DE69936445T2

DE69936445T2 - Kristallines tnf-alpha-konvertierendes enzym und verwendung davon

Info

Publication number: DE69936445T2
Application number: DE69936445T
Authority: DE
Inventors: Roy A. Seattle BLACK; Raymond James Bellevue PAXTON; Wolfram Bode; Klaus Maskos; Carlos Fernandez-Catalan; James Ming Bedminster CHEN; Jeremy Ian New City LEVIN
Original assignee: Max Planck Institut fuer Biochemie; Wyeth LLC; Immunex Corp
Current assignee: Max Planck Institut fuer Biochemie; Wyeth LLC; Immunex Corp
Priority date: 1998-02-04
Filing date: 1999-02-03
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2019-02-04
Also published as: JP2004503202A; IL163513A0; NO20003687D0; HUP0101596A1; AR015513A1; AU2574099A; CN1342200A; ES2293718T3; AR024804A1; DE69936445D1; ATE366303T1; EP1053304A2; EP1053304B1; IL137557A0; CA2319040A1; DK1053304T3; IL163513A; NZ505959A; WO1999040182A2; NO20003687L

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Zytokin Tumornekrosefaktor-α (TNFα) spielt eine Rolle bei der Auslösung entzündlicher Reaktionen und hat bekanntlich eine zytotoxische Wirkung gegenüber Tumorzellen. Wenn er im Übermaß erzeugt wird, kann TNFα aber auch große Schäden am menschlichen Körper hervorrufen und schließlich zu einem multiplen Organausfall und zum Tod führen (siehe Bemelmans et al., „Tumor Necrosis Factor: Function, Release and Clearance", Crit. Rev. Immun. 16: 1-11 (1996)).
Tumornekrosefaktor-α wird von aktivierten Zellen wie mononukleären Phagozyten, T-Zellen, B-Zellen, Mastzellen und NK-Zellen produziert. TNFα existiert in zwei Formen: einem Typ-II-Membranprotein mit einer relativen Molekülmasse von 26 kD und einer löslichen 17 kD Form, die aus der Membranform durch proteolytische Spaltung erzeugt wird. Das TNFα Membranprotein wird als ein 223 Aminosäuremembran-verankerter Vorläufer synthetisiert. Löslicher TNFα wird von dem membrangebundenen Vorläufer durch eine membranverankerte Proteinase freigesetzt. Diese Proteinase wurde kürzlich als eine Multidomänen-Metalloproteinase mit dem Namen „TNFα-converting enzyme" (TACE – TNAα-konvertierendes Enzym) identifiziert (siehe Black et al., „A metalloproteinase disintigrin that releases tumor-necrosis factor-α from cells", Nature 385: 729-733 (1997), Moss et al., „Cloning of a disintigrin metalloproteinase that processes precursor tumor-necrosis factor-α", Nature 385: 733-736 (1997)). TACE wurde jüngst als eine Zink-Endopeptidase identifiziert, die aus einer extrazellulären Region besteht, umfassend ein N-terminales Signalpeptid, eine Prodomäne, eine katalytische Domäne (TCD) mit 263 Resten, der eine Furinspaltstelle vorangeht (Reste 211-214), eine Disintegrin-Domäne, eine EGF-artige Domäne und eine Crambin-artige Domäne, eine scheinbare Transmembranhelix und den intrazellulären C-terminalen Schwanz. Das Tumornekrosefaktor-α-konvertierende Enzym (TACE), einschließlich einer Polynucleotidsequenz, ist ausführlich in der veröffentlichten PCT-Anmeldung Nr. WO 96/41624 beschrieben.
Wie oben erwähnt, birgt die Überproduktion oder unregulierte Produktion von TNFα große physiologische Gefahren. Er ist in verschiedenen schädlichen physiologischen Krankheiten wie Rheumatoidarthritis, Kachexie und endotoxischem Schock verwickelt. Er kann letztendlich auch zu Organausfall und zum Tod führen. Folglich wird eine Möglichkeit zur Kontrolle oder Blockierung der Freisetzung von TNFα in den Kreislauf benötigt. Aufgrund der Rolle von TACE bei der Umwandlung von TNFα würde eine Inhibition, Modulierung oder Regulierung von TACE die Freisetzung von TNFα in den Kreislauf beeinflussen. Inhibitoren von Metalloproteinasen und ihr strukturbasierter Entwurf sind in Zask et al., „Inhibition of Matrix Metalloproteinases: Structure Based Design" Current Pharmaceutical Design, 2:624-661 (1996) beschrieben. Verbindungen, die sich mit TACE assoziieren, wie Inhibitoren, Rezeptoren oder Modulatoren, sind somit für den Schutz von Patienten vor nachteiligen Effekten in Verbindung mit der Überproduktion oder unregulierten Produktion von Tumornekrosefaktor-α von Nutzen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die sich mit einem TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptid assoziiert. Das TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptid kann die katalytische Domäne des TNF-α-konvertierenden Enzyms umfassen. Ferner kann das TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptid das Expressionsprodukt eines Polynucleotids sein, das die Pro- und katalytische Domäne des TNF-α-konvertierenden Enzyms kodiert. Alternativ kann das TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptid das Expressionsprodukt eines Polynucleotids sein, das die Aminosäurereste 1-477 des TNF-α-konvertierenden Enzyms kodiert. Das Polynucleotid kann substituiert sein, so dass der Aminosäurerest Ser266 in Ala und der Aminosäurerest Asn452 in Gln geändert ist, wobei ein zweites Polynucleotid, das die Sequenz Gly-Ser-(His)₆ kodiert, mit dem C-Terminus fusioniert ist.
Die obigen Zusammensetzungen können ferner einen Bindungspartner beinhalten, der zur Co-Kristallisation mit dem TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptid geeignet ist. Der Bindungspartner kann ein Bindungspartner auf Hydroxamatbasis sein. Ferner kann der Bindungspartner N-{D,L-2-(Hydroxyaminocarbonyl)methyl-4-methylpentanoyl}-L-3-amino-2-dimethylbutanoyl-L-alanin,2-(amino)ethylamid sein.
Die obigen Zusammensetzungen können eine Kristallstruktur haben, die auf 2,0 Å beugt, sind monoklin, haben eine Einheitszelle, die vier kristallographisch unabhängige TNF-α-konvertierendes-Enzym-Katalysedomänen-(TCD)-Moleküle hat, wobei die TCD-Moleküle in einer asymmetrischen Einheit sind, und/oder haben die monokline Raumgruppe P2₁, wobei die Zelle die Konstanten a = 61,38 Å, b = 126,27 Å, c = 81,27 Å und β = 107,41° hat.
Ferner können die obigen Polypeptide durch die Strukturkoordinaten gemäß Tabelle 1 oder einen wesentlichen Teil davon gekennzeichnet sein.
Ein Verfahren zum Kristallisieren eines TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptids beinhaltet (A) das Vermischen einer Lösung, die ein TACE-Polypeptid und einen Bindungspartner umfasst, mit einem Kristallisationspuffer und (B) das Kristallisieren des Gemischs aus Schritt (A) durch „Drop"-Dampfdiffusion, um ein kristallines Präzipitat zu bilden. Das Verfahren beinhaltet ferner (C) das Übertragen von Keimen von dem kristallinen Präzipitat, das durch die Drop-Dampfdiffusion gebildet wurde, und einem Kristallisationspromotor in ein Gemisch aus einer konzentrierten Lösung, die ein TACE-Polypeptid und ein Bindungspartnersubstrat umfasst, und einem Kristallisationspuffer und (D) das Kristallisieren des Gemischs aus Schritt (C) durch „Drop"-Dampfdiffusion zur Bildung eines Kristalls. In einer anderen Ausgestaltung umfasst der Kristallisationspuffer 0,1 M Na-Citrat, pH 5,4, 20 % w/v PEG 4000 und 20 % v/v Isopropanol. In noch einer anderen Ausgestaltung ist der Bindungspartner N-{D,L-2-(Hydroxyaminocarbonyl)methyl-4-methylpentanoyl}-L-3-amino-2-dimethylbutanoyl-L-alanin, 2-(amino)ethylamid. In einer weiteren Ausgestaltung findet die Kristallisation bei einer Temperatur von 4 bis 20 Grad Celsius statt. In einer weiteren Ausgestaltung liegt die Lösung, die das TACE-Polypeptid und den Inhibitor umfasst, bei einer Konzentration von etwa 5 mg/ml bis etwa 12 mg/ml in einem Puffer. In einer weiteren Ausgestaltung wird die Lösung, die ein TACE-Polypeptid und den Bindungspartner umfasst, mit dem Kristallisationspuffer in einem Verhältnis von 1:1 vermischt.
Ein Tumornekrosefaktor-α-(TNF-α)-konvertierendes-Enzym-Kristall kann durch Co-Kristallisieren eines TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptids mit einem Co-Kristallisationssubstrat hergestellt werden.
Außerdem ist ein rechnerlesbares Medium möglich, auf dem Röntgenkristallkoordinatendaten für die katalytische Domäne des TNF-α-konvertierenden Enzyms oder eines Teils davon aufgezeichnet sind. Auf dem rechnerlesbaren Medium können die in Tabelle 1 dargelegten Röntgenkristallkoordinatendaten oder ein Teil davon aufgezeichnet sein. Das Medium kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus einer Diskette, einer Festplatte, einem Computerband, RAM, ROM, einer CD, DVD, einer Magnetplatte und einer Bildplatte. Auf dem rechnerlesbaren Medium können rechnerlesbare Daten aufgezeichnet werden, wobei das rechnerlesbare Medium, wenn es in Verbindung mit einer Maschine verwendet wird, die mit Befehlen zur Verwendung der Daten programmiert ist, Bildsignale zur Darstellung einer graphischen dreidimensionalen Repräsentation eines TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptids oder eines Teils davon erzeugen kann.
Ein System kann zum Untersuchen eines TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptids verwendet werden, wobei das genannte System Folgendes umfasst: (a) einen Speicher, der Informationen speichern kann, die wenigstens einen Teil eines TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptids repräsentieren, wobei der genannte Speicher wenigstens eine Speicherregion eines ersten Typs, die einen Satz räumlicher Koordinaten beinhaltet, die einen Ort in einem dreidimensionalen Raum angeben, und wenigstens eine Speicherregion eines zweiten Typs umfasst, die Informationen beinhaltet, die ein Charakteristikum von einer aus einer Mehrzahl von Aminosäuren repräsentieren, wobei die genannte Speicherregionen des zweiten Typs mit den genannten Speicherregionen des ersten Typs in dem genannten Speicher logisch assoziiert sind, um eine geometrische Anordnung von wenigstens einem Charakteristikum von dem genannten wenigstens einen Teil des genannten TNF-α-konvertierendes-Enzym-Peptids in dem genannten dreidimensionalen Raum zu repräsentieren; (b) einen mit dem genannten Speicher gekoppelten Prozessor für einen Zugriff auf die genannten Speicherregionen des ersten Typs und die genannten Speicherregionen des zweiten Typs, wobei der Prozessor Bildsignale zur Darstellung eines visuellen Bildes erzeugt, das ein dreidimensionales Bild von dem genannten wenigstens einen Charakteristikum des genannten wenigstens einen Teils des genannten TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptids in dem genannten dreidimensionalen Raum auf der Basis von Daten von dem genannten Speicher repräsentiert; und (c) ein mit dem genannten Prozessor gekoppeltes Display für den Empfang der genannten Bildsignale, wobei das Display ein visuelles dreidimensionales Bild des genannten wenigstens einen Charakteristikums des genannten wenigstens einen Teils des genannten TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptids in dem genannten dreidimensionalen Raum auf der Basis der genannten Bildsignale darstellt. Die Bildsignale können Signale zur Darstellung eines visuellen dreidimensionalen Bildes einer Bandstruktur von wenigstens einem Teil des genannten TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptids in dem genannten dreidimensionalen Raum beinhalten. In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung beinhalten die Bildsignale Signale zur Darstellung eines visuellen Bildes einer Festkörpermodellrepräsentation des genannten wenigstens einen Teils des genannten TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptids in dem genannten dreidimensionalen Raum. In noch einer anderen Ausgestaltung der Erfindung beinhalten die Bildsignale Signale zur Darstellung eines visuellen dreidimensionalen Bildes eines elektrostatischen Oberflächenpotentials von dem genannten wenigstens einen Teil des genannten TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptids in dem genannten dreidimensionalen Raum. In noch einer anderen Ausgestaltung der Erfindung beinhalten die Bildsignale Signale zur Darstellung eines visuellen dreidimensionalen Stereobildes von dem genannten wenigstens einen Teil des genannten TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptids in dem genannten dreidimensionalen Raum. In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung umfasst das System ferner ein Speichergerät, das Daten speichern kann, die eine geometrische Anordnung eines Charakteristikums einer anderen Zusammensetzung als dem genannten TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptid repräsentieren; und eine Bedieneroberfläche zum Empfangen von Befehlen von einem Bediener, wobei der genannte Prozessor mit dem genannten Speichergerät und mit der genannten Bedieneroberfläche gekoppelt ist und zusätzliche Bildsignale zur Darstellung der genannten geometrischen Anordnung des genannten Charakteristikums der genannten Zusammensetzung relativ zu dem genannten visuellen dreidimensionalen Bild des genannten wenigstens einen Charakteristikums des genannten wenigstens einen Teils des genannten TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptids auf dem genannten Display auf der Basis von Befehlen von der Bedieneroberfläche erzeugt. In einer Ausgestaltung ist das Speichergerät ein Bestandteil des genannten Speichers. In einer anderen Ausgestaltung umfasst das System mehrere Speicherregionen des ersten und des zweiten Typs.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Videospeicher bereitgestellt, der Informationen zur Erzeugung einer visuellen Anzeige von wenigstens einem Teil eines TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptids speichern kann, wobei der genannte Videospeicher Folgendes umfasst: (a) wenigstens eine Speicherregion des ersten Typs, wobei jede der genannten Speicherregionen des ersten Typs einen Satz räumlicher Koordinaten beinhaltet, die einen Ort in einem dreidimensionalen Raum angeben; und (b) wenigstens eine Speicherregion des zweite Typs, wobei jede der genannten Speicherregionen des zweiten Typs Informationen zur visuellen Darstellung eines Charakteristikums von einer aus einer Mehrzahl von Aminosäuren enthält; wobei die genannten Speicherregionen des zweiten Typs mit den genannten Speicherregionen des ersten Typs in dem genannten Videospeicher logisch assoziiert sind, um eine geometrische Anordnung von wenigstens einem Charakteristikum des genannten wenigstens einen Teils des genannten TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptids in dem genannten dreidimensionalen Raum zu repräsentieren. Die Speicherregionen des zweiten Typs können mit den genannten Speicherregionen des ersten Typs in dem genannten Videospeicher logisch assoziiert sein, um eine geometrische Anordnung von wenigstens einem Charakteristikum eines katalytischen Domänenteils des genannten TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptids in dem genannten dreidimensionalen Raum zu repräsentieren. Die Speicherregionen des ersten Typs und die genannten Speicherregionen des zweiten Typs können Regionen eines Halbleiterspeichers sein. Die Speicherregionen des ersten Typs und die genannten Speicherregionen des zweiten Typs können Regionen einer Bildplatte sein. Alternativ sind die Speicherregionen des ersten Typs und die genannten Speicherregionen des zweiten Typs Regionen eines Magnetspeichers. Der Videospeicher umfasst mehrere Speicherregionen des ersten und des zweiten Typs.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung bereitgestellt, die sich mit einem TNF-α-konvertierenden Enzym assoziiert, das die Schritte nach Anspruch 1 beinhaltet. In einer Ausgestaltung ist die assoziierende Verbindung ein Inhibitor, Mediator oder eine andere Verbindung, die die Aktivität des TNF-α-konvertierenden Enzyms reguliert. In einer anderen Ausgestaltung ist die assoziierende Verbindung ein kompetitiver Inhibitor, ein unkompetitiver Inhibitor oder ein nichtkompetitiver Inhibitor. In noch einer anderen Ausgestaltung sind die Koordinaten die Koordinaten der Tabelle 1 oder ein wesentlicher Teil davon. Der TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptidkristall umfasst die katalytische Domäne des TNF-α-konvertierenden Enzyms. In noch einer anderen Ausgestaltung ist das TNF-α- konvertierendes-Enzym-Polypeptid das Expressionsprodukt eines Polynucleotids, das die Pro- und katalytischen Domänen des TNF-α-konvertierenden Enzyms kodiert. In noch einer anderen Ausgestaltung ist das TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptid das Expressionsprodukt eines Polynucleotids, das die Aminosäurereste 1-477 des TNF-α-konvertierenden Enzyms kodiert. In einer weiteren Ausgestaltung ist das Polynucleotid so substituiert, dass der Aminosäurerest Ser266 in Ala und der Aminosäurerest Asn452 in Gln geändert ist, wobei ein zweites Polynucleotid, das die Sequenz Gly-Ser-(His)₆ kodiert, mit dem C-Terminus fusioniert ist. In einer weiteren Ausgestaltung wird das TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptidkristall mit einem Bindungspartner co-kristallisiert. In noch einer weiteren Ausgestaltung ist der Bindungspartner ein Bindungspartner auf Hydroxamatbasis oder N-{D,L-2-(Hydroxyaminocarbonyl)methyl-4-methylpentanoyl}-L-3-amino-2-dimethylbutanoyl-L-alanin, 2-(amino)ethylamid. In noch anderen Ausgestaltungen hat der TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptidkristall eine Kristallstruktur, die auf 2,0 Å beugt, ist monoklin, hat eine Einheitszelle, die vier kristallographisch unabhängige TNF-α-konvertierendes-Enzym-Katalysedomäne-(TCD)-Moleküle hat, wobei die TCD-Moleküle in einer asymmetrischen Einheit sind, und/oder gehört zur monoklinen Raumgruppe P2₁, wobei die Zelle die Konstanten a = 61,38 Å, b = 126,27 Å, c = 81,27 Å und β = 107,41° hat. In noch einer anderen Ausgestaltung der Erfindung ist die assoziierende Verbindung dafür vorgesehen, sich mit der S1' Region des TNF-α-konvertierenden Enzyms zu assoziieren. In noch einer anderen Ausgestaltung ist die assoziierende Verbindung dafür vorgesehen, sich mit der S1'S3' Tasche des TNF-α-konvertierenden Enzyms zu assoziieren. In noch anderen Ausgestaltungen der Erfindung ist die assoziierende Verbindung dafür vorgesehen, (i) einen Anteil einzubeziehen, der Zink chelatisiert, ii) eine Wasserstoffbindung mit Leu348 oder Gly349 des TNF-α-konvertierenden Enzyms zu bilden, (iii) eine nicht-polare Gruppe einzuführen, die die S1' Tasche des TNF-α-konvertierenden Enzyms belegt, (iv) eine Gruppe einzuführen, die innerhalb des die S1'-S3 Taschen des TNF-α-konvertierenden Enzyms verbindenden Kanals liegt und die einen angemessenen van-der-Waals-Kontakt mit dem Kanal macht, und/oder (v) eine Wasserstoffbindung mit Leu348 oder Gly349 auf den Rückgratamidgruppen des TNF-α-konvertierenden Enzyms zu bilden.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden für die Fachperson angesichts der hierin enthaltenen Lehren offensichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: 1 ist ein Banddiagramm der katalytischen TACE-Domäne (TCD). Die Kette beginnt unten links auf der hinteren Seite, läuft durch die Strukturelemente sI, hAI, hA, sII, hB, hB2, sIII, IV, IVa, sIVb, sV, hC, „Met-turn" und hD und endet oben links auf der hinteren Seite. Die drei Disulfide sind als Verbindungen dargestellt, wobei die Schwefelatome als kleine Sphären dargestellt sind. Das katalytische Zink (zentrale Sphäre) wird durch die drei Imidazole von His405, His409 und His415 und durch die Hydroxyl- und die Carbonylsauerstoffatome der Inhibitor-Hydroxamsäuregruppe ligandiert. Der Inhibitor, der die Interaktion von Primed-Site-Resten eines Peptidsubstrats nachahmt, ist vollständig dargestellt. 1 wurde mit SETOR erstellt (siehe Evans, S. „SETOR: Hardware Lighted Three-Dimensional Solid Model Representations of Macromolecules" J. Mol. Graph. 11: 134-138 (1993)).
2a und 2b: Die 2a und 2b sind Festkörperoberflächenrepräsentationen der katalytischen Domänen von TACE (TCD) (2a) und MMP-3 (2b). Das elektrostatische Oberflächenpotential ist von –15 (intensiv rot) bis 15 (intensiv blau) k₈T/e umrissen. Beide Aktivortspalten laufen von links nach rechts, wobei sich die katalytischen Zinkatome (Sphären) in der Mitte befinden. Mit Bezug auf TACE ist die volle Struktur des gebundenen Inhibitors dargestellt, mit einer Bindung seiner Isobutyl-(P1')- und seiner Ala-(P3')-Seitenketten in die tiefen S1' und die neuen S3' Taschen. Die Orientierung ist der in 1 ähnlich. Die 2a und 2b wurden mit GRASP erstellt (Nicolls, A., Bharadwaj, R. und Houig, B., „Grase – Graphical representation and analysis of surface properties", Biophys. 64, A166 (1993)).
3: In 3 sind die katalytischen Domänensequenzen von Adamalysin II (ADAM CROAD), TACE und humanem ADAM 10 (hADAMIO) jeweils gemäß ihrer topologischen Äquivalenz und Sequenzähnlichkeit ausgerichtet. Die Restenummern ergeben sich aus der generischen TACE-Nummerierung. Pfeile und Klammern repräsentieren β-Stränge und α-Helices im TACE.
4: 4 ist eine Stereosektion der endgültigen 2,0 Å Elektronendichte um das katalytische Zink (große, zentrale Sphäre), überlagert mit dem endgültigen TACE-Modell. Sichtbar sind die drei zinkligandierenden Imidazolringe von His405 (oben), His409 (links) und His415 (unten), „katalytisches" Glu406 und der Hydroxamsäureanteil des Inhibitors. Die Orientierung ist der in 1 ähnlich. 4 wurde mit TURBO-FRODO erstellt (siehe Roussel, A. & Cambilleau, C., „Turbo-Frodo in Silicon Graphics Geometry", Partners Directory, Silicon Graphics, Mountain View, CA (1989)).
5: 5 ist eine Überlagerung der Banddiagramme der katalytischen Domäne von TACE (hell) und Adamalysin (dunkel). Außerdem sind das katalytische Zink von TACE (Sphäre) und die drei (TACE) und zwei (Adamalysin) Disulfidbrücken dargestellt. Die Orientierung ist der in 1 ähnlich. 5 wurde mit GRASP erstellt.
6: 6 illustriert ein System zur Untersuchung eines TNF-α-konvertierenden Enzyms, einschließlich eines Videospeichers, der Informationen zum Erzeugen einer visuellen Anzeige von wenigstens einem Teil eines TNF-α-konvertierenden Enzyms speichert.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der Strukturkoordinaten eines TACE-Polypeptids, um die dreidimensionale Struktur eines TACE-Polypeptids zu verdeutlichen, sowie den Entwurf und die Entwicklung von Verbindungen, die sich mit TACE assoziieren. Die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur und Strukturkoordinaten, die gemäß der Erfindung bereitgestellt werden, ermöglicht es der Fachperson, Verbindungen herzustellen, die mit TACE interagieren. Solche interagierenden Verbindungen können mit einer Vielfalt von Techniken und Entwurfskriterien hergestellt werden, einschließlich solcher, die in Protein Engineering (Oxender und Fox, Hrsg.) offenbart sind (Alan R. Liss, Inc. 1987).
Der hierin verwendete Begriff TACE bezieht sich auf eine Gruppe von Polypeptiden, die die 26 kD Zellmembrangebundene Form von TNFα in die lösliche 17 kD Form umwandeln können, die die C-terminalen 156 Reste des TNFα-Proteins umfasst. TACE schließt Proteine mit der in der PCT-Anmeldung Nr. WO 96/41624 beschriebenen Aminosäuresequenz sowie jegliche der Proteine ein, die vorzugsweise nicht weniger als 50 Homologie, bevorzugter wenigstens 80 Homologie, noch bevorzugter 90 Homologie zu einer solchen Sequenz auf der Aminosäureebene haben. Außerdem bezieht sich TACE ferner auf die Expressionsprodukte von Nucleotidsequenzen, die in der PCT- Anmeldung Nr. WO 96/41624 offenbart sind. TACE schließt ferner das membrangebundene Protein und lösliche oder verkürzte Proteine ein, die den extrazellulären Teil des Proteins umfassen und die biologische Aktivität beibehalten und sekretiert werden können. Beispiele für solche Proteine sind in der PCT-Anmeldung Nr. WO 96/41624 beschrieben.
Die TACE Aminosäuresequenz oder ein beliebiger Teil oder Rest davon ist in Black et al., „A Metalloproteinase disintigrin that releases tumour-necrosis factor-α from cells", Nature 385: 729-733 (Feb. 1997) zu finden. Variationen in der Aminosäuresequenz von TACE liegen ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Alle hierin enthaltenen Verweise auf die TACE-Aminosäuresequenz beziehen sich auf die Sequenz in Black et al., supra.
Der hierin verwendete Begriff katalytische TACE-Domäne (TCD) bezieht sich auf den Teil eines TACE-Polypeptids zwischen den Resten 215 und 477, einschließlich der vorangehenden Furinspaltstelle (Reste 211-214), oder einen beliebigen Teil davon, der das Peptid PLAQAVRSSS spalten kann.
Expression, Isolation und Reinigung von TACE-Polypeptiden
Das Tumornekrosefaktor-α-konvertierende Enzym (TACE) ist in der veröffentlichten PCT-Anmeldung Nr. WO 96/41624 beschrieben. Die Anmeldung beschreibt isolierte Nucleinsäuren, die TACE oder Teile von TACE kodieren, Expressionsvektoren, die eine cDNA umfassen, die TACE oder Teile davon kodiert, und Wirtszellen, die mit den Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert sind, die eine cDNA umfassen, die TACE oder Teile von TACE kodiert. Die Anmeldung beschreibt ferner Verfahren zur Herstellung von TACE und Teilen davon, zum Beispiel durch Kultivieren transfizierter Zellen, die zur Exprimierung von TACE konstruiert sind, gefolgt von einer Reinigung des rekombinant produzierten TACE oder eines Teils davon. Verfahren zum Isolieren, Exprimieren und Reinigen eines TACE-Polypeptids sind ausführlich in der veröffentlichten PCT-Anmeldung Nr. WO 96/41624 beschrieben.
Gemäß der Erfindung wird cDNA, die das Signalpeptid, Pro- und katalytische Domänen von TACE, d.h. Aminosäurereste 1-477, kodiert, in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt und in einer geeigneten Zelllinie exprimiert. Die cDNA kann auch andere Regionen beinhalten, die die Expression erleichtern oder andere Ziele erreichen, die nicht vom Wesen der Erfindung abweichen, wie flankierende Regionen.
Die cDNAs, die das TACE-Polypeptid oder funktionelle Teile davon kodieren, wie die TCD, können durch Addition, Substitution, Deletion oder Insertion verändert werden. Solche Veränderungen können zum Beispiel vorgenommen werden, um eine Glycosylierung zu verhindern, die Bildung inkorrekter oder unerwünschter Disulfidbrücken zu verhindern und/oder die Expression zu verbessern. Beispiele für solche Veränderungen sind in der WO 96/41624 beschrieben, die mit den darin beschriebenen Verfahren und anderen konventionellen Verfahren durchgeführt werden können. TACE kann auch konjugiert werden. Solche Konjugate können Peptide umfassen, die zugegeben werden, um eine Reinigung und/oder Identifikation zu erleichtern. Zu solchen Peptiden gehören zum Beispiel Poly-His-Peptide. Die Konjugation ist im US-Patent Nr. 5,011,912 und Hopp et al., Biol Technology 6: 1204 (1988) beschrieben.
In einer Ausgestaltung der Erfindung kodiert die cDNA ein TNF-α-konvertierendes-Enzym-Polypeptid, umfassend das Signalpeptid, Pro- und katalytische Domänen des TACE (TCD), Reste 1-477, wobei Ser266 in Ala und Asn452 in Gln geändert ist. Diese Substitutionen sind zur Vermeidung einer N-verknüpften Glycosylierung nützlich. Darüber hinaus kann die Sequenz Gly-Ser(His)₆ zum C-Terminus hinzugefügt werden. Durch die Zugabe der Sequenz Gly-Ser(His)₆ wird die Reinigung des Polypeptids unter Verwendung von Metall-Chelat-Affinitätsharzen wie Ni-NTA-Harzen erleichtert.
Rekombinante Expressionsvektoren, die die Nucleotidsequenz enthalten, die TACE oder einen Teil davon kodiert, können mit allgemein bekannten Verfahren hergestellt werden. Zur Expression von TACE-Polypeptiden geeignete Wirtszellen sind u.a. prokaryotische, Hefe- und höhere eukaryotische Zellen. Vektoren und Wirtszellen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind in der WO 96/41624 beschrieben. Weitere Beispiele für geeignete Expressionssysteme, die zum Exprimieren eines rekombinanten TACE gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind u.a. Säugetier- oder Insekten-Wirtszellkulturexpressionssysteme wie Baculovirus-Systeme in Insektenzellen (siehe Luckow und Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)) und Säugetierzelllinien wie COS-7-Zellen (Gluzman et al., Cell 23:175 (1981)). Es sind weitere Beispiele in der Technik bekannt, die die in der WO 96/41624 beschriebenen beinhalten. In einer Ausgestaltung der Erfindung wird das TACE-Polypeptid in CHO-Zellen exprimiert. In dieser Ausgestaltung sekretieren die Zellen ein Gemisch aus TACE-Polypeptid, beginnend mit Val212 und Arg215.
In einer Ausgestaltung können stabile exprimierende Zellen durch Kultivieren der Zellen in einem Wirkstoff selektiert werden, der solche Zellen abtötet, die den Vektor nicht einbeziehen. Beispiele für geeignete Selektionsverfahren sind z.B. in Kaufman, R.J., „Selection and coamplification of heterologous genes in mammalian cells", Methods in Enzymology, 185:537-566 (1990), beschrieben.
Die Reinigung des exprimierten TACE-Polypeptids kann mit jedem beliebigen geeigneten Mittel erfolgen, wie den in der WO 96/41624 beschriebenen. Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird die Beschaffung eines TACE-Polypeptids bevorzugt, das zur Kristallisation geeignet ist. Bei der Beschaffung eines TACE-Polypeptids, das zur Kristallisation geeignet ist, ist es wichtig, dass der Prozess zur Reinigung des TACE-Polypeptids ausreicht, um ein Polypeptid zu erhalten, das rein genug ist, um ordnungsgemäß zu kristallisieren.
Ein bevorzugtes Reinigungsverfahren beginnt mit einer geeigneten Menge an Medium aus der Kultur von TACE-sekretierenden Zellen. Dieses Medium ist im Allgemeinen ein Supernatant der Kultur. Das Medium enthält das zu reinigende TACE-Polypeptid. Vorzugsweise wird das TACE-Polypeptid unter Verwendung von DNA, die das TACE-Polypeptid kodiert, rekombinant produziert, wobei die Sequenz so geändert wird, dass ein Konjugat oder Konjugate kodiert werden, die die Reinigung erleichtern. Die Sequenz, die Gly-Ser-(His)₆ kodiert, kann zum Beispiel zum C-Terminus hinzugefügt werden, um die Reinigung unter Verwendung von Metall-Chelat-Harzen zu erleichtern.
Das Medium wird zum Beispiel durch Diafiltration konzentriert. Zu geeigneten Diafiltrationseinheiten gehören eine TFF-Diafiltrationseinheit von Millipore (Cut-off 10.000, 1 ft²). Eine geeignete Pufferlösung wird dann zum konzentrierten Medium gegeben. Es kann jeder beliebige geeignete Puffer verwendet werden. Ein solcher geeigneter Puffer enthält 20 mM Tris (pH 7,5) und 300 mM NaCl.
Die Probe wird rekonzentriert und mehrere Male verdünnt. Die Probe kann zum Beispiel rekonzentriert und ein zweites Mal mit dem Puffer verdünnt werden, wieder rekonzentriert werden, ein drittes Mal mit dem Puffer verdünnt und ein letztes Mal rekonzentriert werden. Die in der Diafiltrationseinheit zurückgehaltene Probe wird mit einem geeigneten Verfahren gewonnen, wie z.B. mit einem Rückspülverfahren. Das gewonnene Material kann dann durch eine geeignete Membran filtriert werden. Geeignete Membranen sind z.B. Membranen mit einer Porengröße von 0,45 oder 0,22 Mikron. Anschließend wird Azid zugegeben. Die filtrierte Probe kann dann über Nacht bei niedriger Temperatur, z.B. etwa 2-9°C, gelagert werden. Nach der Übernachtlagerung werden Imidazol von einer Vorratslösung in Wasser und ZnCl₂ von einer Vorratslösung in Wasser zu der filtrierten Probe gegeben. Die Probe wird dann über eine geeignete Säule gepumpt. Eine geeignete Säule ist, vor allem dann, wenn das TACE-Polypeptid mit der Sequenz Gly-Ser-(His)₆ konjugiert ist, ein Metall-Chelat-Harz, wie Ni-NTA-Harz.
Die Säule wird mit einem Puffer gewaschen, z.B. mit einem Puffer, der 20 mM Tris, pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM Imidazol und 5 μM ZnCl₂ umfasst. Das TACE-Polypeptid wird dann mit einem zunehmenden Gradient von Imidazol eluiert. Fraktionen werden in Röhrchen aufgefangen, die Glycerol in Wasser Tris, pH 8, enthalten. Vorzugsweise wird die Glycerollösung am Tag des Säulenlaufs zubereitet.
Ein Aliquot von jeder Fraktion wird auf eine Membran getüpfelt, die mit Amidoschwarz gefärbt wird, um zu bestimmen, welche Fraktionen eine wesentliche Proteinmenge enthalten. Alternativ kann eine kleine Menge, z.B. 5 μl, von jeder Fraktion zur Gelanalyse mit Coomassie-Färbung verwendet werden. Die Fraktionen mit einer wesentlichen Proteinmenge werden gepoolt und der Pool wird anschließend zum Beispiel mit einer Diafiltrationseinheit konzentriert.
In einigen Fällen kann es zu einer Polypeptidaggregation kommen. Zur Beseitigung von Aggregaten und weiteren Erleichterung der Reinigung kann ein Inhibitor von TACE, wie ein Inhibitor auf Hydroxamatbasis, zur konzentrierten Probe von einer Vorratslösung in Wasser gegeben werden und Octylglucosid (im Handel von Boehringer Mannheim erhältlich) wird von einer Vorratslösung in Wasser zugegeben. Die Probe wird dann 15-24 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach der Inkubation wird die Probe auf eine Größenausschlusssäule aufgetragen. Die Säule wird zuerst mit einem geeigneten Puffer äquilibriert, wie z.B. einem Puffer aus 10 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 % Glycerol. Zu geeigneten Größenausschlusssäulen gehören zum Beispiel LKB 2135-365, gepackt mit TSK-G3000 SWG oder dergleichen, wie Superdex-200. Der Puffer wird anschließend durch die Säule gepumpt. Das hoch gereinigte TACE-Polypeptid kann durch Absorption bei 280 nm nachgewiesen werden.
Eine Gelanalyse aller Fraktionen mit wesentlichem Protein wird durchgeführt, um zu bestimmen, welche Fraktionen gepoolt werden sollten. Der Größenauschlusschromatographie-Pool wird zum Beispiel mit einer Diafiltrationseinheit konzentriert.
Ein Bindungspartner wie ein Inhibitor kann dann zur gereinigten Probe gegeben werden. Der Bindungspartner ist vor allem zur Stabilisierung des TACE-Polypeptids geeignet. Der Bindungspartner kann jede beliebige geeignete Verbindung sein. Geeignete Bindungspartner sind z.B. Inhibitoren auf Hydroxamatbasis. Ein geeigneter Inhibitor ist N-{D,L-2-(Hydroxyamino-carbonyl)methyl-4-methylpentanoyl}-L-3-amino-2-dimethylbutanoyl-L-alanin, 2-(amino)ethylamid. Dieser wie auch andere Inhibitoren sind im US-Patent Nr. 5,594,106 (Black et al.) beschrieben.
Der Proteinkomplex kann bei einer niedrigen Temperatur von beispielsweise etwa 4°C gelagert werden.
TACE-Kristall und Verfahren zur Kristallisierung von TACE-Polypeptiden
Ein Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Kristallisieren eines TACE-Polypeptids. Ein bevorzugtes Verfahren beinhaltet das Co-Kristallisieren eines TACE-Polypeptids mit einem Bindungspartner wie oben beschrieben. Beispielhafte Mittel zum Erzeugen des TACE-Polypeptids sowie die Reinigung des Polypeptids sind oben beschrieben.
Kristalle können mit jedem beliebigen geeigneten Verfahren wachsen gelassen oder gebildet werden, wie durch „Drop"-Dampfdiffusion, Batch, Flüssigkeitsbrücke und Dialyse, und unter beliebigen geeigneten Bedingungen. Eine Kristallisation durch Tropfdampfdiffusion wird oft bevorzugt. Darüber hinaus wird die Fachperson verstehen, dass die Kristallisationsbedingungen variiert werden können. In der Technik sind im Allgemeinen verschiedene Verfahren zur Kristallisierung von Polypeptiden bekannt (siehe z.B. die WO 95/35367 , WO 97/15588 , EP 646 599 A2 , GB 2 306 961 A und WO 97/08300 ).
In einer Ausgestaltung der Erfindung kann ein DNA-Konstrukt, das die TACE-Reste 1-477 umfasst, wobei Ser266 in Ala und Asn452 in Gln geändert ist und die Sequenz Gly-Ser-(His)₆ zum C-Terminus hinzugefügt wurde, in CHO-Zellen exprimiert werden. Diese Zellen sekretieren in erster Linie ein prozessiertes TACE-Gemisch, wobei etwa die Hälfte mit Val212 und etwa die Hälfte mit Arg 215 beginnt. Das Gemisch wird wie oben beschrieben gereinigt. Das gereinigte TACE-Polypeptid wird mit dem zugegebenen Bindungspartner in einem Puffer wie oben beschrieben gelagert.
TACE-Polypeptid und Bindungspartner werden co-kristallisiert. Die TACE/Bindungspartner-Lösung wird bei einer Polypeptidkonzentration von etwa 5 mg/ml bis etwa 12 mg/ml in einem oben beschrieben TACE-Puffer mit einem geeigneten Kristallisationspuffer vermischt und mit einer geeigneten Kristallisationstechnik, z.B. durch „Drop"-Dampfdiffusion, kristallisiert. Zu geeigneten Kristallisationspuffer gehören z.B.: 0,1 M Na-Acetat, pH 5,3, 0,2 M CaCl₂, 30 % v/v Ethanol; 0,1 M Na-Citrat, pH 5,0, 40 % v/v Ethanol; 0,1 M Na-Citrat, pH 8,7, 20 % w/v PEG 4000, 20 % v/v Isopropanol und 0,1 M Na-Citrat, pH 5,4, 20 % w/v PEG 4000, 20 % v/v Isopropanol. Die Probe wird bei einer Temperatur von etwa 4 bis 20 Grad Celsius inkubiert. Es entsteht ein kristallines Präzipitat.
Keime von dem erzeugten kristallinen Präzipitat (ganze Kristalle oder Suspensionen aus zerstoßenem Kristall) werden zusammen mit einem geeigneten Kristallisationspromotor wie Kaninchen-Haare zu einer Lösung aus konzentriertem TACE/Substrat in einen Kristallisationspuffer gegeben. Es bilden sich Kristalle aus, die für die Röntgendatenerfassung geeignet sind.
Ein TACE-Polypeptidkristall umfasst ein TNF-α-konvertierendes-Enzym-Katalysedomäne-(TCD)-Polypeptid, das mit einem Inhibitor co-kristallisiert ist. Der Kristall beugt auf etwa 2 Å und gehört zur monoklinen Raumgruppe P2₁. Die Einheitszelle des Kristalls umfasst vier kristallographisch unabhängige TCD-Moleküle. Die TCD-Moleküle sind in einer asymmetrischen Einheit und nicht zu separaten Tetrameren angehäuft, sondern sind in der endlosen periodischen Struktur integriert. Der Kristall hat die Zellkonstanten: a = 61,38 Å (Ångström), b = 126,27 Å, C = 81,27 Å und β = 107,41°.
Röntgenbeugung
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Struktur von TACE, insbesondere die Struktur der katalytischen Domäne von TACE (TCD). Die Struktur von TACE kann mit einem ein TACE-Polypeptid umfassenden Kristall wie oben beschrieben bestimmt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Struktur von TACE und insbesondere die TCD anhand Röntgenkristallographie bestimmt. Es kann jedes geeignete Röntgenbeugungsverfahren zum Erhalten von dreidimensionalen Strukturkoordinaten eines Polypeptids angewendet werden. Die dreidimensionalen Strukturkoordinaten oder ein beliebiger Teil davon, der den interessanten Teil des TACE-Polypeptids charakterisiert, wie die katalytische Domäne des TACE, oder ein Teil davon, der das Peptid PLAQAVRSSS spalten kann, können wie hierin beschrieben verwendet werden.
Verfahren zur Verwendung von TACE-Röntgenbeugungskoordinaten
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der Strukturkoordinaten, die aus den oben beschriebenen Röntgenbeugungsstudien der katalytischen TACE-Domäne erhalten werden. Die Koordinaten können durch direkte Analyse, mit Hilfe von Computern oder Kombinationen davon genutzt werden, um die Struktur, einschließlich der sekundären und tertiären Struktur, der katalytischen TACE-Domäne zu bestimmen. Die Strukturkoordinaten der katalytischen TACE-Domäne können auch zum Entwickeln, Entwerfen und/oder Screenen von Verbindungen verwendet werden, die sich mit TACE assoziieren. Der hierin verwendete Begriff „assoziieren" bedeutet, dass sich die Verbindung ionisch, kovalent, durch Wasserstoffbindung, van-der-Waals-Interaktion, Salzbrücken, sterische Interaktion, hydrophile Interaktionen und hydrophobe Interaktion an TACE binden oder damit interagieren kann. Ferner schließt der Begriff „assoziieren" Assoziationen mit jedem beliebigen Teil der katalytischen TACE-Domäne ein. Verbindungen, die sich mit TACE assoziieren, können z.B. Verbindungen sein, die als kompetitive Inhibitoren, unkompetitive Inhibitoren und nicht-kompetitive Inhibitoren agieren. Verbindungen, die sich mit TACE assoziieren, können auch Verbindungen sein, die als Mediatoren oder andere regulatorische Verbindungen agieren. Verbindungen, die sich mit TACE assoziieren, können auch Verbindungen sein, die zu kurzlebigen Reaktionsintermediaten in der chemischen Reaktion zwischen Substrat und TACE isomerisieren. Insbesondere können Verbindungen, die dafür vorgesehen sind, sich mit TACE zu assoziieren, therapeutisch als Inhibitoren, Mediatoren und andere regulatorische Verbindungen eingesetzt werden.
Die Verwendung von Röntgenkoordinaten zur Strukturbestimmung, für den Molekülentwurf und die Selektion und Synthese von Verbindungen, die sich mit anderen Polypeptiden assoziieren, ist in der Technik bekannt. Die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 95/35367 beschreibt die Verwendung von Röntgenstrukturkoordinaten zum Entwerfen, Bewerten, Synthetisieren und Verwenden von Verbindungen, die sich mit dem Aktivort eines Enzyms assoziieren. Die UK-Patentanmeldung 2306961 A beschreibt die Verwendung von Röntgenkoordinaten beim rationalen Wirkstoffentwurf. Die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 97/15588 beschreibt die Strukturbestimmung eines Polypeptids unter Verwendung von Röntgenbeugungsdiagrammen sowie die Verwendung der Koordinaten und dreidimensionalen Struktur bei der Suche nach Verbindungen, die sich mit dem Polypeptid von Interesse assoziieren. Die vorliegende Erfindung ermöglicht jedoch zum ersten Mal die Verwendung von Röntgenkoordinaten für ein TACE-Polypeptid zur Strukturbestimmung, für den Molekülentwurf sowie die Selektion und Synthese von Verbindungen, die sich mit TACE assoziieren.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung können die mit den vorangehenden Verfahren erhaltenen Strukturkoordinaten als eine graphische Darstellung, einschließlich dreidimensionaler Gestaltdarstellungen, angezeigt oder in diese umgewandelt werden. Dies kann mit handelsüblichen Computerprogrammen erreicht werden, die graphische Darstellungen von Molekülen oder Teilen davon anhand eines Strukturkoordinatensatzes erzeugen können. Beispiele für Computerprogramme, die graphische Darstellungen von Molekülen oder Teilen davon anhand eines Strukturkoordinatensatzes erzeugen können, sind in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 97/08300 beschrieben.
Die Strukturkoordinaten und Struktur können mit anderen ähnlichen Molekülen wie anderen Metalloproteinasen verglichen oder darüber gelegt werden. Die TACE-Strukturkoordinaten und -Struktur können zum Beispiel mit den Strukturkoordinaten oder der Struktur von Schlangengift-Metalloproteinasen, wie z.B. Adamalysin II, verglichen oder darüber gelegt werden. Die TACE-Strukturkoordinaten und -Struktur können auch mit Strukturkoordinaten oder der Struktur von Matrixmetalloproteinasen, wie ADAM 10, inkl. humaner ADAM 10, verglichen oder darüber gelegt werden. Ein Vergleich von TACE und anderen Molekülen, für die eine graphische Struktur oder dreidimensionale Strukturkoordinaten verfügbar sind, kann mit Hilfe erhältlicher Software-Applikationen wie der Molecular Similarity Applikation von QUANTA (Molecular Simulations, Inc., Waltham, MA) erfolgen.
Verbindungen, die sich mit TACE assoziieren, können auch rechnerisch bewertet und entworfen werden, indem chemische Entitäten oder Fragmente im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Assoziation mit TACE und im Speziellen der katalytischen TACE-Domäne gescreent und selektiert werden. Für diesen Aspekt der Erfindung können verschiedene Verfahren angewendet werden. Es kann ein computergeneriertes Modell von TACE und insbesondere der katalytischen Domäne auf der Basis der hierin beschriebenen Strukturkoordinaten visuell begutachtet werden. Computergenerierte Modelle chemischer Entitäten oder spezifischer chemischer Anteile können dann in oder um die katalytische Domäne positioniert und auf der Basis von Energieminimierung und molekularer Dynamik zum Beispiel unter Verwendung verfügbarer Programme wie CHARMM oder AMBER bewertet werden. Die Positionierung der chemischen Entität oder des Fragments kann z.B. mit Docking-Software wie Quanta und Sybyl erzielt werden. Ferner können bekannte und handelsübliche Computerprogramme zum Selektieren chemischer Entitäten oder Fragmente verwendet werden. Nach dem Selektieren geeigneter chemischer Entitäten oder Fragmente können diese zu einer einzelnen Verbindung wie einen Inhibitor, Mediator oder eine andere regulatorische Verbindung zusammengesetzt werden. Bekannte und handelsübliche Modellbausoftware kann beim Zusammensetzen behilflich sein.
Verbindungen, die sich mit TACE und insbesondere mit der katalytischen TACE-Domäne assoziieren, können als Ganzes entworfen werden, anstatt durch Zusammensetzen spezifischer chemischer Anteile oder chemischer Entitäten. Diese Ausgestaltung kann mit Computerprogrammen wie LUDI (Biosym Technologies, San Diego, CA), LEGEND (Molecular Simulations, Burlington, MA) und Leap Frog (Tripos Associates, St. Louis, MO) umgesetzt werden.
Eine Kandidatverbindung kann auf der Basis der gewünschten Orte der Interaktion mit TACE und der Kandidatverbindung im Hinblick auf die zuvor identifizierten Interaktionsorte ausgewählt werden. Nach dem Bestimmen der spezifischen Kandidatverbindung-TACE-Interaktionen werden Docking-Studien unter Verwendung handelsüblicher Docking-Software durchgeführt, um vorläufige „modellierte" Komplexe einer selektierten Kandidat-Verbindung mit TACE bereitzustellen.
Eine eingeschränkte Konformationsanalyse wird zum Beispiel unter Verwendung von molekularer Dynamik (MD) durchgeführt, um die Integrität des modellierten TACE-Inhibitor-Komplexes zu überprüfen. Sobald der Komplex seinen günstigsten Konformationszustand erreicht, wird die von der MD-Studie vorgeschlagene Struktur visuell analysiert, um zu gewährleisten, dass der modellierte Komplex bekannten experimentellen SAR/QSAR (Struktur-Wirkungsbeziehungen/quantitative Struktur-Wirkungsbeziehungen) auf der Basis gemessener Bindungsaffinitäten entspricht.
Gemäß der Erfindung können auch andere Modellierungstechniken angewendet werden. Beispiele für diese Techniken sind in Cohen et al., „Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry", J. Med. Chem., 33: 883-894 (1990) und Navia et al., „The Use of Structural Information in Drug Design", Current Opinions in Structural Biology, 2:202-210 (1992) offenbart.
Verbindungen, die so entwickelt oder entworfen werden, dass sie sich mit TACE assoziieren, können optimiert oder die Effizienz der Assoziation kann mit einer Reihe von in der Technik bekannten Verfahren getestet werden. So können z.B. die Verformungsenergie und elektrostatischen Interaktionen bestimmt und optimiert werden. Es können bekannte und handelsübliche Software- und Hardwaresysteme verwendet werden. Beispiele für eine solche Software sind in der WO 95/07619 offenbart. Eine strukturbasierte Analogisierung zur Optimierung der Inhibitorpotenz, Selektivität und physikalischen wirkstoffartigen Eigenschaften in einer iterativen Weise kann von der Fachperson auf dem Gebiet des Wirkstoffentwurfs ebenfalls durchgeführt werden.
Es können auch Substitutionen an selektierten oder entworfenen Verbindungen erfolgen. Diese Substitutionen können gemacht werden, um die Assoziierungseigenschaften der Verbindung zu verbessern oder zu modifizieren. Solche Substitutionen können zum Beispiel in Seitengruppen oder speziellen Atomen der Verbindungen gemacht werden. Im Allgemeinen sollte mit konservativen Substitutionen begonnen werden, die etwa die gleiche Größe, Gestalt, Ladung und sonstige Charakteristiken der/des ursprünglichen Gruppe oder Atoms haben. Substituierte Verbindungen können wie oben beschrieben weiter analysiert und optimiert werden.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung kann der potentielle Inhibitions-, Mediations-, Regulations- oder sonstige Bindungseffekt einer Verbindung zum Beispiel unter Verwendung von handelsüblicher Computersoftware analysiert und bewertet werden, bevor die eigentliche Synthese und Prüfung einer solchen Verbindung erfolgt. Auf diese Weise kann die Wahrscheinlichkeit einer Synthetisierung und Prüfung inoperativer Verbindungen beurteilt werden.
Verfahren zur Messung der Inhibition sind in der Technik allgemein bekannt und z.B. in der PCT 96/41624 offenbart. Solche Verfahren beinhalten Assays auf der Basis einer Reaktion mit einem Peptidsubstrat.
Katalytische TACE-Domänenstruktur
Die physikalischen Merkmale der TCD, die anhand der mit den beschriebenen Verfahren erhaltenen Röntgenbeugungsdaten bestimmt werden, und ihre Verwendung zur Schaffung molekularer Modelle der TCD werden mit Bezug auf die Figuren ausführlicher beschrieben.
Die in 1 dargestellte Domäne hat die Form eines abgeflachten Ellipsoids, das auf seiner flachen Seite eingekerbt ist, um eine relativ kleine Aktivortspalte zu erhalten, die die kleine „untere" Subdomäne vom „oberen" Hauptmolekülkörper trennt (2a). Die TCD-Polypeptidkette beginnt auf der Moleküloberfläche (auf der unteren hinteren Seite, 1), wobei die Kette zwischen Asp217 und Met221 gut definiert ist (siehe 3). Zentral zum Molekül ist das fünfsträngige β-Faltblatt, wobei die β-Stränge in der folgenden Reihenfolge (von hinten nach vorne, siehe 1) angeordnet sind: sII, sI, sIII, sV und sIV (siehe 3), wobei sIV, der „Rand"-Strang, antiparallel zu den anderen verläuft. Dieses β-Blatt ist stark verdrillt und wird von zwei α-Helixen (hB und hB2) auf seiner konvexen Seite und zwei Helixen (hA und hC) auf seiner konkaven Seite flankiert. Die β-Stränge sI und sII sind durch die kurze α-Helix hA1 und die lange α-Helix hA (die schräg verlaufende Helix auf der hinteren Seite, 1) verbunden. Die β-Stränge sII und sIII sind durch die große „Mehrfachwindungsschleife" (multiple turn loop), die lange „intermediäre" α-Helix hB und die angrenzende kurze α-Helix hB2 verknüpft, die alle auf der „Oberseite" des β-Faltblatts angeordnet sind und folglich seinen mittleren Teil vor freiem Wasser (bulk water) völlig abschirmen ( 1). Die Mehrfachwindungsschleife ist an zwei Orten ausgebaucht, wodurch jeweils eine „spornartige" und recht saure Protuberanz entsteht (in 2a auf der Oberseite des Moleküls sichtbar). Der sIII-sIV Linker endet in einer kurzen „Ausbauchung", bevor er in den Randstrang sIV eintritt. Das sIV-sV Verbindungssegment ist in zwei große „ohrartige", auf der Oberfläche befindliche Schleifen zerteilt, eine erste, die sich an den Hauptmolekülkörper anschmiegt (so dass die „blaue" Oberfläche entsteht, Mitte links, 2a), und eine lange β-Haarnadel-Schleife (sIIa-sIIb), die von der Moleküloberfläche vorsteht (oben links in 1 und 2). Eine ausgebauchte Schleife verknüpft sV mit der „Aktivort-Helix" hC, die sich in der Mitte des Moleküls befindet und abrupt am strikt konservierten Gly412 stoppt, wo die Kette nach unten knickt, um die untere Subdomäne zu bilden.
Die C-terminale Kette, die die letzten 61 TCD-Reste umfasst (3), bildet zunächst drei kurze, gerade, fast lotrecht angeordnete Segmente, die durch zwei „schmale" superverdrillte Schleifen verknüpft sind, kehrt über die enge „Met-turn" Tyr433-Val434-Met435-Tyr436 zur Oberfläche zurück, wo sie bei Pro437 einen Knick macht, um die Pro437-Ile438-Ala439 Außen-„Wand” des S1'-Spalts zu bilden, nähert sich in einer großen Schleife der C-terminalen α-Helix hD, läuft durch sie hindurch und endet auf der „hinteren" Moleküloberfläche nahe dem N-Terminus, wobei die letzten definierten Reste Arg473-Ser474 über Wasserstoffbindungen am Hauptmolekülkörper fixiert sind. Über Cys423-Cys453 ist die erste der beiden „schmalen" Schleifen mit dem N-Terminus der Helix hD Disulfid-verknüpft, deren C-terminales Ende wiederum am „ohrartigen" sIV-sV Linkerpeptid durch Cys365-Cys469 festgeklemmt ist. Räumlich angrenzend verbindet die dritte Disulfidbrücke der TCD, Cys225-Cys333, die N-terminalen Teile der β-Stränge sI und sIII. In dem intakten TACE-Molekül würden vier Reste stromabwärts von Ser474 in Cys478 liegen, der bereits ein integrierter Bestandteil der kompakten länglichen Disintegrin-Domäne ist (Saudek et al., „Three-dimensional structure of echistatin, the smallest active RGD Protein" Biochem. 30, 7369-7372 (1991)). Wenn man Ser474 und diesen Cys478 als Angelpunkte ihrer jeweiligen Domänen betrachtet, dann würde der Drei-Reste-Linker ein relativ uneingeschränktes Andocken der Disintegrin-Domäne an der „linken" Oberseite der katalytischen Domäne ermöglichen.
Die Aktivortspalte von TACE (2a) ist relativ flach auf der linken (nicht vorbehandelten) Seite, ist jedoch nach rechts eingekerbt. Das in ihrem Zentrum befindliche katalytische Zink ist durch die drei Imidazol-NE-Atome von His405, His409 und His 415 (bereitgestellt von der Aktivorthelix und der folgenden „absteigenden" Kette, die das konservierte Zinkbindungs-Konsensus-Motiv HEXXHXXGXXH umfasst) und durch den Carbonyl- und Hydroxylsauerstoff des Hydroxamsäureanteils des Inhibitors fünffach koordiniert (siehe 1, 2a und 4). Dieses Zink-Imidazol-Ensemble basiert auf dem distalen ε-Methyl-Schwefel-Anteil des strikt konservierten Met435, der in der Met-turn liegt, die für den Metzincin-Clan charakteristisch ist (Rode et al., „Astacins, serralysins, snake venom and matrix metalloproteinases exhibit identical zinc binding environments (HEXXHXXGXXH and Met-turn) and topologies and should be grouped into a common family, the 'metzincins' FEBS Lett. 331, 134-140 (1993); Stöcker et al., „The metzincins: Topological and sequential relations between the astacins, adamalysins, serralysins, and matrixins (collagenases) define a superfamily of zinc-peptidases" Protein Sci. 4, 823-840 (1995)). Beide Carboxylatsauerstoffatome des „katalytischen" Glu406 (der als eine allgemeine Base während der Katalyse fungiert (Grams et al., „X-ray structures of human neutrophil collagenase complexed with peptide hydroxamate and peptide thiol inhibitors: Implications for substrate binding and rational drug design" Eur. J. Biochem. 228, 830-841 (1995)), eingequetscht zwischen dem zink-ligandierenden Imidazol von His405 und dem Randstrang, sind mit der Hydroxyl- und der N-H-Gruppe der Hydroxamsäure über Wasserstoff verbunden (siehe 4). Rechts vom katalytischen Zink öffnet sich die tiefe S1' Tasche, die, abgesehen von dem S1' wandbildenden Segment (unten, 1 und 2a), durch die Seitenketten von His405 und Glu406 (links), die sIV Hauptkette und die Leu345 Seitenkette (oben) und die Seitenketten von Val440 (hinten) und Ala439 (rechts) begrenzt ist. Rechts von Ala439 öffnet sich eine zweite (S3') Tasche, die innerhalb des Moleküls mit der S1' Tasche verschmilzt, wodurch eine kleine Brücke aus den gegenüberliegenden Seitenketten von Ala439 und Leu348 zurückbleibt (2a).
Der (pseudo)peptidische Teil des Inhibitors bindet sich in einer erweiterten Geometrie an die eingekerbte rechte Seite der Aktivortspalte, wobei die Interaktion der vorbehandelten („primed") Reste eines produktiv gebundenen Peptidsubstrats nachgeahmt wird (2a). Er läuft antiparallel zur oberen kurzen Ausbauchung Gly346-Thr347-Leu348 und parallel zum S1' wandbildenden Segment Pro437-Ile438-Ala439, wobei jeweils Zweier-Zwischenhauptketten-Wasserstoffbindungen hergestellt werden. Die dominanten intermolekularen Interaktionen erfolgen durch die P1' Isobutyl(pseudo-leucyl)-Seitenketten des Inhibitors; die im Wesentlichen hydrophobe S1' Tasche ist jedoch groß und nimmt drei teilweise geordnete Lösungsmittelmoleküle zusätzlich auf. Die P2' t-Butyl-Seitenkette läuft von dem Enzym weg, schmiegt sich jedoch an das hydrophobe Dach oben an, das durch die Ausbauchung des Enzym gebildet wird. Die P3' Ala-Seitenkette zeigt in die große negativ geladene S3' Tasche, ist aber zu kurz, um günstige Kontakte zu machen. Die C-terminale Diaminoethylgruppe hat unterschiedliche Konformationen in den vier Molekülen.
Das P1' bis P3' Segment Val77-Arg78-Ser79 eines gebundenen Pro-TNFα verbindet sich wahrscheinlich in einer ähnlichen Weise, möglicherweise mit besserer Übereinstimmung, mit der darunter liegenden Spaltoberfläche; die vorangehenden P3 bis P1 Reste Ala74-Gln75-Ala76 richten sich mit Sicherheit antiparallel zum Randstrang aus, wobei sich ihre Seitenketten in die (teilweise geladene) S3 Tasche und die (negativ geladene) flache S2 Vertiefung erstrecken und jeweils aus der zentralen Spalte vorstehen. Die vorbehandelten Suborte und umliegenden Moleküloberflächen von TACE sind durch negative Ladungen dominiert, wohingegen die nicht vorbehandelten Suborte ihrer Natur nach im Wesentlichen hydrophob sind (2a). Entferntere Interaktionen können in der Spezifität von TACE zur Prozessierung von Pro-TNF-α involviert sein. Das 12-Reste-Substrat, das die Pro-TNFα Spaltstelle umfasst, kann auch durch einige der MMPs geteilt werden, allerdings mit geringerer Spezifität und Wirksamkeit (Black et al., „Relaxed specifity of matrix metalloproteinases (MMPs) and TIMP intensity of tumor necrosis factor-α (TNF-α) production suggest the major TNF-α converting enzyme is not an MMP" Biochem. Biophys. Res. Commun. 225, 400-405 (1996)). Folglich ist die bevorzugte Prozessierung des (wahrscheinlich trimeren) (Tang et al., „Human pro-tumour necrosis factor is a homotrimer" Biochem. 35, 8216-8225 (1996a); Tang et al., „Length of the linking domain of human pro-tumor necrosis factor determines the cleavage processing" Biochem. 35, 8226-8233 (1996b)) membrangebundenen pro-TNFα in vivo möglicherweise zum Teil in einer korrekten Assemblierung begründet, d.h. geeignete Präsentation des pro-TNFα Spaltsegments am TACE-Aktivort in einer deutlichen Entfernung zur Verankerungsmembran. Einige experimentelle Beweise (Tang et al., Biochem. 35, 8216-8225 (1996a); Tang et al., Biochem. 35, 8226-8233 (1996b)) legen nahe, dass die Spaltstelle möglicherweise nicht durch die Spaltsequenz alleine bestimmt wird, sondern dass auch der Abstand zur Basis des von den assoziierten C-terminalen Segmenten von drei TNFα-Molekülen gebildeten kompakten Kegels (Jones et al., „Structure of tumor necrosis factor" Nature 338, 225-228 (1989)) eine Rolle spielt. In einem produktiven TACE-proTNFα-Komplex kann die Basis dieses TNFα-Trimer-Kegels (in den die ungeordneten N-Termini hinauf laufen) erkannt werden anhand der „rechten" Seite der katalytischen TACE-Domäne (2a), wobei der etwa 10 Reste lange Spacer die korrekte Platzierung der proTNFα Ala76-Val77 spaltbaren Peptidbindung im Aktivort von TACE bevorzugt.
Die Polypeptidtopologie und insbesondere die Oberflächenpräsentation des katalytischen Zink belegen, dass die katalytische Domäne von TACE ein typisches Metzincin ist (Rode et al., „Astacins, serralysins, snake venom and matmrix metalloproteinases exhibit identical zinc binding environments (HEXXHXXGXXH and Met-turn) and topologies and should be grouped into a common family, the 'metzincins' FEBS lett. 331, 134-140 (1993); Stöcker et al., „The metzincins: Topological and sequential relations between the astacins, adamalysins, serralysins, and matrixins (collagenases) define a superfamily of zinc-peptidases", Protein Sci. 4, 823-840 (1995)). Eine Überlagerung mit den anderen Metzincinen zeigt jedoch, dass seine Topologie der der katalytischen Domäne von Schlangengift-Metalloproteinasen wie Adamalysin II sehr ähnlich ist (5) (Gomis-Rüth et al., „First structure of a snake venom metalloproteinase: prototype for matrix metalloproteinases/collagenases", EMBO J. 12, 4151-4157 (1993); Zhang et al., „Structural interaction of natural and synthetic inhibitors with the venom metalloproteinase, atrolysin C (form d)", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8447-8451 (1994); Kumasaka et al., „Crystal structure of H2-proteinase from the venom of Trimeresurus flavoviridis" J. Biochem. 119, 49-57 (1996)). Diese enge Homologie wird durch die viel bessere simultane Überlagerung des zentralen Blatts und der großen Helixe reflektiert, aber vor allem auch durch ein paar strukturelle Merkmale, die TACE ausschließlich mit den Adamalysinen gemeinsam hat: die lange Helix hB und die vorangehende Mehrfachwindungsschleife auf der Oberseite des β-Blattes; die typisch angeordnete und geformte C-terminale Helix hC und der erweiterte C-Terminus auf der rückseitigen Oberfläche. Etwa 175 der 263 TACE und 201 Adamalysin α-Atome sind topologisch äquivalent (mit einer rms-Abweichung von 1,3 Å, 39 davon haben identische Seitenketten (3). Diese Zahlen kommen solchen nahe, die aus einem Vergleich von Mitgliedern innerhalb der verschiedenen Metzincin-Familien erhalten werden (Stocker et al., supra). Darüber hinaus belegen detaillierte Strukturmerkmale die enge Beziehung zwischen TACE und den Adamalysinen: eine konserviertere Kernstruktur; der locker angeordnete N-Terminus; der charakteristische Asp416 (direkt auf das Zinkbindungs-Konsensus-Motiv folgend, 3), der in identischen intramolekularen Wasserstoffbindungsinteraktionen involviert ist; die angrenzende Disulfidbrücke Cys423-Cys453, die die erste schmale Schleife mit der C-terminalen Helix hD verknüpft (die TACE nicht mit Adamalysin II gemeinsam hat, sondern mit der H2-Proteinase von dem Schlangengift von T. flavoviridis) (Kumasaka et al., supra); die Disulfidbrücke Cys365-Cys469, die den sIV-sV Linker mit der C-terminalen Helix hD verbindet; eine ähnlich geformte Aktivortspalte, mit besonders starken Ähnlichkeiten in der SI' Tasche und anderen vorbehandelten Suborten.
Die katalytische Domäne von TACE (TCD) unterscheidet sich von Adamalysin II auch in mehreren Hinsichten: mit 263 Resten ist ihre Kette viel länger; die meisten der zusätzlichen Reste von TACE sind angehäuft, wodurch eine hA-sII Windung entsteht, die mehr vorsteht, und zwar zu den beiden Oberflächenprotuberanzen der Mehrfachwindungsschleife, zu den beiden „Ohren" des SIV-sV Linkers und zu einem stärker ausgebauchten sV-hC-Verbinder (siehe 3 und 5); eine Calciumbindungsstelle fehlt, aber es ist eine dritte Disulfidbrücke Cys225-Cys333 in TACE vorhanden, wobei beide Elemente allerdings die gleiche Funktion haben, nämlich die N-terminale Kette am Strang siII festzuklemmen; die recht tiefe S3' Tasche von TACE, die mit seiner S1' Tasche verschmilzt; ein fast umgekehrtes Ladungsmuster in den und um die vorbehandelten Suborte(n), mit einer absoluten Prädominanz positiver Ladungen in Adamalysin.
Gemäß ihrer Sequenz und wahrscheinlich mit Bezug auf ihre dreidimensionale Struktur ist die katalytische TACE-Domäne somit kein typisches Mitglied der Säugetier-ADAMS-proper (eine Familie von membranverankerten Zelloberflächenproteinen, wobei die katalytische Domäne recht homolog zu Adamalysin ist (Wolfsberg et al., „ADAMs in Fertilization and Development", Developm. Biol. 18C, 389-401 (1996))). TACE teilt diese „Außenseiter"-Rolle vermutlich mit (boviner) ADAM 10 (3), die ebenfalls eine gewisse TACE-artige Aktivität besitzt (Lunn et al., „Purification of ADAM 10 from bovine spleen as a TNFα convertase," FEBS Lett. 400, 333-335 (1997)) und deren Drosophila-Version (kuz) kürzlichen Feststellungen zufolge den Notch-Rezeptor prozessiert (Rooke et al., Science 273, 1227-1231 (1996)). Außerdem weist ADAM 10 wahrscheinlich eine längliche hA-sII Schleife und die beiden „Ohren" auf, die für TACE typisch sind, hat aber möglicherweise eine Mehrfachwindung, die größenmäßig zwischen TACE und Adamalysin liegt (siehe 3). Neunzig der katalytischen Domänenreste von ADAM 10 sind mit TACE identisch, wodurch die enge Homologie weiter unterstrichen wird (siehe 3), wohingegen die anderen Säugetier-ADAMs wahrscheinlich weit mehr Adamalysin II ähneln (Gomis-Ruth et al., „Refined 2,0 A crystal structure of snake venom zinc endopeptidase adamalysin II" J. Mol. Biol. 239, 513-544 (1994)).
Die Strukturhomologie von TACE zu den MMPs ist wesentlich geringer. Die relative Anordnung der gemeinsamen sekundären Strukturelemente unterscheidet sich stärker (was durch die wesentlich stärkere rms-Wertabweichung von 1,6 Å der etwa 120 topologisch äquivalenten Cα-Atome reflektiert wird) und den MMPs fehlen charakteristische TACE/Adamalysin-Strukturelemente (wie die intermediäre Helix hB und die Mehrfachwindungsschleife, der Asp-Rest hinter dem dritten Zinkbindungs-Histidin) oder sie weisen typische Determinanten (wie das strukturelle Zink und die integrierten Calciumionen) auf, die in TACE nicht vorliegen. Ungeachtet der Unterschiede in der Sekundärstruktur hat die Aktivortspalte von TACE eine gewisse Ähnlichkeit zu der der MMPs, wobei die flache, nicht vorbehandelte (linke) Seite und die schmale vorbehandelte Seite in der tiefen S1' Tasche zentriert sind (2b). Diese Subortähnlichkeit zu den MMPs ist eine Erklärung für die beobachtete teilweise Empfindlichkeit von TNFα-Konvertase-Aktivität gegenüber synthetischen Hydroxamsäure-Inhibitoren, die ursprünglich zur Inhibition verschiedener MMPs entworfen wurden (DiMartino et al., „Anti-arthritic activity of hydroxamic acid-based pseudopeptide inhibitors of matrix metalloproteinases and TNFα processing" Inflamm. Res. 46, 211-215 (1997)). Modellbauexperimente mit TIMP-1 Struktur (Gomis-Ruth et al., „Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1", Nature 389, 77-81 (1997)) zeigen keine offensichtlichen Hindernisse in der Aktivortregion von TACE, die eine einfache Erklärung für seinen Widerstand gegen eine Blockierung durch die TIMPs liefern würden.
Diese TCD-Kristallstruktur liefert somit einen Beweis für eine topologische Ähnlichkeit der katalytischen Domäne von TACE mit der von Adamalysinen/ADAMs und für eine Gemeinsamkeit ihrer Substratbindungsstelle mit der von MMPs. TACE weist jedoch verschiedene strukturelle Eigenarten bezüglich Oberflächenkontur, Ladung und Gestalt auf, wodurch der Entwurf potenter, selektiver, synthetischer Inhibitoren erleichtert wird.
Beim Entwerfen und Entwickeln von Verbindungen wie Inhibitoren, Mediatoren und anderen Verbindungen mit Aktivitäten von biologischer Bedeutung, die sich mit TACE assoziieren, ist es erwünscht, Verbindungen mit einem Blick auf die spezielle Oberflächenkontur, Ladung, Gestalt und andere physikalische Charakteristiken der katalytischen TACE-Domäne auszuwählen. Im Allgemeinen sollten die Verbindungen in der Lage sein, sich physisch und strukturell mit TACE zu assoziieren, und eine Konformation annehmen können, die es ihnen ermöglicht, sich mit TACE zu assoziieren. Die oben beschriebenen Merkmale werden die Fachperson in dieser Hinsicht lenken. Vor allem Verbindungen mit einer linearen Funktionalität müssten besonders geeignet sein. Solche Verbindungen werden angesichts der tiefen Taschen der katalytischen TACE-Domäne besonders geeignet sein.
Die Verbindungen, die sich mit TACE assoziieren, können zum Beispiel dafür vorgesehen sein, sich mit der S1' Region oder der S1'S3' Tasche von TACE zu assoziieren. Verbindungen, die sich mit TACE assoziieren, können auch dafür vorgesehen sein, (i) einen Anteil einzubeziehen, der Zink chelatisiert. Weitere beispielhafte Verbindungen sind Verbindungen, die dafür vorgesehen sind, eine Wasserstoffbindung mit Leu348 oder Gly349 von TACE zu bilden, (ii) eine nicht-polare Gruppe einzuführen, die die S1' Tasche von TACE belegt, (iii) eine Gruppe einzuführen, die innerhalb des die S1'-S3' Taschen von TACE verbindenden Kanals liegt und die einen angemessenen van-der-Waals-Kontakt mit dem Kanal macht, und (iv) eine Wasserstoffbindung mit Leu348 oder Gly349 auf den Rückgratamidgruppen von TNF-α-konvertierendem Enzym zu bilden oder (v) jede beliebige Kombination von Obigem.
Computerlesbares Medium
Auf einem computerlesbaren Medium können die Röntgenbeugungsstrukturkoordinaten eines kristallinen TACE-Polypeptids aufgezeichnet werden. Die computerlesbaren Medien der Erfindung sind zum Speichern, Übertragen und Verwenden der TACE-Strukturkoordinaten mit Software nützlich. Das computerlesbare Medium kann jedes beliebige geeignete Datenspeichermaterial sein, inklusive, aber nicht begrenzt auf, eine Diskette, eine Festplatte, ein computerartiger Direktzugriffsspeicher (RAM), ein Festwertspeicher (ROM), Flash-Speicher, CD-ROM, beschreibbare und überschreibbare CDs, beschreibbare und überschreibbare DVDs, eine Magnet-Bildplatte, ein ZIP-Laufwerk, JAZ-Laufwerk, Syquist-Laufwerk, digitales Bandlaufwerk oder dergleichen. Andere geeignete Medien werden der Fachperson bekannt sein.
Das computerlesbare Medium kann die Koordinaten aus Tabelle 1 oder einen wesentlichen Teil davon umfassen. Das computerlesbare Medium kann in Verbindung mit einer Maschine verwendet werden, die mit Befehlen zur Verwendung der auf dem Medium aufgezeichneten Daten programmiert ist, wie ein Computer mit einem oder mehreren Programmen, die im Laufe der Spezifikation bekannt gegeben werden, zur Anzeige einer graphischen dreidimensionalen Repräsentation eines TACE-Polypeptids oder eines Teils davon.
Rechnergestütztes System
In 6 ist ein System 1000 zur Untersuchung eines TACE-Polypeptids dargestellt. Das System beinhaltet einen Videospeicher 110, der Informationen speichert, die wenigstens einen Teil eines TACE-Polypeptids repräsentieren. Der Speicher hat wenigstens eine Speicherregion 112 des ersten Typs, in der ein Satz räumlicher Koordinaten aufgezeichnet ist, die einen Ort in einem dreidimensionalen Raum angeben, und wenigstens eine Speicherregion 114 des zweiten Typs, in der Informationen aufgezeichnet sind, die ein Charakteristikum von einer aus einer Mehrzahl von Aminosäuren repräsentieren. Die Speicherregionen des zweiten Typs sind mit den Speicherregionen des ersten Typs in dem Videospeicher 110 logisch assoziiert, um eine geometrische Anordnung von wenigstens einem Charakteristikum von wenigstens einem Teil des TACE-Polypeptids in dem dreidimensionalen Raum zu repräsentieren. Speicher, 112 und 114 können zum Beispiel die in der Tabelle 1 dargestellten Daten umfassen. Das System 1000 beinhaltet außerdem einen Prozessor, der mit dem Speicher gekoppelt ist, um auf die Speicherregionen 112 des ersten Typs und die Speicherregionen 114 des zweiten Typs zuzugreifen, um Bildsignale zur Darstellung eines visuellen dreidimensionalen Bildes von wenigstens einem Charakteristikum von wenigstens einem Teil des TACE-Polypeptids in dem dreidimensionalen Raum auf der Basis von Daten aus dem Speicher 110 zu erzeugen. Der Prozessor kann jeder beliebige Universalprozessor mit einer CPU, einem Register, einem Speicher und dergleichen sein. Ein Display 130 ist mit dem Prozessor 120 über Leitungen 125 gekoppelt, um die Bildsignale zu empfangen, um ein visuelles dreidimensionales Bild von wenigstens einem Charakteristikum von wenigstens einem Teil des TACE-Polypeptids in dem dreidimensionlen Raum auf der Basis der Bilddaten auf einem Bildschirm 132 anzuzeigen.
Die Bilddaten können Daten zur Darstellung eines visuellen dreidimensionalen Bildes einer Bandstruktur von wenigstens einem Teil eines TACE-Polypeptids in einem dreidimensionalen Raum wie in 1 dargestellt beinhalten. Ferner können die Bilddaten Daten zur Darstellung eines visuellen dreidimensionalen Bildes einer Festkörpermodellrepräsentation von wenigstens einem Teil des genannten TACE-Polypeptids in einem dreidimensionalen Raum wie in 2 dargestellt beinhalten. Außerdem können die Bilddaten Daten zur Darstellung eines visuellen dreidimensionalen Bildes eines elektrostatischen Oberflächenpotentials von wenigstens einem Teil des TACE-Polypeptids in einem dreidimensionalen Raum wie in 2 dargestellt beinhalten. Alternativ können die Bilddaten Daten zur Darstellung eines visuellen dreidimensionalen Stereobildes von wenigstens einem Teil eines TACE-Polypeptids in einem dreidimensionalen Raum wie in 4 dargestellt beinhalten.
Das erfindungsgemäße System 1000 kann ferner ein Speichergerät 145, das Daten speichert, die eine geometrische Anordnung eines Charakteristikums einer anderen Zusammensetzung als dem TACE-Polypeptid repräsentieren, und eine Bedieneroberfläche wie eine Maus 135 zum Empfangen von Befehlen von einem Bediener umfassen. Das Speichergerät 145 kann zum Beispiel die dreidimensionalen Röntgenkoordinatendaten für andere chemische Entitäten enthalten. Der Prozessor 120 ist mit dem Speichergerät 145 und mit der genannten Bedieneroberfläche 135 gekoppelt und erzeugt zusätzliche Bilddaten zur Darstellung der geometrischen Anordnung des Charakteristikums der Zusammensetzung relativ zu dem genannten visuellen dreidimensionalen Bild des genannten wenigstens einen Charakteristikums des genannten wenigstens einen Teils des TACE-Polypeptids auf dem Bildschirm 132 auf der Basis von Befehlen von der Bedieneroberfläche. In der Ausgestaltung von 6 ist das Speichergerät 145 ein Bestandteil des Speichers 110.
Die Speicherregionen 112 des ersten Typs und die genannten Speicherregionen 114 des zweiten Typs sind Regionen von beispielsweise einem Halbleiterspeicher, Regionen einer Bildplatte oder Regionen eines Magnetspeichers.
In einer Ausgestaltung haben der Prozessor 120 und der Videospeicher 110 die Form eines UNIX oder VAX Computers, wie die von Silicon Graphics, Sun Microsystems und IBM erhältlichen. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung dieser speziellen Hardware und Software beschränkt.
Die Erfindung wird anhand der folgenden illustrativen Beispiele ausführlicher beschrieben. Die Beispiele können zwar nur ausgewählte Ausgestaltungen der Erfindung repräsentieren, aber es zu verstehen, dass die folgenden Beispiele illustrativ und nicht begrenzend sind.
1. Beispiel – Expression, Isolation und Reinigung eines TACE-Polypeptids
cDNA, die das Signalpeptid, Pro- und katalytische Domänen von TACE, Aminosäurereste 1-477, kodiert, wie in Black et al., „A Metalloproteinase disintigrin that releases tumour-necrosis factor-α from cells", Nature 385:729-733 (Feb. 1997) offenbart, wobei Ser266 in Ala geändert und Asn452 in Gln geändert und die Sequenz Gly-Ser-(His)₆ zum C-Terminus hinzugefügt war, wurde in einen Expressionsvektor für CHO-Zellen eingefügt. Das TACE-Polypeptid wurde in CHO-Zellen exprimiert und ein Gemisch des TACE-Polypeptids, beginnend entweder mit Val212 oder Arg215, wurde sekretiert. Die Zellen wurden in dem Wirkstoff Methotrexat kultiviert, der Zellen abtötete, die den Vektor nicht einbezogen.
Das exprimierte TACE-Polypeptid wurde anschließend gereinigt. Die Reinigung begann mit 5 Litern des Mediums, das das exprimierte TACE-Polypeptid enthielt. Das Medium wurde mit einer TFF-Diafiltrationseinheit von Millipore (Cut-off 10.000, 1 ft²) auf etwa 200 ml konzentriert. Die Pumpgeschwindigkeit betrug 50-100 ml/min. Zwei Liter einer Pufferlösung aus 20 mM Tris (pH 7,5) und 300 mM NaCl (Puffer E) wurden anschließend zur Probe gegeben.
Die Probe wurde wie oben beschrieben rekonzentriert und ein zweites Mal mit 2 Litern Puffer E verdünnt, noch einmal rekonzentriert, ein drittes Mal mit 2 Litern Puffer E verdünnt und auf etwa 100 ml rekonzentriert. Die in der Diafiltrationseinheit zurückgehaltene Probe wurde durch Rückspülung gewonnen. Dieses Material wurde dann durch einen 0,45 μm filtriert und Azid wurde zu 0,05 % zugegeben. Die filtrierte Probe wurde über Nacht bei 4°C gelagert.
Nach der Übernachtlagerung wurde Imidazol zur filtrierten Probe zu 5 mM aus einer 200 mM Vorratslösung in Wasser gegeben und ZnCl₂ wurde zu 5 μM aus einer 1 M Vorratslösung in Wasser zugegeben. Die Probe wurde dann über 2,2 ml Qiagen Ni-NTA Superflow-Harz (Kat. Nr. 30430) mit 3 ml/min (Säulengröße 7,5 × 50 mm) gepumpt.
Die Säule wurde mit 100 ml eines Puffers aus 20 mM Tris, pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM Imidazol und 5 μM ZnC₂ (Puffer A) mit 5 ml/min gewaschen. Das Protein wurde dann mit einem zunehmenden Gradient von Imidazol (bis auf 200 mM in 1 Minute) (5 ml Gesamtvolumen) eluiert, gefolgt von 35 ml 200 mM Imidazol in Puffer A. Zwei-ml-Fraktionen wurden aufgefangen, wobei sich TACE im Allgemeinen nach 6 ml Elution ablöst. Die Fraktionen wurden in Röhrchen aufgefangen, die 500 μl von 50 % Glycerol in Wasser und 200 μl von 1 M Tris, pH 8, enthielten. Das Glycerol in Wasser wurde am Tag des Säulenlaufs präpariert.
Ein Dot-Blot, mit 3 μl von jeder Fraktion, wurde mit Amidoschwarz gefärbt, um zu bestimmen, welche Fraktionen eine wesentliche Proteinmenge enthielten. Die Fraktionen mit einer wesentlichen Proteinmenge wurden gepoolt. Der Pool wurde dann mit einem Amicon Centriprep-Konzentrator (Cut-off 10.000) auf 1-2 ml konzentriert.
Der Inhibitor N-{D,L-2-(Hydroxyaminocarbonyl)methyl-4-methylpentanoyl}-L-3-amino-2-dimethylbutanoyl-L-alanin, 2-(amino)ethylamid wurde zur konzentrierten Proben zu 1 mM aus einer 50 mM Vorratslösung in Wasser gegeben, und Octylglucosid wurde zu 1 % aus einer 10 % Vorratslösung in Wasser zugegeben. Die Probe wurde dann bei Raumtemperatur 15 bis 24 Stunden lang inkubiert.
Nach der Inkubation wurde die Probe auf eine 21,5 × 600 mm Größenausschlusssäule, LKB 2135-365, aufgetragen, die mit TSK-G3000 SWG gepackt und mit 10 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 % Glycerol äquilibriert worden war. Dieser Puffer wurde dann durch die Säule mit 2,5 ml/min 100 Minuten lang gepumpt. Das TACE-Polypeptid in dem Abfluss wurde durch Absorption bei 280 nm nachgewiesen. Ausgeschlossenes Material eluierte im Allgemeinen nach etwa 38 Minuten. Das reine TACE eluierte im Allgemeinen nach etwa 78 Minuten oder später.
Anschließend wurde eine Gelanalyse mit 15 μl aller Fraktionen mit wesentlichem Protein durchgeführt, um zu bestimmen, welche Fraktionen gepoolt werden sollten. Der Größenausschlusschromatographie-Pool wurde mit einem Amicon Centriprep-Konzentrator (Cut-off 10.000) auf etwa 1 ml konzentriert.
Der Inhibitor N-{D,L-2-(Hydroxyaminocarbonyl)methyl-4-methylpentanoyl}-L-3-amino-2-dimethylbutanoyl-L-alanin, 2-(amino)ethylamid wurde dann zur gereinigten Probe mit einer Konzentration von 1 mM gegeben. Das Protein kann bei 4°C gelagert werden.
2. Beispiel – Proteinkristallisation
Ein DNA-Konstrukt, das die Prodomäne und die katalytische Domäne von humanem TACE (Reste 1-477) umfasste, wurde mit der Sequenz Gly-Ser-(His)₆ fusioniert, um eine Reinigung des Proteins auf einer Ni-NTA Affinitätssäule zu erleichtern. Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) wurden als Zellen zur Proteinexpression verwendet. Die Zellen sekretierten ein Gemisch aus reifem TACE, beginnend entweder mit Val212 oder Arg215. TACE-haltige Fraktionen von der Ni-NTA-Säule wurden in einem Puffer aus Octylglucosid und dem Bindungspartner N-[D,L-[2-(Hydroxyaminocarbonyl)methyl]-4-methyl-pentanoyl)-L-3-(tert-butyl)-glycyl-L-alanin inkubiert. Der letzte Reinigungsschritt erfolgte auf einer Gelfiltrationssäule. Gereinigtes TACE wurde in einem Puffer aus 10 mM Tris/HCL, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 % Glycerol und 1 mM Inhibitor (TACE-Puffer) gelagert.
Kristallisationsexperimente wurden mit einer TACE-Konzentration von etwa 5 mg/ml durch Vermischen von TACE (in TACE-Puffer) in einem Verhältnis von 1:1 mit den nachfolgend aufgelisteten Kristallisationspuffern und unter Anwendung der „Sitting-drop"-Dampfdiffusionstechnik aufgestellt. Die Experimente erfolgten in zweifacher Ausführung, wobei eine Inkubation entweder bei etwa 4°C oder bei 20°C stattfand. Kristallines Präzipitat wurde bei 20°C in den folgenden Kristallisationspuffern erhalten:

Puffer A) 0,1 M Na-Acetat, pH 5,3, 0,2 M CaCl₂, 30 % v/v Ethanol
Puffer B) 0,1 M Na-Citrat, pH 5,0, 40 % v/v Ethanol
Puffer C) 0,1 M Na-Citrat, pH 8,7, 20 % w/v PEG 4000, 20 % v/v Isopropanol

Kleine Kristalle wurden nach dem Übertragen von Keimen von dem kristallinen Präzipitat mit einem Kaninchenhaar in ein 1:1-Gemisch aus einer konzentrierten Probe von TACE (12 mg/ml in TACE-Puffer) und entweder Puffer B oder C erhalten. Eine weitere Verfeinerung von Puffer C ergab Puffer D, der die Produktion von Kristallen ermöglichte, die für die Röntgendatenerfassung geeignet waren.

Puffer D) 0,1 M Na-Citrat, pH 5,4, 20 % w/v PEG 4000, 20 % Isopropanol

Der erste Datensatz wurde bis zu einer Reduzierung von 2,5 Å auf einem MAR300 Imaging-Plate-Scanner gemessen, der an einem addierenden Cu-Anoden-Generator von Rigaku-Denki angebracht war, der mit 5,4 kW betrieben wurde und eine graphitmonochromatisierte CuKα-Strahlung lieferte. Die Daten wurden mit dem MOSFLM v. 5.23 Programm und Routinen der CCP4 Suite verarbeitet. Keiner der Versuche zur Aufdeckung der Struktur durch Molekülaustauschverfahren unter Verwendung von Adamalysin II, einem Vollalanin-Modell von Adamalysin II und generierten Modellen konnte nützliche Ansatzpunkte zur Phaseneinstellung produzieren. Folglich wurden die Standorte von vier unabhängigen Zinkatomen mit Hilfe einer anomalen Differenz-Patterson-Synthese bestimmt. Zur Messung der MAD-Daten wurden die Kristalle in Flüssigstickstoff tiefgefroren. Hierzu wurden die Kristalle mit Hilfe einer Seidenschlinge von angemessener Größe in einen Kryopuffer (80 % v/v Puffer D mit 17 % v/v Glycerol) übertragen, etwa 10 Sekunden lang eingeweicht und dann sofort bei 90°K tiefgefroren.
Die gewonnenen Kristalle gehören zur monoklinen Raumgruppe P2₁, haben die Zellkonstanten a = 61,38 Å (Angström), b = 126,27 Å, c = 81,27 Å, β = 107,41° und enthalten vier Moleküle in der asymmetrischen Einheit.
3. Beispiel – Röntgenbeugung
Mit den im 2. Beispiel beschriebenen Kristallen wurde ein erster Datensatz bis zu einer Auflösung von 2,5 Å auf einem MAR300 Imaging-Plate-Scanner gemessen, der an einem rotierenden Cu-Anoden-Generator von Rigaku-Denki angebracht war, der mit 5,4 kW betrieben wurde und eine graphitmonochromatisierte CuKα-Strahlung lieferte. Die Daten wurden mit dem MOSFLM v. 5.23 Programm und den Routinen der CCP4 Suite verarbeitet.
Keiner der Versuche zur Aufdeckung der Struktur durch Molekülaustauschverfahren mittels Adamalysin II, einem Vollalanin-Modell von Adamalysin II und anderen Modellen ergab nützliche Ansatzpunkte zur Phaseneinstellung.
Folglich wurden die Standorte der vier unabhängigen Zinkatome mit Hilfe einer anomalen Differenz-Patterson-Synthese bestimmt. Zur Messung von MAD-Daten wurden die Kristalle in einem Stickstoffgasstrom tiefgefroren, der auf die Temperatur von Flüssigstickstoff abgekühlt war. Die Kristalle wurden zuerst in einen Kryopuffer aus 80 % v/v Puffer D (0,1 M Na-Citrat, pH 5,4, 20 % w/v PEG 4000, 20 % v/v Isopropanol) übertragen, der 17 % v/v Glycerol enthielt. Die Übertragung in den Kryopuffer erfolgte mit Hilfe einer Seidenschlinge von geeigneter Größe. Die Kristalle wurden etwa 10 Sekunden lang in dem Kryopuffer eingeweicht und dann sofort bei 90 K tiefgefroren.
Anomale Beugungsdaten bis zu 2,0 Å wurden mit dem MAR345 Imaging-Plate-Scanner bei 90 K auf der Wiggler-Beamline BW6 von DORIS (DESY, Hamburg, Deutschland) unter Verwendung von monochromatischer Röntgenstrahlung bei einer Wellenlänge von maximal f'' (1,2769 Å) und minimal f'' (1,2776 Å) bei der K-Absorptionskante von Zink und bei einer entfernten Wellenlänge (1,060 Å) erfasst. Die Daten wurden gescannt und bewertet mit DENZO/SCALEPACK, woraus 77653 unabhängige Reflexionen von 1.051.836 Messungen hervorgingen (96,9 % Vollständigkeit, R-merge 0,031 in Intensitäten).
MAD-Phasen wurden verfeinert und berechnet mit MLPHARE unter Einschluss aller gemessenen Daten bis zu einer Auflösung von 2,0 Å. Ihre anfängliche mittlere Gütezahl von 0,53 wurde durch Lösungsmittelabflachungs/Histogrammanpassungsverfahren mit DM auf 0,76 erhöht. Diese Dichte ermöglichte den Aufbau der kompletten Ketten der vier unabhängigen katalytischen TALE-Domänen und der gebundenen Hydroxamsäuresubstrate auf einem SGI-System unter Verwendung von TURBO-FRODO. Dieses Modell wurde kristallographisch mit XPLOR und mit CCP4 Routinen auf einen kristallographischen R-Faktor von 18,6 % (R_free 27,4 %) unter Verwendung von 79.400 unabhängigen Reflexionen von 12,0 bis 2 Å Auflösung verfeinert.
Vier unabhängige TACE-Moleküle bilden die periodische Anordnung.
Die Moleküle 1 und 2 und 3 und 4 sind jeweils von Asp219 und Met221 bis Ser474 definiert.
4. Beispiel – Röntgenbeugung
Anomale Dispersionsbeugungsdaten bis zu 2,0 Å wurden mit einem MAR345 Imaging-Plate-Scanner bei 100 K auf der Wiggler-Beamline von DORIS (DESY, Hamburg, Deutschland) unter Verwendung von monochromatischer Röntgenstrahlung bei maximal f' (1,2797 Å) und minimal f (1,2804 Å) bei der K-Absorptionskante von Zink und bei einer entfernten Wellenlänge (1,060 Å) erfasst. Diese Daten wurden gescannt und bewertet mit DENZO/SCALEPACK, woraus 77.653 unabhängige Reflexionen hervorgingen (96,9 % Vollständigkeit, R-merge 0,031).
Die erhaltenen Strukturkoordinaten sind in Tabelle 1 aufgeführt.
TABELLE 1
5. Beispiel – TACE-Inhibitorentwurf
Die TACE Röntgenbeugungskoordinaten wurden in ein Sybyl v. 6.3 (Tripos Associates) Software-Paket eingegeben und die Röntgenstruktur wurde graphisch analysiert. Die Regionen innerhalb der ursprünglichen Röntgenkoordinaten wurden im Hinblick auf Chiralität und Atomtyp korrigiert. Das modifizierte Röntgenmodell von TACE wurde energieminimiert, bis alle TACE-Strukturparameter im Gleichgewicht waren oder optimale Werte aufwiesen. Die energieminimierte Struktur wurde dann mit der ursprünglichen Struktur verglichen, um die Abwesenheit von Anomalien zu bestätigen.
Die Standorte spezifischer Interaktionen) zwischen TACE und dem co-kristallisierten Inhibitor wurden identifiziert. Der Inhibitor wurde dann aus dem Röntgenkomplexmodell entfernt, so dass nur das TACE-Strukturmodell zurückblieb.
Kandidat-Inhibitoren wurden auf der Basis der gewünschten Orte der Interaktion mit TACE und dem Kandidat-Inhibitor im Hinblick auf die zuvor für den co-kristallisierten Inhibitor identifizierten Interaktionsorte ausgewählt. Nachdem spezifische Kandidatinhibitor-TACE-Interaktionen bestimmt worden waren, fanden Docking-Studien statt, um vorläufige „modellierte" Komplexe selektierter Kandidatinhibitoren mit TACE bereitzustellen.
Eine eingeschränkte Konformationsanalyse wurde unter Verwendung von molekularer Dynamik (MD) durchgeführt, um die Integrität des modellierten TACE-Inhibitor-Komplexes zu prüfen. Nachdem der Komplex seinen günstigsten Konformationszustand erreicht hatte, wurde die von der MD-Studie vorgeschlagene Struktur visuell analysiert, um zu gewährleisten, dass der modellierte Komplex bekanntem experimentellen SAR/QSAR auf der Basis von gemessenen Bindungsaffinitäten entsprach.
Der modellierte Kandidatinhibitor-TACE-Komplex wurde analysiert. Die Region des Komplexes, assoziiert mit den S1' Regionen von TACE mit einem kleinen lösungsmittelexponierten Kanal, wurde als Targetregion zur Modifikation gewählt. Eine einzelne Modifikation, eine Benzylgruppe, die innerhalb der Targetregion eingebettet wird, wurde auf der Basis rechnerischer und synthetischer chemischer Prinzipien selektiert. Die Benzylgruppe wurde auf einem geeigneten Zinkchelatorkern so ausgerichtet, dass sie in die S1' S3' Tasche vorragte. Diese Modifikation wandelte einen Inhibitor, der allgemein MMP-selektiv war, in einen solchen um, der TACE-selektiv war. IC50-Daten für den Inhibitor mit einer Benzylmodifikation bestätigen diese Selektivität.
Eine strukturbasierte Analogisierung zur Optimierung der Inhibitorpotenz, Selektivität und physikalischen wirkstoffartigen Eigenschaften wurde in einer iterativen Weise durchgeführt.
6. Beispiel – Messen der TACE-Inhibition
250 μM Peptidsubstrat (Ac-SPLAQAVRSSSR-NH₂) wurden mit 3,7 U/μl TACE in einem Puffer aus 10 mM TRIS HCl, pH 7,4, 10 % Glycerol bei 25°C inkubiert. Die Reaktion wurde mit 1 % TFA (Endkonzentration) nach zwei Stunden gequencht. Das Reaktionsgemisch wurde durch HPLC auf einem Hewlett-Packard 1150 separiert. Die Produktbildung wurde durch Absorbanz bei 220 nm beobachtet.
Die Linearität der Reaktion wurde bestätigt (r² > 0,85). Der Mittelwert (x ± SEM) der Kontrollrate wurde berechnet und im Hinblick auf eine statistische Signifikanz (p < 0,05) mit Wirkstofftestraten unter Verwendung von Dunnetts multiplem Vergleichstest verglichen. Dosis-Wirkungs-Beziehungen wurden mit mehreren Wirkstoffdosen erzeugt und IC₅₀-Werte mit 95 % Cl wurden unter Verwendung von linearer Regression geschätzt.
Anhand der vorangehenden Beschreibung und Beispiele kann die Fachperson die wesentlichen Charakteristiken der Erfindung ermitteln und, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen, Änderungen, Modifikationen und Variationen an der Erfindung vornehmen, um sie an verschiedene Verwendungsbereiche und Bedingungen anzupassen.
SEQUENZAUFLISTUNG
QUELLENANGABEN IN DER BESCHREIBUNG
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In der Beschreibung werden die folgenden Patentdokumente genannt:

• WO 9641624 A [0002] [0017] [0017] [0017] [0020] [0020] [0022] [0024] [0024] [0026]
• US 5011912 A , Hopp [0022]
• US 5594106 A , Black [0035]
• WO 9535367 A [0038] [0045]
• WO 9715588 A [0038] [0045]
• EP 646599 A2 [0038]
• GB 2306961 A [0038] [0045]
• WO 9708300 A [0038] [0046]
• WO 9507619 A [0053]
• US 9902185 W [0111]
• US 60117476 B [0111]
• US 09050083 B [0111]
• US 60073709 B [0111]

In der Beschreibung angeführte Nicht-Patentliteratur

• BEMELMANS et al. Tumor Necrosis Factor: Function, Release and Clearance. Crit. Rev. Immun, 1996, Bd. 16, 1-11 [0001]
• BLACK et al. A metalloproteinase disintigrin that releases tumor-necrosis factor-α from cells. Nature, 1997, Bd. 385, 729-733 [0002]
• MOSS et al. Cloning of a disintigrin metalloproteinase that processes precursor tumor-necrosis factor-α. Nature, 1997, Bd. 385, 733-736 [0002]
• ZASK et al. Inhibition of Matrix Metalloproteinases: Structure Based Design. Current Pharmaceutical Design, 1996, Bd. 2, 624-661 [0003]
• EVANS, S. SETOR: Hardware Lighted Three-Dimensional Solid Model Representations of Macromolecules. J. Mol. Graph, 1993, Bd. 11, 134-138 [0015]
• Protein Engineering. Alan R. Liss, Inc, 1987 [0016]
• BLACK et al. A Metalloproteinase disintigrin that releases tumour-necrosis factor-α from cells. Nature, Februar 1997, Bd. 385, 729-733 [0018] [0078]
• LUCKOW; SUMMERS. Bio/Technology, 1988, Bd. 6, 47 [0024]
• GLUZMAN et al. Cell, 1981, Bd. 23, 175 [0024]
• KAUFMAN, R.J. Selection and coamplification of heterologous genes in mammalian cells. Methods in Enzymology, 1990, Bd. 185, 537-566 [0025]
• COHEN et al. Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry. J. Med. Chem., 1990, Bd. 33, 883-894 [0052]
• NAVIA et al. The Use of Structural Information in Drug Design. Current Opinions in Structural Biology, 1992, Bd. 2, 202-210 [0052]
• SAUDEK et al. Three-dimensional structure of echistatin, the smallest active RGD protein. Biochem., 1991, Bd. 30, 7369-7372 [0059]
• BODE et al. Astacins. serralysins, snake venom and matrix metalloproteinases exhibit identical zinc binding environments (HEXXHXXGXXH and Met-turn) and topologies and should be grouped into a common family, the 'metzincins. FEBS Lett, 1993, Bd. 331, 134-140 [0060]
• STÖCKER et al. he metzincins: Topological and sequential relations between the astacins, adamalysins, serralysins, and matrixins (collagenases) define a superfamily of zinc-peptidases. Protein Sci, 1995, Bd. 4, 823-840 [0060]
• GRAMS et al. X-ray structures of human neutrophil collagenase complexed with peptide hydroxamate and peptide thiol inhibitors: Implications for substrate binding and rational drug design. Eur. J. Biochem., 1995, Bd. 228, 830-841 [0060]
• BLACK et al. Relaxed specificity of matrix metalloproteinases (MMPs) and TIMP intensity of tumor necrosis factor-α (TNF-α) production suggest the major TNF-α converting enzyme is not an MMP. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, Bd. 225, 400-405 [0062]
• TANG et al. Human pro-tumor necrosis factor is a homotrimer. Biochem., 1996, Bd. 35, 8216-8225 [0062]
• TANG et al. Length of the linking domain of human pro-tumor necrosis factor determines the cleavage processing. Biochem., 1996, Bd. 35, 8226-8233 [0062]
• TANG et al. Biochem., 1996, Bd. 35, 8216-8225 [0062]
• TANG et al. Biochem., 1996, Bd. 35, 8226-8233 [0062]
• JONES et al. Structure of tumor necrosis factor. Nature, 1989, Bd. 338, 225-228 [0062]
• BODE et al. Astacins, serralysins, snake venom and matmrix metalloproteinases exhibit identical zinc binding environments (HEXXHXXGXXH and Met-turn) and topologies and should be grouped into a common family, the 'metzincins. FEBS lett, 1993, Bd. 331, 134-140 [0063]
• STÖCKER et al. The metzincins: Topological and sequential relations between the astacins, adamalysins, serralysins, and matrixins (collagenases) define a superfamily of zinc-peptidases. Protein Sci, 1995, Bd. 4, 823-840 [0063]
• GOMIS-RÜTH et al. First structure of a snake venom metalloproteinase: prototype for matrix metalloproteinases/collagenases. EMBO J., 1993, Bd. 12, 4151-4157 [0063]
• ZHANG et al. Structural interaction of natural and synthetic inhibitors with the venom metalloproteinase, atrolysin C (form d. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, Bd. 91, 8447-8451 [0063]
• KUMASAKA et al. Crystal structure of H2-proteinase from the venom of Trimeresurus flavoviridis. Biochem., 1996, Bd. 119, 49-57 [0063]
• WOLFSBERG et al. ADAMs in Fertilization and Development. Developm. Biol, 1996, Bd. 18C, 389-401 [0065]
• LUNN et al. Purification of ADAM 10 from bovine spleen as a TNFα convertase. FEBS Lett, 1997, Bd. 400, 333-335 [0065]
• ROOKE et al. Science, 1996, Bd. 273, 1227-1231 [0065]
• GOMIS-RUTH et al. Refined 2.0 A crystal structure of snake venom zinc endopeptidase adamalysin II. J. Mol. Biol., 1994, Bd. 239, 513-544 [0065]
• DIMARTINO et al. Anti-arthritic activity of hydroxamic acid-based pseudopeptide inhibitors of matrix metalloproteinases and TNFα processing. Inflamm. Res, 1997, Bd. 46, 211-215 [0066]
• GOMIS-RÜTH et al. Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1. Nature, 1997, Bd. 389, 77-81 [0066]

Claims

Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die sich mit einem „TNF-α-converting enzyme"-(TACE)-Polypeptid assoziiert, das die folgenden Schritte beinhaltet: (A) Kristallisieren des genannten TACE-Polypeptids, wobei das genannte Kristallisieren Folgendes beinhaltet: (i) Beziehen eines Fragments des genannten TACE-Polypeptids, wobei das genannte Fragment im Wesentlichen aus der katalytischen Domäne von TACE besteht, (ii) Inkubieren des Fragments mit Octylglucosid in Anwesenheit eines TACE-Inhibitors und (iii) Kristallisieren des Fragments und Bestimmen der Kristallstruktur des Fragments; (B) Entwerfen einer assoziierenden Verbindung für das TACE-Polypeptid, die eine Bindung mit der katalytischen Domäne bildet, auf der Basis von Röntgenstrahlbeugungskoordinaten des TACE-Polypeptidkristalls; (C) Synthetisieren der Verbindung; und (D) Bestimmen der Assoziationsfähigkeit der Verbindung mit dem Polypeptid.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die assoziierende Verbindung ein Inhibitor, Mediator oder eine andere Verbindung ist, die die TACE-Aktivität reguliert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die assoziierende Verbindung ein kompetitiver Inhibitor, ein unkompetitiver Inhibitor oder nichtkompetitiver Inhibitor ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Koordinaten die Koordinaten der Tabelle 1 sind.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der TACE-Polypeptidkristall mit einem Bindungspartner co-kristallisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Bindungspartner ein Bindungspartner auf Hydroxamatbasis ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Bindungspartner N-{D,L-2-(Hydroxyaminocarbonyl)methyl-4-methylpentanoyl)-L-3-amino-2-dimethylbutanoyl-L-alanin,2-(amino)ethylamid ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der TACE-Polypeptidkristall eine Kristallstruktur hat, die auf 2,0 Å beugt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der TACE-Polypeptidkristall monoklin ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der TACE-Polypeptidkristall eine Einheitszelle hat, die vier kristallografisch unabhängige TACE-Domänen-(TCD)-Katalysedomänen-Moleküle hat.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die TCD-Moleküle in einer asymmetrischen Einheit sind.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der TACE-Polypeptidkristall zur monoklinen Raumgruppe P2₁ gehört und die Zelle die Konstanten a = 61,38 Å, b = 126,27 Å, c = 81,27 Å und β = 107,41° hat.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die assoziierende Verbindung dafür vorgesehen ist, sich mit der S1' Region von TACE zu assoziieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, wobei die assoziierende Verbindung dafür vorgesehen ist, sich mit der S1'S3 Tasche von TACE zu assoziieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, wobei die assoziierende Gruppe dafür vorgesehen ist, einen Anteil einzubeziehen, der Zink chelatisiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, wobei die assoziierende Verbindung dafür vorgesehen ist, eine Wasserstoffbindung mit Leu348 oder Gly349 von TACE zu bilden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, wobei die assoziierende Verbindung dafür vorgesehen ist, eine nichtpolare Gruppe einzuführen, die die S1' Tasche von TACE belegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, wobei die assoziierende Verbindung dafür vorgesehen ist, eine Gruppe einzuführen, die innerhalb des die S1'-S3' Taschen von TACE verbindenden Kanals liegt und die einen angemessen van-der-Waals-Kontakt mit dem Kanal macht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, wobei die assoziierende Verbindung dafür vorgesehen ist, eine Wasserstoffbindung mit Leu348 oder Gly349 auf den Rückgratamidgruppen von TACE zu bilden.