ES2287033T3

ES2287033T3 - Estructura cristalina de una desacetilasa e inhibidores de la misma.

Info

Publication number: ES2287033T3
Application number: ES00968344T
Authority: ES
Inventors: Nikola Pavletich; Michael Finnin; Jill Donigian; Victoria Richon; Richard A. Rifkind; Paul A. Marks; Ronald Breslow
Original assignee: Sloan Kettering Institute for Cancer Research; Columbia University in the City of New York
Current assignee: Sloan Kettering Institute for Cancer Research; Columbia University in the City of New York
Priority date: 1999-09-08
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2007-12-16
Anticipated expiration: 2020-09-08
Also published as: DE60034688T2; EP1212357A1; WO2001018045A9; JP2003518923A; EP1212357B1; WO2001018045A1; EP1212357A4; US20030013176A1; CA2383885A1; US20070087427A1; DE60034688D1; ATE361316T1; US20070100559A1; US7124068B2

Abstract

Un cristal de una enzima que comprende actividad desacetilasa en el que dicho cristal difracta eficazmente rayos X para la determinación de las coordenadas atómicas de dicha enzima a un resolución mayor de 4 Å y en el que la estructura de dicha enzima comprende un plegamiento central característico alfa/beta estructural conservado en el que dicho plegamiento alfa/beta conservado comprende una lámina beta paralela de ocho cadenas y ocho hélices alfa y en el que cuatro de las hélices se agrupan en cada cara de dicha lámina beta paralela y en el que dicha estructura de dicha enzima comprende una rmsd de menos de o igual a 1, 5 Å en las posiciones de los átomos Calfaen al menos 2/3 o más de los aminoácidos de HDLP (SEQ ID NO:1) como se define por las coordenadas atómicas de HDLP según la Figura 16 y en el que el cristal tiene las dimensiones de la celda unidad de a = 51, 4 Å, b = 93, 8 Å, c = 78, 7 Å y beta = 96, 9o o a = 53, 4 Å, b = 94, 4 Å y c = 156, 3 Å.

Description

Estructura cristalina de una desacetilasa e inhibidores de la misma.

Introducción

La presente invención se refiere a un homólogo de la histona desacetilasa de la bacteria hipertermofílica Aquifex aeolicus, HDLP (proteína semejante a la histona desacetilasa; también conocida como AcuC1), que comparte un 35,2% de identidad en la secuencia con la histona desacetilasa humana (HDAC1), que puede co-cristalizarse con un ligando inhibidor y, más particularmente, a los datos cristalográficos detallados obtenidos a partir de dicha co-cristalización que se describe en la presente memoria. La invención también se refiere a métodos para utilizar la estructura cristalina y las coordenadas cristalográficas de rayos X de apo-HDLP y HDLP unida al inhibidor para diseñar, aislar y cribar compuestos que se unen a e inhiben el sitio activo de HDLP y proteínas relacionadas con HDLP, tales como las proteínas que pertenecen a la familia HDAC, incluyendo HDAC1.

Antecedentes de la invención

La modificación reversible de las histonas por acetilación está asociada a cambios en la conformación del nucleosoma y en la estructura de la cromatina y juega un papel importante en la regulación de la expresión génica (revisado en Davie y Chadee, 1998, J. Cell Biochem. Suppl. 30-31:203-213). Las enzimas histona acetilasa y desacetilasa que realizan estas modificaciones están implicadas en muchos procesos celulares tales como progresión del ciclo celular y diferenciación y su desregulación está asociada con varios tipos de cáncer humano (revisado en Kouzarides, 1999, Curr. Opin. Genet. Dev. 9:40-48; Hassig et al., 1997, Chem. Biol. 4:783-789; Fenrick y Heibert, 1998, J. Cell. Biochem. Suppl. 30-31: 194-202).

Recientemente, se ha mostrado que varios compuestos antitumorales experimentales, tales como tricostatina A (TSA), trapoxina, ácido suberoilanilida hidroxámico (SAHA) y fenilbutirato actúan, al menos en parte, inhibiendo las histonas desacetilasas. Richon et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 95:3003-3007; Yoshida et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:17174-17179; Kijima et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:22429-22435. Además, se ha mostrado que el sulfuro de dialilo y moléculas relacionadas (Lea et al., 1999, Int. J. Oncol. 2:347-352), oxamflatina (Kim et al., 1999, Oncogene 15:2461-2470), MS-27-275, un derivado sintético de la benzamida (Saito et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96:4592-4597), derivados de butarato (Lea y Tulsyan, 1995, Anticancer Res. 15:879-883), FR901228 (Nokajima et al., 1998, Exp. Cell Res. 241:126-133), depudecina (Kwon et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3356-3361) y ácido m-carboxicinámico bishidroxamida (CBHA; Richon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3003-3007) inhiben las histonas desacetilasas. In vitro, estos compuestos pueden inhibir el crecimiento de células fibroblásticas produciendo la parada del ciclo celular en las fases G1 y G2 (Richon et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5705-5708; Kim et al., 1999, Oncogene 18:2461-2470; Yoshida et al., 1995, Bioessays 17:423-430; Yoshida y Beppu, 1988, Exp. Cell Res. 177:122-131) y pueden dar lugar a la diferenciación terminal y pérdida del potencial transformante de una variedad de líneas celulares transformadas. Richon et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5705-5708; Kim et al., 1999, Oncogene 18:2461-2470; Yoshida et al., 1987, Cancer Res. 47:3688-3691. In vivo, el fenilbutarato es eficaz en el tratamiento de la leucemia promielocítica aguda junto al ácido retinoico. Warrel et al., 1998, J. Natl. Cancer Inst. 90:1621-1625. SAHA es eficaz en la prevención de la formación de tumores mamarios en ratas y tumores de pulmón en ratones. Desai et al., 1999, Proc. AACR 40:abstract #2396; Cohen et al., Cancer Res., enviado.

Las histonas desacetilasas catalizan la eliminación de grupos acetilo de los grupos \varepsilon-amino de los restos de lisina agrupados cerca del extremo N-terminal de las histonas nucleosomales y este proceso está asociado a la represión transcripcional (revisado en Struhl, 1998, Genes Dev. 12:599-606). La deleción del gen de la histona desacetilasa de levaduras, rpd3, o su inactivación farmacológica con tricostatina A, reduce la represión transcripcional en un subconjunto de promotores, tales como los de los genes regulados por Ume6. Kadosh y Struhl, 1998, Mol. Cell. Biol. 18:5121-5127. Esto se acompaña de la acetilación incrementada de las histonas H4 en el promotor reprimido y sus alrededores, pero no tiene efecto en las histonas de las regiones distantes del promotor. Kadosh y Struhl, 1998, Mol. Cell. Biol. 18:5121-5127; Rundlett et al., 1998, Nature 392:831-835.

Las histonas desacetilasas están reclutadas a promotores específicos mediante la asociación con represores transcripcionales que se unen al ADN, bien directamente o a través de co-represores que conectan la desacetilasa con los represores transcripcionales. Por ejemplo, los represores Mad y Ume6 se unen al co-represor Sin3A (Laherty et al., 1997, Cell 89:349-356; Hassig et al., 1997, Cell 89:341-347; Kadosh y Struhl, 1997, Cell 89:365-371), y los receptores nucleares unen N-CoR y los co-represores SMRT relacionados. Nagy et al., 1997, Cell 89:373-380; Alland et al., 1997, Nature 387:49-55; Heinzel et al., 1997, Nature 387:43-48.

La desregulación del reclutamiento de las histonas desacetilasas parece ser uno de los mecanismos mediante los que estas enzimas contribuyen a la tumorogénesis. En la leucemia promielocítica aguda (APL), las translocaciones cromosómicas fusionan el receptor \alpha del ácido retinoico (RAR\alpha) bien con PLZF o con PML. Estas oncoproteínas de fusión tienen una actividad de represión transcripcional aberrante que resulta, en parte, del reclutamiento de un co-represor y, a su vez, de HDAC. Grignani et al., 1998, Nature 391:815-818; Lin et al., 1998, Nature 391:811-814. El tratamiento de células de APL PLZF-RAR\alpha con TSA incrementa su respuesta a la diferenciación inducida por el ácido retinoico. Grignani et al., 1998, Nature 391:815-818; Lin et al., 1998, Nature 391:811-814.

Las histonas desacetilasas comprenden una gran familia de proteínas, conservadas desde la levadura hasta el ser humano, y se dividen en dos clases relacionadas. La clase I se caracteriza por HDAC1, 2, 3 humanas (Taunton et al., 1996, Science 272:408-411; Yang et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12845-12850; Emiliani et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2795-2800) y RPD3 de levaduras (Videl y Gaber, 1991, Mol. Cell. Biol. 11:6317-6327), y la clase II por HDAC4, 5, 6 humanas (Grozinger et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:4868-4873; Fischle et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:11713-11720) y HDA1 de levaduras (Rundlett et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14503-14508). Las dos clases comparten una región de \sim390 aminoácidos de similitud de secuencia, que comprende el núcleo desacetilasa pero son divergentes fuera de esta región. Los genes de las histonas desacetilasas pertenecen a una superfamilia aún mayor (Leipe y Landsman, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3693-3697) que contiene las proteínas procariotas para la utilización de acetoína (AcuC; 28,1% de identidad de secuencia con HDAC1) y las acetilpoliamina amidohidrolasas procariotas (APAH; 15,0% de identidad de secuencia con HDAC1). La actividad enzimática de AcuC no está clara pero su interrupción reduce la capacidad de B. subtilis de degradar la acetoína y de utilizarla como fuente de carbono. Grundy et al., 1993, Mol. Microbiol. 10:259-271. Las APAH catalizan la desacetilación de poliaminas degradando un enlace amida no peptídico (revisado en Leipe y Landsman, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3693-3697).

Es útil plantear las cuestiones de cómo las HDAC y las proteínas relacionadas con HDAC catalizan la desacetilación de histonas y cómo los compuestos referidos anteriormente, particularmente aquellos compuestos con actividad antitumoral, inhiben esta actividad con el fin de entender mejor el mecanismo de inhibición de las HDAC y para facilitar el descubrimiento de compuestos útiles adicionales que pueden inhibir esta actividad. Con este propósito, la presente invención ha determinado la estructura tridimensional de una proteína semejante a HDAC1 de la bacteria termofílica Aquifex aeolicus, de aquí en adelante en la presente memoria HDLP. La determinación de la secuencia de ácido nucleico que codifica HDLP fue descrita por Deckert et al., 1998, Nature 392:353-358. La proteína codificada de 375 restos, cuya secuencia se determinó a partir de la secuencia de ácido nucleico codificadora, comparte un 35,2% de identidad en la secuencia de aminoácidos con HDAC1, desacetila histonas in vitro, y se inhibe por TSA, SAHA y otros inhibidores de HDAC. La determinación de la estructura tridimensional de HDLP es útil en el diseño, identificación y cribado de nuevos compuestos inhibidores de la familia de las HDAC que son útiles para la inhibición del crecimiento celular tanto in vivo como in vitro.

Compendio de la invención

En general, es el objeto de la presente invención proporcionar información detallada de la estructura tridimensional de una familia de proteínas conocidas como histonas desacetilasas (HDAC) y particularmente un homólogo de HDLP de la bacteria hipertermofílica Aquifex aeolicus (proteína semejante a la histona desacetilasa) que comparte un 35,2% de identidad de secuencia con la histona desacetilasa humana (HDAC1). También es un objeto de la presente invención proporcionar información de la estructura tridimensional de una HDLP unida a un compuesto inhibidor.

En una realización de la invención, la información de la estructura tridimensional se obtiene a partir de un cristal de HDLP de tipo salvaje (SEQ ID NO:1) (el ácido nucleico que codifica HDLP de tipo salvaje es SEQ ID NO:2). En una realización más de la invención, la información tridimensional se obtiene a partir de una HDLP mutante que comprende dos mutaciones (1) cisteína 75 a una serina y (2) cisteína 77 a una serina (mutante doble Cys75Ser/Cys77Ser; SEQ ID NO:3) (el ácido nucleico que codifica el mutante doble Cys75Ser/Cys77Ser de HDLP es SEQ ID NO:4). La HDLP mutante de la presente invención facilita la determinación de información de la estructura tridimensional de HDLP unida a un átomo de cinc en su sitio de unión a átomos de cinc.

En una realización preferida de la invención, la información de la estructura tridimensional se obtiene a partir de un co-cristal de un complejo proteína-compuesto inhibidor que comprende HDLP o el mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser y tricostatina A (TSA). En otra realización preferida de la invención la información de la estructura tridimensional se obtiene a partir de un co-cristal de un complejo proteína-compuesto inhibidor que comprende HDLP o el mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser y el ácido suberoilanilida hidroxámico (SAHA). Cualquier compuesto inhibidor de HDLP o de proteínas relacionadas con HDLP (por ejemplo, HDAC) que pueda co-cristalizarse con HDLP puede utilizarse para formar un co-cristal de la presente invención.

Los cristales de proteína y los co-cristales del complejo proteína-inhibidor de la presente invención difractan a un límite de resolución alto de al menos igual a o mayor de 4 angstrom (\ring{A}). En una realización preferida, los cristales de proteína y los co-cristales del complejo proteína-inhibidor de la presente invención difractan a un límite de resolución alto mayor de 2,5 \ring{A}.

Un cristal de la presente invención tiene un grupo espacial C2 con una molécula en la unidad asimétrica y siendo las dimensiones de la unidad a = 51,4 \ring{A}, b = 93,8 \ring{A}, c = 78,7 \ring{A} y \beta = 96,9º (véase, por ejemplo, el Ejemplo 2, más adelante). En otra realización preferida, el cristal tiene un grupo espacial P2_{1}2_{1}2_{1} con dos moléculas en la unidad asimétrica y siendo las dimensiones de la unidad a = 53,4 \ring{A}, b = 94,4 \ring{A}, c = 156,3 \ring{A} (véase, por ejemplo, el Ejemplo 2, más adelante). La estructura de HDLP comprende una lámina \beta paralela con las hélices \alpha empaquetadas frente a las dos caras. En un extremo de la lámina \beta, la HDLP tiene un bolsillo estrecho semejante a un tubo formado por varios bucles ordenados. Las paredes del bolsillo están revestidas con restos hidrofóbicos y en el fondo del bolsillo hay un sitio de unión a cinc y varias cadenas laterales polares. Los compuestos inhibidores de la presente invención se unen al bolsillo.

La información de la estructura tridimensional obtenida a partir de cristales de HDLP, del doble mutante de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser, del doble mutante de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser que comprende un átomo de cinc, de HDLP que comprende un compuesto inhibidor tal como TSA o SAHA y del mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser que comprende un compuesto inhibidor tal como TSA o SAHA puede utilizarse para resolver la estructura de cualquier cristal de proteínas relacionadas con HDLP (por ejemplo, HDAC) o de cualquier proteína relacionada con HDLP mutante y particularmente cualquier proteína relacionada con HDLP de tipo salvaje o mutante complejada con un ligando, incluyendo un sustrato o un compuesto inhibidor. Si los cristales están en un grupo espacial diferente que la estructura conocida, puede utilizarse reemplazamiento molecular para resolver la estructura o si los cristales están en el mismo grupo espacial pueden utilizarse métodos de refinamiento y de diferencia de fourier. La estructura de las proteínas relacionadas con HDLP (por ejemplo, HDAC1) comprende una desviación de la media cuadrática no mayor de 2,0 \ring{A} (rmsd) en las posiciones de los átomos C\alpha para al menos el 50% o más de los aminoácidos de la estructura de HDLP de longitud completa.

La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 y la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:4. La invención también contempla que pueden realizarse mutaciones en proteínas relacionadas con HDLP en restos de cisteína, como en el mutante doble Cys75Ser/Cys77Ser, con el fin de facilitar la determinación de la estructura de dichas proteínas unidas a un átomo de cinc. Además, la presente invención proporciona vectores de expresión que comprenden la molécula de ácido nucleico que codifica un mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser codificado por la secuencia representada por SEQ ID NO:4 unida de manera operativa a secuencias de control de la expresión.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar métodos para el diseño, identificación y cribado de compuestos inhibidores potenciales de la familia HDLP/HDAC. En una realización preferida el método para el diseño, identificación y cribado racionales de compuestos inhibidores potenciales de HDLP y proteínas relacionadas con HDLP (por ejemplo, HDAC) que comprenden actividad desacetilasa comprende las etapas de: (a) utilizar una estructura tridimensional de una HDLP como se define por las coordenadas atómicas de la presente invención; (b) utilizar dicha estructura tridimensional para diseñar o seleccionar dicho compuesto inhibidor potencial; (c) sintetizar y/o seleccionar dicho inhibidor potencial; (d) poner en contacto dicho compuesto inhibidor potencial con dicha enzima en presencia de sustrato acetilado; y (e) determinar el porcentaje de inhibición de la actividad desacetilasa para determinar la actividad inhibidora de dicho compuesto inhibidor potencial. En una realización preferida adicional, pueden determinarse las propiedades de unión de dicho compuesto inhibidor diseñado racionalmente mediante un método que comprende las etapas de: (a) formar un complejo que comprende dicho compuesto inhibidor y HDLP o una proteína relacionada con HDLP, (b) co-cristalizar dicho complejo compuesto inhibidor-HDLP; (c) determinar dicha estructura tridimensional de dicho co-cristal mediante reemplazamiento molecular o refinamiento y diferencia de fourier con las coordenadas moleculares de HDLP como se define por la presente invención; y (d) analizar la estructura tridimensional para determinar las características de unión de dicho compuesto inhibidor potencial.

Es un objeto más de la presente invención identificar una clase definida de compuestos inhibidores de la familia HDLP/HDAC. Se describen compuestos inhibidores de la familia HDLP/HDAC como se representan por la fórmula (I):

1

en la que X comprende un grupo de cubierta que se une a al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en prolina y leucina; Y comprende un grupo de cadena alifática que se une a al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en leucina, fenilalanina y glicina; y Z comprende un grupo de unión del sitio activo que se une a al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido aspártico, tirosina e histidina y puede unirse además a un átomo de cinc.

Descripción breve de los dibujos

La Figura 1 es una tabla que lista las estadísticas de los análisis cristalográficos de rayos X de un cristal de HDLP, un co-cristal HDLP-TSA y un co-cristal HDLP-SAHA.

La Figura 2 muestra un alineamiento de varios homólogos de HDAC mostrando el porcentaje de identidad de la secuencia.

La Figura 3 muestra un gráfico que indica la actividad histona desacetilasa de HDLP y HDAC1 y la inhibición de HDLP y HDAC1 por los inhibidores TSA y toxina HC.

La Figura 4 muestra (A y B) una representación esquemática del complejo HDLP-Zn^{2+}-TSA en dos vistas aproximadamente ortogonales, (C) un diagrama topológico de HDLP que indica las regiones de homología con HDAC1 y (D) una representación esquemática en primer plano del complejo HDLP-Zn^{2+}-SAHA.

La Figura 5 muestra (A) una representación esquemática de un corte de una representación de la superficie de HDLP indicando las cavidades internas del bolsillo y la posición de la lámina \beta, (B) una representación esquemática de una vista en primer plano del sitio activo mirando hacia el bolsillo en una orientación similar a la de la Figura
4B.

La Figura 6 muestra (A) una representación de llenado de espacio de TSA en el bolsillo del sitio activo, (B) una visión estéreo en primer plano de la estructura del complejo HDLP-Zn^{2+}-TSA en una orientación similar a la de la Figura 4B, y (C) una representación esquemática de las interacciones HDLP-TSA.

La Figura 7 muestra (A) una representación esquemática de las regiones de homología compartidas entre HDLP y HDAC1 en una orientación similar a la de la Figura 4A, y (B) una representación esquemática detallada de la homología compartida en el bolsillo y la cavidad interna entre HDLP y HDAC1 en una orientación similar a la de la Figura 4B.

La Figura 8 muestra una representación esquemática del mecanismo catalítico propuesto para la desacetilación de lisina acetilada.

La Figura 9 muestra una representación esquemática de un diagrama de llenado de espacio que muestra los aminoácidos conservados en el sitio activo y en los surcos cercanos.

La Figura 10 es la secuencia de ácido nucleico de HDLP de Aquifex aeolicus (SEQ ID NO. 2).

La Figura 11 es la secuencia de aminoácidos de HDLP de longitud completa de Aquifex aeolicus (SEQ ID NO. 1).

La Figura 12 es la secuencia de ácido nucleico del mutante del sitio activo de HDLP Tyr297Phe (SEQ ID NO. 6).

La Figura 13 es la secuencia de aminoácidos del mutante del sitio activo de HDLP Tyr297Phe (SEQ ID NO. 5).

La Figura 14 es la secuencia de ácido nucleico de un mutante doble de HDLP de Aquifex aeolicus que comprende una mutación Cys75Ser y Cys77Ser (SEQ ID NO. 4).

La Figura 15 es la secuencia de aminoácidos de un mutante doble de HDLP de Aquifex aeolicus que comprende una mutación Cys75Ser y Cys77Ser (SEQ ID NO. 3).

La Figura 16-1 a 16-49 lista las coordenadas atómicas de la estructura para HDLP obtenidas mediante difracción de rayos X a partir de un cristal de HDLP.

La Figura 17-1 a 17-49 lista las coordenadas atómicas de la estructura para el mutante doble de HDLP Cys75Ser/
Cys77Ser que comprende un átomo de cinc en el sitio activo obtenidas mediante difracción de rayos X a partir de un cristal del mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser.

La Figura 18-1 a 18-99 lista las coordenadas atómicas de la estructura del mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77
Ser obtenidas mediante difracción de rayos X a partir de un co-cristal de HDLP complejada con TSA.

La Figura 19-1 a 19-48 lista las coordenadas atómicas de la estructura del mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77
Ser obtenidas mediante difracción de rayos X a partir de un co-cristal de HDLP complejada con SAHA.

Descripción detallada de la invención

La invención se define mediante las reivindicaciones. La materia no cubierta por las reivindicaciones sólo sirve para fines ilustrativos.

La presente invención proporciona cristales de un homólogo de la histona desacetilasa (HDAC) crecidos en presencia y ausencia de un compuesto capaz de inhibir la actividad histona desacetilasa de dicho homólogo de HDAC. Tal y como se refiere en la presente memoria, un homólogo de HDAC (así como una proteína relacionada con HDLP) es cualquier molécula proteica que tiene (a) más del 15% de identidad de secuencia sobre los 375 restos de aminoácidos de HDLP; (b) que tiene no más de veinte inserciones o deleciones para un total de no más de 100 aminoácidos, y (c) actividad desacetilasa. La identidad de secuencia se calcula mediante el programa DNAstar^{TM} utilizando el método clustal para el esquema de peso de la matriz de identidad (DNAstar program, Madison, WI).

\newpage

Un compuesto inhibidor de HDLP/HDAC, tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier compuesto representado por la Fórmula (I):

2

en la que X comprende un grupo de cubierta que se une a al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en tirosina, prolina y leucina; Y comprende un grupo de cadena alifática de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 \ring{A}, preferiblemente 7 \ring{A}, que se une a al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina y glicina; y Z comprende un grupo de unión del sitio activo que se une a al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido aspártico, tirosina e histidina y que puede unirse además a un átomo de cinc. Los compuestos inhibidores de HDAC de la presente invención pueden inhibir más del 50% de la actividad histona desacetilasa de un homólogo de HDAC o de una proteína relacionada con HDLP.

Para crecer los cristales de la presente invención, HDAC y el complejo HDAC-compuesto inhibidor se purifican hasta más del 80% de proteína total y más preferiblemente se purifican hasta más del 90% de proteína total. Para fines de expresión y purificación, la HDLP de longitud completa (número de referencia de Genbank AE000719) puede subclonarse a partir de una preparación de ADN cromosómico de Aquifex aeolicus mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) e insertarse en un vector de expresión.

Puede utilizarse un gran número de sistemas vector-anfitrión conocidos en la técnica. Los vectores posibles incluyen, pero no están limitados a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vector debe ser compatible con la célula anfitriona utilizada. Los ejemplos de vectores incluyen bacteriófagos de E. coli tales como derivados lambda, o plásmidos tales como derivados de pBR322 o derivados del plásmido pUC, por ejemplo, vectores pGEX (Amersham-Pharmacia, Piscataway, Nueva Jersey), vectores pET (Novagen, Madison, WI), vectores pma1-c (Amersham-Pharmacia, Piscataway, Nueva Jersey), vectores pFLAG (Chiang y Roeder, 1993, Pept. Res. 6:62-64), vectores baculovirus (Invitrogen, Carlsbad, CA; Pharmigen, San Diego, CA), etc. La inserción en un vector de clonación puede conseguirse, por ejemplo, ligando el fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene extremos cohesivos complementarios, mediante ligación de extremos romos si no existen extremos cohesivos complementarios o mediante conectores de nucleótidos utilizando técnicas estándar en la técnica. Por ejemplo, Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, (1992). Los vectores recombinantes que comprenden el ácido nucleico de interés pueden introducirse entonces en una célula anfitriona compatible con el vector (por ejemplo, E. coli, células de insectos, células de mamíferos, etc.) mediante transformación, transfección, infección, electroporación, etc. El ácido nucleico también puede ponerse en un vector lanzadera que puede clonarse y propagarse en gran cantidad en las bacterias y después introducirse en una célula anfitriona eucariota para su expresión. Los sistemas de vectores de la presente invención pueden proporcionar secuencias de control de la expresión y pueden permitir la expresión de proteínas in vitro.

En una realización preferida, la HDLP de longitud completa (SEQ ID NO:2) se subclona a partir de una preparación de ADN cromosómico de Aquifex aeolicus en pGEX4T3 (Amersham-Pharmacia, Piscataway, Nueva Jersey). Con el fin de construir un mutante doble que comprende una mutación Cys75Ser y Cys77Ser (SEQ ID NO:4), y para construir el mutante del sitio activo de HDLP Tyr297Phe (SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6), puede utilizarse mutagénesis dirigida mediante PCR con verificación mediante métodos de secuenciación de ADN conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1 más adelante). Los mutantes de la presente invención pueden subclonarse en un vector de expresión adecuado e introducirse en una célula anfitriona para la producción de proteínas, como se ha descrito anteriormente.

Los ácidos nucleicos de HDLP de la presente invención pueden subclonarse en un vector de expresión para crear una construcción de expresión de manera que la molécula de HDLP resultante que se produce comprenda una proteína de fusión comprendiendo dicha proteína de fusión una etiqueta para facilitar la purificación. Tal y como se refiere en la presente memoria, una "etiqueta" es cualquier aminoácido adicional que se proporciona en una proteína en el extremo c-terminal, n-terminal o internamente para facilitar la purificación, para mejorar la producción o para cualquier otro propósito que pueda facilitar los objetivos de la presente invención (por ejemplo, para conseguir unos niveles mayores de producción y/o purificación). Dichas etiquetas incluyen etiquetas conocidas por los expertos en la técnica que son útiles en la purificación tales como, pero sin limitarse a, etiqueta his, etiqueta glutation-s-transferasa, etiqueta flag, etiqueta mbp (proteína de unión a la maltosa), etc. En una realización preferida, las HDLP de tipo salvaje y mutante de la presente invención se etiquetan con glutation-s-transferasa (véase el Ejemplo 1 más adelante). En otra realización preferida, HDAC1 se etiqueta con flag (véase el Ejemplo 1 más adelante). Dichas proteínas etiquetadas también pueden someterse a ingeniería para comprender un sitio de escisión, tal como un sitio de escisión de trombina, enteroquinasa o factor X, para facilitar la eliminación de la etiqueta antes, durante o después de la purificación. Los sistemas de vectores que proporcionan una etiqueta y un sitio de escisión para la eliminación de la etiqueta son especialmente útiles para obtener las construcciones de expresión de la presente invención.

Las HDLP y HDAC etiquetadas de la presente invención pueden purificarse mediante cromatografía de inmuno-afinidad o convencional, incluyendo, pero sin limitarse a, cromatografía utilizando lo siguiente: glutation-sefarosa^{TM} (Amersham-Pharmacia, Piscataway, Nueva Jersey), o una resina equivalente, resinas de purificación de níquel o cobalto, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, resinas hidrofóbicas, filtración en gel, resina anti-epítopo flag, cromatografía en fase reversa, etc. Después de la purificación, la HDLP y el complejo HDLP-compuesto inhibidor pueden concentrarse hasta más de 1 mg/ml para fines de cristalización. En una realización preferida, HDLP y los complejos HDLP-inhibidor se concentran hasta más de 10 mg/ml para cristalización y en una realización particularmente preferida, HDLP y los complejos HDLP-inhibidor se concentran hasta más de 20 mg/ml.

Con el fin de determinar si las HDLP purificadas de la presente invención demuestran actividad histona desacetilasa, las HDLP purificadas y también cualquier proteína relacionada con HDLP pueden ensayarse mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica para la determinación de dicha actividad. En una realización preferida, las HDLP purificadas de la presente invención se incuban en presencia de sustrato histona marcado con [^{3}H]-acetilo (Carmen et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:15837-15844) en un tampón adecuado para la detección de actividad histona desacetilasa (véase el Ejemplo 3 más adelante); se para la reacción; se extrae el acetato liberado y se determina dicho acetato liberado, como describen Henzel, et al. (J. Biol. Chem. 266:21936-21942 (1991); Ejemplo 3 más adelante). En una realización preferida, las HDLP de la presente invención se incuban en presencia de ZnCl_{2} con el fin de obtener actividad histona desacetilasa de ellas (Ejemplo 3 más adelante).

En otra realización, los cristales de la presente invención comprenden HDLP de tipo salvaje purificada (SEQ ID NO:1) y se crecen a temperatura ambiente mediante el método de difusión de vapor en gota colgante a partir de una disolución de cristalización que comprende uno o más precipitantes seleccionados del grupo que consiste en isopropanol, polietilen glicol, y terc butanol (véase el Ejemplo 2, más adelante). La disolución de cristalización puede comprender además una o más sales incluyendo sales seleccionadas del grupo que consiste en NaCl y KCl, y uno o más tampones incluyendo tampones seleccionados del grupo que consiste en Tris (tris(hidroximetil)aminometano) y bis-tris propano-Cl (1,3-bis[tris(hidroximetil)metil-amino]propano (véase el Ejemplo 2, más adelante). El pH de la disolución de cristalización es preferiblemente entre pH 5 y 9, aunque la presente invención también contempla otros valores de pH (véase el Ejemplo 2, más adelante).

Puede utilizarse cualquier técnica de cristalización conocida por los expertos en la técnica para obtener los cristales de la presente invención, incluyendo, pero sin limitarse a, cristalización discontinua, difusión de vapor (bien en gota posada o gota colgante) y microdiálisis. La siembra de los cristales puede requerirse en algunos casos para obtener cristales con calidad para rayos X. Por lo tanto, puede utilizarse micro y/o macro siembra estándar de los cristales.

Los cristales de la presente invención pueden formarse en el grupo espacial C2 con una molécula en la unidad asimétrica y siendo las dimensiones de la unidad a = 51,4 \ring{A}, b = 93,8 \ring{A}, c = 78,7 \ring{A} y \beta = 96,9º (véase el Ejemplo 2, más adelante). Los cristales de la presente invención también pueden formarse en el grupo espacial P2_{1}2_{1}2_{1} con dos moléculas en la unidad asimétrica y siendo las dimensiones de la unidad a = 53,4 \ring{A}, b = 94,4 \ring{A}, c = 156,3 \ring{A} (véase el Ejemplo 2, más adelante). Sin embargo, la presente invención contempla cristales que se forman en cualquier grupo espacial incluyendo, pero sin limitarse a, C2, P2_{1}, P2_{1}2_{1}2_{1}, P3_{1}2_{1}, P4_{3}2_{1}2_{1}, y C222_{1}. Los cristales difractan a una resolución mayor de 4 \ring{A}, preferiblemente mayor de 2,5 \ring{A}.

Para recoger los datos de difracción a partir de los cristales de la presente invención, los cristales pueden congelarse rápidamente en el tampón de cristalización utilizado para el crecimiento de dichos cristales, aunque preferiblemente con una mayor concentración del precipitante (véase, por ejemplo, el Ejemplo 2 más adelante). Por ejemplo, pero sin ser limitativo, si el precipitante utilizado fue PEG 1500 28%, los cristales pueden congelarse rápidamente en la misma disolución de cristalización que la utilizada para el crecimiento de dicho cristal en la que la concentración del precipitante se incrementa hasta el 35% (véase el Ejemplo 2, más adelante). Si el precipitante no es un crioprotector suficiente (es decir, no se forma un cristal después de la congelación rápida) pueden añadirse crioprotectores a la disolución (por ejemplo, glicerol, PEG de bajo peso molecular, alcoholes, etc) con el fin de conseguir la formación de cristal después de la congelación rápida, siempre que el crioprotector sea compatible con la conservación de la integridad de los cristales. Los cristales congelados rápidamente se mantienen a una temperatura menor de -110ºC y preferiblemente menor de -150ºC durante la recogida de los datos cristalográficos mediante difracción de rayos X. Los datos de difracción de rayos X pueden procesarse con DENZO y SCALEPACK (Otwinowski y Minor, 1997, Method Ensemble. 276:307-326) aunque puede utilizarse cualquier método conocido por los expertos en la técnica para procesar los datos de difracción de rayos X.

Con el fin de determinar la estructura atómica de HDLP según la presente invención, puede realizarse análisis por reemplazamiento isomórfico múltiple (MIR), construcción de modelos y refinamiento. Para el análisis MIR, los cristales pueden impregnarse con átomos pesados para producir derivados de átomos pesados necesarios para el análisis MIR. Tal y como se utiliza en la presente memoria, derivado de átomo pesado o derivatización se refiere al método para producir una forma modificada químicamente de un cristal de una proteína o complejo proteico en el que dicha proteína está unida específicamente a un átomo pesado en el cristal. En la práctica, un cristal se impregna en una disolución que contiene átomos o sales de metales pesados, o compuestos organometálicos, por ejemplo, cloruro de plomo, cianuro de oro, timerosal, acetato de plomo, acetato de uranilo, cloruro de mercurio, cloruro de oro, etc, que puede difundir a través del cristal y unirse específicamente a la proteína. La o las localizaciones del o de los átomos o sales de los metales pesados unidos pueden determinarse mediante análisis de difracción de rayos X del cristal impregnado. Esta información se utiliza para generar información de la fase MIR que se utiliza para construir la estructura tridimensional de las HDLP o proteínas relacionadas con HDLP cristalizadas de la presente invención. En una realización preferida, los átomos pesados comprenden timerosal, KAu(CN)_{2} y Pb(Me)_{3}OAc (véase el Ejemplo 2 más adelante). Las fases MIR pueden calcularse mediante cualquier programa conocido por los expertos en la técnica y preferiblemente con el programa MLPHARE (The CCP4 suite: Programs for computational crystallography, 1994, Acta Crystallogr. D. 50:760-763) y también puede utilizar la señal de difracción anómala del derivado timerosal. En una realización preferida, las fases MIR se calcularon a 2,5 \ring{A} y tienen una figura media de mérito de 0,55 (véase la Figura 19 y el Ejemplo 2 más adelante). Las fases pueden mejorarse cuando resulte necesario por aplanamiento del disolvente mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, mediante la utilización del programa DM (The CCP4 suite: Programs for computational crystallography, 1994, Acta Crystallogr. D. 50:760-763).

Posteriormente, puede construirse un modelo inicial de la estructura tridimensional utilizando el programa O (Jones et al., 1991, Acta Crystallogr. A 47:110-119). La interpretación y construcción de la estructura puede facilitarse además mediante la utilización del programa CNS (Brunger et al., 1998, Acta Crystallogr. D 54:905-921).

Para la determinación de la estructura del complejo HDLP-compuesto inhibidor, si el grupo espacial del cristal del complejo HDLP-compuesto inhibidor es diferente, puede utilizarse el reemplazamiento molecular utilizando una estructura conocida de apo-HDLP (tal y como se refiere en la presente memoria, apo-HDLP o apo-HDAC es la enzima no complejada con un compuesto inhibidor) o cualquier estructura conocida de complejo HDLP/inhibidor cuya estructura pueda determinarse como se ha descrito anteriormente y como se describe más adelante en el Ejemplo 2. Si el grupo espacial de los cristales de HDLP-compuesto inhibidor es el mismo, puede utilizarse refinamiento por cuerpos rígidos y diferencia de fourier para resolver la estructura utilizando una estructura conocida de apo-HDLP (tal y como se refiere en la presente memoria, apo-HDLP o apo-HDAC es la enzima no complejada con un compuesto inhibidor) o cualquier estructura conocida de complejo HDLP/inhibidor.

El término "reemplazamiento molecular" se refiere a un método que implica generar un modelo preliminar de la estructura tridimensional de los cristales de HDLP de la presente invención cuyas coordenadas de estructura no se conocen antes de la utilización del reemplazamiento molecular. El reemplazamiento molecular se consigue orientando y situando una molécula cuyas coordenadas de estructura se conocen (en este caso apo-HDLP previamente determinada) en la celda unidad como define el patrón de difracción de rayos X obtenido a partir de un cristal de HDLP o proteína relacionada con HDLP cuya estructura no se conoce para justificar lo mejor posible el patrón de difracción observado del cristal desconocido. Entonces pueden calcularse las fases a partir de este modelo y combinarse con las amplitudes observadas para proporcionar una síntesis de Fourier aproximada de la estructura cuyas coordenadas no se conocen. Esto por su parte puede someterse a cualquiera de las formas de refinamiento para proporcionar una estructura final correcta.

Puede utilizarse cualquier método conocido por el experto en la técnica para determinar la estructura mediante reemplazamiento molecular. Por ejemplo, el programa AMORE (The CCP4 suite: Programs for computational crystallography, 1994, Acta Crystallogr. D. 50:760-763) puede utilizarse para determinar la estructura de una histona desacetilasa desconocida +/- un inhibidor mediante reemplazamiento molecular utilizando las coordenadas de apo-HDLP (Figura 16). Para la determinación de la estructura del compuesto inhibidor TSA, se obtuvo la estructura de TSA a partir de la Cambridge Structural Database (Refcode TRCHST, <<http://www.ccdc.cam.ac.uk>>) puede utilizarse para definir las restricciones estereoquímicas utilizadas en el refinamiento con el programa CNS (Brunger et al., 1998, Acta Crystallogr. D 54:905-921).

La información de la estructura tridimensional y las coordenadas atómicas asociadas con dicha información estructural de HDLP son útiles para resolver la estructura de proteínas cristalizadas que pertenecen a la familia HDAC mediante reemplazamiento molecular. De manera similar, puede resolverse cualquier estructura de una proteína cristalizada que se sospecha que tiene una estructura similar a HDLP tomando como base la similitud o identidad funcional o de secuencia mediante reemplazamiento molecular con la información estructural de HDLP de la presente invención. La estructura de proteínas relacionadas con HDLP determinada mediante reemplazamiento molecular como se ha descrito anteriormente y en el Ejemplo 2 más adelante, comprende una desviación de la media cuadrática (rmsd) no mayor de 2,0 \ring{A} en las posiciones de átomos C\alpha para al menos el 50% o más de los aminoácidos de la estructura de los 375 restos de HDLP de longitud completa. Dicha rmsd puede esperarse tomando como base la identidad en la secuencia de aminoácidos. Chothia y Lesk, 1986, Embo J. 5:823-826.

Las estructuras tridimensionales refinadas de HDLP de la presente invención, específicamente apo-HDLP, mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser que comprende un átomo de cinc en el sitio activo, complejo HDLP/TSA que comprende un átomo de cinc en el sitio activo y complejo HDLP/SAHA que comprende un átomo de cinc en el sitio activo, están representadas por las coordenadas atómicas mostradas en las Figuras 16 a 19, respectivamente. El modelo refinado para apo-HDLP que comprende los aminoácidos 1-375 consiste en los restos de HDLP de tipo salvaje 2 a 373 con los restos 1, 374 y 375 no modelados y presumiblemente desordenados y se determinó a una resolución de 1,8 \ring{A}. De manera similar, el modelo refinado para el mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser que comprende un átomo de cinc en el sitio activo también consiste en los restos 2 a 373 con los restos 1, 374 y 375 no modelados y presumiblemente desordenados y se determinó a una resolución de 2,0 \ring{A}. El modelo refinado para el complejo HDLP/TSA que comprende un átomo de cinc en el sitio activo consiste en los restos 2 a 373 del mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser con los restos 1, 374 y 375 no modelados y presumiblemente desordenados, tiene TSA en el bolsillo de unión y se determinó a una resolución de 2,1 \ring{A}. El complejo HDLP/SAHA es similar al complejo HDLP/TSA pero tiene SAHA en el bolsillo de unión y se determinó a una resolución de 2,5 \ring{A}.

Para los fines de una descripción adicional de la estructura de HDLP y de proteínas relacionadas con HDLP, incluyendo, pero sin limitarse a, HDAC, a partir de los datos obtenidos de los cristales de HDLP de la presente invención, se proporciona la definición de los términos siguientes:

El término "lámina \beta" se refiere a una o más cadenas polipeptídicas (o cadenas \beta) que están alineadas entre sí y que están unidas de manera regular por enlaces de hidrógeno entre los grupos C=O y N-H de la cadena principal. Por lo tanto, todos los enlaces de hidrógeno en una lámina beta se forman entre diferentes segmentos del polipéptido. La mayoría de las láminas \beta en las proteínas son completamente paralelas (interiores de la proteína) o completamente anti-paralelas (un lado de cara al disolvente y el otro al núcleo hidrofóbico). Los enlaces de hidrógeno en las láminas antiparalelas son perpendiculares a la dirección de la cadena y están espaciados uniformemente como pares entre las cadenas. Los enlaces de hidrógeno en las láminas paralelas están inclinados respecto a la dirección de la cadena y espaciados uniformemente entre las cadenas.

El término "hélice \alpha" se refiere a la conformación helicoidal más abundante que se encuentra en las proteína globulares. La longitud media de una hélice \alpha es 10 restos. En una hélice \alpha, todos los protones amida apuntan hacia el extremo N-terminal y todos los oxígenos carbonilo apuntan hacia el extremo C-terminal. La naturaleza repetida de los pares phi, psi asegura esta orientación. Los enlaces de hidrógeno en una hélice \alpha también muestran un patrón repetido en el que el núcleo C=O del resto X (en el que X se refiere a cualquier aminoácido) se une mediante enlace de hidrógeno con el núcleo HN del resto X+4. La hélice \alpha es una estructura enrollada caracterizada por 3,6 restos por giro y con una traslación a lo largo de su eje de 1,5 \ring{A} por aminoácido. Por lo tanto, el avance por vuelta es 3,6x1,5 ó 5,4 \ring{A}. El sentido del giro de las hélices alfa es siempre a derechas.

El término "bucle" se refiere a cualquier otra conformación de aminoácidos (es decir, no una hélice, cadena o lámina). Además, un bucle puede contener interacciones de enlaces entre las cadenas laterales de los aminoácidos pero no de manera repetitiva regular.

Los restos de aminoácidos en los péptidos se referirán de aquí en adelante en la presente memoria como sigue: Fenilalanina es Phe o F; Leucina es Leu o L; Isoleucina es Ile o I; Metionina es Met o M; Valina es Val o V; Serina es Ser o S; Prolina es Pro o P; Treonina es Thr o T; Alanina es Ala o A; Tirosina es Tyr o Y; Histidina es His o H; Glutamina es Gln o Q; Asparagina es Asn o N; Lisina es Lys o K; Ácido Aspártico es Asp o D; Ácido Glutámico es Glu o E; Cisteína es Cys o C; Triptófano es Trp o W; Arginina es Arg o R; y Glicina es Gly o G. Para una descripción adicional de aminoácidos, por favor referirse a Proteins: Structure and Molecular Properties por Creighton, T.E., W.H. Freeman et al., Nueva York, 1983.

El término "aminoácido cargado positivamente" se refiere a cualquier aminoácido que tiene una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiológicas normales. Los ejemplos de aminoácidos cargados positivamente son Arg, Lys e His. El término "aminoácido cargado negativamente" se refiere a cualquier aminoácido que tiene una cadena lateral cargada negativamente en condiciones fisiológicas normales. Los ejemplos de aminoácidos cargados negativamente son Asp y Glu. El término "aminoácido hidrofóbico" se refiere a cualquier aminoácido que tiene una cadena lateral no cargada, no polar que es relativamente insoluble en agua. Los ejemplos de aminoácidos hidrofóbicos son Ala, Leu, Ile, Gly, Val, Pro, Phe, Trp y Met. El término "aminoácido hidrofílico" se refiere a cualquier aminoácido que tiene una cadena lateral no cargada polar que es relativamente soluble en agua. Los ejemplos de aminoácidos hidrofílicos son Ser, Thr, Tyr, Asp, Gln y Cys. El término "aminoácido aromático" se refiere a cualquier aminoácido que comprende una estructura de anillo. Los ejemplos de aminoácidos aromáticos son His, Phe, Trp y Tyr.

El término "sistema de relé de carga" se refiere a una ordenación His-Asp como describen Fersht y Sperling, 1973, J. Mol. Biol. 74:137-149; Blow et al., 1969, Nature 221:337-340.

La información obtenida a partir de las estructuras tridimensionales de la presente invención revelan que HDLP tiene una estructura de dominio único que pertenece a la clase de plegamientos abierta \alpha/\beta (véase, por ejemplo, Branden, 1980, Q. Rev. Biophys. 13: 317-38). En las Figuras 4A y 4B se muestran dos vistas ortogonales de la estructura tridimensional global de HDLP. La estructura de HDLP tiene una lámina \beta paralela central de ocho cadenas (las cadenas están organizadas como \beta2-\beta1-\beta3-\beta8-\beta7-\beta4-\beta5-\beta6) y dieciséis hélices \alpha (marcadas \alpha1 a \alpha16, respectivamente). Véase la Figura 4C. Cuatro de las hélices se agrupan en cada lado de la lámina \beta (\alpha7, \alpha8, \alpha9, \alpha10 y \alpha11, \alpha12, \alpha13, \alpha14) formando el núcleo de estructura \alpha/\beta característico de esta clase de plegamientos. La mayoría de las ocho hélices restantes se sitúan cerca de un lado de la lámina \beta, cerca de las cadenas \beta2-\beta1-\beta3-\beta8. A partir de los extremos C-terminales de las cadenas \beta se originan bucles grandes bien definidos (Bucles L1-L7; Figura 4C). Las hélices extra y los bucles grandes L1-L7 están asociados con una extensión significativa de la estructura más allá del resto de núcleo \alpha/\beta. Esta extensión de la estructura da lugar a dos características estructurales destacadas: un bolsillo profundo estrecho y una cavidad interna adyacente al bolsillo. Estas dos características de la arquitectura comprenden el sitio activo (véase la Figura 5). La estructura de las proteínas relacionadas con HDLP (por ejemplo, HDAC) también puede comprender la estructura característica \alpha/\beta conservada.

El término "sitio activo" comprende cualquiera o todos los sitios siguientes en HDLP, el sitio de unión del sustrato, el sitio en el que se produce la escisión de un grupo acetilo de un sustrato o el sitio al que se une un inhibidor de la familia HDAC o, más particularmente, HDLP. El sitio activo, tal y como se refiere en la presente memoria, comprende Asp166, Asp258, His170, Tyr297, His131, His132, Asp168, Asp173, Phe141, Phe198, Leu265, Pro22 y Gly140 y también un metal unido al fondo del bolsillo por Asp173, Asp168 e His definido por las coordenadas listadas en las Figuras 16 a 19 con una rmsd de 2,0 \ring{A}. El metal que se une al fondo del bolsillo será un catión divalente seleccionado del grupo que consiste en cinc, cobalto o manganeso.

El bolsillo profundo estrecho tiene una forma semejante a un tubo con una profundidad de \sim 11 \ring{A}. La abertura del bolsillo se estrecha hasta la mitad hasta \sim 4,5 por 5,5 \ring{A} y se vuelve más ancho en el fondo (véase la Figura 5A). El bolsillo y sus alrededores cercanos están constituidos por los bucles L1 a L7.

Las paredes del bolsillo están cubiertas con cadenas laterales de restos hidrofóbicos y aromáticos (Pro22, Tyr91 cerca de la entrada; y Gly140, Phe141, Phe198, Leu265 y Tyr297 más abajo; Figura 5B). Para la numeración de los aminoácidos por favor referirse a SEQ ID NO:1. Son particularmente interesantes Phe141 y Phe198, cuyos grupos fenilo están enfrentados entre sí en paralelo a una distancia de 7,5 \ring{A}, marcando la parte más fina del bolsillo (véase la Figura 5B). Es particularmente interesante que sólo un resto del bolsillo es diferente en HDAC1 cuando se alinean las secuencias (el alineamiento puede lograrse utilizando el programa DNAstar^{TM} MegAlign^{TM}, Madison, WI), siendo este resto Glu98 de HDAC1 que es Tyr91 en HDLP. La estructura revela que este resto en HDLP está mayoritariamente expuesto al disolvente.

Cerca del fondo del bolsillo del sitio activo en su punto más estrecho, está localizado un ion cinc (véase la Figura 6A). Con el fin de obtener el cinc en la estructura, los cristales pueden impregnarse con cinc (por ejemplo, ZnCl_{2}) o co-cristalizarse en presencia de cinc. El ion cinc está coordinado por Asp168 (O\delta1, 2,1 \ring{A}), His170 (N\delta1, 2,1 \ring{A}), Asp258 (O\delta1, 1,9 \ring{A}) y una molécula de agua (2,5 \ring{A}). Véanse las Figuras 5B y 6B. Los restos de aminoácidos que coordinan cinc están organizados en una geometría tetraédrica, pero la posición de la molécula de agua, que también está unida por enlace de hidrógeno a His131, se desvía de esta geometría \sim25º.

Además de los ligandos de cinc, el fondo del bolsillo contiene dos histidinas (His131 e His132), dos ácidos aspárticos (Asp166 y Asp173) y una tirosina (Tyr297). Véanse las Figuras 5B y 10B. Cada una de las histidinas forma un enlace de hidrógeno a través de su N\delta1 con un oxígeno carboxilato del ácido aspártico, con el oxígeno localizado en el plano del anillo de imidazol (Figura 5B). Esta organización His-Asp es característica del sistema de relé de carga presente en los sitios activos de las proteasas de serina, en los que sirve para polarizar el N\varepsilon del imidazol y para incrementar su basicidad. Fersht y Sperling, 1973, J. Mol. Biol. 74:137-149; Blow et al., 1969, Nature 221:337-340.

El par de relé de carga Asp166-His131 (de aquí en adelante en la presente memoria referido como "relé de carga enterrado") está situado aún más profundamente en el bolsillo y más escondido si se compara con el relé de carga Asp173-His132 (de aquí en adelante en la presente memoria referido como "relé de carga expuesto") que está parcialmente expuesto al disolvente. El relé de carga enterrado forma un enlace de hidrógeno (2,6 \ring{A}) con la molécula de agua unida a cinc referida anteriormente y este enlace de hidrógeno podría contribuir a la desviación de la coordinación agua-cinc de la geometría ideal (Figura 5B). El relé de carga expuesto está dirigido a un punto que está \sim 2,5 \ring{A} alejado de la molécula de agua y más cerca de la superficie.

La Tyr297 está situada al lado del cinc, opuesta a donde están localizados los dos relés de carga. El grupo hidroxilo de la Tyr se encuentra 4,4 \ring{A} alejado del átomo de cinc y no tiene interacciones con el resto de la proteína (Figura 5B). Al lado de la Tyr297, existe una abertura en la pared del bolsillo que da lugar a la cavidad interna adyacente.

El suelo de la cavidad interna está formado por partes de los bucles L3 y L7 que salen de las cadenas \beta y el techo está formado por el segmento \alpha1-L1-\alpha2. El bucle L1 parece más flexible que los otros bucles de la estructura. Esto puede permitir el intercambio transitorio de los contenidos de la cavidad con el disolvente.

La cavidad está formada mayoritariamente por restos hidrofóbicos y es particularmente rica en restos de glicina (Ala127, Gly128, Gly129, Met130, y Phe141 de L3; Gly293, Gly294, Gly295 y Gly296 de L7; y Tyr17, Pro22 y Leu23 de L1). Sólo hay dos restos cargados en la cavidad (Arg27 e His21) y éstos proceden del bucle L1.

La cavidad puede proporcionar espacio para la difusión del producto acetato fuera del centro catalítico, que puede por otra parte reunirse y protegerse durante la desacetilación frente al disolvente cuando se une el sustrato. Dicha función de la cavidad se ve reforzada por la observación de que la cavidad contiene tres moléculas de agua y dos de isopropanol (del tampón de cristalización) en la estructura de 1,8 \ring{A} de la apo-proteína. La cavidad también puede unir otro cofactor, además del cinc, para facilitar la actividad enzimática de HDLP. Un mecanismo catalítico propuesto para la desacetilación se proporciona en la Figura 8.

La estructura de HDLP tal y como se define por la presente invención, junto a la homología de secuencia de HDAC1, muestra que la proteína HDLP de 375 aminoácidos corresponde al núcleo catalítico de la histona desacetilasa que se conserva en la familia HDAC (véase la Figura 2). El 35,2% de identidad de secuencia entre HDLP y HDAC1 predice una similitud estructural con una rmsd en las posiciones C\alpha de \sim 1,5 \ring{A}. Chothia y Lesk describen la relación entre la divergencia de secuencia y la estructura de proteínas en Embo J. 5:823-826 (1986). El extremo C-terminal de 40 restos de HDLP tiene probablemente una estructura divergente ya que esta región tiene una menor homología con HDAC1, mientras que la hélice \alpha16 en esta región es parte del plegamiento central abierto \alpha/\beta conservado y HDAC1 comprende probablemente una hélice similar. Sin embargo, aunque esta región C-terminal es divergente, esta región está fuera del sitio activo y es probable que no afecte a la estructura del sitio activo. Además del extremo C-terminal del núcleo catalítico de la histona desacetilasa, los miembros de la familia HDAC son divergentes en longitud y secuencia. En la familia HDAC, esta región (restos de aminoácidos \sim390-482) es muy polar, llena de restos ácidos y probablemente es flexible o está débilmente plegada.

La homología HDLP-HDAC se centra mayoritariamente en el núcleo hidrofóbico y en los bucles L1-L7, presentando partes de los bucles que forman el bolsillo y la cavidad adyacente el mayor grado de conservación en la secuencia de los restos de aminoácidos (Figura 9A y 9B). Específicamente, todos los restos polares del sitio activo (los ligandos de cinc, los dos sistemas de relés de carga, y Tyr297) y los restos hidrofóbicos que forman las paredes del bolsillo (Gly140, Phe141, Phe198 y Leu265) son idénticos. Entre los restos que forman la cavidad interna, los más cercanos al sitio activo son idénticos o están sustituidos de manera conservativa (por ejemplo, Leu23 \rightarrow Met y Met130 \rightarrow Leu). Los restos de la superficie alrededor del bolsillo están conservados en menor grado aunque presentan una identidad de secuencia mayor del 35%.

La información obtenida a partir de las estructuras de cristal del complejo HDLP unida al inhibidor de la presente invención revela una información detallada que es útil en el diseño, aislamiento, cribado y determinación de compuestos inhibidores potenciales que pueden inhibir los miembros de la familia HDLP/HDAC. Como se ha descrito anteriormente, la estructura de HDLP consiste en una lámina \beta paralela con hélices \alpha agrupadas frente a ambas caras (Figura 4A, 4B y 4C). En un extremo de la lámina \beta, 7 bucles (L1-L7) forman un bolsillo estrecho semejante a un tubo que están formados por restos hidrofóbicos y que comprenden un sitio de unión de cinc, varias cadenas laterales polares, incluyendo dos relés de carga Asp-His. La mutación de los ligandos de cinc y de otros restos polares del fondo del bolsillo reduce o elimina la actividad catalítica.

Los presentes inventores han encontrado que la mutación en el sitio Tyr297Phe reducía la actividad. Véanse también, Hassig et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3519-3524; Kadosh y Struhl, 1998, Genes Dev. 12:797-805. La eliminación de la actividad mediante la mutación de estos restos indica que esta región es el sitio activo de la enzima. Adyacente al sitio activo, hay una cavidad interna que puede proporcionar espacio para la difusión del producto acetato de la reacción. La homología en el sitio activo entre HDLP y HDAC1, como se ha descrito anteriormente, indica que comparten una homología estructural y funcional.

El compuesto inhibidor, tricostatina A (TSA) (Tsuji et al., 1976, J. Antibiotics 29:1-6) une HDLP insertando su cadena alifática larga, que tiene un grupo ácido hidroxámico en un extremo, en el bolsillo (Figura 6A, 6B y 6C). La cadena alifática realiza múltiples contactos en la parte hidrofóbica del bolsillo. El ácido hidroxámico alcanza el fondo polar del bolsillo en el que coordina el cinc de una manera bidentada y también forma enlaces de hidrógeno con los restos polares en el sitio activo, incluyendo las histidinas del sistema de relé de carga. El grupo dimetilamino-fenilo aromático en el otro extremo de la cadena de TSA contacta en la entrada del bolsillo y sirve para cubrirlo. Los restos de aminoácidos de HDLP que se ponen en contacto con TSA están conservados en HDAC, lo que indica que TSA se une a e inhibe HDAC de una manera similar a HDLP.

En el complejo, el ácido hidroxámico, la mayor parte de la cadena alifática y parte del grupo dimetilamino-fenilo de TSA están enterrados (60% del área de la superficie de TSA; Figura 6A). El grupo ácido hidroxámico se une al cinc de una manera bidentada formando enlaces mediante sus grupos carbonilo (2,4 \ring{A}) e hidroxilo (2,2 \ring{A}) lo que resulta en un Zn^{2+} penta-coordinado (Figura 6B y 6C). El grupo hidroxilo del ácido hidroxámico reemplaza a la molécula de agua que se une al cinc en la estructura apo-HDLP descrita anteriormente. El ácido hidroxámico también se une con enlaces de hidrógeno a las dos histidinas del sistema de relé de carga (oxígeno del hidroxilo a His131 N\varepsilon2, 2,8 \ring{A}; y nitrógeno a His132 N\varepsilon2, 2,8 \ring{A}) y el grupo hidroxilo de Tyr297 (2,4 \ring{A}; Figura 6B y 6C).

La cadena de alqueno ramificada de 5 carbonos de longitud de TSA se ajusta perfectamente a la parte estrecha del bolsillo realizando múltiples contactos de van der Waals con todos los grupos hidrofóbicos que forman el bolsillo (Figura 6B y 6C). Cerca de su parte central, la cadena contiene un enlace doble carbono-carbono sustituido con metilo que se encuentra entre los grupos fenilo de Phe141 y Phe98 en el punto más ajustado del bolsillo (Figura 6A y 6B). La longitud de la cadena de alqueno parece óptima para abarcar la longitud del bolsillo y permitir contactos tanto en el fondo como en la entrada del bolsillo, aunque el grupo de cubierta de Fórmula (I) puede proporcionar la longitud para abarcar el bolsillo permitiendo una cadena alqueno más corta (cadena alifática).

En la entrada del bolsillo, una cara de la estructura planar formada por el dimetilamino-fenilo y grupos carbonilo adyacentes de TSA se pone en contacto en el borde del bolsillo (Pro22, Tyr91, Phe141; Figura 6B y 6C). Este empaquetamiento se facilita por el ángulo de aproximadamente 110º en la estructura global de TSA en la unión de la cadena alifática y el grupo dimetilamino-fenilo (que se produce en el carbono C8 hibridado en sp^{3}). Después de la unión de TSA, la cadena lateral de Tyr91, que está mayoritariamente expuesta al disolvente, cambia su conformación para hacer espacio al grupo dimetilamino-fenilo. Este es el único cambio observado cerca del sitio activo después de la unión de TSA.

El grupo ácido hidroxámico es un resto habitual en los inhibidores de metaloproteasas dependientes de cinc. Véanse, la Patente de EEUU No. 5.919.940 y 5.917.090; Véanse también, Grams et al., 1995, Biochemistry 34:14012-14020; Lovejoy et al., 1999, Nat. Struct. Biol. 6:217-221; y Holmes y Matthews, 1981, Biochemistry 20:6912-6920. Al igual que TSA, estos inhibidores también coordinan el cinc del sitio activo de una manera bidentada utilizando sus oxígenos hidroxilo y carbonilo hidroxamato, reemplazan la molécula de agua nucleofílica por sus grupos hidroxilo hidroxamato y forman enlaces de hidrógeno con la base general (Grams et al., 1995, Biochemistry 34:14012-14020; Lovejoy et al., 1999, Nat. Struct. Biol. 6:217-221; y Holmes y Matthews, 1981, Biochemistry 20:6912-6920).

SAHA, que tiene una actividad inhibidora \sim30 veces menor que TSA (Richon et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3003-3007) une HDLP de manera similar a TSA (véase, por ejemplo, la Figura 4D). El grupo ácido hidroxámico de SAHA realiza los mismos contactos con el cinc y los restos del sitio activo, y la importancia de estas interacciones está recalcada por la pérdida de actividad de los derivados de SAHA que no tienen el grupo hidroxámico (Richon et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3003-3007). La cadena alifática de seis carbonos de longitud de SAHA se empaqueta en la parte hidrofóbica semejante a un tubo del bolsillo. Sin embargo, comparada con TSA la cadena alifática de SAHA no se ajusta tan perfectamente y realiza menos contactos de van der waals, en parte, debido a que SAHA no contiene la rama de grupo metilo C15 de TSA. SAHA tampoco presenta los enlaces dobles de TSA en esta región y esto puede dar lugar a una flexibilidad incrementada de la cadena alifática. El grupo de cubierta de SAHA consiste en un grupo fenil-amino cetona. En la estructura del cristal, el grupo fenilo tiene una densidad electrónica menor, lo que sugiere que no se ajusta tan bien como el grupo de cubierta de TSA. Esto puede deberse a una separación mayor entre los grupos hidroxámico y de cubierta de SAHA comparada con la de TSA (comparar TSA, Fórmula (II) y SAHA, Fórmula (III), a continuación).

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La determinación de la estructura de HDLP y de HDLP unida a un compuesto inhibidor ha permitido, por primera vez, la identificación del sitio activo de HDLP y de proteínas relacionadas con HDLP, tales como las proteínas que pertenecen a la familia HDAC.

La información de la estructura tridimensional y de las coordenadas atómicas asociadas con dicha información estructural de HDLP unida a un compuesto inhibidor es útil para el diseño racional de fármacos proporcionando un método para identificar compuestos inhibidores que se unen a e inhiben la actividad enzimática de HDLP, proteínas de la familia HDAC y otras proteínas semejantes a la histona desacetilasa relacionadas con HDLP. Dicho método para identificar dicho inhibidor potencial para una enzima que comprende actividad desacetilasa comprende las etapas de (a) utilizar una estructura tridimensional de HDLP como se define por sus coordenadas atómicas listadas en las Figuras 16 a 19; (b) utilizar dicha estructura tridimensional para diseñar o seleccionar dicho inhibidor potencial; (c) sintetizar dicho inhibidor potencial; (d) poner en contacto dicho inhibidor potencial con dicha enzima en presencia de un sustrato acetilado; y (e) determinar la capacidad de dicho inhibidor para inhibir dicha actividad desacetilasa.

Los inhibidores potenciales de HDLP y relacionadas con HDLP (por ejemplo, HDAC) identificados mediante el método de la presente invención están representados por la fórmula (I)

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en la que X comprende un grupo de cubierta que se une a al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en prolina y leucina; Y comprende un grupo de cadena alifática que se une a al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en leucina, fenilalanina y glicina; y Z comprende un grupo de unión del sitio activo que se une a al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido aspártico, tirosina e histidina y en el que Z puede unirse además a un átomo de cinc y con la condición de que el compuesto de Fórmula (I) no es TSA, trapoxina, SAHA, derivados de SAHA descritos en las Patentes de EEUU Nos. 5.608.108; 5.700.811; 5.773.474; 5.840.960 y 5.668.179.

La presente invención permite la utilización de técnicas de diseño molecular para diseñar, identificar y sintetizar entidades y compuestos químicos, incluyendo compuestos inhibidores, capaces de unirse al sitio activo de HDLP y proteínas relacionadas con HDLP. Las coordenadas atómicas de apo-HDLP y HDLP unida a un inhibidor pueden utilizarse junto con modelado computacional utilizando un programa de acoplamiento ("docking") tal como GRAM, DOCK, HOOK o AUTODOCK (Dunbrack et al., 1997, Folding & Design 2:27-42) para identificar inhibidores potenciales de HDLP y proteínas relacionadas con HDLP (por ejemplo, HDAC1). Este procedimiento puede incluir el ajuste por ordenador de inhibidores potenciales al sitio activo de HDLP para descubrir el grado de complementación de la forma y la estructura química del inhibidor potencial con el sitio activo o para comparar los inhibidores potenciales con la unión de TSA o SAHA en el sitio activo. Véanse, Bugg et al., 1998, Scientific American Diciembre:92-98; West et al., 1995, TIPS 16:67-74. Los inhibidores potenciales diseñados mediante modelado con un programa de acoplamiento se ajustan a la fórmula general (I) como se ha descrito anteriormente. También pueden utilizarse programas informáticos para estimar la atracción, repulsión y los impedimentos estéricos de HDLP y del compuesto inhibidor potencial. Generalmente, cuanto más perfecto es el ajuste menor son los impedimentos estéricos mayores las fuerzas de atracción y mayor es la especificidad que son características importantes para un compuesto inhibidor específico que interacciona más probablemente con HDLP y proteínas relacionadas con HDLP que con otras clases de proteínas. Estas características se desean particularmente cuando el compuesto inhibidor es un fármaco antitumoral
potencial.

Los compuestos de la presente invención también pueden diseñarse mediante la inspección visual de la estructura tridimensional para determinar inhibidores de la desacetilasa más eficaces. Este tipo de modelado puede referirse como diseño de fármacos "manual". El diseño de fármacos manual puede utilizar la inspección y el análisis visual utilizando un programa de visualización de gráficos tal como "O" (Jones, T.A., Zhou, J.Y., Cowan, S.W., y Kjeldgaard, M., Improved method for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models, Acta Crystallog., A47, 100-119).

Los compuestos inhibidores potenciales pueden seleccionarse inicialmente por su similitud estructural respecto a los constituyentes X, Y y Z de la fórmula (I) mediante diseño de fármacos manual. El análogo estructural diseñado de esta manera puede modificarse entonces mediante programas de modelado informático para definir mejor los candidatos que probablemente sean más eficaces. La reducción del número de candidatos potenciales es útil ya que puede no resultar posible sintetizar y cribar un número incontable de variaciones de compuestos que pueden tener alguna similitud con moléculas inhibidoras conocidas. Dicho análisis se ha mostrado eficaz en el desarrollo de inhibidores de la proteasa de VIH (Lam et al., 1994, Science 263:380-384; Wlodawer et al., 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:543-585; Appelt, 1993, Perspectives in Drug Discovery and Design 1:23-48; Erickson, 1993, Perspectives in Drug Discovery and Design 1:109-128). Alternativamente, el cribado aleatorio de una biblioteca de moléculas pequeñas podría dar lugar a inhibidores potenciales cuya actividad inhibidora puede analizarse mediante modelado computacional como se ha descrito anteriormente para determinar mejor su eficacia como inhibidores.

Los compuestos diseñados utilizando la información de la presente invención pueden ser inhibidores competitivos o no competitivos. Estos inhibidores diseñados pueden unirse a todo o parte del sitio activo de HDLP y pueden ser más potentes, más específicos, menos tóxicos y más eficaces que los inhibidores conocidos de HDLP y proteínas relacionadas con HDLP y particularmente HDAC. Los inhibidores diseñados también pueden ser menos potentes pero pueden tener una vida media mayor in vivo y/o in vitro y, por lo tanto, ser más eficaces inhibiendo la actividad histona desacetilasa in vivo y/o in vitro durante periodos de tiempo prolongados. Dichos inhibidores diseñados son útiles para inhibir la actividad histona desacetilasa de HDLP y proteínas relacionadas con HDLP (por ejemplo, HDAC1), para inhibir el crecimiento celular in vitro e in vivo y pueden ser particularmente útiles como agentes
antitumorales.

La presente invención también permite la utilización de técnicas de diseño molecular para cribar por medios informáticos bases de datos de moléculas pequeñas para localizar entidades o compuestos químicos que puedan unirse a HDLP de una manera análoga a la de TSA y SAHA como se ha definido por la estructura de la presente invención. Dicho cribado informático puede identificar varios grupos que pueden definirse como "X", "Y" o "Z" de fórmula (I) anterior y que pueden utilizarse para sintetizar los inhibidores potenciales de la presente invención que comprende la fórmula (I). Dichos inhibidores potenciales pueden ensayarse para determinar su actividad inhibidora de histona desacetilasa en un ensayo de actividad histona desacetilasa (véase el Ejemplo 3 más adelante), pueden co-cristalizarse con HDLP para determinar las características de unión mediante técnicas cristalográficas con rayos X como se ha definido anteriormente (por ejemplo, dicha estructura de co-cristal puede determinarse mediante reemplazamiento molecular para evaluar las características de unión de dicho inhibidor potencial) o puede evaluarse tomando como base la actividad de unión incubando dicho inhibidor potencial con dicha HDLP, realizando una filtración en gel para separar cualquier inhibidor potencial libre del inhibidor unido a HDLP y determinando la cantidad de actividad histona desacetilasa de HDLP unida al inhibidor. Para determinar las constantes de la unión (por ejemplo, Kd), pueden utilizarse métodos conocidos por los expertos en la técnica tales como análisis Biacore^{TM}, calorimetría isotérmica de titulación, Elisa con un fármaco conocido en la placa para mostrar unión competitiva o mediante un ensayo de actividad desacetilasa.

El diseño de inhibidores potenciales de la presente invención se facilita adicionalmente mediante referencia a la Figura 9, que es una figura de la representación de la superficie que muestra los surcos de la superficie. El análisis de dichos surcos permite una mejor comprensión de los constituyentes del grupo de cubierta de fórmula (I). Los surcos de la superficie están marcados surco A, surco A', surco B y surco C, a los que pueden unirse grupos de cubierta adicionales. La estructura de HDLP unida a TSA o a SAHA muestra que los grupos de cubierta de TSA y SAHA se unen al surco A. Mediante análisis de la identidad de la secuencia de aminoácidos de HDLP y HDAC, el Surco A está conservado en HDAC, tiene un componente hidrofóbico significativo, se encuentra lo suficientemente profundo como para permitir interacciones significativas y es también el mayor de los cuatro surcos. Además del grupo dimetilamino-fenilo de TSA, el surco A puede ajustar aproximadamente 200 dalton de grupos (por ejemplo, el surco A podría acomodar un grupo semejante al naftaleno después de un espaciador apropiado, etc.). El Surco A, tal y como se refiere en la presente memoria, se caracteriza por los restos conservados siguientes de HDLP: His21, Pro22, Lys24, Phe141, Leu265 y Phe335. La periferia del surco A comprende restos no conservados. Además, el Surco A', tal y como se refiere en la presente memoria, comprende mayoritariamente restos no conservados.

El surco B es adyacente al bolsillo. Es significativo que el fondo del surco B comprende el nitrógeno N epsilon de His170, que coordina el cinc a través de su nitrógeno N delta. Puede conseguirse una energía de unión significativa mediante el contacto del protón N\varepsilon de His 170 con un ácido carboxílico o un grupo sulfato. Además, el surco B puede ser lo suficientemente grande como para acoplar un grupo fenilo, cuya superficie puede comprender una carga negativa parcial que puede agruparse sobre el protón N epsilon de His170. Los restos conservados del surco B, tal como se refieren en la presente memoria, son: His170, Tyr196 y Leu265.

El surco C no está tan conservado como los otros dos surcos y los restos de aminoácidos que comprenden el surco C son mayoritariamente polares y expuestos al disolvente. El surco C, tal y como se refiere en la presente memoria, comprende los restos conservados siguientes: Asn87, Gly140 y Phe198.

Los compuestos de la presente invención están representados por la fórmula (I):

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Los ejemplos de constituyentes X adecuados en los que X comprende un grupo de cubierta pueden describirse en tres categorías, dependiendo de hacia qué superficie de surco A, A', B y/o C estén dirigidos. El grupo de cubierta puede comprender las tres categorías en el mismo compuesto. Puede resultar particularmente beneficioso reemplazar el grupo de cubierta de TSA o SAHA por una estructura grande y rígida. Los ejemplos no limitativos de grupos de cubierta adecuados (X) de fórmula (I) que pueden unirse al surco A son: (1) unir un conector 1-3 metilo seguido de un grupo fenilo o naftaleno de la posición para o meta del grupo fenilo de SAHA representado por la fórmula
(IV):

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(2) unir un conector 2-3 metilo seguido de un grupo fenilo o naftaleno de la posición meta del grupo de cubierta fenilo de TSA o del grupo dimetil amino de TSA representado por la fórmula (V):

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y el que puede unirse al surco B es un grupo espaciador 1-3 metilo seguido de un grupo carboxilato, sulfato o fenilo como se representa en la fórmula (VI):

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Respecto al grupo alifático (Y), el diámetro del bolsillo sugiere que puede ajustarse una "cadena lateral" metilo más, además del grupo metilo C15 en el carbono C10. Los ejemplos no limitativos adecuados para los constituyentes Y en los que Y comprende un grupo de cadena alifática son como sigue: (1) añadir un grupo metilo a TSA en el carbono C12 (con o sin un grupo metilo en el carbono C10 y con o sin enlaces dobles y sustituyendo o no los constituyentes X y/o Z de la fórmula (I) como se representa por la fórmula (VII):

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(2) añadir un grupo metilo a TSA en el carbono C9 (con o sin un grupo metilo en el carbono C10; con o sin ambos o alguno de los enlaces dobles, y sustituyendo o no los constituyentes de fórmula (I) X y/o Z como se representa por la fórmula (VIII):

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(3) reemplazar los dos enlaces dobles alqueno de TSA por sólo uno entre C10 y C11, lo que puede liberar la torsión de C11 y C12 para permitir un ajuste mejor, pudiendo también estar sustituidos los grupos X y/o Z como se representa por la fórmula (IX):

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(4) ciclar los carbonos C15 y C12 de TSA mediante un átomo de azufre (o átomo de nitrógeno), pudiendo también estar sustituidos los grupos X y/o Z como se representa por la fórmula (X):

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(5) extender desde el carbono C9 de TSA de manera que la extensión se aproxime y/o penetre en el surco B (véase la Figura 9); haciendo C9 sp3 de manera que tenga algo de libertad; unir a C9 un grupo espaciador 1-3 metilo que puede incluir un enlace doble y unir a éste un grupo carboxilato, sulfato, hidroxilo o fenilo que puede interaccionar con el protón N epsilon de His170 que puede coordinar el átomo de cinc como se representa por la fórmula (XI):

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(6) extender el carbono C8 (reemplazando C14) de TSA de manera que la extensión se aproxime o penetre en el surco B; unir un grupo espaciador 1-3 metilo (que puede incluir un enlace doble) y después unir a éste un grupo carboxilato, sulfato, hidroxilo o fenilo de manera que se realice una interacción con el protón N epsilon de His170 que coordina el átomo de cinc; pudiendo también estar sustituidos los grupos X y/o Z como se representa por la fórmula (XII):

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(7) sustituir el carbono C8 en el extremo de la cadena alifática de manera que la sustitución pueda contactar el surco A, A', B y/o C, en dicho ejemplo, puede requerirse o no un grupo de cubierta (X) y los constituyentes X y Z también pueden estar sustituidos como se representa por la fórmula (XIII):

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(8) las fórmulas VII a XIII anteriores en las que la cadena alifática comprende además un grupo metilo entre el grupo de unión del sitio activo (Z) y el carbono C8 y preferiblemente justo antes del carbono C8, incrementándose la distancia entre X y Z, (9) hacer la conexión entre la cadena alifática y el grupo de cubierta más rígida (por ejemplo, cerrando un anillo de 6 miembros que puede comprender o no oxígeno, pudiendo también estar sustituidos los grupos X y Z como se representa por la fórmula (XIV):

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y (10) combinar dos o más de los cambios mostrados por las fórmulas (VII-XIV).

Además, los ejemplos no limitativos de grupos Z adecuados en los que Z comprende un grupo de unión al sitio activo son como sigue: (1) ácido hidroxámico, (2) ácido carboxílico, (3) sulfonamida, (4) acetamida, (5) epoxicetona, (6) un éster con un conector metilo y un grupo hidroxilo de éster acetato para entrar en la cavidad e interaccionar con una arginina conservada (Arg27) como se representa por la fórmula (XV):

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y (7) una alfacetona como se representa por la fórmula (XVI):

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Además, otros constituyentes X, Y y Z adecuados pueden preverse por el experto en la técnica dada la información de la estructura tridimensional de la presente invención.

Después de haber determinado los constituyentes adecuados potenciales X, Y y Z, los constituyentes se combinan para formar un compuesto de fórmula (I) utilizando técnicas de química combinatoria. Esto puede conseguirse según las Patentes de EEUU Nos. 5.608.108; 5.700.811; 5.773.474; 5.840.960 y 5.668.179, incorporadas en la presente memoria por referencia. Puede utilizarse cualquier método conocido por el experto en la técnica para sintetizar los compuestos de fórmula (I) que comprenden los constituyentes X, Y y Z determinados mediante los métodos descritos anteriormente.

Como se ha mencionado anteriormente, los compuestos de fórmula (I) son útiles para inhibir la actividad histona desacetilasa de HDLP y de proteínas relacionadas con HDLP. Dicha inhibición puede permitir la reducción o el cese del crecimiento celular in vitro e in vivo.

Para la utilización in vitro, dicha reducción o cese del crecimiento celular es útil para estudiar la función de la desacetilación de histonas y la diferenciación durante el ciclo celular y también para estudiar otros mecanismos asociados con la parada del ciclo celular y particularmente cómo la represión de la transcripción está implicada en la progresión del ciclo celular que pueden ser estudios en un sistema modelo de levaduras tal como el descrito por Kadosh y Struhl, 1998, Mol. Cell. Biol. 18:5121-5127. Los sistemas modelo in vitro que pueden utilizarse para estudiar los efectos de inhibidores potenciales en la progresión del ciclo celular y también en el crecimiento de tumores incluyen los descritos por: Richon et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3003-3007; Yoshida et al., 1995, Bioessays 17:423-430; Kim et al., 1999, Oncogene 18:2461-2470; Richon et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5705-5708; y Yoshida et al., 1987, Cancer Res. 47:3688-3691.

Para la utilización in vivo, dicha reducción o cese del crecimiento celular es útil para estudiar el efecto de dichos compuestos inhibidores en sistemas modelo de animales no humanos de cáncer y también es útil para el tratamiento de cáncer en un receptor que necesita dicho tratamiento. Los ejemplos no limitativos de animales que pueden servir como sistemas modelo de animales no humanos incluyen ratones, ratas, conejos, pollos, ovejas, cabras, vacas, cerdos y primates no humanos. Véanse, por ejemplo, Desai et al., 1999, Proc. AACR 40: abstract #2396; Cohen et al., 1999, Cancer Res., enviado. Los compuestos de la presente invención pueden administrarse a un animal no humano transgénico en el que dicho animal ha desarrollado cáncer tales como los modelos de animales en los que el animal tiene propensión a desarrollar cáncer (por ejemplo, sistemas modelo de animales descritos en las Patentes de EEUU 5.777.193, 5.811.634, 5.709.844, 5.698.764 y 5.550.316). Dichos sistemas modelo de animales pueden permitir la determinación de la toxicidad y de la eficacia en la reducción de tumores de los compuestos de la presente invención.

Un compuesto preferido de la presente invención puede comprender una actividad específica alta para HDLP y proteínas relacionadas con HDAC, una buena biodisponibilidad cuando se administra oralmente, actividad en la reducción o cese del crecimiento celular en líneas celulares de tumores y actividad en la reducción o cese del crecimiento tumoral en modelos de animales de varios cánceres.

De acuerdo con esto, otro aspecto de esta invención es un método para erradicar o manejar cáncer en un receptor, que puede ser un animal y es preferiblemente un ser humano. Dicho método comprende administrar a dicho receptor una cantidad reductora de tumores de un compuesto como se define por la fórmula (I) anterior o una sal de éste aceptable fisiológicamente.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición que comprende el compuesto de fórmula (I) y un excipiente o vehículo. La administración de los agentes anteriores puede ser local o sistémica. Dichos vehículos incluyen cualquier disolución fisiológica o dispersante o semejantes adecuados. Las disoluciones fisiológicas incluyen cualquier disolución o medio de dispersión aceptable, tal como disolución salina, o disolución salina tamponada. El vehículo también puede incluir agentes antibacterianos o antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y semejantes. Excepto que cualquier medio convencional, vehículo o agente sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su utilización en las composiciones.

Las rutas de administración para las composiciones que contienen las construcciones vehículo de administración de la presente invención incluyen cualquier ruta convencional y aceptable fisiológicamente, tales como, por ejemplo, las rutas de administración oral, pulmonar, parenteral (inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o subcutánea), inhalación (a través de una formulación de polvo fino o un vapor fino), transdérmica, nasal, vaginal, rectal o sublingual y puede formularse en formas de dosificación apropiadas para cada ruta de administración.

Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar más claramente los aspectos de la invención y no se pretende que limiten el alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Producción y Purificación de las Proteínas

HDLP de tipo salvaje de longitud completa (número de registro Genbank AE000719) se subclonó a partir de una preparación de ADN cromosómico de Aquifex aeolicus (proporcionada por Robert Huber de la Universitaet de Ragensburg, Alemania) en el vector pGEX4T3 (Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los mutantes cisteína a serina y del sitio activo se construyeron mediante mutagénesis dirigida mediante PCR y se secuenciaron. La proteína de fusión HDLP-glutation-S-transferasa (GST) se produjo en Escherichia coli, se purificó mediante cromatografía de afinidad utilizando una columna de resina glutation-sefarosa (Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) y mediante cromatografía de intercambio aniónico (Q-sefarosa^{TM}; Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ). HDLP se escindió de la proteína de fusión mediante trombina a 4ºC, se purificó mediante intercambio aniónico (Q-sefarosa^{TM}; Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) y cromatografía de filtración en gel (Superdex^{TM}200; Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) y se concentró típicamente hasta 25 mg/ml en un tampón de 25 mM bis-tris propano (BTP), 500 mM NaCl, 5 mM ditiotreitol (DTT), 2% isopropanol, pH 7,0.

Aunque no se sabe qué cofactor metálico contiene HDLP in vivo, se presume que es cinc debido a la organización de los ligandos y a las similitudes en el sitio activo con las proteasas dependientes de cinc. La ausencia del metal en la HDLP purificada se piensa que es debida, en parte, a la utilización de DTT durante la purificación. HDLP se reconstituyó con Zn^{2+} mezclando el mutante doble Cys75Ser/Cys77Ser a 10 mg/ml con un exceso molar de 5 veces de ZnCl_{2} en un tampón de 25 mM bis-tris propano, 200 mM NaCl, 1% isopropanol, pH 7,0. El ZnCl_{2} no unido se eliminó fraccionando HDLP a través de una columna G25 desaladora (Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ). El complejo HDLP-Zn^{2+}-TSA se preparó incubando el mutante de HDLP reconstituido con Zn^{2+} con 1 mM TSA durante 45 minutos, seguido de cromatografía de filtración en gel (Superdex^{TM}200; Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) para eliminar el exceso de TSA y concentrando típicamente hasta 25 mg/ml en un tampón de 25 mM bis-tris propano, 500 mM NaCl, 1% isopropanol, pH 7,0.

HDAC1 humana etiquetada con el epítopo FLAG se sobreexpresó utilizando un sistema de expresión de baculovirus en células de insecto Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, CA) crecidas en suspensión en medio sin suero (Sf900, Gibco, Grand Island, NY). La proteína de fusión se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico y de afinidad utilizando la resina de afinidad Anti-FLAG M2 (Sigma, St. Louis, MO) y el Péptido FLAG (Sigma, St. Louis, MO).

Ejemplo 2 Cristalización y recogida de datos

Los cristales de apo-HDLP se crecieron a temperatura ambiente mediante el método de difusión de vapor en gota colgante desde 7,5% isopropanol, 28% PEG 1500, 425 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7,0. Se forman en el grupo espacial C2 con a = 51,4 \ring{A}, b = 93,8 \ring{A}, c = 78,7 \ring{A}, \beta = 96,9 \ring{A} y contienen una molécula de HDLP en la unidad asimétrica. Los datos de difracción se recogieron con cristales congelados rápidamente en un tampón de 7,5% isopropanol, 35% PEG 1500, 75 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 a -170ºC.

La estructura del complejo HDLP-Zn^{2+} se determinó a partir de los cristales del mutante doble de HDLP Cys75Ser/
Cys77Ser crecidos desde 23% terc-butanol, 27% PEG 1500, 400 mM KCl, 100 mM bis-tris propano-HCl, pH 6,8. El grupo espacial y las dimensiones de la celda fueron idénticos a los de los apocristales. Los cristales de HDLP-Zn^{2+} se recogieron y se congelaron en 27% terc-butanol, 22% PEG 1500, 50 mM KCl, 20 mM NaCl, 0,2 mM ZnCl_{2}, 100 mM bis-tris propano, pH 6,8 a -170ºC.

Los cristales del complejo HDLP-Zn^{2+}-TSA comprendían el mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser y se crecieron desde 23% terc-butanol, 27% PEG 1500, 600 mM KCl, 100 mM bis-tris propano-Cl, pH 6,8, mediante microsembrado. Los cristales se crecieron en presencia de cinc. Se forman en el grupo espacial P2_{1}2_{1}2_{1} con a = 53,4 \ring{A}, b = 94,4 \ring{A}, c = 156,3 \ring{A} y contienen dos complejos HDLP-Zn^{2+}-TSA en la unidad asimétrica. Los cristales de HDLP-Zn^{2+}-TSA se recogieron y se congelaron en el mismo criotampón que el de los cristales de HDLP-Zn^{2+} excepto en que se añadió 0,5 mM TSA. Los datos se procesaron con DENZO y SCALEPACK (Otwinowski y Minor, 1997, Method. Ensemble. 276:307-326), análisis MIR, construcción de modelo y refinamiento.

Los cristales del complejo HDLP-Zn^{2+}-SAHA se crecieron y se evaluaron de la misma forma que los cristales de HDLP-Zn^{2+}-TSA. Sin embargo, las restricciones para la estructura de SAHA se construyeron tomando como base los parámetros estereoquímicos de TSA. Al igual que los cristales de apo-HDLP, los co-cristales de SAHA/HDLP crecieron en el grupo espacial C2.

Se realizaron impregnaciones con átomos pesados con los cristales apo-HDLP en un tampón de 7,5% isopropanol, 30% PEG 1500, 75 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, suplementado con 1,0 mM timerosal durante 2 h, 5 mM KAu(CN)_{2} durante 1 h y 1 mM Pb(Me)_{3}OAc durante 2 h. Las fases MIR se calcularon con el programa MLPHARE (The CCP4 suite: Programs for computational crystallography, 1994, Acta Crystallogr. D 50:760-763) a 2,5 \ring{A} utilizando la señal de difracción anómala del derivado de timerosal y tenía una figura media de mérito de 0,55. Las fases se mejoraron mediante aplanamiento del disolvente con el programa DM (The CCP4 suite: Programs for computational crystallography, 1994, Acta Crystallogr. D 50:760-763) y se utilizaron para construir el modelo inicial con el programa O (Jones et al., 1991, Acta Crystallogr. A 47:110-109). Los ciclos sucesivos de reconstrucción y refinamiento por templado o recocido simulado con el programa CNS (Brunger et al., 1998, Acta Crystallogr. D 54:905-921) permitieron la interpretación de HDLP desde el resto 2 al 373. Los restos 1, 374 y 375 no se modelaron y se presume que están desordenados.

La estructura del complejo HDLP-Zn^{2+}-TSA y HDLP-Zn^{2+}-SAHA se determinaron mediante reemplazamiento molecular con el programa AMORE (The CCP4 suite: Programs for computational crystallography, 1994, Acta Crystallogr. D 50:760-763) utilizando la estructura de apo-HDLP como modelo de búsqueda. Los mapas de densidad electrónica iniciales tenían una densidad diferente importante y continua para toda la molécula de TSA. Sin embargo, la molécula de SAHA no estaba tan bien ordenada en la región del grupo de cubierta. La estructura de TSA se obtuvo a partir de la Cambridge Structural Database (Refcode TRCHST) y se utilizó para definir las restricciones estereoquímicas utilizadas en el refinamiento con el programa CNS. Las restricciones de SAHA se construyeron tomando como base los parámetros estereoquímicos de TSA y de los restos de aminoácidos circundantes. La interfase del dímero en los cristales de HDLP-Zn^{2+}-TSA y HDLP-Zn^{2+}-SAHA implica principalmente Phe200 en la superficie de la proteína. La cadena lateral de Phe200 contacta con Tyr291 cuya conformación de la cadena lateral cambia con la unión con TSA y parte del grupo dimetil amino fenilo de TSA del segundo promotor. La familia HDAC no contiene un resto fenilalanina en la posición equivalente.

Ejemplo 3 Ensayos de histona desacetilasa

Las proteínas purificadas se ensayaron incubando 10 \mug de sustrato histona de eritroleucemia murina marcada con [^{3}H] acetilo y tampón de ensayo HDAC (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10% glicerol) durante 30-60 minutos a 37ºC en un volumen total de 30 \mul. Las concentraciones finales de HDLP y HDAC1-FLAG fueron 3,6 \muM y 0,24 \muM respectivamente. Los ensayos se realizaron en duplicado. Las reacciones se pararon y el acetato liberado se extrajo y se ensayó como se ha descrito (Hendzel et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:21936-21942). Las histonas de eritroleucemia murina marcadas con [^{3}H] acetilo se prepararon esencialmente como se ha descrito (Carmen et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:15837-15844). Los inhibidores se añadieron en ausencia del sustrato y se incubaron en hielo durante 20 minutos, se añadió el sustrato y el ensayo se realizó como se ha descrito anteriormente. HDLP se incubó con 20 \muM ZnCl_{2} y 20 \muM MnCl_{2}(H_{2}O)_{4} en tampón HDAC y se ensayó la actividad.

Sólo tuvo actividad HDLP dializada frente a ZnCl_{2}. HDAC1-FLAG se dializó frente a 20 \muM ZnCl_{2} en tampón HDAC que no tuvo efecto en la actividad. Por lo tanto, HDAC1-FLAG contiene un metal cuando se purifica.

No se conoce el sustrato de HDLP in vivo. HDLP puede tener una función en la utilización de acetoína semejante al producto génico AcuC de B. subtilis y se ha indicado como tal en la secuencia del genoma pero la reacción catalizada por AcuC tampoco se conoce. Aún más, el genoma de A. aeolicus carece de los genes acuA y acuB que forman parte del operón acuABC de B. subtilis (Deckert et al., 1998, Nature, 392:353-358), y HDLP es tan similar a HDAC1 humana (identidad del 35,2%) como lo es a AcuC de B. subtilis (identidad del 34,7%).

Claims

1. Un cristal de una enzima que comprende actividad desacetilasa en el que dicho cristal difracta eficazmente rayos X para la determinación de las coordenadas atómicas de dicha enzima a un resolución mayor de 4 \ring{A} y en el que la estructura de dicha enzima comprende un plegamiento central característico \alpha/\beta estructural conservado en el que dicho plegamiento \alpha/\beta conservado comprende una lámina \beta paralela de ocho cadenas y ocho hélices \alpha y en el que cuatro de las hélices se agrupan en cada cara de dicha lámina \beta paralela y en el que dicha estructura de dicha enzima comprende una rmsd de menos de o igual a 1,5 \ring{A} en las posiciones de los átomos C\alpha en al menos 2/3 o más de los aminoácidos de HDLP (SEQ ID NO:1) como se define por las coordenadas atómicas de HDLP según la Figura 16 y en el que el cristal tiene las dimensiones de la celda unidad de a = 51,4 \ring{A}, b = 93,8 \ring{A}, c = 78,7 \ring{A} y \beta = 96,9º o a = 53,4 \ring{A}, b = 94,4 \ring{A} y c = 156,3 \ring{A}.

2. El cristal de la reivindicación 1, en el que dicha enzima es HDLP.

3. El cristal de la reivindicación 1, en el que dicha enzima es HDAC1.

4. El cristal de la reivindicación 1, en el que:

(a) dicha estructura proteica comprende además:

(1): ocho hélices \alpha situadas cerca de un lado de la lámina \beta; y

(2): al menos siete bucles grandes, bien definidos que se originan de los extremos C-terminales de las cadenas \beta de dicha lámina \beta paralela de ocho cadenas en el que las ocho hélices extra y los siete bucles grandes están asociados con una extensión significativa de la estructura fuera del resto central \alpha/\beta y en el que dicha extensión de la estructura da lugar a un bolsillo profundo y estrecho y a una cavidad interna adyacente al bolsillo; o

(b) dicha enzima que comprende actividad desacetilasa se selecciona de HDLP (SEQ ID NO:1), HDAC1 (histona desacetilasa 1), HDAC2 (histona desacetilasa 2), HDAC3 (histona desacetilasa 3), HDAC4 (histona desacetilasa 4), HDAC5 (histona desacetilasa 5), HDAC6 (histona desacetilasa 6), APAH (acetilpoliamina amidohidrolasa), AcuC (proteína C para la utilización de acetoína), y derivados funcionales de éstas.

5. El cristal de la reivindicación 4,

(a) que comprende además un átomo de cinc unido específicamente al sitio activo de dicha enzima; o

(b) que comprende además un compuesto inhibidor de desacetilasa unido específicamente al sitio activo de dicha enzima; o

(c) definido por las coordenadas atómicas según la Figura 16.

6. Un método para identificar un compuesto inhibidor potencial de desacetilasa para una enzima que comprende actividad desacetilasa, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) utilizar una estructura tridimensional de HDLP (SEQ ID NO:1) como se define por las coordenadas atómicas según la Figura 16;

(b) utilizar dicha estructura tridimensional para diseñar o seleccionar dicho inhibidor potencial;

(c) sintetizar opcionalmente dicho inhibidor potencial;

(d) poner en contacto dicho inhibidor potencial con dicha enzima en presencia de un sustrato acetilado; y

(e) determinar la actividad inhibidora de desacetilasa de dicho inhibidor potencial.

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7. El método de la reivindicación 6, en el que

(a) la estructura tridimensional se diseña o selecciona utilizando modelado computacional; o

(b) el inhibidor potencial de desacetilasa se diseña de novo; o

(c) el inhibidor potencial de desacetilasa se diseña tomando como base un inhibidor conocido; o

(d) dicha enzima que comprende actividad desacetilasa se selecciona de HDLP (SEQ ID NO:1), HDAC1 (histona desacetilasa 1), HDAC2 (histona desacetilasa 2), HDAC3 (histona desacetilasa 3), HDAC4 (histona desacetilasa 4), HDAC5 (histona desacetilasa 5), HDAC6 (histona desacetilasa 6), APAH (acetilpoliamina amidohidrolasa), AcuC (proteína C para la utilización de acetoína), y derivados funcionales de éstas.

8. Un método para evaluar las propiedades de unión del compuesto inhibidor potencial de desacetilasa de la reivindicación 7 que comprende las etapas de:

(a) co-cristalizar dicho compuesto con HDLP;

(b) determinar la estructura tridimensional de dicho co-cristal de complejo HDLP-inhibidor potencial mediante reemplazamiento molecular utilizando la estructura tridimensional de HDLP (SEQ ID NO:1) como se define por las coordenadas atómicas según la Figura 16; y

(c) analizar dicha estructura tridimensional de dicha HDLP unida a dicho compuesto inhibidor potencial para evaluar las características de unión de dicho compuesto inhibidor potencial.

9. Un método para resolver la estructura de un cristal de un miembro de la familia HDAC que comprende las etapas de:

(a) recoger los datos de difracción de rayos X de dicho cristal en el que dichos datos difractan a un límite de resolución alto mayor de 4 \ring{A};

(b) utilizar las coordenadas atómicas de HDLP (SEQ ID NO:1) según la Figura 16 para realizar reemplazamiento molecular o refinamiento y diferencia de fourier con dichos datos de difracción de rayos X de dicho cristal de un miembro de la familia HDAC para determinar la estructura de dicho miembro de la familia HDAC; y

(c) refinar dicha estructura de dicho miembro de la familia HDAC.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dicho miembro de la familia HDAC es HDAC1.

11. Un mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser en el que dicho mutante está codificado por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:4.

12. Un mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser en el que dicho mutante tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3.

13. Una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO:4.

14. Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 13.

15. Un método para utilizar el cristal de la reivindicación 1 para cribar un fármaco nuevo que comprende:

(a) seleccionar un ligando potencial realizando diseño racional de fármacos con la estructura tridimensional determinada para el cristal;

(b) poner en contacto el ligando potencial con el dominio de unión al ligando del cristal; y

(c) detectar el potencial de unión del ligando potencial para el dominio de unión al ligando, en el que el fármaco nuevo se selecciona tomando como base que tenga una mayor afinidad por el dominio de unión al ligando que la de un fármaco conocido.

16. El método de la reivindicación 15, en el que dicha enzima es HDLP.

17. El método de la reivindicación 15, en el que dicha enzima es HDAC1 (histona desacetilasa 1).