BRPI0620723A2 - inibição de igf1r mediada por rnai para tratamento de angiogênese ocular - Google Patents

Abstract

INIBIçãO DE IGF1R MEDIADA POR RNAi PARA TRATAMENTO DE ANGIOGêNESE OCULAR. A presente invenção refere-se a RNA de interferência que é prvido para inibição de expressão de mRNA de IGF1 R para tratamento de pa- cientes com angiogênese ocular, particularmente para tratamento de edema retinal, retinopatia diabética, seqúela associada com isquemia retinal, neo-vascularização do segmento posterior (PSNV) e glaucoma neovascular, epara tratamento de pacientes sob risco de desenvolver tais condições.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "INIBIÇÃO DE IGF1R MEDIADA POR RNAi PARA TRATAMENTO DE ANGIOGÊNESE OCULAR".

O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. Número de Série 60 754.796 depositado em 29 de dezembro de 2005, cujo texto é aqui especificamente incorporado a título de referência. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo de composições de RNA de interferência para inibição de expressão de receptor de fator-1 de crescimento do tipo insulina (IGF-1R), a proteína codificada pelo mRNA de IGF1-R, em angiogênese ocular, incluindo aquelas mudanças celulares re- sultantes das interações de fator-1 de crescimento do tipo insulina (IGF-1) e IGF1-R que levam diretamente ou indiretamente à neovascularização ocular, edema retinal, retinopatia diabética, seqüela associada com isquemia retinal, neovascularização do segmento posterior e glaucoma neovascular, por e- xemplo.

Antecedentes da Invenção

Retinopatia diabética (DR) é uma doença do olho que se desen- volve em diabetes devido a mudanças nas células que revestem os vasos sangüíneos, isto é, o endotélio microvascular retinal. Durante o diabetes mel- litus, hiperglicemia pode causar dano de várias maneiras. Por exemplo, gli- cose, ou um metabólito de glicose, se liga aos grupos amino de proteínas, levando a dano de tecido. Ainda, glicose em excesso entra no curso de poliol resultando em acúmulo de sorbitol. Sorbitol não pode ser metabolizado pelas células da retina e pode contribuir para pressão osmótica intracelular alta, edema intracelular, difusão prejudicada, hipoxia de tecido, dano de célula capilar e enfraquecimento capilar. Retinopatia diabética envolve espessa- mento de membranas de base capilar que pode por sua vez prevenir perici- tos, o tipo de célula perivascular predominante em capilares retinais, de con- tato com células endoteliais. Morte de pericito e célula endotelial acontece através de um mecanismo apoptótico durante retinopatia diabética, onde a perda de pericitos provavelmente aumenta a permeabilidade dos capilares e leva a colapso da barreira sangue-retina e desregulagem do fluxo sangüí- neo. Capilares enfraquecidos levam à formação de aneurisma e derrame adicional. Esses efeitos de hiperglicemia podem também prejudicar funções neuronais na retina. DR está relacionada com mircroaneurismas retinais, hemorragias, exudatos e retinitis proliferans, isto é, crescimento de tecido neurovascular e conectivo massivo sobre a superfície interna da retina. Reti- nopatia diabética pode ser do tipo secundário, progressivamente caracteri- zada por microaneurismas; hemorragias pontuadas intra-retinais; exudatos cerosos, amarelos; pontos de algodão (cotton-wool patches)·, e edema ma- cular. Este é um estágio avançado de retinopatia diabética chamado retino- patia diabética não-proliferâtiva.

Conforme a patologia microvascular induzida por diabetes pro- gride, capilares retinais eventualmente se tornam ocluídos e levam a áreas multifocais de hipoxia isquêmica dentro da retina. Condições hipóxicas no tecido não-perfundido elicita a produção de fatores de crescimento capazes de estimulação de crescimento de vaso sangüíneo novo anormal a partir de vasos existentes (angiogênese). Esses novos vasos sangüíneos patológicos crescem para o vítreo e podem causar perda de visão, uma condição cha- mada retinopatia diabética proliferativa (PDR), uma vez que os novos vasos sangüíneos são frágeis e tendem a derramar sangue no olho. O tipo prolife- rativo de DR é caracterizado por neovascularização da retina e disco óptico que pode se projetar para o vítreo, proliferação de tecido fibroso, hemorragia do vítreo e descolamento retinal.

Neovascularização também acontece em um tipo de glaucoma chamado glaucoma neovascular onde pressão intra-ocular aumentada é causada por crescimento de tecido conectivo e novos vasos sangüíneos so- bre a rede trabecular. Glaucoma neovascular é uma forma de glaucoma se- cundário causada por neovascularização no ângulo da câmara.

Neovascularização do segmento posterior (PSNV) é uma pato- logia ameaçadora da visão responsável pelas duas causas mais comuns de cegueira adquirida em países desenvolvidos: degeneração macular relacio- nada com a idade exudativa (AMD) e PDR. Até recentemente, os únicos tra- tamentos aprovados para PSNV que acontece durante AMD exudativa foram fotocoagulação a laser ou terapia fotodinâmica com VISUDYNE®. Ambas terapias envolvem oclusão de vasculatura afetada, que resulta em dano in- duzido por laser, permanente, à retina, e não se direciona à causa de base de neovascularização. Recorrência de neovascularização a partir da mesma área é comum. Para pacientes com PDR, intervenções cirúrgicas com vitrec- tomia e remoção de membranas pré-retinais são as únicas opções atual- mente disponíveis, bem como uma terapia a laser chamada fotocoagulação pan-retinal para prevenir a produção de mais vasos novos.

Esforços farmacêuticos atuais têm focado na inibição do efeito de fatores angiogênicos potentes tal como VEGF. Recentemente, injeção intravítrea de LUCENTIS®, um fragmento de anticorpo anti-VEGF, foi apro- vada para tratamento de AMD. Este fragmento de anticorpo foi criado para se ligar a e inibir VEGF para inibir a formação de novos vasos sangüíneos. Lucentis está também em testes clínicos para o tratamento de edema macu- lar diabético. Outras abordagens incluem o uso de RNA de interferência pe- quenos se direcionando a VEGF ou seu receptor.

O eixo hormônio do crescimento (GH)/IGF1 está implicado em DR conforme evidenciado por resultados mostrando um aumento em IGF1 em fluidos oculares e tecidos de pacientes com DR avançada. Ainda, paci- entes tratados subcutaneamente com octreotídeo, um análogo de somatos- tatina que inibe o eixo GH/IGF1, mostram melhora empírica em edema ma- cular diabético e PDR. No modelo de OIR de camundongo, tratamento com um inibidor de GH ou antagonista de IGF1R diminui significantemente neo- vascularização retinal. Em um modelo diabético de camundongo, terapia de IGF-1 mediada por plasmídeo reverteu angiogênese e fluxo arterial aumen- tados diabéticos.

IGF1R é um membro da família de receptor de tirosina cinase. Vários inibidores de receptor de tirosina cinase de molécula pequena (RTKi) foram descritos que inibem neovascularização retinal e/ou neovasculariza- ção coroidal em camundongos. Cada uma dessas moléculas inibe cinases múltiplas que pode ser eficaz em bloqueio de neovascularização, no entanto, cada uma tem o risco presente de causar efeitos colaterais tóxicos. Um fár- maco de molécula pequena que vai inibir todas as cinases necessárias para bloquear neovascularização pode também inibir uma cinase que é necessá- ria para sobrevivência celular.

A presente invenção refere-se a esta falta de especificidade de inibição de receptor de tirosina cinases, especificamente o receptor de fator- 1 de crescimento do tipo insulina. A presente invenção provê RNAs de inter- ferência se direcionando a IGF1R em angiogênese e permeabilidade vascular.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a RNAs de interferência que si- lenciam expressão de mRNA de IGF-1R, deste modo diminuindo a atividade do complexo ligado IGF-1/IGF1R e tratando angiogênese ocular através da realização de uma diminuição de atividade celular pré-angiogênica e angio- gênica ocular. IGF-1R é ativado pela ligação de IGF-1 ao domínio extracelu- lar do receptor. A ativação da cinase por sua vez resulta em estimulação de substratos intracelulares diferentes.

O termo "angiogênese ocular", conforme aqui usado, inclui con- dições pré-angiogênicas oculares e condições angiogênicas oculares, e in- clui aquelas mudanças celulares resultantes da interação de IGF-1 e IGF-1 R que levam diretamente ou indiretamente à angiogênese ocular, neovascula- rização ocular, edema retinal, retinopatia diabética, seqüela associada com isquemia retinal, PSNV, permeabilidade vascular e glaucoma neovascular, por exemplo. Os RNAs de interferência da invenção são úteis para tratamen- to de pacientes com angiogênese ocular, neovascularização ocular, edema retinal, retinopatia diabética, seqüela associada com isquemia retinal, neo- vascularização do segmento posterior (PSNV) e glaucoma neovascular ou pacientes sob risco de desenvolver tais condições, por exemplo.

Uma modalidade da presente invenção provê um método de a- tenuação da expressão de um alvo de mRNA de IGF1R em um indivíduo. O método compreende administração a um indivíduo de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um RNA de interferência tal como siRNA tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farma- ceuticamente aceitável. Administração é um olho do indivíduo para atenua- ção da expressão de alvo de angiogênese ocular em um ser humano.

Em uma modalidade da invenção, o RNA de interferência com- preende um filamento de nucleotídeo de sentido, um filamento de nucleotí- deo de anti-sentido e uma região de complementaridade contígua pelo me- nos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos. Ainda, o filamento de anti-sentido hibridiza sob condições fisiológicas para uma porção de um mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1, que é a seqüência de cDNA de sen- tido codificando IGF1R (No. De acesso GenBank NM_000875) e tem uma região de complementaridade contínua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a porção de hibridização de mRNA correspon- dendo à SEQ ID NO:1. A administração de tal composição atenua a expres- são de um mRNA de IGF1R do indivíduo.

Em uma modalidade da invenção, um RNA de interferência é criado para se direcionar a um mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1 com- preendendo nucleotídeo 401, 635, 1062, 1548, 1604, 1643, 1766, 1922, 2012, 2069, 2210, 2416, 2423, 2654, 2909, 3339, 3416, 3464, 3476, 3505, 3512, 3871, 3782, 3881, 4064, 4158, 4411, 4487, 4904, 4905, 4909, 3329, 2323 ou 2887.

A presente invenção provê ainda administração de um segundo RNA de interferência a um indivíduo em adição a um primeiro RNA de inter- ferência. O método compreende administração ao indivíduo de um segundo RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e compreendendo um filamento de nucleotídeo de sentido, um filamento de nucleotídeo de anti-sentido e uma região de complementaridade pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos; onde o filamento de anti- sentido do segundo RNA de interferência hibridiza sob condições fisiológicas para uma segunda porção de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1 e o filamento de anti-sentido tem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a segunda porção de hibridização de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1. Ainda, um terceiro, quarto ou quinto etc, RNA de interferência pode ser administra- do de uma maneira similar.

Outra modalidade da invenção é um método de atenuação da expressão de mRNA de IGF1R em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de RNA de interferência de filamento simples tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Para atenuação da expressão de mRNA de IGF1R, o RNA de interferência de filamento simples hibridiza sob condições fisiológicas para uma porção de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1 compreendendo nu- cleotídeo 401, 635, 1062, 1548, 1604, 1643, 1766, 1922, 2012, 2069, 2210, 2416, 2423, 2654, 2909, 3339, 3416, 3464, 3476, 3505, 3512, 3781, 3782, 3881, 4064, 4158, 4411, 4487, 4904, 4905, 4909, 3329, 2323 ou 2887, e o RNA de interferência tem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a porção de hibri- dização de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1. Expressão de mRNA de IFG1R é então atenuada.

Uma modalidade adicional da invenção é um método de trata- mento de angiogênese ocular em um indivíduo com necessidade dele. O método compreende administração a um olho do indivíduo de uma composi- ção compreendendo uma quantidade eficaz de RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, o RNA de interferência compreendendo um filamento de nucleotí- deo de sentido, um filamento de nucleotídeo de anti-sentido e uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos. O filamento de anti-sentido hibridiza sob condições fisiológicas para uma porção de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1 e tem uma re- gião de complementaridade contínua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a porção de hibridização de mRNA correspon- dendo à SEQ ID NO:1. A angiogênese ocular é tratada então.

Outra modalidade da invenção é um método de tratamento de angiogênese ocular em um indivíduo com necessidade dele, o método com- preendendo administrar a um olho do indivíduo uma composição compreen- dendo uma quantidade eficaz de RNA de interferência tendo um comprimen- to de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, o RNA de interferência compreendendo uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os penúltimos 13 nu- cleotídeos da extremidade 3' de um mRNA correspondendo a qualquer uma das SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:8 - SEQ ID NO:40, onde a angiogênese ocular é tratada então.

Outra modalidade da invenção é um método de atenuação da expressão de um mRNA de IGF1R em um indivíduo compreendendo admi- nistrar ao indivíduo uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, onde o RNA de interferência com- preende uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremi- dade 3' de um mRNA correspondendo a qualquer uma das SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:8 - SEQ ID NO:40.

Em uma modalidade adicional da presente invenção, a região de nucleotídeos contíguos é uma região de pelo menos 14 nucleotídeos contí- guos tendo pelo menos 85% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 85% e identidade de seqüência com, os 14 penúltimos nucleotí- deos da extremidade 3' de um mRNA correspondendo à seqüência do identi- ficador de seqüência. Em ainda outra modalidade da invenção, a região de nucleotídeos contíguos é uma região de pelo menos 15, 16, 17 ou 18 nu- cleotídeos contíguos tendo pelo menos 80% de complementaridade de se- qüência para, ou pelo menos 80% de identidade de seqüência com, os pe- núltimos 15, 16, 17 ou 18 nucleotídeos, respectivamente, da extremidade 3' de um mRNA correspondendo à seqüência identificada pelo identificador de seqüência.

Uma modalidade adicional da invenção é um método de trata- mento de angiogênese ocular em um indivíduo com necessidade dele, o mé- todo compreendendo administrar ao indivíduo uma composição compreen- dendo uma molécula de siRNA de filamento duplo que sub-regula a expres- são de um gene de IGF1R através de interferência de RNA, onde cada fila- mento da molécula de siRNA é independentemente de cerca de 19 a cerca de 27 nucleotídeos de comprimento; e um filamento da molécula de siRNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo tendo complementaridade substancial para um mRNA correspondendo ao gene de IGF1R, respectiva- mente, de modo que a molécula de siRNA direciona clivagem do mRNA a- través de interferência de RNA.

Uma composição compreendendo RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e tendo uma seqüência de nucleo- tídeo de qualquer uma das SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:8 - SEQ ID N0:40, ou um complemento dela, e um veículo farmaceuticamente aceitável é uma modalidade da presente invenção. Em uma modalidade, o RNA de interfe- rência é isolado. O termo "isolado" significa que o RNA de interferência é livre de seu meio natural total.

Outra modalidade da invenção é uma composição compreen- dendo uma molécula de siRNA de filamento duplo que sub-regula expressão de um gene de IGF1R através de interferência de RNA, onde cada filamento da molécula de siRNA é independentemente cerca de 19 a cerca de 27 nu- cleotídeos de comprimento; e um filamento da molécula de siRNA compre- ende uma seqüência de nucleotídeo que tem complementaridade substanci- al com um mRNA correspondendo ao gene de IGF1R, respectivamente, de modo que a molécula de siRNA direciona a clivagem do mRNA através de interferência com RNA.

A presente invenção provê uma vantagem sobre os inibidores de molécula pequena de IGF-1R uma vez que um efeito colateral indesejável de terapias de molécula pequena atuais, por exemplo, falta de especificidade, pode ser superado.

Uso de qualquer uma das modalidades conforme aqui descrito na preparação de um medicamento para atenuação da expressão de mRNA de IGF1R é também uma modalidade da presente invenção.

Breve Descrição do Desenho

Para que a maneira na qual os aperfeiçoamentos e objetos da invenção acima mencionados e outros seja obtida, uma descrição mais par- ticular da invenção rapidamente acima descrita será feita a título de referên- cias às suas modalidades específicas, que são ilustradas, nos desenhos a- pensos. Compreendendo que esses desenhos mostram apenas modalida- des típicas da invenção e não devem então ser considerados Iimitantes de seu escopo, a invenção será descrita com especificidade e detalhes adicio- nais através do uso de desenhos acompanhantes onde:

A figura provê um western blot de IGF-IRp de células HeLa transfectadas com siRNAs de IGF1R no. 6, no. 8, no. 17 e n.18 e um siRNA de controle livre de RISC, cada um a 10 nM, 1 nM e 0,1 nM; um siRNA con- trole não-direcionado (NTC2) a 10 nM: e um controle tampão (-siRNA). As setas indicam as posições do precursor de IgF-IR de 97 kDa, IGF-1R de 200 kDa e faixas de actina de 42 kDa.

Descrição Detalhada da Invenção

Os detalhes mostrados aqui são a título de exemplo e para pro- pósitos de discussão ilustrativa das modalidades preferidas da presente in- venção apenas e são apresentados por motivo de provisão do que é acredi- tado ser a descrição mais útil e prontamente compreendida dos princípios e aspectos conceituais de várias modalidades da invenção. Com relação a isso, nenhuma tentativa é feita de mostrar detalhes estruturais da invenção em mais detalhe do que é necessário para a compreensão fundamental da invenção, a descrição tomada com os desenhos e/ou exemplos tornando aparente àqueles versados na técnica como as várias formas da invenção podem ser concretizadas na prática.

As definições e explicações que seguem têm o propósito de e pretendem ser dominantes em qualquer construção futura a menos que cla- ramente e inequivocadamente modificadas nos exemplos que seguem ou quando aplicação do significado tornar qualquer construção sem significado ou essencialmente sem significado. Em casos onde a construção do termo o tornaria sem significado ou essencialmente sem significado, a definição deve ser obtida do Webster's Dictionary, 3- Edição.

Conforme aqui usado, todas as porcentagens são porcentagens em peso, a menos que de outro modo declarado.

Conforme aqui usado, um "fluido" é uma substância amorfa, con- tínua, cujas moléculas se movem livremente uma pelas outras e que tem a tendência em assumir o formato de seu recipiente, por exemplo, um líquido ou gás.

Conforme aqui usado, o termo "provedor de cuidado da saúde" é conhecido na técnica e especificamente inclui um médico, uma pessoa com autoridade para prescrever uma medicação (seja diretamente ou indireta- mente) e um veterinário. Em certas modalidades, um provedor de cuidado da saúde inclui um indivíduo que provê uma medicação com prescrição, tal como na provisão de uma medicação de venda livre.

Conforme aqui usado, os termos "identificação de indivíduos" e "diagnóstico" são usados intercomutavelmente com relação à detecção de uma "predisposição", "propensão grande", "risco", "risco alto" e similar.

Conforme aqui usado, o termo "outra doença retinal ou do nervo óptico" significa e refere-se a pelo menos uma de degeneração macular re- lacionada com a idade, catarata, neuropatia óptica isquêmica aguda (AION), commotio retinae, descolamento retinal, rasgamento ou furos retinais, reti- nopatia diabética e retinopatia iatrogênica e outras retinopatias isquêmicas ou neuropatias ópticas, miopia, retinite pigmentosa e/ou similar.

Interferência de RNA (RNAi) é um processo através do qual RNA de filamento duplo (dsRNA) é usado para silenciar expressão de gene. Embora não desejando ser limitado pela teoria, RNAi começa com a cliva- gem de dsRNAs mais longos em RNAs de interferência pequenos (siRNAs) por uma enzima tipo RNase-lll, dicer. siRNAs e dsRNAs que são geralmente de 19 a 28 nucleotídeos, ou 20 a 25 nucleotídeos, ou 21 a 22 nucleotídeos de comprimento e freqüentemente contêm ressaltos 3' de 2 nucleotídeos e terminais 5' fosfato e 3' hidroxila. Um filamento do siRNA é incorporado a um complexo de ribonucleoproteína conhecido como o complexo de silencia- mento induzido por RNA (RISC). RISC usa este filamento de siRNA para identificar moléculas de mRNA que são pelo menos parcialmente comple- mentares ao filamento de siRNA incorporado, e então cliva esses mRNAs alvo ou inibe sua tradução. Então, o filamento de siRNA que é incorporado ao RISC é conhecido como o filamento guia ou o filamento de anti-sentido. O outro filamento de siRNA, conhecido como o filamento passageiro e ou fila- mento de sentido, é eliminado do siRNA e é pelo menos parcialmente homó- logo ao mRNA alvo. Aqueles de versados na técnica vão reconhecer que, a princípio, qualquer filamento de siRNA pode ser incorporado a RISC e fun- cionar como um filamento guia. No entanto, criação de siRNA (por exemplo, estabilidade de dúplex de siRNA diminuída na extremidade 5' do filamento de anti-sentido) pode favorecer incorporação do filamento de anti-sentido a RISC.

Clivagem mediada por RISC de mRNAs tendo uma seqüência pelo menos parcialmente complementar ao filamento guia leva a uma dimi- nuição do nível de estado uniforme daquele mRNA e da proteína correspon- dente codificada por este mRNA. Alternativamente, RISC pode também di- minuir a expressão da proteína correspondente através da repressão da tra- dução sem clivagem do mRNA alvo. Outras moléculas de RNA e moléculas do tipo RNA podem também interagir com RISC e silenciar expressão de gene. Exemplos de outras moléculas de RNA que podem interagir com RISC incluem grampos curtos de RNAs (shRNAs), siRNAs de filamento simples, microRNAs (miRNAs) e dúplices de 27 meros de subtraio de dicer. O termo "siRNA" conforme aqui usado refere-se a um RNA de interferência de fila- mento duplo a menos que de outro modo mencionado. Exemplos de molécu- las do tipo RNA que podem interagir com RISC incluem moléculas de RNA contendo um ou mais nucleotídeos quimicamente modificados, um ou mais desoxirribonucleotídeos e/ou uma ou mais ligações fosfodiéster. Para propó- sitos da presente discussão, todas as moléculas de RNA ou tipo RNA que podem interagir com RISC e participar nas mudanças mediadas por RISC na expressão do gene serão referidas como "RNAs de interferência". siRNAs, shRNAs, miRNAs e dúplices de 27 meros de substrato de dicer são, então, subconjuntos de "RNAs de interferência".

RNA de interferência de modalidades da invenção parece agir de uma maneira catalítica para clivagem de mRNA alvo, isto é, RNA de inter- ferência é capaz de realizar inibição de mRNA alvo em quantidades estequi- ométricas. Conforme comparado com terapias anti-sentido, RNA significan- temente menos interferente é requerido para prover um efeito terapêutico sob tais condições de clivagem.

A presente invenção refere-se ao uso de RNA de interferência para inibir a expressão de mRNA de receptor de fator-1 de crescimento do tipo insulina (IGF-1R), então interferência com ligação de Iigante e interfe- rência com proliferação e angiogênese subseqüentes. De acordo com a pre- sente invenção, RNAs de interferência providos exogenamente ou expressos endogenamente afetam silenciamento de expressão de IGF1R em tecidos oculares.

Seqüências de ácido nucléico citadas aqui são escritas em uma direção 5' a 3' a menos que de outro modo indicado. O termo "ácido nucléi- co", conforme aqui usado, refere-se a ou DNA ou RNA ou uma forma modifi- cada dele compreendendo as bases purina ou pirimidina presentes em DNA (adenina "A", citosina "C", guanina "G", timina "T") ou em RNA (adenina "A", citosina "C", guanina "G", uracila "U"). RNAs de interferência providos aqui podem compreender bases "T", particularmente nas extremidades 3', embo- ra bases "T" não ocorram naturalmente em RNA. "Ácido nucléico" inclui os termos "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" e pode se referir a uma molé- cula de filamento simples ou uma molécula de filamento duplo. Uma molécu- la de filamento duplo é formada através de emparelhamento de base Wat- son-Crick entre bases A e T, bases C e G e entre bases A e U. Os filamen- tos de uma molécula de filamento duplo podem ter complementaridade par- cial, substancial ou integral uns com os outros e vão formar um híbrido dú- plex, cuja resistência de ligação é dependente da natureza e grau de com- plementaridade da seqüência de bases.

Uma seqüência de mRNA é prontamente deduzida da seqüência da seqüência de DNA correspondente. Por exemplo, SEQ ID NO:1 provê a seqüência de filamento de sentido de DNA correspondendo a mRNA para IGF1R. A seqüência de mRNA é idêntica à seqüência de filamento de senti- do de DNA com as bases "T" substituídas com bases "U". Deste modo, a seqüência de mRNA de IGF1R é conhecida da SEQ ID NO:1.

mRNA de Receptor de Fator-1 de Crescimento do Tipo Insulina (IGF1R): IGF-1R é um membro da família de receptor de tirosina cinase. Cli- vagem proteolítica do precursor de IGF-1R gera a subunidade α de ligação de ligante, extracelular, e a subunidade β de transmembrana, que contém o domínio tirosina cinase intracelular. IGF-1R compreende duas subunidades α e duas β ligadas por ligações dissulfeto. Ligação de ligante dispara prolife- ração de promoção de autotransfosforilação e sobrevivência celular.

As atividades biológicas de fator-1 de crescimento de insulina são mediadas por IGF-1R. Um aumento em IGF-1 foi observado em fluidos oculares e tecidos de pacientes com retinopatia diabética avançada. Vários fatores de crescimento pró-angiogênicos incluindo fator-1 de crescimento do tipo insulina foram encontrados em tecidos e fluidos de pacientes com angi- ogênese ocular. Pacientes tratados subcutaneamente com octreotídeo, um análogo de somatostatina que inibe o eixo GH/IGF1, mostram melhora empí- rica em DME e PDR. No modelo de OIR de camundongo, tratamento com um inibidor de GH ou um antagonista de IGF-1 R diminui significativamente neovascularização retinal. IGF-1 estimula produção endotelial retinal de fator de crescimento endotelial vascular in vitro. Em um modelo diabético de ca- mundongo, terapia com IGF-1 mediada por plasmídeo reverteu angiogênese e fluxo arterial aumentados diabéticos. Deste modo, inibição de expressão de IGF-1 R é provida aqui para tratamento de angiogênese ocular incluindo atividade celular pré-angiogênica e angiogênica.

O banco de dados GenBank do National Center for Biotechno- Iogy Information em ncbi.nlm.nih.gov provê a seqüência de DNA para IGF1R como no. de acesso NM-000875, provido na "Listagem de Seqüência" como SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:1 provê a seqüência de filamento de sentido de DNA que corresponde ao mRNA codificando IGF1R (com a exceção de ba- ses "T" para bases "U"). A seqüência de codificação para IGF1R é dos nu- cleotídeos 46-4149.

Equivalentes da seqüência de mRNA de IGF1R acima citada são formas unidas alternativas, formas alélicas, isozimas ou um seu cogna- to. Um cognato é um mRNA de IGF1R de outra espécie de mamífero que é homólogo à SEQ ID NO:1 (um ortólogo).

Atenuação da expressão de um mRNA: A expressão, "atenua- ção da expressão de um mRNA", conforme aqui usado, significa administra- ção ou expressão de uma quantidade de RNA de interferência (por exemplo, um siRNA) para redução da tradução do mRNA alvo em proteína, ou através de clivagem de mRNA ou através de inibição direta da tradução. A redução na expressão do mRNA alvo ou da proteína correspondente é geralmente referida como "inativação" e é relatada com relação aos níveis presentes seguindo administração ou expressão de um RNA controle não-alvo (por exemplo, um siRNA controle não-alvo). Inativação de expressão de uma quantidade incluindo e entre 50% e 100% é compreendida pelas modalida- des aqui. No entanto, não é necessário que tais níveis de inativação sejam atingidos para propósitos da presente invenção. Em uma modalidade, um RNA de interferência único se direcionando a IGF1R é administrado para diminuir a produção de IGF1R, deste modo inibindo o curso de sinalização de IGF1R. Em outras modalidades, dois ou mais RNAs de interferência se direcionando a mRNA de IGF1R são administrados para diminuir expressão. Em ainda outras modalidades, um primeiro RNA de interferência se direcio- nando a mRNA de IGF1R e um segundo RNA de interferência se direcio- nando a outro mRNA de receptor de tirosina cinase são administrados para realizar uma diminuição de atividade celular pré-angiogênica e angiogênica ocular.

Inativação é geralmente avaliada medindo os níveis de mRNA usando amplificação de reação de cadeia de polimerase quantitativa (qPCR) ou medindo os níveis de proteína através de western blot ou ensaio imuno- absorvente ligado à enzima (ELISA). Análise do nível de proteína provê uma avaliação de ambos clivagem de mRNA bem como inibição de tradução. Técnicas adicionais para medição de inativação incluem hibridização de so- lução de RNA, proteção de nuclease, hibridização northem, monitoramento de expressão de gene com um microarranjo, ligação de anticorpo, radioimu- noensaio e análise celular ativada por fluorescência.

Inibição de alvos citados aqui é também inferida em um ser hu- mano ou mamífero através da observação de uma melhora em um sintoma de angiogênese ocular tal como melhora em edema retinal, retinopatia dia- bética, isquemia retinal ou neovascularização do segmento posterior (PSNV), por exemplo.

RNA de interferência: Em uma modalidade da invenção, RNA de interferência (por exemplo, siRNA) tem um filamento de sentido e um de an- ti-sentido, e os filamentos de sentido e anti-sentido compreendem uma regi- ão de complementaridade pelo menos quase perfeita contígua de pelo me- nos 19 nucleotídeos. Em uma modalidade adicional da invenção, RNA de interferência (por exemplo, siRNA) tem um filamento de sentido e um fila- mento de anti-sentido, e o filamento de anti-sentido compreende uma região de complementaridade pelo menos quase perfeita contígua de pelo menos 19 nucleotídeos para seqüência alvo de mRNA de IGF1R, e o filamento de sentido compreende uma região de identidade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com uma seqüência alvo de mRNA de IGF1R, respectivamente. Em uma modalidade adicional da invenção, o RNA de interferência compreende uma região de pelo menos 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 nucleotídeos contíguos tendo porcentagens de complementaridade de seqüência para, ou tendo porcentagens de identidade de seqüência com, os penúltimos 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 nucleotídeos, respectivamente, da extremidade 3' de um mRNA correspondendo à seqüência alvo correspon- dente dentro de um mRNA.

O comprimento de cada filamento do RNA de interferência com- preende 19 a 49 nucleotídeos e pode compreender um comprimento de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ou 49 nucleotídeos.

O filamento de anti-sentido de um siRNA é o agente guia ativo do siRNA pelo fato de que o filamento de anti-sentido é incorporado a RISC, deste modo permitindo que RISC identifique mRNAs alvo com complementa- ridade pelo menos parcial com o siRNA de anti-sentido para repressão de clivagem ou tradução.

Em modalidades da presente invenção, seqüências alvo de RNA de interferência (por exemplo, seqüências alvo de siRNA ) dentro de uma seqüência de mRNA alvo são selecionadas usando ferramentas de design disponíveis. RNAs de interferência correspondendo a uma seqüência alvo de IGF1R são então testados através da transfecção de células expressando o mRNA alvo seguido por avaliação de inativação conforme acima descrito.

Técnicas para seleção de seqüências alvo para siRNAs são pro- vidas por Tuschl, T. e outros, "The siRNA User Guide", revisado em 6 de maio de 2004, disponível no Rockfeller University web site; por Technical Bulletin No. 506, "siRNA Design Guidelines", Ambion Inc., no web site da Ambion; e por outras ferramentas de design baseadas na web na, por e- xemplo, Invitrogen, Dharmacon, Integrated DNA Technologies, Genscript, ou Proligo web sites. Parâmetros de pesquisa iniciais podem incluir teores G/C entre 35% e 55% e comprimentos de siRNA entre 19 e 27 nucleotídeos. A seqüência alvo pode estar localizada na região de codificação ou nas regi- ões 5' ou 3' não-traduzidas do mRNA.

Uma modalidade de uma seqüência alvo de DNA de 19 nucleo- tídeos para mRNA de IGF1R esta presente nos nucleotídeos 401 a 419 da SEQ ID NO:1:

5*- fCffO^iS^iCI -3' : SEG IP W>t2.

Um siRNA da invenção para direcionamento a uma seqüência de mRNA correspondente de SEQ ID NO:2 e tendo filamentos de 21 nucleo- tídeos e um ressalto 3' de 2 nucleotídeos é:

Sf- UCUÜTCAGMKSAOCAAtJGüHN-3' SEQ ZP IfOtS

3' sm. I» ΪΪΟί4>

Cada resíduo "N" pode ser qualquer nucleotídeo (A, C, G, U1 T) ou nucleotídeo modificado. A extremidade 3' pode ter um número de resí- duos "N" entre e incluindo 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Os resíduos "N" em qualquer fi- lamento podem ser o mesmo resíduo (por exemplo, UU, AA, CC, GG ou TT) ou eles podem ser diferentes (por exemplo, AC, AG, AU, CA, CG, CU, GA, GC, GU, UA, UC ou UG). Os ressaltos 3' podem ser iguais ou eles podem ser diferentes. Em uma modalidade, ambos filamentos têm um ressalto 3'UU.

Um siRNA da invenção para direcionamento de uma seqüência de mRNA correspondente de SEQ ID N0:2 e tendo filamentos de 21 nucleo- tídeos e um ressalto 3'UU em cada filamento é:

5'-

O RNA de interferência pode também ter um ressalto 5' de nu- 10 cleotídeos ou ele pode ter extremidades cegas. Um siRNA da invenção para direcionamento a uma seqüência de mRNA correspondente de SEQ ID N0:2 e tendo filamentos de 19 nucleotídeos e extremidades cegas é:

5' - UCUUCGAGAUGACCAAUCU -3' SEQ ID NO:41 3' - AGAAGCUCUACUGGUUAGA -5' SEQ ID NO:42.

Os filamentos de um RNA de interferência de filamento duplo (por exemplo, um siRNA) podem ser conectados para formar uma estrutura 15 grampos ou pares de base intramolecular (por exemplo, um shRNA). Um shRNA da invenção se direcionando a uma seqüência de mRNA correspon- dente de SEQ ID N0:1 e tendo uma região de origem (stem regiorí) de fila- mento duplo de 19 pb e um ressalto 3'UU é:

<formula>formula see original document page 18</formula>

N é um nucleotídeo, A, T, C, G, U ou uma forma modificada co- nhecida de um versado na técnica. O número de nucleotídeos N na alça é um número entre e incluindo 3a23ou5a15ou7a13ou4a9ou9a11 ou o número de nucleotídeos N é 9. Alguns dos nucleotídeos na alça pode estar envolvidos em interações de par de base com outros nucleotídeos na alça. Exemplos de seqüências de nucleotídeo que podem ser usados para formar a alça incluem 5'-UUCAAGAGA-3' (Brummelkamp, T.R. e outros, (2002) Science 296:550) e 5'-UUUGUGUAG-3' (Castanotto, D. e outros, (2002) RNA 8:1454). Será reconhecido por um versado na técnica que o oli- gonucleotídeo de cadeia simples resultante forma uma estrutura de pares de base intramolecular ou grampo compreendendo uma região de filamento duplo capaz de interagir com o mecanismo de RNAi.

A seqüência alvo de siRNA identificada acima pode ser estendi- da na extremidade 3' para facilitar a criação de dúplices de 27-meros de substrato de dicer. Extensão da seqüência de DNA alvo de DNA de 19 nu- cleotídeos (SEQ ID NO:2) identificada na seqüência de DNA de IGF1R (SEQ ID NO:1) em 6 nucleotídeos dá uma seqüência alvo de DNA de 25 nucleotí- deos presente nos nucleotídeos 401 a 425 da SEQ ID NO:1.

5'- TCTTCGAGATGACCAATCTCAAGGAA -3' SEQ ID NO:43.

Um dúplex de 27 mer de substrato de dicer da invenção para direcionamento a uma seqüência de mRNA correspondente de SEQ ID NO:43 é:

5' -UCUUCGAGAUGACCAAUCUCAAGGA -3' SEQ ID NO: 44 3' -UUAGAAGCUCUACUGGUUAGAGUUCCU -5' SEQ ID NO: 45.

Os dois nucleotídeos da extremidade 3' do filamento de sentido (isto é, os nucleotídeos GA da SEQ ID NO:44) podem ser desoxinucleotí- deos para processamento aumentado. Criação de dúplices de 27 meros de substrato de dicer a partir de seqüências alvo de 19-21 nucleotídeos, tal co- mo provido aqui, é discutida mais pelo Integrated DNA Technologies (IDT) website e por Kim, D.H. e outros (Fevereiro, 2005) Nature Biotechnology 23:2; 222-226.

Quando RNAs de interferência são produzidos através de sínte- se química, fosforilação na posição 5' do nucleotídeo na extremidade 5' de um ou ambos filamentos (quando presente) pode aumentar a eficácia do siRNA e especificidade do complexo RISC ligado mas não é requerida uma vez que a fosforilação pode acontecer intracelularmente.

A Tabela 1 lista exemplos de seqüências alvo de DNA de IGF1R de SEQ ID NO:1 a partir das quais siRNAs da presente invenção são criados de uma maneira conforme acima descrito. IGF1R codifica receptor de fator-1 de crescimento do tipo insulina, conforme acima mencionado. Tabela 1. Seqüências Alvo de 1GF1R para siRNAs

<table>table see original document page 20</column></row><table> <table>table see original document page 21</column></row><table>

Conforme mencionado nos exemplos acima, um versado na téc- nica é capaz de usar a informação de seqüência alvo provida na Tabela 1 para criar RNAs de interferência tendo um comprimento menor ou maior do que as seqüências providas na tabela e se referindo à posição de seqüência na SEQ ID NO:1 e adicionando ou deletando nucleotídeos complementares ou quase complementares à SEQ ID N0:1.

A reação de clivagem de RNA alvo guiada pelos siRNAs e ou- tras formas de RNA de interferência é altamente específica de seqüência. Em geral, siRNA contendo um filamento de nucleotídeo de sentido idêntico em seqüência a uma porção do mRNA alvo e um filamento de nucleotídeo de anti-sentido exatamente complementar a uma porção do mRNA alvo são modalidades de siRNA para inibição de mRNAs citada aqui. No entanto, 100% de complementaridade de seqüência entre o filamento de siRNA de anti-sentido e o mRNA alvo, ou entre o filamento de siRNA de anti-sentido e o filamento de siRNA de sentido, não é requerida para praticar a presente invenção. Então, por exemplo, a invenção permite variações de seqüência que poderiam ser esperadas devido à mutação genética, polimorfismo de filamento ou divergência evolucionária.

Em uma modalidade da invenção, o filamento de anti-sentido do siRNA tem complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com o mRNA alvo. "Quase perfeita", conforme aqui usado, significa que o filamento de anti-sentido do siRNA é "substancialmen- te complementar a" e o filamento de sentido do siRNA é "substancialmente idêntico a" pelo menos uma porção do mRNA alvo. "Identidade", conforme conhecido por uma pessoa versada na técnica, é o grau de relacionamento de seqüência entre seqüências de nucleotídeo conforme determinado atra- vés de combinação da ordem e identidade de nucleotídeos entre as seqüên- cias. Em uma modalidade, o filamento de anti-sentido de um siRNA tendo 80% e entre 80% até 100% de complementaridade, por exemplo, 85%, 90% ou 95% de complementaridade, com a seqüência de mRNA alvo é conside- rado de complementaridade quase perfeita e pode ser usado na presente invenção/Complementaridade contígua "perfeita" é emparelhamento de ba- se Watson-Crick padrão de pares de base adjacentes. Complementaridade contígua "pelo menos quase perfeita" inclui complementaridade "perfeita" conforme usado aqui. Métodos de computador para determinação da identi- dade ou complementaridade são criados para identificar o mais alto grau de combinação das seqüências de nucleotídeos, por exemplo, BLASTN (Alts- chul, S.F. e outros, (1990) J. Moi Biol., 215:403-410).

O termo "identidade percentual" descreve a porcentagem de nu- cleotídeos contíguos em uma primeira molécula de ácido nucléico que é i- gual a uma em um conjunto de nucleotídeos contíguos do mesmo compri- mento em uma segunda molécula de ácido nucléico. O termo "complementa- ridade percentual" descreve a porcentagem de nucleotídeos contíguos em uma primeira molécula de ácido nucléico que pode ser de par de base no sentido Watson-Crick com um conjunto de nucleotídeos contíguos em uma segunda molécula de ácido nucléico.

A relação entre um mRNA alvo (filamento de sentido) e um fila- mento de um siRNA (o filamento de sentido) é aquela de identidade. O fila- mento de sentido de um sRNA é também chamado um filamento passageiro, se presente. A relação entre um mRNA alvo (filamento de sentido) e o outro filamento de um siRNA (o filamento de anti-sentido) é aquela de complemen- taridade. O filamento de anti-sentido de um siRNA é também chamado um filamento guia.

A penúltima base em uma seqüência de ácido nucléico que é escrita em uma direção 5' a 3' é a próxima para a última base, isto é, a pró- xima base para a base 3'. As 13 penúltimas bases de uma seqüência de á- cido nucléico escrita em uma direção 5' a 3' são pelo menos 13 bases de uma seqüência próxima à base 3' e não incluindo a base 3'. Similarmente, as penúltimas 14, 15, 16, 17 ou 18 bases de uma seqüência de ácido nucléico escritas em uma direção 5' a 3' são as pelo menos 14, 15, 16, 17 ou 18 ba- ses de uma seqüência, respectivamente, próximo à base 3' e não incluindo a base 3'.

A frase "uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo méríos~ 90% de complementaridade de seqüência com, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os penúltimos 13 nucleotídeos da extremidade 3' de um mRNA correspondendo a qualquer um de (um i- dentificador de seqüência)" permite uma substituição de nucleotídeo. Duas substituições de nucleotídeo (isto é, 11/13 = 85% de identida- de/complementaridade) não são incluídas em tal frase.

Em uma modalidade da invenção, a região de nucleotídeos con- tíguos é uma região de pelo menos 14 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 85% de complementaridade de seqüência com, ou pelo menos 85% de identidade de seqüência com, os penúltimos 14 nucleotídeos da extremi- dade 3' de um mRNA correspondendo à seqüência identificada por cada i- dentificador de seqüência. Duas substituições de nucleotídeo (isto é, 12/14 = 86% de identidade/complementaridade) são incluídas em tal frase.

Em uma modalidade adicional da invenção, a região de nucleo- tídeos contíguos é uma região de pelo menos 15, 16, 17 ou 18 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 80% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 80% de identidade de seqüência com, os penúltimos 14 nu- cleotídeos da extremidade 3' de um mRNA correspondendo à seqüência do identificador de seqüência. Três substituições de nucleotídeo são incluídas em tal frase.

A seqüência alvo nos mRNAs correspondendo à SEQ ID NO:1 pode estar nas regiões não traduzidas 5' ou 3' do mRNA bem como na regi- ão de codificação do mRNA. Um ou ambos filamentos do RNA de interferência de filamento duplo podem ter um ressalto 3' de a partir de 1 a 6 nucleotídeos, que podem ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma mistura deles. Os nucleotídeos do ressalto não são emparelhados com base. Em uma modali- dade da invenção, o RNA de interferência compreende um ressalto 3' de TT ou UU. Em outra modalidade da invenção, o RNA de interferência compre- ende pelo menos uma extremidade cega. Os terminais geralmente têm um grupo 5' fosfato ou um grupo 3' hidroxila. Em outras modalidades, o filamen- to de anti-sentido tem um grupo 5' fosfato, e o filamento de sentido tem um grupo 5' hidroxila. Em ainda outras modalidades, os terminais são modifica- dos mais através da adição covalente de outras moléculas ou grupos funcio- nais.

Os filamentos de sentido e anti-sentido do siRNA de filamento duplo podem estar em uma formação dúplex de dois filamentos simples con- forme acima descrito ou podem ser uma molécula simples onde as regiões de complementaridade são emparelhadas com base e são covalentemente ligadas por uma alça grampo de modo a formar um filamento simples. Acre- dita-se que o grampo seja clivado intracelularmente por uma proteína cha- mada dicer para formar um RNA de interferência de duas moléculas de RNA emparelhadas com base individuais.

RNAs de interferência podem diferir de RNA de ocorrência natu- ral através da adição, deleção, substituição ou modificação de um ou mais nucleotídeos. Material de não-nucleotídeo pode ser ligado ao RNA de inter- ferência ou na extremidade 5', na extremidade 3' ou internamente. Tais mo- dificações são geralmente criadas para aumentar a resistência à nuclease dos RNAs de interferência, para melhorar a absorção celular, para aumentar o direcionamento celular, para auxiliar no rastreamento de RNA de interfe- rência, para melhorar mais a estabilidade ou para reduzir o potencial para ativação do curso de interferon. Por exemplo, RNAs de interferência podem compreender um nucleotídeo purina nas extremidades dos ressaltos. Conju- gação de colesterol a extremidade 3' do filamento de sentido de uma molé- cula de siRNA por meio de um Iigante pirrolidina, por exemplo, também pro- vê estabilidade a um siRNA.

Modificações adicionais incluem uma molécula de biotina termi- nal 3', um peptídeo conhecido ter propriedades de penetração de célula, uma nanopartícula, um peptidomimético, um corante fluorescente ou um dendrímero, por exemplo.

Nucleotídeos podem ser modificados em sua porção de base, em sua porção açúcar ou na porção fosfato da molécula e função em moda- lidades da presente invenção. Modificações incluem substituições com gru- pos alquila, alcóxi, amino, deaza, halo, hidroxila, tiol, ou uma combinação deles, por exemplo. Nucleotídeos podem ser substituídos com análogos com maior estabilidade tal como substituição de um ribonucleotídeo com um de- soxirribonucleotídeo, ou tendo modificações de açúcar tal como grupos OH 2' substituídos por grupos amino 2', grupos O-metila 2', grupos metoxietila 2' ou uma ponte -0,4'-C metileno 2', por exemplo. Exemplos de análogo de purina ou pirimidina de nucleotídeos incluem uma xantina, uma hipoxantina, uma azapurina, uma metiltioadenina, 7-deaza-adenosina e nucleotídeos mo- dificados com O- e N-. O grupo fosfato do nucleotídeo pode ser modificado substituindo um ou mais dos oxigênios do grupo fosfato com nitrogênio ou com enxofre (fosforotioatos). Modificações são úteis, por exemplo, para au- mentar a função, melhorar a estabilidade ou permeabilidade ou direcionar localização ou direcionamento.

Pode haver uma região ou regiões do filamento de RNA de inter- ferência de anti-sentido que não é (são) complementares a uma porção da SEQ ID N0:1. Regiões não-complementares podem estar na extremidade 3', 5' ou ambas de uma região complementar ou entre duas regiões comple- mentares.

RNAs de interferência podem ser gerados exogenamente atra- vés de síntese química, através de transcrição in vitro ou através de cliva- gem de RNA de filamento duplo mais longo com dicer ou outra nuclease a- propriada com atividade similar. RNAs de interferência quimicamente sinteti- zados, produzidos a partir de ribunucleosídeo fosforamiditas protegidas u- sando um sintetizador de DNA/RNA convencional, podem ser obtidos de fornecedores comerciais tal como Ambion Inc. (Austin, TX), Invitrogen (Car- Isbad, CA) ou Dharmacon (Lafayette, CO). RNAs de interferência são purifi- cados através de extração com um solvente ou resina, precipitação, eletrofo- rese, cromatografia, ou suas combinações, por exemplo. Alternativamente, RNA de interferência pode ser usado com pouca se alguma purificação para evitar perdas devido a processamento da amostra.

RNAs de interferência podem ser também expressos endoge- namente a partir de plasmídeo ou vetores de expressão viral ou a partir de cassetes de expressão mínimos, por exemplo, fragmentos gerados por PCR compreendendo um ou mais promotores e um molde ou moldes apropriados para RNA de interferência. Exemplos de vetores de expressão baseados em plasmídeo comercialmente disponíveis para shRNA incluem membros das séries pSilencer (Ambion, Austin, TX) e pCpG-siRNA (InvivoGen, São Diego, CA). Vetores virais para expressão de RNA de interferência podem ser deri- vados de uma variedade de vírus incluindo adenovírus, vírus adeno- associado, lentivírus (por exemplo, HIV, FIV e EIAV) e herpes vírus. Exem- plos de vetores virais comercialmente disponíveis para expressão de shRNA incluem pSilencer adeno (Ambion, Austin, TX) e pLenti6/BL0CK-iT® DEST (Invitrogen, Carlsbad, CA). Seleção de vetores virais, métodos para expres- são do RNA de interferência a partir do vetor e métodos de aplicação do ve- tor viral estão dentro da habilidade comum de um versado na técnica. E- xemplos de estojos para produção de cassetes de expressão de shRNA ge- rado por PCR incluem Silencer Express (Ambion, Austin, TX) e siXpress (Mi- rus, Madison, WI). Um primeiro RNA de interferência pode ser administrado através de expressão in vivo a partir de um primeiro vetor de expressão ca- paz de expressar o primeiro RNA de interferência e um segundo RNA de interferência pode ser administrado através de expressão in vivo a partir de um segundo vetor de expressão capaz de expressar o segundo RNA de in- terferência, ou ambos RNAs de interferência podem ser administrados atra- vés de expressão in vivo a partir de um único vetor de expressão capaz de expressão de ambos RNAs de interferência.

RNAs de interferência podem ser expressos a partir de uma va- riedade de promotores eucarióticos conhecidos daqueles versados na técni- ca, incluindo promotores da pol III, tal como os promotores U6 ou H1, ou promotores da pol II, tal como o promotor de citomegalovírus. Aqueles ver- sados na técnica vão reconhecer que esses promotores podem também se adaptar para permitir expressão induzível do RNA de interferência.

Hibridização sob Condições Fisiológicas: Em certas modalidades da presente invenção, um filamento de anti-sentido de um RNA de interfe- rência hibridiza com um mRNA in vivo como parte do complexo RISC.

"Hibridização" refere-se a um processo onde ácidos nucléicos de filamento único com seqüências de base complementares ou quase com- plementares interagem para formar complexos ligados a hidrogênio chama- dos híbridos. Reações de hibridização são sensíveis e seletivas. In vitro, a especificidade de hibridização (isto é, estringência) é controlada pelas con- centrações de sal ou formamida nas soluções de pré-hibridização e hibridi- zação, por exemplo, e pela temperatura de hibridização; tal como procedi- mentos que são bem-conhecidos na técnica. Em particular, estringência é aumentada reduzindo a concentração de sal, aumentando a concentração de formamida ou aumentando a temperatura de hibridização.

Por exemplo, condições de alta estringência poderiam acontecer em cerca de 50% de formamida a 37°C a 42°C. Condições de estringência reduzida poderiam acontecer em cerca de 35% a 25% de formamida a 30°C a 359 C. Exemplos de condições de estringência para hibridização são pro- vidos em Sambrook, J., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Exemplos adicio- nais de condições de hibridização estringentes incluem NaCI a 400 mM, Pl- PES a 40 mM, pH 6,4, EDTA a 1 mM, 50°C ou 70°C por 12-16 horas segui- do por lavagem ou hibridização a 70°C em 1XSSC ou 509°C em 1XSSC1 50% de formamida seguido por lavagem a 70°C em 0.3XSSC ou hibridiza- ção a 70°C em 4XSSC ou 50°C em 4XSSC, 50% de formamida seguido por lavagem a 67°C em 1XSSC. A temperatura para hibridização é cerca de 5- 10°C menos do que a temperatura de fusão (Tm) do híbrido onde Tm é de- terminada para híbridos entre 19 e 49 pares de base de comprimento usan- do o cálculo que segue: Tm °C = 81,5 + 16,6(log10[Na+]) + 0,41 (% G+C) - (600/N) onde N é o número de bases no híbrido e [Na+] é a concentração de íons de sódio no tampão de hibridização.

O ensaio de hibridização in vitro descrito acima provê um méto- do de previsão de se ligação entre um siRNA candidato e um alvo terá espe- cificidade. No entanto, no contexto do complexo RISC, clivagem específica de um alvo pode também acontecer com um filamento de anti-sentido que não demonstra alta estringência para hibridização in vitro.

RNA de interferência de filamento simples: Conforme acima mencionado, RNAs de interferência por último funcionam como filamentos simples. RNA de interferência de filamento simples (ss) foi verificado realizar silenciamento de mRNA, embora menos eficientemente do que siRNA de filamento duplo. Deste modo, modalidades da presente invenção também provêem administração de um RNA de interferência ss que hibridiza sob condições fisiológicas para uma porção de SEQ ID NO:1 e tem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a porção de hibridização de SEQ ID NO:1. O RNA de interferência ss tem um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos como para o siRNA ds citado acima. O RNA de interferência ss tem um fosfato 5' ou é fosforilado in situ ou in vivo na posição 5'. O termo "fosforilado 5'" é usado para descrever, por exemplo, polinucleotídeos ou oligonucleotídeos tendo um grupo fosfato ligado através de ligação éster à hidroxila C5 do açúcar (por exemplo, ribose, desoxirribose ou um análogo da mesma) na extremi- dade 5' do polinucleotídeo ou oligonucleotídeo.

RNAs de interferência ss são quimicamente sintetizados ou atra- vés de transcrição in vitro ou expressos endogenamente a partir de vetores ou cassetes de expressão como para RNAs de interferência ds. Grupos fos- fato 5' podem ser adicionados através de uma cinase, ou um fosfato 5' pode ser o resultado de clivagem de nuclease de um RNA. Aplicação é como para RNAs de interferência ds. Em uma modalidade, RNAs de interferência ss tendo extremidades protegidas e modificações resistentes à nuclease são administrados para silenciamento. RNAs de interferência ss podem ser se- cos para armazenamento ou dissolvidos em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para inibir anelamento ou para estabilização.

RNA de interferência grampos: Um RNA de interferência gram- pos é uma molécula simples (por exemplo, uma cadeia de oligonucleotídeo simples) que compreende ambos os filamentos de sentido e anti-sentido de um RNA de interferência em uma estrutura de pares de base intramolecular ou grampos (por exemplo, shRNA). Por exemplo, shRNAs podem ser ex- pressos a partir de vetores de DNA onde os oligonucleotídeos de DNA codi- ficando um filamento de RNA de interferência de sentido são ligados aos oligonucleotídeos do DNA codificando o filamento de RNA de interferência de anti-sentido complementar reverso por um espaçador curto. Se necessá- rio para vetor de expressão escolhido, Ts terminais 3' e sítios de restrição de formação de nucleotídeo podem ser adicionados. O transcrito de RNA resul- tante se dobra sobre si mesmo para formar uma estrutura de pares de base intramolecular.

Modo de administração: RNA de interferência pode ser aplicado por meio de aerossol, bucal, dermal, intradermal, inalante, intramuscular, intranasal, intraocular, intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal, nasal, ocular, oral, óptica, parenteral, emplastro, subcutânea, sublingual, tópica ou transdermal, por exemplo.

RNA de interferência pode ser aplicado diretamente ao olho a- través de injeção ao tecido ocular tal como injeções perioculares, conjunti- vais, subtenon, intracamerais, intravitreais, intraoculares, sub-retinais, sub- conjuntivais, retrobulbares ou intracanaliculares; através de aplicação direta ao olho usando um catetér ou outro dispositivo de colocação tal como pélete retinal, inserto intra-ocular, supositório ou um implante compreendendo um material poroso, não-poroso ou gelationoso; através de gotas oculares tópi- cas ou unguentos; ou através de um dispositivo de liberação lenta no cul-de- sac ou implantado adjacente à esclera (transescleral) ou dentro do olho. In- jeção intracameral pode ser através da córnea para a câmara anterior para permitir que o agente atinja a rede trabecular. Injeção intracanalicular pode ser no canal de Schlemm de drenagem de canais coletores venosos ou no canal de Schlemm.

Indivíduo: Um indivíduo com necessidade de tratamento para angiogênese ocuiar ou sob risco de desenvolver angiogênese ocular é um ser humano ou outro mamífero tendo angiogênese ocular ou sob risco de ter angiogênese ocular associada com expressão indesejada ou inapropriada de atividade de IGF-1R conforme aqui citado. Estruturas oculares associa- das com tais distúrbios podem incluir o olho, retina, coróide, cristalino, cór- nea, rede trabecular, íris, nervo óptico, cabeça do nervo óptico, esclera, segmentos anteriores ou posteriores ou corpo ciliar, por exemplo. Um indiví- duo pode ser também uma célula ocular, cultura celular, órgão ou um órgão ou tecido ex vivo.

Formulações e Dosagem: Formulações farmacêuticas compre- endem RNAs dé interferência, ou seus sais, da invenção até 99% em peso misturados com um meio veículo fisiologicamente aceitável tal como água, tampão, solução salina, glicina, ácido hialurônico, manitol e similar.

RNAs de interferência da presente invenção são administrados como soluções, suspensões ou emulsões. O que segue são exemplos de formulações possíveis concretizadas pela presente invenção._

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Em geral, uma quantidade eficaz dos RNAs de interferência de modalidades da invenção resulta em uma concentração extracelular na su- perfície da célula alvo de a partir de 100 pM a 1 μΜ ou de a partir de 1 nM a 100 nM ou de a partir de 5 nM a cerca de 50 nM ou em cerca de 25 nM. A dose requerida para atingir esta concentração local vai variar dependendo de vários fatores incluindo o método de aplicação, o sítio de aplicação, o número de camadas de célula entre o sítio de aplicação e a célula ou tecido alvo, seja a aplicação local ou sistêmica etc. A concentração no sítio de apli- cação pode ser considerada maior do que ela é na superfície da célula ou tecido alvo. Composições tópicas são aplicadas à superfície do órgão alvo uma a quatro vezes por dia ou em um programa de aplicação prolongado tal como diariamente, semanalmente, duas vezes por semana, mensalmente, ou mais longo, de acordo com o critério de rotina de um clínico versado. O pH da formulação é cerca de pH 4-9 ou pH 4,5 ou pH 7,4.

Tratamento terapêutico de pacientes com RNAs de interferência direcionados contra mRNA de IGF1R é esperado ser benéfico em tratamen- tos de molécula pequena através do aumento da duração de ação, deste modo permitindo dosagem menos freqüente e maior obediência do paciente.

Uma quantidade eficaz de uma formulação pode depender de fatores tal como a idade, raça e sexo do indivíduo, da severidade da angio- gênese ocular, da taxa de transcrição de gene alvo/modificação de proteína, da potência do RNA de interferência e da estabilidade do RNA de interferên- cia, por exemplo. Em uma modalidade, o RNA de interferência é aplicado topicamente a um órgão alvo e atinge o tecido contendo mRNA de IGF1R tal como a retina ou cabeça do nervo óptico em uma dose terapêutica deste modo melhorando um processo de doença associado com angiogênese ocu- lar.

Veículos aceitáveis: Um veículo aceitável refere-se àqueles veí- culos que causam no máximo pouca a nenhuma irritação ocular, provê pre- servação adequada se necessário e aplica um ou mais RNAs de interferên- cia da presente invenção em uma dosagem homogênea. Um veículo aceitá- vel para administração de RNA de interferência de modalidades da presente invenção inclui os reagentes de transfecção baseados em lipídeo catiônicos TranslT®-TKO (Mirus Corporation, Madison, Wl), LIPOFECTIN®, Lipofecta- mina, OLIGOFECTAMINE® (Invitrogen, Carlsbad, CA) ou DHARMAFECT® (Dharmacon, Lafayette, CO); policátions tal como polietilenoimina; peptídeos catiônicos tal como Tat, poliarginina ou Penetratin (peptídeo Antp); ou Iipos- somas. Lipossomas são formados de lipídeos de formação de vesícula pa- drão e um esterol, tal como colesterol, e podem incluir uma molécula de di- recionamento tal como um anticorpo monoclonal tendo afinidade de ligação para antígenos de superfície de célula endotelial, por exemplo. Ainda, os lipossomas podem ser Iipossomas PEGuilados.

Os RNAs de interferência podem ser aplicados em solução, em suspensão ou em dispositivos de aplicação bioerosível ou não-bioerosível. Os RNAs de interferência podem ser aplicados sozinhos ou como compo- nentes de conjugados covalentes, definidos. Os RNAs de interferência po- dem também ser complexados com lipídeos catiônicos, peptídeos catiônicos ou polímeros catiônicos; complexados com proteínas, proteínas de fusão ou domínios de proteína com propriedades de ligação de ácido nucléico (por exemplo, protamina); ou encapsulados em nanopartículas ou lipossomas. Aplicação específica de tecido ou célula pode ser realizada através da inclu- são de uma porção de direcionamento apropriada tal como um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

Para aplicação oftálmica, um RNA de interferência pode ser combinado com conservantes, co-solventes, tensoativos, aumentadores de viscosidade, aumentadores de penetração, tampões, cloreto de sódio ou água oftalmologicamente aceitáveis para formar uma suspensão ou solução oftálmica estéril, aquosa. Formulações de solução podem ser preparadas dissolvendo o RNA de interferência em um tampão aquoso isotônico fisiolo- gicamente aceitável. Ainda, a solução pode incluir um tensoativo aceitável para auxiliar na dissolução do inibidor. Agentes de formação de viscosidade, tal como hidroximetil celulose, hidroxietil celulose, metilcelulose, polivinilpir- rolidona ou similar podem ser adicionados às composições da presente in- venção para melhorar a retenção do composto.

A fim de preparar uma formulação de unguento oftálmica estéril, o RNA de interferência é combinado com um conservante em um veículo apropriado, tal como um óleo mineral, Ianolina líquida ou petrolato branco. Formulações em gel oftálmicas estéreis podem ser preparadas suspendendo o RNA de interferência em uma base hidrofílica preparada a partir da combi- nação de, por exemplo, CARBOPOL®-940 (BF Goodrich, Charlotte, NC), ou similar, de acordo com métodos conhecidos na técnica. VISCOAT® (Alcon Laboratories, Inc., Forth Worth, TX) pode ser usado para injeção intra-ocular, por exemplo. Outras composições da presente invenção podem conter agen- tes aumentadores de penetração tal como cremephor e TWEEN® 80 (mono- lauroato de polioxietileno sorbitano, Sigma Aldrich, St. Louis, MO), no caso de RNA de interferência ser de menos penetração no olho.

Estojos: As modalidades da presente invenção provêem um es- tojo que inclui reagentes para atenuação da expressão de um mRNA con- forme citado aqui em uma célula. O estojo contém um vetor de expressão de siRNA ou shRNA. Para vetores de expressão de siRNAs e shRNA não-viral o estojo compreende também um agente de transfecção ou outro veículo de aplicação adequado. Para vetores de expressão de snRNA, o estojo pode conter o vetor viral e/ou os componentes necessários para produção de ve- tor viral (por exemplo, uma linhagem de célula de empacotamento bem co- mo um vetor compreendendo o molde de vetor viral e vetores auxiliares adi- cionais para empacotamento). O estojo pode também conter vetores de ex- pressão de siRNAs ou shRNA controle positivos e negativos (por exemplo, um siRNA controle não-direcionado ou um siRNA que se direciona a um mRNA não-relacionado). O estojo também contém reagentes para avaliação da inativação dó gene alvo pretendido (por exemplo, iniciadores e sondas para PCR quantitativa para detectar o mRNA alvo e/ou anticorpos contra a proteína correspondente para western blots). Alternativamente, o estojo po- de compreender uma seqüência de siRNA ou uma seqüência de shRNA e as instruções e materiais necessários para gerar o siRNA através de trans- crição in vitro ou para construir um vetor de expressão de shRNA.

Uma combinação farmacêutica em forma de estojo é ainda pro- vida, a qual inclui, em combinação empacotada, um meio veículo adaptado para receber um dispositivo recipiente em confinamento íntimo com ele e um primeiro dispositivo recipiente incluindo uma composição de RNA de interfe- rência e um veículo aceitável. Tais estojos podem ainda incluir, se desejado, um ou mais dos vários componentes de estojo farmacêutico convencional, tal como, por exemplo, recipientes com um ou mais veículos farmaceutica- mente aceitáveis, recipientes adicionais etc, como será prontamente aparen- te àqueles versados na técnica. Instruções impressas, ou como bulas ou rótulos, indicando quantidades dos componentes a serem administrados, orientações para administração e/ou orientações para mistura dos compo- nentes, pode ser também incluída no estojo.

A habilidade de RNA de interferência em inativar os níveis de expressão de gene alvo endógeno em, por exemplo, uma linhagem de célula ocular humana é avaliada in vitro como segue. Células humanas transfor- madas são postas em placa 24 horas antes da transfecção em meio de crescimento padrão (por exemplo, DMEM suplementado com soro bovino fetal a 10%). Transfecção é realizada usando Dharmafect 1 (Dharmacon, Lafayette, CO) de acordo com as instruções do fabricante em concentrações de RNA de interferência variando de 0,1 nM - 100 nM. siRNA controle de não-direcionamento e siRNA de Iamin A/C (Dharmacon) são usados como controle. Os níveis de mRNA alvo são avaliados através de qPCR 24 horas pós-transfecção usando, por exemplo, iniciadores avançado e reverso TAQ- MAN® e um conjunto de sonda que compreende o sítio alvo (Applied Biosys- tems, Foster City, CA). Níveis de proteína alvo podem ser avaliados aproxi- madamente 72 horas pós-transfecção (tempo real dependendo da taxa de modificação da proteína) através de "western blot", por exemplo. Técnicas padrão para isolamento de RNA e/ou proteína a partir de células culturadas são bem conhecidas daqueles versados na técnica. Para reduzir a chance de efeitos fora de alvo, não-específicos, a menor concentração possível de RNA de interferência é usada para produzir o nível desejado de inativação na expressão do gene alvo.

A habilidade de RNAs de interferência da presente invenção em inativar níveis de expressão de proteína IGF-1R é exemplificada mais no Exemplo 1 como segue.

Deste modo, é aqui descrito pelo menos: Um método para atenuação da expressão de mRNA de IGF1R em um sistema de expressão, o dito método compreendendo: administração ao dito sistema de expressão de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável; o dito RNA de interferência compreendendo: um filamento de nucleotídeo de sentido, um filamento de nucleotídeo de anti-sentido e uma região de complementarida- de pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos; onde o dito filamento de nucleotídeo de anti-sentido hibridiza sob condições fisiológicas para uma porção de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1 e tem uma re- gião de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a dita porção de hibridização de mRNA corres- pondendo à SEQ ID NO:1, onde a dita expressão de mRNA de IGF1R é ate- nuada então.

Uso de um medicamento para tratamento de angiogênese ocular em um indivíduo com necessidade dele, o dito método compreendendo: ad- ministração a um olho do dito indivíduo de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, o dito RNA de interferência compreendendo: um filamento de nucleotídeo de sentido, um filamento de nucleotídeo de anti-sentido e uma região de complementa- ridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos; onde o dito filamento de nucleotídeo de anti-sentido hibridiza sob condições fisiológicas para uma porção de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1 e tem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a dita porção de hibridização do mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1, onde a dita angiogênese ocular é tratada então.

Um método de atenuação da expressão de mRNA de IGF1R em um sistema de expressão, o dito método compreendendo: administração ao dito sistema de expressão de uma composição compreendendo uma quanti- dade eficaz de RNA de interferência de filamento simples tendo um compri- mento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, onde o dito RNA de interferência de filamento simples hibridiza sob condi- ções fisiológicas para uma porção de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1 compreendendo nucleotídeo 401, 635, 1062, 1548, 1604, 1643, 1766, 1922, 2012, 2069, 2210, 2416, 2423, 2654, 2909, 3339, 3416, 3464, 3476, 3505, 3512, 3871, 3782, 3881, 4064, 4158, 4411, 4487, 4904, 4905, 4909, 3329, 2323 ou 2887, e o dito RNA de interferência tem uma região de com- plementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nu- cleotídeos com a dita porção de hibridização de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1, onde a dita expressão de mRNA de IGF1R é então atenuada. Um método de atenuação de expressão de mRNA de IGF1R em um sistema de expressão, o dito método compreendendo: administração ao dito sistema de expressão de uma composição compreendendo uma quanti- dade eficaz de RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nu- cleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, o dito RNA de interfe- rência compreendendo: uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contí- guos tendo pelo menos 80% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 80% de identidade de seqüência com, os ditos penúltimos 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 nucleotídeos da dita extremidade 3' de um mRNA cor- respondendo a qualquer uma das SEQ ID NO:2; e SEQ ID NO:8 - SEQ ID N0:40, onde a dita expressão de mRNA de IGF1R é atenuada então.

O uso, na preparação de um medicamento para o tratamento de angiogênese ocular em um indivíduo, de uma composição compreendendo: uma quantidade eficaz de RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, o dito RNA de interferência compreendendo: uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os ditos 13 penúltimos nucleotídeo da dita extremidade 3' de um mRNA correspondendo a qualquer uma das SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:8 - SEQ ID N0:40, onde a dita angio- gênese ocular é tratada então.

O uso, na preparação de um medicamento para o tratamento de angiogênese ocular em um indivíduo, de uma composição compreendendo: uma molécula de siRNA de filamento duplo que sub-regula expressão de um gene de IGF1R através de interferência com RNA, onde: cada filamento da dita molécula de siRNA é independentemente cerca de 19 a cerca de 27 nu- cleotídeos de comprimento; e um filamento da dita molécula de siRNA com- preende uma seqüência de nucleotídeo tendo complementaridade substan- cial com um mRNA correspondendo ao dito gene de IGF1R, respectivamen- te, de modo que a dita molécula de siRNA direciona a clivagem do dito mR- NA através de interferência com RNA.

Uma composição compreendendo um RNA de interferência ten- do um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e compreendendo uma se- qüência de nucleotídeo correspondendo a qualquer uma das SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:8 - SEQ ID N0:40, ou um complemento dela, e um veículo far- maceuticamente aceitável.

Uma composição compreendendo uma molécula de siRNA de filamento duplo que sub-regula expressão de um gene de IGF1R através de interferência com RNA1 onde: cada filamento da dita molécula de siRNA é independentemente cerca de 19 a cerca de 27 nucleotídeos de comprimen- to; e um filamento da dita molécula de siRNA compreende uma seqüência de nucleotídeo tendo complementaridade substancial para um mRNA cor- respondendo ao dito gene de IGF1R de modo que a dita molécula de siRNA direciona a clivagem do dito mRNA através de interferência com RNA. e

Um método de atenuação da expressão de mRNA de IGF1R para um indivíduo expressando mRNA de IGF1R, o dito método compreen- dendo: administrar ao dito indivíduo uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, o dito RNA de interferência compreendendo: um filamento de nucleotídeo de sentido, um filamento de nucleotídeo de anti-sentido e uma região de complementarida- de contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos; onde o dito filamento de nucleotídeo de anti-sentido hibridiza sob condições fisio- lógicas para uma porção de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1 e tem uma região de complementaridade pelo menos quase perfeita de pelo me- nos 19 nucleotídeos com a dita porção de hibridização de mRNA correspon- dendo à SEQ ID NO:1, onde a dita expressão de mRNA de IGF1R é atenua- da então.

A invenção pode ser concretizada em outras formas específicas sem se afastar de seu espírito ou características essenciais. As modalidades descritas devem ser consideradas em todos as considerações apenas como ilustrativas e não restritivas. O escopo da invenção é, então, indicado pelas reivindicações apensas ao invés da descrição acima. Todas as mudanças nas reivindicações que se encaixarem no significado e faixa de equivalência das reivindicações devem ser compreendidas dentro de seu escopo. Ainda, todos os documentos publicados, patentes e pedidos mencionados aqui são aqui incorporados a título de referência, como se apresentados em sua tota- lidade.

Exemplo 1 RNA de Interferência para Silenciar Especificamente IGF1R

O presente estudo examina a habilidade de RNA de interferência com IGF1R em inativar os níveis de expressão de proteína IGF-1R endóge- na em células HeLa culturadas.

A transfecção de células HeLa foi realizada usando concentra- ções in vitro padrão (0,1-10 nM) de siRNAs de IGF1R, siRNA livre de RISC siCONTROL No.1 ou siRNA Sem-direcionamento siCONTROL No. 2 (NTC2) e reagente de transfecção DHARMAFECT® No. 1 (Dharmacon, Lafayetee, CO). Todos os siRNAs foram dissolvidos em tampão de siRNA 1X, uma so- lução aquosa de KCI a 20 mM, HEPES a 6 mM (pH 7,5), MgCI2 a 0,2 mM. Amostras controle incluíam um controle tampão onde o volume de siRNA foi substituído com um volume igual de tampão siRNA 1X (-siRNA). Western blots usando um anticorpo anti-IGF-1Rp foram realizados para avaliar a ex- pressão de proteína IGF1R. Este anticorpo reconhece ambas proteínas pre- cursora de IGF-1R de 200 kDa e IGF-1 Rp madura de 97 kDa. Os siRNAs de IGF1R são RNAs de interferência de filamento duplo tendo especificidade para os alvos que seguem: alvos No. 6 silGFI R SEQ ID NO:38; alvos No. 8 SiIGFIR SEQ ID NO:39; alvos No. 17 silGFI R SEQ ID NO:13; alvos No. 18 silGFIR SEQ ID N0:40. Conforme mostrado pelos dados na figura, os siR- NAs de silGFIR No. 8 e silGFIR No. 17 reduziram a expressão da proteína IGF1R significantemente nas concentrações de 10 nM e 1 nM com relação aos siRNAs controle, indicando que esses siRNAs de IGF1R são mais efica- zes do que silGFIR No. 6 e silGFIR No. 18. Nenhum desses siRNAs redu- ziu a expressão da proteína IGF-1 R significantemente a 0,1 nM.

As referências citadas aqui, até o ponto onde elas proverem de- talhes de procedimento exemplares ou outros suplementares àqueles mos- trados aqui, são especificamente incorporadas a título de referência.

Todos aqueles versados na técnica, à luz da presente revelação, compreenderão que modificações óbvias das modalidades descritas aqui podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Todas as modalidades descritas aqui podem ser feitas e executadas sem experimen- tação indevida à luz da presente descrição. O escopo integral da invenção é demonstrado na descrição e suas modalidades equivalentes. O relatório não deve ser considerado para estreitar indevidamente o escopo integral de pro- teção ao qual a presente invenção é intitulada.

Conforme aqui usado, a menos que de outro modo indicado, "um" e "uma" pretendem significar "um", "pelo menos um" ou "um ou mais".

Claims (14)

1. Método para atenuação da expressão de mRNA de IGF1R em um sistema de expressão, o dito método compreendendo: administração ao dito sistema de expressão de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente acei- tável, o dito RNA de interferência compreendendo: um filamento de nucleotídeo de sentido, um filamento de nucleo- tídeo de anti-sentido e uma região de complementaridade contígua pelo me- nos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos; onde o dito filamento de nucleotídeo de anti-sentido hibridiza sob condições fisiológicas para uma porção de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1 e tem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a dita porção de hibridização de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1, em que a dita expressão de mRNA de IGF1R é atenuada então.

2. Uso de um medicamento para tratamento de angiogênese ocular em um indivíduo com necessidade do mesmo, o dito método compre- endendo: administração a um olho do dito indivíduo de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de RNA de interferência tendo um cumprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente acei- tável, o dito RNA de interferência compreendendo: um filamento de nucleotídeo de sentido, um filamento de nucleo- tídeo de anti-sentido e uma região de complementaridade contígua pelo me- nos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos; em que o dito filamento de nucleotídeo de anti-sentido hibridiza sob condi- ções fisiológicas para uma porção de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1 e tem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a dita porção de hibridização de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1, em que a dita angiogênese ocular é tratada então.

3. Método de atenuação da expressão de mRNA de IGF1R em um sistema de expressão, o dito método compreendendo: administração ao dito sistema de expressão de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de RNA de interferência de filamento simples tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farma- ceuticamente aceitável, em que o dito RNA de interferência de filamento simples hibridiza sob condi- ções fisiológicas para uma porção de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1 compreendendo nucleotídeo 401, 635, 1062, 1548, 1604, 1643, 1766, -1922, 2012, 2069, 2210, 2416, 2423, 2654, 2909, 3339, 3416, 3464, 3476, -3505, 3512, 3871, 3782, 3881, 4064, 4158, 4411, 4487, 4904, 4905, 4909, -3329, 2323 ou 2887, e o dito RNA de interferência tem uma região de com- plementaridade contígua quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a dita porção de hibridização de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1, em que a dita expressão de mRNA de IGF1R é atenuada então.

4. Método de atenuação da expressão de mRNA de IGF1R em um sistema de expressão, o dito método compreendendo: administração ao dito sistema de expressão de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente acei- tável, o dito RNA de interferência compreendendo: uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 80% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 80% de identidade de seqüência com, os ditos penúltimos 13, 14, 15, 16, 17 ou -18 nucleotídeos da dita extremidade 3' de um mRNA correspondendo a qualquer uma da SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:8 - SEQ ID N0:40, em que a dita expressão de mRNA de IGF1R é atenuada então.

5. Uso, na preparação de um medicamento para o tratamento de angiogênese ocular em um indivíduo, de uma composição compreendendo: uma quantidade eficaz de RNA de interferência tendo um comprimento de -19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, o dito RNA de interferência compreendendo: uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 90% de complementaridade de seqüência para, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os ditos 13 penúltimos nucleotídeos da dita extremidade 3' de um mRNA correspondendo a qualquer uma de SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:8 - SEQ ID N0:40. em que a dita angiogênese ocular é tratada então.

6. Uso, na preparação de um medicamento para o tratamento de angiogênese ocular em um indivíduo, de uma composição compreendendo: uma molécula de siRNA de filamento duplo que sub-regula a expressão de um gene de IGF1R através de interferência de RNA1 em que: cada filamento da dita molécula de siRNA é independentemente de cerca de 19 a cerca de 27 nucleotídeos de comprimento; e um filamento da dita molécula de siRNA compreende uma se- quência de nucleotídeo tendo complementaridade substancial com um mR- NA correspondendo ao dito gene de IGF1R, respectivamente, de modo que a dita molécula de siRNA direciona a clivagem do dito mRNA através de in- terferência de RNA.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, 3 ou 4 compreen- dendo ainda administração ao dito sistema de expressão de um segundo RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos com- preendendo: um filamento de nucleotídeo de sentido, um filamento de nucleo- tídeo de anti-sentido e uma região de complementaridade pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos; em que o dito filamento de nucleotídeo de anti-sentido do dito segundo RNA de interferência hibridiza sob condições fisiológicas para uma segunda por- ção de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1 e o dito filamento de anti- sentido tem uma região de complementaridade pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a dita segunda porção de hibridização de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1.

8. Composição compreendendo um RNA de interferência tendo um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e compreendendo uma seqüência de nucleotídeo correspondendo a qualquer uma de SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:8 - SEQ ID N0:40, ou um complemento da mesma, e um veículo farma- ceuticamente aceitável.

9. Composição compreendendo uma molécula de siRNA de fi- lamento duplo que sub-regula a expressão de um gene de IGF1R através de interferência com RNA, em que: cada filamento da dita molécula de siRNA é independentemente cerca de 19 a cerca de 27 nucleotídeos de comprimento; e um filamento da dita molécula de siRNA compreende uma se- qüência de nucleotídeo tendo complementaridade substancial para um mR- NA correspondendo ao dito gene de IGF1R de modo que a dita molécula de siRNA direciona a clivagem do dito mRNA através de interferência com RNA.

10. Método de atenuação da expressão de um mRNA de IGF1R para um indivíduo expressando mRNA de IGF1R, o dito método compreen- dendo: administração ao dito indivíduo de uma composição compreen- dendo uma quantidade eficaz de RNA de interferência tendo um comprimen- to de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, o dito RNA de interferência compreendendo: um filamento de nucleotídeo de sentido, um filamento de nucleo- tídeo de anti-sentido e uma região de complementaridade contígua pelo me- nos perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos; em que o dito filamento de nucleotídeo de anti-sentido hibridiza sob condi- ções fisiológicas para uma porção de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1 e tem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a dita porção de hibridização de mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1, em que a dita expressão de mRNA de IGF1R é atenuada então.

11. Método de acordo com qualquer reivindicação 1, 3, 4 ou 10, em que o dito filamento de anti-sentido é criado para se direcionar a um mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1 compreendendo nucleotídeo 401, -635, 1062, 1548, 1604, 1643, 1766, 1922, 2012, 2069, 2210, 2416, 2423 ou -2654.

12. Método de acordo com qualquer reivindicação 1, 3, 4 ou 10, em que o dito filamento de anti-sentido é criado para se direcionar a um mRNA correspondendo à SEQ ID NO:1 compreendendo nucleotídeo 2909, -3339, 3416, 3464, 3476, 3505, 3512, 3781, 3782, 3881, 4064, 4158, 4411, -4487, 4904, 4905, 4909, 3329, 2323 2887.

13.

Método de acordo com a reivindicação 1, 3, 4 ou 10 ou a composição como definida na reivindicação 8 ou 9, em que a dita composi- ção compreende ainda um segundo RNA de interferência tendo um compri- mento de 19 a 49 nucleotídeos e compreendendo uma região de pelo menos -13, 14, 15, 16, 17 ou 18 nucleotídeos contíguos tendo pelo menos 80% de complementaridade para, ou pelo menos 80% de identidade de seqüência com, os ditos 13 penúltimos nucleotídeos da dita extremidade 3' de um se- gundo mRNA correspondendo a qualquer uma das SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:8 - SEQ ID NQ:40.