CN105467127B - 一种人结肠癌蛋白质标志物col6a3的应用方法及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和医学检测领域。具体而言，本发明提供了人结肠癌标志物COL6A3的一种应用方法，所述的应用方法是COL6A3在制备诊断或预测结肠癌转移、结肠癌临床分期、结肠癌患者预后的制剂中的应用。本发明还提供人结肠癌标志物COL6A3的检测方法及检测试剂盒。本发明的检测试剂盒高效、灵敏、特异性强，相关的检测方法快速、简便，成本较低。

Description

一种人结肠癌蛋白质标志物COL6A3的应用方法及其检测试 剂盒

技术领域

本发明属于基因工程和医学检测领域，涉及一种用作人结肠癌标志物COL6A3的检测方法、检测试剂盒及其应用方法。

背景技术

结肠癌在世界范围内是第三大男性肿瘤和第二大女性肿瘤。根据世界卫生组织GLOBOCAN2012的统计，在2012年预计有74.6万男性和61.4万女性病人，整体致死率是50.1％(男性)和52.1％(女性)，表明预后生存很差。肿瘤发生不但影响个人家庭，也带来严重的社会影响、增加公共卫生支出和财政负担。因此，争取早发现、早确证、早治疗，对于提高结肠癌的治愈率和延长预后生存时间具有非常重要的意义。结肠癌的初发阶段一般症状不明显，容易被忽略，而一旦确证后则往往处于中晚期而使治疗效果不佳，更影响手术后的生存。所以，治疗结肠癌或其他癌症的一个关键在于尽可能早地发现结肠癌。一般结肠癌的诊断，包括观察排便习惯的改变、便血、腹痛等，直肠指症，实验室检查包括血常规、尿常规和大便常规、大便潜血试验，影像检查、B超、CT扫描、结肠镜检查等等。而血清血液检查则是最为通行、常规的检查，常用标志物为癌胚抗原(CEA)、结直肠癌抗原(CCA)、CA19-9，但是这些抗原检测的临床效果差异比较大，且检测的灵敏度和特异性有待提高。从这个意义上说，发现新的同时具有高灵敏度、高特异性的血液标志物是一件非常紧迫的任务。利用这样的新型标志物，就可以在常规体检筛查中尽早地发现早期结肠癌的存在。

其次，对于手术后或放化疗后病人的预后效果、生存情况的预测，常规方法有赖于病理参数、TNM分期、Dukes分期等方法，但在病理判断上有时有人为因素干扰，非常需要有差异显著、灵敏度高、特异性好、操作方便的分子标志物来作为辅助判断手段，因此，寻找结肠癌的有效标志物，准确判断肺腺癌的临床分期和预后成为广大医学研究者的迫切任务。

发明内容

本发明的目的是提供一种人结肠癌蛋白质标志物COL6A3的应用方法。

本发明的另一个目的是提供人结肠癌蛋白质标志物COL6A3的检测方法及其检测试剂 盒。

根据本发明的研究结果，定量PCR、酶联免疫分析和组织免疫杂交证明，COL6A3在结肠癌组织中的表达量显著高于在正常结肠组织的表达量。并且，COL6A3的高表达将缩短结肠癌患者手术后的生存期。因此，COL6A3可以作为一种新的人结肠癌标志物和筛选检测、治疗抗结肠癌药物的靶标为有效判断结肠癌癌变进程提供科学依据。本发明在此基础上完成。

本发明提供了人结肠癌标志物COL6A3的一种应用方法，所述的应用方法是COL6A3在制备诊断或预测结肠癌转移、结肠癌临床分期、结肠癌患者预后的制剂中的应用。

所述的标志物COL6A3在制备诊断或预测结肠癌转移、结肠癌临床分期、结肠癌患者预后的试剂盒中的应用。

所述的标志物COL6A3在制备诊断、缓解或治疗结肠癌的药剂中的应用。

COL6A3可以作为筛选制备诊断、缓解或治疗结肠癌的药剂的靶标。

本发明还提供了一种人结肠癌标志物COL6A3的检测方法，所述的方法包括步骤:

分离提取样本中的基因组DNA或者蛋白；

和/或

检测基因组DNA或者蛋白中COL6A3的含量。

所述的样本为离体的人源的组织或者体液。

利用COL6A3的特异性引物扩增样本中的基因组DNA，检测COL6A3的DNA含量。

利用COL6A3的抗体与样本中的蛋白反应，检测COL6A3的蛋白表达量。

另一方面，本发明提供了一种检测试剂盒，它包括特异性扩增COL6A3的引物，或者针对COL6A3蛋白的抗体。

所述的检测试剂盒含有COL6A3标准品。所述的COL6A3标准品包括COL6A3蛋白、COL6A3基因及其活性片段。

本发明提供了一个用于区分人结肠癌组织以及癌旁正常结肠组织、无淋巴结转移结肠癌组织和有淋巴结转移结肠癌组织的质膜蛋白标志物COL6A3，以及利用该标志物制备判断人结肠癌、结肠癌扩散，结肠癌淋巴结转移、临床分期、结肠癌患者预后和预后的制剂和试剂盒。本发明为有效判断人结肠癌癌变进程提供科学依据。本发明的检测试剂盒高效、灵敏、特异性强，相关的检测方法快速、简便，成本较低。

附图说明

图1定量蛋白质组学鉴定COL6A3在结肠癌成纤维细胞中高表达。A，COL6A3蛋白在3次定量蛋白质组学分析中，被鉴定到的序列覆盖度占49.3％～52.3％。B，COL6A3质谱鉴定的谱图。左边为iTRAQ标签谱图，显示肽段在成纤维细胞样本中高，而在结肠癌上皮细胞中低。右边为COL6A3特异肽段ALILVGLER的谱图。

图2是分析COL6A3蛋白在结肠(癌)成纤维细胞系和结肠癌细胞系中的表达。图2-A是用Western blot方法分析COL6A3蛋白在结肠(癌)成纤维细胞系和结肠癌细胞系的表达水平。CCD-18Co是结肠成纤维细胞系，1031NF和0426NF是癌旁正常结肠成纤维细胞系，1031CAF和0426CAF是结肠癌成纤维细胞系，LoVo、HT29及SW620是结肠癌细胞系。这是全细胞提取物的Western blot。PDGFa、Vimentin和a-SMA是成纤维细胞的标志蛋白，这里用做对照。GAPDH是上样内参。图2-B是COL6A3蛋白在结肠(癌)成纤维细胞系和结肠癌细胞系的培养上清中的表达水平。

图3是利用Oncomine公共数据库中的基因表达芯片数据分析COL6A3基因在结直肠癌和正常结直肠组织中的表达。图3-A是利用Gaedcke Colorectal数据分析COL6A3在65对直肠和直肠癌组织中的表达的散点图，散点下的数字表示病例或正常样本的个数，p值为用Student t test(T检验)分析得到的显著性值，星号代表该T检验用的是配对T检验。图3-B是利用Hong Colorectal数据分析COL6A3在12例结肠和48例结肠癌组织中的表达的散点图。图3-C是利用Kaiser Colon数据分析COL6A3在5例结肠和100例结肠癌组织中表达的散点图。图3-D是利用Ki Colon数据分析COL6A3在41例结肠和82例结肠癌组织中的表达的散点图。图3-E是利用Skrzypczak Colorectal 2数据分析COL6A3在20例结肠、20例结肠腺瘤或结肠癌组织中的表达的散点图。图3-F是利用Skrzypczak Colorectal数据分析COL6A3在24例结肠和81例结肠癌组织中的表达的散点图。图3-G是利用TCGA Colorectal数据分析COL6A3在22例结直肠组织和215例结肠癌组织中的表达的散点图。

图4是利用商业化组织芯片进行COL6A3免疫组织化学分析的结果。图4-A是展示COL6A3在基质中阴性表达的正常结肠组织。图3-B是COL6A3基质阳性表达的癌组织。图4-C和D是COL6A3在基质高表达的结肠癌组织。图4-E，COL6A3在癌旁和结肠癌基质中的表达。图4-F，COL6A3在癌和癌旁的上皮细胞中的表达。

图5是Kaplan-Meier曲线分析COL6A3的基因和蛋白表达与结肠癌生存的关系图。图5-A是COL6A3基因表达与结肠癌病人总体生存的Kaplan-Meier曲线分析图。基因表达数据来源于Oncomine基因表达公共数据库的Smith Colorectal数据集。图5-B是COL6A3基因表达与结肠癌病人总体生存的Kaplan-Meier曲线分析图。基因表达数据来源于Oncomine基因表达公共数据库的Smith Colorectal 2数据集。图5-C是COL6A3蛋白在结肠癌基质中阳性表达和阴性表达与结肠癌病人总体生存的Kaplan-Meier曲线分析图。图5-D是COL6A3蛋白在结肠癌上皮细胞中阳性表达和阴性表达与结肠癌病人总体生存的Kaplan-Meier曲线分析图。图5-E是COL6A3蛋白各种表达组合与结肠癌病人总体生存的Kaplan-Meier曲线分析图。

图6是用ELISA的方法检测结肠癌病人和正常人血浆中的COL6A3蛋白表达。图6-A是ELISA分析结肠癌病人和正常人血浆中的COL6A3蛋白表达，根据标准品的量测定COL6A3在病人和正常人血浆中的量，p值为用Student t test(T检验)分析得到的显著性值。n代表病例数。图6-B是COL6A3蛋白血浆表达的受试者操作特性(ROC)曲线分析。横坐标代表假阳性或1-特异性，纵坐标代表真阳性或灵敏度。对角线是参考线。AUC代表线下面积。

具体实施方式

本发明的人结肠癌蛋白质标志物Spondin-2可以用于制备诊断、预测、检测或筛查人结肠癌癌细胞扩散、结肠癌淋巴结转移、结肠癌临床分期、结肠癌患者预后的制剂。人结肠癌蛋白质标志物Spondin-2可以用于制备诊断、预测、检测或筛查人结肠癌的制剂；特别是用于制备诊断、预测、检测或筛查人结肠癌的试剂盒。下面结合优选实施例对本发明作详细说明，而不会限制本发明。

实施例1

用定量蛋白质组学鉴定、筛选到COL6A3为结肠或结肠癌基质成纤维细胞特异表达的分泌蛋白。

操作流程如下：

1、结肠或结肠癌基质成纤维细胞及结肠癌细胞分泌蛋白收集、蛋白定量

在100mm培养皿中接种细胞3-4×10⁶/皿，培养到70-80％满。用无血清、无酚红DMEM/F12培养基洗细胞，继续用该培养基培养细胞48小时。收集培养上清，离心，分别收集细胞及上清。上清用0.45μm滤膜(Millipore公司)过滤，再用滤膜浓缩(Amicon Ultra4mL,3kDa Filters(Millipore公司))。蛋白定量用常规BCA试剂盒(碧云天公司)。

2、结肠或结肠癌基质成纤维细胞及结肠癌细胞分泌蛋白的iTRAQ标记

8重iTRAQ试剂(AB SCIEX公司)分别标记结肠成纤维细胞CCD-18Co、癌旁成纤维细胞1031NF和0426NF及结肠癌成纤维细胞1031CAF和00426CAF，以及结肠癌细胞LoVo、HT29和SW620。蛋白用量100μg，用1μL变性试剂处理，再用2μL还原试剂在60℃反应1小时。按1：40加入胰酶(AB SCIEX公司)，在37℃酶解13小时。再按100：1加入新的胰酶，继续酶解3小时。用NH₄HCO₃pH调整到7-9。加入iTRAQ试剂标记2小时。8个样本混合后，抽干。用强阳离子交换法分为25个组分，分析柱为Polysulfoethyl column(2.1mm(diameter)×100mm(length),packed withand 5μm materials)(Nest Group公司)。高盐组分用Sep-Pak VacC18column(Waters公司)柱除盐。然后样本抽干待用。

3、蛋白质组学分析

用色谱上样缓冲液将冻干的组分样品重溶，上样到富集和脱盐柱(ZORBAX300SB-C18column(packed with5μm C18materials,0.5(diameter)×23mm(length))(Waters公司)，流动相A是5％乙腈/0.1％甲酸，流动相B是95％乙腈/0.1％甲酸，色谱为Nano Aquity UPLC(Waters公司)。从脱盐柱洗脱下的肽段，进入分析柱(PepMap reversephase analytical column(packed withand 3μm C18materials,75μm(diameter)×150mm(length))(Dionex公司)，从分析柱洗脱出来的肽段进入质谱分析，质谱为a QstarElite mass spectrometer(Applied Biosystems公司)。洗脱梯度为90分钟/5～45％流动相B，流速400nL/分钟。柱尾喷针为10-mm id PicoTip nanospray emitter(New Objective公司)。数据采集在一级质谱及二级质谱间轮换。一级质谱为0.5秒，m/z范围为400-1800Da；随后有6个二级质谱，0.5或1秒，m/z范围为100-1800Da。选择离子强度最高且超过50的3个母离子进行二级质谱，电荷是2+、3+或4+。排除窗口是180秒。软件是Analyst QS 2.0(Applied Biosystems公司)。

4、数据库搜索

数据库搜索用软件ProteinPilot v2.5(Applied Biosystems公司)，数据库是人类蛋白，含20214条序列，是从UniProtKB/Swiss-Prot Release 2014_06数据库中抽取出来的。搜索参数：酶解的酶为胰酶，固定修饰为methyl methanethiosulfate(MMTS)，样本类型是iTRAQ 8-plex(Peptide Labeled)，Bias correction，background correction，分母是iTRAQ 113，Unused ProScore(Conf)设置为0.05，选择独立的假阳性FDR分析。搜索结果，选择1％FDR，至少2个不同 的肽段(99％可能性)支持。质谱分析重复3次，3次的结果合并分析，计算蛋白在成纤维细胞系和结肠癌细胞系中的表达差异，iTRAQ 113(代表0426CAF)作为分母，iTRAQ 114、115、116、117(代表其他4个成纤维细胞系)及118、119、121(代表结肠癌细胞系)与其计算比值，成纤维细胞系与结肠癌细胞系比值再各取平均值，再平均值相比，得到成纤维细胞系相对于结肠癌细胞系的倍数变化。用Student’s t test计算p值。倍数变化≥2且p<0.05作为筛选标准。

5、结果：共鉴定1114个蛋白，其中116个为成纤维细胞系相对特异表达。利用oncomine数据库分析，发现116个成纤维细胞相对特异表达蛋白中，有20个蛋白的编码基因在结肠癌中显著上调，其中包括COL6A3。COL6A3在3次质谱分析中鉴定肽段序列覆盖度占全长蛋白的一半(图1A)，而COL6A3是个很大的蛋白，长度达到3177个氨基酸，因此其鉴定的可靠性很高。质谱结果显示COL6A3在成纤维细胞中表达比较高，而在结肠癌上皮细胞中表达低(图1B)。因此，COL6A3可能是结肠癌基质中高表达的蛋白。

实施例2

用Western blot方法检测COL6A3蛋白在结肠癌细胞系的表达。

操作流程如下：

1、主要溶液配制：

1)PBS溶液：量取生工20×PBS溶液25mL，超纯水定容至500mL，室温保存。

2)50×Protein inhibitor cocktail(蛋白酶抑制剂母液)：取一粒罗氏蛋白酶抑制剂(complete EDTA-free Protease Inhibitor cocktail tablets)，加入1mL超纯水溶解，分装，-20℃保存，此即为50×蛋白酶抑制剂母液。

3)细胞裂解液：50mM Tris-HCl(pH7.4)，1％SDS，2mM EDTA，分装，-20℃保存，每毫升裂解液用时再加20μL 50×Protein inhibitor cocktail。

4)丙烯酰胺溶液：30％丙烯酰胺，0.8％甲叉双丙烯酰胺；

5)分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8；

6)浓缩胶缓冲液：1.0mol/L Tris-HCl pH 6.8；

7)SDS：10％(m/v)；

8)过硫酸氨AP：10％(m/v)；

9)电泳缓冲液：25mmol/L Tris，192mmol/L甘氨酸，0.1％(m/v)SDS，pH 8.3；

10)3×SDS凝胶加样缓冲液：150mmol/L Tris-HCl pH 6.8，300mmol/L DTT，6％SDS，0.3％溴酚蓝，30％甘油，-20℃分装保存，一般DTT现用现加。

11)电转缓冲液：25mmol/L Tris，192mmol/L甘氨酸。

12)TBST缓冲液：8.766g NaCl(即0.15mol/L)，1mL Tween 20，20mL 1M Tris-HCl(pH 7.4)，加超纯水定容到1L。

13)封闭液：称取5g脱脂奶粉溶解于100mL TBST中即为5％脱脂奶粉封闭液。

2、培养细胞全蛋白的提取方法：

1)用真空泵吸掉培养基，加入PBS洗一遍，吸掉，重复一次；

2)将PBS吸掉，培养皿放到冰上，加入适量的细胞裂解液，静置3min；

3)充分裂解后，用干净的细胞刮快速地将细胞刮至培养皿一侧，然后用枪将细胞碎片和裂解液转移至1.5mL离心管中；

4)4℃ 12000g离心15min；

5)将离心后的上清分装转移至1.5mL离心管中，-20℃保存。

3、蛋白定量方法：BCA蛋白浓度测定试剂盒碧云天货号:P0010

1)取BSA(Bio-rad)蛋白标准液，PBS稀释至终浓度为0.5mg/mL；

2)根据蛋白样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B，即50:1配制适量BCA工作液，充分混匀，该BCA工作液室温24h内稳定；

3)将标准液按0，2，4，8，12，16，20μL加到96孔板的标准品孔中，加PBS补足到20μL；

4)吸取2μL蛋白样品到96孔板的样品孔中，加PBS补足20μL；

5)各孔加入200μL BCA工作液，37℃培养箱中放置30min；

6)BioTek Epoch多体积分光光度计OD562nm处测定吸光度。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

4、SDS-PAGE凝胶电泳

1)取成套Bio-Rad配胶用玻璃板ddH₂O清洗干净后于烘箱中烘干，用夹子固定在底座上；

2)按以下配方配制10％分离胶和5％浓缩胶。制备分离胶时，上层用ddH₂O封胶，室温聚合40min以上；制备5％的浓缩胶时，将上层封胶ddH₂O吸净后，加入浓缩胶，插入梳子，并防止产生气泡；

10％分离胶配制如下表：

不同体积(mL)凝胶液中各成分所需体积(mL)

溶液成分

5

10

15

20

25

30

水

1.9mL

4.0mL

5.9mL

7.9mL

9.9mL

11.9mL

30％丙烯酰胺

1.7mL

3.3mL

5.0mL

6.7mL

8.3mL

10.0mL

1.5M Tris(pH 8.8)

1.3mL

2.5mL

3.8mL

5.0mL

6.3mL

7.5mL

10％SDS

50μL

100μL

150μL

200μL

250μL

300μL

10％过硫酸胺

50μL

100μL

150μL

200μL

250μL

300μL

TEMED

2μL

4μL

6μL

8μL

10μL

12μL

浓缩胶配制如下表：

3)待浓缩胶凝固后将凝胶板转移至垂直电泳槽中，使凝胶板凹面向内。加入电泳缓冲液，拔出梳子；

4)已测浓度的蛋白样品按体积比为2:1加入3×loading buffer，沸水中煮5min，12000g离心1min，上样(上样量为30μg/泳道)，同时上样预染蛋白Marker，作为分子量对照。

5)电泳：浓缩胶先以45V电压进行电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后转换成65V继续电泳，待指示剂跑至分离胶底部0.5cm左右停止电泳。

5、转膜及Western blot

1)准备电转缓冲液(现用现配)，根据凝胶大小，切割PVDF膜和滤纸，甲醇活化PVDF膜1min后，将PVDF膜和滤纸在电转缓冲液中浸泡15min以上；

2)撬开玻璃板，取出SDS-PAGE凝胶，放入电转缓冲液中平衡，按黑板-海绵垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-白板的顺序将凝胶与PVDF膜固定于湿转电转夹内，将夹子的黑面对应槽的黑面方向放入电转槽中，加满电转缓冲液进行转膜(冰浴)。通常使用110V2h电转分子量较大的蛋白，也可在4℃冰箱中30V恒压电转过夜；

3)封闭：转膜结束后取出PVDF膜，将紧贴凝胶的一面(蛋白面)朝上放入孵育盒中，5％脱脂奶粉室温封闭1h；

4)一抗孵育：将一抗(购自Sigma-Aldrich)用封闭液1:1000稀释，4℃摇床上孵育过夜；

5)TBST洗涤3次，每次5-10min；

6)二抗孵育：将与一抗相对应的羊抗兔二抗用封闭液稀释到适当浓度(1:5000-1:8000)，室温摇床上孵育1h；

7)TBST洗涤3次，每次5-10min；

8)剪取合适大小的封口膜，在上面加入200-400μL Thermo SuperSignal WestFemto Maximum Sensitivity Substrate超敏显色液(按1:1现用现配工作液)，室温静置1min，使用Las-3000成像系统获取Western blot结果。

6、结果：全细胞裂解物分析，COL6A3蛋白在CCD-18Co、1031NF、1031CAF、0426NF、0426CAF等5个结肠(癌)成纤维细胞系里表达，但在结肠癌细胞系LoVo、HT29及SW620里无表达(图2A)。COL6A3的表达特点与成纤维细胞特异标志物PDGFa、Vimentin、a-SMA一样。在培养上清中，COL6A3在成纤维细胞系中表达，而在结肠癌细胞系里不表达(图2B)。这些结果表明，COL6A3是结肠(癌)基质成纤维细胞特异表达的分泌蛋白。

实施例3

利用Oncomine公共数据库(https://www.oncomine.org/resource/login.html)分析COL6A3基因在结肠癌和癌旁组织中的表达。分析方法：登录上述Oncomine数据库，输入COL6A3基因名，肿瘤类型选择结肠癌，数据类型选择mRNA，差异分析类型选择癌和正常分析，继而分析COL6A3基因在各个数据集中的表达情况，将各个数据集中COL6A3基因在癌和癌旁表达值分别下载、另行分析其表达的差异是否显著。经过分析，证明COL6A3基因在癌组织中相比于癌旁组织呈现显著高表达趋势，这被多个数据集的分析所证明，包括GaedckeColorectal(图3A，n＝65,p＝8.4E-16)、Hong Colorectal(图3B,n＝70,p＝5.2E-7)、Kaiser Colon(图3C,n＝100,p＝0.016)、Ki Colon dataset(图3D,n＝82,p＝4.3E-6)、Skrzypczak Colorectal 2(图3E,n＝20,p＝0.0002)、Skrzypczak Colorectal dataset 2(图3F,n＝81,p＝0.004)和TCGA(图3G,n＝215,p＝0.006)。COL6A3在结肠腺瘤中上调而在结肠癌中表达进一步上升，证明COL6A3在结肠癌发生发展过程中起作用。

实施例4

用免疫组化方法分析COL6A3蛋白在结肠癌和癌旁正常组织中的表达。

操作过程如下：

1、组织芯片：使用商业化组织芯片(上海芯超生物公司)，HCol-Ade180Sur-04包括90例、180点癌和癌旁组织，临床信息包括性别、年龄、TNM、肿瘤大小、分期、分级、随访信息等。芯片样本点的直径为1.5mm，固定方式为福尔马林固定。

2、烘蜡

1)将组织芯片放入烘箱中，温度调至63度，烘蜡一小时。

2)配制试剂。10×PBS缓冲液(配方：80g NaCl、2g KCl、15.35g Na₂HPO₄、2gKH₂PO₄，用纯水定容至1000毫升)：将10×PBS缓冲液稀释至1×PBS缓冲液，再在1×PBS缓冲液中加入占总体积0.05％的吐温试剂；抗原修复液：82mL 0.1mol/L的柠檬酸钠溶液+18mL0.1mol/L的柠檬酸溶液+900mL的纯水置于高压锅中；

3、抗原修复

1)片子烘烤完成后，从烘箱内取出，放入全自动染色机中，进行脱蜡；

2)脱蜡过程：二甲苯两缸，每缸15分钟；无水乙醇两缸，每缸7分钟；90％酒精1缸，7分钟；80％酒精1缸，7分钟；70％酒精1缸，7分钟；

3)从染色机中取出片子，用纯水冲洗3次，一次3分钟。冲洗过程中将柠檬酸修复液放至电炉上开始加热；

4)抗原修复：柠檬酸修复液沸腾后，将片子放入高压锅中，盖上高压锅盖，待出气后开始计时，5分钟。时间到后终止加热，将高压锅盖打开，使其自然冷却至室温；

4、阻断

配制内源性过氧化物酶阻断剂。38.4mL无水甲醇+12mL 30％浓度的H₂O₂+9.6mL纯水；将片子放入阻断剂中10分钟。

5、加入一抗

1)取出片子，用PBS缓冲液冲洗3次，一次5分钟；

2)冰箱中取出COL6A3抗体，放入离心机里7200转离心30秒；

3)取出抗体，按照稀释度用DAKO抗体稀释液1：50稀释；

4)滴加抗体；

5)将湿盒放入冰箱，4℃过夜。

6、加入二抗

1)从冰箱里取出湿盒，静置1小时待其恢复到室温；

2)将片子用PBS缓冲液冲洗3次，一次5分钟；

3)滴加EnVision^TM+/HRP兔工作液(来自DAKO公司)，30分钟；

4)时间到后用PBS冲洗3次，一次5分钟。

7、DAB显色：从冰箱里取出DAB试剂盒，按1mL DAB稀释液+1滴DAB色原进行配制；(来自DAKO液体DAB+底物系统)。在片子上滴加稀释后的DAB，显色5分钟，到时后自来水冲洗15分钟。

8、苏木素复染

1)在片子上滴加苏木素2分钟，时间到后在0.25％的盐酸酒精中浸没2秒，用自来水冲洗2分钟；

2)将片子放入全自动染色机进行脱水，取出封片。

3)脱水过程：75％酒精1缸，3分钟；85％酒精1缸，3分钟；95％酒精1缸，3分钟；无水乙醇两缸，每缸5分钟；二甲苯两缸，每缸5分钟。

9、扫描：用芯片扫描仪Scanscope XT(Aperio公司)扫描。

10、芯片染色的软件分析

1)用软件Aperio ImageScope v.12打开芯片扫描文件，在每个样本点的图上选取3个以上的区域导出为单个TIFF图片；有的样本点，缺乏肿瘤上皮细胞，无法统计表达情况，这样的点放弃。

2)用软件Image-Pro Plus逐个打开这些TIFF图片，计算染色的累积光密度值(IOD)，该值除以统计染色的面积，得到平均累积光密度值(Mean IOD)。来自同一个样本的多个区域计算得到的平均累积光密度值再进一步取平均值，该值代表每个样本COL6A3蛋白的表达量；

3)癌和癌旁的COL6A3蛋白的表达比较用各个样本的平均累积光密度值比较；

4)癌样本的表达分类。为简化分类便于分析，COL6A3蛋白在癌中的表达根据MeanIOD值加上辅助判断，进一步简化分为阳性和阴性表达。

11、结果

在HCol-Ade180Sur-04组织芯片的分析中，COL6A3在癌旁组织基质中表达阴性的代表性图见图4A；在结肠癌组织中，COL6A3基质表达阴性见图4B，COL6A3基质表达阳性见图4C，D)。经过T检验，发现COL6A3蛋白在结肠癌基质中的表达显著高于癌旁正常基质组织(p＝2.4E-13)(图4E)；而在上皮细胞中，经过T检验，发现COL6A3蛋白在正常结肠样本中的表达显著高于癌组织(p＝3.7E-20)(图4F)。这些结果证明COL6A3蛋白是结肠癌基质特异标志物。

实施例5

COL6A3表达与结肠癌病人临床参数的关系

用Oncomine基因表达数据库分析(获取数据方法同前)，结肠癌样本按照COL6A3基因的表达的中位数分为2组，一组为大于中位数的高表达组，一组为小于中位数的低表达组，用K平方法分析COL6A3基因的高、低表达与临床参数的关系。所用软件为PASWStatistics 18。

结果：用Bitter Colon数据集，发现COL6A3基因的表达与分期(Bittner Colon,χ2＝14.951,p＝0.002)、T分期(Bittner Colon,χ2＝9.311,p＝0.025)、Dukes分期(BittnerColon,χ2＝13.596,p＝0.001)、吸烟状态(Bittner Colon,χ2＝5.448,p＝0.02)、复发(Smith Colorectal,χ2＝7.502,p＝0.006)有显著关系(表1)。总体上，COL6A3基因表达上调与肿瘤进展呈正相关。

表1.COL6A3基因的表达与结肠癌病人临床特征的关系

实施例6

Kaplan-Meier方法分析COL6A3基因和蛋白与结肠癌病人预后的关系。

利用Oncomine数据库的基因表达数据集Smith Colorectal分析COL6A3基因表达高低与手术后结肠癌病人的生存时间的关系，COL6A3基因的表达分为大于中位数(89例)和小于中位数(90例)两组。用Kaplan-Meier曲线分析方法做图，两组数据显著性用Log-rank检验方法来检验，结果证明COL6A3基因表达高的一组病人，其整体生存期(Overallsurvival)显著缩短(Log-rank检验，p＝0.0054)(图5A)。用Smith Colorectal 2数据集分析，COL6A3基因表达高的病人(27例)，生存时间比COL6A3表达低的病人缩短(Log-rank检验，p＝0.0178)(图5B)。这个结果表明COL6A3的高表达与结肠癌预后显著相关，COL6A3的基因表达是结肠癌预后的标志物。

利用组织芯片进行免疫组化分析，研究COL6A3蛋白与结肠癌病人预后生存的关系。结肠癌基质中COL6A3蛋白表达阳性的病人(48例)，其生存期比COL6A3蛋白表达阴性的病人(31例)显著缩短(Log-rank检验，p＝0.0374)(图5C)。而结肠癌上皮细胞的COL6A3表达高低与预后无关(Log-rank检验，p＝0.5016)(图5D)。将结肠癌病人按COL6A3的表达分成4组，分别是基质阴性/上皮阳性(13例)、基质阴性/上皮阴性(17例)、基质阳性/上皮阳性(39例)和基质阳性/上皮阴性(9例)，看见COL6A3基质阳性的病人，比COLTA3基质阴性的病人，其生存期都短，而COL6A3基质阳性/上皮阴性的病人，其预后最差(图5E)。

这些实验结果证明，COL6A3基因和蛋白的高表达缩短了结肠癌病人手术后的生存时间，COL6A3基因和蛋白的表达可以作为结肠癌预后的判断指标。

实施例7

单变量和多变量Cox回归分析。

我们使用单变量和多变量Cox回归方法，进一步分析COL6A3基因表达及其他临床参数对结肠癌病人生存时间的影响。单变量分析结果表明，与结肠癌病人的预后显著相关的因素，包括肿瘤分级(p＝0.004,风险比＝2.004,95％置信区间＝1.249-3.215)、复发(p＝0.000,风险比4.801,95％置信区间2.625-8.778)、分期(p＝0.000,风险比2.854,95％置信区间2.111-3.859)和COL6A3基因表达(p＝0.006,风险比＝1.965,95％置信区间＝1.209-3.193)，但不包括年龄、性别(表2)。

多变量回归分析表明，COL6A3基因表达(p＝0.034,风险比2.064,95％置信区间＝1.055-4.041)、复发(p＝0.000,风险比3.775,95％置信区间＝2.034-7.004)和分期(p＝0.048,风险比1.534,95％置信区间＝1.003-2.347)显著影响结肠癌病人的预后，增加预后风险。

以上结果表明，COL6A3基因表达是独立的、影响结肠癌病人生存时间的因素。通过检测结肠癌病人癌组织中的COL6A3基因的表达，就可以预测结肠癌病人的预后生存风险情况。

表2.COL6A3基因表达及其他临床参数影响结肠癌病人生存时间的单变量和多变量分析

实施例8

检测结肠癌病人血液中的COL6A3蛋白的表达水平及其区分结肠癌病人与正常人的能力。

操作过程：

COL6A3蛋白酶联免疫试剂盒(Cloud-Clone Corp公司产品)购自上海武昊公司。

1、结肠癌病人31例，正常人的血浆47例，其中结肠癌病人经过手术确诊。

2、主要溶液配制：

1)标准品(冻干品)稀释：每瓶标准品加入标准品稀释液1mL，盖好后室温放置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10,000pg/mL(贮液)。然后再将其进行梯度稀释，依次稀释成5,000pg/mL，2,500pg/mL,1,250pg/mL,625pg/mL,312pg/mL,156pg/mL,78pg/mL，标准品稀释液(0pg/mL)直接作为空白孔。

2)血清样本稀释：稀释10倍，取20μL血清或血浆加入180μL PBS。

3)检测溶液A及检测溶液B配制：Detection A及Detection B在使用前手甩几下，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别用去离子水以1:100稀释(如：10μL检测溶液A/990μL去离子水)，充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μL/孔)，实际配制时应多配制0.1-0.2mL。

4)洗涤液：用580mL去离子水将20mL浓洗涤液稀释至600mL，进行30倍稀释。

3、操作步骤：

1)加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的标准品。空白孔加100μL标准品稀释液，余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37℃温育2小时。

2)弃去液体，甩干，不用洗涤。

3)每孔加检测溶液A工作液100μL(临用前配制)，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

4)弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次，重复洗板3次。最后一次洗涤后，把孔内的洗涤液完全甩干。

5)每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。

6)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤4。

7)每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37℃避光显色20分钟

8)每孔加终止溶液50μL，终止反应。

9)确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(O.D.值)。

10)计算：以标准品的浓度为纵坐标，O.D.值为横坐标，绘出标准曲线。根据样品O.D.值(样品做了两个复孔，取平均值)，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数(10倍)，即为样品的实际浓度(pg/mL)。

4、结果

1)结肠癌病人及正常人血液中的COL6A3蛋白的表达水平

酶联免疫吸附检测法测定了结肠癌病人及正常人血液中的COL6A3蛋白的表达水平，证明COL6A3蛋白在结肠癌病人(31例)血浆中的水平显著高于正常人(47例)(p＝1.0E-7)(图6A)。结肠癌病人血浆中COL6A3蛋白的平均浓度为306.9ng/mL，而正常人则为73.6ng/mL，病人远高于正常人。

2)血浆中COL6A3蛋白的表达水平区分结肠癌病人与正常人的能力

根据酶联免疫吸附实验的结果，利用受试者操作特征曲线分析，COL6A3蛋白的线下曲线面积(AUC)值为0.883(图6B，表3)，说明COL6A3蛋白作为血浆标志物可以很好地将结肠癌病人与正常健康人区分开来，COL6A3蛋白可以作为结肠癌诊断的血浆指标。

3)血浆COL6A3蛋白检测结肠癌的灵敏度和特异性：根据酶联免疫吸附实验的结果，可以获知血浆COL6A3蛋白检测结肠癌的灵敏度和特异性，当血浆COL6A3蛋白浓度为90.3ng/mL时，结肠癌检测的灵敏度是83.9％，而特异性是89.4％(表4)。

表3.受试者特性曲线分析的曲线下的面积(AUC)

a.在非参数假设下

b.零假设：实面积＝0.5

表4.接受者操作特征曲线分析结肠癌病人及正常人血浆中COL6A3的表达水平

^a最小界限值是最小观测检验值减1，最大界限值是最大观测检验值加1。所有其它的界限值都是两个邻近的观测检验值的平均值。

Claims (2)

1.人结肠癌标志物COL6A3在用于制备诊断或预测结肠癌临床分期、结肠癌患者预后的制剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的标志物COL6A3在制备诊断或预测结肠癌临床分期、结肠癌患者预后的试剂盒中的应用。