ES2685678T3 - Un método para el diagnóstico de neoplasias - II - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar el inicio o la predisposición a la aparición de una neoplasia de intestino grueso o controlar el progreso de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes o transcritos seleccionados de: (i) el gen, genes o transcripciones detectadas por el conjunto de sondas Affymetrix ID: 205935_at; y/o (ii) FOXF1 en una muestra biológica de dicho individuo en la que un nivel más bajo de expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o grupo (ii) en relación con los niveles de control es indicativo de una célula neoplásica del intestino grueso o una célula predispuesta a la aparición de un estado neoplásico.
Description
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- GJA1 CLU CSRP1
- ABCG2
- SCNN1B SLC26A3 PLEKHC1
- CCDC80
- FABP4 SDC2 LOC572558
- UGT1A1
- F13A1 SST FOXP2
- MRC1
- CD36 HLA-DRA HSPA2
- HSD11B2
- SPARCL1 TSC22D3 ATP1A2
- ANPEP
- ZCWPW2 IL6ST TNXB
- MATN2
- TNC C1QC FUCA1
- PRNP
- MT1A MT1X MRGPRF
- ABI3BP
- LOC652745 AOC3 HIGD1A
- HLA-C
- MALL PPAP2A MFSD4
- NDE1
- GNG2 ZSCAN18 AXL
- SRPX
- DNASE1L3 IVD AQP1
- WWTR1
- EGR1 SFRP1 MAP1B
- HMGCS2
- CMBL COL4A2 PALLD
- LOC646627
- GCNT3 GPM6B MPEG1
- KRT20
- SERPING1 EPB41L3 KLHL5
- KLF4
- MEIS1 MAOA TCEAL7
- FHL1
- EDN3 DMD FILIP1L
- ARL14
- MSN MSRB3 IQGAP2
- LUM
- MT1G PLOD2 PRDX6
- SORBS 1
- TPSAB1 C9orf19 RAB31
- METTL7A
- GPX3 MIER3 LOC96610
- FAM129A
- CDKN2B XDH FGFR2
- SCARA5
- FOSB CLDN23 PAPSS2
- SI
- HSPA1A SGCE XLKD1
- ACTA2
- CYBRD1 FOXF2 SMTN
5
10
15
20
25
30
35
40
- (ii)
- ZG 16
en una muestra biológica de dicho individuo en la que un nivel más bajo de expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o grupo (ii) en relación con los niveles de control es indicativo de una célula neoplásica del intestino grueso
- o una célula predispuesta al inicio de un estado neoplásico.
En otro aspecto más, se proporciona un método para detectar el inicio o la predisposición a la aparición de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes o transcritos seleccionados de:
- (i)
- el gen, los genes o las transcripciones detectadas por Affymetrix probeset IDs:
y/o
- (ii)
en una muestra biológica de dicho individuo en la que un nivel más bajo de expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o grupo (ii) en relación con los niveles de control es indicativo de una célula neoplásica del intestino grueso
- o una célula predispuesta al inicio de un estado neoplásico.
Todavía en otro aspecto más, se proporciona un método para detectar el inicio o la predisposición a la aparición de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno
- o más genes o transcritos seleccionados de:
- (i)
- el gen, genes o transcripciones detectadas por Affymetrix probeset IDs: 220834_a; y/o
- (ii)
- MS4A12
en una muestra biológica de dicho individuo en la que un nivel más bajo de expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o grupo (ii) en relación con los niveles de control es indicativo de una célula neoplásica del intestino grueso
- o una célula predispuesta al inicio de un estado neoplásico.
Todavía en otro aspecto más, se proporciona un método para detectar el inicio o la predisposición a la aparición de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno
- o más genes o transcritos seleccionados de:
- (i)
- el gen, genes o transcripciones detectadas por Affymetrix probeset IDs: 206784_a; y/o
- (ii)
- AQP8
en una muestra biológica de dicho individuo en la que un nivel más bajo de expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o grupo (ii) en relación con los niveles de control es indicativo de una célula neoplásica del intestino grueso
- o una célula predispuesta al inicio de un estado neoplásico.
En un aspecto adicional, se proporciona un método para seleccionar el inicio o la predisposición a la aparición de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes o transcritos seleccionados de:
el gen, los genes o las transcripciones detectadas por Affymetrix probeset IDs:
- (i)
- 203908_at, 206198_s_at, 205547_s_at, 207003_at, 206422_at, 209613_s_at, 207245_at; y/o
- (ii)
- SLC4A4, CEACAM7, TAGLN, GUCA1B, GCG, ADH1B, UGT2B17,
en una muestra biológica de dicho individuo en la que un nivel más bajo de expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o grupo (ii) en relación con los niveles de control es indicativo de una célula neoplásica del intestino grueso
o una célula predispuesta al inicio de un estado neoplásico.
En un aspecto relacionado, la presente descripción se refiere a un método para detectar el inicio o la predisposición a la aparición de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método el cribado del nivel de expresión de uno o más genes o transcritos seleccionados de:
(i) el gen, genes o transcripciones detectadas por Affymetrix probeset IDs:
- 200600_at
- 203680_at 211959_at 215076_s_at
- 200665_s_at
- 203729_at 211964_at 215193_x_at
- 200799_at
- 203748_x_at 211985_s_at 219087_at
- 200845_s_at
- 204069_at 211990_at 219607_s_at
- 200859_x_at
- 204122_at 211991_s_at 221541_at
- 200897_s_at
- 204135_at 212077_at 222043_at
- 200974_at
- 204438_at 212091_s_at 222453_at
- 200986_at
- 204457_s_at 212136_at 222513_s_at
- 201041_s_at
- 204570_at 215382_x_at 223121_s_at
- 201061_s_at
- 204688_at 215388_s_at 223122_s_at
- 201069_at
- 205412_at 216442_x_at 223235_s_at
- 201105_at
- 205683_x_at 216474_x_at 223343_at
- 201137_s_at
- 205935_at 216834_at 224560_at
- 201141_at
- 207134_x_at 217480_x_at 224694_at
- 201150_s_at
- 207266_x_at 217757_at 224840_at
- 201289_at
- 208131_s_at 217762_s_at 224964_s_at
- 201300_s_at
- 208370_s_at 217764_s_at 225242_s_at
- 201426_s_at
- 208747_s_at 217767_at 225269_s_at
- 201438_at
- 208788_at 217897_at 225353_s_at
- 201616_s_at
- 208789_at 218162_at 225381_at
- 201617_x_at
- 208894_at 218224_at 225442_at
- 201645_at
- 209047_at 218312_s_at 225602_at
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- 201743_at
- 209138_x_at 218418_s_at 225626_at
- 201744_s_at
- 209147_s_at 218468_s_at 225688_s_at
- 201842_s_at
- 209156_s_at 218469_at 225710_at
- 201852_x_at
- 209191_at 218559_s_at 226001_at
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- 209209_s_at 212158_at 226051_at
- 201859_at
- 209210_s_at 212185_x_at 226084_at
- 201865_x_at
- 209312_x_at 212195_at 226103_at
- 201893_x_at
- 209335_at 212230_at 226430_at
- 201920_at
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- 202007_at
- 209457_at 212265_at 226694_at
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- 210495_x_at 212713_at 227561_at
- 202953_at
- 210517_s_at 212764_at 227623_at
- 202957_at
- 210764_s_at 212956_at 227705_at
- 202994_s_at
- 210809_s_at 213428_s_at 227727_at
- 202995_s_at
- 210982_s_at 213509_x_at 228507_at
- 203066_at
- 211161_s_at 213746_s_at 228750_at
- 203131_at
- 211596_s_at 213891_s_at 228846_at
- 203305_at
- 211671_s_at 214038_at 229530_at
- 203382_s_at
- 211719_x_at 214677_x_at 230264_s_at
- 203477_at
- 211813_x_at 214752_x_at 231579_s_at
- 203645_s_at
- 211896_s_at 215049_x_at 234987_at; y/o
(ii)
- A2M
- CYBRD1 LOC283666 PTGIS
- ACAT1
- CYR61 LOC339562 PTRF
- ACTA2
- DCN LOC387763 QKI
- AKAP12
- DDR2 LOC399959 RAB31
- ANKRD25
- DSCR1 LRIG1 RARRES2
- ANTXR1
- DUSP1 LUM RBMS1
- AP1S2
- DUSP5 MAFB RDX
- APOE
- EFEMP1 MAP1B RELL1
- AQP1
- EGR1 MEIS1 RGS1
- ASPN
- ELOVL5 MFAP4 RGS5
- ATP2B4
- EMP3 MGP SDC2
- AXL
- F13A1 MMP2 SELM
- C10orf56
- FBLN1 MPEG1 SEPT6
- C1QB
- FBN1 MRC1 SERPINF1
- C1QC
- FILIP1L MRGPRF SERPING1
- C1S
- FKBP5 MS4A4A SFRP2
- C20orf118
- FLNA MS4A7 SGCE
- C3
- FN1 MSN SLC20A1
- C9orf19
- FOXF1 MT2A SMOC2
- CALD1
- FXYD6 MXD1 SORBS1
- CALM1
- GALNAC4S-6ST NEXN SPARC
- CCDC80
- GAS1 NID1 SPON1
- CCL11
- GJA1 NR3C1 SRGN
- CCL8
- GNG2 OLFML3 STOM
- CD14
- GPNMB PAG1 TBC1D9
- CD163
- GREM1 PALLD TCEAL7
- 202768_at
- 207392_x_at 217165_x_at 228232_s_at
- 202838_at
- 207432_at 217232_x_at 228241_at
- 203058_s_at
- 207761_s_at 217414_x_at 228469_at
- 203060_s_at
- 208596_s_at 218541_s_at 228961_at
- 203240_at
- 208920_at 218546_at 229070_at
- 203296_s_at
- 209114_at 219059_s_at 229254_at
- 203343_at
- 209374_s_at 219543_at 229659_s_at
- 203474_at
- 209458_x_at 219796_s_at 229831_at
- 203638_s_at
- 209791_at 219948_x_at 230595_at
- 203963_at
- 210107_at 220075_s_at 231925_at
- 204018_x_at
- 210524_x_at 220266_s_at 231975_s_at
- 204034_at
- 210735_s_at 220468_at 233565_s_at
- 204036_at
- 211372_s_at 220645_at 235146_at
- 204130_at
- 211538_s_at 220812_s_at 235766_x_at
- 204388_s_at
- 211549_s_at 221004_s_at 235849_at
- 204389_at
- 211637_x_at 221305_s_at 238143_at
- 204508_s_at
- 211699_x_at 221584_s_at 238750_at
- 204532_x_at
- 211745_x_at 221841_s_at 238751_at
- 204607_at
- 212224_at 221896_s_at 239272_at
- 204673_at
- 212592_at 223484_at 241994_at
- 204818_at
- 212741_at 223597_at 242447_at
- 204895_x_at
- 212814_at 223754_at 242601_at
- 204897_at
- 213317_at 224342_x_at 243278_at; y/o
- 205112_at
-
213451_x_at
224989_at
imagen12
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-
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imagen13
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-
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imagen14
- 205480_s_at
-
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imagen15
(ii)
- 205554_s_at
-
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226147_s_at
imagen16
- 205593_s_at
-
214433_s_at
226302_at
imagen17
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-
214598_at
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imagen18
- 205929_at
-
214916_x_at
226654_at
imagen19
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-
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226811_at
imagen20
- 206094_x_at
-
215299_x_at
227052_at
imagen21
- ADH1C
- FOSB LOC96610 SDCBP2
- AGR3
- FOXF2 MAOA SELENBP1
- ALDH1A1
- FOXP2 MATN2 SI
- ANK3
- FUCA1 MEP1A SMTN
- ARL14
- GPA33 METTL7A SORBS2
- ATP1A2
- HBA1 MFSD4 SRI
- ATP8B1
- HBA2 MGC13057 SST
- BEST2
- HBB MIER3 ST6GALNAC1
- C10orf99
- HHLA2 MMP28 SULT1A1
- C15orf48
- HIGD1A MT1A TNXB
- C1orf115
- HMGCS2 MT1F TSPAN1
- C4orf34
- HPGD MT1M TTRAP
- C6orf105
- HSD11B2 MUC12 UGDH
- C8orf4
- HSD17B2 MUC2 UGP2
- CA12
- HSPA2 MUC4 UGT1A1
- CCL28
- IGHA1 MUCDHL UGT1A3
- CKB
- IGHM MYH11 UGT1A6
- CLCA1
- IL1R2 NDE1 UGT1A8
- CLDN8
- IL8 NR3C2 UGT1A9
- CLIC5
- IQGAP2 P2RY1 UGT2A3
- CMBL
- ITLN1 PADI2 UGT2B15
- CNTN3
- ITM2C PAPSS2 UGT2B 17
- DNASE1L3
- KCNMA1 PBLD VSIG2
- EDG2
- KIAA0828 PDCD4 XDH
- ENAM
- KLF4 PDE9A XLKD1
- ENTPD5
- KRT20 PIGR ZCWPW2
- ETHE1
-
LOC253012
PLCE1
imagen22
- FABP1
-
LOC25845
PPID
imagen23
- FAM46C
-
LOC285382
PRKACB
imagen24
- FAM55D
-
LOC572558
PTGER4
imagen25
- FCGBP
-
LOC646627
RAB27A
imagen26
- FGFR2
-
LOC652128
SCARA5
imagen27
en una muestra biológica de dicho individuo en la que un nivel inferior de expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o grupo (ii) en relación con los niveles de control es indicativo de una célula cancerosa o una célula predispuesta a la aparición de un estado de cáncer.
En otro aspecto más, se proporciona un método para detectar el inicio o la predisposición a la aparición de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método el cribado del nivel de expresión de uno
- o más genes o transcritos seleccionados de:
- (i)
- el gen, genes o transcriptos detectados por Affymetπx probeset IDs
- 202920_at
- 209613_s_at 228504_at 214598_at
- 203881_s_at
- 220037_s_at 228706_s_at 219948_x_at
- 204719_at
- 220376_at 228766_at 220812_s_at
- 204931_at
- 222717_at 228854_at 221305_s_at
- 204940_at
- 224412_s_at 228885_at 229831_at
- 205433_at
- 225381_at 230788_at 231925_at
- 206637_at
- 225575_at 231120_x_at 235146_at
- 207080_s_at
- 227529_s_at 231773_at 238751_at
- 207980_s_at
- 227623_at 203296_s_at 243278_at; y/o
- 209170_s_at
-
227705_at
206664_at
imagen28
- ATP1A2
- FOXP2 P2RY1 UGT1A8
- CLDN8
- HHLA2 SI UGT2A3
- CNTN3
-
HPGD
SORBS2
imagen30
en una muestra biológica de dicho individuo en donde un nivel inferior de expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o grupo (ii) que no está sustancialmente por encima de los niveles de fondo es indicativo de una célula cancerosa o una célula predispuesta al inicio de un estado canceroso.
En otro aspecto adicional se proporciona un método para caracterizar una célula neoplásica o población celular, cuya célula o población celular se deriva del intestino grueso de un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes o transcritos seleccionados de:
(i) el gen, genes o transcripciones detectadas por Affymetrix probeset IDs:
- 200600_at
- 202766_s_at 210495_x_at 218469_at
- 200665_s_at
- 202859_x_at 210511_s_at 218559_s_at
- 200832_s_at
- 202878_s_at 210764_s_at 218638_s_at
- 200974_at
- 202917_s_at 210809_s_at 219087_at
- 200986_at
- 202998_s_at 211161_s_at 221011_s_at
- 201058_s_at
- 203083_at 211571_s_at 221729_at
- 201069_at
- 203325_s_at 211719_x_at 221730_at
- 201105_at
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- 201147_s_at
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- 201150_s_at
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- 201162_at
- 203878_s_at 211966_at 224560_at
- 201163_s_at
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- 201185_at
- 204051_s_at 211981_at 224724_at
- 201261_x_at
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- 201289_at
- 204320_at 212344_at 225681_at
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- 204475_at 212353_at 225710_at
- 201438_at
- 204620_s_at 212354_at 225799_at
- 201616_s_at
- 205479_s_at 212464_s_at 226237_at
(ii)
- 201645_at
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- 201667_at
- 205828_at 212489_at 226694_at
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- 209596_at 217762_s_at 234994_at; y/o
- 202404_s_at
-
209875_s_at
217763_s_at
imagen31
- 202450_s_at
-
209955_s_at
217764_s_at
imagen32
- 202620_s_at
-
210095_s_at
218468_s_at
imagen33
- COL1A2
- INHBA FAP IGFBP3
- CTHRC1
- COL6A2 VIM SERPINF1
- FN1
- ANTXR1 TIMP2 ISLR
- POSTN
- GPNMB SCD HNT
- SPP1
- BGN TIMP3 COL5A1
- MMP1
- TAGLN AEBP1 OLFML2B
- SPARC
- COL4A1 GJA1 KIAA1913
- LUM
- RAB31 NNMT PALM2-AKAP2
(ii)
- 204811_s_at
- 217109_at 228232_s_at
- 204895_x_at
- 217110_s_at 229070_at
- 204897_at
- 218211_s_at 231832_at
- 205259_at
- 219543_at 232176_at
- 205765_at
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- 205927_s_at
- 221841_s_at 235976_at
- 208063_s_at
- 221874_at 236894_at
- 208937_s_at
- 223969_s_at 237521_x_at
- 210107_at
- 223970_at 242601_at; y/o
- 213106_at
-
imagen35 imagen36
- CLCA1
- CTSE ATP8B1
- FCGBP
- C6orf105 CACNA2D2
- HMGCS2
- CKB KLF4
- RETNLB
- ATP8A1 CYP3A5P2
- L1TD1
- MUC4 CAPN9
- SLITRK6
- UGT1A1 NR3C2
- VSIG2
- SELENBP1 PBLD
- LOC253012
- PTGER4 CA12
- ST6GALNAC1
- MLPH WDR51B
- ID1
- KIAA1324 FAM3D
- CYP3A5
-
imagen37 imagen38
en una muestra biológica de dicho individuo en la que un nivel más bajo de expresión de los genes o transcritos del 5 grupo (i) y/o grupo (ii) en relación con un nivel de control del adenoma gastrointestinal es indicativo de un cáncer o una célula predispuesta al inicio de un estado canceroso.
En otro aspecto más, se proporciona un método para caracterizar una célula neoplásica o población celular, cuya célula o población celular se deriva del intestino grueso de un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes o transcritos seleccionados de:
10 (i) el gen o genes detectados por Affymetrix probeset IDs:
202404_s_at, 212464_s_at, 210809_s_at, 225681_at; y/o
(ii) COL1A2, FN1, POSTN, CTHRC1
en una muestra biológica de dicho individuo en la que un nivel inferior de expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o grupo (ii) en relación con un nivel de control del cáncer gastrointestinal es indicativo de una célula de adenoma o una célula predispuesta al inicio de un estado de adenoma.
Todavía en otro aspecto más, se proporciona un método para caracterizar una célula neoplásica o población celular, cuya célula o población celular se deriva del intestino grueso de un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes seleccionados de:
(i) el gen, genes o transcripciones detectadas por Affymetrix probeset IDs:
10 y/o
(ii)
en una muestra biológica de dicho individuo en la que un nivel inferior de expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o grupo (ii) en relación con un nivel de control del cáncer gastrointestinal es indicativo de una célula de
15 adenoma o una célula predispuesta al inicio de un estado de adenoma.
Todavía en otro aspecto más, la presente descripción se refiere a un método para caracterizar una célula o población celular, cuya célula o población celular se deriva del intestino grueso de un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes o transcripciones seleccionadas de:
- (i)
- el gen, genes o transcripciones detectadas por Affymetrix probeset IDs:
- (ii)
- 200665_s_at
- 219087_at 37892_at 201141_at
- 201744_s_at
- 226237_at 202917_s_at 213905_x_at
- 218468_s_at
- 225664_at 226930_at 205547_s_at
- 202859_x_at
- 221730_at 204051_s_at 201438_at;
- 211959_at
- 207173_x_at 210511_s_at y/o
- 223122_s_at
- 203083_at 209156_s_at
- 212353_at
- 203477_at 224694_at
- SPARC
- ASPN COL15A1 ANTXR1
- LUM
- COL6A3 COL11A1 GPNMB
- GREM1
- COL8A1 S100A8 BGN
- IL8
- COL12A1 FNDC1 TAGLN
- IGFBP5
- COL5A2 SFRP4
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
en una muestra biológica de dicho individuo en donde la expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o (ii) a un nivel que no es sustancialmente mayor que los niveles de tejido neoplásico de fondo es indicativo de un cáncer o una célula predispuesta al inicio de un estado canceroso.
Un aspecto relacionado de la presente descripción proporciona una matriz molecular, dicha matriz comprende una pluralidad de:
- (i)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos correspondiente a uno cualquiera o más de los genes marcadores neoplásicos descritos anteriormente o una secuencia que exhibe al menos 80% de identidad con ellos o un derivado funcional, fragmento, variante u homólogo de dicha molécula de ácido nucleico; o
- (ii)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse con una cualquiera
- o más de las secuencias de (i) en condiciones de rigurosidad media o un derivado funcional, fragmento, variante u homólogo de dicha molécula de ácido nucleico; o
(iii) sondas u oligonucleótidos de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse con una cualquiera o más de las secuencias de (i) en condiciones de rigurosidad media o un derivado funcional, fragmento, variante u homólogo de dicha molécula de ácido nucleico; o
(iv) sondas capaces de unirse a una cualquiera o más de las proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico de (i) o un derivado, fragmento u homólogo de las mismas
en donde el nivel de expresión de dichos genes marcadores de (i) o proteínas de (iv) es indicativo del estado neoplásico de una célula o subpoblación celular derivada del intestino grueso.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una representación gráfica de alcohol deshidrogenasa IB (clase I), polipéptido beta.
La Figura 2 es una representación gráfica de la metilación de MAMDC2 y GPM6B en tejidos y líneas celulares normales y neoplásicas. El panel A muestra el nivel de metilación del gen MAMDC2 evaluado por PCR específica de metilación, usando la amplificación del gen CAGE para normalizar los niveles de entrada de ADN. Cada punto representa una muestra de tejido individual o línea celular. Las muestras incluyeron ADN de 18 tejidos de cáncer colorrectal, 12 adenomas colorrectales, 22 tejidos colorrectales normales emparejados, otros 6 tejidos normales y una línea celular y 6 líneas celulares de cáncer de colon. El panel B muestra el nivel relativo de metilación del gen GPM6B evaluado mediante un ensayo COBRA. Los niveles de metilación se puntuaron entre 0 (sin digestión con enzimas de restricción) y 5 (digestión con enzimas de restricción completas). Cada punto representa una sola muestra de tejido. Las muestras incluyeron 14 tejidos de cáncer colorrectal, 11 adenomas colorrectales y 22 tejidos normales emparejados.
La Figura 3 es una representación esquemática de variantes de ARN predichas derivadas de hCG_1815491. Se usaron clones de ADNc derivados de las regiones 8579310 a 8562303 del mapa en el cromosoma 16 humano para localizar secuencias de exones. Flechas: los juegos de cebadores de oligonucleótidos se diseñaron para permitir la medición de variantes de ARN individuales por PCR. Los cebadores que cubren las uniones de corte y empalme se muestran como secuencias de intrón que se extienden, que no están incluidas en la secuencia de cebador de oligonucleótido real.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa, en parte, en la elucidación de los perfiles de expresión génica que caracterizan las poblaciones celulares del intestino grueso en términos de su estado neoplásico y, más particularmente, si son malignas o premalignas. Este hallazgo ahora ha facilitado el desarrollo de medios de rutina para detectar la aparición o predisposición a la aparición de una neoplasia de intestino grueso o caracterizar poblaciones celulares derivadas del intestino grueso basándose en la detección de la regulación a la baja de la expresión de estas moléculas, en relación con los patrones y niveles de expresión control. Con este fin, además de evaluar los niveles de expresión de los genes en cuestión en relación con los niveles normales o no neoplásicos, se ha determinado que una proporción de estos genes no se expresa en el estado de enfermedad, lo que facilita el desarrollo de una prueba cualitativa simple basado en la evaluación requerida solo en relación con los niveles de fondo de la prueba.
De acuerdo con la presente descripción, se ha determinado que los genes detallados anteriormente están modulados, en términos de cambios diferenciales en sus niveles de expresión, dependiendo de si la célula que expresa ese gen es neoplásica o no. Debe entenderse que la referencia a un gen "producto de expresión" o "expresión de un gen" es una referencia ya sea a un producto de transcripción (tal como ARN primario o ARNm) o a un producto de traducción tal como una proteína. A este respecto, se pueden evaluar los cambios en el nivel de expresión de un gen detectando los cambios en el nivel del producto de expresión que se produce (es decir, ARN o proteína), cambios en las proteínas
de cromatina con las que está asociado el gen, por ejemplo, la presencia de histona H3 metilada en lisina en la posición de aminoácido número 9 ó 27 (modificaciones represivas) o cambios en el ADN mismo que actúa para inhibir la expresión, como cambios en la metilación del ADN. Estos genes y sus productos de expresión génica, ya sean transcritos de ARN, cambios en el ADN que actúan para regular negativamente la expresión o proteínas codificadas, se denominan colectivamente “marcadores neoplásicos”.
Por consiguiente, un aspecto de la presente descripción se refiere a un método para detectar el inicio o la predisposición a la aparición de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes o transcritos seleccionados de:
(i) el gen, los genes o las transcripciones detectadas por Affymetrix probeset IDs:
- 200600_at
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- 200621_at
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- 200795_at
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- 200799_at
- 208747_s_at 217764_s_at 203638_s_at
- 200845_s_at
- 208763_s_at 217767_at 203963_at
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- 208788_at 217897_at 204018_x_at
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(ii)
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- 208383_s_at
-
217480_x_at
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imagen43
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- ZG16
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- CA2
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- CA1
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- LOC387763
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- TYROBP IGL@ PAG1
- MYLK
- TNS1 PBLD HCLS1
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utilizar una sonda o conjunto de sondas dirigido a cualquier región del transcrito y no solo a la región de transcripción de 600 pb 3-terminal a la que a menudo se dirigen las sondas Affymetrix.
La referencia a cada uno de los genes y transcritos detallados anteriormente y sus productos de expresión transcritos y traducidos debería entenderse, por lo tanto, como una referencia a todas las formas de estas moléculas y a fragmentos o variantes de las mismas. Como apreciará la persona experta en la técnica, se sabe que algunos genes exhiben variación alélica entre individuos. Por consiguiente, debe entenderse que la presente descripción se extiende a las variantes que, en términos de las aplicaciones de diagnóstico actuales, logran el mismo resultado a pesar del hecho de que puedan existir variantes genéticas menores entre las secuencias de ácido nucleico reales entre individuos o que dentro de un individuo existe puedan existir 2 o más variantes de empalme del gen en cuestión. Por lo tanto, debe entenderse que la presente invención se extiende a todas las formas de ARN (por ejemplo, ARNm, transcrito de ARN primario, miARN, etc.), ADNc e isoformas peptídicas que surgen de corte y empalme alternativo o cualquier otra mutación, variación polimórfica o alélica. También debe entenderse que incluye la referencia a cualquier subunidad de polipéptidos tales como formas precursoras que pueden generarse, ya sea que existan como un monómero, multímero, proteína de fusión u otro complejo.
Para este fin, en términos de los genes abarcados por la presente descripción, se describen en el Ejemplo 6 medios para determinar la existencia de tales variantes, y la caracterización de las mismas. En la medida en que los genes de la presente descripción se describen por referencia a un conjunto de sondas Affymetrix, la Tabla 6 proporciona detalles de la secuencia de ácido nucleico a la que se dirige cada conjunto de sondas. En base a esta información, la persona experta podría, como una cuestión de procedimiento de rutina, identificar el gen respecto del cual esa secuencia forma parte. Un protocolo típico para hacer esto también se describe en el Ejemplo 6. Se debe entender que el "individuo" que es el sujeto de la prueba puede ser cualquier mamífero humano o no humano. Ejemplos de mamíferos no humanos incluyen primates, animales de granja (por ejemplo, caballos, ganado vacuno, ovejas, cerdos, burros), animales de laboratorio (p. ej., ratones, ratas, conejillos de indias), animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos) y animales salvajes cautivos (por ejemplo, ciervos, zorros). Preferiblemente, el mamífero es un humano.
El método de la presente invención se basa en la comparación del nivel de los marcadores neoplásicos de una muestra biológica con los niveles de control de estos marcadores. El "nivel de control" puede ser un "nivel normal", que es el nivel de marcador expresado por una correspondiente célula de intestino grueso o una población celular que no es neoplásica.
El nivel normal (o "no neoplásico") puede determinarse usando tejidos derivados del mismo individuo que es objeto de prueba. Sin embargo, se apreciará que esto puede ser bastante invasivo para el individuo en cuestión y, por lo tanto, es más conveniente analizar los resultados de la prueba en relación con un resultado estándar que refleje resultados individuales o colectivos obtenidos de individuos que no sean el paciente en cuestión. Esta última forma de análisis es, de hecho, el método de análisis preferido, ya que permite el diseño de kits que requieren la recopilación y el análisis de una única muestra biológica, que es una muestra de prueba de interés. Los resultados estándar que proporcionan el nivel normal se pueden calcular por cualquier medio adecuado que sea bien conocido por la persona experta en la técnica. Por ejemplo, una población de tejidos normales puede evaluarse en términos del nivel de los marcadores neoplásicos de la presente invención, proporcionando de ese modo un valor estándar o intervalo de valores frente al que se analizan todas las muestras de prueba futuras. También se debe entender que el nivel normal se puede determinar a partir de los sujetos de una cohorte específica y para su uso con respecto a las muestras de prueba derivadas de esa cohorte. De acuerdo con esto, se puede determinar un número de valores estándar o intervalos que corresponden a cohortes que difieren con respecto a características tales como la edad, el sexo, la etnia
o el estado de salud. Dicho "nivel normal" puede ser un nivel discreto o un intervalo de niveles. Una disminución en el nivel de expresión de los genes en cuestión con relación a los niveles normales es indicativo de que el tejido es neoplásico.
Sin limitar la presente descripción a ninguna teoría o modo de acción, aunque cada uno de los genes o transcritos descritos anteriormente se expresa diferencialmente, tampoco individualmente o en combinación, como entre células neoplásicas y no neoplásicas del intestino grueso, y por lo tanto es diagnóstico de la existencia de una neoplasia del intestino grueso, se encontró que la expresión de algunos de estos genes exhibía niveles particularmente significativos de sensibilidad, especificidad y valor predictivo positivo y negativo. Por consiguiente, en una realización preferida, se seleccionaría y evaluaría el nivel de expresión de uno o más de estos genes. Para este fin, y sin limitar la presente descripción a ninguna teoría o modo de acción, se determinó que los siguientes marcadores se expresaban en tejido neoplásico a un nivel de 3-11 veces menor que el tejido no neoplásico, cuando se evaluaba en virtud del método ejemplificado en este documento:
- Número de reducciones
- Gen, genes o las transcripciones detectadas por Affymetrix Sonda No: Gen
- 11
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- TPM2
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- CLCA1
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- WWTR1
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- LUM
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25 5
10
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35
40
y/o
- (ii)
en una muestra biológica de dicho individuo en la que un nivel más bajo de expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o grupo (ii) en relación con los niveles de control es indicativo de una célula neoplásica del intestino grueso
- o una célula predispuesta a la aparición de un estado neoplásico.
Preferiblemente, dicho nivel de control es un nivel no neoplásico.
Todavía en otra realización preferida, se proporciona un método para detectar el inicio o la predisposición a la aparición de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes o transcritos seleccionados de:
- (i)
- el gen, genes o transcripciones detectadas por el conjunto de sondas Affymetrix ID: 220834_at; y/o
- (ii)
- MS4A12
en una muestra biológica de dicho individuo en la que un nivel más bajo de expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o grupo (ii) en relación con los niveles de control es indicativo de una célula neoplásica del intestino grueso
- o una célula predispuesta a la aparición de un estado neoplásico.
Preferiblemente, dicho nivel de control es un nivel no neoplásico.
Todavía en otra realización preferida, se proporciona un método para seleccionar el inicio o la predisposición a la aparición de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes o transcritos seleccionados de:
- (i)
- el gen, genes o transcripciones detectadas por el conjunto de sondas Affymetrix ID: 206784_at; y/o
- (ii)
- AQP8
en una muestra biológica de dicho individuo en la que un nivel más bajo de expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o grupo (ii) en relación con los niveles de control es indicativo de una célula neoplásica del intestino grueso
- o una célula predispuesta a la aparición de un estado neoplásico.
Preferiblemente, dicho nivel de control es un nivel no neoplásico.
En una realización adicional, se proporciona un método para detectar el inicio o la predisposición a la aparición de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes o transcritos seleccionados de:
- (i)
- (i) el gen, genes o transcripciones detectadas por el conjunto de sondas Affymetrix ID: 203908_at, 206198_s_at, 205547_s_at, 207003_at, 206422_at, 209613_s_at, 207245_at; y/o
- (ii)
- SLC4A4, CEACAM7, TAGLN, GUCA1B, GCG, ADH1B, UGT2B17
en una muestra biológica de dicho individuo en la que un nivel más bajo de expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o grupo (ii) en relación con los niveles de control es indicativo de una célula neoplásica del intestino grueso
- o una célula predispuesta a la aparición de un estado neoplásico.
Preferiblemente, dicho nivel de control es un nivel no neoplásico.
En otra realización adicional, se proporciona un método para detectar el inicio o la predisposición al inicio de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes o transcritos seleccionados de:
(i) el gen, genes o transcripciones detectadas por el conjunto de sondas Affymetrix ID: 206134_at, 217546_at, 206561_s_at, 211719_x_at, 202291_s_at, 209687_at; y/o
Por consiguiente, en un aspecto relacionado, la presente descripción se refiere a un método para detectar el inicio o la predisposición a la aparición de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método seleccionar el nivel de expresión de uno o más genes o transcritos seleccionados de:
(i) el gen, genes o transcripciones detectadas por el conjunto de sondas Affymetrix ID:
- 200600_at
- 203680_at 211959_at 218469_at
- 200665_s_at
- 203729_at 211964_at 218559_s_at
- 200799_at
- 203748_x_at 211985_s_at 219087_at
- 200845_s_at
- 204069_at 211990_at 219607_s_at
- 200859_x_at
- 204122_at 211991_s_at 221541_at
- 200897_s_at
- 204135_at 212077_at 222043_at
- 200974_at
- 204438_at 212091_s_at 222453_at
- 200986_at
- 204457_s_at 212136_at 222513_s_at
- 201041_s_at
- 204570_at 212158_at 223121_s_at
- 201061_s_at
- 204688_at 212185_x_at 223122_s_at
- 201069_at
- 205412_at 212195_at 223235_s_at
- 201105_at
- 205683_x_at 212230_at 223343_at
- 201137_s_at
- 205935_at 212233_at 224560_at
- 201141_at
- 207134_x_at 212265_at 224694_at
- 201150_s_at
- 207266_x_at 212386_at 224840_at
- 201289_at
- 208131_s_at 212387_at 224964_s_at
- 201300_s_at
- 208370_s_at 212397_at 225242_s_at
- 201426_s_at
- 208747_s_at 212414_s_at 225269_s_at
- 201438_at
- 208788_at 212419_at 225353_s_at
- 201616_s_at
- 208789_at 212464_s_at 225381_at
- 201617_x_at
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- 201645_at
- 209047_at 212671_s_at 225602_at
- 201667_at
- 209101_at 212713_at 225604_s_at
- 201743_at
- 209138_x_at 212764_at 225626_at
- 201744_s_at
- 209147_s_at 212956_at 225688_s_at
- 201842_s_at
- 209156_s_at 213428_s_at 225710_at
- 201852_x_at
- 209191_at 213509_x_at 226001_at
- 201858_s_at
- 209209_s_at 213746_s_at 226051_at
- 201859_at
- 209210_s_at 213891_s_at 226084_at
- 201865_x_at
- 209312_x_at 214038_at 226103_at
- 201893_x_at
- 209335_at 214677_x_at 226430_at
- 201920_at
- 209436 at 214752_x_at 226682_at
- 202007_at
- 209457_at 215049_x_at 226694_at
- 202069_s_at
- 209496_at 215076_s_at 226818_at
- 202133_at
- 209621_s_at 215193_x_at 226834_at
- 202283_at
- 209651_at 215382_x_at 226841_at
- 202291_s_at
- 209656_s_at 215388_s_at 227061_at
- 202403_s_at
- 209868_s_at 216442_x_at 227099_s_at
- 202620_s_at
- 210084_x_at 216474_x_at 227235_at
- 202686_s_at
- 210133_at 216834_at 227404_s_at
- 202760_s_at
- 210139_s_at 217480_x_at 227529_s_at
- 202766_s_at
- 210495_x_at 217757_at 227561_at
- 202953_at
- 210517_s_at 217762_s_at 227623_at
- 202957_at
- 210764_s_at 217764_s_at 227705_at
- 202994_s_at
- 210809_s_at 217767_at 227727_at
- 202995_s_at
- 210982_s_at 217897_at 228507_at
- 203066_at
- 211161_s_at 218162_at 228750_at
- 203131_at
- 211596_s_at 218224_at 228846_at
- 203305_at
- 211671_s_at 218312_s_at 229530_at
- 203382_s_at
- 211719_x_at 218353_at 230264_s_at
- 203477_at
- 211813_x_at 218418_s_at 231579_s_at
- 203645_s_at
- 211896_s_at 218468_s_at 234987_at;
y/o
(ii)
- A2M
- CYBRD1 LGALS1 PRKAR2B
- ACAT1
- CYR61 LOC283666 PRNP
- ACTA2
- DCN LOC339562 PTGIS
- AKAP12
- DDR2 LOC387763 PTRF
- ANKRD25
- DSCR1 LOC399959 QKI
- ANTXR1
- DUSP1 LRIG1 RAB31
- AP1S2
- DUSP5 LUM RARRES2
- APOE
- EFEMP1 MAFB RBMS1
- AQP1
- EGR1 MAP1B RDX
- ASPN
- ELOVL5 MEIS1 RELL1
- ATP2B4
- EMP3 MFAP4 RGS1
- AXL
- F13A1 MGP RGS5
- C10orf56
- FBLN1 MMP2 SDC2
- C1QB
- FBN1 MPEG1 SELM
- C1QC
- FILIP1L MRC1 SEPT6
- C1S
- FKBP5 MRGPRF SERPINF1
- C20orf118
- FLNA MS4A4A SERPING1
- C3
- FN1 MS4A7 SFRP2
- C9orf19
- FOXF1 MSN SGCE
- CALD1
- FXYD6 MT2A SLC20A1
- CALM1
- GALNAC4S-6ST MXD1 SMOC2
- CCDC80
- GAS1 NEXN SORBS1
- CCL11
- GJA1 NIDI SPARC
- CCL8
- GNG2 NR3C1 SPON1
- CD14
- GPNMB OLFML3 SRGN
- CD163
- GREM1 PAG1 STOM
- 202838_at
- 207390_s_at 217022_s_at 227725_at
- 203058_s_at
- 207392_x_at 217109_at 227735_s_at
- 203060_s_at
- 207432_at 217110_s_at 227736_at
- 203240_at
- 207761_s_at 217165_x_at 228133_s_at
- 203296_s_at
- 208596_s_at 217232_x_at 228195_at
- 203343_at
- 208920_at 217414_x_at 228232_s_at
- 203474_at
- 209114_at 218541_s_at 228241_at
- 203638_s_at
- 209374_s_at 218546_at 228469_at
- 203963_at
- 209458_x_at 219059_s_at 228961_at
- 204018_x_at
- 209791_at 219543_at 229070_at
- 204034_at
- 210107_at 219796_s_at 229254_at
- 204036_at
- 210524_x_at 219948_x_at 229659_s_at
- 204130_at
- 210735_s_at 220075_s_at 229831_at
- 204388_s_at
- 211372_s_at 220266_s_at 230595_at
- 204389_at
- 211538_s_at 220468_at 231925_at
- 204508_s_at
- 211549_s_at 220645_at 231975_s_at
- 204532_x_at
- 211637_x_at 220812_s_at 233565_s_at
- 204607_at
- 211699_x_at 221004_s_at 235146_at
- 204673_at
- 211745_x_at 221305_s_at 235766_x_at
- 204818_at
- 212224_at 221584_s_at 235849_at
- 204895_x_at
- 212592_at 221841_s_at 238143_at
- 204897_at
- 212741_at 221896_s_at 238750_at
- 205112_at
- 212814_at 223484_at 238751_at
- 205259_at
- 213317_at 223597_at 239272_at
- 205403_at
- 213451_x_at 223754_at 241994_at
- 205480_s_at
- 213629_x_at 224342_x_at 242447_at
- 205554_s_at
- 213921_at 224989_at 242601_at
(ii)
- 205593_s_at
- 213953_at 224990_at 243278_at;
- 205892_s_at
- 214164_x_at 225458_at y/o
- 205929_at
-
214433_s_at
225728_at
imagen54
- ADH1C
- FGFR2 LOC646627 PTGER4
- AGR3
- FOSB LOC652128 RAB27A
- ALDH1A1
- FOXF2 LOC96610 SCARA5
- ANK3
- FOXP2 MAOA SDCBP2
- ARL14
- FUCA1 MATN2 SELENBP1
- ATP1A2
- GPA33 MEP1A SI
- ATP8B1
- HBA1 METTL7A SMTN
- BEST2
- HBA2 MFSD4 SORBS2
- C10orf99
- HBB MGC13057 SRI
- C15orf48
- HHLA2 MIER3 SST
- C1orf115
- HIGD1A MMP28 ST6GALNAC1
- C4orf34
- HMGCS2 MT1A SULT1A1
- C6orf105
- HPGD MT1F TNXB
- C8orf4
- HSD11B2 MT1M TSPAN1
- CA12
- HSD17B2 MUC12 TTRAP
- CCL28
- HSPA2 MUC2 UGDH
- CKB
- IGHA1 MUC4 UGP2
- CLCA1
- IGHM MUCDHL UGT1A1
- CLDN8
- IL1R2 MYH11 UGT1A3
- CLIC5
- IL8 NDE1 UGT1A6
- CMBL
- IQGAP2 NR3C2 UGT1A8
- CNTN3
- ITLN1 P2RY1 UGT1A9
- DNASE1L3
- ITM2C PADI2 UGT2A3
y/o
(ii)
- 207980_s_at
- 227623_at 203296_s_at 243278_at;
- 209170_s_at
-
227705_at
206664_at
imagen56
- 209209_s_at
-
227827_at
211549_s_at
imagen57
- ADH1B
- CD36 P2RY1 PLEKHC1
- SORBS2
- BCHE ANK2 LRRC19
- PYY
- TCEAL7 XLKD1 LIFR
- ABCA8
- ANGPTL1 LOC399959 ATP1A2
- RPL24
- DMD AKAP12 HPGD
- SI
- GCNT2 UGT2A3 GPM6B
- CLDN8
- SDPR HHLA2 UGT1A8
- P2RY14
- PKIB SORBS2 FOXP2
- PLN
-
CITED2
CLDN23
imagen58
- TRPM6
-
TCF21
CNTN3
imagen59
en una muestra biológica de dicho individuo en el que un nivel de expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o 5 grupo (ii) que no está sustancialmente por encima de los niveles de fondo es indicativo de una célula neoplásica o una célula predispuesta a la aparición de un estado neoplásico.
En una realización más preferida, dichos genes o transcripciones se seleccionan de:
(i) el gen, genes o transcripciones detectadas por el conjunto de sondas Affymetrix ID: 209613_s_at, 227827_at, 204719_at, 228504_at, 228885_at, 206664_at, 207080_s_at; y/o 10 (ii) ADH1B, SORBS2, PYY, ABCA8, RPL24, SI
Preferiblemente, dicha neoplasia es un adenoma o un adenocarcinoma y dicho tejido gastrointestinal es tejido colorrectal. En otra realización más, se ha determinado que una subpoblación adicional de estos marcadores es más característica
del desarrollo de adenoma, mientras que otros son más característicos del desarrollo del cáncer. Por consiguiente, se 15 proporciona un medio conveniente de obtener cualitativamente información indicativa en relación con las
características del neoplasma en cuestión. De acuerdo con esta realización, se proporciona un método para seleccionar el inicio o la predisposición a la aparición de una neoplasia de intestino grueso en un individuo, comprendiendo dicho método el cribado del nivel de expresión de uno o más genes o transcritos seleccionados de:
20 (i) el gen, genes o transcripciones detectadas por el conjunto de sondas Affymetrix ID: 209209_s_at, 225381_at, 227529_s_at, 227623_at, 227705_at; y/o
(ii) AKAP12, LOC399959, PLEKHC1, TCEAL7
En términos de cribado para la regulación por disminución de la expresión de un marcador, también sería bien conocido por la persona experta en la técnica que los cambios que son detectables a nivel de ADN son indicativos de cambios en la actividad de expresión génica y por lo tanto cambios en los niveles de productos de expresión. Tales cambios incluyen, pero no están limitados a, cambios en la metilación del ADN. Por consiguiente, la referencia en este
5 documento a "detectar el nivel de expresión" y la comparación de estos "niveles de expresión" para controlar "niveles de expresión" debe entenderse como una referencia para evaluar factores de ADN que están relacionados con la transcripción, como los patrones de metilación de genes/ADN.
También sería conocido por las personas expertas en la técnica que los cambios en la estructura de la cromatina son indicativos de cambios en la expresión génica. El silenciamiento de la expresión génica a menudo está asociado con
10 la modificación de las proteínas de la cromatina, la metilación de las lisinas en una o ambas posiciones 9 y 27 de la histona H3 son ejemplos bien estudiados, mientras que la cromatina activa está marcada por la acetilación de la lisina 9 de la histona H3. De este modo, la asociación de secuencias génicas con cromatina que lleva modificaciones represivas o activas puede usarse para realizar una evaluación del nivel de expresión de un gen.
Está dentro de la habilidad de la persona experta en la técnica determinar el método de detección más apropiado para
15 cualquier situación dada. Con este fin, los genes que se sabe que codifican un producto de expresión que es secretado por la célula o el límite de membrana se detallan en la tabla a continuación. Se apreciará que el cribado de marcadores neoplásicos que se secretan o se unen a la membrana puede proporcionar ventajas particulares en términos del diseño de un producto de detección de diagnóstico.
- El gen o los genes detectados por la sonda Affymetrix no:
- 200600_at
- 205593_s_at 212185_x_at 224480_s_at
- 200845_s_at
- 205765_at 212192_at 224663_s_at
- 200859_x_at
- 205892_s_at 212224_at 224694_at
- 200884_at
- 205927_s_at 212230_at 224823_at
- 200897_s_at
- 205929_at 212233_at 224836_at
- 200974_at
- 205935_at 212265_at 224840_at
- 201041_s_at
- 205935_at 212288_at 224959_at
- 201058_s_at
- 205950_s_at 212386_at 224963_at
- 201061_s_at
- 206000_at 212387_at 224964_s_at
- 201069_at
- 206094_x_at 212397_at 224989_at
- 201105_at
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- 201137_s_at
- 206149_at 212419_at 225207_at
- 201300_s_at
- 206198_s_at 212671_s_at 225242_s_at
- 201324_at
- 206199_at 212730_at 225269_s_at
- 201426_s_at
- 206208_at 212741_at 225381_at
- 201539_s_at
- 206209_s_at 212764_at _ 225442_at
- 201540_at
- 206262_at 212814_at 225458_at
- 201616_s_at
- 206377_at 212859_x_at 225575_at
- El gen o los genes detectados por la sonda Affymetrix no:
- 201617_x_at
- 206385_s_at 212956_at 225602_at
- 201667_at
- 206461_x_at 213106_at 225604_s_at
- 201739_at
- 206561_s_at 213317_at 225626_at
- 201743_at
- 206576_s_at 213509_x_at 225710_at
- 201865_x_at
- 206637_at 213629_x_at 225720_at
- 201920_at
- 206664_at 213746_s_at 225721_at
- 201957_at
- 206710_s_at 213891_s_at 225782_at
- 202007_at
- 206784_at 213953_at 225894_at
- 202069_s_at
- 207126_x_at 214027_x_at 225895_at
- 202133_at
- 207245_at 214234_s_at 226001_at
- 202242_at
- 207266_x_at 214235_at 226051_at
- 202266_at
- 207390_s_at 214414_x_at 226084_at
- 202274_at
- 207392_x_at 214433_s_at 226103_at
- 202388_at
- 207432_at 214505_s_at 226147_s_at
- 202555_s_at
- 207761_s_at 214598_at 226248_s_at
- 202620_s_at
- 207980_s_at 214677_x_at 226302_at
- 202686_s_at
- 208063_s_at 214696_at 226303_at
- 202731_at
- 208131_s_at 214752_x_at 226304_at
- 202741_at
- 208370_s_at 214768_x_at 226333_at
- 202742_s_at
- 208383_s_at 214777_at 226430_at
- 202746_at
- 208450_at 215049_x_at 226594_at
- 202760_s_at
- 208581_x_at 215118_s_at 226654_at
- 202768_at
- 208596_s_at 215125_s_at 226682_at
- 202888_s_at
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- 202920_at
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- ABCA8
- EGR1 LOC25845 PPID
- ABI3BP
- ELOVL5 LOC283666 PPP1R12B
- ACAT1
- EMP1 LOC285382 PPP1R14A
- ACTA2
- EMP3 LOC339562 PRDX6
- ACTG2
- ENTPD5 LOC387763 PRIMA1
- ADH1B
- EPB41L3 LOC399959 PRKACB
- ADH1C
- ETHE1 LOC572558 PRKAR2B
- AKAP12
- F13A1 LOC63928 PRNP
- AKR1B10
- FABP1 LOC652128 PTGER4
- ALDH1A1
- FABP4 LOC652745 PTGIS
- ANK2
- FAM107A LRIG1 PTRF
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- FAM129A LRRC19 QKI
- ANKRD25
- FAM46C MAB21L2 RAB27A
- ANPEP
- FBLN1 MAFB RAB31
- El gen o los genes detectados por la sonda Affymetrix no:
- ANTXR1
- FCGBP MAG1 RBMS1
- AOC3
- FGFR2 MALL RDX
- AP1S2
- FHL1 MAOA RELL1
- APOE
- FILIP1L MAP1B RGS1
- AQP1
- FKBP5 MEIS1 RGS2
- AQP8
- FLNA MEP1A RGS5
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- BCHE
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- BEST2
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- C10orf56
- GALNAC4S- MPEG1 SELM
- C10orf99
- 6ST MPEG1 SGCE
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- GAS1 MRC1 SGK
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- GCNT3 MS4A12 SLC20A1
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- GNG2 MS4A7 SLC26A3
- C6orf105
- GPA33 MSN SLC4A4
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- GPM6B MSRB3 SLITRK6
- C7
- GUCY1A3 MT1A SMOC2
- C9orf19
- HBA1 MT1E SMTN
- CA1
- HBA2 MT1F SORBS 1
- CA2
- HBB MT1G SRI
- CA4
- HCLS1 MT1H SRPX
- El gen o los genes detectados por la sonda Affymetrix no:
- CALD1
- HHLA2 MT1M ST6GALNAC1
- CALM1
- HIGD1A MT1X STMN2
- CAPN9
- HLA-C MT2A STOM
- CAV1
- HLA-DPA1 MUC12 SULT1A1
- CCDC80
- HLA-DPB1 MUCDHL SYNPO2
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- CFL2
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- CHGA
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- CITED2
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- IGHA1 PALLD TSPAN1
- CLCA1
- IGHM PALM2- TSPAN7
- CLCA4
- IGKV1D-13 AKAP2 TTRAP
- CLDN8
- IGL@ PAPSS2 TUBB6
- CLIC5
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- CMBL
- IL1R2 PCK1 UGDH
- CNN1
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- CNTN3
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- COL4A2
- ITM2A PDGFRA UGT1A3
- COL6A2
- ITM2C PDK4 UGT1A6
- El gen o los genes detectados por la sonda Affymetrix no:
- COX7A1
- KCNMA1 PDLIM3 UGT1A8
- CRYAB
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- KCTD12 PIGR UGT2A3
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- DDR2
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- LMOD1 PPAP2A LOC253012
- PPAP2B
-
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La referencia a "molécula de ácido nucleico" debe entenderse como una referencia tanto a moléculas de ácido desoxirribonucleico como a moléculas de ácido ribonucleico y a fragmentos de las mismas. La presente invención, por lo tanto, se extiende tanto a la detección directa de los niveles de ARNm en una muestra biológica como al cribado
5 del ADNc complementario que se ha transcrito de forma inversa a partir de una población de ARNm de interés. Está dentro de la habilidad de la persona experta en la técnica diseñar una metodología dirigida a la detección de ADN o ARN. Como se detalla anteriormente, el método de la presente invención también se extiende al cribado del producto proteico traducido del ARNm en cuestión o el ADN genómico en sí mismo.
En una realización preferida, el nivel de expresión génica se mide por referencia a genes que codifican un producto
10 de proteína y, más particularmente, dicho nivel de expresión se mide al nivel de las proteínas. Por consiguiente, en la medida en que la presente descripción se dirige al cribado de marcadores que se detallan en la tabla anterior, dicho cribado se dirige preferiblemente a la proteína codificada.
En otra realización particularmente preferida, dicha expresión génica se evalúa analizando la metilación del ADN genómico. En otra realización, la expresión se evalúa mediante la asociación de ADN con proteínas de cromatina que
15 llevan modificaciones represivas, por ejemplo, la metilación de las lisinas 9 ó 27 de la histona H3.
Como se detalla anteriormente, debe entenderse que aunque la presente invención se ejemplifica con respecto a la detección de moléculas de ácido nucleico expresadas (por ejemplo, ARNm), también abarca métodos de detección basados en el cribado del producto proteico de los genes en cuestión. La presente invención también debe entenderse que abarca métodos de detección basados en la identificación de proteínas y/o moléculas de ácido nucleico en una o
20 más muestras biológicas. Esto puede ser de particular importancia en la medida en que algunos de los marcadores neoplásicos de interés pueden corresponder a genes o fragmentos de genes que no codifican un producto proteico. De acuerdo con esto, en la medida en que esto ocurra, no sería posible evaluar una proteína y el marcador en cuestión tendría que evaluarse sobre la base de los perfiles de expresión de transcripción o cambios en el ADN genómico.
El término "proteína" debe entenderse que abarca péptidos, polipéptidos y proteínas (incluyendo fragmentos de
25 proteínas). La proteína puede estar glicosilada o no glicosilada y/o puede contener un rango de otras moléculas fusionadas, enlazadas, unidas o asociadas de otro modo a la proteína, tal como aminoácidos, lípidos, carbohidratos u otros péptidos, polipéptidos o proteínas. La referencia en este documento a una "proteína" incluye una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos así como una proteína asociada con otras moléculas tales como aminoácidos, lípidos, carbohidratos u otros péptidos, polipéptidos o proteínas.
Las proteínas codificadas por los marcadores neoplásicos de la presente invención pueden estar en forma multimérica
5 lo que significa que dos o más moléculas se asocian juntas. Cuando las mismas moléculas de proteína se asocian juntas, el complejo es un homomultímero. Un ejemplo de homomultímero es un homodímero. Cuando al menos una proteína marcadora está asociada con al menos una proteína no marcadora, entonces el complejo es un heteromultímero tal como un heterodímero.
La referencia a un "fragmento" se debe entender como una referencia a una porción de la molécula o proteína de
10 ácido nucleico en cuestión. Esto es particularmente relevante con respecto al cribado de niveles de ARN modulados en muestras de heces ya que es probable que el ARN en cuestión se haya degradado o fragmentado debido al entorno del intestino. Por lo tanto, uno puede realmente detectar fragmentos de la molécula de ARN en cuestión, cuyos fragmentos se identifican en virtud del uso de una sonda adecuadamente específica.
La referencia al "inicio" de una neoplasia, tal como adenoma o adenocarcinoma, debe entenderse como una referencia
15 a una o más células de ese individuo que presenta displasia. En este sentido, el adenoma o adenocarcinoma puede estar bien desarrollado porque se ha desarrollado una masa de células displásicas. Alternativamente, el adenoma o el adenocarcinoma pueden estar en una etapa muy temprana en que solo se han producido relativamente pocas divisiones celulares anormales en el momento del diagnóstico. La presente invención también se extiende a la evaluación de la predisposición de un individuo al desarrollo de una neoplasia, tal como un adenoma o
20 adenocarcinoma. Sin limitar la presente invención de ninguna manera, los niveles modificados de los marcadores neoplásicos pueden ser indicativos de la predisposición de ese individuo para desarrollar una neoplasia, tal como el desarrollo futuro de un adenoma o adenocarcinoma u otro adenoma o adenocarcinoma.
En otro aspecto relacionado de la presente descripción, se han identificado marcadores que permiten la caracterización del tejido neoplásico del intestino grueso en términos de si se trata de un adenoma o un cáncer. Este
25 desarrollo ahora proporciona un medio simple pero preciso para caracterizar el tejido utilizando medios que no sean los métodos tradicionales que se utilizan actualmente.
De acuerdo con este aspecto de la presente descripción, se proporciona un método para caracterizar una célula neoplásica o población celular, cuya población celular o célula se deriva del intestino grueso de un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes o transcripciones seleccionadas de:
30 (i) el gen, genes o transcripciones detectadas por Affymetrix probeset IDs: (ii) en dicha población celular o célula en la que un menor nivel de expresión de los genes del grupo (i) y/o grupo (ii) en relación con un nivel de control del cáncer gastrointestinal es indicativo de una célula de adenoma o una célula predispuesta a la aparición de un estado de adenoma.
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- MMP3 LBH MAFB
- CDH11
- IGFBP7 CTGF LOC541471
- THBS2
- FSTL1 TNC LOC387763
- COL15A1
- COL4A2 G0S2 CHI3L1
- COL11A1
- VCAN SQLE THY1
- S100A8
- SMOC2 EFEMP1 LOXL1
- FNDC1
- HTRA1 APOE CD93
- SFRP4
-
CYR61
MSN
imagen72
en una muestra biológica de dicho individuo en la que un nivel más bajo de expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o grupo (ii) en relación con un nivel de control del adenoma gastrointestinal es indicativo de un cáncer o una célula predispuesta al inicio de un estado canceroso.
Preferiblemente, dicho tejido gastrointestinal es tejido colorrectal.
5 En una realización, dicha expresión se evalúa rastreando los cambios de ADN que impactan en la metilación, en particular la hipermetilación. En otra realización, la expresión se evalúa mediante la asociación de ADN con proteínas de cromatina que llevan modificaciones represivas, por ejemplo, la metilación de las lisinas 9 ó 27 de la histona H3.
La referencia a un "nivel de control de adenoma" o "nivel de control del cáncer" debe entenderse como una referencia al nivel de dicha expresión génica en una población de células gastrointestinales de adenoma o cáncer,
10 respectivamente. Como se discutió anteriormente en relación con "niveles normales", el nivel del sujeto puede ser un nivel discreto o un intervalo de niveles. Por consiguiente, debe entenderse que la definición de "nivel de control de adenoma" o "nivel de control de cáncer" tiene una definición correspondiente a "nivel normal", aunque en el contexto de la expresión de genes por una población neoplásica de células de intestino grueso.
En términos de este aspecto de la presente invención, el análisis del sujeto se realiza en una población de células
15 neoplásicas. Estas células se pueden derivar de cualquier manera, tales como células neoplásicas desprendidas que se han recogido mediante un lavado con enema o a partir de una muestra gastrointestinal, tal como una muestra de heces. Alternativamente, las células en cuestión pueden haberse obtenido a través de una biopsia u otra técnica quirúrgica.
Sin limitar de ningún modo este aspecto de la descripción, se ha determinado que varios de los marcadores de este
20 aspecto de la presente invención se expresan a niveles particularmente significativos por debajo de los de las células neoplásicas. Por ejemplo, se han observado niveles de expresión disminuidos de 3 a 9 veces con respecto a los siguientes marcadores que son indicativos de adenomas gastrointestinales, cuando se evalúan mediante el método ejemplificado en este documento.
- Número de reducciones
- Gen, genes o transcripciones detectadas por la sonda Affymetrix No: Gen
- 9
- 202404_s_at COL1A2
- 8
- 225681_at CTHRC1
- 7
- 212464_s_at FN1
- 210809_s_at
- POSTN
- 6
- 209875 s at SPP1
- 5
- 221740_at MMP1
- 204475_at
- 4
- 200665_s_at SPARC
- 201744_s_at
- LUM
- 218468_s_at
- GREM1
- 202859_x_at
- IL8
- 211959_at
- IGFBP5
- imagen74
- 223122_s_at SFRP2
- imagen75
- 212353_at SULF1
- imagen76
- 219087_at ASPN
- Número de reducciones
- Gen, genes o transcripciones detectadas por la sonda Affymetrix No: Gen
- imagen77
- 201438_at COL6A3
- imagen78
- 226237_at COL8A1
- imagen79
- 225664_at COL12A1
- imagen80
- 221730_at COL5A2
- imagen81
- 207173_x_at CDH11
- imagen82
- 203083_at THBS2
- imagen83
- 203477_at COL15A1
- 3
- 37892_at COL11A1
- imagen84
- 202917_s_at S100A8
- imagen85
- 226930_at FNDC1
- imagen86
- 204051_s_at SFRP4
- imagen87
- 210511_s_at INHBA
- imagen88
- 209156_s_at COL6A2
- imagen89
- 224694_at ANTXR1
- imagen90
- 201141_at GPNMB
- imagen91
- 213905_x_at BGN
- imagen92
- 205547_s_at TAGLN
En otro ejemplo, se han observado niveles de expresión disminuidos de entre 3 y 5 veces con respecto a los siguientes marcadores que son indicativos de cánceres gastrointestinales, cuando se evalúan mediante el método ejemplificado en este documento.
- Número reducciones
- de Gen, genes o transcripciones detectadas por la sonda Affymetrix No: Gen
- 5
-
imagen93 210107_at CLCA1
- 3
-
imagen94 203240_at FCGBP
- 204607_at
- HMGCS2
- imagen95
- 223969_s_at RETNLB
- 219955_at
- L1TD1
- Número reducciones
- de Gen, genes o transcripciones detectadas por la sonda Affymetrix No: Gen
- 232481_s_at
- SLITRK6
- 228232_s_at
- VSIG2
- 242601_at
- LOC253012
- 227725_at
- ST6GALNAC1
De acuerdo con esta realización, se proporciona un método para caracterizar una célula neoplásica o población celular, cuya población celular o célula se deriva del intestino grueso de un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes seleccionados de:
- (i)
- el gen, genes o transcritos detectados por Affymetrix probeset IDs:
y/o
- (ii)
en una muestra biológica de dicho individuo en el que un nivel inferior de expresión de los genes o transcritos del 10 grupo (i) y/o (ii) en relación con un nivel de control del cáncer gastrointestinal es indicativo de una célula de adenoma
o una célula predispuesta al inicio de un estado de adenoma.
En otra realización, se proporciona un método para caracterizar una población celular o célula neoplásica, cuya población celular o célula se deriva del intestino grueso de un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes seleccionados de:
15 (i) el gen, genes o transcritos detectados por el conjunto de sondas de Affymetrix IDs:
y/o
(ii)
en una muestra biológica de dicho individuo en el que un nivel inferior de expresión de los genes o transcritos del 20 grupo (i) y/o (ii) en relación con un nivel de control del cáncer gastrointestinal es indicativo de una célula de adenoma
o una célula predispuesta al inicio de un estado de adenoma. Preferiblemente, dicho tejido gastrointestinal es tejido colorrectal. Todavía más preferiblemente, dicha muestra biológica es una muestra de tejido. En otra realización preferida, la presente descripción se refiere a un método para caracterizar una población celular o
25 célula, cuya población celular o célula se deriva del intestino grueso de un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes o transcripciones seleccionadas de:
(i) el gen, genes o transcripciones detectadas por el conjunto de sondas Affymetrix ID:
Preferiblemente, dicho tejido gastrointestinal es tejido colorrectal.
Incluso más preferiblemente, dicha muestra biológica es una muestra de tejido.
En otro aspecto relacionado, se ha determinado que un subconjunto de los marcadores de este aspecto de la presente invención son útiles como marcadores cualitativos de caracterización de tejido neoplásico porque estos marcadores, 5 si no son detectables a niveles sustancialmente superiores a los niveles de fondo en tejido neoplásico, son indicativos de tejido canceroso.
Según este aspecto, la presente descripción proporciona un método para caracterizar una célula neoplásica o población celular, cuya población celular o célula se deriva del intestino grueso de un individuo, comprendiendo dicho método evaluar el nivel de expresión de uno o más genes o transcripciones seleccionadas de:
10 (i) el gen o genes detectados por el conjunto de sondas Affymetrix ID:
y/o
(ii)
en una muestra biológica de dicho individuo en donde la expresión de los genes o transcritos del grupo (i) y/o (ii) a un
15 nivel que no es sustancialmente mayor que los niveles de tejido neoplásico de fondo es indicativo de un cáncer o una célula predispuesta al inicio de un estado canceroso.
Preferiblemente, dicho tejido gastrointestinal es tejido colorrectal.
Todavía más preferiblemente, dicha muestra biológica es una muestra de tejido.
En una realización más preferida, los métodos de la presente descripción se dirigen preferiblemente al cribado de
20 proteínas codificadas por los marcadores de la presente descripción o a cambios en la metilación del ADN del ADN genómico. En otra realización, la expresión se evalúa mediante la asociación de ADN con proteínas de cromatina que llevan modificaciones represivas, por ejemplo, la metilación de las lisinas 9 ó 27 de la histona H3.
Aunque el método preferido es detectar el producto de expresión o cambios en el ADN de los marcadores neoplásicos con el fin de diagnosticar el desarrollo de neoplasias o su predisposición, la detección de cambios inversos en los 25 niveles de dichos marcadores puede desearse bajo ciertas circunstancias, por ejemplo, para monitorear la efectividad del tratamiento terapéutico o profiláctico dirigido a la modulación de un trastorno neoplásico, como el desarrollo de adenoma o adenocarcinoma. Por ejemplo, cuando la expresión reducida de los marcadores en cuestión indica que un individuo ha desarrollado una afección caracterizada por el desarrollo de un adenoma o adenocarcinoma, por ejemplo, el cribado de un aumento en los niveles de estos marcadores posteriormente al inicio de un régimen terapéutico puede
30 utilizarse para indicar inversión u otra forma de mejora de la condición del individuo en cuestión.
El método de la presente invención es, por lo tanto, útil como una prueba única o como un monitor permanente de aquellos individuos que se considera que están en riesgo de desarrollar neoplasias o como un monitor de la efectividad de los regímenes de tratamiento terapéutico o profiláctico dirigidos a inhibir o no ralentizar el desarrollo de neoplasias. En estas situaciones, el mapeo de la modulación de los niveles de expresión de marcadores neoplásicos en una o 35 más clases de muestras biológicas es un indicador valioso del estado de un individuo o de la eficacia de un régimen terapéutico o profiláctico que se usa actualmente. Por consiguiente, debe entenderse que el método de la presente descripción se extiende a la monitorización de aumentos o disminuciones en los niveles de expresión del marcador en un individuo en relación con su nivel normal (como se define anteriormente), niveles de control de fondo, niveles de cáncer, niveles de adenoma o relativos a uno o más niveles de expresión de marcador más tempranos determinados
40 a partir de una muestra biológica de dicho individuo.
Los medios para evaluar los marcadores de neoplasma expresados en el sujeto en una muestra biológica se pueden lograr mediante cualquier método adecuado, que son bien conocidos por las personas expertas en la técnica. Con este fin, se apreciará que, en la medida en que se está examinando una población celular homogénea (como una biopsia tumoral o una población celular que se ha enriquecido a partir de una población de partida heterogénea) o una 45 sección de tejido, se puede utilizar una amplia gama de técnicas tales como hibridación in situ, evaluación de perfiles de expresión mediante microensayos, inmunoensayos y similares (descritos posteriormente en más detalle en este documento) para detectar la ausencia o la regulación a la baja del nivel de expresión de uno o más marcadores de interés. Sin embargo, en la medida en que se explora una población celular heterogénea o un fluido corporal en el que se encuentran poblaciones heterogéneas de células, como una muestra de sangre, la ausencia o reducción en el nivel
diferencial, donde se compara el perfil de expresión de genes en diferentes células o tejidos, a menudo un tejido de interés y un tejido de control, y cualquier diferencia en la expresión génica entre los tejidos respectivos es identificada. Dicha información es útil para la identificación de los tipos de genes expresados en un tipo de tejido particular y el diagnóstico de condiciones en función del perfil de expresión.
En un ejemplo, el ARN de la muestra de interés se somete a transcripción inversa para obtener ADNc marcado. Ver la patente de los EE. UU. No. 6.410.229 (Lockhart et al.) El ADNc se hibrida luego con oligonucleótidos o ADNc de secuencia conocida dispuestos en un chip u otra superficie en un orden conocido. En otro ejemplo, el ARN se aisló de una muestra biológica y se hibridó a un chip sobre el que se anclaron sondas de ADNc. La ubicación del oligonucleótido al que se hibrida el ADNc marcado proporciona información de secuencia sobre el ADNc, mientras que la cantidad de ARN o ADNc hibridado marcado proporciona una estimación de la representación relativa del ARN o ADNc de interés. Ver Schena, et al. Science 270: 467 -470 (1995). Por ejemplo, el uso de una micromatriz de ADNc para analizar patrones de expresión génica en cáncer humano se describe por DeRisi, et al. (Nature Genetics 14: 457 -460 (1996)).
En una realización preferida, se preparan sondas de ácido nucleico correspondientes a los ácidos nucleicos en cuestión. Las sondas de ácido nucleico unidas al biochip están diseñadas para ser sustancialmente complementarias a los ácidos nucleicos de la muestra biológica de manera que se produce la hibridación específica de la secuencia diana y las sondas de la presente invención. Esta complementariedad no necesita ser perfecta, ya que puede haber cualquier número de desapareamientos de pares de bases que interferirán con la hibridación entre la secuencia diana y los ácidos nucleicos monocatenarios de la presente invención. Se espera que la homología general de los genes a nivel de nucleótidos sea probablemente de aproximadamente 40% o más, probablemente de aproximadamente 60%
o más, e incluso más probablemente de aproximadamente 80% o más; y además que habrá secuencias contiguas correspondientes de aproximadamente 8-12 nucleótidos o más. Sin embargo, si el número de mutaciones es tan grande que no puede producirse hibridación incluso en las condiciones de hibridación menos rigurosas, la secuencia no es una secuencia diana complementaria. Por lo tanto, por "sustancialmente complementario" en este documento se entiende que las sondas son suficientemente complementarias a las secuencias diana para hibridarse en condiciones de reacción normales, particularmente en condiciones de alta rigurosidad.
Una sonda de ácido nucleico generalmente es monocatenaria, pero puede ser parcialmente única y parcialmente bicatenaria. La varadura de la sonda está dictada por la estructura, composición y propiedades de la secuencia objetivo. En general, las sondas de oligonucleótidos varían de aproximadamente 6, 8, 10, 12, 15, 20, 30 a aproximadamente 100 bases de longitud, siendo preferidas de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 bases, y siendo particularmente preferidas de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 bases. Es decir, generalmente genes completos rara vez se utilizan como sondas. En algunas realizaciones, se pueden usar ácidos nucleicos mucho más largos, hasta cientos de bases. Las sondas son suficientemente específicas para hibridar con una secuencia de plantilla complementaria en condiciones conocidas por los expertos en la técnica. El número de desajustes entre las secuencias de la sonda y sus secuencias complementarias de plantilla (objetivo) a las que se hibridan durante la hibridación generalmente no supera el 15%, generalmente no supera el 10% y preferiblemente no supera el 5%, según lo determina BLAST (valor predeterminado ajustes).
Las sondas de oligonucleótidos pueden incluir las bases heterocíclicas que se encuentran naturalmente en los ácidos nucleicos (uracilo, citosina, timina, adenina y guanina), así como bases modificadas y análogos de bases. Cualquier base o análogo de base modificado compatible con la hibridación de la sonda a una secuencia diana es útil en la práctica de la invención. La porción de azúcar o glucósido de la sonda puede comprender desoxirribosa, ribosa y/o formas modificadas de estos azúcares, tales como, por ejemplo, 2'-O-alquil ribosa. En una realización preferida, el resto de azúcar es 2'-desoxirribosa; sin embargo, puede usarse cualquier resto de azúcar que sea compatible con la capacidad de la sonda para hibridarse con una secuencia diana.
En una realización, las unidades de nucleósidos de la sonda están unidas por una cadena principal de fosfodiéster, como es bien conocido en la técnica. En realizaciones adicionales, los enlaces internucleótidos pueden incluir cualquier enlace conocido por un experto en la técnica que sea compatible con la hibridación específica de la sonda que incluye, pero sin limitación, fosforotioato, metilfosfonato, sulfamato (por ejemplo, patente de Estados Unidos Nº 5.470.967) y poliamida (es decir, ácidos nucleicos peptídicos). Los ácidos nucleicos peptídicos se describen en Nielsen et al. (1991) Science 254: 1497 -1500, U.S. Pat. No. 5,714,331, y Nielsen (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10:71-75.
En ciertas realizaciones, la sonda puede ser una molécula quimérica; es decir, puede comprender más de un tipo de base o subunidad de azúcar, y/o los enlaces pueden ser de más de un tipo dentro del mismo cebador. La sonda puede comprender un resto para facilitar la hibridación a su secuencia diana, como se conoce en la técnica, por ejemplo, intercaladores y/o ligantes de surcos menores. Las variaciones de las bases, los azúcares y la cadena principal internucleosida, así como la presencia de cualquier grupo colgante en la sonda, serán compatibles con la capacidad de la sonda para unirse, de una manera específica de la secuencia, con su secuencia diana. Una gran cantidad de modificaciones estructurales son posibles dentro de estos límites. Ventajosamente, las sondas según la presente invención pueden tener características estructurales tales que permitan la amplificación de señal, tales características estructurales son, por ejemplo, sondas de ADN ramificadas como las descritas por Urdea et al. (Nucleic Acids Symp. Ser., 24: 197-200 (1991)) o en la Patente Europea No. EP-0225.807. Además, los métodos sintéticos para preparar las diversas bases heterocíclicas, azúcares, nucleósidos y nucleótidos que forman la sonda, y la preparación de oligonucleótidos de secuencia predeterminada específica, están bien desarrollados y son conocidos en la técnica. Un método preferido para la síntesis de oligonucleótidos se describe en la patente de EE.UU. No. 5.419.966.
Se pueden diseñar múltiples sondas para un ácido nucleico diana particular para dar cuenta del polimorfismo y/o estructura secundaria en el ácido nucleico diana, redundancia de datos y similares. En algunas realizaciones, cuando se usa más de una sonda por secuencia, se usan sondas solapantes o sondas para diferentes secciones de un solo gen diana. Es decir, dos, tres, cuatro o más sondas se usan para generar redundancia para un objetivo en particular. Las sondas pueden superponerse (es decir, tener alguna secuencia en común), o son específicas para secuencias distintas de un gen. Cuando se han de detectar polinucleótidos diana múltiples de acuerdo con la presente invención, cada sonda o grupo de sonda correspondiente a un polinucleótido diana particular está situado en un área discreta de la micromatriz.
Las sondas pueden estar en solución, como en pozos o en la superficie de una micro-matriz, o unidas a un soporte sólido. Los ejemplos de materiales de soporte sólidos que se pueden usar incluyen un plástico, una cerámica, un metal, una resina, un gel y una membrana. Los tipos útiles de soportes sólidos incluyen placas, cuentas, material magnético, microperlas, chips de hibridación, membranas, cristales, cerámicas y monocapas autoensamblables. Un ejemplo comprende una matriz bidimensional o tridimensional, tal como un chip de gel o de hibridación con múltiples sitios de unión de sonda (Pevzner y col., J. Biomol. Struc. & Dyn. 9:399-410, 1991; Maskos y Southern, Nuc. Acids Res. 20: 1679-84, 1992). Los chips de hibridación pueden usarse para construir matrices de sondas muy grandes que posteriormente se hibridan con un ácido nucleico diana. El análisis del patrón de hibridación del chip puede ayudar en la identificación de la secuencia de nucleótidos diana. Los patrones pueden ser analizados manualmente o por computadora, pero está claro que la secuenciación posicional por hibridación se presta para el análisis computerizado y la automatización. En otro ejemplo, se puede usar un chip Affymetrix en un soporte estructural en fase sólida en combinación con un enfoque basado en perlas fluorescentes. En otro ejemplo más, se puede utilizar una micromatriz de ADNc. A este respecto, los oligonucleótidos descritos por Lockkart et al. (es decir, las sondas de síntesis Affymetrix in situ en la fase sólida) son particularmente preferidas, es decir, fotolitografía.
Como apreciarán los expertos en la técnica, los ácidos nucleicos se pueden unir o inmovilizar a un soporte sólido en una amplia variedad de formas. Por "inmovilizado" en este documento se entiende que la asociación o unión entre la sonda de ácido nucleico y el soporte sólido es suficiente para ser estable en las condiciones de unión, lavado, análisis y eliminación. La unión puede ser covalente o no covalente. Por "unión no covalente" y equivalentes gramaticales se entiende en este documento una o más interacciones electrostáticas, hidrófilas e hidrófobas. Se incluye en la unión no covalente la unión covalente de una molécula, como la estreptavidina, al soporte y la unión no covalente de la sonda biotinilada a la estreptavidina. Por "unión covalente" y equivalentes gramaticales en este documento se entiende que los dos restos, el soporte sólido y la sonda, están unidos por al menos un enlace, que incluye enlaces sigma, enlaces pi y enlaces de coordinación. Los enlaces covalentes se pueden formar directamente entre la sonda y el soporte sólido o se pueden formar mediante un agente de reticulación o mediante la inclusión de un grupo reactivo específico en el soporte sólido o la sonda o ambas moléculas. La inmovilización también puede implicar una combinación de interacciones covalentes y no covalentes.
Las sondas de ácido nucleico se pueden unir al soporte sólido mediante unión covalente tal como mediante conjugación con un agente de acoplamiento o mediante unión covalente o no covalente tales como interacciones electrostáticas, enlaces de hidrógeno o acoplamiento anticuerpo-antígeno, o mediante combinaciones de los mismos. Los agentes de acoplamiento típicos incluyen biotina/avidina, biotina/estreptavidina, fragmento Fc de anticuerpo de proteína A/IgG de Staphylococcus aureus y quimeras de estreptavidina/proteína A (T. Sano y CR Cantor, Bio/Technology 9: 1378-81 (1991)), o derivados o combinaciones de estos agentes. Los ácidos nucleicos se pueden unir al soporte sólido mediante un enlace fotoescindible, un enlace electrostático, un enlace disulfuro, un enlace peptídico, un enlace diéster o una combinación de estos tipos de enlaces. La matriz también se puede unir al soporte sólido mediante un enlace liberable selectivamente tal como 4,4'-dimetoxitritilo o su derivado. Los derivados que se han encontrado útiles incluyen ácido 3 ó 4[bis-(4-metoxifenil)]-metilbenzoico, ácido N-succinimidil-3 ó 4[bis-(4metoxifenil)]-metil-benzoico, ácido N-succinimidil-3 ó 4[bis-(4-metoxifenil)]-hidroximetilbenzoico, ácido N-succinimidil3 ó 4[bis-(4-metoxifenil)]-clorometil-benzoico y sales de estos ácidos.
En general, las sondas se unen al biochip en una amplia variedad de formas, como apreciarán los expertos en la técnica. Como se describe en este documento, los ácidos nucleicos pueden sintetizarse primero, con posterior unión al biochip, o pueden sintetizarse directamente en el biochip.
El biochip comprende un sustrato sólido adecuado. Por "sustrato" o "soporte sólido" u otros equivalentes gramaticales se entiende cualquier material que pueda modificarse para contener sitios individuales discretos apropiados para la unión o asociación de las sondas de ácido nucleico y es susceptible de al menos un método de detección. El soporte en fase sólida de la presente invención puede ser de cualquier material sólido y estructuras adecuadas para soportar la hibridación y síntesis de nucleótidos. Preferiblemente, el soporte en fase sólida comprende al menos una superficie sustancialmente rígida sobre la que pueden inmovilizarse los cebadores y puede realizarse la reacción de transcriptasa inversa. Los sustratos con los que los elementos de micro-matrices de polinucleótidos están asociados de forma estable y pueden fabricarse a partir de una variedad de materiales, incluidos plásticos, cerámicas, metales, acrilamida, celulosa, nitrocelulosa, vidrio, poliestireno, acetato de polietilen-vinilo, polipropileno, polimetacrilato, polietileno, óxido de polietileno, polisilicatos, policarbonatos, teflón, fluorocarbonos, nailon, caucho de silicio, polianhídridos, ácido
complejo anticuerpo-antígeno-anticuerpo. El sustrato reaccionará con la enzima ligada al segundo anticuerpo, dando una señal visual cualitativa, que puede cuantificarse adicionalmente, usualmente espectrofotométricamente, para dar una indicación de la cantidad de antígeno que estaba presente en la muestra. La "molécula indicadora" también se extiende al uso de la aglutinación celular o la inhibición de la aglutinación, tales como glóbulos rojos en perlas de látex, y similares.
Alternativamente, los compuestos fluorescentes, tales como fluoreceína y rodamina, pueden estar químicamente acoplados a anticuerpos sin alterar su capacidad de unión. Cuando se activa por iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo adsorbe la energía de la luz, induciendo un estado de excitabilidad en la molécula, seguido por la emisión de la luz a un color característico visualmente detectable con un microscopio óptico. Como en el EIA, el anticuerpo marcado con fluorescencia puede unirse al primer complejo anticuerpo-hapteno. Después de lavar el reactivo no unido, el complejo terciario restante se expone luego a la luz de la longitud de onda apropiada, la fluorescencia observada indica la presencia del hapteno de interés. Las técnicas de inmunofluorescencia y EIA están ambas bien establecidas en la técnica y son particularmente preferidas para el presente método. Sin embargo, también se pueden emplear otras moléculas indicadoras, tales como moléculas de radioisótopos, quimioluminiscentes o bioluminiscentes.
- (v)
- Determinar la expresión alterada de marcadores neoplásicos de proteínas en la superficie celular, por ejemplo mediante inmunohistoquímica.
- (vi)
- Determinación de la expresión de proteína alterada basada en cualquier prueba funcional adecuada, prueba enzimática o prueba inmunológica además de las detalladas en los puntos (iv) y (v) anteriores.
Una persona medianamente experta en la técnica podría determinar, como una cuestión de procedimiento de rutina, la idoneidad de aplicar un método dado a un tipo particular de muestra biológica.
Sin limitar la presente invención de ninguna manera, y como se detalla anteriormente, los niveles de expresión génica se pueden medir mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden medirse productos de transcripción o traducción de genes. Los productos de transcripción génica, es decir, el ARN, pueden medirse, por ejemplo, mediante ensayos de hibridación, ensayos de transcripción, transferencias Northern u otros métodos conocidos en la técnica.
Los ensayos de hibridación generalmente implican el uso de sondas de oligonucleótidos que se hibridan con los productos de transcripción de ARN monocatenarios. Por lo tanto, las sondas de oligonucleótidos son complementarias con el producto de expresión de ARN transcrito. Típicamente, una sonda específica de secuencia puede dirigirse para hibridarse con ARN o ADNc. Una "sonda de ácido nucleico", como se usa en el presente documento, puede ser una sonda de ADN o una sonda de ARN que se hibrida con una secuencia complementaria. Cualquier experto en la técnica sabrá cómo diseñar tal sonda de manera que se produzca la hibridación específica de la secuencia. Cualquier experto en la materia sabrá además cómo cuantificar la cantidad de hibridación específica de secuencia como una medida de la cantidad de expresión génica para que el gen se transcriba para producir el ARN específico.
La muestra de hibridación se mantiene en condiciones que son suficientes para permitir la hibridación específica de la sonda de ácido nucleico a un producto de expresión génica específico. La "hibridación específica", como se usa en la presente memoria, indica una hibridación casi exacta (por ejemplo, con pocos desapareamientos, si es que hay alguno). La hibridación específica puede realizarse bajo condiciones de alta rigurosidad o condiciones de severidad moderada. En una realización, las condiciones de hibridación para la hibridación específica son de alta rigurosidad. Por ejemplo, ciertas condiciones de alta rigurosidad se pueden usar para distinguir ácidos nucleicos perfectamente complementarios de aquellos de menor complementariedad. Las “condiciones de alta rigurosidad”, “condiciones de rigurosidad moderada” y “condiciones de baja rigurosidad” para hibridaciones de ácidos nucleicos se explican en las páginas 2.10.1-2.10.16 y en las páginas 6.3.1-6.3.6 de Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel F. y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1998)).
Las condiciones exactas que determinan la rigurosidad de la hibridación dependen no solo de la fuerza iónica (por ejemplo, 0,2 x SSC, 0,1 x SSC), temperatura (por ejemplo, temperatura ambiente, 42ºC, 68ºC) y la concentración de agentes desestabilizadores tales como formamida o agentes desnaturalizantes tales como SDS, pero también factores tales como la longitud de la secuencia de los ácidos nucleicos, composición de la base, porcentaje de desajuste entre secuencias de hibridación y la frecuencia de aparición de subconjuntos de esa secuencia dentro de otras secuencias no idénticas. Por lo tanto, las condiciones equivalentes se pueden determinar variando uno o más de estos parámetros mientras se mantiene un grado similar de identidad o similitud entre las dos moléculas de ácido nucleico. Típicamente, las condiciones se usan de modo que las secuencias al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90% o al menos aproximadamente 95% o más idénticas entre sí permanecen hibridadas entre sí. Variando las condiciones de hibridación desde un nivel de rigurosidad al que no se produce la hibridación hasta un nivel en el que se observa la hibridación por primera vez, pueden determinarse las condiciones que permitirán que una secuencia determinada se hibride (por ejemplo, selectivamente) con la mayoría de las secuencias complementarias en la muestra.
Las condiciones ejemplares que describen la determinación de las condiciones de lavado para condiciones de rigurosidad moderada o baja se describen en Kraus, M. y Aaronson, S., 1991. Methods Enzymol., 200: 546 -556; y en, Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1998). El lavado es el paso en el que generalmente se establecen las condiciones para determinar un nivel mínimo de complementariedad de los híbridos. Generalmente, comenzando desde la temperatura más baja a la que solo se produce la hibridación homóloga, cada ºC mediante el cual la temperatura de lavado final se reduce (manteniendo constante la concentración de SSC) permite un aumento de 1% en el porcentaje máximo de desapareamiento entre las secuencias que se hibridan. En general, duplicar la concentración de SSC da como resultado un aumento en la Tm, de aproximadamente 17ºC. Usando estas pautas, la temperatura de lavado puede determinarse empíricamente para rigurosidad alta, moderada o baja, dependiendo del nivel de desapareamiento buscado. Por ejemplo, un lavado de baja rigurosidad puede comprender lavar en una solución que contiene 0,2 veces SSC/0,1% SDS durante 10 minutos a temperatura ambiente; un lavado de rigurosidad moderada puede comprender el lavado en una solución precalentada (42ºC) que contiene 0,2 veces SSC/0,1% SDS durante 15 minutos a 42ºC; y un lavado de alta rigurosidad puede comprender el lavado en una solución precalentada (68ºC) que contiene 0,1 veces SSC/0,1% SDS durante 15 minutos a 68ºC. Además, los lavados se pueden realizar repetidamente o secuencialmente para obtener un resultado deseado como se conoce en la técnica. Las condiciones equivalentes pueden determinarse variando uno o más de los parámetros dados como ejemplo, como se conoce en la técnica, mientras se mantiene un grado similar de complementariedad entre la molécula de ácido nucleico diana y el cebador o sonda utilizada (por ejemplo, la secuencia que se debe administrar). hibridizado).
Un aspecto relacionado de la presente descripción proporciona una matriz molecular, cuya matriz comprende una pluralidad de:
- (i)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos correspondiente a uno cualquiera o más de los genes marcadores neoplásicos descritos anteriormente o una secuencia que muestra al menos 80% de identidad con ellos o un derivado funcional, fragmento, variante u homólogo de dicha molécula de ácido nucleico; o
- (ii)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse con una cualquiera
- o más de las secuencias de (i) en condiciones de rigurosidad media o un derivado funcional, fragmento, variante u homólogo de dicha molécula de ácido nucleico; o
(iii) sondas de ácido nucleico u oligonucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse con una cualquiera o más de las secuencias de (i) en condiciones de rigurosidad media o un derivado funcional, fragmento, variante u homólogo de dicha molécula de ácido nucleico; o
(iv) sondas capaces de unirse a una cualquiera o más de las proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico de (i) o un derivado, fragmento u homólogo de las mismas;
en donde el nivel de expresión de dichos genes marcadores de (i) o proteínas de (iv) es indicativo del estado neoplásico de una célula o subpoblación celular derivada del intestino grueso.
Preferiblemente, dicho porcentaje de identidad es al menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%
o 99%.
La baja astringencia incluye y abarca desde al menos aproximadamente 1% v/v hasta al menos aproximadamente 15% v/v formamida y desde al menos aproximadamente 1M hasta al menos aproximadamente 2M de sal para la hibridación, y al menos aproximadamente 1M hasta al menos aproximadamente 2M de sal para las condiciones de lavado. Se pueden aplicar condiciones de astringencia alternativas cuando sea necesario, tales como rigurosidad media, que incluyen y abarcan desde al menos aproximadamente 16% v/v a al menos aproximadamente 30% v/v de formamida y desde al menos aproximadamente 0,5 M hasta al menos aproximadamente 0,9 M de sal para la hibridación, y al menos aproximadamente 0,5 M a al menos aproximadamente 0,9 M de sal para condiciones de lavado, o alta astringencia, que incluye y abarca desde al menos aproximadamente 31% v/v hasta al menos aproximadamente 50% v/v de formamida y desde al menos aproximadamente 0,01 M a al menos aproximadamente 0,15 M de sal para la hibridación, y de al menos aproximadamente 0,01 M a al menos aproximadamente 0,15 M de sal para las condiciones de lavado. En general, el lavado se lleva a cabo a Tm = 69,3 + 0,41 (G + C)% [19] = -12ºC. Sin embargo, la Tm de un ADN dúplex disminuye en 1ºC con cada aumento del 1% en el número de pares basados en emparejamientos erróneos (Bonner et al (1973) J. Mol. Biol. 81:123).
Preferiblemente, las sondas en cuestión están diseñadas para unirse al ácido nucleico o proteína a la que están dirigidas con un nivel de especificidad que minimiza la incidencia de reactividad no específica. Sin embargo, se apreciará que puede no ser posible eliminar toda posible reactividad cruzada o reactividad no específica, siendo esto una limitación inherente de cualquier sistema basado en sondas.
En términos de las sondas que se usan para detectar las proteínas en cuestión, pueden tomar cualquier forma adecuada, incluidos anticuerpos y aptámeros.
Una biblioteca o matriz de ácido nucleico o sondas de proteínas proporciona información rica y muy valiosa. Además, dos o más matrices o perfiles (información obtenida del uso de una matriz) de tales secuencias son herramientas útiles para comparar un conjunto de prueba de resultados con una referencia, como otra muestra o calibrador almacenado. Al usar una matriz, las sondas individuales típicamente se inmovilizan en ubicaciones separadas y se les permite reaccionar para reacciones de unión. Los cebadores asociados con conjuntos ensamblados de marcadores son útiles para la preparación de bibliotecas de secuencias o para la detección directa de marcadores de otras muestras biológicas.
Una biblioteca (o matriz, cuando se refiere a ácidos nucleicos separados físicamente correspondientes a al menos algunas secuencias en una biblioteca) de marcadores genéticos presenta propiedades altamente deseables. Estas propiedades están asociadas a condiciones específicas y pueden caracterizarse como perfiles regulatorios. Un perfil, como se denomina en este documento, se refiere a un conjunto de miembros que proporciona información de diagnóstico del tejido del que se derivaron originalmente los marcadores. Un perfil en muchos casos comprende una serie de puntos en una matriz hecha a partir de secuencias depositadas.
Un perfil de paciente característico generalmente se prepara mediante el uso de una matriz. Un perfil de matriz se puede comparar con uno o más perfiles de matriz u otros perfiles de referencia. Los resultados comparativos pueden proporcionar información abundante sobre estados de enfermedad, estado de desarrollo, receptividad a la terapia y otra información sobre el paciente.
Otro aspecto de la presente descripción proporciona un kit de diagnóstico para analizar muestras biológicas que comprende un agente para detectar uno o más reactivos marcadores neoplásicos útiles para facilitar la detección por el agente en el primer compartimento. También pueden incluirse otros medios, por ejemplo, para recibir una muestra biológica. El agente puede ser cualquier molécula detectora adecuada.
La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes:
EJEMPLO 1
Métodos y materiales
Datos Affymetrix GeneChip
Los datos del perfil de expresión génica y los datos clínicos que los acompañan se adquirieron en GeneLogic Inc (Gaithersburg, MD, EE. UU.). Para cada tejido analizado, se obtuvieron datos de micromatrices de oligonucleótidos para 44.928 conjuntos de sondas (Affymetrix HGU133A y HGU133B, combinados), descriptores clínicos y experimentales, e imágenes microscópicas digitalmente archivadas de preparaciones histológicas. Se realizó un análisis de control de calidad para eliminar matrices que no cumplían con las medidas de control de calidad esenciales definidas por el fabricante.
Los niveles de expresión de transcripción se calcularon mediante Microarray Suite (MAS) 5.0 (Affymetrix) y las técnicas de normalización Robusta Multichip Average (RMA) (Affymetrix. GeneChip expression data analysis fundamentals. Affymetrix, Santa Clara, California, EE. UU., 2001; Hubbell et al. Bioinformatics, 18: 1585 -1592, 2002; Irizarry et al. Nucleic Acid Research, 31, 2003). Se usaron datos normalizados de MAS para realizar rutinas de control de calidad estándar y se normalizó el conjunto de datos finales con RMA para todos los análisis posteriores.
Expresión diferencial univariante
Se identificaron transcritos de genes expresados de forma diferencial usando un ensayo t moderado implementado en la biblioteca de limma descargada del repositorio Bioconductor para R. (G. K. Smyth. Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R and Bioconductor, 3 (l): Artículo 3, 2004; G K Smyth. Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R and Bioconductor. Springer, Nueva York, 2005). Se corrigieron las estimaciones de la significación (valores de p) para ajustar la prueba de hipótesis múltiples utilizando la corrección de Bonferonni.
Patrones de expresión específicos del tejido
Para construir un filtro para la expresión génica “inactivada” hipotéticamente, se estimó por primera vez el nivel medio de expresión para todos los 44.928 conjuntos de sondas en toda la gama de los 454 tejidos. Para estimar un umbral de activación/desactivación de expresión, se clasificaron los 44.928 valores medios y se calculó el valor de expresión equivalente al percentil 30 a través del conjunto de datos. Se eligió este umbral arbitrario porque se teorizó que la mayoría de las transcripciones (y presumiblemente más del 30%) en una muestra determinada deberían ser silenciadas transcripcionalmente. Por lo tanto, este umbral representa un límite superior conservador para lo que se estima como señal no específica o de fondo.
Anotaciones de símbolos génicos
Para asignar los nombres de los conjuntos de pruebas Affymetrix a símbolos genéticos oficiales, se utilizaron los metadatos de anotación disponibles en Bioconductor. Se utilizó la versión 1.16.0 de la biblioteca Hgu133plus2, que se ensambló utilizando los datos de Entrez Gene descargados el 15 de marzo de 2007.
Estimaciones de las características de rendimiento La utilidad de diagnóstico para cada tabla de marcadores que se muestra en el presente documento se estimó que incluía: sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo, razón de verosimilitud positiva, razón de verosimilitud negativa. Estas estimaciones se calcularon en los mismos datos utilizados para descubrir los marcadores y, por lo tanto, potencialmente sobreestimarán las características de rendimiento en futuras muestras de
5 tejido. Para mejorar la generalización de las estimaciones, se utilizó una técnica de remuestreo de navaja de azúcar modificada para calcular un valor menos sesgado para cada característica.
Resultados
Se aplicó un rango de pruebas estadísticas univariadas sobre los datos de micromatrices de oligonucleótidos Affymetrix para revelar genes humanos que podrían usarse para discriminar tejidos neoplásicos colorrectales de tejidos no neoplásicos. Se identificaron además una serie de transcripciones de genes que parecen ser útiles para diferenciar los adenomas colorrectales del carcinoma colorrectal. También se identificaron un subconjunto de estas transcripciones que pueden tener una utilidad diagnóstica particular debido a que los productos proteicos se secretan
o se muestran en la superficie celular de las células epiteliales. Finalmente, se identificó un subconjunto adicional de
transcritos expresados específicamente en tejidos neoplásicos y en niveles bajos o casi de fondo en tejidos no 15 neoplásicos.
Genes expresados diferencialmente en tejidos neoplásicos
A partir de un conjunto GeneChip total de 44.928 conjuntos de sonda se determinó que más de 11.000 conjuntos de sonda se expresaban diferencialmente mediante la prueba t moderada utilizando el paquete de limma en BioConductor
(G. K. Smyth, 2004 supra) empleando corrección de prueba múltiple conservadora (Bonferroni). Cuando esta lista se filtró adicionalmente para incluir solo aquellos conjuntos de sondas que demostraban un cambio de expresión media doble o mayor entre los tejidos neoplásicos y no neoplásicos, se encontró que 560 conjuntos de sondas se expresaban más bajas en las neoplasias con respecto a los tejidos normales.
Estos 560 conjuntos de sondas se anotaron usando los metadatos y paquetes de anotación más recientes disponibles para los chips. Los 560 conjuntos de sondas subexpresados se asignaron a 434 símbolos génicos.
- Δ-expression
- Conjunto de sondas ID Mapas de símbolos génicos
- DOWN
- 560 434
25
Marcadores hipotéticos específicos para neoplasia colorrectal
Si bien los patrones de expresión génica diferencial son útiles para fines de diagnóstico, este proyecto también busca identificar las proteínas de diagnóstico arrojadas en la luz del intestino por el epitelio colorrectal neoplásico. Para descubrir las proteínas candidatas, la lista de transcripciones expresadas diferencialmente se filtró con un criterio de selección dirigido a identificar marcadores específicamente desactivados en tejidos de neoplasia colorrectal. Para identificar los genes "desactivados", los criterios de filtro se diseñaron para encontrar genes con i) niveles de expresión neoplásica por debajo de un umbral teórico de activación/desactivación y ii) señales normales al menos 2 veces superiores. El perfil de expresión de una transcripción de ejemplo que se "apaga" en tejidos neoplásicos se muestra en la Figura 1.
35 Ejemplo 2
Sondas elevadas en tejidos no neoplásicos en relación con los neoplásicos
Se aplicó el análisis de expresión diferencial para identificar los conjuntos de sondas regulados por disminución en los datos del chip del gen Affymetrix que miden la concentración de ARN en 454 tejidos colorrectales que incluyen 161 muestras de adenocarcinoma, 29 muestras de adenoma, 42 muestras de colitis y 222 tejidos no enfermos. Usando correcciones conservativas para múltiples pruebas de hipótesis y un corte de cambio de doblez absoluto de 2 veces se determinó que 560 conjuntos de sondas exhibían un nivel de expresión disminuido en tejidos neoplásicos con relación a controles no neoplásicos. Se han mapeado 560 de estos conjuntos de sondas a 434 símbolos de genes putativos basados en la secuencia de nucleótidos del transcrito.
Prueba de Validación/Hipótesis
45 Los niveles de expresión de ARN de estos candidatos se midieron en muestras clínicas derivadas de forma independiente. Se hibridaron 526 conjuntos de sondas con extractos de ARN de 68 muestras clínicas que comprendían 19 adenomas, 19 adenocarcinomas y 30 controles no enfermos usando un "chip genético Adenoma" diseñado a medida. Treinta y cuatro (34) conjuntos de sondas no se probaron ya que no se incluyeron en el diseño personalizado. Se confirmó que 459 de 526 de los conjuntos de sondas diana (o conjuntos de sondas directamente relacionados con el mismo objetivo del gen locus) también se expresaron diferencialmente (P <0,05) en estos tejidos derivados de forma independiente. Los resultados del análisis de expresión diferencial de estos 459 conjuntos de sondas se muestran en la Tabla 1.
Se sometieron a prueba adicionalmente los 372 de los 434 loci génicos únicos a los que se sabe que hibridan los 560 comjuntos de sondas. Los 62 símbolos de genes restantes no se representaron en los datos de validación. Se observó que 328 de 372 símbolos génicos estaban representados en los datos de validación por al menos un conjunto de sonda expresado diferencialmente y muchos símbolos incluían múltiples conjuntos de sondas contra regiones a través del locus putativo. En la Tabla 2 se muestra una lista completa de conjuntos de pruebas que se unen a los loci de destino.
Conclusión
Los conjuntos de sondas candidatos y los símbolos mostrados en las Tablas 1 y 2, respectivamente, se expresan diferencialmente más abajo en los tejidos colorrectales neoplásicos en comparación con los controles no neoplásicos.
Ejemplo 3
Conjuntos de sondas que demuestran un perfil específico de no neoplasia
Durante el análisis de los datos de descubrimiento, se observó un nuevo perfil de expresión entre fenotipos neoplásicos y no neoplásicos. Se formuló la hipótesis de que un subconjunto de conjuntos de sondas expresados diferencialmente de forma cuantitativa se expresaba adicionalmente cualitativamente de manera diferencial. Dichos conjuntos de sondas no muestran evidencia de una actividad de expresión génica en tejidos neoplásicos, es decir, estos conjuntos de sondas parecen expresarse por encima de los niveles de fondo solo en tejidos no neoplásicos. Esta observación y la hipótesis resultante se basan en dos principios:
- 1.
- Que la mayoría de las transcripciones humanas que están presentes en GeneChip en todo el genoma (p. ej. U133) probablemente no se expresan en la mucosa colorrectal; y
- 2.
- Esa intensidad de unión a micromatrices para tales conjuntos de sondas “desactivados” (a ARNc marcado) reflejará el fondo del ensayo técnico, es decir, la unión de oligonucleótidos no específica.
Para generar una lista de conjuntos de sondas no neoplásicos específicos, se comparó la intensidad neoplásica de los conjuntos de sonda expresados diferencialmente con un umbral de señal de fondo hipotético a través de todos los conjuntos de sondas en el chip. Se observó que, por diseño, todos los conjuntos de sondas en el conjunto de candidatos a partir del cual se eligen los transcritos "activados" están al menos dos veces sobreexpresados en los tejidos no enfermos en relación con los tejidos enfermos. Combinados, estos criterios producen el subconjunto de especies de transcritos expresados diferencialmente que se expresan específicamente en tejidos no neoplásicos.
Este análisis demostró que 42 conjuntos de sondas que corresponden a aproximadamente 41 loci genéticos exhiben un perfil de expresión de transcripción no específico de neoplasia.
Prueba de Validación/Hipótesis
El diseño del chip genético personalizado impide probar los conjuntos de sondas no neoplásicos específicos utilizando los mismos principios que se usan para el descubrimiento. En particular, el chip genético personalizado (por diseño) no contiene un conjunto grande de conjuntos de sondas anticipados para hibridarse hipotéticamente con transcripciones génicas "desactivadas/'no transcritas". Esto se debe a que el diseño del chip genético personalizado está muy sesgado hacia las transcripciones expresadas diferencialmente en los tejidos neoplásicos colorrectales.
Por lo tanto, la prueba de expresión diferencial habitual (limma) se aplicó a estos conjuntos de sondas candidatos expresados específicamente en tejidos no neoplásicos. De los 37 (de 42) conjuntos de sondas en el chip genético personalizado, 33 conjuntos de sondas (o conjuntos de sondas que se unen al mismo locus) se expresaron diferencialmente entre los 38 tejidos neoplásicos (adenoma y cáncer) y controles no neoplásicos. Los resultados de estos experimentos de validación se muestran en la Tabla 3.
Se pretendía además probar todos los conjuntos de sondas que se sabe hibridan con los loci génicos a los que los conjuntos de sondas reivindicaron en este documento. De los 41 loci genéticos putativos dirigidos por los conjuntos de sondas, 33 estaban presentes en los datos de validación. Los treinta y tres (33) de estos 33 símbolos de genes (100%) demostraron al menos un conjunto de sondas hibridante que se expresó diferencialmente en los tejidos neoplásicos. Los resultados de estos experimentos, que incluyen todos los conjuntos de sondas que se unen a cada locus objetivo de una manera expresada diferencialmente, se muestran en la Tabla 4.
Ejemplo 4
Materiales y métodos para los ejemplos 2 y 3
Los datos de perfil de expresión génica medidos en 454 muestras de tejido colorrectal que incluyen controles de enfermedades neoplásicas, normales y no neoplásicas se adquirieron de GeneLogic Inc (Gaithersburg, MD, EE. UU.).
Para cada especimen de tejido Affymetrix (Santa Clara, CA, EE. UU.), se recibieron datos de micromatrices oligonucleotídicas que totalizaban 44.928 conjuntos de sondas (HGU133A y HGU133B, combinados), descriptores clínicos y experimentales e imágenes microscópicas archivadas digitalmente de preparaciones histológicas. Antes de aplicar los métodos de descubrimiento a estos datos, se llevaron a cabo extensos métodos de control de calidad, incluida la exploración estadística, la revisión de los registros clínicos para la coherencia y la auditoría histopatológica de una muestra aleatoria de matrices. Las micromatrices que no cumplían con los criterios de calidad aceptables se eliminaron del análisis.
Evaluación de la hipótesis
Los biomarcadores de transcripción candidatos se analizaron usando una micromatriz de oligonucleótidos personalizada de conjuntos de sondas de oligonucleótidos 25 mer diseñados para hibridarse con transcritos de ARN candidatos identificados durante el descubrimiento. Las hipótesis de expresión diferencial se probaron usando extractos de ARN derivados de muestras clínicas recogidas de forma independiente que comprendían 30 tejidos colorrectales normales, 19 tejidos de adenoma colorrectal y 19 tejidos de adenocarcinoma colorrectal. Cada extracto de ARN se confirmó que cumplía estrictos criterios de control de calidad.
Muestras de tejido colorrectal
Todos los tejidos utilizados para la prueba de hipótesis se obtuvieron de un banco de tejidos hospitalarios de referencia terciaria en el área metropolitana de Adelaida, Australia (Hospital General de Repatriación y Centro Médico Flinders). El acceso al banco de tejidos para esta investigación fue aprobado por el Comité de Investigación y Ética del HospitalGeneral de Repatriación y el Comité de Ética del Centro Médico Flinders. Se recibió el consentimiento informado del paciente para cada tejido estudiado.
Después de la resección quirúrgica, las muestras se colocaron en un recipiente estéril y se tomaron del quirófano. El tiempo transcurrido desde la resección quirúrgica hasta la recogida en el quirófano fue variable, pero no más de 30 minutos. Se tomaron muestras de aproximadamente 125 mm3 (5x5x5 mm) de tamaño del tejido macroscópicamente normal lo más alejadas posible de la patología, definidas tanto por región colónica como a distancia proximal o distal a la patología. Los tejidos se colocaron en crioviales, luego se sumergieron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -150ºC hasta el procesamiento.
Extracción de ARN
Las extracciones de ARN se realizaron usando reactivo Trizol® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Cada muestra se homogeneizó en 300 μl de reactivo Trizol usando un taladro Dremel modificado y matraces desechables esterilizados. Se añadieron 200 µl adicionales de reactivo Trizol al homogeneizado y las muestras se incubaron a TA durante 10 minutos. Luego se añadieron 100 μl de cloroformo, las muestras se agitaron en vórtex durante 15 segundos y se incubaron a TA durante 3 minutos más. La fase acuosa que contenía el ARN diana se obtuvo por centrifugación a 12.000 rpm durante 15 min, 40ºC. A continuación, se precipitó el ARN incubando muestras a TA durante 10 min con 250 μL de isopropanol. El precipitado de ARN purificado se recogió mediante centrifugación a 12.000 rpm durante 10 minutos, a 40ºC y se descartaron los sobrenadantes. Después, los sedimentos se lavaron con 1 mL de etanol al 75%, seguido de agitación vorticial y centrifugación a 7.500 g durante 8 minutos, 40ºC. Finalmente, los peletes se secaron al aire durante 5 minutos y se resuspendieron en 80 μl de agua libre de RNasa. Para mejorar la subsiguiente solubilidad, las muestras se incubaron a 55ºC durante 10 minutos. El ARN se cuantificó midiendo la densidad óptica a A260/280 nm. La calidad del ARN se evaluó mediante electroforesis en un gel de formaldehído de agarosa al 1,2%.
Procesamiento del chip genético
Para probar las hipótesis relacionadas con los candidatos a biomarcadores para la neoplasia colorrectal, los extractos de ARN se analizaron utilizando un GeneChip personalizado diseñado por los inventores en colaboración con Affymertix (Santa Clara, CA, EE. UU.). Estos GeneChips personalizados se procesaron utilizando el protocolo Affymetrix estándar desarrollado para el conjunto HU Gene ST 1.0 que se describe en (Affy: WTAssay).
Software estadístico y procesamiento de datos
Las bibliotecas R y BioConductor del entorno de estadísticas R (BioConductor, www.bioconductor.org) (BIOC) se usaron para la mayoría de los análisis. Para asignar las ID de los conjuntos de pruebas al símbolo del gen en la biblioteca CustomChorChip hgu133plus2 se utilizó la versión 2.2.0 que se ensambló utilizando los datos de Entrez Gene descargados el 18 de abril a las 12:30:55 de 2008 (BIOC).
Prueba de hipótesis de biomarcadores expresados diferencialmente
Para evaluar la expresión diferencial entre clases de tejido, se utilizó la prueba de la t de Student para medias iguales entre dos muestras o la variante robusta proporcionada por la biblioteca de limma (Smyth) (limma). Para mitigar el impacto del descubrimiento falso debido a múltiples pruebas de hipótesis, se aplicó un ajuste de Bonferroni a los valores P en el proceso de descubrimiento (MHT: Bonf). Para las hipótesis que prueban la hipótesis múltiples ligeramente menos conservadora se aplicó la corrección de prueba Benjamini & Hochberg, que tiene como objetivo controlar la tasa de descubrimiento falso de soluciones (MHT: BH).
Descubrimiento de patrones de expresión génica específicos de tejido
Los métodos de descubrimiento que utilizan datos de expresión génica a menudo dan lugar a numerosos candidatos, muchos de los cuales no son adecuados para productos comerciales porque implican diferencias sutiles de expresión génica que serían difíciles de detectar en la práctica de laboratorio. Pepe et al. señalan que el biomarcador "ideal" es detectable en el tejido tumoral pero no detectable (en absoluto) en el tejido no tumoral (Pepe: biomarcador:desarrollo). Para desviar el descubrimiento hacia candidatos que cumplan con este criterio, se desarrolló un método de análisis que buscaba enriquecer a los candidatos para biomarcadores cuya ausencia cualitativa o medición de presencia es diagnóstica para el fenotipo de interés. Este método intenta seleccionar candidatos que muestran un patrón prototípico "encendido" o "apagado" relativo a una estimación de la expresión de fondo/ruido en el chip. Se teoriza que tales transcritos de ARN tienen más probabilidades de correlacionarse con proteínas traducidas cadena abajo con potencial de diagnóstico o para predecir cambios genómicos corriente arriba (por ejemplo, el estado de metilación) que podrían usarse de forma diagnóstica. Este enfoque en los resultados cualitativos en lugar de cuantitativos puede simplificar el proceso de desarrollo del producto para dichos biomarcadores.
El método se basa en la suposición de que el conjunto de especies de ARN extraídas en cualquier tejido dado (por ejemplo, mucosa colorrectal) se unirá específicamente a un subconjunto relativamente pequeño del conjunto completo de conjuntos de sondas en un GeneChip diseñado para medir el genoma completo. Bajo esta suposición, se estima que la mayoría de los conjuntos de sondas en un chip de gen humano completo no exhibirán señales específicas de alta intensidad.
Esta observación se utiliza para aproximar el fondo o la 'unión no específica' a través del chip al elegir un nivel teórico igual al valor de, p. ej. el cuantil más bajo del 25% de los valores medios ordenados. Este cuantil puede establecerse arbitrariamente en algún nivel por debajo del cual se realiza una suposición razonable de que las señales no representan el enlace de ARN anterior. Finalmente, esta estimación de fondo se usa como un umbral para estimar los conjuntos de sondas "DESACTIVADOS" en un experimento para, por ejemplo, las muestras de tejido no neoplásicas.
Por el contrario, se hipotetiza adicionalmente que los conjuntos de sondas que están 1) expresados por encima de este nivel teórico de umbral y 2) a niveles diferencialmente más altos en las muestras tumorales pueden ser un biomarcador candidato específico de tumor. Se observa que, en este caso, el concepto de umbrales de "doble cambio" también se puede aplicar convenientemente para enfatizar aún más el concepto de aumentos de expresión absoluta en un conjunto de pruebas putativamente "ACTIVADOS".
Dado el supuesto de baja vinculación de fondo para una fracción considerable de los conjuntos de sonda medidos, este método solo se usó en los grandes datos y descubrimientos de GeneLogic. Para construir un filtro para el biomarcador hipotéticamente "activado" en los datos de descubrimiento de GeneLogic, se estimó el nivel de expresión medio para todos los 44.928 conjuntos de sondas en todo el rango de los 454 tejidos. Los 44.928 valores medios se clasificaron luego y se calculó el valor de expresión equivalente al percentil 25 en el conjunto de datos. Se eligió este umbral arbitrario porque la mayoría de las transcripciones (y presumiblemente más del 25%) en una muestra dada deberían exhibir una concentración baja que efectivamente es un silencio transcripcional. Por lo tanto, este umbral representa un límite superior conservador para lo que se estima que es una expresión no específica o de fondo.
Ejemplo 5
Datos de metilación de ADN
Los ensayos se desarrollaron para la detección de la metilación en las regiones promotoras de los ocho genes regulados por disminución en la Tabla 5. Los métodos para el tratamiento con bisulfito de ADN y los ensayos para la determinación de los niveles de metilación del ADN, que incluyen MSP y COBRA, se describen en Clark et al. (2006).
Cinco ensayos de MSP usaron los pares de cebadores mostrados en la TABLA 7. Se usó una PCR de control para la amplificación no sesgada del gen CAGE para determinar la cantidad de ADN de entrada para proporcionar una referencia para la cuantificación del nivel de metilación de cada gen. Para las PCR, las reacciones de 25 μL en Biorad iQ SyBr Green Super Mix contenían 5 ng de ADN tratado con bisulfito (1 ng para análisis de líneas celulares y 6 ng para muestras clínicas) y 200 nM de cebadores directos e inversos. Las condiciones de ciclado de PCR fueron:
95,0ºC por 2 minutos
Seguido por 50 ciclos de:
95,0°C/15sec
TempºC/30sec
72,0ºC/30sec Donde "Temp" es la temperatura de recocido optimizada para cada gen como se muestra en la Tabla yy.
Para el gen DF, se realizaron 3 ciclos preliminares usando una temperatura de fusión de 95,0ºC, seguida de 50 ciclos con una temperatura de fusión inferior de 84,0ºC (para reducir la amplificación inespecífica).
Se generó una curva estándar usando ADN metilado con M.SssI metilasa (100% metilado) y ADN que se había amplificado in vitro usando la ADN polimerasa Phi29 (0% de metilación).
Los ensayos COBRA se desarrollaron para tres genes como se muestra en la TABLA 8. Los PCR se configuraron como se indicó anteriormente con las condiciones de ciclado:
95,0ºC por 2 minutos
Seguido por 50 ciclos de:
95,0ºC/15sec
TempºC/30sec
72,0ºC/30sec
Después de la PCR, se digirieron 10 μl de producto de PCR con la enzima apropiada (TABLA 8), se analizaron los productos de digestión por electroforesis en gel y los niveles de metilación se determinaron semicuantitativamente.
El estado de metilación de los ocho genes se determinó en cuatro líneas celulares de cáncer colorrectal, Caco2, HCT116, HT29 y SW480, así como ADN de sangre normal y la línea celular de fibroblastos de pulmón normal, MRC5. El nivel de metilación se resume en la Tabla 5. Las regiones promotoras de los ocho genes muestran una fuerte metilación en 2 ó 3 de las cuatro líneas celulares de cáncer colorrectal probadas. Todas mostraron una falta o un bajo nivel de metilación en el ADN del ADN normal de la sangre y de la línea celular de fibroblastos MRC5, a excepción de la metilación de DF en MRC5.
Para dos de estos genes, el análisis de MAMDC2 y GPM6B se ha extendido a un conjunto de 12 adenomas, 18 de cáncer y 22 muestras de tejidos normales emparejados (Figura 2, A y B).
Para MAMDC2 el análisis cuantitativo demostró que 2 de 12 adenomas y 6 de 18 muestras de cáncer mostraron una metilación elevada en comparación con el nivel más alto observado en muestras de tejido normal. Los niveles de metilación del gen GPM6B se determinaron mediante ensayos COBRA semicuantitativos, calificados en una escala de 0 a 5 basada en la inspección visual de las digestiones de restricción. Una clara tendencia hacia el aumento de la metilación del promotor en la progresión de normal a adenoma a cáncer fue evidente (Figura 2, panel B).
Estos datos demuestran varios ejemplos de genes regulados por disminución que tal regulación a la baja en líneas celulares de cáncer colorrectal y tejido de neoplasia primaria puede asociarse con la metilación de ADN y que los ensayos de metilación de ADN pueden usarse para discriminar el cáncer del tejido normal.
Ejemplo 6
Determinar la identidad génica de una secuencia de interés de ácido nucleico que se define por un conjunto de sondas Affymetrix
RASTREAR la secuencia de interés utilizando las herramientas de búsqueda de alineación local básicas disponibles en línea [BLAST], p. NCBI/BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
- (a)
- Seleccione "Humano" en BLAST ASSEMBLED GENOMES en la página web http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
- (b)
- Deje la configuración predeterminada, es decir:
- •
- Base de datos: Genoma (todas las asambleas)
- •
- Programa: megaBLAST: compare las secuencias de nucleótidos altamente relacionadas
- •
- Parámetros opcionales: esperar: 0,01, filtro: predeterminado, descripciones: 100, alineaciones: 100
- (c)
- Copiar/Pegar secuencia en la ventana "BLAST"
- (d)
- Haga clic en "Comenzar búsqueda"
- (e)
- Haga clic en "Ver informe" Evaluación de los resultados de búsqueda de Open BLAST Se pueden identificar alineaciones de secuencia múltiples y significativas al "rastrear" la secuencia.
Identificar la nomenclatura de genes de la coincidencia de secuencia identificada
- (a)
- Haga clic en el enlace a uno de los aciertos identificados
- (b)
- La nueva página representará esquemáticamente la posición del acierto en un cromosoma. Será evidente qué el gen es un acierto.
- (c)
- Recupere la secuencia del "acierto" haciendo clic en el enlace
- (d)
- Haga una búsqueda del gen en la ventana de "búsqueda" proporcionada. Esto proporciona las coordenadas del nucleótido del gen para el gen.
Determinar la promiscuidad de la secuencia
- (a)
- Abra la herramienta NCBI/BLAST, (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
- (b)
- Haga clic en "rastreo de nucleótidos" en "BLAST básico"
- (c)
- Copie/pegue la secuencia de interés en la ventana "Secuencia de consultas"
- (d)
- Haga clic en "Rastreo". Evaluación de los resultados de búsqueda nBLAST de la secuencia
- (a)
- El ejercicio nBLAST con la secuencia puede dar como resultado múltiples aciertos de rastreo, de los cuales algunos números de entrada se enumeran en la "Descripción".
- (b)
- Estos aciertor deben ser revisados. Determinar la ubicación de la secuencia en el gen La base de datos de Ensembl es una base de datos en línea que produce y mantiene genomas eucarióticos
seleccionados de anotaciones automáticas (www.ensembl.org/index.html) Identificar la ubicación de la secuencia en el gen
- (a)
- Establezca "Buscar" en Homo Sapiens, escriba "el nombre del gen" en el campo de búsqueda provisto (Ensemble.org/index.html)
- (b)
- Haga clic en "Adelante"
- (c)
- Haga clic en el enlace "vega protein_coding Gene: OTTHUMG000000144184" para obtener un informe de anotación
- (d)
- Haga clic en "Gene DAS Report" para recuperar información con respecto a la base de datos de sitios de empalme alternativos: escriba "the gene name" en el campo de búsqueda
- •
- Haga clic en "the gene entry"
- •
- Desplácese hasta "evidencias"
- •
- Revise los sitios de empalme alternativos
- •
- Haga clic en "intrón/exones confirmados" para obtener una lista de coordenadas de los exones e intrones. Empalme y corte y/o transcripción alternativos La base de datos AceView proporciona una representación de secuencia curada y no redundante de todas las
secuencias públicas de ARNm. La base de datos está disponible a través de NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Acembly/ Investigación adicional de las transcripciones de ARNm de genes
- (a)
- Escriba "el nombre del gen" en el campo "búsqueda" provisto
- (b)
- Haga clic en "Adelante"
- (c)
- La siguiente información está disponible en la entrada resultante en AceView:
- •
- El número de clones de ADNc a partir de los cuales se construye el gen (es decir, se originó a partir de un trabajo experimental que implicaba el aislamiento del ARNm)
- •
- Los ARNm que se predice que serán producidos por el gen
- •
- La existencia de exones alternativos que no se superponen y sitios de poliadenilación alternativos validados
- •
- La existencia de truncamientos
- •
- La posibilidad de expresión alternativa regulada
5 • Intrones registrados como participantes en el empalme y corte alternativo del gen
(d) Motivos clásicos del sitio de empalme y corte
Aplicación del método a LOC643911/hCG_1815491
Materiales y métodos
Extracción de ARN
10 Las extracciones de ARN se realizaron usando reactivo Trizol® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Cada muestra se homogeneizó en 300 μl de reactivo de Trizol usando un taladro dremel modificado y pistilos desechables esterilizados. Se añadieron 200 µl adicionales de reactivo Trizol al homogeneizado y las muestras se incubaron a TA durante 10 minutos. Luego se añadieron 100 μl de cloroformo, las muestras se agitaron en vórtex durante 15 segundos y se incubaron a TA durante 3 minutos más. La fase acuosa que contiene el
15 ARN diana se obtuvo por centrifugación a 12.000 rpm durante 15 minutos, 40ºC. Luego se precipitó el ARN incubando muestras a TA durante 10 min con 250 μL de isopropanol. El precipitado de ARN purificado se recogió mediante centrifugación a 12.000 rpm durante 10 minutos, a 40ºC y se descartaron los sobrenadantes. Después, los sedimentos se lavaron con 1mL de etanol al 75%, seguido de agitación vorticial y centrifugación a 7.500 g durante 8 min, 40ºC. Finalmente, los pellets se secaron al aire durante 5 minutos y se resuspendieron en 80 μl de agua libre de RNasa.
20 Para mejorar la solubilidad posterior, las muestras se incubaron a 55ºC durante 10 min. El ARN se cuantificó midiendo la densidad óptica a A260/280 nm. La calidad del ARN se evaluó mediante electroforesis en un gel de formaldehído de agarosa al 1,2%.
Procesamiento de Gene Chip
Las muestras de ARN para analizar en Human Exon 1.0 ST GeneChips se procesaron utilizando el kit de marcaje y
25 control de objetivo Affymetrix WT (parte n. ° 900652) siguiendo el protocolo descrito en (Affymetrix 2007 P/N 701880 Rev.4). Brevemente: se sintetizó ADNc de primer ciclo a partir de 100 ng de ARN ribosómico reducido usando cebadores hexámeros aleatorios marcados con la secuencia promotora T7 y SuperScript II (Invitrogen, Carlsbad CA), esto fue seguido por la síntesis de ADN polimerasa I del ADNc de la segunda cadena. El ARNc antisentido se sintetizó a continuación usando la polimerasa T7. El segundo ciclo de cDNA sentido fue sintetizado después utilizando
30 SuperScript II, dNTP + dUTP, y hexámeros aleatorios para producir cadena de sentido cDNA que incorpora uracilo. Este ADNc monocatenario que contenía uracilo se fragmentó luego usando una combinación de uracilo ADN glicosilasa (UDG) y apurínico/apirimidínico endonucleasa1 (APE 1). Finalmente, el ADN se marcó con biotina usando la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y el reactivo de marcaje de ADN propiedad de Affymetrix. La hibridación a las matrices se llevó a cabo a 45ºC durante 16-18 horas.
35 El lavado y la tinción de GeneChips hibridado se llevaron a cabo utilizando Affymetrix Fluidics Station 450 y se escanearon con Affymetrix Scanner 3000 siguiendo los protocolos recomendados.
PCR cuantitativa a tiempo real SYBR Verde
La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real se realizó en ARN aislado de muestras clínicas para la amplificación y detección de los diversos transcritos hCG_1815491.
40 En primer lugar, se sintetizó ADNc a partir de 2 μg de ARN total usando el kit de transcripción inversa de alta capacidad de Applied Biosystems (P/N 4368814). Después de la síntesis, la reacción se diluyó 1:2 con agua para obtener un volumen final de 40 ul y 1 ul de este ADNc diluido se usó en reacciones de PCR posteriores.
La PCR se realizó en un volumen de 25 μl usando una mezcla principal Promega 2x PCR de 12,5 μl (P/N M7502), 1,5 μl de cebador directo 5 μM, 1,5 μl de cebador inverso 5 μM, 7,875 μl de agua, 0,625 μl de una dilución 1:3000 de
45 10.000x existencias de tinte puro SYBR verde 1 (Invitrogen P/N S7567), y 1 μl de ADNc.
Las condiciones de ciclado para la amplificación fueron 95ºC durante 2 minutos x 1 ciclo, 95° durante 15 segundos y 60° durante 1 minuto x 40 ciclos. Las reacciones de amplificación se realizaron en un Corbett Research Rotor-Gene RG3000 o en una máquina de PCR Roche LightCycler480 en tiempo real. Cuando se utilizó la máquina de PCR en tiempo real Roche LightCycler480 para la amplificación, el volumen de reacción se redujo a 10 μl y se realizó en una 50 placa de 384 pocillos, pero las relaciones relativas entre todos los componentes permanecieron iguales. Los resultados
demuestran una sobreexpresión estadísticamente significativa en extractos de ARN no neoplásicos en relación con los controles neoplásicos. Signif. FDR: valor p ajustado para la prueba de diferencia de medias entre el ARN extraído de los tejidos con neoplasia y no neoplásicos. El ajuste se realiza utilizando la corrección de Benjamini y Hochberg para múltiples pruebas de hipótesis (Benjamini y Hochberg, 1995); D.value50: Estimación del parámetro de eficacia
5 diagnóstica correspondiente al área de la característica de operador receptor ROC. Este parámetro proporciona una estimación conveniente de la utilidad de diagnóstico y se describe en (Saunders, 2006); FC: veces el cambio entre el nivel de expresión media de no neoplasia frente a neoplasia; Sens-Spec: Estimación del rendimiento de diagnóstico correspondiente al punto de curva ROC que demuestra igual sensibilidad y especificidad; IC (95): intervalo de confianza del 95% de las estimaciones de sensibilidad y especificidad.
10 Tabla 3
Conjuntos de sondas que demuestran un perfil elevado cualitativo (además de cuantitativo) en tejidos no neoplásicos en relación con controles neoplásicos. TargetPS: identificación del conjunto de sondas Affymetrix HG-U133plus2; Símbolo: símbolo de gen putativo correspondiente a la id del conjunto de pruebas objetivo: los nombres de símbolos múltiples indican la posibilidad de hibridación del conjunto de sondas a múltiples objetivos de genes; Signif. FDR: valor 15 p ajustado para la prueba de diferencia de medias entre el ARN extraído de tejidos con neoplasia y no neoplásicos. El ajuste se realiza utilizando la corrección de Benjamini y Hochberg para múltiples pruebas de hipótesis (Benjamini y Hochberg, 1995); D.value50: Estimación del parámetro de eficacia diagnóstica correspondiente al área de la característica de operador receptor ROC. Este parámetro proporciona una estimación conveniente de la utilidad de diagnóstico y se describe en (Saunders, 2006); FC: veces el cambio entre el nivel de expresión media de no neoplasia
20 frente a neoplasia; Sens-Spec: Estimación del rendimiento de diagnóstico correspondiente al punto de curva ROC que demuestra igual sensibilidad y especificidad; IC (95): intervalo de confianza del 95% de las estimaciones de sensibilidad y especificidad.
Tabla 4
La evidencia de múltiples conjuntos de sondas que corresponden a los símbolos de los genes reivindicados en este
25 documento exhiben cambios cualitativos en la concentración de RNA en tejidos no neoplásicos en comparación con los tejidos neoplásicos. Símbolo: símbolo del gen; ValidPS DOWN: identificaciones del conjunto de sondas de Affymetrix que demuestran una sobreexpresión estadísticamente significativa en los extractos de ARN neoplásico en relación con los controles no neoplásicos. Signif. FDR: valor p ajustado para la prueba de diferencia de medias entre el ARN extraído de tejidos con neoplasia y no neoplásicos. El ajuste se realiza utilizando la corrección de Benjamin y
30 Hochberg para múltiples pruebas de hipótesis (Benjamin y Hochberg, 1995); D.value50: Estimación del parámetro de eficacia diagnóstica correspondiente al área de la característica de operador receptor ROC. Este parámetro proporciona una estimación conveniente de la utilidad de diagnóstico y se describe en (Saunders, 2006); FC: veces el cambio entre el nivel de expresión media de no neoplasia frente a neoplasia; Sens-Spec: Estimación del rendimiento de diagnóstico correspondiente al punto de curva ROC que demuestra igual sensibilidad y especificidad; IC (95):
35 intervalo de confianza del 95% de las estimaciones de sensibilidad y especificidad.
Los expertos en la materia apreciarán que la invención descrita en este documento es susceptible de variaciones y modificaciones distintas a las específicamente descritas. Debe entenderse que la invención incluye todas las variaciones y modificaciones de este tipo. La invención también incluye todos los pasos, características, composiciones y compuestos mencionados o indicados en esta memoria descriptiva, individual o colectivamente, y
40 todas y cada una de las combinaciones de cualesquiera dos o más de dichos pasos o características.
TABLA 1
- Diana PS
- Símbolo Signif. FDR D.val5 FC Sens-Spec CI (95)
- 230788_at
- SPTLC3 :GCNT2 2,16E-27 3,9512 13,36 97,6 94,2-99,2
- 207502_at
- GUCA2B 7,04E-25 3,6279 51,78 96,5 92,3-98,6
- 207003_at
- GUCA1B 7,32E-25 3,565 10,7 96,3 92-98,5
- 206208_at
- CA4 1,73E-24 3,6263 10,41 96,5 92,4-98,6
- 206209_s_at
- CA4 1,73E-24 3,6265 10,41 96,5 92,3-98,6
- 203908_at
- LOC727995:SLC4A4:LOC730 895 2,23E-23 3,6298 3,58 96,5 92,4-98,6
- Diana PS
- Símbolo Signif. FDR D.val5 FC Sens-Spec CI (95)
- 206784_at
- AQP8 2,98E-22 3,3284 10,82 95,2 90,3-97,9
- 205950_s_at
- CA1 3,15E-22 3,368 38,27 95,4 90,6-98
- 209735_at
- ABCG2 1,09E-21 3,2584 31,53 94,8 89,7-97,7
- 230830_at
- OSTbeta 6,23E-21 3,1861 7,15 94,4 89,2-97,5
- 223754_at
- MGC13057 6,94E-21 3,2036 3,18 94,5 89,3-97,5
- 228195_at
- MGC13057 6,94E-21 3,2023 3,18 94,5 89,4-97,5
- 228706_s_at
- CLDN23 4,27E-20 3,0757 3,47 93,8 88,2-97,1
- 228707_at
- CLDN23 4,27E-20 3,072 3,47 93,8 88,3-97,1
- 223551_at
- PKIB 5,94E-20 3,1219 3,28 94,1 88,6-97,3
- 231120_x_at
- PKIB 5,94E-20 3,1226 3,28 94,1 88,6-97,3
- 226492_at
- SEMA6D 6,07E-20 3,0898 4,27 93,9 88,4-97,2
- 220026_at
- CLCA4 1,25E-19 3,1909 16,3 94,5 89,2-97,5
- 224836_at
- TP53INP2 1,45E-19 3,0248 3,78 93,5 87,9-96,9
- 220834_at
- MS4A12 2,13E-19 3,29 7,15 95 90-97,8
- 224412_s_at
- TRPM6 2,25E-19 3,01 7,5 93,4 87,7-96,8
- 220037_s_at
- XLKD1 3,60E-19 2,9412 7,44 92,9 87,1-96,6
- 219059_s_at
- XLKD1 3,60E-19 2,942 7,44 92,9 87-96,6
- 209612_s_at
- ADH1B:ADH1A 4,70E-19 3,0183 4,67 93,4 87,7-96,9
- 209613_s_at
- ADH1B:ADH1A 4,70E-19 3,0147 4,67 93,4 87,7-96,9
- 200845_s_at
- LOC389249:PRDX6 5,56E-19 2,8412 2,76 92,2 86,1-96,1
- 209301_at
- CA2 5,87E-19 2,9662 9,22 93,1 87,3-96,7
- 208399_s_at
- EDN3 6,42E-19 2,9342 11,21 92,9 87-96,5
- 228961_at
- MIER3 9,14E-19 2,9183 3,91 92,8 86,9-96,5
- 231975_s_at
- MIER3 9,14E-19 2,9172 3,91 92,8 86,8-96,4
- 204719_at
- ABCA8 1,26E-18 2,9172 6,82 92,8 86,8-96,5
- 207761_s_at
- METTL7A 1,35E-18 3,1247 1,93 94,1 88,6-97,3
- Diana PS
- Símbolo Signif. FDR D.val5 FC Sens-Spec CI (95)
- 207977_s_at
- DPT 1,53E-18 2,8967 9,07 92,6 86,6-96,4
- 213068_at
- DPT 1,53E-18 2,8973 9,07 92,6 86,7-96,4
- 213071_at
- DPT 1,53E-18 2,8962 9,07 92,6 86,7-96,4
- 218756_s_at
- MRM1:MGC4172 1,74E-18 2,9041 3,74 92,7 86,6-96,4
- 212288_at
- FNBP1:C1orf85:CCT3 1,76E-18 3,0475 2,04 93,6 88-97
- 204036_at
- EDG2 2,44E-18 2,8853 3,19 92,5 86,4-96,3
- 202037_s_at
- SFRP1 2,77E-18 2,8647 15,53 92,4 86,3-96,2
- 206143_at
- SLC26A3 4,18E-18 2,9202 21,4 92,8 86,9-96,5
- 215657_at
- SLC26A3 4,18E-18 2,9226 21,4 92,8 86,9-96,5
- 231773_at
- ANGPTL1 1,42E-17 2,7938 4,64 91,9 85,6-95,9
- 205480_s_at
- UGP2 1,64E-17 2,7911 2,41 91,9 85,6-95,9
- 204955_at
- SRPX 1,79E-17 2,7753 3,91 91,7 85,5-95,8
- 222722_at
- OGN 2,25E-17 2,7048 13,67 91,2 84,8-95,4
- 202555_s_at
- MYLK 2,33E-17 2,773 3,99 91,7 85,4-95,8
- 224823_at
- MYLK 2,33E-17 2,7727 3,99 91,7 85,4-95,8
- 225575_at
- LIFR 2,45E-17 2,7823 6,36 91,8 85,5-95,8
- 214142_at
- LOC653808:ZG16 2,51E-17 2,8119 8,14 92 85,8-95,9
- 206710_s_at
- EPB41L3 2,62E-17 2,8298 2,51 92,1 85,9-96,1
- 205464_at
- SCNN1B 3,20E-17 2,7209 16,15 91,3 84,9-95,5
- 220812_s_at
- HHLA2 3,47E-17 2,6717 10,02 90,9 84,4-95,3
- 203913_s_at
- HPGD 3,65E-17 2,8441 3,21 92,2 86,1-96,1
- 203914_x_at
- HPGD 3,65E-17 2,8456 3,21 92,3 86,1-96,1
- 211548_s_at
- HPGD 3,65E-17 2,8446 3,21 92,3 86,1-96,1
- 211549_s_at
- HPGD 3,65E-17 2,8466 3,21 92,3 86,1-96,1
- 206198_s_at
- CEACAM7 3,96E-17 2,7882 10,4 91,8 85,5-95,9
- 206199_at
- CEACAM7 3,96E-17 2,7855 10,4 91,8 85,6-95,8
- Diana PS
- Símbolo Signif. FDR D.val5 FC Sens-Spec CI (95)
- 211848_s_at
- CEACAM7 3,96E-17 2,7882 10,4 91,8 85,6-95,8
- 226430_at
- SMAD5:RELL1 4,10E-17 2,6968 2,5 91,1 84,6-95,4
- 202992_at
- C7 4,40E-17 2,7163 6,67 91,3 84,9-95,5
- 205112_at
- PLCE1 6,91E-17 2,7542 2,43 91,6 85,2-95,7
- 229839_at
- SCARA5 1,25E-16 2,6897 2,86 91,1 84,6-95,3
- 235849_at
- SCARA5 1,25E-16 2,6918 2,86 91,1 84,5-95,3
- 209763_at
- CHRDL1 1,49E-16 2,6093 13,88 90,4 83,7-94,9
- 205259_at
- NR3C2 2,08E-16 2,5812 3,19 90,2 83,4-94,7
- 202242_at
- TSPAN7 2,13E-16 2,6519 3,68 90,8 84,1-95,1
- 203000_at
- STMN2 2,25E-16 2,6115 6,13 90,4 83,7-94,9
- 203001_s_at
- STMN2 2,25E-16 2,6141 6,13 90,4 83,7-94,9
- 209074_s_at
- FAM107A 2,52E-16 2,6171 2,92 90,5 83,8-94,9
- 202920_at
- ANK2 2,59E-16 2,6499 6,76 90,7 84,1-95,1
- 213317_at
- CLIC5 3,68E-16 2,696 2,37 91,1 84,6-95,4
- 204697_s_at
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- Diana PS
- Símbolo Signif. FDR D.val5 FC Sens-Spec CI (95)
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- No Symbol 9,1926E12 2,1537 1,61 85,9 78,291,6
- 221305_s_at
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- 203881_s_at
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- 206637_at
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- 214598_at
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- 227529_s_at
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- 219948_x_at
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- 222717_at
- SDPR 9,6207E08 1,5993 2,21 78,8 70,185,9
- 229831_at
- CNTN3 1,1953E07 1,6145 3,93 79 70,386,1
- Diana PS
- Símbolo Signif. FDR D.val5 FC Sens-Spec CI (95)
- 204940_at
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- 227827_at
- SORBS2 4,2323E05 1,3016 2,1 74,2 65,181,9
- 238751_at
- SORBS2 4,2323E05 1,3015 2,1 74,2 65,182
- 209209_s_at
- PLEKHC1 0,0007 1,0304 1,82 69,7 60,378
- 206664_at
- SI 0,0054 0,9301 2,79 67,9 58,476,3
TABLA 4
- Símbolo génico
- ValidPS_DOWN Signif. FDR D.val 5 FC Sens-Spec CI (95)
- ANK2
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- imagen168
-
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- DMD
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-
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- ABCA8
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- imagen180
-
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- TCF21
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- HuGene_st:204931_at:830709-HuGene_st:273418
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- imagen186
-
HuGene_st:229529_at:1001969-HuGene_st
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- Símbolo
- ValidPS_DOWN Signif. D.val FC Sens- CI
- génico
-
imagen192 FDR 5imagen193 Spec (95)
- PLN
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- imagen194
-
HuGene_st:204940_at
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- BCHE
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-
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- CITED2
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- imagen224
-
HuGene_ st:209168_at
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- PLEKH
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- C1
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- imagen230
-
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- ADH1B
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-
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- Símbolo génico
- ValidPS_DOWN Signif. FDR D.val 5 FC Sens-Spec CI (95)
- imagen242
-
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- XLKD1
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-
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TABLA 5
- Gen
- Sangre Normal MRC5 CaCo2 HCT116 HT29 SW480
- CXCL12
- Desmet bajo desmet met met desmet
- DF
- Bajo met met met desmet met
- MAMDC2
- Desmet desmet met desmet desmet met
- CA4
- desmet desmet met met met desmet
- MT1M
- bajo bajo bajo met bajo met
- P2RY14
- desmet Bajo Met Met Desmet Met
- GPM6B
- Bajo Bajo Bajo Met Met Met
- ADAMDEC1
- bajo Desmet Met Met desmet met
TABLA 6
- imagen360
- ID conjunto de sondas Secuencia diana
- 1
-
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- 2
-
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- 3
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- imagen364
- ID conjunto de sondas Secuencia diana
- 4
-
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- 5
-
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- 6
-
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- 7
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- 8
-
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- 9
-
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- 10
-
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- imagen372
-
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- 11
-
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- imagen376
- ID conjunto de sondas Secuencia diana
- 12
-
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- 13
-
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- 16
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- 19
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- 20
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- imagen386
-
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- imagen389
- ID conjunto de sondas Secuencia diana
- 21
-
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imagen390
- 22
-
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- 23
-
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- 24
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- 28
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- 29
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- imagen399
- ID conjunto de sondas Secuencia diana
- 30
-
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- 31
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- 32
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- 34
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- 35
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- 37
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- 38
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- imagen409
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- 39
-
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- 40
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- 45
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- 46
-
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imagen417
- imagen418
- ID conjunto de sondas Secuencia diana
- 47
-
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- 48
-
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- 49
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- 50
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- imagen427
- ID conjunto de sondas Secuencia diana
- 55
-
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- 58
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- 59
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- 60
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- ID conjunto de sondas Secuencia diana
- 63
-
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- 65
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- ID conjunto de sondas Secuencia diana
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-
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- ID conjunto de sondas Secuencia diana
- 661
-
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- 662
-
237521 _x_at
imagen1104
- 663
-
37892_ at
imagen1105
TABLA 7: Cebadores MSP y condiciones PCR
- Gen
- Conjunto de sondas Nombre del gen Cebador directo 5'-3' Cebador inverso 5' -3' Temp Recocido
- CA4
-
206208_at
Anhidrasa carbónica IV
imagen1106 GCGCACCGAAAAAACCG (SEQ ID NO:665) 61,0°C
- CXCL1 2
-
209687_at
Quemoquina,CXC Motif, Ligand 12
imagen1107 imagen1108 64,0°C
- DF
-
205382_s _at
Factor complemento D
imagen1109 AAACGAACCGCTCCCCG (SEQ ID NO:669) 64,0°C
- MAMD C2
-
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Precursor proteína 2 que contiene el dominio MAM
imagen1110 imagen1111 60,0°C
- MT1M
-
217546_at
Metalotioneína-1 M
imagen1112 GCTTACACCCGCCCGACTA (SEQ ID NO:673) 62,0°C
- CAGE
-
imagen1113 Ensayo de amplificación sesgado controlimagen1114 imagen1115 61,0°C
TABLA 8: Cebadores COBRA y condiciones PCR
- Gen
- Conjunto de sondas Nombre del gen Cebador directo 5'-3' Cebador inverso 5' -3' Temp Recocido Enzima
- ADAM DECI
-
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ADAM-tipo, decisina 1
imagen1116 imagen1117 61,0°C
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