JP2012050439A - グルコガンレセプター発現の調節 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒトのグルカゴンレセプターをコードする核酸分子を標的とする、長さ8〜80核酸塩基のオリゴヌクレオチド化合物であって、該核酸分子の好ましい標的部分に特異的にハイブリダイズし、該レセプターの発現を阻害する化合物、グルカゴンレセプターの発現調節およびグルカゴンレセプターの発現に関連する疾患の診断および治療のための該化合物を用いる方法、ならびに該化合物を含む薬学的組成物。
【選択図】なし
Description
本発明は、グルカゴンレセプターの発現を調節するための、組成物および方法を提供する。とりわけ本発明は、化合物に関連し、特に、オリゴヌクレオチド化合物に関連する。好ましい実施形態において、これら化合物は、グルカゴンレセプターをコードする核酸分子にハイブリダイズする。本明細書中において、このような化合物がグルカゴンレセプターの発現を調節することが示される。
正常な血糖の維持は、慎重に調節された代謝事象である。グルカゴンは、アミノ酸29個のペプチドであり、吸収後の状態下での血糖値の調節を担っており、このグルカゴンは、肝糖源分解、肝糖源新生の活性化、脂肪組織における脂肪分解の刺激、および、インスリン分泌の刺激により、肝臓からのグルコースの放出を増大する。インスリンは、高血糖値の間に、糖源分解および糖新生のグルカゴンを介した増強を、逆転する。糖尿病患者において、インスリンは利用可能でないか、十分に効果的でないかのいずれかである。糖尿病の治療は、伝統的に、インスリンレベルの増加に集中してきたが、グルカゴンの拮抗作用機能が、代替治療法として検討されている。グルカゴンは、グルカゴンレセプターを通して信号を放つことにより、その生理学的作用を発揮するので、グルカゴンレセプターは、糖尿病に対する潜在的に治療標的として、提案されている(Madsenら、Curr. Pharm. Des., 1999, 5, 683-691)。
研究方法は、抗体、ぺプチジルアンタゴニスト、および、低分子の用途に関する。加えて、標的とされるマウスにおけるグルカゴンレセプター遺伝子破壊は、グルカゴンレセプターの完全欠損および血漿グルカゴン値上昇にもかかわらず、このマウスは、ほぼ標準的な血糖症および脂血症を維持することが示されている(Parkerら、Biochem. Biophys. Res.
Commun., 2002, 290, 839-843)。特許出願第WO02/45494号(Allenら)は、グルカゴンレセプター遺伝子の変異を有するトランスジェニックマウスを開示する。グルカゴンレセプターのアゴニストまたはアンタゴニスト、グルカゴンレセプター遺伝子の機能、発現または活性を調節する因子、このような因子の同定方法、耐糖能異常に関連する病状の改善方法、肥満症、体重増加、糖尿病に影響する因子の同定方法、肥満症または糖尿病状態の治療方法、および、グルカゴンレセプター遺伝子の変異を有するトランスジェニックマウスに関連する表現型データもまた、特許請求される。
本発明は、化合物を対象とし、特に、核酸および核酸様のオリゴマーに関し、これらはグルカゴンレセプターをコードする核酸に対して標的化され、そして、グルカゴンレセプターの発現を調節する。本発明の化合物を含有する薬学的組成物および他の組成物もまた、供給される。さらに供給されるのは、グルカゴンレセプターの調節因子のためのスクリーニング方法、および、細胞内か、組織内か、または動物内でのグルカゴンレセプター発現の調節方法であり、上記細胞に対してか、上記組織に対してか、または、上記動物に対して、本発明の一つ以上の化合物または組成物を接触させる工程を含有する。動物、特にヒトの治療方法もまた、本明細書中に示され、このヒトは、グルカゴンレセプターの発現に関連する疾患または状態を有する疑いがあるか、または、この疾患または状態の傾向があるヒトである。このような方法は、治療に必要なヒトに対して、治療的にまたは予防的有効量の、本発明の一つ以上の化合物または組成物を投与する工程を含有する。
(A. 発明の概要)
本発明は、グルカゴンレセプターをコードする核酸分子の機能または効果を調節する用途のために、化合物、好ましくは、オリゴヌクレオチドおよび類似種を使用する。グルカゴンレセプターをコードする一つ以上の核酸分子と、特異的にハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドを提供することによって達成される。本明細書中に用いられる場合、用語「標的核酸」および「グルカゴンレセプターをコードする核酸分子」は便宜上、グルカゴンレセプターをコードするDNA、このようなDNAから転写されたRNA(mRNA前駆体、mRNAまたはその一部を含む)、およびまた、このようなRNAに由来するcDNAもまた包含するように用いられている。本発明の化合物とその標的核酸とのハイブリダイゼーションは、概して、「アンチセンス」と呼ばれる。したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態の実施を含まれると考えられる好ましい機構は、本明細書中において「アンチセンス阻害」と呼ばれる。このようなアンチセンス阻害は代表的に、オリゴヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチドセグメントの水素結合ベースのハイブリダイゼーションに基づいており、その結果、少なくとも一つの鎖または部分が、切断され、分解され、またはそうでなければ、実施不可能にされる。この点において、特異的な核酸分子、および、このようなアンチセンス阻害のためのそれらの機能を標的とすることが、現在好ましい。
または、オリゴヌクレオチド分子であり、したがって、このオリゴヌクレオチドとこの標的核酸との間の水素結合の位置は、相補的な位置であるとみなされる。各分子中の十分な数の相補的な位置が、互いに水素結合し得る核酸塩基により占められる場合、上記オリゴヌクレオチド、および、さらに上記DNA、上記RNA、または、上記オリゴヌクレオチド分子は、互いに相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズし得る」および「相補的」は、上記オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に安定かつ特異的な結合が生じるような、十分な数の核酸塩基を上回る十分な程度の正確な対形成、または、相補性を示すのに用いられる用語である。
本発明によれば、化合物は、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列(External Guide Sequence(EGS))オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー、プライマー、プローブ、および、少なくとも一部の標的核酸にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物を含む。それ自体で、これらの化合物は、一本鎖オリゴマー化合物か、二本鎖オリゴマー化合物か、環状オリゴマー化合物か、またはヘアピンオリゴマー化合物の形態で導入され得、そして、内部かまたは末端に、突出またはループのような構造要素を含み得る。一旦システムに導入されると、本発明の上記化合物は、上記標的核酸の修飾に影響する一つ以上の酵素または構造タンパク質の作用を誘発し得る。このような酵素の非限定的な一つの例は、RNAseHであり、RNA:DNA二重螺旋のRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。「DNA様」である一本鎖アンチセンス化合物がRNAseHを誘発することは、当該分野において公知である。RNAseHの活性化は、それゆえに、上記RNA標的の切断を生じ、それによって、オリゴヌクレオチドを介した遺伝子発現阻害の効率を大いに増強する。RNaseIII内のリボヌクレアーゼ、および、酵素のリボヌクレアーゼLファミリーのような他のリボヌクレアーゼに関して、類似した役割が仮定されている。
かつ特異的な、アンチセンスを介した遺伝子の機能の低下か、または、その遺伝子に関連する遺伝子産物の機能の低下を引き起こすことが示されている。この現象は、植物および動物の両方で生じ、そして、ウィルスの防衛およびトランスポゾンサイレンシングとの進化的関係を有すると考えられる。
特定の核酸分子に対してアンチセンス化合物を「標的化」とすることは、本発明の状況において、多工程なプロセスとなり得る。このプロセスは、通常、機能が調節される標的核酸の同定から始まる。この標的核酸配列は、例えば、細胞遺伝子(またはその遺伝子から転写されたmRNA)であり得、この細胞遺伝子の発現は、特定の障害もしくは疾患状態、または、病原菌の核酸分子に関連する。本発明において、上記標的核酸は、グルカゴンレセプターをコードする。
すなわち、5’-UAA、5’-UAG、および、5’-UGA(対応するDNA配列は、それぞれ、5’-TAA、5’-TAG、および、5’-TGA))のうち一つを有し得ることもまた、当該分野においてさらに公知である。
さらなる実施形態において、本明細書中で同定される「好ましい標的セグメント」は、グルカゴンレセプターの発現を調節するさらなる化合物をスクリーニングする際に用いられ得る。「調節因子」は、グルカゴンレセプターをコードする核酸分子の発現を減少または増加する化合物であり、そして、この化合物は、好ましい標的セグメントに対して相補的である少なくとも8核酸塩基部分を含む。上記スクリーニング方法は、グルカゴンレセプターをコードする核酸分子の好ましい標的セグメントを一つ以上の候補調節因子と接触させる工程、および、グルカゴンレセプターをコードする核酸分子の発現を減少するかまたは増加する一つ以上の候補調節因子を選択する工程を包含する。上記候補調節因子が、グルカゴンレセプターをコードする核酸分子の発現を調節(例えば、減少または増加のいずれか)し得ることが一旦示された後、その調節因子は、グルカゴンレセプターの機能のさらなる調査研究において用いられ得るか、または、本発明に従う、研究試薬としてか、診断薬としてか、もしくは治療薬としての使用のために、用いられ得る。
本発明の化合物は、診断剤、治療剤(予防を含む)のため、ならびに研究試薬および研究キットとして利用され得る。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、強烈な特異性で遺伝子の発現を阻害し得、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、頻繁に、当業者によって、特定の遺伝子の機能を解明するため、または、生物学的経路の種々の一員の機能を見分けるために用いられ得る。
2000, 480, 2-16)、連続的遺伝子発現分析(SAGE(serial analysis of gene expression))(Maddenら、Drug Discov. Today, 2000, 5, 415-425)、消化したcDNAの制限酵素増幅(READS(restriction enzyme amplification of digested cDNAs)(PrasharおよびWeissman、Methods Enzymol., 1999, 303, 258-72)、全遺伝子発現分析(TOGA(total gene expression analysis))(Sutcliffeら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000,
97, 1976-81)、タンパク質アレイおよびプロテオミクス(Celisら、FEBS Lett., 2000,
480, 2-16;Jungbluntら、Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10、発現遺伝子断片(expressed sequence tag(EST))の塩基配列決定(Celisら、FEBS Lett., 2000, 480, 2-16;Larssonら、J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57)、サブストラクティブRNAフィンガープリンティング(subtractive RNA fingerprinting(SuRF))(Fuchsら、Anal. Biochem., 2000, 286, 91-98;Larsonら、Cytometry, 2000, 41, 203-208)、サブストラクティブクローニング(subtractive cloning)、ディファレンシャルディスプレイ(differential display(DD))(JurecicおよびBelmont、Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21)、比較ゲノムハイブリダイゼーション(comparative genomic hybridization)(Carulliら、J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286-96)、FISH(蛍光原位置ハイブリダイズ形成(flourescent in situ hybridizaion))技術(GoingおよびGusterson、Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895-904)、ならびに質量分析法(To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41)が挙げられる。
当該分野において公知であるように、ヌクレオシドは、塩基-糖結合である。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基である。このような複素環式塩基の最も一般的な二つの種類は、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分と共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドについて、リン酸基は、糖のヒドロオキシル部分の2’位、3’位または5’位のいずれかと結合し得る。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は、隣接するヌクレオシドと互いに共有結合し、線状の重合体化合物を形成する。その後、この線状の重合体化合物の各末端は、環状化合物を形成するためにさらに結合し得るが、しかしながら、線状化合物が一般的に好ましい。加えて、線状化合物は、内部核酸塩基相補性を有し得、従って、完全な二本鎖化合物かまたは部分的な二本鎖化合物を生成する様式で折りたたまれ得る。オリゴヌクレオチド中では、リン酸基は通常、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するものとして、称される。RNAおよびDNAの標準的な結合または骨格は
、3’-5’ホスホジエステル結合である。
405,938号;同第5,434,257号;同第5,466,677号;同第5,470,967号;同第5,489,677号;同第5,541,307号;同第5,561,225号;同第5,596,086号;同第5,602,240号;同第5,610,289号;同第5,602,240号;同第5,608,046号;同第5,610,289号;同第5,618,704号;同第5,623,070号;同第5,663,312号;同第5,633,360号;同第5,677,437号;同第5,792,608号;同第5,646,269号および同第5,677,439号が挙げられる。特定の特許は、本願と共有に係り、そして、各々の特許は、本明細書中で参考として援用される。
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣物において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合(すなわち、骨格)の両方は、新規基に置換される。この核酸塩基単位は、適切な標的核酸のハイブリダイゼーションのために維持される。ひとつのそのような化合物である、優れたハイブリダイゼーションの特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド模倣物は、、ペプチド核酸(PNA)と呼ばれる。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミドを含む骨格、特にアミノエチルグリシン骨格に置換されている。核酸塩基は、保持され、そして骨格のアミド部分のアザ窒素原子に対して、直接的または間接的に結合される。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第5,539,082号、同第5,714,331号、および、同第5,719,262号が挙げられ、各々の特許は、本明細書中で参考として援用される。PNA化合物の調製のさらなる教示は、Nielsenら、Science, 1991, 254, 1497-1500において見出され得る。
改変されたオリゴヌクレオチドはまた、一つ以上の置換糖部分を含み得る。好ましいオリゴヌクレオチドは、2’位に以下のうちの一つを含む:OH;F;O-アルキル、S-アルキル、またはN-アルキル;O-アルケニル、S-アルケニル、またはN-アルケニル;O-アルキニル、S-アルキニル、またはN-アルキニル;または、O-アルキル-O-アルキル。ここで、このアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のC1〜C10アルキル、置換または非置換のC2〜C10アルケニルおよび置換または非置換のC2〜C10アルキニルであり得る。特に好ましいオリゴヌクレオチドは、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nONH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3]2である。ここで、nおよびmは、1〜約10である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2’位に以下のうちの一つを含む:C1〜C10低級アルキル、置換低級のアルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリールまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物速度論的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬理学的特性を改善するための基、および、類似する特性を有する他の置換基。好ましい改変としては、2’-メトキシエトキシ(2’-O-CH2CH2OCH3(2’-O-(2-メトキシエチル)または2’-MOEとしても知られる))(Martinら、Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504)、すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。さらなる好ましい改変としては、本明細書中に例として下記に記
載されるように、2’-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、O(CH2)2ON(CH3)2基(2’-DMAOEとしても知られる)、および本明細書中に実施例として下記にさらに記載されるように、2’-ジメチルアミノエトキシエトキシ(当該分野において2’-O-ジメチル-アミノ-エトキシ-エチルまたは2’-DMAEOEとしても知られる)、すなわち、2’-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2が挙げられる。
オリゴヌクレオチドとしてはまた、核酸塩基(当該分野において時折、単に「塩基」として称される)の改変体および置換体が挙げられ得る。本明細書中において用いられるように、「改変されていない」核酸塩基または「天然の」核酸塩基としては、プリン塩基のアデニン(A)およびグアニン(G)、ならびにピリミジン塩基のチミン(T)、シトシン(C)、およびウラシル(U)が挙げられる。改変された核酸塩基としては、他の合成核酸塩基および天然核酸塩基(例えば、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロオキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン、および2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよび5-ハロシトシン、5-プロピニル(-C≡C-CH3)ウラシルおよび5-プロピニル(-C≡C-CH3)シトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、6-アゾシトシン、および6-アゾチミン、5-ウラシル(プソイドウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロアデニンおよび8-ハログアニン、8-アミノアデニンおよび8-アミノグアニン、8-チオールアデニンおよび8-チオールグアニン、8-チオアルキルアデニンおよび8-チオアルキルグアニン、8-ヒドロキシルアデニンおよび8-ヒドロキシルグアニン、ならびに他の8-置換アデニンおよび8-置換グアニン、5-ハロウラシルおよび5-ハロシトシン特に5-ブロモウラシルおよび5-ブロモシトシン、5-トリフルオロメチルウラシルおよび5-トリフルオロメチルシトシン、ならびに他の5-置換ウラシルおよび5-置換シトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノーアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニン)が挙げられる。さらに改変された核酸塩基としては
、三環式ピリミジン(例えば、フェノキサジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾオキサジン-2(3H)-オン)、フェノチアジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾチアジン-2(3H)-オン)、置換フェノキサジンシチジンのようなG-クランプ(例えば、9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾオキサジン-2(3H)-オン)、カルバゾールシチジン(2H-ピリミド[4,5-b]インドール-2-オン)、ピリドインドールシチジン(H-ピリド[3’,2’:4,5]ピロロ[2,3-d]ピリミジン-2-オン)が挙げられる。改変された核酸塩基としてはまた、プリン塩基またはピリミジン塩基が、他の複素環で置き換えられた核酸塩基(例えば、7-デアザ-アデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジン、および2-ピリドン)が挙げられ得る。さらなる核酸塩基としては、米国特許第3,687,808号において開示された核酸塩基、(The Concise Encyclopedia Of
Polymer Science And Engineering, 858-859頁、Kroschwitz, J. I. 編、John Wiley &
Sons, 1990)において開示された核酸塩基、(Englischら, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613)において開示された核酸塩基、および(Sanghvi, Y. S., 第15章、Antisense Research and Applications, 289-302頁、Crooke, S. T. およびLebleu, B. 編, CRC Press, 1993)において開示された核酸塩基が挙げられる。これらの核酸塩基のうち特定のものは、本発明の化合物の結合親和力を増幅させるために、特に有用である。これらとしては、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、ならびに、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、および5-プロピニルシトシンを含む、N-2置換プリン、N-6置換プリンおよびO-6置換プリンが挙げられる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6〜1.2℃増加することが示されていて、そして、現在、好ましい塩基置換である。
本発明のオリゴヌクレオチドの別の改変としては、活性、細胞の分布または細胞のオリゴヌクレオチド摂取を促進する一つ以上の部分または結合体の、オリゴヌクレオチドへの化学的結合が挙げられる。このような部分または結合体としては、官能基(例えば、第一ヒドロキシル基または第二ヒドロキシル基)と共有結合した結合体基が挙げられ得る。本発明の結合体基としては、インターカレーター、レセプター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を高める基、およびオリゴマーの薬動力学的特性を高める基が挙げられる。典型的な結合体基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が挙げられる。薬力学的特性を高める基としては、本発明の文脈において、摂取を改善する基、分解に対する耐性を高める基、および/または、標的核酸との配列特異的なハイブリダイゼーションを増強する基が挙げられる。薬動力学的特性を高める基としては、本発明の文脈において、本発明の化合物の摂取、分布、代謝、または排泄を改善する基が挙げられる。代表的な結合体基は、1992年10月23日に出願された国際特許出願PCT/US92/09196、および米国特許第6,287,860号において開示され、これらの全体の開示は、本明細書中において参考として援用される。結合体部分としては、限定はされないが、以下のような脂質部分が挙げられる:コレステロール部分、コール酸、チオエーテル(例えば、ヘキ
シル-S-トリチルチオール)、チオコレステロール、脂肪族鎖(例えば、ドテカンジオール残基もしくはウンデシル残基)、リン脂質(例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート)、ポリアミングリコール鎖もしくはポリエチレングリコール鎖またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、あるいはオクタデシルアミン部分またはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、以下の活性な薬物物質と結合され得る:例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)-(+)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、2,3,5-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤、または抗生物質。オリゴヌクレオチド-薬物結合体、およびそれらの調製は、1999年6月15日に出願された米国特許出願09/334,130において記載され、本明細書中において、その全体が参考として援用される。
所与の化合物におけるすべての位置が統一的に改変される必要はなく、そして、事実、一つより多くの上記改変は、単一化合物に組み込まれ得るか、または、オリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオチド上にさえ組み込まれ得る。
方を切断するRNAseLのようなエンドリボヌクレアーゼの作用により達成され得る。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動によって慣用的に検出され得、そして、必要ならば、当該分野で公知である関連の核酸ハイブリダイゼーション技術によって検出され得る。
本発明のアンチセンス化合物は、任意の薬学的に容認可能な塩、エステル、またはこのようなエステルの塩、あるいは、ヒトを含む動物に投与する際に、生物学的に活性な代謝産物またはそれらの残留物を(直接的にかまたは間接的に)提供し得る、他の任意の化合物を含む。用語「薬学的に容認可能な塩」は、生理学的かつ薬学的に容認可能な本発明の化合物の塩(すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、そして、所望されない毒物学的効果をそれに与えない塩)を称する。オリゴヌクレオチドについて、薬学的に容認可能な塩、およびそれらの使用の好ましい例は、米国特許第6,287,860号においてさらに記載され、その全体が本明細書中で参考として援用される。ナトリウム塩は、本発明の化合物の特に適した塩である。
本発明の化合物はまた、取り込み、分布、および/または、吸収を補助するために、他の分子、分子構造、または化合物の混合物と(例えば、リポソーム、レセプター標的分子、経口処方物、直腸処方物、局所的処方物、または他の処方物として)、混合され得るか、カプセル化され得るか、結合され得るか、さもなければ関連し得る。このような取り込み補助処方物、分布補助処方物、および/または、吸収補助処方物の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第5,108,921号:同第5,354,844号;同第5,416,016号;同第5,459,127号;同第5,521,291号;同第5,543,158号;同第5,547,932号;同第5,583,020号;同第5,591,721号;同第4,426,330号;同第4,534,899号;同第5,013,556号;同第5,108,921号;同第5,213,804号;同第5,227,170号;同第5,264,221号;同第5,356,633号;同第5,395,619号;同第5,416,016号;同第5,417,978号;同第5,462,854号;同第5,469,854号;同第5,512,295号;同第5,527,528号;同第5,534,259号;同第5,543,152号;同第5,556,948号;同第5,580,575号および同第5,595,756号が挙げられる。各々の特許は、本明細書中で参考として援用される。
あると考えられる。局所的投与のための薬学的組成物および薬学的組成物としては、経皮貼布剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、座剤、スプレー剤、液剤および粉剤が挙げられ得る。従来の薬学的キャリア、水性基剤、粉末剤、または油性基剤、増粘剤などは、必要もしくは望ましくあり得る。コーティングされたコンドーム、グローブなどもまた、有用である。
0日に出願された)、および同第10/071,822号(2002年、2月8日に出願された)において詳細に記載され、各々は本明細書中でその全体が参考として援用される。
治療的組成物の処方物およびそれらに続く次の投与(投薬)は、当該分野の技術範囲内にあると考えられる。投薬は、数日から数ヶ月続く処置期間においてか、または、治癒がもたらされるかもしくは疾患状態の縮小が達成されるまで、処置される疾患状態の重症度および反応に依存している。最適な投薬計画は、患者の体内における薬剤の蓄積を測定することによって計算し得る。当業者は容易に、最適な投薬量、投薬方法、および反復率を決定し得る。最適な投薬量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的な有効性に依存して変化し得、そして、この投薬量は一般に、動物モデルにおいてインビボおよびインビトロで効果的であると見出されたEC50に基づき、見積もられ得る。一般的に、投薬量は、kg(体重)ごとに0.01μg〜100gであり、そして、毎日、毎週、毎月、もしくは毎年一度以上、または2〜20年間ごとに一度のみ与えられ得る。当業者は容易に、測定した残存時間、および体液または組織中の薬剤濃度に基づく投薬によって、容易に反復率を見積もり得る。下記の成功した処置において、患者が疾患状態の再発を予防するための維持治療を経験することが望ましくあり得る。ここで、オリゴヌクレオチドは、維持量(kg(体重)ごとに0.01μg〜100gの量を、毎日一度以上から20年に一度の範囲)で投与される。
(ヌクレオシドホスホラミダイトの合成)
次の化合物(アミダイトおよびそれらの中間体を含む)は、米国特許第6,426,220号および公開されたPCT WO02/36743に記載されるように調整された:5-メチルdCアミダイトの5’-O-ジメトキシトリチル-チミジン中間体、5-メチル-dCアミダイトの5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシ-5-メチルシチジン中間体、5-メチルdCアミダイトの5’-O-ジメトキシトリチル-2’-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジンの最後から2番目の中間体、[5’-O-(4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル)-2’-デオキシ-N4-ベンゾイル-5-メチルシチジン-3’-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト(5-メチルdCアミダイト)、2’-フルオロデオキシアデノシン、2’-フルオロデオキシグアノシン、2’-フルオロウリジン、2’-フルオロデオキシシチジン、2’-O-(2-メトキシエチル)改変アミダイト、2’-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジン中間体、5’-O-DMT-2’-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジンの最後から2番目の中間体、[5’-O-(4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル)-2’-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジン-3’-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト(MOE Tアミダイト)、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルシチジン中間体、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-(2-メトキシエチル)-N4-ベンゾイル-5-メチル-シチジン最後から2番目の中間体、[5’-O-(4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル)-2’-O-(2-メトキシエチル)-N4-ベンゾイル-5-メチルシチヂン-3’-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト(MOE 5-Me-Cアミダイト)、[5’-O-(4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル)-2’-O-(2-メトキシエチル)-N6-ベンゾイルアデノシン-3’-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト(MOE Aアミダイト)、[5’-O-(4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル)-2’-O-(2-メトキシエチル)-N4-イソブチリルグアノシン-3’-O-イル]-2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト(MOE Gアミダイト)、2’-O-(アミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトおよび2’-O-(ジメチルアミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイト、2’-(ジメチルアミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト、5’-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2’-アンヒドロ-5-メチルウリジン、5’-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2’-O-(2-ヒドロキシエチル)-5-メチルウリジン、2’-O-[(2-フタルイミドキシ)エチル]-5’-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチルウリジン、5’-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2’-O-[(2-ホルマドキシミノオキシ)エチル]-5-メチルウリジン、5’-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2’-O-[N,N-ジメチルアミノオキシエチル]-5-メチルウリジン、2’-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン、5’-O-DMT-2’-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン、5’-O-DMT-2’-O-(2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン-3’-[(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト]、2’-(アミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト、N2-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2’-O-(2-エチルアセチル)-5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)グアノシン-3’-[(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト]、2’-ジメチルアミノエトキシエトキシ(2’-DMAEOE)ヌクレオシドアミダイト、2’-O-[2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)エチル]-5-メチルウリジン、5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-[2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)-エチル]-5-メチルウリジンおよび5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-[2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)エチル]-5-メチルウリジン-3’-O-(シアノエチル-N,N-ジイソプロピル)ホスホラミダイト。
(オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドの合成)
本発明に従って用いられるアンチセンス化合物は、周知な技術である固相合成によって、簡便かつ慣用的に生成され得る。このような合成の装置は、いくつかの販売元(例えば、Applied Biosystems(Foster City, CA)を含む)から販売される。当該分野において知られる他のこのような合成方法は、追加してかまたは代替的に用いられる。オリゴヌクレオチド(例えば、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体)を調製する類似技術が用いられることは、周知である。
よびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド(アミド-4結合オリゴヌクレオシドとしても同定される)、および、混合骨格化合物(例えば、交互MMIおよびP=O結合またはP=S結合を有する)を、米国特許第5,378,825号、同第5,386,023号、同第5,489,677号、同第5,602,240号、および同5,610,289号において、記載されるように調製し、本明細書中でこれら特許のすべてが、参考として援用される。
(RNA合成)
概して、RNA合成化学は、戦略的な中間反応における種々の保護基の選択的取り込みに基づく。当業者は、有機合成における保護基の使用を理解するが、有用なクラスとしては、シリルエーテルが挙げられる。特にかさ高いシリルエーテルは、2’-ヒドロキシル上の酸に不安定なオルトエステル保護基と組み合わせて、5’-ヒドロキシルを保護するために用いられる。従って、この保護基のセットは、標準的な固相合成技術に用いられる。すべての他の合成ステップの後で、最後に不安定なオルトエステル保護基を除くことは、重要である。さらに、合成の間におけるシリル保護基の早い段階での使用は、2’ヒドロキシルの所望されない脱保護をすることなく、所望される際、容易な除去を保証する。
かしながら、オリゴヌクレオチドの合成の後で、オリゴヌクレオチドを、固形支持体からオリゴヌクレオチドを切断するだけでなくオルトエステルからアセチル基を除くメチルアミンで処理する。生じるオルトエステル上の2-エチル-ヒドロキシル置換基は、アセチル化前駆体よりも電子求引性が少なくなる。結果として、改変されたオルトエステルは、酸で触媒される加水分解に対して、より不安定となる。特に、切断速度は、アセチル基が除かれた後で、約10倍速くなる。従って、このオルトエステルは、オリゴヌクレオチド合成と適合するための十分な安定性を有するが、後で改変された際、このオルトエステルは、最終RNAオリゴヌクレオチド産物と適合性の比較的に穏やかな水性の条件下で脱保護が行われるのを可能にする。
B. E. ら、Tetrahedron, 1967, 23, 2315-2331)。
(キメラオリゴヌクレオチドの合成)
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたは混合オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なるタイプであり得る。これらとしては、第一のタイプ(ここで、連結されるヌクレオシドの「ギャップ」セグメントは、連結されるヌクレオシドの5’と3’の「ウィング」セグメント間に位置する)、ならびに、第二の「開放端」タイプ(ここで、「ギャップ」セグメントは、オリゴマー化合物の3’末端または5’末端のいずれかに位置する)が挙げられる。第一のタイプのオリゴヌクレオチドはまた、「ギャップマー」またはギャップを有するオリゴヌクレオチドとして当該分野において公知である。第二のタイプのオリゴヌクレオチドはまた、「ヘミマー」または「ウィングマー」として当該分野において公知である。
2’-O-アルキルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントおよび2’-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドを、上述の自動DNA合成装置Model394を用いて、合成する。上記自動合成装置を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、そして、2’-デオキシ-5’-ジメトキシトリチル-3’-O-ホスホロアミダイトはDNA部分として、そして、5’-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-3’-O-ホスホロアミダイトは5’ウィングおよび3’ウィングとする。標準的な合成サイクルを、
5’-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-3’-O-ホスホロアミダイトの反応時間が増加させたカップリング工程を含むことにより、改変する。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを、支持体から切断し、濃縮アンモニア(NH4OH)中で12〜16時間、55℃で脱保護する。この脱保護されたオリゴを、適切な方法(析出、カラムクロマトグラフィー、減圧下での容量の減少、そして、キャピラリー電気泳動およびマススペクトロメトリを用いた、収量および純度の分光光度法による分析)によって回収する。
[2’-O-(2-メトキシエチル)]--[2’-デオキシ]--[2’-O-(メトキシエチル)]キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2’-O-メチルアミダイトを2’-O-(メトキシエチル)アミダイトに置き換えて、2’-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上述の手順に従って、調製した。
[2’-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル]--[2’-デオキシホスホロチオエート]--[2’-O-(メトキシエチル)ホスホジエステル]キメラオリゴヌクレオチドは、2’-O-メチルアミダイトを2’-O-(メトキシエチル)アミダイトに置き換えて、2’-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上述の手順に従って、ヨウ素での酸化によりキメラ構造のウィング部分にあるホスホジエステルヌクレオチド間結合を生成し、そして、3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1ジオキシド(Beaucage Reagent)を利用する硫化により、中央ギャップにホスホロチオエートヌクレオチド間結合を生成して調製する。
(グルカゴンレセプターを標的とする二重鎖アンチセンス化合物の設計およびスクリーニング)
本発明によると、本発明のアンチセンス化合物およびその相補体を含む一連の核酸二重鎖は、グルカゴンレセプターを標的とするように設計され得る。二重鎖のアンチセンス鎖の核酸塩基配列は、表1のオリゴヌクレオチドの少なくとも8核酸塩基部分を含む。上記鎖の末端は、突出部を形成するために、一つ以上の天然核酸塩基または改変された核酸塩基を加えることによって改変し得る。dsRNAのセンス鎖は、アンチセンス鎖の相補鎖として設計および合成され、そして、このセンス鎖はまた、いずれかの末端に対する改変または付加を含み得る。例えば、一つの実施形態において、dsRNA二重鎖の両鎖は、中央の核酸塩基に対して相補的であり、この両鎖は一方の末端または両法の末端に突出部を有する。
RNA二重鎖は、単分子または二分子であり得る。すなわち、二本鎖は、一つの分子部分であり得るか、または別個の分子であり得る。二重鎖のRNA鎖は、本明細書中に開示される方法によって合成し得るか、またはDharmacon Research Inc., (Lafayette, CO)より購入し得る。合成した後、相補鎖をアニールさせる。一本鎖を分注し、50μMの濃度に希釈する。希釈した後で、30μLの各鎖を、15μLのアニーリング緩衝液の5×溶液と合わせる。上記緩衝液の最終濃度は、100mMの酢酸カリウム、30mMのHEPES-KOH(pH7.4)、および2mMの酢酸マグネシウムである。最終量は75μLである。この溶液を、90℃で1分間インキュベートし、次いで15秒間遠心する。実験中にdsRNA二重鎖を用いる際は、チューブを37℃で1時間静置する。dsRNA二重鎖の最終濃度は、20μMである。この溶液は、-20℃で凍結保存し得、そして5回まで凍結融解し得る。
(オリゴヌクレオチドの単離)
制御された微細孔ガラスの固体支持体(controlledpore glass solid support)から切断し、そして、55℃で12〜16時間、濃水酸化アンモニウム中で脱ブロック化した後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを、3倍容量より多いエタノールを用いて1MのNH4OAcから沈殿させ、回収する。合成されたオリゴヌクレオチドを、エレクトロスプレイ質量分光法(分子量決定)によってか、またはキャピラリーゲル電気泳動によって分析し、そして、全長物質の少なくとも70%であることを判断する。上記合成によって得られるホスホロチオエート結合およびホスホジエステル結合の相対量を、-16amu産物(+/-32+/-48)に比例した正確な分子量比率によって決定する。いくつかの研究では、オリゴヌクレオチドを、Chiangら、J. Biol. Chem. 1991,266,18162-18171により記載されるようにHPLCによって精製する。HPLC精製した材料から得られる結果は、HPLC精製していない材料で得られる結果と類似する。
(オリゴヌクレオチドの合成-96ウェルプレートフォーマット)
オリゴヌクレオチドを、96ウェルプレートフォーマット内で同時に96個の配列をアセンブルし得る自動合成装置上の、固相P(III)ホスホロアミダイト化学によって合成する。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、水性ヨウ素の酸化によって生成する。ホスホロ
チオエートヌクレオチド間結合は、3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1ジオキシド(Beaucage Reagent)を利用する無水アセトニトリル中の硫化により、生成する。標準的な塩基が保護されたβ-シアノエチル-ジイソ-プロピルホスホロアミダイトは、製造メーカー(例えば、PE-Applied Biosystems, Foster City, CA、またはPharmacia, Piscataway, NJ)より購入される。非標準的なヌクレオシドを、標準的な方法または特許化された方法によって合成する。塩基が保護されたβ-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトとして用いる。
(オリゴヌクレオチド分析-96ウェルプレートフォーマット)
各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度を、サンプルの希釈およびUV吸収分光法によって測定する。個々の生成物の完全長の完全性を、96ウェルフォーマット(Beckman P/ACETMMDQ)において、または、個々に調製したサンプルについて、市販のCE装置(例えば、Beckman P/ACETM5000, ABI 270)上のいずれかでキャピラリー電気泳動(CE)により評価する。塩基組成および骨格組成を、エレクロトスプレー質量分光法を用いる化合物の質量分析により確認する。すべてのアッセイテストプレートを、単一チャネル自動ピペット装置および複数チャネル自動ピペット装置を用いてマスタープレートから希釈する。プレートは、プレート上の化合物の少なくとも85%が少なくとも完全長の85%である場合に容認し得ると判断される。
(細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理)
標的核酸の発現におけるアンチセンス化合物の効果を、この標的核酸が測定可能なレベルで存在するという条件で、任意の種々の細胞型において、試験し得る。この効果を、例えば、PCRまたはノザンブロット分析を用いて、慣用的に決定し得る。以下の細胞型は、例証する目的のために提供されるが、選ばれた細胞型において標的が発現するという条件で、他の細胞型も慣用的に用い得る。これは、当該分野において慣用的な方法(例えば、ノザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、またはRT-PCR)により容易に決定され得る。
ヒト移行細胞の膀胱癌細胞株T-24は、American Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, VA)より得られる。T-24細胞を、10%のウシ胎仔血清(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)、ペニシリンを1mLにつき100単位、およびストレプトマイシンを1mLにつき100μg(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)を補充した完全なマッコイ5A基礎培地(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)中で、慣用的に培養する。細胞を、細胞が90%のコンフルエンスに達した際のトリプシン処理および希釈によって慣用的に継代する。細胞を、RT-PCR分析において使用するために、7000細胞/ウェルの濃度で、96ウェルプレート(Falcon-Primaria #353872)に播種する。
ヒト肺癌細胞株A549は、American Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, VA)より得られる。A549細胞を、10%のウシ胎仔血清(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)、ペニシリンを1mLにつき100単位、およびストレプトマイシンを1mLにつき100μg(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)を補充したDMEM基礎培地(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)中で慣用的に培養する。細胞を、細胞が90%のコンフルエンスに達した際のトリプシン処理および希釈によって慣用的に継代する。
ヒト新生児皮膚線維芽細胞(Human neonatal dermal fibroblast(NHDF))は、Clonetics Corporation(Walkersville, MD)より得られる。NHDFを、供給業者が推奨するように補充された線維芽細胞増殖培地(Clonetics Corporation, Walkersville, MD)中で慣用的に維持する。細胞を、供給業者が推奨するように10の回の継代まで維持する。
ヒト胚ケラチノサイト(Human embryonic keratinocytes(HEK))は、Clonetics Corporation(Walkersville, MD)より得られる。HEKを、供給業者が推奨するように処方されたケラチノサイト増殖培地(Clonetics Corporation, Walkersville, MD)中で慣用的に維持する。細胞を、供給業者が推奨するように10の回の継代まで維持する。
ヒト胚芽種細胞株HepG2は、Amrican Type Culture Collection(Manassas, VA)より得られる。HepG2細胞を、10%のウシ胎仔血清、非必須アミノ酸、および1mMのピルビン酸ナトリウム(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を補充したイーグルMEM中で慣用的に培養する。細胞を、細胞が90%のコンフルエンスに達した際のトリプシン処理および希釈によって慣用的に継代する。細胞を、RT-PCR分析において使用するために、7000細胞/ウェルの濃度で、96ウェルプレート(Falcon-Primaria #3872)に播種し得る。
初代マウス肝細胞を、Charles River Labsより購入したCD-1マウスから調製する。初代マウス肝細胞を、10%のウシ胎仔血清(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)、250nMのデキサメタゾン(Sigma)、10nMのウシのインスリン(Sigma)を補充した肝細胞接着培地(Hepatocyte Attachment Media(Gibco))中で慣用的に培養する。細胞を、RT-PCR分析において使用するために、10000細胞/ウェルの濃度で、96ウェルプレート(Falcon-Primaria #3872)に播種し得る。
細胞が65〜75%のコンフルエンスに達すると、それらをオリゴヌクレオチドで処理する。96ウェルプレート上で培養した細胞については、ウェルを一度、100μLのOPTI-MEMTM-1低血清培地(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)で洗浄し、そして次いで、3.75μg/mLのLIPOFECTINTM(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)、および所望の濃度のオリゴヌクレオチドを含む、130μLのOPTI-MEMTM-1で処理する。細胞を処理し、データを三連で得る。37℃での処理の4〜7時間後、上記培地を新しい培地と取り替える。細胞を、
オリゴヌクレオチド処理の16〜24時間後に回収する。
(グルカゴンレセプター発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析)
グルカゴンレセプター発現のアンチセンス調節を、当該分野において公知な種々の方法でアッセイし得る。例えば、グルカゴンレセプターmRNAレベルを、例えばノザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、またはリアルタイムPCR(RT-PCR)によって定量し得る。リアルタイム定量PCRが、現在好ましい。RNA分析を、全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAに対して実施し得る。本発明のRNA分析の好ましい方法は、本明細書中の他の実施例において記載されるような全細胞RNAの使用である。RNA単離方法は、当該分野において周知である。ノザンブロット分析もまた、当該分野において慣用的である。リアルタイム定量(PCR)を、PE-Applied Biosystems, Foster City, CAより入手可能な市販のABI PRISMTM7600モデル、7700モデル、または7900モデルの配列検出システム(Sequence Detection System)を用いて簡便的に達成し得、そして、製造業者の指示書に従って用い得る。
(表現型アッセイの設計およびグルカゴンレセプターインヒビターの使用についてのインビボ研究)
(表現型アッセイ)
グルカゴンレセプターインヒビターが本明細書中に開示される方法によって同定された後で、化合物を、特定の疾患状態または状態の処置における効能の測定可能な予測的指標をそれぞれ有する一つ以上の表現型アッセイにおいてさらに研究する。表現型アッセイ、キット、およびそれらの使用のための試薬は、当業者に周知であり、そして、これらは、本明細書中において、健康状態および疾患におけるグルカゴンレセプターの役割および/または関連性を研究するために使用される。いくつかの市販製造業者のうちの1つから購入され得る代表的な表現型アッセイとしては、細胞の生存度、細胞毒性、増殖、または細胞生存を決定するためのアッセイ(Molecular Probes, Eugene, OR;PerkinElmer, Boston, MA)、酵素的アッセイ(Panvera, LLC, Madison, WI;BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ;Oncogene Research Products, San Diego, CA)を含むタンパク質に基づくアッセイ、細胞調節、シグナル伝達、炎症、酸化プロセス、および、アポトーシス(Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI)、トリグリセリド蓄積(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、新脈管形成アッセイ、管形成アッセイ、サイトカインアッセイおよびホルモンアッセイ、ならびに代謝アッセイ(Chemicon International Inc., Temecula, CA;Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)が挙げられる。
本明細書中に記載されるインビボ研究の個々の被験体は、ヒトを含む温血脊椎動物である。
役割について十分に通知されることを保証するために厳格に管理する。
(RNAの単離)
(ポリ(A)+mRNAの単離)
ポリ(A)+mRNAを、Miuraら(Clin. Chem., 1996,42,1758-1764)に従って、単離した。ポリ(A)+mRNA単離の他の方法は、当該分野において慣用的である。簡単に述べると、96ウェルプレート上で生育した細胞について、細胞から成長培地を除き、各ウェルを200μLの冷PBSで洗浄した。60μLの溶解緩衝液(10mM Tris-HCl、pH7.6、1mM EDTA、0.5M NaCl、0.5%NP-40、20mM、バナジルリボヌクレオシド複合体)を各ウェルに加え、このプレートを、穏やかに攪拌し、室温にて5分間インキュベートした。55μLの溶解物を、Oligo d(T)コーティングを施した96ウェルプレート(AGCT Inc., Irvine CA)に移した。プレートを室温にて60分間インキュベートし、200μLの洗浄緩衝液(10mM Tris-HCl、pH7.6、1mM EDTA、0.3M NaCl)で3回洗浄した。最後の洗浄の後、このプレートをペーパータオルで拭き取って、余分な洗浄緩衝液を除き、5分間空気乾燥した。60μLの溶出緩衝液(5mM Tris-HCl、pH7.6)を、70℃に予熱し、各ウェルに加え、このプレートを90℃の加熱板上で5分間培養し、溶出物を新しい96ウェルプレートに移した。
用いて、同様に処理され得る。
全RNAは、RNEASY 96TMキット、およびQiagen Inc. (Valencia, CA)より購入した緩衝液を用いて、単離した。簡単に述べると、96ウェルプレート上で生育した細胞について、細胞から成長培地を除き、各ウェルを200μLの冷PBSで洗浄した。150μLのRLT緩衝液を各ウェルに加え、このプレートを、20秒間、激しく攪拌した。150μLの70%エタノールを各ウェルに加え、この内容物を3回上下にピペッティングすることで混合した。このサンプルを、廃棄物収集トレイ付きのQIAVACTMマニホールドに付属し、減圧源に付属するRNEASY96TMウェルプレートに移した。1分間減圧した。500μLのRW1緩衝液を、RNEASY96TMプレートの各ウェルに加え、15分間インキュベートし、1分間再度減圧した。追加の500μLのRW1緩衝液を、RNEASY96TMプレートの各ウェルに加え、2分間減圧した。1mLのRPE緩衝液を、RNEASY96TMプレートの各ウェルに加え、90秒間減圧した。RPE緩衝液による洗浄を繰り返し、さらに3分間減圧した。このプレートを、QIAVACTMマニホールドから取り外し、ペーパータオル上に置き乾燥させた。上記プレートを、1.2mL収集チューブを備える収集チューブラック付きのQIAVACTMマニホールドに再度取り付けた。RNAを、リボヌクレアーゼを含まない水140μLをピペッティングすることによって溶出し、1分間インキュベートし、3分間減圧した。
(グルカゴンレセプターmRNAレベルのリアルタイム定量的PCR解析)
グルカゴンレセプターmRNAレベルの定量は、メーカーの指示書に従って、ABI PRISMTM7600、7700、または7900 Sequence Detection System(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、リアルタイム定量的PCRにより達成された。これは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物を、リアルタイムで、ハイスループットに定量することを可能とする、密閉したチューブの、ゲルベースでない、蛍光検出システムである。PCRが完了した後で増幅産物が定量される標準的なPCRとは対照的に、リアルタイム定量的PCRの産物は、それらが増幅するのに伴い定量される。これは、PCR反応物中に、順方向PCRプライマーと逆方向PCRプライマーとの間で特異的にアニールするオリゴヌクレオチドプローブ、および、二種類の蛍光色素を含むことにより達成される。レポーター色素(例えば、FAMまたはJOE(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CA、または、Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IAのいずれかより得られた))を、プローブの5’末端に付与し、そして、消光色素(例えば、TAMRA(PE-Applied
Biosystems, Foster City, CA, Operon Technologies Inc., Alameda, CA、または、Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IAのいずれかより得られた))を、プローブの3’末端に付与する。プローブと色素が損なわれていない場合、レポーター色素の放射は、3’位の消光色素の接近によって消光される。増幅の間、標的配列に対するプローブのアニーリングによって、Taqポリメラーゼの5’-エキソヌクレアーゼ活性により切断され得る基質が作製される。PCR増幅サイクルの伸長段階の間、Taqポリメラーゼによるプローブの切断によって、プローブの残りの部分から(すなわち、消光部分から)レポーター色素が外され、そして、配列特異的な蛍光シグナルが発生する。各サイクルにおいて、追加のレポーター色素分子は、それら各プローブから切断され、そして、蛍光強度は、ABI PRISMTMSequence Detection Systemに組み込まれたレーザー光により、一定間隔でモニターされる。各アッセイにおいて、未処理のコントロールサンプルからのmRNAの連続希釈を含む一連の並行反応は、テストサンプルのアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後に
おける阻害率を定量するのに用いられる標準曲線を生成する。
逆方向プライマー:CCGCATCTCTTGAACACGAA(配列番号6)そして
PCRプローブは:FAM-TTGGCACCACAAAGT-TAMRA(配列番号7)
であった。ここで、FAMは、蛍光レポーター色素であり、そしてTAMRAは消光色素である。ヒトのGAPDHのプライマーは、以下であった:
逆方向プライマー:GAAGATGGTGATGGGATTTC(配列番号9)そして
PCRプローブは:5' JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3'(配列番号10)
であった。ここで、JOEは、蛍光色素であり、そしてTAMRAは消光色素である。
登録番号NM_008101.1(本明細書中において配列番号11として援用される))を用いて設計された。マウスのグルカゴンレセプターについて、PCRプライマーは、以下であった:
逆方向プライマー:CGGGCCCACACCTCTTG(配列番号13)そして
PCRプローブは:FAM-CCACAAAGTGCAGCACCGCCTAGTGT-TAMRA(配列番号14)
であった。ここで、FAMは、蛍光レポーター色素であり、そしてTAMRAは消光色素である。マウスのGAPDHについて、PCRプライマーは、以下であった:
逆方向プライマー:GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT(配列番号16)そして
PCRプローブは:5' JOE-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC-TAMRA 3'(配列番号17)
であった。ここで、JOEは、蛍光レポーター色素であり、そしてTAMRAは消光色素である。
(グルカゴンレセプターmRNAレベルのノザンブロット分析)
アンチセンス処理の18時間後、細胞単層を冷PBSで2度洗浄し、1mLのRNAZOLTM(TEL-TEST“B”Inc., Friendswood, TX)に溶解した。製造元推奨プロトコルに従って、全RNAを調製した。20マイクログラムの全RNAを、MOPS buffer system(AMRESCO, Inc. Solon, OH)を用い、電気泳動によって1.1%のホルムアルデヒドを含む1.2%のアガロースゲルを通して分画した。ノザンブロット移動緩衝液システム(TEL-TEST“B”Inc., Friendswood, TX)を用い、一晩中キャピラリー上を移動させ、RNAをゲルからHYBONDTM-N+ナイロン膜(Amersham Pharmacia Biothech, Piscataway, NJ)に移した。RNA移動を、UVによる可視化によって確かめた。膜を、STRATALINKERTMUV Crosslinker 2400(Stratagen, Inc, La Jolla, CA)を用いるUV架橋によって固定した。続いて、この膜は、ストリンジェントな条件についての製造元の推奨に従ってQUICKHYBTMハイブリダイゼーション溶液(Stratagen,
La Jolla, CA)を用いて調査した。
逆方向プライマー:CCGCATCTCTTGAACACGAA(配列番号6)。
充填効率および移動効率の変動を正規化するために、膜が取り出され、ヒトのグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)RNA(Clontech, Palo Alto, CA)について調査した。
逆方向プライマー:CGGGCCCACACCTCTTG(配列番号13)。
充填効率および移動効率の変動を正規化するために、膜が取り出され、マウスのグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)RNA(Clontech, Palo Alto, CA)につい
て調査した。
(2’-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる、ヒトグルカゴンレセプターの発現のアンチセンス阻害)
本発明に従って、一連のアンチセンス化合物を、公開された配列(Genbank登録番号NM_000160.1(本明細書中において配列番号4として援用される)、Genebank登録番号AC069004.2(本明細書中において配列番号18として援用される)からの3つのコンティグの連鎖、およびGenbank登録番号AJ245489.1(本明細書中において配列番号19として援用される))を用いて、ヒトグルカゴンレセプターRNAの異なる領域を標的とするように設計した。その化合物は、表1に示される。「標的部位」は、化合物が結合する特定の標的配列上の第一(最も5’側)のヌクレオチド数を示す。表1のすべての化合物は、長さが20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド(「ギャップマー」)であり、この化合物は、5ヌクレオチドの「ウィング」によって両端(5’方向および3’方向)に隣接する、10個の2’-デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域から構成される。このウィングは、2’-メトキシエチル(2’-MOE)ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間(骨格)結合は、オリゴヌクレオチドのすべてにおいてホスホロチオエート(P=S)である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。この化合物を、本明細書中の他の実施例において開示されるような定量的リアルタイムPCRによって、ヒトのグルカゴンレセプターmRNAレベルに対するそれらの効果について分析した。データは、HepG2細胞が本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理される3回の実験からの平均である。各データポイントのポジティブコントロールは、表の配列番号によって同定した。「N. D. 」は、「データなし」を示す。
(2’-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる、ヒトグルカゴンレセプターの発現の阻害)
表1に示されているように、配列番号20、21、22、24、25、28、29、30、35、37、39、40、41、42、43、44、46、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、64、67、68、69、70、71、72、74、75、76、78、79、80、81、82、87、88、89、91、92、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、107、110、111、112、113
、114、115、116、117、118、119、121、122、124、125、127、129、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、152、153、155、156、157、158、159、160、161、162、164、166、168、169、170、171、174、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、212、213、214、215、216、217、218、219、221、225、227、230、231、233、235、236、237、238、240、241、242、243、245、246、247、248、249、251、252、253、254、255、256、257、258、261、262、263、264、266、267、268、269、270、271、273、275、278、279、280、281、282、284、286、287、288、291、293、297、298、300、301、302、303、304、305、306、307、309、310、311、312、314、316、317、321、322、325、326、329、330、332、333、336、338、339、341、342、343、344、346、348、349、351、353、354、355、356、358、360、361、365、367、368、370、371、373、374、376、377、379、380、381、382、383、384、386、388、390、391、392、393、396および397は、このアッセイで少なくとも40%のヒトのグルカゴンレセプター発現の阻害率を示した配列であり、そしてそれゆえに好ましい配列である。配列番号183、184、231、249、254、346、365および392は現在、より好ましい配列である。この好ましい配列が相補的である標的領域は、本明細書中において、「好ましい標的セグメント」として呼ばれ、そしてそれゆえに、本発明の化合物による標的化において好ましい。これらの好ましい標的セグメントは、表3に示される。これらの配列は、チミン(T)を含むことが示されるが、当業者は、チミン(T)は、一般的に、RNA配列中のウラシル(U)によって置換されることを理解する。この配列は、表1に示された上記好ましいアンチセンス化合物の逆相補体を表す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の第1の(最も5’側)ヌクレオチドの数を指す。表3中にまた示されるのは、各々の好ましい標的セグメントが見出された種である。
(2’-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスグルカゴンレセプター発現のアンチセンス阻害)
本発明に従って、第二の一連のアンチセンス化合物を、公開された配列(Genbank登録番号NM_008101.1(本明細書中において配列番号11として援用される)、代替的なプロモーターを有するGenbank登録番号AF229079.1(本明細書中において配列番号400として援用される)由来のmRNA配列、Genebank登録番号AF229079.1(本明細書中において配列番号401として援用される)、代替的なプロモーターを有するGenebank登録番号AF229079.1(本明細書中において配列番号402として援用される)由来の第二のmRNA配列、およびGenebank登録番号AA920726.1(本明細書中において配列番号403として援用される))を用いて、マウスグルカゴンレセプターRNAの異なる領域を標的とするよう設計した。この化合物は、表2に示される。「標的部位」は、化合物が結合する特定の標的核酸上の第一(最も5’側)のヌクレオチド数を示す。表2のすべての化合物は、長さが20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド(「ギャップマー」)であり、この化合物は、5ヌクレオチドの「ウィング」によって両端(5’方向および3’方向)に近接する、10個の2’-デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域から構成される。このウィングは、2’-メトキシエチル(2’-MOE)ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間(骨格)結合は、オリゴヌクレオチドのすべてにおいてホスホロチオエート(P=S)である。全てのシチジン残基は、5’-メチルシチジンである。化合物を、本明細書中の他の実施例において記載されるような定量的リアルタイムPCRによって、マウスのグルカゴンレセプターmRNAレベルに対するそれらの効果について分析した。データは、マウスの初期肝細胞が本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理される3回の実験からの平均である。各データポイントのポジティブコントロールは、表の配列番号によって同定した。存在する場合、「N. D. 」は「データなし」を示す。
(2’-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスグルカゴンレセプターのmRNAレベルの阻害)
表2中に示されるように、配列番号404、406、407、408、409、410、411、412、413、414、416、417、418、424、425、426、427、428、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、446、448、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、473、474、476、479および480は、この実験中で少なくとも30%のマウスのグルカゴンレセプター発現の阻害を示した配列であり、そして、それゆえに好ましい配列である。これらの好ましい配列に相補的な標的領域は、本明細書中において、「好ましい標的セグメント」として呼ばれ、そしてそれゆえに、本発明の化合物による標的化に好ましい。これらの好ましい標的セグメントは、表3中に示される。これらの配列は、チミン(T)含むことが示され、当業者は、チミン(T)は、一般的に、RNA配列においてはウラシル(U)によって置換されることを理解する。この配列は、表1および表2中に示された上記好ましいアンチセンス化合物の逆相補鎖を表す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上に在る最初(最も5’側)のヌクレオチド番号を指す。各々の好ましい標的セグメントが見つかった種はまた、表3中に示される。
(グルカゴンレセプター中で同定された好ましい標的セグメントの配列および位置)
これらの「好ましい標的セグメント」は、本発明のアンチセンス化合物とのハイブリダイゼーションに利用可能であることが実験によって見つかっているので、当業者は、慣用的な実験を用いるのみで、これら好ましい標的セグメントに対して特異的にハイブリダイズし、その結果、グルカゴンレセプターの発現を阻害する他の化合物を包含する、本発明のさらなる実施形態を認識するか、確かめ得る。
(グルカゴンレセプターのタンパク質レベルのウェスタンブロット解析)
ウェスタンブロット解析(免疫ブロット解析)は、標準的な方法を用いて行う。オリゴヌクレオチド処理の16〜20時間後に細胞を回収し、一度PBSで洗浄し、Laemmli緩衝液(100μl/ウェル)に懸濁し、5分間沸騰させ、そして、16%のSDS-PAGEゲル上にロードする。ゲルは、150Vで1.5時間泳動し、そして、ウエスタンブロッティングのため、膜に移す。放射線標識されたかまたは蛍光標識された、一次抗体種に対する二次抗体とともに、グルカゴンレセプターを対象とする適切な一次抗体を用いる。PHOSPHORIMAGERTM(Molecular Dynamics, Sunnyvale CA)を用いて、バンドを視覚化する。
(血漿グルコースレベルおよびグルカゴンレセプターのmRNA減少におけるマウス中のグルカゴンレセプターのアンチセンス阻害の効果:lean動物、db/dbマウスおよびob/obマウス)
本発明に従って、マウスのグルカゴンレセプター(ISIS 148359(配列番号408:agcaggctta ggttgtggtg)、および、ISIS 180475(配列番号452:gagctttgcc ttcttgccat))を標的とした二つのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該分野で認められる肥満症および糖尿病におけるモデルマウスの治療有効性を評価された。ob/obマウスは、レプチン遺伝子上に変異を有した、レプチン欠損マウスである。一方、db/dbマウスは、レプチンレセプター遺伝子上に変異を有する。二つの系統は、ヒトのII型糖尿病に非常に似ている肥満症および糖尿病の症状を示す(Tsang, S. H., 1998, P&S Medical Review, Vol. 5, No. 1)。
(正常血糖マウス、db/dbマウス、およびob/obマウスの満腹時血糖値および空腹時血糖値ならびにグルカゴンレセプターのmRNAレベルにおける、ISIS 148359およびISIS 180475処置の効果)
これらのデータは、グルカゴンレセプターのmRNAを標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 148359およびISIS 180475が、マウスの肝臓におけるグルカゴンレセプターのmRNAレベルを減少し得ることを示している。これらのデータはさらに、正常血糖マウス、db/dbマウス、およびob/obマウスの血漿グルコースレベルの減少に伴い、グルカゴンレセプターの発現が減少することを示している。処置済みマウスは、正常血糖マウスとなり、低血糖マウスにならない点に注目することが重要である。従ってグルカゴンレセプターのアンチセンスインヒビターは、低血糖症治療に有用な治療様式であると考えられる。
(グルカゴンレセプターのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖尿病ob/obマウスの血漿グルコースを低下させる-4週間にわたる研究)
C57Bl/eOlaHsd-Lepob(ob/ob)雄マウスを、Harlan(Indianapolis, Indiana, USA)より購入した。動物は、実験開始前に一週間、環境に順応させた。マウスは、フィルタ天井のポリカーボネート製の籠中に、一籠に五匹、収容した。動物を、21℃、12時間:12時間の明暗周期(午前6時に点灯)で維持した。すべての動物に、脱イオン水を自由に与えた。ob/obマウスには、Purina Diet 5015を自由に与えた。アンチセンス化合物を、標準生理食塩水中で調整し、そして、その溶液を、0.2μm孔のフィルタを通して滅菌した。動物に対して、アンチセンス化合物溶液またはビヒクル(生理食塩水)を、一週間に二度(3.5日間隔)、皮下に注射することによって投与した。それぞれの研究を開始する前、および、研究の間の毎週一回、麻酔なしの尾部の切断によって、トラシロール(Serologicals Proteins, Kankakee, Illinois, USA)およびジペプチジルペプチダーゼ(DPP)-IVインヒビター(Linco Diagnostic Services, St. Charles, Missouri, USA)を含むEDTA血漿チューブに、血液を回収した。食物摂取量および体重は、週ごとに測定した。グルコースおよびトリグリセリドの血漿レベルは、Hitachi 912 clinical chemistry analyzer(Roche, Indianapolis, Indiana, USA)で決定した。
を試験するために、7〜8週齢のob/obマウスに対して、グルカゴンレセプター[ISIS 148359(配列番号408)またはISIS 180475(配列番号452)]のアンチセンスインヒビターか、その配列がマウスゲノムまたはラットゲノムうちのどの既知転写物にもマッチしない、一般的なコントロールオリゴヌクレオチド(ISIS 141923(配列番号818))か、七つの内部塩基を除いて、ISIS 180475と同一な配列であるミスマッチオリゴヌクレオチド(ISIS 298682;GCGATTTCCCGTTTTGACCT;配列番号819)か、あるいは、生理食塩水を、一週間に二度(3.5日ごと)、4週間にわたって投与した。すべてのオリゴヌクレオチドを、25mg/kgで投与した。データは、処置群あたり8匹の平均値(+_SEMで示される)である。すべてのマウスの血漿グルコースレベルは、0日目において、約330〜370mg/dlであった。生理食塩水処置、および、コントロールオリゴヌクレオチド処置されたob/obマウスにおいては時間が経つにつれて高血糖が悪化するが、グルカゴンレセプターのアンチセンス化合物処置された動物においては、血漿グルコースが劇的に減少することを示した。12日目において、コントロールオリゴヌクレオチド(ISIS 141923)処置および生理食塩水処置されたob/obマウスの血漿グルコースレベルは、それぞれ、約472mg/dlと約425mg/dlであった。アンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 148359、および、ISIS 180475)処置されたマウスの血漿グルコースレベルは、それぞれ、約240mg/dlと約180mg/dlであった。27日目において、コントロールオリゴヌクレオチド(ISIS 141923)処置および生理食塩水処置されたob/obマウスの血漿グルコースレベルは、それぞれ、約435mg/dlと約390mg/dlであった。アンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 148359、および、ISIS 180475)処置されたマウスの血漿グルコースレベルは、それぞれ、約165mg/dlと約130mg/dlであった。なお、後者の値は、正常範囲内である。
(げっ歯類におけるグルカゴンレセプターのアンチセンス阻害の効果)
(実施例20)
(グルカゴンレセプターのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖尿病db/dbマウスの血漿グルコースを低下させる-4週間にわたる研究)
C57Bl/KsOlaHsd-Lepdb(db/db)雄マウス、および、lean(db+/?)雄マウスは、Harlan(Indianapolis, Indiana, USA)より購入した。動物は、実験開始前に1週間、環境に順応させた。マウスは、フィルタ天井のポリカーボネート製の籠中に、一籠に5匹、収容した。動物を、21℃、12時間:12時間の明暗周期(午前6時に点灯)で維持した。すべての動物に、脱イオン水を自由に与えた。db/dbマウスには、Purina Diet 5008を自由に与えた。アンチセンス化合物を、標準生理食塩水中で調整し、そして、その溶液を、0.2μm孔のフィルタを通して滅菌した。動物に対して、アンチセンス化合物溶液またはビヒクル(生理食塩水)を、1週間に二度(3.5日間隔)、皮下に注射することによって投与した。それぞれの研究を開始する前、および、研究の間の毎週1回、麻酔なしの尾部の切断によって、トラシロール(Serologicals Proteins, Kankakee, Illinois, USA)およびジペプチジルペプチダーゼ(DPP)-IVインヒビター(Linco Diagnostic Services, St. Charles, Missouri, USA)を含むEDTA血漿チューブに、血液を回収した。食物摂取量および体重は、週ごとに測定した。グルコースおよびトリグリセリドの血漿レベルは、Hitachi 912 clinical chemistry analyzer(Roche, Indianapolis, Indiana, USA)で決定した。
ンチセンス処置後、412±33mg/dlから121±12mg/dlまで低下した(表5)。db/dbマウスにおけるこれらの結果は、3週間にわたってグルカゴンレセプターのアンチセンス化合物ISIS 148359を試験した予備研究において、報告されたものと類似している(Osborneら、2003, Diabetes 52, A129(要旨))。
(グルカゴンレセプターのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ZDFラットの血漿グルコースを低下させる)
ZDF/GmiCrl-fa/fa(ZDF)雄マウスは、Charles River Laboratories(Wilmington, Massachusetts, USA)より購入した。動物は、実験開始前に1週間、環境に順応させた。ラットは、フィルタ天井のポリカーボネート製の籠中に、一籠に一匹、収容した。動物を、21℃、12時間:12時間の明暗周期(午前6時に点灯)で維持した。すべての動物に、脱イオン水を自由に与えた。ZDFラットには、Purina Diet 5008を自由に与えた。アンチセンス化合物を、標準生理食塩水中で調整し、そして、その溶液を、0.2μm孔のフィルタを通して滅菌した。七週齢の動物に対して、アンチセンス化合物溶液またはビヒクル(生理食塩水)を、一週間に二度(3.5日間隔)、合計9回分(最後の処置は28日目)、皮下に注射することによって投与し、続いて同じ期間の洗い出し期をおいた。オリゴヌクレオチド濃度は、グルカゴンレセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 180475(配列番号452)か、または、ネガティブコントロールオリゴヌクレオチドISIS 141923(配列番号818)のいずれかの、25mg/kgである。それぞれの研究を開始する前、および、研究の間の毎週1回、麻酔なしの尾部の切断によって、トラシロール(Serologicals Proteins, Kankakee, Illinois, USA)およびジペプチジルペプチダーゼ(DPP)-IVインヒビター(Linco Diagnostic Services, St. Charles, Missouri, USA)を含むEDTA血漿チューブに、血液を回収した。食物摂取量および体重は、週ごとに測定した。グルカゴンレセプターのmRNA(標的)を、この研究の各時点で取り出した5匹の動物の肝臓から、リアルタイム定量PCRによって測定した。ラット36B4リボソームのリンタンパク質のmRNA(「18S RNA」)を、測定し、そして、RNA投入量の正規化に用いた。データは、処置群あたりの5匹のラットの平均値である。上記処置期間の全体にわたる比較において、コントロールオリゴヌクレオチドで処置された動物と比較した場合(P<0.05:テューキー法を用い調節)グルカゴンレセプターのアンチセンス化合物ISIS 180475による標的の減少は、有意な違いを示した(P<0.05:テューキー法を用い調節)。肝性グルカゴンレセプターのmRNAは、ISIS 180475の最初の投与後24時間以内にコントロールの50%まで、そして、7回目の投与後48時間以内にコントロールの30%まで、劇的に減少した。
た報告によると、一般的に、9〜19日の範囲に及ぶ)と一致する。
(グルカゴンレセプターのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、高グルカゴン症にもかかわらず、高血糖または低血糖を引き起こさない)
血中グルコースへの影響に加えて、グルカゴンレセプター(配列番号452;ISIS
180475)のアンチセンスインヒビターによる処置は、正常なげっ歯類および糖尿病げっ歯類の両者において、著しい(および可逆的)高グルカゴン症という結果を生じる(表5)。この高グルカゴン症のレベルは、グルカゴンレセプターノックアウトマウスおいて観察されたレベルと似ている(Parkerら、2002, Biochem Biophys Res Commun. 290,839-843;Gellingら、2003、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100,1438-1443)。これら血清グルカゴンレベルが高いことが理由で、グルカゴンレセプターのアンチセンスインヒビターが、高血糖を導くか(具体的には、肝性グルカゴンレセプターレベルが、処置を中止した後に、徐々に正常に戻る)、否かを決定することが重要であった。従って、処置または洗い出し期の間に決して高グルカゴン症の動物が高血糖を示さないことが重要である。事実、グルカゴンレセプターのアンチセンス処置動物は、検査した全ての時点において、満腹時血漿グルコースの減少を調節したことを示した。
(アンチセンス処置db/dbマウスの島おいて、グルカゴンレセプターmRNAは減少される)
ランゲルハンス島を、生理食塩水またはグルカゴンレセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 180475(配列番号452)を25mg/kgで、合計9用量、1週間に二度(3.5日毎)、皮下注射により処置した12週齢の雄性db/dbマウス(1処置群あたりn=5〜6)から単離した。マウスを、頚椎脱臼により屠殺した。総胆管に27ゲージ針でカニューレ挿入し、そして、膵臓を、2%のウシ血清アルブミン(Applichem, Darmstadt, Germany)および1mg/mlのコラゲナーゼ(Serva, Heidelberg, Germany)を含む、3mlのハンクス緩衝液(Sigma, Taufkirchen, Germany)で膨張させた。続いて、この膵臓を取り出し、37℃のハンクス緩衝液中で切断した。島を、750×gで15分間、Histopaque-1077TM(Sigma)勾配によ
って精製した。島を、10%FBS、100U/mlのペニシリン、および100:g/mlのストレプトマイシン(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)を含むRPMI-1640培地中で一晩培養した。3個体からの島200個を、RNA抽出に1サンプルを得るためにプールした。リアルタイム定量的RT-PCRを、遺伝子発現をプロファイルするために用いた。島グルカゴンレセプターmRNAレベルを、アンチセンス処置動物において、生理食塩水処置コントロール動物と比較して約75%減少した。アンチセンス化合物の薬理学的効果に加えて、高グルカゴン症に対する代償性反応、または処置動物における増加したα細胞の集団が、観察された結果の一因となり得ることに注目すべきである。
(グルカゴンレセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドは、機能的グルカゴンレセプターの数を減少させる)
グルカゴンレセプターのmRNAの減少が機能的グルカゴンレセプター数の減少と関連するかどうかを評価するために、相同的競合アッセイ(homologus competition assay)を、コントロールアンチセンス化合物かまたはグルカゴンレセプターアンチセンス化合物で処理したマウスから調製した肝細胞膜を用いて行った。125I-グルカゴン結合は、コントロール膜サンプル中の標識してないグルカゴン濃度を増加させることにより効果的に競合した。コントロールオリゴヌクレオチド処理したdb/dbマウス、またはグルカゴンレセプターオリゴヌクレオチド(ISIS 180475;配列番号452)処理したdb/dbマウスからの15〜20μgの膜を、0.1nMの125I-グルカゴン(2000Ci/mmol, PerkinElimer, Boston, Massachusetts, USA)、ならびに50mMのHeps、1mMのMgCl2、5mMのEDTA、0.005%のTween20、0.1%のBSA、およびEDTAを含まないプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)を含む緩衝液中の標識していないグルカゴン(Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, USA)の望ましい濃度において、インキュベートした。アッセイを、96ウェルのMultiScreen-HVの0.45μmフィルタープレート(Millipore, Bedford, Massachusetts, USA)上でラベルされたリガンドが過剰に存在する定常状態下で行った。室温での2時間のインキュベート後、プレートを、氷冷緩衝液(20mMのTris, pH7.4)で濾過することにより迅速に洗浄し、50℃で45分間、乾燥させた。Optiphase Supermix(PerkinElmer)の添加後、プレートを、Wallac
Microbetaシンチレーションカウンターで数えた。データ分析を、GraphPad Prismソフトウェアを用いて行い、そして、平均値+/-標準偏差のように表した。グルカゴンレセプターオリゴヌクレオチドで処理した動物由来のサンプルから得たデータは、アッセイおよび曲線適合パラメーターの検出限界に近かった。見かけのBmaxについて数値を導き出すために、Kdを、コントロールアンチセンス処理動物由来のサンプルから得た平均値(0.69+/-0.2nM)に固定した。
(ヒトグルカゴンレセプターおよびサルグルカゴンレセプターのアンチセンスインヒビター-投薬反応)
上述の実施例15におけるスクリーニングに基づき、ヒトグルカゴンレセプターアンチセンスオリゴヌクオチド部分集合を、さらなる研究のために選択した。投薬反応の研究を、ISIS 315186、ISIS 310457、ISIS 315324、ISIS 315278、ISIS 315181、ISIS 315297、ISIS 315163、およびISIS 310456について、ヒトHepG2細胞培養液およびカニクイザル初代肝細胞の両方において行った。これら6つの化合物は、ヒトグルカゴンレセプター核酸標的およびカニクイザルグルカゴンレセプター核酸標的の両方に対して相同である。ユニバーサルコントロールISIS 29848(配列番号820:NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(ここでNは、等モルのA、C、G、およびTの混合物である。位置1〜5および位置16〜20にホスホロチオエート
骨格ならびにMOEを有するキメラ2’MOEギャップマー))を、ネガティブコントロールとして用いた。
(ヒトHepG2細胞およびカニクイザルグル初代肝細胞におけるグルカゴンレセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50(単位:nM))
(カニクイザルのグルカゴンレセプター発現のアンチセンス阻害における投与量範囲の
研究)
サルの研究は、SNBL USA, Ltd., Everett, WAにおいて実施した。最初の投与の際に体重約5〜10kgの成体(6〜8年齢)Macca fascicularis(実験用カニクイザル)の雄性40匹を用いた。動物を、Animal Welfare Actに従い初期環境を管理した囲い内で個別に飼育した。動物に、Purina Mills Laboratory Profiled Fiber Plus(登録商標)Monkey Diet(Animal Specialties, Hubbard, OR)を与えた。時折、新鮮な果物および野菜もさらに与えた。すべての動物に対して、新鮮な飲料水を自由に与えた。絶食測定の前、予定された採血の前の午後4時30分から午後5時00分の間に、囲いから食物を取り出した。動物を少なくとも16時間絶食させた後、投与または給餌の前に、血漿分析のための血液サンプルを収集した。絶食分析のために、約2.3〜2.5mLの血液を末梢静脈から採血した。約1.8〜2.0mLを、血液1ml中10μlのDPP-IVインヒビターおよび血液1ml中の250KIUトラシロール(trasylol)を含むK2-EDTAチューブ内に入れた。約0.5mlをリチウムヘパリンチューブに入れた。一旦、EDTAおよび添加物の入ったチューブ内に血液を入れ、そのチューブを反転させ混合し、5分間以内、氷上に置いた。リチウムヘパリンチューブ内の血液をまた、5分間以内、氷上に置いた。血液サンプルを遠心(2000×g、4〜8℃で15分間)し、サンプル収集の30分以内に、血漿を得た。この血漿を、-70℃かそれ以下で凍らせた。サンプルをドライアイス上に乗せ、次の分析のために、以下に記載されるように宅配便により運んだ。非絶食分析のために、採血日の午前の給餌(8時30分〜9時30分)を与えた。給餌してから90分後に採血した。残ったビスケットの数を、採血時に数えた。サンプルを調製し、そして上述のように発送した。
逆方向プライマー:CACGGAGCTGGCCTTCAG(配列番号822)
プローブ:ATCCACGCGAACCTGTTTGTGTCCTT(配列番号823)
RNA量を組織中の18SRNAレベルに正規化した。結果を、生理食塩水処置サルと比較したアンチセンス処置サルにおけるグルカゴンレセプターmRNAの減少率として表7に示す。
(グルカゴンレセプターのアンチセンスインヒビターで処置した後におけるサル肝臓のグルカゴンレセプターmRNAの減少-RT-PCR実験1)
RT-PCRによる同じ組織サンプルのRNA分析を、上述の同じプライマープローブセットを用いて別個に繰り返した。結果を、生理食塩水処置サルと比較したアンチセンス処置サルにおけるグルカゴンレセプターmRNAの減少率として表8中に示す。
(グルカゴンレセプターのアンチセンスインヒビターで処置した後におけるサル肝臓のグルカゴンレセプターmRNAの減少-RT-PCR実験2)
RT-PCRによって得られた結果を、標準的な方法に従うノザンブロット分析によって確認した(実施例14)。ノザンブロットに使用したcDNAプローブは、カニクイザルの肝臓からRT-PCRによって生成したサルGCGRの900塩基の断片であった。結果を表9に示す。
(グルカゴンレセプターのアンチセンスインヒビターで処置した後におけるサル肝臓のグルカゴンレセプターmRNAの減少-ノザンブロット)
血中グルコースレベルを、グルカゴンレセプターのアンチセンスインヒビターで処置した後のサルおいて測定した。グルコースの読み取りを、上述のように収集した血液サンプルからの一滴の血液を用いて実施し、そして、One Touch Profile(登録商標)(Lifescan Inc., a Johnson and Johnson
Company)上で読み取った。本研究において正常血糖(非糖尿病)サルを用いたので、血中グルコースレベルの有意な変化は、期待もされず観察もされなかった。アンチセンス処置した後に低血糖になった動物はいなかった。
(グルカゴンレセプターのアンチセンスインヒビターで処置した後のサルの肝臓における絶食時グルカゴンレベル)
グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)レベルを、グルカゴンレセプターのアンチセンスインヒビターで5週間または10週間処置する前(基準)および処置した後の絶食したサルの血漿中において測定した。ストレスのよる人為的結果を避けるため、サルを血液収集の前に
麻酔した。GLP-1レベルを、放射免疫測定法、ELISAおよび/または契約した研究所(Linco, St. Charles MO)によるLuminex放射免疫測定法により決定した。結果を表11に示す。
(グルカゴンレセプターのアンチセンスインヒビターで処置した後のサルの肝臓における絶食時GLP-1レベル)
Claims (76)
- 長さ8〜80核酸塩基の化合物であって、ヒトのグルカゴンレセプターをコードする核酸分子の標的とされ、ここで、該化合物は、ヒトのグルカゴンレセプターをコードする該核酸分子の好ましい標的部分に特異的にハイブリダイズし、そして、ヒトのグルカゴンレセプターの発現を阻害し、ここで、該好ましい標的部分は、配列番号:484-816のいずれかの、少なくとも連続した8核酸塩基である、化合物。
- 請求項1に記載の化合物であって、ここで、前記好ましい標的部分は、配列番号:4、18または19で説明される前記ヌクレオチド配列の一部分であり、これは、配列番号:183、184、231、249、254、346、365、392、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、41、42、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、250、251、252、253、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、393、394、395、396、397、398、または399の、少なくとも8核酸塩基部分に相補的である、化合物。
- 請求項1に記載の化合物であって、配列番号:183、184、231、249、254、346、365、392、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、41、42、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、250、251、252、253、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、2
95、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、393、394、395、396、397、398、または、399の、少なくとも8核酸塩基部分を含む、化合物。 - 請求項1に記載の化合物であって、配列番号:183、184、231、249、254、346、365、または、392の少なくとも8核酸塩基部分を含む、化合物。
- 請求項1、2、3、または、4のいずれかに記載の化合物であって、ヒトのグルカゴンレセプターをコードする配列番号4の核酸分子に対して、少なくとも70%の相補性を有する、化合物。
- 請求項1、2、3、または、4のいずれかに記載の化合物であって、ヒトのグルカゴンレセプターをコードする配列番号4の核酸分子に対して、少なくとも80%の相補性を有する、化合物。
- 請求項1、2、3、または、4のいずれかに記載の化合物であって、ヒトのグルカゴンレセプターをコードする配列番号4の核酸分子に対して、少なくとも90%の相補性を有する、化合物。
- 請求項1、2、3、または、4のいずれかに記載の化合物であって、ヒトのグルカゴンレセプターをコードする配列番号4の核酸分子に対して、少なくとも95%の相補性を有する、化合物。
- 請求項1に記載の化合物であって、配列番号:183、184、231、249、254、346、365、392、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、41、42、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、75、76、77、78、79、80、81、82、83、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、250、251、252、253、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、393、394、395、396、397、398、および、399からなる群より選択される、化合物。
- 請求項9に記載の化合物であって、配列番号:183、184、231、249、254、346、365、および、392からなる群より選択される、化合物。
- ヒトのグルカゴンレセプターをコードする核酸分子の標的とされる、長さ8〜80核酸塩基の化合物であって、ここで、該化合物は、ヒトのグルカゴンレセプターをコードする該核酸分子に特異的にハイブリダイズし、そして、ヒトのグルカゴンレセプターの発現を阻害し、ここで、該化合物は、配列番号:43、84、85、86、87、88、89、90、91、162、163、164、165、166、または、167の、少なくとも8核酸塩基部分を含む、化合物。
- 請求項11に記載の化合物であって、ヒトのグルカゴンレセプターをコードする配列番号:18の核酸分子に対して、少なくとも70%の相補性を有する、化合物。
- 請求項11に記載の化合物であって、ヒトのグルカゴンレセプターをコードする配列番号:18の核酸分子に対して、少なくとも80%の相補性を有する、化合物。
- 請求項11に記載の化合物であって、ヒトのグルカゴンレセプターをコードする配列番号:18の核酸分子に対して、少なくとも90%の相補性を有する、化合物。
- 請求項11に記載の化合物であって、ヒトのグルカゴンレセプターをコードする配列番号:18の核酸分子に対して、少なくとも95%の相補性を有する、化合物。
- 請求項11に記載の化合物であって、配列番号:43、84、85、86、87、88、89、90、91、162、163、164、165、166、および、167からなる群より選択される、化合物。
- ヒトのグルカゴンレセプターをコードする核酸分子の標的とされる、長さ8〜80核酸塩基の化合物であって、ここで、該化合物は、ヒトのグルカゴンレセプターをコードする該核酸分子に特異的にハイブリダイズし、そして、ヒトのグルカゴンレセプターの発現を阻害し、ここで、該化合物は、配列番号:40、または、74の、少なくとも8核酸塩基部分を含む、化合物。
- 請求項17に記載の化合物であって、ヒトのグルカゴンレセプターをコードする配列番号:19の核酸分子に対して、少なくとも70%の相補性を有する、化合物。
- 請求項17に記載の化合物であって、ヒトのグルカゴンレセプターをコードする配列番号:19の核酸分子に対して、少なくとも80%の相補性を有する、化合物。
- 請求項17に記載の化合物であって、ヒトのグルカゴンレセプターをコードする配列番号:19の核酸分子に対して、少なくとも90%の相補性を有する、化合物。
- 請求項17に記載の化合物であって、ヒトのグルカゴンレセプターをコードする配列番号:19の核酸分子に対して、少なくとも95%の相補性を有する、化合物。
- 請求項17に記載の化合物であって、配列番号:40および74からなる群より選択される、化合物。
- 長さ8〜80核酸塩基の化合物であって、マウスのグルカゴンレセプターをコードする、配列番号:11、400、401、402、または、403の核酸分子の標的とされ、ここで、該化合物は、マウスのグルカゴンレセプターをコードする該核酸分子に特異的にハイブリダイズし、そして、マウスのグルカゴンレセプターの発現を阻害する、化合物。
- 請求項23に記載の化合物であって、マウスのグルカゴンレセプターをコードする配列番号:11、400、401、402、または、403の核酸分子に対して、少なくとも70%の相補性を有する、化合物。
- 請求項23に記載の化合物であって、マウスのグルカゴンレセプターをコードする配列番号:11、400、401、402、または、403の核酸分子に対して、少なくとも80%の相補性を有する、化合物。
- 請求項23に記載の化合物であって、マウスのグルカゴンレセプターをコードする配列番号:11、400、401、402、または、403の核酸分子に対して、少なくとも90%の相補性を有する、化合物。
- 請求項23に記載の化合物であって、マウスのグルカゴンレセプターをコードする配列番号:11、400、401、402、または、403の核酸分子に対して、少なくとも95%の相補性を有する、化合物。
- 請求項1、11、17、または、23に記載の化合物であって、長さ12〜50核酸塩基である、化合物。
- 請求項28に記載の化合物であって、長さ15〜30核酸塩基である、化合物。
- 請求項28に記載の化合物であって、長さ20核酸塩基である、化合物。
- 請求項1、11、17、または、23に記載の化合物であって、オリゴヌクレオチドを含む、化合物。
- 請求項31に記載の化合物であって、DNAオリゴヌクレオチドを含む、化合物。
- 請求項31に記載の化合物であって、RNAオリゴヌクレオチドを含む、化合物。
- 請求項31に記載の化合物であって、キメラオリゴヌクレオチドを含む、化合物。
- 請求項31に記載の化合物であって、ここで、前記化合物の少なくとも一部分は、オリゴヌクレオチド-RNA二本鎖を形成するためにRNAにハイブリダイズする、化合物。
- 請求項31に記載の化合物であって、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、一本鎖である、化合物。
- 請求項1-36のいずれかに記載の前記化合物であって、一つ、二つ以上の修飾型があり、ここで、該修飾は、ヌクレオシド間結合、糖成分、または、核酸塩基に修飾される、化合物。
- 請求項37に記載の化合物であって、少なくとも一つの、2’-O-メトキシエチル糖成分を有する、化合物。
- 請求項37に記載の化合物であって、少なくとも一つの、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、化合物。
- 請求項37に記載の化合物であって、少なくとも一つの、5-メチルシトシンを有する、化
合物。 - 請求項1-40に記載の化合物であって、薬局で入手可能な化合物。
- 細胞内または組織内のヒトのグルカゴンレセプターの発現を阻害する方法であって、該細胞または該組織と、請求項1-41のいずれかに記載の前記化合物と接触する工程を含み、そのため、ヒトのグルカゴンレセプターの発現は阻害される、方法。
- 請求項1-41のいずれかに記載の前記化合物を含む、キットまたはアッセイデバイス。
- グルカゴンレセプター活性に関連する疾患または状態を有するヒトを処置する方法であって、請求項1-14のいずれか1項に記載の化合物の治療的にまたは予防的に有効な量を、該ヒトに対して、投与し、そのため、ヒトのグルカゴンレセプターの発現は阻害される工程を含む、方法。
- 請求項44に記載の方法であって、ここで、前記疾患または前記状態は、代謝病もしくは代謝状態、糖尿病、肥満症、原発性高グルカゴン血症、インスリン欠乏症、または、インスリン抵抗性である、方法。
- 請求項45に記載の方法であって、ここで、前記疾患または前記状態は、II型糖尿病である、方法。
- 請求項44に記載の方法であって、ここで、前記疾患または前記状態は、血中グルコースレベルの上昇、血中トリグリセリドレベルの上昇、または、血中コレステロールレベルの上昇に関連する、方法。
- ヒトの血中グルコース濃度を減少する方法であって、請求項1-14のいずれか1項に記載の化合物を、該ヒトに対して、投与する工程を含む、方法。
- 請求項48に記載の方法であって、ここで、前記血中グルコース濃度は、血漿グルコース濃度である、方法。
- 請求項48に記載の方法であって、ここで、前記ヒトは、糖尿病または肥満症を患う、方法。
- ヒトのグルカゴンレセプター活性に関連する疾患の発症または状態の開始を妨げるか、または、遅らせる方法であって、請求項1-14のいずれかに記載の化合物の治療的にまたは予防的に有効な量を、該ヒトに対して、投与する工程を含む、方法。
- 請求項51に記載の方法であって、ここで、前記疾患または前記状態は、代謝病もしくは代謝状態、糖尿病、原発性高グルカゴン血症、インスリン欠乏症、インスリン抵抗性。または、肥満症である、方法。
- 請求項52に記載の方法であって、ここで、前記疾患または前記状態は、II型糖尿病である、方法。
- 請求項51に記載の方法であって、ここで、血中グルコースレベルの上昇、血中トリグリセリドレベルの上昇、または、血中コレステロールレベルの上昇に関連する、方法。
- ヒトの血中グルコース濃度の上昇の開始を妨げるか、または、遅せる方法であって、請
求項1-41のいずれか1項に記載の化合物を、該ヒトに対して、投与する工程を含む、方法。 - 請求項55に記載の方法であって、ここで、前記ヒトは、糖尿病、肥満症、または、インスリン抵抗性を患う、方法。
- 請求項55に記載の方法であって、ここで、前記血中グルコースレベルは、血漿グルコースレベルである、方法。
- 細胞内または組織内のマウスのグルカゴンレセプターの発現を阻害する方法であって、該細胞または該組織と、請求項23に記載の前記化合物とを接触させ、そのため、マウスのグルカゴンレセプターの発現は阻害される工程を含む、方法。
- マウスのグルカゴンレセプターの調節因子のスクリーニング方法であって、該方法は、以下aおよびb:
a. マウスのグルカゴンレセプターをコードする核酸分子の好ましい標的部分(配列番号:11、400、401、402、または、403)と、グルカゴンレセプター調節因子の一つ以上の候補とを接触させる工程、および
b. グルカゴンレセプター発現の一つ以上の調節因子を同定する工程であって、該調節因子は、マウスの該グルカゴンレセプター発現を調節する、工程を包含する方法。 - 請求項59に記載の方法であって、ここで、グルカゴンレセプター発現の前記調節因子は、オリゴヌクレオチド、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、RNAとハイブリダイズして、オリゴヌクレオチド-RNA二本鎖を形成することができるRNAオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分を有するRNAオリゴヌクレオチド、一本鎖RNA、二本鎖RNA、または、キメラオリゴヌクレオチドを含む、方法。
- マウスの血中グルコースレベルを減少する方法であって、請求項23に記載の化合物を、該マウスに対して、投与する工程を含む、方法。
- マウスの血中グルコースレベルの上昇の開始を妨げるか、または、遅らせる方法であって、請求項23に記載の化合物を、該マウスに対して、投与する工程を含む、方法。
- 配列番号184を含む化合物または、その薬学的に受容可能な塩であって、ここで、すべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合を含み、核酸塩基1-5および16-20は、2’-O-メトキシエチル改変を含み、すべてのシチジン残基は、5-メチル改変を含む、化合物またはその薬学的に受容可能な塩。
- 請求項63に記載の化合物であって、ここで、化合物は、ナトリウム塩である、化合物。
- グルカゴンレセプター活性に関連する疾患または状態を有するヒトを処置する方法であって、該ヒトに対して、請求項63に記載の化合物の治療有効量を投与する工程を含む、方法。
- 請求項65に記載の方法であって、ここで、前記状態とは、代謝病もしくは代謝状態、糖尿病、インスリン乏症、原発性高グルカゴン血症、または、肥満症、である、方法。
- ヒトの血中グルコースレベルを減少する方法であって、請求項63に記載の化合物の治療有効量を、該ヒトに対して投与する工程を含む、方法。
- 薬学的組成物であって、請求項1-41または請求項63-64のいずれか1項に記載の化合物および薬学的に受容可能な希釈済またはキャリアを含む、薬学的組成物。
- 化合物の使用であって、該使用は、グルカゴンレセプター活性に関連する疾患に苦しむ被験者を処置するための医薬品の製造における、請求項1-41または請求項63-64のいずれか1項に記載の化合物の使用。
- 請求項69に記載の使用であって、ここで、前記疾患は、代謝病である、使用。
- 請求項69に記載の使用であって、ここで、前記疾患は、糖尿病である、使用。
- 請求項69に記載の使用であって、ここで、前記疾患は、肥満症である、使用。
- 請求項69に記載の使用であって、ここで、前記疾患は、インスリン欠乏症またはインスリン抵抗性に関連する、使用。
- 請求項69に記載の使用であって、ここで、前記疾患は、原発性高グルカゴン血症に関連する、使用。
- 請求項69に記載の使用であって、ここで、前記疾患は、上昇した血中グルコースレベルに関連する、使用。
- 請求項69に記載の使用であって、ここで、前記疾患は、上昇した血中トリグリセリドレベルまたは上昇した血中コレステロールレベルに関連する、使用。
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---|---|---|---|---|
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US20060009410A1 (en) * | 2002-11-13 | 2006-01-12 | Crooke Rosanne M | Effects of apolipoprotein B inhibition on gene expression profiles in animals |
US9719094B2 (en) | 2002-11-14 | 2017-08-01 | Thermo Fisher Scientific Inc. | RNAi targeting SEC61G |
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DK2284266T3 (da) * | 2002-11-14 | 2014-01-13 | Thermo Fisher Scient Biosciences Inc | sIRNA-MOLEKYLE MOD TP53 |
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US20100113307A1 (en) * | 2002-11-14 | 2010-05-06 | Dharmacon, Inc. | siRNA targeting vascular endothelial growth factor (VEGF) |
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WO2006006948A2 (en) * | 2002-11-14 | 2006-01-19 | Dharmacon, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY |
US7691998B2 (en) * | 2002-11-14 | 2010-04-06 | Dharmacon, Inc. | siRNA targeting nucleoporin 62kDa (Nup62) |
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US20050287558A1 (en) * | 2004-05-05 | 2005-12-29 | Crooke Rosanne M | SNPs of apolipoprotein B and modulation of their expression |
US7585968B2 (en) * | 2005-03-28 | 2009-09-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and their uses directed to thymus and activation-regulated chemokine (TARC) |
EA200800869A1 (ru) * | 2005-09-19 | 2008-10-30 | ДЖОНСОН ЭНД ДЖОНСОН ФАРМАСЬЮТИКАЛ РИСЕРЧ ЭНД ДИВЕЛОПМЕНТ, Эл. Эл. Си. | Модуляция экспрессии рецептора глюкагона |
AU2007257094B2 (en) | 2006-05-05 | 2012-10-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for modulating expression of SGLT2 |
US20080241140A1 (en) | 2007-02-12 | 2008-10-02 | Medical College Of Georgia | Gene amplification of coactivator coaa and uses thereof |
JP2010522245A (ja) * | 2007-03-24 | 2010-07-01 | ゲンザイム コーポレイション | ヒトアポリポタンパク質bと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与 |
CL2009000586A1 (es) | 2008-03-27 | 2010-06-04 | Lilly Co Eli | Fragmento fab o anticuerpo monoclonal humanizado que lo comprende que se une a receptor de glucagon humano/glucr, de rata, de raton, y mono cinomolgus; vector que comprende polinuccleotido codificante; celula huesped que lo comprende; composicion farmaceutica; uso para tratar diabetes tipo 1 o 2, o para la perdida de peso |
EP2408796B1 (en) | 2009-03-16 | 2020-04-22 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Targeting Apolipoprotein B for the reduction of Apolipoprotein C-III |
KR20190062511A (ko) * | 2011-04-27 | 2019-06-05 | 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 | 아포지방단백질 ciii (apociii) 발현의 조정 |
CA2849273C (en) * | 2011-09-20 | 2020-07-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of gcgr expression |
EP2992098B1 (en) | 2013-05-01 | 2019-03-27 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for modulating hbv and ttr expression |
JP6667453B2 (ja) | 2014-05-01 | 2020-03-18 | アイオーニス ファーマシューティカルズ, インコーポレーテッドIonis Pharmaceuticals,Inc. | 成長ホルモン受容体発現を調節するための組成物及び方法 |
WO2015179693A1 (en) | 2014-05-22 | 2015-11-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugated antisense compounds and their use |
BR112018072362A2 (pt) | 2016-05-06 | 2019-02-19 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | oligonucleotídeos conjugados a uma unidade de ligando do receptor glp-1 e seus usos |
WO2018067900A1 (en) | 2016-10-06 | 2018-04-12 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Method of conjugating oligomeric compounds |
JP2019535839A (ja) | 2016-11-29 | 2019-12-12 | ピュアテック ヘルス エルエルシー | 治療剤の送達のためのエクソソーム |
US20210388357A1 (en) * | 2020-05-13 | 2021-12-16 | Hoffmann-La Roche Inc. | Oligonucleotide agonists targeting progranulin |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994005789A1 (en) * | 1992-08-28 | 1994-03-17 | Zymogenetics, Inc. | Glucagon receptors |
WO1999013886A1 (en) * | 1997-09-17 | 1999-03-25 | East Carolina University | Multiple target hybridizing nucleic acids, their preparation, compositions, formulation, kits and applications |
WO2002045494A2 (en) * | 2000-12-06 | 2002-06-13 | Deltagen, Inc. | Transgenic mice containing glucagon receptor gene disruptions |
WO2002092772A2 (en) * | 2001-05-14 | 2002-11-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of ptp1b expression |
WO2003010139A2 (en) * | 2001-07-26 | 2003-02-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of hormone-sensitive lipase expression |
WO2003011887A2 (en) * | 2001-08-01 | 2003-02-13 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of apolipoprotein b expression |
Family Cites Families (231)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3687808A (en) | 1969-08-14 | 1972-08-29 | Univ Leland Stanford Junior | Synthetic polynucleotides |
US4469863A (en) | 1980-11-12 | 1984-09-04 | Ts O Paul O P | Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof |
US4534899A (en) | 1981-07-20 | 1985-08-13 | Lipid Specialties, Inc. | Synthetic phospholipid compounds |
US4426330A (en) | 1981-07-20 | 1984-01-17 | Lipid Specialties, Inc. | Synthetic phospholipid compounds |
US5023243A (en) | 1981-10-23 | 1991-06-11 | Molecular Biosystems, Inc. | Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same |
US4476301A (en) | 1982-04-29 | 1984-10-09 | Centre National De La Recherche Scientifique | Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon |
JPS5927900A (ja) | 1982-08-09 | 1984-02-14 | Wakunaga Seiyaku Kk | 固定化オリゴヌクレオチド |
FR2540122B1 (fr) | 1983-01-27 | 1985-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application |
US4605735A (en) | 1983-02-14 | 1986-08-12 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Oligonucleotide derivatives |
US4948882A (en) | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
US4824941A (en) | 1983-03-10 | 1989-04-25 | Julian Gordon | Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems |
US4587044A (en) | 1983-09-01 | 1986-05-06 | The Johns Hopkins University | Linkage of proteins to nucleic acids |
US5118800A (en) | 1983-12-20 | 1992-06-02 | California Institute Of Technology | Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide |
US5118802A (en) | 1983-12-20 | 1992-06-02 | California Institute Of Technology | DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside |
US5550111A (en) | 1984-07-11 | 1996-08-27 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof |
FR2567892B1 (fr) | 1984-07-19 | 1989-02-17 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons |
US5258506A (en) | 1984-10-16 | 1993-11-02 | Chiron Corporation | Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains |
US5367066A (en) | 1984-10-16 | 1994-11-22 | Chiron Corporation | Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites |
US5430136A (en) | 1984-10-16 | 1995-07-04 | Chiron Corporation | Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites |
US4828979A (en) | 1984-11-08 | 1989-05-09 | Life Technologies, Inc. | Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection |
FR2575751B1 (fr) | 1985-01-08 | 1987-04-03 | Pasteur Institut | Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques |
US5235033A (en) | 1985-03-15 | 1993-08-10 | Anti-Gene Development Group | Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof |
US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
US5405938A (en) | 1989-12-20 | 1995-04-11 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
US5166315A (en) | 1989-12-20 | 1992-11-24 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
US5185444A (en) | 1985-03-15 | 1993-02-09 | Anti-Gene Deveopment Group | Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages |
US4762779A (en) | 1985-06-13 | 1988-08-09 | Amgen Inc. | Compositions and methods for functionalizing nucleic acids |
US5317098A (en) | 1986-03-17 | 1994-05-31 | Hiroaki Shizuya | Non-radioisotope tagging of fragments |
JPS638396A (ja) | 1986-06-30 | 1988-01-14 | Wakunaga Pharmaceut Co Ltd | ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体 |
DE3788914T2 (de) | 1986-09-08 | 1994-08-25 | Ajinomoto Kk | Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere. |
US5264423A (en) | 1987-03-25 | 1993-11-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
US5276019A (en) | 1987-03-25 | 1994-01-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
US4904582A (en) | 1987-06-11 | 1990-02-27 | Synthetic Genetics | Novel amphiphilic nucleic acid conjugates |
WO1988010264A1 (en) | 1987-06-24 | 1988-12-29 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology | Nucleoside derivatives |
US5585481A (en) | 1987-09-21 | 1996-12-17 | Gen-Probe Incorporated | Linking reagents for nucleotide probes |
US4924624A (en) | 1987-10-22 | 1990-05-15 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof |
US5188897A (en) | 1987-10-22 | 1993-02-23 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates |
US5525465A (en) | 1987-10-28 | 1996-06-11 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same |
DE3738460A1 (de) | 1987-11-12 | 1989-05-24 | Max Planck Gesellschaft | Modifizierte oligonukleotide |
US5403711A (en) | 1987-11-30 | 1995-04-04 | University Of Iowa Research Foundation | Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved |
ATE151467T1 (de) | 1987-11-30 | 1997-04-15 | Univ Iowa Res Found | Durch modifikationen an der 3'-terminalen phosphodiesterbindung stabilisierte dna moleküle, ihre verwendung als nukleinsäuresonden sowie als therapeutische mittel zur hemmung der expression spezifischer zielgene |
US5082830A (en) | 1988-02-26 | 1992-01-21 | Enzo Biochem, Inc. | End labeled nucleotide probe |
WO1989009221A1 (en) | 1988-03-25 | 1989-10-05 | University Of Virginia Alumni Patents Foundation | Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates |
US5278302A (en) | 1988-05-26 | 1994-01-11 | University Patents, Inc. | Polynucleotide phosphorodithioates |
US5109124A (en) | 1988-06-01 | 1992-04-28 | Biogen, Inc. | Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine |
US5216141A (en) | 1988-06-06 | 1993-06-01 | Benner Steven A | Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages |
US5175273A (en) | 1988-07-01 | 1992-12-29 | Genentech, Inc. | Nucleic acid intercalating agents |
US5262536A (en) | 1988-09-15 | 1993-11-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides |
US5194599A (en) | 1988-09-23 | 1993-03-16 | Gilead Sciences, Inc. | Hydrogen phosphonodithioate compositions |
US5512439A (en) | 1988-11-21 | 1996-04-30 | Dynal As | Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof |
US5457183A (en) | 1989-03-06 | 1995-10-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Hydroxylated texaphyrins |
US5599923A (en) | 1989-03-06 | 1997-02-04 | Board Of Regents, University Of Tx | Texaphyrin metal complexes having improved functionalization |
US5354844A (en) | 1989-03-16 | 1994-10-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Protein-polycation conjugates |
US5108921A (en) | 1989-04-03 | 1992-04-28 | Purdue Research Foundation | Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules |
US5391723A (en) | 1989-05-31 | 1995-02-21 | Neorx Corporation | Oligonucleotide conjugates |
US5256775A (en) | 1989-06-05 | 1993-10-26 | Gilead Sciences, Inc. | Exonuclease-resistant oligonucleotides |
US4958013A (en) | 1989-06-06 | 1990-09-18 | Northwestern University | Cholesteryl modified oligonucleotides |
US5227170A (en) | 1989-06-22 | 1993-07-13 | Vestar, Inc. | Encapsulation process |
US5451463A (en) | 1989-08-28 | 1995-09-19 | Clontech Laboratories, Inc. | Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides |
US5134066A (en) | 1989-08-29 | 1992-07-28 | Monsanto Company | Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs |
US5254469A (en) | 1989-09-12 | 1993-10-19 | Eastman Kodak Company | Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures |
US5591722A (en) | 1989-09-15 | 1997-01-07 | Southern Research Institute | 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity |
US5013556A (en) | 1989-10-20 | 1991-05-07 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US5356633A (en) | 1989-10-20 | 1994-10-18 | Liposome Technology, Inc. | Method of treatment of inflamed tissues |
US5527528A (en) | 1989-10-20 | 1996-06-18 | Sequus Pharmaceuticals, Inc. | Solid-tumor treatment method |
US5721218A (en) | 1989-10-23 | 1998-02-24 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotides with inverted polarity |
US5399676A (en) | 1989-10-23 | 1995-03-21 | Gilead Sciences | Oligonucleotides with inverted polarity |
EP0942000B1 (en) | 1989-10-24 | 2004-06-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-Modified oligonucleotides |
US5264564A (en) | 1989-10-24 | 1993-11-23 | Gilead Sciences | Oligonucleotide analogs with novel linkages |
US5264562A (en) | 1989-10-24 | 1993-11-23 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide analogs with novel linkages |
US5292873A (en) | 1989-11-29 | 1994-03-08 | The Research Foundation Of State University Of New York | Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe |
US5177198A (en) | 1989-11-30 | 1993-01-05 | University Of N.C. At Chapel Hill | Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates |
US5130302A (en) | 1989-12-20 | 1992-07-14 | Boron Bilogicals, Inc. | Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same |
US5469854A (en) | 1989-12-22 | 1995-11-28 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Methods of preparing gas-filled liposomes |
US5580575A (en) | 1989-12-22 | 1996-12-03 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Therapeutic drug delivery systems |
US5486603A (en) | 1990-01-08 | 1996-01-23 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide having enhanced binding affinity |
US5587470A (en) | 1990-01-11 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 3-deazapurines |
US5670633A (en) | 1990-01-11 | 1997-09-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
US5587361A (en) | 1991-10-15 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
US5459255A (en) | 1990-01-11 | 1995-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-2 substituted purines |
US5623065A (en) | 1990-08-13 | 1997-04-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped 2' modified oligonucleotides |
US5681941A (en) | 1990-01-11 | 1997-10-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted purines and oligonucleotide cross-linking |
US5646265A (en) | 1990-01-11 | 1997-07-08 | Isis Pharmceuticals, Inc. | Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites |
US5578718A (en) | 1990-01-11 | 1996-11-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Thiol-derivatized nucleosides |
US5149797A (en) | 1990-02-15 | 1992-09-22 | The Worcester Foundation For Experimental Biology | Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides |
US5220007A (en) | 1990-02-15 | 1993-06-15 | The Worcester Foundation For Experimental Biology | Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides |
AU7579991A (en) | 1990-02-20 | 1991-09-18 | Gilead Sciences, Inc. | Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers |
US5214136A (en) | 1990-02-20 | 1993-05-25 | Gilead Sciences, Inc. | Anthraquinone-derivatives oligonucleotides |
US5321131A (en) | 1990-03-08 | 1994-06-14 | Hybridon, Inc. | Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling |
US5470967A (en) | 1990-04-10 | 1995-11-28 | The Dupont Merck Pharmaceutical Company | Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
GB9009980D0 (en) | 1990-05-03 | 1990-06-27 | Amersham Int Plc | Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides |
ES2116977T3 (es) | 1990-05-11 | 1998-08-01 | Microprobe Corp | Soportes solidos para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y metodos para inmovilizar oligonucleotidos de modo covalente. |
US5218105A (en) | 1990-07-27 | 1993-06-08 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5608046A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds |
US5602240A (en) | 1990-07-27 | 1997-02-11 | Ciba Geigy Ag. | Backbone modified oligonucleotide analogs |
US5386023A (en) | 1990-07-27 | 1995-01-31 | Isis Pharmaceuticals | Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling |
US5688941A (en) | 1990-07-27 | 1997-11-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds |
US5378825A (en) | 1990-07-27 | 1995-01-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs |
US5138045A (en) | 1990-07-27 | 1992-08-11 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5614617A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
US5223618A (en) | 1990-08-13 | 1993-06-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 4'-desmethyl nucleoside analog compounds |
US5541307A (en) | 1990-07-27 | 1996-07-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof |
US5610289A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogues |
US5623070A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
US5618704A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-08 | Isis Pharmacueticals, Inc. | Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling |
US5489677A (en) | 1990-07-27 | 1996-02-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms |
US5677437A (en) | 1990-07-27 | 1997-10-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
US5245022A (en) | 1990-08-03 | 1993-09-14 | Sterling Drug, Inc. | Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides |
ES2083593T3 (es) | 1990-08-03 | 1996-04-16 | Sterling Winthrop Inc | Compuestos y metodos para inhibir la expresion de genes. |
US5177196A (en) | 1990-08-16 | 1993-01-05 | Microprobe Corporation | Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof |
US5512667A (en) | 1990-08-28 | 1996-04-30 | Reed; Michael W. | Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides |
US5214134A (en) | 1990-09-12 | 1993-05-25 | Sterling Winthrop Inc. | Process of linking nucleosides with a siloxane bridge |
US5561225A (en) | 1990-09-19 | 1996-10-01 | Southern Research Institute | Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages |
WO1992005186A1 (en) | 1990-09-20 | 1992-04-02 | Gilead Sciences | Modified internucleoside linkages |
US5432272A (en) | 1990-10-09 | 1995-07-11 | Benner; Steven A. | Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases |
CA2095212A1 (en) | 1990-11-08 | 1992-05-09 | Sudhir Agrawal | Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides |
US6582908B2 (en) * | 1990-12-06 | 2003-06-24 | Affymetrix, Inc. | Oligonucleotides |
US5672697A (en) | 1991-02-08 | 1997-09-30 | Gilead Sciences, Inc. | Nucleoside 5'-methylene phosphonates |
WO1992017611A1 (en) * | 1991-03-28 | 1992-10-15 | The University Of Tennessee Research Corporation | Dna silver staining |
JP3220180B2 (ja) | 1991-05-23 | 2001-10-22 | 三菱化学株式会社 | 薬剤含有タンパク質結合リポソーム |
US5714331A (en) | 1991-05-24 | 1998-02-03 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility |
US5539082A (en) | 1993-04-26 | 1996-07-23 | Nielsen; Peter E. | Peptide nucleic acids |
US5719262A (en) | 1993-11-22 | 1998-02-17 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having amino acid side chains |
JPH06508622A (ja) * | 1991-06-18 | 1994-09-29 | テンプル ユニバーシティ−オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤーエデュケーション | bcr−ab1アンチセンスオリゴヌクレオチドによる白血球増殖の選択的抑制 |
WO1993000446A1 (en) * | 1991-06-27 | 1993-01-07 | Genelabs Technologies, Inc. | Screening assay for the detection of dna-binding molecules |
US5371241A (en) | 1991-07-19 | 1994-12-06 | Pharmacia P-L Biochemicals Inc. | Fluorescein labelled phosphoramidites |
US5571799A (en) | 1991-08-12 | 1996-11-05 | Basco, Ltd. | (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response |
US5521291A (en) | 1991-09-30 | 1996-05-28 | Boehringer Ingelheim International, Gmbh | Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells |
NZ244306A (en) | 1991-09-30 | 1995-07-26 | Boehringer Ingelheim Int | Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation |
ES2103918T3 (es) | 1991-10-17 | 1997-10-01 | Ciba Geigy Ag | Nucleosidos biciclicos, oligonucleotidos, procedimiento para su obtencion y productos intermedios. |
US5594121A (en) | 1991-11-07 | 1997-01-14 | Gilead Sciences, Inc. | Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines |
JP3739785B2 (ja) | 1991-11-26 | 2006-01-25 | アイシス ファーマシューティカルズ,インコーポレイティド | 修飾されたピリミジンを含有するオリゴマーを使用する増強された三重らせんおよび二重らせんの成形 |
US5484908A (en) | 1991-11-26 | 1996-01-16 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines |
TW393513B (en) | 1991-11-26 | 2000-06-11 | Isis Pharmaceuticals Inc | Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines |
US5792608A (en) | 1991-12-12 | 1998-08-11 | Gilead Sciences, Inc. | Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use |
US5359044A (en) | 1991-12-13 | 1994-10-25 | Isis Pharmaceuticals | Cyclobutyl oligonucleotide surrogates |
US5700922A (en) | 1991-12-24 | 1997-12-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules |
US5595726A (en) | 1992-01-21 | 1997-01-21 | Pharmacyclics, Inc. | Chromophore probe for detection of nucleic acid |
US5565552A (en) | 1992-01-21 | 1996-10-15 | Pharmacyclics, Inc. | Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis |
FR2687679B1 (fr) | 1992-02-05 | 1994-10-28 | Centre Nat Rech Scient | Oligothionucleotides. |
US5633360A (en) | 1992-04-14 | 1997-05-27 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation |
US5434257A (en) | 1992-06-01 | 1995-07-18 | Gilead Sciences, Inc. | Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages |
EP0577558A2 (de) | 1992-07-01 | 1994-01-05 | Ciba-Geigy Ag | Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte |
US5272250A (en) | 1992-07-10 | 1993-12-21 | Spielvogel Bernard F | Boronated phosphoramidate compounds |
US5652355A (en) | 1992-07-23 | 1997-07-29 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Hybrid oligonucleotide phosphorothioates |
RU95104940A (ru) | 1992-07-27 | 1997-01-10 | Хайбрайдон | Способ введения в олигонуклеотид алкилфосфонотиоатной или арилфосфонотиоатной межнуклеотидной связи, способ получения олигонуклеотида, олигонуклеотиды, способ ингибирования генной экспрессии, способ лечения |
US5804383A (en) * | 1992-08-21 | 1998-09-08 | The Regents Of The University Of California | Method and assay for detection of the expression of allele-specific mutations by allele-specific in situ reverse transcriptase polymerase chain reaction |
US5776725A (en) * | 1992-08-28 | 1998-07-07 | Zymogenetics, Inc. | Recombinant production of glucagon receptors |
US5872242A (en) * | 1992-10-05 | 1999-02-16 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide inhibition of ras |
US6410324B1 (en) * | 2001-04-27 | 2002-06-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of tumor necrosis factor receptor 2 expression |
US5985558A (en) * | 1997-04-14 | 1999-11-16 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense oligonucleotide compositions and methods for the inibition of c-Jun and c-Fos |
US5583020A (en) | 1992-11-24 | 1996-12-10 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides |
US5574142A (en) | 1992-12-15 | 1996-11-12 | Microprobe Corporation | Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery |
JP3351476B2 (ja) | 1993-01-22 | 2002-11-25 | 三菱化学株式会社 | リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム |
JPH08508714A (ja) | 1993-01-25 | 1996-09-17 | ハイブライドン インコーポレイテッド | オリゴヌクレオチド・アルキルホスホネートおよびアルキルホスホノチオエート |
US5476925A (en) | 1993-02-01 | 1995-12-19 | Northwestern University | Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups |
US5395619A (en) | 1993-03-03 | 1995-03-07 | Liposome Technology, Inc. | Lipid-polymer conjugates and liposomes |
GB9304618D0 (en) | 1993-03-06 | 1993-04-21 | Ciba Geigy Ag | Chemical compounds |
GB9304620D0 (en) | 1993-03-06 | 1993-04-21 | Ciba Geigy Ag | Compounds |
DK0691968T3 (da) | 1993-03-30 | 1998-02-23 | Sanofi Sa | Acykliske nukleosid-analoge og oligonukleotidsekvenser indeholdende disse |
AU6412794A (en) | 1993-03-31 | 1994-10-24 | Sterling Winthrop Inc. | Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages |
DE4311944A1 (de) | 1993-04-10 | 1994-10-13 | Degussa | Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen |
US5462854A (en) | 1993-04-19 | 1995-10-31 | Beckman Instruments, Inc. | Inverse linkage oligonucleotides for chemical and enzymatic processes |
WO1994025588A2 (en) * | 1993-04-30 | 1994-11-10 | Biognostik Gesellschaft für Biomolekulare Diagnostik mbH | ANTISENSE-OLIGONUCLEOTIDES FOR THE TREATMENT OF IMMUNOSUPPRESSIVE EFFECTS OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR-β (TGF-β) |
US5534259A (en) | 1993-07-08 | 1996-07-09 | Liposome Technology, Inc. | Polymer compound and coated particle composition |
US5543158A (en) | 1993-07-23 | 1996-08-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Biodegradable injectable nanoparticles |
US5417978A (en) | 1993-07-29 | 1995-05-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use |
US5502177A (en) | 1993-09-17 | 1996-03-26 | Gilead Sciences, Inc. | Pyrimidine derivatives for labeled binding partners |
US5801154A (en) * | 1993-10-18 | 1998-09-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein |
US5457187A (en) | 1993-12-08 | 1995-10-10 | Board Of Regents University Of Nebraska | Oligonucleotides containing 5-fluorouracil |
US5446137B1 (en) | 1993-12-09 | 1998-10-06 | Behringwerke Ag | Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides |
PT733059E (pt) | 1993-12-09 | 2001-03-30 | Univ Jefferson | Compostos e metodos para mutacoes dirigidas ao local em celulas eucarioticas |
US5595756A (en) | 1993-12-22 | 1997-01-21 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents |
US5519134A (en) | 1994-01-11 | 1996-05-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Pyrrolidine-containing monomers and oligomers |
US5596091A (en) | 1994-03-18 | 1997-01-21 | The Regents Of The University Of California | Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides |
US5627053A (en) | 1994-03-29 | 1997-05-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid |
US5625050A (en) | 1994-03-31 | 1997-04-29 | Amgen Inc. | Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics |
US5646269A (en) | 1994-04-28 | 1997-07-08 | Gilead Sciences, Inc. | Method for oligonucleotide analog synthesis |
US5563036A (en) * | 1994-04-29 | 1996-10-08 | Tularik, Inc. | Transcription factor-DNA binding assay |
US5525711A (en) | 1994-05-18 | 1996-06-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes |
US5543152A (en) | 1994-06-20 | 1996-08-06 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Sphingosomes for enhanced drug delivery |
US5612455A (en) * | 1994-07-05 | 1997-03-18 | Tularik, Inc. | Nuclear factors and binding assay |
US5597696A (en) | 1994-07-18 | 1997-01-28 | Becton Dickinson And Company | Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates |
US5597909A (en) | 1994-08-25 | 1997-01-28 | Chiron Corporation | Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use |
US5580731A (en) | 1994-08-25 | 1996-12-03 | Chiron Corporation | N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith |
US5734039A (en) * | 1994-09-15 | 1998-03-31 | Thomas Jefferson University | Antisense oligonucleotides targeting cooperating oncogenes |
US5591721A (en) | 1994-10-25 | 1997-01-07 | Hybridon, Inc. | Method of down-regulating gene expression |
US5512295A (en) | 1994-11-10 | 1996-04-30 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery |
US5792747A (en) | 1995-01-24 | 1998-08-11 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Highly potent agonists of growth hormone releasing hormone |
US5652356A (en) | 1995-08-17 | 1997-07-29 | Hybridon, Inc. | Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides |
CA2253877A1 (en) * | 1997-03-07 | 1998-11-09 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Antisense compounds to cd14 |
JP3756313B2 (ja) | 1997-03-07 | 2006-03-15 | 武 今西 | 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体 |
US6133246A (en) * | 1997-08-13 | 2000-10-17 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins |
EP1557424A1 (en) | 1997-09-12 | 2005-07-27 | Exiqon A/S | Bi-cyclic nucleoside, nucleotide and oligonucleoide analogues |
AU9509798A (en) * | 1997-09-25 | 1999-04-12 | University Of Florida | Antisense oligonucleotide compositions targeted to angiotensi n converting enzy me mrna and methods of use |
US6238921B1 (en) * | 1998-03-26 | 2001-05-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of human mdm2 expression |
US20030203862A1 (en) * | 1998-03-26 | 2003-10-30 | Miraglia Loren J. | Antisense modulation of MDM2 expression |
US20030228597A1 (en) * | 1998-04-13 | 2003-12-11 | Cowsert Lex M. | Identification of genetic targets for modulation by oligonucleotides and generation of oligonucleotides for gene modulation |
WO2000005418A1 (en) | 1998-07-23 | 2000-02-03 | Gen-Probe Incorporated | Methods for detecting and measuring spliced nucleic acids |
US6228642B1 (en) * | 1998-10-05 | 2001-05-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of tumor necrosis factor-(α) (TNF-α) expression |
US6692959B2 (en) * | 1998-11-25 | 2004-02-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of IL-1 receptor-associated kinase-4 expression |
US20030087854A1 (en) * | 2001-09-10 | 2003-05-08 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of fibroblast growth factor receptor 3 expression |
CA2850318A1 (en) | 1999-02-26 | 2000-08-31 | The University Of British Columbia | Trpm-2 antisense therapy |
US5998148A (en) * | 1999-04-08 | 1999-12-07 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of microtubule-associated protein 4 expression |
US6492152B1 (en) * | 1999-06-15 | 2002-12-10 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Core 1 β3-galactosyl transferases and methods of use thereof |
US6284538B1 (en) * | 1999-07-21 | 2001-09-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of PTEN expression |
CA2392685C (en) * | 1999-11-29 | 2011-02-22 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antibacterial method and composition |
US6287860B1 (en) | 2000-01-20 | 2001-09-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of MEKK2 expression |
US6770486B1 (en) * | 2000-02-08 | 2004-08-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Optimization of ligand affinity for RNA targets using mass spectrometry |
WO2001092524A2 (en) | 2000-05-26 | 2001-12-06 | Aeomica, Inc. | Myosin-like gene expressed in human heart and muscle |
JP2004507236A (ja) | 2000-08-18 | 2004-03-11 | プロスケリア | 骨粗鬆症の診断および治療に有用な調節遺伝子および系 |
AU2001296412A1 (en) * | 2000-09-29 | 2002-04-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of mekk4 expression |
US6426220B1 (en) | 2000-10-30 | 2002-07-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of calreticulin expression |
US7425545B2 (en) * | 2001-07-25 | 2008-09-16 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of C-reactive protein expression |
AU2003243391A1 (en) * | 2002-06-06 | 2003-12-22 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for production of maize lines with increased transformability |
US6903105B2 (en) * | 2003-02-19 | 2005-06-07 | Parion Sciences, Inc. | Sodium channel blockers |
US7750142B2 (en) * | 2003-04-28 | 2010-07-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of glucagon receptor expression |
US7399853B2 (en) * | 2003-04-28 | 2008-07-15 | Isis Pharmaceuticals | Modulation of glucagon receptor expression |
US7825235B2 (en) * | 2003-08-18 | 2010-11-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression |
US20050142581A1 (en) * | 2003-09-04 | 2005-06-30 | Griffey Richard H. | Microrna as ligands and target molecules |
US20050053981A1 (en) * | 2003-09-09 | 2005-03-10 | Swayze Eric E. | Gapped oligomeric compounds having linked bicyclic sugar moieties at the termini |
US20050074801A1 (en) * | 2003-09-09 | 2005-04-07 | Monia Brett P. | Chimeric oligomeric compounds comprising alternating regions of northern and southern conformational geometry |
RU2377301C2 (ru) * | 2003-12-23 | 2009-12-27 | Сантарис Фарма А/С | ОЛИГОМЕРНОЕ СОЕДИНЕНИЕ, ПОНИЖАЮЩЕЕ ЭКСПРЕССИЮ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГЕНА Bcl-2, КОНЪЮГАТ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ОЛИГОМЕРНОГО СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА |
CA2580504C (en) * | 2004-09-17 | 2013-10-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Enhanced antisense oligonucleotides |
DE202005008426U1 (de) | 2005-05-31 | 2005-09-15 | Ricon Sieb Und Foerdertechnik | Fördervorrichtung mit Fördertuch |
EA200800869A1 (ru) | 2005-09-19 | 2008-10-30 | ДЖОНСОН ЭНД ДЖОНСОН ФАРМАСЬЮТИКАЛ РИСЕРЧ ЭНД ДИВЕЛОПМЕНТ, Эл. Эл. Си. | Модуляция экспрессии рецептора глюкагона |
US8935416B2 (en) | 2006-04-21 | 2015-01-13 | Fortinet, Inc. | Method, apparatus, signals and medium for enforcing compliance with a policy on a client computer |
WO2013080784A1 (ja) | 2011-11-30 | 2013-06-06 | シャープ株式会社 | メモリ回路とその駆動方法、及び、これを用いた不揮発性記憶装置、並びに、液晶表示装置 |
US9400902B2 (en) | 2012-05-22 | 2016-07-26 | Trimble Navigation Limited | Multi-modal entity tracking and display |
US10867398B2 (en) | 2017-11-21 | 2020-12-15 | Reliance Core Consulting LLC | Methods, systems, apparatuses and devices for facilitating motion analysis in an environment |
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Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994005789A1 (en) * | 1992-08-28 | 1994-03-17 | Zymogenetics, Inc. | Glucagon receptors |
WO1999013886A1 (en) * | 1997-09-17 | 1999-03-25 | East Carolina University | Multiple target hybridizing nucleic acids, their preparation, compositions, formulation, kits and applications |
WO2002045494A2 (en) * | 2000-12-06 | 2002-06-13 | Deltagen, Inc. | Transgenic mice containing glucagon receptor gene disruptions |
WO2002092772A2 (en) * | 2001-05-14 | 2002-11-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of ptp1b expression |
WO2003010139A2 (en) * | 2001-07-26 | 2003-02-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of hormone-sensitive lipase expression |
WO2003011887A2 (en) * | 2001-08-01 | 2003-02-13 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of apolipoprotein b expression |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6010010379; Gene Vol.140, 1994, p.203-209 * |
JPN6010010381; Biochemical and Biophysical Research Communications Vol.198, No.1, 1994, p.328-334 * |
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