ES2400033T3 - Modulación de la expresión del receptor del factor de crecimiento I similar a la insulina - Google Patents

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Abstract

Oligonucleótido antisentido que comprende de 8 a 80 nucleobases de longitud, comprendiendo dichooligonucleótido un tramo de al menos 8 nucleobases consecutivas que es complementario al menos en un 90% a laSEQ ID NO: 160 y que se dirige a una molécula de ácido nucleico que codifica para un receptor de factor decrecimiento similar a la insulina humano (SEQ ID NO: 97), hibridándose específicamente dicho oligonucleótido condicha molécula de ácido nucleico e inhibiendo la expresión de IGF-IR.

Description

Modulación de la expresión del receptor del factor de crecimiento I similar a la insulina
5 Campo de la invención
La presente descripción da a conocer composiciones y métodos para modular la expresión de un gen de receptor de factor de crecimiento. En particular, la invención se refiere a oligonucleótidos que se hibridan con moléculas de ácido nucleico que codifican para el receptor del factor de crecimiento I similar a la insulina (receptor de IGF-I o IGF-IR). Se muestra a modo de ejemplo en el presente documento que tales oligonucleótidos modulan la proliferación, lo que es relevante para el tratamiento de cáncer y trastornos de la piel proliferativos e inflamatorios. Sin embargo, se entenderá que los oligonucleótidos pueden usarse para cualquier otro estado en el que esté implicado el IGF-IR incluyendo estados inflamatorios.
15 Antecedentes de la invención
Se recogen al final de la descripción detalles bibliográficos de las publicaciones a las que se hace referencia por autor en esta memoria descriptiva.
La referencia a cualquier técnica anterior en esta memoria descriptiva no es, y no debe tomarse como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que esta técnica anterior forma parte del conocimiento general común en cualquier país.
La psoriasis y otros estados similares son trastornos de la piel proliferativos y/o inflamatorios comunes y a menudo
25 alarmantes que afectan o que tienen el potencial de afectar a una proporción significativa de la población. El estado surge a partir de la sobreproliferación de queratinocitos basales en la capa epidérmica de la piel asociada con inflamación en la dermis subyacente. Aunque se ha desarrollado una gama de tratamientos, ninguno es completamente eficaz ni está libre de efectos secundarios adversos. Aunque la causa subyacente de la psoriasis sigue siendo esquiva, existe algo de consenso de opinión en que el estado surge, al menos en parte, a partir de la sobreexpresión de factores de crecimiento locales y su interacción con sus receptores que favorecen la proliferación de queratinocitos mediante receptores de queratinocitos que parecen ser más abundantes durante la psoriasis.
Un grupo importante de factores de crecimiento son los factores de crecimiento similares a la insulina derivados de la piel (IGF) que favorecen la proliferación de queratinocitos. En particular, IGF-1 y IGF-2 son polipéptidos ubicuos
35 cada uno con potentes efectos mitogénicos sobre una amplia gama de células. Las moléculas del tipo de IGF también se conocen como “factores de progresión” que promueven células “competentes” a través de síntesis de ADN. Los IGF actúan a través de un receptor común conocido como receptor de tipo I o IGF-IR, que está unido a tirosina cinasa. Se sintetizan en tejidos mesenquimatosos, incluyendo la dermis, y actúan sobre células adyacentes de origen mesodérmico, endodérmico o ectodérmico. La regulación de su síntesis implica hormona de crecimiento (GH) en el hígado, pero está mal definida en la mayoría de los tejidos (Sara, Physiological Reviews 70: 591-614, 1990).
Proteínas particulares, denominadas proteínas de unión a IGF (IGFBP), parecen estar implicadas en la regulación autocrina/paracrina de la disponibilidad de IGF tisular (Rechler y Brown, Growth Regulation 2: 55-68, 1992). Hasta la
45 fecha se han identificado seis IGFBP. Los efectos exactos de las IGFBP no están claros y los efectos observados in vitro han sido inhibidores o estimuladores dependiendo del método experimental empleado (Clemmons, Growth Regn. 2:80, 1992). Sin embargo, hay algunas pruebas de que determinadas IGFBP están implicadas en el direccionamiento de IGF-I a su receptor de la superficie celular.
La piel, que comprende la epidermis y la dermis subyacente, tiene receptores de GH en fibroblastos dérmicos (Oakes et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 73: 1368-1373, 1992). Los fibroblastos sintetizan IGF-1 así como IGFBP-3, 4, 5 y 6 (Camacho-Hubner et al., J. Biol. Chem. 267: 11949-11956, 1992) que pueden estar implicadas en el direccionamiento de IGF-1 a células adyacentes así como a la epidermis superpuesta. El tipo de célula epidérmica mayoritario, el queratinocito, no sintetiza IGF-I, pero posee receptores de IGF-I y es sensible a IGF-I (Neely et al., J.
55 Inv. Derm. 96: 104, 1991).
En la última década, ha habido muchos informes del uso de oligonucleótidos antisentido para explorar la función génica y en el desarrollo de fármacos basados en ácido nucleico. Los oligonucleótidos antisentido inhiben la traducción del ARNm mediante varios modos alternativos que incluyen la destrucción del ARNm diana a través del reclutamiento de ARNasa H, o interferencia con el procesamiento del ARN, la exportación nuclear, el plegamiento o la exploración ribosómica. Más recientemente, un mejor entendimiento de los sitios de acción intracelulares de las diversas modalidades antisentido y mejoras en la química de oligonucleótidos han aumentado el número de informes de inhibición de la expresión validada.
65 En el trabajo que condujo a la presente invención, los inventores se centraron en el uso del enfoque antisentido para inhibir el crecimiento de queratinocitos epidérmicos humanos, particularmente en trastornos de crecimiento epidérmicos humanos tales como psoriasis. La psoriasis es un estado de la piel común y desfigurante asociado a hiperplasia epidérmica grave. Las terapias existentes para la psoriasis son sólo parcialmente eficaces, sin embargo, tratamientos dirigidos a la epidermis han demostrado ser prometedores (Jensen et al., Br. J. Dermatol. 139: 984-991, 1998; van de Kerkhof, Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol. 11: 2-10, 1998). Una estrategia es desarrollar inhibidores
5 antisentido de la expresión de IGF-IR y usarlos para bloquear la supervivencia y división celular estimulada por IGF-I en la epidermis.
El IGF-IR es un receptor de la superficie celular unido a tirosina cinasa (Ullrich et al., EMBO J. 5: 2503-2512, 1986) que regula la división, transformación y apoptosis celulares en muchos tipos de células (LeRoith et al., Endocr. Rev. 10 16: 143-163, 1995; Rubin y Baserga, Laboratory Investigation 73: 311-331, 1995). Los queratinocitos epidérmicos humanos son altamente sensibles a la activación de IGF-IR (Ristow y Messmer, J. Cell Physiol. 137: 277-284,1988; Neely et al., J. Invest. Dermatol. 96: 104-110, 1991; Wraight et al., J. Invest. Dermatol. 103: 627-631, 1994) y varios estudios apuntan a un importante papel de la activación de IGF-1R en la patogénesis de la psoriasis (Krane et al., J. Invest. Dermatol. 96: 419-424, 1991; Krane et al., J. Exp. Med. 175: 1081-1090, 1992; Ristow, Growth Regul. 3: 12915 137, 1993; Hodak et al., J. Invest. Dermatol. 106: 564-570, 1996; Xu et al., J. Invest. Dermatol. 106: 109-112, 1996; Ristow, Dermatology 195: 213-219, 1997; Wraight et al., J. Invest. Dermatol. 108: 452-456, 1997). El IGF-IR se ha seleccionado como diana previamente por enfoques antisentido en fibroblastos, células hematopoyéticas y células de glioblastoma para investigar su papel en la transformación y la progresión del ciclo celular (Pietrzkowski et al., Mol. Cell Biol. 12: 3883-3889, 1992; Porcu et al., Mol. Cell Biol. 12: 5069-5077, 1992; Reiss et al., Oncogene 7:
20 2243-2248, 1992; Resnicoff et al., Cancer Res. 54: 2218-2222, 1994).
Se ha notificado la identificación de oligonucleótidos de fosforotioato propinilados que pueden reducir los niveles de ARNm de IGF-IR cuando se suministran eficazmente al núcleo del queratinocito (White et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10: 195-203, 2000; Wraight et al., Nat. Biotechnol. 18: 521-526, 2000). Estos oligonucleótidos también
25 eran eficaces en la reducción de la unión a IGF-I, la activación del receptor y la proliferación celular in vitro y la proliferación epidérmica in vivo (Wraight et al., 2000, citado anteriormente).
Se seleccionaron oligonucleótidos de fosforotioato modificados con propino (Flanagan et al., Nat. Biotechnol. 14: 1139-1145, 1996b; Flanagan y Wagner, Mol. Cell Biochem. 172: 213-225,1997) porque su afinidad aumentada por el
30 ARNm diana permite la inhibición del ARNm con concentraciones inferiores (Wagner et al., 1993, citado anteriormente) y su longitud de oligonucleótido más corta (Flanagan et al., Nucleic Acids Res. 24: 2936-2941, 1996a) que fosforotioatos no modificados, reduciendo teóricamente la incidencia de efectos aptaméricos sobre células diana.
35 Aunque se ha demostrado éxito con los oligonucleótidos de fosforotioato modificados con propino, es necesario considerar químicas alternativas para reducir la toxicidad, aumentar la estabilidad, aumentar el perfil de especificidad, mejorar la penetración y/o intensificar la potencia y las propiedades biológicas, químicas o físicas. Oligonucleótidos de químicas alternativas también pueden proporcionar otras ventajas incluyendo fabricación a gran escala conocida, conocimiento del desarrollo clínico en seres humanos y/o aprobación conocida como fármacos.
Sumario de la invención
A lo largo de toda esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra “comprenden”,
o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, se entenderá que implica la inclusión de un elemento o
45 número entero o grupo de elementos o de números enteros establecidos pero no la exclusión de cualquier otro elemento o número entero o grupo de elementos o de números enteros.
Se hace referencia a secuencias de nucleótidos y aminoácidos mediante una número identificador de secuencia (SEQ ID NO:). Los SEQ ID NO: corresponden numéricamente a los identificadores de secuencia <400>1 (SEQ ID
50 NO:1), <400>2 (SEQ ID NO:2), etc. Se proporciona un resumen de los identificadores de secuencia en la tabla 1. Se proporciona una lista de secuencias tras las reivindicaciones.
La presente invención se refiere a oligonucleótidos que se dirigen al receptor del factor de crecimiento I similar a la insulina humano (IGF-IR) y que inhiben la expresión de IGF-IR. También se proporcionan composiciones 55 farmacéuticas que comprenden los oligonucleótidos de la invención. Se dan a conocer métodos de selección de moduladores de la expresión génica de IGF-IR y métodos de modulación de la expresión del gen de IGF-IR en células, tejidos o animales que comprenden poner en contacto dichas células, tejidos o animales con uno o más de los compuestos o las composiciones dadas a conocer en el presente documento. También se exponen en el presente documento métodos de tratamiento de un animal, particularmente un ser humano, que se sospecha que 60 tiene o que es propenso a una enfermedad o estado asociado con la expresión de IGF-IR o su ligando, IGF-I. Tales métodos comprenden administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de los oligonucleótidos o las composiciones de la invención a la persona que necesita el tratamiento. La invención proporciona el uso de un oligonucleótido de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar a un animal que tiene una enfermedad, estado o trastorno asociado con IGF-IR, en el que dicho oligonucleótido inhibe la
65 expresión de IGF-IR.
También se proporciona un oligonucleótido de la invención para su uso en el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad, estado o trastorno asociado con IGF-IR, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión de IGF-IR.
Los oligonucleótidos de la presente invención se denominan en el presente documento oligonucleótidos antisentido 5 o ASO. Los ASO a los que se hace referencia en la memoria descriptiva objeto se enumeran en la tabla 1. Los ASO se identifican mediante un número “ISIS” así como por un número de SEQ ID. Los ASO de la presente invención se basan en las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 125 y 160.
Otros ASO incluyen ISIS 175308 (SEQ ID NO: 116), ISIS 175302 (SEQ ID NO: 110), ISIS 175314 (SEQ ID NO: 10 122), ISIS 175307 (SEQ ID NO: 115) e ISIS 175323 (SEQ ID NO: 131).
Otro grupo de ASO incluye ISIS 323744 (SEQ ID NO: 50), ISIS 323747 (SEQ ID NO: 53), ISIS 323767 (SEQ ID NO: 73), ISIS 323762 (SEQ ID NO: 68) e ISIS 323737 (SEQ ID NO: 43).
15 El ASO preferido es ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125).
Tabla 1 Resumen de moléculas de ácido nucleico
N.º de ISIS
REGIÓN SEQ ID NO DIANA SITIO DIANA SECUENCIA/DESCRIPCIÓN % de inhib. SEQ ID NO
323695
UTR en 5’ NM_000875.2 25 CCTTTTATTTGGGATGAAAT 50 1
323696
Codón de inicio NM_000875.2 37 CCAGACTTCATTCCTTTTAT 44 2
323697
Codificante NM_000875.2 157 TGATAGTCGTTGCGGATGTC 73 3
323698
Codificante NM_000875.2 162 GCTGCTGATAGTCGTTGCGG 72 4
323699
Codificante NM_000875.2 167 CTTCAGCTGCTGATAGTCGT 74 5
323700
Codificante NM_0008752 196 CCCTCGATCACCGTGCAGTT 56 6
323701
Codificante NM_000875.2 223 TTGGAGATGAGCAGGATGTG 65 7
323702
Codificante NM_000875.2 228 CGGCCTTGGAGATGAGCAGG 66 8
323703
Codificante NM_000875.2 233 GTCCTCGGCCTTGGAGATGA 71 9
323704
Codificante NM_000875.2 238 CGGTAGTCCTCGGCCTTGGA 71 10
323705
Codificante NM_000875.2 367 TTGTAGAAGAGTTTCCAGCC 52 11
323706
Codificante NM_000875.2 396 TGGTCATCTCGAAGATGACC 5 12
323707
Codificante NM_000875.2 401 GAGATTGGTCATCTCGAAGA 20 13
323708
Codificante NM_000875.2 406 TCCTTGAGATTGGTCATCTC 41 14
323709
Codificante NM_000875.2 411 CAATATCCTTGAGATTGGTC 29 15
323710
Codificante NM_000875.2 416 AAGCCCAATATCCTTGAGAT 43 16
323711
Codificante NM_000875.2 443 CCCCCGAGTAATGTTCCTCA 41 17
323712
Codificante NM_000875.2 459 TCTCAATCCTGATGGCCCCC 56 18
323713
Codificante NM_000875.2 527 GTTATTGGACACCGCATCCA 31 19
323714
Codificante NM_000875.2 532 ATGTAGTTATTGGACACCGC 64 20
323715
Codificante NM_000875.2 537 CCACAATGTAGTTATTGGAC 65 21
323716
Codificante NM_000875.2 571 CACAGGTCCCCACATTCCTT 42 22
323717
Codificante NM_000875.2 576 CTGGACACAGGTCCCCACAT 45 23
323718
Codificante NM_000875.2 616 ATGGTGGTCTTCTCACACAT 69 24
323719
Codificante NM_000875.2 621 TGTTGATGGTGGTCTTCTCA 66 25
323720
Codificante NM_000875.2 626 CTCATTGTTGATGGTGGTCT 81 26
323721
Codificante NM_000875.2 632 GTTGTACTCATTGTTGATGG 73 27
323722
Codificante NM_000875.2 637 CGGTAGTTGTACTCATTGTT 71 28
323723
Codificante NM_000875.2 642 AGCAGCGGTAGTTGTACTCA 70 29
323724
Codificante NM_000875.2 647 GGTCCAGCAGCGGTAGTTGT 60 30
323725
Codificante NM_000875.2 652 TTTGTGGTCCAGCAGCGGTA 67 31
323726
Codificante NM_000875.2 674 TGGGCACATTTTCTGGCAGC 57 32
323727
Codificante NM_000875.2 1283 GGAGTAATTCCCTTCTAGCT 21 33
323728
Codificante NM_000875.2 1324 TCCCACAGTTGCTGCAAGTT 73 34
323729
Codificante NM_000875.2 1678 ATGTTCCAGCTGTTGGAGCC 72 35
323730
Codificante NM_000875.2 1683 CCACCATGTTCCAGCTGTTG 78 36
323731
Codificante NM_000875.2 1750 GTCCAGGGCTTCAGCCCATG 74 37
323732
Codificante NM_000875.2 1786 GTGAGGGTCACAGCCTTGAC 59 38
323733
Codificante NM_000875.2 1791 CCATGGTGAGGGTCACAGCC 78 39
323734
Codificante NM_000875.2 1846 TTGGTGCGAATGTACAAGAT 61 40
323735
Codificante NM_000875.2 2029 ATTTTGTCTTTGGAGCAGTA 65 41
323736
Codificante NM_000875.2 2203 AGGAAATTCTCAAAGACTTT 43 42
323737
Codificante NM_000875.2 2290 CTGCTTCGGCTGGACATGGT 84 43
323738
Codificante NM_000875.2 2295 TGTTCCTGCTTCGGCTGGAC 76 44
323739
Codificante NM_000875.2 2368 CTGCTCTCAAAGAAAGGGTA 58 45
323740
Codificante NM_000875.2 2373 CCACTCTGCTCTCAAAGAAA 0 46
323741
Codificante NM_000875.2 2378 GTTATCCACTCTGCTCTCAA 57 47
323742
Codificante NM_000875.2 2383 TCCTTGTTATCCACTCTGCT 58 48
323743
Codificante NM_000875.2 2446 TTGCAGCTGTGGATATCGAT 53 49
323744
Codificante NM_000875.2 2451 CGTGCTTGCAGCTGTGGATA 85 50
323745
Codificante NM_000875.2 2456 AGCCTCGTGGTTGCAGCTGT 75 51
323746
Codificante NM_000875.2 2461 TTCTCAGCCTCGTGGTTGCA 62 52
323747
Codificante NM_000875.2 2466 CCAGCTTCTCAGCCTCGTGG 85 53
323748
Codificante NM_000875.2 2471 GCAGCCCAGCTTCTCAGCCT 77 54
323749
Codificante NM_000975.2 2476 GCGCTGCAGCCCAGCTTCTC 71 55
323750
Codificante NM_000875.2 2578 TTTAAAAAGATGGAGTTTTC 8 56
323751
Codificante NM_000875.2 2583 GCCACTTTAAAAAGATGGAG 77 57
323752
Codificante NM_000875.2 2677 TCCTGTCTGGACACACATTC 66 58
323753
Codificante NM_000875.2 2791 AAGAACACAGGATCTGTCCA 38 59
323754
Codificante NM_000875.2 2796 CATAGAAGAACACAGGATCT 33 60
323755
Codificante NM_000875.2 2992 GGAACGTACACATCAGCAGC 36 61
323756
Codificante NM_000875.2 3076 ACTCCTTCATAGACCATCCC 26 62
323757
Codificante NM_000875.2 3301 CGGAGATAACTTTTGAGATC 35 63
323758
Codificante NM_000875.2 3306 GAGACCGGAGATAACTTTTG 29 64
323759
Codificante NM_000875.2 3478 ATTTTGACTGTGAAATCTTC 13 65
323760
Codificante NM_000875.2 3643 GCGATCTCCCAGAGGACGAC 72 66
323761
Codificante NM_000875.2 3870 TGTAGTAGAAGGAGACCTCC 26 67
323762
Codificante NM_000875.2 4000 GCCTTGTGTCCTGAGTGTCT 84 68
323763
Codón de terminación NM_000875.2 4139 ATCCAAGGATCAGCAGGTCG 69 69
323764
UTR en 3’ NM_000875.2 4329 GCTGCTTGCATATTGAAAAA 77 70
323765
UTR en 3’ NM_000875.2 4334 AAAAAGCTGCTTGCATATTG 74 71
323766
UTR en 3’ NM_000875.2 4366 GCCCATGTCAGTTAAGGGTT 69 72
323767
UTR en 3’ NM_000875.2 4822 CCAGCGTGTCTCTCAAATGG 84 73
323768
Intrón NT_035325.2 62268 GGAGTTTAAAGGACAGTGCC 59 74
323769
Exón: Unión del intrón NT_035325.2 280527 CATCACTGACCTCTTTCTAT 0 75
IG-IR 5’ (M69229)
secuencia no traducida en 5’ de IGF-IR humano 76
IGF-IR (NM0008 75)
secuencia de nucleótidos que codifica para IGF-IR humano 77
DT1064
secuencia de nucleótidos que codifica para el compuesto de partida de C5 propino de IGF-IR CAC AGU UGC UGC AAG DT10642 78
13920
oligonucleótido antisentido control para H-ras humana 79
18078
oligonucleótido antisentido control para JNK humana 80
15770
oligonucleótido antisentido control para c-raf de ratón y rata 81
161212
cebador de PCR para hIGF-RI 82
161214
cebador de PCR para hIGF-RI 83
161215
cebador de PCR para hIGF-RI 84
129692
ASO control negativo 85
121691
ASO control negativo 86
122291
ASO control negativo 87
R451
ASO usado para estudio de localización 88
251741
ASO usado para estudio de localización 89
13920
ASO usado para estudio de localización 90
147979
ASO usado para estudio de localización 91
hebra sentido a modo de ejemplo
92
hebra antisentido a modo de ejemplo
93
cebador de PCR para hGAPDH
94
cebador de PCR para hGAPDH
95
sonda de de PCR para hGAPDH
96
Secuencia de nucleótidos de IGF-IR con regiones no traducidas en 3’ y 5’
97
18078
ASO control negativo 98
298948
ASO control negativo 99
175292
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 930 agtctcaaactcagtcttcg 78 100
175293
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 42 gttaatgcttgaaacaaga 40 101
175294
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 558 gaagtccgggtcacaggcga 77 102
175295
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 29 aacaagagccccagcctcgc 76 103
175296
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 38 atgctggtaaacaagagccc 57 104
175297
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 37 tgctggtaaacaagagcccc 61 105
175298
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 516 ggagtcaaatgaatgagcg 74 106
175299
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 665 aatctgcctaggcgaggaaa 78 107
175300
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 36 gctggtaaacaagagcccca 54 108
175301
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 671 agcccaaatctgcctaggcg 77 109
175302
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 730 cctccattttcaaacccgga 93 110
175303
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 260 gaaggtcacagccgaggcga 82 111
175304
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 265 tcgctgaaggtcacagccga 76 112
175305
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 410 atccaggacacacacaaagc 81 113
175306
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 557 aagtccgggtcacaggcgag 54 114
175307
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 931 aagtctcaaactcagtcttc 86 115
175308
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 738 gtcgtcggcctccattttca 94 116
175309
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 526 gcagaaacgcggagtcaaaa 72 117
175310
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 429 gcggcgagctccttcccaaa 76 118
175311
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 40 taatgctggtaaacaagagc 53 119
175312
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 723 tttcaaacccggagaggcag 31 120
175313
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 657 taggcgaggaaaaacaagcc 62 121
175314
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 266 ctcgctgaaggtcacagccg 87 122
175315
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 798 gcagcggcccagggctcggc 75 123
175316
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 267 gctcgctgaaggtcacagcc 82 124
175317
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 889 cgaaggaaacaatactccga 84 125
175318
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 523 gaaacgcggagtcaaaatga 68 126
175319
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 884 gaaacaatactccgaagggc 63 127
175320
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 414 ccaaatccaggacacacaca 64 128
175321
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 734 tcggcctccattttcaaacc 78 129
175322
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 554 tccgggtcacaggcgaggcc 67 130
175323
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 508 aatgaatgagcggctccccc 82 131
175324
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 261 tgaaggtcacagccgaggcg 57 132
175325
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 259 aaggtcacagccgaggcgag 55 133
175326
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 415 cccaaatccaggacacacac 74 134
175327
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 933 acaagtctcaaactcagtct 61 135
175328
UTR en 5’ SEQ ID NO: 97 33 ggtaaacaagagccccagcc 64 136
90444
930 cgaagactgagtttgagact 137
90446
558 tcgcctgtgacccggacttc 138
90447
29 gcgaggctggggctcttgtt 139
90448
38 gggctcttgtttaccagcat 140
90449
37 ggggctcttgtttaccagca 141
90450
516 cgctcattcattttgactcc 142
90451
665 tttcctcgcctaggcagatt 143
90452
36 tggggctcttgtttaccagc 144
90453
671 cgcctaggcagamgggct 145
90454
730 tccgggtttgaaaatggagg 146
90455
260 tcgcctcggctgtgaccttc 147
90456
265 tcggctgtgaccttcagcga 148
90457
410 gctttgtgtgtgtcctggat 149
90458
557 ctcgcctgtgacccggactt 150
90459
931 gaagactgagtttgagactt 151
90460
738 tgaaaatggaggccgacgac 152
90461
526 ttttgactccgcgtttctgc 153
90462
429 tttgggaaggagctcgccgc 154
90463
40 gctcttgtttccagcatta 155
90465
657 ggcttgtttttcctcgccta 156
90466
266 cggctgtgaccttcagcgag 157
90467
798 gccgagccctgggccgctgc 158
90468
267 ggctgtgaccttcagcgagc 159
90469
889 tcggagtattgtttccttcg 160
90470
523 tcattttgactccgcgtttc 161
90471
884 gcccttcggagtattgtttc 162
90472
414 tgtgtgtgtcctggatttgg 163
90473
734 ggtttgaaaatggaggccga 164
90474
554 ggcctcgcctgtgacccgga 165
90475
508 gggggagccgctcattcatt 166
90476
261 cgcctcggctgtgaccttca 167
90477
259 ctcgcctcggctgtgacctt 168
90478
415 gtgtgtgtcctggatttggg 169
90479
933 agactgagtttgagacttgt 170
90480
33 ggctggggctcttgtttacc 171
1 ASO, oligonucleótido antisentido
2 Todas las C y U están propinadas en C5
Breve descripción de las figuras
5 La figura 1 es una representación esquemática de una biopsia de piel mantenida ex vivo.
La figura 2 es una representación de (A) la secuencia de nucleótidos de la región del gen de IGF-IR (NM000875 que es una combinación de X04434 y M69229; SEQ ID NO: 77).
10 CARACTERÍSTICAS Ubicación/Calificadores
fuente 1..4989
/organismo = “Homo sapiens”
/dbx_ref = “taxón:9606”
5
/cromosoma = “15”
/mapa = “15q25-q26”
10
/clon = “(lambda)IGF-1-R.85, (lambda)IGF-1-R.76” /tipo_tejido = “placenta”
/lib_clon = “(lamda)gt10”
15
gen 1..4989
/gen = “IGF1R”
20
/nota = “sinónimo: JTK13” /dbx_ref = “LocusID;3480”
/dbx_ref = “MIM:147370”
25
CDS 46..4149
/gen = “IGF1R”
30
/número_EC = “2.7.1.112” /codón_iniciación = 1
/producto = “precursor del receptor de factor de crecimiento 1 similar a insulina”
35
/id_proteína = “NP000866.1”
/dbx_ref = “GI:4557665”
40
/dbx_ref = “LocusID:3480” /dbx_ref = “MIM:147370”
péptido_señ
46..135
45
/gen = “IGF1R”.
péptido_mat
136..2265
50
/gen = “IGF1R” /producto = “cadena alfa del receptor de factor de crecimiento 1 similar a insulina”
característica_misc
196..531
55
/gen = “IGF1R”
60
/nota = “dominio_L-recept: Región: dominio L de receptor. Los dominios L para estos receptores constituyen el sitio de unión al ligando bilobal. Cada domino L consiste en una beta-hélice destrógira monocatenaria. Esta entrada de Pfam no aparece en los primeros 50 residuos de aminoácidos del dominio”
característica_misc
dbx_ref = “CDD:pfam01030” 568..1044
65
/gen = “IGF1R”
/nota = “similar a furina; Región: región rica en cisteína similar a furina”
/dbx_ref = “CDD:pfam00757”
5
característica_misc 694..1041
/gen = “IGF1R”
/nota = “VSP; Región: proteína de superficie específica variante de Giardia”
/dbx_ref = “CDD:pfam03302”
característica_misc
724..855
15
/gen = “IGF1R”
/nota = “FU; Región: repeticiones similares a furina”
/dbx_ref = “CDD:smart00261”
característica_misc
1168..1479
/gen = “IGF1R”
25
/nota = “dominio_L_recep; Región: dominio L de receptor. Los dominios L para estos receptores constituyen el sitio de unión al ligando bilobal. Cada domino L consiste en una beta-hélice destrógira monocatenaria. Esta entrada de Pfam no aparece en los primeros 50 residuos de aminoácidos del dominio”
/dbx_ref = “CDD:pfam01030”
característica_misc
1519..1800
35
/gen = “IGF1R” /nota = “FN3; Región: Dominio de fibronectina tipo 3”
/dbx_ref = “CDD:smart00060”
péptido_mat
2266..4146
/gen = “IGF1R”
45
característica_misc /producto = “cadena beta del receptor de factor de crecimiento 1 similar a insulina” 2542..2787
/gen = “IGF1R”
/nota = “FN3; Región: Dominio de fibronectina tipo 3”
/dbx_ref = “CDD:smart00060”
55
característica_misc 2548..2796 /gen = “IGF1R”
/nota = “fn3; Región: Dominio de fibronectina tipo III”
/dbx_ref = “CDD:pfam000411”
característica_misc
2836..2910
65
/gen = “IGF1R” /nota = “región transmembrana (AA 906 - 929); sitio de región transmembrana”
característica_misc
3040..3843
5
/gen = “IGF1R” /nota = “cinasa; Región: Dominio de proteína cinasa”
/dbx_ref = “CDD:pfam00069”
característica_misc
3040..3843
/gen = “IGF1R”
15
/nota = “TyrKc; Región: Tirosina cinasa, dominio catalítico” /dbx_ref = “CDDsmart00219”
característica_misc
3052..3837
/gen = “IGF1R”
/nota = “S_TKc; Región: Serina/treonina proteína cinasas, domino catalítico”
25
característica_misc /dbx_ref = “CDD:smart00220” 122..2251
/gen = “IGF1R”
/nota = “subunidad alfa (AA 1 - 710)”
característica_misc
182..190
35
/gen = “IGF1R” /nota = “sitio de glicosilación unido a pot.N (AA 21 - 23)”
característica_misc
335..343
/gen = “IGF1R”
/nota = “sitio de glicosilación unido a pot.N (AA 72 - 74)”
45
característica_misc 434..442 /gen = “IGF1R”
/nota = “sitio de glicosilación unido a pot.N (AA 105 - 107)”
característica_misc
761..769
/gen = “IGF1R”
55
variación /nota = “sitio de glicosilación unido a pot.N (AA 214 - 216)” 948
/gen = “IGF1R”
/alelo = “C”
/alelo = “A”
65
característica_misc /dbx_ref = “dbSNP:2229764” 971..979
/gen = “IGF1R”
5
característica_misc /nota = “sitio de glicosilación unido a pot.N (AA 284 - 286)” 1280..1288
/gen = “IGF1R”
/nota = “sitio de glicosilación unido a pot.N (AA 387 - 389)”
característica_misc
1343..1351
15
/gen = “IGF1R” /nota = “sitio de glicosilación unido a pot.N (AA 408 - 410)”
característica_misc
1631..1639
/gen = “IGF1R”
/nota = “sitio de glicosilación unido a pot.N (AA 504 - 506)”
25
variación 1731 /gen = “IGF1R”
/alelo = “G”
/alelo = “A”
/dbx_ref = “dbSNP:2228531”
35
característica_misc 1850..1858 /gen = “IGF1R”
/nota = “sitio de glicosilación unido a pot.N (AA 577 - 579)”
característica_misc
1895..1903
/gen = “IGF1R”
45
característica_misc /nota = “sitio de glicosilación unido a pot.N (AA 592 - 594)” 1949..1957
/gen = “IGF1R”
/nota = “sitio de glicosilación unido a pot.N (AA 610 - 612)”
característica_misc
2240..2251
55
/gen = “IGF1R” /nota = “sitio de procesamiento del supuesto pro-receptor (AA 707 -710)”
característica_misc
2252..4132
/gen = “IGF1R”
/nota = “subunidad beta (AA 711 - 1337)”
65
característica_misc 2270..2278 /gen = “IGF1R”
/nota = “sitio de glicosilación unido a pot.N (AA 717 - 719]”
5
característica_misc 2297..2305 /gen = “IGF1R”
/nota = “sitio de glicosilación unido a pot.N (AA 726 - 728)”
característica_misc
2321..2329
/gen = “IGF1R”
15
variación /nota = “sitio de glicosilación unido a pot.N (AA 734 - 736)” 2343
/gen = “IGF1R”
/alelo = “T”
/alelo = “C”
25
característica_misc /dbx_ref = “dbSNP:3743262” 2729..2737
/gen = “IGF1R”
/nota = “sitio de glicosilación unido a pot.N (AA 870 - 872)”
característica_misc
2768..2776
35
/gen = “IGF1R” /nota = “sitio de glicosilación unido a pot.N (AA 883 - 885)”
característica_misc
2918..2926
/gen = “IGF1R”
/nota = “sitio de glicosilación unido a pot.N (AA 933 - 935)”
45
característica_misc 3047..3049 /gen = “IGF1R”
/nota = “sitio de unión pot.ATP (AA 976)”
característica_misc
3053..3055
/gen = “IGF1R”
55
característica_misc /nota = “sitio de unión pot.ATP (AA 978)” 3062..3064
/gen = “IGF1R”
/nota = “sitio de unión pot.ATP (AA 981)”
característica_misc
3128..3130
65
/gen = “IGF1R” /nota = “sitio de unión pot.ATP (AA 1003)”
variación 3174 /gen = “IGF1R”
5 /alelo = “G” /alelo = “A” /dbx_ref = “dbSNP:2229765”
variación complemento(4205) /alelo = “G”
15 /alelo = “C” /dbx_ref = “dbSNP:3825954”
variación 4267 /gen = “IGF1R” /alelo = “T”
25 /alelo = “A” /dbx_ref = “dbSNP: 1065304” variación 4268 /gen = “IGF1R” /alelo = “T” 35 /alelo = “A” /dbx_ref “dbSNP:1065345” variación complemento(4567) /alelo = “AG” /alelo = “-” 45 /dbx_ref = “dbSNP:3833015” ORIGEN RECUENTO BASES 1216 a 1371 c 1320 g 1082 t
(B) Secuencia de nucleótidos de IGR-IR y secuencia de aminoácidos correspondiente con regiones no traducidas en 3’ y 5’ (NM000).
La figura 3 es una representación gráfica que muestra (A) el efecto de ISIS de ASO de IGF-IR de partida de 175292 a 175328 sobre ARNm de IGF-IR en células A549 en relación con ISIS 13650, ISIS 18078 e ISIS 29848 controles
55 negativos. (B) El efecto de ISIS de ASO de IGF-IR de partida 175314, ISIS 175317 e ISIS 175323 sobre ARNm de IGR-IR en células A459. Para (A) y (B), se transfectaron las células A459 con lipofectina complejada con oligonucleótidos antisentido y control a una razón de lípido 2: oligonucleótido 1. Se aisló el ARN celular total 16-20 h más tarde en un proceso automatizado (por ejemplo Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.). El histograma representa mediciones por triplicado a partir de un único experimento, que muestran los niveles medios de ARNm de IGF-IR como un % de los niveles en control no tratado ± DE, (C) secuencias de nucleótidos de compuestos ASO, oligonucleótidos control y oligonucleótidos cebador/sonda.
La figura 4 es una representación gráfica que muestra el efecto de DT1064 (SEQ ID NO: 43) y ASO de IGR-IR de partida (ISIS 175314 (SEQ ID NO: 27), ISIS 175317 (SEQ ID NO: 30) e ISIS 175323 (SEQ ID NO: 36)) sobre los 65 niveles de ARNm de IGR-IR en queratinocitos HaCaT. Se trataron células HaCaT confluentes en un 85-90% con GSV (2 μg/ml), con o sin oligonucleótidos antisentido y control (6,25, 25, 100 o 400 nM). Se transfectaron las células
una vez (18 h antes de la recogida; A) o dos veces (a las 24 y 48 h antes de la recogida; B). Se recuperó el ARN total y se sometió a transcripción inversa antes de someterse a ensayo por duplicado en PCR en tiempo real. Se normalizó el ARNm de IGF-IR frente a 18S y se expresó como un % de los niveles en las células control tratadas con GSV. Los resultados representan la media ± EEM de pocillos por duplicado de dos experimentos separados. UT
5 = células no tratadas, GSV = células tratadas con GSV solamente.
La figura 5 es una representación fotográfica y gráfica que muestra el efecto de DT1064 (SEQ ID NO: 43) y ASO de IGR-IR de partida (ISIS 175314 (SEQ ID NO: 27), ISIS 175317 (SEQ ID NO: 30) e ISIS 175323 (SEQ ID NO: 36)) sobre la proteína IGF-IR en queratinocitos HaCaT. Se transfectaron células HaCaT confluentes en un 85-90% cada 24 h durante 3 días. Se recogieron los lisados celulares y se resolvieron cantidades iguales de proteína (o bien 25 o bien 30 μg) de cada muestra mediante SDS-PAGE al 7% p/v. Se sometió la proteína a transferencia a membrana de PVDF y se sondó con IgG anti-conejo que reconoce la subunidad β de IGF-IR. (A) Una inmunotransferencia representativa (Western 3) que muestra la intensidad de la señal de IGF-IR. Se corrieron las muestras en 4 geles; las células tratadas y no tratadas con GSV de cada gel se muestran junto con las muestras que han corrido en el
15 mismo gel. (B) Cuantificación de la intensidad de banda de la proteína IGF-IR expresada como un % de los niveles del control tratado con GSV. El histograma muestra la media ± EEM para los datos de tres experimentos separados en los que se evalúan los tratamientos por duplicado. Se realizó un ANOVA unilateral seguido por comparaciones por emparejamiento mediante la prueba de Dunnett: *P<0,05, Δ P<0,001 frente a células tratadas con GSV. UT = células no tratadas, GSV = células tratadas con GSV solamente.
La figura 6 es una representación gráfica que muestra el efecto de DT1064 y ASO de IGR-IR de partida sobre las tasas de proliferación celular en queratinocitos HaCaT. Se transfectaron células HaCaT subconfluentes con GSV solamente (2 μg/ml) o GSV (2 μg/ml) complejado con oligonucleótidos antisentido o control (6,25, 25, 100 ó 400 nM) cada 24 h durante hasta 3 días. Se estimó el número de células usando ensayo con negro de amido en el momento
25 de la primera transfección, y a intervalos de 24 h posteriores. Los datos se representan como media ± EEM de dos experimentos separados en los que se determinó el número de células por duplicado. UT = células no tratadas, GSV = células tratadas con GSV solamente.
La figura 7 es una representación de la secuencia de desoxirribonucleótidos de la región no traducida en 5’ del gen del IGF-IR (M69229; SEQ ID NO: 76) que muestra la ubicación de dianas para ISIS 175314, ISIS 175317 e ISIS 175323.
La figura 8 es una representación gráfica que muestra el efecto de ISIS 175317, ASO de partida de IGF-IR y DT1064 sobre los niveles de ARNm del receptor de IGF-I en queratinocitos HaCaT.
35 Se trataron células HaCaT confluentes en un 85% (pases 62-63) durante 20 h con GSV (2 μg/ml), con o sin oligonucleótidos antisentido o control (6, 13, 25, 50, 100 ó 200 nM). Se extrajo el ARN total y se sometió a transcripción inversa antes de someterse a ensayo por duplicado mediante PCR en tiempo real. Se normalizó el ARNm del receptor de IGF-I frente a 18S y se expresó como un porcentaje de los niveles de ARNm de IGF-IR en células tratadas con GSV. Los resultados representan la media ± DE (n = 4) de pocillos por duplicado de dos experimentos separados. UT = células no tratadas, GSV = células tratadas con GSV solamente.
La figura 9 es una representación gráfica que muestra el efecto de ISIS 175317, otros ASO de partida de IGF-IR y DT1064 sobre los niveles de ARNm del receptor de IGF-I en queratinocitos HaCaT. Se trataron células HaCaT
45 confluentes en un 85% (pases 62-63) durante 20 h con GSV (2 μg/ml), con o sin oligonucleótidos antisentido o control (6, 13, 25, 50, 100 ó 200 nM). Se extrajo el ARN total y se sometió a transcripción inversa antes de someterse a ensayo por duplicado mediante PCR en tiempo real. Se normalizó el ARNm del receptor de IGF-I frente a 18S y se expresó como un porcentaje de los niveles de ARNm de IGF-IR en células tratadas con GSV. Los resultados representan la media ± DE (n = 4) de pocillos por duplicado de dos experimentos separados. UT = células no tratadas, GSV = células tratadas con GSV solamente.
En este experimento ASO de IGR-IR de partida: ISIS175317, ASO de IGR-IR de partida: ISIS 323737, ISIS 323744, ISIS 323762, ISIS 323767.
55 La figura 10 es una representación gráfica que muestra el efecto de ISIS 175317, cuatro ASO de partida de IGF-IR recién identificados y DT1064 sobre los niveles de ARNm del receptor de IGF-I en queratinocitos HaCaT. se trataron células HaCaT confluentes en un 85% (pase 45) durante 20 h con GSV (2 μg/ml), con o sin oligonucleótidos antisentido o control (0,3, 1,6, 3, 6, 25 ó 100 nM). Se extrajo el ARN total y se sometió a transcripción inversa antes de someterse a ensayo por duplicado mediante PCR en tiempo real. Se normalizó el ARNm del receptor de IGF-I frente a 18S y se expresó como un porcentaje de los niveles de ARNm de IGF-IR en células tratadas con GSV. Los resultados representan la media ± DE (n = 2) de pocillos por duplicado de un único experimento. UT = células no tratadas, GSV = células tratadas con GSV solamente.
En este experimento: ASO de IGR-IR de partida: ISIS 175317. ASO de IGR-IR de partida: ISIS 323737, ISIS 65 323744, ISIS 323762, ISIS 323767. Gapmeros de 2’MOE control: ISIS 129691 (al azar), ISIS 306064 (8 apareamientos erróneos). ASO de IGR-IR de C-5 propino: DT1064. C-5 propino control: 6416 (15 apareamientos erróneos).
La figura 11 es una representación gráfica que muestra las curvas de concentración-respuesta para los efectos de
5 los cuatro ASO identificados recientemente e ISIS 175317 sobre los niveles relativos de ARNm de IGF-IR en queratinocitos HaCaT. Se trataron células HaCaT confluentes en un 85% (pase 45) durante 20 h con GSV (2 μg/ml), con o sin oligonucleótidos antisentido o control (0,4, 1,6, 3, 6, 25 ó 100 nM). Se extrajo el ARN total y se sometió a transcripción inversa antes de someterse a ensayo por duplicado mediante PCR en tiempo real. Se normalizó el ARNm del receptor de IGF-I frente a 18S y se expresó como un porcentaje de células tratadas con GSV. Los resultados representan la media ± DE (n = 2) de pocillos por duplicado de un único experimento. UT = células no tratadas, GSV = células tratadas con GSV solamente.
En este experimento: ASO de IGR-IR de partida: ISIS 175317. ASO de IGR-IR de partida: ISIS 323737, ISIS 323744, ISIS 323762, ISIS 323767.
15 La figura 12 es una representación gráfica que muestra los niveles medios de ARNm de IGF-IR en biopsias de piel psoriásica tras la aplicación tópica de ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125). Las barras representan el nivel promedio de ARNm de IGF-IR en la epidermis y la dermis de biopsias tratadas con vehículo y tratadas con ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125). Los datos se expresan en relación con el nivel promedio de ARNm de IGF-IR en la epidermis de las muestras tratadas con vehículo, las barras de error son una desviación estándar. ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125) aplicado por vía tópica (10% en crema de ISIS) redujo significativamente los niveles de ARNm de IGF-IR en la epidermis y la dermis 24 h tras la aplicación tópica a explantes. En todos los casos n = 11. (* = p<0,05, *** = p<0,001).
25 La figura 13 es una representación gráfica que muestra los niveles medios de ARNm de IGF-IR en biopsias de piel psoriásica tras la aplicación tópica de ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125). Las barras representan el nivel promedio de ARNm de IGF-IR en la epidermis psoriásica y la epidermis normal de biopsias tratadas con vehículo y tratadas con ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125). Los datos se expresan en relación con el nivel promedio de ARNm de IGF-IR en la epidermis de las muestras tratadas con vehículo, las barras de error son una desviación estándar. ISIS 175317 aplicado por vía tópica (SEQ ID NO: 125) (10% en crema de ISIS) redujo significativamente los niveles de ARNm de IGF-IR en la epidermis y la dermis 24 h tras la aplicación tópica a explantes. En todos los casos n = 11. (* = p<0,05, *** = p<0,001).
La figura 14 es una representación gráfica que muestra los niveles medios de ARNm de IGF-IR en biopsias de piel
35 psoriásica tras la aplicación tópica de ISIS 175317 a tejido de epidermis que muestra especificidad de ISIS 175317 para IGF-IR y no para GAPDH, HPRT, receptor de insulina, Casp. 3 y Bax. Las barras representan el nivel promedio de ARNm de IGF-IR en la epidermis y la dermis de biopsias tratadas con vehículo y tratadas con ISIS 175317. Los datos se expresan en relación con el nivel promedio de ARNm de IGF-IR en la epidermis de las muestras tratadas con vehículo, las barras de error son una desviación estándar. ISIS 175317 aplicado por vía tópica (10% en crema de ISIS) redujo significativamente los niveles de ARNm de IGF-IR en la epidermis y la dermis 24 h tras la aplicación tópica a explantes. En todos los casos n = 11. (* = p<0,05, *** = p<0,001).
Descripción detallada de la realización preferida
45 A. Visión general de la invención
La presente descripción da a conocer compuestos, preferiblemente oligonucleótidos y especies similares para su uso en la modulación de la función o el efecto de moléculas de ácido nucleico que codifican para el receptor del factor de crecimiento I similar a insulina y, en una realización particular, el receptor del factor de crecimiento I similar a insulina humano (IGF-IR). La invención proporciona oligonucleótidos que se hibridan específicamente con una molécula de ácido nucleico que codifica para IGF-IR. Tal como se usan en el presente documento, las expresiones “ácido nucleico diana” y “molécula de ácido nucleico que codifica para IGF-IR” se han usado por conveniencia para englobar ADN que codifica para IGF-IR, ARN (incluyendo pre-ARNm y ARNm o partes del mismo) transcrito a partir de tal ADN y también ADNc derivado de tal ARN. La hibridación de un oligonucleótido de esta invención con su
55 ácido nucleico diana se denomina generalmente “antisentido”. Por consiguiente, el mecanismo preferido que se cree que está incluido en la práctica de algunas realizaciones preferidas de la invención se denomina en el presente documento “inhibición antisentido.” Tal inhibición antisentido se basa normalmente en hibridación basada en puentes de hidrógeno de cadenas o segmentos de oligonucleótido de manera que al menos una cadena o segmento se escinde, degrada o se vuelve inviable de otro modo. Con respecto a esto, se prefiere actualmente dirigir moléculas de ácido nucleico específicas y sus funciones para tal inhibición antisentido.
Las funciones del ADN con el que va a interferirse pueden incluir replicación y transcripción. La replicación y la transcripción, por ejemplo, pueden proceder de un molde celular endógeno, un vector, un constructo de plásmido o de otro modo. Las funciones del ARN con la que va a interferirse pueden incluir funciones tales como translocación 65 del ARN a un sitio de traducción de proteínas, translocación del ARN a sitios dentro de la célula que están distantes del sitio de síntesis de ARN, traducción de proteínas a partir del ARN, corte y empalme del ARN para producir una o
más especies de ARN, y actividad catalítica o formación de complejos que implican al ARN que pueden acoplarse en o facilitarse por el ARN. El resultado de tal interferencia con la función del ácido nucleico diana es la modulación de la expresión de IGF-IR. “Modulación” y “modulación de la expresión” significa o bien un aumento (estimulación) o bien una disminución (inhibición) en la cantidad o niveles de una molécula de ácido nucleico que codifica para el
5 gen, por ejemplo, ADN o ARN. En el contexto de la invención, la inhibición es la forma de modulación de la expresión y el ARNm a menudo es un ácido nucleico diana preferido.
En el contexto de esta invención, “hibridación” significa el emparejamiento de cadenas complementarias de compuestos oligoméricos. En la presente invención, el mecanismo preferido de emparejamiento implica puentes de hidrógeno, que pueden ser puentes de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inversos, entre bases complementarias de nucleósidos o nucleótidos (nucleobases) de las cadenas de compuestos oligoméricos. Por ejemplo, adenina y timina son nucleobases complementarias que se emparejan a través de la formación de puentes de hidrógeno. La hibridación puede producirse en diversas circunstancias.
15 Un compuesto antisentido puede hibridarse específicamente cuando la unión del compuesto al ácido nucleico diana interfiere con la función normal del ácido nucleico diana para producir una pérdida de activad, y hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto antisentido a secuencias de ácido nucleico no dianas en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro.
En la presente invención el término “condiciones de hibridación rigurosas” o “condiciones rigurosas” se refiere a condiciones en las que un oligonucleótido de la invención se hibridará con su secuencia diana, pero hasta un número mínimo de otras secuencias. Condiciones rigurosas son dependientes de secuencia y serán diferentes en
25 diferentes circunstancias y en el contexto de esta invención, las “condiciones rigurosas” en las que se hibridan los oligonucleótidos con una secuencia diana se determinan por la naturaleza y la composición de los oligonucleótidos y los ensayos en los que se están investigando.
“Complementario,” tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de emparejamiento preciso entre dos nucleobases de un compuesto oligomérico. Por ejemplo, si una nucleobase en una posición determinada de un oligonucleótido (un compuesto oligomérico), puede formar puentes de hidrógeno con una nucleobase en una posición determinada de un ácido nucleico diana, siendo dicho ácido nucleico diana una molécula de ADN, ARN u oligonucleótido, entonces se considera que la posición de la formación de puentes de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana es una posición complementaria. El oligonucleótido y la molécula de ADN,
35 ARN u oligonucleótido adicional son complementarias entre sí cuando un número suficiente de posiciones complementarias en cada molécula están ocupadas por nucleobases que pueden formar puentes de hidrógeno entre sí. Por tanto, “que puede hibridarse específicamente” y “complementario” son términos que se usan para indicar un grado suficiente de emparejamiento o complementariedad preciso a lo largo de un número suficiente de nucleobases de manera que se produzca la unión estable y específica entre el oligonucleótido y un ácido nucleico diana.
Se entiende en la técnica que no es necesario que la secuencia de un compuesto antisentido sea complementaria en un 100% a la de su ácido nucleico diana con la que puede hibridarse específicamente. Además, un oligonucleótido puede hibridarse a lo largo de uno o más segmentos de manera que segmentos intermedios o adyacentes no están implicados en el acontecimiento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle o 45 estructura de horquilla). Se prefiere que los compuestos antisentido dados a conocer en el presente documento comprendan al menos una complementariedad de secuencia del 70% con una región diana dentro del ácido nucleico diana, más preferiblemente que comprendan una complementariedad de secuencia del 90% e incluso más preferiblemente que comprendan una complementariedad de secuencia del 95% con la región diana dentro de la secuencia del ácido nucleico diana al que se dirigen. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una región diana, y se hibridarían por tanto específicamente, representaría una complementariedad del 90 por ciento. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleobases complementarias y no es necesario que sean contiguas entre sí o a nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos
55 regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana tendría una complementariedad global del 77,8% con el ácido nucleico diana.
La complementariedad en porcentaje de un compuesto antisentido con un región de un ácido nucleico diana puede determinarse de manera rutinaria usando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990; Zhang y Madden, Genome Res. 7: 649-656, 1997).
B. Compuestos de la invención
65 Según la presente descripción, los compuestos incluyen compuestos oligoméricos antisentido, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos de secuencia guía externa (EGS), secuencias de corte y empalme alternas, cebadores, sondas y otros compuestos oligoméricos que se hibridan con al menos una parte del ácido nucleico diana. Como tales, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligoméricos monocatenarios, bicatenarios, circulares o en horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias o bucles internos o terminales. Una vez introducidos en un sistema, tales compuestos pueden provocar la acción de
5 que una o más enzimas o proteínas estructurales efectúen la modificación del ácido nucleico diana.
Un ejemplo no limitativo de una enzima de este tipo es la ARNasa H, una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. Se conoce en la técnica que los compuestos antisentido monocatenarios que son “similares a ADN” provocan la activación de la ARNasa H. La activación de la ARNasa H, por tanto, da como resultado la escisión del ARN diana, potenciando de ese modo enormemente la eficacia de la inhibición mediada por oligonucleótidos de la expresión génica. Se han propuesto papeles similares para otras ribonucleasas tales como las de la familia de enzimas de ARNasa III y ribonucleasa L.
La presente invención proporciona un oligonucleótido antisentido que comprende de 8 a 80 nucleobases de longitud
15 que es complementario en al menos un 90% a la SEQ ID NO: 160 y que se dirige a una molécula de ácido nucleico que codifica para el receptor del factor de crecimiento similar a insulina humano (SEQ ID NO: 97), hibridándose específicamente dicho oligonucleótido con dicha molécula de ácido nucleico e inhibiendo la expresión de IGF-IR.
Aunque la forma preferida de oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido antisentido monocatenario, en muchas especies se ha demostrado que la introducción de estructuras bicatenarias, tales como moléculas de ARN bicatenario (ARNbc), induce la reducción mediada por antisentido potente y específica de la función de un gen o sus productos génicos asociados. Este fenómeno se produce tanto en plantas como en animales y se cree que tiene una relación evolutiva con la defensa frente a virus y el silenciamiento de transposones.
25 La primera evidencia de que el ARNbc podría conducir a silenciamiento génico en animales se produjo en 1995 a partir de un trabajo en el nematodo, Caenorhabditis elegans (Guo y Kempheus, Cell 81: 611-620, 1995). Montgomery et al. han demostrado que los principales efectos de interferencia del ARNbc son post-transcripcionales (Montgomery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 15502-15507, 1998). El mecanismo antisentido posttranscripcional definido en Caenorhabditis elegans que resulta de la exposición a ARN bicatenario (ARNbc) se ha denominado interferencia de ARN (iARN). Este término se ha generalizado para significar silenciamiento génico mediado por antisentido que implica la introducción de ARNbc que conduce a la reducción específica de secuencia de niveles de ARNm seleccionados como diana endógenos (Fire et al., Nature 391: 806-811, 1998). Recientemente, se ha demostrado que, en efecto, los oligómeros de ARN monocatenarios de polaridad antisentido de los ARNbc son los potentes inductores de iARN (Tijsterman et al., Science, 295; 694-697,2002).
35 En el contexto de esta descripción, el término “compuesto oligomérico” se refiere a un polímero u oligómero que comprende una pluralidad de unidades monoméricas. En el contexto de esta invención, el término “oligonucleótido” se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o miméticos, quimeras, análogos y homólogos de los mismos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos de nucleobases, azúcares y enlaces internucleosídicos covalentes (esqueleto principal) que se producen de manera natural, así como oligonucleótidos que tienen partes que no se producen de manera natural que funcionan de manera similar. Tales oligonucleótidos modificados o sustituidos se prefieren a menudo con respecto a las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular potenciada, afinidad potenciada por un ácido nucleico diana y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas.
45 Los oligonucleótidos tal como se definieron anteriormente son los compuestos proporcionados por esta invención.
Los oligonucleótidos según esta invención comprenden de 8 a 80 nucleobases (es decir desde 8 hasta 80 nucleósidos unidos). Un experto habitual en la técnica apreciará que la invención incorpora oligonucleótidos de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 nucleobases de longitud.
En una realización preferida, los oligonucleótidos de la invención tienen de 12 a 50 nucleobases de longitud. Un
55 experto habitual en la técnica apreciará que esto incorpora oligonucleótidos de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleobases de longitud.
En otra realización preferida, los oligonucleótidos de la invención tienen de 15 a 40 nucleobases de longitud. Un experto habitual en la técnica apreciará que esto incorpora oligonucleótidos de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases de longitud.
Particularmente preferidos son oligonucleótidos de desde 12 hasta 50 nucleobases, incluso más preferiblemente los que comprenden desde 15 hasta 30 nucleobases.
65 Los oligonucleótidos antisentido de 8-80 nucleobases de longitud que comprenden un tramo de al menos ocho (8) nucleobases consecutivas seleccionadas de entre los compuestos antisentido ilustrativos se consideran oligonucleótidos antisentido adecuados según la presente descripción.
Los oligonucleótidos antisentido preferidos a modo de ejemplo de la presente descripción incluyen secuencias de
5 oligonucleótido que comprenden al menos las 8 nucleobases consecutivas del extremo 5’-terminal de uno de los oligonucleótidos antisentido preferidos ilustrativos (siendo las nucleobases restantes un tramo consecutivo del mismo oligonucleótido que comienza inmediatamente antes del extremo 5’-terminal del oligonucleótido antisentido que puede hibridarse específicamente al ácido nucleico diana y que continúa hasta el oligonucleótido que contiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 nucleobases). Oligonucleótidos antisentido preferidos de manera similar se representan mediante secuencias de oligonucleótido que comprenden al menos las 8 nucleobases consecutivas del extremo 3’-terminal de uno de los oligonucleótidos antisentido preferidos ilustrativos (siendo las nucleobases restantes un tramo consecutivo del mismo oligonucleótido que comienza inmediatamente después del extremo 3’-terminal del oligonucleótido antisentido que puede hibridarse específicamente al ácido nucleico diana y que continúa hasta el oligonucleótido que contiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 nucleobases). Un
15 experto en la técnica provisto del oligonucleótido antisentido preferido ilustrado en el presente documento podrá identificar, sin experimentación excesiva, oligonucleótidos antisentido preferidos adicionales.
El compuesto candidato dado a conocer en el presente documento se denomina mediante el número ISIS o SEQ ID NO. (Tabla 1).
Los compuestos candidatos también se denominan en el presente documento compuestos “de partida”.
Los ASO incluyen los ISIS 175308 (SEQ ID NO: 116), ISIS 175302 (SEQ ID NO: 110), ISIS 175314 (SEQ ID NO: 122), ISIS 175307 (SEQ ID NO: 115) e ISIS 175323 (SEQ ID NO: 131).
25 Otro grupo de ASO incluyen los ISIS 323744 (SEQ ID NO: 50), ISIS 323747 (SEQ ID NO: 53), ISIS 323767 (SEQ ID NO: 73), ISIS 323762 (SEQ ID NO: 68) e ISIS 323737 (SEQ ID NO: 43).
El ASO preferido es de ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125).
C. Dianas de la invención
“Dirigir” un compuesto antisentido a una molécula de ácido nucleico particular, en el contexto de esta descripción, puede ser un procedimiento de múltiples etapas. El procedimiento habitualmente comienza con la identificación de
35 un ácido nucleico diana cuya función ha de modularse. Este ácido nucleico diana puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito a partir del gen) cuya expresión está asociada con un trastorno o estado patológico particular, o una molécula de ácido nucleico a partir de un agente infeccioso. En la presente invención, el ácido nucleico diana codifica para IGF-IR.
El procedimiento de direccionamiento habitualmente también incluye la determinación de al menos una región, segmento o sitio diana dentro del ácido nucleico diana para que se produzca la interacción antisentido de manera que resulte el efecto deseado, por ejemplo, modulación de la expresión. Dentro del contexto de la presente invención, el término “región” se define como una parte del ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable. Dentro de las regiones de ácido nucleico diana hay segmentos. Los
45 “segmentos” se definen como partes más pequeñas o subpartes de regiones dentro de un ácido nucleico diana. Los “sitios,” tal como se usa en la presente invención, se definen como posiciones dentro de un ácido nucleico diana.
Puesto que, tal como se conoce en la técnica, el codón de iniciación de la traducción normalmente es 5’-AUG (en moléculas de ARNm transcritas; 5’-ATG en la molécula de ADN correspondiente), el codón de inicio de la traducción también se denomina “codón AUG”, el “codón de inicio” o el “codón de inicio AUG”. Una minoría de genes tienen un codón de inicio de la traducción que tiene una secuencia de ARN 5’-GUG, 5’-UUG o 5’-CUG, y se ha demostrado que 5’-AUA, 5’-ACG y 5’-CUG funcionan in vivo. Por tanto, los términos “codón de inicio de la traducción” y “codón de inicio” pueden englobar muchas secuencias de codón, aun cuando el aminoácido iniciador en cada caso normalmente sea metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). También se conoce en la técnica que
55 los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o más codones de inicio alternativos, pudiendo utilizarse uno cualquiera de ellos preferiblemente para el inicio de la traducción en un tipo de célula particular o tejido, o en un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la invención, “codón de inicio” y “codón de inicio de la traducción” se refieren al codón o codones que se usan in vivo para iniciar la traducción de un ARNm transcrito a partir de un gen que codifica para IGF-IR, independientemente de la(s) secuencia(s) de tales codones. También se conoce en la técnica que un codón de terminación de la traducción (o “codón de terminación”) de un gen puede tener una de tres secuencias, es decir, 5’-UAA, 5’-UAG y 5’-UGA (siendo las secuencias de ADN correspondientes 5’-TAA, 5’-TAG y 5’- TGA, respectivamente).
Los términos “región de codón de inicio” y “región de codón de iniciación de la traducción” se refieren a una parte de
65 un ARNm o gen de este tipo que engloba desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5’ o 3’) desde un codón de inicio de la traducción. De manera similar, los términos “región de codón de terminación” y “región de codón de terminación de la traducción” se refieren a una parte de un ARNm o gen de este tipo que engloba desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5’ o 3’) desde un codón de terminación de la traducción. Por consiguiente, la “región de codón de inicio” (o “región de codón de iniciación de la traducción”) y la “región de codón
5 de terminación” (o “región de codón de terminación de la traducción”) son todas las regiones que pueden seleccionarse como diana de manera eficaz con los oligonucleótidos antisentido de la presente invención.
El marco de lectura abierto (ORF) o “región codificante,” que se conoce en la técnica que se refiere a la región entre el codón de inicio de la traducción y el codón de terminación de la traducción, es también una región que puede seleccionarse como diana de manera eficaz. Dentro del contexto de la presente invención, una región preferida es la región intragénica que engloba el codón de iniciación o terminación de la traducción del marco de lectura abierto (ORF) de un gen.
Otras regiones diana incluyen la región no traducida en 5’ (5’UTR), que se conoce en la técnica que se refiere a la
15 parte de un ARNm en la dirección de 5’ desde el codón de inicio de la traducción, y por tanto que incluye los nucleótidos entre el sitio de caperuza en 5’ y el codón de inicio de la traducción de un ARNm (o nucleótidos correspondientes en el gen), y la región no traducida en 3’ (3’UTR), que se conoce en la técnica que se refiere a la parte de un ARNm en la dirección de 3’ desde el codón de terminación de la traducción, y por tanto que incluye los nucleótidos entre el codón de terminación de la traducción y el extremo 3’ de un ARNm (o nucleótidos correspondientes en el gen). El sitio de caperuza en 5’ de un ARNm comprende un residuo de guanosina metilado en N7 unido al residuo más en 5’ del ARNm a través de un enlace trifosfato 5’-5’. Se considera que la región de caperuza en 5’ de un ARNm incluye la propia estructura de caperuza en 5’ así como los primeros 50 nucleótidos adyacentes al sitio de caperuza. También se prefiere seleccionar como diana la región de caperuza en 5’.
25 Aunque algunos transcritos de ARNm eucariotas se traducen directamente, muchos contienen una o más regiones, conocidas como “intrones”, que se escinden del transcrito antes de traducirse. Las regiones restantes (y por tanto traducidas) se conocen como “exones” y se someten a corte y empalme juntos para formar una secuencia de ARNm continua. Seleccionar como diana sitios de corte y empalme, es decir, uniones intrón-exón o uniones exón-intrón, también puede ser particularmente útil en situaciones en las que un corte y empalme aberrante está implicado en una enfermedad, o cuando la sobreproducción de un producto de corte y empalme particular está implicada en una enfermedad. Las uniones de fusión aberrante debidas a reorganizaciones o deleciones, también son sitios diana preferidos. Los transcritos de ARNm producidos a través del proceso de corte y empalme de dos (o más) ARNm de diferentes fuentes de genes se conocen como “transcritos de fusión”. También se sabe que los intrones pueden seleccionarse como diana de manera eficaz usando compuestos antisentido dirigidos a, por ejemplo, ADN o pre
35 ARNm.
También se conoce en la técnica que pueden producirse transcritos de ARN alternativos a partir de las mismas regiones genómicas de ADN. Estos transcritos alternativos se conocen generalmente como “variantes”. Más específicamente, las “variantes de pre-ARNm” son transcritos producidos a partir del mismo ADN genómico que difieren de otros transcritos producidos a partir del mismo ADN genómico o bien en su posición de inicio o bien en la de terminación y contienen tanto secuencias intrónicas como exónicas.
Con la escisión de una o más regiones de exones o intrones, o partes de las mismas durante el corte y empalme, las variantes de pre-ARNm producen “variantes de ARNm” más pequeñas. Por consiguiente, las variantes de ARNm
45 son variantes de pre-ARNm procesadas y cada variante de pre-ARNm única siempre debe producir una variante de ARNm única como resultado del corte y empalme. Estas variantes de ARNm también se conocen como “variantes de corte y empalme alternativas”. Si no se produce el corte y empalme de la variante de pre-ARNm, entonces la variante de pre-ARNm es idéntica a la variante de ARNm.
También se conoce en la técnica que pueden producirse variantes a través del uso de señales alternativas para iniciar o terminar la transcripción y que los pre-ARNm y ARNm pueden poseer más de un codón de inicio o codón de terminación. Las variantes que se originan a partir de un pre-ARNm o ARNm que usan codones de inicio alternativos se conocen como “variantes de inicio alternativas” de ese pre-ARNm o ARNm. Estos transcritos que usan un codón de terminación alternativo se conocen como “variantes de terminación alternativas” de ese pre-ARNm o ARNm. Un
55 tipo específico de variante de terminación alternativa es la “variante de poliA” en la que los múltiples transcritos producidos resultan de la selección alternativa de una de las “señales de terminación de poliA” mediante la maquinaria de transcripción, produciendo de ese modo transcritos que terminan en sitios de poliA únicos. Dentro del contexto de la invención, los tipos de variantes descritos en el presente documento también son ácidos nucleicos diana preferidos.
Las ubicaciones en el ácido nucleico diana con las que se hibridan los compuestos antisentido dados a conocer se denominan más adelante en el presente documento “segmentos diana preferidos.” Tal como se usa en el presente documento, el término “segmento diana preferido” se define como al menos una parte de 8 nucleobases de una región diana a la que se dirige un compuesto antisentido activo. Aunque sin querer restringirse a la teoría, se cree
65 actualmente que estos segmentos diana representan partes del ácido nucleico diana que son accesibles para hibridación.
Aunque en el presente documento se exponen las secuencias específicas de ciertos segmentos diana preferidos, un experto en la técnica reconocerá que éstas sirven para ilustrar y describir realizaciones particulares dentro del alcance de la presente invención. Un experto habitual puede identificar segmentos diana preferidos adicionales.
5 Los segmentos diana de 8-80 nucleobases de longitud que comprenden a tramo de al menos ocho (8) nucleobases consecutivas seleccionadas de entre los segmentos diana preferidos ilustrativos también se consideran adecuados para seleccionarse como diana.
Los segmentos diana pueden incluir secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos las 8 nucleobases consecutivas del extremo 5’-terminal de uno de los segmentos diana preferidos ilustrativos (siendo las nucleobases restantes un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que comienza inmediatamente antes del extremo 5’-terminal del segmento diana y que continúa hasta el ADN o ARN que contiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 nucleobases). De manera similar, los segmentos diana preferidos se representan por secuencias de ADN o ARN
15 que comprenden al menos las 8 nucleobases consecutivas del extremo 3’-terminal de uno de los segmentos diana preferidos ilustrativos (siendo las nucleobases restantes un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que comienza inmediatamente después del extremo 3’-terminal del segmento diana y que continúa hasta el ADN o ARN que contiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 nucleobases). Un experto en la técnica provisto de los segmentos diana preferidos ilustrados en el presente documento podrá identificar, sin experimentación excesiva, segmentos diana preferidos adicionales.
Una vez identificadas una o más regiones, segmentos o sitios diana, se eligen los compuestos antisentido que sean suficientemente complementarios a la diana, es decir, que se hibridan suficientemente bien y con suficiente especificidad, para dar el efecto deseado.
D. Examen y validación de dianas
En una realización adicional de la presente descripción, los “segmentos diana preferidos” identificados en el presente documento pueden emplearse en un examen de compuestos adicionales que modulan la expresión del gen del IGF-IR. Los “moduladores” son aquellos compuestos que disminuyen o aumentan la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica para IGF-IR y que comprenden al menos una parte de 8-nucleobases que es complementaria a un segmento diana preferido. El método de examen comprende las etapas de poner en contacto un segmento diana preferido de una molécula de ácido nucleico que codifica para IGF-IR con uno o más moduladores candidatos, y selecciona uno o más moduladores candidatos que disminuyen o aumentan la expresión
35 de una molécula de ácido nucleico que codifica para IGF-IR. Una vez que se muestra que el modulador o moduladores candidato(s) pueden modular (por ejemplo o bien disminuir o bien aumentar) la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica para IGF-IR, el modulador puede emplearse entonces en estudios de investigación adicionales de la función de IGF-IR, o para su uso como agente de investigación, diagnóstico o terapéutico según la presente descripción.
Los segmentos diana preferidos dados a conocer en el presente documento también pueden combinarse con sus compuestos antisentido complementarios respectivos para formar oligonucleótidos bicatenarios estabilizados (dúplex).
45 Se ha demostrado en la técnica que tales restos de oligonucleótido bicatenarios modulan la expresión de la diana y también regulan la traducción así como el procesamiento de ARN a través de un mecanismo antisentido. Además, los restos bicatenarios pueden someterse a modificaciones químicas (Fire et al., Nature 391: 806-811, 1998; Timmons y Fire, Nature 395: 854, 1998; Timmons et al., Gen 263: 103-112, 2001; Tabara et al., Science 282: 430431, 1998; Montgomery et al., 1998, citado anteriormente; Tuschl et al., Genes Dev. 13: 3191-3197, 1999; Elbashir et al., Nature, 411: 494-498, 2001; Elbashir et al., Genes Dev. 15: 188-200, 2001). Por ejemplo, se ha demostrado que tales restos bicatenarios inhiben la diana mediante la hibridación clásica de la cadena antisentido del dúplex con la diana, desencadenando de ese modo la degradación enzimática de la diana (Tijsterman et al., 2002, citado anteriormente).
55 Los compuestos dados a conocer en el presente documento también pueden aplicarse en las áreas de descubrimiento de fármacos y validación de dianas. La presente descripción da a conocer el uso de los compuestos y segmentos diana preferidos identificados en el presente documento en esfuerzos de descubrimiento de fármacos para elucidar relaciones que existen entre IGF-I, IGF-IR o la interacción IGF-I/IGF-IR y un estado patológico, fenotipo
o afección. Estos métodos incluyen detectar o modular IGF-IR que comprende poner en contacto una muestra, tejido, célula u organismo con los compuestos dados a conocer en el presente documento, medir el nivel de ácido o proteína de IGF-IR y/o un criterio de valoración fenotípico o químico en algún momento tras el tratamiento, y opcionalmente comparar el valor medido con una muestra no tratada o muestra tratada con un compuesto adicional como el dado a conocer en el presente documento. Estos métodos también pueden realizarse en paralelo o en combinación con otros experimentos para determinar la función de genes desconocidos durante el procedimiento de
65 validación de dianas o para determinar la validez de un producto génico particular como diana para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, estado o fenotipo particulares.
E. Kits, reactivos de investigación, diagnóstico y terapéutica
Los compuestos de la presente descripción en el presente documento utilizados para diagnóstico, terapéutica,
5 profilaxis y como reactivos de investigación y kits. Además, los expertos en la técnica a menudo usan oligonucleótidos antisentido, que pueden inhibir la expresión génica con especificidad exquisita, para elucidar la función de genes particulares o para distinguir entre funciones de diversos miembros de una ruta biológica.
Para el uso en kits y diagnóstico, los compuestos dados a conocer en el presente documento, o bien solos o bien en
10 combinación con otros compuestos o terapéutica, pueden usarse como herramientas en análisis diferenciales y/o combinatorios para elucidar patrones de expresión de una parte o del complemento entero de genes expresados dentro de células y tejidos.
Como ejemplo no limitativo, se comparan patrones de expresión dentro de células o tejidos tratados con uno o más
15 compuestos antisentido para controlar células o tejidos no tratados con compuestos antisentido y se analizan los patrones producidos para determinar niveles diferenciales de expresión génica ya que guardan relación, por ejemplo, con asociación de enfermedades, rutas de señalización, ubicación celular, nivel de expresión, tamaño, estructura o función de los genes examinados. Estos análisis pueden realizarse en células estimuladas o no estimuladas y en presencia o ausencia de otros compuestos que afectan a los patrones de expresión.
20 Los ejemplos de métodos de análisis de expresión génica conocidos en la técnica incluyen matrices o micromatrices de ADN (Brazma y Vilo, FEBS Lett. 480: 17-24, 2000; Celis et al., FEBS Lett. 480: 2-16, 2000), SAGE (análisis en serie de expresión génica) (Madden et al., Drug Discov. Today 5: 415-425, 2000), READS (amplificación con enzimas de restricción de ADNc digeridos) (Prashar y Weissman, Methods Enzymol. 303: 258-272, 1999), TOGA
25 (análisis de expresión génica total) (Sutcliffe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 1976-1981, 2000), matrices de proteínas y proteómica (Celis et al. 2000, citado anteriormente; Jungblut et al., Electrophoresis 20: 2100-2110, 1999), secuenciación de marcador de secuencia expresada (EST) (Celis et al., 2000, citado anteriormente; Larsson et al., J. Biotechnol.80: 143-157, 2000), huella genética de ARN sustractiva (SuRF) (Fuchs et al., Anal. Biochem.
286: 91-98, 2000; Larson et al., Cytometry 41: 203-208, 2000), clonación sustractiva, presentación diferencial (DD)
30 (Jurecic y Belmont, Curr. Opin. Microbiol. 3: 316-321, 2000), hibridación genómica comparativa (Carulli et al., J. Cell Biochem. Suppl. 31: 286-296, 1998), técnicas de FISH (hibridación fluorescente in situ) (Going y Gusterson, Eur. J. Cancer, 35: 1895-1904, 1999) y métodos de espectrometría de masas (To, Comb. Chem. High Throughput Screen,
3: 235-241, 2000).
35 Los compuestos dados a conocer en el presente documento son útiles para investigación y diagnóstico, porque estos compuestos se hibridan con ácidos nucleicos que codifican para IGF-IR. Por ejemplo, los oligonucleótidos que se muestra que se hibridan con una eficacia tal y en condiciones tales como las dadas a conocer en el presente documento como para ser inhibidores de IGF-IR o inhibidores de la expresión génica de IGF-IR eficaces, también serán cebadores o sondas eficaces en condiciones que favorecen la amplificación o detección génica,
40 respectivamente. Estos cebadores y sondas son útiles en métodos que requieren la detección específica de moléculas de ácido nucleico que codifica para IGF-IR y en la amplificación de dichas moléculas de ácido nucleico para detección o para su uso en estudios adicionales de IGF-IR o su gen. La hibridación de los oligonucleótidos antisentido, particularmente los cebadores y las sondas, de la invención con un ácido nucleico que codifica para IGFIR puede detectarse mediante medios conocidos en la técnica. Tales medios pueden incluir la conjugación de
45 una enzima con el oligonucleótido, el radiomarcaje del oligonucleótido o cualquier otro medio de detección adecuado. También pueden prepararse kits que usan tal medio de detección para detectar el nivel de IGF-IR en una muestra.
Los expertos en la técnica también aprovechan la especificidad y la sensibilidad de los compuestos antisentido para
50 usos terapéuticos. Los compuestos antisentido se han empleado como restos terapéuticos en el tratamiento de estados patológicos en animales, incluyendo seres humanos. Se han administrado fármacos de oligonucleótidos antisentido, incluyendo ribozimas, de manera segura y eficaz a seres humanos y en la actualidad están en marcha numerosos ensayos clínicos. Por tanto, se establece que los compuestos antisentido pueden ser útiles en modalidades terapéuticas que pueden configurarse para ser útiles en regímenes de tratamiento para el tratamiento
55 de células, tejidos y animales, especialmente seres humanos.
Para la terapéutica, puede tratarse un animal, preferiblemente un ser humano, que se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno que puede tratarse modulando la expresión del gen del IGF-IR mediante la administración de compuestos antisentido según esta descripción. Por ejemplo, en un ejemplo no limitativo, los métodos 60 comprenden la etapa de administrar al animal que necesita tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la expresión génica de IGF-IR. Los inhibidores de la expresión génica de IGF-IR dados a conocer en el presente documento inhiben de manera eficaz la actividad de la proteína IGF-IR o inhiben la expresión del gen del IGF-IR. La actividad o expresión de IGF-IR o su gen en un animal puede inhibirse en aproximadamente el 10%. Preferiblemente, la actividad o expresión de IGF-IR o su gen en un animal se inhibe en aproximadamente el 30%.
65 Más preferiblemente, la actividad o expresión de IGF-IR o su gen en un animal se inhibe en el 50% o más.
Por ejemplo, la reducción de la expresión del gen del IGF-IR puede medirse en suero, tejido adiposo, células cutáneas, hígado o cualquier otro fluido corporal, tejido u órgano del animal. Preferiblemente, las células contenidas dentro de dichos fluidos, tejidos u órganos que se están analizando contienen una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína IGF-IR.
5 Los oligonucleótidos de la invención pueden utilizarse en composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad eficaz de un compuesto a un diluyente o portador adecuado farmacéuticamente aceptable. El uso de los oligonucleótidos y métodos de la invención también puede ser útil profilácticamente.
F. Modificaciones
Tal como se conoce en la técnica, un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La parte de base del nucleósido normalmente es una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de tales bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen adicionalmente un grupo fosfato unido
15 covalentemente a la parte de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar de pentofuranosilo, el grupo fosfato puede unirse o bien al resto hidroxilo en 2’, 3’ o 5’ del azúcar. En la formación de los oligonucleótidos, los grupos fosfato unen covalentemente nucleósidos adyacentes entre sí para formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los extremos respectivos de este compuesto polimérico lineal pueden unirse adicionalmente para formar un compuesto circular, sin embargo, generalmente se prefieren los compuestos lineales. Además, los compuestos lineales pueden tener complementariedad de nucleobases interna y por tanto pueden plegarse de manera que produzcan un compuesto completa o parcialmente bicatenario. Dentro de los oligonucleótidos, los grupos fosfato se denominan comúnmente como elementos de formación del esqueleto principal internucleosídico del oligonucleótido. El enlace normal o esqueleto principal del ARN y ADN es un enlace fosfodiéster de 3’ a 5’.
Enlaces internucleosídicos modificados (esqueletos principales)
Ejemplos específicos de oligonucleótidos antisentido preferidos útiles en esta invención incluyen oligonucleótidos que contienen esqueletos principales modificados o enlaces internucleosídicos no naturales. Tal como se define en esta memoria descriptiva, los oligonucleótidos que tienen esqueletos principales modificados incluyen aquellos que conservan un átomo de fósforo en el esqueleto principal y los que no tienen un átomo de fósforo en el esqueleto principal. Para los fines de esta memoria descriptiva, y tal como se denomina en ocasiones en la técnica, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su esqueleto principal nucleosídico también pueden considerarse oligonucleósidos.
35 Esqueletos principales de oligonucleótidos modificados preferidos que contienen un átomo de fósforo en ellos incluyen, por ejemplo, de fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil y otros alquil fosfonatos incluyendo 3’-alquilenfosfonatos, 5’-alquilenfosfonato y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3’-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y boranofosfatos que tienen enlaces 3’-5’ normales, análogos unidos en 2’-5’ de éstos y los que tienen polaridad invertida en la que uno o más enlaces internucleotídicos es un enlace de 3’ a 3’, de 5’ a 5’ o de 2’ a 2’. Oligonucleótidos preferidos que tienen polaridad invertida comprenden un único enlace de 3’ a 3’ en el enlace internucleotídico más en 3’, es decir un único residuo nucleosídico invertido que puede ser abásico (la nucleobase desaparece o tiene un grupo hidroxilo en lugar
45 de la misma). También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.
Las patentes de EE.UU. representativas que enseñan la preparación de los enlaces que contienen fósforo anteriores incluyen, pero no se limitan a, los documentos US: 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.194.599; 5.565.555; 5.527.899; 5.721.218; 5.672.697 y 5.625.050, algunas de las cuales son de titularidad común con esta solicitud.
Esqueletos principales de oligonucleótidos modificados preferidos que no incluyen un átomo de fósforo en los
55 mismos tienen esqueletos principales que se forman mediante enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de heteroátomos mixtos, o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen los que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azúcar de un nucleósido); esqueletos principales de siloxano; esqueletos principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; esqueletos principales de formacetilo y tioformacetilo; esqueletos principales de metilenformacetilo y tioformacetilo; esqueletos principales de riboacetilo; esqueletos principales que contienen alqueno; esqueletos principales de sulfamato; esqueletos principales de metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos principales de sulfonato y sulfonamida; esqueletos principales de amida; y otros que tienen partes componentes de N, O, S y CH2 mixtas.
65 Las patentes de EE.UU. representativas que enseñan la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero no se limitan a, los documentos US: 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033;
5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; 5.792.608; 5.646.269 y 5.677,439, algunas de las cuales son de titularidad común con esta solicitud.
5 Miméticos de enlaces internucleosídicos y azúcar modificado
En otros miméticos de oligonucleótido preferidos, tanto el azúcar como el enlace internucleosídico (es decir el esqueleto principal), de las unidades de nucleótido se sustituyen por grupos novedosos. Las unidades de nucleobases se mantienen para hibridación con un ácido nucleico diana apropiado. Un compuesto de este tipo, un mimético de oligonucleótido que se ha demostrado que tiene propiedades de hibridación excelentes, se denomina ácido nucleico peptídico (PNA). En compuestos de PNA, el esqueleto principal de azúcar de un oligonucleótido se sustituye por un esqueleto principal que contiene amida, en particular un esqueleto principal de aminoetilglicina. Las nucleobases están conservadas y se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la parte de amida del esqueleto principal. Las patentes de EE.UU. representativas que enseñan la preparación de compuestos de PNA
15 incluyen, pero no se limitan a, los documentos US: 5.539.082; 5.714.331 y 5.719,262. Enseñanzas adicionales de compuestos de PNA pueden encontrarse en Nielsen et al., Science 254: 1497-1500, 1991.
Las realizaciones preferidas de la invención son oligonucleótidos con esqueletos principales de fosforotioato y oligonucleósidos con esqueletos principales de heteroátomos, y en particular -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-[conocidos como metileno (metilimino) o esqueleto principal de MMI], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- y -O-N(CH3)-CH2-CH2- [en los que el esqueleto principal de fosfodiéster nativo se representa como -O-P-O-CH2-] de la patente de EE.UU. 5.489.677 nombrada anteriormente y los esqueletos principales de amida de la patente EE.UU. 5.602.240 nombrada anteriormente. También se prefieren oligonucleótidos que tienen estructuras de esqueleto principal de morfolino de la patente EE.UU. 5.034.506 nombrada anteriormente.
Azúcares modificados
Los oligonucleótidos modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos. Los oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2’: OH; F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, en los que el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10 o alquenilo y alquinilo C2 a C10 sustituidos o no sustituidos. Particularmente preferidos son O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, en los que n y m son de desde 1 hasta aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2’: alquilo inferior C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH,
35 SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2’-metoxietoxilo (2’-O-CH2CH2OCH3) también conocido como 2’-O-(2-metoxietilo) o 2’-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 78: 486-504, 1995) es decir, un grupo alcoxialcoxilo. Una modificación preferida incluye 2’-dimetilaminooxietoxilo, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2’-DMAOE, tal como se describe en ejemplos más adelante en el presente documento, y 2’-dimetilaminoetoxietoxilo (también conocido en la técnica como 2’-O-dimetil-amino-etoxi-etilo o 2’-DMAEOE), es decir, 2’-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2, también descrito en ejemplos más adelante en el presente documento.
45 Otras modificaciones preferidas incluyen 2’-metoxilo (2’-O-CH3), 2’-aminopropoxilo (2’-OCH2CH2CH2NH2), 2’-alilo (2’-CH2-CH=CH2), 2’-O-alilo (2’-O-CH2-CH=CH2) y 2’-fluoro (2’-F). La modificación en 2’ puede ser en la posición arabino (arriba) o en la posición ribo (abajo). Una modificación 2’-arabino preferida es 2’-F. También pueden obtenerse modificaciones similares en otras posiciones en el oligonucleótido, particularmente en la posición 3’ del azúcar en el nucleótido 3’ terminal o en los oligonucleótidos unidos en 2’-5’ y en la posición 5’ del nucleótido 5’ terminal. Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar tales como restos de ciclobutilo en lugar del azúcar de pentofuranosilo. Las patentes EE.UU. representativas que enseñan la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no se limitan a los documentos US: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909;
55 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; 5.792.747 y 5.700.920, algunas de las cuales son de titularidad común con esta solicitud.
Una modificación preferida adicional del azúcar incluye ácidos nucleicos bloqueados (LNA) en los que el grupo 2’hidroxilo está unido al átomo de carbono en 3’ o 4’ del anillo de azúcar, formando de ese modo un resto de azúcar bicíclico. El enlace es preferiblemente un grupo metileno (-CH2-)n que se une al átomo de oxígeno en 2’ y el átomo de carbono en 4’ en el que n es 1 ó 2. Los LNA y su preparación se describen en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.
Nucleobases naturales y modificadas
65 Los oligonucleótidos también pueden incluir modificaciones y sustituciones en la nucleobase (a menudo denominada
en la técnica simplemente “base”). Tal como se usa en el presente documento, las nucleobases “no modificadas” o “naturales” incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2- aminoadenina, 6-metil y otros derivados de 5 alquilo de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-C:C-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, 6-azo-uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo-, 8-amino-, 8-tiol-, 8-tioalquil-, 8-hidroxil- y otras adeninas y guaninas sustituidas en la posición 8, 5-halo- particularmente 5-bromo-, 5-trifluorometily otros uracilos y citosinas sustituidos en la posición 5, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3desazaadenina. Las nucleobases modificadas adicionales incluyen pirimidinas tricíclicas tales como fenoxazincitidina(1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazin-citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2(3H)ona), G-clamps (análogos de citosina) tales como una fenoxazin-citidina sustituida (por ejemplo 9-(2-aminoetoxi)-Hpirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol-citidina (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindol-citidina (H15 pirido[3’,2’:4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona). Las nucleobases modificadas también pueden incluir aquellas en las que la base de purina o pirimidina está sustituida por otros heterociclos, por ejemplo 7-desaza-adenina, 7desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las nucleobases adicionales incluyen las descritas en la patente EE.UU. n.º 3.687.808, las descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, las descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613, 1991, y las descritas por Sanghvi, Y.S., capítulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S.T. y Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Algunas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos de la invención. Estas incluyen pirimidinas sustituidas en la posición 5, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y O-6, incluyendo 2aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina
25 aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico a 0,6-1,2ºC y son sustituciones de bases preferidas actualmente, incluso más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcar con 2’-O-metoxietilo.
Las patentes EE.UU. representativas que enseñan la preparación de algunas de las nucleobases modificadas nombradas anteriormente así como otras nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a, los documentos nombrados anteriormente US 3.687.808, así como US: 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121, 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985; 5.830.653; 5.763.588; 6.005.096 y 5.681.941, algunas de las cuales son de titularidad común con esta solicitud, y la patente EE.UU. 5.750.692, de titularidad común con la presente solicitud.
35 Conjugados
Otra modificación de los oligonucleótidos de la invención implica la unión química a los oligonucleótido de uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, la distribución celular o la captación celular del oligonucleótido. Estos restos o conjugados pueden incluir grupos conjugados unidos covalentemente a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados de la invención incluyen intercaladores, moléculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, poliéteres, grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas de los oligómeros y grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas de los oligómeros. Los grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Los grupos que potencian las propiedades 45 farmacodinámicas, en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la captación, potencian la resistencia a la degradación y/o refuerzan la hibridación específica de secuencia con el ácido nucleico diana. Los grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas, en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la captación, la distribución, el metabolismo o la excreción de los compuestos de la presente invención. Los grupos conjugados representativos se dan a conocer en la solicitud de patente internacional PCT/US92/09196, presentada el 23 de octubre de 1992 y la patente estadounidense 6.287.860. Los restos conjugados incluyen pero no se limitan a restos de lípidos tales como un resto de colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo, hexil-Stritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo, un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1-,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o ácido acético de adamantano, un resto de palmitilo, o un resto de octadecilamina o
55 hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Los oligonucleótidos de la invención también pueden conjugarse a sustancias farmacológicas activas, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triyodobenzoico, ácido flufenámico, ácido folínico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometicina, un barbiturato, una cefalosporina, un fármaco sulfa, un antidiabético, un agente antibacteriano o un antibiótico. Los conjugados de oligonucleótido-fármaco y su preparación se describen en la solicitud de patente estadounidense 09/334.130 (presentada el 15 de junio de 1999):
Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales conjugados de oligonucleótido incluyen, pero no se limitan a, los documentos US: 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717, 5.580.731; 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 65 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136;
5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241, 5.391.723; 5.416.203, 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941, algunas de las cuales son de titularidad común con esta solicitud.
5 Compuestos quiméricos
No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado estén modificadas de manera uniforme, y de hecho más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente puede incorporarse en un único compuesto o incluso un único nucleósido dentro de un oligonucleótido.
10 La presente invención también incluye oligonucleótidos antisentido que son oligonucleótidos quiméricos. Oligonucleótidos antisentido “quiméricos” o “quimeras,” en el contexto de esta invención, son oligonucleótidos antisentido que contienen dos o más regiones químicamente distintas, constituidas cada una por al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido.
15 Estos oligonucleótidos normalmente contienen al menos una región en la que el oligonucleótido está modificado de modo que se confiera al oligonucleótido resistencia aumentada a degradación por nucleasa, captación celular aumentada, estabilidad aumentada y/o afinidad de unión aumentada para el ácido nucleico diana. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como sustrato para enzimas que pueden escindir híbridos ARN:ADN o
20 ARN:ARN. A modo de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. La activación de la ARNasa H, por tanto, da como resultado la escisión de la diana de ARN, potenciando de ese modo enormemente la eficacia de la inhibición de la expresión génica mediada por oligonucleótidos. La escisión de los híbridos ARN:ARN puede llevarse a cabo, de manera similar, a través de las acciones de endorribonucleasas, tales como ARNasa L que escinde tanto ARN celular como viral. La escisión de la
25 diana de ARN puede detectarse de manera rutinaria mediante electroforesis en gel y, si es necesario, técnicas de hibridación de ácidos nucleicos asociadas conocidas en la técnica.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de la invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótido tal como se
30 describió anteriormente. Tales compuestos también se han denominado en la técnica híbridos o gapmeros. Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales estructuras híbridas incluyen, pero no se limitan a, los documentos US: 5.013.830; 5.149.797; 5.220.007; 5.256.775; 5.366.878; 5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065; 5.652.355; 5.652.356 y 5.700.922, algunas de las cuales son de titularidad común con esta solicitud.
G. Formulaciones
Los oligonucleótidos de la invención también pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo con otras moléculas, estructuras de moléculas o mezclas de compuestos, como por ejemplo, liposomas, moléculas
40 dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras, para ayudar en la captación, distribución y/o absorción. Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales formulaciones que ayudan a la captación, distribución y/o absorción formulaciones incluyen, pero no se limitan a, los documentos US: 5.108.921; 5.354.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.158; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330; 4.534.899; 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016; 5.417.978;
45 5.462.854; 5.469.854; 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575 y 5.595.756,
Las composiciones que comprenden los oligonucleótidos antisentido de la invención engloban cualquier sal, éster, o sale de tal éster, o cualquier otro compuesto, farmacéuticamente aceptable, que con la administración a un animal, incluyendo un ser humano, puede proporcionar (directa o indirectamente) el residuo o metabolito biológicamente
50 activo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción también establece profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los oligonucleótidos de la invención, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes.
El término “profármaco” indica un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una
55 forma activa (es decir, fármaco) dentro del organismo o las células del mismo mediante la acción de enzimas endógenas u otros compuestos químicos y/o condiciones. En particular, las versiones de profármaco de los oligonucleótidos de la invención se preparan como derivados de SATE [(S-acetil-2-tioetil)fosfato] según los métodos dados a conocer en el documento WO 93/24510 concedido a Gosselin et al., publicado el 9 de diciembre de 1993 o en los documentos WO 94/26764 y US 5.770.713 concedidos a Imbach et al.
60 El término “sales farmacéuticamente aceptables” se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los oligonucleótidos de la invención: es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del compuesto original y que no confieren efectos toxicológicos no deseados al mismo. Para los oligonucleótidos, los ejemplos preferidos de sales farmacéuticamente aceptables y sus usos se describen adicionalmente en la patente estadounidense
65 6.287.860.
La presente invención también incluye composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen los oligonucleótidos antisentido de la invención. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse en un número de formas que depende de si se desea tratamiento local o sistémico y de la zona que va a tratarse. La administración puede ser tópica (incluyendo por vía oftálmica y a membranas mucosas incluyendo
5 suministro vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo, mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo mediante nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica), oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o administración intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular. Se cree que los oligonucleótidos con al menos una modificación de 2’-O-metoxietilo son particularmente útiles para la administración oral. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizadores, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables portadores, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares farmacéuticos convencionales. También pueden ser útiles preservativos, guantes y similares recubiertos.
15 Las formulaciones farmacéuticas contempladas por la presente descripción, que pueden presentarse convenientemente en una forma farmacéutica unitaria, pueden prepararse según técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de asociar los principios activos con el/los portador(es) o excipiente(es) farmacéutico(s). En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme o estrecha los principios activos con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, conformar el producto.
Las composiciones de la presente invención pueden formularse en cualquiera de muchas formas farmacéuticas posibles tales como, pero sin limitarse a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse como suspensiones
25 en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener adicionalmente sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizadores.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, disoluciones, emulsiones, espumas y formulaciones que contienen liposomas. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender uno o más potenciadores de la penetración, portadores, excipientes u otros principios activos o inactivos.
Las emulsiones normalmente son sistemas heterogéneos de un líquido disperso en otro en forma de gotitas que
35 superan habitualmente 0,1 μm de diámetro. Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersas, y el fármaco activo que puede estar presente como disolución o bien en la fase acuosa, la fase oleosa o por sí mismo como una fase separada. Las microemulsiones se incluyen como una realización de la presente invención. Las emulsiones y sus usos se conocen bien en la técnica y se describen adicionalmente en la patente de EE.UU. 6.287.860.
Formulaciones de la presente invención incluyen formulaciones liposómicas. Tal como se usa en la presente invención, el término “liposoma” significa una vesícula compuesta por lípidos anfifílicos dispuestos en una bicapa o bicapas esférica(s). Los liposomas son vesículas unilamelares o multilamelares que tienen una membrana formada de material lipófilo y un interior acuoso que contiene la composición que va a suministrarse. Los liposomas
45 catiónicos son liposomas cargados positivamente que se cree que interaccionan con moléculas de ADN cargadas negativamente para formar un complejo estable. Se cree que los liposomas que son sensibles al pH o están cargados negativamente atrapan ADN en lugar de formar complejos con él. Tanto los liposomas catiónicos como los no catiónicos se han usado para suministrar ADN a las células.
Los liposomas también incluyen liposomas “estabilizados estéricamente”, un término que, tal como se usa en el presente documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan en liposomas, dan como resultado vidas de circulación potenciadas en relación con los liposomas que carecen de tales lípidos especializados. Ejemplos de liposomas estabilizados estéricamente son aquellos en los que parte de la porción lipídica que forma la vesícula del liposoma comprende uno o más glicolípidos o está derivatizada
55 con uno o más polímeros hidrófilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). Los liposomas y sus usos se describen adicionalmente en la patente estadounidense 6.287.860,
Las formulaciones y composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden incluir tensioactivos. El uso de tensioactivos en productos farmacológicos, formulaciones y en emulsiones se conoce bien en la técnica. Los tensioactivos y sus usos se describen adicionalmente en la patente estadounidense 6.287.860.
En una realización, la presente invención emplea diversos potenciadores de la penetración para efectuar el suministro eficaz de ácido nucleicos, particularmente oligonucleótidos. Además de ayudar a la difusión de fármacos no lipófilos a través de las membranas celulares, los potenciadores de la penetración también potencian la 65 permeabilidad de fármacos lipófilos: Los potenciadores de la penetración pueden clasificarse según pertenezcan a una de cinco amplias categorías, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no
tensioactivos no quelantes. Los potenciadores de la penetración y sus usos se describen adicionalmente en la patente estadounidense 6.287.860.
Un experto en la técnica reconocerá que las formulaciones se diseñan de manera rutinaria según su uso pretendido, 5 es decir la vía de administración.
Las formulaciones preferidas para administración tópica incluyen aquellas en las que los oligonucleótidos de la invención están en mezcla con un agente de suministro tópico tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Los lípidos y liposomas preferidos incluyen neutros (por ejemplo dioleoilfosfatidil-etanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidil-colina DMPC, diestearolifosfatidil-colina) negativos (por ejemplo dimiristoilfosfatidil-glicerol DMPG) y catiónicos (por ejemplo dioleoiltetrametilaminopropilo DOTAP y dioleoilfosfatidil-etanolamina DOTMA).
Para la administración tópica u otra, los oligonucleótidos de la invención pueden encapsularse dentro de liposomas o
15 pueden formar complejos con los mismos, en particular con liposomas catiónicos. Alternativamente, los oligonucleótidos pueden complejarse con lípidos, en particular con lípidos catiónicos. Los ácidos grasos y ésteres preferidos, las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y sus usos se describen adicionalmente en la patente estadounidense 6.287.860.
Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, materiales microparticulados, materiales nanoparticulados, suspensiones o disoluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, agentes de dispersión o adyuvantes. Las formulaciones orales preferidas son aquellas en las que los oligonucleótidos de la invención se administran conjuntamente con uno o más quelantes
25 y tensioactivos potenciadores de la penetración. Los tensioactivos preferidos incluyen ácidos grasos y/o ésteres o sales de los mismos, ácidos biliares y/o sales de los mismos. Los ácidos/sales biliares y ácidos grasos preferidos y sus usos se describen adicionalmente en la patente estadounidense 6.287.860.
También se prefieren combinaciones de potenciadores de la penetración, por ejemplo, ácidos/sales grasos en combinación con ácidos/sales biliares. Una combinación particularmente preferida es la sal sódica de ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Los potenciadores de la penetración adicionales incluyen polioxietilen-9-lauril éter, polioxietilen-20-cetil éter. Los oligonucleótidos de la invención pueden suministrarse por vía oral, en forma granular incluyendo partículas secas pulverizadas, o complejados para formar micro o nanopartículas. Los agentes de complejación de oligonucleótidos y sus usos se describen adicionalmente en la patente estadounidense 6.287.860.
35 Las formulaciones orales para los oligonucleótidos y su preparación se describen en detalle en las solicitudes estadounidenses 09/108.673 (presentada el 1 de julio de 1998), 09/315.298 (presentada el 20 de mayo de 1999) y 10/071.822, presentada el 8 de febrero de 2002.
Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir disoluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero sin limitarse a, potenciadores de la penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.
45 Determinadas realizaciones de la invención proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen uno o más oligonucleótidos antisentido y uno o más de otros agentes quimioterápicos que funcionan mediante un mecanismo no antisentido. Los ejemplos de tales agentes quimioterápicos incluyen pero no se limitan a fármacos quimioterápicos contra el cáncer tales como daunorubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, esorubicina; bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinósido, bis-cloroetilnitrosurea, busulfano, mitomicina C, actinomicina. D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosurea, mostazas nitrogenadas, melfalán, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclofosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etopósido (VP-16),
55 trimetrexato, irinotecán, topotecán, gemcitabina, tenipósido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Cuando se usan con los oligonucleótidos de la invención, tales agentes quimioterápicos pueden usarse individualmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleótido), secuencialmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleótido durante un periodo de tiempo seguido por MTX y oligonucleótido), o en combinación con uno o más de tales agentes quimioterápicos (por ejemplo, 5-FU, MTX y oligonucleótido, o 5-FU, radioterapia y oligonucleótido). También pueden combinarse en las composiciones de la invención fármacos antiinflamatorios, incluyendo pero sin limitarse a fármacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y fármacos antivirales, incluyendo pero sin limitarse a ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir. Las combinaciones de oligonucleótidos antisentido y otros fármacos no antisentido también están dentro del alcance de esta invención. Dos o más compuestos combinados pueden usarse juntos o secuencialmente.
65 En otra realización relacionada, las composiciones de la invención pueden contener uno o más oligonucleótidos antisentido, dirigidos a un primer ácido nucleico y uno o más compuestos antisentido adicionales dirigidos a una segunda diana de ácido nucleico. Alternativamente, las composiciones de la invención pueden contener dos o más oligonucleótidos antisentido dirigidos a diferentes regiones de la misma diana de ácido nucleico. Se conocen en la técnica numerosos ejemplos de oligonucleótidos antisentido. Pueden usarse dos o más oligonucleótidos combinados juntos o secuencialmente.
H. Dosificación
Se cree que la formulación de las composiciones terapéuticas y su administración posterior (dosificación) están dentro de los conocimientos de los expertos en la técnica. La dosificación depende de la gravedad y la capacidad de respuesta del estado patológico que va a tratarse, durante el curso de tratamiento que dura desde varios días hasta varios meses, o hasta que se logra la cura o una disminución del estado patológico. Pueden calcularse calendarios de dosificación óptimos a partir de mediciones de acumulación de fármaco en el organismo del paciente. Los expertos habituales pueden determinar fácilmente las dosificaciones óptimas, metodologías de dosificación y tasas de repetición. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los oligonucleótidos
15 individuales y generalmente pueden estimarse basándose en las CE50 que se ha encontrado que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosificación es de desde 0,01 ug hasta 100 g por kg de peso corporal y puede administrarse una vez o más al día, semanal, mensual o anualmente, o incluso una vez cada de 2 a 20 años. Los expertos habituales en la técnica pueden estimar fácilmente tasas de repetición para dosificación basadas en tiempos de residencia y concentraciones del fármaco medidos en tejidos o fluidos corporales. Tras el tratamiento satisfactorio, puede ser deseable hacer que el paciente se someta a terapia de mantenimiento para prevenir la recaída del estado patológico, administrándose el oligonucleótido en dosis de mantenimiento, que oscilan entre 0,01 ug y 100 g por kg de peso corporal, de una o más veces al día, a una vez cada 20 años.
Aunque la presente invención se ha descrito con especificidad según determinadas de sus realizaciones preferidas,
25 los siguientes ejemplos sirven sólo para ilustrar la invención y no se pretende que limiten la misma. Los ejemplos se refieren a ISIS de ASO 175317 que es un oligonucleótido de la invención así como a los resultados de los ASO relacionados.
Ejemplos
Ejemplo 1
Síntesis de fosforamiditas de nucleósido
35 Los siguientes compuestos, incluyendo amiditas y sus productos intermedios, se prepararon tal como se describe en la patente estadounidense 6.426.220 y el documento publicado PCT WO 02/36743; producto intermedio de 5’-Odimetoxitritil-timidina para 5-metil-dC amidita, producto intermedio de 5’-O-dimetoxitritil-2’-desoxi-5-metilcitidina para 5-metil-dC amidita, penúltimo producto intermedio de 5’-O-dimetoxitritil-2’-desoxi-N4-benzoil-5-metilcitidina para 5metil-dC amidita, [5’-O-(4,4’-dimetoxitrifenilmetil)-2’-desoxi-N4-benzoil-5-metilcitidin-3’-O-il]-2-cianoetil-N,Ndiisopropilfosforamidita (5-metil-dC amidita), 2’-fluorodesoxiadenosina, 2’-fluorodesoxiguanosina, 2’-fluorouridina, 2’fluorodesoxicitidina, amiditas modificadas con 2’-O-(2-metoxietilo), producto intermedio de 2’-O-(2-metoxietil)-5metiluridina, penúltimo producto intermedio de 5’-O-DMT-2’-O-(2-metoxietil)-5-metiluridina, [5’-O-(4,4’dimetoxitrifenilmetil)-2’-O-(2-metoxietil)-5-metiluridin-3’-O-il]-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita (MOE T amidita), producto intermedio de 5’-O-dimetoxitritil-2’-O-(2-metoxietil)-5-metilcitidina, penúltimo producto intermedio de 5’-O
45 dimetoxitritil-2’-O-(2-metoxietil)-N4-benzoil-5-metil-citidina, [5’-O-(4,4’-dimetoxitrifenilmetil)-2’-O-(2-metoxietil)-N4benzoil-5-metilcitidin-3’-O-il]-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita (MOE 5-Me-C amidita), [5’-O-(4,4’dimetoxitrifenilmetil)-2’-O-(2-metoxietil)-N6-benzoiladenosin-3’-O-il]-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita (MOE A amidita), [5’-O-(4,4’-dimetoxitrifenilmetil)-2’-O-(2-metoxietil)-N4-isobutirilguanosin-3’-O-il]-2-cianoetil-N,Ndiisopropilfosforamidita (MOE G amidita), amiditas de nucleósido de 2’-O-(aminooxietilo) y amiditas de nucleósido de 2’-O-(dimetilaminooxietilo), amiditas de nucleósido de 2’-(dimetilaminooxietoxilo), 5’-O-terc-butildifenilsilil-O2-2’anhidro-5-metiluridina, 5’-O-terc-butildifenilsilil-2’-O-(2-hidroxietil)-5-metiluridina, 2’-O-([2-ftalimidoxi)etil]-5’-tbutildifenilsilil-5-metiluridina, 5’-O-terc-butildifenilsilil-2’-O-[(2-formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina, 5’-O-tercbutildifenilsilil-2’-O-[N,N-dimetilaminooxietil]-5-metiluridina, 2’-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina, 5’-O-DMT-2’-O(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina, 5’-O-DMT-2’-O-(2-N,N-dimetilaminooxietil)-5-metiluridina-3’-[(2-cianoetil)-N,N
55 diisopropilfosforamidita], amiditas de nucleósido de 2’-(aminooxietoxilo), N2-isobutiril-6-O-difenilcarbamoil-2’-O-(2etilacetil)-5’-O-(4,4’-dimetoxitritil)guanosina-3’-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita], amiditas de nucleósido de 2’-dimetilaminoetoxietoxilo (2’-DMAEOE), 2’-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)etil]-5-metiluridina, 5’-O-dimetoxitritil-2’-O[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)-etil)]-5-metiluridina y 5’-O-dimetoxitritil-2’-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)-etil)]-5metiluridina-3’-O-(cianoetil-N,N-diisopropil)fosforamidita.
Ejemplo 2
Síntesis de oligonucleótidos y oligonucleósidos
65 Los oligonucleótidos antisentido usados según esta invención pueden prepararse de manera conveniente y rutinaria a través de la técnica bien conocida de síntesis en fase sólida. El equipo para tal síntesis lo comercializan varios proveedores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). Puede emplearse adicional o alternativamente cualquier otro medio para tal síntesis conocido en la técnica. Se conoce bien usar técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como los fosforotioatos y derivados alquilados.
5 Oligonucleótidos: Se sintetizan oligonucleótidos fosfodiéster (P=O) sustituidos y no sustituidos en un sintetizador de ADN automatizado (modelo 394 de Applied Biosystems) usando química de fosforamidita convencional con oxidación mediante yodo.
Se sintetizan fosforotioatos (P=S) de manera similar a oligonucleótidos fosfodiéster con las siguientes excepciones: se efectuó la tiación utilizando una disolución al 10% p/v de 1,1-dióxido de 3,H-1,2-benzoditiol-3-ona en acetonitrilo para la oxidación de los enlaces fosfita. Se aumentó el tiempo de la etapa de reacción de tiación hasta 180 s y le precedió la etapa de ocupación de extremos normal. Tras la escisión de la columna de CPG y el desbloqueo en hidróxido de amonio concentrado a 55ºC (12-16 h), se recuperaron los oligonucleótidos mediante precipitación con >3 volúmenes de etanol a partir de una disolución de NH4OAc 1 M. Se preparan oligonucleótidos de fosfinato tal
15 como se describe en la patente estadounidense 5.508.270.
Se preparan oligonucleótidos de fosfonato de alquilo tal como se describe en la patente estadounidense 4.469.863.
Se preparan oligonucleótidos de 3’-desoxi-3’-metilenfosfonato tal como se describe en las patentes estadounidenses
5.610.289 ó 5.625.050.
Se preparan oligonucleótidos de fosforamidita tal como se describe en la patente estadounidense 5.256.775 o la patente estadounidense 5.366.878.
25 Se preparan oligonucleótidos de fosfonotioato de alquilo tal como se describe en las solicitudes PCT publicadas PCT/US94/00902 y PCT/US93/06976 (publicadas como documentos WO 94/17093 y WO 94/02499, respectivamente).
Se preparan oligonucleótidos de 3’-desoxi-3’-aminofosforamidato tal como se describe en la patente estadounidense
5.476.925.
Se preparan oligonucleótidos de fosfotriéster tal como se describe en la patente estadounidense 5.023.243.
Se preparan oligonucleótidos de boranofosfato tal como se describe en las patentes estadounidenses 5.130.302 y 35 5.177.198,
Oligonucleósidos: Se preparan oligonucleósidos unidos con metilenmetilimino, también identificados como oligonucleósidos unidos con MMI, oligonucleósidos unidos con metilendimetilhidrazo, también identificados como oligonucleósidos unidos con MDH, y oligonucleósidos unidos con metilencarbonilamino, también identificados como oligonucleósidos unidos con amida-3, y oligonucleósidos unidos con metilenaminocarbonilo, también identificados como oligonucleósidos unidos con amida-4, así como compuestos de estructura principal mixta que tienen, por ejemplo, enlaces MMI y P=O o P=S alternos tal como se describe en las patentes estadounidenses 5.378.825, 5.386.023, 5.489.677, 5.602.240 y 5.610.289.
45 Se preparan oligonucleósidos unidos con formacetal y tioformacetal tal como se describe en las patentes estadounidenses 5.264.562 y 5.264.564.
Se preparan oligonucleósidos unidos con óxido de etileno tal como se describe en la patente estadounidense
5.223.618.
Ejemplo 3
Síntesis de ARN
55 En general, la química de síntesis de ARN se basa en la incorporación selectiva de diversos grupos protectores en reacciones intermedias estratégicas. Aunque un experto habitual en la técnica entenderá el uso de grupos protectores en la síntesis orgánica, una clase útil de grupos protectores incluye silil éteres. En particular, se usan silil éteres voluminosos para proteger el 5’-hidroxilo en combinación con un grupo protector de ortoéster lábil a ácidos en el 2’-hidroxilo. Este conjunto de grupos protectores se usa entonces con la tecnología de síntesis en fase sólida convencional. Es importante eliminar por último el grupo protector de ortoéster lábil a ácidos tras todas las otras etapas sintéticas. Además, el uso temprano de los grupos protectores de sililo durante la síntesis garantiza una fácil eliminación cuando se desee, sin desprotección no deseada del 2’ hidroxilo.
Tras este procedimiento para la protección secuencial del 5’-hidroxilo en combinación con la protección del 2’
65 hidroxilo mediante grupos protectores que se eliminan de manera diferencial y que son químicamente lábiles de manera diferencial, se sintetizaron oligonucleótidos de ARN.
Se sintetizan oligonucleótidos de ARN de un modo por etapas. Se añade cada nucleótido secuencialmente (dirección de 3’ a 5’) a un oligonucleótido unido a un soporte sólido. El primer nucleósido en el extremo 3’ de la cadena se une covalentemente a un soporte sólido. Se añaden el precursor de nucleótido, una fosforamidita de
5 ribonucleósido, y el activador, acoplando la segunda base sobre el extremo 5’ del primer nucleósido. Se lava el soporte y se ocupa cualquier grupo 5’-hidroxilo sin reaccionar con anhídrido acético para producir restos 5’-acetilo. Se oxida entonces el enlace para dar el enlace P(V) más estable y deseado en última instancia. Al final del ciclo de adición de nucleótido, se escinde el grupo 5’-sililo con fluoruro. Se repite el ciclo para cada nucleótido posterior.
Tras la síntesis, se escinden los grupos protectores de metilo en los fosfatos en 30 minutos utilizando 2-carbamoil-2cianoetilen-1,1-ditiolato de disodio trihidratado 1 M (S2Na2) en DMF. Se lava la disolución de desprotección del oligonucleótido unido al soporte sólido usando agua. Se trata entonces el soporte con metilamina al 40% en agua durante 10 minutos a 55ºC. Esto libera los oligonucleótidos de ARN en la disolución, desprotege las aminas exocíclicas y modifica los grupos 2’. Los oligonucleótidos pueden analizarse mediante HPLC de intercambio aniónico
15 en esta fase.
Los grupos 2’-ortoéster son los últimos grupos protectores en eliminarse. El grupo protector de ortoéster de monoacetato de etilenglicol desarrollado por Dharmacon Research, Inc. (Lafayette, CO) es un ejemplo de un grupo protector de ortoéster útil que tiene las siguientes propiedades importantes. Es estable en las condiciones de síntesis de fosforamiditas de nucleósido y síntesis de oligonucleótidos. Sin embargo, tras la síntesis de oligonucleótidos, el oligonucleótido se trata con metilamina que no sólo escinde el oligonucleótido del soporte sólido sino que también elimina los grupos acetilo de los ortoésteres. Los sustituyentes de 2-etil-hidroxilo resultantes en el ortoéster son menos secuestrantes de electrones que el precursor acetilado. Como resultado, el ortoéster modificado se hace más lábil a la hidrólisis catalizada por ácido. Específicamente, la velocidad de escisión es aproximadamente 10 veces
25 más rápida tras eliminarse los grupos acetilo. Por tanto, este ortoéster presenta suficiente estabilidad con el fin de ser compatible con la síntesis de oligonucleótidos y aún, cuando se modifica posteriormente, permite que la desprotección se lleve a cabo en condiciones acuosas relativamente suaves compatibles con el producto de oligonucleótido de ARN final.
Adicionalmente, se conocen bien en la técnica métodos de síntesis de ARN (Scaringe, Ph.D. Thesis, University of Colorado, 1996; Scaringe et al., J. Am. Chem. Soc. 120: 11820-11821; 1998; Matteucci y Caruthers, J. Am. Chem. Soc.103: 3185-3191, 1981; Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862, 1981; Dahl et al., Acta Chem. Scand. 44: 639-641; 1990, Reddy et al., Tetrahedrom Lett. 25: 4311-4314, 1994; Wincott et al., Nucleic Acids Res.
23: 2677-2684, 1995; Griffin et al., Tetrahedron 23: 2301-2313, 1967a; Griffin et al., Tetrahedron 23: 2315-2331, 35 1967b).
Pueden sintetizarse compuestos antisentido de ARN (oligonucleótidos de ARN) de la presente invención mediante los métodos en el presente documento o adquirirse de Dharmacon Research, Inc (Lafayette, CO). Una vez sintetizados, pueden aparearse entonces compuestos antisentido de ARN complementarios mediante métodos conocidos en la técnica para formar compuestos antisentido bicatenarios (en dúplex). Por ejemplo, pueden formarse dúplex combinando 30 μl de cada una de las hebras complementarias de oligonucleótidos de ARN (disolución de oligonucleótidos de ARN 50 uM) y 15 μl de tampón de apareamiento 5X (acetato de potasio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM pH 7,4, acetato de magnesio 2 mM) seguido por calentamiento durante 1 minuto a 90ºC, luego 1 hora a 37ºC. Los compuestos antisentido en dúplex resultantes pueden usarse en kits, ensayos, selecciones u otros
45 métodos para investigar el papel de un ácido nucleico diana.
Ejemplo 4
Síntesis de oligonucleótidos quiméricos
Los oligonucleósidos, oligonucleótidos quiméricos u oligonucleótidos/oligonucleósidos mixtos de la invención pueden ser de varios tipos diferentes. Éstos incluyen un primer tipo en el que el segmento “gap” de nucleósidos unidos está situado entre segmentos “wing” 5’ y 3’ de nucleósidos unidos y un segundo tipo de “extremos abiertos” en el que el segmento “gap” está ubicado en el extremo o bien 3’ o bien 5’ terminal del compuesto oligomérico. Los
55 oligonucleótidos del primer tipo se conocen también en la técnica como “gapmeros” (“gapmers”) u oligonucleótidos incompletos. Los oligonucleótidos del segundo tipo se conocen también en la técnica como “hemímeros” o “wingmeros” (“wingmers”).
Oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos de [2’-O-Me]-[2’-desoxi]-[2’-O-Me]
Se sintetizan oligonucleótidos quiméricos que tienen segmentos de oligonucleótidos de 2’-fosforotioato de O-alquilo y 2’-desoxifosforotioato usando un sintetizador de ADN automatizado de Applied Biosystems modelo 394, tal como anteriormente. Se sintetizan oligonucleótidos usando el sintetizador automatizado y 2’-desoxi-5’-dimetoxitritil-3’-Ofosforamidita para la parte de ADN y 5’-dimetoxitritil-2’-O-metil-3’-O-fosforamidita para los segmentos “wing” 5’ y 3’. 65 El ciclo de síntesis convencional se modifica incorporando etapas de acoplamiento con tiempos de reacción aumentados para la 5’-dimetoxitritil-2’-O-metil-3’-O-fosforamidita. Se escinde el oligonucleótido completamente
protegido del soporte y se desprotege en amoniaco concentrado (NH4OH) durante 12-16 h a 55ºC. Se recupera entonces el oligo desprotegido mediante un método apropiado (precipitación, cromatografía en columna, volumen reducido a vacío) y se analiza espectrofotométricamente para determinar el rendimiento y la pureza mediante electroforesis capilar y mediante espectrometría de masas.
Oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos de [2’-O-(2-metoxietil)]-[2’-desoxi]-[2’-O-(metoxietilo)]
Se prepararon oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos de [2’-O-(2-metoxietil)]--[2’-desoxi]--[-2’-O-(metoxietilo)] según el procedimiento anterior para el oligonucleótido quimérico de 2’-O-metilo, con la sustitución de las 2’-O-metilamiditas por las 2’-O-(metoxietil)-amiditas.
Oligonucleótidos quiméricos de [2’-O-(2-metoxietil)fosfodiéster]-[2’-desoxifosforotioato]-[2’-O-(2metoxietil)fosfodiéster]
15 Se preparan oligonucleótidos quiméricos de [2’-O-(2-metoxietilfosfodiéster]--[2’-desoxifosforotioato]--[2’-O(metoxietil)fosfodiéster] según el procedimiento anterior para el oligonucleótido quimérico de 2’-O-metilo con la sustitución de las 2’-O-metil amiditas por 2’-O-(metoxietil)-amiditas, oxidación con yodo para generar los enlaces internucleotídicos de fosfodiéster con las partes de segmento “wing” de las estructuras quiméricas y sulfurización utilizando 1,1 dióxido de 3,H-1,2-benzoditiol-3-ona (reactivo de Beaucage) para generar los enlaces internucleotídicos de fosforotioato para el segmento gap del centro.
Se sintetizan otros oligonucleótidos quiméricos, oligonucleósidos quiméricos y oligonucleótidos/oligonucleósidos mixtos según la patente estadounidense 5.623.065.
25 Ejemplo 5
Diseño y selección de compuestos antisentido en dúplex que seleccionan como diana ARNm de IGF-1R
Puede diseñarse una serie de dúplex de ácido nucleico que comprenden los compuestos antisentido tales como oligonucleótidos antisentido de la presente invención y sus complementos para que seleccionen como diana ARNm de IGF-IR. La secuencia de nucleobases de la hebra antisentido del dúplex comprende al menos una parte de un oligonucleótido seleccionado SEQ ID NO: 1 hasta 76 y SEQ ID NO: 100 hasta 136 mostradas en la tabla 1 incluyendo ISIS de ASO 175308, 175302, 175314, 175307, 175317, 175323, 232744, 323747, 323767, 323762 y 323737. Los extremos de las hebras pueden modificarse mediante la adición de una o más nucleobases naturales o
35 modificadas para formar una proyección. Se diseña entonces la hebra sentido del ARNbc y se sintetiza como el complemento de la hebra antisentido y también puede contener modificaciones o adiciones en cualquier extremo terminal. Por ejemplo, en una realización, ambas hebras del dúplex de ARNbc serían complementarias a lo largo de las nucleobases centrales, teniendo cada una proyecciones en unos o ambos extremos terminales.
Por ejemplo, un dúplex que comprende una hebra antisentido que tiene la secuencia CGAGAGGCGGACGGGACCG y que tiene una proyección de dos nucleobases de desoxitimidina (dT) tendría la siguiente estructura:
45 Pueden sintetizarse las hebras de ARN del dúplex mediante métodos dados a conocer en el presente documento o adquirirse de Dharmacon Research Inc., (Lafayette, CO). Una vez sintetizadas, se aparean las hebras complementarias. Se toman alícuotas de hebras individuales y se diluyen hasta una concentración de 50 uM. Una vez diluidas, se combinan 30 ul de cada hebra con 15 ul de una disolución 5X de tampón de apareamiento. La concentración final de dicho tampón es acetato de potasio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM pH 7,4 y acetato de magnesio 2 mM. El volumen final es de 75 ul. Se incuba esta disolución durante 1 minuto a 90ºC y luego se centrifuga durante 15 segundos. Se deja reposar el tubo durante 1 hora a 37ºC, momento en el que se usan los dúplex de ARNbc en la experimentación. La concentración final del dúplex de ARNbc es de 20 uM. Puede almacenarse esta disolución congelada (-20ºC) y congelarse-descongelarse hasta 5 veces.
55 Una vez preparados, se evalúan los compuestos antisentido en dúplex para determinar su capacidad para modular la expresión génica de IGF-IR.
Cuando las células alcanzan el 80% de confluencia, se tratan con los compuestos antisentido en dúplex de la invención. Para células hechas crecer en placas de 96 pocillos, se lavan los pocillos una vez con 200 μl de medio reducido en suero OPTI-MEM-1 (Gibco BRL) y entonces se tratan con 130 μl de OPTI-MEM-1 que contiene LIPOFECTIN 12 μg/ml (Gibco BRL) y el compuesto antisentido de dúplex deseado a una concentración final de 200 nM. Tras 5 horas de tratamiento, se reemplaza el medio por medio nuevo. Se recogen las células 16 horas tras el tratamiento, momento en el que se aísla el ARN y se mide la reducción de la diana mediante RT-PCR.
Ejemplo 6
5 Aislamiento de oligonucleótidos
Tras la escisión del soporte sólido de vidrio de poro controlado y el desbloqueo en hidróxido de amonio concentrado 55ºC durante 12-16 horas, se recuperan los oligonucleótidos o oligonucleósidos mediante precipitación en NH4OAc 1 M con >3 volúmenes de etanol. Se analizan los oligonucleótidos sintetizados mediante espectroscopía de masas por electrospray (determinación del peso molecular) y mediante electroforesis en gel capilar y se determina que son material de longitud completa al menos al 70%. Se determinaron las cantidades relativas de enlaces fosforotioato y fosfodiéster obtenidas en la síntesis mediante la razón de peso molecular correcto en relación con el producto de -16 amu (+/-32 +/-48). Para algunos estudios, se purificaron oligonucleótidos mediante HPLC, tal como se describe por Chiang et al., J. Biol. Chem. 266: 18162-18171, 1991. Los resultados obtenidos con el material purificado
15 mediante HPLC fueron similares a los obtenidos con el material no purificado mediante HPLC.
Ejemplo 7
Síntesis de oligonucleótidos – Formato de placa de 96 pocillos
Se sintetizaron oligonucleótidos mediante química de fosforamidita de fase sólida P(III) en un sintetizador automatizado de que puede ensamblar 96 secuencias simultáneamente en un formato de 96 pocillos. Se produjeron enlaces internucleotídicos fosfodiéster mediante oxidación con yodo acuoso. Se generaron enlaces internucleotídicos de fosforotioato mediante sulfurización utilizando 1,1-dióxido de 3,H-1,2-benzoditiol-3-ona (reactivo
25 de Beaucage) en acetonitrilo anhidro. Se adquirieron beta-cianoetil-diiso-propilfosforamiditas protegidas con bases convencionales de proveedores comerciales (por ejemplo PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, o Pharmacia, Piscataway, NJ). Se sintetizan nucleósidos no convencionales según métodos patentados o convencionales. Se utilizan como beta-cianoetildiisopropilfosforamiditas protegidas con bases.
Se escindieron los oligonucleótidos del soporte y se desprotegieron con NH4OH concentrado a temperatura elevada (55-60ºC) durante 12-16 horas y entonces se secó el producto liberado a vacío. Entonces se resuspendió el producto secado en agua estéril para proporcionar una placa madre a partir de la cual se diluyen entonces todas las muestras de placa de prueba y analíticas utilizando pipetas robóticas.
35 Ejemplo 8
Análisis de oligonucleótidos – Formato de placa de 96 pocillos
Se evaluó la concentración de oligonucleótido en cada pocillo mediante dilución de muestras y espectroscopía de absorción UV. Se evaluó la integridad de la longitud completa de los productos individuales mediante electroforesis capilar (EC) en o bien el formato de 96 pocillos (Beckman P/ACE (marca comercial) MDQ) o bien, para muestras preparadas individualmente, en un aparato de EC comercial (por ejemplo, Beckman P/ACE (marca comercial) 5000, ABI 270). Se confirmó la composición de la estructura principal y las bases mediante análisis de masas de los compuestos utilizando espectroscopía de masas por electrospray. Se diluyeron todas las placas de prueba del
45 ensayo a partir de la placa madre usando pipetas robóticas de un único canal y de múltiples canales. Se determinó que las placas eran aceptables si al menos el 85% de los compuestos en la placa eran de longitud completa al menos al 85%.
Ejemplo 9
Cultivo celular y tratamiento de oligonucleótidos
Puede someterse a prueba el efecto de los compuestos antisentido sobre la expresión de ácido nucleico diana en cualquiera de una variedad de tipos celulares siempre que el ácido nucleico diana esté presente a niveles medibles.
55 Esto puede determinarse de manera rutinaria usando, por ejemplo análisis de transferencia de tipo Northern o PCR. Se proporcionan los siguientes tipos celulares para fines ilustrativos, aunque pueden usarse de manera rutinaria otros tipos celulares, siempre que la diana se exprese en el tipo celular elegido. Esto puede determinarse fácilmente mediante métodos de rutina en la técnica, por ejemplo, análisis de transferencia de tipo Northern, ensayos de protección de ribonucleasa o RT-PCR.
Células T-24:
Se obtuvo la línea celular de carcinoma de células transicionales de vejiga humano T-24 de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) (Manassas, VA). Se cultivaron de manera rutinaria células T-24 en medio basal 5A de 65 McCoy completo (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) complementado con suero de ternero fetal al 10% p/v (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), penicilina 100 unidades por ml y estreptomicina 100 microgramos por ml
(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Se realizaron pases de las células de manera rutinaria mediante tripsinización y dilución cuando alcanzaron el 90% de confluencia. Se sembraron las células en placas de 96 pocillos (Falcon-Primaria n.º 353872) a una densidad de 7000 células/pocillo para su uso en análisis de RT-PCR.
5 Para la transferencia de tipo Northern u otro análisis, pueden sembrarse las células sobre placas de 100 mm u otras placas de cultivo de tejido y convencionales tratarse de manera similar, usando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.
Células A549:
Se obtuvo la línea celular de carcinoma de pulmón humano A549 de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) (Manassas, VA). Se cultivaron de manera rutinaria células A549 en medio basal DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) complementado con suero de ternero fetal al 10% (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), penicilina 100 unidades por ml y estreptomicina 100 microgramos por ml (Invitrogen Corporation, Carlsbad,
15 CA). Se realizaron pases de las células de manera rutinaria mediante tripsinización y dilución cuando alcanzaron el 90% de confluencia.
Células NHDF:
Se obtuvieron fibroblastos dérmicos neonatales humanos (NHDF) de Clonetics Corporation (Walkersville, MD). Se mantuvieron los NHDF de manera rutinaria en medio de crecimiento de fibroblastos (Clonetics Corporation, Walkersville, MD) complementado tal como recomienda el proveedor. Se mantuvieron las células durante hasta 10 pases tal como recomienda el proveedor.
25 Células HEK:
Se obtuvieron queratinocitos embrionarios humanos (HEK) de Clonetics Corporation (Walkersville, MD). Se mantuvieron los HEK de manera rutinaria en medio de crecimiento de queratinocitos (Clonetics Corporation, Walkersville, MD) formulado tal como recomienda el proveedor. Se mantuvieron las células de manera rutinaria durante hasta 10 pases tal como recomienda el proveedor.
Tratamiento con compuestos antisentido:
Cuando las células alcanzaron el 65-75% de confluencia, se trataron con oligonucleótido. Para células hechas crecer
35 en placas de 96 pocillos, se lavaron los pocillos una vez con 100 μl de medio reducido en suero OPTI-MEM (marca comercial)-1 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) y entonces se trataron con 130 μl de OPTI-MEM (marca comercial)-1 que contenía 3,75 μg/ml de LIPOFECTIN (marca comercial) (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) y la concentración deseada de oligonucleótido. Se tratan las células y se obtienen los datos por triplicado. Tras 4-7 horas de tratamiento a 37ºC, se reemplazó el medio por medio nuevo. Se recogieron las células 16-24 horas tras el tratamiento con oligonucleótido.
La concentración de oligonucleótido usada varía de línea celular a línea celular. Para determinar la concentración de oligonucleótido óptima para una línea celular particular, se tratan las células con un oligonucleótido control positivo a una gama de concentraciones.
45 Para células humanas, el oligonucleótido control positivo se selecciona de o bien ISIS 13920 (TCCGTCATCGCTCCTCAGGG, SEQ ID NO: 79) que se dirige a H-ras humano, o bien ISIS 18078, (GTGCGCGCGAGCCCGAAATC, SEQ ID NO: 80) que se dirige a Jun-N-terminal cinasa-2 humano (JNK2). Ambos controles son gapmeros de 2’-O-metoxietilo (2’-O-metoxietilos mostrados en negrita) con una estructura principal de fosforotioato. Para células de ratón o rata, el oligonucleótido control positivo es ISIS 15770, ATGCATTCTGCCCCCAAGGA, SEQ ID NO: 81, un gapmero de 2’-O-metoxietilo (2’-O-metoxietilos mostrados en negrita) con una estructura principal de fosforotioato que se dirige a c-raf tanto de ratón como de rata. La concentración de oligonucleótido control positivo que da como resultado el 80% de inhibición del ARNm de c-H-ras (para ISIS 13920), JNK2 (para ISIS 18078) o c-raf (para ISIS 15770) se utiliza entonces como concentración de
55 selección para nuevos oligonucleótidos en experimentos posteriores para esa línea celular. Si no se logra el 80% de inhibición, la concentración más baja de oligonucleótido control positivo que da como resultado el 60% de inhibición del ARNm de c-H-ras, JNK2 o c-raf ARNm se utiliza entonces como concentración de selección de oligonucleótidos en experimentos posteriores para esa línea celular. Si no se logra el 60% de inhibición, se considera que esa línea celular particular no es adecuada para experimentos de transfección de oligonucleótidos. Las concentraciones de oligonucleótidos antisentido usadas en el presente documento son de desde 50 nM hasta 300 nM.
Ejemplo 10
Análisis de la inhibición por oligonucleótidos de la expresión génica de IGF-1R
65 Puede someterse a ensayo la modulación antisentido de la expresión génica de IGF-1R de una variedad de modos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden cuantificarse los niveles de ARNm de IGF-IR mediante, por ejemplo, análisis de transferencia de tipo Northern, reacción en cadena de la polimerasa competitiva (PCR) o PCR en tiempo real (RT-PCR). Se prefiere actualmente la PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis del ARN puede realizarse sobre ARN celular total o ARN poli(A)+. El método preferido de análisis de ARN de la presente invención es el uso
5 de ARN celular total tal como se describe en otros ejemplos en el presente documento. Se conocen bien en la técnica métodos de aislamiento de ARN. El análisis de transferencia de tipo Northern también es de rutina en la técnica. La (PCR) cuantitativa en tiempo real puede lograrse convenientemente usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM (marca comercial) 7600, 7700 ó 7900 disponible comercialmente, disponible de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y usado según las instrucciones del fabricante.
Pueden cuantificarse los niveles de proteína de IGF-IR de una variedad de modos bien conocidos en la técnica, tales como immunoprecipitación, análisis de inmunotransferencia de tipo Western (inmunotransferencia), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Pueden identificarse anticuerpos dirigidos contra IGF-IR y obtenerse de una variedad de fuentes, tales como el catálogo de
15 de anticuerpos de MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse mediante métodos de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales convencionales bien conocidos en la técnica.
Ejemplo 11
Diseño de ensayos fenotípicos y estudios in vivo para el uso de inhibidores de la expresión génica de IGF-1R
Ensayos fenotípicos
Una vez que se han identificado inhibidores de la expresión génica de IGF-IR mediante los métodos dados a
25 conocer en el presente documento, se investigan los compuestos adicionalmente en uno o más ensayos fenotípicos, teniendo cada uno criterios de valoración medibles predictivos de la eficacia en el tratamiento de una afección o estado patológico particular.
Los expertos en la técnica conocen bien ensayos fenotípicos, kits y reactivos para su uso y se usan en el presente documento para investigar el papel y/o la asociación de IGF-IR en salud y enfermedad. Los ensayos fenotípicos representativos, que pueden adquirirse de uno cualquiera de varios proveedores comerciales, incluyen aquéllos para determinar la viabilidad celular, citotoxicidad, proliferación o supervivencia celular (Molecular Probes, Eugene, OR; PerkinElmer, Boston, MA), ensayos basados en proteínas incluyendo ensayos enzimáticos (Panvera, LLC, Madison, WI; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ; Oncogene Research Products, San Diego, CA), regulación celular,
35 transducción de señales, inflamación, procesos oxidativos y apoptosis (Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI), acumulación de triglicéridos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ensayos de angiogénesis, ensayos de formación de tubos, ensayos de citocinas y hormonas y ensayos metabólicos (Chemicon International Inc., Temecula, CA; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
En un ejemplo no limitativo, se tratan células que se determina que son apropiadas para un ensayo fenotípico particular (es decir, células MCF-7 seleccionadas de estudios de cáncer de mama; adipocitos para estudios de obesidad) con inhibidores de la expresión génica de IGF-IR identificados a partir de estudios in vitro así como compuestos de control a concentraciones óptimas que se determinan mediante los métodos descritos anteriormente. Al final del periodo de tratamiento, se analizan las células tratadas y no tratadas mediante uno o más métodos
45 específicos para el ensayo para determinar los criterios de valoración y desenlaces fenotípicos.
Los criterios de valoración fenotípicos incluyen cambios en la morfología celular a lo largo del tiempo o la dosis de tratamiento así como cambios en los niveles de componentes celulares tales como proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, hormonas, sacáridos o metales. Mediciones del estado celular que incluyen pH, estadio del ciclo celular, ingesta o excreción de indicadores biológicos por la célula, son también criterios de valoración de interés.
También se usa el análisis del genotipo de la célula (medición de la expresión de uno o más de los genes de la célula) tras el tratamiento como indicador de la eficacia o potencia de los inhibidores de la expresión génica de IGF-IR. Se miden genes distintivos, o los genes que se sospecha que están asociados con un estado patológico,
55 afección o fenotipo específico, tanto en células tratadas como no tratadas.
Estudios in vivo
Los sujetos individuales de los estudios in vivo descritos el presente documento son animales vertebrados de sangre caliente, que incluyen a seres humanos.
El ensayo clínico se somete a rigurosos controles para garantizar que los individuos no se ponen en riesgo innecesariamente y que se les informa completamente sobre su papel en el estudio. Para explicar los efectos psicológicos de los tratamientos que se reciben, se les administra a los voluntarios aleatoriamente placebo o 65 inhibidor de la expresión génica de IGF-IR. Además, para evitar que los médicos tengan un sesgo en los tratamientos, no se les informa de si la medicación que están administrando es un inhibidor de la expresión génica
de IGF-IR o un placebo. Usando este enfoque de aleatorización, cada voluntario tiene la misma posibilidad de que se le administre o bien el nuevo tratamiento o bien el placebo.
Los voluntarios reciben o bien el inhibidor de la expresión génica de IGF-IR o bien placebo durante un periodo de
5 ocho semanas midiéndose parámetros biológicos asociados con la afección o el estado patológico que está midiéndose al comienzo (mediciones iniciales antes de cualquier tratamiento), al final (tras el tratamiento final) y a intervalos regulares durante el periodo de estudio. Tales mediciones incluyen los niveles de moléculas de ácido nucleico que codifican para IGF-IR o los niveles de proteína de IGF-IR en fluidos corporales, tejidos u órganos en comparación con los niveles antes del tratamiento. Otras mediciones incluyen, pero no se limitan a, índices de la afección o el estado patológico que está tratándose, el peso corporal, la tensión arterial, los títulos séricos de indicadores farmacológicos de enfermedad o toxicidad así como mediciones de ADME (absorción, distribución, metabolismo y excreción).
La información registrada para cada paciente incluye la edad (años), el género, la altura (cm), la historia familiar de
15 afección o estado patológico (sí/no), clasificación de motivación (algo/moderada/grande) y el número y tipo de regímenes de tratamiento previos para la afección o enfermedad indicada.
Los voluntarios que toman parte en este estudio son adultos sanos (edad de 18 a 65 años) y aproximadamente un número igual de sujetos masculinos y femeninos participan en el estudio. Los voluntarios con determinadas características se distribuyen por igual para el tratamiento con placebo e inhibidor de la expresión génica de IGF-IR. En general, los voluntarios tratados con placebo tienen poca o ninguna respuesta al tratamiento, mientras que los voluntarios tratados con el inhibidor de la expresión génica de IGF-IR muestran tendencias positivas en su índice de afección o estado patológico al final del estudio.
25 Ejemplo 12
Aislamiento de ARN
Aislamiento de ARNm poli(A)+
Se aisló ARNm poli(A)+ según Miura et al. (Clin. Chem. 42: 1758-1764, 1996). Otros métodos para el aislamiento de ARNm poli(A)+ son de rutina en la técnica. En resumen, para células hechas crecer en placas de 96 pocillos, se eliminó el medio de crecimiento de las células y se lavó cada pocillo con 200 μl de PBS frío. Se añadieron 60 μl de tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M, NP-40 al 0,5%, complejo de vanadil
35 ribonucleósido 20 mM) a cada pocillo, se agitó la placa suavemente y entonces se incubó a temperatura ambiente durante cinco minutos. Se transfirieron 55 μl de lisado a placas de 96 pocillos recubiertas con Oligo d(T) (AGCT Inc., Irvine CA). Se incubaron las placas durante 60 minutos a temperatura ambiente, se lavaron 3 veces con 200 μl de tampón de lavado (Tris-HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 1 mM, NaCl 0,3 M). Tras el lavado final, se secaron las placas sobre servilletas de papel para eliminar el tampón de lavado en exceso y entonces se secaron al aire durante 5 minutos. Se añadieron a cada pocillo 60 μl de tampón de elución (Tris-HCl 5 mM pH 7,6), precalentado hasta 70ºC, se incubó la placa sobre una placa caliente a 90ºC durante 5 minutos y entonces se transfirió el eluato a una placa de 96 pocillos nueva.
Las células hechas crecer en placas de 100 mm u otras placas convencionales pueden tratarse de manera similar, 45 usando volúmenes apropiados de todas las disoluciones.
Aislamiento de ARN total
Se aisló el ARN total usando un kit RNEASY 96 (marca comercial) y tampones adquiridos de Qiagen Inc. (Valencia, CA) siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante. En resumen, para células hechas crecer en placas de 96 pocillos, se eliminó el medio de crecimiento de las células y se lavó cada pocillo con 200 μl de PBS frío. Se añadieron a cada pocillo 150 μl de tampón RLT y se agitó la placa vigorosamente durante 20 segundos. Entonces se añadieron a cada pocillo 150 μl de etanol al 70% y se mezcló el contenido pipeteando tres veces arriba y abajo. Se transfirieron entonces las muestras a la placa de pocillos RNEASY 96 (marca comercial) conectada a un 55 colector QIAVAC (marca comercial) equipado con una bandeja de recogida de desechos y conectado a una fuente de vacío. Se aplicó vacío durante 1 minuto. Se añadieron 500 μl de tampón RW1 a cada pocillo de la placa RNEASY 96 (marca comercial) y se incubó durante 15 minutos y se aplicó de nuevo el vacío durante 1 minuto. Se añadieron 500 μl adicionales de tampón RW1 a cada pocillo de la placa RNEASY 96™ y se aplicó el vacío durante 2 minutos. Se añadió entonces 1 ml de tampón RPE a cada pocillo de la placa RNEASY 96 (marca comercial) y se aplicó el vacío durante un periodo de 90 segundos. Se repitió entonces el lavado con tampón RPE y se aplicó el vacío durante 3 minutos adicionales. Se retiró entonces la placa del colector QIAVAC (marca comercial) y se secó sobre servilletas de papel. Entonces volvió a conectarse la placa al colector QIAVAC (marca comercial) equipado con una gradilla de tubos de recogida que contenía tubos de recogida de 1,2 ml. Se eluyó entonces el ARN pipeteando 140 μl de agua libre de ARNasa a cada pocillo, incubando 1 minuto y aplicando entonces el vacío durante 3 minutos.
65 Las etapas de elución y pipeteo repetitivas pueden automatizarse usando un instrumento Bio-Robot 9604 de QIAGEN (Qiagen, Inc., Valencia CA). Esencialmente, tras la lisis de las células en la placa de cultivo, se transfiere la placa a la plataforma del robot donde se llevan a cabo las etapas de pipeteo, tratamiento con ADNasa y elución.
5 Ejemplo 13
Análisis de PCR cuantitativa en tiempo real de los niveles de ARNm de IGF-1R
Se logró la cuantificación de los niveles ARNm de IGF-1R mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM (marca comercial) 7600, 7700 ó 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Éste es un sistema de detección de fluorescencia de tubo cerrado, no basado en gel que permite la cuantificación de alto rendimiento de productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. En contraposición a la PCR convencional en la que los productos de amplificación se cuantifican tras completarse la PCR, los productos en la PCR cuantitativa en tiempo real se 15 cuantifican a medida que se acumulan. Esto se logra incluyendo en la reacción PCR una sonda de oligonucleótido que se aparea específicamente entre los cebadores de PCR directo e inverso, y contiene dos colorantes fluorescentes. Se une un colorante indicador (por ejemplo, FAM o JOE, obtenido de o bien PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CA o bien Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA) al extremo 5’ de la sonda y se une un colorante extintor (por ejemplo, TAMRA, obtenido de o bien PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CA o bien Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA) al extremo 3’ de la sonda. Cuando la sonda y los colorantes están intactos, la emisión del colorante indicador se extingue por la proximidad del colorante extintor en 3’. Durante la amplificación, el apareamiento de la sonda a la secuencia diana crea un sustrato que puede escindirse mediante la actividad exonucleasa 5’ de Taq polimerasa. Durante la fase de extensión del ciclo de amplificación por PCR, la escisión de la sonda mediante la Taq
25 polimerasa libera el colorante indicador del resto de la sonda (y por tanto del resto extintor) y se genera una señal fluorescente específica de secuencia. Con cada ciclo, se escinden moléculas de colorante indicador adicionales de sus respectivas sondas, y se monitoriza la intensidad de fluorescencia a intervalos regulares mediante la óptica de láser incorporada en el sistema de detección de secuencias ABI PRISM (marca comercial). En cada ensayo, una serie de reacciones en paralelo que contienen diluciones en serie de ARNm de muestras control no tratadas genera una curva patrón que se usa para cuantificar el porcentaje de inhibición tras el tratamiento con oligonucleótidos antisentido de muestras de prueba.
Antes del análisis de PCR cuantitativa, se evalúan conjuntos de cebador-sonda específicos para el gen diana que está midiéndose para evaluar su capacidad para “multiplexarse” con una reacción de amplificación de GAPDH. En la
35 multiplexación, tanto el gen diana como el gen patrón interno GAPDH se amplifican simultáneamente en una única muestra. En este análisis, de diluye en serie ARNm aislado de células no tratadas. Cada dilución se amplifica en presencia de conjuntos de cebador-sonda específicos para GAPDH sólo, gen diana sólo (“uniplexación”) o ambos (multiplexación). Tras la amplificación por PCR, se generan curvas patrón de ARNm de la diana y GAPDH como función de la dilución a partir de las muestras tanto uniplexadas como multiplexadas. Si tanto la pendiente como el coeficiente de correlación de las señales de la diana y GAPDH generadas a partir de las muestras multiplexadas se encuentran dentro del 10% de sus valores correspondientes generados a partir de las muestras uniplexadas, el conjunto de cebador-sonda específico para esa diana se considera multiplexable. También se conocen en la técnica otros métodos de PCR.
45 Se obtuvieron reactivos de PCR de Invitrogen Corporation, (Carlsbad, CA). Se llevaron a cabo las reacciones de RT-PCR añadiendo 20 μl de cóctel de PCR (tampón de PCR 2,5x menos MgCl2, MgCl2 6,6 mM, 375 μM de cada uno de dATP, dCTP, dCTP y dGTP, 375 nM de cada uno de cebador directo y cebador inverso, 125 nM de sonda, 4 unidades de inhibidor de ARNasa, 1,25 unidades de Taq PLATINUM (marca comercial registrada), 5 unidades de transcriptasa inversa de MuLV y colorante ROX 2,5x) a placas de 96 pocillos que contenían 30 μl de disolución de ARN total (20-200 ng). Se llevó a cabo la reacción de RT mediante incubación durante 30 minutos a 48ºC. Tras una incubación de 10 minutos a 95ºC para activar la Taq PLATINUM (marca comercial registrada), se llevaron a cabo 40 ciclos de un protocolo de PCR de dos etapas: 95ºC durante 15 segundos (desnaturalización) seguido por 60ºC durante 1,5 minutos (apareamiento/extensión).
55 Se normalizan las cantidades de diana génica obtenidas mediante RT-PCR en tiempo real usando o bien el nivel de expresión de GAPDH, un gen cuya expresión es constante, o bien cuantificando el ARN total usando RiboGreen (marca comercial) (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). Se cuantifica la expresión de GAPDH mediante RT-PCR en tiempo real, ejecutándose simultáneamente con la diana, multiplexando o por separado. Se cuantifica el ARN total usando el reactivo de cuantificación de ARN RiboGreen (marca comercial) (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). Se enseñan métodos de cuantificación de ARN mediante RiboGreen (marca comercial) en Jones et al. (Analytical Biochemistry 265: 368-374, 1998).
En este ensayo, se pipetean 170 μl de reactivo de trabajo RiboGreen (marca comercial) (reactivo RiboGreen (marca comercial) diluido 1:350 en Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) en una placa de 96 pocillos que contiene 30 μl de
65 ARN celular, purificado. Se lee la placa en un instrumento CytoFluor 4000 (PE Applied Biosystems) con excitación a 485 nm y emisión a 530 nm.
Se diseñaron sondas y cebadores para IGF-IR humano para que se hibridasen con la secuencia de nucleótidos de IGF-IR, usando información de secuencia publicada (número de registro de GenBank NM000875 (figuras 2A y 2B), incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 76 o M69229 (SEQ ID NO: 77) que es la región no
5 traducida en 5’ de la secuencia génica de IGF-IR). Para IGF-IR humano, los cebadores de PCR eran:
cebador directo: CCCTTTCTTTGCAGTTTTCCC (SEQ ID NO: 82 - ISIS 161212);
cebador inverso: CGTCGTCGGCCTCCATT (SEQ ID NO: 83 - 161214); y
la sonda de PCR era: FAM-CCTTCCTGCCTCTCCGGGTTTGA-TAMRA (SEQ ID NO: 84 - ISIS 161215)
en la que FAM es el colorante fluorescente y TAMRA es el colorante extintor. Para GAPDH humano, los cebadores de PCR eran:
15 cebador directo: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (SEQ ID NO: 94)
cebador inverso: GAAGATGGTGATGGGATTTC (SEQ ID NO: 95) y
la sonda de PCR era: 5’ JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3’ (SEQ ID NO: 95 en la que JOE es el colorante indicador fluorescente y TAMRA es el colorante extintor).
Ejemplo 14
25 Análisis de transferencia de tipo Northern de los niveles de ARNm de IGF-1R
Dieciocho horas tras el tratamiento antisentido, se lavaron las monocapas celulares con PBS frío y se lisaron en 1 ml de RNAZOL (marca comercial) (TEL-TEST “B” Inc., Friendswood, TX). Se preparó ARN total siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante. Se fraccionaron veinte microgramos de ARN total mediante electroforesis a través de geles de agarosa al 1,2% p/v que contenían formaldehído al 1,1% v/v usando un sistema de tampón MOPS (AMRESCO, Inc. Solon, OH). Se transfirió el ARN del gel a membranas de nailon HYBOND (marca comercial)-N+ (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) mediante transferencia capilar durante la noche usando un sistema de tampón de transferencia de tipo Northern/Southern (TEL-TEST “B” Inc., Friendswood, TX). Se confirmó la transferencia del ARN mediante visualización por UV. Se fijaron las membranas mediante
35 reticulación con UV usando un reticulador UV STRATALINKER (marca comercial) 2400 (Stratagene, Inc, La Jolla, CA) y luego se estudiaron con sonda usando disolución de hibridación QUICKHYB (marca comercial) (Stratagene, La Jolla, CA) usando las recomendaciones del fabricante para condiciones rigurosas.
Para detectar IGF-IR humano, se preparó una sonda específica de IGF-IR mediante PCR usando el cebador directo para IGF-IR humano CCCTTTCTTTGCAGTTTTCCC (SEQ ID NO: 82 - ISIS 161212) y el cebador inverso para IGF-IR humano, secuencia de cebador inverso CGTCGTCGGCCTCCATT (SEQ ID NO: 83 - ISIS 161214). Para normalizar variaciones en la eficacia de carga y transferencia, se separaron las membranas y se estudiaron con sonda para detectar ARN de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa humano (GAPDH) (Clontech, Palo Alto, CA).
45 Se visualizaron las membranas hibridadas y se cuantificaron usando un instrumento PHOSPHORIMAGER (marca comercial) y software IMAGEQUANT (marca comercial) V3.3 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Se normalizaron los datos con respecto a los niveles de GAPDH en controles no tratados.
Ejemplo 15
Inhibición antisentido de la expresión de IGF-IR humano
Se diseñaron una serie de compuestos antisentido para seleccionar como diana diferentes regiones del ARNm de IGF-IR humano o la región no traducida en 5’, usando secuencias publicadas expuestas en los n.os de registro
55 NM000875 (SEQ ID NO: 77) y M69229 (SEQ ID NO: 76). Los compuestos se muestran en la tabla 1. “Sitio diana” indica el primer número de nucleótido (el más próximo al extremo 5’) en la secuencia diana particular a la que se une el compuesto. Todos los compuestos en la tabla 1 son ASO de o bien la región no traducida en 5’ o bien la región codificante del IGF-IR. Se analizaron los compuestos para determinar su efecto sobre los niveles de ARNm de IGF-IR humano mediante PCR en tiempo real cuantitativa tal como se describió en otros ejemplos en el presente documento (véanse la figura 3 y la tabla 1). Los datos son promedios de tres experimentos. El control positivo para cada punto de datos se identifica en la tabla 1 mediante el número de ID de secuencia. Si está presente, “S.D.” indica “sin datos”.
Tal como se muestra en la tabla 1, algunos compuestos de partida demostraron al menos algo de inhibición de la
65 expresión de IGF-IR en este ensayo y por tanto se prefieren. Los ejemplos de ASO preferidos incluyen ISIS de ASO 175308, 175302, 175314, 175307, 175317, 175323, 323744, 323747, 323767, 323762 y 323737. Las regiones diana a las que estas secuencias preferidas son complementarias se denominan en el presente documento “segmentos diana preferidos” y por tanto se prefieren para la selección como diana por compuestos dados a conocer en el presente documento. SEQ ID n.os 137 hasta 171 representan segmentos diana preferidos identificados en IGF-1R. El “sitio diana” en la tabla 1 indica el primer número de nucleótido (el más próximo al extremo 5’) en el ácido nucleico
5 diana particular al que se une el oligonucleótido.
Puesto que se ha hallado mediante experimentación que estos “segmentos diana preferidos” están abiertos a, y están accesibles para la hibridación con los compuestos antisentido dados a conocer en el presente documento, un experto en la técnica reconocerá o podrá determinar, usando nada más que experimentación de rutina, realizaciones
10 adicionales que abarcan otros compuestos que se hibridan específicamente con estos segmentos diana preferidos y en consecuencia inhiben la expresión de IGF-IR.
Según la presente descripción, los compuestos antisentido incluyen compuestos oligoméricos antisentido, ASO, ribozimas, oligonucleótidos de secuencia de guía externa (EGS), secuencias de corte y empalme alternativo,
15 cebadores, sondas y otros compuestos oligoméricos cortos que se hibridan a al menos una parte del ácido nucleico diana.
El fin de este ejemplo es investigar la localización epidérmica de ASO con química de dU,dC-fosforotioato de C5propinilo (C5-propino) o gapmero de 2’-O-(2-metoxi)etilo (gapmero de 2’ MOE) de fosforotioato completo tras la 20 aplicación tópica a piel psoriásica. Se realizaron estudios en explantes de piel psoriásica ex vivo tal como se muestra en la figura 1, con microscopía confocal, fluorescencia directa e inmunohistoquímica usados para detectar la localización de ASO. En estudios previos, se ha mostrado que un ASO de C5-propino conjugado con FITC alcanza la capa basal de la epidermis tras la aplicación tópica a piel psoriásica (White et al., Journal of Investigative Dermatology 118: 1003-1007, 2002). En este ejemplo, se encontró que tanto gapmero de 2’ MOE como ASO de C5
25 propino penetraban en la epidermis de biopsias de piel psoriásica cuando se formulaban en o bien crema o bien metilcelulosa al 5% p/v. Parecía acumularse ASO de ambas químicas en las capas basales de la epidermis tal como se evaluó mediante tanto microscopía de fluorescencia directa como detección inmunohistoquímica de ASO. La localización de FITC-ASO no era obviamente diferente de la de ASO sin FITC.
30 Aplicación tópica de ASO
Se ha mostrado que ASO de C5-propino se acumula en queratinocitos basales de piel psoriásica humana (pero no normal) tras la aplicación tópica (White et al., 2002, citado anteriormente), presumiblemente debido a la función de barrera comprometida del estrato córneo en la psoriasis. Además, se mostró que se acumulaba un ASO de 35 fosforotioato en los queratinocitos basales de piel humana normal cuando se formulaba en una crema (Mehta et al.,
J. Invest. Dermatol. 115: 805-812, 2000). Un ASO híbrido de fosforotioato-fosfodiéster en agua destilada no pudo acumularse en queratinocitos basales tras la aplicación tópica a piel humana a pesar de que parecía cruzar el estrato córneo y acumularse en el citoplasma de queratinocitos en las capas superiores de la epidermis (Wingens et al., Lab Invest. 79: 1415-1424, 1999).
40 El presente ejemplo investigó la localización de ASO de gapmero de 2’ MOE en piel psoriásica humana tras la aplicación tópica.
Oligonucleótidos
45 Los oligonucleótidos empleados se enumeran en la tabla 4.
Tabla 4: Lista de los cuatro oligonucleótidos usados en estudios de aplicación tópica. Las secciones subrayadas llevan química de 2’ MOE
Química
Identificación Secuencia Detectado por Ac 2E1
C5 propino
R451 UAACACGACGCGAAU-FITC [SEQ ID NO: 53] Desconocido
2’MOE
ASO 251741 FITC-TCCGTCATCGCTCCTCAGGG [SEQ ID NO: 54] Sí
2’ MOE
ASO 13920 TCCGTCATCGCTCCTCAGGG [SEQ ID NO: 55] Sí
2’ MOE
ASO 147979 FITC-TCCCGCCTGTGACATGCATT [SEQ ID NO: 56] No
Recogida de biopsias de piel humana
Se recogieron biopsias de piel psoriásica de voluntarios. Se recogieron hasta 3 biopsias con sacabocados de 8 mm, de grosor completo de cada voluntario por un dermatólogo. La zona de la que se toma la biopsia no se limpió ni se 55 desinfectó antes de la recogida de las biopsias. Se colocaron inmediatamente las biopsias sobre una gasa (humedecida con PBS) y se almacenaron sobre hielo hasta que se usaron (∼2 h).
En el momento de la recogida, se puntuó la gravedad de la psoriasis en las biopsias usando el componente PRS
(escala de clasificación de parámetros, “parameter rating scale”) de la puntuación PASI (índice de gravedad del área de psoriasis, “psoriasis area severity index”) (Fredriksson et al., Dermatologica 157: 238-244, 1978). En resumen, se puntuaron cada uno de eritema (enrojecimiento), induración (hinchazón) y descamación (exfoliación) de desde 0 (ausente) hasta 4 (grave) para proporcionar una puntuación de PRS de 0 a 12.
Microscopía confocal en vivo
24 h tras la aplicación de FITC-ASO, se retiraron las biopsias de las placas de cultivo y se colocaron en cubreobjetos, con el estrato córneo hacia abajo, y se colocó una gota de PBS sobre la dermis expuesta para mantenerla húmeda. Se realizó entonces microscopía confocal en vivo tal como se describió previamente (White et al., J. Invest. Dermatol. 112: 887-892, 1999; White et al., 2002, citado anteriormente). En resumen, se evaluó la aplicación tópica de FITC-ASO con excitación a 488 nm (láser de ion argón) y detección a 515 nm. El instrumento usado era un microscopio invertido IX70 (Olympus Australia, Melbourne, Australia) conectado a un sistema confocal Optiscan f900e (Optiscan Pty, Melbourne, Australia).
15 La microscopia confocal da como resultado secciones frontales con respecto a la superficie de la piel y para cada biopsia se tomaron una serie de imágenes a profundidad creciente dentro de la epidermis. El trabajo previo indica que puede detectarse fluorescencia hasta 100 μm bajo la superficie usando este método.
Con el fin de determinar la ubicación epidérmida de queratinocitos que contienen FITC-ASO, se usaron los criterios de White et al., (1999, citado anteriormente) como guía. Estos criterios eran:
• morfología celular
25 • presencia y tamaño de núcleos:
y corneocitos anucleares
y núcleos en queratinocitos del estrato granuloso >15 μm
y núcleos de queratinocitos basales <10 μm
• profundidad de células (queratinocitos basales al menos 50 μm por debajo de la superficie).
35 Procesamiento de muestras de tejido
Tras la microscopía confocal, se fijaron todas las biopsias durante 24 h en paraformaldehído al 4% (4ºC) seguido por 48 h en sacarosa 0,5 M (4ºC). Se sumergieron entonces las biopsias en etanol graduado (al 70%, 80%, 90% y 2 x 100% cada uno durante 90 min.) seguido por 2 x 90 min. en limoneno y 2 x 90 min en cera de parafina (65ºC) usando un procesador de tejido (Shandon Citadel 1000, Shandon Inc, Pittsburgh, EE.UU.). Tras el procesamiento, se incrustaron las biopsias en parafina (Shandon Histocentre 2, Shandon Inc) y se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se requirió.
Se cortaron secciones de 5 μm de grosor transversales a la epidermis (micrótomo Leica RM2035, Leica Instruments,
45 Wetzlar, Alemania), se transfirieron a portaobjetos de vidrio recubiertos con silano y se secaron a 37ºC durante la noche. Se almacenaron las secciones en un recipiente sellado a temperatura ambiente hasta que se procesaron para la evaluación histológica de la psoriasis, fluorescencia directa o inmunohistoquímica.
Evaluación histológica de la psoriasis
Se desceraron secciones (5 μm) de cada biopsia de piel psoriásica mediante inmersión en limoneno durante 2 x 5 min. seguido por lavados de 5 min. consecutivos en etanol graduado (al 100%, 90%, 80%, 70% y 50%) y 5 min. en agua. Se tiñeron entonces las secciones con hematoxilina de Harris (tiñe los núcleos celulares de color azul) y eosina (tiñe el citoplasma y otras estructuras tisulares de color rosa) antes de lavarse en etanol (2 x 15 s) y limoneno
55 (2 x 15 s). Se cubrieron con el cubreobjetos entonces las secciones con medio de montaje DPX (BDH Laboratory Supplies, Poole, Inglaterra).
Detección de ASO mediante fluorescencia directa
Se desceraron secciones y se lavaron tal como se describió anteriormente antes de cubrirse con el cubreobjeetos con medio de montaje MOWIOL (Biosciences inc, La Jolla, EE.UU.) que contenía reactivo anti-desvanecimiento DABCO al 2,5% (Sigma, St Louis, EE.UU.). Se ajustó el brillo de la imagen para corregir la autofluorescencia. Se definió la autofluorescencia como la fluorescencia producida a partir de muestra tratada con vehículo (crema o metilcelulosa al 5% p/v).
Detección de ASO mediante inmunohistoquímica (2E1 Ab)
Se desceraron secciones tal como se describió anteriormente y se detectaron ASO usando el anticuerpo 2E1-B5 purificado por afinidad (Berkeley Antibody Company, Berkeley, EE.UU.) suministrado por Isis Pharmaceuticals. El 5 anticuerpo 2E1-B5 es una IgG1 de ratón que reconoce motivos de TGC y GC en oligonucleótidos de fosforotioato (Mehta et al., 2000, citado anteriormente).
Se incubaron las secciones en H2O2 al 1% v/v en metanol durante 30 min. para extinguir la actividad peroxidasa endógena, se lavaron con PBS y se incubaron durante 10 min. en proteinasa K lista para usar DAKO (marca comercial registrada) (DAKO corporation, Carpenteria, EE.UU.). Se bloquearon las secciones con BSA al 1% p/v/IgG de oveja 20 ug/ml en PBS durante 20 min. antes de una incubación de 45 min. con el anticuerpo primario 2E1 (dilución 1/4000). Se lavaron de nuevo las secciones con PBS y se detectó el anticuerpo primario usando el kit ABC de ratón Vectastain (marca comercial registrada) Elite (Vector Laboratories, Burlingame, EE.UU.). El kit ABC de ratón Vectastain (marca comercial registrada) Elite usa un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón biotinilado que se
15 detecta luego con un complejo de avidina y peroxidasa del rábano biotinilada. Se usó DAB como sustrato de manera que la localización del anticuerpo se indicaba mediante una coloración marrón.
Captura de imágenes
Con la excepción de imágenes confocales (véase “microscopía confocal en vivo” en esta sección), se capturaron todas las imágenes usando una cámara digital de color Sony DXC-950P (Sony, Tokyo, Japón) conectada a un microscopio Nikon E600 (Nikon Corporation, Tokyo, Japón) y controlada mediante un sistema de obtención de imágenes MCID M4 (Imaging Research Inc, St Catharines, Canadá). La excitación de fluorescencia la proporcionó una fuente de energía de lámpara de mercurio de alta presión Nikon HB-10103AF (Nikon Corporacition) y se
25 observó a través de un filtro de barrera apropiado.
Evaluación de biopsias de piel psoriásicas
Se recogió piel psoriásica del abdomen, los muslos, la espalda, las nalgas, la espinilla, el codo o las caderas de voluntarios. Se tomaron hasta tres biopsias de cada individuo y se asignaron las biopsias de cada individuo a grupos experimentales separados.
La gravedad de la psoriasis, tal como se determina usando la PRS, era de 6,8 ± 1,7 (media ± DE, n=42) con un intervalo de desde 3 hasta 9. La PRS no era significativamente diferente a través de grupos experimentales
35 (p=0,9609, ANOVA no paramétrico de Kruskal-Wallis).
Bajo examen histológico, todas las biopsias parecían psoriásicas aunque había una considerable variación en la morfología entre biopsias. Además de las variaciones en la gravedad de la psoriasis, la variación observada puede deberse a las diferentes ubicaciones corporales de las que se tomaron las biopsias. Era visible una capa de queratinocitos basales engrosada en todas las biopsias, y en muchas (pero no en todas las biopsias), eran evidentes crestas interpapilares alargadas y núcleos celulares en el estrato córneo (paraqueratosis). Se observaron células que se asemejaban a leucocitos invasores en la dermis de la mayoría de las biopsias.
Ejemplo 16 45
Aplicación tópica de ASO
Para confirmar los resultados de White et al., (2002, citado anteriormente), que demostraban la localización de ASO de C5-propino en queratinocitos basales de biopsias de piel psoriásica, y para investigar la distribución de ASO de 2’ MOE tras la aplicación tópica en crema o metilcelulosa al 5% p/v, se aplicaron los siguientes ASO conjugados con FITC a biopsias de piel psoriásica separadas:
• R451 al 0,1% p/p (C5-propino) en metilcelulosa al 5% p/v;
55 • ISIS 251741 (2’ MOE) al 0,1% p/p en metilcelulosa al 5% p/v;
• ISIS 251741(2’ MOE) al 0,1% p/p en crema.
La microscopía de fluorescencia directa mostró tanto el ASO de gapmero de 2’ MOE como el ASO de C5-propino en la epidermis de lesiones de piel psoriásica, con fluorescencia claramente presente en núcleos de queratinocitos basales. También puede observarse fluorescencia en núcleos de células que parecen ser leucocitos invasores ubicados en la dermis. No había diferencias aparentes en el patrón de fluorescencia producido por los ASO de C5propino y de gapmero de 2’ MOE tras la aplicación tópica.
65 Además, ASO de gapmero de 2’ MOE en crema mostraron una distribución epidérmica comparable a la observada para ASO de gápmero de 2’ MOE formulados en metilcelulosa al 5% p/v, sin diferencias aparentes en la localización
epidérmica de la fluorescencia.
Se confirmaron estos resultados mediante microscopía confocal en vivo que también demostró la localización nuclear de FITC-AON en células que se ajustan a los criterios para queratinocitos basales; núcleos celulares <10 μm 5 y menos de 50 μm por debajo de la superficie). De manera interesante, los ASO parecen estar en los núcleos de corneocitos paraqueratóticos. Las células parecen intermediar entre queratinocitos del estrato granuloso y corneocitos, aunque están presentes en la superficie de la epidermis. En algunos casos, estos queratinocitos parecen excluir los ASO de sus núcleos. Se observaban claramente características consecuentes con la psoriasis que mostraban o bien queratinocitos del estrato granuloso con núcleos mucho más pequeños que lo que se
10 esperaría en piel normal y/o bien queratinocitos basales mucho más próximos a la superficie que lo que se esperaría en piel normal.
Ejemplo 17
15 Detección de un ASO al 5%, que contiene una adición conocida de FITC-ASO al 0,1%, formulado en crema.
Pueden emplearse concentraciones de ASO superiores. Por tanto, es útil determinar si un FITC-ASO contenido como una adición conocida al 0,1% en una formulación de ASO total al 5% puede detectarse mediante microscopía de fluorescencia directa y/o microscopía confocal. Se aplicó 2’ MOE FITC-ASO ISIS 251741 (al 0,1% p/p) con el 2’
20 MOE ISIS 13920 sin FITC (al 4,9% p/p) en crema a biopsias de piel psoriásica para este fin.
Las imágenes de microscopía confocal y de fluorescencia directa de muestras tratadas con un 2’ MOE al 5% que contenía una adición conocida de FITC-ASO al 0,1% mostraron fluorescencia en queratinocitos basales. El aumento de la concentración de ASO no pareció alterar la localización epidérmica de la fluorescencia producida por el FITC
25 ASO, con una localización similar a la observada tras la aplicación de FITC-ASO al 0,1% solo.
Ejemplo 18
Evaluación comparativa de oligonucleótidos antisentido (ASO)
30 Se propone que oligonucleótidos antisentido (ASO) que seleccionan como diana ARNm de IGF-IR son nuevos agentes terapéuticos eficaces para reducir trastornos inflamatorios y/o proliferativos. El fin de este ejemplo es evaluar comparativamente tres ASO de IGF-IR preferidos con química de gapmero de 2’ MOE, “5-10-5,” de fosforotioato completo contra DT1064 (SEQ ID NO: 78), un ASO de dU,dC-fosforotioato de C5-propinilo de 15
35 meros. Todas las C y las U en DT1064 se someten a propinilación en C5. Se realizaron estudios en un sistema de transfección de queratinocitos humanos, con los niveles de proteína y de ARNm de IGF-IR la proliferación celular como criterios de valoración. En estudios previos DT1064 inhibió satisfactoriamente la expresión de IGF-IR en este sistema (Wraight et al., 2000, citado anteriormente; Fogarty et al., Antisense Nucleic Acid Drug Development 12: 369-377, 2002).
40 Los resultados muestran que los tres ASO de IGF-IR reducían el ARNm de IGF-iR con la misma potencia que DT1064. También se redujeron los niveles de proteína de IGF-IR y las tasas de proliferación mediante los ASO.
Estos hallazgos apoyan el uso de la química de gapmero de 2’ MOE para la inactivación del ARNm de IGF-IR.
45 Basándose en su rendimiento en los estudios presentados en este ejemplo, ASO 175317 es un ASO de gapmero de 2’ MOE particularmente útil para ensayos terapéuticos.
Gapmeros de 2’ MOE
50 Los tres gapmeros de 2’ MOE, “5-10-5”, compuestos de partida de fosforotioato mostraron inhibición dependiente de la concentración del ARNm de IGF-IR en células A549 (células epiteliales de pulmón humanas) tal como se evalúa mediante PCR en tiempo real, figura 3. Se evaluaron los tres compuestos de partida para determinar su actividad en un sistema de transfección de células cutáneas de queratinocitos humanos.
55 Evaluación comparativa in vitro de gapmeros de 2’ MOE
Los tres ASO de partida se han “evaluado comparativamente” in vitro contra DT1064 con los siguientes criterios de valoración:
60 1. ARNm de IGF-IR total evaluado mediante PCR en tiempo real;
2. Proteína de IGF-IR celular total determinada mediante inmunotransferencia;
3. Tasa de crecimiento de células de queratinocitos HaCaT sometida a ensayo mediante unión de colorante negro 65 de amido.
Oligonucleótidos
Los oligonucleótidos usados en este estudio se muestran en la tabla 2.
Tabla 2: Lista de los siete oligonucleótidos usados para pruebas in vitro. Las secuencias de nucleótidos de los ASO se presentan en la figura 3.
Química
Identificación Antisentido/control
1
dU,dC-fosforotioato de C5-propynilo DT1064 A
2
DT6416 C (apareamiento erróneo)
3
(Abreviatura: C5-propino) R451 C (al azar)
4
gapmero de 2’-O-(2-metoxi)etilo, 5,10,5, ISIS 175314 A
5
fosforotioato en todas partes ISIS 175317 A
6
ISIS 175323 A
7
(Abreviatura: gapmero de 2’ MOE) ISIS 129691 C (al azar)
Cultivo celular
10 Se usó en este estudio la línea celular de queratinocitos humanos inmortalizados espontáneamente, HaCaT (Boukamp et al., 1988, citado anteriormente). Se mantuvieron las células como cultivos en monocapa en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con suero de ternero fetal (FCS) al 10% p/v a 37ºC en una atmósfera del 5% v/v de CO2.
15 Transfección de queratinocitos con oligonucleótidos antisentido
Se sembraron queratinocitos HaCaT (número de pase de 44 a 47) en los pocillos de placas de 96 pocillos (PCR en tiempo real), 24 pocillos (proliferación celular) o 12 pocillos (inmunotransferencia o apoptosis). Se trataron células confluentes al 85-95% con la preparación de liposomas, Cytofectin GSV (GSV; Glen Research, Sterling Virginia, 20 EE.UU.) sola, o complejada con oligonucleótidos antisentido o control. También se estudiaron células no tratadas (control no tratado). Se diluyó cada oligonucleótido antisentido o control en DMEM libre de suero hasta 20X la concentración final deseada y se mezcló con un volumen igual de GSV (40 μg/ml). Se dejó que las mezclas de lípido/oligonucleótido se complejaran a temperatura ambiente durante 10 min., luego se diluyeron diez veces con DMEM que contenía FCS al 10% p/v. Se transfectaron las células con concentraciones finales de oligonucleótido
25 6,25, 25, 100 ó 400 nM y GSV 2 μg/ml. Se realizaron las transfecciones en pocillos duplicados, mientras que se procesaron células no tratadas y tratadas con GSV en cuatro pocillos repetidos.
Niveles de ARNm de IGF-1R
30 Se extrajo el ARN total usando un kit RNEASY (marca comercial registrada) Mini (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) y de 0,5 a 1 μg se transcribieron de manera inversa usando el kit de PCR para ARN GeneAmp (marca comercial registrada) (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), según las instrucciones del fabricante. Se usó PCR en tiempo real semicuantitativa para determinar la cantidad de ARNm de receptor de IGF-I en la muestra en relación con células tratadas con GSV solo. Se usaron reactivos desarrollados previamente para el receptor de IGF-I
35 humano (Applied Biosystems, n.º de producto 4319442F) y 18S (n.º de producto 4319413E) que contenían cebadores y sondas fluorescentes TaqMan (marca comercial registrada) en una reacción PCR múltiplex para amplificar simultáneamente ambos productos en cada muestra. Se usó un detector de secuencias ABI Prism (marca comercial) 7700 (Applied Biosystems) para el análisis. Se normalizaron entonces los niveles de ARNm de IGF-1R con respecto a 18S. Se usaron dos protocolos de transfección, se transfectaron las células (1) una vez, 18 h antes
40 de la extracción del ARN, o (2) un total de dos veces, a las 24 y 48 h antes de la extracción del ARN.
Niveles de proteína de IGF-1R
Tras las transfecciones con oligonucleótidos cada 24 h durante tres días, se lavaron las monocapas celulares con
45 PBS, luego se lisaron en un tampón que contenía HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, glicerol al 10% v/v, Triton X-100 al 1% v/v, aprotinina 100 ug/ml. Se sometió a ensayo la concentración de proteína total de los lisados con el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce; Rockford, Illinois, EE.UU.) que usa BSA como patrón de proteína. Se resolvieron 25 ó 30 μg de cada lisado mediante SDS-PAGE (acilamida al 7% p/v), entonces se transfirieron a membrana Immobilon-P (Millipore, Bedford, Massachusettes). Se bloquearon los sitios de unión no
50 específica con leche en polvo desnatada al 5% p/v, luego se estudió con sonda el filtro con IgG policlonal de conejo que reconoce la subunidad D de la proteína de IGF-1R (C-20; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EE.UU.). Se reveló la señal específica de IGF-1R usando el kit de inmunotransferencia de tipo Western ECF (Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra, RU) y se detectó mediante exploración con Posphoimager y quimiofluorescencia seguido por cuantificación con el software ImageQuant (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, EE.UU.). Se controló la variación entre filtros mediante normalización de las intensidades de señal con respecto a la señal media para células tratadas con GSV solo.
5 Ensayo de proliferación celular
Se hicieron crecer células hasta el 40% de confluencia en placas de 24 pocillos y se transfectaron cada 24 h durante hasta 3 días. Se determinó el número de células a las 0, 24, 48 y 72 h usando un protocolo de unión de negro de amido en el que la unión de negro de amido a proteína celular (cuantificada espectrofotométricamente) se
10 correlaciona con el número de células (Schultz et al., J. Immunol. Methods 167: 1-13, 1994). En resumen, se fijaron las monocapas celulares con glutaraldehído al 1% v/v en PBS, luego se tiñeron con negro de amido al 0,1% p/v en acetato de Na a pH 3,5 durante 30 min. Tras un único lavado en H2O ácida, se eluyó el colorante unido a proteína con NaOH (50 mM) y se monitorizó la absorbancia del eluato a 620 nm. Los datos se expresan en relación con la señal determinada para células tratadas con GSV a 0 h.
ARNm de IGF-IR
La figura 4 muestra los datos de PCR en tiempo real de IGF-1R para queratinocitos HaCaT tratados con gapmeros de 2’ MOE o C5-propino. Los resultados eran similares si las células se transfectaron una vez (figura 4A), o dos 20 veces (figura 4B). Los niveles de ARNm de IGF-1R eran inferiores en células transfectadas con DT1064, en consonancia con los niveles notificados anteriormente usando ensayos de protección de ARNasa [Fogarty et al, 2002, citado anteriormente]. Los tres ASO de partida también provocaron la inactivación del ARNm de IGF-1R. Además, la inactivación del ARNm de IGF-1R era similar para los tres ASO de partida y DT1064. Por ejemplo, en la figura 4A, a ASO 100 nM, la reducción promedio en el ARNm era del 68%, 77%, 75% y 78% para ASO 175314, ASO
25 175317, ASO 175323 y DT1064, respectivamente.
Proteína de IGF-IR
La figura 5A muestra una inmunotransferencia de tipo Western de receptor de IGF-I representativa de células
30 HaCaT transfectadas con gapmero de 2’ MOE o C5 propino. La proteína de IGF-IR (cadena D) aparece como una única banda de peso molecular de 110 kD.
Se combinan las intensidades de bandas (expresadas en relación con células tratadas con GSV solo) a partir de tres experimentos separados y se presentan en la figura 5B. Los datos muestran que DT1064 suprimió de manera
35 potente los niveles de proteína de IGF-IR tal como se mostró previamente (Fogarty et al., 2002, citado anteriormente). En relación con células tratadas con GSV solo, los tres ASO de partida redujeron significativamente la proteína de IGF-IR a 25 nM y 100 nM (P<0,01). ISIS 175317 e ISIS 175323, pero no ISIS 175314, inactivaron la proteína de IGF-IR a la concentración de 400 nM (P<0,01). No hubo inactivación significativa de la proteína de IGF-IR con ISIS 175317 o ISIS 175323 a la concentración más baja, 6,25 nM.
40 En relación con el control de GSV, la transfección de células HaCaT con DT1064 proporcionó una reducción máxima aparente del 75% cuando se trataron las células a una concentración de 100 nM, mientras que los niveles de proteína de IGF-IR con ISIS 175317 eran aproximadamente del 60%. La inactivación de la proteína de IGF-IR asociada con cada uno de los ASO se expresa como un porcentaje de su control apropiado. Esto muestra que la
45 capacidad de los ASO para inactivar la proteína diana es comparable a la de DT1064 (véase la tabla 3).
Tabla 3: Inactivación de la proteína de IGF-IR con ASO expresados como un porcentaje de los oligonucleótidos control de la misma química a la misma concentración
6,25 nM
25 nM 100 nM 400 nM
DT1064 (en relación con 6416)
34 48 59 41
DT1064 (en relación con R451)
36 53 64 35
ISIS 175314
35 57** 51** 30
ISIS 175317
28 60*** 65*** 50**
ISIS 175323
19 50*** 58*** 44**
50 * P<0,5, **P<0,01, ***P<0,001 frente a proteína de IGF-1R en células HaCaT transfectadas con oligonucleótido de la misma química y dosis; prueba de Tukey.
Proliferación celular
55 El efecto ASO específicos de IGF-iR y oligonucleótidos control sobre la proliferación de HaCaT se muestra en la figura 6. En células no tratadas, los números de células de queratinocitos aumentaron más de cuatro veces a lo largo de tres días. Las células tratadas con GSV también aumentaron en número aunque no en el mismo grado que las células no tratadas (el 64% de las no tratadas a las 72 h) lo que sugiere algún efecto del lípido sobre las tasas de proliferación. En relación con células no tratadas y tratadas con GSV, todas las células tratadas con oligonucleótidos mostraron tasas inferiores de proliferación celular a lo largo de los 3 días, teniendo las células tratadas con DT1064
5 las tasas más bajas de proliferación celular en todos los puntos de tiempo y a todas las concentraciones de oligonucleótido. De los ASO sometidos a prueba, había una tendencia de que ISIS 175317 estuviese asociado con las tasas más baja de proliferación celular lo más notablemente a la concentración de 400 nM.
Se han sometido a prueba tres ASO de partida de IGF-IR en el sistema de transfección de queratinocitos HaCaT en MCRI. Los hallazgos principales son:
Los tres ASO de partida redujeron los niveles de ARNm de IGF-IR en comparación con el control de GSV y el oligonucleótido al azar de gapmero de 2’ MOE. En relación con DT1064, los ASO de partida proporcionaron una reducción similar en el ARNm de IGF-IR.
•
Los tres ASO de partida redujeron significativamente la proteína de IGF-IR en relación con el control de GSV y el oligonucleótido al azar de 2’ MOE. Los ASO de partida redujeron los niveles de proteína de IGF-IR. Sin embargo, cuando se expresaba como un porcentaje de inactivación en relación con oligonucleótidos de control de la misma química, el efecto de los ASO de partida era similar al de DT1064.
•
Los tres ASO de partida redujeron las tasas de proliferación celular en relación con el control de GSV.
Mantenimiento ex vivo de biopsias de piel psoriásica
25 Se mantuvieron biopsias durante 24 h tal como se describió anteriormente (Russo et al., Endocrinology 135: 14371446, 1994; White et al., 2002, citado anteriormente). En resumen, se eliminó la grasa subcutánea de las biopsias antes de que se colocaran, con la dermis hacia abajo, sobre un tapón de agar BACTO (marca comercial) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, EE.UU.) formado en el medio de una malla de acero inoxidable triangular. Se diseñó la malla de acero para que se ajustara al pocillo central de una placa de cultivo de órganos de pocillo central FALCON (marca comercial registrada) de 60 mm (Becton Dickinson) de modo que el tapón de agar estaba suspendido sobre el pocillo central. Se llenó el pocillo central con medio de Eagle modificado por Dulbecco (que contenía suero de ternero fetal al 10% p/v, penicilina 50 UI/ml, estreptomicina 50 ug/ml) hasta el nivel del tapón de agar y el pocillo exterior se llenó con PBS para mantener la humedad. Se incubaron las biopsias a 37ºC en una atmósfera del 5% v/v de CO2. La figura 1 muestra la disposición del aparato de tejido.
35 Ejemplo 19
Comparación de la microscopía de fluorescencia directa y la inmunohistoquímica para la detección de ASO.
Se formuló el 2’ MOE FITC-ASO ISIS 251741 al 0,1% p/p en metilcelulosa al 5% p/v y se aplicó por vía tópica a biopsias de piel psoriásica. Tanto fluorescencia directa como inmunohistoquímica con el anticuerpo 2E1 pueden detectar ISIS 251741. Esta característica permitió el uso de secciones adyacentes para comparar directamente la localización de ASO tal como se determina mediante las dos tecnologías de detección.
45 Ambos métodos de detección muestran una distribución notablemente similar de ASO. Ambos métodos muestran acumulación de ASO en queratinocitos basales, exclusión de ASO de los núcleos de la mayoría de los queratinocitos del estrato granuloso y ASO en los núcleos de células que parecen ser leucocitos invasores ubicados en la dermis. La acumulación de ASO en el estrato córneo es evidente usando ambos métodos de detección.
Estos resultados indican que tanto fluorescencia directa como inmunohistoquímica son métodos viables para la detección de ASO en piel, sin embargo, ambas metodologías tienen sus puntos fuertes y debilidades. La digestión de secciones de piel con proteinasa K (requerida antes de la inmunohistoquímica) a menudo da como resultado la degradación de la morfología del tejido. La detección inmunohistoquímica de ASO también está limitada a ASO de química (fosforotioato) y secuencia de nucleótidos (motivos TGC o GC) específicas mientras que cualquier ASO
55 puede conjugarse con FITC. Además, la detección inmunohistoquímica de ASO parece ser más variable que la detección de ASO mediante fluorescencia directa. Sin embargo, las secciones teñidas de manera inmunohistoquímica pueden almacenarse y utilizarse también durante un periodo de tiempo más largo que las secciones fluorescentes, que se desvanecen con el tiempo. Además, hay una falta de datos referentes a los efectos de la conjugación con FITC sobre las propiedades fisicoquímicas de ASO.
Ejemplo 20
Efecto de la conjugación con FITC sobre la localización epidérmica de ASO tras la aplicación tópica
65 Con el fin de determinar si una etiqueta de FITC unida a un ASO altera la localización epidérmica del ASO tras la aplicación tópica, se trataron las biopsias con una mezcla de ASO que contenía el ASO sin FITC ISIS 13920 (detectable mediante inmunohistoquímica pero no fluorescencia directa) y el FITC-ASO ISIS 147979 (detectable mediante fluorescencia directa pero no inmunohistoquímica). La comparación de secciones en serie de tejidos tratados con esta mezcla no mostró diferencias aparentes entre la localización de los dos ASO. Estos datos indican que en biopsias de piel psoriásica, una etiqueta de FITC sobre un ASO no altera la localización epidérmica.
5 Con el fin de controlar la posibilidad de que el FITC-ASO pueda afectar a la localización epidérmica de ISIS 13920, se trataron las biopsias con ISIS 13920 al 0,1% p/v solo. Tal como puede observarse, la detección inmunohistoquímica de ISIS 13920 demuestra un patrón de distribución de ASO aparentemente no diferente del observado para ASO 13920 mezclado con ISIS 147979.
Se investigó la localización de ASO de 2’ MOE aplicados por vía tópica en la epidermis de lesiones de piel psoriásica y se comparó con ASO de C5-propino. Los cinco hallazgos principales son:
• ASO de gapmero de 2’ MOE aplicados por vía tópica en o bien metilcelulosa al 5% p/v o bien crema podían cruzar
15 el estrato córneo de lesiones de piel psoriásica. ASO localizados en los núcleos de queratinocitos basales en la epidermis y leucocitos invasores en la dermis.
•
La localización epidérmica tras la aplicación tópica no parece diferir entre ASO de C5-propino y gapmero de 2’ MOE.
•
Tras la aplicación tópica, pueden detectarse ASO de gapmero de 2’ MOE en los núcleos de queratinocitos basales tanto mediante microscopia de fluorescencia directa (ASO conjugado con FITC sólo) como mediante inmunohistoquímica con el Ac 2E1.
25 • La conjugación con FITC de ASO no parece alterar su capacidad para alcanzar queratinocitos basales o su localización epidérmica tras la aplicación tópica.
Ejemplo 21
Formulación del fármaco
Se resuspendieron ASO liofilizados en agua destilada, estéril y se determinó la concentración de ASO mediante su densidad óptica a 260 nm antes de su formulación en o bien un gel de metilcelulosa al 5% p/v o bien en una crema (Isis Pharmaceuticals). La crema contenía:
•
miristato de isopropilo (10% p/p)
•
monoestearato de glicerilo (10% p/p)
•
estearato de polioxilo 40 (15% p/p)
•
hidroxipropilmetilcelulosa (0,5% p/p)
• fosfato de sodio monobásico monohidratado (0,3% p/p) 45
•
fosfato de sodio dibásico heptahidratado (0,9% p/p)
•
fenoxietanol (2,5% p/p)
•
metilparabeno (0,5% p/p)
•
propilparabeno (0,5% p/p)
•
agua purificada (59,8% p/p)
55 Para la formulación en metilcelulosa al 5% p/v, se diluyó metilcelulosa al 10% p/v (en PBS) dos veces con PBS que contenía ASO a dos veces la concentración final deseada.
Para la formulación en crema, se secaron ASO (secadora de vacío DNA Mini, Medos company, Melbourne, Australia) y luego se disolvieron en una cantidad apropiada de crema para dar la concentración final deseada.
Ejemplo 22
Aplicación del fármaco
65 Aproximadamente 30 min. tras transferirse las biopsias a 37ºC, se pesaron ASO o vehículo (30 mg) y se aplicaron directamente a una región central de aproximadamente 4 mm de diámetro de las biopsias con una espátula pequeña. Un anillo delgado alrededor del borde de la biopsia se mantuvo libre de ASO o vehículo con el fin de evitar la aplicación de ASO al borde expuesto de la muestra. A pesar de estas precauciones, en aproximadamente el 20% de las biopsias los ASO parecían haber estado en contacto con los bordes de la biopsia tal como se evaluó
5 mediante microscopia de fluorescencia directa.
Ejemplo 23
Grupos experimentales
10 De acuerdo con los objetivos de este ejemplo, se aplicaron formulaciones de ASO a al menos cuatro biopsias de diferentes individuos. Las formulaciones de ASO y los controles usados fueron:
•
R451 al 0,1% p/p en metilcelulosa al 5% 15
• ISIS 251741 al 0,1% p/p en metilcelulosa al 5% p/v
•
ISIS 251741 al 0,1% p/p en crema 20 • ISIS 251741 al 0,1% p/p mezclado con ASO 13920 al 4,9% p/2 en crema
• ISIS 13920 al 0,1% p/p en metilcelulosa al 5% p/v
•
ISIS 147979 al 0,1% p/p mezclado con ASO 13920 al 0,1% p/p en metilcelulosa al 5% v/v 25
•
ISIS 147979 al 0,1% p/p en metilcelulosa al 5% p/v
•
metilcelulosa al 5% p/v sola.
30 Crema sola. Ejemplo 24 Evaluación comparativa para ISIS 175317 y DT1064
35 Este ejemplo muestra la evaluación comparativa de IGF-IR humano identificado en una selección primara contra ASO de IGF-IR (ISIS 175317) y DT1064 en queratinocitos HaCaT.
Se midieron los niveles de ARNm de IGF-IR mediante PCR en tiempo real tras la transfección durante la noche
40 transfección de queratinocitos HaCaT con ASO de IGF-IR y oligonucleótidos control. Los resultados muestran que los cuatro nuevos compuestos de partida, así como ISIS 175317 y DT1064, inhibían de manera potente los niveles de ARNm de IGF-IR de una manera dependiente de la concentración y específica de secuencia. En relación con células HaCaT tratadas con el reactivo de transfección solo, ninguno de los cuatro ASO de IGF-IR recientemente identificados suprimió los niveles de ARNm de IGF-IR con eficacia o potencia superior a ISIS 175317.
45 Oligonucleótidos
Tabla 5: Lista de los oligonucleótidos usados para pruebas in vitro
Química
Identificación Antisentido/control
1
ISIS 175317 A
2
ISIS 323737 A
3
gapmero de 2’-O-(2-metoxi)etilo, 5,10,5, fosforotioato en todas partes ISIS 323744 A
4
ISIS 323762 A
5
Todas las bases de citosina metiladas ISIS 323767 A
6
(Abreviatura: gapmero de 2’ MOE) ISIS 306064 C (apareamiento erróneo de 8 nucleótidos para ISIS 175317)
7
ISIS 129691 C (al azar)
8
dU,dC-fosforotioato de C5-propinilo DT1064 A
9
(Abreviatura: C5-propino) DT6416 C (apareamiento erróneo de 15 nucleótidos para DT1064)
Se confirmó la concentración de cada oligonucleótido mediante su absorbancia UV a 260 nm antes de su uso.
Transfección de queratinocitos con oligonucleótidos antisentido
5 Se mantuvieron queratinocitos HaCaT como cultivos en monocapa en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con suero de ternero fetal (FCS) al 10% v/v a 37ºC en una atmósfera del 5% v/v de CO2/95% v/v de O2.
10 Se sembraron queratinocitos HaCaT [número de pases 62 y 63 (figura 8) y 45 (figura 10)] en los pocillos de placas de 96 pocillos. Se trataron células confluentes al 85-95% con la preparación de liposomas, Cytofectin GSV sola, o complejada con oligonucleótidos antisentido o control durante 20 h. También se estudiaron células no tratadas (control no tratado). Se mezcló cada oligonucleótido antisentido o control (concentración final de 20X) en DMEM libre de suero con un volumen igual de GSV (concentración final de 20X; 40 μg/ml). Se dejó que las mezclas de
15 lípido/oligonucleótido se complejaran a temperatura ambiente durante 10-15 min., luego se diluyeron diez veces con DMEM que contenía FCS al 10% v/v. Se transfectaron las células con oligonucleótido (intervalo de concentración final de 0,4 a 200 nM) y GSV 2 μg/ml. Se realizaron las transfecciones en pocillos duplicados, mientras que se procesaron células no tratadas y tratadas con GSV en cuatro y seis pocillos repetidos, respectivamente.
20 Niveles de ARNm de receptor de IGF-I
Se extrajo el ARN total usando un kit RNeasy® Mini (Qiagen Inc., Valencia, California, EE.UU.) y aproximadamente de 0,1 a 0,2 μg se transcribieron de manera inversa usando el kit de PCR para ARN GeneAmp® (Applied Biosystems, Foster City, California, EE.UU.), según las instrucciones del fabricante. Se usó PCR en tiempo real 25 semicuantitativa para determinar la cantidad de ARNm de receptor de IGF-I en la muestra en relación con células tratadas con Cytofectin GSV solo. Se usaron reactivos desarrollados previamente para el receptor de IGF-I humano (Applied Biosystems, n.º de producto 4319442F) y ARN ribosómico 18S (n.º de producto 4319413E) que contenían cebadores y sondas fluorescentes TaqMan (marca comercial registrada) en una reacción PCR múltiplex para amplificar simultáneamente ambos productos en cada muestra. Se usó un detector de secuencias ABI Prism™ 7700
30 (Applied Biosystems) para el análisis. Se normalizaron entonces los niveles de ARNm de receptor de IGF-1 con respecto a ARN ribosómico 18S.
Efectos biológicos
35 Se estudió inicialmente el efecto de oligonucleótidos antisentido y control oligonucleótidos sobre los niveles de ARNm de IGF-IR a concentraciones de 6, 13, 25, 50, 100 y 200 nM. Se eligieron estas concentraciones porque cubrían un intervalo que permitiría una comparación de datos con experimentos de evaluación comparativa in vitro previos usando gapmeros de 2’MOE en queratinocitos HaCaT.
40 La figura 8 muestra los niveles de ARNm de receptor de IGF-I para dos experimentos en los que se transfectaron queratinocitos HaCaT con oligonucleótidos de gapmeros de 2’ MOE (ISIS 175317, ISIS 323737, ISIS 323744, ISIS 323762, ISIS 323767, ISIS 129691 o ISIS 306064) o de C5-propino (DT1064 o 6416). En relación con células tratadas con GSV, los cinco ASO de gapmero de 2’MOE suprimieron de manera potente los niveles de ARNm de IGF-IR (figura 9). La inactivación máxima de la diana era similar para cada ASO de 2’MOE (intervalo del 71-77%). La
45 tabla 6 muestra la eficacia máxima de los ASO de partida de IGF-IR.
Tabla 6: Eficacia máxima de ASO de partida de IGF-IR de ISIS
Niveles de ARNm de IGF-IR
ASO de IGF-1R de gapmero de 2’ MOE
(% de células tratadas con cytofectin GSV)
ISIS 323762 23,1 ISIS 323767 24,3 ISIS 175317 26,8 ISIS 323737 27,5 ISIS 323744 29,5
Calculada a partir de la eficacia máxima de los niveles de ARNm de IGF-IR (% de células tratadas con GSV citofectina) notificada en la figura 2
En contraposición, los niveles de ARNm de IGF-IR para los dos oligonucleótidos de control de gapmero de 2’MOE
50 (ISIS 129691 y ISIS 306064) eran similares a los niveles de las células tratadas con GSV, lo que indica que el efecto del ASO de gapmero de 2’MOE sobre los niveles de ARNm de IGF-IR era específico de secuencia (figura 8). El efecto de DT1064 sobre la supresión de IGF-IR era máximo al 77% a 100 nM. Sin embargo, la transfección de células HaCaT con el oligonucleótido de control de apareamiento erróneo de C-5 propino (6416) también suprimía
los niveles de ARNm de IGF-IR hasta el 46% a la misma concentración. Esto concordaba con los datos previos.
Puesto que se observó supresión máxima o casi máxima de los niveles de ARNm de IGF-IR con los ASO en el intervalo de concentración de desde 25 hasta 200 nM, era difícil diferenciar entre la eficacia de los cinco ASO de 5 2’MOE. Por tanto, se decidió someter a prueba su efecto a concentraciones inferiores. La figura 10 muestra los niveles de ARNm de IGF-IR a partir de un único experimento en el que se trataron células HaCaT con oligonucleótidos a 0,4, 1,6, 3, 6, 25 ó 100 nM. Como en los experimentos anteriores a las concentraciones superiores, los cinco ASO de 2’MOE suprimieron específicamente los niveles de ARNm de IGF-IR, y lo hicieron con potencia similar. La inhibición máxima del ARNm de IGF-IR era del 87% para ISIS 175317, similar a la del ASO de
10 gapmero de 2’MOE recientemente identificado (intervalo del 79-85% de GSV). La respuesta al tratamiento con ASO era dependiente de la concentración en este intervalo. El tratamiento de queratinocitos HaCaT con DT1064 25 nM suprimió los niveles de ARNm de IGF-IR en un 81%, similar al ASO de gapmero de 2’MOE.
La figura 11 muestra las curvas de concentración-respuesta para los ASO de 2’MOE dirigidos a IGF-IR (mismos
15 datos que la figura 10). Con la posible excepción de ISIS 323767, estos datos indican potencias similares de ISIS 175317 y los gapmeros de 2’MOE. Esto se refleja en la CE50 calculada a partir de las curvas de concentraciónrespuesta y enumerada en la tabla 7. La CE50 para DT1064 era de 3,2 nM (I.C. 2,1 - 4,7). Es importante observar que los valores de CE50 presentados en la tabla 7 se calcularon a partir de un único experimento y se facilitan como una estimación sólo. Se requerirían experimentos de concentración-respuesta adicionales para proporcionar una
20 estimación más exacta de los valores de CE50 para los ASO.
Tabla 7: CE50 media (intervalos de confianza del 50%) para la supresión por ASO de gapmero de 2’MOE de los niveles de ARNm de IGF-IR en queratinocitos HaCaT
ASO de gapmero de 2’MOE CE50 [nM]
ISIS 175317 2,6 (1,8-3,6) ISIS 323744 2,8 (2,2-3,6) ISIS 323737 3,2 (0,4-25,8) ISIS 323762 3,3 (2,4-4,3) ISIS 323767 4,2 (2,4-7,4)
25 Se realizaron los experimentos de concentración-respuesta notificados en el presente documento dos veces al intervalo de concentración superior y no mostraron diferencia en la eficacia máxima (tabla 6). Se realizó el experimento de concentración-respuesta una vez al intervalo de concentración inferior. En todas las concentraciones estudiadas (de 0,4 a 200 nM), ninguno de los cuatro compuestos de partida usados en este ejemplo parecían presentar una inactivación del ARNm de IGF-IR mayor que ISIS 175317 en queratinocitos HaCaT (figuras 9 y 11). El
30 examen de las curvas de concentración-respuesta mostró una potencia similar entre ISIS 175317 y los cuatro compuestos de partida tal como se evalúa mediante la CE50 (figura 11).
Oligonucleótido antisentido
35 Se proporcionan detalles de los ASO de IGF-IR usados en este ejemplo en la tabla 5. Los nucleótidos subrayados son modificaciones con 2’MOE. Todas las bases de citosina están metiladas.
Tabla 5: ASO de IGH-IR
Química
Identificación Secuencia
Gapmero de 2’MOE, fosforotioato en todas partes
ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125) CGAAGGAAACAATACTCCGA
40 Se fabricó ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125) en calidad de grado de investigación por Isis Pharmaceuticals, California, EE.UU.
Recogida de biopsias de piel psoriásica
45 Se recogieron biopsias de piel psoriásica de once voluntarios en condiciones éticas (protocolo 22023A del Royal Children’s Hospital Etics in Human Research Committee, Melbourne, Australia). Se recogieron tres biopsias con sacabocados de 8 mm, de grosor completo de la misma lesión en cada voluntario por un dermatólogo. La zona de la que se tomaron las biopsias no se limpio ni se desinfectó antes de la recogida de la biopsia. Se colocaron inmediatamente las biopsias sobre una gasa (humedecida con PBS) y se almacenaron sobre hielo hasta que se
50 usaron (∼2 h). En el momento de la recogida, se puntuó la gravedad de la psoriasis en las biopsias usando el componente PRS (escala de clasificación de parámetros) de la puntuación PASI (índice de gravedad del área de psoriasis) (Fredriksson et al., 1978 citado anteriormente). En resumen, se puntuaron cada uno de eritema (enrojecimiento), induración (hinchazón) y descamación (exfoliación) de desde 0 (ausente) hasta 4 (grave) para proporcionar una puntuación de PRS de 0 a 12.
Mantenimiento ex vivo de biopsias de piel psoriásica
5 Se mantuvieron biopsias durante 24 h tal como se describió anteriormente (Russo et al., 1994, citado anteriormente; White et al., 2002, citado anteriormente). En resumen, se eliminó la grasa subcutánea de las biopsias antes de que se colocaran, con la dermis hacia abajo, sobre un tapón de agar BACTO™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, EE.UU.) formado en el medio de una malla de acero inoxidable triangular. Se diseñó la malla de acero para que se ajustara al pocillo central de una placa de cultivo de órganos de pocillo central FALCON (marca comercial registrada) de 60 mm (Becton Dickinson) de modo que el tapón de agar estaba suspendido sobre el pocillo central. Se llenó el pocillo central con medio de Eagle modificado por Dulbecco (que contenía suero de ternero fetal al 10% p/v, penicilina 50 UI/ml, estreptomicina 50 ug/ml) hasta el nivel del tapón de agar y el pocillo exterior se llenó con PBS para mantener la humedad. Se incubaron las biopsias a 37ºC en una atmósfera del 5% v/v de CO2. La disposición del aparato de tejido se muestra en la figura 1.
15 Formulación del fármaco
Se resuspendió ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125) liofilizado en agua destilada estéril y se determinó la concentración de la disolución mediante su densidad óptica a 260 nm. Para su formulación en crema, se secaron ASO (secadora de vacío DNA Mini, Medos Company, Melbourne, Australia), luego se disolvieron en una cantidad apropiada de crema (Isis Pharmaceuticals, EE.UU.) para proporcionar una concentración final del 10% p/p. La crema contenía:
• miristato de isopropilo (10% p/p)
25 • fenoxietanol (2,5% p/p)
•
monoestearato de glicerilo (10% p/p)
•
metilparabeno (0,5% p/p)
•
estearato de polioxilo 40 (15% p/p)
•
propilparabeno (0,5% p/p)
35 • hidroxipropilmetilcelulosa (0,5% p/p)
•
agua purificada (59,8% p/p)
•
fosfato de sodio monobásico monohidratado (0,3% p/p)
•
fosfato de sodio dibásico heptahidratado (0,9% p/p)
Aplicación del fármaco
45 Tras una incubación previa de 30 minutos de la biopsia a 37ºC, se aplicaron directamente 30 mg de fármaco o vehículo pesados previamente a una región central de aproximadamente 4 mm de diámetro de cada biopsia con una espátula pequeña. Un anillo delgado alrededor del borde de la biopsia se mantuvo libre de ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125) o vehículo con el fin de evitar que la crema tocara el borde expuesto de la muestra. Estudios previos en este laboratorio usando FITC-ASO aplicados de este modo han mostrado que en aproximadamente el 20% de los casos los ASO entran en contacto con los bordes de la biopsia.
Grupos experimentales
Se recogieron tres biopsias de cada voluntario. Una de las biopsias se trató con vehículo (crema de Isis) y las otras
55 dos con ISIS 175317 al 10% (SEQ ID NO: 125) en la crema. Este régimen de tratamiento permite análisis apareado (biopsia tratada con vehículo apareada con el promedio de las dos biopsias tratadas con ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125)) de los datos, y el control de posibles efectos de confusión provocados por variaciones entre sujetos en los niveles de ARNm de IGF-IR. Se trataron dos biopsias de cada paciente con ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125) para aumentar la probabilidad de detectar cualquier efecto farmacológico.
Separación de la epidermis de la dermis
Al final del periodo de tratamiento (24 h), se incubaron muestras de tejido en EDTA 0,5 M (pH 7,4) a 60ºC durante 90 s para romper la unión epidérmica-dérmica y permitir la separación de la epidermis y la dermis mediante
65 disección roma (Dusserre et al., 1992 citado anteriormente). Se congelaron inmediatamente la epidermis y la dermis separadas en nitrógeno líquido y se almacenaron a -70ºC hasta que se extrajo el ARN.
Medición de los niveles de ARNm de IGF-IR mediante PCR en tiempo real
Se trituraron mecánicamente los tejidos en un almirez y mano de almirez de acero inoxidable que se había enfriado
5 con nitrógeno líquido. Se extrajo el ARN total usando un kit Rneasy (marca comercial registrada) Mini (Qiagen Inc., Valencia, California, EE.UU.). Se transcribió de manera inversa el ARN total (de 100 a 700 ng) usando el kit de PCR para ARN GeneAmp (Applied Biosystems, Foster City, California, EE.UU.), según las instrucciones del fabricante. La cantidad de ARN inicial se hizo coincidir tan estrechamente como fuese posible para cada conjunto de biopsias y se transcribieron de manera inversa todas las muestras en la misma reacción. Se usó PCR en tiempo real semicuantitativa para determinar la cantidad de ARNm de IGF-IR en biopsias en relación con ARN 18S. Se usaron reactivos desarrollados previamente para IGF-I humano (Applied Biosystems, n.º de producto 4319442F) y 18S (n.º de producto 4319413E) que contenían cebadores y sondas fluorescentes TaqMan (marca comercial registrada) en una reacción PCR múltiplex para amplificar simultáneamente ambos productos en cada muestra. Cada muestra se sometió a ensayo por duplicado. Se usó un detector de secuencias ABI Prism 7700 (Applied Biosystems) para el
15 análisis. Se normalizaron los niveles de ARNm de IGF-IR con respecto a 18S.
Análisis estadístico
Para el análisis estadístico, se aparearon las biopsias de cada individuo. Se apareó cada biopsia tratada con vehículo con el promedio de las dos biopsias tratadas con ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125). Para la comparación de los niveles de ARNm de IGF-IR en biopsias tratadas con ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125) y tratadas con vehículo, se usó una prueba de la t apareada paramétrica. Esta prueba supone que la población subyacente tiene una distribución gaussiana. Estos datos no diferían significativamente (P>0,1) de lo esperado si la toma de muestras era a partir de una población con una distribución gaussiana tal como se evaluó mediante una prueba de Kolmogorov
25 Smirnov modificada (Dallal et al., 1986 citado anteriormente). Además, los gráficos de puntos de las diferencias en los niveles de ARNm de IGF-IR entre biopsias tratadas con vehículo e ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125) parecían ser de una población con una distribución gaussiana. Para todas las otras comparaciones, se usó la prueba por parejas apareadas de Wilcoxon no paramétrica. Esta prueba no hace suposiciones sobre la distribución de la población subyacente. Se realizó el análisis estadístico usando GraphPad Prism versión 3.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California EE.UU.). Todos los datos se presentan como media ± una desviación estándar.
Medición de los niveles de ARNm de IGF-IR, GAPDH, HPRT, receptor de insulina (IR), capsasa 3 y Bax mediante PCR en tiempo real
35 Se trituraron mecánicamente los tejidos en un almirez y mano de almirez de acero inoxidable que se había enfriado con nitrógeno líquido. Se extrajo el ARN total usando un kit Rneasy (marca comercial registrada) Mini (Qiagen Inc., Valencia, California, EE.UU.). Se transcribió de manera inversa el ARN total (de 100 a 700 ng) usando el kit de PCR para ARN (marca comercial registrada) GeneAmp (Applied Biosystems, Foster City, California, EE.UU.), según las instrucciones del fabricante. La cantidad de ARN inicial se hizo coincidir tan estrechamente como fuese posible para cada conjunto de biopsias y se transcribieron de manera inversa todas las muestras en la misma reacción.
Se usó PCR en tiempo real semicuantitativa para determinar la cantidad de ARNm de IGF-IR, GAPDH, HPRT, receptor de insulina (IR), caspasa 3 y Bax en biopsias en relación con ARN 18S. Se usaron reactivos desarrollados previamente para los genes mencionados anteriormente (Applied Biosystems, n.º de producto 4319442F (IGF-IR),
45 n.º 433764F (GAPDH), n.º 4333768F (HPRT), n.º 4318283F (Bax) y n.º de ID de ensayo Hs00263337_m1 de “ensayo a demanda” de Applied Biosystems (caspasa 3) y n.º Hs00169631ml (receptor de insulina)), cada uno individualmente, en una reacción PCR múltiplex con un reactivo desarrollado previamente para 18S (Applied Biosystems, n.º de producto 4319413E). Estos reactivos desarrollados previamente contenían cebadores y sondas fluorescentes TaqMan (marca comercial registrada) y, cuando se usaron en una reacción PCR múltiplex, amplificaron simultáneamente el gen diana (IGF-IR, GAPDH, HPRT, receptor de insulina (IR), caspasa 3 o Bax) y 18S en cada muestra. Se sometió a ensayo cada muestra por duplicado. Se usó un detector de secuencias ABI Prism™ 7700 (Applied Biosystems) para el análisis. Se normalizaron los niveles de ARNm de IGF-IR, GAPDH, HPRT, receptor de insulina (IR), caspasa 3 y Bax con respecto a 18S.
55 Análisis estadístico
Para el análisis estadístico, se aparearon las biopsias de cada individuo. Se apareó cada biopsia tratada con vehículo con el promedio de las dos biopsias tratadas con ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125).
Para la comparación de los niveles de ARNm del gen de interés en biopsias tratadas con ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125) y tratadas con vehículo, se usó una prueba de la t apareada paramétrica. Esta prueba supone que la población subyacente tiene una distribución gaussiana. Estos datos no diferían significativamente (P>0,1) de lo esperado si la toma de muestras era a partir de una población con una distribución gaussiana tal como se evaluó mediante una prueba de Kolmogorov-Smirnov modificada (Dallal et al., 1986). Además, los gráficos de puntos de las diferencias en
65 los niveles de ARNm del gen de interés entre biopsias tratadas con vehículo e ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125) parecían ser de una población con una distribución gaussiana.
Se realizó el análisis estadístico usando GraphPad Prism versión 3.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California EE.UU.). Todos los datos se presentan como media ± una desviación estándar).
5 Los resultados se muestran en las figuras 12 a 14 y demuestran claramente la eficacia del ASO de ISIS 175317 (SEQ ID NO: 125) en la crema para reducir IGF-IR y ARN en epidermis normal, dermis y epidermis psoriásica. Los resultados en la figura 14 demuestran claramente la especificidad de este ASO para IGF-IR.
Los expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita en el presente documento es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente en los ejemplos. Debe entenderse que la invención incluye todas las variaciones y modificaciones de este tipo que están abarcadas por las reivindicaciones. La invención también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos a los que se hace referencia o se indica en esta memoria descriptiva, individual o conjuntamente, y todas y cada una de las combinaciones de dos cualquiera o más de dichas etapas o características. 15
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<150> Documento AU 2003900609/AU2003902610
<151> /
<160> 171
<170> PatentIn versión 3.1
<210> 1
<211> 20 65 <212> ADN
<213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
5
<220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> N = cualquier base
<400> 1 ccttttattt gggatgaaat
20
15
<210> 2 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
<400> 2 ccagacttca ttccttttat
20
25
<210> 3 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
<400> 3 tgatagtcgt tgcggatgtc
20
35
<210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
45
<400> 4 gctgctgata gtcgttgcgg <210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial 20
<220> <223> oligonucleótido antisentido
55
<400> 5 cttcagctgc tgatagtcgt 20
<210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
65
<400> 6 ccctcgatca ccgtgcagtt 20
5
<210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
<400> 7 ttggagatga gcaggatgtg
20
15
<210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
<400> 8 cggccttgga gatgagcagg
20
25
<210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
<400> 9 gtcctcggcc ttggagatga
20
35
<210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
45
<400> 10 cggtagtcct cggccttgga <210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial 20
<220> <223> oligonucleótido antisentido
55
<400> 11. ttgtagaaga gtttccagcc 20
<210> 12 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
65
<400> 12 tggtcatctc gaagatgacc 20
5
<210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
<400> 13 gagattggtc atctcgaaga
20
15
<210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
<400> 14 tccttgagat tggtcatctc
20
25
<210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
<400> 15 caatatcctt gagattggtc
20
35
<210> 16 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
45
<400> 16 aagcccaata tccttgagat <210> 17 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial 20
<220> <223> oligonucleótido antisentido
55
<400> 17 cccccgagta atgttcctca 20
<210> 18 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
65
<400> 18 tctcaatcct gatggccccc 20
5
<210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
<400> 19 gttattggac accgcatcca
20
15
<210> 20 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
<400> 20 atgtagttat tggacaccgc
20
25
<210> 21 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
<400> 21 ccacaatgta gttattggac
20
35
<210> 22 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
45
<400> 22 cacaggtccc cacattcctt <210> 23 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial 20
<220> <223> oligonucleótido antisentido
55
<400> 23 ctggacacag gtccccacat 20
<210> 24 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
65
<400> 24 atggtggtct tctcacacat 20
5
<210> 25 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
<400> 25 tgttgatggt ggtcttctca
20
15
<210> 26 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
<400> 26 ctcattgttg atggtggtct
20
25
<210> 27 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
<400> 27 gttgtactca ttgttgatgg
20
35
<210> 28 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
45
<400> 28 cggtagttgt actcattgtt <210> 29 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial 20
<220> <223> oligonucleótido antisentido
55
<400> 29 agcagcggta gttgtactca 20
<210> 30 <211> 20 <212> ADN <213> secuencia artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido
65
<400> 30 ggtccagcag cggtagttgt 20
<210> 31
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 31
tttgtggtcc agcagcggta
20
<210> 32
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 32
tgggcacatt ttctggcagc
20
<210> 33
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 33
ggagtaattc ccttctagct
20
<210> 34
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 34
tcccacagtt gctgcaagtt
20
<210> 35
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 35
atgttccagc tgttggagcc
20
<210> 36
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 36
ccaccatgtt ccagctgttg
20
<210> 37
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 37
gtccagggct tcagcccatg
20
<210> 38
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 38
gtgagggtca cagccttgac
20
<210> 39
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 39
ccatggtgag ggtcacagcc
20
<210> 40
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 40
ttggtgcgaa tgtacaagat
20
<210> 41
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 41
attttgtctt tggagcagta
20
<210> 42
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 42
aggaaattct caaagacttt
20
<210> 43
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 43
ctgcttcggc tggacatggt
20
<210> 44
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 44
tgttcctgct tcggctggac
20
<210> 45
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 45
ctgctctcaa agaaagggta
20
<210> 46
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 46
ccactctgct ctcaaagaaa
20
<210> 47
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 47
gttatccact ctgctctcaa
20
<210> 48
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 48
tccttgttat ccactctgct
20
<210> 49
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 49
ttgcagctgt ggatatcgat
20
<210> 50
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 50
cgtggttgca gctgtggata
20
<210> 51
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 51
agcctcgtgg ttgcagctgt
20
<210> 52
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400>
tctcagcct cgtggttgca
20
<210> 53
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 53
ccagcttctc agcctcgtgg
20
<210> 54
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 54
gcagcccagc ttctcagcct
20
<210> 55
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 55
gcgctgcagc ccagcttctc
20
<210> 56
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 56
tttaaaaaga tggagttttc
20
<210> 57
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 57
gccactttaa aaagatggag
20
<210> 58
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 58
tcctgtctgg acacacattc
20
<210> 59
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 59
aagaacacag gatctgtcca
20
<210> 60
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 60
catagaagaa cacaggatct
20
<210> 61
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 61
ggaacgtaca catcagcagc
20
<210> 62
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 62
actccttcat agaccatccc
20
<210> 63
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 63
ggagataac ttttgagatc
20
<210> 64
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 64
gagaccggag ataacttttg
20
<210> 65
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 65
attttgactg tgaaatcttc
20
<210> 66
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 66
gcgatctccc agaggacgac
20
<210> 67
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 67
tgtagtagaa ggagacctcc
20
<210> 68
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 68
gccttgtgtc ctgagtgtct
20
<210> 69
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 69
atccaaggat cagcaggtcg
20
<210> 70
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 70
gctgcttgca tattgaaaaa
20
<210> 71
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 71
aaaaagctgc ttgcatattg
20
<210> 72
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 72
gcccatgtca gttaagggtt
20
<210> 73
<211> 20
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 73 ccagcgtgtc tctcaaatgg
<210> 74
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 74 ggagtttaaa ggacagtgcc
<210> 75
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 75 catcactgac ctctttctat
<210> 76
<211> 1651
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 76
<210> 77
<211> 4989
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 77
<210> 78
<211> 15
<212> ARN
<213> Artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido que codifica para C5 propino de IGF-IR
<400> 78 cacaguugcu gcaag
15
<210> 79 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido control para H-ras humana
<400> 79 tccgtcatcg ctcctcaggg
20
<210> 80 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido control para JNK humana
<400> 80 gtgcgcgcga gcccgaaatc
20
<210> 81 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> oligonucleótido antisentido control para c-raf de ratón y de rata
<400> 81 atgcattctg cccccaagga
20
<210> 82 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Cebador de PCR para hIGF-RI
<400> 82 ccctttcttt gcagttttcc c
21
<210> 83 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Cebador de PCR para hIGF-RI
<400> 83 cgtcgtcggc ctccatt
17
<210> 84 <211> 23 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR para hIGF-RI
<400> 84
ccttcctgcc tctccgggtt tga
23
<210> 85
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR para hIGF-RI
<400> 85
acatgggcgc gcgactaagt
20
<210> 86
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 86
atgcatacta cgaaaggccg
20
<210> 87
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 87
tattccacga acgtaggctg
20
<210> 88
<211> 15
<212> ARN
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 88
uaacacgacg cgaau
15
<210> 89
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 89
tccgtcatcg ctcctcaggg
20
<210> 90
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 90
tccgtcatcg ctcctcaggg
20
<210> 91
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleótido antisentido
<400> 91
tcccgcctgt gacatgcatt
20
<210> 92
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> hebra sentido a modo de ejemplo
<400> 92
cgagaggcgg acgggaccgt t
21
<210> 93
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> hebra antisentido a modo de ejemplo
<400> 93
ttgctctccg cctgccctgg c
21
<210> 94
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda de PCR para hGAPDH
<400> 94
gaaggtgaag gtcggagtc
19
<210> 95
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda de PCR para hGAPDH
<400> 95
gaagatggtg atgggatttc
20
<210> 96
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
5
<220> <223> Sonda de PCR para hGAPDH <400> 96 caagcttccc gttctcagcc 20
10
<210> 97 <211> 5983 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 97
<210> 98
<211> 391
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
<210> 99
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> N = cualquier base
<400> 99
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn
20
<210> 100
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 100
agtctcaaac tcagtcttcg
20
<210> 101
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 101
gttaatgctg gtaaacaaga
20
<210> 102
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 102
gaagtccggg tcacaggcga
20
<210> 103
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 103
aacaagagcc ccagcctcgc
20
<210> 104
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 104
atgctggtaa acaagagccc
20
<210> 105
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 105
tgctggtaaa caagagcccc
20
<210> 106
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 106
ggagtcaaaa tgaatgagcg
20
<210> 107
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 107
aatctgccta ggcgaggaaa
20
<210> 108
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 108
gctggtaaac aagagcccca
20
<210> 109
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 109
agcccaaatc tgcctaggcg
20
<210> 110
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 110
cctccatttt caaacccgga
20
<210> 111
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 111
gaaggtcaca gccgaggcga
20
<210> 112
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 112
tcgctgaagg tcacagccga
20
<210> 113
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 113
atccaggaca cacacaaagc
20
<210> 114
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 114
aagtccgggt cacaggcgag
20
<210> 115
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 115
aagtctcaaa ctcagtcttc
20
<210> 116
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 116
gtcgtcggcc tccattttca
20
<210> 117
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 117
gcagaaacgc ggagtcaaaa
20
<210> 118
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 118
gcggcgagct ccttcccaaa
20
<210> 119
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 119
taatgctggt aaacaagagc
20
<210> 120
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 120
tttcaaaccc ggagaggcag
20
<210> 121
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 121
taggcgagga aaaacaagcc
20
<210> 122
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 122
ctcgctgaag gtcacagccg
20
<210> 123
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 123
gcagcggccc agggctcggc
20
<210> 124
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 124
gctcgctgaa ggtcacagcc
20
<210> 125
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 125
cgaaggaaac aatactccga
20
<210> 126
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 126
gaaacgcgga gtcaaaatga
20
<210> 127
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 127
gaaacaatac tccgaagggc
20
<210> 128
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 128
ccaaatccag gacacacaca
20
<210> 129
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 129
tcggcctcca ttttcaaacc
20
<210> 130
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 130
tccgggtcac aggcgaggcc
20
<210> 131
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 131
aatgaatgag cggctccccc
20
<210> 132
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 132
tgaaggtcac agccgaggcg
20
<210> 133
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 133
aaggtcacag ccgaggcgag
20
<210> 134
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 134
cccaaatcca ggacacacac
20
<210> 135
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 135
acaagtctca aactcagtct
20
<210> 136
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 136
ggtaaacaag agccccagcc
20
<210> 137
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 137
cgaagactga gtttgagact
20
<210> 138
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 138
tcgcctgtga cccggacttc
20
<210> 139
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 139
gcgaggctgg ggctcttgtt
20
<210> 140
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 140
gggctcttgt ttaccagcat
20
<210> 141
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 141
ggggctcttg tttaccagca
20
<210> 142
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 142
cgctcattca ttttgactcc
20
<210> 143
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 143
tttcctcgcc taggcagatt
20
<210> 144
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 144
tggggctctt gtttaccagc
20
<210> 145
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 145
cgcctaggca gatttgggct
20
<210> 146
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 146
tccgggtttg aaaatggagg
20
<210> 147
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 147
tcgcctcggc tgtgaccttc
20
<210> 148
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 148
tcggctgtga ccttcagcga
20
<210> 149
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 149
gctttgtgtg tgtcctggat
20
<210> 150
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 150
ctcgcctgtg acccggactt
20
<210> 151
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 151
gaagactgag tttgagactt
20
<210> 152
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 152
tgaaaatgga ggccgacgac
20
<210> 153
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 153
ttttgactcc gcgtttctgc
20
<210> 154
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 154
tttgggaagg agctcgccgc
20
<210> 155
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 155
gctcttgttt accagcatta
20
<210> 156
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 156
ggcttgtttt tcctcgccta
20
<210> 157
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 157
cggctgtgac cttcagcgag
20
<210> 158
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 158
gccgagccct gggccgctgc
20
<210> 159
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 159
ggctgtgacc ttcagcgagc
20
<210> 160
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 160
tcggagtatt gtttccttcg
20
<210> 161
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 161
tcattttgac tccgcgtttc
20
<210> 162
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 162
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20
<210> 163
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 163
tgtgtgtgtc ctggatttgg
20
<210> 164
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 164
ggtttgaaaa tggaggccga
20
<210> 165
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 165
ggcctcgcct gtgacccgga
20
<210> 166
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 166
gggggagccg ctcattcatt
20
<210> 167
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 167
cgcctcggct gtgaccttca
20
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<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 168
ctcgcctcgg ctgtgacctt
20
<210> 169
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 169
gtgtgtgtcc tggatttggg
20
<210> 170
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 170
agactgagtt tgagacttgt
20
<210> 171
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 171
ggctggggct cttgtttacc
20

Claims (30)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Oligonucleótido antisentido que comprende de 8 a 80 nucleobases de longitud, comprendiendo dicho oligonucleótido un tramo de al menos 8 nucleobases consecutivas que es complementario al menos en un 90% a la SEQ ID NO: 160 y que se dirige a una molécula de ácido nucleico que codifica para un receptor de factor de crecimiento similar a la insulina humano (SEQ ID NO: 97), hibridándose específicamente dicho oligonucleótido con dicha molécula de ácido nucleico e inhibiendo la expresión de IGF-IR.
  2. 2.
    Oligonucleótido según la reivindicación 1, que comprende de 12 a 50 nucleobases de longitud, comprendiendo dicho oligonucleótido un tramo de al menos 8 nucleobases consecutivas que es complementario en un 100% a la SEQ ID NO: 160.
  3. 3.
    Oligonucleótido según la reivindicación 1, que comprende de 15 a 30 nucleobases de longitud, comprendiendo dicho oligonucleótido un tramo de al menos 8 nucleobases consecutivas que es complementario en un 90% a la SEQ ID NO: 160.
  4. 4.
    Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un oligonucleótido de ADN, un oligonucleótido de ARN o un oligonucleótido quimérico.
  5. 5.
    Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, hibridándose al menos una porción de dicho oligonucleótido con ARN para formar un dúplex de oligonucleótido-ARN.
  6. 6.
    Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que tiene al menos un enlace internucleosídico, resto azúcar o nucleobase modificado.
  7. 7.
    Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que tiene al menos un resto 2’-O-metoxietilazúcar.
  8. 8.
    Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene al menos un enlace internucleosídico de fosforotioato.
  9. 9.
    Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que tiene al menos una 5-metilcitosina.
  10. 10.
    Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 9, comprendiendo dicho oligonucleótido un tramo de al menos 8 nucleobases consecutivas que es complementario en un 100% a la SEQ ID NO: 160.
  11. 11.
    Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 9, comprendiendo dicho oligonucleótido un tramo de al menos 8 nucleobases consecutivas que es complementario al menos en un 95% a la SEQ ID NO: 160.
  12. 12.
    Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 9, que comprende al menos 18 nucleobases que son idénticas al menos en un 90% a la SEQ ID NO: 125.
  13. 13.
    Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 9, que comprende al menos 15 nucleobases que son idénticas al menos en un 95% a la SEQ ID NO: 125.
  14. 14.
    Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 9, que comprende al menos 12 nucleobases que son idénticas en un 100% a la SEQ ID NO: 125.
  15. 15.
    Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 9, que consiste en la SEQ ID NO: 125.
  16. 16.
    Oligonucleótido que consiste en 20 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de nucleobases que consiste en la secuencia de nucleobases citada en SEQ ID NO: 125 en la que una región de diez desoxinucleótidos está flanqueada en ambos extremos 5’ y 3’ con cinco nucleótidos de 2’-O-(2-metoxietilo), siendo cada enlace internucleosídico un fosforotioato y cada citosina una 5-metilcitosina.
  17. 17.
    Composición que comprende el oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o una sal del mismo y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
  18. 18.
    Método de diagnóstico in vitro para identificar un estado patológico que comprende identificar la presencia de IGF-IR en una muestra usando un oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y/o una composición según la reivindicación 17.
  19. 19.
    Kit o dispositivo de ensayo que comprende el oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y/o una composición según la reivindicación 17.
  20. 20.
    Uso de un oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y/o una composición según la
    reivindicación 17 en la fabricación de un medicamento para tratar a un animal que tiene una enfermedad, estado o trastorno asociado a IGF-IR, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión de IGF-IR y en el que el trastorno asociado a IGF-IR es un trastorno de la piel seleccionado de psoriasis, ictiosis, pitiriasis rubra pilaris, seborrea, queloides, queratosis, neoplasias, esclerodermia, verrugas, crecimientos benignos o cánceres de la piel.
  21. 21.
    Uso según la reivindicación 20, en el que el oligonucleótido inhibe la expresión de IGF-IR.
  22. 22.
    Uso según la reivindicación 20 o la reivindicación 21, en el que el animal o mamífero es un ser humano.
  23. 23.
    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que el oligonucleótido es una molécula de ácido nucleico de fosforotioato.
  24. 24.
    Composición según la reivindicación 17, en la que dicho oligonucleótido puede inhibir o reducir de otra manera la proliferación celular u otro trastorno médico mediado por IGF-IR.
  25. 25.
    Composición según la reivindicación 24, en la que dicho oligonucleótido es una molécula de ácido nucleico de fosforotioato.
  26. 26.
    Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o composición según la reivindicación 17 para su uso en el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad, estado o trastorno asociado a IGF-IR, inhibiendo dicho oligonucleótido la expresión de IGF-IR.
  27. 27.
    Oligonucleótido o composición según la reivindicación 26, inhibiendo el oligonucleótido la expresión de IGF-IR.
  28. 28.
    Oligonucleótido o composición según la reivindicación 26 ó 27, en el que el trastorno asociado a IGF-IR es un trastorno de la piel seleccionado de psoriasis, ictiosis, pitiriasis rubra pilaris, seborrea, queloides, queratosis, neoplasias, esclerodermia, verrugas, crecimientos benignos o cánceres de la piel.
  29. 29.
    Oligonucleótido o composición según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, siendo el animal o mamífero un ser humano.
  30. 30.
    Oligonucleótido o composición según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, siendo el oligonucleótido una molécula de ácido nucleico de fosforotioato.
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