DE60034688T2

DE60034688T2 - Kristallstruktur einer deacetylase und deren inhibitoren

Info

Publication number: DE60034688T2
Application number: DE60034688T
Authority: DE
Inventors: Nikola New York PAVLETICH; Michael New York FINNIN; Jill North Arlington DONIGIAN; Victoria New York RICHON; Richard A. New York RIFKIND; Paul A. Washington MARKS; Ronald Englewood BRESLOW
Original assignee: Sloan Kettering Institute for Cancer Research; Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York; Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 1999-09-08
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2020-09-09
Also published as: US20070087427A1; WO2001018045A9; EP1212357B1; DE60034688D1; US20070100559A1; CA2383885A1; ES2287033T3; ATE361316T1; US20030013176A1; EP1212357A4; WO2001018045A1; JP2003518923A; EP1212357A1; US7124068B2

Description

Einführung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Homologes der Histon-Deacetylase aus dem hyperthermophilen Bakterium Aquifex aeolicus, HDLP (Histon-Deacetylase-ähnliches Protein; auch als AcuC1 bekannt), welches eine 35,2% Sequenzidentität mit der menschlichen Histon-Deacetylase (HDAC1) teilt, die mit einem inhibitorischen Ligaeden cokristallisiert werden kann, und insbesondere aus dieser hier beschriebenen Cokristallisation gewonnene genaue kristallographische Daten. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Verwendung der Kristallstruktur und der Koordinaten aus der Röntgenstrahl-Kristallographie des Apo-HDLP und von Inhibitor-gebundenem HDLP zum Entwerfen, Isolieren und Screenen von Verbindungen, die sich an das aktive Zentrum des HDLP und der mit HDLP verwandten Proteine binden und es hemmen, wie z.B. solche Proteine, welche zu der HDLP-Familie, einschließlich HDAC1, gehören.
Hintergrund der Erfindung
Die reversible Modifikation der Histone durch Acetylierung geht mit Veränderungen in der Konformation der Nucleosomen und der Struktur des Chromatins einher und spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression (Übersichtsartikel in Davie und Chadee, 1998, J. Cell Biochem. Suppl. 30–31: 203–213). Die Enzyme Histon-Acetylase und -deacetylase, welche diese Modifikationen ausführen, spielen bei vielen Zellprozessen wie der Progression und Differenzierung des Zellzyklus eine Rolle und ihre Deregulation ist mit verschiedenen Arten von menschlichem Krebs assoziiert (Übersichtsartikel in Kouzarides, 1999, Curr. Opin. Genet. Dev. 9: 40–48; Rassig et al., 1997, Chem. Biol. 4: 783–789; Fenrick und Heibert, 1998, J. Cell. Biochem. Suppl. 30–31: 194–202).
Vor kurzem ist gezeigt worden, dass einige experimentelle Antitumor-Verbindungen wie z.B. Trichostatin A (TSA), Trapoxin, Suberoylanilid-Hydroxamsäure (SAHA) und Phenylbutyrat zumindest teilweise wirken, indem sie Histon-Deacetylasen hemmen (Richon et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 95: 3003–3007; Yoshida et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 17174–17179; Kijima et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 22429–22435). Zusätzlich ist gezeigt worden, dass Diallylsulfid und verwandte Moleküle (Lea et al., 1999, Int. J. Oncol. 2: 347–352), Oxamflatin (Kim et al., 1999, Oncogene 15: 2461–2470), MS-27–275, ein synthetisches Benzamid-Derivat (Saito et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 4592–4597), Butarat-Derivate (Lea und Tulsyan, 1995, Anticancer Res. 15: 879–883), FR901228 (Nokajima et al., 1998, Exp. Cell Res. 241: 126–133), Depudecin (Kwon et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3356–3361) und m-Carboxyzimtsäure-Bishydroxamid (CBHA; Richon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3003–3007) Histon-Deacetylasen hemmen. In vitro können diese Verbindungen das Wachstum von Fibroblasten-Zellen hemmen, indem sie den Zellzyklus veranlassen, in der G1- und G2-Phase anzuhalten (Richon et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5705–5708; Kim et al., 1999, Oncogene 18: 2461–2470; Yoshida et al., 1995, Bioassays 17: 423–430; Yoshida & Beppu, 1988, Exp. Cell Res. 177: 122–131) und sie können zu der terminalen Differenzierung und dem Verlust von transformierendem Potential einer Vielzahl von transformierten Zelllinien führen (Richon et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci USA 93: 5705–5708; Kim et al., 1999, Oncogene 18: 2461–2470; Yoshida et al., 1987, Cancer Res. 47: 3688–3691). In vivo ist Phenylbutyrat zusammen mit Retinonsäure bei der Behandlung von akuter promyelozytärer Leukämie wirksam (Warrell et al., 1998, J. Natl. Cancer Inst. 90: 1621–1625). SAHA wirkt bei der Verhinderung der Bildung von Brusttumoren in Ratten und Lungentumoren in Mäusen (Desai et al., 1999, Proc. AACR 40: Abstract #2396; Cohen et al., Cancer Res.; eingereicht).
Histon-Deacetylasen katalysieren die Entfernung von Acetylgruppen aus den ε-Aminogruppen der Lysin-Reste, die nahe dem N-Terminus der Nucleosomen-Histone angehäuft sind und dieser Prozess ist mit der Repression der Transkription assoziiert (Übersichtsartikel in Struhl, 1998, Genes Dev. 12: 599– 606). Eine Deletion des Histon-Deacetylase-Gens rpd3 der Hefe oder deren pharmakologische Inaktivierung mit Trichostatin A vermindert die Transkriptions-Repression in einer Untergruppe von Promotoren, wie z.B. denen der Ume6-regulierten Gene (Kadosh & Struhl, 1998, Mol. Cell. Biol. 18: 5121–5127). Dies geht mit der erhöhten Acetylierung der H4-Histone im reprimierten Promotor und dessen Nachbarschaft einher, hat aber keine Wirkung auf Histone in den vom Promotor beabstandeten Abschnitten (Kadosh & Struhl, 1998, Mol. Cell. Biol. 18: 5121–5127; Rundlett et al., 1998, Nature 392: 831–835).
Die Histon-Deacetylasen werden zu spezifischen Promotoren hingezogen, indem sie sich mit DNA-bindenden Repressoren der Transkription assoziieren, entweder direkt oder über Corepressoren, welche die Deacetylase und die Transkriptions-Repressoren über eine Brücke miteinander verbinden. Beispielsweise binden sich der Mad- und der Ume6-Repressor an den Corepressor Sin3A (Laherty et al., 1997, Cell 89: 349–356; Rassig et al., 1997, Cell 89: 341–347; Kadosh & Struhl, 1997, Cell 89: 365–371) und die Kernrezeptoren binden N-CoR und die verwandten SMRT-Corepressoren (Nagy et al., 1997, Cell 89: 373–380; Alland et al., 1997, Nature 387: 49–55; Heinzel et al., 1997, Nature 387: 43–48).
Die Deregulation der Rekrutierung der Histon-Deacetylasen scheint einer der Mechanismen zu sein, über welche diese Enzyme zur Tumorentstehung beitragen. Bei akuter promyelozytärer Leukämie (APL) fusionieren chromosomale Translokationen den Retinonsäure-Rezeptor-α (RARα) entweder an PLZF oder an PML. Diese Fusions-Onkoproteine weisen eine anomale transkriptionelle Repressionsaktivität auf, die teilweise von der Rekrutierung eines Corepressors und dann wieder von HDACs herrührt (Grignani et al., 1998, Nature 391: 815–818; Lin et al., 1998, Nature 391: 811–814). Die Behandlung von PLZF-RARα APL-Zellen mit TSA beschleunigt deren Reaktion auf eine Retinonsäureinduzierte Differenzierung (Grignani et al., 1998, Nature 391: 815–818; Lin et al., 1998, Nature 391: 811–814).
Die Histon-Deacetylasen umfassen eine von der Hefe bis zum Menschen konservierte große Familie von Proteinen und sie werden in zwei verwandte Klassen eingeteilt. Die Klasse I wird durch HDAC1, 2, 3 des Menschen (Taunton et al., 1996, Science 272: 408–411; Yang et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 12845–12850; Emiliani et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2795–2800) und durch RPD3 der Hefe (Videl & Gaber, 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 6317–6327) charakterisiert und die Klasse II durch HDAC4, 5, 6 des Menschen (Grozinger et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4868–4873; Pischle et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 11713–11720) und HDA1 der Hefe (Rundlett et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14503 14508). Die beiden Klassen haben einen Abschnitt von 390 Aminosäuren mit Sequenzähnlichkeit gemeinsam, welcher den Deacetylase-Kern umfasst, sie divergieren jedoch außerhalb dieses Abschnitts. Die Histon-Deacetylase-Gene gehören zu einer noch größeren Superfamilie (Leipe & Landsman, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3693–3697), welche die prokyryotischen Acetoin nutzenden Proteine (AcuC; 28,1% Sequenzidentität mit NDAC1) und die prokaryotischen Acetylpolyamin-Amidohydrolasen (APAH; 15,0% Sequenzidentität mit HDAC1) enthält. Die enzymatische Aktivität von AcuC ist nicht klar, aber dessen Spaltung vermindert die Fähigkeit von B. subtilis, Acetoin abzubauen und es als Kohlenstoffquelle zu nutzen (Grundy et al., 1993, Mol. Microbiol. 10: 259–271). Die APAHs katalysieren die Deacetylierung der Polyamine, indem sie eine Amidbindung des Nicht-Peptids spalten (Übersichtsartikel bei Leipe & Landsman, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3693–3697).
Es ist nützlich, sich zu fragen, wie die HDACs und die mit HDAC verwandten Proteine die Deacetylierung der Histone katalysieren und wie die oben angegebenen Verbindungen, insbesondere solche Verbindungen mit Antitumoraktivität, diese Aktivität hemmen, um zu einem besseren Verständnis des Mechanismus der Hemmung der HDACs zu kommen und die Entdeckung von weiteren nützlichen Verbindungen zu erleichtern, welche diese Aktivität hemmen können. Zu diesem Zweck wurde in der vorliegenden Erfindung die dreidimensionale Struktur eines HDAC1-ähnlichen Proteins aus dem thermophilen Bakterium Aquifex aeolicus, im Folgenden als HDLP bezeichnet, ermittelt. Die Bestimmung der codierenden Nucleinsäuresequenz des HDLP wurde von Deckert et al., 1998, Nature 392: 353–358 beschrieben. Das codierte Protein von 375 Resten, dessen Sequenz aus der codierenden Nucleinsäuresequenz ermittelt wurde, hat eine 35,2% Aminosäuresequenz-Identität mit HDAC1 gemeinsam, deacyliert Histone in vitro und wird von TSA, SAHA und einigen anderen HDAC-Inhibitoren gehemmt. Die Ermittlung der dreidimensionalen Struktur des HDLP ist für das Design, die Identifizierung und das Screening von neuen Verbindungen für die Hemmung der HDAC-Familie von Nutzen, welche für die Hemmung des Zellwachstums sowohl in vivo als auch in vitro nützlich sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Der vorliegenden Erfindung liegt im Allgemeinen die Aufgabe zu Grunde, eine genaue dreidimensionale Struktur-Information über eine Familie von Proteinen zu liefern, welche als Histon-Deacetylasen (HDAC) bekannt sind, und insbesondere über ein Homologes aus dem hyperthermophilen Bakterium Aquifex aeolicus HDLP (Histon-Deacetylase-ähnliches Protein), welches mit der menschlichen Histon-Deacetylase (HDAC1) eine 35,2% Sequenzidentität gemeinsam hat. Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine dreidimensionale Struktur-Information eines HDLP zur Verfügung zu stellen, das an eine Inhibitor-Verbindung gebunden ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Information über die dreidimensionale Struktur von einem Kristall des Wildtyp-HDLP (SEQ ID NO: 1) erhalten (die das Wildtyp-HDLP codierende Nucleinsäure ist die SEQ ID NO: 2). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die dreidimensionale Information aus einem zwei Mutationen umfassenden mutanten HDLP erhalten, (1) Cystein 75 zu einem Serin und (2) Cystein 77 zu einem Serin (Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante; SEQ ID NO: 3) (die Nucleinsäure, welche die HDLP-Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante codiert, ist die SEQ ID NO: 4). Die HDLP-Mutante der vorliegenden Erfindung erleichtert die Ermittlung der Information über die dreidimensionale Struktur des HDLP, das an ein Zink-Atom an seiner Zink-Atom-Bindungsstelle gebunden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Information über die dreidimensionale Struktur aus einem Cokristall eines Protein-Inhibitor-Verbindungs-Komplexes erhalten, welcher das HDLP oder die HDLP-Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante und Trichostatin A (TSA) umfasst. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Information über die dreidimensionale Struktur aus einem Cokristall eines Protein-Inhibitor-Verbindungs-Komplexes erhalten, welcher das HDLP oder die HDLP-Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante und Suberoylanilid-Hydroxamsäure (SAHA) umfasst. Jede HDLP-Inhibitorverbindung oder Inhibibitorverbindung für ein mit HDLP verwandtes Protein (z.B. HDAC) kann eingesetzt werden, um einen Cokristall der vorliegenden Erfindung zu bilden.
Die Protein-Kristalle und Cokristalle des Protein-Inhibitor-Komplexes der vorliegenden Erfindung beugen bis zu einer hohen Auflösungsgrenze von mindestens gleich oder größer 4 Angström (Å). In einer bevorzugten Ausführungsform beugen die Protein-Kristalle und Cokristalle des Protein-Inhibitor-Komplexes der vorliegenden Erfindung bis zu einer hohen Auflösungsgrenze von über 2,5 Å.
Ein Kristall der vorliegenden Erfindung hat eine Raumgruppe C2 mit einem Molekül in der asymmetrischen Einheitszelle und mit Abmessungen der Einheitszelle von a = 51,4 Å, b = 93,8 Å, c = 78,7 Å und β = 96,9° (siehe z.B. Beispiel 2, unten). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform hat der Kristall eine Raumgruppe P2₁2₁2₁ mit zwei Molekülen in der asymmetrischen Einheitszelle und mit Abmessungen der Einheitszelle von a = 53,4 Å, b = 94,4 Å, c = 156,3 Å (siehe z.B. Beispiel, 2 unten). Die Struktur des HDLP umfasst ein paralleles β-Faltblatt mit zu beiden Seiten sich scharenden α-Helices. An einem Ende des β-Faltblatts weist das HDLP eine enge rohrähnliche Tasche auf, welche von einigen wohl geordneten Schleifen gebildet wird. Die Wände der Tasche sind mit hydrophoben Resten ausgekleidet und am Boden der Tasche gibt es eine Bindungsstelle für Zink und einige polare Seitenketten. Die inhibitorischen Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden in der Tasche gebunden.
Die von Kristallen des HDLP, der HDLP-Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante, der ein Zinkatom umfassenden HDLP-Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante, dem eine inhibitorische Verbindung wie TSA oder SAHA umfassenden HDLP und der eine inhibitorische Verbindung wie TSA oder SAHA umfassenden HDLP-Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante erhaltene Information über die dreidimensionale Struktur kann dazu verwendet werden, die Struktur von jedem Kristall eines mit HDLP verwandten Proteins (z.B. HDAC) oder von jedem mutanten mit HDLP verwandten Protein und insbesondere von jedem Wildtyp oder jedem mutanten mit HDLP verwandten Protein, das mit einem Liganden einschließlich einem Substrat oder einer Inhibitor-Verbindung komplexiert ist, aufzuklären. Falls die Kristalle in einer anderen Raumgruppe sind als die bekannte Struktur, kann ein Molecular Replacement eingesetzt werden, um die Struktur aufzuklären oder, falls die Kristalle in derselben Raumgruppe sind, kann eine Verfeinerung und Differenzen-Fourieranalyse eingesetzt werden. Die Struktur der mit HDLP verwandten Proteine (z.B. HDAC1) weist an den Positionen der Cα-Atome für mindestens 50% oder mehr der Aminosäuren der HDLP-Struktur mit voller Länge eine RMSD (root mean square deviation) von nicht größer als 2,0 Å auf.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Nucleinsäuremolekül zur Verfügung, das für eine HDLP-Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 3 codiert und die Nucleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 4 aufweist. Mit der Erfindung sollen auch bei mit dem HDLP verwandten Proteinen an den Cysteinresten wie bei der Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante Mutationen erzeugt werden, um die Ermittlung der Struktur dieser an ein Zink-Atom gebundenen Proteine zu erleichtern. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung Expressionsvektoren zur Verfügung, welche das Nucleinsäuremolekül enthalten, das für eine durch die SEQ ID NO: 4 wiedergegebene funktionsfähig an Kontrollsequenzen für die Expression gebundene HDLP-Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante codiert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren für den Entwurf, die Identifizierung und das Screening von potentiellen Inhibitor-Verbindungen für die HDLP/HDAC-Familie zur Verfügung zu stellen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren für einen praktischen Entwurf, Identifizierung und Screening von potentiellen Inhibitor-Verbindungen für HDLP und mit HDLP verwandte Proteine (z.B. HDACs) mit Deacetylase-Aktivität die Schritte: (a) Einsatz einer durch die Atomkoordinaten der vorliegenden Erfindung definierten dreidimensionalen Struktur eines HDLP; (b) Verwendung dieser dreidimensionalen Struktur, um die potentielle Inhibitor-Verbindung zu entwerfen oder auszusuchen; (c) Synthese und/oder Auswahl dieses potentiellen Inhibitors; (d) in Kontakt Bringen dieser potentiellen Inhibitor-Verbindung mit dem Enzym in Gegenwart eines acetylierten Substrats und (e) Bestimmung der prozentualen Hemmung der Deacetylase-Aktivität, um die inhibitorische Deacetylase-Aktivität dieser potentiellen Inhibitor-Verbindung zu ermitteln. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die Bindungseigenschaften dieser zweckmäßig entworfenen inhibitorischen Verbindung mit einem Verfahren ermittelt werden, das die Schritte umfasst: (a) Bildung eines Komplexes mit dieser inhibitorischen Verbindung und einem HDLP oder einem mit HDLP verwandten Protein; (b) Cokristallisation dieses inhibitorische Verbindung/HDLP-Komplexes; (c) Ermittlung der dreidimensionalen Struktur dieses Cokristalls über ein Molecular Raplacement oder eine Verfeinerung und Differenzen-Fourier-Analyse mit den durch die vorliegende Erfindung definierten Molekül-Koordinaten und (d) Analyse der dreidimensionalen Struktur zur Ermittlung der Bindungseigenschaften der potentiellen Inhibitor-Verbindung.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine definierte Klasse von Inhibitor-Verbindungen für die HDLP/HDAC-Familie zu identifizieren. Es werden die durch die Formel (I) wiedergegebenen Inhibitor-Verbindungen für die HDLP/HDAC-Familie beschrieben:
in welcher X eine Verkappungsgruppe umfasst, die an mindestens eine Aminosäure gebunden wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe Prolin und Leucin; Y eine aliphatische Kettengruppe umfasst, die an mindestens eine Aminosäure gebunden wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe Leucin, Phenylalanin und Glycin; und Z eine Bindungsgruppe für das aktive Zentrum umfasst, welche an mindestens eine Aminosäure gebunden wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe Asparaginsäure, Tyrosin und Histidin und welche ferner an ein Zink-Atom gebunden werden kann.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Tabelle, in welcher die Statistik aus der röntgenkristallographischen Analyse eines HDLP-Kristalls, eines HDLP-TSA-Cokristalls und eines HDLP-SAHA-Cokristalls aufgelistet sind.
2 zeigt ein Alignment von verschiedenen HDAC-Homologen mit Angabe der prozentualen Sequenzidentität.
3 zeigt eine graphische Darstellung, welche die Histon-Deacetylase-Aktivität des HDLP und des HDAC1 sowie die Hemmung des HDLP und des HDAC1 durch die Inhibitoren TSA und HC-Toxin angibt.
4 Zeigt (A & B) eine schematische Wiedergabe des HDLP-Zn²⁺-TSA-Komplexes in zwei annähernd rechtwinkligen Ansichten, (C) ein Topologie-Diagramm des HDLP, das die Homologie-Abschnitte mit HDAC1 angibt sowie (D) eine schematische Nahdarstellung des HDLP-Zn²⁺-SAHA-Komplexes.
5 zeigt (A) eine schematische Darstellung eines Dünnschnitts durch eine Oberflächendarstellung des HDLP, wobei die inneren Vertiefungen der Tasche und die Position des β-Faltblatts angegeben sind, (B) eine schematische Wiedergabe einer Nahdarstellung des aktiven Zentrums mit Blickrichtung nach unten in die Tasche in einer ähnlichen Orientierung wie in 4B.
6 zeigt (A) eine raumfüllende Darstellung von TSA in der Tasche mit dem aktiven Zentrum, (B) Eine Stereo-Nahansicht der Struktur des HDLP-Zn²⁺-TSA-Komplexes in einer ähnlichen Orientierung wie in 4B und (C) eine schematische Darstellung der HDLP-TSA-Wechselwirkungen.
7 zeigt (A) eine schematische Darstellung der zwischen HDLP und HDAC1 gemeinsamen Homologieabschnitte in einer ähnlichen Orientierung wie in 4A und (B) eine genaue schematische Darstellung der in der Tasche und der inneren Vertiefung zwischen HDLP und HDAC1 gemeinsamen Homologie in einer ähnlichen Orientierung wie in 4B.
8 zeigt eine schematische Darstellung des vorgeschlagenen katalytischen Mechanismus für die Deacetylierung von acetyliertem Lysin.
9 zeigt eine schematische Darstellung eines raumfüllenden Diagramms welches die konservierten Aminosäuren im aktiven Zentrum und den nahe gelegenen Furchen zeigt.
10 ist die Nucleinsäuresequenz des HDLP aus Aquifex aeolicus (SEQ ID NO: 2).
11 ist die Aminosäuresequenz des HDLP in voller Länge aus Aquifex aeolicus (SEQ ID NO: 1).
12 ist die Nucleinsäuresequenz der Mutante Tyr297Phe des aktiven Zentrums des HDLP (SEQ ID NO: 6).
13 ist die Aminosäuresequenz der Mutante Tyr297Phe des aktiven Zentrums des HDLP (SEQ ID NO: 5).
14 ist die Nucleinsäuresequenz einer Doppelmutante des HDLP aus Aquifex aeolicus mit einer Cys75Ser- und einer Cys77Ser-Mutation (SEQ ID NO: 4).
15 ist die Aminosäuresequenz einer Doppelmutante des HDLP aus Aquifex aeolicus mit einer Cys75Ser- und einer Cys77Ser-Mutation (SEQ ID NO: 3).
16-1 bis 16-49 listet die Atomstrukturkoordinaten für HDLP auf, wie sie durch Röntgenbeugung von einem HDLP-Kristall gewonnen wurden.
17-1 bis 17-49 listet die Atomstrukturkoordinaten für die Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante des HDLP mit einem Zinkatom im aktiven Zentrum auf, wie sie durch Röntgenbeugung von einem Kristall der HDLP-Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante gewonnen wurden.
18-1 bis 18-99 listet die Atomstrukturkoordinaten für die Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante des HDLP auf, wie sie durch Röntgenbeugung von einem Cokristall des mit TSA komplexierten HDLP gewonnen wurden.
19-1 bis 19-48 listet die Atomstrukturkoordinaten für die Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante des HDLP auf, wie sie durch Röntgenbeugung von einem Cokristall des mit SAHA komplexierten HDLP gewonnen wurden.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung wird durch die Ansprüche definiert. Ein von den Ansprüchen nicht abgedeckter Gegenstand dient nur den Zwecken der Veranschaulichung.
Die vorliegende Erfindung stellt Kristalle eines Histon-Deacylase (HDAC)-Homologen zur Verfügung, welche in Gegenwart und Abwesenheit einer Verbindung gezüchtet wurden, welche in der Lage ist, die Histon-Deacetylase-Aktivität dieses HDAC-Homologen zu hemmen. Das hier so genannte HDAC-Homologe (ebenso wie ein mit HDLP verwandtes Protein) ist jedes Proteinmolekül (a) mit einer mehr als 15% Sequenzidentität mit dem HDLP über dessen 375 Aminosäurereste hinweg; (b) mit nicht mehr als 20 Insertionen oder Deletionen für insgesamt nicht mehr als 100 Aminosäuren und (c) mit Deacetylase-Aktivität. Die Sequenzidentität wird mit dem Programm DNAstar^TM unter Einsatz der Identity-Matrix-Weighing-Scheme-Clustal-Methode (DNAstar program, Madison, WI) berechnet.
Eine hier verwendete HDLP/HDAC-Inhibitor-Verbindung bezieht sich auf jede durch die Formel (I) wiedergegebene Verbindung:
in welcher X eine Verkappungsgruppe umfasst, die an mindestens eine Aminosäure gebunden wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe Tyrosin, Prolin und Leucin; Y eine aliphatische Kettengruppe von etwa 5 bis etwa 10 Å, vorzugsweise 7 Å, umfasst, die an mindestens eine Aminosäure gebunden wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe Phenylalanin und Glycin; und Z eine Bindungsgruppe für das aktive Zentrum umfasst, welche an mindestens eine Aminosäure gebunden wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe Asparaginsäure, Tyrosin und Histidin und welche ferner an ein Zink-Atom gebunden werden kann. Die inhibitorischen HDAC-Verbindungen der vorliegenden Erfindung können mehr als 50% der Histon-Deacetylase-Aktivität eines HDAC-Homologen oder eines mit HDLP verwandten Proteins hemmen.
Um die Kristalle der vorliegenden Erfindung zu züchten werden das HDAC und der HDAC-Inhibitor-Verbindungs-Komplex auf mehr als 80% Gesamtprotein und mehr bevorzugt auf mehr als 90% Gesamtprotein gereinigt. Für die Zwecke der Expression und Reinigung kann das HDLP in voller Länge (Genbank-Hinterlegungsnummer WE000719) aus einem Chromosomen-DNA-Präparat von Aquifax aeolicus mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) subcloniert und in einen Expressionsvektor insertiert werden.
Es kann eine große Zahl von im Stand der Technik bekannten Vektor-Wirts-Systemen eingesetzt werden. Mögliche Vektoren sind, aber nicht ausschließlich, Plasmide oder modifizierte Viren, der Vektor muss aber mit der eingesetzten Wirtszelle kompatibel sein. Beispiele für Vektoren sind E. coli-Bakteriophagen wie die Lambda-Derivate oder Plasmide wie die pBR322-Derivate oder die pUC-Plasmid-Derivate, z.B. die pGEX-Vektoren (Amersham-Pharmacia, Piscataway, New Jersey), pET-Vektoren (Novagen, Madison, WI), pmal-c-Vektoren (Amersham-Pharmacia, Piscataway, New Jersey), pFLAG-Vektoren (Chiang und Roeder, 1993, Pept. Res. 6: 62–64), Baculovirus-Vektoren (Invitrogen, Carlsbad, CA; Pharmingen, San Diego, CA) usw. Die Insertion in einen Klonierungsvektor kann z.B. durch Ligation des DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor erfolgen, der über komplementäre kohäsive Enden verfügt, mittels Blunt-End-Ligation, falls keine komplementären kohäsiven Enden zur Verfügung stehen oder über Nucleotid-Linker unter Einsatz von Standard-Techniken aus dem Stand der Technik (z.B. Ausubel et al. (Hrg.), Current Protocols in Molecular Biology, (1992). Die rekombinanten Vektoren, welche die gewünschte Nucleinsäure enthalten, lassen sich dann über eine Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation usw. in eine Wirtszelle einführen, die mit dem Vektor kompatibel ist (z.B. E. coli, Insektenzellen, Säugerzellen usw.) Die Nucleinsäure kann auch in einen Shuttle-Vektor gesetzt werden, der sich in Bakterien zu großen Mengen klonieren und vervielfältigen lässt, und wird dann zur Expression in eine eukaryotische Wirtszelle eingeführt. Die Vektorsysteme der vorliegenden Erfindung können für Kontrollsequenzen für die Expression sorgen und können die Expression von Proteinen in vitro gestatten.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das HDLP in voller Länge (SEQ ID NO: 2) aus einem Chromosomen-DNA-Präparat von Aquifex aeolicus in pGEX4T3 (Amersham-Pharmacia, Piscataway, New Jersey) subcloniert. Um eine Doppelmutante mit einer Cys75Ser- und einer Cys77Ser-Mutation (SEQ ID NO: 4) zu konstruieren und um die Mutante Tyr297Phe des aktiven Zentrums des HDLP (SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6) zu konstruieren, kann eine zielgerichtete PCR-Mutagenese verwendet werden mit einer Nachprüfung mittels DNA-Sequenzierung nach dem Fachmann bekannten Verfahren (siehe z.B. Beispiel 1, unten). Die Mutanten der vorliegenden Erfindung lassen sich in einen geeigneten Expressionsvektor subclonieren und für die Produktion von Proteinen, wie oben beschrieben, in eine Wirtszelle einführen.
Die Nucleinsäuren für das HDLP der vorliegenden Erfindung können in einen Expressionsvektor subcloniert werden um ein Expressionskonstrukt zu erzeugen, so dass das erhaltene HDLP-Molekül, das produziert wird, ein Fusionsprotein umfasst, wobei dieses Fusionsprotein für eine leichte Reinigung ein Tag enthält. Der hier verwendete Begriff "Tag" bezieht sich auf alle zusätzlichen Aminosäuren, welche in einem Protein entweder C-terminal, N-Terminal oder intern vorgesehen sind, um die Reinigung leichter zu machen, um die Produktion zu verbessern oder für jeden anderen Zweck, der das Erreichen der Ziele der vorliegenden Erfindung erleichtern kann (z.B. um zu höheren Ausbeuten bei der Produktion und/oder Reinigung zu gelangen). Solche Tags sind Tags, von denen der Fachmann weiß, dass sie bei der Reinigung von Nutzen sind, wie z.B., aber nicht ausschließlich, das His-Tag, das Glutathion-S-Transferase-Tag, das Flag-Tag, das MBP (Maltose-Bindungs-Protein)-Tag usw. In einer bevorzugten Ausführungsform werden das Wildtyp-HDLP und das mutante HDLP der vorliegenden Erfindung mit einem Glutathion-S-Transferase-Tag versehen siehe Beispiel 1, unten). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die HDAC1 mit einem Flag-Tag versehen (siehe Beispiel 1, unten). Derartige mit einem Tag versehenen Proteine können auch technisch verändert werden, damit sie eine Spaltstelle wie z.B. eine Thrombin-, Enterokinase- oder Faktor X-Spaltstelle umfassen, um die Entfernung des Tags vor, während oder nach der Reinigung zu erleichtern. Vektorsysteme, welche ein Tag und eine Spaltstelle zur Entfernung des Tags zur Verfügung stellen, sind besonders nützlich für die Herstellung der Expressionskonstrukte der vorliegenden Erfindung.
Die mit Tags versehenen HDLPs und HDACs der vorliegenden Erfindung lassen sich mittels Immunoaffinität oder einer herkömmlichen Chromatographie reinigen, einschließlich, aber nicht ausschließlich, einer der folgenden Chromatographien: Glutathion-Sepharose^TM (Amersham-Pharmacia, Piscataway, New Jersey) oder ein gleich wirkendes Harz, Nickel- oder Kobalt-Reinigungs-Harze, eine Anionenaustauscherchromatographie, eine Kationenaustauscherchromatographie, hydrophobe Harze, eine Gelfiltration, ein Antiflag-Epitop-Harz, Umkehrphasenchromatographie usw. Nach der Reinigung kann das HDLP und der HDLP-Inhibitor-Verbindungs-Komplex für die Kristallisation bis über 1 mg/ml aufkonzentriert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden das HDLP und die HDLP-Inhibitor-Komplexe zur Kristallisation auf über 10 mg/ml aufkonzentriert und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden das HDLP und die HDLP-Inhibitor-Komplexe auf über 20 mg/ml aufkonzentriert
Um zu ermitteln, ob die gereinigten HDLPs der vorliegenden Erfindung eine Histon-Deacetylase Aktivität zeigen, können die gereinigten HDLPs und auch jedes mit HDLP verwandte Protein mit jedem dem Fachmann zur Ermittlung dieser Aktivität bekannten Verfahren untersucht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die gereinigten HDLPs der vorliegenden Erfindung in Gegenwart eines [³H]-Acetyl-markierten Histonsubstrats (Carmen et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 15837–15844) in einem für den Nachweis der Histon-Deacetylase-Aktivität geeigneten Puffer inkubiert (siehe Beispiel 3, unten), die Reaktion gestoppt, das freigesetzte Acetat extrahiert und dieses freigesetzte Acetat wie bei Henzel et al. (J. Biol. Chem. 266: 21936–21942 (1991); Beispiel 3, unten) beschrieben gemessen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die HDLPs der vorliegenden Erfindung in Gegenwart von ZnCl₂ inkubiert, um daraus eine Histon-Deacetylase-Aktivität zu erhalten (Beispiel 3, unten).
In einer anderen Ausführungsform umfassen die Kristalle der vorliegenden Erfindung gereinigtes Wildtyp-HDLP (SEQ ID NO: 1) und sie werden bei Raumtemperatur mit Hilfe der Dampfdiffusionsmethode im hängenden Tropfen aus einer Kristallisationslösung mit einem oder mehreren Fällungsmitteln, die ausgesucht sind aus der Gruppe Isopropanol, Polyethylenglykol und tert. Butanol (siehe Beispiel 2, unten) gezüchtet. Die Kristallisationslösung kann ferner eines oder mehrere Salze umfassen, einschließlich Salze, die ausgewählt wurden aus der Gruppe NaCl und KCl sowie einen oder mehrere Puffer, einschließlich Puffer, die ausgewählt wurden aus der Gruppe Tris(tris(hydroxymethyl)aminomethan und Bis-tris-Propan-Cl(1,3-Bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]propan) (siehe Beispiel 2, unten). Das pH der Kristallisationslösung liegt vorzugsweise zwischen pH 5–9, obwohl bei der vorliegenden Erfindung auch andere pH-Werte in Erwägung gezogen werden (siehe Beispiel 2, unten).
Um die Kristalle der vorliegenden Erfindung zu erhalten, kann jede dem Fachmann bekannte Kristallisationstechnik verwendet werden, einschließlich, aber nicht ausschließlich, einer Batch-Kristallisation, einer Dampf-Diffusion (entweder mit dem sitzenden oder dem hängenden Tropfen) sowie einer Mikrodialyse. In einigen Fällen kann auch ein Animpfen der Kristalle nötig sein, um für Röntgenstrahlung geeignete Kristalle zu erhalten. Es können daher standardisierte Animpfungen mit Mikro- und/oder Makrokristallen zum Einsatz kommen
Die Kristalle der vorliegenden Erfindung können sich in der Raumgruppe C2 mit einem Molekül in der asymmetrischen Einheit und mit den Einheitsabmessungen von a = 51,4 Å, b = 93,8 Å, c = 78,7 Å und β = 96,9° (siehe Beispiel 2, unten) ausbilden. Die Kristalle der vorliegenden Erfindung können sich auch in der Raumgruppe P2₁2₁2₁ mit zwei Molekülen in der asymmetrischen Einheit und mit den Einheitsabmessungen von a = 53,4 Å, b = 94,4 Å, c = 156,3 Å (siehe Beispiel 2, unten) ausbilden. Für die vorliegende Erfindung werden jedoch Kristalle erwogen, die sich in jeder Raumgruppe, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, C2, P2₁, P2₁2₁2₁, P3₁21, P4₃2₁2₁ und C222₁ ausbilden. Die Kristalle beugen bis zu einer Auflösung von größer als 4 Å, vorzugsweise von größer als 2,5 Å.
Um aus den Kristallen der vorliegenden Erfindung die Beugungsdaten zu sammeln, können die Kristalle in dem für das Züchten dieser Kristalle verwendeten Kristallisationspuffer blitzgefroren werden, vorzugsweise jedoch mit einer höheren Konzentration des Fällungsmittels (siehe z.B. Beispiel 2, unten). Falls das verwendete Fällungsmittel 28% PEG 1500 war, können die Kristalle beispielsweise, aber nicht ausschließlich, in der gleichen Kristallisationslösung blitzgefroren werden, welche für die Zucht des Kristalls eingesetzt wurde, wobei die Konzentration des Fällungsmittels auf 35% angehoben wird (siehe Beispiel 2, unten). Falls das Fällungsmittel kein ausreichendes Kryoprotektiv ist (d.h. nach dem Blitzgefrieren bildet sich kein Glas) können der Lösung Kryoprotektive (z.B. Glycerin, niedermolekulare PEGs, Alkohole usw.) zugesetzt werden, um nach dem Blitzgefrieren eine Glasbildung zu erreichen, vorausgesetzt, das Kryoprotektiv ist mit der Konservierung der Kristallintegrität kompatibel. Die blitzgefrorenen Kristalle werden während der Aufnahme der kristallographischen Daten mittels Röntgenbeugung bei einer Temperatur von unter –110°C gehalten, vorzugsweise bei weniger als –150°C. Die Röntgenbeugungsdaten können mit DENZO und SCALEPACK (Otwinowsky & Minor, 1997, Method Ensemble. 276: 307–326) bearbeitet werden, zur Bearbeitung der Röntgenbeugungsdaten kann jedoch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren herangezogen werden.
Um die Atomstruktur des erfindungsgemäßen HDLP zu ermitteln, können ein multipler isomorpher Ersatz (MIR), der Bau eines Modells und eine Verfeinerung durchgeführt werden. Für eine MIR-Analyse können die Kristalle in Schweratomen getränkt werden, um für die MIR-Analyse benötigte Schweratomderivate herzustellen. Der hier verwendete Begriff Schweratomderivat oder -Derivatisierung bezieht sich auf das Verfahren der Herstellung einer chemisch modifizierten Form eines Protein- oder Proteinkomplex-Kristalls, wobei das Protein in dem Kristall spezifisch an ein Schweratom gebunden ist. In der Praxis wird ein Kristall in einer Lösung getränkt, welche Schwermetallatome oder -salze oder metallorganische Verbindungen enthält, z.B. Bleichlorid, Goldcyanid, Thimerosal, Bleiacetat, Uranylacetat, Quecksilberchlorid, Goldchlorid usw., welche durch den Kristall diffundieren können und sich spezifisch an das Protein binden. Die Position(en) des (der) gebundenen Schwermetallatoms (Schwermetallatome) oder -salze können mittels eine Röntgenstrahlbeugungs-Analyse des getränkten Kristalls ermittelt werden. Diese Information wird dazu verwendet, eine MIR-Phaseninformation zu erzeugen, die dazu benutzt wird, die dreidimensionale Struktur des kristallisierten HDLPs und der mit HDLP verwandten Proteine der vorliegenden Erfindung zu konstruieren. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Schweratome Thimerosal, KAu(CN)₂ und Pb(Me)₃OAc (siehe Beispiel 2, unten). Die MIR-Phasen können mit jedem dem Fachmann bekannten Programm berechnet werden und vorzugsweise mit dem Programm MLPHARE (The CCP4 suite: Programs for computational crystallography, 1994, Acta Crystallogr. D. 50: 760–763) und es kann auch das anormale Beugungssignal aus dem Thimerosalderivat verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wurden die MIR-Phasen bei 2,5 Å berechnet und haben eine mittlere Figure of merit von 0,55 (siehe 19 und Beispiel 2, unten). Die Phasen können, wenn nötig, durch Solvent-flattening nach dem Fachmann bekannten Verfahren verbessert werden, einschließlich, aber nicht ausschließlich, durch die Verwendung des Programms DM (The CCP4 suite: Programs for computational crystallography, 1994, Acta Crystallogr. D. 50: 760–763).
Danach kann ein Anfangsmodell der dreidimensionalen Struktur unter Einsatz des Programms O (Jones et al., 1991, Acta Crystallogr. A 47: 110–119) erstellt werden. Die Interpretation und der Aufbau der Struktur lässt sich durch den Einsatz des Programms CNS (Brunger et al., 1998, Acta Crystallogr. D 54: 905–921) weiter erleichtern.
Falls die Raumgruppe des Kristalls des HDLP-Inhibitor-Verbindungs-Komplexes unterschiedlich ist, lässt sich für die Ermittlung der Struktur des HDLP-Inhibitor-Verbindungs-Komplexes ein Molecular Replacement einsetzen, indem eine bekannte Struktur für Apo-HDLP (unter dem hier verwendeten Ausdruck Apo-HDLP oder Apo- HDAC wird das Enzym verstanden, das nicht mit einer Inhibitor-Verbindung komplexiert ist) oder irgend eine bekannte Struktur eines HDLP/Inhibitor-Komplexes verwenden, dessen Struktur wie oben und unten in Beispiel 2 beschrieben, ermittelt werden kann. Falls die Raumgruppe des Kristalls der HDLP-Inhibitor-Verbindung die gleiche ist, kann ein rigid body refinement und eine Differenz-Fourier-Synthese eingesetzt werden, um die Struktur unter Einsatz einer bekannten Struktur für das Apo HDLP (unter dem hier verwendeten Ausdruck Apo-HDLP oder Apo-HDAC wird das Enzym verstanden, das nicht mit einer Inhibitor-Verbindung komplexiert ist) oder irgendeiner bekannten Struktur des HDLP/Inhibitor-Komplexes aufzuklären.
Der Ausdruck "Molecular Replacement" bezieht sich auf ein Verfahren, in welchem ein vorläufiges Modell der dreidimensionalen Struktur des erfindungsgemäßen HDLP-Kristalls erstellt wird, dessen Strukturkoordinaten vor der Verwendung des Molecular Replacement unbekannt sind. Ein Molecular Replacement wird erreicht, indem ein Molekül, dessen Strukturkoordinaten bekannt sind (in diesem Falle das zuvor bestimmte Apo-HDLP), in der Einheitszelle, wie sie durch das Röntgenbeugungsmuster definiert wird, das aus einem HDLP-Kristall oder dem Kristall eines mit HDLP verwandten Proteins erhaltene wurde, dessen Struktur unbekannt ist, so ausgerichtet und positioniert wird, dass das beobachtete Beugungsmuster des unbekannten Kristalls damit am besten erklärt wird. Die Phasen lassen sich dann aus diesem Modell berechnen und mit den beobachteten Amplituden kombinieren, um eine ungefähre Fourier-Synthese der Struktur zu liefern, deren Koordinaten unbekannt sind. Diese kann dann wieder zum Gegenstand von irgendwelchen verschieden Formen von Verfeinerungen gemacht werden, um schließlich eine genaue Struktur zu liefern.
Jede dem Fachmann bekannte Methode kann verwendet werden, um durch Molecular Replacement die Struktur zu ermitteln. Beispielsweise kann das Programm AMORS (The CCP4 suite: Programs for computational crystallography, 1994, Acta Crystallogr. D. 50: 760–763) verwendet werden, um die Struktur einer unbekannten Histon-Deacetylase +/– einen Inhibitor mittels Molecular Replacement zu ermitteln, indem die Apo-HDLP-Koordinaten eingesetzt werden (16). Zur Ermittlung der Struktur der inhibitorischen Verbindung TSA wurde die Struktur von TSA aus der Cambridge Structural Database (Refcode TRCHST, <<http://www.ccdc.cam.ac.uk>>) erhalten und kann dazu verwendet werden, die bei der Verfeinerung mit dem Programm CNS (Brunger et al., 1998, Acta Crystallogr. D 54: 905–921) benutzten sterischen Hinderungen zu definieren.
Die Information über die dreidimensionale Struktur und die mit dieser Struktur Information assoziierten Atomkoordinaten des HDLP sind für die mittels Molecular Replacement erfolgende Aufklärung der Struktur von kristallisierten Proteinen von Nutzen, die zur HDAC-Familie gehören. Auf ähnliche Weise lässt sich jede Struktur eines kristallisierten Proteins, von dem man denkt, dass es wegen seiner Funktions- oder Sequenzähnlichkeit oder Identität mit HDLP eine ähnliche Struktur aufweist, mittels Molecular Replacement mit der Struktur-Information für das erfindungsgemäße HDLP aufklären. Die, wie oben und in Beispiel 2 unten beschrieben, mit Hilfe des Molecular Replacement ermittelte Struktur der mit HDLP verwandten Proteine weisen in den Positionen der Cα-Atome für mindestens 50% oder mehr der Aminosäuren der Struktur über die volle Länge der 375 Aminosäurereste des HDLP eine mittlere Quadratwurzel-Abweichung (RMSD, root mean square deviation) von nicht größer als 2,0 Å auf. Auf Grund der Identität in der Aminosäuresequenz kann eine derartige RMSD erwartet werden (Chothia & Lesk, 1986, Embo J. 5: 823–826).
Die verfeinerten dreidimensionalen HDLP-Strukturen der vorliegenden Erfindung, speziell von Apo-HDLP, des Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutanten-HDLP mit einem Zink-Atom im aktiven Zentrum, des HDLP/TSA-Komplexes mit einem Zink-Atom im aktiven Zentrum und des HDLP/SAHA-Komplexes mit einem Zink-Atom im aktiven Zentrum, werden durch die in den 16 bzw. 19 wiedergegebenen Atomkoordinaten dargestellt. Das verfeinerte Modell für das Apo-HDLP mit den Aminosäuren 1–375 besteht aus den Wildtyp-HDLP-Resten 2 bis 373, wobei die Reste 1, 374 und 375 nicht modelliert und vermutlich ungeordnet sind, und wurde bis zu einer Auflösung von 1,8 Å ermittelt. Ähnlich besteht auch das verfeinerte Modell für das Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutanten-HDLP mit einem Zink-Atom im aktiven Zentrum aus den Resten 2 bis 373, wobei die Reste 1, 374 und 375 nicht modelliert und vermutlich ungeordnet sind, und wurde bis zu einer Auflösung von 2,0 Å ermittelt. Das verfeinerte Modell für den HDLP/TSA-Komplex mit einem Zink-Atom im aktiven Zentrum besteht aus den Resten 2 bis 373 für das Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutanten-HDLP mit den nicht modellierten und vermutlich ungeordneten Resten 1, 374 und 375, hat TSA in der Bindungstasche und wurde bis zu einer Auflösung von 2,0 Å ermittelt. Der HDLP/SAHA-Komplex ähnelt dem HDLP/TSA-Komplex, hat aber SAHA in der Bindungstasche und wurde bis zu einer Auflösung von 2,5 Å ermittelt.
Für eine weitere Beschreibung der Strukturen des HDLP und der mit HDLP verwandten Proteine, einschließlich, aber nicht ausschließlich, den HDACs, aus den von HDLP-Kristallen der vorliegenden Erfindung erhaltenen Daten, wird die Definition der folgenden Ausdrücke angegeben:
Der Ausdruck "β-Faltblatt" bezieht sich auf zwei oder mehr Polypeptidketten (oder β-Stränge), die Seite an Seite zueinander verlaufen und regelmäßig über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den C=O- und N-H-Gruppen der Hauptkette miteinander verbunden sind. Daher bestehen alle Wasserstoffbrückenbindungen in einem β-Faltblatt zwischen verschiedenen Segmenten des Polypeptids. Die meisten β-Faltblatt-Strukturen in Proteinen sind durchgehend parallel (im Innern des Proteins) oder durchgehend antiparallel (eine Seite dem Lösungsmittel die andere dem hydrophoben Kern zugewandt) angeordnet. Die Wasserstoffbrückenbindungen in antiparallelen Faltblattstrukturen stehen senkrecht zu der Richtung der Kette und sind als Paare zwischen den Strängen gleichmäßig voneinander beabstandet. Die Wasserstoffbrückenbindungen in parallelen Faltblattstrukturen sind in Bezug auf die Kettenrichtung schräg angeordnet und zwischen den Strängen gleichmäßig voneinander beabstandet.
Der Ausdruck "α-Helix" bezieht sich auf die in globulären Proteinen am häufigsten anzutreffende Helix-Konformation. Die mittlere Länge einer α-Helix erstreckt sich über 10 Aminosäurereste. In einer α-Helix weisen alle Amid-Protonen zum N-terminalen Ende hin und alle Carbonylsauerstoffatome weisen zum C-terminalen Ende hin. Die sich wiederholende Eigenschaft der phi, psi-Paare gewährleistet diese Ausrichtung. Die Wasserstoffbrückenbindungen innerhalb einer Helix zeigen auch ein sich wiederholendes Muster, in welchem die C=O-Gruppe im Grundgerüst des Restes X (X bezieht sich auf jede Aminosäure) zur H-H-Gruppe im Grundgerüst des Restes X+4 eine Wasserstoffbrücke ausbildet. Die α-Helix weist eine schraubenförmig gewundene Struktur auf, welche durch 3,6 Reste pro Windung gekennzeichnet ist und längs ihrer Achse pro Aminosäure um 1,5 Å fortschreitet. Somit beträgt die Ganghöhe 3,6 × 1,5 oder 5,4 Å. Die Schraubenrichtung einer α-Helix ist immer rechtshändig.
Der Ausdruck "Schleife" bezieht sich auf jede andere Konformation von Aminosäuren (d.h. keine Helix, kein Strang und kein Faltblatt). Darüber hinaus kann eine Schleife Bindungswechselwirkungen zwischen den Seitenketten der Aminosäuren aufweisen, jedoch nicht repetitiv und regelmäßig.
Die Aminosäurereste in den Peptiden werden in der weiteren Beschreibung wie folgt abgekürzt: Phenylalanin ist Phe oder F; Leucin ist Leu oder L; Isoleucin ist Ile oder I; Methionin ist Met oder M; Valin ist Val oder V; Serin ist Ser oder S; Prolin ist Pro oder P; Threonin ist Thr oder T; Alanin ist Ala oder A; Tyrosin ist Tyr oder Y; Histidin ist His oder H; Glutamin ist Gln oder Q; Asparagin ist Asn oder N; Lysin ist Lys oder K; Asparaginsäure ist Asp oder D; Glutaminsäure ist Glu oder E; Cystein ist Cys oder C; Tryptophan ist Trp oder W; Arginin ist Arg oder R und Glycin ist Gly oder G. Für eine weitergehende Beschreibung der Aminosäuren kann auf Proteins: Structure and Molecular Properties von Creighton, T.E., W.H. Freemen & Co., New York 1983 zurückgegriffen werden.
Der Ausdruck "positiv geladene Aminosäure" bezieht sich auf jede Aminosäure mit einer unter normalen physiologischen Bedingungen positiv geladenen Seitenkette. Beispiele für positiv geladene Aminosäuren sind Arg, Lys und His. Der Ausdruck "negativ geladene Aminosäure" bezieht sich auf jede Aminosäure mit einer unter normalen physiologischen Bedingungen negativ geladenen Seitenkette. Beispiele für negativ geladene Aminosäuren sind Asp und Glu. Der Ausdruck "hydrophobe Aminosäure" bezieht sich auf jede Aminosäure mit einer ungeladenen unpolaren Seitenkette, welche in Wasser relativ unlöslich ist. Beispiele für hydrophobe Aminosäuren sind Ala, Leu, Ile, Gly, Val, Pro, Phe, Trp und Met. Der Ausdruck "hydrophile Aminosäure" bezieht sich auf jede Aminosäure mit einer ungeladenen polaren Seitenkette, welche in Wasser relativ löslich ist. Beispiele für hydrophile Aminosäuren sind Ser, Thr, Tyr, Asp, Gln und Cys. Der Ausdruck "aromatische Aminosäure" bezieht sich auf jede Aminosäure mit einer Ringstruktur. Beispiele für aromatische Aminosäuren sind His, Phe, Trp und Tyr.
Der Ausdruck "Charge-Relay-System" bezieht sich auf eine His-Asp-Anordnung wie sie von Fersht & Sperling, 1973, J. Mol. Biol. 74: 137–149 und Blow et al., 1969, Nature 221: 337–340 beschrieben wurde.
Die aus den dreidimensionalen Strukturen der vorliegenden Erfindung erhaltene Information zeigt, dass das HDLP die Struktur einer Einzeldomäne aufweist, welche zu der offenen α/β- Faltungsklasse gehört (siehe z.B. Branden, 1980, Q. Rev. Biophys. 13: 317–338). In den 4A und 4B werden zwei rechtwinklig zueinander stehende Ansichten der gesamten dreidimensionalen Struktur des HDLP gezeigt. Die HDLP-Struktur weist eine zentral gelegene achtsträngige parallele Faltblattstruktur auf (die Stränge sind als β2-β1-β3-β8-β7-β4-β5-β6 angeordnet) sowie 16 α-Helices (jeweils α1 bis α16 markiert) (siehe 4C). Vier der Helices scharen sich auf jeder Seite des β-Faltblatts (α7, α8, α9, α10 sowie α11, α12, α13, α14) und bilden die für diese Faltungsklasse charakteristische α/β-Struktur des Kerns. Die meisten der restlichen 8 Helices sind nahe einer Seite des β-Faltblatts in der Nähe der Stränge β2-β1-β3-β8 positioniert. Aus den C-terminalen Enden der β-Stränge entspringen große gut definierte Schleifen (Schleifen L1 bis L7; 4C). Die zusätzlichen Helices und die großen L1- bis L7-Schleifen sind mit einer signifikanten Ausdehnung der Struktur über das α/β-Strukturmerkmal des Kerns hinaus assoziiert. Diese Ausdehnung der Struktur hat zwei herausragende architektonische Merkmale zur Folge: eine tiefe schmale Tasche und einen an die Tasche angrenzenden inneren Hohlraum. Diese beiden architektonischen Merkmale umfassen das aktive Zentrum (siehe 5A). Die Struktur der mit HDLP verwandten Proteine (z.B. der HDACs) kann auch die konservierte charakteristische α/β-Struktur umfassen.
Der Begriff "aktives Zentrum" umfasst einige oder alle der folgenden Orte im HDLP, den Substrat-Bindungs-Ort, den Ort, wo sich die Abspaltung einer Acetylgruppe von einem Substrat abspielt oder den Ort, wo ein Inhibitor der HDAC-Familie oder insbesondere des HDLP gebunden wird. Das hier beschriebene aktive Zentrum umfasst Asp166, Asp258, His170, Tyr297, His131, His132, Asp168, Asp173, Phe141, Phe198, Leu265, Pro22 und Gly140 und auch ein am Boden der Tasche durch Asp173, Asp168 und His gebundenes Metall, welche durch die Koordinaten in den 16 bis 19 mit einer RMSD von 2,0 Å definiert sind. Das am Boden der Tasche gebundene Metall ist ein zweiwertiges Kation, das ausgewählt ist aus der Gruppe Zink, Cobalt oder Mangan.
Die tiefe enge Tasche hat eine röhrenförmige Gestalt mit einer Tiefe von –11 Å. Die Öffnung der Tasche verengt sich auf halbem Wege nach unten auf τ 4,5 bis 5.5 Å und wird am Boden wieder breiter (siehe 5A). Die Tasche und ihre unmittelbare Umgebung werden von den Schleifen L1 bis L7 gebildet.
Die Wände der Tasche sind mit den Seitenketten der hydrophoben und aromatischen Reste bedeckt (Pro22, Tyr91 nahe dem Eingang und Gly140, Phe141, Phe198, Leu265 und Tyr297 weiter unten; 5B). Zur Nummerierung der Aminosäuren siehe SEQ ID NO: 1. Von besonderem Interesse sind Phe141 und Phe198, deren Phenylgruppen sich parallel in einem Abstand von 7,5 Å gegenüberstehen und den schmalsten Abschnitt der Tasche markieren (siehe 5B). Von besonderem Interesse ist, dass sich bei einem Alignment der Sequenzen nur ein Rest der Tasche in HDAC1 unterscheidet (das Alignment kann mit Hilfe des DNAstar^TM-MegAlign^TM-Programms, Madison, WI) erfolgen. Dieser Rest ist Glu98 von HDAC1, welcher im HDLP Tyr91 ist. Die Struktur lässt erkennen, dass dieser Rest im HDLP am meisten dem Lösungsmittel ausgesetzt ist.
In der Nähe des Bodens der Tasche des aktiven Zentrums an deren engster Stelle befindet sich ein Zink-Ion siehe 6A). Um in der Struktur das Zink zu erhalten, kann man die Kristalle in Zink (z.B. ZnCl₂) eintauchen oder in Gegenwart von Zink cokristallisieren. Das Zinkion wird von Asp168 (Oδ1, 2,1 Å), His170 (Nδ1, 2,1 Å), Asp258 (Oδ1, 1,9 Å) und einem Wassermolekül (2,5 Å) koordiniert (siehe 5B und 6B). Die Zink koordinierenden Aminosäurereste sind in der Geometrie eines Tetraeders angeordnet, aber die Position des Wassermoleküls, das auch über eine Wasserstoffbrücke an His131 gebunden ist, weicht von dieser Geometrie um –25° ab.
Zusätzlich zu den Zink-Liganden enthält der Boden der Tasche zwei Histidinreste (His131 und His132), zwei Asparaginsäurereste (Asp166 und Asp173) und einen Tyrosinrest (Tyr297) (siehe 5B und 10B). Jeder der Histidinreste bildet über seinen Nδ1 eine Wasserstoffbrückenbindung zu einem Carboxylat-Sauerstoff der Asparaginsäure aus, wobei der Sauerstoff in der Ebene des Imidazol-Rings liegt (5B). Diese His-Asp-Anordnung ist charakteristisch für das in den aktiven Zentren der Serin-Proteasen vorkommende Charge-Relay-System, wo es dazu dient, den Imidazol-Nε zu polarisieren und seine Basizität zu erhöhen (Fersht & Sperling, 1973, J Mol. Biol. 74: 137–149; Blow et al., 1969, Nature 221: 337–340).
Der Asp166-His131-Charge-Pair-Relay (im folgenden als "buried Charge-Relay" bezeichnet) befindet sich noch tiefer in der Tasche und ist im Vergleich mit dem Asp173-His132-Charge-Relay (im Folgenden als "exposed Charge Relay" bezeichnet), welcher teilweise dem Lösungsmittel ausgesetzt ist, mehr verdeckt. Der buried Charge-Relay bildet eine Wasserstoffbrückenbildung (2,6 Å) zu dem oben bezeichneten, an Zink gebundenen Wassermolekül aus und diese Wasserstoffbrückenbildung könnte zu der Abweichung der Wasser-Zink-Koordination von der idealen Geometrie beitragen (5B). Der exposed Charge-Relay ist auf einen Punkt –2,5 Å von dem Wassermolekül entfernt gerichtet und näher an der Oberfläche.
Tyr297 liegt dem Zink am nächsten in entgegengesetzter Richtung zur Lage der beiden Charge-Relay-Systeme. Die Hydroxylgruppe des Tyr liegt 4,4 Å vom Zinkatom entfernt und hat keine Wechselwirkungen mit dem Rest des Proteins (5B). Tyr297 am nächsten liegt eine Öffnung in der Taschenwand, die zu dem angrenzenden inneren Hohlraum führt.
Der Boden des inneren Hohlraums wird von Abschnitten der L3- und L7-Schleifen gebildet, wo sie aus den β-Strängen herausragen und das Dach wird von dem α1-L1-α2-Segment gebildet. Die L1-Schleife scheint flexibler zu sein als die anderen Schleifen in der Struktur. Dies kann den vorübergehenden Austausch der Inhalte des Hohlraums mit dem Bulk-Lösungsmittel gestatten.
Der Hohlraum ist vor allem mit hydrophoben Resten ausgekleidet und ist besonders reich an Glycinresten (Ala127, Gly128, Gly129, Met130 und Phe141 bei L3; Gly293, Gly294, Gly295 und Gly296 bei L7; Tyr17, Pro22 und Leu33 bei L1). In dem Hohlraum gibt es nur zwei geladene Reste (Arg27 und His21) und diese werden von der L1-Schleife beigetragen.
Der Hohlraum kann Raum für die Diffusion des Acetat-Produkts weg vom katalytischen Zentrum bieten, der sonst, wenn das Substrat gebunden ist, während der Deacetylierung von dem Lösungsmittel angefüllt und abgeschirmt sein kann. Eine derartige Rolle für den Hohlraum wird von der Beobachtung gestützt, dass der Hohlraum in der 1,8 Å-Apo-Proteinstruktur drei Wasser- und zwei Isopropanol-Moleküle enthält (aus dem Kristallisationspuffer). Der Hohlraum kann auch zusätzlich zum Zink einen anderen Cofaktor binden, um die enzymatische Aktivität des HDLP zu erleichtern. Ein vorgeschlagener katalytischer Mechanismus zur Deacatylierung wird in 8 angegeben.
Die Struktur des HDLP, wie sie von der vorliegenden Erfindung definiert ist, zusammen mit der Sequenzhomologie des HDAC1 zeigt, dass das HDLP-Protein aus 375 Aminosäuren dem katalytischen Kern der Histon-Deacetylase entspricht, welche über die HDAC-Familie konserviert ist (siehe 2). Die 35,2% HDLP-HDAC1-Sequenzidentität sagt eine strukturelle Ähnlichkeit in den Cα-Positionen mit einer RMSD von –1,5 Å voraus. Chothia und Lask beschreiben in EMBO J. 5: 823–826 (1986) die Beziehung zwischen der Abweichung der Sequenz und der Struktur der Proteine. Es ist wahrscheinlich, dass das aus 40 Resten bestehende C-terminale Ende des HDLP eine abweichende Struktur aufweist, da dieser Abschnitt eine geringere Homologie zu HDAC1 hat, obwohl die α16-Helix in diesem Abschnitt Teil der konservierten offen α/β-Kernfaltung ist und es wahrscheinlich ist, dass HDAC1 eine ähnliche Helix umfasst. Wie abweichend dieser C-terminale Abschnitt auch sein mag, so liegt dieser Abschnitt doch außerhalb des aktiven Zentrums und beeinflusst die Struktur des aktiven Zentrums wahrscheinlich nicht. Jenseits des C-terminalen Endes des katalytischen Kerns der Histon-Deacetylase sind die Mitglieder der HDAC_Familie in der Länge und Sequenz abweichend. Dieser Abschnitt (Aminosäurereste –390–482) in der HDAC-Familie ist hoch polar, mit sauren Aminosäureresten besetzt und wahrscheinlich flexibel oder lose gefaltet.
Die HDLP-HDAC-Homologie erfasst vor allem den hydrophoben Kern und die L1–L7-Schleifen mit den Schleifenabschnitten, welche die Tasche und den angrenzenden Hohlraum mit dem höchsten Anteil der Sequenzkonservierung von Aminosäureresten bilden. (9A und 9B). Speziell sind alle polaren Reste im aktiven Zentrum (die Zink-Liganden, die beiden Charge-Relay-Systeme und Tyr297) und die hydrophoben Reste, welche die Wände der Tasche bilden (Gly140, Phe141, Phe198 und Leu265) identisch. Unter den Resten, welche den inneren Hohlraum bilden, sind diejenigen, welche dem aktiven Zentrum am nächsten sind, entweder identisch oder konservativ substituiert (z.B. Leu23 τ Met und Met130 τ Leu). Die Oberflächenreste um die Tasche sind in geringerem Maße konserviert, weisen jedoch immer noch eine über 35% mittlere Sequenzidentität auf.
Die aus den Kristallstrukturen des Inhibitor-gebundenen HDLP-Komplexes der vorliegenden Erfindung erhaltene Information liefert eine genaue Information, die beim Design, der Isolierung, dem Screening und der Ermittlung von potentiellen Inhibitor-Verbindungen, welche Mitglieder der HDLP/HDAC-Familie hemmen können, von Nutzen ist. Wie oben beschrieben, besteht die HDLP-Struktur aus einem parallelen β-Faltblatt mit sich an beiden Seiten scharenden α-Helices (4A, 4B und 4C). An einem Ende des β-Faltblatts bilden 7 Schleifen (L1–L7) eine enge, röhrenförmige Tasche, die mit hydrophoben Resten ausgekleidet ist und eine Bindungsstelle für Zink umfasst, einige polare Seitenketten, einschließlich zweier Asp-His-Charge-Relay-Systeme. Eine Mutation der Zink-Liganden und anderer polarer Reste am Boden der Tasche reduziert oder eliminiert die katalytische Aktivität.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung fanden heraus, dass eine Mutation an der Tyr297Phe-Stelle die Aktivität herabsetzte (siehe auch Rassig et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3519–3524; Kadosh & Struhl, 1998, Genes Dev. 12: 797–805). Die Eliminierung der Aktivität durch Mutation dieser Reste zeigt, dass diese Region das aktive Zentrum des Enzyms darstellt. Angrenzend an dieses aktive Zentrum gibt es einen inneren Hohlraum, der Platz für die Diffusion des Acetat-Reaktionsprodukts bietet. Eine wie oben beschriebene Homologie im aktiven Zentrum zwischen HDLP und HDAC1 zeigt, dass sie eine strukturelle und funktionelle Homologie gemeinsam haben.
Die Inhibitor-Verbindung Trichostatin A(TSA) (Tsuji et al., 1976, J. Antibiotics 29: 1–6) bindet sich am HDLP, indem ihre lange aliphatische Kette, welche an einem Ende eine Hydroxamsäuregruppe aufweist, in die Tasche insertiert wird (6A, 6B und 6C). Die aliphatische Kette stellt in dem lochähnlichen hydrophoben Abschnitt der Tasche Mehrfachkontakte her, wo sie das Zink zweizähnig koordiniert und auch Wasserstoffbrückenbindungen zu den polaren Resten im aktiven Zentrum ausbildet, einschließlich den zwei Histidinresten der Charge-Relay-Systeme. Die aromatische Dimethylaminophenylgruppe am anderen Ende der TSA-Kette stellt am Eingang der Tasche Kontakte her und dient zu deren Verkapselung. Die Aminosäurereste des HDLP, welche mit der TSA einen Kontakt ausbilden, sind in der HDAC konserviert, was darauf hindeutet, dass TSA die HDAC auf eine ähnliche Weise wie das HDLP bindet und hemmt.
In dem Komplex sind die Hydroxamsäure, der größte Teil der aliphatischen Kette und ein Teil der Dimethylaminophenylgruppe der TSA verdeckt (60% der Oberfläche der TSAs; 6A). Die Hydroxamsäuregruppe bindet das Zink zweizähnig, indem es über seine Carbonyl-(2,4 Å) und Hydroxylgruppe (2,2 Å) Bindungen bildet, was zu einem pentakoordinierten Zn²⁺ führt (6B und 6C). Die Hydroxylgruppe der Hydroxamsäure ersetzt das Wassermolekül, das in der oben beschriebenen Apo-HDLP-Struktur an das Zink gebunden ist. Die Hydroxamsäure ist auch über Wasserstoffbrückenbindungen mit beiden Histidinresten des Charge-Relay-Systems (Hydroxyl-Sauerstoff an His131 Ne2, 2,8 Å; und Stickstoff an His132 Ne2, 2,8 Å) und der Tyr297-Hydroxylgruppe verbunden (2,4 Å, 6B und 6C).
Die 5 Kohlenstoffatome lange verzweigte Alken-Kette des TSA passt bequem in den engen Abschnitt der Tasche, indem sie mit allen die Tasche auskleidenden hydrophoben Gruppen Van der Waals-Kontakte herstellt (6B und 6C). In der Nähe ihres Zentrums enthält die Kette eine Methyl-substituierte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung, die Sandwichartig zwischen den Phenylgruppen von Phe141 uns Phe98 am engsten Punkt der Tasche angeordnet ist (6A und 6B). Die Länge der Alkengruppe scheint optimal, um die Länge der Tasche zu überspannen und um Kontakte sowohl am Boden als auch am Eingang der Tasche zu gestatten, obwohl die Verkappungsgruppe der Formel (I) eine ausreichende Länge zur Verfügung stellen kann, um die Tasche zu überspannen, was eine kürzere Alkenkette (aliphatische Kette) gestattete.
Am Eingang der Tasche stellt eine Seite der von der Dimethylaminophenyl- und den angrenzen Carbonylgruppen der TSA gebildeten planaren Struktur am Rand der Tasche (Pro22, Tyr91, Phe141; 6B und 6C) Kontakte her. Diese Verpackung wird durch den ungefähren Winkel von 120° in der Gesamtstruktur der TSA an der Verbindung der aliphatischen Kette mit der Dimethylaminophenylgruppe (der am sp³-hybridisierten C8-Kohlenstoff stattfindet) erleichtert. Nach der Bindung der TSA ändert die Seitenkette von Tyr91, die dem Lösungsmittel am meisten ausgesetzt ist, ihre Konformation, um Platz für die Dimethylaminophenylgruppe zu schaffen. Dies ist die einzige Veränderung in der Nähe des aktiven Zentrums, die nach der Bindung der TSA beobachtet wurde.
Die Hydroxamsäuregruppe ist in Zink-Metalloprotease-Inhibitoren ein gemeinsames Strukturmerkmal (siehe US-Patente 5,919,940 und 5,917,090 ; siehe auch Grame et al., 1995, Biochemistry 34: 14012–14020; Lovejoy et al., 1999, Nat. Struct. Biol. 6: 217–221 und Holmes & Matthews, 1981, Biochemistry 20: 6912–6920). Wie TSA koordinieren diese Inhibitoren auch das Zink im aktiven Zentrum zweizähnig, indem sie ihre Hydroxamat-Hydroxyl und Sauerstoffatome benutzen, ersetzen das nucleophile Wassermolekül durch ihre Hydroxamat-Hydroxylgruppen und bilden Wasserstoffbrückenbindungen zu der allgemeinen Base aus (Grams et al., 1995, Biochemistry 14: 14012–14020; Lovejoy et al., 1999, Nat. Struct. Biol. 6: 217–221 und Holmes & Matthews, 1981, Biochemistry 20: 6912–6920).
SAHA, das eine 30-fach schwächere inhibitorische Aktivität als TSA aufweist (Richon et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3003–3007) bindet HDLP ähnlich wie TSA (siehe z.B. Fogur 4D). Die Hydroxamsäuregruppe der SAHA stellt die gleichen Kontakte zum Zink und den Aminosäureresten im aktiven Zentrum her und die Bedeutung dieser Wechselwirkungen wird durch den Aktivitätsverlust der SAHA-Derivate unterstrichen, denen die Hydroxamgruppe fehlt (Richon et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3003–3007). Die sechs Kohlenstoffatome lange Gruppe der SAHA wird in den röhrenförmigen hydrophoben Abschnitt der Tasche gepackt. Im Vergleich mit TSA jedoch wird die aliphatische Kette der SAHA weniger bequem gepackt und bildet weniger Van der Waals-Kontakte aus, teilweise deshalb, weil der SAHA der Methylgruppenzweig an C15 von TSA fehlt. SAHA fehlen auch die Doppelbindungen der TSA in diesem Bereich und dies kann zu einer höheren Flexibilität der aliphatischen Kette führen. Die Verkappungsgruppe der SAHA besteht aus einer Phenylamino-Ketongruppe. In der Kristallstruktur verfügt die Phenylgruppe über eine geringe Elektronendichte, was nahe legt, dass sie nicht so gut wie die Verkappungsgruppe der TSA gepackt wird. Dies kann auf die größere Trennung zwischen der Hydroxamgruppe und der Verkappungsgruppe der SAHA im Vergleich mit TSA zurückzuführen sein (vergleiche TSA, Formel (II) und SAHA, Formel (III), unten).
Durch die Aufklärung der Struktur des HDLP und des an eine inhibitorische Verbindung gebundenen HDLP wurde man zum ersten Mal in die Lage versetzt, das aktive Zentrum des HDLP und der mit dem HDLP verwandten Proteine, wie z.B. der zur HDAC-Familie gehörenden Proteine, zu identifizieren.
Die Information über die dreidimensionale Struktur und die Atomkoordinaten, die mit der Struktur-Information über das an eine inhibitorische Verbindung gebundene HDLP assoziiert sind, ist für ein vernünftiges Design von Arzneimitteln von Nutzen, indem ein Verfahren zur Identifizierung von inhibitorischen Verbindungen zur Verfügung gestellt wird, die sich an das HDLP, an Proteine der HDAC-Familie und andere mit dem HDLP verwandte Histon-Deacetylase-ähnliche Proteine binden und diese hemmen. Dieses Verfahren zur Identifizierung dieses potentiellen Inhibitors für ein Enzym mit Deacetylase-Aktivität umfasst die Schritte: (a) Einsatz einer durch die Atomkoordinaten gemäß den 16 bis 19 definierten dreidimensionalen Struktur des HDLP, b) Verwendung dieser dreidimensionalen Struktur, um den potentiellen Inhibitor zu entwerfen oder auszusuchen; (c) Synthese dieses potentiellen Inhibitors; (d) in Kontakt Bringen dieses potentiellen Inhibitors mit dem Enzym in Gegenwart eines acetylierten Substrats und (e) Bestimmung der Fähigkeit des Inhibitors, die Deacetylase-Aktivität zu hemmen.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Inhibitoren des HDLP und der mit dem HDLP verwandten Proteine (z.B. HDAC) werden durch die Formel (I) wiedergegeben
in welcher X eine Verkappungsgruppe umfasst, die an mindestens eine Aminosäure gebunden wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe Prolin und Leucin; Y eine aliphatische Kettengruppe umfasst, die an mindestens eine Aminosäure gebunden wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe Leucin, Phenylalanin und Glycin; und Z eine Bindungsgruppe für das aktive Zentrum umfasst, welche an mindestens eine Aminosäure gebunden wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe Asparaginsäure, Tyrosin und Histidin und wobei Z ferner an ein Zink-Atom gebunden werden kann, vorausgesetzt, dass die Verbindung der Formel (I) nicht TSA, TrApoxin, SAHA, oder ein in den US-Patenten 5,608,108 ; 5,700,811 ; 5,373,474 ; 5840,960 und 5,668,179 beschriebenes SAHA Derivat darstellt.
Mit der vorliegenden Erfindung lässt sich die Technik des Molecular Designs einsetzen, um chemische Entitäten und Verbindungen einschließlich inhibitorischer Verbindungen zu entwerfen, zu identifizieren und zu synthetisieren, die in der Lage sind, sich an das aktive Zentrum des HDLP und der mit dem HDLP verwandten Proteine zu binden. Die Atomkoordinaten des Apo-HDLP und des Inhibitor-gebundenen HDLP können zusammen mit einem Computer-Modeling unter Einsatz eines Docking-Programms wie GRAM, DOCK, HOOK oder AUTODOCK (Dunbrack et al., 1997, Folding & Design 2: 27–42) dazu verwendet werden, um potentielle Inhibitoren des HDLP und von mit HDLP verwandten Proteinen (z.B. HDAC1) zu identifizieren. Diese Vorgehensweise kann ein Computer-Fitting von möglichen Inhibitoren an das aktive Zentrum des HDLP umfassen, um festzustellen, wie gut die Form und die chemische Struktur des potentiellen Inhibitors zum aktiven Zentrum passt, oder um die potentiellen Inhibitoren mit der Bindung von TSA oder SAHA im aktiven Zentrum zu vergleichen (siehe Bugg et al., 1998, Scientific American December: 92–98; West et al., 1995, TIPS 16: 67–74). Die durch Modeling mit einem Docking-Programm entworfenen potentiellen Inhibitoren stimmen mit der wie oben beschriebenen allgemeinen Formel (I) überein. Es können auch Computerprogramme eingesetzt werden, um die Anziehung, Abstoßung und sterische Hinderung des HDLP und der potentiellen Inhibitor-Verbindung abzuschätzen. Im Allgemeinen gilt, je besser der Sitz, desto geringer die sterische Hinderung, desto größer die Anziehungskräfte und desto größer die Spezifität, welche wichtige Merkmale für eine spezifische Inhibitor-Verbindung darstellen, die mit größerer Wahrscheinlichkeit mit dem HDLP und mit dem HDLP verwandten Proteinen in Wechselwirkung treten als andere Proteinklassen. Diese Merkmale sind insbesondere dort erwünscht, wo die Inhibitor-Verbindung ein potentielles Antikrebsmittel ist.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung lassen sich auch durch Inaugenscheinnahme der dreidimensionalen Struktur entwerfen, um wirkungsvollere Deacetylase-Inhibitoren zu bestimmen. Diese Art von Modeling kann als "manuelles" Drug-Design bezeichnet werden. Beim manuellen Drug-Design können eine visuelle Besichtigung und eine Analyse unter Einsatz eines graphischen Visualisierungsprogramms wie "O" (Jones, T.A., Zhou, J.Y., Cowan, S.W. und Kjeldgaard, M., Improved method for building Protein models in electron density maps and the location of errors in these models, Acta Crystallog., A47, 110–119) zum Einsatz kommen.
Am Anfang können potentielle Inhibitor-Verbindungen mit manuellem Drug-Design nach ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit den X-, Y- und Z-Bestandteilen der Formel (I) ausgesucht werden. Das so gefundene Strukturanaloge kann dann mit Hilfe von Computer-Modeling-Progammen modifiziert werden, um die wahrscheinlichsten wirksamen Kandidaten besser zu definieren. Es ist nützlich, die Zahl möglicher Kandidaten zu verringern, da es unmöglich werden kann, unzählige Variationen von Verbindungen zu synthetisieren und zu sreenen, die eine gewisse Ähnlichkeit zu bekannten inhibitorischen Molekülen aufweisen. Eine derartige Analyse hat sich bei der Entwicklung von HIV-Protease-Inhibitoren als wirksam erwiesen (Lam et al., 1994, Science 263: 380–384; Wlodawer et al., 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 543–585; Appelt, 1993, Perspectives in Drug Discovery and Design 1: 23–48; Erickson, 1993, Perspectives in Drug Discovery and Design 1: 109–128). Alternativ könnte ein zufälliges Screening einer kleinen Molekülbibliothek zu potentiellen Inhibitoren führen, deren inhibitorische Aktivität dann, wie oben beschrieben, mit einem Computer-Modeling analysiert werden kann, um ihre Wirksamkeit als Inhibitoren besser zu bestimmen.
Die mit Hilfe der Information der vorliegenden Erfindung entworfenen Verbindungen können kompetitive oder nicht kompetitive Inhibitoren sein. Diese entworfenen Inhibitoren können sich an das ganze oder einen Teil des aktiven Zentrums des HDLP binden und sie können stärker, spezifischer, weniger toxisch und effektiver als bekannte Inhibitoren für das HDLP und für mit dem HDLP verwandte Proteine und insbesondere für HDACs sein. Die entworfenen Inhibitoren können auch weniger stark sein, aber in vivo und/oder in vitro eine längere Halbwertszeit aufweisen und daher bei der Hemmung der Histon-Deacetylase-Aktivität in vivo und/oder in vitro über längere Zeiträume hinweg effektiver sein. Diese entworfenen Inhibitoren sind für die Hemmung der Histon-Deacetylase-Aktivität des HDLP und der mit dem HDLP verwandten Proteine (z.B. HDAC1) von Nutzen, um das Zellwachstum in vitro und in vivo zu hemmen und sie können besonders als Antikrebsmittel von Nutzen sein.
Bei der vorliegenden Erfindung lassen sich auch die Techniken des Molecular Designs einsetzen, um mit Computerhilfe kleine Molekül-Datenbanken nach chemischen Entitäten oder Verbindungen zu durchsuchen, welche in analoger Weise wie die durch die Struktur der vorliegenden Erfindung definierten TSA und SAHA an das HDLP binden können. Mit Hilfe eines derartigen Computer-gestützten Screenings lassen sich verschiedene Gruppen identifizieren, die als "X", " Y" oder "Z" der obigen Formel (I) definiert werden können und welche zur Synthese von potentiellen, die Formel (I) umfassenden Inhibitoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Derartige potentielle Inhibitoren können in einem Histon-Deacetylaseaktivitäts-Assay auf ihre inhibitorische Histon-Deacetylase-Aktivität hin untersucht werden (siehe Beispiel 3, unten), sie können mit HDLP cokristallisiert werden, um mit Hilfe der oben angegebenen Techniken der Röntgenkristallographie die Bindungseigenschaften zu bestimmen (z.B. lässt sich die Struktur des Cokristalls durch Molecular Replacement ermitteln, um die Bindungseigenschaften des potentiellen Inhibitors zu bewerten), oder sie lassen sich auf Grundlage ihrer Bindungsaktivität beurteilen, indem der potentielle Inhibitor mit dem HDLP inkubiert wird, eine Gelfiltration durchgeführt wird, um irgend welchen freien potentiellen Inhibitor von den HDLP gebundenen Inhibitoren abzutrennen, und indem der Grad der Histon-Deacetylase-Aktivität des Inhibitor-gebundenen HDLP bestimmt wird. Zur Messung der Bindungskonstanten (z.B. Kd) können dem Fachmann bekannte Verfahren eingesetzt werden, z.B. z.B. eine BIAcore^TM-Analyse, die isotherme Titrationskalorimetrie, ein ELISA mit einem bekannten Arzneimittel auf der Platte, um eine kompetitive Hemmung anzuzeigen, oder ein Deacetylase-Aktivitäts-Assay.
Das Design von potentiellen Inhibitoren der vorliegenden Erfindung wird durch eine Bezugnahme auf 9 weiter erleichtert, welche eine Oberflächenansicht darstellt und die Furchen auf der Oberfläche wiedergibt. Eine Analyse von derartigen Furchen gibt einen Einblick in die Bestandteile der Verkapselungsgruppe der Formel (I). Die Oberflächenfurchen sind die markierten Furche A, Furche A', Furche B und Furche C, in welchen zusätzliche Verkapselungsgruppen gebunden werden können. Die Struktur des entweder an TSA oder SAHA gebundenen HDLP zeigt, dass die Verkapselungsgruppen von TSA und SAHA in der Furch A gebunden werden. Eine Analyse der Identität der Aminosäuresequenzen des HDLP und der HDACs zeigte, dass Furche A bei den HDACs gut konserviert ist, eine signifikant hydrophobe Komponente aufweist, ausreichend tief erscheint, damit signifikante Wechselwirkungen stattfinden können und auch die größte der vier Furchen darstellt. Zusätzlich zu der Dimethylaminophenyl-Gruppe der TSA kann die Furch A Gruppen von annähernd 200 Dalton aufnehmen (z.B. könnte Furch A eine Naphthalin-ähnliche Gruppe nach einem passenden Spacer aufnehmen usw.). Die hier so bezeichnete Furche A ist durch die folgenden konservierten Reste des HDLP gekennzeichnet: His21, Pro22, Lys24, Phe141, Leu265 und Phe335. Die Peripherie der Furch A umfasst nicht konservierte Reste. Zusätzlich umfasst die hier so bezeichnete Furch A' vor allem nicht konservierte Reste.
Die Furche B liegt unmittelbar neben der Tasche. Es ist von Bedeutung, dass der Boden der Furche B den Nε-Stickstoff von His170 enthält, das über seinen Nδ-Stickstoff das Zink koordiniert. Es lässt sich eine signifikante Bindungsenergie erreichen, wenn das Nε-Proton von His170 mit einer Carbonsäure- oder Sulfat-Gruppe in Kontakt kommt. Darüber hinaus kann die Furche B ausreichend groß sein, um eine Phenylgruppe aufzunehmen, deren Fläche eine partielle negative Ladung umfassen kann, die das Nε-Proton von His170 abschirmen kann. Die konservierten Reste der hier so bezeichneten Furche B sind His170, Tyr196 und Leu265.
Die Furche C ist nicht so gut konserviert wie die beiden anderen Furchen und die Aminosäurereste, welche die Furche C umfassen, sind größtenteils polar und dem Lösungsmittel ausgesetzt. Die hier so bezeichnete Furche C umfasst die folgenden konservierten Reste: Asn87, Gly140 und Phe198.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden durch die Formel (I) wiedergegeben:
Die Beispiele für geeignete X-Bestandteile, wobei X eine Verkapselungsgruppe umfasst, lassen sich in drei Kategorien beschreiben, je nach dem, auf welche Oberfläche der Furche A, A', B und/oder C sie abzielen. Die Verkapselungsgruppe kann alle drei Kategorien auf derselben Verbindung umfassen. Es kann von besonderem Vorteil sein, die Verkapselungs-Gruppe der TSA oder der SAHA durch eine große feste Struktur zu ersetzen. Nicht einschränkende Beispiele für geeignete Verkapselungsgruppen (X) der Formel (I), welche in der Furche A gebunden werden können, sind: (1) das Anheften eines 1-3-Methyl-Linkers gefolgt von einer Phenyl- oder Naphthalin-Gruppe von der para- oder meta-Position der durch die Formel (IV) wiedergegebenen Phenyl-Gruppe der SAHA:
(2) das Anheften eines 2-3-Methyl-Linkers gefolgt von einer Phenyl- oder Naphthalin-Gruppe von der meta-Position der Phenyl-Verkappungsgruppe der TSA oder aus der durch die Formel (V) wiedergegebenen Dimethylamino-Gruppe der TSA:
und eine Verkapselungsgruppe, die in Furche B gebunden werden kann, ist ein 1-3-Methylgruppen-Spacer gefolgt von einer wie in Formel (VI) wiedergegebenen Carboxylat-, Sulfat- oder Phenyl-Gruppe:
Bezüglich der aliphatischen Gruppe (Y) legt der Durchmesser der Tasche nahe, dass zusätzlich zu der C15-Methylgruppe am C10-Kohlenstoff noch eine Methyl-"Seitenkette" mehr aufgenommen werden könnte. Nicht einschränkende geeignete Beispiele für die Y-Bestandteile, wobei Y eine aliphatische Ketten-Gruppe umfasst, sind die folgenden: (1) Addition einer Methylgruppe an die TSA am C12-Kohlenstoff (mit oder ohne eine Methylgruppe am C10-Kohlenstoff und mit oder ohne Doppelbindungen und mit oder ohne Substitution der X- und/oder Z-Bestandteile der Formel (I), wie dies durch Formel (VII) wiedergegeben wird:
(2) Anheften einer Methylgruppe an die TSA am C9-Kohlenstiff (mit oder ohne eine Methylgruppe am C10-Kohlenstoff, mit oder ohne beide oder nur eine der Doppelbindungen und mit oder ohne Substitution der X- und/oder Z-Bestandteile der Formel (I), wie dies durch Formel (VIII) wiedergegeben wird:
(3) Ersetzen der beiden Alkylen-Doppelbindungen der TSA durch nur eine zwischen C10 und C11, was die C11- und C12-Verdrehung aufheben kann, um einen besseren Sitz zu gestatten, wobei die X- und/oder Z-Gruppe auch substituiert sein kann, wie dies in Formel (IX) dargestellt ist:
(4) Cyclisieren der C15- und C12-Kohlenstoffatome der TSA über ein Schwefelatom (oder Stickstoffatom), wobei die X- und/oder Z-Gruppen ebenfalls substituiert sein können, wie dies in Formel (X) wiedergegeben wird:
(5) Verlängern von dem C9-Kohlenstoffatom der TSA aus so, dass sich die Verlängerung der Furche B annähert und/oder in sie eintritt (siehe 9), sp³-Hybridisierung des C9 so, dass es über eine gewisse Freiheit verfügt, Anheften eines 1-3-Methylgruppen-Spacers, der eine Doppelbindung enthalten kann, und dann daran Anheften einer Sulfat-, Carboxylat-, Sulfat-, Hydroxyl- oder Phenyl-Gruppe, welche in Wechselwirkung mit dem Nε-Proton des His170 treten können, welches das Zinkatom koordinieren kann, wie dies in Formel (XI) dargestellt ist:
(6) Verlängern weg vom C8-Kohlenstoffatom (unter Ersatz von C14) der TSA so, dass die Verlängerung sich der Furche B annähert oder in sie eintritt, Anheften eines 1-3-Methylgruppen-Spacers (der eine Doppelbindung aufweisen kann) und dann daran Anbinden einer Carboxylat-, Sulfat-, Hydroxyl- oder Phenyl-Gruppe so, dass mit dem Nε-Proton des His170, welches das Zinkatom koordiniert, eine Wechselwirkung stattfindet, wobei der X- und/oder der Z-Bestandteil ebenfalls substituiert sein können, wie dies in Formel (XII) dargestellt ist:
(7) Substituieren des C8-Kohlenstoffs am Ende der aliphatischen Kette so, dass die Substitution mit den Furchen A, A', B und/oder C in Kontakt kommen kann, wobei in einem derartigen Beispiel eine Verkapselungs-Gruppe (X) benötigt werden kann oder auch nicht und die X- und Z-Bestandteile ebenfalls substituiert sein können, wie dies in Formel (XIII) dargestellt ist:
(8) Vergrößern des Abstandes zwischen X und Z in den obigen Formeln VII bis XIII, wobei die aliphatische Kette ferner eine Methylgruppe zwischen der an das aktive Zentrum bindenden Gruppe (Z) und dem C8-Kohlenstoff und vorzugsweise kurz vor dem C8-Kohlenstoff aufweist, (9) dafür Sorgen, dass die Verbindung zwischen der aliphatischen Kette und der Verkappungsgruppe starrer wird (z.B. durch Schließen eine 6-gliedrigen Ringes, welcher Sauerstoff enthalten kann oder auch nicht), wobei die X- und Z-Gruppen ebenfalls substituiert sein können, wie dies in Formel (XIV) dargestellt ist:
und (10) Kombinieren von zwei oder mehr der in den Formeln (VII–XIV) wiedergegebenen Abänderungen.
Zusätzlich stellen die folgenden Vertreter nicht einschränkende Beispiele für geeignete Z-Gruppen dar, wobei Z eine an das aktive Zentrum bindende Gruppe umfasst: (1) Hxdroxamsäure, (2) Carbonsäure, (3) Sulfonamid, (4) Acetamid, (5) Epoxyketon, (6) ein Ester mit einem Methyl-Linker und einer Hydroxylgruppe eines Acetatesters zum Einführen in den Hohlraum und zur Wechselwirkung mit einem konservierten Arginin (Arg27), wie dies in Formel (XV) dargestellt ist:
und (7) ein Alphaketon, wie dies in Formel (XVI) dargestellt ist:
Zusätzlich können vor dem Hintergrund der erfindungsgemäßen Information über die dreidimensionale Struktur vom Fachmann andere geeignete X-, Y- und Z-Bestandteile ins Auge gefasst werden.
Nach der Ermittlung geeigneter potentieller X-, Y- und Z-Bestandteile werden die Bestandteile unter Verwendung von kombinatorisch chemischen Techniken miteinander kombiniert, um eine Verbindung der Formel (I) zu bilden. Dies kann nach den US-Patenten 5,608,108 , 5,700,811 , 5,773,474 , 5,840960 und 5,668,179 geschehen, welche hiermit als Referenz eingeführt werden. Jedes dem Fachmann bekannte Verfahren kann eingesetzt werden, um die Verbindungen der Formel (I), welche die nach den oben beschriebenen Methoden ermittelten X-, Y- und Z-Bestandteile umfassen, zu synthetisieren.
Wie oben angegeben, sind die Verbindungen der Formel (I) bei der Hemmung der Histon-Deacetylase-Aktivität des HDLP und der mit HDLP verwandten Proteine von Nutzen. Eine derartige Hemmung kann eine Reduktion oder Einstellung des Zellwachstums in vitro und in vivo gestatten.
Für eine Anwendung in vitro sind eine derartige Reduktion oder Einstellung des Zellwachstums nützlich, um die Rolle der Histon-Deacetylierung und -Differenzierung während des Zellzyklus zu untersuchen und auch um andere Mechanismen zu untersuchen, die mit dem Anhalten des Zellzyklus assoziiert sind und insbesondere, welche Rolle die Repression der Transkription beim Fortschreiten des Zellzyklus spielt, was in einem Modellsystem der Hefe wie das von Kadosh & Stuhl, 1009, Mol. Cell. Biol. 18: 5121–5127 beschriebene untersucht werden kann. In vitro-Modellsysteme, welche verwendet werden können, um die Wirkungen potentieller Inhibitoren auf den Verlauf des Zellzyklus und auch des Tumorwachstums zu untersuchen sind solche, wie sie bei Richon et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3003–3007; Yoshida et al., 1995, Bioessays 17: 423–430; Kim et al., 1999, Oncogene 18: 2461–2470; Richon et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5705–5708 und Yoshida et al., 1987, Cancer Res. 47: 3688–3691 beschrieben sind.
Für eine in vivo-Anwendung ist eine derartige Reduktion oder Einstellung des Zellwachstums von Nutzen, um die Wirkung dieser Inhibitor-Verbindungen in nicht humanen Tiermodellsystemen für Krebs zu untersuchen und sie ist auch für die Behandlung von Krebs bei einem Empfänger, der eine solche Behandlung benötigt, von Nutzen. Nicht einschränkende Beispiele für Tiere, die als nicht humane Tiermodellsysteme dienen können sind Mäuse, Ratten, Kaninchen, Hühner, Schafe, Ziegen, Kühe, Schweine und nicht menschliche Primaten (siehe z.B. Desai et al., 1999, Proc. AACR 20: Abstract #2396; Cohen et al., 1999, Cancer Res., eingereicht). Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können einem transgenen nicht humanen Tier verabreicht werden, wobei das Tier Krebs ausgebildet hat, wie z. B. solche Tiermodelle, in welchen das Tier eine Neigung hat, Krebs auszubilden (z.B. die in den US-Patenten 5,777,193 , 5,811,634 , 5,709,844 , 5,698,764 und 5,550,316 beschriebenen Tiermodellsysteme). Solche Tiermodellsysteme erlauben die Bestimmung der Toxizität und Effizienz der Tumorreduktion der Verbindungen der vorliegenden Erfindung.
Eine bevorzugte Verbindung der vorliegenden Erfindung kann eine hochspezifische Aktivität für HDLP oder für mit HDLP verwandte Proteine, bei oraler Verabreichung eine gute biologische Verfügbarkeit, Aktivität bei der Reduzierung oder Einstellung des Zellwachstums in Tumorzelllinien und Aktivität bei der Reduzierung oder Einstellung des Tumorwachstums in Tiermodellen von verschiedenen Krebsarten umfassen.
Dementsprechend ist ein anderer Aspekt dieser Erfindung ein Verfahren zur Ausrottung oder Behandlung von Krebs in einem Empfänger, der ein Tier und vorzugsweise ein Mensch sein kann. Dieses Verfahren umfasst die Verabreichung einer den Tumor reduzierenden Menge einer durch die obige Formel (I) definierten Verbindung oder eines physiologisch verträglichen Salzes derselben an den Empfänger.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung ist eine Zusammensetzung vorgesehen, welche die Verbindung der Formel (I) und ein Vehikel oder einen Träger umfasst. Die Verabreichung der vorstehenden Wirkstoffe kann lokal oder systemisch erfolgen. Solche Träger umfassen alle geeigneten physiologischen Lösungen oder Dispersionsmittel oder dergl. Die physiologischen Lösungen umfassen jede geeignete Lösung oder jedes Dispersionsmedium wie Saline oder gepufferte Saline. Der Träger kann auch antibakterielle Wirkstoffe und gegen Pilze gerichtete Wirkstoffe, isotonische und absorptionsverzögernde Wirkstoffe und dergl. umfassen. Mit der Ausnahme, dass sich irgendein konventielles Medium, ein Träger oder ein Wirkstoff nicht mit dem aktiven Inhaltsstoff verträgt, wird seine Verwendung in den Zusammensetzungen empfohlen.
Die Verabreichungswege für die die erfindungsgemäßen Vehikelkonstrukte für die Abgabe enthaltenden Zusammensetzungen umfassen alle konventionellen und physiologisch annehmbaren Wege, wie z.B. orale, pulmonale, parenterale (intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse (IV) oder subkutane Injektion), über eine Inhalation (über eine Feinpulver-Formulierung oder einen feinen Nebel) erfolgende, transdermale, nasale, vaginale, rektale oder sublinguale Verabreichungswege und können in Dosierungsformen formuliert werden, die für jeden Verabreichungsweg passend sind.
Die folgenden Beispiele dienen einer klareren Veranschaulichung der Aspekte der Erfindung und sollen den Umfang der Erfindung nicht einschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung und Reinigung der Proteine
Das Wildtyp-HDLP (GenBank-Hinterlegungsnummer AE000719) wurde aus einem Präparat der chromosomalen-DNA von Aquifex aeolicus (von Robert Huber von der Universität Regensburg, Deutschland, zur Verfügung gestellt) mit Hilfe der Phosphat-Kettenreaktion (PCR) in den pGEX4T3-Vektor (Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) subkloniert. Die CysτSer-Mutante und die Mutanten am aktiven Zentrum wurden mit Hilfe der zielgerichteten PCR-Mutagenese konstruiert und dann sequenziert. Das HDLP-Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsprotein wurde in Escherichia coli produziert, mit Hilfe einer Affinitätschromatographie unter Einsatz einer Säule aus Glutathion-Sepharose-Harz (Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) und einer Anionenaustauscher-Chromatographie (Q-Sepharose^TM; Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) gereinigt. Das HDLP wurde mit Thrombin bei 4°C von dem Fusionsprotein abgespalten, mit Hilfe eines Ionenaustauscher-(Q-Sepharose^TM; Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) und einer Gelfiltrations-Chromatographie (Superdex^TM 200; Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) gereinigt und in einem Puffer aus 25 mM Bis-tris-Propan (BTP), 500 mM NaCl, 5 mM Dithiothreitol (DTT), 2% Isopropanol, pH 7,0 auf typischerweise 25 mg/ml aufkonzentriert.
Obwohl nicht bekannt ist, welchen Metall-Cofaktor das HDLP in vivo enthält, wird angenommen, dass es sich wegen der Anordnung der Liganden und den Ähnlichkeiten im aktiven Zentrum mit den Zink-Proteasen um Zink handelt. Es wird angenommen, dass das Fehlen des Metalls in dem gereinigten HDLP teilweise auf die Verwendung von DTT während der Reinigung zurückzuführen ist. Das HDLP wurde mit Zn²⁺ rekonstituiert, indem die Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante bei 10 mg/ml mit einem 5-fachen molaren Überschuss an ZnCl₂ in einem Puffer aus 25 mM Bis-tris-Propan, 200 mM NaCl, 1% Isopropanol, pH 7,0 vermischt wurde. Ungebundenes ZnCl₂ wurde durch Fraktionierung des HDLP über eine G25-Entsalzungs-Säule (Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) entfernt. Der HDLP-Zn²⁺-TSA-Komplex wurde hergestellt, indem die mit Zn²⁺ rekonstituierte HDLP-Mutante mit 1 mM TSA über einen Zeitraum von 45 Minuten inkubiert wurde, gefolgt von einer Gelfiltrations-Chromatographie (Superdex^TM 200; Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ), um überschüssige TSA zu entfernen, und indem in einem Puffer aus 25 mM Bis-tris-Propan, 500 mM NaCl, 1% Isopropanol, pH 7,0 auf typischerweise 25 mg/ml aufkonzentriert wurde.
Das mit einem FLAG-Epitop etikettierte humane HDAC1 wurde überexprimiert, indem in Hi5-Insektenzellen (Invitrogen, Carlsbad, CA), die in Suspension in einem serumfreien Medium (Sf900, Gibco, Grand Island, NY) gezüchtet wurden, ein Expressionssystem von Baculoviren verwendet wurde. Das Fusionsprotein wurde mit Hilfe einer Anionenaustauscher- und einer Affinitäts-Chromatographie unter Einsatz eines Anti-FLAG-M2-Affinitätsharzes (Sigma, St. Louis, MO) und eines FLAG-Peptids (Sigma, St. Louis, MO) gereinigt.
Beispiel 2: Kristallisation und Sammeln der Daten:
Die Kristalle des Apo-HDLP wurden bei Raumtemperatur mit Hilfe der Dampfdiffusionsmethode im hängenden Tropfen aus 7,5% Isopropanol, 28% PEG 1500, 425 mM NaCl, 100 mM Tris-Cl, pH 7,0 gezüchtet. Sie bilden sich in der Raumgruppe C2 mit a = 51,4 Å, b = 93,8 Å, c = 78,7 Å, β = 96,9 Å und enthalten in der asymmetrischen Einheit ein HDLP-Molekül. Die Beugungsdaten wurden mit Kristallen gewonnen, die in einem Puffer aus 7,5% Isopropanol, 35% PEG 1500, 75 mM NaCl, 100 mM Tris-Cl, pH 8,0 bei –170°C blitzgefroren worden waren.
Die Struktur des HDLP-Zn²⁺-Komplexes wurde an HDLP-Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutanten-Kristallen ermittelt, die aus 23% tert.-Butanol, 27% PEG 1500, 400 mM KCl, 100 mM Bis-tris-Propan-Cl, pH 6,8 gezüchtet worden waren. Die Raumgruppe und die Abmessungen der Zelle waren mit denen des Apo-Kristalls identisch. Die HDLP-Zn²⁺-Kristalle wurden geerntet und in 27% tert.-Butanol, 22% PEG 1500, 50 mM KCl, 20 mM NaCl, 0,2 mM ZnCl₂, 100 mM Bis-tris-Propan, pH 6,8 bei –170°C eingefroren.
Die Kristalle des HDLP-Zn²⁺-TSA-Komplexes umfassten die HDLP-Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante und wurden aus 23% tert.-Butanol, 27% PEG 1500, 600 mM KCl, 100 mM Bis-tris-Propan-Cl, pH 6,8 mittels Mikroaussaat gezüchtet. Die Kristalle wurden in Gegenwart von Zink gezüchtet. Sie bilden sich in der Raumgruppe P2₁2₁2₁ mit a = 53,4 Å, b = 94,4 Å, c = 156,3 Å und enthalten in der symmetrischen Einheit zwei HDLP-Zn²⁺-TSA-Komplexe. Die HDLP-Zn²⁺-TSA-Kristalle wurden geerntet und in dem gleichen Kryopuffer wie die HDLP-Zn²⁺-Kristalle eingefroren, mit der Ausnahme, dass 0,5 mM TSA zugesetzt wurden. Die Daten wurden mit DENZO und SCALEPACK (Otwinowsky & Minor, 1997, Method. Ensemble. 276: 307–326), einer MIR-Analyse, dem Bau eines Modells und einer Verfeinerung verarbeitet.
Die HDLP-Zn²⁺-SAHA-Komplex-Kristalle wurden auf die gleiche Weise wie die HDLP-Zn²⁺-TSA-Kristalle gezüchtet und ausgewertet. Die Einschränkungen für die SAHA-Struktur wurden jedoch auf Grundlage stereochemischer Parameter aus der TSA konstruiert. Wie die Apo-HDLP-Kristalle wuchsen die SAHA/HDLP-Cokristalle in der Raumgruppe C2.
Die Apo-HDLP-Kristalle wurden in einem Puffer aus 7,5% Isopropanol, 30% PEG 1500, 75 mM NaCl, 100 mM Tris-Cl, pH 8,0 mit Schweratomen getränkt, der mit 1,0 mM Thimerosal 2 Stunden lang, mit 5 mM KAu(CN)₂ 1 Stunde lang und mit 1 mM Pb(Me)₃OAc 2 Stunden lang supplementiert worden war. Die MIR-Phasen wurden mit dem Programm MLPHARE (The CCP4 suite; Programs for computational crystallography, 1994, Acta Crytallogr. D 50: 760–763) bei 2,5 Å mit Hilfe des anomalen Beugungungssignals aus dem Thimerosalderivat berechnet und sie wiesen eine mittlere Figure of merit von 0,55 auf. Die Phasen wurden mittels Solvent-flattening mit dem Programm DM (The CCP4 suite; Programs for computational crystallography, 1994, Acta Crytallogr. D 50: 760–763) verbessert und dazu verwendet, das Anfangsmodell mit dem Programm O (Jones et al., 1991, Acta Crytallogr. A 47: 110–109) zu erstellen. Sukzessive Folgen von Umbaumaßnahmen und einer Simulated-Annealing-Verfeinerung mit dem Programm CNS Brunger et al., 1998, Acta Crytallogr. D 54: 905–921) gestattete die Interpretation des HDLP aus den Resten 2–373. Die Reste 1, 374 und 375 wurden nicht modelliert und sind vermutlich ungeordnet.
Die Strukturen des HDLP-Zn²⁺-TSA- und des HDLP-Zn²⁺-SAHA-Komplexes wurden mittels Molecular Replacement mit dem Programm AMORS (The CCP4 suite; Programs for computational crystallography, 1994, Acta Crytallogr. D 50: 760–763) unter Einsatz der Apo-HDLP-Struktur als Suchmodell ermittelt. Die Elektronendichte-Karten am Anfang wiesen eine starke und kontinuierliche Differenzdichte für das gesamte TSA-Molekül auf. Das SAHA-Molekül jedoch war in dem Abschnitt mit der Verkapselungsgruppe nicht so gut geordnet. Die Struktur der TSA wurde von der Cambridge Structural Database (Refcode TRCHST) erhalten und wurde dazu verwendet, die beim Verfeinern mit dem Programm CNS benutzten stereochemischen Einschränkungen zu definieren. Die Einschränkungen der SAHA wurden auf Grundlage der stereochemischen Parameter aus der TSA und den umgebenden Aminosäureresten konstruiert. Bei der dimeren Schnittstelle im HDLP-Zn²⁺-TSA- und im HDLP-Zn²⁺-SAHA-Kristall spielt primär Phe200 auf der Oberfläche des Proteins eine Rolle. Die Seitenkette des Phe200 kommt mit Tyr91, dessen Konformation der Seitenkette sich nach der Bindung der TSA verändert, und mit einem Teil der Dimethylaminophenyl-Gruppe der TSA aus dem zweiten Protomer in Kontakt. An der entsprechenden Position enthält die HDAC-Familie keinen Phenylalanin-Rest.
Beispiel 3: Histon-Deacetylase-Assays:
Die gereinigten Proteine wurden untersucht, indem 10 μg von [³H]Acetyl-markiertem murinem Erythroleukämie-Histon-Substrat und HDAC-Assay-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10% Glycerin) 30–60 Minuten lang bei 37°C in einem Gesamtvolumen von 30 μl inkubiert wurden. Die Endkonzentrationen des HDLP und des HDAC1-FLAG betrugen 3,6 μM bzw. 0,24 μM. Die Assays wurden zweifach durchgeführt. Die Reaktionen wurden gestoppt und das freigesetzte Acetat extrahiert und wie beschrieben (Hendzel wt al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 21936–21942) untersucht. Die [³H]Acetyl-markierten murinen Erythroleukämie-Histone wurden im Wesentlichen wie beschrieben gewonnen (Carmen et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 15837–15844). Die Inhibitoren wurden in Abwesenheit des Substrats zugesetzt und auf Eis 20 Minuten lang inkubiert, das Substrat zugegeben und der Assay wie oben beschrieben durchgeführt. Das HDLP wurde mit 20 μM ZnCl₂ und 20 μM MnCl₂(H₂O)₄ in HDAC-Puffer inkubiert und auf seine Aktivität hin untersucht.
Nur das gegen ZnCl₂ dialysierte HDLP wies Aktivität auf. HDAC1-FLAG wurde gegen 20 μM ZnCl₂ in HDAC-Puffer dialysiert, was keine Wirkung auf die Aktivität hatte. Daher enthält HDAC1-FLAG, wie gereinigt, ein Metall.
Das in vivo-Substrat des HDLP ist nicht bekannt. Das HDLP kann wie das AcuC-Gen aus B. subtilis eine Rolle bei der Acetoin-Verwertung spielen und es ist entsprechend auch in der Genomsequenz eine Anmerkung gemacht worden, aber die von AcuC katalysierte Reaktion ist ebenfalls nicht bekannt. Ferner scheinen dem Genom von A. aeolicus das AcuA- und AcuB-Gen zu fehlen, welche einen Teil des acuABC-Operons von B. subtilis darstellen (Deckert et al., 1998, Nature 392: 353–358) und das HDLP ist dem menschlichen HDAC1 so ähnlich (35,2% Identität) wie dem AcuC von B. subtilis (34,7% Identität).
Sequenzprotokoll

Claims

Kristall eines Enzyms mit Deacetylase-Aktivität, wobei der Kristall zur Bestimmung der Atomkoordinaten des Enzyms Röntgenstrahlen bis zu einer Auflösung von über 4 Å effektiv beugt und wobei die Struktur des Enzyms einen konservierten Kern mit einer charakteristischen α/β-Faltstruktur aufweist, wobei die konservierte α/β-Faltung ein achtsträngiges paralleles β-Faltblatt und acht α-Helices umfasst und wobei sich vier der Helices zu beiden Seiten des parallelen β-Faltblatts scharen und wobei die Struktur des Enzyms an den Positionen der Cα-Atome für mindestens 2/3 oder mehr der Aminosäuren von HDLP (SEQ ID NO:1) eine RMSD von kleiner oder gleich 1,5 Å aufweist, wie dies gemäß 16 durch die Atomkoordinaten von HDLP angegeben wird und wobei der Kristall Abmessungen für die Einheitszelle von a = 51,4 Å, b = 93,8 Å, c = 78,7 Å und β = 96,9° oder a = 53,4 Å, b = 94,4 Å und c = 156,3 Å aufweist.
Kristall nach Anspruch 1, wobei das Enzym HDLP ist.
Kristall nach Anspruch 1, wobei das Enzym HDAC1 ist.
Kristall nach Anspruch 1, wobei (a) die Proteinstruktur ferner (1) acht nahe an der Seite des β-Faltblatts positionierte α-Helices umfasst sowie (2) mindestens sieben große gut bestimmte Loops, welche von den C-terminalen Enden der β-Stränge der achtsträngigen parallelen β-Faltblattstruktur stammen, wobei die acht zusätzlichen Helices und die sieben großen Loops mit einer signifikanten Ausdehnung der Struktur über die α/β-Kernstruktur hinaus einhergehen und wobei die Ausdehnung der Struktur zu einer tiefen engen Tasche und zu einer an die Tasche angrenzenden inneren Aushöhlung führt; oder (b) das Enzym mit Deacetylase-Aktivität ausgewählt ist aus HDLP (SEQ ID NO:1), HDAC1 (Histon-Deacetylase 1), HDAC2 (Histon-Deacetylase 2), HDAC3 (Histon-Deacetylase 3), HDAC4 (Histon-Deacetylase 4), HDAC5 (Histon-Deacetylase 5), HDAC6 (Histon-Deacetylase 6), APAH (Acetylpolyaminamido-hydrolase), AcuC (Acetoin verwendendes Protein C) und funktionellen Derivaten derselben.
Kristall nach Anspruch 4, welcher (a) ferner im aktiven Zentrum des Enzyms ein spezifisch gebundenes Zinkatom umfasst; oder (b) ferner im aktiven Zentrum des Enzyms eine spezifisch gebundene Deacetylase-Inhibitorverbindung umfasst; oder (c) durch die Atomkoordinaten gemäß 16 definiert ist.
Verfahren zur Identifizierung einer potentiellen Deacetylase-Inhibitorverbindung für ein Enzym, welches Deacetylase-Aktivität aufweist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Einsatz einer durch die Atomkoordinaten gemäß 16 definierten dreidimensionalen Struktur von HDLP (SEQ ID NO:1); (b) Verwendung dieser dreidimensionalen Struktur, um den potentiellen Inhibitor zu entwerfen oder auszusuchen; (c) wahlweise Synthese dieses potentiellen Inhibitors; (d) in Kontakt Bringen dieses potentiellen Inhibitors mit dem Enzym in Gegenwart eines acetylierten Substrats und (e) Bestimmung der inhibitorischen Deacetylase-Aktivität dieses potentiellen Inhibitors.
Verfahren nach Anspruch 6, in welchem (a) die dreidimensionale Struktur unter Einsatz von Computer-Modeling entworfen oder ausgesucht wird; (b) der potentielle Deacetylase-Inhibitor neu entworfen wird oder (c) der potentielle Deacetylase-Inhibitor auf der Grundlage eines bekannten Inhibitors entworfen wird oder (d) das Enzym mit Deacetylase-Aktivität ausgewählt wird aus HDLP (SEQ ID NO:1), HDAC1 (Histon-Deacetylase 1), HDAC2 (Histon-Deacetylase 2), HDAC3 (Histon-Deacetylase 3), HDAC4 (Histon-Deacetylase 4), HDAC5 (Histon-Deacetylase 5), HDAC6 (Histon-Deacetylase 6), APAH (Acetylpolyaminamido-hydrolase), AcuC (Acetoin verwendendes Protein C) und funktionellen Derivaten derselben.
Verfahren zur Bestimmung der Bindungseigenschaften des potentiellen Deacetylase-Inhibitors gemäß Anspruch 7 in den Schritten: (a) gemeinsame Kristallisation dieser Verbindung mit HDLP; (b) Ermittlung der dreidimensionalen Struktur des gemeinsamen Kristalls aus dem Komplex von HDLP und dem potentiellen Inhibitor mittel Molekular Replacement unter Verwendung der durch die Atomkoordinaten gemäß 16 definierten dreidimensionalen Struktur von HDLP (SEQ ID NO:1) und (c) Analyse der dreidimensionalen Struktur des an die potentielle Inhibitor-Verbindung gebundenen HDLP, um die Bindungseigenschaften der potentiellen Inhibitorverbindung zu ermitteln.
Verfahren zur Lösung der Struktur eines Kristallvertreters aus der HDAC-Familie in den Schritten: (a) Sammeln von Daten über die Röntgenstrahlbeugung des Kristalls, wobei die Daten bis zu einer hohen Auflösung mit einem Grenzwert über 4 Å beugen; (b) Verwendung der Atomkoordinaten von HDLP (SEQ ID NO:1) gemäß 16 zur Durchführung eines Molecular Replacement oder einer Verfeinerung und Differenz-Fouriermethode mit den Daten für die Röntgenstrahlbeugung des Kristallvertreters aus der HDAC-Familie, um die Struktur des Vertreters aus der HDAC-Familie zu ermitteln und (c) Verfeinerung der Struktur des Vertreters aus der HDAC-Familie.
Verfahren nach Anspruch 9, in welchem der Vertreter aus der HDAC-Familie HDAC1 ist.
Eine Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante von HDLP, in welcher die Mutante von der Nucleinsäuresequenz der SEQ ID NO:4 codiert wird.
Eine Cys75Ser/Cys77Ser-Doppelmutante von HDLP, in welcher die Mutante die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 aufweist.
Nucleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO:4.
Expressionsvektor mit der Nucleotidsequenz von Anspruch 13.
Verfahren zur Verwendung des Kristalls von Anspruch 1 zum Screening eines neuen Arzneimittels in den Schritten: (a) Auswahl eines potentiellen Liganden, indem mit der für den Kristall ermittelten dreidimensionalen Struktur ein zweckmäßiges Arzneimitteldesign durchgeführt wird; (b) in Kontakt Bringen des potentiellen Liganden mit der Liganden-Bindungsdomäne des Kristalls und (c) Ermittlung des Bindungspotentials des potentiellen Liganden für die Liganden-Bindungsdomäne, wobei das neue Arzneimittel auf der Grundlage ausgewählt wird, dass es eine größere Affinität für die Liganden-Bindungsdomäne aufweist als ein bekanntes Arzneimittel.
Verfahren nach Anspruch 15, in welchem das Enzym HDLP ist.
Verfahren nach Anspruch 15, in welchem das Enzym HDAC1 (Histon-Deacetylase 1) ist.