ES2293718T3 - Enzima convertidora de tnf-alfa cristalina y usos de la misma. - Google Patents

Abstract

Un método para identificar un compuesto que se asocia a un polipéptido de enzima convertidora de TNF-alfa (TACE), que comprende: (A) cristalizar dicho polipéptido TACE, donde dicha cristalización implica (i) obtener un fragmento de dicho polipéptido TACE, consistiendo dicho fragmento esencialmente en el dominio catalítico de la TACE, (ii) incubando el fragmento con octilglucósido en presencia de un inhibidor TACE, y (iii) cristalizar el fragmento y terminar la estructura de cristal del fragmento; ( B) diseñar un compuesto de asociación para el polipéptido TACE que forma un enlace con el dominio catalítico basado en coordenadas de difracción de rayos X del cristal del polipéptido TACE; (C) sintetizar el compuesto; y (D) determinar la capacidad de asociación del compuesto con el polipéptido.

Description

Enzima convertidora de TNF\alpha cristalina y usos de la misma.

Antecedentes de la invención

La citoquina factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha) juega un papel en la inducción de reacciones inflamatorias y se conoce que es citotóxico respecto a células tumorales. Sin embargo, el TNF\alpha, también puede provocar daño grave al cuerpo humano cuando se produce en exceso conduciendo eventualmente a fallo orgánico múltiple y muerte. Véase Bemelmans et al., "Tumor Necrosis Factor: Function, Release and Clearance", Crit. Rev. Immun. 16: 1-11 (1996).

El factor de necrosis tumoral \alpha se produce por células activadas, tales como fagocitos mononucleares, Células T, Células B, mastocitos y células NK. El TNF\alpha existe en dos formas: una proteína de membrana de tipo II que tiene una masa molecular relativa de 26 kD y una forma soluble de 17 kD generada a partir de la forma de membrana por escisión proteolítica. La proteína de membrana TNF\alpha se sintetiza como un precursor anclado a membrana de 223 aminoácidos. El TNF\alpha soluble se libera del precursor unido a membrana por una proteinasa anclada a membrana. Esta proteinasa se ha identificado recientemente como una metaloproteinasa multidominio llamada enzima convertidora de TNF\alpha (TACE). Véase, Black et al., "A metalloproteinase disintigrin that releases tumor-necrosis factor-\alpha from cells", Nature 385: 729-733 (1997), Moss et al., "Cloning of a disintigrin metalloproteinase that processes precursor tumor-necrosis factor-\alpha, "Nature 385: 733-736 (1997). La TACE se ha identificado recientemente como una endopeptidasa de cinc que consiste en una región extracelular que comprende un péptido señal N-terminal, un prodominio, un dominio catalítico de 263 residuos (TCD) que está precedido de un sitio de escisión de furina (residuos 211-214), un dominio desintegrina, un dominio similar al EGF, un dominio similar a crambina, una clara hélice transmembrana y la cola C-terminal intracelular. La enzima convertidora del factor de necrosis tumoral \alpha (TACE), incluyendo una secuencia polinucleotídica, se describe con detalle en la solicitud PTC publicada Nº WO 96/41624.

Como se ha señalado anteriormente, la sobreproducción o producción no regulada de TNF\alpha presenta serios peligros fisiológicos. Se ha implicado en diversas enfermedades fisiológicas perjudiciales tales como artritis reumatoide, caquexia y choque endotóxico. Eventualmente, también puede conducir a fallo orgánico y muerte. Por tanto, se necesita un modo de controlar o bloquear la liberación de TNF\alpha a la circulación. Debido al papel de la TACE en la conversión del TNF\alpha, la inhibición, modulación y regulación de la TACE afectaría a la liberación a la circulación del TNF\alpha. Los inhibidores de metaloproteinasas y el diseño basado en la estructura de los mismos se describen en Zask et al., "Inhibition of Matrix Metalloproteinases: Structure Based Desing" Current Pharmaceutical Design, 2:624-661 (1996). Por tanto, los compuestos que se asocian a la TACE, tales como inhibidores, receptores o moduladores serán útiles para proteger a los pacientes de los efectos adversos asociados a la sobreproducción o producción no regulada de factor de necrosis tumoral \alpha.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un método para identificar un compuesto que se asocia a un polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha. El polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha puede comprender el dominio catalítico de la enzima convertidora de TNF-\alpha. Además, el polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha puede ser el producto de expresión de un polinucleótido que codifica los dominios pro y catalítico de la enzima convertidora de TNF-\alpha. Alternativamente, el polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha puede ser el producto de expresión de un polinucleótido que codifica los residuos aminoacídicos 1-477 de la enzima convertidora de TNF-\alpha. El polinucleótido puede estar sustituido de tal forma que el residuo aminoacídico Ser266 cambia a Ala y el residuo aminoacídico Asn452 cambia a Gln, y en el que un segundo polinucleótido que codifica la secuencia Gly-Ser-(His)_{6} se condensa con el extremo C.

Las anteriores composiciones pueden comprender además una pareja de unión adecuada para la co-cristalización con el polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha. La pareja de unión puede ser una pareja de unión basada en hidroxamato. Además, la pareja de unión puede ser N-{D,L-2-(hidroxiaminocarbonil)metil-4-metilpentanoil}-L-3-amino-2-dimetilbutanoil-L-alanina, 2-(amino)etil amida.

Las anteriores composiciones pueden tener una estructura de cristal que difracta a 2,0 \ring{A}, son monoclínicas, tienen una unidad celular que comprende cuatro moléculas de dominio catalítico (TCD) de enzima convertidora de TNF-\alpha cristalográficamente independientes, tienen las moléculas TCD en una unidad asimétrica, y/o tienen grupo espacial P2_{1} monoclínico y la célula tiene las constantes a=61,38 A, b=126,27 A, c=81,27 A, y \beta=107,41º.

Además, los anteriores polipéptidos se pueden caracterizar por las coordenadas de estructura de acuerdo con la Tabla 1, o una parte sustancial de la misma.

Un método para cristalizar un polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha, comprende (A) mezclar una solución que comprende un polipéptido TACE y una pareja de unión con un tampón de cristalización; y (B) cristalizar la mezcla de la etapa (A) por difusión de vapor por gota para formar un precipitado cristalino. El método comprende además (C) transferir inóculos desde el precipitado cristalino formado por la difusión de vapor por gota y un promotor de cristalización a una mezcla de una solución concentrada que comprende un polipéptido TACE y sustrato de pareja de unión, y un tampón de cristalización; y (D) cristalizar la mezcla de la etapa (C) por difusión de vapor por gota para formar un cristal. En otra realización, el tampón de cristalización es Citrato de Na 0,1 M pH 5,4, PEG 4000 al 20% p/v, e Isopropanol al 20% v/v. En otra realización más, la pareja de unión es N-{D,L-2-(hidroxiaminocarbonil)metil-4-metilpentanoil}-L-3-amino-2-dimetilbutanoil-L-alanina, 2-(amino)etil amida. En otra realización más, la cristalización es a una temperatura que varía de 4 a 20 grados Celsius. En otra realización, la solución que comprende el polipéptido TACE y el inhibidor está a una concentración de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 12 mg/ml en un tampón. En una realización adicional, la solución que comprende un polipéptido TACE y la pareja de unión se mezcla con el tampón de cristalización en una proporción de 1:1.

Se puede hacer un cristal de enzima convertidora de factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha) co-cristalizando un polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha con un sustrato de co-cristalización.

También es posible tener un medio legible por ordenador que tiene registrado en el mismo datos de coordenadas cristalográficas de rayos x para el dominio catalítico del la enzima convertidora de TNF-\alpha, o una parte del mismo. El medio legible por ordenador puede tener registrado en el mismo los datos de coordenadas cristalográficas de rayos x expuestos en la Tabla 1, o una parte de los mismos. El medio se puede seleccionar del grupo compuesto por un disco flexible, un disco duro, cinta de ordenador, RAM, ROM, CD, DVD, un disco magnético y un disco óptico. El medio legible por ordenador puede tener grabado en el mismo datos legibles por ordenador, cuando se usa junto con una máquina programada con instrucciones para usar los datos, es capaz de generar señales de imagen para representar una representación gráfica tridimensional del polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha, o una parte del mismo.

Se puede usar un sistema para estudiar un polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha, comprendiendo dicho sistema a) una memoria capaz de almacenar información que representa al menos una parte de un polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha, donde dicha memoria comprende al menos una región de almacenamiento de primer tipo, incluyendo un conjunto de coordenadas espaciales que especifican una localización en un espacio tridimensional, y al menos una región de almacenamiento de segundo tipo que comprende información que representa una característica de uno de una pluralidad de aminoácidos, estando dichas regiones de almacenamiento de segundo tipo asociadas de forma lógica a dichas regiones de almacenamiento de primer tipo en dicha memoria para representar una disposición geométrica de al menos una característica de dicha al menos una parte de dicho péptido de enzima convertidora de TNF-\alpha en dicho espacio tridimensional; b) un procesador acoplado a dicha memoria para acceder a dichas regiones de almacenamiento de primer tipo y dichas regiones de almacenamiento de segundo tipo, donde el procesador genera señales de imagen para ilustrar una imagen visual que representa una imagen tridimensional de dicha al menos una característica de dicha al menos una parte de dicho polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha en dicho espacio tridimensional basándose en los datos de dicha memoria; y c) una pantalla acoplada a dicho procesador para recibir dichas señales de imagen, donde la pantalla representa una imagen visual tridimensional de dicha al menos una característica de dicha al menos una parte de dicho polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha en dicho espacio tridimensional basada en dichas señales de imagen. Las señales de imagen pueden incluir señales para representar una imagen visual tridimensional de una estructura de cinta de al menos una parte de dicho polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha en dicho espacio tridimensional. En otra realización de la invención, las señales de imagen incluyen señales para representar una imagen visual de una representación de modelo sólido de dicha al menos una parte de dicho polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha en dicho espacio tridimensional. En otra realización más de la invención, las señales de imagen incluyen señales para representar una imagen visual tridimensional de potencial superficial electrostático de dicha al menos una parte de dicho polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha en dicho espacio tridimensional. En otra realización más de la invención, las señales de imagen incluyen señales para representar una estereoimagen tridimensional de dicha al menos una parte de dicho polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha en dicho espacio tridimensional. En una realización adicional de la invención, el sistema comprende adicionalmente un dispositivo de almacenamiento capaz de almacenar datos que representan una disposición geométrica de una característica de una composición diferente a dicho polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha; y una interfaz de operador para recibir instrucciones de un operador; y donde dicho procesador se acopla a dicho dispositivo de almacenamiento y a dicha interfaz de operador y genera señales de imagen adicionales para representar dicha disposición geométrica de dicha característica de dicha composición relacionada con dicha imagen visual tridimensional de dicha al menos una característica de dicha al menos una parte de dicho polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha en dicha pantalla basada en instrucciones de la interfaz de operador. En una realización, el dispositivo de almacenamiento es parte de dicha memoria. En otra realización, el sistema comprende una pluralidad de regiones de almacenamiento de primer tipo y segundo tipo.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una memoria de vídeo capaz de almacenar información para generar una presentación visual de al menos una parte de un polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha, comprendiendo dicha memoria de vídeo (a) al menos una región de almacenamiento de primer tipo, incluyendo cada una de dichas regiones de almacenamiento un conjunto de coordenadas espaciales que especifican una localización en un espacio tridimensional, y (b) al menos una región de almacenamiento de segundo tipo, conteniendo cada una de dichas regiones de almacenamiento de segundo tipo información para representar visualmente una característica de uno de una pluralidad de aminoácidos; donde dichas regiones de almacenamiento de segundo tipo están asociadas de forma lógica a dichas regiones de almacenamiento de primer tipo en dicha memoria de vídeo para representar una disposición geométrica de al menos una característica de dicha al menos una parte de dicho polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha en dicho espacio tridimensional. Las regiones de almacenamiento de segundo tipo se pueden asociar de forma lógica a dichas regiones de almacenamiento de primer tipo en dicha memoria de vídeo para representar una disposición geométrica de al menos una característica de una parte del dominio catalítico de dicho polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha en dicho espacio tridimensional. Las regiones de almacenamiento de primer tipo y las regiones de almacenamiento de segundo tipo pueden ser regiones de una memoria semiconductora. Las regiones de almacenamiento de primer tipo y dichas regiones de almacenamiento de segundo tipo pueden ser regiones de un disco óptico. Alternativamente, las regiones de almacenamiento de primer tipo y dichas regiones de almacenamiento de segundo tipo son regiones de una memoria magnética. La memoria de vídeo comprende una pluralidad de regiones de almacenamiento de primer y segundo tipo.

En un aspecto de la invención, se proporciona un método para identificar un compuesto que se asocia a la enzima convertidora de TNF-\alpha, comprendiendo las etapas de acuerdo con la reivindicación 1. En una realización, el compuesto de asociación es un inhibidor, mediador u otro compuesto que regula la actividad de la enzima convertidora de TNF-\alpha. En otra realización, el compuesto de asociación es un inhibidor competitivo, un inhibidor anticompetitivo o un inhibidor no competitivo. En otra realización más, las coordenadas son las coordenadas de la Tabla 1, o una parte sustancial de las mismas. El cristal de polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha comprende el dominio catalítico de la enzima convertidora de TNF-\alpha. En otra realización más, el polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha es el producto de expresión de un polinucleótido que codifica los dominios pro y catalítico de la enzima convertidora de TNF-\alpha. En otra realización más, el polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha es el producto de expresión de un polinucleótido que codifica los residuos aminoacídicos 1-477 de la enzima convertidora de TNF-\alpha. En otra realización, el polinucleótido está sustituido de tal forma que el residuo aminoacídico Ser266 cambia a Ala y el residuo aminoacídico Asn452 cambia a Gln, y donde un segundo polinucleótido que codifica la secuencia Gly-Ser-(His)_{6} se condensa con el extremo C. En una realización adicional, el cristal de polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha co-cristaliza con una pareja de unión. En una realización más, la pareja de unión es una pareja de unión basada en hidroxamato o N-{D,L-2(hidroxiaminocarbonil)metil-4-metilpentanoil}-L-3-amino-2-dimetilbutanoil-L-alanina,2-(amino)etil amida. En otra realización más, el cristal de polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha tiene una estructura de cristal que difracta a 2,0 \ring{A}, es monoclínico, tiene una célula unitaria que comprende cuatro moléculas de dominio catalítico (TDC) de la enzima convertidora de TNF-\alpha cristalográficamente independientes, tiene las moléculas TDC en una unidad asimétrica, y/o es del grupo espacial P2_{1} monoclínico y la célula tienen las constantes a=61,38 \ring{A}, b=126,27 \ring{A}, c=81,27 \ring{A} y \beta=107,41º. En otra realización más, la invención del compuesto de asociación se diseña para asociarse a la región S1' de la enzima convertidora de TNF-\alpha. En otra realización más, el compuesto de asociación se diseña para asociarse al bolsillo S1'S3' de la enzima convertidora de TNF-\alpha. En otras realizaciones más de la invención, el compuesto de asociación se diseña para (i) incorporar un resto que quele cinc, (ii) forma un enlace de hidrógeno con Leu348 o Gly349 de la enzima convertidora de TNF-\alpha, (iii) introduce un grupo no polar que ocupa el bolsillo S1' de la enzima convertidora de TNF-\alpha, (iv) introduce un grupo que se sitúa en el canal que comparte los bolsillos S1'-S3' de la enzima convertidora de TNF-\alpha y que hace un contacto van der Waals apropiado con el canal, y/o (v) forma un enlace de hidrógeno con Leu348 o Gly 349 de los grupos amida de la estructura de la enzima convertidora de TNF-\alpha.

Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes para los especialistas en la técnica en vista de los contenidos de este documento.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1: La Figura 1 es un diagrama de cinta del dominio catalítico de la TACE (TDC). La cadena empieza en el lado posterior izquierdo inferior, pasa por los elementos estructurales sI, hAI, hA, sII, hB, hB2, sIII, IV, IVa, sIVb, sV, hC, giro Met y hD, y termina en el lado posterior izquierdo superior. Los tres disulfuros se muestran como conexiones, con los sulfuros dados como pequeñas esferas. El cinc catalítico (esfera central) está ligado por los tres imidazoles de His405, His409 e His415, y por los átomos de oxígeno hidroxilo y carbonilo del grupo ácido hidroxámico del inhibidor. Se muestra completamente el inhibidor que imita la interacción de los residuos del sitio del cebador de un substrato de péptido. La Figura 1 se ha hecho usando SETOR. Véase Evans, S. "SETOR: Hardware Lighted Three-Dimensional Solid Model Representations of Macromolecules" J. Mol. Graph. 11:134-138 (1993).

Figs. 2a y 2b: Las Figuras 2a y 2b son representaciones de superficie sólida de los dominios catalíticos de la TACE (TDC) (Figura 2a) y MMP-3 (Figura 2b). El potencial superficial electroestático se acota desde -15 (rojo intenso) a 15 (azul intenso) k_{8}T/e. Ambas hendiduras de sitio activo pasan de izquierda a derecha, con los átomos de cinc catalítico (esferas) en los centros. En la TACE, el inhibidor del enlace se muestra con toda su estructura, uniéndose con su isobutilo (P1') y sus cadenas laterales de Ala (P3') al bolsillo profundo S1' y nuevo S3'. La orientación es similar a la Figura 1. Las Figuras 2a y 2b se han hecho usando GRASP. Nicolls, A., Bharadwaj, R. y Houig, B., "Grasp - Graphical representation and analysis of surface properties", Biophys. 64, A166 (1993).

Fig. 3: La Figura 3 alinea las secuencias del dominio catalítico de adamalisina II (ADAM_CROAD), TACE y ADAM 10 humana (hADAMIO), de acuerdo con su equivalencia topológica y similitud de secuencia, respectivamente. Los números de residuos se deben a la numeración TACE genérica. Las flechas y lazos representan hebras \beta y hélices \alpha en la TACE.

Fig. 4: La Figura 4 es una estereosección de la densidad de electrones terminal de 2,0 \ring{A} alrededor del cinc catalítico (gran esfera central) superpuesta al modelo TACE final. Son visibles los tres anillos imidazol que unen cinc de His405 (parte superior), His409 (izquierda) e His415 (parte inferior), el Glu406 "catalítico" y el resto de ácido hidroxámico del inhibidor. La orientación es similar a la Fig.1. La Figura 4 se ha hecho usando TURBO-FRODO. Véase Roussel, A. & Cambilleau, C., "Turbo-Frodo in Silicon Graphics Geometry", Partners Directory, Silicon Graphics, Mountain View, CA (1989).

Fig. 5: La Figura 5 es una superposición de los gráficos de cinta del dominio catalítico de la TACE (claro) y adamalisina (oscuro). También se muestra el cinc catalítico de la TACE (esfera) y los tres (TACE) y dos (adamalisina) puntes disulfuro. La orientación es similar a la Fig. 1. La Figura 5 se ha hecho usando GRASP.

Fig. 6: La Figura 6 ilustra un sistema para estudiar una enzima convertidora de TNF-\alpha, incluyendo una memoria de vídeo que almacena información para generar una presentación visual de al menos una parte de una enzima convertidora de TNF-\alpha.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al uso de las coordenadas estructurales de un polipéptido TACE para aclarar la estructura tridimensional de un polipéptido TACE y diseñar y desarrollar compuestos que se asocien a la TACE. El conocimiento de la estructura tridimensional y las coordenadas estructurales proporcionado de acuerdo con la invención permite que el especialista en la técnica haga compuestos que interaccionarán con la TACE. Tales compuestos de interacción se pueden hacer por una diversidad de técnicas y criterios de diseño, incluyendo aquellos descritos en Protein Engineering (Oxender y Fox, eds.) (Alan R. Liss, Inc. 1987).

Como se usa en este documento, la TACE se refiere a un grupo de polipéptidos que son capaces de convertir la forma unida a membrana de 26 kD del TNF\alpha en la forma soluble de 17 kD que comprende los 156 residuos C-terminales de la proteína TNF\alpha. La TACE abarca proteínas que tienen la secuencia aminoacídica descrita en la solicitud PTC Nº WO 96/41624, así como cualquiera de aquellas proteínas que tengan homología, preferiblemente no menos del 50%, más preferiblemente no menos del 80% de homología, y aun más preferiblemente un 90% de homología con tales secuencias, a nivel de aminoácidos. Adicionalmente, la TACE se refiere además a los productos de expresión de secuencias de nucleótidos descritas en la solicitud PCT Nº WO 96/41624. La TACE además abarca la proteína de unión a membrana y las proteínas solubles o truncadas que comprenden la parte extracelular de la proteína y que mantienen actividad biológica y que son capaces de ser secretadas. Se describen ejemplos de tales proteínas en la solicitud PTC Nº WO 96/41624.

La secuencia aminoacídica de la TACE, o cualquier parte o residuo de la misma, se puede encontrar en Black et al. "A Metalloproteinase disintigrin that releases tumour-necrosis factor-\alpha from cells", Nature 385: 729-733 (Feb. 1997). En la presente invención también están contenidas las variaciones en la secuencia aminoacídica de la TACE. Todas las referencias a la secuencia aminoacídica de la TACE contenidas en este documento se refieren a la secuencia de Black et al., supra.

Como se usa en este documento, el dominio catalítico de la TACE (TCD) se refiere a la parte de un polipéptido TACE entre los residuos 215 y 477 e incluyendo el sitio de escisión de furina precedente (residuos 211-214) o cualquier parte del mismo que sea capaz de escindir el péptido PLAQAVRSSS.

Expresión, Aislamiento y Purificación de Polipéptidos TACE

La enzima convertidora del factor de necrosis tumoral-\alpha (TACE) se describe en la solicitud PTC publicada Nº WO 96/41624. La solicitud describe ácidos nucleicos aislados que codifican la TACE o partes de la TACE, vectores de expresión que comprenden un ADNc que codifica la TACE o partes de la misma, y células hospedadoras transformadas o transfectadas con los vectores de expresión que comprenden un ADNc que codifica la TACE o partes de la TACE. La solicitud describe adicionalmente procesos para producir la TACE y partes de la misma, por ejemplo, cultivando células transfectadas generadas por ingeniería genética para expresar la TACE, seguido de la purificación de la TACE o parte de la misma producida de forma recombinante. Los métodos para aislar, expresar y purificar un polipéptido TACE se describen detalladamente en la solicitud PTC publicada Nº WO 96/41624.

De acuerdo con la invención, el ADNc que codifica el péptido señal, los dominios pro y catalítico de la TACE, es decir, los residuos aminoacídicos 1-477 se inserta en un vector de expresión adecuado y se expresa en una línea celular adecuada. El ADNc también puede incluir otras regiones que facilitan la expresión o logran otros objetos que por otra parte no se apartan de la esencia de la invención, tales como regiones flanqueantes.

Los ADNc que codifican el polipéptido TACE, o partes funcionales de la misma, tal como el TCD, se pueden alterar por adición, sustitución, deleción o inserción. Tales alteraciones se pueden hacer, por ejemplo, para evitar la glicosilación, evitar la formación de puentes disulfuro incorrectos o no deseados, y/o potenciar la expresión. Se describen ejemplos de dichas alteraciones en el documento WO 96/41624 y se pueden realizar por los métodos descritos en el mismo y otros métodos convencionales. La TACE también se puede conjugar. Dichos conjugados pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación y/o identificación. Tales péptidos incluyen, por ejemplo, péptidos poli-His. La conjugación se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.011.912 y Hopp et al., Bio/Technology 6:1204 (1998).

En una realización de la invención, el ADNc codifica un polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha que comprende el péptido señal, dominios pro y catalítico de la TACE (TCD), residuos 1-477, con Ser266 cambiada a Ala y Asn452 cambiado a Gln. Estas sustituciones son útiles para evitar la N-glicosilación. Adicionalmente, la secuencia Gly-Ser-(His)_{6} se puede añadir al extremo C. La adición de la secuencia Gly-Ser-(His)_{6} facilita la purificación del polipéptido usando resinas de afinidad de quelato de metal, tales como las resinas Ni-NTA.

Los vectores de expresión recombinantes que contienen la secuencia nucleotídica que codifica la TACE, o una parte de la misma, se pueden preparar usando métodos bien conocidos. Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de polipéptidos TACE incluyen células procariotas, de levadura y células eucariotas superiores. Los vectores y células hospedadoras adecuados para usar en la presente invención se describen en el documento WO 96/41624. Ejemplos adicionales de sistemas de expresión adecuados que se pueden emplear para expresar TACE recombinante de acuerdo con la presente invención incluyen sistemas de expresión de cultivos de células hospedadoras de insectos o mamíferos, incluyendo sistemas de baculovirus en células de insecto (véase Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1998) y líneas celulares de mamífero tales como células COS 7 (Gluzman et al., Cell 23:175 (1981)). Se conocen ejemplos adicionales en la técnica e incluyen aquellos descritos en el documento WO 96/41624. En una realización de la invención, el polipéptido TACE se expresa en células CHO. En esta realización, las células secretan una mezcla del polipéptido TACE comenzando con Val212 y Arg215.

En una realización, las células de expresión estables se pueden seleccionar cultivando las células en un fármaco que destruya aquellas células que no incorporen el vector. Se describen ejemplos de métodos de selección adecuados en, por ejemplo, Kaufman, R. J., "Selection and coamplification of heterologous genes in mammalian cells", Methods in Enzymology, 185:537-566 (1990).

La purificación del polipéptido TACE expresado se puede realizar por cualquier medio adecuado, tales como aquellos que se describen en el documento WO 96/41624. De acuerdo con un aspecto de la invención, es preferible obtener un polipéptido TACE que sea adecuado para cristalización. En la obtención de un polipéptido TACE adecuado para cristalización, es importante que el proceso para purificar el polipéptido TACE sea suficiente para obtener un polipéptido lo suficientemente puro para cristalizar adecuadamente.

Un método preferido de purificación comienza con una cantidad adecuada de medio del cultivo de células secretoras de TACE. Este medio es generalmente un sobrenadante del cultivo. El medio contiene el polipéptido TACE que se tiene que purificar. Preferiblemente, el polipéptido TACE se produce de forma recombinante usando ADN que codifica el polipéptido TACE con la secuencia alterada para codificar un conjugado o conjugados que faciliten la purificación. Por ejemplo, la secuencia que codifica Gly-Ser-(His)_{6} puede añadirse al extremo C para facilitar la purificación usando resinas de quelato de metal.

El medio se concentra, por ejemplo, por diafiltración. Las unidades de diafiltración adecuadas incluyen un límite Millipore 10K, unidad de diafiltración TFF de 30,48 cm^{2} (1 ft^{2}). Después se añade una solución de tampón adecuada al medio concentrado. Se puede usar cualquier tampón adecuado. Uno de tales tampones adecuados contiene Tris 20 mM (pH 7,5) y NaCl 300 mM.

La muestra se reconcentra y diluye numerosas veces. Por ejemplo, la muestra se puede reconcentrar y diluir una segunda vez con el tampón, se puede volver a reconcentrar, diluir una tercera vez con el tampón, y reconcentrar una última vez. La muestra retenida en la unidad de diafiltración se recupera por un método adecuado, tal como por un método de flujo inverso. El material recuperado después se puede filtrar a través de una membrana adecuada. Las membranas adecuadas incluyen, por ejemplo, membranas de tamaño de poro de 0,45 ó 0,22 micrómetros. Después se añade azida. La muestra filtrada se puede almacenar después durante una noche a baja temperatura, tal como aproximadamente 2-9ºC. Después del almacenamiento durante una noche, se añaden a la muestra filtrada imidazoles de una solución madre en agua y ZnCl_{2} de una solución madre en agua. La mezcla después se bombea por una columna adecuada. Una columna adecuada, particularmente cuando el polipéptido TACE está conjugado con la secuencia Gly-Ser-(His)_{6,} es una resina de quelato de metal, tal como una resina Ni-NTA.

La columna se lava con un tampón, tal como un tampón de Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazol 5 mM, y ZnCl_{2} 5 \muM. Después, el polipéptido TACE se eluye con un gradiente creciente de imidazol. Las fracciones se recogen en tubos que contienen glicerol en agua Tris pH 8. Preferiblemente, la solución de glicerol se prepara el día del desarrollo de la columna.

Se coloca una alícuota de cada fracción en una membrana la cual está teñida con negro amido para determinar qué fracciones contienen una cantidad significativa de proteína. Alternativamente, se puede usar una pequeña cantidad, por ejemplo, 5 \mul, de cada fracción para análisis en gel usando tinción Coomassie. Las fracciones con una cantidad significativa de proteína se agregan, y después el agregado se concentra con, por ejemplo, una unidad de diafiltración.

En algunos casos puede suceder la agregación del polipéptido. Para eliminar los agregados y facilitar adicionalmente la purificación, se puede añadir un inhibidor de la TACE, tal como un inhibidor basado en hidroxamato, a la muestra concentrada de una solución madre en agua, y se añade octilglucósido (disponible en el mercado en Boehringer Mannheim) de una solución madre en agua. Después, la muestra se incuba a temperatura ambiente durante 15-24 horas.

Después de la incubación, la muestra se aplica a una columna de exclusión por tamaño. La columna se equilibra en primer lugar con un tampón adecuado, tal como un tampón Tris 10 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, glicerol al 10%. Las columnas de exclusión por tamaño adecuadas incluyen, por ejemplo, LKB 2135-365, rellena de TSK-G3000 SWG o similares tal como Superdex-200. Después, el tampón se bombea a través de la columna. El polipéptido TACE altamente purificado se puede detectar por absorción a 280 nm.

Se realiza un análisis en gel de todas las fracciones con proteína significativa para determinar qué fracciones se tienen que agregar. El agregado de cromatografía de exclusión por tamaño se concentra usando, por ejemplo, una unidad de diafiltración.

Después se puede añadir una pareja de unión, tal como un inhibidor, a la muestra purificada. La pareja de unión es particularmente útil para estabilizar el polipéptido TACE. La pareja de unión puede ser cualquier compuesto adecuado. Las parejas de unión adecuadas incluyen, por ejemplo, inhibidores basados en hidroxamato. Un inhibidor adecuado es N-{D,L-2-(hidroxiaminocarbonil)metil-4-metilpentanoil}-L-3-amino-2-dimetilbutanoil-L-alanina, 2-(amino)etil amida. Este inhibidor, así como otros inhibidores, se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.594.106 (Black et al.).

El complejo de proteína se puede almacenar a baja temperatura, por ejemplo, a aproximadamente 4ºC.

Cristal de TACE y Métodos de Cristalización de Polipéptidos TACE

Un aspecto de la invención se refiere a un método para cristalizar un polipéptido TACE. Un método preferido comprende co-cristalizar un polipéptido TACE con una pareja de unión que se ha descrito anteriormente. Anteriormente se han descrito medios ejemplares para obtener el polipéptido TACE, así como la purificación del polipéptido.

Los cristales se pueden dejar crecer o formarse por cualquier método adecuado, incluyendo difusión de vapor por gota, procesos discontinuos, puente líquido, y diálisis, y en cualquier condición adecuada. A menudo, la cristalización por difusión de vapor por gota es preferible. Además, los especialistas en la técnica entenderán que se pueden variar las condiciones de cristalización. En la técnica se conocen generalmente diversos métodos para cristalizar polipéptidos. Véase, por ejemplo, los documentos WO 95/35367, WO 97/15588, EP 646 599 A2, GB 2 306 961 A y WO 97/08300.

En una realización de la invención, una construcción de ADN que comprende los residuos 1-477 de la TACE, con Ser 266 cambiada a Ala, Asn452 cambiada a Gln, y la secuencia Gly-Ser-(His)_{6} añadida al extremo C, se puede expresar en células CHO. Estas células secretan principalmente una mezcla procesada de TACE, comenzando aproximadamente la mitad con Val212 y aproximadamente la mitad con Arg215. La mezcla se purifica como se ha descrito anteriormente. El polipéptido TACE purificado, con la pareja de unión unida, se almacena en un tampón como se ha descrito anteriormente.

El polipéptido TACE y la pareja de unión se co-cristalizan. La solución TACE/pareja de unión, a una concentración de polipéptido de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 12 mg/ml en un tampón de TACE que se ha descrito anteriormente, se mezcla con un tampón de cristalización adecuado y se cristaliza usando una técnica de cristalización adecuada, por ejemplo, difusión de vapor por gota. Los tampones de cristalización adecuados, por ejemplo, incluyen: Acetato Na 0,1 M pH 5,3; CaCl_{2} 0,2 M, Etanol al 30% v/v; Citrato Na 0,1M pH 5,0; Etanol al 40% v/v; Citrato Na 0,1 M pH 8,7; PEG 4000 al 20% p/v, Isopropanol al 20% v/v; y Citrato Na 0,1 M pH 5,4; PEG 4000 al 20% p/v; Isopropanol al 20% v/v. La mezcla se incuba a una temperatura que varía entre 4 a 20 grados Celsius. Se forma un precipitado cristalino.

Se transfieren inóculos del precipitado cristalino obtenido, como cristales enteros o suspensiones de cristales triturados, junto con un promotor de cristalización adecuado, tal como pelo de conejo, a una solución de TACE/sustrato concentrada en un tampón de cristalización. Se forman cristales adecuados para la recogida de datos por rayos X.

Un cristal de polipéptido TACE comprende un polipéptido de dominio catalítico (TCD) de la enzima convertidora de TNF-\alpha co-cristalizado con un inhibidor. El cristal difracta a aproximadamente 2 \ring{A} y pertenece al grupo espacial P2_{1} monoclínico. La unidad celular del cristal comprende cuatro moléculas de TCD cristalográficamente independientes. Las moléculas de TCD están en una unidad asimétrica y no se agrupan en tetrámeros separados, pero se integran en la estructura periódica infinita. El cristal tiene las constantes celulares: a = 61,38 \ring{A} (angstrom), b = 126,27 \ring{A}, C = 81,27 \ring{A} y \beta = 107,41º.

Difracción por Rayos X

Otro aspecto de la invención se refiere a la estructura de la TACE, particularmente la estructura del dominio catalítico de la TACE (TCD). La estructura de la TACE se puede determinar usando un cristal que comprende un polipéptido TACE como se ha descrito anteriormente. De acuerdo con la presente invención, la estructura de la TACE, y particularmente del TCD, se determina usando cristalografía de rayos X. Se puede usar cualquier método de difracción de rayos X adecuado para obtener coordenadas estructurales tridimensionales de un polipéptido. Las coordenadas estructurales tridimensionales o cualquier parte de las mismas que caracterizan la parte del polipéptido TACE de interés, tal como el dominio catalítico de la TACE o parte del mismo, que sea capaz de escindir el péptido PLAQAVRSSS, se puede usar como se describe en este documento.

Métodos para Usar las Coordenadas de Difracción de Rayos X de la TACE

La invención también se refiere al uso de las coordenadas de estructura obtenidas por los estudios de difracción de rayos X que se han descrito anteriormente del dominio catalítico de la TACE. Se pueden utilizar las coordenadas, mediante análisis directo, con la ayuda de ordenadores, o combinaciones de los mismos, para determinar la estructura, incluyendo la estructura secundaria y terciaria, del dominio catalítico de la TACE. Las coordenadas de la estructura del dominio catalítico de la TACE también se pueden usar para desarrollar, diseñar, y/o investigar compuestos que se asocien con la TACE. Como se usa en este documento, "asociar" significa que el compuesto se puede unir a o interactuar con la TACE de forma iónica, covalente, mediante enlace de hidrógeno, interacción van der Waals, puentes de sal, interacción estérica, interacciones hidrófilas e interacción hidrófobas. Además, el término "asociar" comprende asociaciones con cualquier parte del dominio catalítico de la TACE. Por ejemplo, los compuestos que se asocian con la TACE pueden ser compuestos que actúan como inhibidores competitivos, inhibidores anti-competitivos, e inhibidores no competitivos. Los compuestos que se asocian con la TACE también puede ser compuestos que actúan como mediadores u otros compuestos reguladores. Los compuestos que se asocian con la TACE también pueden ser compuestos que se isomericen a intermedios de reacción de vida corta en la reacción química del sustrato con la TACE. En particular, los compuestos diseñados para asociarse con la TACE se pueden usar terapéuticamente como inhibidores, mediadores y otros compuestos reguladores.

El uso de las coordenadas de rayos X para la determinación estructural, diseño molecular y selección y síntesis de compuesto que se asocian con otros polipéptidos se conoce en la técnica. La solicitud PCT publicada WO 95/35367 describe el uso de coordenadas estructurales de rayos X para diseñar, evaluar, sintetizar y usar compuestos que se asocian al sitio activo de una enzima. La Solicitud de Patente del Reino Unido 2306961A describe el uso de coordenadas de rayos X en el diseño racional de fármacos. La solicitud PCT publicada WO 97/15588 describe la determinación estructural de un polipéptido usando patrones de difracción de rayos X así como el uso de las coordenadas y la estructura tridimensional para obtener compuestos que se asocien al polipéptido de interés. Sin embargo, la invención permite por primera vez el uso de coordenadas de rayos X de un polipéptido TACE para la determinación estructural, diseño molecular, y selección y síntesis de compuestos que se asocian a la TACE.

En un aspecto de la invención, las coordenadas estructurales obtenidas por los anteriores métodos se pueden presentar como, o convertir en, una representación gráfica, incluyendo representaciones de forma tridimensionales. Esto se puede conseguir usando programas de ordenador disponibles en el mercado capaces de generar representaciones gráficas de moléculas, o partes de las mismas, a partir de un conjunto de coordenadas estructurales. Los ejemplos de programas de ordenador capaces de generar representaciones gráficas de moléculas, o partes de las mismas, a partir de un conjunto de coordenadas estructurales, se describen en la solicitud PCT publicada WO 97/08300.

Las coordenadas estructurales y la estructura se pueden comparar con, o superponer sobre, otras moléculas similares, tales como otras metaloproteinasas. Por ejemplo, las coordenadas estructurales y la estructura de la TACE se pueden comparar con o superponer sobre las coordenadas estructurales o la estructura de metaloproteinasas de veneno de serpiente, tal como, por ejemplo, adamalisina II. Las coordenadas estructurales y la estructura de la TACE también se pueden comparar con o superponer sobre las coordenadas estructurales o la estructura de las metaloproteinasas de matriz, tal como ADAM 10, incluyendo ADAM 10 humana. La comparación de la TACE y otras moléculas para las que están disponibles una estructura gráfica o coordinadas estructurales tridimensionales se puede realizar con la ayuda de aplicaciones de software disponibles, tal como la aplicación de Similitud Molecular de QUANTA (Molecular Simulations, Inc., Waltham, MA).

Los compuestos que se asocian con la TACE también se pueden evaluar por ordenador y diseñar investigando y seleccionando entidades o fragmentos químicos para su capacidad de asociación con la TACE, y específicamente, el dominio catalítico de la TACE. Se pueden usar varios métodos para conseguir este aspecto de la invención. Se puede inspeccionar visualmente un modelo generado por ordenador de la TACE, y específicamente el dominio catalítico, basado en las coordenadas estructurales descritas en este documento. Los modelos generados por ordenador de entidades químicas o restos químicos específicos se pueden colocar después en o alrededor del dominio catalítico y evaluar basándose en la minimización de energía y dinámica molecular, usando, por ejemplo, programas disponibles tales como CHARMM o AMBER. La colocación de la entidad o fragmento químico se puede conseguir, por ejemplo, con software de acoplamiento tales como Quanta y Sybyl. Adicionalmente, se pueden usar programas de ordenador conocidos y disponibles en el mercado seleccionando entidades o fragmentos químicos. Una vez que se han seleccionado entidades o fragmentos químicos adecuados, se pueden ensamblar en un único compuesto, tal como un inhibidor, mediador u otro compuesto regulador. El software de construcción de modelos conocido y disponible en el mercado puede ayudar en el ensamblado.

Los compuestos que se asocien a la TACE y específicamente el dominio catalítico de la TACE se pueden diseñar como un conjunto, en vez de por el ensamblado de restos químicos específicos o entidades químicas. Esta realización se puede realizar usando programas de ordenador tales como LUDI (Biosym Technologies, San Diego, CA), LEGEND (Molecular Simulations, Burlington, MA), y Leap Frog (Tripos Associates, St., Louis, MO).

Se puede seleccionar un compuesto candidato basándose en los sitios deseados de interacción con la TACE y el compuesto candidato a la vista de los sitios de interacción que han identificado previamente. Una vez que se han determinado las interacciones específicas de compuesto candidato - TACE, se realizan estudios de acoplamiento, usando software de acoplamiento disponible en el mercado, para proporcionar complejos "modelados" preliminares del compuesto candidato seleccionado con la TACE.

El análisis conformacional obligado se realiza usando, por ejemplo, dinámicas moleculares (MD) para comprobar la integridad del complejo modelado TACE-inhibidor. Una vez que el complejo alcanza su estado conformacional más favorable, la estructura como se propone por el estudio MD se analiza visualmente para asegurar que el complejo modelado cumple con la SAR/QSAR experimental conocida (relación estructura-actividad/relación cuantitativa de estructura-actividad) basada en afinidades de unión medidas.

También se pueden usar otras técnicas de modelado de acuerdo con la invención. Los ejemplos de estas técnicas se describen en Cohen et al., "Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry", J. Med. Chem., 33: 883-894 (1990) y Navia et al., "The Use of Structural Information in Drug Design", Current Opinions in Structural Biology, 2:202-210 (1992).

Los compuestos desarrollados o diseñados para asociarse con la TACE se pueden optimizar o la eficacia de la asociación se puede ensayar usando varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden determinar y optimizar la energía de deformación y las interacciones electroestáticas. Se pueden usar sistemas de software y hardware conocidos y disponibles en el mercado. Los ejemplos tal software se describen en el documento WO 95/07619. La analogía basada en la estructura para la optimización de la potencia, selectividad y propiedades físicas similares a fármaco del inhibidor también se puede realizar de una manera iterativa por los especialistas en la técnica del diseño de fármacos.

También se pueden realizar sustituciones en compuestos seleccionados o diseñados. Estas sustituciones se pueden realizar para mejorar o modificar las propiedades de asociación del compuesto. Tales sustituciones se pueden hacer, por ejemplo, en grupos laterales o átomos particulares de los compuestos. Generalmente se tiene que comenzar con sustituciones conservativas que tienen aproximadamente el mismo tamaño, forma, carga y otras características que el grupo o átomo original. Los compuestos sustituidos se pueden analizar y optimizar adicionalmente como se ha descrito anteriormente.

En un aspecto adicional de la invención, el efecto potencial inhibidor, mediador, regulador u otro efecto de unión de un compuesto se puede analizar y evaluar, usando, por ejemplo, software de ordenador disponible en el mercado, antes de la propia síntesis y ensayo de tal compuesto. De este modo, se puede evaluar la probabilidad de sintetizar y ensayar compuestos no operativos.

Los procedimientos para medir la inhibición generalmente son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento PCT 96/41624. Tales métodos incluyen ensayos basados en la reacción con un sustrato peptídico.

Estructura del Dominio Catalítico de la TACE

Las características físicas del TCD, determinadas basándose en los datos de difracción de rayos X obtenidos usando los métodos descritos y su uso para crear modelos moleculares del TCD, se describen adicionalmente, con referencia a las Figuras.

El dominio representado en la Fig. 1 tiene la forma de un elipsoide achatado, mellado en su lado plano para dar una hendidura de sitio activo relativamente pequeña que separa el subdominio "inferior" pequeño del cuerpo molecular principal "superior" (Fig. 2a). La cadena polipeptídica del TCD comienza en la superficie molecular (en la parte posterior inferior, Fig. 1), definiéndose bien la cadena entre Asp217 y Met221 (véase Fig. 3). Central en la molécula está la lámina plegada \beta de cinco hebras, con la hebras \beta dispuestas en el orden (desde la parte posterior a la anterior, véase Fig. 1) sII, sI, sIII, sV y sIV (véase Fig. 3), con sIV, la hebra "del borde", discurriendo antiparalela respecto a las demás. La lámina \beta está altamente enrollada flanqueada por dos hélices \alpha (hB y hB2) en su lado convexo y dos hélices (hA y hC) en su lado cóncavo. Las hebras \beta sI y sII se conectan por la hélice \alpha hA1 corta y la hélice \alpha hA larga (la hélice oblicua del lado posterior, Fig. 1). Las hebras \beta sII y sIII se unen mediante el gran "bucle de múltiples giros", la hélice \alpha hB larga "intermedia" y la hélice \alpha hB2 corta adyacente, todas dispuestas en la "parte superior" de la lámina \beta apantallando por tanto completamente su parte central de agua libre (Fig. 1). El bucle de múltiples giros se abomba en dos sitios dando origen a un saliente "similar a un espolón" y uno bastante acídico, respectivamente (visibles en la Fig. 2a en la parte superior de la molécula). El enlazador sIII-sIV termina en un "abombamiento" corto, antes de entrar en la hebra del borde sIV. El segmento de conexión sIV-sV se divide en dos grandes bucles localizados en la superficie "similares a orejas", el primero se acerca al cuerpo molecular principal (dando origen a la superficie "azul", a la izquierda en el centro, en la Fig. 2a), y proyectándose un bucle en horquilla \beta largo (sIIa-sIIb) desde la superficie molecular (parte superior izquierda en las Figs. 1 y 2). Un bucle abombado une sV con la "hélice de sitio activo" hC, que se localiza en el centro de la molécula y finaliza de forma abrupta en la Gly412 estrictamente conservada, donde la cadena se dobla hacia abajo para construir el subdominio inferior.

La cadena C-terminal que comprende los últimos 61 residuos del TCD (Fig. 3) forma en primer lugar tres segmentos cortos rectos dispuestos aproximadamente perpendiculares unidos mediante dos bucles súperenrollados "estrechos", vuelve por el "giro Met" estrecho Tyr433-Val434-Met435-Tyr436 de vuelta a la superficie donde se dobla en Pro437 para formar la "pared" externa Pro437-Ile438-Al439 de la grieta S1', se aproxima en un bucle ancho a la hélice \alpha hD C-terminal y la atraviesa, y termina en la superficie "posterior" molecular cerca del extremo N, con los últimos residuos definidos Arg473-Ser474 fijados mediante enlaces de hidrógeno al cuerpo molecular principal. Mediante Cys423-Cys453, el primero de los dos bucles "estrechos" se une mediante disulfuro con el extremo N de la hélice hD, cuyo extremo C-terminal a su vez se sujeta al péptido enlazador sIV-sV "similar a una oreja" mediante Cys365-Cys469. Espacialmente adyacente, el tercer puente disulfuro del TCD, Cys225-Cys333, conecta las partes N-terminales de las hebras \beta sI y sIII. En la molécula TACE intacta, cuatro residuos aguas abajo de Ser474 alojarían Cys478, que ya es parte integral del dominio desintegrina alargado compacto (Saudek et al., "Three-dimensional structure of echistatin, the smallest active RGD protein "Biochem, 30. 7369-7372 (1991)). Considerando la Ser474 y esta Cys478 como puntos de giro para sus respectivos dominios, los tres enlazadores de residuo permitirían un acoplamiento relativamente libre del dominio desintegrina a los lados superficiales "izquierdos" del dominio catalítico.

La hendidura de sitio activo de la TACE (Fig. 2a) es relativamente plana en el lado izquierdo (sin cebador), pero se mella en la derecha. El cinc catalítico que se aloja en su centro esta penta-coordinado mediante los tres átomos de imidazol N\in2 de His405, His409 e His415 (proporcionados por la hélice de sitio activo y la siguiente cadena "descendente" que comprende el motivo consenso de unión de cinc conservado HEXXHXXGXXH), y por el oxigeno carbonilo el hidroxilo del resto de ácido hidroxámico del inhibidor (véase Figs. 1, 2a y 4). Este ensamblado de cinc-imidazol está basado en el resto distal \varepsilon-metil-sulfuro de la Met435 estrictamente conservada, alojada en el giro Met característico del clan de las metzincinas (Bode et al., "Astacins, serralysins, snake venom and matriz metalloproteinases exhibit identical zinc binding environments (HEXXHXXGXXH and Met-turn) and topologies and should be grouped into a common family, the ``metzincins''" FEBS Lett. 331, 134-140 (1993); Stöcker et al., "The metzincins: Topological and sequential relations between the astacins, adamalysins, serralysins and matrixins (collagenases) define a superfamily of zinc-peptidases" Protein Sci. 4, 823-840 (1995)). Ambos oxígenos de carboxilato del Glu406 "catalítico" (que actúa como una base general durante la catálisis (Grams et al., "X-ray structures of human neutrophil collagenase complexed with peptide hydroxamate and peptide thiol inhibitors: Implications for substrate binding and rational drug desing" Eur. J. Biochem. 228, 830-841 (1995)) introducidos entre el imidazol de unión de cinc de la His405 y la hebra del borde, se unen por enlace de hidrógeno al grupo hidroxilo y NH del ácido hidroxámico (véase Fig. 4). A la derecha del cinc catalítico se abre el bolsillo S1' profundo, que, aparte de por el segmento que forma la pared S1' (parte inferior, Figs. 1 y 2a), está bordeado por las cadenas laterales de His405 y Glu406 (izquierda), la cadena principal sIV y la cadena lateral de Leu345 (parte superior), y las cadenas laterales de Val440 (posterior) y Ala439 (derecha). Hacia la derecha de Ala439 se abre un segundo bolsillo (S3'), en cuyo interior la molécula se une con el bolsillo S1', dejando un pequeño puente hecho por las cadenas laterales opuestas de Ala439 y Leu348 (Fig. 2a).

La parte (pseudo)peptídica del inhibidor se une en una geometría extendida al lado derecho mellado de la hendidura de sitio activo, imitando la interacción de los residuos con cebador de un sustrato peptídico unido de forma productiva (Fig. 2a). Es antiparalelo al abombamiento corto superior Gly346-Thr347-Leu348 y paralelo al segmento que forma la pared de S1' Pro437-Ile438-Ala439, formando dos y dos enlaces de hidrógeno internos en la cadena principal, respectivamente. Las interacciones intermoleculares dominantes se realizan por la cadena lateral de isobutilo (pseudo-leucilo) P1' del inhibidor y el bolsillo esencialmente hidrófobo S1', sin embargo, es grande y aloja adicionalmente tres moléculas de disolvente parcialmente ordenadas. La cadena lateral de t-butilo P2' se extiende alejándose de la enzima, pero se aproxima al anterior dosel hidrófobo formado por el abombamiento de la enzima. La cadena lateral de Ala P3' se dirige hacia el bolsillo grande cargado negativamente S3', pero es demasiado corta para realizar contactos favorables. El grupo diaminoetilo C-terminal tiene diferentes conformaciones a las cuatro moléculas.

El segmento P1' a P3' Val77-Arg78-Ser79 de un enlace pro-TNF\alpha se une probablemente de una manera similar, posiblemente con mejor coincidencia con la superficie de hendidura subyacente; los residuos precedentes P3 a P1 Ala74-Gln75-Ala76 se alinearán definitivamente de forma antiparalela a la hebra del borde, con sus cadenas laterales extendiéndose al interior del bolsillo S3 (parcialmente cargado) y la depresión (cargada negativamente) S2 plana, y proyectándose hacia el exterior de la hendidura central, respectivamente. Los subsitios con cebador y las superficies moleculares circundantes de la TACE están dominados por cargas negativas, mientras que los subsitios sin cebador son de naturaleza esencialmente hidrófoba (Fig. 2a). Las interacciones más distantes pueden estar implicadas en la especificidad de la TACE para procesar el pro-TNF\alpha. Los substratos de 12 residuos que comprenden el sitio de escisión de pro-TNF\alpha también se pueden dividir por algunas de las MMP, aunque con menos especificidad y eficacia (Black et al., "Relaxed specificity of matriz metalloproteinases (MMP's) and TIMP intensity of tumor necrosis factor-\alpha (TNF-\alpha) production suggest the major TNF-\alpha converting enzyme is not an MMP" Biochem. Biophys. Res. Commun. 255, 400-405 (1996)). Por tanto, el procesado preferencial del pro-TNF\alpha unido a membrana (probablemente trimérico) (Tang et al., "Human pro-tumor necrosis factor is a homotrimer" Biochem. 35, 8216-8255 (1996a); Tang et al., "Length of the linking domain of human pro-tumor necrosis factor determines the cleavage processing" Biochem. 35, 8226-8233 (1996b)) in vivo puede deberse en parte al ensamblado correcto, es decir, la presentación adecuada del segmento de escisión de pro-TNF\alpha al sitio activo de la TACE en una distancia definida de la membrana de anclaje. Alguna evidencia experimental (Tang et al., Biochem. 35, 8216-8225 (1996a)); Tang et al., Biochem. 35, 8226-8233 (1996b)) sugiere que el sitio de escisión puede que no se determine solamente por la secuencia de escisión, sino que también la distancia a la base del cono compacto formado por los segmentos C-terminales asociados de tres moléculas de TNF\alpha (Jones et al., "Structure of tumor necrosis factor" Nature 338, 225-225 (1989)) juega un papel. En un complejo productivo de TACE-proTNF\alpha, la base de este cono trimérico de TNF\alpha (en la que se introducen los extremos N desordenados) se puede reconocer por el lado "derecho" del dominio catalítico de la TACE (Fig. 2a), favoreciendo el espacial de aproximadamente 10 residuos de longitud la colocación correcta del péptido de escisión de pro-TNF\alpha Ala76-Val77 unido en el sitio activo de la TACE.

La topología del polipéptido y en particular la presentación superficial del cinc catalítico prueban que el dominio catalítico de la TACE es una metzincina típica. (Bode et al., "Astacins, serralysins, snake venom and matrix metalloproteinases exhibit identical zinc binding environments (HEXXHXXGXXH and Met-turn) and topologies and should be grouped into a common family, the ``metzincins''" FEBS lett. 331, 134-140 (1993), Stöcker et al., "The metzincins: Topological and sequential relations between astacins, adamalysins, serralysins and matrixins (colagenases) define a superfamily of zinc-peptidases" Protein Sci. 4, 823-840 (1995)). Una superposición con las demás metzincinas muestra, sin embargo, que su topología es muy similar a la del dominio catalítico de metaloproteinasas de veneno de serpiente tal como la adalisina II (Fig. 5). (Gomis-Rüth et al., "First structure of a snake venom metalloproteinase: prototype for matrix metalloproteinases/collagenases" EMBO J. 12, 4151-4157 (1993); Zhang et al., "Structural interaction of natural and synthetic inhibitors with the venom metalloproteinase, atrolysin C (form d)" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8447-8451 (1994); Kumasaka et al., "Crystal structure of H2-proteinase from the venom of Trimeresurus flavoviridis" J. Biochem. 119, 49-57 (1996)). Esta gran homología se refleja por la superposición mucho más simultanea de la lámina central y las grandes hélices, pero en particular también por una unión de características estructurales, que la TACE comparte exclusivamente con las adamalisinas tales como; la hélice hB larga y el bucle multigiro precedente dispuestos en la parte superior de la lamina \beta; la hélice hC C-terminal dispuesta y conformada de forma típica; y el extremo C extendido colocado sobre la superficie del lado posterior. Aproximadamente 175 de los 263 \alpha átomos de la TACE y 201 de la adamalisina son topológicamente equivalentes (con una desviación rms de 1,3 \ring{A}, 39 de los cuales tienen cadenas laterales idénticas (Fig. 3). Estos números están cercanos a aquellos obtenidos a partir de una comparación de miembros de las diferentes familias de metzincinas. (Stöcker et al., supra). Además, las características estructurales detalladas prueban la relación cercana de la TACE con las adamalisinas: una estructura de núcleo más conservada, el extremo N dispuesto de forma libre; la Asp416 característica (siguiendo directamente al motivo consenso de unión de cinc, Fig. 3) implicada en interacciones de enlace hidrógeno intramolecular idénticas; el puente disulfuro adyacente Cys423-Cys453 uniendo el primer bucle estrecho a la hélice hD C-terminal (que la TACE no comparte con la adamalisina II, pero con la proteinasa H2 del veneno de serpiente de T. flavoviridis) (Kumasaka et al., supra); puente disulfuro Cys365-Cys469 conectando el enlazador sIV-sV con la hélice hD C-terminal; una hendidura de sitio activo configurada de forma similar, con similitudes particularmente fuertes en el bolsillo S1' y otros subsitios con cebador.

El dominio catalítico de la TACE (TCD) también difiere de la adamalisina II en varios aspectos: con 263 residuos, su cadena es mucho más larga; casi todos los residuos adicionales de la TACE se agrupan dando origen a un giro hA-sII más sobresaliente, a los dos salientes superficiales del bucle de giro múltiple, a las dos "orejas" del enlazador sIV-sV, y a un conector sV-hC más abombado (véase Figs. 3 y 5); ausencia de un sitio de unión de calcio pero presencia de un tercer puente disulfuro Cys225-Cys333 en la TACE, sirviendo ambos elementos, sin embargo, para la misma función, de hecho, para sujetar la cadena N-terminal a la hebra sIII; el bolsillo S3' bastante profundo de la TACE que se une con su bolsillo S1'; un patrón de carga aproximadamente invertido en y alrededor de los subsitios con cebador con una predominancia absoluta de cargas positivas en la adamalisina.

De acuerdo con su secuencia, y probablemente respecto a su estructura tridimensional, el dominio catalítico de la TACE, por tanto, no es un miembro típico de las propias ADAM de mamífero (una familia de proteínas de superficie celular ancladas a membrana, con el dominio catalítico bastante homólogo a la adamalisina (Wolfsberg et al., "ADAMSs in Fertilization and Development" Developm. Biol. 18C, 389-401 (1996)). La TACE presumiblemente comparte este papel "marginal" con la ADAM 10 (bovina) (Fig. 3), que también posee alguna actividad similar a la TACE (Lunn et al., "Purification of ADAM 10 from bovine spleen as a TNF\alpha convertase", FEBS Lett. 400, 333-335 (1997)), y cuya versión Drosophila (kuz) se ha demostrado recientemente que procesa el receptor Notch (Rooke et al., Science 273, 1227-1231 (1996)). Además, la ADAM 10 probablemente muestra un bucle hA-sII alargado y las dos "orejas" típicas de la TACE, pero puede tener un giro múltiple de tamaño intermedio entre la TACE y la adamalisina (véase Fig. 3). Noventa de los residuos del dominio catalítico de ADAM 10 son idénticos a la TACE subrayando adicionalmente la gran homología (véase Fig. 3), mientras que la otra ADAM de mamífero probablemente se asemeja mucho más a la adamalisina II (Gomis-Ruth et al., "Refined 2.0 A crystal structure of snake venom zinc endopeptidase adamalysin II" J. Mol. Bio. 239, 513-544 (1994)).

La homología estructural de la TACE con las MMP es significativamente menor. La disposición relativa de los elementos estructurales secundarios comunes difiere mucho (reflejado por la desviación rms significativamente mayor de 1,6 \ring{A} de los aproximadamente 120 átomos C\alpha topológicamente equivalentes), y las MMP carece de los elementos estructurales característicos de la TACE/adamalisina (tal como la hélice hB intermedia y el bucle de giro múltiple, el residuo Asp detrás de la tercera histidina de unión de cinc), o presenta determinantes típicos (tales como el cinc estructural y los iones de calcio integrados) que no se observan en la TACE. A pesar de las diferencias en la estructura secundaria, la hendidura de sitio activo de la TACE tiene alguna similitud con la de las MMP, con el lado plano sin cebador (lado izquierdo), y el lado con cebador estrecho centrado en el bolsillo profundo S1' (Fig. 2b). Esta similitud de subsitio con las MMP explica la sensibilidad parcial observada de la actividad de la TNF\alpha-convertasa hacia inhibidores de ácido hidroxámico sintéticos diseñados originalmente para la inhibición de diversas MMP (DiMartino et al., "Anti-arthritic activity of hydroxamic acid-based pseudopeptide inhibitors of matrix metalloproteinases and TNF\alpha processing" Inflamm. Res. 46, 211-215 (1997)). Los experimentos de construcción de un modelo con estructura TIMP-1 (Gomis-Rüth et al., "Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1" Nature 389, 77-81 (1997)) no muestran obstáculos obvios en la región del sitio activo de la TACE que explicarían de forma sencilla su resistencia al bloqueo por las TIMP.

La estructura de cristal del TCD, por tanto, proporciona evidencia de una similitud topológica del dominio catalítico de la TACE con el de la adamalisina/ADAM, y que comparten su sitio de unión a sustrato con el de las MMP. Sin embargo, la TACE muestra varias peculiaridades estructurales respecto al contorno superficial, carga y forma, que facilitan el diseño de potentes inhibidores sintéticos selectivos.

Durante el diseño y desarrollo de compuestos, tales como inhibidores, mediadores y otros compuestos que tienen actividades con significancia biológica, que se asocian con la TACE, es deseable seleccionar compuestos teniendo en cuenta el contorno superficial, carga, forma particulares y otras características físicas del dominio catalítico de la TACE. Generalmente, los compuestos tienen que ser capaces de asociarse físicamente y estructuralmente con la TACE, así como ser capaces de asumir una conformación que permita que se asocie con la TACE. Las características que se han descrito anteriormente dirigirán a los especialistas en la técnica en este aspecto. En particular, son particularmente adecuados los compuestos con una funcionalidad lineal. Tales compuestos serán particularmente adecuados a la vista de los bolsillos profundos del dominio catalítico de la TACE.

Los compuestos que se asocian con la TACE, por ejemplo, se pueden diseñar para asociarse con la región S1' o el bolsillo S1'-S3' de la TACE. Los compuestos que se asocian con la TACE también se pueden diseñar para (i) incorporar un resto que quele el cinc. Los compuestos ejemplares adicionales incluyen compuestos que están diseñados para formar un enlace de hidrógeno con Leu348 o Gly349 de la TACE. (ii) introducir un grupo no polar que ocupe el bolsillo S1' de la TACE. (iii) introducir un grupo que se sitúe en el canal que comparte los bolsillos S1'-S3' de la TACE y que realice un contacto van der Waal apropiado con el canal, y (iv) formar un enlace de hidrógeno con Leu348 o Gly349 en los grupo amida de la estructura de la enzima convertidora del TNF\alpha, o (v) cualquier combinación de lo anterior.

Medio Legible por Ordenador

Un medio legible por ordenador puede tener grabado él mismo las coordenadas estructurales de difracción de rayos X de un polipéptido TACE cristalino. Los medios legibles por ordenador de la invención son útiles para almacenamiento, transferencia y uso con software de las coordenadas estructurales de la TACE. El medio legible por ordenador puede ser cualquier material de almacenamiento de datos adecuado, incluyendo, pero sin limitación, un disco flexible, un disco duro, Memoria de Acceso Aleatorio de tipo ordenador, Memoria Sólo de Lectura, memoria instantánea, CD-ROM, CD grabables y regrabables, DVD grababales y regrabables, discos magnéticos-ópticos, unidad ZIP, unidad JAZ, unidad Syquist, unidad de cinta digital, o similares. Los especialistas en la técnica conocerán otros medios adecuados.

El medio legible por ordenador puede comprender las coordenadas de la Tabla 1 o una parte sustancial de las mismas. El medio legible por ordenador se puede usar junto con una maquina programada con instrucciones para usar los datos almacenados en el medio, tal como un ordenador cargado con uno o más programas identificados a lo largo de la memoria descriptiva, para presentar una representación grafica, tridimensional de un polipéptido TACE, o cualquier parte del mismo.

Sistema Basado en Ordenador

La Figura 6 ilustra un sistema 1000 para estudiar un polipéptido TACE. El sistema incluye una memoria de vídeo 110 que almacena información que representa al menos una parte de un polipéptido TACE. La memoria tiene al menos una región de almacenamiento de primer tipo 112, que tiene registrada en la misma un conjunto de coordenadas espaciales que especifican una localización en un espacio tridimensional, y al menos una región de almacenamiento de segundo tipo 114, teniendo registrada en la misma información que representa una característica de uno de una pluralidad de aminoácidos. Las regiones de almacenamiento de segundo tipo se asocian de forma lógica con las regiones de almacenamiento de primer tipo en la memoria de vídeo 110 para representar una disposición geométrica de al menos una característica de al menos una parte del polipéptido TACE en el espacio tridimensional. La memoria, 112 y 114 pueden comprender, por ejemplo, los datos mostrados en la Tabla 1. El sistema 1000 también incluye un procesador, acoplado a la memoria para acceder a las regiones de almacenamiento de primer tipo 112 y a las regiones de almacenamiento de segundo tipo 114, para generar señales de imagen para representar una imagen visual tridimensional de al menos una característica de al menos una parte del polipéptido TACE en un espacio tridimensional basándose en los datos de la memoria 110. El procesador puede ser un procesador para cualquier propósito con una CPU, registro, memoria y similares. Una pantalla 130 se acopla al procesador 120 mediante conexiones 125 para recibir las señales de imagen, para representar una imagen visual tridimensional de al menos una característica de al menos una parte del polipéptido TACE en el espacio tridimensional basándose en los datos de imagen en un monitor 132.

Los datos de imagen pueden incluir datos para representar una imagen visual tridimensional de una estructura de cinta de al menos una parte de un polipéptido TACE en el espacio tridimensional, tal como muestra la Fig. 1. Adicionalmente, los datos de imagen pueden incluir datos para representar una imagen visual tridimensional de una representación de modelo sólido de al menos una parte de dicho polipéptido TACE en el espacio tridimensional, tal como se muestra en la Fig. 2. Adicionalmente, los datos de imagen pueden incluir datos para representar una imagen visual tridimensional de potencial superficial electrostático de al menos una parte del polipéptido TACE en el espacio tridimensional, tal como se muestra la Fig. 2. Alternativamente, los datos de imagen pueden incluir datos para representar una estereoimagen visual tridimensional de al menos una parte de un polipéptido TACE en el espacio tridimensional, tal como se muestra en la Fig. 4.

El sistema 1000 de la presente invención puede comprender adicionalmente un dispositivo de almacenamiento 145 que almacene datos que representan una disposición geométrica de una característica de una composición diferente del polipéptido TACE y una interfaz de operador, tal como un ratón 135, para recibir instrucciones de un operador. El dispositivo de almacenamiento 145 puede incluir, por ejemplo, los datos de coordenadas de rayos X tridimensionales para otras entidades químicas. El procesador 120 está acoplado al dispositivo de almacenamiento 145 y a dicha interfaz de operador 135 y genera datos de imagen adicionales para representar la disposición geométrica de la característica de la composición relativa a dicha imagen visual tridimensional de dicha al menos una característica de dicha al menos una parte del polipéptido TACE en el monitor 132 basándose en las instrucciones de la interfaz de operador. En la realización de la Fig. 6, el dispositivo de almacenamiento 145 es parte de la memoria 110.

Las regiones de almacenamiento de primer tipo 112 y dichas regiones de almacenamiento de segundo tipo 114 son regiones de, por ejemplo, una memoria semiconductora, regiones de un disco óptico, o regiones de una memoria magnética.

En una realización, el procesador 120 y la memoria de vídeo 110 están en forma de un ordenador UNIX o VAX, tales como aquellos disponibles en Sillicon Graphics, Sun Microsystems, e IBM. Sin embargo, la invención no se limita al uso este hardware y software particular.

La invención se describe más detalladamente en los siguientes ejemplos ilustrativos. Aunque los ejemplos pueden representar solamente realizaciones seleccionadas de la invención, se tiene que entender que los siguientes ejemplos son ilustrativos y no limitantes.

Ejemplo 1 Expresión, Aislamiento y Purificación del Polipéptido TACE

Se insertó un ADNc que codifica el péptido señal, LOS dominios pro y catalítico de la TACE, LOS ácido aminoacídicos 1-477, como se describe en Black et al., "A Metalloproteinase disintigrin that releases tumour-necrosis factor-\alpha from cells", Nature 385: 729-733 (Feb. 1997), con Ser266 cambiado a Ala, Asn452 cambiado a Gln y la secuencia Gly-Ser-(His)_{6} añadida al extremo C, en un vector de expresión de células CHO. El polipéptido TACE se expresó en células CHO y se secretó una mezcla del polipéptido TACE comenzando con Val212 o Arg215. Las células se cultivaron en el fármaco, metotrexato, que destruye aquellas células que no han incorporado el vector.

El polipéptido TACE expresado después se purificó. La purificación comenzó con 5 litros del medio que contenía el polipéptido TACE expresado. El medio se concentró hasta aproximadamente 200 ml con un limite Millipore de 10K, unidad de diafiltración de TFF de 30,48 cm^{2} (1 ft^{2}). La velocidad de bombeo era de 50-100 ml/min. Después se añadieron dos litros de una solución tampón de Tris 20 mM (pH 7,5) y NaCl 300 mM (Tampón E) a la muestra.

La muestra se reconcentró como se ha descrito anteriormente y se diluyó una segunda vez con 2 litros de Tampón E, se volvió a reconcentrar, se diluyó una tercera vez con 2 litros de Tampón E, y se reconcentró hasta aproximadamente 100 ml. La muestra retenida en la unidad de diafiltración se recuperó mediante flujo inverso. Este material se filtró después a través de un 0,45 \mum y se añadió azida al 0,05%. La muestra filtrada se almacenó durante una noche a 4ºC.

Después del almacenamiento durante una noche, se añadió imidazol a la muestra filtrada a 5 mM de una solución madre 200 mM en agua y se añadió ZnCl_{2} a 5 \muM de una solución madre 1 M en agua. Después, la muestra se bombeó por 2,2 ml de resina Qiagen Ni-NTA de Superflujo (Nº Cat. 30430) a 3 ml/min (tamaño de columna 7,5 x 50 mm).

La columna se lavó a 5 ml/min con 100 ml de un tampón de Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazol 5 mM y ZnCl_{2} 5 \mum (Tampón A). Después, la proteína se eluyó con un gradiente creciente de imidazol, aumentando hasta 200 mM en 1 minuto (5 ml de volumen total), seguido de 35 ml de imidazol 200 mM en Tampón A. Se recogieron dos fracciones de 2 ml, presentándose la TACE generalmente aproximadamente a los 6 ml en la elución. Las fracciones se recogieron en tubos que contenían 500 \mul de glicerol al 50% en agua y 200 \mul de Tris 1M pH 8. El glicerol en agua se preparó el día del desarrolló de la columna.

Se tiñó una transferencia dot, con 3 \mul de cada fracción, con negro amido para determinar qué fracciones contenían una cantidad significativa de proteína. Las fracciones con una cantidad significativa de proteína se agruparon. Después, el grupo se concentró hasta 1-2 ml con un concentrador de límite 10 K Amicon Centriprep.

El inhibidor N-{D,L-2-(hidroxiaminocarbonilo)metil-4-metilpentanoilo}-L-3-amino-2-dimetilbutanoil-L-alanina, 2-(amino)etil amida se añadió a la muestra concentrada a 1 mM de una solución madre 50 mM en agua, y se añadió octilglucósido al 1% de una solución madre al 10% en agua. Después, la muestra se incubó a temperatura ambiente durante 15-24 horas.

Después de la incubación, la muestra se aplicó a una columna de exclusión por tamaño de 21,5 x 600 mm, LKB 2135-365, llena de TSK-G3000 SWG, y se equilibró con Tris 10 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, glicerol al 10%. Después, este tampón se bombeó a través de la columna a 2,5 ml/min durante 100 minutos. El polipéptido TACE en el efluente se detectó mediante absorción a 280 nm. El material excluido eluyó generalmente aproximadamente a los 38 minutos. La TACE pura eluyó generalmente aproximadamente a los 78 minutos o más.

Después se realizó un análisis en gel, con 15 \mul de todas las fracciones con proteína significativa para determinar qué fracciones se tienen que agrupar. El grupo de cromatografía de exclusión por tamaño se concentró hasta aproximadamente 1 ml con un limite de 10 K de Amicon Centripep.

El inhibidor N-{D,L-2-(hidroxiaminocarbonilo)metil-4-metilpentanoilo}-L-3-amino-2-dimetilbutanoil-L-alanina, 2-(amino)etil amida se añadió después a la muestra purificada a una concentración de 1 mM. La proteína se puede almacenar a 4ºC.

Ejemplo 2 Cristalización de Proteína

Una construcción de ADN que comprende el prodominio y el dominio catalítico de la TACE humana (residuos 1-477) se condensó con la secuencia Gly-Ser-(His)_{6} para facilitar la purificación de la proteína en una columna de afinidad de Ni-NTA. Se usaron células de Ovario de Hámster Chino (CHO) para la expresión de proteína. Las células secretaron una mezcla de TACE madura comenzando con Val212 o Arg215. Las fracciones que contenían TACE de la columna Ni-NTA se incubaron en un tampón que contenía octilglucósido y la pareja de unión N-{D,L-2-(hidroxiaminocarbonilo)metil]-4-metil-pentanoil}-L-3-(terc-butil)-glicil-L-alanina. La etapa de purificación final se realizó en una columna de filtración en gel. La TACE purificada se almacenó en un tampón que contenía Tris/HCL 10 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, glicerol al 10% y 1 mM de inhibidor (tampón TACE).

Los experimentos de cristalización se ajustaron a una concentración de TACE de aproximadamente 5 mg/ml mezclando la TACE (en tampón TACE) en una proporción 1:1 con los tampones de cristalización enumerados a continuación y usando la técnica de difusión de vapor de gota sentada. Los experimentos se realizaron por duplicado y se incubaron a aproximadamente 4ºC o a 20ºC. Se obtuvo precipitado cristalino a 20º en los siguientes tampones de cristalización:

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Tampón A) Acetato de Na 0,1 M pH 5,3, CaCl_{2} 0,2 M, Etanol al 30% v/v

Tampón B) Citrato de Na 0,1 M pH 5,0, Etanol al 40% v/v

Tampón C) Citrato de Na 0,1 M pH 8,7, PEG4000 al 20% p/v, Isopropanol al 20% v/v

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Se obtuvieron cristales pequeños después de transferir inóculos del precipitado cristalino con un pelo de un conejo en una mezcla 1:1 de una muestra concentrada de TACE (12 mg/ml en tampón TACE) con tampón B o C. El refinamiento adicional del tampón C dio como resultado el tampón D, que permitió la producción de cristales adecuados para la recogida de datos por rayos X.

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Tampón D) Citrato de Na 0,1 M pH 5,4, PEG 4000 a 20% p/v, Isopropanol al 20% v/v

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El primer conjunto de datos se midió a una resolución de 2,5 \ring{A} en un escáner de placa de formación de imágenes MAR300 unido a un generador de ánodo de Cu rotatorio Rigaku-Denki accionado a 5,4 mW proporcionando radiación CuK\alpha monocromada con grafito. Los datos se procesaron con el programa MOSFLM v. 5.23 y rutinas de la serie CCP4. Todos los intentos para esclarecer la estructura mediante métodos de sustitución molecular usando adamalisina II, un modelo de adamalisina II todo de alanina y modelos generados no produjeron puntos de inicio útiles para la sincronización. Por tanto, las localizaciones de cuatro átomos de cinc independientes se determinaron con la ayuda de una síntesis de Patterson de diferencia anómala. Para medir los datos MAD, los cristales se ultracongelaron en nitrógeno liquido. Por lo tanto, los cristales se transfirieron en un criotampón (tampón De al 80% v/v que contiene glicerol al 17% v/v) con la ayuda de un bucle de seda de tamaño apropiado, se remojaron durante aproximadamente 10 segundos y después se ultracongelaron inmediatamente a 90 grados K.

Los cristales obtenidos pertenecen al grupo espacial P2_{1}, tienen constantes celulares a=61,38 \ring{A} (angstrom), b=
126,27 \ring{A}, c=81,27 \ring{A}, \beta=107,41º, y contienen cuatro moléculas en la unidad asimétrica.

Ejemplo 3 Difracción de Rayos-X

Usando los cristales descritos en el Ejemplo 2, un primer conjunto de datos se midió a una resolución de 2,5 \ring{A} en un escáner de placa de formación de imágenes MAR300 unido a un generador de ánodo de Cu rotatorio Rigaku-Denki accionado a 5,4 mW proporcionando radiación CuK\alpha monocromada con grafito. Los datos se procesaron con el programa MOSFLM v. 5.23 y rutinas de la serie CCP4.

Todos los intentos para esclarecer la estructura mediante métodos de sustitución molecular usando adamalisina II, un modelo de adamalisina II todo de alanina y modelos generados no produjeron puntos de inicio útiles para la sincronización.

Por tanto, las localizaciones de los cuatro átomos de cinc independientes se determinaron con la ayuda de una síntesis de Patterson de diferencia anómala. Para medir los datos MAD, los cristales se ultracongelaron en una corriente de gas de nitrógeno enfriada hasta la temperatura de nitrógeno liquido. Los cristales se transfirieron en primer lugar a un criotampón de Tampón D al 80% v/v (Citrato de Na 0,1 M pH 5,4, PEG 4000 al 20% p/v, Isopropanol al 20% v/v) que contiene glicerol al 17% v/v. La transferencia al criotampón se realizó con la ayuda de un bucle de seda de un tamaño apropiado. Los cristales se remojaron en el criotampón durante aproximadamente 10 segundos y se ultracongelaron inmediatamente después a 90 K.

Los datos de difracción anómalos a 2,0 \ring{A} se recogieron con el escáner de placa de formación de imágenes MAR345 a 90 K en la línea del ondulador BW6 de DORIS (DESY, Hamburgo, Alemania), usando radiación de rayos-X monocromática a las longitudes de onda de f'' máxima (1,2769 \ring{A}) y f'' mínima (1,2776 \ring{A}) en el borde de absorción K del cinc y con una longitud de onda remota (1,060 \ring{A}). Los datos se escanearon y se evaluaron usando DENZO/SCALEPACK, obteniendo 77653 reflexiones independientes de 1051836 mediciones (finalización 96,9%, R-fusión 0,031 en intensidades).

Las fases MAD se refinaron y calcularon con MLPHARE incluyendo todos los datos medidos a una resolución de 2,0 \ring{A}. Su figura de merito media inicial de 0,53 aumentó hasta 0,76 por métodos aplanamiento de disolvente/armonización de histogramas aplicando DM. Esta densidad permitió la construcción de las cadenas completas de los cuatro dominios catalíticos de la TACE independientes y los sustratos de ácido hidroxámico unidos en un sistema SGI usando TURBO-FRODO. Este modelo se refinó cristalográficamente con XPLOR y con rutinas CCP4 hasta un factor R cristalográfico de 18,6% (R_{sin} 27,4%) usando 79400 reflexiones independientes de resolución 12,0 a 2 \ring{A}.

Cuatro moléculas independientes de TACE forman la disposición periódica.

Las moléculas 1 y 2, y 3 y 4 se definen por Asp219 y Met221, respectivamente, a Ser474.

Ejemplo 4 Difracción de Rayos X

Se recogieron datos de difracción de dispersión anómala a 2,0 \ring{A} con un escáner de placa de formación de imágenes MAR345 a 100 K en la línea del ondulador DORIS (DESY, Hamburgo, Alemania), usando radiación de rayos X monocromática de f' máxima (1,2797 \ring{A}) y f mínima (1,2808 \ring{A}) en el borde de absorción K de cinc y a una longitud de onda remota (1,060 \ring{A}). Estos datos se evaluaron y se escanearon usando DENZO/SCALEPACK, obteniendo 77.653 reflexiones independientes (finalización 96,9%, R-fusión 0,031).

Las coordenadas estructurales obtenidas se reproducen en la Tabla 1.

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TABLA 1

COMENTARIO Creado por MOLEMAN V. 961218/7.2.5 el viernes 19 de septiembre 20:05:05 1997 para el usuario Carlos.

COMENTARIO MoleMan Archivo PDB

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Ejemplo 5 Diseño de Inhibidor de TACE

Las coordenadas de difracción de rayos X de la TACE se leyeron en un programa de software Sybyl v. 6.3 (Tripos Associates) y se analizó gráficamente la estructura de rayos X. Las regiones en las coordenadas originales de rayos X se corrigieron para quiralidad y tipo de átomo. El modelo de rayos X modificado de la TACE se minimizó en energía hasta que todos los parámetros estructurales de la TACE estuvieran en sus valores de equilibrio u óptimos. La estructura minimizada en energía, después se comparó con la estructura original para confirmar la ausencia de anomalías.

Se identificaron los sitios de interacción o interacciones específica(s) entre la TACE y el inhibidor co-cristalizado. El inhibidor se retiró después del modelo del complejo de rayos X, dejando solamente el modelo estructural de la TACE.

Los inhibidores candidatos se seleccionaron basándose en los sitios de interacción con la TACE y el inhibidor candidato en vista de los sitios de interacción identificados previamente para el inhibidor co-cristalizado. Una vez determinadas las interacciones específicas de inhibidor candidato-TACE, se realizaron estudios de acoplamiento para proporcionar complejos "modelados" preliminares de inhibidores candidatos seleccionados con la TACE.

Se realizó el análisis conformacional obligatorio usando dinámicas moleculares (MD) para comprobar la integridad del complejo modelado TACE-inhibidor. Una vez que el complejo alcanzó su estado conformacional más favorable, la estructura como se propone por el estudio MD se analizó visualmente para asegurar que el complejo modelado cumplía con SAR/QSAR experimental conocida basándose en afinidades de unión medidas.

Se analizó el complejo modelado inhibidor candidato-TACE. La región del complejo asociado con las regiones S1' de la TACE que contienen un pequeño canal expuesto a disolvente se seleccionó como una región diana para modificación. Una única modificación, un grupo bencilo que se incrusta en la región diana, se seleccionó basándose en principios químicos computacionales y de síntesis. El grupo bencilo se orientó en un núcleo quelante de cinc apropiado para proyectarse en el bolsillo S1' S3'. Esta modificación convierte un inhibidor que era generalmente selectivo para MMP en uno que es selectivo para la TACE. Los datos de CI50 para el inhibidor con una modificación bencilo confirman esta selectividad.

Se realizó de forma iterativa la analogía basada en estructura para la optimización de la potencia, la selectividad y las propiedades físicas similares a fármaco del inhibidor.

Ejemplo 6 Medida de la Inhibición de la TACE

Se incubaron 250 \muM de sustrato peptídico (Ac-SPLAQAVRSSSR-NH_{2}) con 3,7 U/\mul de TACE en un tampón que contiene TRIS HCl 10 mM, pH 7,4, glicerol al 10% a 25 grados C. La reacción se detuvo con TFA al 1% (concentración final) después de dos horas. La mezcla de reacción se separó mediante HPLC en una Hewlett-Packard 1150. La formación del producto se controló mediante absorbancia a 220 nm.

La linealidad de la reacción se confirmó (r^{2}>0,85). La media (x \pm sem) de la velocidad control se calculó y comparó para significancia estadística (p < 0,05) con índices ensayadas con fármacos usando el ensayo de comparación de múltiple de Dunnet. Se generaron las relaciones de dosis-respuesta usando múltiples dosis de fármaco y se estimaron valores de CI_{50} con Cl al 95% usando regresión lineal.

A partir de la anterior descripción y los ejemplos, los especialistas en la técnica pueden determinar las características esenciales de la invención y, sin apartarse del alcance de la invención, pueden realizar cambios, modificaciones y variaciones de la invención para adaptarla a diversos usos y condiciones.

<110> BLACK, Roy A.

\hskip1cm PAXTON, Raymond James

\hskip1cm BODE, Wolfram

\hskip1cm MASKOS, Klaus

\hskip1cm FERNANDEZ-CATALAN, Carlos

\hskip1cm CHEN, James Ming

\hskip1cm LEVIN, Jeremy Ian

\hskip1cm IMMUNEX CORPORATION

\hskip1cm INSTITUTO MAX-PLANCK DE BIOQUÍMICA

\hskip1cm AMERICAN HOME PRODUCTS CORPORATION

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<120> ENZIMA CONVERTIDORA DE TNF-\alpha CRISTALINA Y USO DE LA MISMA

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<130> 016761/0149

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<140> PCT/US99/02185

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<141> 03-02-1999

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<150> US 60/117.476

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<151> 27-01-1999

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<150> US 09/050.083

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<151> 30-03-1998

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<150> US 60/073.709

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<151> 04-02-1998

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<160> 7

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 1

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\sa{Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser}

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<210> 2

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400> 2

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\sa{Gly Ser His His His His His His}

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<210> 3

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: motivo consenso de unión de cinc

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (3)..(4)

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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (6)..(7)

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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (9)..(10)

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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido

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<400> 3

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\sa{His Glu Xaa Xaa His Xaa Xaa Gly Xaa Xaa His}

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<210> 4

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<211> 203

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<212> PRT

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<213> veneno de serpiente

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<400> 4

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70

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<210> 5

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<211> 287

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<212> PRT

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<213> mamífero o insecto

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: polipéptido

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<400> 5

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71

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<210> 6

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<211> 276

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

72

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<210> 7

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido

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<400>7

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\sa{Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg}

Claims (19)

1. Un método para identificar un compuesto que se asocia a un polipéptido de enzima convertidora de TNF-\alpha (TACE), que comprende:

(A)

cristalizar dicho polipéptido TACE, donde dicha cristalización implica

(i)

obtener un fragmento de dicho polipéptido TACE, consistiendo dicho fragmento esencialmente en el dominio catalítico de la TACE,

(ii)

incubando el fragmento con octilglucósido en presencia de un inhibidor TACE, y

(iii)

cristalizar el fragmento y terminar la estructura de cristal del fragmento;

(B)

diseñar un compuesto de asociación para el polipéptido TACE que forma un enlace con el dominio catalítico basado en coordenadas de difracción de rayos X del cristal del polipéptido TACE;

(C)

sintetizar el compuesto; y

(D)

determinar la capacidad de asociación del compuesto con el polipéptido.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto de asociación es un inhibidor, mediador u otro compuesto que regula la actividad de la TACE.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el compuesto de asociación es un inhibidor competitivo, un inhibidor anti-competitivo o un inhibidor no competitivo.

4. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que las coordenadas son las coordenadas de la Tabla 1.

5. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el cristal de polipéptido TACE se co-cristaliza con una pareja de unión.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la pareja de unión es una pareja de unión basada en hidroxiamato.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la pareja de unión es N-{D,L-2-(hidroxiaminocarbonil)metil-4-metilpentanoil}-L-3-amino-2-dimetilbutanoil-L-alanina, 2-(amino)etil amida.

8. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el cristal del polipéptido TACE tiene una estructura de cristal que difracta a 2,0 \ring{A}.

9. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el cristal del polipéptido TACE es monoclínico.

10. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el cristal del polipéptido TACE tiene una unidad celular que comprende cuatro moléculas del dominio catalítico (TCD) de la TACE cristalográficamente independientes.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que las moléculas del TCD están en una unidad asimétrica.

12. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el cristal del polipéptido TACE es del grupo espacial monoclínico P2_{1} y la célula tiene las constantes a = 61,38 \ring{A}, b = 126,27 \ring{A}, c = 81,27 \ring{A} y \beta = 107,41º.

13. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el compuesto de asociación se diseña para asociarse con la región S1' de la TACE.

14. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el compuesto de asociación se diseña para asociarse con el bolsillo S1'S3' de la TACE.

15. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el compuesto de asociación se diseña para incorporar un resto que quele el cinc.

16. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el compuesto de asociación se diseña para formar un enlace de hidrógeno con Leu348 o Gly349 de la TACE.

17. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el compuesto de asociación se diseña para introducir un grupo no polar que ocupa el bolsillo S1' de la TACE.

18. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el compuesto de asociación se diseña para introducir un grupo que se encuentra en el canal que comparte los bolsillos S1'-S3' de la TACE y que realiza contacto van der Waal apropiado con el canal.

19. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el compuesto de asociación se diseña para formar un enlace de hidrógeno con Leu348 o Gly349 en los grupos amida de la estructura de la TACE.