ES2287033T3 - Estructura cristalina de una desacetilasa e inhibidores de la misma. - Google Patents
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Abstract
Un cristal de una enzima que comprende actividad desacetilasa en el que dicho cristal difracta eficazmente rayos X para la determinación de las coordenadas atómicas de dicha enzima a un resolución mayor de 4 Å y en el que la estructura de dicha enzima comprende un plegamiento central característico alfa/beta estructural conservado en el que dicho plegamiento alfa/beta conservado comprende una lámina beta paralela de ocho cadenas y ocho hélices alfa y en el que cuatro de las hélices se agrupan en cada cara de dicha lámina beta paralela y en el que dicha estructura de dicha enzima comprende una rmsd de menos de o igual a 1, 5 Å en las posiciones de los átomos Calfaen al menos 2/3 o más de los aminoácidos de HDLP (SEQ ID NO:1) como se define por las coordenadas atómicas de HDLP según la Figura 16 y en el que el cristal tiene las dimensiones de la celda unidad de a = 51, 4 Å, b = 93, 8 Å, c = 78, 7 Å y beta = 96, 9o o a = 53, 4 Å, b = 94, 4 Å y c = 156, 3 Å.
Description
Estructura cristalina de una desacetilasa e
inhibidores de la misma.
La presente invención se refiere a un homólogo
de la histona desacetilasa de la bacteria hipertermofílica
Aquifex aeolicus, HDLP (proteína semejante a la histona
desacetilasa; también conocida como AcuC1), que comparte un 35,2%
de identidad en la secuencia con la histona desacetilasa humana
(HDAC1), que puede co-cristalizarse con un ligando
inhibidor y, más particularmente, a los datos cristalográficos
detallados obtenidos a partir de dicha
co-cristalización que se describe en la presente
memoria. La invención también se refiere a métodos para utilizar la
estructura cristalina y las coordenadas cristalográficas de rayos X
de apo-HDLP y HDLP unida al inhibidor para diseñar,
aislar y cribar compuestos que se unen a e inhiben el sitio activo
de HDLP y proteínas relacionadas con HDLP, tales como las proteínas
que pertenecen a la familia HDAC, incluyendo HDAC1.
La modificación reversible de las histonas por
acetilación está asociada a cambios en la conformación del
nucleosoma y en la estructura de la cromatina y juega un papel
importante en la regulación de la expresión génica (revisado en
Davie y Chadee, 1998, J. Cell Biochem. Suppl.
30-31:203-213). Las enzimas
histona acetilasa y desacetilasa que realizan estas modificaciones
están implicadas en muchos procesos celulares tales como progresión
del ciclo celular y diferenciación y su desregulación está asociada
con varios tipos de cáncer humano (revisado en Kouzarides, 1999,
Curr. Opin. Genet. Dev. 9:40-48;
Hassig et al., 1997, Chem. Biol.
4:783-789; Fenrick y Heibert, 1998, J.
Cell. Biochem. Suppl. 30-31:
194-202).
Recientemente, se ha mostrado que varios
compuestos antitumorales experimentales, tales como tricostatina A
(TSA), trapoxina, ácido suberoilanilida hidroxámico (SAHA) y
fenilbutirato actúan, al menos en parte, inhibiendo las histonas
desacetilasas. Richon et al., 1998, Proc. Natl. Acad.
Sci., USA 95:3003-3007; Yoshida et
al., 1990, J. Biol. Chem.
265:17174-17179; Kijima et al., 1993,
J. Biol. Chem. 268:22429-22435.
Además, se ha mostrado que el sulfuro de dialilo y moléculas
relacionadas (Lea et al., 1999, Int. J. Oncol.
2:347-352), oxamflatina (Kim et al.,
1999, Oncogene 15:2461-2470),
MS-27-275, un derivado sintético de
la benzamida (Saito et al., 1999, Proc. Natl. Acad.
Sci. 96:4592-4597), derivados de butarato
(Lea y Tulsyan, 1995, Anticancer Res.
15:879-883), FR901228 (Nokajima et
al., 1998, Exp. Cell Res.
241:126-133), depudecina (Kwon et
al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95:3356-3361) y ácido
m-carboxicinámico bishidroxamida (CBHA; Richon
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95:3003-3007) inhiben las histonas
desacetilasas. In vitro, estos compuestos pueden inhibir el
crecimiento de células fibroblásticas produciendo la parada del
ciclo celular en las fases G1 y G2 (Richon et al., 1996,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:5705-5708; Kim et al., 1999,
Oncogene 18:2461-2470; Yoshida et
al., 1995, Bioessays 17:423-430;
Yoshida y Beppu, 1988, Exp. Cell Res.
177:122-131) y pueden dar lugar a la
diferenciación terminal y pérdida del potencial transformante de
una variedad de líneas celulares transformadas. Richon et
al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:5705-5708; Kim et al., 1999,
Oncogene 18:2461-2470; Yoshida et
al., 1987, Cancer Res.
47:3688-3691. In vivo, el
fenilbutarato es eficaz en el tratamiento de la leucemia
promielocítica aguda junto al ácido retinoico. Warrel et
al., 1998, J. Natl. Cancer Inst.
90:1621-1625. SAHA es eficaz en la
prevención de la formación de tumores mamarios en ratas y tumores de
pulmón en ratones. Desai et al., 1999, Proc. AACR
40:abstract #2396; Cohen et al., Cancer Res.,
enviado.
Las histonas desacetilasas catalizan la
eliminación de grupos acetilo de los grupos
\varepsilon-amino de los restos de lisina
agrupados cerca del extremo N-terminal de las
histonas nucleosomales y este proceso está asociado a la represión
transcripcional (revisado en Struhl, 1998, Genes Dev.
12:599-606). La deleción del gen de la
histona desacetilasa de levaduras, rpd3, o su inactivación
farmacológica con tricostatina A, reduce la represión
transcripcional en un subconjunto de promotores, tales como los de
los genes regulados por Ume6. Kadosh y Struhl, 1998, Mol. Cell.
Biol. 18:5121-5127. Esto se acompaña de
la acetilación incrementada de las histonas H4 en el promotor
reprimido y sus alrededores, pero no tiene efecto en las histonas de
las regiones distantes del promotor. Kadosh y Struhl, 1998, Mol.
Cell. Biol. 18:5121-5127; Rundlett et
al., 1998, Nature
392:831-835.
Las histonas desacetilasas están reclutadas a
promotores específicos mediante la asociación con represores
transcripcionales que se unen al ADN, bien directamente o a través
de co-represores que conectan la desacetilasa con
los represores transcripcionales. Por ejemplo, los represores Mad y
Ume6 se unen al co-represor Sin3A (Laherty et
al., 1997, Cell 89:349-356; Hassig
et al., 1997, Cell 89:341-347;
Kadosh y Struhl, 1997, Cell
89:365-371), y los receptores nucleares unen
N-CoR y los co-represores SMRT
relacionados. Nagy et al., 1997, Cell
89:373-380; Alland et al., 1997,
Nature 387:49-55; Heinzel et
al., 1997, Nature 387:43-48.
La desregulación del reclutamiento de las
histonas desacetilasas parece ser uno de los mecanismos mediante
los que estas enzimas contribuyen a la tumorogénesis. En la leucemia
promielocítica aguda (APL), las translocaciones cromosómicas
fusionan el receptor \alpha del ácido retinoico (RAR\alpha) bien
con PLZF o con PML. Estas oncoproteínas de fusión tienen una
actividad de represión transcripcional aberrante que resulta, en
parte, del reclutamiento de un co-represor y, a su
vez, de HDAC. Grignani et al., 1998, Nature
391:815-818; Lin et al., 1998,
Nature 391:811-814. El tratamiento de
células de APL PLZF-RAR\alpha con TSA incrementa
su respuesta a la diferenciación inducida por el ácido retinoico.
Grignani et al., 1998, Nature
391:815-818; Lin et al., 1998,
Nature 391:811-814.
Las histonas desacetilasas comprenden una gran
familia de proteínas, conservadas desde la levadura hasta el ser
humano, y se dividen en dos clases relacionadas. La clase I se
caracteriza por HDAC1, 2, 3 humanas (Taunton et al., 1996,
Science 272:408-411; Yang et
al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:12845-12850; Emiliani et al., 1998,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95:2795-2800) y RPD3 de levaduras (Videl y
Gaber, 1991, Mol. Cell. Biol.
11:6317-6327), y la clase II por HDAC4, 5, 6
humanas (Grozinger et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 96:4868-4873; Fischle et al.,
1999, J. Biol. Chem. 274:11713-11720)
y HDA1 de levaduras (Rundlett et al., 1996, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93:14503-14508). Las dos
clases comparten una región de \sim390 aminoácidos de similitud
de secuencia, que comprende el núcleo desacetilasa pero son
divergentes fuera de esta región. Los genes de las histonas
desacetilasas pertenecen a una superfamilia aún mayor (Leipe y
Landsman, 1997, Nucleic Acids Res.
25:3693-3697) que contiene las proteínas
procariotas para la utilización de acetoína (AcuC; 28,1% de
identidad de secuencia con HDAC1) y las acetilpoliamina
amidohidrolasas procariotas (APAH; 15,0% de identidad de secuencia
con HDAC1). La actividad enzimática de AcuC no está clara pero su
interrupción reduce la capacidad de B. subtilis de degradar
la acetoína y de utilizarla como fuente de carbono. Grundy et
al., 1993, Mol. Microbiol.
10:259-271. Las APAH catalizan la
desacetilación de poliaminas degradando un enlace amida no
peptídico (revisado en Leipe y Landsman, 1997, Nucleic Acids
Res. 25:3693-3697).
Es útil plantear las cuestiones de cómo las HDAC
y las proteínas relacionadas con HDAC catalizan la desacetilación
de histonas y cómo los compuestos referidos anteriormente,
particularmente aquellos compuestos con actividad antitumoral,
inhiben esta actividad con el fin de entender mejor el mecanismo de
inhibición de las HDAC y para facilitar el descubrimiento de
compuestos útiles adicionales que pueden inhibir esta actividad. Con
este propósito, la presente invención ha determinado la estructura
tridimensional de una proteína semejante a HDAC1 de la bacteria
termofílica Aquifex aeolicus, de aquí en adelante en la
presente memoria HDLP. La determinación de la secuencia de ácido
nucleico que codifica HDLP fue descrita por Deckert et al.,
1998, Nature 392:353-358. La proteína
codificada de 375 restos, cuya secuencia se determinó a partir de la
secuencia de ácido nucleico codificadora, comparte un 35,2% de
identidad en la secuencia de aminoácidos con HDAC1, desacetila
histonas in vitro, y se inhibe por TSA, SAHA y otros
inhibidores de HDAC. La determinación de la estructura
tridimensional de HDLP es útil en el diseño, identificación y
cribado de nuevos compuestos inhibidores de la familia de las HDAC
que son útiles para la inhibición del crecimiento celular tanto
in vivo como in vitro.
En general, es el objeto de la presente
invención proporcionar información detallada de la estructura
tridimensional de una familia de proteínas conocidas como histonas
desacetilasas (HDAC) y particularmente un homólogo de HDLP de la
bacteria hipertermofílica Aquifex aeolicus (proteína
semejante a la histona desacetilasa) que comparte un 35,2% de
identidad de secuencia con la histona desacetilasa humana (HDAC1).
También es un objeto de la presente invención proporcionar
información de la estructura tridimensional de una HDLP unida a un
compuesto inhibidor.
En una realización de la invención, la
información de la estructura tridimensional se obtiene a partir de
un cristal de HDLP de tipo salvaje (SEQ ID NO:1) (el ácido nucleico
que codifica HDLP de tipo salvaje es SEQ ID NO:2). En una
realización más de la invención, la información tridimensional se
obtiene a partir de una HDLP mutante que comprende dos mutaciones
(1) cisteína 75 a una serina y (2) cisteína 77 a una serina (mutante
doble Cys75Ser/Cys77Ser; SEQ ID NO:3) (el ácido nucleico que
codifica el mutante doble Cys75Ser/Cys77Ser de HDLP es SEQ ID
NO:4). La HDLP mutante de la presente invención facilita la
determinación de información de la estructura tridimensional de
HDLP unida a un átomo de cinc en su sitio de unión a átomos de
cinc.
En una realización preferida de la invención, la
información de la estructura tridimensional se obtiene a partir de
un co-cristal de un complejo
proteína-compuesto inhibidor que comprende HDLP o el
mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser y tricostatina A (TSA). En
otra realización preferida de la invención la información de la
estructura tridimensional se obtiene a partir de un
co-cristal de un complejo
proteína-compuesto inhibidor que comprende HDLP o
el mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser y el ácido
suberoilanilida hidroxámico (SAHA). Cualquier compuesto inhibidor
de HDLP o de proteínas relacionadas con HDLP (por ejemplo, HDAC) que
pueda co-cristalizarse con HDLP puede utilizarse
para formar un co-cristal de la presente
invención.
Los cristales de proteína y los
co-cristales del complejo
proteína-inhibidor de la presente invención
difractan a un límite de resolución alto de al menos igual a o
mayor de 4 angstrom (\ring{A}). En una realización preferida, los
cristales de proteína y los co-cristales del
complejo proteína-inhibidor de la presente invención
difractan a un límite de resolución alto mayor de 2,5
\ring{A}.
Un cristal de la presente invención tiene un
grupo espacial C2 con una molécula en la unidad asimétrica y siendo
las dimensiones de la unidad a = 51,4 \ring{A}, b =
93,8 \ring{A}, c = 78,7 \ring{A} y \beta = 96,9º
(véase, por ejemplo, el Ejemplo 2, más adelante). En otra
realización preferida, el cristal tiene un grupo espacial
P2_{1}2_{1}2_{1} con dos moléculas en la unidad asimétrica y
siendo las dimensiones de la unidad a = 53,4 \ring{A},
b = 94,4 \ring{A}, c = 156,3 \ring{A} (véase, por
ejemplo, el Ejemplo 2, más adelante). La estructura de HDLP
comprende una lámina \beta paralela con las hélices \alpha
empaquetadas frente a las dos caras. En un extremo de la lámina
\beta, la HDLP tiene un bolsillo estrecho semejante a un tubo
formado por varios bucles ordenados. Las paredes del bolsillo están
revestidas con restos hidrofóbicos y en el fondo del bolsillo hay
un sitio de unión a cinc y varias cadenas laterales polares. Los
compuestos inhibidores de la presente invención se unen al
bolsillo.
La información de la estructura tridimensional
obtenida a partir de cristales de HDLP, del doble mutante de HDLP
Cys75Ser/Cys77Ser, del doble mutante de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser que
comprende un átomo de cinc, de HDLP que comprende un compuesto
inhibidor tal como TSA o SAHA y del mutante doble de HDLP
Cys75Ser/Cys77Ser que comprende un compuesto inhibidor tal como TSA
o SAHA puede utilizarse para resolver la estructura de cualquier
cristal de proteínas relacionadas con HDLP (por ejemplo, HDAC) o de
cualquier proteína relacionada con HDLP mutante y particularmente
cualquier proteína relacionada con HDLP de tipo salvaje o mutante
complejada con un ligando, incluyendo un sustrato o un compuesto
inhibidor. Si los cristales están en un grupo espacial diferente
que la estructura conocida, puede utilizarse reemplazamiento
molecular para resolver la estructura o si los cristales están en
el mismo grupo espacial pueden utilizarse métodos de refinamiento y
de diferencia de fourier. La estructura de las proteínas
relacionadas con HDLP (por ejemplo, HDAC1) comprende una desviación
de la media cuadrática no mayor de 2,0 \ring{A} (rmsd) en las
posiciones de los átomos C\alpha para al menos el 50% o más de
los aminoácidos de la estructura de HDLP de longitud completa.
La presente invención también proporciona una
molécula de ácido nucleico que codifica un mutante doble de HDLP
Cys75Ser/Cys77Ser que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO:3 y la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:4. La invención
también contempla que pueden realizarse mutaciones en proteínas
relacionadas con HDLP en restos de cisteína, como en el mutante
doble Cys75Ser/Cys77Ser, con el fin de facilitar la determinación
de la estructura de dichas proteínas unidas a un átomo de cinc.
Además, la presente invención proporciona vectores de expresión que
comprenden la molécula de ácido nucleico que codifica un mutante
doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser codificado por la secuencia
representada por SEQ ID NO:4 unida de manera operativa a secuencias
de control de la expresión.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar métodos para el diseño, identificación y cribado de
compuestos inhibidores potenciales de la familia HDLP/HDAC. En una
realización preferida el método para el diseño, identificación y
cribado racionales de compuestos inhibidores potenciales de HDLP y
proteínas relacionadas con HDLP (por ejemplo, HDAC) que comprenden
actividad desacetilasa comprende las etapas de: (a) utilizar una
estructura tridimensional de una HDLP como se define por las
coordenadas atómicas de la presente invención; (b) utilizar dicha
estructura tridimensional para diseñar o seleccionar dicho compuesto
inhibidor potencial; (c) sintetizar y/o seleccionar dicho inhibidor
potencial; (d) poner en contacto dicho compuesto inhibidor potencial
con dicha enzima en presencia de sustrato acetilado; y (e)
determinar el porcentaje de inhibición de la actividad desacetilasa
para determinar la actividad inhibidora de dicho compuesto inhibidor
potencial. En una realización preferida adicional, pueden
determinarse las propiedades de unión de dicho compuesto inhibidor
diseñado racionalmente mediante un método que comprende las etapas
de: (a) formar un complejo que comprende dicho compuesto inhibidor
y HDLP o una proteína relacionada con HDLP, (b)
co-cristalizar dicho complejo compuesto
inhibidor-HDLP; (c) determinar dicha estructura
tridimensional de dicho co-cristal mediante
reemplazamiento molecular o refinamiento y diferencia de fourier
con las coordenadas moleculares de HDLP como se define por la
presente invención; y (d) analizar la estructura tridimensional
para determinar las características de unión de dicho compuesto
inhibidor potencial.
Es un objeto más de la presente invención
identificar una clase definida de compuestos inhibidores de la
familia HDLP/HDAC. Se describen compuestos inhibidores de la
familia HDLP/HDAC como se representan por la fórmula (I):
en la que X comprende un grupo de
cubierta que se une a al menos un aminoácido seleccionado del grupo
que consiste en prolina y leucina; Y comprende un grupo de cadena
alifática que se une a al menos un aminoácido seleccionado del
grupo que consiste en leucina, fenilalanina y glicina; y Z comprende
un grupo de unión del sitio activo que se une a al menos un
aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido aspártico,
tirosina e histidina y puede unirse además a un átomo de
cinc.
La Figura 1 es una tabla que lista las
estadísticas de los análisis cristalográficos de rayos X de un
cristal de HDLP, un co-cristal
HDLP-TSA y un co-cristal
HDLP-SAHA.
La Figura 2 muestra un alineamiento de varios
homólogos de HDAC mostrando el porcentaje de identidad de la
secuencia.
La Figura 3 muestra un gráfico que indica la
actividad histona desacetilasa de HDLP y HDAC1 y la inhibición de
HDLP y HDAC1 por los inhibidores TSA y toxina HC.
La Figura 4 muestra (A y B) una representación
esquemática del complejo
HDLP-Zn^{2+}-TSA en dos vistas
aproximadamente ortogonales, (C) un diagrama topológico de HDLP que
indica las regiones de homología con HDAC1 y (D) una representación
esquemática en primer plano del complejo
HDLP-Zn^{2+}-SAHA.
La Figura 5 muestra (A) una representación
esquemática de un corte de una representación de la superficie de
HDLP indicando las cavidades internas del bolsillo y la posición de
la lámina \beta, (B) una representación esquemática de una vista
en primer plano del sitio activo mirando hacia el bolsillo en una
orientación similar a la de la Figura
4B.
4B.
La Figura 6 muestra (A) una representación de
llenado de espacio de TSA en el bolsillo del sitio activo, (B) una
visión estéreo en primer plano de la estructura del complejo
HDLP-Zn^{2+}-TSA en una
orientación similar a la de la Figura 4B, y (C) una representación
esquemática de las interacciones HDLP-TSA.
La Figura 7 muestra (A) una representación
esquemática de las regiones de homología compartidas entre HDLP y
HDAC1 en una orientación similar a la de la Figura 4A, y (B) una
representación esquemática detallada de la homología compartida en
el bolsillo y la cavidad interna entre HDLP y HDAC1 en una
orientación similar a la de la Figura 4B.
La Figura 8 muestra una representación
esquemática del mecanismo catalítico propuesto para la
desacetilación de lisina acetilada.
La Figura 9 muestra una representación
esquemática de un diagrama de llenado de espacio que muestra los
aminoácidos conservados en el sitio activo y en los surcos
cercanos.
La Figura 10 es la secuencia de ácido nucleico
de HDLP de Aquifex aeolicus (SEQ ID NO. 2).
La Figura 11 es la secuencia de aminoácidos de
HDLP de longitud completa de Aquifex aeolicus (SEQ ID NO.
1).
La Figura 12 es la secuencia de ácido nucleico
del mutante del sitio activo de HDLP Tyr297Phe (SEQ ID NO. 6).
La Figura 13 es la secuencia de aminoácidos del
mutante del sitio activo de HDLP Tyr297Phe (SEQ ID NO. 5).
La Figura 14 es la secuencia de ácido nucleico
de un mutante doble de HDLP de Aquifex aeolicus que comprende
una mutación Cys75Ser y Cys77Ser (SEQ ID NO. 4).
La Figura 15 es la secuencia de aminoácidos de
un mutante doble de HDLP de Aquifex aeolicus que comprende
una mutación Cys75Ser y Cys77Ser (SEQ ID NO. 3).
La Figura 16-1 a
16-49 lista las coordenadas atómicas de la
estructura para HDLP obtenidas mediante difracción de rayos X a
partir de un cristal de HDLP.
La Figura 17-1 a
17-49 lista las coordenadas atómicas de la
estructura para el mutante doble de HDLP Cys75Ser/
Cys77Ser que comprende un átomo de cinc en el sitio activo obtenidas mediante difracción de rayos X a partir de un cristal del mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser.
Cys77Ser que comprende un átomo de cinc en el sitio activo obtenidas mediante difracción de rayos X a partir de un cristal del mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser.
La Figura 18-1 a
18-99 lista las coordenadas atómicas de la
estructura del mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77
Ser obtenidas mediante difracción de rayos X a partir de un co-cristal de HDLP complejada con TSA.
Ser obtenidas mediante difracción de rayos X a partir de un co-cristal de HDLP complejada con TSA.
La Figura 19-1 a
19-48 lista las coordenadas atómicas de la
estructura del mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77
Ser obtenidas mediante difracción de rayos X a partir de un co-cristal de HDLP complejada con SAHA.
Ser obtenidas mediante difracción de rayos X a partir de un co-cristal de HDLP complejada con SAHA.
La invención se define mediante las
reivindicaciones. La materia no cubierta por las reivindicaciones
sólo sirve para fines ilustrativos.
La presente invención proporciona cristales de
un homólogo de la histona desacetilasa (HDAC) crecidos en presencia
y ausencia de un compuesto capaz de inhibir la actividad histona
desacetilasa de dicho homólogo de HDAC. Tal y como se refiere en la
presente memoria, un homólogo de HDAC (así como una proteína
relacionada con HDLP) es cualquier molécula proteica que tiene (a)
más del 15% de identidad de secuencia sobre los 375 restos de
aminoácidos de HDLP; (b) que tiene no más de veinte inserciones o
deleciones para un total de no más de 100 aminoácidos, y (c)
actividad desacetilasa. La identidad de secuencia se calcula
mediante el programa DNAstar^{TM} utilizando el método clustal
para el esquema de peso de la matriz de identidad (DNAstar program,
Madison, WI).
\newpage
Un compuesto inhibidor de HDLP/HDAC, tal y como
se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier compuesto
representado por la Fórmula (I):
en la que X comprende un grupo de
cubierta que se une a al menos un aminoácido seleccionado del grupo
que consiste en tirosina, prolina y leucina; Y comprende un grupo
de cadena alifática de aproximadamente 5 a aproximadamente 10
\ring{A}, preferiblemente 7 \ring{A}, que se une a al menos un
aminoácido seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina y
glicina; y Z comprende un grupo de unión del sitio activo que se une
a al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en
ácido aspártico, tirosina e histidina y que puede unirse además a un
átomo de cinc. Los compuestos inhibidores de HDAC de la presente
invención pueden inhibir más del 50% de la actividad histona
desacetilasa de un homólogo de HDAC o de una proteína relacionada
con
HDLP.
Para crecer los cristales de la presente
invención, HDAC y el complejo HDAC-compuesto
inhibidor se purifican hasta más del 80% de proteína total y más
preferiblemente se purifican hasta más del 90% de proteína total.
Para fines de expresión y purificación, la HDLP de longitud completa
(número de referencia de Genbank AE000719) puede subclonarse a
partir de una preparación de ADN cromosómico de Aquifex
aeolicus mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
e insertarse en un vector de expresión.
Puede utilizarse un gran número de sistemas
vector-anfitrión conocidos en la técnica. Los
vectores posibles incluyen, pero no están limitados a, plásmidos o
virus modificados, pero el sistema de vector debe ser compatible
con la célula anfitriona utilizada. Los ejemplos de vectores
incluyen bacteriófagos de E. coli tales como derivados
lambda, o plásmidos tales como derivados de pBR322 o derivados del
plásmido pUC, por ejemplo, vectores pGEX
(Amersham-Pharmacia, Piscataway, Nueva Jersey),
vectores pET (Novagen, Madison, WI), vectores pma1-c
(Amersham-Pharmacia, Piscataway, Nueva Jersey),
vectores pFLAG (Chiang y Roeder, 1993, Pept. Res.
6:62-64), vectores baculovirus (Invitrogen,
Carlsbad, CA; Pharmigen, San Diego, CA), etc. La inserción en un
vector de clonación puede conseguirse, por ejemplo, ligando el
fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene extremos
cohesivos complementarios, mediante ligación de extremos romos si no
existen extremos cohesivos complementarios o mediante conectores de
nucleótidos utilizando técnicas estándar en la técnica. Por ejemplo,
Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular
Biology, (1992). Los vectores recombinantes que comprenden el
ácido nucleico de interés pueden introducirse entonces en una
célula anfitriona compatible con el vector (por ejemplo, E.
coli, células de insectos, células de mamíferos, etc.) mediante
transformación, transfección, infección, electroporación, etc. El
ácido nucleico también puede ponerse en un vector lanzadera que
puede clonarse y propagarse en gran cantidad en las bacterias y
después introducirse en una célula anfitriona eucariota para su
expresión. Los sistemas de vectores de la presente invención pueden
proporcionar secuencias de control de la expresión y pueden
permitir la expresión de proteínas in vitro.
En una realización preferida, la HDLP de
longitud completa (SEQ ID NO:2) se subclona a partir de una
preparación de ADN cromosómico de Aquifex aeolicus en
pGEX4T3 (Amersham-Pharmacia, Piscataway, Nueva
Jersey). Con el fin de construir un mutante doble que comprende una
mutación Cys75Ser y Cys77Ser (SEQ ID NO:4), y para construir el
mutante del sitio activo de HDLP Tyr297Phe (SEQ ID NO:5 y SEQ ID
NO:6), puede utilizarse mutagénesis dirigida mediante PCR con
verificación mediante métodos de secuenciación de ADN conocidos por
los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1 más
adelante). Los mutantes de la presente invención pueden subclonarse
en un vector de expresión adecuado e introducirse en una célula
anfitriona para la producción de proteínas, como se ha descrito
anteriormente.
Los ácidos nucleicos de HDLP de la presente
invención pueden subclonarse en un vector de expresión para crear
una construcción de expresión de manera que la molécula de HDLP
resultante que se produce comprenda una proteína de fusión
comprendiendo dicha proteína de fusión una etiqueta para facilitar
la purificación. Tal y como se refiere en la presente memoria, una
"etiqueta" es cualquier aminoácido adicional que se proporciona
en una proteína en el extremo c-terminal,
n-terminal o internamente para facilitar la
purificación, para mejorar la producción o para cualquier otro
propósito que pueda facilitar los objetivos de la presente invención
(por ejemplo, para conseguir unos niveles mayores de producción y/o
purificación). Dichas etiquetas incluyen etiquetas conocidas por
los expertos en la técnica que son útiles en la purificación tales
como, pero sin limitarse a, etiqueta his, etiqueta
glutation-s-transferasa, etiqueta
flag, etiqueta mbp (proteína de unión a la maltosa), etc. En una
realización preferida, las HDLP de tipo salvaje y mutante de la
presente invención se etiquetan con
glutation-s-transferasa (véase el
Ejemplo 1 más adelante). En otra realización preferida, HDAC1 se
etiqueta con flag (véase el Ejemplo 1 más adelante). Dichas
proteínas etiquetadas también pueden someterse a ingeniería para
comprender un sitio de escisión, tal como un sitio de escisión de
trombina, enteroquinasa o factor X, para facilitar la eliminación
de la etiqueta antes, durante o después de la purificación. Los
sistemas de vectores que proporcionan una etiqueta y un sitio de
escisión para la eliminación de la etiqueta son especialmente
útiles para obtener las construcciones de expresión de la presente
invención.
Las HDLP y HDAC etiquetadas de la presente
invención pueden purificarse mediante cromatografía de
inmuno-afinidad o convencional, incluyendo, pero
sin limitarse a, cromatografía utilizando lo siguiente:
glutation-sefarosa^{TM}
(Amersham-Pharmacia, Piscataway, Nueva Jersey), o
una resina equivalente, resinas de purificación de níquel o
cobalto, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de
intercambio catiónico, resinas hidrofóbicas, filtración en gel,
resina anti-epítopo flag, cromatografía en fase
reversa, etc. Después de la purificación, la HDLP y el complejo
HDLP-compuesto inhibidor pueden concentrarse hasta
más de 1 mg/ml para fines de cristalización. En una realización
preferida, HDLP y los complejos HDLP-inhibidor se
concentran hasta más de 10 mg/ml para cristalización y en una
realización particularmente preferida, HDLP y los complejos
HDLP-inhibidor se concentran hasta más de 20
mg/ml.
Con el fin de determinar si las HDLP purificadas
de la presente invención demuestran actividad histona desacetilasa,
las HDLP purificadas y también cualquier proteína relacionada con
HDLP pueden ensayarse mediante cualquier método conocido por los
expertos en la técnica para la determinación de dicha actividad. En
una realización preferida, las HDLP purificadas de la presente
invención se incuban en presencia de sustrato histona marcado con
[^{3}H]-acetilo (Carmen et al., 1996, J.
Biol. Chem. 271:15837-15844) en un tampón
adecuado para la detección de actividad histona desacetilasa (véase
el Ejemplo 3 más adelante); se para la reacción; se extrae el
acetato liberado y se determina dicho acetato liberado, como
describen Henzel, et al. (J. Biol. Chem.
266:21936-21942 (1991); Ejemplo 3 más
adelante). En una realización preferida, las HDLP de la presente
invención se incuban en presencia de ZnCl_{2} con el fin de
obtener actividad histona desacetilasa de ellas (Ejemplo 3 más
adelante).
En otra realización, los cristales de la
presente invención comprenden HDLP de tipo salvaje purificada (SEQ
ID NO:1) y se crecen a temperatura ambiente mediante el método de
difusión de vapor en gota colgante a partir de una disolución de
cristalización que comprende uno o más precipitantes seleccionados
del grupo que consiste en isopropanol, polietilen glicol, y terc
butanol (véase el Ejemplo 2, más adelante). La disolución de
cristalización puede comprender además una o más sales incluyendo
sales seleccionadas del grupo que consiste en NaCl y KCl, y uno o
más tampones incluyendo tampones seleccionados del grupo que
consiste en Tris (tris(hidroximetil)aminometano) y
bis-tris propano-Cl
(1,3-bis[tris(hidroximetil)metil-amino]propano
(véase el Ejemplo 2, más adelante). El pH de la disolución de
cristalización es preferiblemente entre pH 5 y 9, aunque la presente
invención también contempla otros valores de pH (véase el Ejemplo
2, más adelante).
Puede utilizarse cualquier técnica de
cristalización conocida por los expertos en la técnica para obtener
los cristales de la presente invención, incluyendo, pero sin
limitarse a, cristalización discontinua, difusión de vapor (bien en
gota posada o gota colgante) y microdiálisis. La siembra de los
cristales puede requerirse en algunos casos para obtener cristales
con calidad para rayos X. Por lo tanto, puede utilizarse micro y/o
macro siembra estándar de los cristales.
Los cristales de la presente invención pueden
formarse en el grupo espacial C2 con una molécula en la unidad
asimétrica y siendo las dimensiones de la unidad a = 51,4
\ring{A}, b = 93,8 \ring{A}, c = 78,7 \ring{A}
y \beta = 96,9º (véase el Ejemplo 2, más adelante). Los cristales
de la presente invención también pueden formarse en el grupo
espacial P2_{1}2_{1}2_{1} con dos moléculas en la unidad
asimétrica y siendo las dimensiones de la unidad a = 53,4
\ring{A}, b = 94,4 \ring{A}, c = 156,3 \ring{A}
(véase el Ejemplo 2, más adelante). Sin embargo, la presente
invención contempla cristales que se forman en cualquier grupo
espacial incluyendo, pero sin limitarse a, C2, P2_{1},
P2_{1}2_{1}2_{1}, P3_{1}2_{1}, P4_{3}2_{1}2_{1}, y
C222_{1}. Los cristales difractan a una resolución mayor de 4
\ring{A}, preferiblemente mayor de 2,5 \ring{A}.
Para recoger los datos de difracción a partir de
los cristales de la presente invención, los cristales pueden
congelarse rápidamente en el tampón de cristalización utilizado para
el crecimiento de dichos cristales, aunque preferiblemente con una
mayor concentración del precipitante (véase, por ejemplo, el Ejemplo
2 más adelante). Por ejemplo, pero sin ser limitativo, si el
precipitante utilizado fue PEG 1500 28%, los cristales pueden
congelarse rápidamente en la misma disolución de cristalización que
la utilizada para el crecimiento de dicho cristal en la que la
concentración del precipitante se incrementa hasta el 35% (véase el
Ejemplo 2, más adelante). Si el precipitante no es un crioprotector
suficiente (es decir, no se forma un cristal después de la
congelación rápida) pueden añadirse crioprotectores a la disolución
(por ejemplo, glicerol, PEG de bajo peso molecular, alcoholes, etc)
con el fin de conseguir la formación de cristal después de la
congelación rápida, siempre que el crioprotector sea compatible con
la conservación de la integridad de los cristales. Los cristales
congelados rápidamente se mantienen a una temperatura menor de
-110ºC y preferiblemente menor de -150ºC durante la recogida de los
datos cristalográficos mediante difracción de rayos X. Los datos de
difracción de rayos X pueden procesarse con DENZO y SCALEPACK
(Otwinowski y Minor, 1997, Method Ensemble.
276:307-326) aunque puede utilizarse
cualquier método conocido por los expertos en la técnica para
procesar los datos de difracción de rayos X.
Con el fin de determinar la estructura atómica
de HDLP según la presente invención, puede realizarse análisis por
reemplazamiento isomórfico múltiple (MIR), construcción de modelos y
refinamiento. Para el análisis MIR, los cristales pueden
impregnarse con átomos pesados para producir derivados de átomos
pesados necesarios para el análisis MIR. Tal y como se utiliza en
la presente memoria, derivado de átomo pesado o derivatización se
refiere al método para producir una forma modificada químicamente de
un cristal de una proteína o complejo proteico en el que dicha
proteína está unida específicamente a un átomo pesado en el cristal.
En la práctica, un cristal se impregna en una disolución que
contiene átomos o sales de metales pesados, o compuestos
organometálicos, por ejemplo, cloruro de plomo, cianuro de oro,
timerosal, acetato de plomo, acetato de uranilo, cloruro de
mercurio, cloruro de oro, etc, que puede difundir a través del
cristal y unirse específicamente a la proteína. La o las
localizaciones del o de los átomos o sales de los metales pesados
unidos pueden determinarse mediante análisis de difracción de rayos
X del cristal impregnado. Esta información se utiliza para generar
información de la fase MIR que se utiliza para construir la
estructura tridimensional de las HDLP o proteínas relacionadas con
HDLP cristalizadas de la presente invención. En una realización
preferida, los átomos pesados comprenden timerosal,
KAu(CN)_{2} y Pb(Me)_{3}OAc (véase
el Ejemplo 2 más adelante). Las fases MIR pueden calcularse
mediante cualquier programa conocido por los expertos en la técnica
y preferiblemente con el programa MLPHARE (The CCP4 suite: Programs
for computational crystallography, 1994, Acta Crystallogr. D.
50:760-763) y también puede utilizar la
señal de difracción anómala del derivado timerosal. En una
realización preferida, las fases MIR se calcularon a 2,5 \ring{A}
y tienen una figura media de mérito de 0,55 (véase la Figura 19 y
el Ejemplo 2 más adelante). Las fases pueden mejorarse cuando
resulte necesario por aplanamiento del disolvente mediante métodos
conocidos por los expertos en la técnica incluyendo, pero sin
limitarse a, mediante la utilización del programa DM (The CCP4
suite: Programs for computational crystallography, 1994, Acta
Crystallogr. D. 50:760-763).
Posteriormente, puede construirse un modelo
inicial de la estructura tridimensional utilizando el programa O
(Jones et al., 1991, Acta Crystallogr. A
47:110-119). La interpretación y construcción
de la estructura puede facilitarse además mediante la utilización
del programa CNS (Brunger et al., 1998, Acta
Crystallogr. D 54:905-921).
Para la determinación de la estructura del
complejo HDLP-compuesto inhibidor, si el grupo
espacial del cristal del complejo HDLP-compuesto
inhibidor es diferente, puede utilizarse el reemplazamiento
molecular utilizando una estructura conocida de
apo-HDLP (tal y como se refiere en la presente
memoria, apo-HDLP o apo-HDAC es la
enzima no complejada con un compuesto inhibidor) o cualquier
estructura conocida de complejo HDLP/inhibidor cuya estructura
pueda determinarse como se ha descrito anteriormente y como se
describe más adelante en el Ejemplo 2. Si el grupo espacial de los
cristales de HDLP-compuesto inhibidor es el mismo,
puede utilizarse refinamiento por cuerpos rígidos y diferencia de
fourier para resolver la estructura utilizando una estructura
conocida de apo-HDLP (tal y como se refiere en la
presente memoria, apo-HDLP o
apo-HDAC es la enzima no complejada con un
compuesto inhibidor) o cualquier estructura conocida de complejo
HDLP/inhibidor.
El término "reemplazamiento molecular" se
refiere a un método que implica generar un modelo preliminar de la
estructura tridimensional de los cristales de HDLP de la presente
invención cuyas coordenadas de estructura no se conocen antes de la
utilización del reemplazamiento molecular. El reemplazamiento
molecular se consigue orientando y situando una molécula cuyas
coordenadas de estructura se conocen (en este caso
apo-HDLP previamente determinada) en la celda
unidad como define el patrón de difracción de rayos X obtenido a
partir de un cristal de HDLP o proteína relacionada con HDLP cuya
estructura no se conoce para justificar lo mejor posible el patrón
de difracción observado del cristal desconocido. Entonces pueden
calcularse las fases a partir de este modelo y combinarse con las
amplitudes observadas para proporcionar una síntesis de Fourier
aproximada de la estructura cuyas coordenadas no se conocen. Esto
por su parte puede someterse a cualquiera de las formas de
refinamiento para proporcionar una estructura final correcta.
Puede utilizarse cualquier método conocido por
el experto en la técnica para determinar la estructura mediante
reemplazamiento molecular. Por ejemplo, el programa AMORE (The CCP4
suite: Programs for computational crystallography, 1994, Acta
Crystallogr. D. 50:760-763) puede
utilizarse para determinar la estructura de una histona desacetilasa
desconocida +/- un inhibidor mediante reemplazamiento molecular
utilizando las coordenadas de apo-HDLP (Figura 16).
Para la determinación de la estructura del compuesto inhibidor TSA,
se obtuvo la estructura de TSA a partir de la Cambridge Structural
Database (Refcode TRCHST,
<<http://www.ccdc.cam.ac.uk>>) puede utilizarse para
definir las restricciones estereoquímicas utilizadas en el
refinamiento con el programa CNS (Brunger et al., 1998,
Acta Crystallogr. D 54:905-921).
La información de la estructura tridimensional y
las coordenadas atómicas asociadas con dicha información
estructural de HDLP son útiles para resolver la estructura de
proteínas cristalizadas que pertenecen a la familia HDAC mediante
reemplazamiento molecular. De manera similar, puede resolverse
cualquier estructura de una proteína cristalizada que se sospecha
que tiene una estructura similar a HDLP tomando como base la
similitud o identidad funcional o de secuencia mediante
reemplazamiento molecular con la información estructural de HDLP de
la presente invención. La estructura de proteínas relacionadas con
HDLP determinada mediante reemplazamiento molecular como se ha
descrito anteriormente y en el Ejemplo 2 más adelante, comprende una
desviación de la media cuadrática (rmsd) no mayor de 2,0 \ring{A}
en las posiciones de átomos C\alpha para al menos el 50% o más de
los aminoácidos de la estructura de los 375 restos de HDLP de
longitud completa. Dicha rmsd puede esperarse tomando como base la
identidad en la secuencia de aminoácidos. Chothia y Lesk, 1986,
Embo J. 5:823-826.
Las estructuras tridimensionales refinadas de
HDLP de la presente invención, específicamente
apo-HDLP, mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser
que comprende un átomo de cinc en el sitio activo, complejo HDLP/TSA
que comprende un átomo de cinc en el sitio activo y complejo
HDLP/SAHA que comprende un átomo de cinc en el sitio activo, están
representadas por las coordenadas atómicas mostradas en las Figuras
16 a 19, respectivamente. El modelo refinado para
apo-HDLP que comprende los aminoácidos
1-375 consiste en los restos de HDLP de tipo salvaje
2 a 373 con los restos 1, 374 y 375 no modelados y presumiblemente
desordenados y se determinó a una resolución de 1,8 \ring{A}. De
manera similar, el modelo refinado para el mutante doble de HDLP
Cys75Ser/Cys77Ser que comprende un átomo de cinc en el sitio activo
también consiste en los restos 2 a 373 con los restos 1, 374 y 375
no modelados y presumiblemente desordenados y se determinó a una
resolución de 2,0 \ring{A}. El modelo refinado para el complejo
HDLP/TSA que comprende un átomo de cinc en el sitio activo consiste
en los restos 2 a 373 del mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser
con los restos 1, 374 y 375 no modelados y presumiblemente
desordenados, tiene TSA en el bolsillo de unión y se determinó a una
resolución de 2,1 \ring{A}. El complejo HDLP/SAHA es similar al
complejo HDLP/TSA pero tiene SAHA en el bolsillo de unión y se
determinó a una resolución de 2,5 \ring{A}.
Para los fines de una descripción adicional de
la estructura de HDLP y de proteínas relacionadas con HDLP,
incluyendo, pero sin limitarse a, HDAC, a partir de los datos
obtenidos de los cristales de HDLP de la presente invención, se
proporciona la definición de los términos siguientes:
El término "lámina \beta" se refiere a
una o más cadenas polipeptídicas (o cadenas \beta) que están
alineadas entre sí y que están unidas de manera regular por enlaces
de hidrógeno entre los grupos C=O y N-H de la cadena
principal. Por lo tanto, todos los enlaces de hidrógeno en una
lámina beta se forman entre diferentes segmentos del polipéptido.
La mayoría de las láminas \beta en las proteínas son completamente
paralelas (interiores de la proteína) o completamente
anti-paralelas (un lado de cara al disolvente y el
otro al núcleo hidrofóbico). Los enlaces de hidrógeno en las
láminas antiparalelas son perpendiculares a la dirección de la
cadena y están espaciados uniformemente como pares entre las
cadenas. Los enlaces de hidrógeno en las láminas paralelas están
inclinados respecto a la dirección de la cadena y espaciados
uniformemente entre las cadenas.
El término "hélice \alpha" se refiere a
la conformación helicoidal más abundante que se encuentra en las
proteína globulares. La longitud media de una hélice \alpha es 10
restos. En una hélice \alpha, todos los protones amida apuntan
hacia el extremo N-terminal y todos los oxígenos
carbonilo apuntan hacia el extremo C-terminal. La
naturaleza repetida de los pares phi, psi asegura esta orientación.
Los enlaces de hidrógeno en una hélice \alpha también muestran un
patrón repetido en el que el núcleo C=O del resto X (en el que X se
refiere a cualquier aminoácido) se une mediante enlace de hidrógeno
con el núcleo HN del resto X+4. La hélice \alpha es una
estructura enrollada caracterizada por 3,6 restos por giro y con una
traslación a lo largo de su eje de 1,5 \ring{A} por aminoácido.
Por lo tanto, el avance por vuelta es 3,6x1,5 ó 5,4 \ring{A}. El
sentido del giro de las hélices alfa es siempre a derechas.
El término "bucle" se refiere a cualquier
otra conformación de aminoácidos (es decir, no una hélice, cadena o
lámina). Además, un bucle puede contener interacciones de enlaces
entre las cadenas laterales de los aminoácidos pero no de manera
repetitiva regular.
Los restos de aminoácidos en los péptidos se
referirán de aquí en adelante en la presente memoria como sigue:
Fenilalanina es Phe o F; Leucina es Leu o L; Isoleucina es Ile o I;
Metionina es Met o M; Valina es Val o V; Serina es Ser o S; Prolina
es Pro o P; Treonina es Thr o T; Alanina es Ala o A; Tirosina es Tyr
o Y; Histidina es His o H; Glutamina es Gln o Q; Asparagina es Asn
o N; Lisina es Lys o K; Ácido Aspártico es Asp o D; Ácido Glutámico
es Glu o E; Cisteína es Cys o C; Triptófano es Trp o W; Arginina es
Arg o R; y Glicina es Gly o G. Para una descripción adicional de
aminoácidos, por favor referirse a Proteins: Structure and
Molecular Properties por Creighton, T.E., W.H. Freeman et
al., Nueva York, 1983.
El término "aminoácido cargado
positivamente" se refiere a cualquier aminoácido que tiene una
cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiológicas
normales. Los ejemplos de aminoácidos cargados positivamente son
Arg, Lys e His. El término "aminoácido cargado negativamente"
se refiere a cualquier aminoácido que tiene una cadena lateral
cargada negativamente en condiciones fisiológicas normales. Los
ejemplos de aminoácidos cargados negativamente son Asp y Glu. El
término "aminoácido hidrofóbico" se refiere a cualquier
aminoácido que tiene una cadena lateral no cargada, no polar que es
relativamente insoluble en agua. Los ejemplos de aminoácidos
hidrofóbicos son Ala, Leu, Ile, Gly, Val, Pro, Phe, Trp y Met. El
término "aminoácido hidrofílico" se refiere a cualquier
aminoácido que tiene una cadena lateral no cargada polar que es
relativamente soluble en agua. Los ejemplos de aminoácidos
hidrofílicos son Ser, Thr, Tyr, Asp, Gln y Cys. El término
"aminoácido aromático" se refiere a cualquier aminoácido que
comprende una estructura de anillo. Los ejemplos de aminoácidos
aromáticos son His, Phe, Trp y Tyr.
El término "sistema de relé de carga" se
refiere a una ordenación His-Asp como describen
Fersht y Sperling, 1973, J. Mol. Biol.
74:137-149; Blow et al., 1969,
Nature 221:337-340.
La información obtenida a partir de las
estructuras tridimensionales de la presente invención revelan que
HDLP tiene una estructura de dominio único que pertenece a la clase
de plegamientos abierta \alpha/\beta (véase, por ejemplo,
Branden, 1980, Q. Rev. Biophys. 13:
317-38). En las Figuras 4A y 4B se muestran dos
vistas ortogonales de la estructura tridimensional global de HDLP.
La estructura de HDLP tiene una lámina \beta paralela central de
ocho cadenas (las cadenas están organizadas como
\beta2-\beta1-\beta3-\beta8-\beta7-\beta4-\beta5-\beta6)
y dieciséis hélices \alpha (marcadas \alpha1 a \alpha16,
respectivamente). Véase la Figura 4C. Cuatro de las hélices se
agrupan en cada lado de la lámina \beta (\alpha7, \alpha8,
\alpha9, \alpha10 y \alpha11, \alpha12, \alpha13,
\alpha14) formando el núcleo de estructura \alpha/\beta
característico de esta clase de plegamientos. La mayoría de las
ocho hélices restantes se sitúan cerca de un lado de la lámina
\beta, cerca de las cadenas
\beta2-\beta1-\beta3-\beta8.
A partir de los extremos C-terminales de las
cadenas \beta se originan bucles grandes bien definidos (Bucles
L1-L7; Figura 4C). Las hélices extra y los bucles
grandes L1-L7 están asociados con una extensión
significativa de la estructura más allá del resto de núcleo
\alpha/\beta. Esta extensión de la estructura da lugar a dos
características estructurales destacadas: un bolsillo profundo
estrecho y una cavidad interna adyacente al bolsillo. Estas dos
características de la arquitectura comprenden el sitio activo
(véase la Figura 5). La estructura de las proteínas relacionadas con
HDLP (por ejemplo, HDAC) también puede comprender la estructura
característica \alpha/\beta conservada.
El término "sitio activo" comprende
cualquiera o todos los sitios siguientes en HDLP, el sitio de unión
del sustrato, el sitio en el que se produce la escisión de un grupo
acetilo de un sustrato o el sitio al que se une un inhibidor de la
familia HDAC o, más particularmente, HDLP. El sitio activo, tal y
como se refiere en la presente memoria, comprende Asp166, Asp258,
His170, Tyr297, His131, His132, Asp168, Asp173, Phe141, Phe198,
Leu265, Pro22 y Gly140 y también un metal unido al fondo del
bolsillo por Asp173, Asp168 e His definido por las coordenadas
listadas en las Figuras 16 a 19 con una rmsd de 2,0 \ring{A}. El
metal que se une al fondo del bolsillo será un catión divalente
seleccionado del grupo que consiste en cinc, cobalto o
manganeso.
El bolsillo profundo estrecho tiene una forma
semejante a un tubo con una profundidad de \sim 11 \ring{A}. La
abertura del bolsillo se estrecha hasta la mitad hasta \sim 4,5
por 5,5 \ring{A} y se vuelve más ancho en el fondo (véase la
Figura 5A). El bolsillo y sus alrededores cercanos están
constituidos por los bucles L1 a L7.
Las paredes del bolsillo están cubiertas con
cadenas laterales de restos hidrofóbicos y aromáticos (Pro22, Tyr91
cerca de la entrada; y Gly140, Phe141, Phe198, Leu265 y Tyr297 más
abajo; Figura 5B). Para la numeración de los aminoácidos por favor
referirse a SEQ ID NO:1. Son particularmente interesantes Phe141 y
Phe198, cuyos grupos fenilo están enfrentados entre sí en paralelo
a una distancia de 7,5 \ring{A}, marcando la parte más fina del
bolsillo (véase la Figura 5B). Es particularmente interesante que
sólo un resto del bolsillo es diferente en HDAC1 cuando se alinean
las secuencias (el alineamiento puede lograrse utilizando el
programa DNAstar^{TM} MegAlign^{TM}, Madison, WI), siendo este
resto Glu98 de HDAC1 que es Tyr91 en HDLP. La estructura revela que
este resto en HDLP está mayoritariamente expuesto al disolvente.
Cerca del fondo del bolsillo del sitio activo en
su punto más estrecho, está localizado un ion cinc (véase la Figura
6A). Con el fin de obtener el cinc en la estructura, los cristales
pueden impregnarse con cinc (por ejemplo, ZnCl_{2}) o
co-cristalizarse en presencia de cinc. El ion cinc
está coordinado por Asp168 (O\delta1, 2,1 \ring{A}), His170
(N\delta1, 2,1 \ring{A}), Asp258 (O\delta1, 1,9 \ring{A}) y
una molécula de agua (2,5 \ring{A}). Véanse las Figuras 5B y 6B.
Los restos de aminoácidos que coordinan cinc están organizados en
una geometría tetraédrica, pero la posición de la molécula de agua,
que también está unida por enlace de hidrógeno a His131, se desvía
de esta geometría \sim25º.
Además de los ligandos de cinc, el fondo del
bolsillo contiene dos histidinas (His131 e His132), dos ácidos
aspárticos (Asp166 y Asp173) y una tirosina (Tyr297). Véanse las
Figuras 5B y 10B. Cada una de las histidinas forma un enlace de
hidrógeno a través de su N\delta1 con un oxígeno carboxilato del
ácido aspártico, con el oxígeno localizado en el plano del anillo
de imidazol (Figura 5B). Esta organización His-Asp
es característica del sistema de relé de carga presente en los
sitios activos de las proteasas de serina, en los que sirve para
polarizar el N\varepsilon del imidazol y para incrementar su
basicidad. Fersht y Sperling, 1973, J. Mol. Biol.
74:137-149; Blow et al., 1969,
Nature 221:337-340.
El par de relé de carga
Asp166-His131 (de aquí en adelante en la presente
memoria referido como "relé de carga enterrado") está situado
aún más profundamente en el bolsillo y más escondido si se compara
con el relé de carga Asp173-His132 (de aquí en
adelante en la presente memoria referido como "relé de carga
expuesto") que está parcialmente expuesto al disolvente. El relé
de carga enterrado forma un enlace de hidrógeno (2,6 \ring{A})
con la molécula de agua unida a cinc referida anteriormente y este
enlace de hidrógeno podría contribuir a la desviación de la
coordinación agua-cinc de la geometría ideal (Figura
5B). El relé de carga expuesto está dirigido a un punto que está
\sim 2,5 \ring{A} alejado de la molécula de agua y más cerca de
la superficie.
La Tyr297 está situada al lado del cinc, opuesta
a donde están localizados los dos relés de carga. El grupo
hidroxilo de la Tyr se encuentra 4,4 \ring{A} alejado del átomo de
cinc y no tiene interacciones con el resto de la proteína (Figura
5B). Al lado de la Tyr297, existe una abertura en la pared del
bolsillo que da lugar a la cavidad interna adyacente.
El suelo de la cavidad interna está formado por
partes de los bucles L3 y L7 que salen de las cadenas \beta y el
techo está formado por el segmento
\alpha1-L1-\alpha2. El bucle L1
parece más flexible que los otros bucles de la estructura. Esto
puede permitir el intercambio transitorio de los contenidos de la
cavidad con el disolvente.
La cavidad está formada mayoritariamente por
restos hidrofóbicos y es particularmente rica en restos de glicina
(Ala127, Gly128, Gly129, Met130, y Phe141 de L3; Gly293, Gly294,
Gly295 y Gly296 de L7; y Tyr17, Pro22 y Leu23 de L1). Sólo hay dos
restos cargados en la cavidad (Arg27 e His21) y éstos proceden del
bucle L1.
La cavidad puede proporcionar espacio para la
difusión del producto acetato fuera del centro catalítico, que
puede por otra parte reunirse y protegerse durante la desacetilación
frente al disolvente cuando se une el sustrato. Dicha función de la
cavidad se ve reforzada por la observación de que la cavidad
contiene tres moléculas de agua y dos de isopropanol (del tampón de
cristalización) en la estructura de 1,8 \ring{A} de la
apo-proteína. La cavidad también puede unir otro
cofactor, además del cinc, para facilitar la actividad enzimática de
HDLP. Un mecanismo catalítico propuesto para la desacetilación se
proporciona en la Figura 8.
La estructura de HDLP tal y como se define por
la presente invención, junto a la homología de secuencia de HDAC1,
muestra que la proteína HDLP de 375 aminoácidos corresponde al
núcleo catalítico de la histona desacetilasa que se conserva en la
familia HDAC (véase la Figura 2). El 35,2% de identidad de secuencia
entre HDLP y HDAC1 predice una similitud estructural con una rmsd
en las posiciones C\alpha de \sim 1,5 \ring{A}. Chothia y Lesk
describen la relación entre la divergencia de secuencia y la
estructura de proteínas en Embo J.
5:823-826 (1986). El extremo
C-terminal de 40 restos de HDLP tiene probablemente
una estructura divergente ya que esta región tiene una menor
homología con HDAC1, mientras que la hélice \alpha16 en esta
región es parte del plegamiento central abierto \alpha/\beta
conservado y HDAC1 comprende probablemente una hélice similar. Sin
embargo, aunque esta región C-terminal es
divergente, esta región está fuera del sitio activo y es probable
que no afecte a la estructura del sitio activo. Además del extremo
C-terminal del núcleo catalítico de la histona
desacetilasa, los miembros de la familia HDAC son divergentes en
longitud y secuencia. En la familia HDAC, esta región (restos de
aminoácidos \sim390-482) es muy polar, llena de
restos ácidos y probablemente es flexible o está débilmente
plegada.
La homología HDLP-HDAC se centra
mayoritariamente en el núcleo hidrofóbico y en los bucles
L1-L7, presentando partes de los bucles que forman
el bolsillo y la cavidad adyacente el mayor grado de conservación en
la secuencia de los restos de aminoácidos (Figura 9A y 9B).
Específicamente, todos los restos polares del sitio activo (los
ligandos de cinc, los dos sistemas de relés de carga, y Tyr297) y
los restos hidrofóbicos que forman las paredes del bolsillo
(Gly140, Phe141, Phe198 y Leu265) son idénticos. Entre los restos
que forman la cavidad interna, los más cercanos al sitio activo son
idénticos o están sustituidos de manera conservativa (por ejemplo,
Leu23 \rightarrow Met y Met130 \rightarrow Leu). Los restos de
la superficie alrededor del bolsillo están conservados en menor
grado aunque presentan una identidad de secuencia mayor del 35%.
La información obtenida a partir de las
estructuras de cristal del complejo HDLP unida al inhibidor de la
presente invención revela una información detallada que es útil en
el diseño, aislamiento, cribado y determinación de compuestos
inhibidores potenciales que pueden inhibir los miembros de la
familia HDLP/HDAC. Como se ha descrito anteriormente, la estructura
de HDLP consiste en una lámina \beta paralela con hélices \alpha
agrupadas frente a ambas caras (Figura 4A, 4B y 4C). En un extremo
de la lámina \beta, 7 bucles (L1-L7) forman un
bolsillo estrecho semejante a un tubo que están formados por restos
hidrofóbicos y que comprenden un sitio de unión de cinc, varias
cadenas laterales polares, incluyendo dos relés de carga
Asp-His. La mutación de los ligandos de cinc y de
otros restos polares del fondo del bolsillo reduce o elimina la
actividad catalítica.
Los presentes inventores han encontrado que la
mutación en el sitio Tyr297Phe reducía la actividad. Véanse
también, Hassig et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 95:3519-3524; Kadosh y Struhl, 1998,
Genes Dev. 12:797-805. La eliminación
de la actividad mediante la mutación de estos restos indica que esta
región es el sitio activo de la enzima. Adyacente al sitio activo,
hay una cavidad interna que puede proporcionar espacio para la
difusión del producto acetato de la reacción. La homología en el
sitio activo entre HDLP y HDAC1, como se ha descrito anteriormente,
indica que comparten una homología estructural y funcional.
El compuesto inhibidor, tricostatina A (TSA)
(Tsuji et al., 1976, J. Antibiotics
29:1-6) une HDLP insertando su cadena
alifática larga, que tiene un grupo ácido hidroxámico en un extremo,
en el bolsillo (Figura 6A, 6B y 6C). La cadena alifática realiza
múltiples contactos en la parte hidrofóbica del bolsillo. El ácido
hidroxámico alcanza el fondo polar del bolsillo en el que coordina
el cinc de una manera bidentada y también forma enlaces de
hidrógeno con los restos polares en el sitio activo, incluyendo las
histidinas del sistema de relé de carga. El grupo
dimetilamino-fenilo aromático en el otro extremo de
la cadena de TSA contacta en la entrada del bolsillo y sirve para
cubrirlo. Los restos de aminoácidos de HDLP que se ponen en contacto
con TSA están conservados en HDAC, lo que indica que TSA se une a e
inhibe HDAC de una manera similar a HDLP.
En el complejo, el ácido hidroxámico, la mayor
parte de la cadena alifática y parte del grupo
dimetilamino-fenilo de TSA están enterrados (60%
del área de la superficie de TSA; Figura 6A). El grupo ácido
hidroxámico se une al cinc de una manera bidentada formando enlaces
mediante sus grupos carbonilo (2,4 \ring{A}) e hidroxilo (2,2
\ring{A}) lo que resulta en un Zn^{2+}
penta-coordinado (Figura 6B y 6C). El grupo
hidroxilo del ácido hidroxámico reemplaza a la molécula de agua que
se une al cinc en la estructura apo-HDLP descrita
anteriormente. El ácido hidroxámico también se une con enlaces de
hidrógeno a las dos histidinas del sistema de relé de carga (oxígeno
del hidroxilo a His131 N\varepsilon2, 2,8 \ring{A}; y nitrógeno
a His132 N\varepsilon2, 2,8 \ring{A}) y el grupo hidroxilo de
Tyr297 (2,4 \ring{A}; Figura 6B y 6C).
La cadena de alqueno ramificada de 5 carbonos de
longitud de TSA se ajusta perfectamente a la parte estrecha del
bolsillo realizando múltiples contactos de van der Waals con todos
los grupos hidrofóbicos que forman el bolsillo (Figura 6B y 6C).
Cerca de su parte central, la cadena contiene un enlace doble
carbono-carbono sustituido con metilo que se
encuentra entre los grupos fenilo de Phe141 y Phe98 en el punto más
ajustado del bolsillo (Figura 6A y 6B). La longitud de la cadena de
alqueno parece óptima para abarcar la longitud del bolsillo y
permitir contactos tanto en el fondo como en la entrada del
bolsillo, aunque el grupo de cubierta de Fórmula (I) puede
proporcionar la longitud para abarcar el bolsillo permitiendo una
cadena alqueno más corta (cadena alifática).
En la entrada del bolsillo, una cara de la
estructura planar formada por el dimetilamino-fenilo
y grupos carbonilo adyacentes de TSA se pone en contacto en el
borde del bolsillo (Pro22, Tyr91, Phe141; Figura 6B y 6C). Este
empaquetamiento se facilita por el ángulo de aproximadamente 110º en
la estructura global de TSA en la unión de la cadena alifática y el
grupo dimetilamino-fenilo (que se produce en el
carbono C8 hibridado en sp^{3}). Después de la unión de TSA, la
cadena lateral de Tyr91, que está mayoritariamente expuesta al
disolvente, cambia su conformación para hacer espacio al grupo
dimetilamino-fenilo. Este es el único cambio
observado cerca del sitio activo después de la unión de TSA.
El grupo ácido hidroxámico es un resto habitual
en los inhibidores de metaloproteasas dependientes de cinc. Véanse,
la Patente de EEUU No. 5.919.940 y 5.917.090; Véanse también, Grams
et al., 1995, Biochemistry
34:14012-14020; Lovejoy et al., 1999,
Nat. Struct. Biol. 6:217-221; y Holmes
y Matthews, 1981, Biochemistry
20:6912-6920. Al igual que TSA, estos
inhibidores también coordinan el cinc del sitio activo de una manera
bidentada utilizando sus oxígenos hidroxilo y carbonilo
hidroxamato, reemplazan la molécula de agua nucleofílica por sus
grupos hidroxilo hidroxamato y forman enlaces de hidrógeno con la
base general (Grams et al., 1995, Biochemistry
34:14012-14020; Lovejoy et al., 1999,
Nat. Struct. Biol. 6:217-221; y Holmes
y Matthews, 1981, Biochemistry
20:6912-6920).
SAHA, que tiene una actividad inhibidora
\sim30 veces menor que TSA (Richon et al., 1998, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95:3003-3007) une
HDLP de manera similar a TSA (véase, por ejemplo, la Figura 4D). El
grupo ácido hidroxámico de SAHA realiza los mismos contactos con el
cinc y los restos del sitio activo, y la importancia de estas
interacciones está recalcada por la pérdida de actividad de los
derivados de SAHA que no tienen el grupo hidroxámico (Richon et
al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95:3003-3007). La cadena alifática de seis
carbonos de longitud de SAHA se empaqueta en la parte hidrofóbica
semejante a un tubo del bolsillo. Sin embargo, comparada con TSA la
cadena alifática de SAHA no se ajusta tan perfectamente y realiza
menos contactos de van der waals, en parte, debido a que SAHA no
contiene la rama de grupo metilo C15 de TSA. SAHA tampoco presenta
los enlaces dobles de TSA en esta región y esto puede dar lugar a
una flexibilidad incrementada de la cadena alifática. El grupo de
cubierta de SAHA consiste en un grupo fenil-amino
cetona. En la estructura del cristal, el grupo fenilo tiene una
densidad electrónica menor, lo que sugiere que no se ajusta tan bien
como el grupo de cubierta de TSA. Esto puede deberse a una
separación mayor entre los grupos hidroxámico y de cubierta de SAHA
comparada con la de TSA (comparar TSA, Fórmula (II) y SAHA, Fórmula
(III), a continuación).
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación de la estructura de HDLP y de
HDLP unida a un compuesto inhibidor ha permitido, por primera vez,
la identificación del sitio activo de HDLP y de proteínas
relacionadas con HDLP, tales como las proteínas que pertenecen a la
familia HDAC.
La información de la estructura tridimensional y
de las coordenadas atómicas asociadas con dicha información
estructural de HDLP unida a un compuesto inhibidor es útil para el
diseño racional de fármacos proporcionando un método para
identificar compuestos inhibidores que se unen a e inhiben la
actividad enzimática de HDLP, proteínas de la familia HDAC y otras
proteínas semejantes a la histona desacetilasa relacionadas con
HDLP. Dicho método para identificar dicho inhibidor potencial para
una enzima que comprende actividad desacetilasa comprende las
etapas de (a) utilizar una estructura tridimensional de HDLP como se
define por sus coordenadas atómicas listadas en las Figuras 16 a
19; (b) utilizar dicha estructura tridimensional para diseñar o
seleccionar dicho inhibidor potencial; (c) sintetizar dicho
inhibidor potencial; (d) poner en contacto dicho inhibidor
potencial con dicha enzima en presencia de un sustrato acetilado; y
(e) determinar la capacidad de dicho inhibidor para inhibir dicha
actividad desacetilasa.
Los inhibidores potenciales de HDLP y
relacionadas con HDLP (por ejemplo, HDAC) identificados mediante el
método de la presente invención están representados por la fórmula
(I)
en la que X comprende un grupo de
cubierta que se une a al menos un aminoácido seleccionado del grupo
que consiste en prolina y leucina; Y comprende un grupo de cadena
alifática que se une a al menos un aminoácido seleccionado del
grupo que consiste en leucina, fenilalanina y glicina; y Z comprende
un grupo de unión del sitio activo que se une a al menos un
aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido aspártico,
tirosina e histidina y en el que Z puede unirse además a un átomo
de cinc y con la condición de que el compuesto de Fórmula (I) no es
TSA, trapoxina, SAHA, derivados de SAHA descritos en las Patentes de
EEUU Nos. 5.608.108; 5.700.811; 5.773.474; 5.840.960 y
5.668.179.
La presente invención permite la utilización de
técnicas de diseño molecular para diseñar, identificar y sintetizar
entidades y compuestos químicos, incluyendo compuestos inhibidores,
capaces de unirse al sitio activo de HDLP y proteínas relacionadas
con HDLP. Las coordenadas atómicas de apo-HDLP y
HDLP unida a un inhibidor pueden utilizarse junto con modelado
computacional utilizando un programa de acoplamiento
("docking") tal como GRAM, DOCK, HOOK o AUTODOCK (Dunbrack
et al., 1997, Folding & Design
2:27-42) para identificar inhibidores
potenciales de HDLP y proteínas relacionadas con HDLP (por ejemplo,
HDAC1). Este procedimiento puede incluir el ajuste por ordenador de
inhibidores potenciales al sitio activo de HDLP para descubrir el
grado de complementación de la forma y la estructura química del
inhibidor potencial con el sitio activo o para comparar los
inhibidores potenciales con la unión de TSA o SAHA en el sitio
activo. Véanse, Bugg et al., 1998, Scientific American
Diciembre:92-98; West et al., 1995,
TIPS 16:67-74. Los inhibidores
potenciales diseñados mediante modelado con un programa de
acoplamiento se ajustan a la fórmula general (I) como se ha descrito
anteriormente. También pueden utilizarse programas informáticos
para estimar la atracción, repulsión y los impedimentos estéricos
de HDLP y del compuesto inhibidor potencial. Generalmente, cuanto
más perfecto es el ajuste menor son los impedimentos estéricos
mayores las fuerzas de atracción y mayor es la especificidad que son
características importantes para un compuesto inhibidor específico
que interacciona más probablemente con HDLP y proteínas
relacionadas con HDLP que con otras clases de proteínas. Estas
características se desean particularmente cuando el compuesto
inhibidor es un fármaco antitumoral
potencial.
potencial.
Los compuestos de la presente invención también
pueden diseñarse mediante la inspección visual de la estructura
tridimensional para determinar inhibidores de la desacetilasa más
eficaces. Este tipo de modelado puede referirse como diseño de
fármacos "manual". El diseño de fármacos manual puede utilizar
la inspección y el análisis visual utilizando un programa de
visualización de gráficos tal como "O" (Jones, T.A., Zhou,
J.Y., Cowan, S.W., y Kjeldgaard, M., Improved method for building
protein models in electron density maps and the location of errors
in these models, Acta Crystallog., A47,
100-119).
Los compuestos inhibidores potenciales pueden
seleccionarse inicialmente por su similitud estructural respecto a
los constituyentes X, Y y Z de la fórmula (I) mediante diseño de
fármacos manual. El análogo estructural diseñado de esta manera
puede modificarse entonces mediante programas de modelado
informático para definir mejor los candidatos que probablemente
sean más eficaces. La reducción del número de candidatos potenciales
es útil ya que puede no resultar posible sintetizar y cribar un
número incontable de variaciones de compuestos que pueden tener
alguna similitud con moléculas inhibidoras conocidas. Dicho análisis
se ha mostrado eficaz en el desarrollo de inhibidores de la
proteasa de VIH (Lam et al., 1994, Science
263:380-384; Wlodawer et al., 1993,
Ann. Rev. Biochem. 62:543-585; Appelt,
1993, Perspectives in Drug Discovery and Design
1:23-48; Erickson, 1993, Perspectives in
Drug Discovery and Design 1:109-128).
Alternativamente, el cribado aleatorio de una biblioteca de
moléculas pequeñas podría dar lugar a inhibidores potenciales cuya
actividad inhibidora puede analizarse mediante modelado
computacional como se ha descrito anteriormente para determinar
mejor su eficacia como inhibidores.
Los compuestos diseñados utilizando la
información de la presente invención pueden ser inhibidores
competitivos o no competitivos. Estos inhibidores diseñados pueden
unirse a todo o parte del sitio activo de HDLP y pueden ser más
potentes, más específicos, menos tóxicos y más eficaces que los
inhibidores conocidos de HDLP y proteínas relacionadas con HDLP y
particularmente HDAC. Los inhibidores diseñados también pueden ser
menos potentes pero pueden tener una vida media mayor in
vivo y/o in vitro y, por lo tanto, ser más eficaces
inhibiendo la actividad histona desacetilasa in vivo y/o
in vitro durante periodos de tiempo prolongados. Dichos
inhibidores diseñados son útiles para inhibir la actividad histona
desacetilasa de HDLP y proteínas relacionadas con HDLP (por
ejemplo, HDAC1), para inhibir el crecimiento celular in vitro
e in vivo y pueden ser particularmente útiles como
agentes
antitumorales.
antitumorales.
La presente invención también permite la
utilización de técnicas de diseño molecular para cribar por medios
informáticos bases de datos de moléculas pequeñas para localizar
entidades o compuestos químicos que puedan unirse a HDLP de una
manera análoga a la de TSA y SAHA como se ha definido por la
estructura de la presente invención. Dicho cribado informático
puede identificar varios grupos que pueden definirse como "X",
"Y" o "Z" de fórmula (I) anterior y que pueden utilizarse
para sintetizar los inhibidores potenciales de la presente
invención que comprende la fórmula (I). Dichos inhibidores
potenciales pueden ensayarse para determinar su actividad
inhibidora de histona desacetilasa en un ensayo de actividad histona
desacetilasa (véase el Ejemplo 3 más adelante), pueden
co-cristalizarse con HDLP para determinar las
características de unión mediante técnicas cristalográficas con
rayos X como se ha definido anteriormente (por ejemplo, dicha
estructura de co-cristal puede determinarse
mediante reemplazamiento molecular para evaluar las características
de unión de dicho inhibidor potencial) o puede evaluarse tomando
como base la actividad de unión incubando dicho inhibidor potencial
con dicha HDLP, realizando una filtración en gel para separar
cualquier inhibidor potencial libre del inhibidor unido a HDLP y
determinando la cantidad de actividad histona desacetilasa de HDLP
unida al inhibidor. Para determinar las constantes de la unión (por
ejemplo, Kd), pueden utilizarse métodos conocidos por los expertos
en la técnica tales como análisis Biacore^{TM}, calorimetría
isotérmica de titulación, Elisa con un fármaco conocido en la placa
para mostrar unión competitiva o mediante un ensayo de actividad
desacetilasa.
El diseño de inhibidores potenciales de la
presente invención se facilita adicionalmente mediante referencia a
la Figura 9, que es una figura de la representación de la superficie
que muestra los surcos de la superficie. El análisis de dichos
surcos permite una mejor comprensión de los constituyentes del grupo
de cubierta de fórmula (I). Los surcos de la superficie están
marcados surco A, surco A', surco B y surco C, a los que pueden
unirse grupos de cubierta adicionales. La estructura de HDLP unida a
TSA o a SAHA muestra que los grupos de cubierta de TSA y SAHA se
unen al surco A. Mediante análisis de la identidad de la secuencia
de aminoácidos de HDLP y HDAC, el Surco A está conservado en HDAC,
tiene un componente hidrofóbico significativo, se encuentra lo
suficientemente profundo como para permitir interacciones
significativas y es también el mayor de los cuatro surcos. Además
del grupo dimetilamino-fenilo de TSA, el surco A
puede ajustar aproximadamente 200 dalton de grupos (por ejemplo, el
surco A podría acomodar un grupo semejante al naftaleno después de
un espaciador apropiado, etc.). El Surco A, tal y como se refiere
en la presente memoria, se caracteriza por los restos conservados
siguientes de HDLP: His21, Pro22, Lys24, Phe141, Leu265 y Phe335. La
periferia del surco A comprende restos no conservados. Además, el
Surco A', tal y como se refiere en la presente memoria, comprende
mayoritariamente restos no conservados.
El surco B es adyacente al bolsillo. Es
significativo que el fondo del surco B comprende el nitrógeno N
epsilon de His170, que coordina el cinc a través de su nitrógeno N
delta. Puede conseguirse una energía de unión significativa
mediante el contacto del protón N\varepsilon de His 170 con un
ácido carboxílico o un grupo sulfato. Además, el surco B puede ser
lo suficientemente grande como para acoplar un grupo fenilo, cuya
superficie puede comprender una carga negativa parcial que puede
agruparse sobre el protón N epsilon de His170. Los restos
conservados del surco B, tal como se refieren en la presente
memoria, son: His170, Tyr196 y Leu265.
El surco C no está tan conservado como los otros
dos surcos y los restos de aminoácidos que comprenden el surco C
son mayoritariamente polares y expuestos al disolvente. El surco C,
tal y como se refiere en la presente memoria, comprende los restos
conservados siguientes: Asn87, Gly140 y Phe198.
Los compuestos de la presente invención están
representados por la fórmula (I):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos de constituyentes X adecuados en
los que X comprende un grupo de cubierta pueden describirse en tres
categorías, dependiendo de hacia qué superficie de surco A, A', B
y/o C estén dirigidos. El grupo de cubierta puede comprender las
tres categorías en el mismo compuesto. Puede resultar
particularmente beneficioso reemplazar el grupo de cubierta de TSA
o SAHA por una estructura grande y rígida. Los ejemplos no
limitativos de grupos de cubierta adecuados (X) de fórmula (I) que
pueden unirse al surco A son: (1) unir un conector
1-3 metilo seguido de un grupo fenilo o naftaleno de
la posición para o meta del grupo fenilo de SAHA representado por la
fórmula
(IV):
(IV):
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
(2) unir un conector 2-3 metilo
seguido de un grupo fenilo o naftaleno de la posición meta del grupo
de cubierta fenilo de TSA o del grupo dimetil amino de TSA
representado por la fórmula (V):
\vskip1.000000\baselineskip
y el que puede unirse al surco B es
un grupo espaciador 1-3 metilo seguido de un grupo
carboxilato, sulfato o fenilo como se representa en la fórmula
(VI):
\vskip1.000000\baselineskip
Respecto al grupo alifático (Y), el diámetro del
bolsillo sugiere que puede ajustarse una "cadena lateral"
metilo más, además del grupo metilo C15 en el carbono C10. Los
ejemplos no limitativos adecuados para los constituyentes Y en los
que Y comprende un grupo de cadena alifática son como sigue: (1)
añadir un grupo metilo a TSA en el carbono C12 (con o sin un grupo
metilo en el carbono C10 y con o sin enlaces dobles y sustituyendo
o no los constituyentes X y/o Z de la fórmula (I) como se representa
por la fórmula (VII):
\vskip1.000000\baselineskip
(2) añadir un grupo metilo a TSA en el carbono
C9 (con o sin un grupo metilo en el carbono C10; con o sin ambos o
alguno de los enlaces dobles, y sustituyendo o no los constituyentes
de fórmula (I) X y/o Z como se representa por la fórmula
(VIII):
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
(3) reemplazar los dos enlaces dobles alqueno
de TSA por sólo uno entre C10 y C11, lo que puede liberar la
torsión de C11 y C12 para permitir un ajuste mejor, pudiendo también
estar sustituidos los grupos X y/o Z como se representa por la
fórmula (IX):
\vskip1.000000\baselineskip
(4) ciclar los carbonos C15 y C12 de TSA
mediante un átomo de azufre (o átomo de nitrógeno), pudiendo también
estar sustituidos los grupos X y/o Z como se representa por la
fórmula (X):
\vskip1.000000\baselineskip
(5) extender desde el carbono C9 de TSA de
manera que la extensión se aproxime y/o penetre en el surco B (véase
la Figura 9); haciendo C9 sp3 de manera que tenga algo de libertad;
unir a C9 un grupo espaciador 1-3 metilo que puede
incluir un enlace doble y unir a éste un grupo carboxilato, sulfato,
hidroxilo o fenilo que puede interaccionar con el protón N epsilon
de His170 que puede coordinar el átomo de cinc como se representa
por la fórmula (XI):
\vskip1.000000\baselineskip
(6) extender el carbono C8 (reemplazando C14) de
TSA de manera que la extensión se aproxime o penetre en el surco B;
unir un grupo espaciador 1-3 metilo (que puede
incluir un enlace doble) y después unir a éste un grupo
carboxilato, sulfato, hidroxilo o fenilo de manera que se realice
una interacción con el protón N epsilon de His170 que coordina el
átomo de cinc; pudiendo también estar sustituidos los grupos X y/o Z
como se representa por la fórmula (XII):
\newpage
(7) sustituir el carbono C8 en el extremo de la
cadena alifática de manera que la sustitución pueda contactar el
surco A, A', B y/o C, en dicho ejemplo, puede requerirse o no un
grupo de cubierta (X) y los constituyentes X y Z también pueden
estar sustituidos como se representa por la fórmula (XIII):
(8) las fórmulas VII a XIII anteriores en las
que la cadena alifática comprende además un grupo metilo entre el
grupo de unión del sitio activo (Z) y el carbono C8 y
preferiblemente justo antes del carbono C8, incrementándose la
distancia entre X y Z, (9) hacer la conexión entre la cadena
alifática y el grupo de cubierta más rígida (por ejemplo, cerrando
un anillo de 6 miembros que puede comprender o no oxígeno, pudiendo
también estar sustituidos los grupos X y Z como se representa por
la fórmula (XIV):
y (10) combinar dos o más de los
cambios mostrados por las fórmulas
(VII-XIV).
Además, los ejemplos no limitativos de grupos Z
adecuados en los que Z comprende un grupo de unión al sitio activo
son como sigue: (1) ácido hidroxámico, (2) ácido carboxílico, (3)
sulfonamida, (4) acetamida, (5) epoxicetona, (6) un éster con un
conector metilo y un grupo hidroxilo de éster acetato para entrar en
la cavidad e interaccionar con una arginina conservada (Arg27) como
se representa por la fórmula (XV):
y (7) una alfacetona como se
representa por la fórmula
(XVI):
Además, otros constituyentes X, Y y Z adecuados
pueden preverse por el experto en la técnica dada la información de
la estructura tridimensional de la presente invención.
Después de haber determinado los constituyentes
adecuados potenciales X, Y y Z, los constituyentes se combinan para
formar un compuesto de fórmula (I) utilizando técnicas de química
combinatoria. Esto puede conseguirse según las Patentes de EEUU
Nos. 5.608.108; 5.700.811; 5.773.474; 5.840.960 y 5.668.179,
incorporadas en la presente memoria por referencia. Puede
utilizarse cualquier método conocido por el experto en la técnica
para sintetizar los compuestos de fórmula (I) que comprenden los
constituyentes X, Y y Z determinados mediante los métodos descritos
anteriormente.
Como se ha mencionado anteriormente, los
compuestos de fórmula (I) son útiles para inhibir la actividad
histona desacetilasa de HDLP y de proteínas relacionadas con HDLP.
Dicha inhibición puede permitir la reducción o el cese del
crecimiento celular in vitro e in vivo.
Para la utilización in vitro, dicha
reducción o cese del crecimiento celular es útil para estudiar la
función de la desacetilación de histonas y la diferenciación durante
el ciclo celular y también para estudiar otros mecanismos asociados
con la parada del ciclo celular y particularmente cómo la represión
de la transcripción está implicada en la progresión del ciclo
celular que pueden ser estudios en un sistema modelo de levaduras
tal como el descrito por Kadosh y Struhl, 1998, Mol. Cell.
Biol. 18:5121-5127. Los sistemas modelo
in vitro que pueden utilizarse para estudiar los efectos de
inhibidores potenciales en la progresión del ciclo celular y
también en el crecimiento de tumores incluyen los descritos por:
Richon et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95:3003-3007; Yoshida et al., 1995,
Bioessays 17:423-430; Kim et
al., 1999, Oncogene 18:2461-2470;
Richon et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:5705-5708; y Yoshida et al., 1987,
Cancer Res. 47:3688-3691.
Para la utilización in vivo, dicha
reducción o cese del crecimiento celular es útil para estudiar el
efecto de dichos compuestos inhibidores en sistemas modelo de
animales no humanos de cáncer y también es útil para el tratamiento
de cáncer en un receptor que necesita dicho tratamiento. Los
ejemplos no limitativos de animales que pueden servir como sistemas
modelo de animales no humanos incluyen ratones, ratas, conejos,
pollos, ovejas, cabras, vacas, cerdos y primates no humanos.
Véanse, por ejemplo, Desai et al., 1999, Proc. AACR
40: abstract #2396; Cohen et al., 1999, Cancer
Res., enviado. Los compuestos de la presente invención pueden
administrarse a un animal no humano transgénico en el que dicho
animal ha desarrollado cáncer tales como los modelos de animales en
los que el animal tiene propensión a desarrollar cáncer (por
ejemplo, sistemas modelo de animales descritos en las Patentes de
EEUU 5.777.193, 5.811.634, 5.709.844, 5.698.764 y 5.550.316). Dichos
sistemas modelo de animales pueden permitir la determinación de la
toxicidad y de la eficacia en la reducción de tumores de los
compuestos de la presente invención.
Un compuesto preferido de la presente invención
puede comprender una actividad específica alta para HDLP y
proteínas relacionadas con HDAC, una buena biodisponibilidad cuando
se administra oralmente, actividad en la reducción o cese del
crecimiento celular en líneas celulares de tumores y actividad en la
reducción o cese del crecimiento tumoral en modelos de animales de
varios cánceres.
De acuerdo con esto, otro aspecto de esta
invención es un método para erradicar o manejar cáncer en un
receptor, que puede ser un animal y es preferiblemente un ser
humano. Dicho método comprende administrar a dicho receptor una
cantidad reductora de tumores de un compuesto como se define por la
fórmula (I) anterior o una sal de éste aceptable
fisiológicamente.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporciona una composición que comprende el compuesto de fórmula
(I) y un excipiente o vehículo. La administración de los agentes
anteriores puede ser local o sistémica. Dichos vehículos incluyen
cualquier disolución fisiológica o dispersante o semejantes
adecuados. Las disoluciones fisiológicas incluyen cualquier
disolución o medio de dispersión aceptable, tal como disolución
salina, o disolución salina tamponada. El vehículo también puede
incluir agentes antibacterianos o antifúngicos, agentes isotónicos
y retardantes de la absorción y semejantes. Excepto que cualquier
medio convencional, vehículo o agente sea incompatible con el
ingrediente activo, se contempla su utilización en las
composiciones.
Las rutas de administración para las
composiciones que contienen las construcciones vehículo de
administración de la presente invención incluyen cualquier ruta
convencional y aceptable fisiológicamente, tales como, por ejemplo,
las rutas de administración oral, pulmonar, parenteral (inyección
intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o subcutánea),
inhalación (a través de una formulación de polvo fino o un vapor
fino), transdérmica, nasal, vaginal, rectal o sublingual y puede
formularse en formas de dosificación apropiadas para cada ruta de
administración.
Los ejemplos siguientes se proporcionan para
ilustrar más claramente los aspectos de la invención y no se
pretende que limiten el alcance de la invención.
HDLP de tipo salvaje de longitud completa
(número de registro Genbank AE000719) se subclonó a partir de una
preparación de ADN cromosómico de Aquifex aeolicus
(proporcionada por Robert Huber de la Universitaet de Ragensburg,
Alemania) en el vector pGEX4T3 (Amersham-Pharmacia,
Piscataway, NJ) utilizando la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Los mutantes cisteína a serina y del sitio activo se
construyeron mediante mutagénesis dirigida mediante PCR y se
secuenciaron. La proteína de fusión
HDLP-glutation-S-transferasa
(GST) se produjo en Escherichia coli, se purificó mediante
cromatografía de afinidad utilizando una columna de resina
glutation-sefarosa
(Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) y mediante
cromatografía de intercambio aniónico
(Q-sefarosa^{TM};
Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ). HDLP se
escindió de la proteína de fusión mediante trombina a 4ºC, se
purificó mediante intercambio aniónico
(Q-sefarosa^{TM};
Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) y cromatografía
de filtración en gel (Superdex^{TM}200;
Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) y se concentró
típicamente hasta 25 mg/ml en un tampón de 25 mM
bis-tris propano (BTP), 500 mM NaCl, 5 mM
ditiotreitol (DTT), 2% isopropanol, pH 7,0.
Aunque no se sabe qué cofactor metálico contiene
HDLP in vivo, se presume que es cinc debido a la organización
de los ligandos y a las similitudes en el sitio activo con las
proteasas dependientes de cinc. La ausencia del metal en la HDLP
purificada se piensa que es debida, en parte, a la utilización de
DTT durante la purificación. HDLP se reconstituyó con Zn^{2+}
mezclando el mutante doble Cys75Ser/Cys77Ser a 10 mg/ml con un
exceso molar de 5 veces de ZnCl_{2} en un tampón de 25 mM
bis-tris propano, 200 mM NaCl, 1% isopropanol, pH
7,0. El ZnCl_{2} no unido se eliminó fraccionando HDLP a través
de una columna G25 desaladora (Amersham-Pharmacia,
Piscataway, NJ). El complejo
HDLP-Zn^{2+}-TSA se preparó
incubando el mutante de HDLP reconstituido con Zn^{2+} con 1 mM
TSA durante 45 minutos, seguido de cromatografía de filtración en
gel (Superdex^{TM}200; Amersham-Pharmacia,
Piscataway, NJ) para eliminar el exceso de TSA y concentrando
típicamente hasta 25 mg/ml en un tampón de 25 mM
bis-tris propano, 500 mM NaCl, 1% isopropanol, pH
7,0.
HDAC1 humana etiquetada con el epítopo FLAG se
sobreexpresó utilizando un sistema de expresión de baculovirus en
células de insecto Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, CA) crecidas en
suspensión en medio sin suero (Sf900, Gibco, Grand Island, NY). La
proteína de fusión se purificó mediante cromatografía de intercambio
aniónico y de afinidad utilizando la resina de afinidad
Anti-FLAG M2 (Sigma, St. Louis, MO) y el Péptido
FLAG (Sigma, St. Louis, MO).
Los cristales de apo-HDLP se
crecieron a temperatura ambiente mediante el método de difusión de
vapor en gota colgante desde 7,5% isopropanol, 28% PEG 1500, 425 mM
NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7,0. Se forman en el grupo
espacial C2 con a = 51,4 \ring{A}, b = 93,8 \ring{A}, c = 78,7
\ring{A}, \beta = 96,9 \ring{A} y contienen una molécula de
HDLP en la unidad asimétrica. Los datos de difracción se recogieron
con cristales congelados rápidamente en un tampón de 7,5%
isopropanol, 35% PEG 1500, 75 mM NaCl, 100 mM
Tris-HCl, pH 8,0 a -170ºC.
La estructura del complejo
HDLP-Zn^{2+} se determinó a partir de los
cristales del mutante doble de HDLP Cys75Ser/
Cys77Ser crecidos desde 23% terc-butanol, 27% PEG 1500, 400 mM KCl, 100 mM bis-tris propano-HCl, pH 6,8. El grupo espacial y las dimensiones de la celda fueron idénticos a los de los apocristales. Los cristales de HDLP-Zn^{2+} se recogieron y se congelaron en 27% terc-butanol, 22% PEG 1500, 50 mM KCl, 20 mM NaCl, 0,2 mM ZnCl_{2}, 100 mM bis-tris propano, pH 6,8 a -170ºC.
Cys77Ser crecidos desde 23% terc-butanol, 27% PEG 1500, 400 mM KCl, 100 mM bis-tris propano-HCl, pH 6,8. El grupo espacial y las dimensiones de la celda fueron idénticos a los de los apocristales. Los cristales de HDLP-Zn^{2+} se recogieron y se congelaron en 27% terc-butanol, 22% PEG 1500, 50 mM KCl, 20 mM NaCl, 0,2 mM ZnCl_{2}, 100 mM bis-tris propano, pH 6,8 a -170ºC.
Los cristales del complejo
HDLP-Zn^{2+}-TSA comprendían el
mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser y se crecieron desde 23%
terc-butanol, 27% PEG 1500, 600 mM KCl, 100 mM
bis-tris propano-Cl, pH 6,8,
mediante microsembrado. Los cristales se crecieron en presencia de
cinc. Se forman en el grupo espacial P2_{1}2_{1}2_{1} con a =
53,4 \ring{A}, b = 94,4 \ring{A}, c = 156,3 \ring{A} y
contienen dos complejos
HDLP-Zn^{2+}-TSA en la unidad
asimétrica. Los cristales de
HDLP-Zn^{2+}-TSA se recogieron y
se congelaron en el mismo criotampón que el de los cristales de
HDLP-Zn^{2+} excepto en que se añadió 0,5 mM TSA.
Los datos se procesaron con DENZO y SCALEPACK (Otwinowski y Minor,
1997, Method. Ensemble. 276:307-326),
análisis MIR, construcción de modelo y refinamiento.
Los cristales del complejo
HDLP-Zn^{2+}-SAHA se crecieron y
se evaluaron de la misma forma que los cristales de
HDLP-Zn^{2+}-TSA. Sin embargo, las
restricciones para la estructura de SAHA se construyeron tomando
como base los parámetros estereoquímicos de TSA. Al igual que los
cristales de apo-HDLP, los
co-cristales de SAHA/HDLP crecieron en el grupo
espacial C2.
Se realizaron impregnaciones con átomos pesados
con los cristales apo-HDLP en un tampón de 7,5%
isopropanol, 30% PEG 1500, 75 mM NaCl, 100 mM
Tris-HCl, pH 8,0, suplementado con 1,0 mM timerosal
durante 2 h, 5 mM KAu(CN)_{2} durante 1 h y 1 mM
Pb(Me)_{3}OAc durante 2 h. Las fases MIR se
calcularon con el programa MLPHARE (The CCP4 suite: Programs for
computational crystallography, 1994, Acta Crystallogr.
D 50:760-763) a 2,5 \ring{A}
utilizando la señal de difracción anómala del derivado de timerosal
y tenía una figura media de mérito de 0,55. Las fases se mejoraron
mediante aplanamiento del disolvente con el programa DM (The CCP4
suite: Programs for computational crystallography, 1994, Acta
Crystallogr. D 50:760-763) y se
utilizaron para construir el modelo inicial con el programa O
(Jones et al., 1991, Acta Crystallogr. A
47:110-109). Los ciclos sucesivos de
reconstrucción y refinamiento por templado o recocido simulado con
el programa CNS (Brunger et al., 1998, Acta Crystallogr.
D 54:905-921) permitieron la
interpretación de HDLP desde el resto 2 al 373. Los restos 1, 374 y
375 no se modelaron y se presume que están desordenados.
La estructura del complejo
HDLP-Zn^{2+}-TSA y
HDLP-Zn^{2+}-SAHA se determinaron
mediante reemplazamiento molecular con el programa AMORE (The CCP4
suite: Programs for computational crystallography, 1994, Acta
Crystallogr. D 50:760-763)
utilizando la estructura de apo-HDLP como modelo de
búsqueda. Los mapas de densidad electrónica iniciales tenían una
densidad diferente importante y continua para toda la molécula de
TSA. Sin embargo, la molécula de SAHA no estaba tan bien ordenada en
la región del grupo de cubierta. La estructura de TSA se obtuvo a
partir de la Cambridge Structural Database (Refcode TRCHST) y se
utilizó para definir las restricciones estereoquímicas utilizadas
en el refinamiento con el programa CNS. Las restricciones de SAHA
se construyeron tomando como base los parámetros estereoquímicos de
TSA y de los restos de aminoácidos circundantes. La interfase del
dímero en los cristales de
HDLP-Zn^{2+}-TSA y
HDLP-Zn^{2+}-SAHA implica
principalmente Phe200 en la superficie de la proteína. La cadena
lateral de Phe200 contacta con Tyr291 cuya conformación de la
cadena lateral cambia con la unión con TSA y parte del grupo dimetil
amino fenilo de TSA del segundo promotor. La familia HDAC no
contiene un resto fenilalanina en la posición equivalente.
Las proteínas purificadas se ensayaron incubando
10 \mug de sustrato histona de eritroleucemia murina marcada con
[^{3}H] acetilo y tampón de ensayo HDAC (20 mM
Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10% glicerol) durante
30-60 minutos a 37ºC en un volumen total de 30
\mul. Las concentraciones finales de HDLP y
HDAC1-FLAG fueron 3,6 \muM y 0,24 \muM
respectivamente. Los ensayos se realizaron en duplicado. Las
reacciones se pararon y el acetato liberado se extrajo y se ensayó
como se ha descrito (Hendzel et al., 1991, J. Biol.
Chem. 266:21936-21942). Las histonas de
eritroleucemia murina marcadas con [^{3}H] acetilo se prepararon
esencialmente como se ha descrito (Carmen et al., 1996, J.
Biol. Chem. 271:15837-15844). Los
inhibidores se añadieron en ausencia del sustrato y se incubaron en
hielo durante 20 minutos, se añadió el sustrato y el ensayo se
realizó como se ha descrito anteriormente. HDLP se incubó con 20
\muM ZnCl_{2} y 20 \muM
MnCl_{2}(H_{2}O)_{4} en tampón HDAC y se ensayó
la actividad.
Sólo tuvo actividad HDLP dializada frente a
ZnCl_{2}. HDAC1-FLAG se dializó frente a 20 \muM
ZnCl_{2} en tampón HDAC que no tuvo efecto en la actividad. Por
lo tanto, HDAC1-FLAG contiene un metal cuando se
purifica.
No se conoce el sustrato de HDLP in vivo.
HDLP puede tener una función en la utilización de acetoína semejante
al producto génico AcuC de B. subtilis y se ha indicado como
tal en la secuencia del genoma pero la reacción catalizada por AcuC
tampoco se conoce. Aún más, el genoma de A. aeolicus carece
de los genes acuA y acuB que forman parte del operón acuABC de
B. subtilis (Deckert et al., 1998, Nature,
392:353-358), y HDLP es tan similar a HDAC1
humana (identidad del 35,2%) como lo es a AcuC de B. subtilis
(identidad del 34,7%).
Claims (17)
1. Un cristal de una enzima que comprende
actividad desacetilasa en el que dicho cristal difracta eficazmente
rayos X para la determinación de las coordenadas atómicas de dicha
enzima a un resolución mayor de 4 \ring{A} y en el que la
estructura de dicha enzima comprende un plegamiento central
característico \alpha/\beta estructural conservado en el que
dicho plegamiento \alpha/\beta conservado comprende una lámina
\beta paralela de ocho cadenas y ocho hélices \alpha y en el
que cuatro de las hélices se agrupan en cada cara de dicha lámina
\beta paralela y en el que dicha estructura de dicha enzima
comprende una rmsd de menos de o igual a 1,5 \ring{A} en las
posiciones de los átomos C\alpha en al menos 2/3 o más de los
aminoácidos de HDLP (SEQ ID NO:1) como se define por las coordenadas
atómicas de HDLP según la Figura 16 y en el que el cristal tiene las
dimensiones de la celda unidad de a = 51,4 \ring{A}, b = 93,8
\ring{A}, c = 78,7 \ring{A} y \beta = 96,9º o a = 53,4
\ring{A}, b = 94,4 \ring{A} y c = 156,3 \ring{A}.
2. El cristal de la reivindicación 1, en el que
dicha enzima es HDLP.
3. El cristal de la reivindicación 1, en el que
dicha enzima es HDAC1.
4. El cristal de la reivindicación 1, en el
que:
(a) dicha estructura proteica comprende
además:
- (1)
- ocho hélices \alpha situadas cerca de un lado de la lámina \beta; y
- (2)
- al menos siete bucles grandes, bien definidos que se originan de los extremos C-terminales de las cadenas \beta de dicha lámina \beta paralela de ocho cadenas en el que las ocho hélices extra y los siete bucles grandes están asociados con una extensión significativa de la estructura fuera del resto central \alpha/\beta y en el que dicha extensión de la estructura da lugar a un bolsillo profundo y estrecho y a una cavidad interna adyacente al bolsillo; o
(b) dicha enzima que comprende actividad
desacetilasa se selecciona de HDLP (SEQ ID NO:1), HDAC1 (histona
desacetilasa 1), HDAC2 (histona desacetilasa 2), HDAC3 (histona
desacetilasa 3), HDAC4 (histona desacetilasa 4), HDAC5 (histona
desacetilasa 5), HDAC6 (histona desacetilasa 6), APAH
(acetilpoliamina amidohidrolasa), AcuC (proteína C para la
utilización de acetoína), y derivados funcionales de éstas.
5. El cristal de la reivindicación 4,
(a) que comprende además un átomo de cinc unido
específicamente al sitio activo de dicha enzima; o
(b) que comprende además un compuesto inhibidor
de desacetilasa unido específicamente al sitio activo de dicha
enzima; o
(c) definido por las coordenadas atómicas según
la Figura 16.
6. Un método para identificar un compuesto
inhibidor potencial de desacetilasa para una enzima que comprende
actividad desacetilasa, comprendiendo dicho método las etapas
de:
(a) utilizar una estructura tridimensional de
HDLP (SEQ ID NO:1) como se define por las coordenadas atómicas
según la Figura 16;
(b) utilizar dicha estructura tridimensional
para diseñar o seleccionar dicho inhibidor potencial;
(c) sintetizar opcionalmente dicho inhibidor
potencial;
(d) poner en contacto dicho inhibidor potencial
con dicha enzima en presencia de un sustrato acetilado; y
(e) determinar la actividad inhibidora de
desacetilasa de dicho inhibidor potencial.
\vskip1.000000\baselineskip
7. El método de la reivindicación 6, en el
que
(a) la estructura tridimensional se diseña o
selecciona utilizando modelado computacional; o
(b) el inhibidor potencial de desacetilasa se
diseña de novo; o
(c) el inhibidor potencial de desacetilasa se
diseña tomando como base un inhibidor conocido; o
(d) dicha enzima que comprende actividad
desacetilasa se selecciona de HDLP (SEQ ID NO:1), HDAC1 (histona
desacetilasa 1), HDAC2 (histona desacetilasa 2), HDAC3 (histona
desacetilasa 3), HDAC4 (histona desacetilasa 4), HDAC5 (histona
desacetilasa 5), HDAC6 (histona desacetilasa 6), APAH
(acetilpoliamina amidohidrolasa), AcuC (proteína C para la
utilización de acetoína), y derivados funcionales de éstas.
8. Un método para evaluar las propiedades de
unión del compuesto inhibidor potencial de desacetilasa de la
reivindicación 7 que comprende las etapas de:
(a) co-cristalizar dicho
compuesto con HDLP;
(b) determinar la estructura tridimensional de
dicho co-cristal de complejo
HDLP-inhibidor potencial mediante reemplazamiento
molecular utilizando la estructura tridimensional de HDLP (SEQ ID
NO:1) como se define por las coordenadas atómicas según la Figura
16; y
(c) analizar dicha estructura tridimensional de
dicha HDLP unida a dicho compuesto inhibidor potencial para evaluar
las características de unión de dicho compuesto inhibidor
potencial.
9. Un método para resolver la estructura de un
cristal de un miembro de la familia HDAC que comprende las etapas
de:
(a) recoger los datos de difracción de rayos X
de dicho cristal en el que dichos datos difractan a un límite de
resolución alto mayor de 4 \ring{A};
(b) utilizar las coordenadas atómicas de HDLP
(SEQ ID NO:1) según la Figura 16 para realizar reemplazamiento
molecular o refinamiento y diferencia de fourier con dichos datos de
difracción de rayos X de dicho cristal de un miembro de la familia
HDAC para determinar la estructura de dicho miembro de la familia
HDAC; y
(c) refinar dicha estructura de dicho miembro de
la familia HDAC.
10. El método de la reivindicación 9, en el que
dicho miembro de la familia HDAC es HDAC1.
11. Un mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser
en el que dicho mutante está codificado por la secuencia de ácido
nucleico SEQ ID NO:4.
12. Un mutante doble de HDLP Cys75Ser/Cys77Ser
en el que dicho mutante tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO:3.
13. Una secuencia de nucleótidos según la SEQ ID
NO:4.
14. Un vector de expresión que comprende la
secuencia de nucleótidos de la reivindicación 13.
15. Un método para utilizar el cristal de la
reivindicación 1 para cribar un fármaco nuevo que comprende:
(a) seleccionar un ligando potencial realizando
diseño racional de fármacos con la estructura tridimensional
determinada para el cristal;
(b) poner en contacto el ligando potencial con
el dominio de unión al ligando del cristal; y
(c) detectar el potencial de unión del ligando
potencial para el dominio de unión al ligando, en el que el fármaco
nuevo se selecciona tomando como base que tenga una mayor afinidad
por el dominio de unión al ligando que la de un fármaco
conocido.
16. El método de la reivindicación 15, en el que
dicha enzima es HDLP.
17. El método de la reivindicación 15, en el que
dicha enzima es HDAC1 (histona desacetilasa 1).
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