MX2008006910A

MX2008006910A - Inhibicion mediada por rnai de igfir para tratamiento de angiogenesis ocular

Info

Publication number: MX2008006910A
Application number: MX/A/2008/006910A
Authority: MX
Inventors: P Bingaman David; E Chatterton Jon
Original assignee: Alcon Manufacturing Ltd; P Bingaman David; E Chatterton Jon
Priority date: 2005-12-29
Filing date: 2008-05-29
Publication date: 2008-09-02

Abstract

Se proporciona interferencia de RNA para inhibición de expresión de IGFIR mRNA para tratar pacientes con angiogénesis ocular, particularmente para tratar edema retiniano, neovascularizsción de segmento posterior (PSNV), y glaucoma neovascular, y para tratar pacientes en riesgo de desarrollar dichas condiciones.

Description

INHIBICIÓN MEDIADA POR RNAI DE IGFIR PARA TRATAMIENTO DE ANGIOGÉNESIS OCULAR La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de EUA Número de Serie 60/754,796, presentada el 29 de diciembre de 2995, el texto de la cual se incorpora específicamente por referencia en la presente . CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de interferir composiciones de RNA para inhibición de expresión de receptor de factor-1 de crecimiento semejante a insulina (IGF-1R), la proteína codificada por IGFIR mRNA. , en angiogénesis ocular, incluyendo aquellos cambios celulares que resultan de la interacción de factor-1 de crecimiento semejante a insulina (IGF-1) e IGR-1R que conducen directa o indirectamente a neovascularización ocular, edema retiniana, retinopatía diabética, secuelas asociadas con isquemia retiniana, neovascularización de segmento posterior, y glaucoma neovascular, por ejemplo. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La retinopatía diabética (DR) es una enfermedad del ojo que se desarrolla en diabetes debido a cambios en las células que recubren los vasos sanguíneos, es decir, el endotelio microvascular retimano. Durante la diabetes mellitas, la hiperglicemia puede ocasionar daño en un número de formas. Por ejemplo, la glucosa, o un metabolito de glucosa, se enlaza a los grupos auno de proteínas, conduciendo a daño de tejido. Además, el exceso de glucosa entra a la trayectoria de poliol resultando en acumulaciones de sorbitol. El sorbitol no se puede metabolizar mediante las células de la retina y puede contribuir a presión osmótica mtracelular elevada, edema mtracelular, difusión dañada, hipoxia de tejido, daño de célula capilar, y debilitamiento capilar. La retmopatia diabética involucra espesamiento de las membranas de base capilares que a su vez pueden impedir que los pepcitos, el tipo de célula perivascular predominante en capilares retiñíanos, hagan contacto con las células endoteliales . Ocurre la muerte del pepcito y célula endotelial a través de un mecanismo apoptotico durante la retmopatia diabética, en donde la pérdida de pericitas probablemente aumenta la permeabilidad de los capilares que conduce a rotura de la barrera de sangre-retina y desregulación de flujo de sangre. Los capilares debilitados conducen a formación de neurisma y fuga adicional. Estos efectos de hiperglicemia también pueden dañar las funciones neuronales en la retina. DR está asociada con los microaneurismas retínales, hemorragias, exudados y retinitis proliferans, es decir, crecimiento de tejido masivo neovascular y de conexión en la superficie interna de la retina. La retinopatía diabética puede ser del tipo de fondo, caracterizada progresivamente por microaneurismas; hemorragias de punteado intrarretiniano; exudados amarillos, cerosos; parches de algodón-lana; y edema macular. Esta es una etapa temprana de retinopatía diabética denominada retinopatía diabética no proliferante. A medida que progresa la patología microvascular inducida por diabetes, los capilares retiñíanos eventualmente se ocluyen y conducen a áreas multifocales de hipoxia de isquemia dentro de la retina. Las condiciones hipóxicas en el tejido no perfundido ocasiona la producción de factores de crecimiento capaces de estimular crecimiento anormal de nuevo vaso sanguíneo de los vasos existentes (angiogenésis) . Estos vasos sanguíneos nuevos patológicos crecen hacia el vitreo y pueden ocasionar pérdida de la vista, una condición llamada retinopatía diabética proliferante (PDR) , puesto que los nuevos vasos sanguíneos son frágiles y tienden a escurrir sangre hacia el ojo. El tipo proliferante de DR se caracteriza por neovascularización de la retina y disco óptico que se puede proyectar hacia el vitreo, proliferación de tejido fibroso, hemorragia del vitreo, y separación retiniana. La neovascularización también ocurre en un tipo de glaucoma llamado glaucoma neovascular en el que la presión infraocular aumentada es ocasionada por crecimiento de tejido conector y nuevos vasos sanguíneos sobre la red trabecular. El glaucoma neovascular es una forma de glaucoma secundario ocasionado por neovascularización en el ángulo de cámara. La neovascularización de segmento posterior (PSNV) es una patología que amenaza la visión responsable de dos de las causas más comunes de ceguera adquirida en países desarrollados: degeneración macular relacionada con la edad exudante (AMD) y PDR. Hasta recientemente, los únicos tratamientos aprobados para PSNV que ocurre durante AMD exudante fueron fotocoagulación con láser o terapia fotodinámica con VISUDYNEMR. Ambas terapias involucran oclusión de vasculatura afectada, que resulta en daño inducido por láser, permanece a la retina, y no se dirige a la causa subyacente de neovascularización. La recurrencia de neovascularización desde la misma área es común. Para pacientes con PDR, las intervenciones quirúrgicas con vitrectomía y remoción de membranas prerretinianas son las únicas opciones actualmente disponibles, así como una terapia láser llamada fotocoagulación apnretmal para impedir la producción de nuevos vasos nuevos. Los esfuerzos farmacéuticos actuales se han enfocado en inhibir los efectos de factores angiogénicos potentes tales como VEGF. Recientemente, la inyección mtravítrea de LUCENTISMR, un fragmento de anticuerpo de anti-VEGF, fue aprobado para tratamiento de AMD. Este fragmento de anticuerpo fue diseñado para ligarse e inhibir el VEGF para inhibir la formación de nuevos vasos sanguíneos. Lucentis también esta en pruebas clínicas para el tratamiento de edema macular diabética. Otros acercamientos incluyen el uso de RNA de interferencia pequeño que se dirige a VEGF o su receptor. El e e de hormona de crecimiento (GF) /IGFI está implicado en DR como se evidencia por resultados que muestran un aumento en IGFI en fluidos oculares y tejidos para pacientes con DR avanzando. Además, los pacientes tratados subcutáneamente con octrotido, un análogo de somatostatma que inhibe el e e de GH/IGFI, muestran mejora empírica en edema macular diabética y PDR. En el modelo OÍR de ratón, el tratamiento con inhibidor de GH o antagonista de IGFIR disminuye significativamente la neovasculapzación retiniana. En un modelo diabético de ratón, la terapia de IGF-1 mediada con plásmido invirtió la angiogénesis diabética aumentada y el flujo arterial. IGFIR es un miembro de la familia de cinasa de tirosína receptora. Varios inhibidores de cinasa de tirosina receptores (RTKi) de molécula pequeña se han descrito que inhiben la neovascularización retiniana y/o la neovascularización coroidal en ratones. Cada una de estas moléculas inhibe múltiples cinasas que pueden ser efectivas para bloquear la neovascularización, sin embargo, cada uno tiene un riesgo inherente de ocasionar efectos laterales tóxicos. Una droga de molécula pequeña que inhiba todas las cinasas necesarias para bloquear la neovascularización también puede inhibir una cinasa que se necesita para supervivencia de célula. La presente invención se dirige a esta falta de especificidad de inhibición de cinasas de tirosina receptoras, específicamente el receptor de factor-1 de crecimiento semejante a insulina. La presente invención proporciona RNAs de interferencia que se dirigen a IGFIR en angiogénesis y permeabilidad vascular. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a RNAs de interferencia que silencian la expresión de IGFIR mRNA, disminuyendo de esta manera la actividad del complejo ligado de IGF-1/IGF-1R y tratar angiogénesis ocular efectuando una reducción de actividad celular preangiogénica y angiogénica ocular. El IGR-IR se activa mediante el enlace de IGF-1 al dominio extracelular del receptor. La activación de la cinasa, a su vez, resulta en el estímulo de diferentes substratos intracelulares. El término "angiogénesis ocular", como se usa en la presente, incluye condiciones preangiogénicas oculares y condiciones angiogénicas oculares, e incluye aquellos cambios celulares que resultan de la interacción de IGF-1 e IGF-1R que conducen directa o indirectamente a angiogénesis ocular, neovascularización ocular, edema retiniana, retinopatía diabética, secuela asociada con isquemia retiniana, PSNV, permeabilidad vascular, y glaucoma neovascular, por ejemplo. Los RNAs de interferencia de la invención son útiles para tratar pacientes con angíogénesis ocular, neovascularización ocular, edema retiniana, retinopatía diabética, secuela asociada con isquemia retiniana, neovascularización de segmento posterior (PSNV, y glaucoma neovascular, o pacientes en riesgo de desarrollar dichas condiciones, por ejemplo. Una modalidad de la presente invención proporciona un método para atenuar la expresión de un a meta de IGFIR mRNA en un sujeto. El método comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de RNA de interferencia tal como un siRNA que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable. La administración es a un ojo del sujeto para atenuar la expresión de una meta de angiogénesis ocular en un humano. En una modalidad de la invención, el RNA de interferencia comprende una hebra de nucleótido de sentido, una hebra de nucleótido de contrasentido y una región de una complementariedad contigua casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos. Además, le hebra de contrasentido se hibridiza bajo condiciones fisiológicas a una porción de un mRNA correspondiente a SEC ID NO: 1 que es la secuencia de cDNA de sentido que codifica IGFIR (GenBank no. de acceso NM_000875) y tiene una región de complementariedad contigua cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos con la porción de hibridización de mRNA correspondiente a SEC ID NO: 1. La administración de dicha composición atenúa la expresión de un IGFIR mRNA del sujeto. En una modalidad de la invención, el RNA de interferencia se designa para dirigir un mRNA correspondiente a SEC ID NO: 1 que comprende nucleótido 401, 635, 1062, 1548, 1604, 1643, 1766, 1922, 2012, 2069, 2210, 2416 2423, 2654, 2909, 3339, 3416, 3464, 3476, 3505, 3512, 3781, 3872, 3881, 4064, 4158, 4411, 4487, 4904, 4905, 4909, 3329, 2323 o 2887. La presente invención provee además la administración de un segundo RNA de interferencia a un sujeto además de un primer RNA de interferencia. El método comprende administrar al sujeto un segundo RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y que comprende una hebra de nucleótido de sentido, una hebra de nucleótido de contrasentido, y una región de complementariedad cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos; en donde la hebra de contrasentido del segundo RNA de interferencia se hibridiza bajo condiciones fisiológicas a una segunda porción de mRNA correspondiente a SEC ID N0:1 y la hebra de contrasentido tiene una región de complementariedad contigua cuando menos casi perfecta de por lo menos 19 nucleótidos con la segunda porción de hibridización de mRNA correspondiente a SEC OD N0:1. Además, un tercero, cuarto o quinto, etc., RNA de interferencia se puede administrar de una manera similar. Otra modalidad de la invención es un método para atenuar la expresión de IGFIR mRNA en un sujeto que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de RNA de interferencia de una sola hebra que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable.

Para atenuar la expresión de IGFIR mRNA, las hibrizidas de RNA de interferencia de una sola hebra bajo condiciones fisiológicas a una porción de mRNA correspondiente a SEC ID NO:l que comprenden el nucleótido 401, 635, 1062, 1548, 1604, 1643, 1766, 1922, 2012, 2069, 2210, 2416 2423, 2654, 2909, 3339, 3416, 3464, 3476, 3505, 3512, 3781, 3782, 38831, 4064, 4158, 4411, 4487, 4904, 4905, 4909, 3329, 2323 o 2887, y el RNA de interferencia tiene una región de complementariedad contigua cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos con la porción de hibridización de mRNA correspondiente a SEC ID NO: 1. La expresión de IGFIR mRNA de esta manera se atenúa. Una modalidad adicional de la invención es un método para tratar angiogénesis ocular en un sujeto en necesidad del mismo. El método comprende administrar a un ojo del sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable, el RNA de interferencia comprendiendo una hebra de nucleótido de sentido, una hebra de nucleótido de contrasentido, y una región de complementariedad contigua cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nuclétidos. Las hibridizas de hebra de contrasentido bajo condiciones fisiológicas a una porción de mRNA correspondiente a SEC ID NO: 1 tiene una región de complementariedad contigua cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos con la porción de hibridización de mRNA correspondiente a SEC ID NO: 1. El angiogénesis ocular se trata por el mismo. Otra modalidad de la invención es un método para tratar angiogénesis ocular en un sujeto en necesidad del mismo, el método comprendiendo administrar a un ojo del sujeto una composición gue comprende una cantidad efectiva de RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable, el RNA de interferencia comprendiendo una región de cuando menos 13 nucleótidos contiguos que tienen complementariedad de secuencia de cuando menos 90% a, o por lo menos identidad de secuencia de 90% con, los penúltimos 13 nucléotidos del extremo 3' de un mRNA correspondiente a cualquiera de SEC UD BI;2 Y SEC ID NO: 8 - SEC ID NO: 40, en donde la angiogénesis ocular se trata por el mismo. Otra modalidad de la invención es un método para atenuar la expresión de un IGFIR mRNA en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde RNA de interferencia comprende una región de cuando menos 13 nucleótidos contiguos que tienen cuando menos 90% de complementariedad de secuencia a, o cuando menos 90% de identificad de secuencia con, los penúltimos 13 nucleótidos del extremo 3' de un mRNA correspondiente a cualquiera de SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 8 -SEC ID NO:40. En una modalidad adicional de la presente invención, la región de nucleótidos contiguos es una región de cuando menos 14 nucleótidos contiguos que tiene cuando menos 85% de complementariedad de secuencia a, o cuando menos 85% de identidad de secuencia con, los penúltimos 14 nucleótidos en el extremo 3' de un mRNA correspondiente a la secuencia del identificador de secuencia. En todavía otra modalidad de la invención, la región de nucleótidos contiguos es una región de cuando menos 15, 16, 17 o 18 nucleótidos contiguos que tienen cuando menos 80% de complementariedad de secuencia a, o cuando menos 80% de identidad de secuencia con, los penúltimos 15, 16, 17 o 18 nucleótidos, respectivamente, del extremo 3' de un mRNA correspondiente a la secuencia identificada por el identificador de secuencia. Una modalidad adicional de la invención es un método para tratar angiogénesis ocular en un sujeto en necesidad del mismo, el método comprendiendo administrar al sujeto una composición que comprende una molécula de siTNA de doble hebra que regula descendentemente la expresión de un gene de IGFIR a través de interferencia de RNA, en donde cada hebra de la molécula de siRNA es independientemente alrededor de 19 a alrededor de 27 nucleótidos de longitud; y una hebra de la molécula de mRNA comprende una secuencia de nucleótido que tiene complementariedad substancial con un mRNA correspondiente al gene de IGFIR, respectivamente, de manera que la molécula de siRNA dirija la segmentación del RNAa través de interferencia de RNA. Una composición que comprende RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y que tiene una secuencia de nucleótido de cualquiera de SEC ID NO: 2, y SEC ID NO: 8 - SEC ID NO: 40, o un complemento de las mismas, y un portador farmacéuticamente aceptable es una modalidad de la presente invención. En una modalidad, el RNA de interferencia se aisla. El término "aislado" significa que el RNA de interferencia está libre en su medio natural total. Otra modalidad de la invención es una composición que comprende una molécula de siRNA de doble hebra que regula descendentemente la expresión de un gene de IGFIR a través de interferencia de RNA, en donde cada hebra de la molécula de siRNA es independientemente de alrededor de 19 a alrededor 27 nucleótidos de longitud; y una hebra de la molécula de siRNA comprende una secuencia de nucleótido tiene una complementariedad substancial a un mRNA correspondiente al gene de IGFIR, respectivamente, de modo que la molécula de siRNA dirige la segmentación ' del mRNA a través de interferencia de RNA. La presente invención proporciona una ventaja sobre los inhibidores de molécula pequeña de IGF-1R, puesto que el efecto lateral indeseable de terapias de molécula pequeña actual, v.gr., falta de especificidad, se puede superar. El uso de cualquiera de las modalidades como se describe en la presente en la preparación de un médicamente para atenuar la expresión de IGFIR mRNA también es una modalidad de la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO A fin de que la manera en la que las mejoras y objetos arriba mencionados y otros de la invención se obtengan, una descripción particular de la invención brevemente descrita arriba se presentará mediante referencia a modalidades específicas de la misma, que están ilustradas, en los dibujos anexos. Entendiendo que estos dibujos ilustran solamente modalidades típicas de la invención y, por lo tanto, no deben considerarse limitativos de su alcance, la invención se describirá con especificidad y detalle adicionales a través del uso de los dibujos que se acompañan, en los cuales : La figura 1 proporciona una mancha estern de IGF- IR/5 de células HeLa transfectadas con IGFIR siRNAs #6, #8, #17, y #18, y un siRNA de control libre de RISC, cada uno a 10 nM, 1 nM, y 0.1 nM, ; un siRNA de control de no meta (NTC2) a 10 nM, y un control de tampón (-siRNA) . Las flechas indican las posiciones del precursor 97-kDa IGF-IR/5, precursor 200-kDa IGF-1R, y bandas de actina 42-kDa. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los detalles mostrados en la presente son por vía de ejemplo y para propósitos de discusión ilustrativa de las modalidades preferidas de la presente invención solamente y se presentan en la causa de proporcionar lo que se cree que es la descripción más útil y fácil de entender de los principios y aspectos conceptuales de diversas modalidades de la invención. A este respecto, no se hace intento de mostrar detalles estructurales de la invención con mayor detalle del que es necesario para el entendimiento fundamental de la invención, la descripción tomada con los dibujos y/o ejemplos que hacen evidente a aquellos expertos en el ramo como las diversas formas de la invención se pueden moralizar en la práctica. Las siguientes definiciones y explicaciones se pretenden e intentan que estén controlando en cualquier construcción futura a menos que se modifique claramente y de manera no ambigua en los siguientes ejemplos o cuando la aplicación del significado hace a cualguier construcción sin significado o esencialmente sin significado. En casos en donde la construcción del término lo haría sin significado o esencialmente sin significado, la definición se debe tomar del Diccionario Webster' s, 3a Edición. Como se usa en la presente, todos los porcentajes son porcentajes en peso, a menos que se manifieste de otra manera . Como se usa en la presente, un "fluido" es una substancia amorfa, continua, cuyas moléculas se mueven libremente más allá una de la otra y que tiene la tendencia de asumir la forma de su recipiente, por ejemplo, un líquido o un gas. Como se utiliza en la presente, el término "proveedor de cuidado de salud" se conoce en el ramo e incluye específicamente un médico, una persona con autoridad para prescribir un medicamento (ya sea directa o indirectamente), y un veterinario. En ciertas modalidades, un proveedor de cuidado de salud incluye una persona que proporciona un medicamento sin prescripción, tal como al proporcionar un médicamente sobre el mostrador. Como se utilizan en la presente, los términos "sujetos de identificación" y "diagnosticar" se usan intercambiablemente con respecto a la dirección de una "predisposición", "propensión aumentada", "riesgo", "riesgo aumentado", y lo semejante. Como se utiliza en la presente, el término "otra enfermedad retiniano o de nervio óptico" significa y se refiere a cuando menos una degeneración macular relacionada con la edad, catarata, neuropatía óptica isquémica aguda (AION) , conmoción retíniana, separación retiniana, lágrimas y agujaros retiñíanos, retinopatía diabético y retinopatía iatrogénica y otras retinopatías isquémicas o neuropatías ópticas, miopía, retinitis pigmentosa, y/o lo semejante. Interferencia de NRA (RNAi) es un proceso mediante el que RNA de hebra doble (dsRN A) se usa para silenciar la expresión de gene. Mientras que no se desea estar limitado por la teoría, RNAi empieza con la segmentación de dsRNAs más largas hacia RNAs de interferencia pequeñas (siRNAs) mediante una enzima semejante a RNaselII, cortadora. SiRNAs son dsRNAs que usualmente son de alrededor de 19 a 28 nucleótidos, o 20 a 25 nucleótidos, o 21 a 22 nucleótidos en longitud y frecuentemente obtienen colgantes de terminales 3' de 2-nucleótido, y 5' fosfato y 3' hidroxilo. Una hebra del siRNA se incorpora en un complejo de ribonucleoproteína conocido como el complejo silenciador inducido por RNA (RISC) . El RISC utiliza esta hebra de siRNA para identificar moléculas de mRNA que son cuando menos parcialmente complementarias a la hebra de siRNA incorporada, y luego segmenta estos mRNAs de meta o inhibíe su traslación. Por lo tanto, la hebra de siRNA que se incorpora en el RISC se conoce como la hebra de guía o la hebra de contrasentido. La otra hebra de siRNA, conocida como la hebra pasajera o la hebra de sentido, se elimina del siRNA y es cuando menos parcialmente homologa al mRNA de meta. Aquellos de experiencia en el ramo reconocerán que, en principio ya sea la hebra de siRNA se puede incorporar en RISC y funcionar como una hebra de guía. Sin embargo, el diseño de siRNA (v.gr., estabilidad doble de siRNA disminuida en el extremo 5' de la hebra de contrasentido) puede favorecer la incorporación de la hebra de contrasentido en RISC. La segmentación mediada por RISC de mRNAs que tienen una secuencia cuando menos parcialmente complementaria a la hebra de guía conduce a una disminución en el nivel de estado constante de ese mRNA y la proteína correspondiente codificada por este mRNA. Alternativamente, RISC también puede disminuir la expresión de la proteína correspondiente a través de represión de traslación sin segmentación del mRNA de meta. Otras moléculas de RNA y moléculas semejantes a RNA también pueden mteractuar con RISC y silenciar la expresión de gene. Ejemplos de otras moléculas de RNA que pueden mteractuar con RISC incluyen RNAs de pasador corto (shRNAs) , siRNAs de una sola hebra, microRNAs (miRNAs) , y dobles 27 mer de substrato cortador. El término "siRNA" como se usa en la presente se refiere a un RNA de interferencia de doble hebra a menos que se anote de otra manera. Los ejemplos de moléculas semejantes a RNA que pueden mteractuar con RISC incluyen moléculas de RNA que contienen uno o más nucleótidos químicamente modificados, uno o mas deoximbonucleótidos, y/o uno o más enlaces no fosfodiéster . Para propósitos de la presente discusión todas las moléculas RNA o semejantes a RNA que pueden mteractuar con RISC y participan en cambios mediados por RISC en expresión de gene se referirán como "RNAs de interferencia", SiRNAs, shRNAs, miRNAs, y dobles 27-mer cortador-substrato son, por lo tanto, subjuegos de "R$NAs de interferencia".

El RNA de interferencia de modalidades de la invención parece actuar de una manera catalítica para segmentación del mRNA de meta, es decir, el RNA de interferencia es capaz de efectuar la inhibición de mRNA de meta en cantidades subestequiométricas . En comparación con terapias de contrasentido, RNA significativamente menos interferente se requiere para proporcionar un efecto terapéutico bajo dichas condiciones de segmentación. La presente invención se relaciona con el uso de RNA de interferencia para inhibir la expresión de mRNA de receptor de factor-1 de crecimiento semejante a insulina (IGR-1R), interfiriendo de esta manera con enlace de ligando e interfiriendo con proliferación subsecuente y angiogénesis .

De conformidad con la presente invención, los RNAs de interferencia proporcionron efectro exógenamente o expresados endógenamente silenciando la expresión de IGFIR en tejidos oculares . Las secuencias de ácido nucleico citadas en la presente se escriben en una dirección 5' a 3' a menos que se indique de otra manera. El termino "ácido nucleico" como se usa en la presente, se refiere a ADN o RNA o una forma modLficada de los mismos que comprende las bases de pupna o pipmidma presentes en ADN (adenina "A", citosina "C", guanina "G", timina "T") o es RNA (adenina "A!, citosina ¡C!, guanina "G", uracilo "U") . Los RNAs de interferencia proporcionados en la presente pueden comprender bases "T", particularmente en los extremos 3' , aún cuando las bases "T" no ocurren naturalmente en RNA. El "ácido nucleico2 incluye los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" y se puede referir a una molécula de una sola hebra o una molécula de hebra doble. Una molécula de hebra doble se forma mediante la base de Watson-Crick que se empareja entre las bases A y B, bases C y B, y entre las bases A y /. Las hebras de la molécula de doble hebra pueden tener complementariedad parcial, substancial o completa entre sí y formarán un híbrido doble, la resistencia de enlace del cual depende de la naturaleza y grado de complementariedad de la secuencia de bases. Una secuencia de mRNA se deduce fáciulmente de la secuencia de la secuencia de ADN correspondiente. Por ejemplo, SEC ID NO: 1 proporciona una secuencia de hebra de sentido de AND correspondiente al mRNA para IGFIR. La secuencia de mRNA es idéntica a la secuencia de hebra de sentido de ADN con las bases "T" reemplazadas con bases "U" . Por lo tanto, la secuencia de rRNA de IGFIR se conoce de SEC ID NO:l. mRNA Receptor de Factor-1 de Crecimiento semejante a Insulina (IGFIR) : IGF-1R es un miembro de la familia de cmasa de tirosma receptora. La fragmentación proteolítica del precursor IGF-1R general el ligando extracelular que enlace la subumdad a y la subunidad de transmembrana ß, que contiene el dominio de cmasa de tirosina mtracelular . IGF-1R comprende dos sunidades a y dos ß enlazadas mediante enlaces de disulfuro. En enlace de ligando dispara la auto-transforforilación que promueve la proliferación y supervivencia de célula. Las actividades biológicas de factor-1 de crecimiento de insulina son mediadas a través de IGR-1R. Un aumento en IGF-1R se ha observado en fluidos y tejidos oculares de pacientes con retmopatía diabética en avance. Varios factores de crecimiento proangiogénico incluyendo factor-1 de crecimiento semejante a insulina se han encontrado en tejidos y fluidos de pacientes con angiogénesis ocular. Los pacientes tratados subcutáneamente con octreoturo, un análogo de so astostatma que inhibe el e e GH/IGF1, muestran mejora empírica en DME y PDR. En el modelo de ratón OÍR, el tratamiento con un inhibidor de GH o un antagonista de IGF-1R disminuye significativamente la neovasculapzación retimana. IGF-1 estimula la producción endotelial retiniana del factor de crecimiento endotelial vascular in Vitro. En un modelo diabético de ratón, la terapia de IGF-1 mediata con plásmido invirtió la angiogénesis aumentada diabética y flujo arterial. Por lo tanto, la inhibición de expresión de IGF-1R se proporciona en la presente para tratar angiogénesis ocular que incluye actividad celular pre-angiogénica y angiogénica. La base de datos de GenBank del Nacional center for biotechnology Information en nebi.nlm.nih.gov proporciona una secuencia de ADN para IGFIR co ono .1 de acceso NM_000875, sprovisto en el "Listado de Secuencia" como SEC ID NO: 1. SEC ID N0:1 proporciona la secuencia de hebra de sentido de ADN que corresponde al IGFIR de codificación de mRNA (con la excepción de las bases "T" para las bases "U").La secuencia de codificación para IGFIR es de nucleótidos 46-4149. Equivalentes de la secuencia de IGHFIR mRNA arriba citada son formas de empalme alternativas, formas alélicas, isozimas o un análogo de las mismas. Un análogo es un IGFIR mRNA de otra especie de mamífero que es homólogo a SEC ID NO: 1 (un ortólogo) . Expresión de atenuación de un nRNA: La frase "atenuación de expresión de un mRNA", como se usa en la presente/ significa administrar o expresar una cantidad de RNA de interferencia (v.gr., un siRNA) para reducir la traslación el mRNA de meta hacía proteína, ya sea a través de fragmentación de mRNA o a través de inhibición directa de traslación. La reducción en expresión del RA de meta o la proteína correspondiente se refiere comúnmente como el "extermino" y se reporta con relación a niveles presentes después de la administración o expresión de un RNA de control de no meta (v.gr., un siRNA de control de no meta). El exterminio de expresión de una cantidad que incluye y entre 50 y 100% se contempla por las modalidades en la presente. En una modalidad, un solo RNA de interferencia que se dirige a IGFIR se administra para disminuir la producción de IGFIR, inhibiendo de esta manera la trayectoria de señalización de IGFIR. En otras modalidades, dos o más RNAs de interferencia que se dirigen a IGFIR mRNA se administran para disminuir la expresión. En todavía otras modalidades, un primer RNA de interferencia que se dirige a IGFIR mRNA y un segundo RNA de interferencia que se dirige a otro mRNA de cinasa de tirosina receptora se administrar para efectuar una reducciónen actividad celular preangiogénica y angiogénica ocular. La reducción se determina comúnmente midiendo los nivles de mRNA usando amplificación de reacción de cadena de polimerasa (qPCR) cuantitativa o midiendo los niveles de proteína mediante mancha western o ensayo in unosorbente enlazado con enzima (ELISA) . Analizar los niveles de proteína proporciona una determinación de ambos fragmentación de mRNA así como inhibición de traslación. Técnicas adicionales para medir la reducción incluyen hibridización de solución de RNA, protección de nucleasa, hibridización del norte, supervisión de expresión de gene con una microdisposición enlace de anticuerpo, radioinmunoensayo y análisis de célula activada por fluorescencia. La inhibición de metas citadas en la presente también se infiere en un humano o mamífero observando una mejora en un síntoma de angiogénesis ocular tal como mejora en edema retiniano, retinopatía diabética, isquemia retiniana, o neovascularización de segmento posterior (PSNV)=, por ejemplo. RNA de Interferencia: En una modalidad de la invención, el RNA de interferencia (v.gr., siRNA) tiene una hebra de sentido y un hebra de contrasentido, y las hebras de sentido y contrasentido comprenden una región de cuando menos complementariedad contigua casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos. En una modalidad adicional de la invención, el RNA de interferencia (v.gr., siRNA) tiene una hebra de sentido y una hebra de contrasentido, y la hebgra de contrasentido comprende una reción de complementariedad contigua cuando menos casi perfecdta de por lo menos 19 nucleótidos a una secuencia de meta de IGFIR mRNA, y la hebra de sentido comprende una región de identidad contigua cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos con la secuencia de meta de IGFIR mRNA, respectivamente. En una modalidad adicional de la invención, el RNA de interferencia comprende una región de cuando menos 13, 14, 15, 16, 17 o 18 nucleótidos contiguos que tienen porcentajes de complementariedad de secuencia a o, que tienen porcentajes de identidad de secuencia con, los penúltimos 13, 14, 15, 16, 17 o 18 nucleótidos, respectivamente del extremo 3' de un mRNA correspondiente a la secuencia de meta correspondiente dentro de un mRNA. La longitud de cada hebra del RNA de interferencia comprende 19 a 49 nucleótidos, y puede comprender una longitud de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 nucleótidos. La hebra de contrasentido de un siRNA es el agente de guía activo del siRNA en que la hebra de contrasentido se incorpora en el RISC, permitiendo de esta manera que el RISC identifique mRNAs de meta con cuando menos complementariedad parcial a la hebra de siRNA de contrasentido para fragmentación o represión traslacional . En modalidades de la presente invención, las secuencias de meta de RNA de interferencia (v.gr., secuencias de meta de siRNA) dentro de una secuencia de mRNA de meta se seleccionan usando herramientas de diseño disponibles. Los RNAs deinterferencia correspondientes a una secuencia de meta de IGFIR luego se prueban mediante transfección de células gue expresan el mRNA de meta seguido por determinación de reducción como se describe arriba. Las técnicas para seleccionar secuencias de meta para siRNAs se proporcionan por Tuschl T. y col., "The siRNA User Guide", revisada el 6 de mayo de 2004, disponible en el sitio web de Rockefeller University, ; mediante Technical Bulletin #506 "SiRNA Design Guidelines", Abtion Inc., en el sitio web de TAmbion; y mediante otras herramientas de diseño basadas en web en, por ejemplo, los sitios web de Invitrogen, Dharmacon, Integrated DNA Technologies, Gescript, o Proligo. Los parámetros de búsqueda iniciales pueden incluir contenidos de G/C entre 35% y 55% y longitudes de siRNA entre 19 y 27 nucleótidos. La secuencia de meta puede estar colocada en la región de codificación o en las regiones no trasladadas 50 y 30 del mRNA.

Una modalidad de una secuencia de meta de ADN de 19 nucleótidos para IGFIR mRNA está presente en los nuyclótidos 401° a 419 de SEC ID N0:1: 5' - TCTTCGAGATGACCAATCT - 3' SEC ID NO: 2. Un siRNA de la invención para dirigir una secuencia de mRNA correspondiente de AEC ID NO: 2 y que tiene 21 hebras de nucleótido y un saliente 30 de 2-nucleótidos es: 5' - UCUUCGAGAUGACCAAUCUNN-3' SEC ID NO: 3 3' -NNAGAAGTCUCUACUGGUUAGA-5' SEC ID No : 4. Cada residuo "N" puede ser cualquier nucleótido (A, C, G, U, T) o nucleótido modificado. El extremo 3' puede tener un número de residuos "N" entre e incluyendo 1, 2, 3, 4, 5, y 6. Los residuos "N" en cualquier hebra pueden ser los mismos residuos (v.gr., UU, AA, CC, GG o TT) o pueden ser diferentes (v.gr., AC, AG, AU, CA, CG, CU, GA, GC, GU, UA, UC, o UG) . Los salientes 3' pueden ser los mismos o pueden ser diferentes. En una modalidad, ambas hebras tienen una saliente 3'UU. Un siRNA de la invención para dirigir una secuencia de mRNA correspondiente de SEC ID NO: 2 y que tiene 19 hebras de nucleótido y extremos romos es: 5'- UCUUCGAGAUGACCAAUCU -3' SEC ID NO: 41 3'- AGAAGCUCUACUGGUUAGA -5' SEC ID NO: 42.

Las hebras de un RNA de interferencia de doble hebra (v.gr., un siRNA) se pueden conectar para formar una estructura de pasador o de vastago-enlace (v.gr., un shRNA) , Un shRNA de la invención que se dirige a una secuencia de mRNA correspondiente de SEC ID NO:l que tiene una región de vastago de hebra doble de 19 bp y una saliente 3'UU es NNN / \ 5' -UCUUCGAGAUGACCAAUCU N 3' -UUGAAGCUCUACUGGUUAGA N SEC ID NO: 7 \ / MMM N es un nucleótido A, T, C, G, U, o una forma modificada conocido por uno de experiencia ordinaria en el ramo. El número de nucleótidos N en el lazo es un número entre y que incluye 3 a 23, o 15 a 15, o 7 a 13, o 4 a 9, 9 9 a 11, o el número de nucleótidos N es 9. Algunos de los nucleótidos en el lazo puede involucrarse en interacciones de par de base con otros nucleótidos en el lazo. Los ejemplos de secuencias de oligonucleótido que se pueden usar para formar el lazo incluyen 5' -UUCAAG GA-3' (Brummelkamp, T.R., y col. (2002) Science 296: 550) y 5' -UUUGUGUAG-3' (Castanotto, D., y col. (2002) RNA8:1454). Se reconocerá por un experto en el ramo que el orligonucleótido de cadena sencilla resultante forma un vástago-lazo o estructura de pasador que comprende una región de doble hebra capaz de interactuar con la maquinaria de RNAi. La secuencia de meta siRNA arriba identificada se puede extender en el extremo 3' para facilitar el diseño de dobles de cortador-substrato 27-mer. La extensión de una secuencia de meta de ADN de 19 nucleótidos (SEC ID NO: 2) identificada en la secuencia de IGFIR ADN (SEC ID NO:l) mediante 6 nuycleótidos proporciona una secuencia de meta de ADN de 25 nucleótidos presente en los nucleótidos 401 a 425 de SEC ID NO:l: 5' - TCTTCGAGATGACCAATCTCAAGGA -3' SEC ID NO: 3. Un doble de cortador-substrato 27-mer de la invención para dirigir una secuencia de mRNA correspondiente de SEC ID NO: 43 es: 5' - UCUUCGAGAUGACCAAUCUCAAGGA -3' SEC ID NO: 44 3' - UUAGAAGCUCUACUGGUUAGAGUUCCU -5' SEC ID NO: 45. Los dos nucleótidos en el extremo 3' de la hebra de sentido (es decir, los núcletidos GA de SEC ID NO: 44) pueden ser deoxinucleótidos para procesamiento mejorado. El diseño de dobles coarbador-substrato 27-mer de secuencias de meta de 19-21 nucleótidos, tales como se proporcionan en la presente, se describe adicionamente por el sitio web Integrated DNA Technologies (IDT) y por Kim, H.-H., y col., (febrero de 2005) Nature Biotechnology 23:2; 222-226. Cuando se producen RNAs de interferencia mediante síntesis guímica, la fosforilación en la posición 5' del nucleótido en el extremo 5' de una o ambas hebras (cuando están presentes) puede mejorar la eficacia de siRNA y la especificidad del comjplejo de RISC ligado pero no se requiere puesto que la fosforilación puede ocurrir intracelularmente . El Cuadro 1 enumera ejemplos de secuencias de meta de IGFIR ADN de SEC ID NO:l de los que los siRNAs de la presente invención están diseñados de una manera como se expone arriba. IGFIR codifica receptor de factor-1 de crecimiento semejante a insulina, como se anota arriba. Cuadro 1 : Secuencias de meta de IGFIR para SiRNAs Secuencia de Meta # de Nucleótido de Partida SEC ID NO: de IGFIR con referencia a SEC ID No:l Como se citó en los ejemplos anteriores, uno de experiencia en el ramo es capaz de usar la información de secuencia de meta provista en el Cuadro 1 para diseñar RNAs de interferencia que tienen una longitud más corta o más larga que las secuencias proporcionadas en el cuadro y haciendo referencia a la posición de secuencia de SEC ID N0:1 y añadiendo u omitiendo los nucleótidos completarlos o casi complementarios a SEC ID N0:1. La reacción de fragmentación de RNAde meta mediante siRNAs y otras formas de RNA de interferencia es una secuencia altamente específica. En general, siRNA que contiene una hebra de nucleótido de sentido idéntica en secuencia a una porción del RNAde meta y una hebra de nucleótido de contrasentido exactamente complementaria a una porción el mRNA de meta son modalidades de siRNA para inhibición de mRNA citadas en la presente. Sin embargo, 100% de complementariedad de secuencia entre la hebra de siRNA de contrasentido y el mRNA de metal, o entre la hebra de siRNA de contrasentido y la hebra de siRNA de sentido, no se requiere para practicar la presente invención. De esta manera, por ejemplo, la invención permite variaciones de secuencia que se podrían esperar debido a mutación genética, polimorfismo de cepa, o divergencia de evolución. En una modalidad de la invención, la hebra de contrasentido del siRNA tiene complementariedad contigua cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos con el mRNA de meta, "casi perfecta", como se usa en la presente, significa que la hebra de contrasentido del siRNA es "substancialmente complementaria a", y le hebra de sentido de siRNA es "substancialmente idéntica a" cuando menos una porción del mRNA de meta, "identidad", como se sabe por uno de experiencia ordinaria en el ramo, es el grado de relación de secuencia entre secuencias de nucleótido como se determina haciendo coincidir el orden e identificad de los nucleótidos entre las secuencias. En una modalidad, la hebra de contrasentido de un siRNA que tiene 80% y entre 80 hasta 100% de complementariedad, por ejemplo, 85%, 90% o 95% de complementariedad, a una secuencia de mRNA de meta se consideran complementariedad casi perfecta y se pueden usar en la presente invención Complementariedad contigua "perfecta" es el emparejamiento de base de Watson-Crick convencional de pares de base adyacentes. Complementariedad conticua "cuando menos casi perfecta" incluye complementariedad "perfecta" como se usa en la presente. Los métodos de computadora para determinar la identidad o complementariedad están diseñados para identificar el mayor grado de coincidencia de secuencias de nucleótido, por ejemplo BLASTN (Altschul, S.f., y col. (1990) J. Mo . Biold. 215:403-410) . El término "por ciento de identidad" describe el porcentaje de nucleótidos contiguos en una primera molécula de ácido nucleico que es la misma que en un juego de nucleótidos contiguos de la misma longitud en una segunda molécula de ácido nucleico. El término "por ciento de complementariedad" describe el porcentaje de nucleótidos contiguos en una primera molécula de ácido nucleico que se pueden basar en par en el sentido de Watson-Crick con un juego de nucleótidos contiguos en una segunda molécula de ácido nucleico. La relación entre un mRNA de meta (hebra de sentido) y una hebra de un siRNA (la hebra de sentid) es agüella de identidad. La hebra de sentido de un siRNA también se llama una hebra pasajera, si está presente. La relación entre un mRNA de meta (hebra de sentido) y la otra hebra de un siRNA (la hebra de contrasentido) es aquella de complementariedad. La hebra de contrasentido de un siRNA también se llama una hebra de guía. La penúltima base en una secuencia de ácido nucleico que se escribe en una dirección 5' a 3' es la siguiente a la última base, es decir, la base siguiente a la base 3' . Las penúltimas 13 bases de una secuencia de ácido nucleico escrita en una dirección 5' a 3' son las últimas 13 bases de una secuencia siguiente a la base 30 y que no incluye la base 3' . De manera similar, las penúltimas 14, 15, 16, 17 o 18 bases de una secuencia de ácido nucleico escrita en una dirección 5' a 3' son las últimas 14, 15, 16, 17 o 18 bases de una secuencia, respectivamente siguiente a la base 3' y no incluyendo la base 3' . La frase "una región de cuando menos 13 nucleótidos contiguos que tienen cuando menos 90% de complementariedad de secuencia a, o cuando menos 905 de identidad de secuencia con, los penúltimos 13 nucleótidos del extremo 3' de un mRNA correspondiente a cualquiera de (un identificador de secuencia)" permite una substitución de un nucleótido. Las substituciones de nucleótido (es decir, 11/13 = 89% de identidad/complementariedad) no se incluyen en dicha frase. En una modalidad de la invención, la región de nucleótidos contiguos es una región de cuando menos 14 nucleótidos contiguos que tienen cuando menos 85% de complementariedad de secuencia a, o cuando menos 85% de identidad de secuencia con, los penúltimos 14 nucleótidos del extremo 3' de un mRNA correspondiente a la secuencia identificada por cada identificador de secuencia. Dos substituciones de nucleótido (es decir, 12/14 = 80% de identidad/complementariedad) se incluyen en dicha frase. En una modalidad adicional de la invención, la región de nucleótidos contiguos es una región de cuando menos 15, 16, 17 o 18 nucleótidos contiguos gue tienen cuando menos 805 de complementariedad de secuencia a, o cuando menos 805 de identidad de secuencia con, los penúltimos 14 nucleótidos del extremo 3' de un mRNA correspondiente a la secuencia del identificador de secuencia. Estas substituciones de nucleótido se incluyen en dicha frase.

La secuencia de meta en los mRNAs correspondientes a SEC ID N0:° pueden estar en las regiones 5' o 3' no trasladadas del mRNA así como en la región de codificación del mRNA. Una o ambas de las hebras del RNA de interferencia de dobe hebra pueden tener una saliente 3' de 1 a 6 nucleótidos, que pueden ser ribonucleótidos o deoxirribonucleótidos o una mezcla de los mismos. Los nucleótidos de la saliente no están emparejados en base. En una modalidad de la invención, el RNA de interferencia comprende una saliente 3' de TT o UU. En otra modalidad de la invención, el RNA de interferencia comprende cuando menos un extremo romo. Los términos usualmente tienen un grupo fosfato 5' o un grupo hidroxilo 3' . En otras modalidades, la hebra de contrasentido tiene un grupo fosfato 5' , y la hebra de sentido tiene un grupo hidroxilo 5' . En todavía otras modalidades, los términos se modifican adicionalmente mediante la adición covalente de otras moléculas o grupos funcionales . Las hebras de sentido y contrasentido del siRNA de doble hebra puede estar en una formación doble de dos hebras sencillas como se describe arriba o pueden ser una sola molécula en donde las regiones de complementariedad están emparejadas en base y están covalentemente enlazadas a un lazo de pasador de manera de formar una sola hebra. Se cree que el pasador se fragmenta intracelularmente mediante una proteíana denominada cortador para formar un RNA de interferencia de dos moléculas de RNA individuales emparejadas en base. Los RNAs de interferencia pueden diferir de RNA que ocurre naturalmente mediante la adición, omisión, substitución o modificación de uno o más nucleótidos. El material no no nucleótido puede estar ligado al RNA de interferencia, ya sea en el extremo 5' , el extremo 3' , o internamente. Dichas modificaciones están comúnmente diseñadas para aumentar la resistencia de nucleasa de los RNAs de interferencia, para mejorar la admisión celular, para mejorar la dirección celular, para ayudar a trazar el RNA de interferencia, para mejorar adicionalmente la estabilidad, o para reducir el potencial para activación de la trayectoria de interferón. Por ejemplos los RNAs de interferencia pueden comprender un nucleótido de purina en los extremos de salientes. La conjugación de colesterol al extremo 3' de la hebra de sentido de una molécula siRNA por medio de un enlazador de pirrolidina, por ejemplo, también proporciona estabilidad a un siRNA.

Modificaciones adicionales incluyen una molécula de biotina terminal 3', un péptido conocido por tener propiedades de penetración de célula, una nanopartícula, un peptidomimético, un tinte fluorescente, o un dendrímero, por ejemplo. Los nucleótidos se pueden modificar en su porción de base, en su porción de azúcar, o en la porción de fosfato de la molécula y funcionar en modalidades de la presente invención. Las modificaciones incluyen substituciones con grupos alquilo, alcoxilo, amino, deaza, halo, hidroxilo, tiol, o una combinación de los mismos, por ejemplo. Los nucleótidos se pueden substituir con análogos con mayor estabilidad tal como reemplazando un ribonucleótido con un deoxirribonucleótido, o tener modificaciones de azúcar tales como grupo OH 2' reemplazados por grupos amino 2', grupos 0-metilo 2', grupos metoxietilo 2', o un puente 2'-0, 4'-C metileno, por ejemplo. Los ejemplos de un análogo de purina o pirimidina de nucleótidos incluyen la xantina, una hipoxantina, una azapurina, una metiltioademina, 7-deaza-adenoxina y nucleótidos 0- o N-modificados . El grupo fosfato del nucleótido se puede modificar substituyendo uno o más de los oxígenos del grupo fosfato con nitrógeno o con azufre (fosforotioatos) . Las modificaciones son útiles, por ejemplo, para mejorar la función, para mejorar la estabilidad o permeabilidad, o para localización o dirección directa. Puede haber una región o regiones de la hebra de RNA de interferencia de contrasentido que no son complementarias a una porción de SEC ID NO:l. Las regiones no complementarias pueden estar en 3' , 5' o ambos extremos de una región complementaria o entre dos regiones complementarias . Los RNAs de interferencia se pueden generar exógenamente mediante síntesis química, mediante transcripción in Vitro, o mediante fragmentación de RNA de doble hebra más larga con cortador u otra nucleasa apropiada con actividad similar. Los RNAs de interferencia químicamente sintetizados, producidos de fosforamiditas de ribonucleótido protegidas usando un sintetizador de ADN/RNA convencional, se pueden obtener de proveedores comerciales tales como Ambion Inc. (Austin, TX) , Invitrogen (Carlsbad, CA) , o Dpharmacon (Lafayette, CO) . Las RNAs de interferencia se purifican mediante extracción con un solvente o resina, precipitación electroforesis, cromatografía, o una combinación de los mismos, por ejemplo. Alternativamente, el RNA de interferencia se puede usar con poca, si hay alguna, purificación para evitar pérdidas debidas a procesamiento de muestra. Los RNAs de interferencia también se pueden expresar endógenamente de plásmido o vectores de expresión viral o de cassettes de expresión mínima. Por ejemplo fragmentos generados de PCR gue comprenden uno o más promotores y una plantilla apropiada o plantillas para el RNA de interferencia. Los ejemplos de vectores de expresión basados en plásmido comercialmente disponibles para shRNA incluyen miembros de las series pSilincer (Ambion, Austin, TX) y pCpG-siRNA (InvivoGen, San Diego, CA) . Los vectores virales para expresión de RNA de interferencia se pueden derivar de una variedad de virus incluyendo adenovirus, virus asociado con adeno, lentivirus (v.gr. HIV, FIV, y EIAV) , y virus de herpes. Los ejemplos de vectores virales comercialmente disponibles para expresión de shRNA incluyen pSilencer adeno (Ambion, Austin, TX) y pLenti6/BLOCK-iTMR-DEST (Invitrogen, Carlsbad, CA) . La selección de vectores virales, métodos para expresar el RNA de interferencia del vector y métodos para entregar el vector viral están dentro de la experiencia ordinaria de uno en el ramo. Ejemplos de equipos de producción de cassettes de expresión de shRNA generada por PCR incluyen Silencer Express (Ambion, Austin, TX) , y siXpress (Mirus, Madison, Wl) . Un primer RNA de interferencia se puede administrar a través de expresión en vivo de un primer vector de expresión capaz de expresar el primer RNA de interferencia y un segundo RNA de interferencia se puede administrar a través de expresión en vivo de un segundo vector de expresión capaz de espresar el segundo RNA de interferencia, o ambos RNAs de interferencia se pueden administrar a través de expresión en vivo de un vector de expresión sencillo capaz de expresar ambos RNAs de interferencia. Los RNAs de interferencia se pueden expresar de una variedad de promotores eucarióticos conocidos por aquellos de expriencia ordinaria en el ramo, incluyendo promotores de pol III, tales como los promotres U6 o Hl, o promotores pol II, tales como el promotor citomegalovirus . Aquellos de experiencia en el ramo reconocerán que estos promotores también se pueden adaptar para permitir expresión inducible del RNA de interferencia. Hibridización bajo Condiciones Fisiológicas: En ciertas modalidades de la presente invención, una hebra de contrasentido de un RNA de interferencia se hibridiza con un mRNA en vivo como parte del complejo RISC. 80 "Hibridización" se refiere a un proceso en el que ácidos nucleicos de una sola hebra con secuencias de base complementarias o casi complementarias interact ' 'uan para formar complejos enlazados con hidrógeno llamados híbridos. Las reacción de hibridización son sensibles y selectivas. In Vitro, la especificidad de hibridización (es decir, exigencia) se controla mediante las concentraciones de sal o formamida en soluciones de prehibridización e hibridización, por ejemplo, y mediante la temperatura de hibridización; dichos procedimientos son bien conocidos en el ramo. En particular, la exigencia se aumenta reduciendo la concentración de sal, aumentando la concentración de formamida, o elevando la temperatura de hibridización. Por ejemplo, condiciones de alta exigencia podrían ocurrir a alrededor de 505 de formamida a 37°C a 42°C. Condiciones de exigencia reducida podrían ocurrir a alrededor de 35% a 25% de formamida a 30°C a 35°CD. Los ejemplos de condiciones de exigencia para hibridización se proporcionan en Sambrook, J., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Ejemplso adicionales de condiciones de hibridización exigentes incluyen 400 nM de NaCl, 40 mM de PIEPES pH 6.4, 1 mM de EDTA, 50° 9 70°C durante 12-16 horas seguido por lavado, o híbridización a 70°C en IXSSC o 50°C en IXSSC, 50% de formamida seguido por lavado a 70°C en 0.3XSSC, o hibridización a 70°C en 4XSSC of 50°C en 4XSSC, 50% de formamida seguido por lavado a 67°C en 1XSSC. La temperatura para hibridización es alrededor de 5-10°C menor que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido en donde Tm se determina para híbridos entre 19 y 40 pares de base en longitud usando el siguiente cálculo: Tm °C = 81.5 + 16.6 (log?o[Na+j) + 0.41 (% G+C) - (600/n) en donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones de sodio en el tampón de hibridización. El ensayo de hibridización in Vitro arriba descrito proporciona un método para predecir si el enlace entre un siRNA candidato y una meta tendrá especificidad. Sin embargo, en el contexto del complejo RISC, la fragmentación específica de una meta también puede ocurrir con una hebra de contrasentido que no demuestra exigencia elevada para hibridización in Vitro. RNA de interferencia de una sola hebra: Como se citó arriba, los RNAs de interferencia finalmente funcionan como hebras sencillas. El RNA de interferencia de hebra sencilla (ss) se ha encontrado que efectúa el silenciamiento de mRNA, a pesar de que menos eficientemente que siRNA de doble hebra. Por lo tanto, las modalidades de la presente invención también provee la administración de un RNA de interferencia ss que se hibriza bajo condiciones fisiológicas a una porción de SEC ID NO: 1 y tiene una región de complementariedad contigua cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos con la porción de hibridización de SEC IDN0:1. El RNA ss de interferencia tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos como para el siRNA ds arriba citado. El RNA de inteferencia ss tiene un fosfato 5' o es fosforilado in situ o in vivo en la posición 5' . Rl y'rtmino "fosforilado en 5'" se usa para describir, por ejemplo, polinucleótidos u oligonucleótidos que tienen un grupo fosfato fijado a través de enlace de éster al hidroxilo C5 del azúcar (v.gr., ribosa, desoxiribosa, o un análogo de los mismos) en el extremo 5' del polinucleótido u oligonucleótido . Los RNAs de interferencia SS se sintetizan químicamente o mediante transcripción in Vitro o se expresan endógenamente de vectores o cassettes de expresión como para RNAs de interferencia ds . Los grupos fosfato 5' se pueden añadir a través de una cisana, o un fosfato 5' puede ser el resultado de fragmentación de nucleasa de un RNA. La entrega es para RNAs de interferencia ds . En una modalidad, como los RNAs de interferencia que tienen extremos protegidos y modificaciones resistentes a la nucleasa se administrar para silenciar. Los RNAs de interferencia ss se pueden secar para alcacenamiento o disolver en una solución acuosa. La solución puede contener tampones o sales para inhibir el recocido o para estabilización. RNA de interferencia de pasador: un RNA de interferencia de pasador es una sola molécula (v.gr., una sola cadena de oligonucleótido) que comprende ambas hebras de sentido y contrasentido de un RNA de interferencia en una estructura de vástago-lazo o pasador (v.gr., un shRNA). Por ejemplo, shRNAs se pueden expresar de vectores de ADN en los que los oligonucleótidos de ADN que codifican una hebra de RNA de interferencia de sentido están enlazados a los oligonucleótidos de ADN que codifican la hebra de RNA de interferencia de contrasentido complementaria inversa mediante un espaciador corto. Si se necesita para el vector de expresión escogido, la terminal 3' TOs y nucleótidos que forman sitios de restricción se pueden añadir. La transcripción de RNA resultante se doble sobre sí misma para formar la estructura de vástago-lazo. Modo de administración. El RNA de interferencia se puede entregar a través de administración en aerosol, bucal, dérmica, intradérmica, inhalación, intramuscular, intranasal, infraocular, intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal, nasal, ocular, oral, ótica, parenteral, parche, subcutánea, sublingual, tópica o transdérmica, por ejemplo. El RNA de interferencia se puede entregar directamente al ojo mediante inyección de tejido ocular tal como periocular, conjuntival, subtenón, intracameral, intravitreal, infraocular, subretiniana, subconjuntival, retrobulbar o inyecciones intracanaliculares; mediante aplicación directa al ojo usando un catéter u otro dispositivo de colocación tal como un granulo retiniano, inserción infraocular, supositorio o un implante que comprende un material poroso, no poroso, o gelatinoso; mediante gotas o ungüentos oculares tópicos; o mediante un dispositivo de liberación lenta en el culo de bolsa o implantado adyacente a la esclera (transescleral) o dentro del ojo. La inyección intracameral puede ser a través de la córnea hacia la cámara anterior para permitir que el agente alcance la red trabecular. La inyección intracanalicular puede ser hacia canales colectores venosos que3 drenan el canal de Schlem o hacia el canal de Schlemm. Sujeto: Un sujeto en necesidad de tratamiento para angiogenésis ocular o en riesgo de desarrollar angiogenésis ocular es un humano u otro mamífero que tiene angiogenésis ocular o en riesgo de tener angiogenésis ocular asociada con expresión no deseada o inapropiada o actividad de IGR-1R como se cita en la presente. Las estructuras oculares asociadas con dichos desórdenes pueden incluir el ojo, retina, coroide, cristalino, córnea, red trabecular, iris, nervio óptico, cabeza de nervio óptico, esclera, segmentos anterior o posterior, o cuerpo ciliar, por ejemplo. Un sujeto también puede ser una célula ocular, cultivo de célula, órgano o un órgano o tejido ex vivo. Formulaciones y Dosificación: Las formulaciones farmacéuticas comprenden RNAs de interferencia, o sales de los mismos, de la invención hasta 99% en peso mezclados con un portador fisiológicamente aceptable tal comko agua, tampón, salina, glicina, ácido hialurónico, manitol, y lo semejante . Los RNAs de inteferencia de la presente invención se administran como soluciones, suspensiones, o emulsiones. Los siguientes son ejemplos de posibles formulaciones moralizadas por esta invención. Cantidad en % en peso RNA de interferencia hasta 99; 0.1-99; 0.1 - 50; 0.5 - 10.0 Hidroxipropilmetilcelulosa 0.5 Cloruro de sodio 0.8 Cloruro de Benzalconio 0.01 EDTA 0.01 NaOH/HCl qs pH 7.4 Agua purificada (libre de RNase) qs 100 mL Cantidad en % en peso RNA de interferencia hasta 99; 0.1-99; 0.2-50; 0.5-10.0 Salina Tamponada de Fosfato 0.5 Cloruro de Benzalconio 0.01 Polisorbato 80 0.5 Agua purificada (libre de RNase) q.s. a 100% Cantidad en % en peso RNA de interferencia hasta 99; 0, 1-99; 0.1 - 50; 0.5 - 10.0 Fosfato de sodio monobásico 0.05 Fosfato de sodio dibésico 0.15 (anhidro) Cloruro de sodio 0.75 EDTA disódico 0.05 EL de Cromofor 0.1 Cloruro de Benzalconio 0.01 HCl y/o NaOH pH 7.3-7.4 Agua purificada (Libre de RNase) q.s. a 100% Cantidad en % en peso RNA de interferencia hasta 99; 0.1-99; 0.1-50; 0.5 - 10.0 Salina Tamponada con Fosfato 1.0 Hidroxipropil-ß-ciclodextrina .0 Agua purificada (Libre de RNase) q.s. a 100% Generalmente, una cantidad efectiva de los RNAs de interferencia de modalidades de la invención resulta en una concentración extracelular en la superficie de la célula de meta de 100 pM a 1 uM, o de 1 Nm a 100 nM, o de 5 nM a alrededor de 50 nM, o de alrededor de 25 nM. La dosis requerida para lograr esta concentración local variará dependiendo de un número de factores que incluyen el método de entrega, el sitio de entrega, el número de capas de célula entre el sitio de entrega y la célula de meta o tejido, si la entrega es local o sistémica, etc. La concentración en el sitio de entrega puede ser considerablemente superior que lo que es en la superficie de la célula o tejido de meta. Las composiciones tópicas se entregan a la superficie del órgano de meta una a cuatro vecdes al día, o en un programa de entrega prolongado tal como diariamente, semanalmente, bisemanalmente, mensualmente, o más prolongado, de conformidad con la discreción de rutina de un clínico experimentado. El pH de la formulación es alrededor de pH 4-9, o pH 4.5 a pH 7.4. El tratamiento terapéutico de pacientes con RNAs de interferencia dirigido contra IGFIR mRNA se espera que sea benéfico sobre tratamientos de molécula pequeña aumentando la duración de acción, permitiendo de esta manera dosificación menos frecuente y mayor cumplimiento del paciente. Una cantidad efectiva de una formulación puede depender de factores tales como edad, raza, y sexo del sujeto, la severidad de la angiogenésis ocular, el régimen de transcripción de gene/vuelta de proteína de meta, la potencia del RNA de interferencia, y la estabilidad de RNA de interferencia, por ejemplo. En una modalidad, el RNA de interferencia se entrega tópicamente a un órgano de meta y alcanza el tejido que contiene IGFIR mRNA tal como la retina o cabeza de nervio óptico a una dosis terapéutica, mejorando de esta manera un proceso de enfermedad asociado con angiogenesis . Portadores aceptables: Un portador aceptable se refiere a aquellos portyadores que ocasionan cuando mucho, poca o ninguna irritación ocular, proporcionan conservación apropiada si se necesita, y entregan uno o más RNAs de interferencia de la presente invención en una dosificación homogénea. Un portador aceptable para administración de RNA de interferencia de modalidades de la presente invención incluyen los reactivos de transfección basados en lípido catiónico TransIT®-TKO (Mirus Corporation, Madison, Wl), LIPOFECTIN®, Lipofectamina, OLIGOFECTAMINEMR (Invitrogen, Carlsbad, CA) , o DHARMAFECTMR (Dharmacon, Lafayette, CO) ; policationes tales como polietilenimina; péptidos catiónicos tales como Tat, poliarginina, o Penetratina (péptido Antp) ; o liposomas. Las liposomas se forman de lípidos formadores de vesícula convencionales y un esterol, tal como colesterol, y pueden incluir una molécula de dirección y tal como un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de enlace para antígenos de superficie de célula endotelial, por ejemplo. Además, las liposomas pueden ser liposomas PEGiladas. Los RNAs de interferencia se pueden entregar en solución, en suspensión, o en dispositivos de entrega bioerosionables o no bioerosionables . Los RNAs de interferencia se pueden entregar solos o como componentes de conjugados covalentes, definidos. Los RNAs de interferencia también se pueden formar en complejo con lípidos catiónicos, péptidos catiónicos, o polímeros catiónicos; hechos complejo con proteínas, proteínas de fusión, o dominios de proteína con propiedades de enlace de ácido nucleico (v.gr., protamina) ; o encapsulados en nanopartículas o liposomas La entrega específica de tejido o célula se puede lograr mediante la inclusión de una fracción de dirección apropiado tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Para entrega oftálmico, un RNA de interferencia se puede combinar con conservadores oftalmológicamente aceptables, cosolventes, agentes tensioactivos, mejoradotes de viscosidad, mejoradotes de penetración, tampones, cloruro de sodio, o agua para formar una suspensión o solución oftálmica acuosa, estéril. Las formulaciones en solución se pueden preparar disolviendo el RNA de interferencia en un tampón acuoso isotónico fisiológicamente aceptable. Además, la solución puede incluir un agente tensioactívo aceptable para ayudar a disolver el inhibidor. Los agentes de formación de viscosidad, tales como hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, o lo semejante se puede añadir a las composiciones de la presente invención para mejorar la retención del compuesto. A fin de preparar una formulación de ungüento oftálmico estéril, el RNA de interferencia se combina con un conservador en un vehículo apropiado, k tal como aceite mineral, lanolina líquida, o vaselina blanca. Las formulaciones de gel oftálmico estériles se pueden preparar suspendiendo el RNA de interferencia en una base hidrofílica preparada de la combinación de, por ejemplo, CARBOPOL®-940 (BF Goodrich, Charlotte, NC) , o lo semejante, de conformidad con métodos conocidos en el ramo. VISCOAT® (Alcon Laboratorios, Inc., Fort Worth, TX) se puede usar para inyección infraocular, por ejemplo. Otras composiciones de la presente invención puedencontener agentes que mejoran la penetración tales como cremefor y TWEEN® 80 (monolaureato de sorbitán de polioxietileno, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) , en el evento de que el RNA de interferencia sea menos penetrante en el ojo. Equipos. Las modalidades de la presente invención proporcionan un equipo que incluye reactivos para atenuar la expresión de un mRNA como se cita en la presente en una célula. El equipo contiene un siRNA o un vector de expresión de shRNA. Para siRNAs y vectores de expresión de shRNA no virales el equipo también contiene un reactivo de transfección u otro vehículo de entrega apropiado. Para vectores de expresión de shRNA viral, el equipo puede contener un vector viral y/o los componentes necesarios para producción de vector viral (v.gr., una línea de 'célula de empaque así como un vector que comprende la plantilla de vector viral y vectores de ayuda adicionales para empaque) . El equipo también puede contener siRNAs o vectores de expresión de shRNA de control positivos y negativos (v.gr., un siRNA de control de no dirección o un siRNA que apunta a un mRNA no relacionado) . El equipo también puede contener reactivos para determinar la reducción del gene de meta pretendido (v.gr., imprimadores y sondas para PCR cuantitativo para detectar el mRNA de meta y/o anticuerpos contra la proteína correspondiente para manchas western) . Alternativamente, el equipo puede comprender una secuencdia de siRNA o una secuencia de shRNA y las instrucciones y materiales necesarios para gednerar el siRNA mediante transcripción in Vitro o para construir un vector de expresión de shRNA. Una combinación farmacéutica en forma de equipo se proporciona además que incluye, en combinación empacada, un medio portador adaptado para recibir un medio de recipiente en confinación cerrada con el mismo y un primer medio de recipiente que incluye una composición de RNA de interferencia y un portador aceptable. Estos equipos pueden incluir además, si se desea, uno o más componentes de diversos componentes de equipo farmacéuticos convencionales, tales como por ejemplo, recipientes con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, recipientes adicionales, etc., como será evidente a aquellos expertos en el ramo. Instrucciones impresas, ya sea como inserciones o como etiquetas, cantidades de indicación de los componentes que se van a administrar, líneas de guía para administración, y/o líneas de guía para mezclar los componentes también se pueden incluir en el equipo. La capacidad de RNA de interferencia de reducir los niveles de expresión de gene de meta endógeno, por ejemplo, en una línea de célula ocular humana se evalúa in Vitro como sigue. Las células humanas transformadas se colocan en placas 24 h antes de la transfección en medio de crecimiento convencional (v.gr., DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal) . La transfección se realiza usando Dharmafect 1 (Dhgarmacon, Lafayette, CO) de conformidad con las instrucciones del fabricante a concentraciones de RNA de interferencia que varían de 0.1 nM - 100 nM. El siRNA de control de no apuntar y siRNA de lamina A/C (Dharmacon) se usan como controles. Los niveles de mRNA de meta se determinan mediante qPCR 24 horas después de transfección usando, por ejemplo, imprimadores de avance y reversa TAQMAN® y un juego de sonda gue abarca el sitio de meta (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Los niveles de proteína de meta se pueden determinar aproximadamente 72 h después de transfección (el tiempo real dependiendo del régimen de cambio de proteína) mediante mancha western, por ejemplo. Las técnicas convencionales para RNA y/o aislamiento de proteína de células cultivadas son bien conocidos a aquellos expertos en el ramo. Para reducir la probabilidad de efectos no específicos, fuera de meta, la posible concentración más baja de RNA de interferencia se usa que produce el nivel deseado de reducción en expresión de gene de metal. La capacidad de RNAs de interferencia de la presente invención para reducir niveles de expresión de proteína de IGR-1R se ejemplifica además en el Ejemplo 1 como sigue . Consecuentemente, se describe en la presente cuando menos. Un método para atenuar la expresión de IGFIR mRNA en un sistema de expresión, el método comprendiendo: administrar el sistema de expresión una composición que comprende una cantidad efectiva de RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable, el RNA de interferencia comprendiendo: una hebra de nucleótido de sentido, una hebra de nucleótido de contrasentido, y una región de complementariedad contigua cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos; en donde la hebra de nucleótido de contrasentido se hibridiza bajo condiciones fisiológicas a una porción de mRNA correspondiente a SEC ID N0:1 y tiene una región de complementariedad contigua cuando menos casi perfecta y cuando menos 19 nucleótidos con la porción de hibridización de mRNA correspondiente a SEC ID NO:l, en donde la expresión de IGFIR RNBA se atenúa por la misma. El uso de un medicamento para tratar angiogenésis ocular en un sujeto en necesidad del mismo, el método compende: administrar a un ojo del sujeto, una composición que comprende una cantidad efectiva de RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable, el RNA de interferencia comprendiendo: una hebra de nucleótido de sentido, una hebra de nucleótido de contrasentido, y una región de complementariedad contigua cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos, en donde la hebra de nucleótido de contrasentido se hibridiza bajo condiciones fisiológicas a una porción de mRNA correspondiente a SEC ID NO: 1, y tiene una región de complementariedad contigua casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos con la porción de hibridización de mRNA correspondiente a SEC ID N0:1, en donde la angiogenésis ocular se trata por el mismo. Un método para atenuar la expresión de IGFIR mRNA en un sistema de expresión, el método comprendiendo: administrar al sistema de expresión una composición que comprende una cantidad efectiva de RNA de interferencia de una sola hebra que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el RNA de interferencia de una sola hebra se hibridiza bajo condiciones fisiolólgicas a una porción de mRNA correspondiente a SEC IC NO:l gue comprende nucleótido 401, 635, 1062, 1548, 1643, 1766, 1922, 2012, 2069, 2210, 2416, 2423, 2654, 2909, 3339, 3419, 3464, 3476, 3505, 3512, 3781, 3872, 3881, 4064, 4158, 4411, 4487, 4904, 4905, 4909, 3329, 2323 o 28887, y el RNA de interferencia tiene una región de complementariedad contigua cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos con la porción de hibridización de mRNA correspondiente a SEC ID NO:l, en donde la expresión de IGFIR mRNA se atenúa por el mismo .

Un método para atenuar la expresión de IGFIR mRNA en un sistema de expresión, el método comprendiendo: administrar al sistema de expresión una composición que comprende una cantidad efectiva de RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 s 49 nucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable, el RNA de interferencia comprendiendo: una región de cuando menos 13 nucleótidos contiguos que tienen cuando menos 80% de complementariedad de secuencia a, o por lo menos 80 identidad de secuenciaron, los penúltimos 13, 14, 15, 16, 17 o 18 nucleótidos del extremo 3' de un mRNA correspondiente a cualquier de SEC ID NO: 2, y SEC ID NO: 87 - SEC ID NO: 40, en donde la expresión de IGFIR Mrna se atenúa por el mismo. El uso, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de angiogénesis ocular en un sujeto, de una composición que comprende: una cantidad efectiva de RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable, el RNA de interferencia comprendiendo: una región de cuando menos 13 nucleótidoscontiguos gue tienen cuando menos 90% de complementariedad de secuencia a, o cuando menos 90% de identidad de secuencia con, los penúltimos 13nucleótidos del extremo 3' de un mRNA correspondiente a cualquiera de SEC ID NO: 2, y SEC ID NO: 8 - SEC ID NO: 40, en donde la angiogenésis ocular se trata por la misma. El uso en la preparación de un medicamento para el tratamiento de angiogenésis ocular en un sujeto, de una composición que comprende: una molécula de siRNA de doble hebra que regula descendentemente la expresión de uyn gene de IGFIR a través de interferencia de RNA, en donde. Cada hebra de la molécula de siRNA es independientemente de alrededor de 19 a alrededor de 27 nucleótidos de longitud; y una hebra de la molécula de siRNA comprende una secuencia de nucleótido que tiene complementariedad substancial al mRNA correspondiente al gene IGFIR, respectivamente, de modo que la molécula de siRNA dirija la fragmentación del mRNA a través de interferencia de RNA. Una composición que comprende un RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y que comprende una secuencia de nucleótido que corresponde a cualquiera de SEC ID NO: 2, y SEC ID NO: 8 - SEC ID NO: 40, o un complemento de las mismas, y un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición que comprende una molécula de siRNA de doble hebra que regula descendentemente la expresión de un gene de IGFIR a través de interferencia de RNA, en donde: cada hebra de la molécula siRNA es independientemente alrededor de 19 a alrededor de 27 nucleótidos en longitud; y una hebra de la molécula de siRNA comprende una secuencia de nucleótido que tiene complementariedad substancial a un mRNA correspondiente al gene IGFIR de manera que la molécula de siRNA dirige la fragmentación del mRNA a través de interferencia de RNA y Un método para atenuar la expresión de IGFIR mRNA a un sujeto que expresa IGFIR mRNA, el método comprendiendo: administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nyucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable, el RNA de interferencia comprendiendo: una hebra de nucleótido de sentido, una hebra de nucleótido de contrasentido, y una región dee complementariedad continua cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos; en donde la hebra de nucleótido de antisentido se hibridiza bajo condiciones fisiológicas a una porción de mRNA correspondiente a SEC ID NO:l y tiene una región de una complementariedad contigua cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos con la porción de hibridización de mRNA correspondiente a SEC ID NO:l, en donde la expresión de IGFIR mRNA se atenúa por el mismo.

La invención se puede moralizar en otras formas específicas sin abandonar su espíritu o características esenciales. Las modalidades descritas deben considerarse en todos los aspectos solamente como ilustrativas y no restrictivas. El alcance de la invención, por lo tanto, se indica por las reivindicaciones anexas más bien gue por la descripción anterior. Todos los cambios en las reivindicaciones que queden dentro del significado y alcance de equivalente de las reivindicaciones se deben abarcar dentro de su alcance. Además, todos los documentos, patentes y solicitudes publicados mencionados en la presente se incorporan por la presente por referencia, como si se presentaran en su totalidad. Ejemplo 1 RNA de Interferencia para Silenciar Específicamente IGFIR El presente estudio examina la capacidad de RNA de interferir IGFIR para reducir los niveles de expresión de proteína IGF-1R endógena en células heLa cultivadas. La transfección de células HeLa se logró usando concentraciones in Vitro convencionales (0.1 -10 nM) de IGFIR siRNAs, siRNA #1 libre de RISCO siCONTROL, o siRNA #2 de no meta si-CONTROL (NTC2) y reactivo de transfección DHARMAFECT® #1 (Dharmacon, Lafayette, CO) : Todos los siRNAs se disolvieron en tampón IX siRNA, una solución acuosa de 20 mM KCl, 6 M HEPES (pH 7.5), 0.2 mM de MgCl3. Las muestras de control incluyeron un control de tamjpón en el que el volumen de siRNA se reemplazó con un volumen igual de tampón IX siRNA (-siRNA) . Las manchas western usando un anticuerpo de anti-IGF-lRß se realizaron para determinar la expresión de proteína IGF-1R. Este anticuerpo reconoce ambos el prcursor de 200-kDa IGF-1R y 97-kDa proteínas de IGF-lRß maduras. Los IGFIR siRNAs son RNAs de interferencia de doble hebra que tienen especificidad para las siguientes metas: mrysd dilGFIR #5 SEC ID NO: 38; metas silGFIR #8 SEC ID NO: 39; metas silGFIR #17 SEC ID NO: 13; metas SilGFIR #18 SEC ID NOMO. Como se muestra por los datos de la figura, los siRNAs de SilGFIR #8 y silGFIR #17 redujeron la expresión de proteína IGF-1R significativamente a las concentraciones de 10 nM y 1 nM con relación a los siRNAs de control, indicando que estas siRNAs de IGFIR son más efectivos que silGFIR #6 y silGFIR #18. Ninguno de los siRNAS redujo expresión de proteína IGF-1R significativamente a 0.1 nM. Las referencias citadas en la presente, hasta el grado en que proporcionan procedimientos de ejemplo u otros detalles suplementarios a aquellos expuestos en la presente, se incorporan específicamente por referencia.

Aquellos de experiencia en el ramo, en la luz de la presente exposición, apreciarán que modificaciones evidentes a las modalidades descritas en la presente se pueden hacer sin abandonar el espíritu y alcance de la invención. Todas las modalidades descritas en la presente se pueden hacer y ejecutar sin experimentación indebida en la luz de la presente exposición. El alcance completo de la invención se expone en la exposición y modalidades equivalentes de la misma. La especificación no debe considerarse que estreche indebidamente el alcance completo de protección al que tiene derecho la presente invención. Como se utilizan en la presente y a menos que se indique de otra manera, los términos "un2 y "una" se toman para significar "uno", o "cuando menos uno" o "uno o más".

Claims

REIVINDICACIONES 1.- Un método para atenuar la expresión de IGFIR mRNA en un sistema de expresión, el método comprendiendo: administrar al sistema de expresión una composición que comprende una cantidad efectiva de RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable, el RNA de interferencia comprendiendo: una hebra de nucleótido de sentido, una hebra de nucleótido de contrasentido, y una región de complementariedad contigua cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nuclétidos; en donde la hebra de nucleótido de contrasentido se hibridiza bajo condiciones fisiológicas a una porción de mRNA correspondiente a SEC ID NO:l y tiene una región de complementariedad contidgua cuando menos casi perfecta de por lo menos 19 nucleótidos con la porción de hibridización de mRNA correspondiente a SEC ID NO:l, en donde la expresión de IGFIR mRNA se atenúa por la misma.
2.- El uso de un medicamento para tratar angiogenésis ocular en un sujeto en necesidad del mismo, el método comprendiendo: administrar a un ojo del sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable, el RNA de interferencia comprendiendo: una hebra de nucleótido de sentido, una hebra de nucleótido de contrasentido, y una región de complementariedad contigua cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos; en donde la hebra de nucleótido de contrasentido se hibridiza bajo condiciones fisiológicas a una proción de mRNA correspondiente a SEC ID NO: 1, y tiene una región de complementariedad contigua cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos con la porción de hibricización de mRNA correspondiente a SEC ID NO:l, en donde la angiogenésis ocular se trata por el mismo.
3.- Un método para atenuar la expresión de IGFIR mRNA en un sistema de expresión, el método comjprendiendo : Administrar al sistema de expresión una composición que comprende una cantidad efectiva de RNA de interferencia de una sola hebra que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el RNA de interferencia de una sola hebra se hibridíza bajo condiciones fisiológicas a una porción de mRNA correspondiente a SEC ID N0:1 que comprende nucleótido 401, 635, 1062, 1548, 1604, 1643, 1766, 1922, 2012 2069, 2210, 2416, 2423, 2654, 2909, 3339, 341°6, 3464, 3476, 3505, 3512, 3781, 3782, 3881, 4064, 4158, 4411, 4487, 4904, 4905, 4909, 3329, 2323 o 2887, y el RNA de interferencia tiene una región de complementariedad contigua cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos con la porción de hibridización del mRNA correspondiente a SEC ID N0:1, en donde la expresión de IGFIR Mrna SE ATENÚA POR LA MISMA.
4.- Un método para atenuar la expresión de IGFIR mRNA en un sistema de expresión, el método comprendiendo: administrar al sistema de expresión una composición que comprende una cantidad efectiva de RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable, el RNA de interferencia comprendiendo: una región de cuando menos 14 nucleótidos contiguos que tienen cuando menos 80% de complementariedad de secuencia a, o cuando menos 80% de identidad de secuencia con, los penúltimos 13, 14, 15, 16, 17 o 18 nucleótidos del extremo 3' de un mRNA correspondiente a cualquiera de SEC ID NO: 2, y SEC ID NO: 8 - SEC ID NO:40, en donde la expresión de IGFIR mRNA se atenúa por el mismo.
5.- El uso, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de angiogenésis ocular en un sujeto, de una composición que comprende: una cantidad efectiva de RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable, el RNA de interferencia comprendiendo: una región de cuando menos 13 nucleótidos contiguos que tiene cuando menos 90% de complementariedad de secuencia a, o por lo menos 90% de identidad de secuencia con, los penúltimos 13 nucleótidos del extremo 3' de un mRNA correspondiente a cualquiera de SEC ID NO: 2, y SEQ ID NO: 8 - SEC ID NO:40, en donde la angiogenésis ocular se trata por la misma.
6.- El uso, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de angiogenésis ocular en un sujeto, de una composición que comprende: una molécula de siRNA de doble hebra que regula descendentemente la expresión de un gene de IGFIR a través de interferencia de RNA, en donde : cada hebra de la molécula de siRNA es independientemente de alrededor de 29 a alrededor de 27 nucleótidos de longitud; y una hebra de la molécula de siRNA comprende una secuencia de nucleótido que tiene complementariedad substancial a un mRNA correspondiente al gene IGFIR, respectivamente, de modo que la molécula de siRNA dirige la fragmentación dee mRNA a través de interferencia de RNA.
7.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 4, que comprende además administrar al sistema de expresión un segundo RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos, y que comprende: una hebra de nucleótido de sentido, una hebra de nucleótido de contrasentido, y una región de complementariedad cuando menos casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos; en donde la hebra de nucleótido de contrasentido del segundo RNA de interferencia se hibridiza bajo condiciones fisiológicas a una segunda porción de mRNA que corresponde a SEC ID NO: 1 y la hebra de contrasentido tiene una región de complementariedad contigua cuando menos casi perfecta de por lo menos 19 nucleótidos con la segunda porción de hibridización de mRNA correspondiente a SEC ID NO: 1.
8.- Una composición que comprende un RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y que comprende una secuencia de nucleótido correspondiente a cualquiera de SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 8 - SEC ID NO: 0, o un complemento de la misma, y una portador farmacéuticamente aceptable .
9.- Una composición que comprende una molécula de siRNA de doble hebra que regula descendentemente la expresión de un gene de IGFIR a través de interferencia de RNA, en donde : cada hebra de la molécula de siRNA es independientemente de alrededor de 19 a alrededor de 27 nucleótidos de longitud; y una hebra de la molécula siRNA comprende una secuencia de nucleótido que tiene complementariedad substancial a un mRNA correspondiente al gene de IGFIR de modo que la molécula de siRNA dirija la fragmentación del mRNA a través de interferencia de RNA.
10.- Un método para atenuar la expresión de IGFIR mRNA a un sujeto que expresa IGFIR mRNA, el método comprendiendo : administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de un RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y un portador farmacéuticamente aceptable, el RNA de interferencia comprendiendo: una hebra de nucleótido de sentido, una hebra de nucleótido de contrasentido, y una región de complementariedad contigua por lo menos casi perfecta de cuando menos 19 nucleótidos; en donde la hebra de nucleótido de contrasentido se hibridiza bajo condiciones fisiológicas a una porción de mRNA correspondiente a SEC ID NO: 1 y tiene una región de complementariedad contigua cuando menos casi perfecta de por lo menos 19 nucleótidos con la porción de hibridización de mRNA correspondiente a SEC ID NO: 1, en donde la expresión de IGFIR mRNA se atenúa por la misma.
11.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, o 10, en donde la hebra de contrasentido está diseñada para dirigir un mRNA correspondiente a SEC ID NO: 1 que comprende nucleótido 401, 635, 1062, 1548, 1604, 1643, 1766, 1922, 2012, 2069, 2210, 2416, 2423, o 2654.
12.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, o 10, en donde la hebra de contrasentido está diseñada para dirigir un mRNA correspondiente a SEC ID NO: 1 que comprende nucleótido 2909, 3339, 3416, 3464, 3476, 3505, 3512, 3781, 3872, 3881, 4064, 4158, 4411, 44876, 4904, 4905, 4909, 3329, 2323 o 2887.
13.- El método de conformidad con la reivindicación 1, 3, 4, o 10, o la composición de conformidad con la reivindicación 8 o 9, en donde la composición comprende además un segundo RNA de interferencia que tiene una longitud de 19 a 49 nucleótidos y que comprende una región de por lo menos 13, 14, 15, 16, 17 o 18 nucleótidos contiguos que tienen cuando menos 805 de complementariedad a, o por lo menos 805 de identidad de secuencia con los penúltimos 13 nucleótidos del extremo 3' de un segundo mRNA correspondiente a cualquiera de SEC ID NO: 2, y SEC ID NO: 8 -SEC ID NO:40.