JPH08509751A

JPH08509751A - 表面の化学的官能化

Info

Publication number: JPH08509751A
Application number: JP6517262A
Authority: JP
Inventors: ジョンエフダブリューキーナ; マーチンエヌウィボールン; スイシオンカイ; ミンディヤン
Original assignee: オレゴン州
Priority date: 1993-01-21
Filing date: 1994-01-21
Publication date: 1996-10-15
Also published as: EP0680623A1; AU6231794A; EP0680623A4; US5580697A; CA2154444A1; WO1994017447A1

Abstract

(57)【要約】種々の基質の表面を共有的に修飾する方法、およびこの方法によって修飾された表面を備える種々の基質を開示する。候補となる表面には、種々の重合体、珪質、金属、炭索の同索体形態、および半導体の表面が挙げられる。これらの表面を、それぞれがニトレン生成基と官能化基とを有する分子を備えた試薬に対して、このニトレン生成基をニトレン中間体へと変換させる、電子およびイオンのようなエネルギー化された荷電粒子、フォトン、または熱の存在下に接触させる。このニトレンは、この基質の表面上に存在する種々の化学基のいずれかと共有的に反応し、これによって官能化基の基質表面へのニトレン付加を行わせる。次いで、この官能化基は、下流の化学反応に参加し、これによって生体分子を含むあらゆる広範な官能基が、この表面に対して共有的に結合することができ、これによって表面の化学的挙動を劇的に変化させる。こうした表面の官能化は、１つの反応工程および複数の反応工程を通じて実施できる。

Description

【発明の詳細な説明】表面の化学的官能化謝辞本発明は、国立一般医療科学研究所からの付与番号ＧＭ２７１３７および海軍研究所からの付与番号Ｎ０００１４−９２−Ｊ−１４１２（Ｒ＆Ｔコード４１３ｔ０１１）の下に、米国政府の補助によってなされたものである。米国政府は、本発明に特定の権利を有している。発明の分野本発明は、重合性材料および他の材料の表面を含む、表面の化学的修飾に関するものである。発明の背景種々の表面を化学的に修飾することは、集中的な研究の主題となってきた。こうした表面を例示すると、重合体類、Braybrook等「Prog．Polym．Sci．」15:71 5-734頁(1990)；金属類、Stratmann，「Adv．Mater．」2，191-195,（1990）；シリカ，Bhatia等，「J．Am．Chem．Soc．」114,4432-4433,（1992）；およびグラファイト，Delamar，「J．Am．Chem．Soc．」114，5883-5884(1992)。この研究は、新規な複合体，Baum等「Chem．Mater．」3，714-720(1991)；耐久性材料, MacDonald等「Chem．Mater．」3，435-442(1991)；バイオセンサー，Pantano等，「J．Am．Chem．Soc．」113，1832-1833(1991)；およびバイオ材料Allicock等「Chem．Mater．」3，450-454(1991)の開発に主として向けられてきた。最近、表面修飾はフォトリソグラフィーと組み合わされて、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドの合成，Fodor等，「Science」251，767-773(1991)およびKiederowski ，「Angew．Chem．Int．Ed．Eng．」30，822-823(1991)；およびバイオポリマーの固定化，Rozsnyai等，「Angew．Chem．Int．Ed．Eng．」31，759-761(1992)に対して広がってきた。本分野で既知の表面修飾方法のほとんどは、化学的試薬Id による表面の順次処理を含んでいる。上記。表面修飾試薬としてアジド類を使用することは、こうした研究のうちの僅かにしか含まれていない。Scriven（編集）におけるBreslow，「Azides and Nitrenes」第10章、Academic press，ニューヨーク州（1984）；Harmer，「Langmir」7,2010-2012(1991)。重合体フィルムを修飾するための既存の方法の例としては、ポリスチレンのスルホン化，Gibson等「Macromolecules」13，34,（1980）；ポリ（アリロキシ）ホスファゼンのスルホン化，Allcock等「Chem．Mater．」3，1120(1991)；ポリエステルのプラズマ処理，Porta等，「Chem．Mater．」3，293，（1991）；ポリイミドの塩基加水分解，Lee等，「Macromolecules」23，2097,（1990）；ポリホスファゼンの塩基加水分解，Allcock等「Chem．Mater．」3，1441(1991)；およびポリ（フッ化ビニリデン）の塩基処理，Dias等，「Macromolecules」17，2529 ,（1984）が挙げられる。重合体を修飾する他の通常法は、ポリエチレンのような炭化水素重合体の表面を、気相中で発生したニトレンまたはカルベン中間体に対して接触させることからなる。Scriven（編集）におけるBreslow，「Azides and Nitrenes」第10章、A cademlc press，ニューヨーク州（1984）。また、溶液中で発生したジフルオロカルベンは、1,4-ポリブタジエンを修飾することが報告された。Siddiqui等，「 Macromolecules」19，595(1986)。ペルフルオロフェニルアジド（PFPAs）は、PFPAsをシクロヘキサンまたはトルエンのような炭化水素溶媒中で光分解したときには、これらの非フッ素化相同体に対するCH挿入の効率の向上を示すことが発見された。Keana等，「Fluorine Chem．」43，151，（1989）；Keana等，「J．Org．Chem．」55，3640，（1990）；Leyva等，「J．Org．Chem．」54，5938，（1989）；およびSoundararajan等，「J.Org．Chem．」55，2034，（1990）。PFPAsは、当初は、効率的な光標識試薬として開発された。Cai等，「Bioconjugate Chem．」2，38(1991)；Pinney等，「J.Org．Chem．」56，3125,（1991）；およびCrocker等，「Bioconjugate Chem ．」1，419，（1990）。最近、ビス-（PFPAs）が、ポリスチレン、Cai等，「Che m．Mater．」2，631,（1990）；およびポリ（３-オクチルチオフェン）、Cai等，「J．Molec．Electron．」7，63,（1991）に対する効率的な架橋剤であることが示された。表面を化学的に修飾する本分野の現状の観点から、特に一工程で、種々の材料の表面の分子を化学的に官能化するための他の方法に対する要望が残されている。また、広範な種々の用途のいずれにおいても使用できる、新しいタイプの化学的に修飾された分子、特に官能化された重合体に対して、継続的な要望がある。発明の要約こうしたこれまでの要望は、本発明によって満足され、本発明は種々の基質の表面を共有結合的に修飾する（例えば、官能化する）ための方法を提供し、および化学的に修飾された表面を備えた種々の基質を提供する。本発明に従って官能化することができる基質は、広範な種々の重合体基質および炭素原子の種々の同素体形態（例えば、グラファイト、「炭素電極」、ダイアモンドおよびダイアモンドフィルム、およびＣ₆₀、Ｃ₇₀のようなフラーレン）、珪質材料、および種々のあらゆる金属を含んでいるが、これらには限定されない。また、この基質は、シリコン、ガリウム砒素のような半導体材料、および他の半導体材料（ドープされたものまたはドープされていないもの）であって良い。本発明に従って、基質の表面を、ニトレンを生成する官能化剤に対して、フォトン、電子、または熱のような反応エネルギー源の存在下に接触させることによって、官能化する。この反応エネルギー源の存在下に、この官能化剤は、ニトレン中間体を生成し、ニトレン中間体が、基質の表面上の−ＣＨ、−ＮＨ、−ＯＨ、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｃ−Ｃ−、および他の基と共有結合的に反応することによって、この基質の表面にこの官能化剤の「ニトレン付加」または「ニトレン挿入」を生じさせる。ニトレン中間体を生成させるためには、この表面分子との反応に使用されるこの官能化剤は、アジド基、または反応エネルギー源に対して暴露したときに反応性のニトレンを生成させることができる相同性の化学基で終結していなければならない。本発明に従って、この基質の表面を、一工程または複数工程の方法のいずれかによって、官能化する。複数工程の方法においては、各工程は、典型的には、異なる官能化剤を含んでいる。一工程の方法および複数工程の方法のいずれにおいても、少なくとも１つの工程には、ニトレンを生成する官能化剤が含まれている。一工程の方法においては、この官能化剤の各分子が、ニトレンを生成する基に加えて、このニトレン生成基に対して共有的に結合する官能化作用を有する基を備えている。この官能化作用を有する基は、ニトレン中間体と架橋反応をせず、さもなくば基質の表面への官能化剤のニトレン付加反応を顕著に妨害しないような、実質的にあらゆる所望の化学基であってよい。例えば、この官能化基は、放射線活性標識、蛍光標識、酵素、薬理学的活性基、診断上の活性基、抗体、核酸、表面活性剤、およびあらゆる種々の広範な他の基から選択することができるが、しかしこれらに限定する必要はない。複数工程反応において基質を官能化するのに適した官能化剤は、幾つかの方法で配列することができる。１つの方法に従うと、第一の官能化剤を基質と反応させることによって、第一の官能化剤の分子の基質表面への共有的付加を達成し；この後に、第二の官能化剤を加えることによって、付加された第一の官能化剤の分子と反応させ、従って共有的に結合させる。こうした方法においては、この第一の官能化剤は、それぞれが前記のニトレン生成基に加えて第一の官能化基を有している分子からなり、第一の官能化基は、第一の官能化剤が基質の表面へとニトレンの付加によって共有結合した後に、下流の化学反応に参加するのに適合している。例えば、第一の官能化基は、第二の官能化剤の分子上の−ＮＨ基、−ＯＨ基、または他の求核性基と反応性である活性エステルであってよい。次いで、この第二の官能化剤は、酵素、抗体、診断薬または治療薬のような、基質の表面に対して付加することが最終的に望まれる第二の官能化基をもたらすことができる。他の複数工程の方法は、最初に第二の官能化剤（第二の、または最終的には所望の官能化基を有している）を第一の官能化剤（ニトレン生成基を有している）と反応させ；次いで、第二の反応において、第一の反応の生成物を、反応エネルギー源の存在下に基質と反応させることによって、第一の反応の生成物を基質の表面へとニトレンの付加によって共有的に付加させることを含む。本発明に従う、一工程または複数工程の方法用に好適な官能化剤の分類は、Ｎ −ヒドロキシスクシンイミド活性エステル−官能化されたペルフルオロフェニルアジド（ＮＨＳ−PFPAs）からなる。このＮＨＳ活性エステル基は、官能化剤分子のPFPAs部分に由来する高度に反応性のニトレン中間体の反応の間の生成によって、基質の表面へと共有的に結合しはじめる。（この中間体の反応性のニトレン部分は、好ましくは、このニトレン部分がＮＨＳ活性のエステル部分と分子内で反応できないように、構造的に拘束されている。）従って、この基質の表面は、「修飾」（例えば、官能化）され始める。この後に、この活性のエステルは、それぞれアミドまたはエステル生成によって、（生体分子のような）１級アミンまたはヒドロキシル基を含有する種々の試薬との反応に更に参加することができる。本発明の他の態様に従って、ニトレンを生成する官能化剤を、膜の形態のようにして、基質の表面へと塗布することができる。次いで、この被覆された基質を反応エネルギー源（フォトン、または電位ビームのような粒子ビーム）に空間的に選択的な方法で暴露させて、表面の特定領域を官能化させて他の領域は官能化せず、これによってこの表面上に官能化されたパターンを生成させる。こうしたパターンは、この被覆された表面を反応エネルギー源へと暴露しうる高い解像度の方法によって、マイクロメーター単位で測定される寸法およびそれ以下の寸法を有することができる。従って、本発明は、マイクロエレクトロニクスにおいて、および新規なミクロンスケールのバイオセンサーの構成において、広範な応用を有している。図面の簡単な説明図１は、蛍光顕微鏡の下に観察されたミクロンサイズのパターンの写真であり（４５０−４９０ｎｍの励起波長、５１０ｎｍよりも大きい放出）、例４に記載したポリスチレンフィルムの表面の修飾を示している。図２Ａは、例５に記載したようにして、予め形成されたポリスチレンパターンをＰＦＰＡ化合物（スキームＩの化合物１ａ）によって処理し、続いて光分解し、次いでＮ−（５−アミノペンチル）ビオチンアミドによって処理し、続いてフルオレセインアビジンによって処理することによって生成した、蛍光たんぱく質の顕微鏡写真である。図２Ｂは、実験的な対照例の顕微鏡写真であり、ここで例５に記載したようにして、ポリスチレンパターンがフルオレセインアビジンのみによって処理されている。図３Ａは、例６に記載されているように、最初にＮＨＳ−ＰＦＰＡによって、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼによって官能化された、新しく開裂したグラファイト表面の、原子力顕微鏡によって得られた像である。図３Ｂは、実験対照例の原子力顕微鏡による像であり、ここで例６に記載されているように、新しく開裂したグラファイト表面が、西洋ワサビペルオキシダーゼによって処理されており、ＮＨＳ−ＰＦＰＡによって処理されていない。図４Ａは、例１０に記載したようにして、反応エネルギー源として電子ビームを使用してＮＨＳ−ＰＦＰＡによって官能化したポリスチレン表面の、蛍光顕微鏡を使用して得られた顕微鏡写真（４５０−４９０ｎｍの励起波長、５１０ｎｍよりも大きい放出波長）である。図４Ｂは、ビームの用法と線幅とを示す、図４Ａについての凡例である。詳細な説明次の用語を明細書中で使用する。「基質」は、本発明に従って官能化できるような表面を与える非流体材料である。基質は、分子（例えば、熱可塑性重合体分子）、熱硬化性分子網目構造（例えば、架橋重合体分子）、または特定のガラスおよび結晶において見いだされるような、他の原子または分子会合体からなっていてよい。「表面分子」は、基質の分子であって、少なくとも基質の表面上に存在する部分を有している分子である。「重合体基質」は、重合体分子または重合体分子の網目構造を備えている基質である。「重合体分子」は、「モノマー」と呼ばれる小分子を互いに共有的に結合することによって生成した大分子である。重合体分子中に存在するこれらのモノマーは、同じであってよく、異なっていてよい。重合体分子は、セルロース、デンプン、たんぱく質、および核酸のような（ただし、これらに限定されない）天然のものであってよく；またはナイロンおよびポリエチレンのような（ただし、これらに限定されない）合成のものであってよい。基質においては、重合体分子は、非共有的（熱可塑性のような）または共有的架橋結合網目構造（熱硬化性のような）を含む、幾つかの方法のいずれによって会合していてもよい。「官能化された基質」は、この基質に対して１種または２種以上の官能基が本発明に従って共有的に結合されている基質である。「官能基」は、有機化学的な方法で１種以上の原子が互いに結合されることによって、所望の化学的特性を有する基である。本発明に従って、官能化剤の官能基は、本発明に従って基質の表面へと共有的に結合されたときには、類似の官能基または異なる種類の官能基のいずれかと、１種以上の更なる結合反応に加わることができる。こうした結合反応は、（ａ）これらの官能基の、種々の付加的な官能基のいずれかへの付加：または（ｂ）官能化された基質分子の相互結合（架橋）をもたらしうる。用語「官能化された重合体」は、官能化された重合体基質、または官能化された重合体分子のいずれかを示しうる。本発明による「官能化剤」は、本発明に従って基質を官能化するのに適合した試薬である。官能化剤の分子は、第二の官能基に結合された少なくとも一種のニトレン生成基を（第一の官能基として）有しており、ここでこのニトレン生成基は、好ましくは、官能化剤の分子構造によってこのニトレン生成基と官能基との間で拘束されている。このニトレン生成基は、反応条件下で基質の表面を官能化する能力を有する。官能化剤上の「ニトレン生成基」は、反応エネルギー源に対して暴露したときにニトレン基となる化学的部分である。「ニトレン基」（一般的には、「ニトレン（Nitrene）」または「ニトレン中習熟した者によって、カルベンの窒素相同体であるとみなされている。カルベンのように、ニトレンは一般的には中間体であるとみなされている。ニトレンは高度に反応性であり、一般的には通常の条件下では単離することはできない。しかし、本発明による反応のような、特定の化学的反応は、ニトレンの存在を仮定することなしでは、既知の反応機構によっては、説明することはできない。重要なニ１レン反応は、次式によって要約することができる。（ａ）アリールニトレンを含むニトレンは、−ＣＨ部位で、および−ＮＨ部位で付加反応を受けうる：例えば、（ｂ）またニトレンは、−Ｃ−Ｃ−および−Ｃ＝Ｃ−結合で付加を受けうる。例えば、ここで使用したように、用語「付加反応」は、官能化剤のニトレン基の表面分子との反応という文脈で使用したときには、本発明に従って基質表面上の分子との間でニトレンが受けうる、種々の付加および挿入反応のいずれをも一般的に示している。本発明に従って、ニトレン生成基を有する官能化剤を反応エネルギー源に対して暴露したときに、官能化反応が生じ、これがニトレン生成基をニトレン中間体へと変換させる。この官能化反応は、基質の表面とニトレン中間体との反応によって進行する。「反応エネルギー源」は、特に官能化剤の分子上のニトレン生成基をニトレンへと変換させることによって、本発明による官能化反応を駆動するエネルギー源であり、ニトレンが基質の表面と反応する。好適な反応エネルギー源には、（紫外（ＵＶ）光、深ＵＶ光、レーザー光、Ｘ線、および赤外線放射または導電性加熱の形態の熱のような）フォトン、（電子ビームのような）エネルギー化された電子、および（イオンビームのような）エネルギー化されたイオンが含まれる（しかし限定はされない）。これらの反応エネルギー源は、通常は、リソグラフィー、走査型顕微鏡、および、ＵＶおよび可視光のフォトンの場合には、光化学的反応を実施するためおよび蛍光分子を励起するためといったような用途に使用されている。「官能化反応」は、基質の表面を本発明によって官能化する反応である。官能化反応は、一工程以上から構成することができる。少なくとも一つの工程に、反応エネルギー源の存在下での、基質の表面と、ニトレン生成基を有する官能化剤の分子との反応が含まれている。本発明に従って、基質の表面を、化学品によって官能化し、これによって官能化剤の分子上の官能基が、この表面へと共有結合しはじめる。こうした共有結合を達成するには、反応エネルギー源へと官能化剤の分子を暴露することによって、官能化剤の分子（この官能化剤の分子も、それぞれ下記のような所望の官能基を備えている）上のニトレン生成基を、基質の表面に対して高度に反応性であるニトレン中間体へと変換する。この官能化剤は、好ましくは、一般的にアリールアジド、アルキルアジド、アルケニルアジド、アルキニルアジド、アシルアジド、およびアジドアセチル誘導体からなる群より選択され、すべてが種々の置換基を有することができる。最も好ましくは、フッ素（および／または塩素）原子が、可能な最大の広さでは、このアジド基に隣接する官能化剤分子上の位置に存在している。また、上記のアジドの各々は、同じ分子中に、ニトレン部分が発生した後にこのニトレン部分との反応から構造的に抑制されている、次の官能基のいずれかを有している。（ａ）カルボキシル基、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；Ｎ −ヒドロキシベンズトリアゾールエステル；このカルボキシル基に対応する酸ハライド；アシルイミダゾール；チオエステル；ｐ−ニトロフェニルエステル；コレステロールおよびグルコースのような、生物学的に活性の（および光学的に活性の）アルコールのエステルを含む、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステル；アンモニア、一級、および二級アミン、およびエピネフリン、ドーパ、酵素、抗体、および蛍光分子のような生物学的に活性の（および光学的に活性の）アミンを含むアミンに由来するアミドのような種々のアミド誘導体；のような（しかし、これらには限定されない）カルボキシル基の種々の誘導体。（ｂ）遊離のアルコール基、または例えば、脂肪酸、ステロイド酸、またはナプロシンまたはアスピリンのような薬剤を含む、適当なカルボン酸に対してエステル化されたアルコール基；（ｃ）ハロアルキル基であって、このハライドが、カルボキシレート陰イオン、チオール陰イオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンのような求核性基によって後に置換することができ、これによってこのハロゲン原子の部位で新しい基の共有的付加をもたしらうる。（ｄ）マレイミド基または他のジエノフィル基であって、この基が、例えばエルゴステロールのような１、３−ジエン含有分子とのディールスアルドール環化付加反応においてジエノフィルとして作用しうる。（ｅ）アルデヒドまたはケトン基であって、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシムのような周知のカルボニル誘導体の生成によって、またはグリニア付加やアルキルリチウムの付加のような機構によって、引き続いて誘導体化が可能であるアルデヒドまたはケトン基；および（ｆ）引き続いてアミンと反応することで、例えばスルホンアミドを生成するようなスルホニルハライド。官能化剤がニトレン中間体へと変換される一般的な反応は：ここでＸは官能基であり、Ｒは芳香族環、ヘテロ芳香環、または他の炭素含有フラグメントである。ＵＶ光からなる反応エネルギー源は、例えば、次の代表的方法の１つによって前記反応へと与えることができる：（ａ）試料を、３５０ｎｍ、３００ｎｍ、または２５４ｎｍのランプのうちいずれかを備えたライオネット光化学反応装置（ Rayonet Photochemical Reactor）のウエル内に配置し、常温で数分間大気下で照射する。この照射時間を調整することによって、露光線量を変更することができる。（ｂ）試料に対して、例えば投射ＵＶリソグラフィーによって（これには限定されない）高解像度フォトマスクを使用して照射する。（ｃ）ＫＳＭカールサス深ＵＶ接触配列装置（Karl Suss deep-UV contact alighner）中で接触高解像度フォトマスクを使用して、光分解を実施する。本分野に習熟した者には容易に理解できることであるが、これらの方法も、ＵＶ以外の波長のフォトンによる官能化反応をもたらすために、一般的に使用することができる。電子からなる反応エネルギー源は、次の代表的方法によって本反応へと与えることができる：本試料に対して真空下で電子または粒子ビームを、１〜４０ｋＶの範囲内から選択されたエネルギーで照射する。（代表的な電子ビーム源は、電子ビームリソグラフィーのために改善された「ＪＥＯＬ８４０Ａ」電子顕微鏡である。）このビームを、処理された基質の表面を横切るようにステップさせて、特定領域を露光し、他の領域は露光しない。各ステップにおける停止時間を調整することによって、露光線量を変更することができる。特に有用な官能化剤は、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸であって、このカルボニル基が反応性エステル、アミド、酸ハライド、または混合された無水物の組成物によって更に活性化されたものに由来ずるペルフルオロフェニルアジド（ＰＦＰＡｓ）からなる群より選択される。例えば、限定を意図したものではないが、代表的な官能化ペルフルオロフェニルアジドは、一般式：を有しており、ここで、Ｘは次のいずれであってもよい：ＣＮ、ＣＯＮＨ₂、ＣＨＯ、ＣＯ₂Ｍｅ、ＣＯＭｅ、ＮＯ₂、ＣＯ₂Ｈ、ＣＯＣｌ、ＣＯ−イミダゾール、ＣＯＮＨＳ、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＨ₂ＮＨ₂、ＣＯＣＨ₂Ｂｒ、Ｎ−マレイミド、ＮＨ −ビオチニル、ＣＯＮＨ−Ｒ（ここでＲはポリペプチド部分である）、ＣＯＮＨ −Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−ＮＨ−ビオチニル（ここでＸおよびＹはスペーサー原子であり、Ｓ−Ｓ結合は後の工程で還元的に開裂可能である）、およびＣＯＮＨＳ−ＳＯ₃Ｎａ。代表的な活性化されたＰＦＰＡｓには、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルＡ（「ＮＨＳ−ＰＦＰＡ」とも記載する）、ｐ−ニトロフェニルエステルＢ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルＣ、アシルイミダゾールＤ、酸塩化物Ｅ、混合された無水物Ｆおよび２，２，２−トリクロロエチルエステルＧが含まれる（しかし、これらに限定はされない）。前述の官能化剤の候補に加えて、のような、反応性の官能基とＰＦＰＡ部分との間に配置された「スペーサー」を有する他のＰＦＰＡｓを使用することができる。官能化剤として有用な他のアリールアジドの候補は、のように、上記した例に類似しているが、ただし他のアリール部分によってＰＦＰＡが置換されている。本発明に従って官能化することができる基質の候補には、重合体基質、グラファイト、金属、および珪質材料だけでなく、シリコン、ガリウム砒素、および他の半導体材料が含まれるが、これらに限定はされない。珪質の基質（例えば、ガラス、シリカ、マイカ、石英）の場合には、官能化剤は、対応するニトレンに変換されたときには、基質の表面上にあるＳｉＯ−Ｈ基、Ｓｉ−ＯＨ基、またはＳｉ−ＯＳｉ基と反応するものと考えられる。グラファイトおよび炭素原子の他の同素体の形態の場合には、官能化剤が、対応するニトレンに変換されたときに、基質の表面上にある炭素環と反応するものと考えられる。本発明に従って官能化することができる重合体基質には、−ＣＨ基、および／または−ＮＨ基、および／または−ＯＨ基および／または−Ｃ＝Ｃ−部位を有する重合体分子を有する、実質的にあらゆる重合体材料が含まれる。これらの重合体基質には、（ａ）ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリブテン、およびこれらの共重合体で例示されるような飽和ポリオレフィン；（ｂ）アクリル酸、メタクリル酸、〔ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）〕、およびアクリロニトリルの重合体および共重合体のようなアクリル樹脂；（ｃ）ポリスチレン、およびポリ（ｐ−クロロスチレン）およびポリ（ｐ−ヒドロキシスチレン）のようなポリスチレンの相同体；（ｄ）ポリ（イソプレン）およびポリ（ブタジエン）のような不飽和ポリオレフィン；（ｅ）ポリイミド（ベンゾフェノンテトラカルボキシリックジアンハイドライド／テトラエチルメチレンジアニリン）のようなポリイミド；（ｆ）ポリ（トリメチレンアジペート）およびポリ（ヘキシメチレンセバケート）のようなポリエステル；（ｇ）ポリ（３−アルキルチオフェン）、ポリ（３−アルキルピロール）、およびポリアニリンのような共役および導電性重合体；（ｈ）ポリ（アリロキシホスファゼン）、ポリ〔ビス（トリフルオロエトキシ）ホスファゼン〕、ポリシラン、およびポリカルボシラン、シロキサン重合体、および他のシリコン含有重合体のような無機重合体；（ｉ）「ケミカルアンドエンジニアリングニュース（Chemical and Eng ineering News）」１９９２年８月３１日、第８頁に記載されているような、ポリクロコナイン（polycroconaine）およびポリスクアレイン（polysquaraine）のような有機金属（例えば金属の性質を有する有機重合体）；（ｊ）パラジウムポリ−インおよびフェロセン含有ポリアミドのような有機金属重合体；および（ｋ）セルロース繊維、キチンおよびデンプンのような多糖類が含まれるが、これらに限定はされない。基質の表面の官能化は、この表面に付加されるべき官能基；この表面への付加の間に不所望の反応からこの官能基を保護することが必要であるかどうか；および便宜上の事項に応じて、１つまたはそれ以上の工程で生じさせることができる。例えば、２段階官能化プロトコルにおいて、各段階には異なる官能化剤が関連する。第１段階には、第１官能化剤、例えばＮＨＳ−ＰＦＰＡが関連し、これは第１段階の過程の間にニトレン中間体に転化される。例えばポリマー基質を用いる第１段階の間、ＮＨＳ−ＰＦＰＡ分子上のＮＨＳ活性エステル基は、以下の反応式１に一般的に示される反応により表面ポリマー分子に共有結合する：従って、この第１段階反応は、ＮＨＳ−ＰＦＰＡを反応エネルギー源に暴露することによりＮＨＳ−ＰＦＰＡ１から誘導される高度な反応性を有するニトレン中間体の発生を必要とする。明らかなように、ＰＦＰＡのＮＨＳ−エステル部分はこの第１段階の化学反応には関係しない。むしろ、ＮＨＳ−エステルが、表面分子に移動した後に、以下に記載する第２段階の化学反応に用いられる。第２段階において、ＮＨＳエステルは第２官能化剤の分子と容易に反応する。第２官能化剤は、第１または第２アミンおよび／またはヒドロキシルを有する分子から選択する。ＮＨＳ−エステルと第１アミンとの反応は、反応式２に示すようにアミド形成により進行する：（式中の化合物２ａおよび２ｂは反応式１に示したものである。）ＮＨＳ−エステルとヒドロキシルとの反応は、反応式３に示すようにエステル形成により進行する：（式中の化合物２ａおよび２ｂは反応式１に示したものである。）多くのタイプの生体分子がアミンおよび／またはヒドロキシル基を有するため、これらの分子は、第１段階官能化反応で表面分子に共有結合したＮＨＳ−エステルとの第２段階官能化反応における反応に適合する官能化剤として作用することができる。従って、巨大分子、例えばタンパク質、核酸、炭水化物および他の種々の分子を含む広範囲にわたる任意の分子を、本発明の方法を用いて基質に結合させることができる。また、本発明において、第１に、基質に結合する分子のニトレン生成誘導体（例えば生体分子、薬物、検体、触媒［遷移金属を含む］および診断用の薬剤）を調製し、この誘導体を基質の表面に塗布し、次に処理した表面を反応エネルギー源に暴露してニトレン生成誘導体を表面分子にニトレン中間体を介して共有結合させることができる。ニトレン生成部分が、ニトレンが同一分子の他の部分と容易に反応することができないように構造的に束縛されていることが必要である。従って、フェニル環の４位がアジド基に好ましい位置である。いかなる方法においても限定することを意図せずに本発明の範囲を明示するために、以下に本発明の代表的な官能化を記載する：（a）発癌性または突然変異誘発性多環式芳香族炭化水素を基質に結合させて「発癌性」表面を形成することができる。例示的な多環式炭化水素にはエチジウム化合物および種々のピレン化合物（例えば１−ピレンメチルアミンおよび６− アミノクリセン）が含まれる。また、このような化合物を基質に結合させる際には、炭化水素を基質表面から「持ち上げる」作用を有する「スペーサー基」を用いることができる。代表的なスペーサー含有炭化水素は、１−ピレンブチル酸から誘導された第１アミンである。このような反応は、一般的に反応式４で示される：（式中の２ａおよび２ｂは反応式１に示したものであり、Ｚはスペーサー基を示す。）（b）基質表面の疎水性は、ＮＨＳ−エステル基が基質表面に第１段階反応で（ニトレン中間体を介して）結合した後に、ＮＨＳ−エステル基と長鎖脂肪族アミン、例えば１−アミノヘキサデカンとが第２段階反応で反応することにより変化させることができる。このような反応を一般的に反応式５に示す：（式中のＲは疎水性原子の鎖、例えばＣ₁₂Ｈ₂₅−、オレイル、オクタデシル，３ −β−アミノコレスタン（aminocholestane）またはヘキシルメチルシリルであり；２ａおよび２ｂは反応式１に示したものである。）（c）基質表面の親水性は、ＮＨＳ−エステル基が基質表面に第１段階反応で（ニトレン中間体を介して）結合した後に、ＮＨＳ−エステル基とアミンを含む高度な極性を有する分子とが第２段階反応で反応することにより変化させることができる。このようなアミン含有極性分子には：グルコザミン、エタノールアミン、ポリエチレンイミン（ｐＨ７においてプロトン付加した）、ポリリシン（ｐＨ７においてプロトン付加した）、グリセロールおよび他のポリヒドロキシ化合物が含まれる（しかし必ずしもこれらには限定されない）。このような反応は一般的には反応式５で示されるが、ここではＲはＨＯＣＨ₂ＣＨ₂−またはＮＨ₂（ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ−）_n−ＣＨ₂ＣＨ₂−であり；２ａおよび２ｂは反応式１に示したものである。ポリアルコールに関しては、このような反応は反応式６で一般的に示される：（式中のＲは例えばＣＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨ₂ＯＨであり；２ａおよび２ｂは反応式１に示したものである。）（d）基質表面は、ＮＨＳ−エステル基が基質表面に第１段階反応ですでに結合している領域で界面活性とすることができる。界面活性とする反応は、任意のアミノ化またはヒドロキシル化「界面活性剤」分子、例えば１−アミノドデカン酸を用いる２段階反応により進行する。ｐＨ７において、この化合物が基質に結合した後、カルボキシル基はイオン化され、化合物は、極性カルボン酸アニオンで終了する長い疎水性尾部として基質表面から離れるように延びる。このような反応は反応式７で一般的に示される：（式中のＲは−（ＣＨ₂）_n−ＣＯ₂Ｈであり；２ａおよび２ｂは反応式１に示したものである。）（e）酵素を、第１段階反応で官能化された基質表面に、例えばＮＨＳ活性エステルを用いて、例えば、酵素分子上に存在するリシンアミノ基とＮＨＳ活性エステルとの第２段階反応により結合させることができる。代表的な反応を反応式８に示す：（式中のＲ−ＮＨ₂はポリペプチド、例えば酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ）、レクチンまたは抗体上のリシン残基を示し；２ａおよび２ｂは反応式１に示したものである。）（f）また、抗体、レクチンおよび他のタンパク質を、酵素を結合させる反応と同様の官能化反応により基質に結合させることができる。次に、このような結合分子を、例えば、バイオセンサーにおいて高選択性感知剤として用いることができる。（g）特定の分子を基質表面に結合させて、基質表面の湿潤性を制御するかまたは生存細胞が基質表面に付着する能力を変化させることができる。（h）基質表面を１または２段階反応でビオチニル化し、次にビオチニル化した表面を、例えばアビジンまたはストレプタビジンの誘導体で処理することができる。アビジンまたはストレプタビジンは、このように他の生体分子をその後表面に結合させる架橋単位として用いられる。代表的な反応は以下の通りである：２段階反応（反応式９）（式中の２ａおよび２ｂは反応式１に示したものであり、ＲＮＨ₂はＮ−ビオチニルヘキシレンジアミン：のアミノ基を示す。）１段階反応は、基質をビオチン（反応式１２、化合物５参照）のＰＦＰＡ誘導体で被覆し、次に光分解するかまたは電子線を照射することにより実施される。本発明をさらに例示および記載するために、以下に実施例を記載する：実施例１この実施例では、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−機能化（NHS-機能化）ペルフルオロフェニルアジド（PFPA）１ａおよび１ｂを用いて、典型的な重合体（ポリスチレン）の表面を変化させた（反応式10）。 PFPA１ａはKeana et al.の、「J．Org．Chem．」55：3640〜3647（1990）に記載されている。 PFPA１ｂは４−アジド−２、３、５、６−テトラフルオロベンズアミドペンタン酸〔融点（mp）：160〜161℃；高分解能マススペクトル（HRMS）C₁₂H₁₀F₄N₄O₃ についての計算値：334.0687；実測値m/z：334.0710〕で５−アミノペンタン酸をＮ−アシル化し、次いでジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下にNHSと結合し、Ｎ−スクシンイミジル−５−（４−アジド−２、３、５、６−テトラフルオロベンズアミド）ペンタノエート１ｂ〔mp：93〜95℃；HRMSのC₁₆H₁₃F₄N₅O₅についての計算値：431.0850；実測値m/z：431.0866〕を生成することにより調製した。 Cai et al.の、「Chem．Mater.」４：879〜884（1992）に記載されているように、５重量％ポリスチレン（PS）のキシレン溶液をガラスディスクにスピンコーティングし、ディスク上に約0.5μmの厚さのフィルムを形成した。次いで0.5重量％の１ａまたは１ｂのニトロメタン溶液を用いて、PSフィルムをスピンコーティングし、60℃で20分間ベーキングした。ベーキング工程は残留溶媒を除去し、表面に堆積したPFPAがPSフィルムに拡散するのを促進すると考えられた。その後フィルムの光分解はFTIR（フーリエ変換赤外線）分光法により示されるアジド基の完全な分解を起こした。空気中、環境温度で５分間、254nmのランプを用いてRayonet光化学反応器で光分解を行った。支持体としてNaClディスクを用い、FTIRを対照試料について行った。PS表面へのNHS PFPAエステルの共有結合性接着は、それぞれ２ａおよび２ｂを生じた（反応式10）。反応は１ａまたは１ｂから誘導した高い反応性のニトレン中間体のＣ−Ｈ結合の挿入により起こると考えられる。Keana et al.の、「J．Org．Chem.」55：3640〜3647（1990）；Ley va et al.の、「J．Org．Chem.」54：5938〜5945（1989）；およびPoe et al.の、「J．Am．Chem．Soc.」114：5054〜5067（1992）を参照。 NHS活性エステルが一級アミンおよび二級アミンと容易に反応し、アミドを形成するため、Anderson et al．の、「J．Am．Chem．Soc.」86：1839〜1842（196 4）、生体分子を含む種々の一級アミンおよび二級アミン含有反応物を原則としてこの方法により重合体表面に接着することができる。実施例２この例では、実施例１に記載したようにPFPA-NHSにより変化させたPSフィルム上にセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP,シグマ社）を固定した。化合物を反応式10に示す。フィルム2aおよび2bを50μM HRPのNaHCO₃緩衝液（pH 8.2）中で25℃３時間インキュベーションした、Brinkley，「Bioconjugate Chem.」３：２〜13（1992）、次いでリン酸緩衝液（pH 7.0）で完全に洗浄した。得られた固定HRPフィルム3 aおよび3bの酵素活性を、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ABTS）および過酸化水素（1.8mM ABTS /0.8mM H₂O₂）を用い、25℃のリン酸緩衝液中で420nmの分光測光法により測定した。Groome，「J．Clin．Chem．Clin．Biochem.」18：345〜349（1980）を参照。固定HRPが天然HRPと同一の活性を有するとの適切な仮定を行い、Nakane et al ．「J．Histochem．Cytochem.」22：1084〜1091（1974）、適切な固定効率を示すように、固定HRPの程度を3aについては0.5±0.1ng/mm²、スペーサを含む類似の3b については1.0±0.2ng/mm²と計算した。 HRP分子は約40,000ダルトンの分子量および水和状態で2.67nmの半径を有する。Steiner et al.の、「Eur．J．Biochem.」82：543〜549（1978）を参照。平坦な重合体表面を得るための、HRPの単層の表面付着量はmm²当たり2.7ng HRPである。対照実験では、PFPAでスピンコーティングしてない重合体フィルムを同様にベーキングし、光照射して、さらにHRP溶液とインキュベーションした。得られたフィルムはHRP活性を示さなかった。実施例３この実施例では、導電重合体、ポリ（３−オクチルチオフェン）（P30T）の表面変更、Cai et al.の、「J．Mol．Electron.」７：63〜68（1991）参照を、実施例１および２に記載した方法と同様の方法で行った。PFPA-NHS変更P30Tフィルム上に固定するHRPの量はフィルム3aでは0.2±0.1ng/mm²（反応式10）、フィルム3bでは0.3±0.1ng/mm²であった。実施例４この実施例では、PFPAをフォトリソグラフィと組み合わせて用いて、PS表面を変化させ、重合体の表面にミクロン寸法のパターンを形成した。化合物は反応式 10に示す。 PSフィルムを物質1aのニトロメタン溶液でスピンコーティングし、上述のようにベーキングし、さらに0.5μmの最小特徴寸法を有する高分解能フォトマスクを介して光照射した。光分解はKSM Karl Suss遠紫外線接触アライナで実施した。次いでフィルムを20秒間ニトロメタン中に浸し、空気で乾燥して、５−（アミノアセトアミド）フルオレセイン（Molecular Probes社、米国オレゴン州ウジェーヌ）の25℃エタノール溶液（4mg/mL）で１時間反応させ、次いでエタノールで完全に洗浄した。図１は蛍光顕微鏡下に観察された、得られたミクロン寸法のパターンを示し、さらに、この新規表面変更戦略を例示する。最も小さい特徴（0.5μm）が解像されるが、わずかに広がっており、おそらくこれは回折作用によると考えられる。対照として、スピンコーティングNHS活性エステル1aを有しないPSフィルムを光分解し、現像して５−（アミノアセトアミド）フルオレセインで処理した。蛍光顕微鏡下では、蛍光パターンは観察されなかった（データは示していない）。実施例５この実施例では、予め形成した重合体微細構造の表面を変化させた。化合物を反応式10に示す。予め遠紫外線リソグラフィを用いてシリコンウェハ上に製造した、PSのミクロン寸法のパターンを物質1aのニトロメタン溶液に10秒間浸し、ベーキングし、さらに上述のように光分解した。次いで試料をＮ−（５−アミノペンチル）ビオチンアミド（Molecular Probes社、米国オレゴン州ウジェーヌ）のDMF溶液（１mg/ 0.2mL）中に４時間浸漬し、さらにDMFで洗浄しその後エタノールで洗浄した。アビジンのビオチンに対する強力なアフィニティを利用するために〔Green、「Adv ．Protein Chem.」29：85〜133（1975）；Heitzmann et al.の、「Proc．Nat．A cad．Sci．USA」71：3537〜3541（1974）参照〕、ウェハを蛍光タンパク質のpH 8.2の緩衝液（3.2mg/0.5mL）中で４時間インキュベーションすることにより、フルオレセインアビジン（Molecular Probes社、米国オレゴン州ウジェーヌ）を表面に接着させた。得られたミクロン寸法のパターンを図2Aに示し、さらに実験対照を図2Bに示す。これらの結果はビオチン−アビジン−フルオレセインアセンブリが予備成形したPS微細構造に共有結合で接着することを示す。実施例６この実施例では、グラファイトの表面を機能化した。一片の熱分解グラファイトを、透明接着テープを用いて新しく裂き、0.5％W/WのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドテトラフルオロベンゾエート（NHS-PFPA）の脱水ニトロメタン溶液を用いて1,000rpmの速度のスピニングによりコーティングした。コーティングしたグラファイトを60℃で20分間ベーキングし、空気の下で環境温度にて 254nmのランプを用いて５分間光照射した。次いでグラファイトを25℃で、50μM のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）のNaHCO₃緩衝液（pH 8.2）中で３時間インキュベーションし、リン酸緩衝液（pH 7.0）で完全に洗浄した。機能化グラファイトの酵素活性を、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ABTS）および過酸化水素（ 1.8mM ABTS/0.8mM H₂O₂）を用いる25℃のリン酸緩衝液中で420nmの分光測光法により決定した。固定HRPが天然HRPと同一の活性を有するとの適切な仮定による、固定HRPの程度は2.1ng/nm²であった。対照実験は、次のように行った：一片の新たに裂いたグラファイトを同様にベーキングし、光照射してHRP溶液とインキュベーションした。対照の酵素活性は0.4ng HRP/mm²であった。したがって、対照をNHS-PFPAで処理しなかった。試料および対照を原子力顕微鏡法（AFM）を用いて試験した。原子力顕微鏡は環境温度の空気中で操作した。試料の典型的AFM像を図3Aに、対照の像を図3Bに示す。図3Aでは、明瞭なスフィアが固定HRP分子に対応する。図3Bでは、不明瞭なスフィアが見出されたにすぎず、対照面ではHRP分子の固定化が著しく少ないことを示している。したがって、NHS-PFPAは、HRPのグラファイト表面への実質的共有結合性接着を達成するのに必要である。実施例７この実施例の化学現象を反応式11に示す。この実施例では２種の光活性ビオチン、PFPA−ビオチン３および５を調製した。これらの光活性ビオチンを、ビオチン基を有する重合体表面の機能化に用いることができた。かかるビオチン基化表面をさらに反応させて、アビジンのようなビオチン結合タンパク質により生体分子を基板に接着させることができる。Ｎ−４−アジド−２、３、５、６−テトラフルオロベンジルビオチンアミドの合成（3）を次のように行った：33mgのＮ−スクシンイミジル−Ｄ−ビオチン（0.097ミリモル）を0.5mL DMSO-d₆に溶かした溶液に27mgの４−アジド−２、３、５、６−テトラフルオロベンジルアミン（0.12ミリモル）を添加した。得られた溶液を室温に0.5時間維持し、その後NMRで反応の終了を確認した。この溶液を 10mLの水に滴下して加え沈殿を生成させた。沈殿を濾過し、水で洗浄して、乾燥させ、ほとんど無色の、融点＝164〜165℃を有する固体として物質３の36.8mg（ 85％）を得た。¹H-NMR(CDCl₃＋DMSO-d₆)：1.157(q,2)、1.40(m,4)、1.95 0(t,2)、2.87(m,2)、4.01(m,1)、4.20(m,3)、5.41(m,2)、7.53(m,1)。IR(KBr)： 3454、3290、2931、2161、2125、1704、1654、1549、1493、1420、1239、1054cm^-1 。Ｎ−４−アジド−２、３、５、６−テトラフルオロベンジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサンアミドの合成（5）を次のように行った：49.2mgのＮ−スクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（0.108ミリモル）の0.6mL 脱水DMF溶液に32mg（0.14ミリモル）の４−アジド−２、３、５、６−テトラフルオロベンジルアミンを添加した。溶液を室温で１時間かき混ぜ、次いで、10mL の水に滴下した。得られた沈殿を濾過し、水で洗浄して、乾燥させ、無色の、融点＝160〜161℃を有する固体として物質５の60.1mg（99％）を得た。¹H-NMR(CDC l₃＋DMSO-d₆)：0.98(m,2)、1.14(m,4)、1.31(m,6)、1.85(m,4)、2.4〜2.5(m,2) 、2.8(m,3)、3.92(m,1)、4.10(m,3)、5.52(s,1)、5.56(s,1)、6.76(m,1)、7.56( m,1)。IR(KBr)：3438、3301、935、2162、2177、1700、1652、1547、1499、1416 、1239、1054cm^-1。実施例８この実施例は重合体を機能化することができる種々のPFPAを基とする架橋剤の合成に関係する。特に、NHSエステル基とPFPA基との間に異なる結合剤長さを有するNHSエステル機能化PFPAの基を合成した。特に、これらの機能化PFPAを、生体高分子中のアミノ基を、隣接する化学基に光架橋するため、および一般的な重合体に機能化するために適用した。全体の化学現象を反応式12に示す。化学現象は、変異によりATPaseに導入されたシステイン基をマッピングするために予め用いたマレイミド含有PFPA１および２を利用し、50％ほどの高い光架橋収量を得られる。Aggeler et al.、「Biochemistry」31：2956〜2961（1992）参照。特に、NHS含有PFPA４および５は、光化学的な−CHまたは−NH挿入反応により、ポリペプチド鎖のアミノ基を隣接する化学基に架橋するのに適用する。また、これらのPFPAはNHS基を有する重合体を変化させ、次いで重合体に他の官能基を導入するためのアミノ含有反応物と反応させるのに用いることができる。反応式12において、酸６およびグリシンエチルエステル７と、カップリング試薬としてのジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）とを反応させることにより、次のようにアミド８を生じた：217mg（1.55ミリモル）のグリシンエチルエステルヒドロクロリドと158mg（1.56ミリモル）のトリエチルアミンとの混合物をテトラヒドロフラン（７mL）中で20分間かき混ぜた。その後、369mg（1.57ミリモル）の４−アジド−２、３、５、６−テトラフルオロベンゾイル酸６と324mg のDCCを添加した。この混合物を一昼夜かき混ぜて濾過した。濾液を蒸発させ、残留物を20mLの酢酸エチルに溶解した。次にこの溶液を脱水し、濾過した。濾液を0.1 N HCl（２×10mL）、５％NaHCO₃（２×10mL）、および水（２×10mL）で洗浄した。この溶液を脱水して蒸発させて固体を得た。この固体を調製用TLCにより精製して融点＝85〜86℃を有する無色の固体として160mg（32％収率）の物質８を得た。¹HNMR：1.321(t,3,J=7.13)、4.239(d,2,J=4.82)、4.273(q,2,J=7.1 3）、6.540(mb,1)。IR：2128、1744、1686、1649、1523、1488、1225、1001cm^-1 。C₁₁H₈F₄N₄O₃の分析計算値（anal.calcd）：Ｃ、41.26；Ｈ、2.52；Ｎ、17.50 。実測値：Ｃ、41.46；Ｈ、2.37；Ｎ、17.66。その後の加水分解により固体としての酸９を、次のように31％の総収率で作製した：60mgの物質８の0.5mLメタノール溶液に2.5％のNaOH水溶液0.4mLを添加した。得られた溶液を１時間かき混ぜた。次いで、2N HClを用いて、この溶液をpH １以下の酸性とした。沈殿を濾過し脱水して白色固体として23mgの物質９を得た。濾液をTHF/CHCl₃（１：１、３×３mL）により抽出し、さらに抽出液を脱水して蒸発させ、融点が147〜148℃の白色固体として、追加の量（32mg）の物質９を得た（合わせた収率55mg、99％）。¹H-NMR(CDCl₃+DMSO-d₆)：4.339(d,2,J=4.80 ）、6.527(m,1)。MS：292(2，M⁺)、264(20，M⁺-N₂)、190(20,NC₆F₄CO）、162(10 0、NC₆F₄)。塩化アシル10を５−アミノペンタン酸11と塩基性下に反応させ酸性化することにより、次のように酸12を作製した：238mg（2.03ミリモル）の５−アミノペンタン酸11の50％NaOH水溶液（0.4mL）と2.6mLの水の溶液に239mg（0.942ミリモル）の４−アジド−２、３、５、６−テトラフルオロベンゾイルクロリド10を添加した。沈殿が直ちに観察された。この混合物を５分間かき混ぜ３mLの水を加えた。次にこの混合物をさらに15分間かき混ぜ、2N HClを用いてpH１以下の酸性にした。この沈殿を濾過し、0.1N HCl（１mL）および水２mLで洗浄し、さらに乾燥して231mgの固体を得た。この固体を１mLのエーテルを用いて洗浄し、テトラヒドロフランとエーテルの混合物中で結晶化し、融点＝160〜161℃を有する無色固体として171mg（54％収率）の物質12を得た。¹H-NMR(CDCl₃+DMSO-d₆)：1.753(m,4) 、2.540(t,2,J=6.73)、3.504(q,2,J-5.90)、6.1(m,1)。MS：334(5，M⁺)、317(4 ，M⁺-OH)、306(40，M⁺-N₂)、190(15，NC₆F₄CO)、162(100,NC₆F₄)。C₁₂H₁₀F₄N₄O₃ についての高分解能MSの計算値：334.0687；実測値：334.0710。 NHS活性エステル４および５を、酸９および１２のそれぞれと、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとを、DCCの存在下に反応させることにより調製した。特に、物質４を調製するために、39.3mg（0.134ミリモル）の物質９、29.3mg（0.142ミリモル）のDCC、および16.6mgのNHSの0.5mL THF溶液を25℃一昼夜かき混ぜた。得られた混合物を濾過した。濾液を蒸発させ、１mLのCH₂Cl₂に再溶解した固体を得た。得られた混合物を濾過した。濾液を蒸発させ、無色の固体として42mg（80 ％収率）の物質４を得た。分析試料を、アセトン／ヘキサン中で再結晶化することにより、融点＝145〜146℃の無色固体として得た。¹H-NMR:2.883(S，4)4.637( d，2，J＝5.40)、6.548(mb，1)。IR:2129，1792，1748，1718，1699，1649，152 0，1489，1204cm^-1。MS:389(8，Ｍ⁺)、275(60，Ｍ⁺−NHS)、247(27，Ｍ⁺−NHS− Ｎ₂)、218(65，Ｍ⁺−CONHS−Ｎ₂−Ｈ)、190(45，NC₆F₄CO)、162(100，NC₆F₄)。C₁₃ H₇F₄N₅O₅についての高分解能MSの計算値:389.0382;実測値:389.0405。 NHSエステル５をエステル４と同様の方法で酸12から調製し、融点＝93〜95℃ の無色固体として91％の収率で単離した。¹H-NMR：1.77(m,2)、1.85(m,2)、2. 691(t,2,J=6.65)、2.841(s,4)、3.512(q,2,J=6.24)、6.22(m,1)。IR：2127、181 7、1786、1742、1681、1649、1602、1526、1487、1260、1209、1069cm^-1。MS：4 31(5，M⁺)、403(3，M⁺-N₂)、317(22，M⁺-NHS)、289(8，M⁺-NHS-N₂)、162(100，N C₆F₄)。C₁₆H₁₃F₄N₅O₅についての高分解能MSの計算値：431.0850；実測値：431.0 866。２種のNHS-活性エステル４および５は、NHS-活性エステル３と一緒に、PFPAと NHS基との間に異なる長さの結合剤を有するNHS含有PFPAの基を形成した。したがって、化合物３、４および５はポリペブチド鎖のような生体高分子中のアミノ基を、NHS基により機能化し、その後、光で発生したニトレン中間体により隣接する生体高分子に架橋するのに有用である。また、これらの化合物は、重合体基板を含む、基板を機能化するのに用いることができる。実施例９この実施例は、次の式によって一般に示される、２種の異種二官能価の、開裂し得るPFPAを基とする架橋剤を合成した以外、実施例８と同様である：例えば、次の化合物を合成した：一般に、分子のPFPA部分は基板を機能化するのに用いることができ、マレイミド部分を他の官能基に接着するのに用いることができる（ディールスアルダー型の反応でSH含有分子または１，３−ジエン含有分子との反応により）。次いで、後で、マレイミド側を温和な条件下に表面から開裂させることができる。他の開裂し得る基は過ヨウ素酸を用いて開裂する１，２−ジオール結合である。実施例10 この実施例はポリスチレンの機能化に関係する。１cm²片のシリコンウェハに、５％W/Wのポリスチレンの溶液を1,000rpmでスピニングすることによりコーティングした。次いでこのウェハに、1,000rpmの速度で、0.5％W/WのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジド−２、３、５、６ −テトラフルオロベンゾエートのニトロメタン溶液をスピンコーティングし、60 ℃で20分間ベーキングし、さらに電子線リソグラフィにかけた。コーティングしたウェハをニトロメタン中に20秒間浸し、未接着PFPAを除去し、空気で乾燥して、さらに2mg/mLの５−（アミノアセトアミド）フルオレセインのエタノール溶液と25℃で１時間反応させた。次いでウェハを一昼夜エタノール中に浸漬して、非共有結合で接着したフルオレセイン残留物を除去した。得られた結果を図4A（図4Bの凡例）に示す。これらは蛍光顕微鏡（450〜490nm の励起、＞510nmの発光）下に観察されたパターンを描いている。これらのパターンは電子線リソグラフィにより線の幅（最も太いものから最も細いものまで）：５μm、２μm、１μm、0.5μm、0.2μm、および0.1μmを用いて描いた（図4B ）。図4Bに示すように、投与量は、左から右に５、２、および１μm幅、右から左に0.5、0.2、および0.1μm幅で、40、35、30、25、20、15、10、５、および１ μC/cm²である。図4Aでは、0.2μmの特徴を解像した。最も小さい特徴（0.1μm）は、この最適化していない実験では解像できなかった。感度は約10〜約30μC/cm²である。本発明では好適例と多数の実施例とを関連付けて説明しているが、これらの例に限定されないことを理解する必要がある。一方、本発明は、すべての代用法、変更例、および添付した請求の範囲により規定される、本発明の意図および範囲内に含まれるであろう均等物をカバーすることを意味している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者カイスイシオンアメリカ合衆国オレゴン州 97402 イュージンダブリューセブンティーンスアヴェニュー 2155 (72)発明者ヤンミンディアメリカ合衆国オレゴン州 97405 イュージンパターソン１ 2157

Claims

【特許請求の範囲】１．物質上に官能化された表面を製造する方法であって：（ａ）それぞれニトレンとの付加反応を受け得る化学的部分を有する表面分子を含む非流体基質を用意し；（ｂ）それぞれニトレン生成基と官能基とを有している分子からなる第一の官能化剤をこの表面へと適用し；（ｃ）前記第一の官能化剤が適用されたこの表面を反応エネルギー源に暴露することによって、前記ニトレン生成基を、前記基質表面上の化学的部分との付加反応を受けるニトレンへと変換し、これによって前記官能基を前記表面分子へと共有的に結合させる、各工程を備えている方法。２．工程（ａ）において、−ＣＨ、−ＮＨ、−ＯＨ、−Ｃ−Ｃ−、−Ｃ＝Ｃ−、ＳｉＯ−Ｈ、Ｓｉ−ＯＨおよびＳｉ−ＯＳｉ部分からなる群より選ばれた化学的部分を有する表面分子を含む基質を用意する、請求項１記載の方法。３．工程（ａ）において重合体基質を用意する、請求項２記載の方法。４．工程（ａ）において、前記重合体基質が、飽和ポリオレフィン、アクリル、ポリスチレン、ポリスチレン相同体、不飽和ポリオレフィン、ポリイミド、ポリエステル、共役重合体、導電性重合体、無機重合体、有機金属、有機金属重合体および多糖類からなる群より選ばれている、請求項３記載の方法。５．工程（ａ）において、重合体材料、珪質材料、半導体材料、金属および炭素原子の同素形態からなる群より選ばれた基質を用意する、請求項１記載の方法。６．工程（ｃ）において、前記反応エネルギー源が、エネルギー化された電子、エネルギー化されたイオン、フォトンおよび熱からなる群より選択されている、請求項１記載の方法。７．工程（ｃ）において、前記基質表面上の予め選択された領域を、前記反応エネルギー源に暴露して、官能化されていない領域に対して前記表面上に官能化された領域のパターンを生成させる、請求項１記載の方法。８．前記基質表面へとフォトマスクを適用し、このフォトマスクがこれによって前記表面上に前記反応エネルギー源に対して暴露可能な領域と前記反応エネルギー源に対して暴露されない他の領域との予め選択されたパターンを輪郭付け、次いで前記フォトマスクが前記反応エネルギー源と前記基質表面との間に位置するように前記表面を前記反応エネルギー源に暴露することによって、前記基質の表面上の予め選択された領域の前記反応エネルギー源への暴露を実施する、請求項７記載の方法。９．前記反応エネルギー源がフォトンからなる、請求項８記載の方法。１０．前記反応エネルギー源がＵＶ光からなる、請求項９記載の方法。１１．前記基質表面上の予め選択された領域の前記反応エネルギー源への暴露を、前記基質表面上の予め選択された領域へと、エネルギー化された電子のビームを照射することによって実施する、請求項７記載の方法。１２．基質上に官能化された表面を生成させる方法であって、（ａ）それぞれニトレンとの付加反応を受け得る化学的部分を有する表面分子を含む表面を備えた非流体基質を用意し；（ｂ）それぞれニトレン生成基と第一の官能基とを有する分子を含む第一の官能化剤を用意し；（ｃ）前記第一の官能化剤を前記表面へと適用し；（ｄ）工程（ｃ）と同時に、または工程（ｃ）に引き続いて、前記表面を反応エネルギー源に暴露することによって、前記表面上の前記第一の官能化剤の分子上の前記ニトレン生成基を、前記表面分子上の化学的部分との付加反応を受けるニトレンへと変換し、これによって前記第一の官能基を前記表面分子へと共有的に結合させる、各工程を備えている方法。１３．工程（ｂ）において、前記第一の官能化剤の分子上の前記第一の官能基が、スペーサー基によって前記ニトレン生成基から分離されている、請求項１２記載の方法。１４．工程（ｂ）において、前記第一の官能化剤の分子上の前記ニトレン生成基がアジド基である、請求項１２記載の方法。１５．工程（ｂ）において、アリールアジド、アルキルアジド、アルケニルアジド、アルキニルアジド、アシルアジドおよびアジドアセチル化合物からなる群より選択された第一の官能化剤を用意する、請求項１４記載の方法。１６．工程（ｂ）において、〔ここで、Ｘは、ＣＮ：ＣＯＮＨ₂：ＣＨＯ：ＣＯ₂ＣＨ₃：ＣＯＣＨ₃：ＮＯ₂ ：ＣＯ₂Ｈ：ＣＯＣｌ：ＣＯ−イミダゾール：ＣＯＮＨＳ：ＣＨ₂ＯＨ：ＣＨ₂ＮＨ₂：ＣＯＣＨ₂Ｂｒ：Ｎ−マレイミド：ＮＨ−ビオチニル：ＣＯＮＨ−Ｒ（ここでＲはポリペプチドである）：ＣＯＮＨ−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−ＮＨ−ビオチニル（ここでＸおよびＹはスペーサー原子である）：およびＣＯＮＨＳ−ＳＯ₃Ｎａからなる群より選択されている。〕の構造を有する官能化されたペルフルオロフェニルアジドからなる群より選択された第一の官能化剤を用意する、請求項１５記載の方法。１７．工程（ｂ）において、前記第一の官能化剤が、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸に由来するペルフルオロフェニルアジドからなる群より選択されている、請求項１６記載の方法。１８．工程（ｂ）において、前記第一の官能化剤が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−官能化されたペルフルオロフェニルアジドからなる群より選択されている、請求項１７記載の方法。１９．工程（ｂ）において、前記第一の官能化剤の分子上の前記第一の官能基が、カルボキシル基、酸ハライド、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキルエステル、アルケニルエステル、アルキニルエステル、芳香族エステル、アミド、遊離のアルコール基、カルボン酸にエステル化されたアルコール基、ハロアルキル基、マレイミドおよび他のジエノフィル基、アルデヒド、ケトン、およびスルホニルハライド基からなる群より選択されている、請求項１２記載の方法。２０．前記第一の官能化剤の各分子について、前記第一の官能基が前記ニトレン生成基と反応しないように拘束されている、請求項１９記載の方法。２１．工程（ａ）において疎水性基質を用意し、前記第一の官能基がこの基質よりも疎水性が少ない、請求項１２記載の方法。２２．工程（ａ）において親水性基質を用意し、前記第一の官能基が前記基質よりも親水性が少ない、請求項１２記載の方法。２３．工程（ｄ）の後に、更に、それぞれ前記第一の官能基と反応性の第二の官能基を有する分子を含む第二の官能化剤を用意し；前記基質表面へと結合されている前記第一の官能基を前記第二の官能化剤へと、前記第二の官能基が前記第一の官能基との化学的反応を受けるのを促進する条件下で暴露し、これによって前記第二の官能化剤の分子を前記基質表面へと共有的に結合させる、各工程を有する、請求項１２記載の方法。２４．前記第一の官能基がエステルであり、前記第二の官能基が、水酸基、一級アミン、および二級アミンからなる群より選択されている、請求項２３記載の方法。２５．前記第二の官能化剤の分子が、それぞれ更に第三の官能基を有している、請求項２３記載の方法。２６．前記第三の官能基がポリペプチドを有している、請求項２５記載の方法。２７．前記第三の官能基が酵素からなる、請求項２６記載の方法。２８．前記第三の官能基が西洋ワサビペルオキシダーゼからなる、請求項２７記載の方法。２９．前記第三の官能基が核酸からなる、請求項２５記載の方法。３０．前記第三の官能基が多糖類からなる、請求項２５記載の方法。３１．前記第三の官能基が、親水性、疎水性、表面活性、発癌性、突然変異誘発性、診断性、治療性、蛍光性、および蛍光標識の部分からなる群より選択された部分からなる、請求項２５記載の方法。３２．前記第一の官能基がビオチンからなる、請求項１２記載の方法。３３．前記第一の官能基がビオチンからなる、請求項２３記載の方法。３４．前記第二の官能化剤が、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群より選択されている、請求項３３記載の方法。３５．物質上に官能化された表面を生成させる方法であって、（ａ）それぞれニトレンとの付加反応を受け得る化学的部分を有する表面分子を含む表面を備えた非流体基質を用意し；（ｂ）それぞれニトレン生成基と第一の官能基とを有する分子からなる第一の官能化剤を用意し；（ｃ）それぞれ前記第一の官能基と反応性の第二の官能基を有している分子からなる第二の官能化剤を用意し；（ｄ）前記第一の官能化剤を前記第二の官能化剤へと、前記第一の官能化剤の前記第二の官能化剤への付加反応を促進する条件下で加えることによって、前記第二の官能化剤の分子を前記第一の官能化剤の分子へと結合させ、これによって前記第二の官能化剤の分子へと結合された前記第一の官能化剤の分子をそれぞれ有する分子の反応生成物を生成させ；（ｅ）前記反応生成物の分子を前記基質表面へと適用し；（ｆ）工程（ｅ）と同時に、または工程（ｅ）に引き続いて、前記表面を反応エネルギー源に暴露することによって、前記表面上の前記反応生成物の分子上の前記ニトレン生成基を、前記表面分子上の化学的部分との付加反応を受けるニトレンへと変換し、これによって前記反応生成物の分子を前記表面分子へと共有的に結合させる、各工程を備えている方法。３６．重合体基質を官能化する方法であって；（ａ）−ＮＨ、−ＣＨ、−ＯＨ、−Ｃ−Ｃ−および−Ｃ＝Ｃ−基からなる群より選択された少なくとも一種の反応性基を有する重合体分子からなる重合体材料を用意し；（ｂ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−官能化されたペルフルオロフェニルアジドを前記基質の表面へと適用して前記基質にＮＨＳ−ＰＦＰＡ−被覆表面を生成させ；（ｃ）このＮＨＳ−ＰＦＰＡ−被覆表面を反応エネルギー源へと暴露することによって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−官能化されたペルフルオロフェニルアジドを、前記重合体分子上の反応性基に対してニトレン付加させる各工程を有する方法。３７．請求項１記載の方法に従って官能化された表面を備えている非流体物質。３８．請求項１２記載の方法に従って官能化された表面を備えている非流体物質。３９．請求項３５記載の方法に従って官能化された表面を備えている非流体物質。