivos alcanzaron una DO600 de ~0,9 y ~1,2, respectivamente, y tanto d5SICSTP como dNaMTP se descompusieron hasta solo el 17-20 % y el 10-16 % de sus concentraciones iniciales de 0,25 mM (figura 12A). De acuerdo con los experimentos descritos anteriormente, la retención del UBP después de 15 h fue del 97 ± 5 % y >95 %, según se determinó por desplazamiento en gel y secuenciación, respectivamente, y después de 19 h fue del 91 ± 3 % y >95 %. Cuando los cultivos entraron en la fase estacionaria y los trifosfatos se descompusieron por completo, la pérdida de plásmido comenzó a competir con la replicación (figuras 12B y C), pero incluso entonces, la retención del UBP se mantuvo en ~45 % y ~15 %, a los 3 y 6 días, respectivamente. Además, cuando se perdió d5SICS-dNaM, se reemplazó por dA-dT, lo que es consistente con el espectro mutacional de Kf. Finalmente, la forma de la curva de retención frente al tiempo refleja la de la curva de crecimiento frente al tiempo. Tomados en conjunto, estos datos apoyan firmemente la conclusión de que la pérdida del UBP se debe a un emparejamiento incorrecto mediado por la replicación (que es inevitable después de la descomposición del trifosfato no natural) y no a la actividad de las rutas de reparación del ADN.
Ejemplo 11: Evolución dirigida de células con mayor actividad de NTT
Las células que albergan NTT endógenos se incuban en presencia de dNTP naturales y uno o más ácidos nucleicos no naturales. La concentración de uno o más de los dNTP naturales en contacto con las células disminuye lentamente con el tiempo y con el crecimiento. La concentración de uno o más de los ácidos nucleicos no naturales en contacto con las células aumenta lentamente con el tiempo y con el crecimiento. Las células supervivientes se someten a más rondas de exposición a concentraciones crecientes de los ácidos nucleicos no naturales y concentraciones decrecientes de los dNTP naturales. Las células supervivientes, los lisados o los NTT purificados se ensayan para determinar la cinética de unión, la incorporación, la replicación y/o la incorporación de los ácidos nucleicos no naturales. Los conjuntos de células que demuestran una mayor incorporación, replicación y/o incorporación de los ácidos nucleicos no naturales en comparación con las células iniciales que albergan NTT endógenos se ensayan adicionalmente para las variantes de n Tt usando PCR y métodos de secuenciación. Las células y/o la información de las secuencias variantes de NTT se usan para generar proteínas recombinantes y reactivos de ácido nucleico para la expresión en células huésped como se ha descrito anteriormente. Además, las células genomanipuladas están genomanipuladas para contener una mayor actividad de incorporación, actividad de replicación y/o incorporación de ácidos nucleicos no naturales en comparación con las células iniciales que albergan NTT endógenos.
Ejemplo 12: Evolución dirigida de células con actividad de polimerasa para ácidos nucleicos no naturales
Las células que albergan polimerasas endógenas se incuban en presencia de dNTP naturales y uno o más ácidos nucleicos no naturales. La concentración de uno o más de los dNTP naturales en contacto con las células disminuye lentamente con el tiempo y con el crecimiento. La concentración de uno o más de los ácidos nucleicos no naturales en contacto con las células aumenta lentamente con el tiempo y con el crecimiento. Las células supervivientes se someten a más rondas de exposición a concentraciones crecientes de los ácidos nucleicos no naturales y concentraciones decrecientes de los dNTP naturales. Las células supervivientes, los lisados o las polimerasas purificadas se ensayan para la replicación y/o incorporación de los ácidos nucleicos no naturales. Los conjuntos de células que demuestran una mayor incorporación, replicación y/o incorporación de los ácidos nucleicos no naturales en comparación con las células iniciales que albergan polimerasas endógenas se ensayan adicionalmente para las variantes de polimerasa usando PCR y métodos de secuenciación. Las células y/o la información de las secuencias variantes de polimerasa se usan para generar proteínas recombinantes y reactivos de ácido nucleico para la expresión en células huésped como se ha descrito anteriormente. Además, las células genomanipuladas están genomanipuladas para contener una mayor actividad de polimerasa, actividad de replicación y/o incorporación de ácidos nucleicos no naturales en comparación con las células iniciales que albergan polimerasas endógenas.
Otras realizaciones
A menos que se explique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece esta divulgación. Las siguientes referencias contienen realizaciones de los métodos y composiciones que se pueden usar en el presente documento: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18a edición, publicado por Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2); Benjamin Lewin, Genes IX, publicado por Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Mol. Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Mol. Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Los procedimientos estándar de la presente divulgación se describen, por ejemplo, en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EE.UU. (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EE.UU. (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., Nueva York, EE.UU. (1986); o Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol. 152, S. L. Berger y A. R. Kimmerl (eds.), Academic Press Inc., San Diego, EE.UU. (1987)). Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. coligan, et. al., ed. John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Editorial: Wiley-Liss; 5a edición (2005), y Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather y David Barnes editors, Academic Press, 1a edición, 1998).
En el presente documento se desvelan moléculas, materiales, composiciones y componentes que se pueden usar para, se pueden usar junto con, se pueden usar en la preparación para, o son productos de métodos y composiciones que se desvelan en el presente documento. Se entiende que cuando se desvelan combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales y aunque no se puede desvelar explícitamente la referencia específica de cada una de las diversas combinaciones individuales y colectivas y la permutación de estas moléculas y compuestos, cada uno se contempla específicamente y se describe en el presente documento. Por ejemplo, si se desvela y se analiza un nucleótido o ácido nucleico y se analizan una serie de modificaciones que se pueden hacer en varias moléculas, incluyendo el nucleótido o ácido nucleico, todas y cada una de las combinaciones y permutaciones de nucleótidos o ácidos nucleicos y las modificaciones que son posibles se contemplan

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un microorganismo procariota genomanipulado que comprende al menos un ácido nucleico no natural, que comprende al menos un par de bases no naturales (UBP) y un ácido nucleico heterólogo que codifica un transportador de nucleósido trifosfato (NTT), en donde:
(a) el microorganismo procariota genomanipulado es Escherichia coli;
(b) el al menos un UBP comprende un primer nucleótido no natural y un segundo nucleótido no natural que han sido incorporados al microorganismo genomanipulado por el NTT e incorporados en el al menos un ácido nucleico no natural dentro del microorganismo genomanipulado por una maquinaria celular;
(c) el NTT comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica al SEQ ID NO:1; y (d) el primer nucleótido no natural es dTPT3 o d5SICS, y el segundo nucleótido no natural es dNaM.
2. El microorganismo genomanipulado de la reivindicación 1, en el que el NTT es un NTT de algas.
3. El microorganismo genomanipulado de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el NTT es un NTT2 de Phaeodactylum tricornutum (Pt).
4. El microorganismo genomanipulado de la reivindicación 1, en donde el microorganismo genomanipulado comprende una incorporación reforzada de un nucleótido no natural, una incorporación reforzada de un nucleótido no natural en un ácido nucleico del microorganismo o una disminución de la degradación del al menos un ácido nucleico no natural en comparación con el microorganismo de tipo silvestre respectivo.
5. El microorganismo genomanipulado de la reivindicación 4, en donde el microorganismo genomanipulado comprende además al menos un UBP molde que comprende al menos un nucleótido molde no natural.
6. Un método para preparar el microorganismo genomanipulado de la reivindicación 1, que comprende:
poner en contacto el microorganismo genomanipulado como se define en la reivindicación 1 con un primer y un segundo nucleósido trifosfato no natural, en donde el primer nucleósido trifosfato no natural es dTPT3 trifosfato o d5SICS trifosfato, y el segundo nucleósido trifosfato no natural es dNAM trifosfato; y
hacer crecer el microorganismo genomanipulado en un medio de cultivo;
en donde los nucleósidos trifosfato no naturales se incorporan en el al menos un ácido nucleico dentro del microorganismo genomanipulado mediante la maquinaria celular para generar el al menos un ácido nucleico no natural, y en donde el al menos un UBP se forma dentro del microorganismo genomanipulado.
7. El microorganismo genomanipulado de la reivindicación 1, en el que el primer nucleótido no natural es dTPT3.
8. El microorganismo genomanipulado de la reivindicación 1, en el que el primer nucleótido no natural es d5SICS.
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