JP2003518923A

JP2003518923A - デアセチラーゼ及びその阻害剤の結晶構造

Info

Publication number: JP2003518923A
Application number: JP2001522267A
Authority: JP
Inventors: パブレティッチ，ニコラ; フィニン，マイケル; ドニジャン，ジル; リション，ビクトリア; リフカインド，リチャード，エイ．; マークス，ポール，エイ．; ブレスロー，ロナルド
Original assignee: Columbia University of New York
Current assignee: Columbia University of New York
Priority date: 1999-09-08
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2003-06-17
Also published as: DE60034688D1; WO2001018045A9; US20030013176A1; EP1212357B1; CA2383885A1; US7124068B2; EP1212357A4; ES2287033T3; ATE361316T1; WO2001018045A1; US20070087427A1; DE60034688T2; EP1212357A1; US20070100559A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、超高温菌アキフェクス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ）由来のヒストンデアセチラーゼ様タンパク質（ＨＤＬＰ）の三次元構造情報を提供する。ＨＤＬＰはヒトヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ１）と３５．２％のアミノ酸配列同一性を共有する。本発明はさらに、阻害剤分子が結合したＨＤＬＰの三次元構造情報を提供する。本発明の三次元構造情報はＨＤＬＰ、ＨＤＡＣファミリーメンバーおよびＨＤＬＰ関連分子を阻害することができるデアシラーゼ阻害剤化合物のデザイン、単離およびスクリーニングに有用である。本発明はまた、亜鉛原子の存在下にＨＤＬＰの三次元構造の決定を容易化する突然変異体ＨＤＬＰをコードする核酸に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本願は、１９９９年９月８日出願の米国仮出願６０／１５２，７５３号の優先
権を主張し、その内容は参照することによりここに組み込まれる。

【０００２】本発明は、国立衛生研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆ
Ｈｅａｌｔｈ）認可Ｎｏ．ＲＯ１ＣＡ−６５６９８の下、政府の支援をもっ
てなされたものである。したがって、米国合衆国政府は本発明において特定の権
利を有し得る。

【０００３】本願を通して、様々な刊行物が著者、記事（date）及び引用によって参照され
る。これらの刊行物の開示全体は、ここに記載され、かつ権利が主張される発明
の時点で当該技術分野における熟練者に公知である技術の状況をより十分に説明
するため、参照することにより本願に組み込まれる。

【０００４】緒言本発明は、ヒトヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ１）と３５．２％の配列同
一性を共有し、阻害性リガンドと共に共結晶化することができる、超高温菌アキ
フェクス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ）に由来するヒスト
ンデアセチラーゼ相同体、ＨＤＬＰ（ヒストンデアセチラーゼ様タンパク質；別
名ＡｃｕＣ１）に関し、特には、ここに開示される、該共結晶化から得られる詳
細な結晶学的データに関する。また、本発明は、ＨＤＬＰ及びＨＤＬＰ関連タン
パク質、例えば、ＨＤＡＣ１を含むＨＤＡＣファミリーに属するそれらのタンパ
ク質に結合し、かつその活性部位を阻害する化合物のデザイン、単離及びスクリ
ーニングのためのアポ−ＨＤＬＰ及び阻害剤（inhibitor ）結合ＨＤＬＰの結晶
構造及びＸ線結晶座標を使用する方法に関する。

【０００５】背景技術アセチル化によるヒストンの可逆修飾はヌクレオソーム立体配座及びクロマチ
ン構造の変化に関わりがあり、遺伝子発現の調節において重要な役割を果たす（
ＤａｖｉｅａｎｄＣｈａｄｅｅ，１９９８，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ
．Ｓｕｐｐｌ．３０−３１：２０３−２１３において論評されている）。これら
の修飾を行うヒストンアセチラーゼ及びデアセチラーゼ酵素は多くの細胞プロセ
ス、例えば、細胞周期の進行及び分化に関与し、それらの崩壊は幾つかのタイプ
のヒト癌に関わる（Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇ
ｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４０−４８；Ｈａｓｓｉｇら，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｌ．４；７８３−７８９；ＦｅｎｒｉｃｋａｎｄＨｅｉｂｅｒｔ，１９
９８，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．３０−３１：１９４−２０
２において論評されている）。

【０００６】近年、幾つかの実験的抗腫瘍化合物、例えば、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、
トラポキシン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、及びフェニル
ブチレートが、少なくとも部分的には、ヒストンデアセチラーゼを阻害すること
によって作用することが示されている。Ｒｉｃｈｏｎら，１９９８，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ９５：３００３−３００７；Ｙｏｓｈ
ｉｄａら，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７１７４−１７１７
９；Ｋｉｊｉｍａら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２４２９
−２２４３５。加えて、ジアリルスルフィド及び関連分子（Ｌｅａら，１９９９
，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２：３４７−３５２）、オキサムフラチン（Ｋｉｍ
ら，１９９９，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１５：２４６１−２４７０）、ＭＳ−２７−
２７５、合成ベンズアミド誘導体（Ｓａｉｔｏら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６；４５９２−４５９７）、ブタレート誘導体（Ｌｅ
ａａｎｄＴｕｌｓｙａｎ，１９９５，ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ．１５：８７９−８８３）、ＦＲ９０１２２８（Ｎｏｋａｊｉｍａら，１９９８．Ｅｘ
ｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．２４１：１２６−１３３）、デプデシン（Ｋｗｏｎら，
１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：３３５６−
３３６１）及びｍ−カルボキシシンナム酸ビスヒドロキサミド（ＣＢＨＡ；Ｒｉ
ｃｈｏｎら，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：３００３
−３００７）がヒストンデアセチラーゼを阻害することが示されている。イン・
ビトロで、これらの化合物は線維芽細胞の成長を、Ｇ１及びＧ２期において細胞
周期の停止を引き起こすことにより阻害することができ（Ｒｉｃｈｏｎら，１９
９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：５７０５−５７
０８；Ｋｉｍら，１９９９，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１８：２４６１−２４７０；Ｙ
ｏｓｈｉｄａら，１９９５．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ１７；４２３−４３０；Ｙｏ
ｓｈｉｄａ＆Ｂｅｐｐｕ，１９８８，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１７７：１２
２−１３１）、末端分化及び様々な形質転換細胞株の形質転換能力の喪失につな
がり得る。Ｒｉｃｈｏｎら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ９３：５７０５−５７０８；Ｋｉｍら，１９９９，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
１８：２４６１−２４７０；Ｙｏｓｈｉｄａら，１９８７，ＣａｎｃｅｒＲ
ｅｓ．４７：３６８８−３６９１。イン・ビボで、フェニルブチレートは、レチ
ノイン酸と共に、急性前骨髄性白血病の治療において有効である。Ｗａｒｒｅｌ
ｌら，１９９８，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．９０：１６２１−１
６２５。ＳＡＨＡは、ラットにおける乳腫瘍、及びマウスにおける肺腫瘍の形成
の防止において有効である。Ｄｅｓａｉら，１９９９，Ｐｒｏｃ．ＡＡＣＲ４０：ａｂｓｔｒａｃｔ＃２３９６；Ｃｏｈｅｎら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，
提示済。

【０００７】ヒストンデアセチラーゼは、ヌクレオソームヒストンのＮ−末端近傍に集中す
るリジン残基のε−アミノ基からのアセチル基の除去を触媒し、このプロセスは
転写抑制に関わる（Ｓｔｒｕｈｌ，１９９８，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１２：５９
９−６０６において論評されている）。酵母ヒストンデアセチラーゼ遺伝子、ｒ
ｐｄ３の欠失又はトリコスタチンＡでのその薬理学的不活性化は、プロモーター
のサブセット、例えば、Ｕｍｅ６−調節遺伝子のものにおいて転写抑制を低下さ
せる。Ｋａｄｏｓｈ＆Ｓｔｒｕｈｌ，１９９８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：５１２１−５１２７。これには抑制されたプロモーター及びその近傍にお
けるＨ４ヒストンのアセチル化の増加を伴うが、プロモーター末端領域のヒスト
ンに対する効果はない。Ｋａｄｏｓｈ＆Ｓｔｒｕｈｌ，１９９８，Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：５１２１−５１２７；Ｒｕｎｄｌｅｔｔら，１９９８，
Ｎａｔｕｒｅ３９２：８３１−８３５。

【０００８】ヒストンデアセチラーゼは、直接又はデアセチラーゼを転写リプレッサーに橋
渡しするコリプレッサー（ｃｏ−ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）を介してＤＮＡ結合転写
リプレッサーと会合することにより、特定のプロモーターに集められる。例えば
、Ｍａｄ及びＵｍｅ６リプレッサーはコリプレッサーＳｉｎ３Ａに結合し（Ｌａ
ｈｅｒｔｙら，１９９７，Ｃｅｌｌ８９：３４９−３５６；Ｈａｓｓｉｇら，
１９９７，Ｃｅｌｌ８９：３４１−３４７；Ｋａｄｏｓｈ＆Ｓｔｒｕｈｌ，１
９９７，Ｃｅｌｌ８９：３６５−３７１）、核受容体はＮ−ＣｏＲ及び関連Ｓ
ＭＲＴコリプレッサーを結合する。Ｎａｇｙら，１９９７，Ｃｅｌｌ８９：３
７３−３８０；Ａｌｌａｎｄら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ３８７：４９−５５
；Ｈｅｉｎｚｅｌら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ３８７：４３−４８。

【０００９】ヒストンデアセチラーゼの招集の崩壊は、これらの酵素が腫瘍形成に貢献する
機構の１つであるように思われる。急性前骨髄性白血病（ＡＰＬ）においては、
染色体の転位によりレチノイン酸受容体−α（ＲＡＲα）がＰＬＺＦ又はＰＭＬ
のいずれかに融合する。これらの融合腫瘍性タンパク質は、部分的には、コリプ
レッサーの、次にはＨＤＡＣの招集によって生じる異常転写抑制活性を有する。
Ｇｒｉｇｎａｎｉら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ３９１：８１５−８１８；Ｌｉ
ｎら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ３９１：８１１−８１４。ＴＳＡでＰＬＺＦ−
ＲＡＲα ＡＰＬ細胞を処理することで、レチノイン酸誘導分化に対するそれら
の応答性が高まる。Ｇｒｉｇｎａｎｉら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ３９１：８
１５−８１８；Ｌｉｎら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ３９１：８１１−８１４。

【００１０】ヒストンデアセチラーゼは酵母からヒトで保存されているタンパク質の巨大フ
ァミリーを含み、２つの関連クラスに分けられる。クラスＩはヒトＨＤＡＣ１、
２、３（Ｔａｕｎｔｏｎら，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：４０８−４１
１；Ｙａｎｇら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１２８４５−１２８５０；Ｅｍｉｌｉａｎｉら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：２７９５−２８００）、及び酵母Ｒ
ＰＤ３（Ｖｉｄｅｌ＆Ｇａｂｅｒ，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：６３１７−６３２７）を特徴とし、クラスＩＩはヒトＨＤＡＣ４、５、６（
Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ９６：４８６８−４８７３；Ｆｉｓｃｈｌｅら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７４；１１７１３−１１７２０）、及び酵母ＨＤＡ１（Ｒｕｎｄ
ｌｅｔｔら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１４５０３−１４５０８）を特徴とする。これら２つのクラスは、デアセチラ
ーゼ・コアを含む〜３９０のアミノ酸領域の配列類似性を共有するが、この領域
の外側では異なる。ヒストンデアセチラーゼ遺伝子はより大きなスーパーファミ
リーに属し（Ｌｅｉｐｅ＆Ｌａｎｄｓｍａｎ，１９９７，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓＲｅｓ．２５：３６９３−３６９７）、これは原核生物アセトイン利用
タンパク質（ＡｃｕＣ：ＨＤＡＣ１と２８．１％配列同一）、及び原核生物アセ
チルポリアミンアミドヒドロラーゼ（ＡＰＡＨ：ＨＤＡＣ１と１５．０％配列同
一）を含む。ＡｃｕＣの酵素活性は明らかではないが、その破損によりアセトイ
ンを分解してそれを炭素源として利用する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の能
力が低下する。Ｇｒｕｎｄｙら，１９９３，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：２５９−２７１。ＡＰＡＨは、非ペプチドアミド結合を開裂することにより、
ポリアミンの脱アセチル化を触媒する（Ｌｅｉｐｅ＆Ｌａｎｄｓｍａｎ，１９９
７，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５；３６９３−３６９７において
論評されている）。

【００１１】ＨＤＡＣ及びＨＤＡＣ関連タンパク質がいかにしてヒストンの脱アセチル化を
触媒し、かつ上で参照される化合物、特には抗腫瘍活性を有する化合物が如何に
してこの活性を阻害するのかという問題に取り組むことは、ＨＤＡＣの阻害の機
構をより理解し、かつこの活性を阻害し得るさらなる有用な化合物の発見を促進
するために有用である。この目的に向かって、本発明は、高温菌アキフェクス・
エオリクスに由来するＨＤＡＣ１様タンパク質、以下ＨＤＬＰ、の三次元構造を
決定している。ＨＤＬＰの核酸コーディング配列の決定はＤｅｃｋｅｒｔら，１
９９８，Ｎａｔｕｒｅ３９２：３５３−３５８に記載された。この核酸コーデ
ィング配列から配列が決定される、コードされた３７５残基のタンパク質は、Ｈ
ＤＡＣ１と３５．２％のアミノ酸配列同一性を共有し、イン・ビトロでヒストン
を脱アセチル化し、かつＴＳＡ、ＳＡＨＡ及び幾つかの他のＨＤＡＣ阻害剤によ
って阻害される。ＨＤＬＰの三次元構造の決定は、イン・ビボ及びイン・ビトロ
の両者での細胞成長の阻害に有用である新規ＨＤＡＣファミリー阻害性化合物の
デザイン、同定及びスクリーニングにおいて有用である。

【００１２】発明の要旨一般には、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）として知られるタンパク質フ
ァミリー、特には、ヒトヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ１）と３５．２％の
配列同一性を共有する超高温菌アキフェクス・エオリクスＨＤＬＰに由来する相
同体（ヒストンデアセチラーゼ様タンパク質）の詳細な三次元構造情報を提供す
ることが本発明の目的である。また、阻害性化合物に結合するＨＤＬＰの三次元
構造情報を提供することも本発明の目的である。

【００１３】本発明の一態様においては、三次元構造情報を野生型ＨＤＬＰ（配列番号：１
）（野生型ＨＤＬＰをコードする核酸は配列番号：２）の結晶から得る。本発明
のさらなる態様においては、三次元情報を、２つの突然変異（１）システイン７
５からセリンへの及び（２）システイン７７からセリンへの突然変異（Ｃｙｓ７
５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７Ｓｅｒ二重突然変異体；配列番号：３）（ＨＤＬＰＣｙ
ｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７Ｓｅｒ二重突然変異体をコードする核酸は配列番号：
４）を含む突然変異体ＨＤＬＰから得る。本発明のＨＤＬＰ突然変異体は、亜鉛
原子にその亜鉛原子結合部位で結合するＨＤＬＰの三次元構造情報の決定を容易
にする。

【００１４】本発明の好ましい態様においては、三次元構造情報を、ＨＤＬＰ又はＨＤＬＰＣｙｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７Ｓｅｒ二重突然変異体及びトリコスタチンＡ（
ＴＳＡ）を含むタンパク質−阻害剤化合物複合体の共結晶から得る。本発明の別
の好ましい態様においては、三次元構造情報を、ＨＤＬＰ又はＨＤＬＰＣｙｓ
７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７Ｓｅｒ二重突然変異体及びスベロイルアニリドヒドロキ
サム酸（ＳＡＨＡ）を含むタンパク質−阻害剤化合物複合体の共結晶から得る。
ＨＤＬＰと共結晶化できるあらゆるＨＤＬＰ又はＨＤＬＰ関連タンパク質（例え
ば、ＨＤＡＣ）阻害剤化合物を本発明の共結晶の形成に用いることができる。

【００１５】本発明のタンパク質結晶及びタンパク質−阻害性複合体共結晶は、少なくとも
４オングストローム（Å）に等しいか、又はそれを上回る高最大分解能まで回折
する。好ましい態様においては、本発明のタンパク質結晶及びタンパク質−阻害
性複合体共結晶は、２．５Åを上回る高最大分解能まで回折する。

【００１６】本発明の結晶は様々な形態を取ることができ、それらの全てが本発明によって
意図される。好ましい態様においては、結晶は、非対称単位内に１つの分子を有
し、かつａ＝５１．４Å、ｂ＝９３．８Å、ｃ＝７８．７Å及びβ＝９６．９°
の単位寸法を有するＣ２空間群を有する（例えば、下記実施例２を参照）。別の
好ましい態様においては、結晶は、非対称単位内に２つの分子を有し、かつａ＝
５３．４Å、ｂ＝９４．４Å、ｃ＝１５６．３Åの単位寸法を有するＰ２₁２₁ ２₁の空間群を有する（例えば、下記実施例２を参照）。ＨＤＬＰ構造は、いず
れの面に対してもαヘリックスがパッキング（packing）されている平行βシー
トを含む。このβシートの一端では、ＨＤＬＰは、幾つかの十分に秩序付けられ
たループによって形成される狭いチューブ様ポケットを有する。このポケットの
壁は疎水性残基で裏打ち（lined ）されており、ポケットの底部には亜鉛結合部
位及び幾つかの極性側鎖が存在する。本発明の阻害性化合物はこのポケットにお
いて結合する。

【００１７】ＨＤＬＰ、ＨＤＬＰＣｙｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７Ｓｅｒ二重突然変異体、
亜鉛原子を含むＨＤＬＰＣｙｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７Ｓｅｒ二重突然変異体
、ＴＳＡ又はＳＡＨＡのような阻害性化合物を含むＨＤＬＰ、及びＴＳＡ又はＳ
ＡＨＡのような阻害性化合物を含むＨＤＬＰＣｙｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７Ｓ
ｅｒ二重突然変異体の結晶から得られる三次元構造情報は、あらゆるＨＤＬＰ関
連タンパク質（例えば、ＨＤＡＣ）結晶、又はあらゆる突然変異体ＨＤＬＰ関連
タンパク質、特には、基質もしくは阻害剤化合物を含むリガンドと複合体を形成
したＨＤＬＰ関連タンパク質のあらゆる野生型もしくは突然変異体の構造を解析
するのに用いることができる。結晶が既知構造とは異なる空間群にある場合、そ
の構造を解析するのに分子置換を用いることができ、結晶が同じ空間群にある場
合には、精密化及び差フーリエ法を用いることができる。ＨＤＬＰ関連タンパク
質（例えば、ＨＤＡＣ１）の構造は、完全長ＨＤＬＰ構造の少なくとも５０％以
上のアミノ酸についてＣα原子の位置に２．０Åを上回る根二乗平均偏差（ｒｍ
ｓｄ）を含まない。

【００１８】本発明は、配列番号：３のアミノ酸配列を有するＨＤＬＰＣｙｓ７５Ｓｅｒ
／Ｃｙｓ７７Ｓｅｒ二重突然変異体をコードする核酸分子及び配列番号：４の核
酸配列も提供する。亜鉛原子に結合する該タンパク質の構造の決定を容易にする
ため、Ｃｙｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７Ｓｅｒ二重突然変異体と同様に、ＨＤＬＰ
関連タンパク質のシステイン残基に突然変異が誘発されることも本発明によって
意図される。加えて、本発明は、発現制御配列に作動可能に連結する、配列番号
：４によって表される配列によってコードされるＨＤＬＰＣｙｓ７５Ｓｅｒ／
Ｃｙｓ７７Ｓｅｒ二重突然変異体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを提
供する。

【００１９】本発明の別の目的は、ＨＤＬＰ／ＨＤＡＣファミリーの潜在的な阻害剤化合物
のデザイン、同定及びスクリーニングのための方法を提供することにある。好ま
しい態様において、デアセチラーゼ活性を含むＨＤＬＰ及びＨＤＬＰ関連タンパ
ク質（例えば、ＨＤＡＣ）の潜在的阻害剤化合物の合理的デザイン、同定及びス
クリーニングのための方法は：（ａ）本発明の原子座標によって規定されるＨＤ
ＬＰの三次元構造を用いる工程；（ｂ）該三次元構造を該潜在的阻害剤化合物の
デザイン又は選択に用いる工程；（ｃ）該潜在的阻害剤を合成及び／又は選択す
る工程；（ｄ）アセチル化基質の存在下において該潜在的阻害剤化合物を該酵素
と接触させる工程；及び（ｅ）デアセチラーゼ活性の阻害パーセントを決定して
該潜在的阻害剤化合物の阻害活性を決定する工程を含む。さらなる好ましい態様
においては、該合理的にデザインされた阻害性化合物の結合特性を、（ａ）該阻
害性化合物及びＨＤＬＰ又はＨＤＬＰ関連タンパク質を含む複合体を形成する工
程、（ｂ）該阻害性化合物−ＨＤＬＰ複合体を共結晶化する工程；（ｃ）分子置
換又は精密化及び本発明によって規定されるＨＤＬＰの分子座標を用いる差フー
リエによって該共結晶の該三次元構造を決定する工程；並びに（ｄ）三次元構造
を解析して該潜在的阻害剤化合物の結合特性を決定する工程を含む方法によって
決定することができる。

【００２０】本発明のさらなる目的は、定義されたクラスのＨＤＬＰ／ＨＤＡＣファミリー
阻害剤化合物を同定することにある。本発明のＨＤＬＰ／ＨＤＡＣファミリー阻
害剤化合物は式（Ｉ）によって表される：（式中、Ｘはプロリン及びロイシンからなる群より選択される少なくとも１つの
アミノ酸に結合するキャップ基を含み；Ｙはロイシン、フェニルアラニン及びグ
リシンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸に結合する脂肪族鎖
基を含み；並びに、Ｚはアスパラギン酸、チロシン及びヒスチジンからなる群よ
り選択される少なくとも１つのアミノ酸に結合し、かつ亜鉛原子にさらに結合す
ることができるアンド（and ）活性部位結合基を含む。）

【００２１】発明の詳細な説明本発明は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）相同体の結晶であって、該Ｈ
ＤＡＣ相同体のヒストンデアセチラーゼ活性を阻害することが可能な化合物の存
在及び不在下において成長させた結晶を提供する。ここで参照されるとき、ＨＤ
ＡＣ相同体（ＨＤＬＰ関連タンパク質に加えて）は、（ａ）ＨＤＬＰの３７５ア
ミノ酸残基にわたって１５％を上回る配列同一性を有し；（ｂ）合計で１００以
下のアミノ酸について挿入又は欠失が２０以下であり；並びに（ｃ）デアセチラ
ーゼ活性を有するあらゆるタンパク質分子である。配列同一性は、同一性マトリ
ックス重み付けスキーム・クラスタル法（ｉｄｅｎｔｉｔｙｍａｔｒｉｘｗ
ｅｉｇｈｉｎｇｓｃｈｅｍｅｃｌｕｓｔａｌｍｅｔｈｏｄ）を用いるプロ
グラムＤＮＡｓｔａｒ^TM（ＤＮＡｓｔａｒプログラム、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）
によって算出する。

【００２２】ＨＤＬＰ／ＨＤＡＣ阻害剤化合物は、ここで用いられる場合、式（Ｉ）：で表されるあらゆる化合物を指し、式中、Ｘはチロシン、プロリン及びロイシン
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸に結合するキャップ基を含
み；Ｙはフェニルアラニン及びグリシンからなる群より選択される少なくとも１
つのアミノ酸に結合する、約５ないし約１０Å、好ましくは７Åの脂肪族鎖基を
含み；並びに、Ｚはアスパラギン酸、チロシン及びヒスチジンからなる群より選
択される少なくとも１つのアミノ酸に結合し、かつ亜鉛原子にさらに結合するこ
とができる活性部位結合基を含む。本発明のＨＤＡＣ阻害性化合物は、ＨＤＡＣ
相同体又はＨＤＬＰ関連タンパク質のヒストンデアセチラーゼ活性を５０％を上
回って阻害することができる。

【００２３】本発明の結晶を成長させるため、ＨＤＡＣ及びＨＤＡＣ阻害性化合物複合体を
総タンパク質が８０％を上回るまで精製し、より好ましくは総タンパク質が９０
％を上回るまで精製する。発現及び精製の目的で、完全長ＨＤＬＰ（Ｇｅｎｂａ
ｎｋ受付番号ＡＥ０００７１９）をアキフェクス・エオリクス染色体ＤＮＡ調製
品からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってサブクローン化し、発現ベクタ
ーに挿入することができる。

【００２４】当該技術分野において公知の多数のベクター・宿主系を用いることができる。
可能性のあるベクターには、限定されるものではないが、プラスミド又は改変ウ
イルスが含まれるが、そのベクター系は用いられる宿主細胞に適合しなければな
らない。ベクターの例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）バクテリオファージ、例え
ばラムダ誘導体、又はプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２誘導体もしくはｐＵＣ
プラスミド誘導体、例えば、ｐＧＥＸベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）、ｐＥＴベクター（
Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐｍａｌ−ｃベクター（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）
、ｐＦＬＡＧベクター（ＣｈｉａｎｇａｎｄＲｏｅｄｅｒ，１９９３，Ｐｅ
ｐｔ．Ｒｅｓ．６：６２−６４）、バキュロウイルスベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ
、ＣＡ）等が含まれる。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的突出
末端を有するクローニングベクターにＤＮＡ断片をライゲートすることにより、
利用可能な相補的突出末端がない場合には平滑末端ライゲーションにより、又は
ヌクレオチドリンカーを介して当該技術分野において標準的な技術を用いること
により達成することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ．），Ｃｕｒ
ｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，
（１９９２）。その後、目的の核酸を含む組換えベクターを、そのベクターに適
合する宿主細胞（例えば、大腸菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等）に、形質転換、
トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション等によって導入すること
ができる。核酸を、クローン化してバクテリア内で多量に増殖させることができ
るシャトルベクター内に配置した後、発現用の真核細胞宿主に導入することもで
きる。本発明のベクター系は発現制御配列を提供することができ、イン・ビトロ
でのタンパク質の発現を可能にする。

【００２５】好ましい態様においては、完全長ＨＤＬＰ（配列番号：２）をアキフェクス・
エオリクス染色体ＤＮＡ調製品からｐＧＥＸ４Ｔ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）にサブクローン
化する。Ｃｙｓ７５Ｓｅｒ及びＣｙｓ７７Ｓｅｒ突然変異を含む二重突然変異体
（配列番号：４）を構築し、かつＨＤＬＰ活性部位突然変異体Ｔｙｒ２９７ｐｈ
ｅ（配列番号：５及び配列番号：６）を構築するため、ＰＣＲ部位特異的突然変
異誘発を当該技術分野おける熟練者に公知の方法でのＤＮＡ配列決定法による検
証と共に用いることができる（例えば、下記実施例１を参照）。本発明の突然変
異体は、上述のように、適切な発現ベクターにサブクローン化し、タンパク質産
生用の宿主細胞に導入することができる。

【００２６】本発明のＨＤＬＰ核酸を発現ベクターにサブクローン化し、産生されるＨＤＬ
Ｐ分子が融合タンパク質を含むように発現構築物を創製することができ、ここで
、該融合タンパク質は精製を容易にするためのタグを含む。ここで参照される場
合、「タグ」は、精製を容易にするため、産生を改善するため、又は本発明の目
的を容易にし得る他のあらゆる目的のため（例えば、より高レベルの産生及び／
又は精製を達成するため）、タンパク質のＣ末端、ｎ末端又は内部のいずれかに
もたらされるあらゆる追加アミノ酸である。このようなタグには、精製において
有用であることが当該技術分野における熟練者に公知であるタグ、例えば、限定
されるものではないが、ｈｉｓタグ、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ・
タグ、フラッグ・タグ、ｍｂｐ（マルトース結合性タンパク質）タグ等が含まれ
る。好ましい態様においては、本発明の野生型及び突然変異体ＨＤＬＰをグルタ
チオン−ｓ−トランスフェラーゼでタグ化する（下記実施例１を参照）。別の好
ましい態様においては、ＨＤＡＣ１をフラッグ・タグ化する（下記実施例１を参
照）。そのようなタグ化されたタンパク質を、精製の前、その間もしくはその後
のタグの除去を容易にするため、開裂部位、例えば、トロンビン、エンテロキナ
ーゼ又はＸ因子開裂部位を含むように加工することもできる。タグ及びタグを除
去するための開裂部位をもたらすベクター系は、本発明の発現構築物を作製する
のに特に有用である。

【００２７】本発明のタグ付けされたＨＤＬＰ及びＨＤＡＣは、免疫親和性又は以下のもの
を用いるクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されるものではない通常のク
ロマトグラフィーによって精製することができる：グルタチオン−ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ^TM（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ
ｅｗＪｅｒｓｅｙ）もしくは等価樹脂、ニッケルもしくはコバルト精製樹脂、
アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性樹
脂、ゲル濾過、抗フラッグ・エピトープ樹脂、逆相クロマトグラフィー等。精製
後、結晶化の目的で、ＨＤＬＰ及びＨＤＬＰ−阻害剤化合物複合体を１ｍｇ／ｍ
ｌを上回るまで濃縮することができる。好ましい態様においては、結晶化のため
、ＨＤＬＰ及びＨＤＬＰ−阻害剤複合体を１０ｍｇ／ｍｌを上回るまで濃縮し、
特に好ましい態様においては、ＨＤＬＰ及びＨＤＬＰ−阻害剤複合体を２０ｍｇ
／ｍｌを上回るまで濃縮する。

【００２８】本発明の精製ＨＤＬＰがヒストンデアセチラーゼ活性を示すかどうかを決定す
るため、精製ＨＤＬＰ及びあらゆるＨＤＬＰ関連タンパク質をも、該活性の決定
について当該技術分野における熟練者に公知のあらゆる方法によってアッセイす
ることができる。好ましい態様においては、Ｈｅｎｚｅｌら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６６：２１９３６−２１９４２（１９９１）；下記実施例３を参照）
によって記載されるように、本発明の精製ＨＤＬＰを、［³Ｈ］アセチル標識ヒ
ストン基質（Ｃａｒｍｅｎら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１
５８３７−１５８４４）の存在下、ヒストンデアセチラーゼ活性の検出に適する
緩衝液中でインキュベートし（下記実施例３を参照）；反応を停止させ；放出さ
れたアセテート（acetate ）を抽出して該放出されたアセテートを測定する。好
ましい態様においては、本発明のＨＤＬＰを、それらからヒストンデアセチラー
ゼ活性を得るため、ＺｎＣｌ₂の存在下でインキュベートする（下記実施例３）
。

【００２９】別の態様においては、本発明の結晶は精製野生型ＨＤＬＰ（配列番号：１）を
含み、室温でハンギング・ドロップ（ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ）蒸気拡散法に
より、イソプロパノール、ポリエチレングリコール、及びｔｅｒｔ−ブタノール
からなる群より選択される１種類以上の沈殿剤を含む結晶化溶液から成長させる
（下記実施例２を参照）。この結晶化溶液は、ＮａＣｌ及びＫＣｌからなる群よ
り選択される塩を含む１種類以上の塩、並びにＴｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン）及びビス−トリスプロパン−Ｃ１（１，３−ビス［トリス
（ヒドロキシメチル）メチル−アミノ］プロパン）からなる群より選択される緩
衝液を含む１種類以上の緩衝液をさらに含んでいてもよい（下記実施例２を参照
）。結晶化溶液のｐＨは、他のｐＨ値も本発明によって意図されるものの、好ま
しくはｐＨ５ないし９である（下記実施例２を参照）。

【００３０】本発明の結晶を得るのに当該技術分野における熟練者に公知のあらゆる結晶化
技術を用いることができ、これにはバッチ結晶化、（シッティング・ドロップ（
ｓｉｔｔｉｎｇｄｒｏｐ）もしくはハンギング・ドロップのいずれかによる）
蒸気拡散及びミクロ透析が含まれるが、これらに限定されるものではない。幾ら
かの場合、Ｘ線品質の結晶を得るのに結晶の接種が必要となることもある。した
がって、そのために結晶の標準的なミクロ及び／マクロ接種を用いることができ
る。

【００３１】本発明の結晶は、非対称単位内に１つの分子を有し、かつａ＝５１．４Å、ｂ
＝９３．８Å、ｃ＝７８．７Å及びβ＝９６．９°の単位寸法を有する空間群Ｃ
２の形態をとることができる（下記実施例２を参照）。また、本発明の結晶は、
非対称単位内に２つの分子を有し、かつａ＝５３．４Å、ｂ＝９４．４Å、ｃ＝
１５６．３Åの単位寸法を有する空間群Ｐ２₁２₁２₁の形態をとることもでき
る（下記実施例２を参照）。しかしながら、本発明は、Ｃ２、Ｐ２₁、Ｐ２₁２ ₁ ２₁、Ｐ３₁２１、Ｐ４₃２₁２₁、及びＣ２２２₁を含むがこれらに限定さ
れるものではないあらゆる空間群の形態をとる結晶も意図されている。これらの
結晶を４Åを上回る分解能、好ましくは２．５Åを上回る分解能まで回折する。

【００３２】本発明の結晶からの回折データを修正するため、結晶を、それらの結晶の成長
に用いたものではあるが、好ましくはより高い沈殿剤濃度を有する結晶化緩衝液
中で瞬間凍結することができる（例えば、下記実施例２を参照）。例えば、限定
を目的とするものではないが、用いられる沈殿剤が２８％ＰＥＧ１５００である
場合、結晶を、沈殿剤濃度を３５％に増加したその結晶の成長に用いたものと同
じ結晶化溶液中で瞬間凍結することができる（下記実施例２を参照）。沈殿剤が
十分な凍結保護物質ではない（すなわち、瞬間凍結の際にガラスが形成されない
）場合、瞬間凍結の際のガラス形成を達成するため、凍結保護物質（例えば、グ
リセロール、低分子量ＰＥＧ、アルコール等）を、その凍結保護物質が結晶の完
全性の保存に適合するという条件の下で溶液に添加することができる。この瞬間
凍結結晶は、Ｘ線回折による結晶学的データの収集の間、−１１０℃未満、好ま
しくは−１５０℃未満の温度で維持する。Ｘ線回折データはＤＥＮＺＯ及びＳＣ
ＡＬＥＰＡＣＫ（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ＆Ｍｉｎｏｒ，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄ
Ｅｎｓｅｍｂｌｅ．２７６：３０７−３２６）で処理することができるが、当
該技術分野における熟練者に公知のあらゆる方法をＸ線回折データの処理に用い
ることができる。

【００３３】本発明に従ってＨＤＬＰの原子構造を決定するため、多重同形置換（ｍｕｌｔ
ｉｐｌｅｉｓｏｍｏｒｐｈｏｕｓｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（ＭＩＲ）解析
、モデル構築及び精密化を行うことができる。ＭＩＲ解析に対しては、結晶を重
原子に浸漬してＭＩＲ解析に必要な重原子誘導体を生成することができる。ここ
で用いられる場合、重原子誘導体又は誘導体化はタンパク質又はタンパク質複合
体結晶の化学的に修飾された形態を生成する方法であって、そのタンパク質が結
晶内の重原子に特異的に結合する方法を指す。実際には、結晶全体にわたって拡
散し、かつタンパク質に特異的に結合し得る重金属原子もしくは塩、又は有機金
属化合物、例えば、塩化鉛、シアン化金、チメロサール、酢酸鉛、酢酸ウラニル
、塩化水銀、塩化金等を含む溶液に結晶を浸漬する。結合重金属原子（１つもし
くは複数）又は塩の位置は浸漬した結晶のＸ線回折解析によって決定することが
できる。この情報をＭＩＲ相情報の生成に用い、それを本発明の結晶化ＨＤＬＰ
及びＨＤＬＰ関連タンパク質の三次元構造の構築に用いる。好ましい態様におい
て、重原子にはチメロサール、ＫＡｕ（ＣＮ）₂及びＰｂ（Ｍｅ）₃ＯＡｃが含
まれる（下記実施例２を参照）。ＭＩＲ相は当該技術分野における熟練者に公知
のあらゆるプログラムにより、好ましくはプログラムＭＬＰＨＡＲＥ（Ｔｈｅ
ＣＣＰ４ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓｆｏｒｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａ
ｌｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，１９９４，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏ
ｇｒ．Ｄ．５０：７６０−７６３）で算出することができ、チメロサール誘導体
からの異常回折シグナルを用いることもできる。好ましい態様においては、ＭＩ
Ｒ相を２．５Åで算出したところ、０．５５の平均フィギュアオブメリット
（ｆｉｇｕｒｅｏｆｍｅｒｉｔ）を有する（図１９及び下記実施例２を参照
）。これらの相は、必要であれば、プログラムＤＭ（ＴｈｅＣＣＰ４ｓｕｉ
ｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓｆｏｒｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｃｒｙｓｔａ
ｌｌｏｇｒａｐｈｙ，１９９４，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０：７６０−７６３）の使用によるものを含むがこれに限定されるものではない、
当該技術分野における熟練者に公知の方法による溶媒平滑化によって改善するこ
とができる。

【００３４】その後、プログラムＯ（Ｊｏｎｅｓら，１９９１，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌ
ｌｏｇｒ．Ａ４７；１１０−１１９）を用いて三次元構造の初期モデルを構築
することができる。構造の解釈及び構築は、プログラムＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒ
ら，１９９８，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４：９０５−９２１
）を用いることによってさらに容易にすることができる。

【００３５】ＨＤＬＰ−阻害剤化合物複合体の構造の決定について、そのＨＤＬＰ−阻害剤
化合物複合体結晶の空間群が異なる場合、アポ−ＨＤＬＰ（ここで参照される場
合、アポ−ＨＤＬＰ又はアポ−ＨＤＡＣは阻害剤化合物と複合体を形成していな
い酵素である）の既知構造、又はその構造を上述の通り、及び下記実施例２と同
様に決定することができるあらゆる既知ＨＤＬＰ／阻害剤複合体の構造を用いて
、分子置換を使用することができる。ＨＤＬＰ−阻害剤化合物結晶の空間群が同
じ場合、アポ−ＨＤＬＰ（ここで参照される場合、アポ−ＨＤＬＰ又はアポ−Ｈ
ＤＡＣは阻害剤化合物と複合体を形成していない酵素である）の既知構造又はあ
らゆる公知のＨＤＬＰ／阻害剤複合体構造を用いて、剛性体精密化及び差フーリ
エを構造解析に使用することができる。

【００３６】「分子置換」という用語は、分子置換の使用前は構造座標が不明である、本発
明のＨＤＬＰ結晶の三次元構造の予備モデルを生成することを含む方法を指す。
分子置換は、構造座標が既知である分子（この場合には予め決定されたアポ−Ｈ
ＤＬＰ）を、構造が不明であるＨＤＬＰ又はＨＤＬＰ関連タンパク質結晶から得
られるＸ線回折パターンによって規定される単位格子内に、未知結晶の観察され
た回折パターンを最良に説明できるように配向及び位置付けすることによって達
成される。その後、このモデルから相を算出し、観察された振幅と組み合わせて
座標が不明である構造の最適フーリエ合成を得ることができる。次にこれを幾つ
かの精密化形態のいずれかに処し、最終的な正確な構造を得ることができる。

【００３７】熟練技術者に公知のあらゆる方法を分子置換による構造の決定に用いることが
できる。例えば、プログラムＡＭＯＲＥ（ＴｈｅＣＣＰ４ｓｕｉｔｅ：Ｐｒ
ｏｇｒａｍｓｆｏｒｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ
ａｐｈｙ，１９９４，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．５０：７６０−
７６３）を、アポ−ＨＤＬＰ座標を用いる分子置換による未知ヒストンデアセチ
ラーゼ＋／−阻害剤の構造決定に用いることができる（図１６）。阻害性化合物
ＴＳＡの構造決定のため、ケンブリッジ・ストラクチャラル・データベース（Ｃ
ａｍｂｒｉｄｇｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＤａｔａｂａｓｅ）から得たＴＳＡ
の構造（参照コードＴＲＣＨＳＴ、≪ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｃｄｃ．ｃａｍ
．ａｃ．ｕｋ≫）を、プログラムＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒら，１９９８，Ａｃｔ
ａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４；９０５−９２１）での精密化において
用いられる立体化学的制限の定義に用いることができる。

【００３８】三次元構造情報及びこのＨＤＬＰの構造情報に伴う原子座標は、ＨＤＡＣファ
ミリーに属する結晶化したタンパク質の分子置換による構造の解明に有用である
。同様に、機能又はＨＤＬＰとの配列類似性もしくは同一性に基づいて構造が類
似すると考えられる結晶化タンパク質のあらゆる構造を、本発明のＨＤＬＰ構造
情報を用いる分子置換によって解明することができる。上述の通り、及び下記実
施例２と同様に分子置換によって決定されるＨＤＬＰ関連タンパク質の構造は、
完全長ＨＤＬＰの３７５残基にわたるその構造のアミノ酸の少なくとも５０％以
上について、Ｃα原子の位置で２．０Å以下の根平均二乗偏差（ｒｍｓｄ）を含
む。このようなｒｍｓｄはアミノ酸配列同一性に基づくものと期待することがで
きる。Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，１９８６，ＥｍｂｏＪ．５：８２３−８２
６。

【００３９】本発明の精密化三次元ＨＤＬＰ構造、特には、アポ−ＨＤＬＰ、活性部位に亜
鉛原子を含むＣｙｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７Ｓｅｒ二重突然変異体ＨＤＬＰ、活
性部位に亜鉛原子を含むＨＤＬＰ／ＴＳＡ複合体、及び活性部位に亜鉛原子を含
むＨＤＬＰ／ＳＡＨＡ複合体は、それぞれ図１６ないし１９に示される原子座標
によって表される。アミノ酸１−３７５を含むアポ−ＨＤＬＰの精密化モデルは
、モデル化されておらず、かつ無秩序であると推定される残基１、３７４及び３
７５を伴う野生型ＨＤＬＰ残基２ないし３７３からなり、１．８Åの分解能まで
決定された。同様に、活性部位に亜鉛原子を含むＣｙｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７
Ｓｅｒ二重突然変異体ＨＤＬＰの精密化モデルも、モデル化されておらず、かつ
無秩序であると推定される残基１、３７４及び３７５を伴う残基２ないし３７３
からなり、２．０Åの分解能まで決定された。活性部位に亜鉛原子を含むＨＤＬ
Ｐ／ＴＳＡ複合体の精密化モデルは、モデル化されておらず、かつ無秩序である
と推定される残基１、３７４及び３７５を伴うＣｙｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７Ｓ
ｅｒ二重突然変異体ＨＤＬＰ残基２ないし３７３からなり、結合ポケットにＴＳ
Ａを有し、かつ２．１Åの分解能まで決定された。ＨＤＬＰ／ＳＡＨＡ複合体は
ＨＤＬＰ／ＴＳＡ複合体に類似するが、結合ポケットにＳＡＨＡを有し、２．５
Åの分解能まで決定された。

【００４０】ＨＤＡＣを含むがこれに限定されるものではないＨＤＬＰ及びＨＤＬＰ関連タ
ンパク質の構造を、本発明のＨＤＬＰ結晶から得られたデータからさらに説明す
る目的で、以下の用語の定義を提示する。

【００４１】「βシート」という用語は、互いに平行して延び、かつ主鎖Ｃ＝Ｏ及びＮ−Ｈ
基の間で水素結合によって通常の方法で連結する２つ以上のポリペプチド鎖（す
なわちβストランド）を指す。したがって、ベータシート内の全ての水素結合は
ポリペプチドの異なるセグメント間に存在する。タンパク質内のほとんどのβシ
ートは全平行（タンパク質内部）であるか、又は全逆平行（一端が溶媒に面し、
他方が疎水性コアに面する）である。逆平行シート内の水素結合は鎖の方向に対
して垂直であり、鎖間の対として均等に間隔をとる。平行シート内の水素結合は
鎖の方向に対して傾斜し、鎖間で均等に間隔をとる。

【００４２】「αへリックス」という用語は、球状タンパク質において見いだされる最も異
常なへリックス配座を指す。αへリックスの平均長は１０残基である。αへリッ
クスにおいては、全てのアミドプロトンがＮ末端を指し、全てのカルボニル酸素
がＣ末端を指す。ｐｈｉ、ｐｓｉ対の反復性がこの配向を確実なものとする。α
へリックス内の水素結合も、残基Ｘ（ここで、Ｘはあらゆるアミノ酸を指す）の
骨格Ｃ＝Ｏが残基Ｘ＋４の骨格ＨＮに水素結合する反復パターンを示す。αへリ
ックスは、ターン当たり３．６残基及びアミノ酸当たりその軸に沿って１．５Å
移動することを特徴とするコイル構造である。したがって、そのピッチは３．６
×１．５、すなわち、５．４Åである。αへリックスのスクリューセンス（ｓｃ
ｒｅｗｓｅｎｓｅ）は常に右回りである。

【００４３】「ループ」という用語は、アミノ酸の他のあらゆる配座（すなわち、へリック
ス、ストランド又はシートではない）を指す。加えて、ループは、反復性の通常
の様式ではないが、アミノ酸側鎖間に結合相互作用を含み得る。

【００４４】ペプチド内のアミノ酸残基は、以後、以下のように略す：フェニルアラニンは
Ｐｈｅ又はＦ；ロイシンはＬｅｕ又はＬ；イソロイシンはＩｌｅ又はＩ；メチオ
ニンはＭｅｔ又はＭ；バリンはＶａｌ又はＶ；セリンはＳｅｒ又はＳ；プロリン
はＰｒｏ又はＰ；トレオニンはＴｈｒ又はＴ；アラニンはＡｌａ又はＡ；チロシ
ンはＴｙｒ又はＹ；ヒスチジンはＨｉｓ又はＨ；グルタミンはＧｌｎ又はＱ；ア
スパラギンはＡｓｎ又はＮ；リジンはＬｙｓ又はＫ；アスパラギン酸はＡｓｐ又
はＤ；グルタミン酸はＧｌｕ又はＥ；システインはＣｙｓ又はＣ；トリプトファ
ンはＴｒｐ又はＷ；アルギニンはＡｒｇ又はＲ；及びグリシンはＧｌｙ又はＧ。
アミノ酸のさらなる説明については、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｂｙＣｒｅｉｇｈｔｏ
ｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，ＮｅｗＹｏｒｋ１９８３
を参照されたい。

【００４５】「正に荷電したアミノ酸」という用語は、通常の生理学的条件下で正に荷電し
た側鎖を有するあらゆるアミノ酸を指す。正に荷電したアミノ酸の例は、Ａｒｇ
、Ｌｙｓ及びＨｉｓである。「負に荷電したアミノ酸」という用語は、通常の生
理学的条件下で負に荷電した側鎖を有するあらゆるアミノ酸を指す。負に荷電し
たアミノ酸の例は、Ａｓｐ及びＧｌｕである。「疎水性アミノ酸」という用語は
、比較的水に不溶性である非荷電、非極性側鎖を有するあらゆるアミノ酸を指す
。疎水性アミノ酸の例は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、
Ｐｈｅ、Ｔｒｐ及びＭｅｔである。「親水性アミノ酸」という用語は、比較的水
溶性である非荷電、極性側鎖を有するあらゆるアミノ酸を指す。親水性アミノ酸
の例は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、及びＣｙｓである。「芳香
族アミノ酸」という用語は、環構造を含むあらゆるアミノ酸を指す。芳香族アミ
ノ酸の例は、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ及びＴｙｒである。

【００４６】「電荷リレー系（charge relay system ）」という用語は、Ｆｅｒｓｈｔ＆Ｓ
ｐｅｒｌｉｎｇ，１９７３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７４：１３７−１４９；Ｂ
ｌｏｗら，１９６９，Ｎａｔｕｒｅ２２１：３３７−３４０に記載されるＨｉ
ｓ−Ａｓｐ配置を指す。

【００４７】本発明の三次元構造から得られる情報は、ＨＤＬＰがオープンα／βクラスの
折り畳みに属する単一ドメイン構造を有することを明らかにする（例えば、Ｂｒ
ａｎｄｅｎ，１９８０，Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１３：３１７−３８を参
照）。ＨＤＬＰの三次元構造全体の直交系図が図４Ａ及び４Ｂに示されている。
このＨＤＬＰ構造は、中央８鎖平行βシート（β２−β１−β３−β８−β７−
β４−β５−β６と配置された鎖）、及び１６のαへリックス（それぞれ、α１
ないしα１６と表示されている）を有する。図４Ｃを参照。へリックスのうちの
４つはβシートのいずれの面上にもパッキング（pack）され（α７、α８、α９
、α１０及びα１１、α１２、α１３、α１４）、このクラスの折り畳みのコア
α／β構造の特徴を形成する。残りの８つのへリックスのほとんどはβシートの
一方の側（one side）近傍、鎖β２−β１−β３−β８近傍に位置する。巨大な
充分に規定されたループ（ループＬ１−Ｌ７；図４Ｃ）はβ鎖のＣ末端から始ま
る。余分のへリックス及び巨大Ｌ１−Ｌ７ループは、コアα／βモチーフを越え
てその構造の顕著な伸展部と会合する。この構造の伸展部は２つの顕著な構造的
特徴を生じる：深く狭いポケット及びそのポケットに隣接する内部キャビティ。
これらの２つの構造的な特徴は活性部位を含む（図５Ａ参照）。ＨＤＬＰ−関連
タンパク質（例えば、ＨＤＡＣ）の構造は保存されたα／β構造特徴も含むこと
ができる。

【００４８】用語「活性部位」はＨＤＬＰ中の以下の部位のいずれかまたは全てを含む：基
質結合部位、基質からのアセチル基の切断が起こる部位またはＨＤＡＣファミリ
ー、または、より詳細には、ＨＤＬＰの阻害剤が結合する部位。本明細書中でい
う活性部位はＡｓｐ１６６、Ａｓｐ２５８、Ｈｉｓ１７０、Ｔｙｒ２９７、Ｈｉ
ｓ１３１、Ｈｉｓ１３２、Ａｓｐ１６８、Ａｓｐ１７３、Ｐｈｅ１４１、Ｐｈｅ
１９８、Ｌｅｕ２６５、Ｐｒｏ２２およびＧｌｙ１４０、ならびにｒｍｓｄが２
．０Åである図１６ないし１９にリストされた座標によって規定されるＡｓｐ１
７３、Ａｓｐ１６８およびＨｉｓによるポケットの底部に結合した金属を含む。
該ポケットの底部に結合する金属は、亜鉛、コバルトまたはマンガンよりなる群
から選択される二価カチオンであろう。

【００４９】深く狭いポケットは１１Åまでの深さを有するチューブ様形状である。該ポケ
ットの開口は４．５×５．５Åまでに半分縮まり、底部においてより広くなる（
図５Ａ参照）。該ポケットおよびその直近の周囲はループＬ１ないしＬ７よりな
る。

【００５０】該ポケットの壁は疎水性および芳香族残基（入口近くのＰｒｏ２２、Ｔｙｒ９
１；およびさらに下ったＧｌｙ１４０、Ｐｈｅ１４１、Ｐｈｅ１９８、Ｌｅｕ２
６５およびＴｙｒ２９７；図５Ｂ）の側鎖で被覆される。アミノ酸のナンバリン
グについては、配列番号：１を参照されたし。特に興味深いのはＰｈｅ１４１お
よびＰｈｅ１９８であり、そのフェニル基は７．５Åの距離にて平行に相互に向
かい合い、該ポケットの最も細い部分を形成する（図５Ｂ参照）。特に興味深い
のは、配列を整列させると（アラインメントはＤＮＡｓｔａｒ（商標）TM Ｍｅ
ｇＡｌｉｇｎ（商標）TMプログラム、マディソン、ワイオミング州を用いて達成
することができる）、１つのポケット残基のみがＨＤＡＣ１で異なり、この残基
がＨＤＬＰにおけるＴｙｒ９１であるＨＤＡＣ１のＧｌｕ９８であることである
。該構造により、ＨＤＬＰ中のこの残基が大部分は溶媒に曝露されることが示さ
れる。

【００５１】その最も狭い点における活性部位のポケットの底部近くには、亜鉛イオンが位
置する（図６Ａ参照）。該構造において亜鉛を得るために、結晶を亜鉛（例えば
、ＺｎＣｌ₂）中に浸漬させるか、亜鉛の存在下で共結晶化させてもよい。亜鉛
イオンにはＡｓｐ１６８（Ｏδ１、２．１Å）、Ｈｉｓ１７０（Ｎδ１、２．１
Å）、Ａｓｐ２５８（Ｏδ１、１．９Å）および水分子（２．５Å）が配位する
。図５Ｂおよび６Ｂ参照。亜鉛に配位するアミノ酸残基は四面体幾何学的配列に
配列するが、Ｈｉｓ１３１にまた水素結合する水分子の位置はこの幾何学的配列
から−２５゜だけそれる。

【００５２】亜鉛リガンドに加え、該ポケットの底部は２つのヒスチジン（Ｈｉｓ１３１お
よびＨｉｓ１３２）、２つのアスパラギン酸（Ａｓｐ１６６およびＡｓｐ１７３
）およびチロシン（Ｔｙｒ２９７）を含む。図５Ｂおよび１０Ｂ参照。ヒスチジ
ンの各々はそのＮδ１を介してアスパラギン酸のカルボキシレート酸素に対して
水素結合を形成し、該酸素はイミジゾール（imidizole ）環の面に位置する（図
５Ｂ）。このＨｉｓ−Ａｓｐ配置はセリンプロテアーゼの活性部位に存在する電
荷リレー系の特徴であり、イミジゾールＮεを分極させ、その塩基性を増加させ
るように働く。Ｆｅｒｓｈｔ＆Ｓｐｅｒｌｉｎｇ、１９７３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．７４：１３７−１４９；Ｂｌｏｗら，１９６９，Ｎａｔｕｒｅ２２１：
３３７−３４０。

【００５３】Ａｓｐ１６６−Ｈｉｓ１３１電荷ペアリレー（以後、「埋没型電荷リレー」と
いう）は、部分的に溶媒に曝露されているＡｓｐ１７３−Ｈｉｓ１３２電荷リレ
ー（以後、「露出型電荷リレー」という）と比較して、ポケットにより深く、か
つより埋め込まれて位置する。該埋没型電荷リレーは上述した亜鉛−結合水分子
に対して水素結合（２．６Å）を形成し、この水素結合は理想的な幾何学的配列
からの水−亜鉛配位の偏差に寄与しうるであろう（図５Ｂ）。露出型電荷リレー
は、水分子から２．５Åまで離れた、表面に近い点に向けられる。

【００５４】Ｔｙｒ２９７は、亜鉛の隣に、２つの電荷リレー系が位置するところと向かい
合って位置する。Ｔｙｒヒドロキシル基は亜鉛原子から４．４Å離れて存在し、
タンパク質の残りとの相互作用は有しない（図５Ｂ）。Ｔｙｒ２９７の隣には、
ポケット壁中に開口があり、これは隣接する内部キャビティに至る。

【００５５】内部キャビティのフロアーは、それらがβストランドから出現するにつれ、Ｌ
３およびＬ７ループの一部を形成し、ルーフ（roof）はα１−Ｌ１−α２セグメ
ントよりなる。Ｌ１ループは構造中の他のループよりも柔軟に見える。これは、
キャビティの内容物とバルク溶媒との一時的な交換を可能とし得る。

【００５６】該キャビティは主として疎水性残基で裏打ちされ、特にグリシン残基が豊富で
ある（Ｌ３のＡｌａ１２７、Ｇｌｙ１２８、Ｇｌｙ１２９、Ｍｅｔ１３０および
Ｐｈｅ１４１；Ｌ７のＧｌｙ２９３、Ｇｌｙ２９４、Ｇｌｙ２９５およびＧｌｙ
２９６；およびＬ１のＴｙｒ１７、Ｐｒｏ２２およびＬｅｕ２３）。キャビティ
には２つの荷電残基（Ａｒｇ２７およびＨｉｓ２１）のみがあり、これらはＬ１
ループによって寄与される。

【００５７】キャビティは、基質が結合すると、溶媒からの脱アセチル化の間に、さもなく
ば混雑し、保護されるであろう触媒中心から離れるアセテート産物の拡散のため
のスペースを提供することができる。キャビティについてのそのような役割は、
キャビティが１．８Åアポ−タンパク質構造に（結晶化緩衝液からの）３つの水
分子および２つのイソプロパノール分子を含んでいるという観察によって支持さ
れる。キャビティは、ＨＤＬＰの酵素活性を促進するために、亜鉛に加えてもう
１つの補因子にも結合することができる。脱アセチル化について提案された触媒
メカニズムを図８に示す。

【００５８】ＨＤＡＣ１配列相同性と組み合わせて、本発明によって規定されるＨＤＬＰの
構造は、３７５−アミノ酸ＨＤＬＰタンパク質が、ＨＤＡＣファミリーにわたっ
て保存されたヒストンデアセチラーゼ触媒コアに対応することを示す（図２参照
）。３５．２％ＨＤＬＰ−ＨＤＡＣ１配列同一性は、１．５ÅまでのＣα位置に
おけるｒｍｓｄとの構造類似性を予測する。ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋは、
配列の発散（divergence）とタンパク質の構造との間の関係をＥｍｂｏＪ．５：８２３−８２６（１９８６）に記載する。この領域におけるα１６ヘリックス
は保存された開口α／βコア折り畳みの一部であって、ＨＤＡＣ１は同様のヘリ
ックスよりなるようであるが、この領域はＨＤＡＣ１に対してより低い相同性を
有するので、ＨＤＬＰの４０−残基Ｃ−末端は多様な構造を有する傾向にある。
しかし、多様なこのＣ−末端領域が存在することができ、この領域は活性部位の
外側にあり、活性部位の構造に影響しないようである。ヒストンデアセチラーゼ
触媒コアのＣ−末端を超えて、ＨＤＡＣファミリーのメンバーは長さおよび配列
が多様である。ＨＤＡＣファミリ−において、この領域（３９０−４８２までの
アミノ酸残基）は高度に極性であり、酸性残基があり、柔軟性であるかまたは緩
く折り畳まれている傾向にある。

【００５９】ＨＤＬＰ−ＨＤＡＣ相同性は、主に疎水性コアおよびＬ１−Ｌ７ループにマッ
プされ、最高レベルのアミノ酸残基配列保存を有するポケットおよび近接キャビ
ティを形成するループの一部を有している（図９Ａおよび９Ｂ）。具体的には、
活性部位における極性残基の全て（亜鉛リガンド、２つの電荷リレー系およびＴ
ｙｒ２９７）およびポケットの壁を形成する疎水性残基（Ｇｌｙ１４０、Ｐｈｅ
１４１、Ｐｈｅ１９８およびＬｅｕ２６５）は同一である。内部キャビティを形
成する残基の中で、活性部位に最も近いものは同一であるかまたは保存的に置換
されている（例えば、Ｌｅｕ２３→ＭｅｔおよびＭｅｔ１３０→Ｌｅｕ）。ポケ
ットの周りの表面残基はあまり保存されてないが、依然として３５％の平均配列
同一性を超える。

【００６０】本発明の阻害剤−結合ＨＤＬＰ複合体結晶構造から得られた情報により、ＨＤ
ＬＰ／ＨＤＡＣファミリーのメンバーを阻害することができる潜在的阻害剤化合
物のデザイン、単離、スクリーニングおよび測定で有用である詳細な情報が明ら
かにされる。前記したように、ＨＤＬＰ構造は、両方の面に対するαヘリックス
パッキングを持つ平行βシートよりなる（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ）。βシート
の１つの端部において、７つのループ（Ｌ１−Ｌ７）は、疎水性残基によって裏
打ちされ、２つのＡｓｐ−Ｈｉｓ電荷リレー系を含んだ亜鉛結合部位、いくつか
の極性側鎖からなる狭いチューブ様ポケットを形成する。ポケット底部における
亜鉛リガンドおよび他の極性残基の突然変異は触媒活性を低下させるか、あるい
は失わせる。

【００６１】本発明者らは、Ｔｙｒ２９７Ｐｈｅ部位における突然変異が活性を低下させる
ことを見い出した。Ｈａｓｓｉｇら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：３５１９−３５２４；Ｋａｄｏｓｈ＆Ｓｔｒｕｈｌ，
１９９８，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１２：７９７−８０５も参照。これらの残基の
突然変異による活性の排除は、この領域が酵素活性部位であることを示している
。活性部位に隣接して、アセテート反応産物の拡散のためのスペースを提供する
ことができる内部キャビティがある。上述したＨＤＬＰおよびＨＤＡＣ１の間の
活性部位における相同性は、それらが構造的および機能的相同性を共有すること
を示す。

【００６２】阻害剤化合物であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）（Ｔｓｕｊｉら，１９７６，
Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ２９：１−６）は、一端にヒドロキサム酸基を有
する長い脂肪族鎖をポケットに挿入することによってＨＤＬＰに結合する（図６
Ａ、６Ｂおよび６Ｃ）。脂肪族鎖はポケットのウェル状疎水性部分において多数
の接触をなす。ヒドロキサム酸はポケットの極性底部に到達し、そこで、二座（
bidentate ）方式で亜鉛に配位し、また、２つの電荷リレー系ヒスチジンを含ん
だ活性部位中の極性残基と水素結合を形成する。ＴＳＡ鎖の他端における芳香族
ジメチルアミノ−フェニル基はポケット入口で接触し、それに蓋をするように働
く。ＴＳＡに接触するＨＤＬＰのアミノ酸残基はＨＤＡＣにおいて保存されてお
り、これは、ＴＳＡがＨＤＬＰに対するのと同様にＨＤＡＣに結合し、それを阻
害することを示す。

【００６３】該複合体において、ヒドロキサム酸、脂肪族鎖の大部分およびＴＳＡのジメチ
ルアミノ−フェニル基の部分は埋め込まれている（ＴＳＡの表面積の６０％；図
６Ａ）。ヒドロキサム酸基は二座方式で亜鉛に結合し、カルボニル基（２．４Å
）およびヒドロキシル基（２．２Å）を介して結合を形成し、その結果、五−配
位Ｚｎ²⁺が得られる（図６Ｂおよび図６Ｃ）。ヒドロキサム酸のヒドロキシル基
は、前記したアポ−ＨＤＬＰ構造中の亜鉛に結合する水分子を置き換える。また
、ヒドロキサム酸は両方の電荷リレー系ヒスチジン（Ｈｉｓ１３１Ｎε２に対
するヒドロキシル酸素、２．８Å；およびＨｉｓ１３２、Ｎε２に対する窒素、
２．８Å）、およびＴｙｒ２９７ヒドロキシル基（２．４Å；図６Ｂおよび６Ｃ
）とで水素結合する。

【００６４】ＴＳＡの５−炭素長分岐アルケン鎖は、ポケットの狭い部分でぴったりと適合
し、ポケットを裏打ちする疎水性基の全てとの多数のファン・デル・ワールス接
触をなす（図６Ｂおよび６Ｃ）。その中心近くで、該鎖は、ポケットの最も密な
点においてＰｈｅ１４１およびＰｈｅ９８のフェニル基の間にはさまれたメチル
置換炭素−炭素二重結合を含む（図６Ａおよび６Ｂ）。アルケン鎖の長さは、ポ
ケットの長さにわたり、ポケットの底部および入口双方で接触をなすのに最適な
ように見えるが、式（Ｉ）のキャップ基はポケットにわたるための長さを提供し
て、より短いアルケン鎖（脂肪族鎖）を可能とする。

【００６５】ポケットの入口において、ジメチルアミノ−フェニルおよびＴＳＡの隣接カル
ボニル基によって形成された平面構造の１つの面はポケットのリムにおいて接触
する（Ｐｒｏ２２、Ｔｙｒ９１、Ｐｈｅ１４１；図６Ｂおよび６Ｃ）。このパッ
キングは、（ｓｐ³混成Ｃ８炭素において起こる）脂肪族鎖およびジメチルアミ
ノ−フェニル基の接合におけるＴＳＡの全体構造中のほぼ１１０゜角度によって
促進される。ＴＳＡ結合に際して、最も溶媒に暴露されるＴｙｒ９１の側鎖は立
体配座を変化させて、ジメチルアミノ−フェニル基のためのスペースを形成する
。これは、ＴＳＡ結合に際して観察される活性部位近くの変化に過ぎない。

【００６６】ヒドロキサム酸基は亜鉛メタロプロテアーゼ阻害剤において共通のモチーフで
ある。米国特許第５，９１９，９４０号および第５，９１７，０９０号参照；ま
た、Ｇｒａｍｓら、１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４；１４０１２−
１４０２０；Ｌｏｖｅｊｏｙら，１９９９，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：２１７−２２１；およびＨｏｌｍｅｓ＆Ｍａｔｔｈｅｗｓ，１９８１，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０：６９１２−６９２０参照。ＴＳＡと同様に、これ
らの阻害剤も、それらのヒドロキサメートヒドロキシルおよびカルボニル酸素を
用いて二座方式で活性部位亜鉛に配位し、求核水分子をそれらのヒドロキサメー
トヒドロキシル基で置き換え、一般的な塩基に対する水素結合を形成する（Ｇｒ
ａｍｓら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４：１４０１２−１４０２
０；Ｌｏｖｅｊｏｙら，１９９９，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：２１
７−２２１：およびＨｏｌｍｅｓ＆Ｍａｔｔｈｅｗｓ，１９８１，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ２０：６９１２−６９２０）。

【００６７】ＴＳＡよりも３０倍までの弱い阻害活性を有するＳＡＨＡ（Ｒｉｃｈｏｎら、
１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：３００３−
３００７）は、ＴＳＡに対するのと同様にＨＤＬＰに結合する（例えば、図４Ｄ
参照）。ＳＡＨＡヒドロキサム酸基は亜鉛および活性部位残基に対して同一の接
触をなし、これらの相互作用の重要性はヒドロキサム基を欠くＳＡＨＡ誘導体の
活性の喪失によって強調される（Ｒｉｃｈｏｎら，１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：３００３−３００７）。ＳＡＨＡの６−
炭素長脂肪族鎖はポケットのチューブ様疎水性部分にパッキングされる。しかし
ながら、ＴＳＡと比較して、ＳＡＨＡの脂肪族鎖はより緩くパッキングされ、フ
ァン・デル・ワールス接触をあまり形成しない。これは、いくらかは、ＳＡＨＡ
がＴＳＡのＣ１５メチル基分岐を欠くからである。また、ＳＡＨＡはこの領域に
おいてＴＳＡの二重結合を欠き、これは脂肪族鎖の柔軟性の増加をもたらす。Ｓ
ＡＨＡのキャップ基はフェニル−アミノケトン基よりなる。結晶構造において、
フェニル基は弱い電子密度を有し、ＴＳＡのキャップ基と同様にパッキングされ
ないことを示す。これは、ＴＳＡと比較してＳＡＨＡのヒドロキサム基およびキ
ャップ基の間のより大きな分離によるものであろう（以下のＴＳＡ、式（ＩＩ）
およびＳＡＨＡ、式（ＩＩＩ）を比較されたし）。

【００６８】ＨＤＬＰおよび阻害性化合物に結合したＨＤＬＰの構造の決定は、初めて、Ｈ
ＤＬＰおよび関連ＨＤＬＰタンパク質、たとえば、ＨＤＡＣファミリーに属する
タンパク質の活性部位の同定を可能とした。

【００６９】三次元構造情報および阻害性化合物に結合したＨＤＬＰの該構造情報に関連し
た原子座標は、ＨＤＬＰ、ＨＤＡＣファミリータンパク質およびＨＤＬＰに関連
する他のヒストンデアセチラーゼ様タンパク質に結合し、その酵素活性を阻害す
る阻害性化合物を同定する方法を提供する合理的な薬物デザインにおいて有用で
ある。デアセチラーゼ活性を含む酵素のための該潜在的阻害剤を同定する該方法
は、（ａ）図１６ないし１９にあげたその原子座標によって規定されるＨＤＬＰ
の三次元構造を用い；（ｂ）該三次元構造を使用して、該潜在的阻害剤をデザイ
ンまたは選択し；（ｃ）該潜在的阻害剤を合成し；（ｄ）アセチル化基質の存在
下で該潜在的阻害剤を該酵素と接触させ；次いで、（ｅ）該デアセチラーゼ活性
を阻害する該阻害剤の能力を測定する工程を含む。

【００７０】本発明の方法によって同定された潜在的ＨＤＬＰおよびＨＤＬＰ関連（例えば
、ＨＤＡＣ）阻害剤は式（Ｉ）：（式中、Ｘはプロリンおよびロイシンよりなる群から選択される少なくとも１つ
のアミノ酸に結合するキャップ基を含み；Ｙはロイシン、フェニルアラニンおよ
びグリシンよりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸に結合する脂肪
族鎖基を含み；およびＺはアスパラギン酸、チロシンおよびヒスチジンよりなる
群から選択される少なくとも１つのアミノ酸に結合する活性部位結合基を含み、
ここに、Ｚはさらに亜鉛原子に結合することができ、但し、式（Ｉ）の化合物は
米国特許第５，６０８，１０８号；第５，７００，８１１号；第５，７７３，４
７４号；第５，８４０，９６０号および第５，６６８，１７９号に記載されたＴ
ＳＡ、トラポキシン、ＳＡＨＡ、ＳＡＨＡ誘導体ではない）によって表される。

【００７１】本発明は、ＨＤＬＰおよびＨＤＬＰ関連タンパク質の活性部位に結合すること
ができる、阻害性化合物を含めた、化学的存在および化合物をデザインし、同定
し、合成するための分子デザイン技術の使用を可能とする。アポ−ＨＤＬＰおよ
び阻害剤結合ＨＤＬＰの原子座標は、ＨＤＬＰおよびＨＤＬＰ関連タンパク質（
例えば、ＨＤＡＣ１）の潜在的阻害剤を同定するためにＧＲＡＭ、ＤＯＣＫ、Ｈ
ＯＯＫまたはＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｄｕｎｂｒａｃｋら，１９９７，Ｆｏｌｄｉｎ
ｇ＆Ｄｅｓｉｇｎ２：２７−４２）のようなドッキングプログラムを用いるコ
ンピューターモデリングと組み合わせて用いることができる。この手法は、潜在
的阻害剤の形状および化学構造がどれくらい活性部位を補うかを確認し、または
潜在的阻害剤を活性部位におけるＴＳＡまたはＳＡＨＡの結合と比較するための
、潜在的阻害剤のＨＤＬＰの活性部位へのコンピューターフィッティングを含む
ことができる。Ｂｕｇｇら，１９９８、ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａ
ｎＤｅｃｅｍｂｅｒ：９２−９８；Ｗｅｓｔら，１９９５，ＴＩＰＳ１６：
６７−７４参照。ドッキングプログラムでのモデリングによってデザインされた
潜在的阻害剤は、上述した一般式（Ｉ）と適合する。また、コンピュータープロ
グラムを用いて、ＨＤＬＰおよび潜在的阻害剤化合物の引力、反発および立体的
障害を見積もることもできる。一般に、フィットが密になれば、立体的障害はよ
り低く、引力はより大きく、タンパク質の他のクラスよりはむしろＨＤＬＰおよ
びＨＤＬＰ関連タンパク質とより相互作用するであろう特異的阻害性化合物につ
いての重要な特徴である特異性はより大きくなる。これらの特徴は、阻害性化合
物が潜在的抗腫瘍薬物である場合に特に望まれる。

【００７２】本発明の化合物は、三次元構造を視覚により視覚的に洞察して、より効果的な
デアセチラーゼ阻害剤を決定することによってデザインすることもできる。この
タイプのモデリングを「マニュアル」薬物デザインということができる。マニュ
アル薬物デザインは、「Ｏ」のようなグラフィックスビジュアル化プログラムを
用いる視覚での洞察および分析を使用することができる（Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．
，Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ｙ．，Ｃｏｗａｎ，Ｓ．Ｗ．，およびＫｊｅｌｄｇａａｒｄ，
Ｍ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｂｕｉｌｄｉｎｇｐｒｏｔ
ｅｉｎｍｏｄｅｌｓｉｎｅｌｅｃｔｒｏｎｄｅｎｓｉｔｙｍａｐｓお
よびｔｈｅｌｏｃａｔｉｏｎｏｆｅｒｒｏｒｓｉｎｔｈｅｓｅｍｏ
ｄｅｌｓ，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇ．，Ａ４７，１１０−１１９）。

【００７３】最初に、潜在的阻害剤化合物を、マニュアル薬物デザインによって、式（Ｉ）
のＸ、ＹおよびＺ構成要素に対するそれらの構造類似性につき選択することがで
きる。このようにデザインされた構造アナログを、次いで、最も効果的であるら
しい候補を良好に規定するコンピューターモデリングプログラムによって修飾す
ることができる。既知の阻害分子に対していくらか類似性を有し得る数えること
ができないほど多くの数の変形化合物を合成し、それをスクリーニングするのは
不可能なので、潜在的候補の数の減少は有用である。そのような分析は、ＨＩＶ
プロテアーゼ阻害剤の開発において効果的であることが示されている。（Ｌａｍ
ら，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３：３８０−３８４；Ｗｌｏｄａｗｅｒら
，１９９３Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：５４３−５８５；Ａｐｐ
ｅｌｔ，１９９３，ＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｉｎＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ
ｅｒｙａｎｄＤｅｓｉｇｎ１：２３−４８；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，１９９３
，ＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｉｎＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙａｎｄ
Ｄｅｓｉｇｎ１：１０９−１２８）。あるいは、小さな分子ライブラリーのラ
ンダムスクリーニングは、阻害剤としてのそれらの有効性をよりよく決定するた
めに、上述のコンピューターモデリングによってその阻害活性を分析することが
できる潜在的阻害剤をもたらす。

【００７４】本発明の情報を用いてデザインした化合物は競合的または非競合的阻害剤であ
ってよい。これらのデザインされた阻害剤はＨＤＬＰの活性部位の全てまたは一
部に結合することができ、ＨＤＬＰおよびＨＤＬＰ関連タンパク質、特にＨＤＡ
Ｃに対する既知の阻害剤よりも優れており、特異的であり、毒性が低く、かつ効
果的でありうる。また、デザインされた阻害剤は効力が低いが、イン・ビボおよ
び／またはイン・ビトロでより長い半減期を有することができ、従って、延長さ
れた時間の間、イン・ビボおよび／またはイン・ビトロでヒストンデアセチラー
ゼ活性を阻害するのにより効果的であり得る。該デザインされた阻害剤は、ＨＤ
ＬＰおよびＨＤＬＰ関連タンパク質（例えば、ＨＤＡＣ１）のヒストンデアセチ
ラーゼ活性を阻害し、イン・ビトロおよびイン・ビボで細胞増殖を阻害するのに
有用であり、抗腫瘍剤として特に有用であり得る。

【００７５】また、本発明は、本発明の構造によって規定されるＴＳＡおよびＳＡＨＡと同
様の様式で、ＨＤＬＰに対して結合することができる化学的存在または化合物に
つき、小さな分子のデーターベースをコンピューターでスクリーニングするため
の分子デザイン技術の使用を可能とする。そのようなコンピュータースクリーニ
ングは、前記式（Ｉ）の「Ｘ」、「Ｙ」または「Ｚ」として定義することができ
、式（Ｉ）を含む本発明の潜在的阻害剤を合成するのに使用することができる種
々の基を同定することができる。そのような潜在的阻害剤は、ヒストンデアセチ
ラーゼ活性アッセイにおいてヒストンデアセチラーゼ阻害活性についてアッセイ
することができ（後記実施例３参照）、ＨＤＬＰと共結晶化して、前記定義のＸ
−線結晶学技術を通じて結合特徴を決定することができ（例えば、該共結晶構造
は、該潜在的阻害剤の結合特徴を評価するための分子置換によって決定すること
ができる）、あるいは該潜在的阻害剤を該ＨＤＬＰと共にインキュベートし、ゲ
ル濾過を行ってＨＤＬＰ−結合阻害剤に対するいずれの遊離潜在的阻害剤も分離
し、阻害剤−結合ＨＤＬＰのヒストンデアセチラーゼ活性の量を測定することに
よって結合活性に基づいて評価することができる。結合定数（例えば、Ｋｄ）を
測定するために、ＢｉａｃｏｒｅTM分析、等温滴定比色法、競合結合を示すプレ
ート上の既知の薬物を用いるＥｌｉｓａ、あるいはデアセチラーゼ活性アッセイ
等の当該分野で知られた方法を使用することができる。

【００７６】本発明の潜在的阻害剤のデザインは、表面のグルーブを示す表面表示図である
図９を参照することによってさらに容易にされる。そのようなグルーブの分析は
、式（Ｉ）のキャップ基の構成要素に対する洞察を与える。表面グルーブは、そ
れにさらなるキャップ基を結合させることができる標識されたグルーブＡ、グル
ーブＡ’、グルーブＢおよびグルーブＣである。ＴＳＡまたはＳＡＨＡいずれか
に結合したＨＤＬＰの構造は、ＴＳＡおよびＳＡＨＡのキャップ基がグルーブＡ
に結合することを示す。ＨＤＬＰおよびＨＤＡＣのアミノ酸配列の同一性を分析
することによって、グルーブＡはＨＤＡＣにおいてよく保存されており、かなり
の疎水性成分を有し、かなりの相互作用を可能とするのに十分に深いようであり
、また、４つのグルーブのなかで最大である。ＴＳＡのジメチルアミノフェニル
基に加えて、Ａグルーブは約２００ダルトンに値する基にフィットすることがで
きる（例えば、グルーブＡは適当なスペーサの後にナフタレン様の基を収容でき
る）。本明細書中に言及したグルーブＡは、ＨＤＬＰの以下の保存された残基：
Ｈｉｓ２１、Ｐｒｏ２２、Ｌｙｓ２４、Ｐｈｅ１４１、Ｌｅｕ２６５およびＰｈ
ｅ３３５によって特徴付けられる。グルーブＡの周囲は保存されていない残基を
含む。加えて、本明細書中に言及したグルーブＡ’は主として保存されていない
残基を含む。

【００７７】グルーブＢはポケットに直近に隣接している。重要なことは、グルーブＢの底
部が、そのＮ−デルタ窒素を介して亜鉛に配位するＨｉｓ１７０のＮ−イプシロ
ン窒素を含むことである。Ｈｉｓ１７０のＮεプロトンをカルボン酸またはサル
フェート基と接触させることによって、かなりの結合エネルギーを達成すること
ができる。加えて、グルーブＢは、その面がＨｉｓ１７０のＮ−イプシロンプロ
トン上にパッキングできる部分的に負の電荷を含んでよいフェニル基にフィット
するのに十分な大きさでありうる。本明細書中に言及したグルーブＢの保存され
た残基はＨｉｓ１７０、Ｔｙｒ１９６およびＬｅｕ２６５である。

【００７８】グルーブＣは他の２つのグルーブほどはよく保存されておらず、グルーブＣを
含むアミノ酸残基は最も極性であって、溶媒に暴露されている。本明細書中に言
及したグルーブＣは以下の保存された残基を含む：Ａｓｎ８７、Ｇｌｙ１４０お
よびＰｈｅ１９８。

【００７９】本発明の化合物は式（Ｉ）：によって表される。

【００８０】Ｘがキャップ基を含む適当なＸ構成要素についての例は、グルーブＡ、Ａ’、
Ｂおよび／またはＣのいずれの表面にそれらが標的化されるかに応じて、３つの
カテゴリーで記載することができる。キャップ基は同一化合物において全ての３
つのカテゴリーを含むことができる。特別の利点は、ＴＳＡまたはＳＡＨＡのキ
ャップ基を大きな剛直な構造に置き換えることができることである。グルーブＡ
に結合することができる式（Ｉ）の適当なキャップ基（Ｘ）についての非限定的
な例は：（１）１−３メチルリンカーに続いて、式（ＩＶ）：によって表されるＳＡＨＡのフェニル基のパラまたはメタ位からフェニルまたは
ナフタレン基を結合させること、（２）２−３メチルリンカーに続いて、ＴＳＡのフェニルキャップ基のメタ位
から、または式（Ｖ）：によって表されるＴＳＡのジメチルアミノ基からフェニルまたはナフタレン基を
結合させることであり、グルーブＢに結合することができるのは１−３メチル基
スペーサーに続いての、式（ＶＩ）：によって表されるカルボキシレート、サルフェートまたはフェニル基である。

【００８１】脂肪族（Ｙ）基に関しては、ポケットの直径は、さらにもう１つのメチル「側
鎖」が、Ｃ１０炭素上のＣ１５メチル基に加えてフィットすることができること
を示唆する。Ｙが脂肪族鎖基を含むＹ構成要素についての非限定的で適当な例は
：（１）（Ｃ１０炭素上のメチル基と共にまたはそれなくして、および二重結合
と共にまたはそれなくして、および式（ＶＩＩ）：によって表される式（Ｉ）のＸおよび／またはＺ構成要素を置換してまたは置換
することなく）Ｃ１２炭素上でＴＳＡにメチル基を付加すること、（２）（Ｃ１０炭素上のメチル基と共にまたはそれなくして；二重結合の双方
またはいずれかと共にまたはそれなくして、および式（ＶＩＩＩ）：によって表される式（Ｉ）のＸおよび／またはＺ構成要素を置換してまたは置換
することなく）Ｃ９炭素上でＴＳＡにメチル基を付加すること、（３）Ｃ１１およびＣ１２トーション（torsion ）を解除して良好なフィット
を可能とすることができるＣ１０およびＣ１１の間の唯１つでＴＳＡの２つのア
ルカレン（alkalene）二重結合を置き換えること、ここに、Ｘおよび／またはＺ
基もまた式（ＩＸ）：によって表されるように置換することができ、（４）硫黄原子（または窒素原子）を介してＴＳＡのＣ１５およびＣ１２炭素
を環化させること、ここに、Ｘおよび／またはＺ基もまた式（Ｘ）：によって表されるように置換することができ、（５）当該延長がグルーブＢに近づきおよび／または侵入するようにＴＳＡの
Ｃ９炭素から延長させ（図９参照）；それがいくらかの自由度を有することがで
きるようにＣ９をｓｐ３とし；Ｃ９に、二重結合を含むことができる１−３メチ
ル基スペーサーを結合させ、それらはそれにサルフェート、カルボキシレート、
サルフェート、ヒドロキシル、またはフェニル基を結合させ、これは式（ＸＩ）
：によって表されるように亜鉛原子に配位することができるＨｉｓ１７０のＮ−イ
プシロンプロトンと相互作用をすることができ、（６）当該延長がグルーブＢに近づくかまたはそれに侵入するようにＴＳＡの
（Ｃ１４を置き換える）Ｃ８炭素を外に延長し；（二重結合を含むことができる
）１−３メチル基スペーサーを結合させ、次いで、亜鉛原子に配位するＨｉｓ１
７０のＮ−イプシロンプロトンと相互作用をなすようにそれに対してカルボキシ
レート、サルフェート、ヒドロキシルまたはフェニル基を連結させ；Ｘおよび／
またはＺ構成要素もまた式（ＸＩＩ）：によって表されるように置換することができ、（７）当該置換がそのような例においてグルーブＡ、Ａ’、Ｂおよびまたは
Ｃに接触することができるように脂肪族鎖の端部においてＣ８炭素を置換し、キ
ャップ基（Ｘ）は必要であるか、または要求されず、ＸおよびＺ構成要素が式（
ＸＩＩＩ）：によって表されるように同様に置換することができ、（８）脂肪族鎖が、さらに、活性部位結合基（Ｚ）およびＣ８炭素の間、およ
び好ましくはＣ８炭素の直前にメチル基を含み、ＸおよびＺの間の距離を増加さ
せる前記式ＶＩＩないしＸＩＩＩ、（９）（例えば、酸素を含んでも含まなくて
もよい６−員環を閉じることによって）脂肪族鎖およびキャップ基の間の結合を
より剛直にすることであり、ＸおよびＺ基もまた式（ＸＩＶ）：によって表されるように置換することができ、（１０）これは式（ＶＩＩ−ＸＩ
Ｖ）によって示される変化のうちの２以上を組み合せる。

【００８２】加えて、Ｚが活性部位結合基を含む適当なＺ基についての非限定的例は以下の
ものである：（１）ヒドロキサム酸、（２）カルボン酸、（３）スルホンアミド
、（４）アセトアミド、（５）エポキシケトン、（６）キャビティに導き、式（
ＸＶ）：によって表されるように保存されたアルギニン（Ａｒｇ２７）と相互作用させる
ためのメチルリンカーおよびアセテートエステルのヒドロキシル基を持つエステ
ル、および（７）式（ＸＶＩ）：によって表されるアルファケトン。

【００８３】加えて、本発明の三次元情報が与えられれば、他の適当なＸ、ＹおよびＺ構成
要素は当業者が考えることができる。

【００８４】潜在的で適当なＸ、ＹおよびＺ構成要素を決定した後、コンビナトリアル化学
技術を用い、構成要素を組み合わせて式（Ｉ）の化合物を形成させる。これは、
参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６０８，１０８号；第５，７
００，８１１号；第５，７７３，４７４号；第５，８４０，９６０号および第５
，６６８，１７９号に従って達成することができる。当業者に知られたいずれの
方法を用いて、前記した方法によって決定されたＸ、ＹおよびＺ構成要素を含む
式（Ｉ）の化合物を合成することもできる。

【００８５】上述したように、式（Ｉ）の化合物は、ＨＤＬＰおよびＨＤＡＣ−関連タンパ
ク質のヒストンデアセチラーゼ活性を阻害するのに有用である。そのような阻害
は、イン・ビトロおよびイン・ビボにて細胞増殖の減少または停止を可能とする
ことができる。

【００８６】イン・ビトロでの使用には、細胞増殖のそのような減少または停止は、細胞周
期の間のヒストン脱アセチル化および分化の役割を研究するのに、また、細胞周
期停止に関連する他のメカニズム、特に、Ｋａｄｏｓｈ＆Ｓｔｒｕｈｌ，１９９
８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：５１２１−５１２７によって記載され
ているもののような酵母モデル系で調べることができる細胞周期の進行に転写の
抑制がどのように関与しているかを研究するのに有用である。細胞周期の進行お
よび腫瘍増殖に対する潜在的阻害剤の効果を研究するのに使用することができる
イン・ビトロモデル系は、Ｒｉｃｈｏｎら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：３００３−３００７；Ｙｏｓｈｉｄａら．，１
９９５，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ１７：４２３−４３０；Ｋｉｍら，１９９９，Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ１８：２４６１−２４７０；Ｒｉｃｈｏｎら，１９９６，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：５７０５−５７０８；およ
びＹｏｓｈｉｄａら，１９８７，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４７：３６８８−３６
９１によって記載されているものを含む。

【００８７】イン・ビボでの使用は、細胞増殖のそのような減少または停止は、癌の非−ヒ
ト動物モデル系において該阻害剤化合物の効果を調べるのに有用であり、また、
癌の治療を必要とするレシピエントにおいてそのような治療で有用である。非−
ヒト動物モデル系として供することができる動物の非限定的例はマウス、ラット
、ウサギ、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタおよび非−ヒト霊長類を含む。
例えば、Ｄｅｓａｉら，１９９９，Ｐｒｏｃ．ＡＡＣＲ４０：ａｂｓｔｒａｃ
ｔ＃２３９６，Ｃｏｈｅｎら，１９９９，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，提示済参
照。本発明の化合物はトランスジェニック非−ヒト動物に投与することができ、
ここに、当該動物が癌を発症する傾向を有する動物モデルのように発症した癌を
該動物が有する（例えば、米国特許第５，７７７，１９３号，第５，８１１，６
３４号，第５，７０９，８４４号，第５，６９８，７６４号および第５，５５０
，３１６号に記載された動物モデル系）。そのような動物モデル系は、本発明の
化合物の毒性および腫瘍減少効果の測定を可能とすることができる。

【００８８】本発明の好ましい化合物は、ＨＤＬＰおよびＨＤＡＣ関連タンパク質に対する
高い特異的活性、経口投与した場合の良好な生物利用性、腫瘍細胞株における細
胞増殖の減少または停止における活性、および種々の癌の動物モデルにおける腫
瘍増殖の減少または停止における活性を有することができる。

【００８９】従って、本発明のもう１つの態様は、動物であってよく、好ましくはヒトであ
るレシピエントにおいて癌を根絶しまたは管理する方法である。該方法は、腫瘍
を減少させる量の前記式（Ｉ）によって定義される化合物、またはその生理学的
に許容される塩を該レシピエントに投与することを含む。

【００９０】本発明のさらなる態様において、式（Ｉ）の化合物および賦形剤または担体を
含む組成物が提供される。前記剤の投与は局所的または全身的であってよい。そ
のような担体はいずれの適当な生理学的溶液または分散剤等も含む。生理学的溶
液は生理食塩水または緩衝化生理食塩水のようにいずれの許容される溶液または
分散物媒体も含む。また、担体は抗細菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延
剤等を含むこともできる。あらゆる通常の媒体の範囲を除き、担体または剤は有
効成分に適合せず、組成物におけるその使用が考えられる。

【００９１】本発明の送達ビヒクル構築物を含有する組成物のための投与経路は、例えば、
経口、肺、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、（微細
な粉末処方または微細なミストを介する）吸入、経皮、鼻孔、膣、直腸、または
舌下の投与経路のようにいずれの慣用的かつ生理学的に許容される経路も含み、
各投与経路につき適切な投与形態に処方することができる。

【００９２】以下の実施例は本発明の態様をより明瞭に説明するために掲げ、本発明の範囲
を限定する意図のものではない。

【００９３】実施例実施例１：タンパク質の生産および精製ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用い、全長野生型ＨＤＬＰ（Ｇｅｎｂａｎ
ｋ受付番号ＡＥ０００７１９）を、（ＲｏｂｅｒｔＨｕｂｅｒｏｆＵｎｉ
ｖｅｒｓｉｔａｅｔｏｆＲｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，ドイツ国によって提供され
た）Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ染色体ＤＮＡ調製物からｐＧＥＸ４Ｔ３
（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰｈａｒｍａｃｉａＰｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）ベク
ターにサブクローニングした。ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発によってシステイ
ンないしセリンおよび活性部位突然変異体を構築し、配列決定した。ＨＤＬＰ−
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）で生産させ、グルタチオン−セファロース樹脂
（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のカ
ラムを用いるアフィニティークロマトグラフィによって、およびアニオン交換ク
ロマトグラフィー（Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^TM；Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって精製した。ＨＤＬＰは４℃に
てトロンビンで融合タンパク質から切断し、アニオン−交換（Ｑ−ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ^TM；Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ
Ｊ）およびゲル濾過クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ^TM２００；Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって精製し、
典型的には、２５ｍＭビス−トリスプロパン（ＢＴＰ）、５００ｍＭＮａＣｌ
、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２％イソプロパノール、ｐＨ７．０の
緩衝液中で２５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。

【００９４】いずれの金属補因子をＨＤＬＰがイン・ビボで含有するかは知られていないが
、リガンドの配列および亜鉛プロテアーゼに対する活性部位における類似性のた
め亜鉛であると推定される。精製されたＨＤＬＰにおける金属の欠如は、部分的
には、精製の間のＤＴＴの使用によるものと推定される。１０ｍｇ／ｍｌのＣｙ
ｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７Ｓｅｒ二重突然変異体を２５ｍＭビス−トリスプロパ
ン、２００ｍＭＮａＣｌ、１％イソプロパノール、ｐＨ７．０の緩衝液中の５
倍モル過剰のＺｎＣｌ₂と混合することによって、ＨＤＬＰをＺｎ²⁺で復元した
。Ｇ２５脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａ
ｗａｙ，ＮＪ）を通してＨＤＬＰを分画することによって、未結合ＺｎＣｌ₂を
除去した。Ｚｎ²⁺復元ＨＤＬＰ突然変異体を１ｍＭＴＳＡと共に４５分間イン
キュベートし、続いてゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ^TM２００
；Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を行
って過剰のＴＳＡを除去し、典型的には、２５ｍＭビス−トリスプロパン，５０
０ｍＭＮａＣｌ、１％イソプロパノール、ｐＨ７．０の緩衝液中で２５ｍｇ／
ｍｌまで濃縮することによって、ＨＤＬＰ−Ｚｎ²⁺−ＴＳＡ複合体を調製した。
無血清媒体（Ｓｆ９００，Ｇｉｂｃｏ，ＧｌａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）中の
懸濁状態で増殖させたＨｉ５昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａ
ｄ，ＣＡ）にてバキュロウイルス発現系を用い、ＦＬＡＧエピトープタグ化ヒト
ＨＤＡＣ１を過剰発現させた。抗ＦＬＡＧＭ２アフィニティー樹脂（Ｓｉｇｍ
ａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＦＬＡＧペプチド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）を用い、アニオン交換およびアフィニティークロマトグラフィ
ーによって融合タンパク質を精製した。

【００９５】実施例２：結晶化およびデータの収集ハンギング−ドロップ蒸気−拡散方法によって、アポ−ＨＤＬＰの結晶を、７
．５％イソプロパノール、２８％ＰＥＧ１５００、４２５ｍＭＮａＣｌ、１０
０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．０から室温にて成長させた。それらは、ａ＝５１
．４Å、ｂ＝９３．８Å、ｃ＝７８．７Å、β＝９６．９Åを持つ空間群Ｃ２に
て形成され、非対称単位中に１つのＨＤＬＰ分子を含む。−１７０℃で７．５％
イソプロパノール、３５％ＰＥＧ１５００、７５ｍＭＮａＣｌ、１００ｍ
Ｍトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０の緩衝液中で瞬間凍結させた結晶で回折データを収
集した。

【００９６】２３％ｔｅｒｔ−ブタノール、２７％ＰＥＧ１５００、４００ｍＭＫＣｌ、
１００ｍＭビス−トリスプロパン−Ｃｌ、ｐＨ６．８から成長させたＨＤＬＰ
Ｃｙｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７Ｓｅｒ二重突然変異体結晶から、ＨＤＬＰ−Ｚｎ ²⁺ 複合体の構造を決定した。空間群および格子寸法はアポ結晶と同一であった。
ＨＤＬＰ−Ｚｎ²⁺結晶を採取し、−１７０℃で２７％ｔｅｒｔ−ブタノール、２
２％ＰＥＧ１５００、５０ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＮａＣｌ、０．２ｍＭ
ＺｎＣｌ₂、１００ｍＭビスートリスプロパン、ｐＨ６．８中で凍結させた。

【００９７】ＨＤＬＰ−Ｚｎ²⁺−ＴＳＡ複合体の結晶はＨＤＬＰＣｙｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙ
ｓ７７Ｓｅｒ二重突然変異体を含み、マイクロ接種によって、２３％ｔｅｒｔ−
ブタノール、２７％ＰＥＧ１５００、６００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭビス−
トリスプロパン−Ｃｌ、ｐＨ６．８から成長させた。結晶を亜鉛の存在下で成長
させた。ａ＝５３．４Å、ｂ＝９４．４Å、ｃ＝１５６．３Åを持つ空間群Ｐ２ ₁ ２₁２₁にてそれらは形成され、非対称単位中に２つのＨＤＬＰ−Ｚｎ²⁺−Ｔ
ＳＡ複合体を含有する。ＨＤＬＰ−Ｚｎ²⁺−ＴＳＡ結晶を採取し、０．５ｍＭ
ＴＳＡを添加した以外はＨＤＬＰ−Ｚｎ²⁺結晶と同一の低温緩衝液中で凍結させ
た。ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ＆Ｍｉｎｏｒ
，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｓｅｍｂｌｅ．２７６：３０７−３２６）でデ
ータを処理した。ＭＩＲ解析、モデル構築および精密化。

【００９８】該ＨＤＬＰ−Ｚｎ²⁺−ＳＡＨＡ複合体結晶を成長させ、ＨＤＬＰ−Ｚｎ²⁺−Ｔ
ＳＡ結晶と同様に評価した。しかしながら、ＳＡＨＡ構造についての拘束はＴＳ
Ａからの立体化学パラメータに基づいて設けた。アポ−ＨＤＬＰ結晶と同様に、
ＳＡＨＡ／ＨＤＬＰ共結晶を空間群Ｃ２で成長させた。

【００９９】７．５％イソプロパノール、３０％ＰＥＧ１５００、７５ｍＭＮａＣｌ、
１００ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０の緩衝液中、重原子浸漬をアポ−ＨＤＬＰ
結晶で行い、１．０ｍＭチメロサールを２時間、５ｍＭＫＡｕ（ＣＮ）₂を１
時間、および１ｍＭＰｂ（Ｍｅ）₃ＯＡｃを２時間補足した。チメロサール誘
導体からの異常回折シグナルを用い、２．５Åにて、ＭＩＲ相をプログラムＭＬ
ＰＨＡＲＥ（ＴｈｅＣＣＰ４ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓｆｏｒｃｏ
ｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，１９９４，Ａｃｔ
ａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０：７６０−７６３）で計算し、それは０
．５５の平均フィギュアオブメリットを有した。プログラムＤＭ（Ｔｈｅ
ＣＣＰ４ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓｆｏｒｃｏｍｕｐｕｔａｔｉｏｎ
ａｌｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，１９９４，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌ
ｌｏｇｒ．Ｄ５０：７６０−７６３）で溶媒平滑化することによって相を改良
し、それを用いてプログラムＯ（Ｊｏｎｅｓら，１９９１，ＡｃｔａＣｒｙｓ
ｔａｌｌｏｇｒ．Ａ４７：１１０−１０９）で初期モデルを構築した。プログ
ラムＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒら，１９９８，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ
．Ｄ５４：９０５−９２１）を用いる連続ラウンドの再構築およびシミュレー
トされたアニーリング精密化は、残基２ないし３７３のＨＤＬＰの解釈を可能と
した。残基１、３７４および３７５はモデル化されず、規則的でないと推定され
た。

【０１００】サーチモデルとしてアポ−ＨＤＬＰ構造を用い、プログラムＡＭＯＲＥ（Ｔｈ
ｅＣＣＰ４ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓｆｏｒｃｏｍｐｕｔａｔｉｏ
ｎａｌｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，１９９４，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａ
ｌｌｏｇｒ．Ｄ５０：７６０−７６３）での分子置換によって、ＨＤＬＰ−Ｚ
ｎ²⁺−ＴＳＡおよびＨＤＬＰ−Ｚｎ²⁺−ＳＡＨＡ複合体の構造を決定した。初期
電子密度マップは全ＴＳＡ分子につき強力で連続的な差密度を有した。しかしな
がら、ＳＡＨＡ分子はキャップ基領域で同様に秩序立ってはいなかった。ＴＳＡ
の構造はＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＤａｔａｂａｓｅ（Ｒ
ｅｆｃｏｄｅＴＲＣＨＳＴ）から得られ、これを用いて、プログラムＣＮＳで
の精密化で用いる立体化学制限を定義した。ＳＡＨＡの制限はＴＳＡおよび周囲
のアミノ酸残基からの立体化学パラメータに基づいて設定した。ＨＤＬＰ−Ｚｎ ²⁺ −ＴＳＡおよびＨＤＬＰ−Ｚｎ²⁺−ＳＡＨＡ結晶におけるダイマーの界面は、
主として、タンパク質表面にＰｈｅ２００を含む。Ｐｈｅ２００側鎖は、その側
鎖立体配置がＴＳＡ結合に際して変化するＴｙｒ９１、および第２のプロトマー
からのＴＳＡのジメチルアミノフェニル基の一部に接触する。ＨＤＡＣファミリ
ーは同等位置にフェニルアラニン残基を含有しない。

【０１０１】実施例３：ヒストンデアセチラーゼアッセイ１０μｇの［³Ｈ］アセチル−標識ネズミ赤白血病ヒストン基質およびＨＤＡ
Ｃアッセイ緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣ
ｌ、１０％グリセロール）を３０μｌの全容量中にて３７℃で３０ないし６０分
間インキュベートすることによって、精製されたタンパク質をアッセイした。Ｈ
ＤＬＰおよびＨＤＡＣ１−ＦＬＡＧの最終濃度は、各々、３．６μＭおよび０．
２４μＭであった。アッセイは二連で行った。反応を停止させ、放出されたアセ
テートを記載されているように抽出し、アッセイした（Ｈｅｎｄｚｅｌら，１９
９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１９３６−２１９４２）。［３Ｈ］
アセチル−標識ネズミ赤白血病ヒストンは実質的に記載されているように調製し
た（Ｃａｒｍｅｎら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１５８３７
−１５８４４）。阻害剤を基質の不存在下で添加し、氷上で２０分間インキュベ
ートし、基質を添加し、前記したようにアッセイを行った。ＨＤＬＰを、ＨＤＡ
Ｃ緩衝液中で２０μＭＺｎＣｌ₂および２０μＭＭｎＣｌ₂（Ｈ２Ｏ）₄と
共にインキュベートし、活性について試験した。

【０１０２】ＺｎＣｌ₂に対して透析したＨＤＬＰのみが活性を有した。活性に対して影響
を有しないＨＤＡＣ緩衝液中の２０μＭＺｎＣｌ₂に対してＨＤＡＣ１−ＦＬ
ＡＧを透析した。従って、ＨＤＡＣ１−ＦＬＡＧは精製された金属を含有する。

【０１０３】ＨＤＬＰのイン・ビボ基質は知られていない。ＨＤＬＰはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓＡｃｕＣ遺伝子産物と同様にアセトイン資化において役割を有することが
でき、それはゲノム配列においてそれ自体解明されているが、ＡｃｕＣによって
触媒される反応もまた知られていない。さらに、Ａ．ａｅｏｌｉｃｕｓのゲノム
はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのａｃｕＡＢＣオペロンの一部であるａｃｕＡおよびａ
ｃｕＢ遺伝子を欠くようであり（Ｄｅｃｋｅｒｔら，１９９８Ｎａｔｕｒｅ３９２：３５３−３５８）、ＨＤＬＰはそれがＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＡｃｕＣ
に対するように（３４．７％同一性）、ヒトＨＤＡＣ１に対して同様である（３
５．２％同一性）。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＨＤＬＰ結晶、ＨＤＬＰ−ＴＳＡ共結晶、及びＨＤＬＰ−ＳＡＨＡ共
結晶のＸ線結晶解析からの統計値を列挙する表である。

【図２】図２は、様々なＨＤＡＣ相同体のアラインメントを配列同一性パーセントと共
に示す。

【図３】図３は、ＨＤＬＰ及びＨＤＡＣ１のヒストンデアセチラーゼ活性並びに阻害剤
ＴＳＡ及びＨＣ−毒素によるＨＤＬＰ及びＨＤＡＣ１の阻害を示すグラフを示す
。

【図４】図４は、（Ａ＆Ｂ）２つのほぼ直交する視点からのＨＤＬＰ−Ｚｎ²⁺−ＴＳＡ
複合体の模式図、（Ｃ）ＨＤＡＣ１との相同領域を表すＨＤＬＰのトポロジーダ
イアグラム、及び（Ｄ）ＨＤＬＰ−Ｚｎ²⁺−ＳＡＨＡ複合体の拡大模式図を示す
。

【図５】図５は、（Ａ）ポケット内部キャビティ及び指示されるβシートの位置を有す
るＨＤＬＰの表面図を通したスライスの模式図、（Ｂ）図４Ｂと同様の方向にポ
ケット内を見下ろす活性部位の拡大図の模式図を示す。

【図６】図６は、（Ａ）活性部位ポケットにおけるＴＳＡの空間充填図、（Ｂ）図４Ｂ
と同様の方向でのＨＤＬＰ−ＺＮ²⁺−ＴＳＡ複合体の構造の拡大立体図、及び（
ｃ）ＨＤＬＰ−ＴＳＡ相互作用の模式図を示す。

【図７】図７は、（Ａ）図４Ａと同様の方向での、ＨＤＬＰ及びＨＤＡＣ１の間で共有
される相同領域の模式図、並びに（Ｂ）図４Ｂと同様の方向での、ＨＤＬＰ及び
ＨＤＡＣ１の間でポケット及び内部キャビティにおいて共有される相同性の詳細
な模式図を示す。

【図８】図８は、アセチル化リジンの脱アセチル化について提示される触媒機構の模式
図を示す。

【図９】図９は、活性部位及び隣接グルーブにおける保存アミノ酸を示す空間充填図の
模式図を示す。

【図１０】図１０は、アキフェクス・エオリクスに由来するＨＤＬＰの核酸配列である（
配列番号：２）。

【図１１】図１１は、アキフェクス・エオリクスに由来する完全長ＨＤＬＰのアミノ酸配
列である（配列番号：１）。

【図１２】図１２は、ＨＤＬＰ活性部位突然変異体Ｔｙｒ２９７Ｐｈｅの核酸配列である
（配列番号：６）。

【図１３】図１３は、ＨＤＬＰ活性部位突然変異体Ｔｙｒ２９７Ｐｈｅのアミノ酸配列で
ある（配列番号：５）。

【図１４】図１４は、Ｃｙｓ７５Ｓｅｒ及びＣｙｓ７７Ｓｅｒ突然変異を含む、アキフェ
クス・エオリクスに由来するＨＤＬＰの二重突然変異体の核酸配列である（配列
番号：４）。

【図１５】図１５は、Ｃｙｓ７５Ｓｅｒ及びＣｙｓ７７Ｓｅｒ突然変異を含む、アキフェ
クス・エオリクスに由来するＨＤＬＰの二重突然変異体のアミノ酸配列である（
配列番号：３）。

【図１６】図１６−１ないし１６−４９は、ＨＤＬＰの結晶からのＸ線回折によって誘導
されるＨＤＬＰの原子構造座標を列挙する。

【図１７】図１７−１ないし１７−４９は、ＨＤＬＰＣｙｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７Ｓ
ｅｒ二重突然変異体の結晶からのＸ線回折によって誘導される、活性部位に亜鉛
原子を含むＨＤＬＰＣｙｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７Ｓｅｒ二重突然変異体の原
子構造座標を列挙する。

【図１８】図１８−１ないし１８−９９は、ＴＳＡと複合体を形成するＨＤＬＰの共結晶
からのＸ線回折によって誘導されるＨＤＬＰＣｙｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７Ｓ
ｅｒ二重突然変異体の原子構造座標を列挙する。

【図１９】図１９−１ないし１９−４８は、ＳＡＨＡと複合体を形成するＨＤＬＰの共結
晶からのＸ線回折によって誘導されるＨＤＬＰＣｙｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７
Ｓｅｒ二重突然変異体の原子構造座標を列挙する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/68 33/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (71)出願人ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨークＴＨＥＴＲＵＳＴＥＥＳＯＦＣＯＬＵＭＢＩＡＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＩＮＴＨＥＣＩＴＹＯＦＮＥＷＹＯＲＫアメリカ合衆国10027ニューヨーク州ニューヨーク、ウエスト・ワンハンドレッドシックスティーンス・ストリート・アンド・ブロードウェイ（番地の表示なし) (72)発明者パブレティッチ，ニコラアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨーク，イースト 75ティーエイチストリート 330，アパートメント 38 エイ (72)発明者フィニン，マイケルアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨーク，アパートメント 19エス，イースト 63アールディーストリート 504 (72)発明者ドニジャン，ジルアメリカ合衆国ニュージャージー 07031 ノースアーリントン，ユニオンプレース 13 (72)発明者リション，ビクトリアアメリカ合衆国ニューヨーク 10021 ニューヨーク，アパートメント 28エム，イースト 63アールディーストリート 504 (72)発明者リフカインド，リチャード，エイ．アメリカ合衆国ニューヨーク 10022 ニューヨーク，イースト 58ティーエイチストリート 425，アパートメントナンバー48エイ (72)発明者マークス，ポール，エイ．アメリカ合衆国コネティカット 06793 ワシントン，ロシターロード７ (72)発明者ブレスロー，ロナルドアメリカ合衆国ニュジャージー 07631 イングルウッド，ブロードアベニュー 275 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 DA36 FB01 4B024 AA01 AA11 BA11 CA02 DA06 HA11 HA17 4B050 CC03 DD11 FF11 FF12 FF14 FF17 LL01 4B063 QA18 QQ30 QR10 QR67

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】デアセチラーゼ活性を含んでなる酵素の結晶であって、前記
結晶は前記酵素の原子座標の決定に関して４Åを超える分解能までＸ線を有効に
回折するものであり、前記酵素の構造は保存されたコアであるα／β構造に特徴
的な折り畳みを含んでなり、前記保存されたα／β折り畳みは８鎖平行βシート
および８つのαヘリックスを含んでなり、該ヘリックスの４つは前記平行βシー
トのいずれの面上にもパッキングされており、前記酵素の前記構造はＨＤＬＰの
原子座標により規定されるＨＤＬＰのアミノ酸の少なくとも２／３以上のＣα原
子の位置において１．５Å以下のｒｍｓｄを含んでなるものである、結晶。
【請求項２】前記タンパク質構造が、以下：（ａ）βシートの一方の側近傍に位置する８つのαヘリックス；ならびに（ｂ）前記８鎖平行βシートのβストランドのＣ末端から始まる少なくとも７つ
の巨大な充分に規定されたループ、ここで、余分の８つのヘリックスおよび７つ
の巨大なループはコアα／βモチーフを越えて、その構造の顕著な伸展部と会合
し、かつ該構造の前記伸展部は深く狭いポケットおよび該ポケットに隣接する内
部キャビティを生じさせるものである、をさらに含んでなるものである、請求項１記載の結晶。
【請求項３】デアセチラーゼ活性を含んでなる前記酵素が、ＨＤＬＰ、Ｈ
ＤＬＰ関連タンパク質、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、Ｈ
ＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ関連タンパク質、ＡＰＡＨ、ＡｃｕＣ、および
それらの機能的誘導体からなる群より選ばれるものである、請求項１記載の結晶
。
【請求項４】前記酵素の活性部位に特異的に結合した亜鉛原子をさらに含
んでなるものである請求項２記載の結晶。
【請求項５】前記酵素の活性部位に特異的に結合したデアセチラーゼ阻害
剤化合物をさらに含んでなるものである請求項２記載の結晶。
【請求項６】図１６の原子座標により規定される請求項２記載の結晶。
【請求項７】ａ．図１６の原子座標によって規定されるＨＤＬＰの三次元
構造を用いる工程；ｂ．前記三次元構造を使用して、前記潜在的阻害剤をデザインまたは選択する工
程；ｃ．前記潜在的阻害剤を合成する工程；ｄ．アセチル化基質の存在下で前記潜在的阻害剤を前記酵素と接触させる工程；
ならびに、ｅ．前記潜在的阻害剤のデアセチラーゼ阻害活性を測定する工程、を含む、デアセチラーゼ活性を含んでなる酵素の潜在的デアセチラーゼ阻害剤化
合物の同定方法。
【請求項８】三次元構造がコンピューターモデリングを用いてデザインま
たは選択されるものである請求項７記載の方法。
【請求項９】潜在的デアセチラーゼ阻害剤がデ・ノボでデザインされるも
のである請求項７記載の方法。
【請求項１０】潜在的デアセチラーゼ阻害剤が公知の阻害剤に基づいてデ
ザインされるものである請求項７記載の方法。
【請求項１１】デアセチラーゼ活性を含んでなる前記酵素が、ＨＤＬＰ、
ＨＤＬＰ関連タンパク質、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、
ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ関連タンパク質、ＡＰＡＨ、およびＡｃｕＣ
からなる群より選ばれるものである、請求項７記載の方法。
【請求項１２】潜在的デアセチラーゼ阻害剤化合物の結合特性の評価方法
であって、ａ．前記化合物をＨＤＬＰと共に共結晶化させる工程；ｂ．図１６の原子座標により規定されるＨＤＬＰの三次元構造を用いて分子置換
により前記ＨＤＬＰ−潜在的阻害剤複合体共結晶の三次元構造を決定する工程；
ならびにｃ．前記潜在的阻害剤化合物に結合した前記ＨＤＬＰの前記三次元構造を解析し
て前記潜在的阻害剤化合物の結合特性を評価する工程、を含む、評価方法。
【請求項１３】ＨＤＡＣファミリーメンバーの結晶構造の解析方法であっ
て、ａ．４Åを越える高最大分解能まで回折する、前記結晶のＸ線回折データを収集
する工程；ｂ．図１６のＨＤＬＰの原子座標を用いて、前記ＨＤＡＣファミリーメンバーの
構造を決定するために、前記ＨＤＡＣファミリーメンバーの結晶の前記Ｘ線回折
データを用いて分子置換または精密化および差フーリエを行う工程；ならびにｃ．前記ＨＤＡＣファミリーメンバーの前記構造を精密化する工程、を含む、解析方法。
【請求項１４】前記ＨＤＡＣファミリーメンバーがＨＤＡＣ１である請求
項１３記載の方法。
【請求項１５】配列番号：４の核酸配列によりコードされるものである、
ＨＤＬＰのＣｙｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７Ｓｅｒ二重突然変異体。
【請求項１６】配列番号：３のアミノ酸配列を有するものである、ＨＤＬ
ＰのＣｙｓ７５Ｓｅｒ／Ｃｙｓ７７Ｓｅｒ二重突然変異体。
【請求項１７】配列番号：４の核酸配列。
【請求項１８】請求項１７に記載のヌクレオチド配列を含んでなる発現ベ
クター。
【請求項１９】新規薬物のスクリーニングのための請求項１に記載の結晶
の使用方法であって、ａ．該結晶について決定した三次元構造を用いて合理的薬物デザインを行うこと
により、潜在的リガンドを選択する工程；ｂ．潜在的リガンドを該結晶のリガンド結合ドメインと接触させる工程；ならび
にｃ．リガンド結合ドメインへの潜在的リガンドの結合能を検出する工程、ここで
、新規薬物が公知の薬物よりもリガンド結合ドメインに対して強い親和性を有す
ることに基づいて選択されるものである、を含む、使用方法。