JP2006520586A - インスリン様増殖因子i受容体発現の調節 - Google Patents
インスリン様増殖因子i受容体発現の調節 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006520586A JP2006520586A JP2006501357A JP2006501357A JP2006520586A JP 2006520586 A JP2006520586 A JP 2006520586A JP 2006501357 A JP2006501357 A JP 2006501357A JP 2006501357 A JP2006501357 A JP 2006501357A JP 2006520586 A JP2006520586 A JP 2006520586A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- igf
- seq
- compound
- nucleic acid
- oligonucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/33—Chemical structure of the base
- C12N2310/334—Modified C
- C12N2310/3341—5-Methylcytosine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
本発明は、増殖因子受容体遺伝子の発現を調節する組成物および方法を提供する。特に、本発明は、好ましい態様において、インスリン様増殖因子I受容体(IGF-I受容体またはIGF-IR)をコードする核酸分子とハイブリダイズする化合物、特にオリゴヌクレオチド化合物に関する。そのような化合物は、本発明において増殖性および炎症性の皮膚障害および癌の治療に関連する増殖を調節するために例示される。しかし、化合物は、炎症病態を含む、IGF-IRが関与している如何なる他の疾患にも用いることができると理解されるであろう。
本明細書において著者らによって引用される出版物の参考書目の詳細は説明文の末尾にまとめてある。
IGF-IRは、トランスフォーメーションおよび細胞周期進行におけるその役割を調べるために、線維芽細胞、造血細胞、および神経膠芽腫においてアンチセンスアプローチによってこれまで標的とされてきた
本明細書を通して、内容物がそうでないことを必要としている限り、「含む(comprise、comprises、comprising)」という用語またはその変化形は、記述の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を含めるが、他の任意の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を除外しないことを意味すると理解されるであろう。
A.発明の概要
本発明は、インスリン様増殖因子I受容体、および特定の態様においてヒトインスリン様増殖因子I受容体(IGF-IR)をコードする核酸分子の機能または作用を調節するために用いられる化合物、好ましくはオリゴヌクレオチドおよび類似の種を用いる。本発明は、IGF-IRをコードする一つまたは複数の核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することによって得られる。本明細書において用いられるように、「標的核酸」および「IGF-IRをコードする核酸分子」という用語は、IGF-IRをコードするDNA、そのようなDNAから転写されたRNA(プレ-mRNAおよびmRNAまたはその一部を含む)、および同様にそのようなRNAに由来するcDNAを含むために便宜上用いられている。本発明の化合物のその標的核酸とのハイブリダイゼーションは一般的に、「アンチセンス」と呼ばれる。その結果、本発明のいくつかの好ましい態様の実践において含まれると考えられる好ましいメカニズムを、本明細書において「アンチセンス阻害」と呼ぶ。そのようなアンチセンス阻害は典型的に、少なくとも一つの鎖またはセグメントが切断、分解、またはそうでなければ操作不可能となるように、オリゴヌクレオチド鎖またはセグメントの水素結合に基づくハイブリダイゼーションに基づく。この点において、現在、そのようなアンチセンス阻害のために特異的核酸分子およびその機能を標的とすることが好ましい。
本発明に従って、化合物には、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部誘導配列(EGS)オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー、プライマー、プローブ、および標的核酸の少なくとも一部とハイブリダイズする他のオリゴマー化合物が含まれる。そのため、これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、またはヘアピンオリゴマー化合物の形で導入してもよく、内部もしくは末端隆起またはループのような構造要素を含んでもよい。系に導入されると、本発明の化合物は、標的核酸の改変を行うために一つまたは複数の酵素または構造タンパク質の活性を誘発してもよい。
本発明の状況において、アンチセンス化合物を特定の核酸分子に「ターゲティング」することは、多段階プロセスとなりうる。プロセスは通常、その機能を調節すべき標的核酸を同定することによって始まる、この標的核酸は、例えばその発現が特定の障害または疾患状態に関連している細胞遺伝子(または遺伝子から転写されたmRNA)、または感染因子からの核酸分子であってもよい。本発明において、標的核酸はIGF-IRをコードする。
さらなる態様において、本明細書において同定された「好ましい標的セグメント」を、IGF-IR遺伝子の発現を調節するさらなる化合物のスクリーニングにおいて用いてもよい。「調節物質」は、IGF-IRをコードする核酸分子の発現を減少または増加させ、および好ましい標的セグメントに対して相補的な少なくとも8-ヌクレオベース部分を含む化合物である。スクリーニング法は、IGF-IRをコードする核酸分子の好ましい標的セグメントを一つまたは複数の候補調節物質に接触させる段階、およびIGF-IRをコードする核酸分子の発現を減少または増加させる一つまたは複数の候補調節物質を選択する段階を含む。候補調節物質または複数の調節物質がIGF-IRをコードする核酸分子の発現を調節できる(すなわち、減少または増加させる)ことが示された場合、調節物質を、IGF-IRの機能をさらに調べる研究に用いてもよく、または本発明に従って研究、診断、もしくは治療物質として用いてもよい。
例えばそのような二本鎖部分は、標的に対する二本鎖のアンチセンス鎖の古典的なハイブリダイゼーションによって標的を阻害し、それによって標的の酵素的分解を誘発することが示されている(Tijsterman et al.、2002、上記)。
本発明の化合物は、診断薬、治療薬、予防薬、ならびに研究試薬およびキットとして利用することができる。さらに、すばらしい特異性で遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドはしばしば、特定の遺伝子の機能を解明するため、生物経路の様々なメンバーの機能を区別するために、当業者によって用いられる。
Vilo、FEBS Lett. 480:17〜24、2000;Celis et al.、FEBS Lett. 480:2〜16、2000)、SAGE(遺伝子発現連続分析)(Madden et al.、Drug Discov. Today 5:415〜425、2000)、READS(消化cDNAの制限酵素増幅)(PrasharおよびWeissman、Methods Enzymol. 303:258〜272、1999)、TOGA(総遺伝子発現分析)(Sutcliffe et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:1976〜1981、2000)、タンパク質アレイおよびプロテオミクス(Celis et al.、2000、上記;Jungblut et al.、Electrophoresis 20:2100〜2110、1999)、発現された配列タグ(EST)シークエンシング(Celis et al.、2000、上記;Larsson et al.、J. Biotechnol. 80:143〜157、2000)、サブトラクティブRNAフィンガープリンティング(SuRF)(Fuchs et al.、Anal Biochem. 286:91〜98、2000;Larsson et al.、Cytometry 41:203〜208、2000)、サブトラクティブクローニング、ディファレンシャルディスプレイ(DD)(JurecicおよびBelmont、Curr. Opin. Microbiol. 3:316〜321、2000)、比較ゲノムハイブリダイゼーション(Carulli et al.、J. Cell Biochem. Suppl.31:286〜296、1998)、FISH(蛍光インサイチューハイブリダイゼーション)技術(GoingおよびGuesterson、Eur. J. Cancer 35:1895〜1904、1999)、および質量分析法(To、Comb. Chem. High Throughput Screen 3:235〜241、2000)が含まれる。
当技術分野で公知であるように、ヌクレオシドは塩基-糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は通常、複素環塩基である。そのような複素環塩基の二つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合した燐酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、燐酸基は、糖の2'、3'、または5'ヒドロキシル部分のいずれかに結合させることができる。オリゴヌクレオチドを形成する場合、燐酸基は隣接するヌクレオシドを互いに共有結合させて、直線状のポリマー化合物を形成する。次に、この直線状のポリマー化合物のそれぞれの末端をさらに結合させて、環状化合物を形成させることができるが、直線状の化合物が一般的に好ましい。さらに、直線状の化合物は、内部ヌクレオベース相補性を有してもよく、したがって、完全または部分的に二本鎖の化合物を産生するように折り畳んでもよい。オリゴヌクレオチドにおいて、燐酸基は、一般的にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成すると呼ばれる。RNAおよびDNAの通常の結合または骨格は3'から5'ホスホジエステル結合である。
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例には、改変骨格または非天然インターヌクレオシド結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書において定義されるように、改変骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格において燐原子を保持するオリゴヌクレオチド、および骨格に燐原子を有しないオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書の目的に関して、および時に当技術分野において参照されるように、そのヌクレオシド間骨格に燐原子を有しない改変オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであると見なすことができる。
号が含まれるがこれらに限定されない。
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体において、ヌクレオチド単位の糖およびインターヌクレオシド結合(すなわち、骨格)はいずれも、新しい基に置換される。ヌクレオベース単位は、適当な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのような化合物の一つ、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸(PNA)と呼ばれる。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格に置換される。ヌクレオべースは保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,539,082;5,714,331;および5,719,262号が含まれるがこれらに限定されない。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsen et al.、Science 254:1497〜1500、1991に認められうる。
改変オリゴヌクレオチドはまた、一つまたは複数の置換糖部分を含んでもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に以下の一つ:OH;F;O-、S-、もしくはN-アルキル;O-、S-、もしくはN-アルケニル;O-、S-、もしくはN-アルキニル;またはO-アルキル-O-アルキルを含み、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは置換または非置換C1-C10アルキルまたはC2-C10アルケニルおよびアルキニルであってもよい。特に好ましいのはnおよびmが1〜約10である、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3]2である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位で以下の一つを含む:C1-C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリル、またはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレート剤、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬物動力学特性を改善する基、および類似の特性を有する他の置換基を含む。好ましい改変には、2'-メトキシエトキシ(2'-O-(2-メトキシエチル)または2'-MOEとしても知られる(2'-O-CH2CH2OCH3))(Martin et al.、Helv. Chim. Acta. 78:486〜504、1995)、すなわちアルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに好ましい改変には、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち下記の実施例に記述されるように2'-DMAOEとしても知られるO(CH2)2ON(CH3)2基、および2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(当技術分野において2'-O-ジメチル-アミノ-エトキシ-エチルまたは2'-DMAEOEとしても知られる)、すなわち下記の実施例に記述されるように2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2が含まれる。
号が含まれるがこれらに限定されない。
オリゴヌクレオチドにはまた、ヌクレオベース(当技術分野においてしばしば単純に「塩基」と呼ばれる)改変または置換が含まれてもよい。本明細書において用いられるように、「非改変」または「天然」のヌクレオベースには、プリン塩基アデニン(A)およびグアニン(G)、およびピリミジン塩基チミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)が含まれる。改変ヌクレオベースには、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニル(-C≡C-CH3)ウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、シトシン、およびチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニン、ならびに3-デアザグアニンおよび2-デアザアデニンのような他の合成および天然ヌクレオベースが含まれる。さらなる改変ヌクレオベースには、フェノキサジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン)、フェノチアジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾチアジン-2(3H)-オン)、置換フェノキサジンシチジン(例えば、9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン)のようなG-クランプ、カルバゾールシチジン(2H-ピリミド[4,5-b]インドル-2-オン)、ピリドインドールシチジン(H-ピリド[3',2':4,5]ピロロ[2,3-d]ピリミジン-2-オン)のような三環系ピリミジンが含まれる。改変ヌクレオベースにはまた、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば7-デアザ-アデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジンおよび2-ピリドンに置換されているヌクレオベースが含まれてもよい。さらなるヌクレオベースには、米国特許第3,687,808号に開示されるヌクレオベース、「The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」、858〜859頁、Kroschwitz, J.I.編、John Wiley & Sons、1990に開示されるヌクレオベース、English et al.、Angewandte Chemie、国際版、30:613、1991に開示されるヌクレオベース、およびSanghvi, Y.S.、第15章、「Antisense Research and Applications」、289〜302頁、Crooke, S.T,およびLebleu, B.編、CRC出版、1993に開示されるヌクレオベースが含まれる。これらのヌクレオベースのいくつかは、本発明の化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、および5-プロピニルシトシンを含む5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、ならびにN-2、N-6、およびO-6置換プリンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を0.6〜1.2℃増加させることが示されており、現在好ましい塩基置換であるが、2'-O-メトキシエチル糖改変と組み合わせるとさらにより特に好ましい。
号、ならびに本出願によって一般的に所有され、同様に参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,750,692号が含まれるがこれらに限定されない。
本発明のオリゴヌクレオチドのもう一つの改変は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する一つまたは複数の部分または結合体をオリゴヌクレオチドに化学結合させることを含む。これらの部分または結合体には、一級または二級ヒドロキシル基のような官能基に共有結合した結合基が含まれうる。本発明の結合基には、インターカレート剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬物動力学特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を増強する基が含まれる。典型的な結合基には、コレステロール、脂質、燐脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナンスリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が含まれる。本発明の状況において薬物動力学特性を増強する基には、取り込みを改善する、分解に対する抵抗性を増強する、および/または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。本発明の状況において、薬物動態特性を増強する基には、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝、または排泄を改善する基が含まれる。代表的な結合基は、その全開示が参照として本明細書に組み入れられる、1992年10月23日に提出された国際特許出願であるPCT/US92/09196、および米国特許第6,287,860号に開示される。結合体部分には、コレステロール部分、胆汁酸、チオエーテル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール、またはウンデシル残基、燐脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート、ポリアミン、またはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミン、またはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分のような脂質部分が含まれるがこれらに限定されない。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、活性な薬物、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)-(+)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、2,3,5-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、葉酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤、または抗生物質に結合させてもよい。オリゴヌクレオチド-薬物結合体およびその調製は、その全内容物が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許出願第09/334,130号(1999年6月15日に提出)に記述されている。
号が含まれるがこれらに限定されない。
所定の化合物における全ての位置が均一に改変される必要はなく、実際に、上記の一つより多い改変を、単一の化合物、またはオリゴヌクレオチド内の一つのヌクレオシドに組み入れてもよい。
号が含まれるがこれらに限定されない。
本発明の化合物はまた、取り込み、分布、および/または吸収を補助するために、例えばリポソーム、受容体ターゲティング分子、経口、直腸、局所、または他の製剤として、他の分子、分子構造、または化合物の混合物と混合、封入、結合、またはそうでなければ会合させてもよい。そのような取り込み、分布、および/または吸収補助製剤の調製を教示する代表的な米国特許には、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第
号が含まれるがこれらに限定されない。
治療組成物の調製およびその後の投与(投与)は、当業者の範囲内であると考えられる。投与は、治療すべき病態の重症度および反応性に依存し、治療コースは数日から数ヶ月間、治癒が得られるまで、または病態の減少が得られるまで持続する。最適な投与スケジュールは患者の体内での薬物蓄積の測定から計算することができる。当業者は、最適な用量、投与方法論、および繰り返し数を容易に決定することができる。最適な用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的強度に依存して変化してもよく、一般的にインビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効であることが判明したEC50に基づいて推定することができる。一般的に、用量は、0.01ug〜100g/kg体重であり、毎日、毎週、毎月、毎年1回またはそれ以上、または2〜20年毎に1回投与してもよい。当業者は、体液または組織における薬物の測定された残留時間および濃度に基づいて、投与の繰り返し数を容易に推定することができる。治療の成功後、病態の再発を予防するために、患者に、オリゴヌクレオチドを0.01ug〜100g/kg体重の範囲の維持用量で毎日1回またはそれ以上から20年に1回投与する、維持治療を受けさせることが望ましいかも知れない。
実施例1
ヌクレオシドホスホロアミダイトの合成
アミダイトおよびその中間体を含む以下の化合物は、米国特許第6,426,220号および公表されたPCT出願WO02/36743に記述された通りに調製した;5-メチルdCアミダイトの5'-O-ジメトキシトリチル-チミジン中間体、5-メチル-dCアミダイトの5'-O-ジメトキシトリチル-2'-デオキシ-5-メチルシチジン中間体、5-メチルdCアミダイトの5'-O-ジメトキシトリチル-2'-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジン最後から2番目の中間体、[5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3'-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト(5-メチルdCアミダイト)、2'-フルオロデオキシアデノシン、2'-フルオロデオキシグアノシン、2'-フルオロウリジン、2'-フルオロデオキシシチジン、2'-O-(2-メトキシエチル)改変アミダイト、2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジン中間体、5'-O-DMT-2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジン最後から2番目の中間体、[5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジン-3'-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト(MOE Tアミダイト)、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルシチジン中間体、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-(2-メトキシエチル)-N4-ベンゾイル-5-メチル-シチジン最後から2番目の中間体、[5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-N4-ベンゾイル-5-メチル-シチジン-3'-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト(MOE 5-Me-Cアミダイト)、[5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-N6-ベンゾイルアデノシン-3'-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト(MOE Aアミダイト)、[5'-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-2'-O-(2-メトキシエチル)-N4-イソブチリルグアノシン-3'-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト(MOE Gアミダイト)、2'-O-(アミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトおよび2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイト、2'-(ジメチルアミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-(2-ヒドロキシエチル)-5-メチルウリジン、2'-O-[(2-フタルイミドオキシ)エチル]-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[(2-ホルムアドオキシミノオキシ)エチル]-5-メチルウリジン、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[N,Nジメチルアミノオキシエチル]-5-メチルウリジン、2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン、5'-O-DMT-2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン、5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン-3'-[(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト]、2'-(アミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト、N2-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2'-O-(2-エチルアセチル)-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)グアノシン-3'-[(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト]、2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(2'-DMAEOE)ヌクレオシドアミダイト、2'-O-[2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)エチル]-5-メチルウリジン、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-[2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)-エチル]-5-メチルウリジン、および5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-[2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)-エチル]-5-メチルウリジン-3'-O-(シアノエチル-N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト。
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシド合成
本発明に従って用いられるアンチセンス化合物は、固相合成に関する周知の技術を通して簡便かつ普通に作製してもよい。そのような合成のための設備は、例えばアプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems、フォスターシティ、カリフォルニア州)を含むいくつかの販売元によって販売されている。当技術分野で既知のそのような合成の他の手段を、さらにもしくはまたは用いてもよい。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを調製するために類似の技術を用いることは周知である。
RNA合成
一般的に、RNA合成化学は、戦略的な中間反応において様々な保護基を選択的に組み入れることに基づく。当業者は、有機合成において保護基を用いることを理解するであろうが、有用なクラスの保護基には、シリルエーテルが含まれる。特に、かさの大きいシリルエーテルは、2'-ヒドロキシル上の酸不安定性のオルトエステル保護基と組み合わせて、5'-ヒドロキシルを保護するために用いられる。次に、この組の保護基を標準的な固相合成技術と共に用いる。他の全ての合成段階の後に、酸不安定なオルトエステル保護基を最後に除去することが重要である。その上、合成の際にシリル保護基を最初に用いることによって、望ましければ、2'-ヒドロキシルが望ましくなく脱保護されることなく、除去が確実に容易となる。
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または混合オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なるタイプとなりうる。これらには、結合したヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが、結合したヌクレオシドの5'および3'「ウィング」セグメントのあいだに存在する第一のタイプと、「ギャップ」セグメントがオリゴマー化合物の3'または5'末端のいずれかに存在する第二の「開放末端」型が含まれる。第一のタイプのオリゴヌクレオチドはまた、当技術分野において「ギャップマー」またはギャップドオリゴヌクレオチドとしても知られる。第二のタイプのオリゴヌクレオチドはまた、当技術分野において「ヘミマー」または「ウィングマー」としても知られる。
2'-O-アルキルホスホロチオエートおよび2'-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドは、アプライドバイオシステムズ自動DNA分子シンセサイザーモデル394を用いて上記のように合成する。オリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーおよびDNA部分に関して2'-デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-3'-O-ホスホロアミダイト、ならびに5'および3'ウィングに関して5'ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホロアミダイトを用いて合成する。5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホロアミダイトに関して反応時間を増加させたカップリング段階を組み入れることによって、標準的な合成サイクルを改変する。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から切断して、濃アンモニア(NH4OH)において55℃で12〜16時間脱保護する。次に、脱保護されたオリゴを適当な方法(沈殿、カラムクロマトグラフィー、真空での容積減少)によって回収して、キャピラリー電気泳動および質量分析によって収量および純度に関して分光光度法によって分析する。
[2'-O-(2-メトキシエチル)]-[2'-デオキシ]-[2'-O-(メトキシエチル)]キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドに関して先に記述した技法の通りに調製して、2'-O-(メトキシエチル)アミダイトを2'-O-メチルアミダイトの代わりに置換した。
[2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル]-[2'-デオキシホスホロチオエート]-[2'-O-(メトキシエチル)ホスホジエステル]キメラオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドに関する上記の技法の通りに調製するが、2'-O-メチルアミダイトの代わりに2'-O-(メトキシエチル)アミダイトを用いて、ヨウ素による酸化によってキメラ構造のウイング部分内にホスホジエステルインターヌクレオチド結合を生成し、そして3,H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシド(Beaucage試薬)を利用する硫化によって中心のギャップに関してホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を生成する。
IGF-IR mRNAを標的とする二本鎖アンチセンス化合物の設計およびスクリーニング
本発明に従って、本発明のアンチセンス化合物およびその相補体を含む一連の核酸二本鎖を、IGF-IR mRNAを標的とするように設計することができる。二本鎖のアンチセンス鎖のヌクレオベース配列は、好ましいASO
を含む表1に示されるSEQ ID NO:1〜76およびSEQ ID NO:100〜136から選択されるオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を含む。鎖の末端部は、一つまたは複数の天然または改変ヌクレオベースを加えて突出末端を形成することによって改変してもよい。次に、dsRNAのセンス鎖を設計して、アンチセンス鎖の相補体として合成し、いずれかの末端に対する改変または付加を含んでもよい。例えば、一つの態様において、dsRNA二本鎖の双方の鎖は、中心のヌクレオベースに対して相補的であり、それぞれが一つまたは双方の末端に突出末端を有するであろう。
オリゴヌクレオチドの単離
制御された多孔性ガラス固相支持体から切断して、濃水酸化アンモニウムにおいて55℃で12〜16時間脱ブロッキングした後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを1M NH4OAcと共に>3量のエタノールからの沈殿によって回収する。合成オリゴヌクレオチドを、エレクトロスプレー質量分析(分子量の測定)およびキャピラリーゲル電気泳動によって分析したところ、完全長の材料の少なくとも70%であると判断した。合成において得られたホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量は、-16 amu産物(+/-32 +/-48)に対する正確な分子量の比によって決定した。いくつかの試験に関して、オリゴヌクレオチドは、Chiang et al.、J. Biol. Chem. 266:18162〜18171、1991によって記述されるようにHPLCによって精製した。HPLC精製材料から得られた結果は、非HPLC精製材料について得られた結果と類似であった。
オリゴヌクレオチド合成−96ウェルプレートフォーマット
オリゴヌクレオチドは、96ウェルフォーマットで配列96個を同時に構築することができる自動シンセサイザー上で固相P(III)ホスホロアミダイト化学によって合成した。ホスホジエステルインターヌクレオチド結合は、ヨウ素水溶液による酸化によって得られた。ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合は、3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1ジオキシド(Beaucage試薬)の無水アセトニトリル溶液を利用する硫化によって生成した。標準的な塩基保護β-シアノエチル-ジイソ-プロピルホスホロアミダイトは、販売元(例えば、PEアプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、またはファルマシア(Pharmacia)、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)から購入した。非標準ヌクレオシドは、標準的なまたは特許申請された方法の通りに合成する。それらは、塩基保護β-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトとして利用する。
オリゴヌクレオチド分析−96ウェルプレートフォーマット
各ウェルにおけるオリゴヌクレオチドの濃度を、試料の希釈およびUV吸収分光法によって評価した。個々の産物の完全長の完全性を、96ウェルフォーマット(Beckman P/ACE(商標)MDQ)において、または個々に調製した試料に関して、市販のCE装置(例えば、Beckman P/ACE(商標)5000、ABI 270)においてキャピラリー電気泳動(CE)によって評価した。塩基および骨格の組成は、エレクトロスプレー質量分析を利用した化合物の質量分析によって確認した。全てのアッセイ試験プレートを1チャンネルおよび多チャンネルロボットピペッターを用いて主プレートから希釈した。プレートは、プレート上の化合物の少なくとも85%が少なくとも85%完全長であれば許容可能であると判断された。
細胞培養とオリゴヌクレオチド処置
アンチセンス化合物が標的核酸発現に及ぼす作用は、標的核酸が測定可能なレベルで存在する限り、多様な如何なる細胞タイプにおいても試験することができる。これは、例えばPCRまたはノザンブロット分析を用いて普通に決定することができる。以下の細胞タイプは、説明する目的のために提供されるが、他の細胞タイプも、選択した細胞タイプに標的が発現される限り、普通に用いることができる。これは、当技術分野において普通の方法、例えばノザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、またはRT-PCRによって容易に決定することができる。
ヒトの移行上皮性膀胱癌細胞株T-24は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(マナッサス、バージニア州)から得た。T-24細胞は普通、10%w/v仔ウシ胎児血清(インビトロジェン社(Invitrogen Corporation)、カールスバッド、カリフォルニア州)、100単位/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシン(インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州)を添加した完全なMcCoy's 5A基本培地(インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州)において培養した。細胞は、90%コンフルエンスに達した際にトリプシン処理および希釈によって日常的に継代した。細胞を、RT-PCR分析に用いるために96ウェルプレート(ファルコン-プリマリア(Falcon-Primaria)、#353872)に細胞7000個/ウェルの密度で播種した。
ヒト肺癌細胞株A549は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(マナッサス、バージニア州)から得た。A549細胞は、10%仔ウシ胎児血清(インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州)、100単位/mlペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシン(インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州)を添加したDMEM基本培地(インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州)において普通に培養した。細胞は、90%コンフルエンスに達した際にトリプシン処理および希釈によって日常的に継代した。
ヒト新生児皮膚線維芽細胞(NHDF)は、クロネティクスコーポレーション(Clonetics Corporation、ウォーカースビル、メリーランド州)から得た。NHDFsは、供給元の推奨どおりに添加した線維芽細胞増殖培地(クロネティクスコーポレーション、ウォーカースビル、メリーランド州)において日常的に維持した。細胞は、供給元の推奨どおりに継代10回まで維持した。
ヒト胚ケラチノサイト(HEK)は、クロネティクスコーポレーション(ウォーカースビル、メリーランド州)から得た。HEKsは、供給元によって推奨されるとおりにケラチノサイト増殖培地((クロネティクスコーポレーション、ウォーカースビル、メリーランド州)において日常的に維持した。細胞は、供給元の推奨どおりに継代10回まで維持した。
細胞が65〜75%コンフルエンシーに達すると、細胞をオリゴヌクレオチドによって処置した。96ウェルプレートにおいて増殖させた細胞の場合、ウェルを、OPTI-MEM(商標)-1血清減少培地(インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州)100μLによって1回洗浄後、3.75μg/mL LIPOFECTIN(商標)(インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州)および所望の濃度のオリゴヌクレオチドを含むOPTI-MEM(商標)-1 130μLによって処置した。細胞を処置して、データを1試料あたり3個ずつ得る。37℃で4〜7時間処置後、培地を新鮮な培地に交換した。細胞をオリゴヌクレオチド処置の16〜24時間後に回収した。
、またはヒトJun-N-末端キナーゼ-2(JNK2)を標的とする
のいずれかから選択される。いずれの対照も、ホスホロチオエート骨格を有する2'-O-メトキシエチルギャップマー(2'-O-メトキシエチルを太字で示す)である。マウスまたはラット細胞の場合、陽性対照オリゴヌクレオチドは、マウスおよびラットc-rafの双方を標的とする、ホスホロチオエート骨格を有する2'-O-メトキシエチルギャップマー(2'-O-メトキシエチルを太字で示す)である
である。c-H-ras(ISIS 13920の場合)、JNK2(ISIS 18078の場合)、またはc-raf(ISIS 15770の場合)mRNAの80%阻害が起こる陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞株に関するその後の実験における新しいオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として用いる。80%阻害が得られない場合、c-H-ras、JNK2、またはc-raf mRNAの60%阻害が起こる陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度を、その細胞株に関するその後の実験における新しいオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として用いる。60%阻害が得られない場合、その特定の細胞株は、オリゴヌクレオチドトランスフェクション実験にとって不適であると思われる。本明細書において用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、50nM〜300nMである。
IGF-IR遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
IGF-IR遺伝子発現のアンチセンスによる調節は、当技術分野で既知の多様な方法においてアッセイすることができる。例えば、IGF-IR mRNAレベルは、例えばノザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、またはリアルタイムPCR(RT-PCR)によって定量することができる。リアルタイム定量的PCRが現在好ましい。RNA分析は、総細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAについて行うことができる。本発明のRNA分析の好ましい方法は、本明細書に記述の他の実施例に記述されるように総細胞RNAを用いることである。RNAの単離法は当技術分野で周知である。ノザンブロット分析も同様に当技術分野で日常的である。リアルタイム定量的PCRは、PE-アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州から入手可能な市販のABI Prism(商標)7600、7700、または7900配列検出システムを用いて、製造元の説明書に従って簡便に行うことができる。
IGF-IR遺伝子発現阻害剤を用いるための表現型アッセイおよびインビボ試験の設計
表現型アッセイ
IGF-IR遺伝子発現阻害剤を本明細書に開示の方法によって同定した後、化合物を、それぞれが特定の疾患状態または病態の治療において有効性を予測する測定可能なエンドポイントを有する一つまたは複数の表現型アッセイにおいてさらに調べる。
本明細書において記述されるインビボ試験の個々の被験者は、ヒトを含む温血脊椎動物である。
RNA単離
ポリ(A)+mRNA単離
ポリ(A)+mRNAは、Miura et al.(Clin. Chem. 42、1758〜1764、1996)に従って単離した。他のポリ(A)+mRNA単離法は当技術分野で日常的である。簡単に説明すると、96ウェルプレートにおいて増殖させた細胞に関して、増殖培地を細胞から除去して、各ウェルを冷PBS 200μLによって洗浄した。溶解緩衝液(10mMトリス-塩酸、pH7.6、1mM EDTA、0.5M NaCl、0.5%NP-40、20mMバナジル-リボヌクレオシド複合体)60μLを各ウェルに加えて、プレートを軽く攪拌して、室温で5分間インキュベートした。溶解物55μLをオリゴd(T)コーティング96ウェルプレート(AGCTインク、アーバイン、カリフォルニア州)に移した。プレートを室温で60分間インキュベートして、洗浄緩衝液(10mMトリス-HCl、pH7.6、1mM EDTA、0.3M NaCl)200μLによって3回洗浄した。最後に洗浄した後、ペーパータオルの上でプレートの水分をしみこませて過剰量の洗浄緩衝液を除去し、5分間風乾させた。予め70℃に加温した溶出緩衝液(5mMトリス-HCl、pH7.6)60μLを各ウェルに加えて、プレートを90℃のホットプレートにおいて5分間インキュベートして、溶出液を新しい96ウェルに移した。
総RNAは、製造元の推奨する技法に従って、キアゲンインク(バレンシア、カリフォルニア州)から購入したRNEASY 96(商標)キットおよび緩衝液を用いて単離した。簡単に説明すると、96ウェルプレートにおいて増殖させた細胞に関して、増殖培地を細胞から除去して、各ウェルを冷PBS 200μLによって洗浄した。緩衝液RLT 150μLを各ウェルに加えて、プレートを20秒間強く攪拌した。70%エタノール150μLを各ウェルに加えて、上下に3回ピペッティングすることによって内容物を混合した。試料を、排液回収トレイを備えて、真空源に結合させたQIAVAC(商標)マニホルドに接続したRNEASY 96(商標)ウェルプレートに移した。1分間真空を適用した。緩衝液RW1 500μLをRNEASY 96(商標)プレートの各ウェルに加えて、15分間インキュベートして、再度真空を1分間適用した。さらに緩衝液RW1 500μLをRNEASY 96(商標)プレートの各ウェルに加えて、2分間真空を適用した。緩衝液RPE 1mLをRNEASY 96(商標)プレートの各ウェルに加えて90秒間真空を適用した。緩衝液RPEによる洗浄を繰り返して、真空をさらに3分間適用した。プレートをQIAVAC(商標)マニホルドから外して、ペーパータオルの上で乾燥させた。プレートを、1.2mL回収試験管を含む回収試験管ラックを備えたQIAVAC(商標)マニホルドに再度取り付けた。次に、RNアーゼ不含水140μLを各ウェルにピペットによって加えることによってRNAを溶出して、1分間インキュベートしてから、真空を3分間適用した。
IGF-IR mRNAレベルのリアルタイム定量的PCR分析
IGF-IR mRNAレベルの定量は、ABI Prism(商標)7600、7700、または7900配列検出システム(PE-アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州)を用いて、製造元の説明書に従ってリアルタイム定量的PCR分析によって行った。これは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物のリアルタイムでの高スループット定量を行うことができる閉鎖管のゲルを用いない蛍光検出系である。PCRの終了後に増幅産物を定量する標準的なPCRとは対照的に、リアルタイム定量的PCRの産物はそれが蓄積する際に定量される。これは、フォワードおよびリバースPCRプライマーのあいだで特異的にアニールして、蛍光色素2個を含むオリゴヌクレオチドプローブをPCR反応に含めることによって行われる。レポーター色素(例えば、PE-アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、オペロンテクノロジーズインク(Operon Technologies Inc.)、アラメダ、カリフォルニア州、またはインテグレーテッドDNAテクノロジーズインク(Integrated DNA Technologies Inc.)、コラルビル、アイオワ州のいずれかから得られるFAMまたはJOE)をプローブの5'末端に結合させて、消光色素(例えば、PE-アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、オペロンテクノロジーズインク、アラメダ、カリフォルニア州、またはインテグレーテッドDNAテクノロジーズインク、コラルビル、アイオワ州のいずれかから得られるTAMRA)をプローブの3'末端に結合させる。プローブと色素が無傷の場合、レポーター色素の放出は3'消光色素が近位に存在すると消光する。増幅の際に、プローブの標的配列へのアニーリングは、Taqポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性によって切断することができる基質を作製する。PCR増幅サイクルの伸長相において、Taqポリメラーゼによってプローブが切断されると、プローブの残りの部分(したがって、消光部分から)からレポーター色素が放出され、配列特異的蛍光シグナルが生成される。各サイクルにおいて、さらなるレポーター色素分子がそのそれぞれのプローブから切断され、蛍光強度を、ABI Prism(商標)配列検出系に組み込まれたレーザー光学によって定期的な間隔でモニターする。それぞれのアッセイにおいて、無処置対照試料からのmRNAの連続希釈を含む一連の平行な反応から標準曲線を作製し、これを用いて試験試料のアンチセンスオリゴヌクレオチド処置後の%阻害を定量する。
フォワードプライマー:
リバースプライマー:
および
FAMが蛍光色素であり、TAMRAが消光色素であり、PCRプローブは
であった。
ヒトGAPDHに関してPCRプライマーは以下の通りであった:
フォワードプライマー:
リバースプライマー:
およびJOEが蛍光色素であり、TAMRAが消光色素であり、PCRプローブは:
であった。
IGF-IR mRNAレベルのノザンブロット分析
アンチセンス処置の18時間後、細胞単層を冷PBSによって2回洗浄して、RNAZOL(商標)(テルテスト「B」インク(TEL-TEST"B" Inc.)、フレンズウッド、テキサス州)1 mlに溶解した。製造元の推奨するプロトコールに従って総RNAを調製した。総RNA 20μgを、MOPS緩衝液系(アムレスコインク(AMRESCO, Inc.)、ソロン、オハイオ州)を用いて、1.1%v/vホルムアルデヒドを含む1.2%w/vアガロースゲルを通しての電気泳動によって分画した。RNAを、ノーザン/サザン転写緩衝液システム(テルテスト「B」インク、フレンズウッド、テキサス州)を用いて一晩毛細管転写によって、ゲルからHYBOND(商標)-N+ナイロンメンブレン(アマシャムファルマシアバイオテック、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)に転写した。RNAの転写はUVの可視化によって確認した。STRATALINKER(商標)UVクロスリンカー2400(ストラタジーンインク(Stratagene, Inc.)、ラホヤ、カリフォルニア州)を用いてメンブレンをUVクロスリンク剤によって固定した後、ストリンジェントな条件に関して製造元の説明書を用いて、QUICKHYB(商標)ハイブリダイゼーション溶液(ストラタジーン、ラホヤ、カリフォルニア州)を用いてプロービングした。
およびヒトIGF-IRのリバースプライマー配列
を用いて、PCRによってIGF-IR特異的プローブを調製した。ローディングおよび転写効率の変動を標準化するために、メンブレンを剥がして、ヒトグリセルアルデヒド-3-燐酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)RNA(クロンテック(Clontech)、パロアルト、カリフォルニア州)に関してプローブした。
ヒトIGF-IR発現のアンチセンス阻害
本発明に従って、アクセッション番号NM000875(SEQ ID NO:76)およびM69229(SEQ ID NO:77)に記載される公表された配列を用いて、ヒトIGF-IR mRNAの異なる領域、または5'非翻訳領域を標的とする一連のアンチセンス化合物を設計した。化合物を表1に示す。「標的部位」は、それに対して化合物が結合する特定の標的配列上の第一(最も5'側の)のヌクレオチド番号を示す。表1における全ての化合物は、IGF-IRの5'非翻訳領域またはコード領域のいずれかのASOである。化合物を、本明細書における他の実施例に記述されるように(図3および表1を参照されたい)、定量的リアルタイムPCRによってヒトIGF-IR mRNAレベルに及ぼすその作用に関して分析した。データは実験3回からの平均値である。それぞれのデータポイントに関する陽性対照を表1において配列ID番号によって同定する。「N.D.」は、存在する場合、データなしを示す。
が含まれる。これらの好ましい配列が相補的である標的領域は、本明細書において「好ましい標的セグメント」と呼ばれ、したがって、本発明の化合物によるターゲティングにとって好ましい。SEQ ID NO:137〜171は、IGF-IRにおいて同定された好ましい標的セグメントを表す。表1における「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の最初の(最も5'側の)ヌクレオチド番号を示す。
C5-プロピンASOは、おそらく乾癬(正常な皮膚には蓄積しない)における角質層の障壁機能の障害により、局所適用後ヒト乾癬皮膚の基底ケラチノサイトに蓄積することが示されている(White et al.、2002、上記)。さらに、ホスホロチオエートASOは、クリームに調製すると正常なヒト皮膚の基底ケラチノサイトに蓄積することが示された(Mehta et al.、J. Invest. Dermatol. 115:805〜812、2000)。ホスホロチオエート-ホスホジエステルハイブリッドASOの蒸留水溶液は、角質層を通過して表皮上層のケラチノサイトの細胞質に蓄積するように思われたにもかかわらず、ヒト皮膚への局所適用後基底ケラチノサイトに蓄積しなかった(Wingens et al.、Lab. Invest. 79:1415〜1424、1999)。
用いたオリゴヌクレオチドを表4に記載する。
乾癬皮膚生検をボランティアから採取した。完全な厚みの8 mmまでの穿刺生検を、皮膚科医が各ボランティアから採取した。生検を採取した領域は、生検の採取前、清拭または消毒しなかった。生検は、ガーゼに直ちに載せて(PBSによって湿らせる)、使用するまで氷中で保存した(〜2時間)。
FITC-ASOの適用後24時間目に、生検を培養皿から除去してスライドガラスに角質層を下にして載せて、露出した真皮にPBS 1滴を載せて湿らせた。次に生存標本の共焦点顕微鏡を既に記述されたとおりに実施した(White et al.、J. Invest. Dermatol. 112:887〜892、1999;White et al.、2002、上記)。要約すると、FITC-ASOの局所適用を488nmでの励起(アルゴンイオンレーザー)および515nmでの検出によって評価した。用いた機器は、オプティスキャンf900e共焦点系(オプティスキャン(Optiscan Pty)、メルボルン、オーストラリア)に接続したIX70オリンパス倒立顕微鏡(オリンパスオーストラリア(Olympus Australia)、メルボルン、オーストラリア)であった。
・細胞の形態
・核の存在および大きさ:
角質細胞無核
顆粒層のケラチノサイトの核>15μm
基底ケラチノサイト<10μm
・細胞の深さ(表面より少なくとも50μm下の基底ケラチノサイト)
共焦点顕微鏡後、生検全体を4%パラホルムアルデヒド(4℃)において24時間固定した後、0.5M蔗糖(4℃)において48時間固定した。次に、生検を段階的なエタノール(70%、80%、90%、および2×100%、それぞれ90分)に沈めた後、組織プロセッサー(シャンドンシタデル1000、シャンドンインク(Shandon Inc.)、ピッツバーグ、アメリカ)を用いてリモネンにおいて2×90分およびパラフィンロウ(65℃)において2×90分沈めた。処理後、生検をパラフィン(シャンドンヒストセンター2、シャンドンインク)に抱埋して必要となるまで室温で保存した。
それぞれの乾癬皮膚生検からの各切片(5μm)をリモネンに沈めて2×5分間ロウを除去した後、段階的エタノール(100%、90%、80%、70%、および50%)において連続して5分間洗浄した後、水において5分間洗浄した。次に、切片をハリスのヘマトキシリン(細胞核を青色に染色)およびエオジン(細胞質および他の組織構造をピンクに染色)によって染色してからエタノール(2×15秒)およびリモネン(2×15秒)において洗浄した。次に、切片をDPX封入培地(BDHラボラトリーサプライズ(BDH Laboratory Supplies)、プール、イギリス)と共にカバーガラスで覆った。
切片のロウを除去して、上記のように洗浄してから2.5%DABCO抗退色剤(シグマ(Sigma)、セントルイス、アメリカ)を含むMOWIOL封入培地(バイオサイエンシズインク(Biosciences Inc.)、ラホヤ、アメリカ)と共にカバーガラスで覆った。自己蛍光を補正するように画像の明度を調節した。自己蛍光は、ビヒクル(5%w/vメチルセルロースまたはクリーム)処置試料から発生した蛍光であると定義した。
切片のロウを上記のように除去して、アイシスファーマシューティカルズ(Isis Pharmaceuticals)によって本発明者らに提供されたアフィニティ精製2E1-B5抗体(バークレーアンチボディカンパニー(Berkeley Antibody Company)、バークレー、アメリカ)を用いてASOを検出した。2E1-B5抗体は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにおけるTGCおよびGCモチーフを認識するマウスIgG1である(Mehta et al.、2000、上記)。
共焦点画像を例外として(この章において「生存標本の共焦点顕微鏡」を参照されたい)、画像は全て、ニコンE600顕微鏡(ニコンコーポレーション、東京、日本)に接続して、MCID M4撮像システム(イメージングリサーチインク(Imaging Research Inc.)、セントキャサリンズ、カナダ)によって制御するソニーDXC-950Pカラーデジタルカメラ(ソニー、東京、日本)を用いて獲得した。蛍光の励起は、ニコンHB-10103AF高圧水銀灯パワーサプライ(ニコンコーポレーション)によって提供して、適当な濾過フィルターを通して見た。
乾癬皮膚を、ボランティアの腹部、太腿、背部、臀部、脛、肘、または股関節から採取した。各人から生検3個までを採取して、各人からの生検を異なる実験群に割付した。
ASOの局所適用
乾癬皮膚生検の基底ケラチノサイトにC5-プロピンASOが局在することを証明したWhite et al.(2002、上記)の結果を確認するため、および5%w/vメチルセルロースまたはクリームでの局所適用後の2' MOE ASOの分布を調べるために、以下のFITC結合ASOを適用して乾癬皮膚生検を分離した:
・0.1%w/w R451(C5-プロピン)の5%w/vメチルセルロース製剤;
・0.1%w/w ISIS 251741(2' MOE)の5%w/vメチルセルロース製剤;
・0.1%w/w ISIS 251741(2' MOE)のクリーム製剤。
クリームに調製した0.1%FITC-ASOスパイクを含む5%ASOの検出
より高いASO濃度を用いてもよい。したがって、全体で5%ASO製剤において0.1%スパイクとして含まれるFITC-ASOを、直接蛍光顕微鏡および/または共焦点顕微鏡によって検出できるか否かを決定することは有用である。非FITC 2' MOE ISIS13920(4.9%w/w)クリーム製剤と混合した2' MOE FITC-ASO ISIS 251741(0.1%w/w)を、この目的のために乾癬皮膚生検に適用した。
アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)の基準値測定
IGF-IR mRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)は、炎症および/または増殖障害を減少させるための有効な新規治療物質であると提唱されている。本実施例の目的は、15merC5-プロピニル-dU,dC-ホスホロチオエートASOであるDT1064(SEQ ID NO:78)に対する完全なホスホロチオエート「5-10-5」2' MOEギャップマー化学を有する好ましい三つのIGF-IR ASOの基準値を測定することである。DT1064における全てのCおよびUはC5プロピニル化を受ける。試験はヒトケラチノサイトトランスフェクション系において行い、IGF-IR mRNAおよびタンパク質レベル、ならびに細胞増殖をエンドポイントとした。これまでの研究において、DT1064は、この系において首尾よくIGF-IR発現を阻害した(Wraight et al.、2000、上記;Fogarty et al.、Antisense Nucleic Acid Drug Development 12:369〜377、2002)。
三つの「5-10-5」、2' MOEギャップマー、ホスホロチオエートリードは、リアルタイムPCRによって評価したところ、A549細胞(ヒト肺上皮細胞)においてIGF-IR mRNAの濃度依存的な阻害を示した(図3)。三つのリードを、ヒトケラチノサイト皮膚細胞トランスフェクション系における活性に関して評価した。
三つのリードASOを以下のエンドポイントによってDT1064に対してインビトロで「基準値測定」を行った:
1.リアルタイムPCRによって評価した総IGF-IR mRNA;
2.イムノブロットによって決定した総細胞IGF-IRタンパク質;
3.アミドブラック色素結合によってアッセイしたHaCaTケラチノサイト細胞増殖速度。
本試験において用いたオリゴヌクレオチドを表2に示す。
自発的に不死化したヒトケラチノサイト細胞株であるHaCaT(Boukamp et al.、1988、上記)を本試験に用いた。細胞を、10%w/v仔ウシ胎児血清(FCS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)において37℃で5%v/v CO2の大気中で単層培養として維持した。
HaCaTケラチノサイト(継代回数44〜47回)を96ウェル(リアルタイムPCR)、24ウェル(細胞増殖)、または12ウェル(イムノブロットまたはアポトーシス)プレートのウェルに播種した。85〜95%コンフルエント細胞をリポソーム調製物、サイトフェクチンGSV(GSV;グレンリサーチ(Glen Research)、スターリング、バージニア州、アメリカ)単独によって、またはアンチセンスもしくは対照オリゴヌクレオチドと複合体を形成して処置した。無処置細胞も同様に試験した(無処置対照)。アンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチドはそれぞれ、無血清DMEMにおいて20倍に希釈して望ましい最終濃度を得て、GSV(40μg/ml)の等量と混合した。脂質/オリゴヌクレオチド混合物を室温で10分間複合体を形成させた後、10%w/v FCSを含むDMEMによって10倍希釈した。細胞に、最終濃度6.25、25、100、または400nMオリゴヌクレオチドおよび2μg/ml GSVをトランスフェクトさせた。トランスフェクションは1試料あたりウェル2個ずつ行い、無処置およびGSV処置細胞はウェル4個ずつ行った。
総RNAをRNEASY(登録商標)ミニキット(キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州)を用いて抽出し、0.5〜1μgをGeneAmp(登録商標)RNA PCRキット(アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、アメリカ)を用いて、製造元の説明書に従って逆転写した。半定量的リアルタイムPCRを用いて、GSV単独によって処置した細胞と比較して試料中のIGF-I受容体mRNAの量を決定した。プライマーおよびTaqMan(登録商標)蛍光プローブを含む、ヒトIGF-I受容体(アプライドバイオシステムズ、製品番号4319442F)および18S(製品番号4319413E)に関する予め展開させた試薬を複合PCR反応において用いて、各試料における双方の産物を同時に増幅した。ABI Prism(商標)7700配列検出器(アプライドバイオシステムズ)を分析に用いた。次に、IGF-IR mRNAレベルを18Sに対して標準化した。二つのトランスフェクションプロトコールを用いた、すなわち細胞を、(1)RNA抽出の18時間前に1回トランスフェクトした、または(2)RNA抽出の24時間および48時間前に計2回トランスフェクトした。
24時間毎に3日間オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした後、細胞単層をPBSによって洗浄し、50 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl、1.5 mM MgCl2、10%v/vグリセロール、1%v/vトリトンX-100、100ug/mlアプロチニンを含む緩衝液において溶解した。溶解物の総蛋白質濃度を、タンパク質標準物質としてBSAを用いるBCAタンパク質アッセイキット(ピアス(Pierce);ロックフォード、イリノイ州、アメリカ)によってアッセイした。各溶解物25または30 μgをSDS-PAGE(7%w/vアクリルアミド)によって分離した後、イモビロン-Pメンブレン(ミリポア(Millipore)、ベッドフォード、マサチューセッツ州)にブロッティングした。非特異的結合部位を5%w/vスキムミルク粉末によってブロックした後、フィルターをIGF-IRタンパク質のβ-サブユニットを認識するウサギポリクローナルIgG(C-20;サンタクルズバイオテクノロジーインク(Santa Cruz Biotechnology Inc.)、サンタクルズ、カリフォルニア州、アメリカ)によってプロービングした。IGF-IR特異的シグナルをECFウェスタンブロッティングキット(アマシャム、バッキンガムシャー、イングランド、イギリス)を用いて展開し、化学蛍光および燐画像走査による検出の後にImageQuantソフトウェア(モレキュラーダイナミクス、サニーベール、カリフォルニア州、アメリカ)による定量を行った。フィルター間変動は、GSV単独で処置した細胞の平均シグナルに対してシグナル強度を標準化することによって制御した。
細胞を、24ウェルプレートにおいて40%コンフルエンスまで増殖させて、24時間毎に3日間トランスフェクトした。アミドブラックの細胞タンパク質(分光光度法によって定量する)に対する結合が細胞数に相関する、アミドブラック結合プロトコール(Schultz et al.、J. Immunol. Methods 167:1〜13、1994)を用いて、細胞数を0、24、48、および72時間目に決定した。簡単に説明すると、細胞単層を1%v/vグルタルアルデヒドのPBS溶液によって固定した後、0.1%w/vアミドブラックの酢酸ナトリウム溶液pH 3.5によって30分間染色した。酸性のH2Oにおいて1回洗浄後、タンパク質結合色素をNaOH(50 mM)によって溶出して、溶出液の吸光度を620 nmでモニターした。データは0時間でのGSV-処置細胞に関して決定したシグナルに対して表記する。
図4は、C5-プロピンまたは2' MOEギャップマーによって処置したHaCaTケラチノサイトに関するIGF-IRリアルタイムPCRデータを示す。結果は、細胞を1回(図4A)または2回(図4B)トランスフェクトしたか否かによらず、類似であった。IGF-IR mRNAレベルはDT1064をトランスフェクトした細胞ではより低く、RNアーゼ保護アッセイを用いて先に報告されたレベルと一致した[Fogarty et al.、2002、上記]。三つのリードASOはまた全て、IGF-IR mRNAのノックダウンを引き起こした。さらに、IGF-IR mRNAのノックダウンは、三つのASOリードおよびDT1064に関して類似であった。例えば、図4Aにおいて、100nM ASOでは、mRNAの減少の平均値は、ASO 175314、ASO 175317、ASO 175323、およびDT1064に関してそれぞれ68%、77%、75%、および78%であった。
図5Aは、C5プロピンまたは2' MOEギャップマーをトランスフェクトしたHaCaT細胞の代表的なIGF-I受容体ウェスタンイムノブロットを示す。IGF-IRタンパク質(β鎖)は、分子量110kDの単一のバンドとして現れる。
*P<0.5、**P<0.01、***P<0.001、同じ化学および用量のオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたHaCaT細胞におけるIGF-IRタンパク質に対して;テュキー検定。
IGF-IR特異的ASOおよび対照オリゴヌクレオチドのHaCaT増殖に及ぼす効果を図6に示す。無処置細胞の場合、ケラチノサイト細胞数は、3日間のあいだに4倍より多く増加した。GSV-処置細胞も同様に数が増加したが、無処置細胞と同程度ではなく(72時間で無処置細胞の64%)、増殖速度に対して脂質が何らかの作用を有することを示唆した。無処置およびGSV処置細胞と比較して、オリゴヌクレオチドを処置した細胞は全て3日間にわたってより低い細胞増殖速度を示し、DT1064処置細胞では、全ての時点およびオリゴヌクレオチドの全ての濃度で細胞増殖速度が最も低かった。調べたASOの中で、ISIS 175317に関して最低の細胞増殖速度に関連した傾向を認め、これは濃度400 nMでは最も顕著であった。
・ 三つのASOリードは全て、GSV対照および2' MOEギャップマーランダムオリゴヌクレオチドと比較してIGF-IR mRNAレベルを減少させた。DT1064と比較して、ASOリードは、IGF-IR mRNAに類似の減少を示した。
・ 三つのASOリードは全て、GSV対照および2' MOEランダムオリゴヌクレオチドと比較してIGF-IRタンパク質を有意に減少させた。ASOリードはIGF-IRタンパク質レベルを減少させた。しかし、対照オリゴヌクレオチドと比較したノックダウンの百分率として表記した場合、ASOリードの作用はDT1064の作用と類似であった。
・ 三つのASOリードは全て、GSV対照と比較して細胞増殖速度を減少させた。
生検はこれまでに記述されているように(Russo et al.、Endocrinology 135:1437〜1446、1994;White et al.、2002、上記)24時間維持した。簡単に説明すると、皮下脂肪を生検から切除して、それらを三角形のステンレススチールメッシュの中央に形成されたBACTO(商標)アガープラグ(ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson)、フランクリンレークス、アメリカ)の上に真皮を下にして置いた。スチールメッシュは、アガープラグが中心ウェル上に懸垂するように60 mm FALCON(登録商標)中心ウェル組織培養皿(ベクトン・ディッキンソン)の中心ウェルに適合するように設計された。中心ウェルに、アガープラグのレベルまでダルベッコ改変イーグル培地(10%w/v仔ウシ胎児血清、50IU/mlペニシリン、50ug/mlストレプトマイシンを含む)を満たして、湿度を維持するために外側のウェルにPBSを満たした。生検を5%v/v CO2大気中で37℃でインキュベートした。図1は、組織装置の配置を示す。
ASOを検出するための直接蛍光顕微鏡および免疫組織化学の比較
2' MOE FITC-ASO ISIS 251741を、5%w/vメチルセルロースにおいて0.1%w/wで調製して、乾癬皮膚生検に局所適用した。直接蛍光および2E1抗体による免疫組織化学はいずれもISIS 251741を検出することができる。この特徴によって、二つの検出技術によって決定した場合、隣接する切片を用いてASOの局在を直接比較することが可能であった。
局所適用後のASOの表皮局在に及ぼすFITC結合の影響
ASOに結合させたFITCタグが局所適用後のASOの表皮局在を変化させるか否かを調べるために、非FITC-ASO 13920(免疫組織化学では検出できるが直接蛍光では検出できない)およびFITC-ASO ISIS 147979(直接蛍光によって検出できるが、免疫組織化学では検出できない)を含むASO混合物によって処置した。この混合物を処置した組織からの連続切片を比較すると、二つのASOの局在に明らかな差を示さなかった。このデータは、乾癬皮膚生検において、ASO上のFITCタグが表皮の局在を変化させないことを示している。
・ 5%w/vメチルセルロースまたはクリーム製剤として局所適用した2' MOEギャップマーASOは、乾癬皮膚病変の角質層を通過することができた。ASOは表皮における基底ケラチノサイト、および真皮の浸潤白血球の核に存在した。
・ 局所適用後の表皮局在は、2' MOEギャップマーとC5-プロピンASOとのあいだで差がないように思われる。
・ 局所適用後、2' MOEギャップマーASOは、直接蛍光顕微鏡(FITC結合ASOのみ)と2E1 Abによる免疫組織化学の双方によって基底ケラチノサイトの核において検出することができる。
・ ASOにFITCを結合させても、局所適用後の基底ケラチノサイトにASOが達する能力またはその表皮局在は変化しないように思われる。
医薬品製剤
凍結乾燥ASOを滅菌蒸留水に再懸濁して、ASOの濃度を260nmでのその吸光度によって決定した後、5%w/vメチルセルロースゲルまたはクリーム(アイシスファーマシューティカルズ(Isis Pharmaceuticals))のいずれかにおいて調製した。クリームは以下を含んだ:
・ ミリスチン酸イソプロピル(10%w/w)
・ モノステアリン酸グリセリル(10%w/w)
・ ステアリン酸ポリオキシル40(15%w/w)
・ ヒドロキシプロピルメチルセルロース(0.5%w/w)
・ 燐酸二水素ナトリウム一水化物(0.3%w/w)
・ 燐酸水素ナトリウム七水化物(0.9%w/w)
・ フェノキシエタノール(2.5%w/w)
・ メチルパラベン(0.5%w/w)
・ プロピルパラベン(0.5%w/w)
・ 精製水(59.8%w/w)
薬剤の適用
生検を37℃に移した30分後、ASOまたはビヒクル(30 mg)を計り取って、小さいスパテラでこれを生検の直径約4 mmの中心領域に直接適用した。生検の辺縁部周辺の薄いリングは、試料の露出した辺縁部にASOを適用しないように、ASOまたはビヒクルに接触しないように維持した。このように注意したにもかかわらず、直接蛍光顕微鏡によって評価したところ、生検の約20%において、ASOは生検の辺縁に接触しているように思われた。
実験群
本実施例の目的に従って、ASO製剤を、異なる人からの少なくとも四つの生検に適用した。用いたASO製剤および対照は以下の通りであった:
・0.1%w/w R451の5%メチルセルロース製剤
・0.1%w/w ISIS 251741の5%w/vメチルセルロース製剤
・0.1%w/w ISIS 251741のクリーム製剤
・4.9%w/w ASO 13920と混合した0.1%w/w ISIS 251741のクリーム製剤
・0.1%w/w ISIS 13920の5%w/vメチルセルロース製剤
・0.1%w/w ASO 13920と混合した0.1%w/w ISIS 147979の5%v/vメチルセルロース製剤
・0.1%w/w ISIS 147979の5%w/vメチルセルロース製剤
・5%w/vメチルセルロース単独
・クリーム単独
ISIS 175317およびDT1064の基準値測定
本実施例は、HaCaTケラチノサイトにおけるIGF-IR ASO(ISIS 175317)およびDT1064に対する一次スクリーニングにおいて同定されたヒトIGF-IRの基準値測定を示す。
HaCaTケラチノサイトを、10%v/v仔ウシ胎児血清(FCS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)において5%v/v CO2/95%v/v O2の大気中で単層培養として維持した。
RNeasy(登録商標)ミニキット(キアゲンインク(Qiagen Inc.)、バレンシア、カリフォルニア州、アメリカ)を用いて総RNAを抽出し、約0.1〜0.2 μgをGeneAmp(登録商標)RNA PCRキット(アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、アメリカ)を用いて製造元の説明書に従って逆転写した。半定量的リアルタイムPCRを用いて、サイトフェクチンGSV単独を処置した細胞と比較して試料中のIGF-I受容体mRNAの量を決定した。プライマーおよびTaqMan(登録商標)蛍光プローブを含む、ヒトIGF-I受容体(アプライドバイオシステムズ製品番号4319442F)および18SリボソームRNA(製品番号4319413E)に関する予め展開した試薬を、多重PCR反応において用いて、それぞれの試料における双方の産物を同時に増幅した。ABI Prism(商標)7700配列検出器(アプライドバイオシステムズ)を分析のために用いた。次に、IGF-I受容体mRNAレベルを、18SリボソームRNAに対して標準化した。
IGF-IR mRNAレベルに及ぼすアンチセンスおよび対照オリゴヌクレオチドの効果を最初に、6、13、25、50、100、および200 nMの濃度で調べた。これらの濃度は、HaCaTケラチノサイトにおいて2' MOEギャップマーを用いたこれまでのインビトロ基準値測定実験とのデータの比較が可能となる範囲を含むことから選択した。
またはC5-プロピンオリゴヌクレオチド(DT1064または6416)をトランスフェクトした二つの実験のIGF-I受容体mRNAレベルを示す。GSV処置細胞と比較して、2' MOEギャップマーASOは5個全てがIGF-IR mRNAレベルを抑制した(図9)。最大の標的ノックダウンは、それぞれの2' MOE ASOに関して類似であった(範囲71〜77%)。表6は、IGF-IR ASOリードの最大の有効性を示す。
本実施例において用いたIGF-IR ASOの詳細を表5に提供する。下線で示したヌクレオチドは2' MOE改変である。シトシン塩基は全てメチル化されている。
乾癬皮膚生検を倫理的な条件(王立こども病院ヒト研究倫理委員会のプロトコール22023A、メルボルン、オーストラリア)でボランティア11人から採取した。完全な厚みの8 mm穿孔生検3個を各被験者の同じ病変から皮膚科医が採取した。生検を採取した領域は、生検採取の前に清拭または消毒しなかった。生検は直ちにガーゼ(PBSによって湿らせた)に載せて、使用するまで氷中で保存した(2時間まで)。採取時、生検における乾癬の重症度を、PASI(乾癬領域重症度指数)スコア(Fredriksson et al.、1978、上記)のPRS(パラメータ採点尺度)成分を用いて採点した。簡単に説明すると、紅斑(発咳)、硬化(腫脹)、および落屑(剥落)をそれぞれ、0(なし)から4(重度)まで採点して0〜12のPRSスコアを得た。
生検は既に記述されているように24時間維持した(Russo et al.、1994、上記;White et al.、2002、上記)。簡単に説明すると、皮下脂肪を生検から切除して、それらを三角形のステンレススチールメッシュの中央に形成されたBACTO(商標)アガープラグ(ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson)、フランクリンレークス、アメリカ)の上に真皮を下にして置いた。スチールメッシュは、アガープラグが中心ウェル上に懸垂するように60mm FALCON(登録商標)中心ウェル組織培養皿(ベクトン・ディッキンソン)の中心ウェルに適合するように設計された。中心ウェルに、アガープラグのレベルまでダルベッコ改変イーグル培地(10%v/v仔ウシ胎児血清、50IU/mlペニシリン、50ug/mlストレプトマイシンを含む)を満たして、湿度を維持するために外側のウェルにPBSを満たした。生検を5%v/v CO2大気中で37℃でインキュベートした。組織装置の配置を図1に示す。
凍結乾燥ISIS 175317(SEQ ID NO:125)を滅菌蒸留水に再浮遊させて溶液の濃度を260 nmでの吸光度によって決定した。クリーム製剤の場合、ASOを乾燥させた後(DNAミニ真空乾燥器、メドスカンパニー、メルボルン、オーストラリア)、適当量のクリーム(アイシス・ファーマシューティカルズ、アメリカ)に溶解して最終濃度10%w/wを得た。クリームは以下を含んだ:
・ ミリスチン酸イソプロピル(10%w/w)
・ フェノキシエタノール(2.5%w/w)
・ モノステアリン酸グリセリル(10%w/w)
・ メチルパラベン(0.5%w/w)
・ ステアリン酸ポリオキシル40(15%w/w)
・ プロピルパラベン(0.5%w/w)
・ ヒドロキシプロピルメチルセルロース(0.5%w/w)
・ 精製水(59.8%w/w)
・ 燐酸二水素ナトリウム一水化物(0.3%w/w)
・ 燐酸水素ナトリウム七水化物(0.9%w/w)
生検を37℃に移した30分後、予め重量を測定した薬物またはビヒクル30mgを、小さいスパテラで各生検の直径約4mmの中心領域に直接適用した。試料の露出した辺縁部にクリームが触れないように、生検の辺縁部周辺の薄いリングをISIS 175317(SEQ ID NO:125)またはビヒクルに接触しないように維持した。このようにして適用したFITC ASOを用いた本研究所での先の実験では、生検の約20%において、ASOが生検の辺縁に接触していることが示された。
各ボランティアから生検3個を採取した。生検の一つをビヒクル(アイシスクリーム)によって処置し、他の二つを10%ISIS 175317(SEQ ID NO:125)のクリーム製剤によって処置した。この処置療法によって、データの対応のある比較(二つのISIS 175317(SEQ ID NO:125)処置生検に対応させたビヒクル処置生検)が可能となり、IGF-IR mRNAレベルにおける被験者間の変動によって引き起こされる可能性がある交絡効果を制御することが可能となる。各患者から二つの生検をISIS 175317(SEQ ID NO:125)によって処置すると、如何なる薬物効果も検出される可能性が増加した。
治療期間終了時(24時間)、組織試料を0.5 M EDTA(pH 7.4)において60℃で90秒間インキュベートして、表皮-真皮接合部を破壊して、鈍器による解剖により表皮と真皮とを分離した(Dusserre et al.、1992、上記)。分離した表皮と真皮を液体窒素において瞬間凍結して、RNAを抽出するまで-70℃で保存した。
組織を、液体窒素において冷却しておいたステンレススチール製の乳鉢と乳棒において機械的に粉砕した。総RNAをRNeasy(登録商標)ミニキット(キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州、アメリカ)を用いて抽出した。総RNA(100〜700 ng)をGeneAmp RNA PCRキット(アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、アメリカ)を用いて、製造元の説明書に従って逆転写した。開始RNAの量を、各組の生検に関して可能な限り厳密にマッチさせて、試料は全て同じ反応において逆転写した。半定量的リアルタイムPCRを用いて、18S RNAに対する生検中のIGF-IR mRNA量を決定した。プライマーおよびTaqMan(登録商標)蛍光プローブを含む、ヒトIGF-IR(アプライドバイオシステムズ、製品番号4319442F)および18S(製品番号4319413E)に関する予め展開させた試薬を複合PCR反応において用いて、各試料における双方の産物を同時に増幅した。各試料を2個ずつアッセイした。ABI Prism 7700配列検出器(アプライドバイオシステムズ)を分析に用いた。IGF-IR mRNAレベルを18Sに対して標準化した。
統計分析に関して、各個体からの生検を組にした。各ビヒクル処置生検を、二つのISIS 175317(SEQ ID NO:125)処置生検の平均値に対して対応させた。ISIS 175317(SEQ ID NO:125)処置およびビヒクル処置生検におけるIGF-IR mRNAレベルを比較するために、パラメトリック対応t-検定を用いた。この試験は、基礎集団がガウス分布を有することを仮定する。これらのデータは、改変コルモゴロフ-スミルノフ試験(Dallal et al.、1986、上記)によって評価した場合に、サンプリングがガウス分布を有する集団からのものである場合、その期待値と有意差を示さなかった(P>0.1)。さらに、ビヒクルとISIS 175317(SEQ ID NO:125)処置生検のあいだのIGF-IR mRNAレベルの差のドットプロットは、ガウス分布集団からのものであるように思われた。他の全ての比較に関して、ノンパラメトリックウィルコクソンのマッチさせた対応のある検定を用いた。この試験は、基礎となる集団分布に関して仮定を行わない。統計分析は、ウィンドウズ用グラフパッドプリズムバージョン3.00(グラフパッドソフトウェア(GraphPad Software)、サンジエゴ、カリフォルニア州、アメリカ)を用いて行った。データは全て平均値±1標準偏差として表記する。
組織を、液体窒素において冷却しておいたステンレススチール製の乳鉢と乳棒において機械的に粉砕した。総RNAをRNeasy(登録商標)ミニキット(キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州、アメリカ)を用いて抽出した。総RNA(100〜700 ng)をGeneAmp(登録商標) RNA PCRキット(アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、アメリカ)を用いて、製造元の説明書に従って逆転写した。開始RNAの量を、各組の生検に関して可能な限り厳密にマッチさせて、試料は全て同じ反応において逆転写した。半定量的リアルタイムPCRを用いて、生検におけるIGF-IR、GAPDH、HPRT、インスリン受容体(IR)、カスパーゼ3&Bax mRNAの量を18S RNAと比較して決定した。上記の遺伝子に対する予め展開させた試薬(アプライドバイオシステムズ、製品番号#4319442F(IGF-IR)、#433764F(GAPDH)、#4333768F(HPRT)、#4318283F(Bax)およびアプライドバイオシステムズ「アッセイオンデマンド」アッセイID # Hs00263337_ml(カスパーゼ3)および# Hs00169631_ml(インスリン受容体))をそれぞれ多重PCR反応において、18Sに関する予め展開させた試薬(アプライドバイオシステムズ、製品番号4319413E)と共に個々に用いた。これらの予め展開させた試薬はプライマーおよびTaqMan(登録商標)、蛍光プローブを含み、多重PCR反応において用いる場合、各試料における標的遺伝子(IGF-IR、GAPDH、HPRT、インスリン受容体(IR)、カスパーゼ3、またはBax)および18Sを同時に増幅した。各試料を1試料あたり2個ずつアッセイした。ABI Prism(商標)7700配列検出器(アプライドバイオシステムズ)を分析に用いた。IGF-IR、GAPDH、HPRT、インスリン受容体(IR)、カスパーゼ3、およびBax mRNAレベルを18Sに対して標準化した。
統計分析に関して、各個体からの生検を組にした。各ビヒクル処置生検を、二つのISIS 175317(SEQ ID NO:125)処置生検の平均値に対して対応させた。
(図2)(A)IGF-IR遺伝子の領域のヌクレオチド配列(X04434およびM69229の組み合わせであるNM000875;SEQ ID NO:76)、
(B)IGF-IRのヌクレオチド配列ならびに3'および5'非翻訳領域を含む対応するアミノ酸配列(NM000)を示す。
(図3)(A)陰性対照ISIS 13650、ISIS 18078、およびISIS 29848と比較してA549細胞におけるIGF-IR mRNAに及ぼすリードIGF-IR ASO ISIS 175292〜175328の効果を示すグラフである。(B)A459細胞のIGF-IR mRNAに及ぼすリードIGF-IR ASO ISIS 175314、ISIS 175317、およびISIS 175323の効果。(A)および(B)に関して、A459細胞を、アンチセンスおよび対照オリゴヌクレオチドと複合体を形成したリポフェクチンに脂質:オリゴヌクレオチド2:1の比でトランスフェクトさせた。自動プロセス(例えば、キアゲンインク(Qiagen Inc.)、バレンシア、カリフォルニア州)で総細胞RNAを16〜20時間後に単離した。ヒストグラムは、1回の実験からの1試料あたり3個ずつの測定を表し、IGF-IR mRNAレベルの平均値を無処置対照±SDにおけるレベルの%として示す。(C)ASO化合物のヌクレオチド配列、対照オリゴヌクレオチド、およびプライマー/プローブオリゴヌクレオチド。
(図4)HaCaTケラチノサイトにおけるIGF-IR mRNAレベルに及ぼすDT1064(SEQ ID NO:43)およびリードIGF-IR ASO(ISIS 175314(SEQ ID NO:27)、ISIS 175317(SEQ ID NO:30)、およびISIS 175323(SEQ ID NO:36))の効果を示すグラフである。85〜90%コンフルエントHaCaT細胞を、アンチセンスおよび対照オリゴヌクレオチド(6.25、25、100、または400nM)の存在下または非存在下でGSV(2μg/ml)によって処置した。細胞を1回(回収前18時間;A)または2回(回収前24および48時間;B)トランスフェクトした。総RNAを回収して逆転写してから、リアルタイムPCRによって1試料あたり2個ずつアッセイした。IGF-IR mRNAを18Sに対して標準化してGSV-処置対照細胞におけるレベルの%として表記した。結果は、異なる2回の実験の1試料あたり2個ずつのウェルからの平均値±SEMを表す。UT=無処置細胞、GSV=GSVのみを処置した細胞。
(図5)HaCaTケラチノサイトにおけるIGF-IRタンパク質に及ぼすDT1064(SEQ ID NO:43)およびリードIGF-IR ASO(ISIS 175314(SEQ ID NO:27))、ISIS 175317(SEQ ID NO:30)、およびISIS 175323(SEQ ID NO:36))の効果を示す写真およびグラフである。85〜90%コンフルエントHaCaT細胞を24時間毎に3日間トランスフェクトした。細胞溶解物を回収して、各試料から等量のタンパク質(25または30μg)を7%w/v SDS-PAGEによって分離した。タンパク質をPVDFメンブレンにブロッティングして、IGF-IRβサブユニットを認識する抗ウサギIgGによってプロービングした。(A)IGF-IRシグナルの強度を示す代表的なイムノブロット(ウェスタン3)。試料をゲル4個において泳動した;各ゲルからのGSV処置および無処置を同じゲルにおいて泳動した試料と共に示す。(B)GSV-処置対照におけるレベルの%として表記したIGF-IRタンパク質バンド強度の定量。ヒストグラムは、処置を1試料あたり2個ずつ評価した異なる3回の実験からのデータの平均値±SEMを示す。一元配置ANOVAを行った後、ダネット検定による対応のある比較を行った:GSV処置細胞に対して*P<0.05、△P<0.001。UT=無処置細胞、GSV=GSVのみを処置した細胞。
(図6)HaCaTケラチノサイトにおける細胞増殖速度に及ぼすDT1064およびリードIGF-IR ASOの効果を示すグラフである。サブコンフルエントHaCaT細胞に、GSV単独(2μg/ml)、またはアンチセンスもしくは対照オリゴヌクレオチド(6.25、25、100、または400nM)と複合体を形成したGSV(2μg/ml)を24時間毎に3日間トランスフェクトした。第一のトランスフェクション時、およびその後24時間間隔で、アミドブラックアッセイを用いて細胞数を推定した。データを、細胞数を1試料あたり2個ずつ測定した異なる二つの実験の平均値±SEMとして表記する。UT=無処置細胞、GSV=GSVのみを処置した細胞。
(図7)ISIS 175314、ISIS 175317、およびISIS 175323の標的の局在を示すIGF-IR遺伝子(M69229;SEQ ID NO:77)の領域のデオキシリボヌクレオチド配列を表す。
(図8)HaCaTケラチノサイトにおけるIGF-I受容体mRNAレベルに及ぼすISIS 175317、IGF-IRリードASO、およびDT1064の効果を示すグラフである。85%コンフルエントHaCaT細胞(継代62〜63回)を、アンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチド(6、13、25、50、100、または200nM)の存在下または非存在下でGSV(2μg/ml)によって20時間処置した。総RNAを抽出して逆転写した後、リアルタイムPCRによって1試料あたり2個ずつアッセイした。IGF-I受容体mRNAを18Sに対して標準化して、GSV-処置細胞におけるIGF-IR mRNAレベルの百分率として表記した。結果は、異なる二つの実験の1試料あたり2個ずつのウェルからの平均値±SD(n=4)を表す。UT=無処置細胞、GSV=GSVのみによって処置した細胞。
(図9)HaCaTケラチノサイトにおけるIGF-I受容体mRNAレベルに及ぼすISIS 175317、他のIGF-IRリードASO、およびDT1064の効果を示すグラフである。85%コンフルエントHaCaT細胞(継代62〜63回)を、アンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチド(6、13、25、50、100、または200nM)の存在下または非存在下でGSV(2μg/ml)によって20時間処置した。総RNAを抽出して逆転写した後、リアルタイムPCRによって1試料あたり2個ずつアッセイした。IGF-I受容体mRNAを18Sに対して標準化して、GSV-処置細胞におけるIGF-IR mRNAレベルの百分率として表記した。結果は、異なる二つの実験の1試料あたり2個ずつのウェルからの平均値±SD(n=4)を表す。UT=無処置細胞、GSV=GSVのみによって処置した細胞。この実験において、リードIGF-IR ASOはISIS 175317、リードIGF-IR ASOはISIS 323737、ISIS 323744、ISIS 323762、ISIS 323767であった。
(図10)HaCaTケラチノサイトにおけるIGF-I受容体mRNAレベルに及ぼすISIS 175317、最近同定された四つのIGF-IRリードASO、およびDT1064の効果を示すグラフである。85%コンフルエントHaCaT細胞(継代45回)を、アンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチド(0.3、1.6、3、6、25、または100nM)の存在下または非存在下でGSV(2μg/ml)によって20時間処置した。総RNAを抽出して逆転写した後、リアルタイムPCRによって1試料あたり2個ずつアッセイした。IGF-I受容体mRNAを18Sに対して標準化して、GSV-処置細胞におけるIGF-IR mRNAレベルの百分率として表記した。結果は、1回の実験の1試料あたり2個ずつのウェルからの平均値±SD(n=2)を表す。UT=無処置細胞、GSV=GSVのみによって処置した細胞。この実験において、リードIGF-IR ASOはISIS 175317であった。リードIGF-IR ASOはISIS 323737、ISIS 323744、ISIS 323762、ISIS 323767であった。対照2' MOEギャップマーはISIS 129691(ランダム)、ISIS 306064(ミスマッチ8個)であった。C-5プロピンIGF-IR ASOはDT1064であった。対照C-5プロピンは6416(ミスマッチ15個)であった。
(図11)HaCaTケラチノサイトにおける相対的IGF-IR mRNAレベルに及ぼす最近同定された四つのASOおよびISIS 175317の効果に関する濃度-反応曲線を示すグラフである。85%コンフルエントHaCaT細胞(継代45回)を、アンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチド(0.4、1.6、3、6、25、または100nM)の存在下または非存在下でGSV(2μg/ml)によって20時間処置した。総RNAを抽出して逆転写した後、リアルタイムPCRによって1試料あたり2個ずつアッセイした。IGF-I受容体mRNAを18Sに対して標準化して、GSV-処置細胞の百分率として表記した。結果は、1回の実験の1試料あたり2個ずつのウェルからの平均値±SD(n=2)を表す。UT=無処置細胞、GSV=GSVのみによって処置した細胞。この実験において、リードIGF-IR ASOはISIS 175317であった。リードIGF-IR ASOはISIS 323737、ISIS 323744、ISIS 323762、ISIS 323767であった。
(図12)ISIS 175317(SEQ ID NO:125)の局所適用後の乾癬皮膚生検におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値を示すグラフである。バーは、ビヒクル処置およびISIS 175317(SEQ ID NO:125)処置生検の表皮および真皮におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値を表す。データは、ビヒクル処置試料の表皮におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値と比較して表記し、エラーバーは1標準偏差である。局所適用したISIS 175317(SEQ ID NO:125)(10%ISISクリーム製剤)は、外植体に局所適用後24時間で表皮および真皮におけるIGF-IR mRNAレベルを有意に減少させた。全ての場合においてn=11であった。(*=p<0.05、***=p<0.001)。
(図13)ISIS 175317(SEQ ID NO:125)の局所適用後の乾癬皮膚生検におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値を示すグラフである。バーは、ビヒクル処置およびISIS 175317(SEQ ID NO:125)処置生検の乾癬表皮および正常表皮におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値を表す。データは、ビヒクル処置試料の表皮におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値と比較して表記し、エラーバーは1標準偏差である。局所適用したISIS 175317(SEQ ID NO:125)(10%ISISクリーム製剤)は、外植体に局所適用後24時間で表皮および真皮におけるIGF-IR mRNAレベルを有意に減少させた。全ての場合においてn=11。(*=p<0.05、***=p<0.001)。
(図14)表皮組織にISIS 175317を局所適用後の乾癬皮膚生検におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値を示すグラフであり、ISIS 175317はIGF-IRに対して特異性を示すが、GAPDH、HPRT、インスリン受容体、Casp3、およびBaxに対して特異性を示さない。バーは、ビヒクル処置およびISIS 175317処置生検の表皮および真皮におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値を表す。データはビヒクル処置試料の表皮におけるIGF-IR mRNAレベルの平均値と比較して表記し、エラーバーは、1標準偏差である。局所適用したISIS 175317(10%ISISクリーム製剤)は、外植体に局所適用後24時間で表皮および真皮におけるIGF-IR mRNAレベルを有意に減少させた。全ての場合においてn=11。(*=p<0.05、***=p<0.001)。
Claims (57)
- 核酸分子と特異的にハイブリダイズしてIGF-IRの発現を阻害する、IGF-IRをコードする核酸分子(SEQ ID NO:76)またはその5'非翻訳領域(SEQ ID NO:77)にターゲティングされる長さが8〜80ヌクレオベースの化合物。
- 長さ8〜50ヌクレオベースを含む、請求項1記載の化合物。
- 長さ8〜30ヌクレオベースを含む、請求項2記載の化合物。
- オリゴヌクレオチドを含む、請求項1記載の化合物。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項4記載の化合物。
- DNAオリゴヌクレオチドを含む、請求項4記載の化合物。
- RNAオリゴヌクレオチドを含む、請求項4記載の化合物。
- キメラオリゴヌクレオチドを含む、請求項4記載の化合物。
- 化合物の少なくとも一部がRNAとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド-RNA二本鎖を形成する、請求項4記載の化合物。
- IGF-IRに特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害する、SEQ ID NO:76またはSEQ ID NO:77と少なくとも70%の相補性を有する請求項1記載の化合物。
- IGF-IR遺伝子に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害する、SEQ ID NO:76またはSEQ ID NO:77と少なくとも80%の相補性を有する請求項1記載の化合物。
- IGF-IRに特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害する、SEQ ID NO:76またはSEQ ID NO:77と少なくとも90%の相補性を有する請求項1記載の化合物。
- IGF-IRに特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害する、SEQ ID NO:76またはSEQ ID NO:77と少なくとも95%の相補性を有する請求項1記載の化合物。
- 少なくとも一つの改変インターヌクレオシド結合、糖部分、またはヌクレオベースを有する、請求項1記載の化合物。
- 少なくとも一つの2'-O-メトキシエチル糖部分を有する、請求項1記載の化合物。
- 少なくとも一つのホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を有する、請求項1記載の化合物。
- 少なくとも一つの5-メチルシトシンを有する、請求項1記載の化合物。
- SEQ ID NO:1〜75およびSEQ ID NO:100〜136からなる群より選択される配列の少なくとも8ヌクレオチド部分を含む、請求項1記載の化合物。
- ISIS 175317(SEQ ID NO:125)である、請求項1記載の化合物。
- 以下の段階を含む、IGF-IR遺伝子発現の調節物質をスクリーニングする方法:
a.IGF-IRをコードする核酸分子の好ましい標的セグメントを、IGF-IR発現の一つまたは複数の候補調節物質に接触させる段階、および
b.IGF-IRの発現を調節する一つまたは複数のIGF-IR発現調節物質を同定する段階。 - 請求項1もしくは18の化合物、またはDT1064(SEQ ID NO:78)と比較して「基準値測定すること」を含む、請求項20記載の方法。
- IGF-IR発現の調節物質が、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、RNAとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド-RNA二本鎖を形成することができるRNAオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を有するRNAオリゴヌクレオチド、またはキメラオリゴヌクレオチドを含む、請求項20記載の方法。
- SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:75、またはSEQ ID NO:100〜136の少なくとも一つと配列類似性を有する少なくとも8ヌクレオベース部分を含む化合物を用いて、試料中のIGF-IRの有無を同定することを含む、疾患状態を同定する診断法。
- 請求項1、18、または19記載の化合物を含むキットまたはアッセイ装置。
- IGF-IRの発現が阻害されるように、請求項1、18、または19記載の化合物の治療的または予防的有効量を動物に投与することを含む、IGF-IRに関連する疾患または病態を有する動物を治療する方法。
- IGF-IRの発現が阻害されるように、請求項1の化合物の有効量を疾患に関係する細胞に接触させる段階を含む、哺乳動物におけるIGF-IRに関連する疾患の作用を改善する方法。
- 化合物がIGF-IR mRNAまたはタンパク質を阻害またはそうでなければ減少させる、請求項26記載の方法。
- IGF-IRに関連する障害が乾癬、魚鱗癬、粃糠疹、ルブラ(rubra)、ピラリス(pilaris)、脂漏、ケロイド、角化症、新生物、強皮症、いぼ、皮膚の良性増殖物または癌から選択される皮膚障害である、請求項27記載の方法。
- 皮膚病態が乾癬である、請求項27記載の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項24〜29のいずれか一項に記載の方法。
- ホスホロチオエート核酸分子がSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:75およびSEQ ID NO:100〜136から選択される、請求項28記載の方法。
- ホスホロチオエート核酸分子がISIS 175317(SEQ ID NO:125)から選択される、請求項28記載の方法。
- 核酸分子がISIS 175317である、請求項28記載の方法。
- 核酸分子がSEQ ID NO:1〜75、およびSEQ ID NO:100〜136から選択される、IGF-I媒介細胞増殖を阻害する、またはそうでなければ減少することができる一つまたは複数のホスホロチオエート核酸分子またはその化学類似体の有効量を、増殖する皮膚または増殖することができる皮膚に接触させることを含む、乾癬の作用を改善する方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項40記載の方法。
- ホスホロチオエート核酸分子がISIS 175317(SEQ ID NO:125)である、請求項40記載の方法。
- 一つまたは複数の薬学的に許容される担体および/または希釈剤をさらに含む、IGF-I媒介細胞増殖または他の疾患を阻害またはそうでなければ減少させることができるホスホロチオエート核酸分子を含む組成物。
- ホスホロチオエート核酸分子がIGF-IRをコードする遺伝子に対するアンチセンス分子である、請求項45記載の組成物。
- 核酸分子がSEQ ID NO:1〜75、およびSEQ ID NO:100〜136から選択される、請求項46記載の組成物。
- 核酸分子がISIS 175317である、請求項47記載の組成物。
- ケラチノサイト細胞の増殖および/または炎症の治療における薬剤の製造におけるIGF-IRをコードする遺伝子に向けられるホスホロチオエートASOの使用。
- ASOがSEQ ID NO:1〜75から選択される、請求項51記載の使用。
- 乾癬の治療のための請求項51または52記載の使用。
- ASOがSEQ ID NO:1〜75、およびSEQ ID NO:100〜136から選択される、請求項51、52、または53記載の使用。
- ASOがISIS 175317(SEQ ID NO:125)から選択される、請求項54記載の使用。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AU2003900609 | 2003-02-11 | ||
AU2003900609A AU2003900609A0 (en) | 2003-02-11 | 2003-02-11 | Modulation of insulin like growth factor i receptor expression |
AU2003902610A AU2003902610A0 (en) | 2003-05-27 | 2003-05-27 | Modulation of insulin like growth factor i receptor expression - ii |
AU2003902610 | 2003-05-27 | ||
PCT/AU2004/000160 WO2004072284A1 (en) | 2003-02-11 | 2004-02-11 | Modulation of insulin like growth factor i receptor expression |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006520586A true JP2006520586A (ja) | 2006-09-14 |
JP2006520586A5 JP2006520586A5 (ja) | 2010-08-05 |
JP4753863B2 JP4753863B2 (ja) | 2011-08-24 |
Family
ID=32870030
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006501357A Expired - Fee Related JP4753863B2 (ja) | 2003-02-11 | 2004-02-11 | インスリン様増殖因子i受容体発現の調節 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US7468356B2 (ja) |
EP (1) | EP1597366B1 (ja) |
JP (1) | JP4753863B2 (ja) |
CA (1) | CA2515484C (ja) |
DK (1) | DK1597366T3 (ja) |
ES (1) | ES2400033T3 (ja) |
NZ (1) | NZ541637A (ja) |
WO (1) | WO2004072284A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013502579A (ja) * | 2009-08-19 | 2013-01-24 | エムペックス ファーマスーティカルズ,インコーポレイテッド | リボフラビンベースのエアロゾル及び臨床試験におけるプラセボとしての使用 |
JP2013253990A (ja) * | 2013-09-11 | 2013-12-19 | Shiseido Co Ltd | シミを有する蓋然性を評価する方法 |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2003900609A0 (en) * | 2003-02-11 | 2003-02-27 | Antisense Therapeutics Ltd | Modulation of insulin like growth factor i receptor expression |
US7468356B2 (en) * | 2003-02-11 | 2008-12-23 | Antisense Therapeutics Ltd. | Modulation of insulin like growth factor I receptor expression |
JP4585342B2 (ja) * | 2005-03-18 | 2010-11-24 | 株式会社資生堂 | 不全角化を抑制する物質のスクリーニング方法、同方法によりスクリーニングされた物質及び不全角化を抑制する方法 |
BRPI0620723A2 (pt) * | 2005-12-29 | 2011-11-22 | Alcon Res Ltd | inibição de igf1r mediada por rnai para tratamento de angiogênese ocular |
JP2008072946A (ja) * | 2006-09-21 | 2008-04-03 | National Livestock Breeding Center | ウシの乳房炎抵抗性の遺伝子診断法 |
US20090258365A1 (en) * | 2008-03-25 | 2009-10-15 | Terstappen Leon W M M | METHOD FOR DETECTING IGF1R/Chr 15 in CIRCULATING TUMOR CELLS USING FISH |
US9084770B2 (en) | 2008-10-14 | 2015-07-21 | Antisense Therapeutics, Ltd. | Modulation of insulin like growth factor I receptor expression in cancer |
WO2010146059A2 (en) | 2009-06-16 | 2010-12-23 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy |
BR112019018555A2 (pt) | 2017-03-09 | 2020-04-14 | Univ Jefferson | métodos e composições para tratamento de cânceres utilizando antissenso |
WO2022094320A2 (en) * | 2020-10-29 | 2022-05-05 | Garcia Blanco Mariano A | Soluble interleukin-7 receptor (sil7r) modulating therapy to treat cancer |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996010401A1 (en) * | 1994-10-04 | 1996-04-11 | Emory University | Methods for regulation of insulin-like growth factor i receptor |
JPH08508405A (ja) * | 1993-03-26 | 1996-09-10 | トーマス ジェファーソン ユニバーシティ | Igf−1レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドにより細胞の増殖を阻害し、且つ細胞を分化させる方法 |
WO1999023259A1 (en) * | 1997-11-04 | 1999-05-14 | Inex Pharmaceutical Corporation | Antisense compounds to insulin-like growth factor-1 receptor |
JP2001504487A (ja) * | 1996-11-22 | 2001-04-03 | リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミネソタ | インスリン様生長因子1型受容体(igf―1r)アンチセンスオリゴヌクレオチド処理乳癌細胞組成物 |
Family Cites Families (193)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3687808A (en) | 1969-08-14 | 1972-08-29 | Univ Leland Stanford Junior | Synthetic polynucleotides |
US4534899A (en) | 1981-07-20 | 1985-08-13 | Lipid Specialties, Inc. | Synthetic phospholipid compounds |
US4426330A (en) | 1981-07-20 | 1984-01-17 | Lipid Specialties, Inc. | Synthetic phospholipid compounds |
JPS5927900A (ja) | 1982-08-09 | 1984-02-14 | Wakunaga Seiyaku Kk | 固定化オリゴヌクレオチド |
FR2540122B1 (fr) | 1983-01-27 | 1985-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application |
US4605735A (en) | 1983-02-14 | 1986-08-12 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Oligonucleotide derivatives |
US4948882A (en) | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
US4824941A (en) | 1983-03-10 | 1989-04-25 | Julian Gordon | Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems |
US4587044A (en) | 1983-09-01 | 1986-05-06 | The Johns Hopkins University | Linkage of proteins to nucleic acids |
US5118800A (en) | 1983-12-20 | 1992-06-02 | California Institute Of Technology | Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide |
US5118802A (en) | 1983-12-20 | 1992-06-02 | California Institute Of Technology | DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside |
FR2567892B1 (fr) | 1984-07-19 | 1989-02-17 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons |
US5367066A (en) | 1984-10-16 | 1994-11-22 | Chiron Corporation | Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites |
US5430136A (en) | 1984-10-16 | 1995-07-04 | Chiron Corporation | Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites |
US5258506A (en) | 1984-10-16 | 1993-11-02 | Chiron Corporation | Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains |
US4828979A (en) | 1984-11-08 | 1989-05-09 | Life Technologies, Inc. | Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection |
FR2575751B1 (fr) | 1985-01-08 | 1987-04-03 | Pasteur Institut | Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques |
US5185444A (en) | 1985-03-15 | 1993-02-09 | Anti-Gene Deveopment Group | Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages |
US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
US5235033A (en) | 1985-03-15 | 1993-08-10 | Anti-Gene Development Group | Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof |
US5166315A (en) | 1989-12-20 | 1992-11-24 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
US5405938A (en) | 1989-12-20 | 1995-04-11 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
US4762779A (en) | 1985-06-13 | 1988-08-09 | Amgen Inc. | Compositions and methods for functionalizing nucleic acids |
US5317098A (en) | 1986-03-17 | 1994-05-31 | Hiroaki Shizuya | Non-radioisotope tagging of fragments |
JPS638396A (ja) | 1986-06-30 | 1988-01-14 | Wakunaga Pharmaceut Co Ltd | ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体 |
EP0260032B1 (en) | 1986-09-08 | 1994-01-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Compounds for the cleavage at a specific position of RNA, oligomers employed for the formation of said compounds, and starting materials for the synthesis of said oligomers |
US5264423A (en) | 1987-03-25 | 1993-11-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
US5276019A (en) | 1987-03-25 | 1994-01-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
US4904582A (en) | 1987-06-11 | 1990-02-27 | Synthetic Genetics | Novel amphiphilic nucleic acid conjugates |
JP2828642B2 (ja) | 1987-06-24 | 1998-11-25 | ハワード フローレイ インスティテュト オブ イクスペリメンタル フィジオロジー アンド メディシン | ヌクレオシド誘導体 |
US5585481A (en) | 1987-09-21 | 1996-12-17 | Gen-Probe Incorporated | Linking reagents for nucleotide probes |
US5188897A (en) | 1987-10-22 | 1993-02-23 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates |
US4924624A (en) | 1987-10-22 | 1990-05-15 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof |
US5525465A (en) | 1987-10-28 | 1996-06-11 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same |
DE3738460A1 (de) | 1987-11-12 | 1989-05-24 | Max Planck Gesellschaft | Modifizierte oligonukleotide |
US5403711A (en) | 1987-11-30 | 1995-04-04 | University Of Iowa Research Foundation | Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved |
ATE151467T1 (de) | 1987-11-30 | 1997-04-15 | Univ Iowa Res Found | Durch modifikationen an der 3'-terminalen phosphodiesterbindung stabilisierte dna moleküle, ihre verwendung als nukleinsäuresonden sowie als therapeutische mittel zur hemmung der expression spezifischer zielgene |
US5082830A (en) | 1988-02-26 | 1992-01-21 | Enzo Biochem, Inc. | End labeled nucleotide probe |
WO1989009221A1 (en) | 1988-03-25 | 1989-10-05 | University Of Virginia Alumni Patents Foundation | Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates |
US5278302A (en) | 1988-05-26 | 1994-01-11 | University Patents, Inc. | Polynucleotide phosphorodithioates |
US5109124A (en) | 1988-06-01 | 1992-04-28 | Biogen, Inc. | Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine |
US5216141A (en) | 1988-06-06 | 1993-06-01 | Benner Steven A | Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages |
US5175273A (en) | 1988-07-01 | 1992-12-29 | Genentech, Inc. | Nucleic acid intercalating agents |
US5262536A (en) | 1988-09-15 | 1993-11-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides |
US5194599A (en) | 1988-09-23 | 1993-03-16 | Gilead Sciences, Inc. | Hydrogen phosphonodithioate compositions |
US5512439A (en) | 1988-11-21 | 1996-04-30 | Dynal As | Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof |
US5457183A (en) | 1989-03-06 | 1995-10-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Hydroxylated texaphyrins |
US5599923A (en) | 1989-03-06 | 1997-02-04 | Board Of Regents, University Of Tx | Texaphyrin metal complexes having improved functionalization |
US5354844A (en) | 1989-03-16 | 1994-10-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Protein-polycation conjugates |
US5108921A (en) | 1989-04-03 | 1992-04-28 | Purdue Research Foundation | Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules |
US5391723A (en) | 1989-05-31 | 1995-02-21 | Neorx Corporation | Oligonucleotide conjugates |
US5256775A (en) | 1989-06-05 | 1993-10-26 | Gilead Sciences, Inc. | Exonuclease-resistant oligonucleotides |
US4958013A (en) | 1989-06-06 | 1990-09-18 | Northwestern University | Cholesteryl modified oligonucleotides |
US5227170A (en) | 1989-06-22 | 1993-07-13 | Vestar, Inc. | Encapsulation process |
US5451463A (en) | 1989-08-28 | 1995-09-19 | Clontech Laboratories, Inc. | Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides |
US5134066A (en) | 1989-08-29 | 1992-07-28 | Monsanto Company | Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs |
US5254469A (en) | 1989-09-12 | 1993-10-19 | Eastman Kodak Company | Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures |
US5591722A (en) | 1989-09-15 | 1997-01-07 | Southern Research Institute | 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity |
US5527528A (en) | 1989-10-20 | 1996-06-18 | Sequus Pharmaceuticals, Inc. | Solid-tumor treatment method |
US5013556A (en) | 1989-10-20 | 1991-05-07 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US5356633A (en) | 1989-10-20 | 1994-10-18 | Liposome Technology, Inc. | Method of treatment of inflamed tissues |
US5721218A (en) | 1989-10-23 | 1998-02-24 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotides with inverted polarity |
US5399676A (en) | 1989-10-23 | 1995-03-21 | Gilead Sciences | Oligonucleotides with inverted polarity |
AU658562B2 (en) | 1989-10-24 | 1995-04-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2' modified oligonucleotides |
US5264562A (en) | 1989-10-24 | 1993-11-23 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide analogs with novel linkages |
US5264564A (en) | 1989-10-24 | 1993-11-23 | Gilead Sciences | Oligonucleotide analogs with novel linkages |
US5292873A (en) | 1989-11-29 | 1994-03-08 | The Research Foundation Of State University Of New York | Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe |
US5177198A (en) | 1989-11-30 | 1993-01-05 | University Of N.C. At Chapel Hill | Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates |
US5130302A (en) | 1989-12-20 | 1992-07-14 | Boron Bilogicals, Inc. | Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same |
US5580575A (en) | 1989-12-22 | 1996-12-03 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Therapeutic drug delivery systems |
US5469854A (en) | 1989-12-22 | 1995-11-28 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Methods of preparing gas-filled liposomes |
US5486603A (en) | 1990-01-08 | 1996-01-23 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide having enhanced binding affinity |
US5587470A (en) | 1990-01-11 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 3-deazapurines |
US5459255A (en) | 1990-01-11 | 1995-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-2 substituted purines |
US5670633A (en) | 1990-01-11 | 1997-09-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
US5578718A (en) | 1990-01-11 | 1996-11-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Thiol-derivatized nucleosides |
US5587361A (en) | 1991-10-15 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
US5623065A (en) | 1990-08-13 | 1997-04-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped 2' modified oligonucleotides |
US5646265A (en) | 1990-01-11 | 1997-07-08 | Isis Pharmceuticals, Inc. | Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites |
US5681941A (en) | 1990-01-11 | 1997-10-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted purines and oligonucleotide cross-linking |
US5220007A (en) | 1990-02-15 | 1993-06-15 | The Worcester Foundation For Experimental Biology | Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides |
US5149797A (en) | 1990-02-15 | 1992-09-22 | The Worcester Foundation For Experimental Biology | Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides |
AU7579991A (en) | 1990-02-20 | 1991-09-18 | Gilead Sciences, Inc. | Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers |
US5214136A (en) | 1990-02-20 | 1993-05-25 | Gilead Sciences, Inc. | Anthraquinone-derivatives oligonucleotides |
US5321131A (en) | 1990-03-08 | 1994-06-14 | Hybridon, Inc. | Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling |
US5470967A (en) | 1990-04-10 | 1995-11-28 | The Dupont Merck Pharmaceutical Company | Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
GB9009980D0 (en) | 1990-05-03 | 1990-06-27 | Amersham Int Plc | Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides |
ATE167523T1 (de) | 1990-05-11 | 1998-07-15 | Microprobe Corp | Teststreifen zum eintauchen für nukleinsäure- hybridisierungsassays und verfahren zur kovalenten immobilisierung von oligonucleotiden |
US5223618A (en) | 1990-08-13 | 1993-06-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 4'-desmethyl nucleoside analog compounds |
US5608046A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds |
US5602240A (en) | 1990-07-27 | 1997-02-11 | Ciba Geigy Ag. | Backbone modified oligonucleotide analogs |
US5541307A (en) | 1990-07-27 | 1996-07-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof |
CA2088258C (en) | 1990-07-27 | 2004-09-14 | Phillip Dan Cook | Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
US5378825A (en) | 1990-07-27 | 1995-01-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs |
US5623070A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
US5218105A (en) | 1990-07-27 | 1993-06-08 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5386023A (en) | 1990-07-27 | 1995-01-31 | Isis Pharmaceuticals | Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling |
US5688941A (en) | 1990-07-27 | 1997-11-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds |
US5138045A (en) | 1990-07-27 | 1992-08-11 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5677437A (en) | 1990-07-27 | 1997-10-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
US5618704A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-08 | Isis Pharmacueticals, Inc. | Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling |
US5489677A (en) | 1990-07-27 | 1996-02-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms |
US5610289A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogues |
US5245022A (en) | 1990-08-03 | 1993-09-14 | Sterling Drug, Inc. | Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides |
ATE131827T1 (de) | 1990-08-03 | 1996-01-15 | Sterling Winthrop Inc | Verbindungen und verfahren zur unterdrückung der genexpression |
US5512667A (en) | 1990-08-28 | 1996-04-30 | Reed; Michael W. | Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides |
US5214134A (en) | 1990-09-12 | 1993-05-25 | Sterling Winthrop Inc. | Process of linking nucleosides with a siloxane bridge |
US5561225A (en) | 1990-09-19 | 1996-10-01 | Southern Research Institute | Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages |
EP0549686A4 (en) | 1990-09-20 | 1995-01-18 | Gilead Sciences Inc | Modified internucleoside linkages |
US5432272A (en) | 1990-10-09 | 1995-07-11 | Benner; Steven A. | Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases |
DE69132510T2 (de) | 1990-11-08 | 2001-05-03 | Hybridon Inc | Verbindung von mehrfachreportergruppen auf synthetischen oligonukleotiden |
US5672697A (en) | 1991-02-08 | 1997-09-30 | Gilead Sciences, Inc. | Nucleoside 5'-methylene phosphonates |
JP3220180B2 (ja) | 1991-05-23 | 2001-10-22 | 三菱化学株式会社 | 薬剤含有タンパク質結合リポソーム |
DK51092D0 (da) * | 1991-05-24 | 1992-04-15 | Ole Buchardt | Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf |
US5714331A (en) | 1991-05-24 | 1998-02-03 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility |
US5539082A (en) | 1993-04-26 | 1996-07-23 | Nielsen; Peter E. | Peptide nucleic acids |
US5719262A (en) | 1993-11-22 | 1998-02-17 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having amino acid side chains |
US5371241A (en) | 1991-07-19 | 1994-12-06 | Pharmacia P-L Biochemicals Inc. | Fluorescein labelled phosphoramidites |
US5571799A (en) | 1991-08-12 | 1996-11-05 | Basco, Ltd. | (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response |
NZ244306A (en) | 1991-09-30 | 1995-07-26 | Boehringer Ingelheim Int | Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation |
US5521291A (en) | 1991-09-30 | 1996-05-28 | Boehringer Ingelheim International, Gmbh | Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells |
EP0538194B1 (de) | 1991-10-17 | 1997-06-04 | Novartis AG | Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte |
US5594121A (en) | 1991-11-07 | 1997-01-14 | Gilead Sciences, Inc. | Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines |
US5484908A (en) | 1991-11-26 | 1996-01-16 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines |
DE637965T1 (de) | 1991-11-26 | 1995-12-14 | Gilead Sciences Inc | Gesteigerte bildung von triple- und doppelhelices aus oligomeren mit modifizierten pyrimidinen. |
TW393513B (en) | 1991-11-26 | 2000-06-11 | Isis Pharmaceuticals Inc | Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines |
US5792608A (en) | 1991-12-12 | 1998-08-11 | Gilead Sciences, Inc. | Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use |
US5359044A (en) | 1991-12-13 | 1994-10-25 | Isis Pharmaceuticals | Cyclobutyl oligonucleotide surrogates |
US5700922A (en) | 1991-12-24 | 1997-12-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules |
US5595726A (en) | 1992-01-21 | 1997-01-21 | Pharmacyclics, Inc. | Chromophore probe for detection of nucleic acid |
US5565552A (en) | 1992-01-21 | 1996-10-15 | Pharmacyclics, Inc. | Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis |
FR2687679B1 (fr) | 1992-02-05 | 1994-10-28 | Centre Nat Rech Scient | Oligothionucleotides. |
US5633360A (en) | 1992-04-14 | 1997-05-27 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation |
FR2692265B1 (fr) | 1992-05-25 | 1996-11-08 | Centre Nat Rech Scient | Composes biologiquement actifs de type phosphotriesters. |
US5434257A (en) | 1992-06-01 | 1995-07-18 | Gilead Sciences, Inc. | Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages |
EP0577558A2 (de) | 1992-07-01 | 1994-01-05 | Ciba-Geigy Ag | Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte |
US5272250A (en) | 1992-07-10 | 1993-12-21 | Spielvogel Bernard F | Boronated phosphoramidate compounds |
US5652355A (en) | 1992-07-23 | 1997-07-29 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Hybrid oligonucleotide phosphorothioates |
AU678769B2 (en) | 1992-07-27 | 1997-06-12 | Hybridon, Inc. | Oligonucleotide alkylphosphonothioates |
US5583020A (en) | 1992-11-24 | 1996-12-10 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides |
US5574142A (en) | 1992-12-15 | 1996-11-12 | Microprobe Corporation | Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery |
JP3351476B2 (ja) | 1993-01-22 | 2002-11-25 | 三菱化学株式会社 | リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム |
DK0677056T3 (da) | 1993-01-25 | 1996-08-05 | Hybridon Inc | Oligonukleotid-alkylphosphonater og -alkylphosphonothioater |
US5476925A (en) | 1993-02-01 | 1995-12-19 | Northwestern University | Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups |
US5395619A (en) | 1993-03-03 | 1995-03-07 | Liposome Technology, Inc. | Lipid-polymer conjugates and liposomes |
GB9304620D0 (en) | 1993-03-06 | 1993-04-21 | Ciba Geigy Ag | Compounds |
GB9304618D0 (en) | 1993-03-06 | 1993-04-21 | Ciba Geigy Ag | Chemical compounds |
JPH08508492A (ja) | 1993-03-30 | 1996-09-10 | スターリング ウィンスロップ インコーポレイティド | 非環式ヌクレオシド類似体及びそれらを含むオリゴヌクレオチド配列 |
HU9501974D0 (en) | 1993-03-31 | 1995-09-28 | Sterling Winthrop Inc | Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages |
DE4311944A1 (de) | 1993-04-10 | 1994-10-13 | Degussa | Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen |
US5462854A (en) | 1993-04-19 | 1995-10-31 | Beckman Instruments, Inc. | Inverse linkage oligonucleotides for chemical and enzymatic processes |
FR2705099B1 (fr) | 1993-05-12 | 1995-08-04 | Centre Nat Rech Scient | Oligonucléotides phosphorothioates triesters et procédé de préparation. |
US5534259A (en) | 1993-07-08 | 1996-07-09 | Liposome Technology, Inc. | Polymer compound and coated particle composition |
US5543158A (en) | 1993-07-23 | 1996-08-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Biodegradable injectable nanoparticles |
US5417978A (en) | 1993-07-29 | 1995-05-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use |
US5502177A (en) | 1993-09-17 | 1996-03-26 | Gilead Sciences, Inc. | Pyrimidine derivatives for labeled binding partners |
US5801154A (en) * | 1993-10-18 | 1998-09-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein |
US5457187A (en) | 1993-12-08 | 1995-10-10 | Board Of Regents University Of Nebraska | Oligonucleotides containing 5-fluorouracil |
US5446137B1 (en) | 1993-12-09 | 1998-10-06 | Behringwerke Ag | Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides |
EP0733059B1 (en) | 1993-12-09 | 2000-09-13 | Thomas Jefferson University | Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells |
US5595756A (en) | 1993-12-22 | 1997-01-21 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents |
US5519134A (en) | 1994-01-11 | 1996-05-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Pyrrolidine-containing monomers and oligomers |
US5596091A (en) | 1994-03-18 | 1997-01-21 | The Regents Of The University Of California | Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides |
US5627053A (en) | 1994-03-29 | 1997-05-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid |
US5625050A (en) | 1994-03-31 | 1997-04-29 | Amgen Inc. | Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics |
US5646269A (en) | 1994-04-28 | 1997-07-08 | Gilead Sciences, Inc. | Method for oligonucleotide analog synthesis |
US5525711A (en) | 1994-05-18 | 1996-06-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes |
US5543152A (en) | 1994-06-20 | 1996-08-06 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Sphingosomes for enhanced drug delivery |
US5597696A (en) | 1994-07-18 | 1997-01-28 | Becton Dickinson And Company | Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates |
US5597909A (en) | 1994-08-25 | 1997-01-28 | Chiron Corporation | Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use |
US5580731A (en) | 1994-08-25 | 1996-12-03 | Chiron Corporation | N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith |
US5591721A (en) | 1994-10-25 | 1997-01-07 | Hybridon, Inc. | Method of down-regulating gene expression |
US5512295A (en) | 1994-11-10 | 1996-04-30 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery |
US5792747A (en) | 1995-01-24 | 1998-08-11 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Highly potent agonists of growth hormone releasing hormone |
US5652356A (en) | 1995-08-17 | 1997-07-29 | Hybridon, Inc. | Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides |
JP3756313B2 (ja) | 1997-03-07 | 2006-03-15 | 武 今西 | 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体 |
AU9063398A (en) | 1997-09-12 | 1999-04-05 | Exiqon A/S | Oligonucleotide analogues |
US5998148A (en) * | 1999-04-08 | 1999-12-07 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of microtubule-associated protein 4 expression |
US6287860B1 (en) | 2000-01-20 | 2001-09-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of MEKK2 expression |
WO2002006345A2 (en) | 2000-07-18 | 2002-01-24 | Curagen Corporation | G-protein coupled receptor proteins (gpcr) and nucleic acids encoding same |
EP1317470B1 (en) * | 2000-09-14 | 2011-04-27 | The University Of British Columbia | Antisense insulin-like growth factor binding protein (igfbp)-2-oligodeoxynucleotides for prostate tumor therapy |
AU2001289085A1 (en) | 2000-09-20 | 2002-04-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of flip-c expression |
US6426220B1 (en) | 2000-10-30 | 2002-07-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of calreticulin expression |
EP1385937A4 (en) | 2001-04-20 | 2005-11-09 | Chiron Corp | CONTRIBUTION OF POLYNUCLEOTIDE AGENTS TO THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM |
US7468356B2 (en) * | 2003-02-11 | 2008-12-23 | Antisense Therapeutics Ltd. | Modulation of insulin like growth factor I receptor expression |
AU2003900609A0 (en) * | 2003-02-11 | 2003-02-27 | Antisense Therapeutics Ltd | Modulation of insulin like growth factor i receptor expression |
US8935416B2 (en) | 2006-04-21 | 2015-01-13 | Fortinet, Inc. | Method, apparatus, signals and medium for enforcing compliance with a policy on a client computer |
JP2014524323A (ja) | 2011-08-25 | 2014-09-22 | ディービー、イクイップメント、アクティーゼルスカブ | 補強された側壁及び可変の長さを有するアクセサリーバッグ |
WO2013080784A1 (ja) | 2011-11-30 | 2013-06-06 | シャープ株式会社 | メモリ回路とその駆動方法、及び、これを用いた不揮発性記憶装置、並びに、液晶表示装置 |
US9400902B2 (en) | 2012-05-22 | 2016-07-26 | Trimble Navigation Limited | Multi-modal entity tracking and display |
US9108673B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-08-18 | Steering Solutions Ip Holding Corporation | Crash release mechanism for automotive steering column |
CA2917705C (en) | 2015-02-25 | 2019-06-18 | Jervis B. Webb Company | Method and system for automated luggage security inspection |
-
2004
- 2004-02-11 US US10/545,354 patent/US7468356B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-02-11 CA CA2515484A patent/CA2515484C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-02-11 JP JP2006501357A patent/JP4753863B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-02-11 ES ES04709958T patent/ES2400033T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-11 NZ NZ541637A patent/NZ541637A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-02-11 WO PCT/AU2004/000160 patent/WO2004072284A1/en active Application Filing
- 2004-02-11 DK DK04709958.5T patent/DK1597366T3/da active
- 2004-02-11 EP EP04709958A patent/EP1597366B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-12-22 US US12/342,025 patent/US8217017B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-06-11 US US13/493,827 patent/US20130096176A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08508405A (ja) * | 1993-03-26 | 1996-09-10 | トーマス ジェファーソン ユニバーシティ | Igf−1レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドにより細胞の増殖を阻害し、且つ細胞を分化させる方法 |
WO1996010401A1 (en) * | 1994-10-04 | 1996-04-11 | Emory University | Methods for regulation of insulin-like growth factor i receptor |
JP2001504487A (ja) * | 1996-11-22 | 2001-04-03 | リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミネソタ | インスリン様生長因子1型受容体(igf―1r)アンチセンスオリゴヌクレオチド処理乳癌細胞組成物 |
WO1999023259A1 (en) * | 1997-11-04 | 1999-05-14 | Inex Pharmaceutical Corporation | Antisense compounds to insulin-like growth factor-1 receptor |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6009064714, J. Invest. Dermatol., 200206, Vol.118, No.6, p.1003−1007 * |
JPN6009064716, Nat. Biotechnol., 200005, Vol.18, No.5, p.521−526 * |
JPN6009064717, Database DDBJ/EMBL/GenBank [online], Accession No.NM_000875, 20030117 * |
JPN6009064719, Database DDBJ/EMBL/GenBank [online], Accession No.M69229, 19941108 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013502579A (ja) * | 2009-08-19 | 2013-01-24 | エムペックス ファーマスーティカルズ,インコーポレイテッド | リボフラビンベースのエアロゾル及び臨床試験におけるプラセボとしての使用 |
JP2013253990A (ja) * | 2013-09-11 | 2013-12-19 | Shiseido Co Ltd | シミを有する蓋然性を評価する方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2400033T3 (es) | 2013-04-05 |
US20060234239A1 (en) | 2006-10-19 |
EP1597366A4 (en) | 2007-01-10 |
DK1597366T3 (da) | 2013-02-25 |
EP1597366B1 (en) | 2012-11-21 |
JP4753863B2 (ja) | 2011-08-24 |
CA2515484C (en) | 2011-09-20 |
US20090286849A1 (en) | 2009-11-19 |
WO2004072284A8 (en) | 2005-10-27 |
EP1597366A1 (en) | 2005-11-23 |
WO2004072284A1 (en) | 2004-08-26 |
US20130096176A1 (en) | 2013-04-18 |
CA2515484A1 (en) | 2004-08-26 |
US7468356B2 (en) | 2008-12-23 |
US8217017B2 (en) | 2012-07-10 |
NZ541637A (en) | 2008-07-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6110327B2 (ja) | 成長ホルモン受容体の発現およびインスリン様成長因子の発現のモジュレーション | |
US8217017B2 (en) | Modulation of insulin like growth factor I receptor expression | |
JP2012050439A (ja) | グルコガンレセプター発現の調節 | |
US20040101852A1 (en) | Modulation of CGG triplet repeat binding protein 1 expression | |
JP2010136725A (ja) | Sglt2発現の調節 | |
WO2004048534A2 (en) | Modulation of cytokine-inducible kinase expression | |
WO2004055162A2 (en) | Modulation of endothelial lipase expression | |
JP2009516710A (ja) | eIF4E−BP2の発現のモジュレート | |
US20040224912A1 (en) | Modulation of PAI-1 mRNA-binding protein expression | |
US20090111767A1 (en) | Modulation of insulin like growth factor i receptor expression | |
WO2004045527A2 (en) | Modulation of nima-related kinase 6 expression | |
WO2004047741A2 (en) | Modulation of iap-like expression | |
US20050215506A1 (en) | Modulation of tyrosinase expression | |
AU2004210882B2 (en) | Modulation of insulin like growth factor I receptor expression | |
WO2004048325A2 (en) | Modulation of jagged 1 expression | |
EP1579011A2 (en) | Modulation of death-associated protein kinase 1 expression | |
US20040102403A1 (en) | Modulation of fibrillarin expression | |
WO2004047736A2 (en) | Modulation of bcl2-associated athanogene expression | |
WO2004052300A2 (en) | Modulation of alpha-methylacyl-coa racemase expression | |
EP1570087A1 (en) | Modulation of cd1d expression | |
WO2004053168A1 (en) | Modulation of adipophilin expression | |
WO2004046325A2 (en) | Modulation of serine/threonine kinase 16 expression |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070209 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090204 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091210 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100309 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100316 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100610 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20100610 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100826 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101224 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101210 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110202 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20110224 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110512 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110524 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140603 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |