DE69630120T2

DE69630120T2 - Kristalle von fragmenten von cd40-liganden und deren verwendung

Info

Publication number: DE69630120T2
Application number: DE69630120T
Authority: DE
Inventors: Mihail N. Karpusas; Juswinder Singh; David W. Thomas
Original assignee: Biogen Inc
Current assignee: Biogen MA Inc
Priority date: 1995-06-22
Filing date: 1996-06-21
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2016-06-22
Also published as: DE69630120D1; DK0833847T3; CA2224812A1; PT833847E; EP0833847B1; ES2202455T3; JPH11508262A; JP2006188541A; WO1997000895A1; HK1010085A1; AU6337296A; ATE250630T1; EP0833847A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine kristalline Form eines löslichen Fragments der extrazellulären Domäne von menschlichen CD40-Liganden und insbesondere einen Kristall eines CD40L-Fragments, der die Reste Gly116 bis Leu261 („sCD40L(116-261)") enthält und dessen durch Röntgenstrukturanalyse erhaltene Struktur. Zusätzlich betrifft diese Erfindung Verfahren zur Verwendung der Kristallstruktur von CD40L oder eines Fragments davon, speziell sCD40L(116-261), zum Entwurf, dem Durchmustern und der Optimierung von Verbindungen, welche die Aktivität von CD40L beeinflussen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Immunsystem besteht aus vielen komplexen Vorgängen, die in ihrer Gesamtheit den Körper gegen toxische und/oder pathogene Agenzien schützen. Im Allgemeinen wird eine Immunantwort eingeleitet, wenn bestimmte Zellen innerhalb des Körpers die toxischen oder pathogenen Agenzien erkennen. Die Antwort wird dann durch irgendeine Reihe von Maßnahmen wie Zell-Zell-Kontakt oder lösliche Überträgerstoffe zu anderen Zellen, die an der Immunantwort beteiligt sind, weitergeleitet.
Es wurde gezeigt, dass der CD40-Ligand („CD40L") funktionelle T- und B-Zell-Interaktionen vermittelt, die an der Immunantwort beteiligt sind (EP-A-585 943). Der Begriff CD40L betrifft eine Gattung von Polypeptiden, die CD40 oder Homologe davon binden können. In der Tat ist die Interaktion von CD40L mit von B-Zellen exprimiertem CD40 die hauptsächliche molekulare Interaktion, die für die T-Zell-Kontakt-abhängige Induktion des Wachstums und der Differenzierung von B-Zellen zum Zweck der Antigen-spezifischen Antikörperproduktion verantwortlich ist. Die Bindung von T-Zell-CD40L an seinen auf der Oberfläche von B-Lymphocyten exprimierten Gegenrezeptor CD40 resultiert in pleiotropen Aktivitäten einschließlich Aktivierung des Wechsels des Antikörper-Isotyps, Verhinderung von B-Zell-Apoptose, Etablierung des immunologischen Gedächtnisses, Bildung von Keimzentren in lymphoiden Geweben, Modulierung von Cytokin-Produktion in aktivierten B-Zellen und Vermehrung und Differenzierung von B-Zellen.
Eine lösliche Version von CD40L kann aus dem extrazellulären Bereich oder Fragmenten davon hergestellt werden. Der Begriff CD40L, wie er hierin verwendet wird, beinhaltet lösliche CD40L-Polypeptide, denen Transmembran- und intrazelluläre Regionen fehlen, Homologe und Analoge von CD40L oder Derivate davon. Frühe Untersuchungen haben gezeigt, dass CD40L Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-Familie der Cytokine ist. Andere Mitglieder dieser Familie schließen TNF-α, LT-α (Lymphotoxin-α, auch als TNF-β bekannt), LT-β, Fas-Ligand, CD30L und CD27L ein. CD40L ist ein membrangebundenes Polypeptid mit einer extrazellulären Region am C-Terminus, einer Transmembran-Region und einer intrazellulären Region am N-Terminus.
Mehrere Mutationen von CD40L sind dafür bekannt, einen X-chromosomal gekoppelten schweren Immundefekt zu verursachen, der als Hyper-IgM-Syndrom („HIGMS") bekannt ist. HIGMS zeichnet sich durch normale oder erhöhte IgM-Spiegel, aber fehlende oder niedrige IgG-, IgA-, und IgE-Spiegel im Serum aus. Bei einem „Knockout" des CD40L-Gens der Maus fehlt ebenfalls die Expression von IgG, IgA und IgE, ähnlich wie beim Hyper-IgM-Syndrom beim Mensch. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass die CD40-Signalübertragung für die IgG-, IgA-, und IgE-Produktion benötigt wird und dass diese Funktion nicht redundant mit anderen Signalübertragungs-/Adhäsionswegen ist. Untersuchungen zeigen, dass CD40L auch bei bestimmten Krankheiten wie Arthritis, Lupus, Multiple Sklerose, Transplantat-Wirt-Reaktion, Colitis ulcerosa, Allergien, Gewebetransplantation und Erzeugung von Antikörpern gegen antigene Arzneimittel eine Rolle spielen kann. Daher ist es offensichtlich, dass ein Eingriff in die CD40-CD40L-Interaktion weitreichende therapeutische und diagnostische Anwendungen besitzt.
Momentan besteht ein Interesse daran, mögliche Arzneimittel-Anwärter, die in die CD40-CD40L-Interaktion eingreifen würden, zu entwerfen, zu identifizieren oder zu erhalten. Das kürzlich aufgekommene Arzneimittel-Design zur Identifizierung von Anwärtern, die bei physiologisch bedeutsamen Wegen eine Rolle spielen, hat eine nützliche Methode zur Verfügung gestellt, Hauptbestandteile für Arzneimittel zu erhalten oder zu entwerfen.
Generell bedarf dieser Ansatz der Auswahl eines Protein-Zielmoleküls, das eine Rolle in einem physiologisch bedeutsamen Weg spielt. Typischerweise wird, wenn einmal ein natürlich vorkommender oder synthetisierter Ligand für das Zielmolekül gefunden wurde, der Ligand modifiziert oder optimiert, um so einen Anwärter mit den gewünschten Eigenschaften herzustellen.
Um einen Liganden wirkungsvoller entwerfen oder modifizieren zu können ist es nützlich, eine dreidimensionale Struktur der bioaktiven Konformation eines bekannten Liganden zu haben, wie er an das Zielmolekül bindet. Darüber hinaus ist es wertvoll, durch Untersuchung der dreidimensionalen Struktur des Zielproteins im Komplex mit dessen bekannten Liganden die detaillierten Wechselwirkungen des Liganden mit seinem Zielmolekül zu verstehen. Dies gestattet dem Fachmann, die kritischen Wechselwirkungen mit dem Protein aufrecht zu erhalten, während gleichzeitig die Liganden-Anwärter modifiziert werden, damit sie genauer mit dem Protein wechselwirken, was sich in erhöhter Wirkungskraft und Spezifität niederschlägt.
Die dreidimensionale Kristallstruktur des Zielproteins ist jedoch häufig nicht verfügbar wegen des bedeutsamen Aufwands, der nötig ist um Kristalle von ausreichender Größe und einer Auflösung zu erhalten, um genaue Informationen bezüglich der Struktur zu liefern. Es ist beispielsweise zeitaufwändig und oftmals schwierig, ein Protein zu exprimieren, zu reinigen und zu charakterisieren. Zusätzlich muss das Protein, wenn es einmal in ausreichender Reinheit erhalten wurde, in einer Größe und Klarheit kristallisiert werden, die für die Röntgenbeugungsanalyse und darauf folgende Strukturaufklärung verwendet werden kann. Obwohl Kristall-Strukturen eine Fülle wertvoller Information auf dem Gebiet des Arzneimittel-Designs und -Entdeckung zur Verfügung stellen können, sind Kristalle von bestimmten biologisch bedeutsamen Verbindungen wie CD40L dem Fachmann nicht ohne weiteres verfügbar.
Obwohl die Aminosäure-Sequenz eines Zielproteins oder seinem Liganden wie CD40L bekannt ist, erlaubt diese Sequenz-Information darüber hinaus keine genaue Vorhersage der Kristall-Struktur des Protein/Liganden. Die Sequenzinformation bietet auch kein Verständnis der strukturellen, konformationellen und chemischen Wechselwirkungen zwischen einem Liganden wie CD40L und seinem Zielprotein.
Daher besteht ein Bedarf an detaillierter Kenntnis der kristallinen dreidimensionalen Struktur der extrazellulären Domäne von CD40L, um wirkungsvoll Verbindungen, die in der Lage sind, in die CD40L-CD40-Wechselwirkungen einzugreifen, zu entwerfen, zu durchmustern oder zu optimieren. Obwohl die Bindung von CD40 und seinen Liganden untersucht wurde, und Ähnlichkeiten zwischen diesem System und dem TNF-System gefunden wurden, legen die vorhandenen Unterschiede nahe, dass diese zwei Ligand-Rezeptor-Systeme räumlich überlappende, aber nicht-identische und nicht-konservierte Stellen von Konrakt-Resten mit verschiedenen molekularen Bindungs-Determinanten verwenden.
Kristalle von CD40L oder Fragmenten von CD40L von einer Größe und Qualität, die die Durchführung von Röntgenbeugungsanalysen gestatten, würden einen Fachmann in die Lage versetzen, Untersuchungen über die Bindungseigenschaften von CD40L, sowie die Bindungseigenschaften von Molekülen oder Molekül-Komplexen, die mit CD40L oder einem Fragment davon assoziiert sind, durchzuführen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung auf Kristalle von CD40L oder Kristalle von Fragmenten von CD40L von ausreichender Größe und Qualität gerichtet, um nützliche Information über die Eigenschaften von CD40L und Molekülen oder Komplexen, die mit CD40L oder CD40 assoziiert sind, zu erhalten. Die beanspruchte Erfindung stellt die dreidimensionale Kristall-Struktur des CD40L-Fragments von Gly116 bis Leu261 bereit, das verwendet werden kann, um Bindungsstellen zu identifizieren, um die Struktur von unbekannten Kristallen zu lösen, um Mutanten mit wünschenswerten Bindungseigenschafen bereitzustellen, und letztlich um Moleküle oder chemische Einheiten zu charakterisieren oder zu identifizieren, die in der Lage sind, in die Wechselwirkung zwischen CD40 und CD40L einzugreifen, zu entwerfen.
Zusätzliche Eigenschaften und Vorteile der Endung werden in der folgenden Beschreibung dargestellt, und werden zum Teil aus der Beschreibung ersichtlich oder bei der praktischen Anwendung der Endung erlernt. Die Zielsetzungen und andere Vorteile der Endung werden durch die Zusammensetzungen und Methoden, die ausführlich in der geschriebenen Beschreibung und den Ansprüchen hiervon, sowie in den angefügten Abbildungen dargelegt werden, verwirklicht und erreicht.
Zum Erreichen dieser und anderer Vorteile und in Übereinstimmung mit dem Zweck der Erfindung, wie sie hierin verkörpert und ausführlich beschrieben ist, betrifft die Erfindung einen Kristall von CD40L. Insbesondere betrifft die Endung einen Kristall, der aus einem funktionellen Fragment der extrazellulären Domäne von sCD40L(116-261) gebildet wird, wobei der Kristall die Zellkonstanten a = b = 77,17 × 10^–10 M (Å), c = 90,46 × 10^–10 M (Å), α = β = 90°, γ = 120°, und eine Raumgruppe R3 besitzt, sowie Äquivalente dieses Kristalls. Die beanspruchten Kristalle von CD40L sind im wesentlichen durch die identifizierten Struktur-Koordinaten in Tabelle 1 beschrieben. Die beanspruchten Kristalle in bestimmten Ausführungsformen sind durch eine Bindungsstellen-Einheit charakterisiert, die einschließt: Ile127, Ser128, Glu129, Ala130, Ser131, Thr135, Ser136, Ala141, Glu142, Lys143, Gly144, Tyr145, Tyr146, Cys178, Asn180, Ser185, Gln186, Ala187, Pro188, Ile190, Ala191, Ser192, Ser197, Pro198, Gly199, Arg200, Phe201, Glu202, Arg203, Ile204, Arg207, Ala209, Thr211, Pro217, Cys218, Gly219, Gln220, Glu230, Leu231, Gln232, Asn240, Val241, Thr242, Asp243, Ser245, Val247, Ser248, His249, Gly250, Thr251, Gly252 und Phe253.
Zusätzlich betrifft die Erfindung Kristalle von Molekülen mit einer Bindungsstelle, die mindestens Arg207 und vorzugsweise die Aminosäuren Lys143, Arg203, Arg207 und Tyr145 umfasst. Die beanspruchten Kristalle in bestimmten Ausführungsformen werden von Molekülen gebildet, die eine Bindungsstellen-Einheit besitzen, die Arg207 umgeben von wenigstens zwei hydrophoben Resten einschließt. Mutanten, Homologe, Co-Komplexe und Fragmente der beanspruchten Kristalle werden hier ebenfalls betrachtet.
In bestimmten Ausführungsformen betrifft die beanspruchte Erfindung Schweratomderivate der kristallisierten Form von sCD40L(116-261) und spezieller die Schweratomderivate der vorstehend beschriebenen kristallisierten Form von CD40L. In verschiedenen Ausführungsformen betrifft die beanspruchte Erfindung Verfahren zur Herstellung von kristallinen Formen von CD40L oder Fragmenten davon durch Bereitstellung einer wässrigen Lösung, die wenigstens ein Fragment von CD40L einschließt, Bereitstellung einer Reservoir-Lösung, die ein präzipitierendes Agens umfasst, Vermischen eines Volumens der CD40L-Lösung mit einem Volumen der Reservoir-Lösung und Kristallisation des daraus hervorgegangenen gemischten Volumens. In bestimmten Ausführungsformen stammt der Kristall von einer wässrigen Lösung, die sCD40L(116-261) einschließt. In bestimmten Ausführungsformen beträgt die Konzentration von CD40L in der wässrigen Lösung ungefähr 1 bis ungefähr 50 mg/ml, vorzugsweise ungefähr 5 mg/ml bis ungefähr 15 mg/ml und in der am stärksten bevorzugten Ausführungsform ungefähr 10 mg/ml. Das in der Erfindung verwendete präzipitierende Agens kann irgendein in der Fachwelt bekanntes präzipitierendes Agens sein, vorzugsweise ist es eines, das aus der Gruppe bestehend aus Natriumcitrat, Ammoniumsulfat und Polyethylenglycol gewählt wird. Jede Konzentration des präzipitierenden Agens kann in der Reservoir-Lösung verwendet werden, jedoch wird vorgezogen, dass die Konzentration ungefähr 1,0 M bis ungefähr 1,5 M beträgt, mehr bevorzugt wird eine Konzentration von 1,2 M. Gleichermaßen kann der pH-Wert der Reservoir-Lösung variien werden, vorzugsweise zwischen ungefähr 4 bis ungefähr 10, am stärksten vorgezogen wird ein pH-Wert von ungefähr 7,5.
Verschiedene Kristallisations-Methoden einschließlich – aber nicht beschränkt auf – Dampfdiffusions-, Batch-, Flüssigbrücken- oder Dialyse-Kristallisation können in der beanspruchten Endung verwendet werden. Dampfdiffusions-Kristallisation wird vorgezogen.
Zusätzlich betrifft die beanspruchte Erfindung Verfahren zur Verwendung des beanspruchten Kristalls und der Struktur-Koordinaten bei Verfahren zum Screening, Entwurf oder Optimierung von Molekülen oder anderen chemischen Einheiten, die in die Wechselwirkung zwischen CD40 und CD40L eingreifen können. Daher können die Struktur-Koordinaten von CD40L oder Teilen davon dazu verwendet werden, die Kristall-Struktur einer Mutante, eines Homologen oder Co-Komplexes von CD40L oder einem Fragment davon zu lösen, sowie um andere unbekannte Kristalle, die mit CD40L oder Fragmenten davon assoziiert sind, zu lösen.
In manchen Ausführungsformen können die Struktur-Koordinaten von CD40L dazu verwendet werden, um eine chemische Einheit zu bewerten, um Informationen über die Bindung der chemischen Einheit an CD40L zu erhalten. Die beanspruchte Erfindung betrifft auch die in Tabelle 1 beschriebenen Struktur-Koordinaten. Die Struktur-Koordinaten können dazu verwendet werden, um chemische Einheiten zu charakterisieren, die in die Beziehung zwischen CD40 oder CD40L eingreifen, wie Inhibitoren oder Agonisten. Die Koordinaten können auch dazu verwendet werden, um die Bindungseigenschaften zu optimieren, um die Orientierung der Liganden an der Bindungsstelle von CD40L oder CD40 zu bestimmen. Der Fachmann wird die zahlreichen Verwendungsmöglichkeiten der beanspruchten Erfindung auf den Gebieten des Arzneimittel-Designs, des Screenings und der Optimierung von Arzneimittel-Anwärtern, sowie bei der Bestimmung von zusätzlichen unbekannten Kristall-Strukturen schätzen.
In verschiedenen Ausführungsformen betrifft die beanspruchte Erfindung ein maschinenlesbares Datenspeichermedium, wobei ein Datenspeichermaterial codiert mit maschinenlesbaren Daten vorliegt, das, wenn es von einer geeigneten Maschine gelesen wird, eine dreidimensionale Wiedergabe eines Kristalls bildlich darstellen kann. Die dargestellten Kristalle umfassen ein Fragment von CD40L wie das durch die Koordinaten in Tabelle 1 beschriebene oder einen Kristall mit einer Bindungsstelle, welche die Aminosäuren Lys143, Arg203, Arg207 und Tyr145 einschließt.
In anderen Ausführungsformen betrifft die beanspruchte Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von wenigstens einem Teil einer dreidimensionalen Struktur einer chemischen Einheit oder eines molekularen Komplexes durch Errechnung von Phasen aus den Struktur-Koordinaten eines Kristalls eines Fragments des CD40-Liganden, Errechnung der Elektronendichtekarte aus den erhaltenen Phasen, und dann der Bestimmung von wenigstens einem Teil der unbekannten Struktur, die auf der Elektronendichtekarte beruht.
In noch anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung Verfahren zur Bewertung der Fähigkeit einer chemischen Einheit mit CD40 oder CD40L zu assoziieren. Die Verfahren verwenden computergestützte oder experimentelle Mittel um einen Anpassungsvorgang zwischen der chemischen Einheit und CD40 oder CD40L durchzuführen, um Daten bezüglich der Assoziation zu erhalten, und zur Analyse der Daten, um die Charakteristika zu bestimmen. Auf diesem Weg identifizierte chemische Einheiten, die in der Lage sind, in die in vivo- oder in vitro-Assoziation zwischen CD40 und CD40L einzugreifen, sind auch in der beanspruchten Erfindung mit eingeschlossen. Die beanspruchten chemischen Einheiten können Bindungsstellen umfassen, die im wesentlichen ähnlich der von CD40L sind, oder können alternativ Bindungsstellen einschließen, die in der Lage sind, mit den Bindungsstellen von CD40L zu assoziieren.
Es ist dahingehend zu verstehen, dass sowohl die vorangegangene allgemeine Beschreibung und die folgende detaillierte Beschreibung beispielhaft und erklärend sind und dazu gedacht sind, eine weitere Darlegung der beanspruchten Erfindung zu liefern.
Die begleitenden Abbildungen sind eingeschlossen, um ein weiteres Verständnis der Erfindung bereitzustellen und sind in dieser Beschreibung eingebaut und stellen einen Teil davon dar, sie veranschaulichen einige Ausführungsformen der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung der Erklärung der Prinzipien der Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine Abbildung der repräsentativen Bereiche einer bei 2,5σ umrissenen 2F_o-F_c-Elektronendichtekarte, die die Reste in der Nachbarschaft der CD40-Bindungsstelle zeigt.
2 ist eine Elektronendichtekarte, die eine Ansicht eines Netzwerks von 3 Tyrosin- und 3 Histidin-Resten zeigt, das in der Nachbarschaft des Zentrums des Trimers von CD40 gebildet wird.
3 ist eine Stereo-Zeichnung der 3-dimensionalen Struktur des menschlichen CD40L, speziell dem CD40L Cα-Grundgerüst.
4 ist eine Bänder-Darstellung und Sekundärstruktur-Zuordnung von CD40L.
5 ist ein Sequenzvergleich der TNF-artigen Domänen von TNFα, Ltα und CD40L basierend auf strukturellen Erwägungen.
6 ist ein Graph von Temperaturfaktoren von Atomen der Hauptkette als Funktion der Anzahl der Reste. Reste sind mit Pro120 als Rest 1 nummeriert.
7 ist eine Darstellung von Resten, die an Hyper-IgM und entworfenen Mutationen beteiligt sind. Das dritte Monomer wurde aus Gründen der Klarheit entfernt.
8 ist eine Zusammenfassung von kristallographischen Daten und Verfeinerungs-Daten von sCD40L(116-261).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Damit die hierin beschriebene Erfindung vollständiger verstanden werden kann, wird die folgende detaillierte Beschreibung angeschlossen.
Die vorliegende Endung betrifft einen Kristall eines löslichen Fragments der extrazellulären Domäne des CD40-Liganden. Insbesondere betrifft es einen Kristall eines Proteins, das die Sequenz von Gly116 bis Leu261 (sCD40L(116-261)) einschließt, die durch Röntgenstrukturanalyse bestimmte Struktur von sCD40L(116-261) und die Verwendung der Struktur von sCD40L(116-261) und die seiner Homologen, Mutanten und Co-Komplexen zum Entwurf, der Identifizierung, dem Screening und/oder der Optimierung von Inhibitor- oder Agonisten-Anwärtern der Aktivität von CD40L.
A. DEFINITIONEN
Der Begriff CD40-Ligand („CD40L"), wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Art von Polypeptiden, die in der Lage sind, an CD40 oder Homologe oder Fragmente davon zu binden. Der Begriff, wie er hierin verwendet wird, beinhaltet sCD40L(116-261), Homologe, Mutanten, Äquivalente und Fragmente davon.
Der Begriff „Co-Komplex" bezieht sich auf CD40L oder eine Mutante oder ein Homologes von CD40L in kovalenter oder nicht-kovalenter Assoziation mit einer chemischen Einheit.
Der Begriff „Homologes" bezieht sich auf ein Protein, das wenigstens ungefähr 50% Aminosäuresequenz-Identität mit dem Protein, mit dem es verglichen wird, besitzt.
Der Begriff „Mutante" bezieht sich auf CD40L oder ein Fragment davon, das durch Ersatz, Entfernung oder Einfügung von wenigstens einer Aminosäure des Wildtyps charakterisiert ist. Eine solche Mutante kann beispielsweise durch Expression von CD40L, dessen kodierende Sequenz vorher mithilfe von Oligonukleotid-gelenkter Mutagenese verändert wurde, hergestellt werden.
Der Begriff „positiv geladene Aminosäure" beinhaltet eine beliebige natürliche oder nicht-natürliche Amiosäure, die unter normalen physiologischen Bedingungen eine positiv geladene Seitenkette besitzt. Beispiele natürlich vorkommender positiv geladener Aminosäuren sind Arginin, Lysin und Histidin.
Der Begriff „negativ geladene Aminosäure" beinhaltet eine beliebige natürliche oder nicht-natürliche Aminosäure, die unter normalen physiologischen Bedingungen eine negativ geladene Seitenkette besitzt. Beispiele natürlich vorkommender negativ geladener Aminosäuren sind Asparaginsäure und Glutaminsäure.
Der Begriff „hydrophobe Aminosäure" bedeutet eine beliebige Aminosäure, die eine ungeladene, nichtpolare Seitenkette besitzt, die in Wasser relativ unlöslich ist. Beispiele sind Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin.
Der Begriff „hydrophile Aminosäure" bedeutet eine beliebige Aminosäure, die eine ungeladene, polare Seitenkette besitzt, die in Wasser relativ löslich ist. Beispiele sind Serin, Threonin, Tyrosin, Asparagin, Glutamin und Cystein.
Der Begriff „veränderte Oberflächenladung" bedeutet eine Veränderung in einer oder mehreren Ladungseinheiten eines mutierten Polypeptids bei physiologischem pH-Wert im Vergleich zum CD40-Ligand. Die Veränderung der Oberflächenladung kann durch Messung des isoelektrischen Punkts (pI) des Polypeptid-Moleküls, das die substituierte Aminosäure enthält, und durch den Vergleich mit dem pI des Wildtyp-Moleküls, bestimmt werden.
Der Begriff „assoziiert mit" bezieht sich auf einen Zustand der Nähe zwischen zwei chemischen Einheiten oder Teilen davon, zum Beispiel eines CD40-Liganden oder Teilen davon und einer chemischen Einheit. Die Assoziation kann nicht-kovalent sein, wobei die Nebeneinanderlage durch Wasserstoffbrückenbindung, van der Waals-Wechselwirkung oder elektrostatische Wechselwirkung energetisch begünstigt sein kann, oder es kann sich um eine kovalente Assoziation handeln.
Der Begriff „Bindungsstelle" bezieht sich auf eine beliebige oder alle Stellen, an denen eine chemische Einheit gebunden ist oder mit einer anderen Einheit assoziiert ist.
Der Begriff „Struktur-Koordinaten" bezieht sich auf die Koordinaten, die von mathematischen Gleichungen abgeleitet sind, die sich auf die Muster beziehen, die bei der Beugung eines monochromatischen Röntgenstrahl durch die Atome (Streuungs-Zentren) der Moleküle in der Kristallform erhalten wurden. Die Beugungsdaten werden zur Berechnung einer Elektronendichtekarte der Wiederholungseinheiten des Kristalls verwendet.
Es ist für Fachleute ersichtlich, dass die erhaltenen Daten von dem speziellen System, das verwendet wurde, abhängig sind, und dass daher unterschiedliche Koordinaten tatsächlich denselben Kristall beschreiben können, falls solche Koordinaten im wesentlichen dieselbe Beziehung beschreiben, wie diejenigen, die hierin beschrieben sind. Die Elektronendichtekarten werden zur Festsetzung der Positionen der einzelnen Atome innerhalb der Elementarzelle des Kristalls verwendet.
Es ist für Fachleute ersichtlich, dass ein Satz mithilfe von Röntgenkristallographie bestimmten Struktur-Koordinaten nicht frei von einem Standardfehler ist. Tabelle 1 stellt die Atom-Koordinaten von sCD40L(116-261) dar. Für den Zweck dieser Erfindung soll jeder Satz Struktur-Koordinaten von CD40L(116-261), bei dem die mittlere quadratische Abweichung äquivalenter Atome des Protein-Grundgerüst weniger als etwa 2 × 10^–10 M (Å) beträgt, wenn er unter Verwendung der Atome des Grundgerüsts den Struktur-Koordinaten in Tabelle 1 überlagert wird, als identisch angesehen werden. Vorzugsweise beträgt die Abweichung weniger als etwa 1 × 10^–10 M (A) und noch mehr vorzuziehen ist eine Abweichung von weniger als etwa 0,5 × 10^–10 M (Å).
Der Begriff „Schweratom-Derivatisierung" bezieht sich auf eine Verfahren zur Herstellung einer chemisch modifizierten Form eines kristallisierten CD40-Liganden. In der Praxis wird ein Kristall in einer Lösung getränkt, die Schwermetallatom-Salze oder organometallische Verbindungen wie z. B. Bleichlorid, Goldthiomalat, Thimerosal- oder Uranylacetat enthält, die durch den Kristall diffundieren und an die Oberfläche des Proteins binden können. Die Position des (der) gebundenen Schwermetallatoms (Schwermetallatome) kann mithilfe von Röntgenbeugungsanalyse des getränkten Kristalls bestimmt werden. Diese Information kann dazu benutzt werden, um die Phaseninformation zu erzeugen, die zur Konstruktion der dreidimensionalen Struktur des Moleküls verwendet wird.
Der Begriff „Elementarzelle" bezieht sich auf einen Block in einer Grundform. Das gesamte Volumen eines Kristalls kann durch regelmäßiges Zusammensetzen solcher Blöcke konstruiert werden. Jede Elementarzelle schließt eine vollständige Darstellung des Elementarmusters dar, durch dessen Wiederholung der Kristall aufgebaut wird.
Der Begriff „Raumgruppe" bezieht sich auf die Anordnung von Symmetrieelementen eines Kristalls.
Der Begriff „molekularer Ersatz" bezieht sich auf eine Verfahren, welches die Erzeugung eines vorläufigen strukturellen Modells eines Kristalls, dessen Struktur-Koordinaten unbekannt sind, einschließt, indem ein Molekül, dessen Struktur-Koordinaten bekannt sind, z. B. die Koordinaten des CD40-Liganden in Tabelle 1, innerhalb der Elementarzelle des unbekannten Kristalls orientiert und positioniert wird, so dass das Ergebnis dem beobachteten Beugungsmuster des unbekannten Kristalls so gut wie möglich entspricht. Ausgehend von diesem Modell können dann die Phasen errechnet werden und mit den beobachteten Amplituden kombiniert werden, so dass man eine angenäherte Fourier-Synthese der Struktur, deren Koordinaten unbekannt sind, erhält. Dies kann wiederum jeder beliebigen von einigen Arten der Verfeinerung unterzogen werden, so dass eine endgültige, genaue Struktur des unbekannten Kitstalls bereitgestellt wird. (Siehe z. B. Lattman, E., „Use of the Rotation and Translation Functions", Methods in Enzymology, 115, S. 55–77 (1985); Rossman, Hrsg., "The Molecular Replacement Method", Int. Sci. Rev. Ser. Nr. 13, Gordon and Breach, New York (1972). Speziell durch Referenz hierin aufgenommen.) Unter Verwendung der Struktur-Koordinaten von CD40-Ligand, die durch diese Endung bereitgestellt werden, kann der molekulare Ersatz dazu verwendet werden, um die Struktur-Koordinaten eines kristallinen Co-Komplexes, eines unbekannten Liganden, einer Mutante, eines Homologen oder einer unterschiedlichen kristallinen Form des CD40-Liganden zu bestimmen. Zusätzlich können der beanspruchte Kristall und seine Koordinaten dazu verwendet werden, die Struktur-Koordinaten einer chemischen Einheit, die mit CD40L oder CD40 assoziiert ist, zu bestimmen.
Der Begriff „chemische Einheit", wie er hierin verwendet wird, soll zum Beispiel jedes Molekül, jeden molekularen Komplex, jede Verbindung oder jedes Fragment davon bedeuten.
CD40L-Mutanten können durch Stellen-spezifischen Einbau von natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren in CD40L unter Verwendung allgemeiner biosynthetischer Methoden, die dem Fachmann geläufig sind, hergestellt werden. Zum Beispiel kann das Codon, das die Aminosäure von Interesse im Wildtyp-CD40L codiert, durch ein „leeres" Nonsens-Codon wie TAG unter Verwendung von Oligonucleotid-gesteuerter Mutagenese ersetzt werden. Eine Suppressor-tRNA, die gegen dieses Codon gerichtet ist, kann dann in vitro mit der gewünschten Aminosäure chemisch aminoacetyliert werden. Die aminoacetylierte tRNA kann dann zu einem in vitro-Translationssystem zugegeben werden, wodurch man ein mutiertes sCD40L mit der Stellen-spezifisch eingebauten Aminosäure erhält.
Der Begriff lösliches Fragment von CD40L und jeder äquivalente Begriff, der hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein funktionelles Fragment von CD40L. Der Begriff „funktionell", wie er in diesem Zusammenhang verwendet wird, bezieht sich auf ein lösliches Fragment der extrazellulären Domäne, das in der Lage ist, an CD40, CD40-Ig-Fusionsprotein oder beliebige Fragmente oder Homologe davon, einschließlich molekulare Komplexe, die Fragmente davon einschließen, zu binden oder daran zu assoziieren. Eine derartige Bindung kann durch Immunopräzipitations-Expertmente unter Verwendung von Standard-Protokollen, die dem Fachmann geläufig sind, demonstriert werden.
A. CD40L, dessen Kristall und seine biologischen Implikationen
Es ist so zu verstehen, dass durchgehend in der Beschreibung und den Ansprüchen die örtliche Bestimmung der Position der beschriebenen Aminosäuren kein absoluter Wert ist, sondern vielmehr die relative Beziehung der Reste zueinander definiert. Es ist daher beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung die Sequenzen, die dieselben oder ähnliche relative Positionen besitzen, einschließt.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht erstmals die Verwendung von Techniken zum molekularen Entwurf für den Entwurf, das Durchmustern und die Optimierung von chemischen Einheiten und Verbindungen, einschließlich inhibitorischer Verbindungen, die in der Lage sind, das aktive Zentrum oder die Nebenbindungsstelle von CD40L, als ganzes oder zum Teil, zu binden. CD40-Ligand (CD40L) ist ein T-Zell- membrangebundenes pleiotropes Cytokin von bedeutendem biomedizinischem Interesse, weil es an wichtigen Funktionen des Immunsystems beteiligt ist, die durch die Bindung von CD40L an CD40 vermittelt werden. CD40 ist ein Molekül, das auf der Oberfläche von B-Zellen und anderen Zelltypen exprimiert wird. CD40L ist in verschiedenen Organismen wie Menschen, Mäusen, Ratten, Schweinen etc. vorhanden. Es ist nicht beabsichtigt, dass die beanspruchte Erfindung auf irgendeine bestimmte Spezies oder einen bestimmten Organismus beschränkt ist.
CD40L ist ein Mitglied der Tumor-Nekrosis-Faktor-Familie von Liganden. Die Kristallstruktur eines anderen Mitglieds dieser Familie, Lymphotoxin-α (LTα) im Komplex mit seinem Rezeptor, ist beschrieben und wurde als System zum Verständnis der Kristallstruktur von CD40L verwendet. Jedoch bestätigen die Unterschiede zwischen dem LT-System und dem CD40-System trotz gewisser Ähnlichkeiten, dass diese zwei Ligand-Rezeptor-Systeme räumlich überlappende, aber nicht identische und nicht-konservierte Stellen von Kontakt-Resten mit verschiedenen molekularen Bindungs-Determinanten verwenden.
Zieht man die Komplexität und die Überlappungen der verschiedenen Vorgänge im Immunsystem in Betracht, legt die Tatsache, dass die CD40-Signalwirkung nicht redundant zu sein scheint, nahe, dass eine Hemmung der CD40L-Signalwirkung wichtige therapeutische Anwendungen haben kann. Es wird erwartet, dass sich die hier bereitgestellte Kristallstruktur von CD40L als hilfreich beim Entwurf, der Identifizierung, Charakterisierung und Optimierung solcher therapeutischer Wirkstoffe erweisen wird.
Die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung des Anmelders schließt ein: (a) die Kristallstruktur von CD40L(116-261) und die Koordinaten davon, (b) die Bindungsstellen von CD40L, (c) Verfahren zur Herstellung eines CD40L-Kristalls und (d) Verfahren zur Verwendung des CD40L-Kristalls und dessen Struktur-Koordinaten.
(a.) Kristallstruktur des CD40-Ligands
Die beanspruchte Erfindung stellt Kristalle des CD40-Liganden, sowie die daraus bestimmte Struktur des CD40-Liganden bereit. Die beanspruchte Erfindung stellt speziell Kristalle eines Fragments des CD40-Liganden (116-261) bereit, die rhomboedrische Elementarzellen und die folgenden Ausmaße besitzen: a = b = 77,17 × 10^–10 M (Å) und c = 90,46 × 10^–10 M (Å), α = β = 90 × 10^–10 M (Å) und γ = 120 × 10^–10 M (Å). Beinahe alle Reste des CD40-Liganden-Fragments, außer den Resten 116–119 des N-Terminus, sind in der in 1 gezeigten endgültigen Elektronendichtekarte gut definiert. Es existieren Bereiche schwacher Intensität für die Reste 182–186 und 210 bis 220. Das gegenwärtige Modell besteht aus 142 Aminosäure-Resten und 95 Wassermolekülen mit einem kristallographischen R-Faktor von 21,8% und einem R_frei von 29,1% für Daten zwischen 7,5 × 10^–10 M (Å) und 2 × 10^–10 M (Å). Das Ramachandran-Diagramm zeigt, dass 140 der 142 Aminosäure-Reste (ϕ, ψ)-Winkel innerhalb der erlaubten Bereiche haben. Die Ausnahmen sind Rest Cys218, der an der Bildung einer Disulfid-Brücke beteiligt ist und Lys143.
CD40-Ligand ist als Sandwich zweier β-Faltblätter mit „Jellyroll"- oder „Greek key"-Topologie gefaltet (3). Die Ausmaße des Moleküls betragen 25 × 10^–10 M (Å) × 30 × 10^–10 M (Å) × 50 × 10^–10 M (Å). Die Faltung ist insgesamt ähnlich der von TNF-α und LT-α. Die hierin verwendete Darstellungsart für die β-Faltblätter und andere strukturelle Merkmale ist die in Eck et. al., „The Structure of Human Lymphotoxin", J. Biol. Chem., 267, 2119–2112 beschriebene. Ein β-Faltblatt besteht aus den Strängen A''AHCF und das andere aus den Strängen B'BGDE. Um das Ausmaß der strukturellen Ähnlichkeit zwischen TNF-α, LT-α und CD40 = Ligand abzuschätzen, wurden die Sequenzen so miteinander verglichen, dass sich eine größtmögliche Überlappung äquivalenter β-Strang-Reste ergab. Die äquivalenten Cα-Atome der β-Stränge wurden dann dazu verwendet, die molekularen Strukturen zu überlagern. Die mittlere quadratische (RMS) Positionsabweichung von 86 äquivalenten Cα-Atomen der überlagerten TNF-α- und CD40L-Moleküle beträgt 1,10 × 10^–10 M (Å). Im Falle des LT/CD40L-Paares beträgt die RMS-Abweichung für die 100 äquivalenten Cα-Atome 1,03 × 10^–10 M (Å). Die Positionen der Reste sind in den Kern- und β-Strang-Bereichen hoch konserviert, unterscheiden sich aber signifikant in bestimmten Schleifen, wie den AA'', CD und EF-Schleifen. Ein Vergleich der TNF-α, LT-α und CD40L-Sequenzen wurde auf Basis der besten strukturellen Überlagerungen angestellt. 5. Die meisten Reste des hydrophoben Kerns von CD40L behalten eine identische Beschaffenheit, zu der in den äquivalenten Resten von TNF und LT angetroffenen Beschaffenheit, bei. Es treten lokale kompensatorische, konformationelle Veränderungen zur Anpassung an Seitenketten-Veränderungen auf, wie der Austausch von Leu33 von LT-α nach Val36 in CD40L, der eine Verschiebung der Seitenkette von Leu161 zur Ausfüllung des leeren Raumes bewirkt.
Drei CD40L-Moleküle bilden ein Trimer ähnlich dem, das in den Kristallstrukturen von TNF-α und LT-α beobachtet wurde. Das Trimer hat die Form eines Pyramidenstumpfs. Die dreifache Achse des Trimers verläuft ungefähr parallel zu den β-Strängen jeder Untereinheit.
Die Grenzfläche zwischen den Untereinheiten wird hauptsächlich von zwei Tyrosinen, zwei Histidinen und einem Leucin gebildet. Daher ist das bei LT beobachtete „aromatic tiling" in CD40L nicht so vorherrschend. Tyr170 und His224 jedes Monomers bilden ein ungewöhnliches Cluster zweier Triaden entlang der dreifachen Achse des Trimers.
Die Kristallpackung der CD40L-Trimere wurde ebenfalls untersucht. Jedes CD40L-Monomer bildet einen Kristall-Kontakt aus, der die Schleifen DE (Reste 198–201), FG (232–233) und BC (64–166) eines Moleküls und die Schleifen CD (182–186), AA'' (131–135) und GH (245–246) des benachbarten Moleküls beinhaltet. Sechzehn Wassermoleküle sind an der Ausbildung des Kontakts beteiligt.
Die CD- und EF-Schleifen von CD40L auf der „Spitze" des Moleküls sind kürzer als die von TNF-α und LT-α. Jedoch enthält die CD-Schleife trotz ihrer geringeren Länge 1,5 Helix-Wendungen, ähnlich wie die der äquivalenten Schleife in LT. In diesen Schleifen treten Analoga zu LT-Bereichen mit geringer Elektronendichte auf, die Anzeichen für Ungeordnetheit sein können. Zusätzlich legt eine Darstellung von Temperatur-Faktoren (6) nahe, dass die CD- und EF-Schleifen die beweglichsten Teile des Moleküls sind. Die C- und F-Stränge sind durch eine Disulfid-Brücke zwischen Cys178 und Cys218, die eine Rolle bei der Stabilisierung der Spitze des Moleküls spielen könnte, verbunden. Auch in TNF ist eine Disulfid-Brücke vorhanden, diese befindet sich aber an einer anderen Position. Obwohl sich die AA''-Schleife zwischen TNF und LT nicht sehr unterscheidet, besitzt sie in CD40L eine ganz andere Struktur. In CD40L ist die AA''-Schleife in Relation zu TNF und LT von der CD40L-Bindungsstelle weg verschoben. Die ungewöhnliche Konformation der AA''-Schleife könnte in Beziehung zu deren umfangreicher Teilnahme am Kristall-Kontakt stehen. Innerhalb der GH-Schleife wird eine kurze 10-helikale Sturktur angetroffen und in der Mitte des E-Stranges tritt eine β-Wölbung auf. Die N- und C-Termini liegen eng nebeneinander an der Basis des Trimers. Die Reste 116–119 des N-Terminus des Konstrukts sind in der Elektronendichtekarte kaum definiert, daher ist Pro120 der erste gut geordnete Rest. Die Reste 116–119 bilden wahrscheinlich einen Teil des Stiels, der die globuläre Domäne mit dem Transmembran-Segment verbindet. Dieser 65 Reste lange Stiel ist ungewöhnlich lang verglichen mit den äquivalenten Segmenten anderer Mitglieder der TNF-Familie.
Eine einzige Glykosylierungs-Stelle wird von einer Analyse der CD40L-Sequenz vorhergesagt. Biochernische Experimente haben ergeben, dass an den Rest Asn240 des zur Kristallisation verwendeten CD40L-Proteins ein N-verknüpftes Kohlenhydrat angefügt ist.
Eine 2F-Fc-Karte zeigt die Elektronendichte in der Nachbarschaft der Seitenkette von Asn240, die wahrscheinlich dem angefügten Kohlenhydrat entspricht. Jedoch beinhaltet das gegenwärtige Modell kein Kohlenhydrat-Atom an dieser Stelle, weil die Dichte an dieser Stelle nicht gut definiert ist.
(b.) Bindungsstell
In Analogie mit der Kristallstruktur des LT-TNFR-Komplexes besteht die CD40-Bindungsstelle aus einer flachen Rinne, die zwischen zwei Monomeren ausgebildet wird. Der Aktivierungs-Komplex von CD40L-CD40 ist vermutlich ähnlich dem des LT-TNFR-Komplexes. Ausgehend von Verknüpfungs-Diagrammen, die zeigen, welcher Rest von LT mit welchem Rest von TNFR interagiert, wurde auf Abschnitte der CD40L-Sequenz geschlossen, die wahrscheinlich die Bindungsstelle von CD40L ausmachen.
Die Anmelder haben festgestellt, dass die CD40L-Bindungsstelle Arg207 in enger physischer Nachbarschaft zu wenigstens zwei hydrophoben Resten umfasst. Im Speziellen schließt die Bindungsstelle wenigstens die Aminosäuren Lys143, Arg203, Arg207 und Tyr145 ein. Zahlreiche andere Reste können in der Bindungsstelle mit eingeschlossen sein, einschließlich aber nicht beschränkt auf Ile127, Ser128, Glu129, Ala130, Ser131, Thr135, Ser136, Ala141, Glu142, Lys143, Gly144, Tyr145, Tyr146, Cys178, Asn180, Ser185, Gln186, Ala187, Pro188, Ile190, Ala191, Ser192, Ser197, Pro198, Gly199, Arg200, Phe201, Glu202, Arg203, Ile204, Arg207, Ala209, Thr211, Pro217, Cys218, Gly219, Gln220, Glu230, Leu231, Gln232, Asn240, Val241, Thr242, Asp243, Ser245, Val247, Ser248, His249, Gly250, Thr251, Gly252 und Phe253.
Ein Fachmann wird erkennen, dass Modifikationen der Bindungsstelle, z. B. Ersetzungen, Einfügungen oder Entfernungen vorgenommen werden können, und die Bindungsstelle ihre Aktivität beibehalten wird. Daher wird in Betracht gezogen, dass eine Bindungsstelle, die wenigstens 50% Homologie zu der vorstehend definierten aufweist, bei der Erfindung eingeschlossen ist. Im Speziellen besitzt sie vorzugsweise ungefähr 60% Homologie und noch stärker wird eine Homologie von etwa 75–99% vorgezogen. Variationen im Prozentsatz der Homologie der vorstehend definierten Bindungsstelle können die Bindungseigenschaften der daraus hervorgegangenen Einheit ändern. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bindungsstelle wenigstens 30 Reste von der vorstehend definierten Liste.
Es wurde erwartet, dass die Bindungsstelle hauptsächlich Reste der AA''- und DE-Schleifen enthält. Außerdem wurde erwartet, dass Reste der CD- und GH-Schleifen und B-, C-, D-, G- und H-Stränge an der CD40-Bindung beteiligt sind. In diesen Bereichen besteht so gut wie keine Sequenz-Konservierung zwischen CD40L und LT-α oder TNF-α. Obwohl Ser131 der AA''-Schleife im Sequenzvergleich konserviert zu sein scheint, zeigt die strukturelle Übereinanderlagerung, dass sie von der äquivalenten Position (Ser38) in LT relativ weit entfernt ist. Die Tyr45-Seitenkette der AA''-Schleife von CD40L ist ungeordnet, wird aber an äquivalenter Position bei Arg51 von LT gefunden, und könnte wie Arg51 im LT-α-TNFR-Komplex eine ausgestreckte und gut definierte Konformation im Komplex besitzen. In der DE-Schleife ist lediglich Phe201 konserviert (äquivalent zu Phe110 von LT). Phe201 nimmt eine ähnliche Konformation zu der von Phe110 im LT-α-TNFR-Komplex ein, während Phe110 im ungebundenen LT eine unterschiedliche Konformation annimmt. Die Arg200-Seitenkette in der DE-Schleife ist an einem Kristall-Kontakt beteiligt. Die Konformation der Schleifen DE AA'' und GH ist wahrscheinlich durch den Kristall-Kontakt beeinflusst, daher wird erwartet, dass dessen Struktur in einem Komplex anders ist. Die mit der im Falle von LT mit der Komplex-Bildung verbundene Konformationsänderungen könnten, obwohl sie gering sind, ein Hinweis auf die Größenordnung der Veränderungen sein, die bei der Bindung von CD40 an CD40L auftreten.
Eine Mischung von sowohl hydrophoben als auch hydrophilen Reste bilden die Oberfläche der Bindungsstelle. Die LT-TNFR-Bindungs-Schnittstelle kann als getrennte obere und untere Bereiche aufgefasst werden. Ähnlich wie LT, besitzt der obere Bereich in CD40L mehr hydrophobe und ungeladene polare Reste als der untere Bereich. Arg207 ist ein wichtiger Rest, der in dem Bereich liegt, an dem sich die unteren und oberen Bereiche treffen. Die Arg207-Seitenkette nimmt eine ausgestreckte Konformation ein, die in Richtung der vermutlichen Position des CD40-Rezeptors weist und ist von wenigstens zwei Oberflächenexponierten hydrophoben Resten und einem Serin-Rest (Ser192) umgeben. Zwei der hydrophoben Reste (190 und Phe253) gehören zu der benachbarten Untereinheit, während Ile204 von der selben Untereinheit stammt. CD40L von der Maus besitzt ein Lysin in der zu Arg207 äquivalenten Position des menschlichen CD40L, und dieses Lysin ist wahrscheinlich ebenfalls von hydrophoben Resten umgeben. Die hydrophobe Umgebung des Arginins könnte die Stärke einer möglichen elektrostatischen Wechselwirkung zwischen diesem Rest und einem sauren Rest von CD40 verstärken.
(c.) Verfahren zur Herstellung eines CD40L-Kristalls
In verschiedenen Ausführungsformen betrifft die beanspruchte Endung Verfahren zur Herstellung einer kristallinen Form von CD40L oder Fragmenten davon, indem zuerst eine wässrige Lösung, die CD40L oder ein Fragment von CD40L umfasst, bereitgestellt wird. Eine Reservoir-Lösung, die ein präzipitierendes Agens einschließt, wird dann mit einem Volumen der CD40L-Lösung vermischt und das daraus hervorgegangene gemischte Volumen wird dann kristallisiert. In bestimmten Ausführungsformen stammt der Kristall von einer wässrigen Lösung, die sCD40L(116-261) umfasst. Die Konzentration von CD40L in der wässrigen Lösungen kann variieren und beträgt vorzugsweise ungefähr 1 bis ungefähr 50 mg/ml, stärker bevorzugt wird eine Konzentration von ungefähr 5 mg/ml bis ungefähr 15 mg/ml und am meisten bevorzugt wird eine Konzentration von ungefähr 10 mg/ml. Gleichermaßen können die in der Erfindung verwendeten präzipitierenden Agenzien variieren und sie können aus irgendeinem in der Fachwelt bekannten präzipitierenden Agens ausgewählt werden. Vorzugsweise wird das präzipitierende Agens aus der Gruppe bestehend aus Natriumcitrat, Ammoniumsulfat und Polyethylenglycol, ausgewählt. Es kann jede Konzentration an präzipitierendem Agens in der Reservoir-Lösung verwendet werden, jedoch beträgt die Konzentration vorzugsweise ungefähr 1,0 M bis ungefähr 1,5 M, noch mehr bevorzugt wird eine Konzentration von ungefähr 1,2 M. Der pH-Wert der Reservoir-Lösung kann ebenfalls variiert werden, vorzugsweise zwischen ungefähr 4 bis ungefähr 10, am meisten bevorzugt wird ein pH-Wert von ungefähr 7,5. Ein Fachmann wird verstehen, dass jeder dieser Parameter ohne unangebrachtes Experimentieren verändert werden kann, und man immer noch annehmbare Kristalle erhalten wird. In der Praxis kann, wenn einmal die geeigneten präzipitierenden Agenzien, Puffer oder andere experimentelle Variablen für eine beliebige Kristallzüchtungs-Methode bestimmt wurden, jede dieser Methoden oder jede andere Methode dazu benutzt werden, die beanspruchten Kristalle zu züchten. Ein Fachmann ist in der Lage, die Variablen entsprechend seinen speziellen Erfordernissen zu bestimmen.
Verschiedene Kristallisationsverfahren können in der beanspruchten Endung angewendet werden einschließlich aber nicht beschränkt auf Dampfdiffusions-, Batch-, Flüssigbrücken- oder Dialyse-Kristallisation. Dampfdiffusions-Kristallisation wird bevorzugt. Siehe z. B. McPherson et al., „Preparation and Analysis of Protein Crystals", Glick,. Hrsg., S. 82–159, John Wiley & Co. (1982); Jancarik et. al., "Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of protein", J. Appl. Cryst. 24, 409–411 (1991), speziell hierin durch Referenz aufgenommen.
Bei der Dampfdiffusions-Kristallisation wird ein kleines Volumen (z. B. ein paar Milliliter) einer Proteinlösung mit einer ein präzipitierendes Agens enthaltenden Lösung vermischt. Dieses gemischte Volumen wird über einer Vertiefung, die eine kleine Menge, z. B. ungefähr 1 ml einer präzipitierenden Lösung enthielt, schwebend aufgehängt. Die Dampfdiffusion des Tropfens in die Vertiefung wird zur Kristall-Bildung in dem Tropfen führen.
Das Dialyse-Kristallisationsverfahren macht von einer semipermeablen Größenausschluss-Membran Gebrauch, die das Protein zurückhält, aber die Diffusion kleiner Moleküle (Puffer und präzipitierende Agenzien) hinein und hinaus zulässt. Bei der Dialyse lässt man, anstatt das Protein und das präzipitierende Agens durch Verdunstung zu konzentrieren, das präzipitierende Agens langsam durch die Membran diffundieren, und reduziert dadurch die Löslichkeit des Proteins, während gleichzeitig die Proteinkonzentration konstant gehalten wird. Die Batch-Methode schließt im Allgemeinen die langsame Zugabe des präzipitierende Agens zu einer wässrigen Proteinlösung ein, bis die Lösung trüb wird; an diesem Punkt kann der Behälter verschlossen werden und eine Zeit lang ungestört stehen gelassen werden, bis die Kristallisation eintritt.
Daher beabsichtigen die Anmelder, dass die beanspruchte Erfindung jede beliebige bzw. alle Kristallisationsverfahren einschließt. Ein Fachmann kann eine beliebige dieser Methoden auswählen und die Parameter so variieren, dass die gewählte Methode den gewünschten Kristall bringt.
(d.) Verwendung des CD40L-Kristalls und dessen Koordinaten
Die beanspruchten Kristalle und die Koordinaten, die diese beschreiben, lassen den Einsatz von molekularen Entwurfstechniken zum Entwurf, der Auswahl und der Synthese chemischer Einheiten und Verbindungen zu, einschließlich inhibitorischen Verbindungen oder Agonisten, die in der Lage sind, an die Bindungsstelle von CD40L oder an CD40 teilweise oder ganz zu binden oder daran zu assoziieren.
Ein Ansatz, der durch diese Erfindung ermöglicht wird, ist die Verwendung der Struktur-Koordinaten von CD40L zum Entwurf chemischer Einheiten, die an CD40L binden oder assoziieren und die physikalischen Eigenschaften solcher Verbindungen auf verschiedene Arten beeinflussen. So können alle Eigenschaften wie, zum Beispiel, Löslichkeit, Affinität, Spezifität, Wirkungskraft, „on/off-rates" oder andere Bindungseigenschaften verändert und/oder optimiert werden.
Durch Sondieren eines CD40L-Kristalls mit einer Bibliothek verschiedener Einheiten können gewünschte chemische Einheiten entworfen werden, um optimale Stellen für Wechselwirkungen zwischen Anwärtern für chemische Einheiten und CD40L zu bestimmen. Zum Beispiel ermöglichen hochauflösende Röntgenbeugungsdaten, die von mit Lösungsmittel gesättigten Kristallen gewonnen wurden, die Bestimmung der Stellen, an denen jeder Typ von Lösungsmittel haftet. Kleine Moleküle, die fest an diese Stellen binden, können dann entworfen, synthetisiert und auf die gewünschte Aktivität getestet werden. Wenn einmal die gewünschte Aktivität erhalten wurde, können die Moleküle weiter optimiert werden.
Die beanspruchte Erfindung ermöglicht es ebenfalls, mithilfe von Computern Datenbanken kleiner Moleküle zu durchmustern oder mithilfe von Computern chemische Einheiten oder Verbindungen zu entwerfen, die ganz oder zum Teil an CD40 oder CD40L binden. Sie können auch dazu verwendet werden, die Kristallstruktur von Mutanten, Co-Komplexen oder der kristallinen Form jedes anderen Moleküls, das homolog zu wenigstens einem Teil von CD40L ist oder daran assoziieren kann, zu lösen.
Ein Verfahren, das zu diesem Zweck eingesetzt werden kann, ist der molekulare Ersatz. Eine unbekannte Kristallstruktur, die irgendeine unbekannte Struktur sein kann, so wie zum Beispiel eine andere Kristallform von CD40L, einer CD40L-Mutante, oder eines Co-Komplexes mit CD40, oder irgendein anderer unbekannter Kristall einer chemischen Einheit, die von Interesse ist und mit CD40L assoziiert ist, kann unter Verwendung der Struktur-Koordinaten dieser Erfindung, die in Tabelle 1 dargestellt sind, bestimmt werden. Co-Komplexe mit CD40L können einschließen ohne darauf beschränkt zu sein: CD40-CD40L, CD40L-kleines Molekül und CD40-abgeleitete Fragmente. Dieses Verfahren wird eine zutreffende, strukturelle Form des unbekannten Kristalls schneller und effizienter bereitstellen, als der Versuch, solche Informationen ohne die beanspruchte Endung zu bestimmen.
Die erhaltene Information kann daher dazu verwendet werden, mögliche Inhibitoren oder Agonisten von CD40L oder CD40 zu optimieren und, was noch wichtiger ist, neue Klassen chemischer Einheiten zu entwerfen und zu synthetisieren, die die Beziehung zwischen CD40L und CD40 beeinflussen.
Der Entwurf von Verbindungen die gemäß dieser Endung, die CD40L hemmen oder beeinflussen, schließt im Allgemeinen die Berücksichtigung von wenigstens zwei Faktoren ein. Erstens muss die Verbindung in der Lage sein, physisch oder strukturell mit CD40L oder CD40 zu assoziieren. Die Assoziation kann jede physische, strukturelle oder chemische Assoziation sein, wie zum Beispiel kovalente oder nicht-kovalente Bindung, van der Waals-Wechselwirkungen, hydrophobe oder elektrostatische Wechselwirkungen.
Zweitens muss die Verbindung in der Lage sein, eine Konformation einzunehmen, die es ihr erlaubt, mit CD40 oder CD40L zu assoziieren. Obwohl nicht alle Teile der Verbindung notwendigerweise an der Assoziation mit CD40 oder CD40L beteiligt sein müssen, können die Teile, die nicht daran teilnehmen, dennoch die Gesamtkonformation des Moleküls beeinflussen. Dies wiederum kann einen signifikanten Einfluss auf die gewünschte Verbindung haben. Solche Anforderungen an die Konformation schließen die gesamte dreidimensionale Struktur und die Ausrichtung der chemischen Einheit oder der chemischen Verbindung in Relation zur gesamten Bindungsstelle oder einem Teil davon ein.
Der potentielle hemmende oder bindende Einfluss einer chemischen Verbindung auf CD40 oder CD40L kann vor der eigentlichen Synthese und dem Test der Verbindung unter Verwendung von Computer-Modellierungstechniken analysiert werden. Wenn die theoretische Struktur der vorgegebenen Verbindung nahe legt, dass die Wechselwirkung und Assoziation zwischen ihr und CD40 oder CD40L nicht ausreicht, wird dem Bedarf nach Synthese und Test der Verbindung vorgebeugt. Wenn jedoch die Computer-Modellierung auf eine starke Wechselwirkung hindeutet, kann dann das Molekül synthetisiert und auf seine Fähigkeit, CD40 oder CD40L zu binden, getestet werden. So kann die teure und zeitaufwändige Synthese nicht funktionsfähiger Verbindungen vermieden werden.
Eine hemmende oder anders bindende Verbindung von CD40 oder CD40L kann mithilfe von Computern durch eine Reihe von Schritten eingeschätzt und entworfen werden, in denen chemische Einheiten oder Fragmente nach ihrer Fähigkeit durchmustert und ausgewählt werden, mit den individuellen Bindungsstellen von CD40L zu assoziieren.
Daher kann ein Fachmann eines von mehreren Verfahren verwenden, um chemische Einheiten oder Fragmente auf deren Fähigkeit durchzutesten mit CD40L und spezieller mit den individuellen Bindungsstellen von sCD40L(116-261) zu assoziieren. Dieser Vorgang kann mit der visuellen Prüfung von, zum Beispiel, der Bindungsstelle auf einem Computermonitor beginnen, basierend auf den CD40L-Koordinaten in Tabelle 1. Ausgewählte Fragmente oder chemische Einheiten können dann innerhalb einer individuellen Bindungstasche von CD40L in einer Vielzahl von Orientierungen positioniert oder „angedockt" werden. Das Andocken kann unter Verwendung von Software wie Quanta und Sybyl bewerkstelligt werden, gefolgt von Energie-Minimierung und Molekulardynamik mit Standard-Molekularmechanik-Kraftfeldern wie CHARM und AMBER.
Spezialisierte Computerprogramme können für die Auswahl interessanter Fragmente oder chemischer Einheiten verwendet werden. (GRID, erhältlich von der Oxford University, Oxford, UK; MCSS oder CATALYST, erhältlich von Molecular Simulations, Burlington, MA; AUTODOCK, erhältlich vom Scripps Research Institute, La Jolla, CA; DOCK erhältlich von der University of California, San Francisco, CA., XSITE, University College of London, UK.)
Sobald geeignete chemische Einheiten oder Fragmente ausgewählt wurden, können sie in einen Inhibitor oder Agonist assembliert werden. Die Assemblierung kann durch visuelle Prüfung der Beziehung der Fragmente zueinander auf dem auf einem Computermonitor dargestellten dreidimensionalen Bild, das auf die hierin offenbarten Struktur-Koordinaten bezogen ist, stattfinden.
Alternativ können die gewünschten chemischen Einheiten experimentell „de novo" unter Verwendung entweder einer leeren Bindungsstelle oder gegebenenfalls einschließlich eines Teils eines Moleküls mit der gewünschten Aktivität entworfen werden. So können zum Beispiel Festphasen-Durchmusterungs-Techniken zum Einsatz kommen, wobei entweder CD40L oder ein Fragment davon, oder ein Anwärter für eine zu prüfende chemische Einheit an eine feste Phase gebunden werden, um auf diese Weise potentielle Binder zur weiteren Untersuchung oder Optimierung zu identifizieren.
Grundsätzlich können alle beliebigen Techniken der molekularen Modellierung gemäß der Erfindung verwendet werden; diese Techniken sind dem Fachmann entweder bekannt oder stehen ihm leicht zur Verfügung. Es ist so zu verstehen, dass die Verfahren und Zusammensetzungen, die hierin offenbart werden, zur Identifizierung, dem Entwurf oder der Charakterisierung nicht nur von Einheiten, die an CD40L assoziieren oder binden, verwendet werden können, sondern alternativ zur Identifizierung, dem Entwurf oder der Charakterisierung von Einheiten, die wie CD40L an CD40 binden und dadurch die CD40L-CD40-Wechselwirkung zerstören. Die beanspruchte Erfindung ist dazu gedacht, diese Verfahren und Zusammensetzungen weitgehend einzuschließen.
Sobald eine Verbindung mithilfe der oben genannten Verfahren entworfen oder ausgewählt worden ist, kann die Effizienz, mit der diese Verbindung an CD40L binden kann, unter Verwendung von Computern oder in einer experimentellen Prüfung getestet und optimiert werden. Verschiedene Parameter können in Abhängigkeit vom gewünschten Ergebnis optimiert werden. Diese schließen ein ohne darauf beschränkt zu sein: Spezifität, Affinität, „on/off rates", Hydrophobizität, Löslichkeit und andere Charakteristika, die für den Fachmann leicht herauszufinden sind.
Daher können gegebenenfalls Substitutionen, Deletionen oder Insertionen in einigen der Bestandteile der chemischen Einheiten vorgenommen werden, um die Bindungseigenschaften zu verbessern oder zu modifizieren. Im Allgemeinen sind die anfänglichen Substitutionen konservativ, d. h. die Ersatzgruppe wird ungefähr dieselbe Größe, Gestalt, Hydrophobizität und Ladung besitzen wie die ursprüngliche Verbindung.
Die vorliegende Endung ermöglicht auch den Entwurf von Mutanten von CD40L und die Auflösung ihrer Kristallstruktur. Spezieller ermöglicht die beanspruchte Erfindung dem Fachmann, die Position von Bindungsstellen und Grenzflächen zu bestimmen und auf diese Weise Stellen zu identifizieren, an denen eine Mutation wünschenswert ist.
Zum Beispiel kann durch den Ersatz oder die Substitution einer oder mehrerer Aminosäure-Reste eine Mutation auf eine bestimmte Stelle oder eine Kombination von Stellen auf dem CD40L gerichtet sein. Solche Mutanten können veränderte Bindungseigenschaften besitzen, die erwünscht sein können oder nicht.
Die Mutanten können mithilfe einer beliebigen in der Fachwelt geläufigen Verfahren, wie zum Beispiel ortsspezifischer Mutagenese, Deletion oder Addition, hergestellt werden und dann auf eine beliebige Eigenschaft von Interesse getestet werden. Mutanten können zum Beispiel auf eine geänderte Ladung bei einem bestimmten pH-Wert, festere Bindung, höhere Spezifität etc. durchgetestet werden.
Die Struktur von CD40L legt nahe, dass die meisten wenn nicht alle der natürlicherweise vorkommenden Einzelstellen-HIGMS-Mutationen eher die Faltung und die Stabilität des Proteins beeinflussen als direkt die Bindungsstelle. In der Tat würde man erwarten, dass schwerwiegendere HIGMS-Mutationen, die Deletionen oder andere drastische Veränderungen einschließen, die Struktur weitaus mehr stören, als Einzelstellen-Mutationen. Außerdem haben sich nur zwei der sechs Bindungsstellen-Reste, die für die Mutagenese ausgewählt wurden, als kritisch für die CD40-Bindung erwiesen.
Eine ähnlich niedrige Trefferhäufigkeit wurde bei einer analogen Mutations-Studie von LTα gefunden. Van Ostade et al., „Structure activity studies of human tumour necrosis factors.", Protein Engineering 7: 5–22 (1994). Diese Beobachtung wirft die Frage auf, ob Mutationen individueller Reste der CD40L-Bindungsstelle generell ausreichen, um die CD40L-CD40-Bindung vollständig zu zerstören. Wenn sie nicht ausreichen, wird die durch CD40 vermittelte zelluläre Signalwirkung fortdauern und die Mutation wird klinisch nicht detektierbar sein. Dieses Verhalten steht im Einklang mit der Tatsache, dass in der Struktur des LTα-Rezeptors eine große Anzahl, nicht weniger als 38, LTα-Reste an der Bindungsgrenzfläche beteiligt sind. Die Grenzfläche ist ziemlich ausgedehnt (520 10^–10 M² (Å²)) und besitzt vermutlich ähnliche Ausmaße im CD40L-CD40-Komplex. Daher wird angenommen, dass jeder Rest nur einen kleinen Teil zur gesamten Bindungsenergie beisteuert. Dennoch wurde gezeigt, dass die Interaktion des menschlichen Wachstumshormon mit seinem Rezeptor ebenfalls einen großen Oberflächenbereich einschließt, aber relativ wenige Schlüssel-Reste den größten Teil der Bindungsenergie beisteuern.
Zusätzlich ist die beanspruchte Endung nützlich für die Optimierung kleiner Moleküle als potentieller Arzneimittel-Anwärter. Daher kann die beanspruchte Kristallstruktur auch dazu verwendet werden, Informationen über die Kristallstrukturen von Komplexen des CD40-Liganden mit kleinen Molekülen als Inhibitoren zu erhalten. Zum Beispiel kann, wenn das inhibitorische kleine Molekül mit dem CD40-Liganden co-kristallisiert ist, die Kristallstruktur des Komplexes durch molekularen Ersatz unter Verwendung der bekannten Koordinaten des CD40-Liganden zur Phasenberechnung gelöst werden. Eine solche Information ist zum Beispiel zur Bestimmung der Natur der Wechselwirkung zwischen dem CD40-Liganden und dem inhibitorischen kleinen Molekül nützlich und kann daher Modifikationen nahe legen, die die Bindungseigenschaften wie Affinität, Spezifität und Kinetiken verbessern würden.
Die schädlichen Effekte verschiedener HIGMS-Mutationen auf CD40L scheinen durch die Destabilisierung dessen Struktur verursacht zu sein. Trp140 beispielsweise ist ein großer hydrophober Rest, der im Inneren des Proteins eingebettet ist, und die Entfernung von dessen Seitenkette bei den HIGMS-Mutationen Trp140→Gly und Trp140→Arg führt offensichtlich zur Destabilisierung der Struktur. Das Valin, das bei der Val126→Ala-Mutation betroffen ist, ist ebenfalls an der Bildung des hydrophoben Kerns beteiligt. Leu155 ist nicht vollständig eingebettet, befindet sich aber in der Mitte des β-Stranges B. Die Einführung eines Prolins an dieser Position, wie bei der Leu155→Pro-HIGMS-Mutation kann die Ausbildung des Stranges zerstören. Das Verhalten der HIGMS-Mutation Ala235→Pro kann auf ähnliche Weise erklärt werden. Die Substitution von Gly144 bei der HIGMS-Mutation Gly144→Glu kann im Verlust der konformationellen Freiheit, die an dieser Position zur Bildung der Ecke der AA''-Schleife nötig ist, resultieren. Folglich wird die Positionierung der benachbarten Reste Lys143 und Tyr145, von denen bekannt ist, dass sie an der Bindung beteiligt sind, gestört. Eine interessante Beobachtung ist die Tatsache, dass alle der oben erwähnten Reste Anhäufungen zu sein scheinen: Trp140, Leu155 und Val126 sind an der Ausbildung eines Bereichs des hydrophoben Kerns beteiligt, der teilweise von den Strängen A, A'', B' und B gebildet wird. Lys143, Gly144 und Tyr145 sind exponierte Oberflächen-Reste der AA''-Schleife, die sehr nahe an den oben erwähnten hydrophoben Resten liegt. Das legt die Vermutung nahe, dass die Bindungskapazität von CD40 sehr empfindlich gegenüber Störungen dieses Bereichs von CD40L ist.
Die HIGMS-Mutationen Ala123→Glu, Gly227→Val und Thr211→Asp beeinflussen die Reste, die an der Bildung der Untereinheiten-Grenzfläche beteiligt sind. Ala123 liegt nahe am Boden des Trimers und befindet sich innerhalb der van der Waals-Distanz dreier hydrophober Reste (Leu168, Val228 und Leu261) der benachbarten Untereinheit. Gly227 ist gegen Tyr172 der benachbarten Untereinheit gepackt und Thr211 liegt auf der EF-Schleife nahe der Untereinheiten-Grenzfläche, wo es mit Arg181 der benachbarten Untereinheit zu interagieren scheint. Es wird erwartet, dass Mutationen, die an diesen Stellen größere Seitenketten einführen (z. B. Thr211→Asp), die Packung der Untereinheiten untereinander zerstören und möglicherweise die Trimerisierung verhindern. Daraus wird ersichtlich, dass die meisten der Einzelstellen-HIGMS-Mutationen die eher Faltung und die Stabilität von CD40L beeinflussen, als eine ummittelbare Rolle bei der CD40-Bindung zu spielen. Außerdem scheint nur die Mutation von zwei der neun angezielten Oberflächen-Resten die Bindung von CD40 zu beeinflussen.
Mutagenese-Untersuchungen an CD40L haben gezeigt, dass die Reste Tyr145 und Lys143 unmittelbar an der CD40-Bindung beteiligt sind. Die Kristallstruktur zeigt, dass beide Reste auf der AA''-Schleife liegen und Oberflächen-exponiert sind. 7. Die äquivalente Schleife in der LT-TNFR-Kristallstruktur ist an mehreren Ligand-Rezeptor-Kontakten beteiligt, was nahe legt, dass Ähnlichkeiten in der Bindung bestehen. Tyr145 liegt an der Ecke der Schleife und seine Seitenkette besitzt keine erkennbare Elektronendichte, was nahe legt, dass es sich in einem ungeordneten Zustand befindet. Das Atom N1 von Lys143 bildet eine Wasserstoffbrückenbindung mit Oδ1 von Glu129 aus. 2. Die Elektronendichtekarte zeigt auch, dass die Seitenkette von Lys143 eine zusätzliche Konformation einnimmt. Ser128 und Glu129, zwei an der HIGMS-Mutation Ser128→Arg Glu129→Gly beteiligte Reste befinden sich nahe bei Lys143 und sind in der Karte gut definiert. Ser128 ist beinahe vollständig eingebettet und seine Seitenketten-Hydroxylgruppe befindet sich innerhalb der Wasserstoffbrückenbindungs-Entfernung zu His249. Es wurde gezeigt, dass der Glu129→Gly-Austausch, der bei der HIGMS-Mutation gefunden wurde, einen Lösungsmittelzugänglichen Rest beeinflusst, der an der CD40-Bindung teilhaben könnte. Bajorath et al., „Identification of Residues on CD40 and its Ligand which are Critical for the Receptor-ligand interaction", Biochemistry 34, 1833–1844 (1995), speziell hierin durch Bezugnahme aufgenommen. Ein möglicher Anwärter dafür ist der exponierte Rest Lys143, und der Verlust von dessen Wasserstoffbrückenbindung mit Glu129 könnte dessen Konformation destabilisieren, was in einer verminderten CD40-Bindung resultieren würde. Alle diese Reste sind in der CD40L-Sequenz der Maus konserviert.
Fünf zusätzliche Einzelstellen-Mutationen, bei denen die Reste Ser131, Asn180, Phe201, Glu202 und Asn240 (an der Bindungsstelle gelegen) durch Alanin substituiert wurden, haben gezeigt, dass diese Reste nicht unbedingt für die CD40-Bindung nötig sind. Außerdem wurde von zwei anderen Mutationen an Positionen von Resten außerhalb der Bindungsstelle (Thr135 und Asp243) gezeigt, dass sie ebenfalls die Bindung nicht beeinflussen. Gemäß ihrer Struktur liegen Ser131 und Thr135 auf der AA''-Schleife und ihre Seitenketten sind nicht exponiert. Asn240, die Glykosylierungsstelle ist Lösungsmittelexponiert. Weil der angehängte Zucker vermutlich dazu führen würde, dass Asn240 nicht für die Interaktion mit CD40 zur Verfügung stünde, schließen wir daraus, dass Asn240 wahrscheinlich nicht an der CD40-Bindung beteiligt ist, was mit den Ergebnissen der Mutagenese übereinstimmt. Asp243 ist ein halb exponierter Rest und bildet eine Wasserstoffbrückenbindung mit Asn186 aus. Asn180 ist ein exponierter Rest an der Spitze des Moleküls. Seine Seitenkette bildet Wasserstoffbrückenbindungen zu den Resten 183 und 216 aus. Phe201 und Glu202 liegen beide auf der DE-Schleife im Bereich der Bindungsstelle und sind Lösungsmittel-exponiert.
C. BEISPIELE
1. Bestimmung der Kristallstrukrur von sCD40L(116-261)
A. Kristallisation
Puffer-Chemikalien wurden von Fisher (Boston, MA) bezogen. Das Durchtesten der Kristallisationsbedingungen wurden mit dem Crystal Screen^TM-Paket von Hampton Research (Riverside, CA) durchgeführt. Ein lösliches Fragment der extrazellulären Domäne des menschlichen CD40-Liganden, das die Aminosäure-Reste Gly116 bis zum C-terminalen Rest Leu261 enthält, wurde wie im folgenden dargestellt in löslicher Form hergestellt und gereinigt: Das Gen, das die sCD40L(116-261)-Aminosäuresequenz G116-L261 kodiert, wurde in den Pichia pastoris-Expressionsvektor pWS106 kloniert, und das sCD40L(116-261)-Protein wurde unter Verwendung von Standard-Protokollen exprimiert. Peitsch et al., „A B-D Model for the CD40 Ligand Predicts That it is a Compact Trimer Similar to the Tumor Necrosis Factors.", Int. Immunol. 5, 233–238. (1993). pWS106 ist eine Variante des Vektors pPIC9 (Invitrogen), in dem die NcoI-Stelle bei 3634 nt im 3'-AOX1-flankierenden Bereich durch ortsspezifische Mutation entfernt wurde. Die Zellen wurden aufgebrochen und das Medium wurde übernacht mit 20 mM Tris-HCl, pH 6,8 dialysiert und auf eine SP-Säule (Pharmacia) geladen. Das gebundene sCD40L wurde mit 2xPBS, pH 7,2 eluiert, und der Puffer wurde durch 1xPBS ausgetauscht.
Der Protein-Bestand wurde als Lösung von 8 mg/ml sCD40L in PBS-Puffer (20,44 g/l Na₂HPO₄, 7,73 g/l Na₂HPO₄-H₂O, 87,66 g/lt NaCl) nutzbar gemacht. Kristalle wurden mithilfe der Dampfdiffusions-Methode gezüchtet (siehe Jancarik et. al.). Zur Bestimmung der Kristallisationsbedingungen wurde ein unvollständiger faktorieller Screen durchgeführt. In einem typischen Experiment wurde Proteinlösung mit einem gleichen Volumen Reservoir-Lösung vermischt, und ein Tropfen des Gemischs wurde unter einem Glasüberzug über der Reservoir-Lösung schwebend aufgehängt. Kristalle wurden ausgehend von einer 1,4 M Na-Citrat, 50 mM Na-Hepes pH 7,5-Reservoir-Lösung gezüchtet. Die Kristalle haben die Form von Würfeln, können einfach reproduziert werden und können maximale Ausmaße von beinahe 1 mm auf jeder Seite erreichen (die optimale Konzentration an präzipitierendem Agens zum Erhalt der größten Kristalle beträgt 1,2 M Na-Citrat). Die Veränderung des pH-Werts zwischen 7 und 8 hatte keinen Einfluss auf die Qualität der Kristalle. Macroseeding-Techniken konnten ebenfalls erfolgreich eingesetzt werden, obwohl sie nicht notwendig waren, um Kristalle ausreichender Qualität zur Datensammlung zu erhalten. Die Kristall- Zusammensetzung wurde nach Waschen, Lösen in Wasser und SDS-Gel-Elektrophorese untersucht. Das Gel wies eine starke Bande von ungefähr 20.000 Dalton und eine viel schwächere Bande von 17.000 Dalton auf. Die schwächere Bande entspricht dem nicht-glykosylierten Protein, während die stärkere Bande der glykosylierten Form entspricht.
Ein Fachmann wird erkennen, dass die besagten Kristallisationsbedingungen variiert werden können. Durch Variation der Kristallisationsbedingungen können andere Kristall-Formen von sCD40L erhalten werden. Solche Variationen können alleine oder in Kombination eingesetzt werden und schließen ein: Variation der endgültigen Protein-Konzentrationen zwischen 5 mg/ml und 35 mg/ml; Variation des Verhältnisses von sCD40L zu dem präzipitierenden Agens; Variation der Citrat-Konzentrationen zwischen 1,2 M und 2,0 nM; Variation des pH-Bereichs zwischen 5,5 und 9,5; Variation der HEPES-Konzentrationen zwischen 5 und 395 mM; Variation der Konzentration oder des Typs Detergens; Variation der Temperatur zwischen –5°C und 30°C; und Kristallisation von sCD40L mithilfe der Batch-, Flüssigbrücken-, oder Dialyse-Methode unter Verwendung der oben genannten Bedingungen oder Variationen davon. Siehe McPherson, A. (1982). Preparation and Analysis of Protein Crystals. (Glick, Hrsg.) S. 82–159, John Wiley & Co., N.Y., hierin speziell durch Bezugnahme aufgenommen.
B. Daten-Sammlung und -Verarbeitung
Kristalle wurden in das Innere von Kapillarröhrchen platziert und mit einem Röntgenstrahl eines Elliot GX-13-Generators auf ihre Beugungs-Kapazität getestet. Oszillations-Photographien zeigten starke Beugung für eine hohe Auflösung. Eine anfängliche Begutachtung der Photographien ließ auf ein beinahe würfelförmiges Gitter schließen.
Ein großer Kristall (0,8 × 0,8 × 0,8 mm) wurde stufenweise in einer vor Kälte schützenden Lösung aus 20% Glycerin, 1,2 M Na Citrat, 50 mM Na Hepes pH 7,5 äquilibriert, auf eine Öse aufgebracht und unmittelbar anschließend in einem –150°C kalten Gasstrom aus flüssigem Stickstoff gefroren. Die Technik des Einfrierens der Kristalle macht diese im wesentlichen unzerstörbar und hat Daten von viel besserer Qualität hervorgebracht. Ein nativer Röntgenstrahlen-Datensatz einer Auflösung von bis zu 1,75 × 10^–10 M (A) wurde unter Verwendung eines Nicolet/Siemens Multiwire Area Detector (Siemens, Inc.) gesammelt. Die Daten wurden unter Verwendung von BUDDHA (25) und dem Programm-Paket CCP4 (The SERC (UK) Collaborative Computing Project No 4, Daresbury Laboratory, UK 1979) integriert und reduziert. Die Sammlung der Daten benötigte ungefähr 5 Tage.
Die Datenverarbeitung deutete auf eine rhomboedrische Elementarzelle mit den ungefähren Zell-Ausmaßen a = b = c = 55 × 10^–10 M (A) und a = b = γ = 91. Zur Unterstützung der Berechnungen wird stattdessen eine hexagonale Elementarzelle mit den Ausmaßen a = b = 77,17 × 10^–10 M (Å), c = 90,46 × 10^–10 M (Å), γ = 120 Grad definiert. Die Verschmelzung der Daten hat nahegelegt, dass die Raumgruppe R3 ist. Falls die Raumgruppe R3 angenommen wird, beträgt R_{Verschmelzung} 6,7%. Wird die Raumgruppe R32 angenommen, beträgt R_{Verschmelzung} 16,6%. Tabelle 1 enthält Informationen über den erhaltenen Datensatz.
Berechnung des Matthews-Volumen ergibt VM = 533.610 A³/Z*MW = 2,97, für Z = 9 (#der asymmetrischen Einheiten in der Elementarzelle) und MW = 20.000 Dalton. Eck et al., J. Biol. Chem. 267, 2119–2112 (1992), hierin speziell durch Bezugnahme aufgenommen. Daher war anfänglich nicht eindeutig, ob sich in der asymmetrischen Einheit ein oder zwei Monomere befanden.
C. Molekularer Ersatz
Jeder weitere computerunterstützte molekulare Ersatz und jede Verfeinerung wurde mithilfe des XPLOR Programm-Pakets durchgeführt. Die graphischen Bearbeitungen des Moleküls wurden mithilfe der QUANTA-Software (Molecular Simulations, Inc.) durchgeführt. Sowohl XPLOR als auch QUANTA wurden an einem Silicon Graphics Indigo2 Computer-Arbeitsplatz betrieben.
Um zu untersuchen, ob eine nicht-kristallographische Symmetrie vorhanden war, wurde die Eigendrehungs-Funktion mit 8–4 × 10^–10 M (Å)-Daten berechnet. Für Φ = 90°, Ψ = 90°, κ = 180° wurde ein sehr hoher Spitzenwert gefunden, der der kristallographischen 3-fachen Achse entspricht. Das deckt sich mit der 3-fachen Achse des sCD40L-Trimers. Weniger hohe Spitzenwerte haben sich für Φ = 0°, Ψ = 30°, κ = 180° und Φ = 0°, Ψ = 90°, κ = 180° und Φ = 0°, Ψ = 150°, κ = 180° ergeben, die einer 2-fachen Achse senkrecht zu der 3-fachen entsprechen. Keine dieser Achsen entsprach einer nicht-kristallographischen Symmetrie.
Ein 3-dimensionales Modell des menschlichen sCD40L wurde unter Verwendung des CD40L-Modells der Maus als Rahmen und unter Verwendung der QUANTA Protein-Homologie-Modellierungs-Software erstellt. Dieses Modell wurde als Probe für die Berechnungen des molekularen Ersatzes verwendet.
Die Berechnung der Kreuz-Rotationsfunktion unter Verwendung eines 2,5° Winkelgitters und 8–4 × 10^–10 M (Å)-Daten erzeugte bei den Euler-Winkeln θ₁ = 234,5°, θ₂ = 5,0°, θ₃ = 234,5° einen hohen Spitzenwert, der 4,5σ über dem Mittelwert lag. Die Drehung des Modells gemäß dieser Lösung und darauffolgende Erzeugung symmetrieverwandter Moleküle, die der 3-fachen kristallographischen Symmetrie entsprechen, bringt erwartungsgemäß ein Trimer mit der 3-fachen Achse parallel zur z-Achse hervor. Die genaue Drehungs-Auflösung wurde mithilfe der Patterson-Korrelation-Verfeinerung gefunden. Bei der Drehungs-Funktion wurde kein signifikanter zweiter Spitzenwert beobachtet.
Zur Durchführung der Translations-Suche wurde das Probenmodell gemäß dem ersten Spitzenwert der Translations-Suche gedreht und so translatiert, dass das Zentrum der Masse des Trimers auf der z-Achse zu liegen kommen würde. Es wurde angenommen, dass dies der erwaneten Position nahe kommen würde, da es schien, als ob die 3-fache Achse des Trimers auf der z-Achse der Elementarzelle liegen würde. Anfängliche Bemühungen, einen eindeutigen Spitzenwert in der Translations-Funktion auf der xy-Ebene zu finden, sind gescheitert. Verkürzte Probenmodelle, die hauptsächlich Reste des Kernbereichs enthielten und deren Struktur mit höherer Wahrscheinlichkeit zwischen verschiedenen Mitgliedern der TNF-Familie konserviert sein würde, erzeugten Translations-Funktionen mit einer Anhäufung von Spitzenwerten an Stellen, die in der Nähe der erwarteten Stellen lagen. Eines dieser verkürzten Modelle, das alle Proteingrundgerüst-Atome sowie die Seitenketten-Atome der Reste 8–12, 53–62, 90–93, 110–114 und 141–146 enthält, erzeugte einen Spitzenwert mit einem Korrelationskoeffizienten von 3,3σ über dem Mittelwert bei x = 0,053, y = 0,053. Dieser Spitzenwert war der höchste auf der Liste der Spitzenwerte und er war nahe an den erwarteten Positionen.
Durch die Erzeugung symmetrieverwandter Moleküle und deren Darstellung mithilfe von Computergraphik wurde festgestellt, dass sie in zufriedenstellender Weise in der Elementarzelle gepackt waren und dass dort nicht genug Raum für ein zweites Molekül zur Verfügung stand. Daraus haben wir geschlossen, dass sich dort nur ein Molekül in der asymmetrischen Einheit befand. Das Vorkommen einer 2-fachen Symmetrie bei der Eigendrehungs-Funktion ist anscheinend eine Folge der internen Symmetrie innerhalb des Moleküls, die möglicherweise in Beziehung zu dem hohen Gehalt an parallelen Strängen steht. In der Tat weist die Eigendrehungs-Funktion, die aus Struktur-Faktoren, die von dem Modell abgeleitet sind, errechnet wurde, Spitzenwerte auf, die der 2-fachen Symmetrie entsprechen.
D. Modellbildung und kristallographische Verfeinerung
Der stereochemische Parametersatz param19.pro von XPLOR wurde für alle Verfeinerungs-Berechnungen verwendet. Das partielle Modell, dass dazu verwendet wurde die Lösung der Translations-Funktion zu finden, wurde einer rigiden Körper-Verfeinerung unter Verwendung von 7,5–2,5 × 10^–10 M (Å)-Daten unterzogen. Nach der anfänglichen rigiden Körper-Verfeinerung betrugen die R und R_frei (29) Faktoren jeweils 49,9% bzw. 51,4%. Der Test-Datensatz, der zur Berechnung von R_frei verwendet wurde, enthielt 10% der Daten. Das partielle Modell wurde 40 Schritten konventioneller positioneller Verfeinerung und einem Zyklus simulierter Abkühlung bei einer anfänglichen Temperatur von T = 2500 K unterzogen. Die R und R_frei-Faktoren fielen auf 31,2% bzw. 43,1%. Um den systematischen Fehler des Modells zu verringern, wurde ein partielles Modell zur Kartenberechnung und Verfeinerung verwendet. Der verwendete Auflösungsbereich betrug 7,5–2,5 × 10^–10 M (Å). Auslassungs („omit")-Karten (30) des simulierten Umkristallisierens („annealing"), die durch konsequentes Weglassen von 10% des Modells jedes Mal berechnet wurden, haben gezeigt, welche Teile des Modells zur Phasenbestimmung verwendet werden konnten. Daher wurde das Modell so modifiziert, dass es lediglich Reste eingeschlossen hat, die auf Abkühlungs-Auslassungs-Karten ausreichend gut definiert waren. Das anfängliche Modell schloss 815 Atome von insgesamt 1374 Atomen des vollständigen Modells ein. 3F₀-F_c-Karten wurden für Zyklen der Modellbildung und -Verfeinerung verwendet. Typischerweise bestanden die Zyklen aus der Modellbildung, der positionellen Verfeinerung und der B-Faktor-Verfeinerung. Gelegentlich wurde ein simuliertes Abkühlen ("annealing") durchgeführt. Als sich die Phasen verbesserten, wurden mehr Atome zu dem Modell hinzugefügt. Anfänglich wurden jedem Strang gruppierte B-Faktoren zugewiesen (einer für Hauptketten- und einer für Seitenketten-Atome). Später wurden für jeden Rest gruppierte B-Faktoren und letztendlich individuelle atomare B-Faktoren verfeinert. Nur manuelle Struktur-Modifikationen, die nach der Verfeinerung in einem geringeren R_frei resultierten, wurden akzeptiert. Als R und R_frei 31,1% bzw. 36,4% erreicht hatten, wurde die Auflösung auf 2,25 × 10^–10 M (Å) und letztendlich auf 2 × 10^–10 M (Å) erweitert. Wassermoleküle wurden mithilfe des Hilfsprogramms X-solvate von QUANTA 4.1 zugefügt. Sowohl Belegungs- als auch Temperatur-Faktoren wurden für die Wassermoleküle verfeinert. 8 fasst die Information, die die kristallographischen Daten und die Verfeinerung betrifft, zusammen. Tabelle 1 listet die Atom-Koordinaten von sCD40L(116-261) auf.
Die Koordinaten der Kristallstruktur von sCD40L können für den strukturbasierten Entwurf kleiner Moleküle, die inhibitorisch auf CD40L wirken, zum computergestützten Arzneimittel-Design und zur iterativen Strukturoptimierung verwendet werden.
a. Computergestütztes Arzneimittel-Design
Inhibitorische kleine Moleküle können unter Verwendung computergestützter Methoden entworfen werden. Diese Methoden sind auch als „de novo drug design" bekannt. In Kürze dargestellt dienen die Koordinaten der Kristallstruktur von sCD40L als Eingabe für ein Computerprograrnm wie DOCK. Programme wie DOCK geben eine Liste von Strukturen kleiner Moleküle heraus, von denen angenommen wird, dass sie an CD40L binden. Diese Moleküle können dann mit biochemischen Untersuchungen auf Bindung von CD40L durchgetestet werden.
Typischerweise sind biochemische Untersuchungen, die Moleküle auf deren Fähigkeit testen, an CD40L zu binden, Untersuchungen vom Kompetitionstyp. Bei solchen Untersuchungen wird das Molekül zu der Untersuchungslösung gegeben und der Grad der Inhibierung wird unter Verwendung konventioneller Methoden gemessen.
b. Iterative Zyklen der Struktur-Optimierung
Die Kristallstruktur von Komplexen, die zwischen sCD40L und inhibitorischen kleinen Molekülen gebildet werden, kann gelöst werden. In Kürze dargestellt werden inhibitorische kleine Moleküle typischerweise unter Verwendung der Koordinaten der Kristallstruktur eines sCD40L entweder mithilfe der oben erwähnten computergestützten Methoden oder mithilfe des Durchsuchens von Bibliotheken kleiner Moleküle gefunden. Das inhibitorische kleine Molekül wird dann zusammen mit sCD40L co-kristallisiert und die Kristallstruktur des Komplexes wird mithilfe des molekularen Ersatzes gelöst. Für den molekularen Ersatz werden die Koordinaten eines sCD40L zur Berechnung der Phasen benötigt. Die Information, die aus diesen Experimenten gesammelt wurde, kann dann zur Optimierung der Struktur inhibitorischer kleiner Moleküle verwendet werden, indem aufgeklärt wird, auf welche Weise die kleinen Moleküle mit dem Zielprotein interagieren. Dies legt Wege zur Modifizierung des kleinen Moleküls nahe, mit denen dessen physicochemische Eigenschaften wie Affinität, Spezifität und Kinetik in Bezug auf das CD40L-Ziel verbessert werden können.
Außer dass sie notwendig für das computergestützte Arzneimittel-Design und die Struktur-Optimierung sind, sind die Kristall-Koordinaten von sCD40L nützlich zur Analyse der CD40L-Bindungsstelle. Durch eine solche Analyse wurde festgestellt, dass sich in der Nähe von Arg207 ein besonders attraktiver Bereich für einen Medikamenten-Angriffspunkt befindet. Arg207 liegt in einem Bereich, der von drei hydrophoben Resten und einem leicht hydrophoben Rest umgeben ist. Diese Gruppierung scheint eine Wand einer zwischen zwei CD40L-Monomeren gebildeten Bindungsaussparung zu demarkieren. Während an dieser Stelle theoretisch keine Bindung erwünscht ist, scheinen Asp84 oder Glu117 in CD40 wahrscheinlich mit CD40L an dieser Stelle zu interagieren. Die hydrophoben Reste, die Arg207 umgeben, könnten in einer erhöhten Stärke der elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen Arg207, Asp84 und Glu117 von CD40 zu resultieren. Speziell scheinen Glu117 und Asp84 wichtig zu sein. Die oben beschriebenen Beobachtungen und Hypothesen legen nahe, dass dieser Bereich signifikant zur Bindungsenergie der CD40L/CD40-Interaktionen beitragen kann, und daher ist er ein attraktives Ziel für den Entwurf von Inhibitoren. Untersuchungen von Mutationen einzelner Stellen können in Verbindung mit den oben beschriebenen Prozessen verwendet werden, um die Bindungsstelle weitergehend zu definieren.
Für den Fachmann wird es offensichtlich sein, dass verschiedene Modifikationen und Variationen bei den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Endung vorgenommen werden können, ohne sich vom Gedanken oder dem Rahmen der Endung zu entfernen. Es ist daher beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung die Modifikationen und Variationen dieser Erfindung abdeckt, vorausgesetzt dass diese sich innerhalb des Rahmens der angefügten Ansprüche und deren Äquivalente befinden.
Tabelle 1

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Kristalls eines CD40-Liganden, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer wässrigen Lösung, die ein Fragment eines CD40-Liganden umfasst; (b) Bereitstellen einer Reservoir-Lösung, die ein präzipitierendes Agens umfasst; (c) Mischen eines Volumens der wässrigen Lösung mit einem Volumen der Reservoir-Lösung, wodurch ein gemischtes Volumen gebildet wird; und (d) Kristallisieren von zumindest einem Teil des gemischten Volumens.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wässrige Lösung eines CD40-Liganden, die in Schritt (a) bereitgestellt wird, eine CD40-Liganden-Konzentration von etwa 1 bis etwa 50 mg pro ml aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die wässrige Lösung eine CD40-Liganden-Konzentration von etwa 5 mg pro ml bis etwa 15 mg pro ml aufweist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die wässrige Lösung eine CD40-Liganden-Konzentration von etwa 10 mg pro ml aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das präzipitierende Agens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Natriumcitrat, Ammoniumsulfat und Polyethylenglykol.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Konzentration des präzipitierenden Agens in der Reservoir-Lösung etwa 1,0 M bis etwa 1,5 M ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Konzentration des präzipitierenden Agens etwa 1,2 M ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der pH-Wert der Reservoir-Lösung etwa 4 bis etwa 10 ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der pH-Wert etwa 7,5 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei Schritt (d) durch Dampfdiffusionskristallisation, Batch-Kristallisation, Flüssigbrücken-Kristallisation oder Dialyse-Kristallisation erfolgt.
Kristall, der von einem funktionellen Fragment der extrazellulären Domäne des CD40-Liganden gebildet wird, der ungefähr die folgenden Zellkonstanten aufweist: a + b = 77,17 × 10^–10 M (Å), c = 90,46 × 10^–10 M (Å), α = β = 90°, γ = 120° und Raumgruppe R3.
Kristall des CD40-Liganden (116-261) nach Anspruch 11 oder ein Homolog davon, wobei der Kristall eine Bindungsstelle umfasst, welche die Aminosäuren Lys143, Arg203, Arg207 und Tyr145 umfasst.
Kristall nach Anspruch 11 oder 12 oder ein Homolog davon, wobei der Kristall Arg207 umfasst, das von mindestens zwei hydrophoben Resten umgeben ist.
Kristall nach Anspruch 12 oder 13, wobei der Kristall weiterhin zumindest 30 Aminosäuren umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Ile127, Ser128, Glu129, Ala130, Ser131, Thr135, Ser136, Ala141, Glu142, Gly144, Tyr146, Cys178, Asn180, Ser185, Gln186, Ala187, Pro188, Ile190, Ala191, Ser192, Ser197, Pro198, Gly199, Arg200, Phe201, Glu202, Ile204, Ala209, Thr211, Pro217, Cys218, Gly219, Gln220, Glu230, Leu231, Gln232, Asn240, Val241, Thr242, Asp243, Ser245, Val247, Ser248, His249, Gly250, Thr251, Gly252 and Phe253.
Verfahren zum Bestimmen von zumindest einem Teil einer dreidimensionalen Struktur eines molekularen Komplexes, wobei der Komplex zumindest ein Fragment eines CD40-Liganden umfasst, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bestimmen der Strukturkoordinaten eines Kristalls des Fragments eines CD40-Liganden; (b) Berechnen der Phasen aus den Strukturkoordinaten; (c) Berechnen einer Elektronendichtekarte aus den Phasen, die in Schritt (b) erhalten wurden; (d) Bestimmen der Struktur von zumindest einem Teil des Komplexes auf der Basis der Elektronendichtekarte.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Strukturkoordinaten, die in Schritt (a) verwendet werden, dieselben sind wie die in Tabelle 1 beschriebenen oder um weniger als etwa 2 Å von den in Tabelle 1 beschriebenen abweichen.
Verfahren zur Evaluierung der Fähigkeit einer chemischen Einheit zur Assoziation mit einem CD40-Ligand oder CD40, mit einem Fragment von CD40 oder einem CD40-Ligand oder mit einem Komplex, der einen CD40-Ligand, CD40 oder Homologe davon umfasst, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Anwenden von rechnerischen oder experimentellen Mitteln, um eine Zusammenpassungsüberprüfung zwischen der chemischen Einheit und dem CD40-Ligand oder CD40, einem Fragment oder einem Komplex davon auszuführen, wodurch Daten erhalten werden, die mit der Assoziation zusammenhängen; und (b) Analysieren der Daten, die in Schritt (a) erhalten wurden, um die Merkmale der Assoziation zwischen der chemischen Einheit und dem CD40-Ligand oder CD40, dem Fragment oder Komplex zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 17, das weiterhin das Identifizieren, Charakterisieren oder Entwerfen einer chemischen Einheit umfasst, die eine gewünschte Assoziation mit einem CD40-Ligand oder Fragment davon aufweist, indem die Strukturkoordinaten eines Kristalls eines CD40-Liganden nach einem der Ansprüche 11 bis 14 verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 18, das weiterhin den Schritt des Optimierens der Bindungseigenschaften der identifizierten, charakterisierten oder entworfenen chemischen Einheit umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19, das weiterhin den Schritt des Bestimmens der Orientierung von Liganden in einer Bindungsstelle des CD40-Liganden umfasst.
Schweratomderivat einer kristallisierten Form des CD40-Liganden.
Schweratomderivat des Kristalls nach einem der Ansprüche 11 bis 14.
Verwendung der Strukturkoordinaten eines CD40-Liganden oder Teilen davon, um eine Kristallform eines mutanten Homologen oder eines Co-Komplexes eines CD40-Liganden oder eines Fragments davon durch molecular replacement aufzulösen.
Verwendung eines Kristalls des CD40-Liganden nach einem der Ansprüche 11 bis 14 oder der Strukturkoordinaten davon für das rechnerische oder experimentelle Evaluieren einer chemischen Einheit, um Informationen über ihre Assoziation mit der Bindungsstelle des CD40-Liganden zu erhalten.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei der Kristall die in Tabelle 1 beschriebenen Strukturkoordinaten aufweist.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei der Kristall der gleiche ist wie der Kristall eines CD40-Liganden, der durch die Koordinaten in Tabelle 1 oder durch Koordinaten, die um weniger als etwa 2 Å von den Koordinaten in Tabelle 1 abweichen, beschrieben ist.
Verwendung eines CD40-Liganden-Kristalls nach einem der Ansprüche 11 bis 14, um die Bindungswechselwirkungen zwischen einer chemischen Einheit und einem CD40-Liganden zu bestimmen.
Maschinenlesbares Datenspeichermedium, umfassend ein Datenspeichermaterial, das mit maschinenlesbaren Daten codiert ist, das, wenn es von einer geeigneten Maschine gelesen wird, in der Lage ist, eine dreidimensionale Wiedergabe eines Kristalls eines Moleküls oder molekularen Komplexes darzustellen, das/der ein Fragment eines CD40L umfasst, das eine Bindungsstelle aufweist, die die Aminosäuren Lys143, Arg203, Arg207 und Tyr145 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, umfassend das Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20 und weiterhin das Formulieren der chemischen Einheit, die im letzten Schritt des Verfahrens nach einem der Ansprüche 17 bis 20 identifiziert wurde, in eine pharmazeutisch verträgliche Form.