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Technisches Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft die Identifizierung einer kristallinen Struktur
des menschlichen IL-18 (hIL-18)-Cytokins, seinen Bindungsmodus an
dessen Rezeptor und Verfahren, die ein weiteres Design und eine
Selektion von Molekülen
mit hIL-18-ähnliche
Aktivität
ermöglichen.
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Hintergrund der Erfindung
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IL-18
ist eine Art von Cytokin oder Substanz, die eine Signaltransduktion
des Immunsystems vermittelt. Wie im japanischen Patent Kokai Nrn.
27,189/96 und
193,098/96 und Okamura et al., Nature,
Bd. 378, Nr. 6,552, S. 88–91
(1995) gezeigt, wurde IL-18 direkt nach seiner Entdeckung vorläufig als "Interferon-gamma-induzierender
Faktor" bezeichnet.
Diese Bezeichnung wurde später
in "IL-18" gemäß dem Vorschlag
von Ushio et al., Journal of Immunology, Bd. 156, S. 4,274–4,279,
(1996) geändert.
IL-18 in reiner Form besteht aus 157 Aminosäuren. Es induziert immunkompetente
Zellen bei der Produktion von Interferon-gamma (hier abgekürzt als "IFN-gamma"), wobei es sich
um ein nützliches
biologisch aktives Protein handelt, das die Erzeugung und Cytotoxizität von Killerzellen
induzieren und verstärken
kann. Intensive Forschungen werden gegenwärtig durchgeführt um die
verschiedenen Nützlichkeiten
von IL-18-Pharmazeutika
zu entwickeln und zu untersuchen. Diese mit hohen Erwartungen verbundenen
Anwendungen beinhalten die Verwendung von IL-18 als antivirales,
antimikrobielles, Antikrebs- und anti-immunopathisches Mittel.
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In
der Natur werden Cytokine einschließlich IL-18 als Substanzen
produziert und sezerniert, die für
die Signaltransduktion im Immunsystem verantwortlich sind. Wenn
daher Cytokine an den Körper
von Säugern verabreicht
werden, stören
sie das natürlich
existierende Gleichgewicht im Immunsystem des Säugers. Die Oberflächen von
Säugerzellen
tragen Stellen oder "Rezeptoren", die für die Erkennung
von Cytokinen veranwortlich sind und sezernierte Cytokine transduzieren
kein Signal an Zellen, bis sie an die Rezeptoren gebunden sind.
Im normalen Immunsystem existiert ein definitives Gleichgewicht
zwischen den jeweiligen Cytokinen und ihren Rezeptoren. Es gibt
gegenwärtig
noch nicht erfüllte
Bedürfnisse
bei der Auffindung und den Kenntnissen über die biologischen und strukturellen
Eigenschaften von IL-18 und seinen Rezeptoren und die Verwendung
solcher Kenntnisse bei dem Entwurf von Arzneimitteln für die Behandlung
und Verbesserung von Krankheiten und Störungen wie viralen und mikrobiellen
Infektionen, Krebs, Entzüundungen,
usw.
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Die
internationale Patentveröffentlichung
WO 01/58956 offenbart die
Struktur von menschlichem IL-18 in Hinblick auf seine Sequenz und
offenbart auch ein Verfahren zur Identifikation von Antikörpern, die
eine hohe Affinität
für menschliches
IL-18 aufweisen und die seine Aktivität neutralisieren könnten.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Gemäß einem
Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein menschliches IL-18
Proteinmolekül
mit den Koordinaten von Tabelle I in im wesentlichen reiner nativer
Form.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine neue kristalline
Form des menschlichen IL-18-Moleküls bereit.
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In
noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung direkte
Informationen hinsichtlich der spezifischen Rolle bereit, die die
für die
Bindung von menschlichem IL-18 an seinen Rezeptor verantwortlichen Reste
spielen.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine menschlich IL-18-kristalline Struktur
des nativen Proteins bereit, wobei das Protein eine Cystein-zu-Serin-Substitution
an Position 38 von SEQ ID NO:1 aufweist. Basierend auf dieser Struktur
und molekularen Modellen, die unter Verwendung verwandter Proteine
gebaut wurden, stellt sie Wege zur Bestimmung der besonders wahrscheinlichen
Plätze
für eine
Modifikation des hIL-18-Moleküls bereit,
ohne seine biologische Aktivität
zu kompromitieren wie auch Verfahren, diese kristalline Form für die Identifikation,
Verbesserung oder einen Antagonismus zur biologischen Aktivität von hIL-18
zu verwenden.
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Die
dreidimensionale Struktur von menschlichem kristallinen IL-18 Die
Kristallstruktur von menschlichem IL-18 in seiner nativen Form wurde
durch molekularen Ersatz bestimmt und auf eine 2,06 Å-Auflösung verfeinert.
Das neue menschliche IL-18, wie IL1β ist in einem zentralem, geschlossenen β-barrel gefaltet,
mit einer Gesamt-β-trefoil-(Blatt)faltung.
Die folgenden Reste bilden die drei Teile des Kleeblatts: (i) 10–47 und 150–156, (ii)
103–149
und (iii) 47–102
und 1–9.
Es wird erwartet, daß die
Struktur von menschlichem IL-18 ähnlich
zu der von murinem IL-18 ist, da die Sequenzen dieser IL-18 hoch
homolog sind (65% Identität).
Die von der Struktur von menschlichem IL-18 abstammende Information
wirft ein Licht darauf, wie Komplexe mit pharmakologischen Mitteln
gebildet werden könnten,
die die Eigenschaften von menschlichem IL-18 verändern, beispielsweise Halbwertszeit
und Immunogenität,
während
die biologische Aktivität
erhalten bleibt. In Abwesenheit struktureller Informationen zum
hIL-18-Rezeptorkomplex werden die hIL-18-Struktur und diejenige
des ILIβ-IL1β-Rezeptorkomplxes
als Modelle für
Interaktionen zwischen hIL-18 und seinem Rezeptor verwendet und
stellen ein rationales Führungsmodell
bereit, wo potentielle Mittel im hIL-18-Molekül plaziert werden könnten. ILlβ und hIL-18
haben ähnliche
Gesamtfaltungen und Strukturen, jedoch ergeben sich deutliche Unterschiede
bei den beiden Strukturen nahe und an den Positionen der Loops.
Im IL1β-Rezeptorkomplex
etablieren die Reste in IL1β-Loop
wichtige Interaktionen mit dem Rezeptor, im wesentlichen durch die
beiden Oberflächen.
Um die Reste von IL-18 zu identifizieren, die mit dem IL-18-Rezeptor in Wechselwirkung
treten können,
wurden Reste von IL-18 auf die IL1β-Struktur kartiert, indem die
153 Cα-Atome
von IL1β mit
IL-18 überlagert
wurden, um ein Root Mean Square, r. m. s. und eine Abweichung von
9 Å zu
erreichen. Basierend auf dieser Überlagerung
wird vorhergesagt, daß hIL-18
mit seinem Rezeptor über
etliche Oberflächen
interagiert. Auf einer der vorgeschlagenen Interaktionsoberflächen ist
die Rezeptor-IL-18-Grenzfläche durch
die IL-18-Reste: 4–18,
30–37,
107–112,
128–135
und 145–148
ausgekleidet. Auf einer anderen vorgeschlagenen Oberfläche, die
auf der anderen Seite des Moleküls
lokalisiert ist, ist die Grenzfläche
durch die folgenden Reste ausgekleidet: 1–8, 50–55, 89–93, 103–105 und 155–156. Dies
läßt die Reste
103–149
in hIL-18 frei von irgendeiner Interaktion mit dem Rezeptor und
diese Reste sind im wesentlichen Lösungsmittel-ausgesetzt. Es wird
nun vorgeschlagen, daß dies
der beste Platz zum Anhaften eines Derivatisierungsmittels ist (beispielsweise
eines Polyethylenglykol-Moleküls) das
die hIL-18-Rezeptorbindungsaktivität nicht kompromitieren würde. Dieser
Vorschlag wird von den Beobachtungen von Kim et al. unterstützt, wo
festgestellt wurde, daß Glu42
und Lys89 für
die Interaktion von menschlichem IL-18 mit dem Rezeptor kritisch
sind. J. Biol. Chem. 277(13): 10998–1003 (2002). Glu42 und Lys89
sind ähnlich
für eine
Interaktion mit dem IL-18-Rezeptor in unserem Modell positioniert,
was die Verwendung der Kristallographiemodelierung für die Vorhersage
der interagierenden Oberflächen
und Interaktionen zwischen Cytokin und Rezeptor weiter validiert.
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Tabelle
I stellt die Atomkoordinaten von nativem menschlichen IL-18 (C38S)
bereit. Die Koordinaten wurden unter Verwendung eines Modells erhalten,
das die Reste 1 bis 156 in der kristallographischen asymmetrischen
Einheit umfaßte.
Die Aminosäuresequenz
des nativen menschlichen IL-18 wird in SEQ ID NO:1 bereitgestellt.
Für die
hier beschriebenen Studien wurde jedoch die C38S-Mutante verwendet.
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Es
wird erwartet, daß die
in Tabelle 1 dargestellten Atom-Koordinaten sich bei Verfeinerung
der Kristallstruktur verändern,
jedoch sollte die Abweichung, die sich als Ergebnis im Hinblick
auf die Cα-Atome
ergibt, nicht substantiell eine r. m. s. von 1,0–1,5 Å überschreiben. Änlich werden
die Bindungswinkel und Bindungslängen
in nicht signifikanter Weise variieren, wie routinemäßig bei
anderen Proteinen beobachtet. Engh et al. (1991), Acta Crystallogr.
A47, 392–400.
Die Interatomwechselwirkungen werden unverändert bleiben, im experimentellen
Fehler. Die relative Konformation und Orientierung oder die Positionierung
der Reste in der Rezeptorbindungsstelle werden ebenfalls nicht beeinflußt sein.
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Beschreibung der Figuren
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1 stellt
ein "Ribbon-Diagramm" von nativem menschlichen
IL-18 (C38S) dieser Erfindung bereit, wobei die Ansicht entlang
der Achse der β-Barrel
genommen wurde und die helikalen Segmente als Bänder und die β-Blätter als
Pfeile repräsentiert
sind. Die Polypeptid-Kette ist regenbogenfarbig, wobei die Farbe
Blau am N- und Farbe Rot am C-Terminus ist.
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2 stellt
ein "Ribbon-Diagramm" der sekundären Strukturelemente
von menschlichen IL-18 bereit. Diese sekundären Strukturelemente von hIL-18
sind: β1
2–14, β2 19–22, β3 28–31, αl 38–41, 310 Helix 42–44, β4 47–54, β5 60–67, β6 71–75, 310 Helix
77–79, β7 82–84, β8 91–92, β9 101–106, β10 109–117, β11 123–130, β12 133–140, 310 Helix 147–149, β13 151–154.
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3 stellt
Diagramme von murinen IL-18, menschlichen IL-1β und menschlichen IL-18-Strukturen bereit.
Ein Seite-an-Seite-Vergleich dieser Strukturen zeigt die Konformationsähnlichkeiten
zwischen diesen strukturell verwandten Cytokinen.
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4 stellt
ein Diagramm bereit, worin das hIL-18-Modell auf den IL1β-IL1-Rezeptor-Komplex überlagert
ist. Menschliches IL-18 ist in einer dünnen gelben Linie gezeichnet
und ILβ-IL1
in einer dünnen
grünen Linie
als Cytokin und einer roten Linie als Rezeptor. Das Diagramm beleuchtet
die Art und Weise, in der hIL-18 an seinen Rezeptor bindet, wie
auch die Beteiligung der Aminosäurereste
an Rezeptorwechselwirkungen und biologischer Aktivität.
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Mutanten und Derivate
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Die
Erfindung beschreibt weiter Homologe, Co-Komplexe, Mutanten und
Derivate der menschlichen IL-18-Kristallstruktur der Erfindung.
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Die
Bezeichnung "Cytokin" wie hier verwendet
bedeutet ein Protein, das das Wachstum und die funktionellen Aktivitäten von
Immunzellen moduliert.
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Die
Bezeichnung "Homolog" wie hier verwendet,
bedeutet ein Protein mit einer mindestens 30%igen Aminosäuresequenzidentität mit einer
funktionalen Domäne
von menschlichem IL-18. Vorzugsweise wird die prozentuale Identität 40 oder
50%, noch bevorzugter 60 oder 70% und besonders bevorzugt 80 oder
90% betragen. Eine 95%ige Identität wird besonders bevorzugt.
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Die
Bezeichnung "Co-Komplex" wie hier verwendet
bedeutet das menschliche IL-18 oder eine Mutante oder ein Homolog
von menschlichem IL-18 in kovalenter oder nicht-kovalenter Assoziation
mit einer chemischen Einheit oder Verbindung.
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Die
Bezeichnung "Mutante" wie hier verwendet,
bedeutet das menschliche IL-18-Polypeptid, d. h. ein Polypeptid,
das die biologische Aktivität
von Wildtyp menschlicher IL-18-Aktivität zeigt, gekennzeichnet durch den
Ersatz von mindestens einer Aminosäure von der Wildtyp IL-18-Sequenz. Eine solche
Mutante kann beispielsweise durch Expression von menschlicher IL-18-cDNA,
vorher in ihrer codierenden Sequenz durch eine Oligonukleotid-gerichtete
Mutagenese hergestellt, werden.
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Die
Bezeichnung "r.
m. s." wie hier
verwendet, bedeutet Root Mean Square. Sie repräsentiert die Standardabweichung
der Datensammlung.
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Die
Bezeichnung "pro-IL-18" wie hier verwendet,
bedeutet die inaktive Vorläuferform
von reifem IL-18. Reifes IL-18 enthält nicht das "Pro-Fragment" und ist biologisch
aktiv.
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Die
Bezeichnung "Molekularersatz" wie hier verwendet
bedeutet ein Verfahren um eine Kristallstruktur unter Verwendung
der Atomkoordinaten eines strukturell verwandten Moleküls aufzulösen.
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Menschliche
IL-18-Mutanten können
auch durch ortsspezifischen Einbau unnatürlicher Aminosäuren in
das menschliche IL-18-Protein unter Verwendung des allgemeinen Biosyntheseverfahrens
von Noren et al., Science, 244: 182–188 (1989) erzeugt werden.
Bei diesem Verfahren werden die Nukleotide, die die Aminosäure von
Interesse in Wildtyp menschlicher IL-18 codieren, durch ein "Blank"-Unsinn-Codon ersetzt,
nämlich TAG,
wobei eine Oligonukleotidgerichtete Mutagenese verwendet wird. Ein
gegen dieses Codon gerichteter Suppressor wird dann in vitro chemisch
aminoacyliert, mit der gewünschten
unnatürlichen
Aminosäure.
Der aminoacylierte Rest wird dann zu einem Invitro-Translationssystem
hinzugefügt,
um ein mutiertes menschliches IL-18-Enzym mit der ortsspezifisch eingebauten
nicht-natürlichen
Aminosäure
zu ergeben.
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Selenocystein
oder Selenomethionin können
in ein Wildtyp oder mutiertes Cytokin durch Expression menschlicher
IL-18 codierender cDNAs in auxotrophen E. coli-Stämmen eingebaut
werden. Hendrickson et al., EMBO J., 9(5): 1665–1672 (1990). Die Wildtyp oder
mutierte Cytokin-cDNA kann in einem Wirtsorganismus auf einem Wachstumsmedium
exprimiert werden, dem entweder natürliches Cystein oder Methionin
oder beide fehlen, das jedoch mit Selenocystein oder Selenomethionin
oder beiden angereichert ist.
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Die
Bezeichnung "schweres
Atomderivat" bezieht
sich auf Derivate von menschlichem IL-18, die durch chemische Modifikation
eines Kristalls von menschlichem IL-18 erzeugt wurden. In der Praxis
wird ein Kristall in einer Lösung
eingetaucht, die das gewünschte
Metallsalz oder eine organometallische Verbindung, zum Beispiel
Bleichlorid, Goldthiomalat, Thimerosal oder Uranylacetat enthält, die
bei Diffusion in das Proteinkristall an das Protein binden kann.
Die Stellung der gebundenen Schwermetallatomstelle(n) kann durch
Röntgenbeugungsanalyse
des eingetauchten Kristalls bestimmt werden. Diese Information wird
dann wiederum verwendet, um die zur Konstruktion einer dreidimensionalen
Elektronendichtekarte benötige
Phasenwinkelinformation zu erzeugen, wovon ein Modell der Atomstruktur
des Enzyms abgeleitet wird, Blundell et al., PROTEIN CRYSTALLOGRAPHY,
Academic Press (1976).
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Verfahren zur Identifizierung von Agonisten
oder Antagonisten der neuen menschlichen IL-18-kristallinen Struktur
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Ein
anderer Aspekt dieser Erfindung involviert ein Verfahren zur Identifizierung
von Agonisten oder Antagonisten eines menschlichen IL-18 durch die
hier beschriebene Kristallstruktur. Die menschliche IL-18-Kristallstruktur
der Erfindung ermöglicht
die Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten der Cytokinaktivität. Solche
Agonisten/Antagonisten können
kompetitiv sein, an die Gesamtheit oder einen Teil des Rezeptors
für menschliches
IL-18 binden oder nicht kompetitiv sein und die IL-18-Aktivität inhibieren
und daran binden, unabhängig
davon ob dies an den Rezeptor gebunden ist.
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Eine
Ausführungsform
untersucht menschliches IL-18-Kristall der Erfindung mit einer Varietät unterschiedlicher
chemischer Molekülsonden
um optimale Stellen entweder für
Interaktionen zwischen solchen Kandidaten Agonisten/Antagonisten-Molekülen und
hIL-18 zu bestimmen oder alternativ für zelluläre Aktivitäten. Beispielsweise ermöglichen
hochauflösende
Röntgenbeugungsdaten,
die von Kristallen, die mit Lösungsmittel
gesättigt
sind, gesammelt wurden die Bestimmung der Bindungspositionen für Lösungsmittelmoleküle. Kleine
Moleküle,
die fest an diese Stellen binden würden, können entworfen, synthetisiert
und im Hinblick auf ihre menschlichen IL-18-agonistischen/antagonistischen
Aktivitäten
getestet werden.
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Eine
andere Ausführungsform
untersucht in einem Screening kleine Moleküldatenbanken im Hinblick auf
chemische Einheiten oder Verbindungen, die an die Gesamtheit oder
einen Teil von menschlichem IL-18 oder menschlichen IL-18-Rezeptor
oder beide binden können.
Dieses Screeningverfahren und seine Verwendbarkeit ist auf dem Gebiet
wohlbekannt. Beispielsweise wurden solche Computermodelltechniken
in einer PCT-Anmeldung
WO 97/16177 ,
veröffentlicht
am 9. Mai 1997, beschrieben.
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Sobald
der Agonist/Antagonist durch das Modellieren identifiziert wurde,
kann er im Hinblick auf seine biologische Aktivität getestet
werden. Beispielsweise können
die identifizierten Moleküle über Standardscreeningformate
in enzymatische Aktivitätsassays
eingeführt
werden. um die inhibitorische Aktivität der Verbindungen zu bestimmen
oder alternativ in Bindungsassays, um die Bindung zu bestimmen.
Ein besonders bevorzugtes Assayformat ist der Enzym-gebundene Immunosorbend-Assay
(ELISA). Dieser und andere Assayformate sind auf dem Gebiet wohlbekannt
und so gibt es keine Begrenzungen für die vorliegende Erfindung.
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Die
folgenden Beispiele illustrieren verschiedene Aspekte dieser Erfindung.
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Beispiele/biologische Verfahren
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Beispiel 1 – Die Reinigung der menschlichen
IL-18 C38S-Mutante in Escherichia coli
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Menschliches
proIL-18 wurde in E. coli als lösliches
Protein mit einem N-terminalen Hexa-His-Tag exprimiert. ProIL-18
wurde mit einer Ni-NTA-Agarosesäule
gereinigt und reifes IL-18 wurde durch Spaltung der Prodomäne mit Caspase
5 erhalten. Die C38S-Mutante von IL-18 wurde so manipuliert, um
das übliche
Auftreten einer Intra-Disulfid-Bindung zwischen C38 und C68 bei
Wildtyp IL-18 bei neutralem pH zu verhindern.
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Die
E. coli-Zellen wurden mit 10 ml/g in 50 mM Tris (pH 8), 500 mM NaCl,
5% Glycerin, 10 mM 2-Mercaptoethanol (Puffer A) enthaltend 1 μg/ml Pepstatin
A und 0,4 mM Phenylmethylsulfonylfluorid suspendiert. Die Zellen
wurden homogenisiert und dann durch zwei Passagen durch einen Mikrofluidisierer
(M110-Y, Microfluidics) bei 12 000 psi lysiert. Zellabfall wurde
durch Zentrifugation bei 30 000 g für 30 min entfernt. Der Überstand
wurde auf eine Ni-NTA-Agarosesäule
gegeben und mit 3 Säulenvolumina
Puffer A gewaschen. Die Säule
wurde dann mit 3 Säulenvolumina
eines 30 mM Imidazolpuffers in Puffer A gewaschen und proIL-18 wurde mit
300 mM Imidazol in Puffer A eluiert, was dann in 25 mM HEPES (pH
7,5), 100 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol dialysiert wurde. Die
mit einem Hexa-His-Tag versehene "Pro"-Domäne wurde
durch Spaltung mit Hexa-His-Tag versehener Caspase 5 in einem proIL-18:Caspase
5-Verhältnis
von 50:1 pro Gewicht für
2 Stunden bei Raumtemperatur entfernt. Die Salzkonzentration der
Proteinmischung wurde auf 0,5 M NaCl eingestellt und die Mischung
wurde dann auf eine Ni-NTA-Agarosesäule aufgebracht.
Reifes IL-18 floß durch
die Säule,
während
Spurenmengen von intaktem proIL-18, der "Pro"-Domäne, Caspase
5 und andere geringfügigere
Kontaminationen an die Ni-NTA-Säule
gebunden wurden. Reifes hIL-18 in der Ni-NTA-Durchflußfraktion wurde
1:10 mit 25 mM Tris (pH 7,5), 5 mM 2-Mercaptoethanol (Puffer B)
verdünnt.
Die Proteinlösung
wurde dann auf eine MonoQ-Säule
aufgebracht und die Flution wurde mit einem linearen Gradienten
von 0–0,3
M NaCl in Puffer B, vorzugsweise in 20 Säulenvolumina durchgeführt. Fraktionen,
die nach der Säule
gesammelt wurden, enthaltend IL-18, wurden basierend auf einer Absorption
bei 280 nm Wellenlänge
und den Ergebnissen der SDS-PAGE gesammelt. Der Pool wurde dann
auf eine HiLoad 26/60 Superdex 75 prep grade-Säule aufgebracht, die mit 25
mM Tris (pH 8), 50 mM NaCl, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA
prääquilibriert war
und die Flution des gewünschten
Proteins wurde mit einer Flußrate
von 2,5 ml/min durchgeführt.
IL-18 wurde als einzelner symmetrischer Peak eluiert. Fraktionen,
die zu diesem Peak korrespondierten, wurden gesammelt und das Protein
im Pool wurde dann auf 10,2 mg/ml für die Kristallisierung konzentriert.
Dieses resultierende Produkt war mehr als 95% rein in SDS-PAGE und hatte die
gewünschte
Aktivität.
Eine N-terminale Aminosäureanalyse
wurde verwendet um seine Identität
zu bestätigen.
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Die
hier beschriebene Erfindung stellt ein Verfahren zur Definition
von Ligandenwechselwirkungen mit IL-18 und seinem Rezeptor bereit:
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1. A. Wirkungen der Ligandenbindung auf
die intrinsische Enzym-Fluoreszenz,
erzeugt von Tryptophan-Resten.
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Die
Bindung von entweder einem natürlichen
Liganden oder einem derivatisierten Molekül kann zu Konformationsänderungen
führen,
die die intrinsische Proteinfluoreszenz ändern. Unter Verwendung einer Stopp-Fluß-Fluoreszenz-Technologie
kann man diese Veränderungen
der intrinsischen Fluoreszenz verwenden, um die mikroskopischen
Ratenkonstanten zu definieren, die mit der Ligandenbindung assoziiert
sind. Alternativ kann man Steady-State-Fluoreszenz-Titrationsverfahren
verwenden, um die Gesamt-Dissoziationskonstante
für die
Bindung zu erzeugen. Standardverfahren werden für die Bewertung der erworbenen
Parameter angewandt.
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Beispiel 2 – Kristallisierung, Strukturbestimmung
und Verfeinerung der Kristallstruktur von menschlichem IL-18
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2. A. Kristallisierung
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Die
menschlichen IL-18 C38S-Kristalle wachsen als hexagonale Stäbe von abgesetzten
Tropfen, äquilibriert
durch die Dampfphase bei Raumtemperatur gegen ein Reservoir von
500 μl Lösung, enthaltend
20% Polyethylenglykol (PEG), 0,07 mM Natriumcitrat mit einem pH
von 5,6 und 0,133 M Ammoniumacetat für 2 bis 3 Wochen in Cryschem-Platten.
Die Tropfen enthielten 2 μl
des Proteins bei 10 mg/ml in 50 mM NaCl, 25 mM Tris bei einem pH
von 8, 0,1 mM EDTA und 5 mM β-Mercaptoethanol.
Die Kristalle gehören
zur Raumgruppe P6(1) mit Einheitszelldimensionen a = 71,4 Å, b = 71,4 Å, c = 88,7 Å, α = β = 90°, γ = 120° und einer
Kopie des menschlichen IL-18 in der asymmetrischen Einheit.
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2. B. Röntgenbeugungsdatensammlung
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Wir
sammelten die Röntgenbeugungsdaten
durch einen einzelnen menschlichen IL-18 (C38S)-Kristall, suspendiert
durch eine Nylonschlaufe und blitzgefroren unter einem kalten Stickstoffgasstrom.
Die Beugungsparameter wurden durch eine ADSC-Quantum 210-ladungsgekoppelte
Vorrichtung bei der 17ID-Strahllinie an der Advanced Photon Source,
Argonne National Laboratory, Illinois, erzeugt. Die Wellenlänge des
monochromatischen Röntgenstrahls
wurde auf 1,000 Å eingestellt.
Der reziproke Raum wurde mit 1,0° Oszillationsschritten
um die ϕ-Goniostaten-Achse als Probe genommen. Die Daten
wurden mit HKL2000 Otwinowski, Z. in Proceedings of the CCP4 Study
Weekend: "Data Collection
and Processing",
29.–30.
Januar, SERC Daresbury Laboratory, England (1993) verarbeitet.
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2. C. Strukturbestimmungen
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Die
Kristallstruktur von menschlichem IL-18 wurde durch molekularen
Ersatz mit der Programmpackung AMoRe [Navaza, J., Acta Cryst. A50,
157–163
(1994)] unter Verwendung der Kristallstruktur von murinem IL-18,
befreit von Lösungsmittelmolekülen als
Suchmodell bestimmt, da sich die murinen und menschlichen IL-18-Proteine
eine 65%ige Aminosäuresequenzidentität teilen.
Das Suchmolekül
wurde in einer orthogonalen Zelle mit Dimensionen von 100 Å × 100 Å × 100 Å plaziert.
Die Kreuzrotations- und Translationsuchen wurde unter Verwendung
von Daten von 20 Å-
bis 4 Å-Auslösungen und
einem Integrationsradius von 25 Å durchgeführt. Die Spitzenauflösung der
Kreuzmutationsfunktion korrespondierte zum IL-18-Molekül in der asymmetrischen
Einheit und war unzweifelhaft von den Hintergrundpeaks diskriminierbar.
Die Suche nach einer korrekten Translation ergab eine Lösung mit
einem R-Faktor von 0,45 und einem Korrelationskoeffizienten von
0,47 nach einer Verfeinerung nach dem Prinzip des starren Körpers in
AmoRe.
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2. D. Modellaufbau und Verfeinerung
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Die
native hIL-18 Struktur wurde aus den Rotations- und Translationsoperationen
aufgebaut, aufgefunden durch molekularen Ersatz unter Verwendung
der murinen IL-18-Struktur. Die menschliche IL-18-Struktur wurde
folgend auf die 2Fo-Fc und Fo-Fc-Elektronendichtekarten aufgebaut.
Gemäß diesen
Karten kann man das menschliche IL-18-Grobmodell etablieren, indem
die Aminosäuren,
die in der murinen Struktur vorliegen, durch diejenigen des menschlichen
Proteins selbst ersetzt werden, wie auch durch Zugabe oder Deletion
von Resten. Wir verwendeten das interaktive Computergraphikprogramm
XTALVIEW um diese Manipulationen durchzuführen. McRee J. Structural Biology
125, 156–165
(1999). Dieses Grobmodell wurde dann etlichen Runden eines simulierten
Annealings, Positions- und B-Faktor-Verfeinerungen unter Verwendung von CNX
[Brunger et al., Science, 235, 458–460 (1987)] und REFMAC [Murshudov
et al., Acta Crystallographica D5, 240–255 (1997)] unterworfen, gefolgt
von einem manuellen Eingriff. Die Verfeinerung und der manuelle Aufbau
wurden durch die Qualität
der 2Fo-Fc- und Fo-Fc-Elektronendichtekarten überwacht wie auch den Wert
von kristallographischem R und R
free. Während der
Verfeinerung wurden Reflexionsdaten von Unendlich bis 2,06 λ verwendet,
falls nötig,
um das Masselösungsmittel
innerhalb des Kristalls auszugleichen, das zur Beugungsintensität beitragen
kann. Das Endmodell des menschlichen IL-18 (C38S) umfaßt die Reste
1 bis 156 [SEQ ID NO:1] und 208 Wassermoleküle. Der R-Faktor des Modells
ist 0,16 und R
free ist 0,19 für 15 011 Reflexionen.
Die r. m. s.-Abweichungen von der Standardgeometrie [Engh et al.,
Acta Cryst. A 47, 392–400 (1991)]
sind 0,013 Å für Bindungslängen und
1,5° für Bindungswinkel. Tabelle
1 Atomkoordinaten der nativen menschlichen IL-18-Struktur (C38S-Mutante)
Sequenzprotokoll
Sequenzprotokoll
