CN113599521A - 一种Circ-COL6A3-6401抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
一种Circ-COL6A3-6401抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程抗体药物研制领域，涉及一种Circ‑COL6A3‑6401抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，具体涉及了一种环状RNA Circ‑COL6A3‑6401核酸分子及其表达的蛋白Circ‑COL6A3‑20KD的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。尤其是针对Circ‑COL6A3‑20KD设计了多克隆抗体Anti‑Circ‑COL6A3，其能够特异性的检测细胞内源性环状RNA Circ‑COL6A3编码的蛋白质的含量，同时可以显著抑制大肠癌细胞的侵袭迁移，该多克隆抗体在肿瘤的临床检测及侵袭迁移治疗中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程抗体药物研制领域，涉及一种Circ-COL6A3-6401抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
近年来随着基因检测技术的完善及创新，非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)作为一种新型基因表达调控方式受到国内外广泛关注。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类大量存在于真核细胞中，由特殊的可变剪切机制形成环形结构的非编码RNA分子(non-coding RNA，ncRNA)。与传统线性RNA不同，circRNA不受RNA外切酶影响，在各物种间具有高度保守性。虽然circRNA通常在低水平表达，但是其在机体多种病理生理过程中发挥着重要的作用。近期研究发现，circRNA表达异常与肿瘤的发生发展密切相关，例如，circRNA_102171通过与CTNNBIP1相互作用激活Wnt/β-catenin通路从而促进甲状腺癌的进展；在非肿瘤细胞中表达较高的circ-Foxo3，通过CDK2促细胞分裂的作用，阻碍细胞周期的进展；circRNA cSMARCA5通过充当miR-17-3p和miR-181b-5p的“海绵”促进肿瘤抑制因子TIMP3的表达，进而抑制肝癌细胞的增值和迁移。由于不含有大部分mRNA翻译所必需的5’帽结构，长期以来circRNA被认为是一种非编码RNA。而近年来研究发现，circRNA在应激等某些特殊情况下，可作为蛋白合成模版编码并翻译蛋白。越来越多的研究也证实circRNA来源的蛋白在细胞应激、肌形成以及肿瘤增殖过程中发挥重要的生物学功能。COL6A3(Collagen type VIalpha 3chain)是位于染色体16q22.1一种肿瘤抑制基因，是VI型胶原蛋白三条α链的编码基因之一。已有研究表明COL6A3与肌张力障碍、结直肠癌、胰腺癌等疾病有关。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，从而制造出一种可以抑制肿瘤药物，一种Circ-COL6A3-6401抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述Circ-COL6A3-6401抑制剂为Circ-COL6A3-6401核酸片段抑制剂或者Circ-COL6A3-20KD肽段抑制剂，其中Circ-COL6A3-6401核酸片段的序列如SEQ ID NO:1所示；所述的Circ-COL6A3-20KD肽段的序列如SEQ ID NO:2所示。
作为优选：所述Circ-COL6A3-6401核酸片段抑制剂为核酸效应分子；所述核酸效应分子为DNA、RNA、PNA或DNA-RNA-杂合体；所述核酸效应分子抑制Circ-COL6A3-6401整体或局部的表达；所述的核酸效应分子选自siRNA，dsRNA，miRNA，核酶，以及shRNA中一种；所述的Circ-COL6A3-6401核酸片段抑制剂针对核酸序列SEQ ID NO:9而设计获得；所述Circ-COL6A3-6401核酸片段抑制剂为siRNA；所述的抑制剂系针对于Circ-COL6A3-6401环状接口而设计；更优选地，针对Circ-COL6A3-6401第713位至第20位中的任意跨越接口的序列片段而设计；所述序列片段优选18个碱基以上的长度，至少与Circ-COL6A3-6401第744位至17位的序列互补；所述的抑制剂系针对于Circ-COL6A3-6401的以下关键片段中的一个而设计，所述的siRNA选自SEQ ID NO:6-8中的任意一条；所述的Circ-COL6A3-20KD肽段抑制剂为抗体及其功能性片段、或小分子化合物。
作为优选：所述的Circ-COL6A3-20KD肽段抑制剂为抗体；该抗体是针对氨基酸序列SEQ ID NO:3的抗体；所述抗体是以SEQ ID NO:3作为免疫原制备单克隆抗体而得。
作为优选：所述肿瘤为COL6A3突变的肿瘤；该COL6A3突变的肿瘤为表达环状Circ-COL6A3-6401并翻译相应蛋白的肿瘤；其表达环状Circ-COL6A3-6401并翻译相应蛋白的肿瘤为:结肠癌。
一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物为Circ-COL6A3-6401抑制剂，该Circ-COL6A3-6401抑制剂包含权2中的Circ-COL6A3-6401核酸片段抑制剂和权3中的Circ-COL6A3-20KD肽段抑制剂以及药学上可接受的载体。
作为优选：所述肿瘤为COL6A3突变的肿瘤；该COL6A3突变的肿瘤为表达环状Circ-COL6A3-6401并翻译相应蛋白的肿瘤；其表达环状Circ-COL6A3-6401并翻译相应蛋白的肿瘤为:结肠癌。
一种用于肿瘤诊断和/或预后判断的试剂盒，所述试剂盒中含有Circ-COL6A3-6401的检测试剂，该检测试剂用于扩增权2中Circ-COL6A3-6401的引物或者抗权3中Circ-COL6A3-20KD蛋白的抗体；
作为优选：所述该试剂盒可用于判断肿瘤为COL6A3突变的肿瘤；该COL6A3突变的肿瘤为表达环状Circ-COL6A3-6401并翻译相应蛋白的肿瘤；其表达环状Circ-COL6A3-6401并翻译相应蛋白的肿瘤为:结肠癌。
本发明的有有益效果:
1.本发明首次在肿瘤细胞中发现了COL6A3的一种环化模式的变异体，Circ-COL6A3-6401，以及其表达的蛋白Circ-COL6A3-20KD，并发现了抑制Circ-COL6A3-6401或Circ-COL6A3-20KD可以实现对肿瘤的抑制。为肿瘤的诊断提供了新的标志物，同时，为肿瘤的治疗提供了新的靶点。
2.本发明设计合成了抗Circ-CDH1-28KD的抗体，其可以有效的抑制肿瘤细胞的增长。
附图说明
图1COL6A3环状RNA形成模式图；
图2COL6A3环状RNA测序鉴定结果；
图3结肠癌以及正常组织中Circ-COL6A3-6401的表达；
图4COL6A3环状RNA翻译小分子蛋白模式图；
图5Western blot检测细胞Circ-COL6A3-20KD蛋白存在；
图6克隆形成实验检测多克隆抗体anti-COL6A3-28抗肿瘤效果；
图7细胞划痕实验检测多克隆抗体anti-COL6A3-28抗肿瘤效果；
图8结肠癌以及正常组织中Circ-COL6A3-20KD的表达。
具体实施方式
Circ-COL6A3-6401抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步地，所述的Circ-COL6A3-6401抑制剂为Circ-COL6A3-6401核酸片段抑制剂或者Circ-COL6A3-20KD肽段抑制剂。
非显而易见地，发明人在结肠癌组织及细胞系SW480及SW620中识别发现了一种环化模式的COL6A3变异体，此环化模式的变异体是由COL6A3基因的第2、3、4外显子通过首尾环化形成，由761个核苷酸组成。我们命名Circ-COL6A3-6401(见图1)，具体地，所述的Circ-COL6A3-6401核酸片段的序列如SEQ ID NO:1所示，其circBase ID名为:hsa_circ_0006401。通过sanger DNA测序的方法鉴定了环状RNA的准确环化接口(见图2)。COL6A3形成环状RNA分子后，形成一个完整的开放阅读框，编码198个氨基酸，蛋白分子量约20KD，我们命名Circ-COL6A3-20KD(见图3)，具体地，所述的Circ-COL6A3-20KD肽段的序列如SEQ IDNO:2所示。
虽然，已经报道了多种肿瘤与COL6A3基因的突变有关，但是，此前，从未有人发现该环状RNA Circ-COL6A3-6401，及其表达的蛋白的存在。更未见人报道Circ-COL6A3的基因与结肠癌有关。令人惊喜的是，发明人通过制备特异性的抗Circ-COL6A3-20KD的多克隆抗体anti-COL6A3-28或者是siRNA干扰Circ-COL6A3-6401，结果发现该抗体或siRNA可以显著地抑制肿瘤细胞的增长，表明了抑制该环状RNA或其表达的蛋白可以抑制肿瘤的增长。
该Circ-COL6A3-6401是由COL6A3基因的第2、3、4外显子通过首尾环化形成，由761个核苷酸组成。而COL6A3基因在多种肿瘤中均有转录。在这些转录COL6A3基因的肿瘤中，均有可能产生Circ-COL6A3-6401。
其中，所述的Circ-COL6A3-6401核酸片段抑制剂为抑制Circ-COL6A3-6401核酸片段整体的或局部表达的物质。
作为一种可选的实施方案，所述的核酸效应分子为DNA、RNA、PNA或DNA-RNA-杂合体。所述核酸效应分子可以是单链的或双链的。可以使用衍生自逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒或痘苗病毒或者衍生自各种细菌质粒的表达载体来将核苷酸序列递送至所靶器官、组织或细胞群。可以使用这样的构建体来将不可翻译的正义或反义序列引入到细胞中。甚至在不存在整合到DNA中的情况下，此类载体也可以继续转录RNA分子直至它们由于内源核酸酶而丧失能力。
所述核酸效应分子可以选自能够抑制Circ-COL6A3-6401表达的小的抑制核酸分子，例如短干扰RNA(siRNA)，双链RNA(dsRNA)，microRNA(miRNA)，核酶，以及小发夹RNA(shRNA)，这些都能减弱或消除Circ-COL6A3-6401和/或Circ-COL6A3-20KD肽段的表达。
这些小的抑制核酸分子可能包括第一、第二链，二者杂交彼此形成一个或多个双链区，每条链大约18～28个核苷酸的长度，大约18～23个核苷酸的长度，或者18，19，20，21，22个核苷酸的长度。另外，单链也可能包含能够相互杂交形成双链的区域，例如在shRNA分子中。
这些小的抑制核酸分子在保持这种减弱或消除Circ-COL6A3-6401和/或Circ-COL6A3-20KD肽段的表达的能力时，可能包括修饰性核苷酸。修饰性核苷酸可用于改善体外或体内特性，如稳定性、活性和/或生物利用度。举个例子，这些修饰性核苷酸可能含有脱氧核苷酸、2’-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸、4’-三核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸和/或2’-O-甲氧乙基核苷酸等。小的抑制核酸分子，如短干扰RNA(siRNA)，也可能含有5’-和/或3’-帽结构，以此来防止核酸外切酶对其降解。
在一些实施例中，小抑制核酸分子组成的双链核酸含有两端钝、或悬垂的核苷酸。其他核苷酸可能包括会导致错位、凸起、循环、或摆动碱基对的核苷酸。小抑制核酸分子可以设计配方以便施用，例如，通过脂质体包裹，或掺入其他载体(如可生物降解聚合物水凝胶，或环糊精)。
所述的Circ-COL6A3-6401核酸片段抑制剂针对核酸序列SEQ ID NO:9而设计获得。
在一些实施例中，所述的Circ-COL6A3-6401核酸片段抑制剂为siRNA。作为优选的实施方式，所述的抑制剂系针对于Circ-COL6A3-6401环状接口而设计；优选地，针对Circ-COL6A3-6401第741位至第20位中的任意跨越接口的序列片段而设计，所述序列片段优选18个碱基以上的长度，至少与Circ-COL6A3-6401第741位至17位的序列互补；更优选地，所述的抑制剂系针对于Circ-COL6A3-6401的以下关键片段中的一个而设计，或者可选地与Circ-COL6A3-6401的以下序列互补:Circ-COL6A3-6401第749位至第8位的片段互补，又或者Circ-COL6A3-73第756位至第16位的片段互补；优选与Circ-COL6A3-6401第755位至第15位的片段互补。在一些优选的实施例中，其选自SEQ ID NO:6-8中的任意一条。
其中，所述的Circ-COL6A3-20KD肽段抑制剂为抗体及其功能性片段、或小分子化合物。作为优选的实施方式，所述的Circ-COL6A3-20KD肽段抑制剂为抗体。所述的抗体可以为单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段(例如，Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子)。所述抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类型的。所述抗体可以以具有或没有修饰的形式进行使用，并且可以共价地或非共价地进行标记，用例如报道基团或效应基团。
根据本发明的“抗体片段”呈现与相应的抗体基本上相同的表位结合位点，和/或具有与相应的抗体实质上相同的Circ-COL6A3-20KD肽段抑制活性。
用于产生本发明的抗体的方法是本领域技术人员已知的。
在一些实施例中，所述的抗体是针对TEMFRITLLQVLHPTQC(SEQ ID NO:3)氨基酸序列设计获得；是以多肽TEMFRITLLQVLHPTQC(SEQ ID NO:3)作为免疫原制备单克隆抗体而得。通过肿瘤细胞划痕实验和细胞侵袭分析，表明本发明的抗体anti-COL6A3-20KD能很好抑制结肠癌细胞的增殖、迁移，结果参见图6、图7。
另一方面，本发明还提供了Circ-COL6A3-6401核酸片段和/或Circ-COL6A3-20KD肽段的检测试剂在制备癌症筛选/诊断/预测/预后诊断剂或诊断系统中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种结肠癌治疗系统，该系统包括1)Circ-COL6A3-6401和/或Circ-COL6A3-20KD检测系统；2)用药系统；其中，所述的检测系统为现有技术中可以检测环状RNA和其表达的肽段的检测系统，如荧光定量PCR和/或免疫组化。该检测系统用于检测Circ-COL6A3-6401和/或Circ-COL6A3-28KD是否存在，如果存在，则接下来可以实施用药系统。其中，所述的用药系统含有Circ-COL6A3-6401核酸片段和/或Circ-COL6A3-20KD肽段抑制剂。
优选地，所述的Circ-COL6A3-6401核酸片段和/或Circ-COL6A3-20KD肽段抑制剂如上文所述。
另一方面，本发明还提供了一种治疗结肠癌的药物研发方法。该方法为针对Circ-COL6A3-6401核酸片段，设计相应的抑制剂或基因治疗工具；作为优选的实施方式，通过基因干扰、基因编辑、反义核酸序列或锁核酸(LNA)的方式实现。
另一方面，本发明还提供了另一种治疗结肠癌的药物研发方法。该方法为针对Circ-COL6A3-20KD，设计相应的Circ-COL6A3-20KD的活性抑制剂。进一步地，所述的Circ-COL6A3-20KD活性抑制剂为抗体及其功能性片段、或小分子化合物；优选地，所述的Circ-COL6A3-20KD活性抑制剂为抗体。
另一方面，本发明还提供了一种Circ-COL6A3-6401特异性的siRNA。
所述的siRNA系针对于Circ-COL6A3-6401环状接口而设计。优选地，针对Circ-CHD1-6401第741位至第20位中的任意跨越接口的序列片段而设计；所述序列片段优选18个碱基以上的长度，至少与Circ-COL6A3-6401第716位至17位的序列互补。
更优选地，所述的siRNA系针对于Circ-COL6A3-6401的以下关键片段中的一个而设计，作为更优选的实施方式，所述的siRNA选自SEQ ID NO:6-8中的任意一条。
另一方面，本发明还提供了一种多肽，其特征在于序列如SEQ ID NO:3所示。
另一方面，本发明还提供了Circ-COL6A3-6401核酸片段或Circ-COL6A3-20KD肽段，所述的核酸片段的序列如SEQ ID NO:1所示；所述的肽段的序列如SEQ ID NO:2所示。
另一方面，本发明还提供了一种抗Circ-COL6A3-20KD的抗体。其采用如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列作为免疫原制备获得。所述的抗体为多克隆抗体。在本发明的一个实施例中，所述的抗体是针对TEMFRITLLQVLHPTQC(SEQ ID NO:3)作为免疫原制备的单克隆抗体而得命名为anti-COL6A3-20KD。
另一方面，本发明还提供了一种用于肿瘤诊断和/或预后判断的试剂盒，所述试剂盒含有:用于扩增Circ-COL6A3-6401的引物，或者抗Circ-COL6A3-28KD蛋白的抗体。
另一方面，本发明还提供了一种用于肿瘤诊断和/或预后判断的系统，其含有以下构件:
a.Circ-COL6A3-6401的检测构件；
b.结果判断构件；所述的结果判断构件用于根据检测构件所检测的Circ-COL6A3-6401的表达量判断结肠癌的患病风险或者预后风险；
若Circ-COL6A3-6401的表达量高，则判断高风险；反之则低风险。
作为一种可实施的方式，Circ-COL6A3-6401的表达量的高低可依据组化评分来划分。
作为一种具体的组化评分方法，其步骤为:由至少两位病理科医生，在双盲条件下(不知晓任何相关临床及病理资料)各自独立判断免疫组化结果。
结果的判断:使用Bresalier半定量评分公式评估染色结果。从每个切片中随机选择十个视图，并对细胞染色强度进行如下评分：阴性细胞(-)没有颜色(0)；呈黄色的弱阳性细胞(+)(1)；中度阳性细胞(++)为浅棕色(2)；阳性细胞(+++)被识别为深棕色(3)。在每个视场中，对具有每种染色强度的细胞计数进行计数，并根据以下公式计算每个切片的平均染色强度：强度评分∑[(0×F0)+(1×F1)+(2×F2)+(3×F3)]，其中F＝％×10个视野。使用Student t检验分析组之间的差异，P<0.05被认为具有统计学意义。
所述的Circ-COL6A3-6401的检测构件含有Circ-COL6A3-6401检测试剂；优选地，所述的Circ-COL6A3-6401的检测试剂为用于扩增Circ-COL6A3-6401的引物，或者抗Circ-COL6A3-20KD蛋白的抗体。
所述的Circ-COL6A3-6401的表达量为环状RNA的量或者其表达的蛋白Circ-COL6A3-20KD的量；
所述的Circ-COL6A3-6401具有SEQ ID NO:1所示的核酸序列；优选地，所述的Circ-COL6A3-20KD具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
本发明中，所述的肿瘤为COL6A3突变的肿瘤类型；具体地，所述的COL6A3突变的肿瘤为表达环状Circ-COL6A3-6401并翻译相应蛋白的肿瘤；更具体地，所述的表达环状Circ-COL6A3-6401并翻译相应蛋白肿瘤包括但不限于:结肠癌、肝癌，乳腺癌，胰腺癌、结肠癌、胃癌等中的一种或多种；特别优选地，所述的肿瘤为结肠癌。
具体实施：实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
需要说明的是:本发明中，所述的Circ-COL6A3-6401具指环状RNA Circ-COL6A3-6401核酸片段，也指该环状RNA翻译的肽段Circ-COL6A3-20KD。
目前，已被公开报道的一种Circ-CDH-6401核酸片段为COL6A3基因第2到4外显子通过首尾连接形成闭合的环形RNA分子，长度为761nt。Circ-COL6A3-6401核酸片段表达产物为Circ-COL6A3-20KD肽段。当然，不能排除的可能性是，后续会发现其他变异体形式的Circ-CDH-6401，执行着类似的机制。根据本发明的理念，这些变异体形式的针对性的抑制、调节、检测应用等，也同样是本发明的保护范围。
Circ-COL6A3-6401抑制剂为至少部分引起环状RNA Circ-COL6A3-6401的遗传信息路径阻断的物质或工具，可以在蛋白质水平(Circ-COL6A3-20KD肽段)抑制，也可以在核酸水平(Circ-COL6A3-6401核酸片段)抑制。蛋白质水平起作用的抑制剂可以选自抗体和/或小分子化合物等。在核酸水平起作用的抑制剂例如反义分子，RNAi分子和/或核酶。
实施例1 COL6A3环状RNA形成及DNA测序鉴定
通过UCSC(http://genome.ucsc.edu/)在线数据库软件分析发现COL6A3基因定位于人的第2号染色体长臂chr2(q37.3)区域，基因组跨越3083bp；根据环状RNA权威数据库circBase(http://circrna.org/)收录的COL6A3环状RNA信息，发现COL6A3基因的第2到4外显子通过首尾连接形成闭合的环形RNA分子，长度为761nt，命名Circ-COL6A3-6401(见图1)，其含有SEQ ID NO:1所示的序列；通过在环状RNA连接位点两侧设计PCR扩增引物，扩增环状RNA的环化位点两翼的序列，经过sangerDNA测序的方法，获得了Circ-COL6A3-6401环状RNA的准确环化位点。设计特异性PCR扩增Circ-COL6A3-6401的PCR引物序列如下:
SEQ ID NO:4
F1:5'TGGCTCTCACTGAAACAGAAATG 3'，
SEQ ID NO:5
R1:5'GTCGTCACTGGGTTGGATGTAG3'
使用RNeasy mini试剂盒根据制造商的说明从SGC7901和BGC823细胞裂解物中分离总RNA。然后在互补的DNA合成之前，在抗RNA酶的存在下用DNase I处理总RNA，以去除DNA污染。用随机引物和禽成纤维细胞病病毒逆转录酶(Promega)合成互补DNA。根据制造商的协议，使用ABI Prism 7500序列检测器进行实时PCR(Power SYBR-Green，ABI，英国沃灵顿)分析。PCR产物经过纯化后做sanger DNA序列测定。通过sanger DNA测序的方法鉴定了环状RNA的准确环化接口(见图2)。PCR检测结肠癌及癌旁组织中Circ-COL6A3-6401的表达(见图3)。
实施例2
COL6A3环状RNA翻译小分子蛋白的预测识别及小鼠单克隆抗体制备通过对Circ-COL6A3-6401环状RNA分子的核苷酸序列分析发现，RNA发生环化后可以形成一个由ATG-TGA组成的开放阅读框，通过翻译产生一个由254个氨基酸组成的新型的COL6A3小蛋白，通过蛋白质分子量预测软件http://www.bio-soft.net/sms/prot_mw.html
预测蛋白的分子量约20KD，命名Circ-COL6A3-20KD(见图4)，其含有SEQ ID NO:2所示的序列。根据Circ-COL6A3-20KD氨基酸序列的组成，设计能用于Elisa、western blot方法检测以及细胞功能测试的小鼠单克隆抗体:方法如下:通过化学合成多肽的方法，合成特异性针对环状RNA COL6A3产生的多肽TEMFRITLLQVLHPTQC(SEQ ID NO:3)氨基酸序列作为免疫原；多克隆抗体制备采用标准化的制备流程如下:
首先进行多肽偶联，多肽偶联载体蛋白BSA，然后进行兔子免疫方案2.1动物选择：兔子采用新西兰白兔，体重2.5Kg左右青壮年。动物选择毛色要光泽，活动自如的健康动物。挑选好动物，先预养2周左右。目的是淘汰有些不合格的动物，使后期的实验能顺利进行。2.2实验前准备：兔子做好标记。2.3抗原准备：2.3.1将抗原从-20度冰箱中拿出，常温溶解，避免反复冻融。并将注射器做好标记，写上项目号和动物号。2.3.2抽取抗原(抗原完全混匀),首免抗原浓度为1mg/ml,兔子为0.5ml/只，二免-四免抗原浓度减半，剂量不变。2.3.3抽取佐剂，佐剂和抗原为1:1体积比抽取。首免采用完全佐剂，二-四免采用不完全佐剂。抽取时，佐剂要充分混合均匀后再抽入注射器。2.3.4二个注射器用针筒连接管对接后进行完全乳化，乳化标准为：乳化好的免疫原滴入37度水中不分散为合格。2.4免疫：兔子采用多点皮下注射，每点为0.2ml。免疫时间：首免后第14天进行二免，二免到三免间隔时间为7天。兔子三免后第7天耳中动脉采小样血清检测，检测合格，7天后加免，加免完7天后可采集全血。
抗体纯化
将亲和层析柱依次用20mL纯水和1×PBS(pH7.4)，流速70mL/h充分清洗。取待纯化的血清10mL于50mL离心管中，用孔径0.45μm，直径25mm微孔滤膜抽滤。将抽滤过的血清样品以40mL/h流速上样，重复一次。用20mL 1×PBS(pH7.4)以70mL/h的流速清洗柱子，10min后连接蛋白检测仪，清洗过程中调节仪器透光率(T档)示数为100。调节蛋白检测仪吸光率(1A档)示数为0，此时打开电脑桌面的HD-A电脑采集器，并将满屏量程调到5，用甘氨酸溶液(pH2.7，0.2M)以40mL/h的速度洗脱抗体，此时按下绿色的洗脱记录按钮开始洗脱，当仪器的示数开始升高时开始收集抗体。在抗体收集过程中以1M的碳酸氢钠及时调节抗体的pH值至7左右，并记录洗脱峰的最高峰值。抗体收集完后，调节pH值至7左右，并记录洗脱的抗体体积，之后用纯净水冲洗连接收集器的橡胶管。依次用20mL 1×PBS和纯水以70mL/h的速度清洗亲和层析柱，之后加入20％乙醇，封口，4℃冰箱保存。
ELISA检测检测
包板：用包被缓冲液(coating buffer:Na2CO3和NaHCO3缓冲液)将已知抗原稀释至1μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加50μl，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗1次。
封闭：每孔加60μl的1％BSA(TBST配制)进行封闭，置37℃孵育1小时。之后弃封闭液。
加样：加一定稀释的待检样品(把待检样品按照一定的比例进行稀释)，50μl于上述已封闭的反应孔。同时设置好阳性对照孔(阳性血清)与阴性对照孔(BSA)。置37℃孵育1小时，之后弃封闭液，用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗2次。
加酶标抗体：将新鲜稀释的二抗-HRP(1:5K，用1％BSA进行稀释)，以50μl/孔加入酶标板孔中，置37℃孵育45min，之后弃封闭液，用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗3次。
加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μl，置37℃反应5min。
终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸90μl。
读板：将酶标板置于预热过的酶标仪中(450nm)进行读数，保存数据，进行分析。
表1 Elisa测试制备的多克隆抗体
实施例3
Western blot蛋白检测
从培养板上刮下细胞，并以牛血清白蛋白为标准，用BCA法测定细胞裂解液的终蛋白浓度。将等效的细胞提取物(20-40μg蛋白质)在5×十二烷基硫酸钠(SDS)中于95℃煮沸5分钟，在冰上冷却，然后通过10-12％SDS-PAGE分离总蛋白提取物，然后电转移到聚偏二氟乙烯膜上。将一抗HAPM0617(1：1,000)和抗GAPDH(1：1,000，Abcam)抗体在TBST中稀释，并在4℃下与膜一起孵育过夜。在室温下应用适当的二抗(1：1,000，抗兔抗体)1h。通过增强的化学发光使免疫反应蛋白可视化。
实验结果如图5所示:western检测在SW620细胞中Circ-COL6A3-20KD蛋白的表达(NC对照组，P-Circ Circ-COL6A3-6401过表达组)。
实施例4平板克隆形成试验
将500个细胞铺在每孔6孔板上的RPMI-1640/10％FBS中，并在37度的培养箱中培养2周。将克隆用1ml 0.1％结晶紫染色20分钟。通过显微镜评估在10个随机选择的领域中的克隆数目。
实验结果见图6:添加Circ-COL6A3-20KD多克隆抗体后的SW480细胞克隆形成数目减少，提示多克隆抗体对SW480细胞增殖能力的抑制作用。
实施例5细胞划痕试验
划线：先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线铺板：处于对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，接种于6孔培养板；细胞铺板6×105个细胞/孔，确保第二天细胞能够长满，每孔最终的培养基总量2mL；细胞培养37℃、5％CO2培养箱中培养24h。划痕：第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。清洗：PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。拍照：4倍镜下进行拍照，保证划痕居中且垂直，注意背景一致，可按0，6，12，24h时间点取样，拍照(具体时间依实验需要而定)。
实验结果见图7:添加Circ-COL6A3-20KD多克隆抗体后的SW480细胞划痕距离减少，提示多克隆抗体对SW480细胞迁移能力的抑制作用。
实施例6免疫组化
切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行；缓冲液洗3min/2次；为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在Hydrogen Peroxide Block中孵育10-15分钟；缓冲液洗5min/2次；滴加Ultra V Block，在室温下孵育5分钟以封闭非特异性的背景染色。(注：孵育不要超过10分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有5-10％正常羊血清，这一步可以省略。)；缓冲液洗5min/2次；滴加一抗工作液37℃孵育1-2小时。(具体孵育时间和温度由试验者最终决定)；缓冲液洗5min/2次。滴加PrimaryAntibody Enhancer(增强子)，在室温下孵育20分钟。缓冲液洗5min/2次。滴加HRP Polymer(酶标二抗)，在室温下孵育30分钟。免疫组化检测结肠癌组织及癌旁组织中Circ-COL6A3-20KD表达(图8)。
序列表
<110> 浙江省人民医院
<120> 一种Circ-COL6A3-6401抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用
<160> 0
<170> SIPOSeqienceListing 1.0
SEQ ID NO:1
DNA
Homo sapiens
AAATGTTCCG AATAACGTTA CTTCAAGTCC TACATCCAAC CCAGTGACGA CAACGAAGCCGGTGACTACG ACGAAGCCGG TGACCACCAC AACAAAGCCT GTAACCACCA CAACAAAGCC TGTGACTATTATAAATCAGC CATCTGTGAA GCCAGCCGCT GCAAAGCCGG CCCCTGCGAA ACCTGTGGCT GCCAAGCCTGTGGCCACAAA GATGGCCACT GTTAGACCCC CAGTGGCGGT GAAGCCAGCA ACGGCAGCGA AGCCTGTAGCAGCAAAGCCA GCAGCTGTAA GACCCCCCGC TGCTGCTGCT GCAAAACCAG TGGCGACCAA GCCTGAGGTCCCTAGGCCAC AGGCAGCCAA ACCAGCTGCC ACCAAGCCAG CCACCACTAA GCCCATGGTT AAGATGTCCCGTGAAGTCCA GGTGTTTGAG ATAACAGAGA ACAGCGCCAA ACTCCACTGG GAGAGGGCTG AGCCCCCCGGTCCTTATTTT TATGACCTCA CCGTCACCTC AGCCCATGAT CAGTCCCTGG TTCTGAAGCA GAACCTCACGGTCACGGACC GCGTCATTGG AGGCCTGCTC GCTGGGCAGA CATACCATGT GGCTGTGGTC TGCTACCTGAGGTCTCAGGT CAGAGCCACC TACCACGGAA GTTTCAGTAC AAAGAAATCT CAGCCCCCAC CTCCACAGCCAGCAAGGTCA GCTTCTAGTT CAACCATCAA TCTAATGGTG AGCACAGAAC CATTGGCTCT CACTGAAACAG
SEQ ID NO:2
Homo sapiens
MATVRPPVAV KPATAAKPVA AKPAAVRPPA AAAAKPVATK PEVPRPQAAK PAATKPATTKPMVKMSREVQ VFEITENSAK LHWERAEPPG PYFYDLTVTS AHDQSLVLKQ NLTVTDRVIG GLLAGQTYHVAVVCYLRSQV RATYHGSFST KKSQPPPPQP ARSASSSTIN LMVSTEPLAL TETEMFRITL LQVLHPTQ
SEQ ID NO:3
TEMFRITLLQVLHPTQC
SEQ ID NO:4
F1:5'TGGCTCTCACTGAAACAGAAATG 3'，
SEQ ID NO:5
R1:5'GTCGTCACTGGGTTGGATGTAG3'
SEQ ID NO:6
Forward: 5’-3’ CUCUCACUGAAACAGAAAU
Reverse: 5’-3’ GAGAGUGACUUUGUCUUUA
SEQ ID 7
Forward: 5’-3’ UCACUGAAACAGAAAUGUU
Reverse: 5’-3’ AGUGACUUUGUCUUUACAA
SEQ ID 8
Forward: 5’-3’ ACAGAAAUGUUCCGAAUAA
Reverse: 5’-3’UGUCUUUACAAGGCUUAUU
Claims (8)
1.一种Circ-COL6A3-6401抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述Circ-COL6A3-6401抑制剂为Circ-COL6A3-6401核酸片段抑制剂或者Circ-COL6A3-20KD肽段抑制剂，其中Circ-COL6A3-6401核酸片段的序列如SEQ ID NO:1所示；所述的Circ-COL6A3-20KD肽段的序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的Circ-COL6A3-6401抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述Circ-COL6A3-6401核酸片段抑制剂为核酸效应分子；所述核酸效应分子为DNA、RNA、PNA或DNA-RNA-杂合体；所述核酸效应分子抑制Circ-COL6A3-6401整体或局部的表达；所述的核酸效应分子选自siRNA，dsRNA，miRNA，核酶，以及shRNA中一种；
所述的Circ-COL6A3-6401核酸片段抑制剂针对核酸序列SEQ ID NO:9而设计获得；所述Circ-COL6A3-6401核酸片段抑制剂为siRNA；所述的抑制剂系针对于Circ-COL6A3-6401环状接口而设计；更优选地，针对Circ-COL6A3-6401第713位至第20位中的任意跨越接口的序列片段而设计；所述序列片段优选18个碱基以上的长度，至少与Circ-COL6A3-6401第744位至17位的序列互补；所述的抑制剂系针对于Circ-COL6A3-6401的以下关键片段中的一个而设计，所述的siRNA选自SEQ ID NO:6-8中的任意一条；所述的Circ-COL6A3-20KD肽段抑制剂为抗体及其功能性片段、或小分子化合物。
3.根据权利要求1所述的Circ-COL6A3-6401抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述所述的Circ-COL6A3-20KD肽段抑制剂为抗体；该抗体是针对氨基酸序列SEQ IDNO:3的抗体；所述抗体是以SEQ ID NO:3作为免疫原制备单克隆抗体而得。
4.根据权利要求1所述的Circ-COL6A3-6401抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述肿瘤为COL6A3突变的肿瘤；该COL6A3突变的肿瘤为表达环状Circ-COL6A3-6401并翻译相应蛋白的肿瘤；其表达环状Circ-COL6A3-6401并翻译相应蛋白的肿瘤为:结肠癌。
5.一种抗肿瘤药物，其特征在于该抗肿瘤药物为Circ-COL6A3-6401抑制剂，该Circ-COL6A3-6401抑制剂包含权2中的Circ-COL6A3-6401核酸片段抑制剂和权3中的Circ-COL6A3-20KD肽段抑制剂以及药学上可接受的载体。
6.根据权利要求5所述的抗肿瘤药物，其特征在于所述肿瘤为COL6A3突变的肿瘤；该COL6A3突变的肿瘤为表达环状Circ-COL6A3-6401并翻译相应蛋白的肿瘤；其表达环状Circ-COL6A3-6401并翻译相应蛋白的肿瘤为:结肠癌。
7.一种用于肿瘤诊断和/或预后判断的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有Circ-COL6A3-6401的检测试剂，该检测试剂用于扩增权2中Circ-COL6A3-6401的引物或者抗权3中Circ-COL6A3-20KD蛋白的抗体。
8.根据权利要求7所述的用于肿瘤诊断和/或预后判断的试剂盒，其特征在于所述该试剂盒可用于判断肿瘤为COL6A3突变的肿瘤；该COL6A3突变的肿瘤为表达环状Circ-COL6A3-6401并翻译相应蛋白的肿瘤；其表达环状Circ-COL6A3-6401并翻译相应蛋白的肿瘤为:结肠癌。
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