JP2003515324A

JP2003515324A - カスパーゼ−７を含む結晶化可能な組成物

Info

Publication number: JP2003515324A
Application number: JP2001539214A
Authority: JP
Inventors: ユンイウェイ，
Original assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1999-11-16
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2003-05-07
Also published as: US20080187980A1; US20030224368A1; WO2001037194A9; WO2001037194A3; WO2001037194A2; AU1772601A; EP1232253A2; CA2389569A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、カスパーゼ−７の活性部位結合ポケットを含む結晶化された分子および分子複合体の構造座標でコード化される、データ保存媒体に関する。このようなデータ保存材料は、このような分子および分子複合体、またはこれらの構造的なホモログを、図形的な三次元表示としてコンピュータースクリーン上で表示し得る。本発明はまた、この構造座標を用いて類似またはホモログのタンパク質またはタンパク質複合体の構造を解明する方法に関する。さらに、本発明は、この構造座標を使用して、カスパーゼ−７またはそのホモログに結合する化合物（阻害化合物を含む）をスクリーニングおよび設計する方法に関する。本発明はまた、カスパーゼ−７の活性部位結合ポケットを含む分子もしくは分子複合体、またはこの活性部位結合ポケットの近接した構造ホモログに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の技術分野）本発明は、カスパーゼ−７の活性部位結合ポケットを含む結晶化した分子およ
び分子複合体の構造座標でコードされたデータ保存媒体に関する。このようなデ
ータ保存材料は、コンピュータースクリーン上の図形的な三次元表示のように、
このような分子および分子複合体、またはそれらの構造相同体を表示し得る。本
発明はまた、同様または相同のタンパク質またはタンパク質複合体の構造を解析
するために構造座標を使用する方法に関する。さらに、本発明は、カスパーゼ−
７またはそれらの相同体に会合する化合物（インヒビター化合物を含む）をスク
リーンおよび設計するために構造座標を使用する方法に関する。本発明はまた、
カスパーゼ−７の活性部位結合ポケットまたはその活性部位結合ポケットの近接
した構造的相同体を含む分子または分子複合体に関する。本発明はまた、カスパ
ーゼインヒビターと複合体化したカスパーゼ−７の組成物および結晶に関する。

【０００２】（発明の背景）アポトーシスまたはプログラムされた細胞死は、所望されない細胞を排除する
生物による主な機構である。アポトーシスの自由化（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
）、すなわち、過剰なアポトーシスまたはそれを引き起こすのに失敗すること、
は、癌、急性炎症および自己免疫障害、虚血疾患および特定の神経変性障害のよ
うな多数の疾患に関係する［一般に、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１、１２８３−１３
１２頁（１９９８）；Ｅｌｌｉｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，
７、６６３頁（１９９１）］。

【０００３】カスパーゼは、アポトーシスおよび細胞分解のためのシグナル経路における重
要なメディエーターであるシステインプロテアーゼ酵素のファミリーである［Ｎ
．Ａ．Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，５，Ｒ９７−Ｒ１０３（
１９９８）］。これらのシグナル経路は、細胞型および刺激に非常に依存するが
、全てのアポトーシス経路は、キータンパク質のタンパク質分解を導く共通のエ
フェクター経路に集中すると考えられる。カスパーゼは、シグナル経路のエフェ
クター相およびその初期におけるさらなる上流の両方に含まれる。初期事象に含
まれるこの上流カスパーゼは、活性化され、次いで、アポトーシスの後発相に含
まれる他のカスパーゼを活性化する。

【０００４】カスパーゼは、それらの優位な機能的役割およびそれらの基質特異性に依存し
て３つの群に分類されている［Ｎ．Ａ．Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｌ．，５、Ｒ９７−Ｒ１０３頁（１９９８）；Ｎ．Ａ．Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ
＆Ｙ．Ｌａｚｅｂｎｉｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１、１３１２−１３１６頁
（１９９８）；Ｍ．Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｌｖｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２７３、３２６０８−３２６１３頁（１９９８）］。

【０００５】第１のサブファミリーは、カスパーゼ−１（ＩＣＥ）、４、および５からなる
。これらのカスパーゼは、プロ炎症性サイトカインプロセシングに関与し、それ
故に、炎症の際に重要な役割を担うことが示されている。カスパーゼ−１、すな
わちこのクラスで最も研究された酵素は、タンパク質分解切断によってＩＬ−１
β前駆体を活性化する。それ故に、この酵素は、炎症性応答において重要な役割
を担う。カスパーゼ−１はまた、インターフェロンγの産生を刺激するインター
フェロンγ誘発因子（ＩＧＩＦまたはＩＬ−１８）、すなわち、抗原提示、Ｔ細
胞活性化および細胞癒着を調節するキー免疫調節剤のプロセシングに関する。

【０００６】残りのカスパーゼは、第２および第３のサブファミリーを構成する。これらの
酵素は、アポトーシスを導く細胞内シグナル経路において中心的重要性を有する
。１つのサブファミリーは、アポトーシス経路における事象の開始（血漿膜から
のシグナルの伝達を含む）に関する酵素からなる。このサブファミリーのメンバ
ーは、カスパーゼ−２、８、９、および１０を含む。エフェクターカスパーゼ３
、６、および７からなる他のサブファミリーは、アポトーシスによる細胞の体系
的な分解および死を生じる最終的な下流切断事象に関する。上流シグナル伝達に
関するカスパーゼは、下流カスパーゼを活性化し、次いで、ＤＮＡ修復機構を無
効にし、ＤＮＡを断片化し、細胞骨格を分解し、そして最終的に細胞を断片化す
る。

【０００７】細胞アポトーシスの増加に関連する種々の哺乳動物疾患状態を処置するための
カスパーゼインヒビターの有用性は、ペプチドカスパーゼインヒビターを使用し
て証明されている。例えば、齧歯動物モデルにおいて、カスパーゼインヒビター
は、梗塞サイズを減少し、心筋梗塞後の心筋細胞アポトーシスを阻害し、これに
よって、発作から生じる損傷容量および神経学的欠損を低減し、外傷脳傷害にお
ける外傷後アポトーシスおよび神経学的欠損を低減し、劇症性肝臓破壊の処置に
有効であり、そして内毒素ショック後の生存を改善する［Ｈ．Ｙａｏｉｔａら、
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９７、２７６−２８１頁（１９９８）；Ｍ．Ｅｎｄｒ
ｅｓら、Ｊ．ＣｅｒｅｂｒａｌＢｌｏｏｄＦｌｏｗａｎｄＭｅｔａｂｏ
ｌｉｓｍ、１８、２３８−２４７頁（１９９８）；Ｙ．Ｃｈｅｎｇら、Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０１、１９９２−１９９９頁（１９９８）；Ａ．Ｇ．
Ｙａｋｏｖｌｅｖら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７、７４１５−７４２４頁（
１９９７）；Ｉ．Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４、２０６
７−２０７２頁（１９９６）；Ｇｒｏｂｍｙｅｒら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，５、５
８５頁（１９９９）］。

【０００８】カスパーゼ−７は、治療用薬剤のための潜在的標的と考えられる。しかし、カ
スパーゼ−７の現在の理解は、カスパーゼ−７媒介疾患に対する十分な処置を導
かない。従って、より有効なカスパーゼ−７インヒビターが必要とされる。カス
パーゼ−７を選択的に阻害するか、またはカスパーゼ−７および他のカスパーゼ
を阻害するインヒビターが必要とされる。

【０００９】カスパーゼ−７に関する薬物発見の試みが、カスパーゼ−７についての構造的
情報の欠損によって妨害されてきた。このような構造的情報は、選択的カスパー
ゼ−７インヒビターおよびパン−カスパーゼインヒビターの発見において有用で
ある。しかし、カスパーゼ−７の構造を決定しようとする試みは、カスパーゼ−
７を結晶化する際の困難性によって妨害されてきた。カスパーゼ−７タンパク質
の結晶について報告されていない。従って、このようなタンパク質のＸ線結晶学
的分析が可能でなかった。

【００１０】（発明の要旨）出願人は、まず、カスパーゼ−７インヒビターと複合体化したカスパーゼ−７
の結晶化およびその複合体の構造座標を提供することによって、この課題を解決
した。その複合体の三次元結晶構造を解析することにより、出願人は、カスパー
ゼ−７の重要な構造的特徴、特に、その活性部位結合ポケットの形状を決定する
ことができた。

【００１１】従って、本発明は、これらの結合ポケットの全てまたは一部を含む分子または
分子複合体、あるいは同様の三次元形状を有するこれらの結合ポケットの相同体
を提供する。

【００１２】本発明は、カスパーゼ−７（カスパーゼ−７活性部位結合ポケットの全てまた
は任意の部分を含む）を含む結晶化した分子および分子複合体の構造座標を含む
、データ保存媒体に関する。このデータ保存媒体は、コンピュータースクリーン
上の図形的な三次元表示のように、このような分子および分子複合体、またはそ
れらの構造相同体を表示し得る。

【００１３】本発明はまた、カスパーゼ−７に対して少なくとも幾らか構造的に同様の特徴
を含む分子または分子複合体の三次元構造の少なくとも一部を決定するための方
法を提供する。これは、カスパーゼ−７について得られる構造座標の少なくとも
幾つかを使用することによって達成される。

【００１４】さらに、本発明は、化合物（カスパーゼ−７に会合する阻害化合物またはそれ
らの相同体を含む）をスクリーンおよび設計するために構造座標を使用する方法
に関する。

【００１５】本発明はまた、カスパーゼ−７／インヒビター複合体の結晶可能な組成物およ
び結晶ならびにこのような結晶を作製するための方法を提供する。

【００１６】（発明の詳細な説明）以下の略語は、本出願全体にわたって使用される：Ａ＝Ａｌａ＝アラニンＴ＝Ｔｈｒ＝トレオニンＶ＝Ｖａｌ＝バリンＣ＝Ｃｙｓ＝システインＬ＝Ｌｅｕ＝ロイシンＹ＝Ｔｙｒ＝チロシンＩ＝Ｉｌｅ＝イソロイシンＮ＝Ａｓｎ＝アスパラギンＰ＝Ｐｒｏ＝プロリンＱ＝Ｇｌｎ＝グルタミンＦ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニンＤ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファンＥ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニンＫ＝Ｌｙｓ＝リジンＧ＝Ｇｌｙ＝グリシンＲ＝Ａｒｇ＝アルギニンＳ＝Ｓｅｒ＝セリンＨ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン。

【００１７】さらなる定義は、必要な場合、明細書中に記載される。

【００１８】本明細書中に記載される本発明をより十分に理解するために、以下の詳細な説
明が、記載される。

【００１９】出願人は、第１に、カスパーゼ−７インヒビターと複合体形成するカスパーゼ
−７を含む、結晶可能な組成物を提供することによって、上記問題を解決した。

【００２０】従って、本発明の１つの実施形態において、テトラペプチドアルデヒドインヒ
ビター（アセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨＯ（ＡＣ−ＤＥＶＤ
−ＣＨＯ））と複合体形成するカスパーゼ−７を含む、結晶可能な組成物が提供
される。好ましくは、カスパーゼ−７は、Ｙ．Ｇｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，２７１，第１０８１６〜１０８２０（１９９６）に従ってアミノ酸１〜３０
３を有する。

【００２１】この複合体のカスパーゼ−７ポリペプチド部分は、天然に存在するカスパーゼ
−７のシステインプロテアーゼ活性を有する、任意のポリペプチドである。

【００２２】好ましくは、本発明の組成物中のカスパーゼ−７ポリペプチドは、本明細書中
に記載されるように調製される、組換えにより産生されたカスパーゼ−７タンパ
ク質である。

【００２３】カスパーゼ−７ポリペプチドおよびＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯは、任意の周知の
方法によって産生され得、この方法としては、合成方法（例えば、固相合成、液
相合成および固相／液相合成の組合せ）；組換えＤＮＡ方法（部位特異的変異誘
発と必要に応じて組合せた、ｃＤＮＡクローニングを含む）；および／または酵
素学的切断方法と必要に応じて組合せた、天然産物の精製が挙げられれ、これに
より、天然に存在するカスパーゼ−７ポリペプチドのフラグメントを産生する。
このインヒビターＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯは、市販（ＰｅｐｔｉｄｅｓＩｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）されているか、または任意の周知の方法（例えば、固相
合成、液相合成および固相／液相合成の組合せ）によって産生され得る。

【００２４】本発明の別の実施形態は、テトラペプチドアルデヒドインヒビター（アセチル
−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨＯ（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ））と複
合体形成するカスパーゼ−７を含む、結晶が提供される。好ましくは、このカス
パーゼ−７は、Ｙ．Ｇｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１０８１６〜
１０８２０頁（１９９６）に従って、アミノ酸１〜３０３を有する。好ましくは
、この結晶は、単位細胞寸法（８８．２Å、８８．２Å、１８６．２Å、α＝９
０．０°、β＝９０．０°、γ＝１２０．０°）を有し、そして空間群Ｐ₃２２
１に属する。より好ましくは、この結晶化酵素は、四量体である。

【００２５】重要なことに、出願人の発明は、第１に、カスパーゼ−７活性部位の結合ポケ
ットの形状および構造に関する情報を提供した。

【００２６】結合ポケットは、薬物発見のような分野で有意に有用である。天然のリガンド
または基質と、それらの対応するレセプターまたは酵素の結合ポケットとの結合
は、活性の多くの生物学的機構の基礎である。同様に、多くの薬物は、レセプタ
ーおよび酵素の結合ポケットとの結合を介して、それらの生物学的効果を及ぼす
。このような結合は、結合ポケットの全ての部分または任意の部分で生じ得る。
このような結合の理解は、それらの標的レセプターまたは酵素とのより有利な結
合を有する薬物の設計、従って、改良された生物学的効果に導くのを助ける。従
って、この情報は、カスパーゼ−７様結合ポケットの強力なインヒビターを設計
する際に価値がある。

【００２７】本明細書中で使用される場合、用語「結合ポケット」とは、その形態の結果と
して、別の化学実体または化合物との好ましく会合する、分子または分子複合体
の領域をいう。

【００２８】用語「カスパーゼ−７様結合ポケット」とは、形態が共通のリガンドを結合す
るようにカスパーゼ−７活性部位結合ポケットの全てまたは任意の部分と十分類
似する、分子または分子複合体の一部分をいう。この形態の共通点は、１．５Å
以下の、カスパーゼ−７中の結合ポケットを構成するアミノ酸の骨格原子の構造
座標（図１に示すように）から根平均二乗偏差により規定される。この計算を実
行する方法は以下に記載される。

【００２９】カスパーゼ−７の「活性部位結合ポケット」または「活性部位」は、カスパー
ゼ−７酵素表面上の領域をいい、ここで基質の切断が起こり、そしてここでＡｃ
−ＤＥＶＤ−ＣＨＯは、その阻害効果を発揮する。

【００３０】用語「Ｐ結合ポケット」、「Ｓポケット」、「Ｓ領域」などは、結合基質、ま
たはカスパーゼ分子上の基質結合部位の一部分をいう。基質のアミノ酸残基は、
これらの相対的に切れやすい結合（すなわち、プロテアーゼにより壊される結合
）位置に従って命名される。この残基は、これらが基質のＮ末端の方へ伸びてい
る場合に、Ｐ１またはＰ２などと命名され、そしてこれらが基質のＣ末端の方へ
伸びている場合に、Ｐ１’またはＰ２’などと命名される。基質のＰ残基または
Ｐ’残基に対応するインヒビターの一部分はまた、基質との類似性によりＰ１、
Ｐ１’などと標識される。Ｐ１、Ｐ１’などと標識された残基を受け取るカスパ
ーゼ分子の結合サブサイトは、Ｓ１、Ｓ１’などと命名され、あるいは、「Ｐ１
結合ポケット」、「Ｐ１’結合ポケット」などと命名され得る（Ｉ．Ｓｃｈｅｃ
ｈｔｅｒおよびＡ．Ｂｅｒｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍｕｎｉ．、２７、ｐｐ．１５７〜１６２（１９６７））。

【００３１】カスパーゼ−７の結晶構造解析において、出願人は、カスパーゼ−７アミノ酸
２３４、２３５、２３７、２７６、２７８、２８１および２８４が、カスパーゼ
３のＳ４結合領域よりもより親水性であるカスパーゼ−７のＳ４結合領域に起因
することを決定した。

【００３２】出願人は、アミノ酸８５、８６、８７、８８、１４４、１４５、１８４、１８
６，１９１、２２３、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３
７，２４０、２７８、２７８、２８１、２８２および２８４が、このリガンドと
相互作用するＡｃ−ＤＥＶＤ―ＣＨＯインヒビターと十分に密接した位置にある
ことを決定した。

【００３３】出願人はまた、アミノ酸残基８７，１８４、および２３３が、カスパーゼ−７
のＰ１結合ポケットにおいて重要であること；アミノ酸残基１９１、２３０、２
３２、および２８２が、カスパーゼ−７のＰ２結合ポケットにおいて重要である
こと；アミノ酸残基８６，８８，２３３が、カスパーゼ−７のＰ３結合ポケット
において重要であること；およびアミノ酸残基２３４，２３５，２３７，２４０
、および２７６が、カスパーゼ−７のＰ３結合ポケットにおいて重要であること
を決定した。

【００３４】当業者は、カスパーゼ−７の他のアイソフォームにおけるアミノ酸の番号が、
本明細書中に記載されたものと異なり得ることを容易に理解する。

【００３５】有利には、本発明により提供される結晶は、ｘ線結晶学に従う。従って、本発
明はまた、カスパーゼ−７複合体、詳細にはカスパーゼ−７／Ａｃ−ＤＥＶＤ−
ＣＨＯ複合体の三次元構造を２．３５Åの解像度で提供する。重要なことには、
これは、カスパーゼ−７の形態および構造についての最初の情報であった。

【００３６】本発明のカスパーゼ−７／インヒビター複合体の三次元構造は、図７に示され
るような構造座標のセットにより規定される。用語「構造座標」は、結晶形態の
カスパーゼ−７／インヒビター複合体の原子（散在中心）によるｘ線単色ビーム
の回折について得られたパターンに関する数学的方程式から誘導されるデカルト
座標をいう。回折データを使用して、結晶の繰り返し単位の電子濃度マップを計
算する。次に、電子濃度マップを使用して、カスパーゼ−７またはカスパーゼ−
７／インヒビター複合体の個々の原子の位置を確立した。

【００３７】当業者は、酵素または酵素複合体またはこれらの一部分についての構造座標の
セットが、三次元形態を規定する点のセットに関することを理解する。従って、
完全に異なる座標のセットが、類似の形態または同一の形態を規定しうることが
起こり得る。さらに、個々の座標における少しの変化は、全形態に対してほとん
ど影響を有さない。

【００３８】上記座標の変化は、構造座標の数学的操作に起因して生じ得る。例えば、図７
に示す構造座標は、構造座標の結晶学的順列、構造座標の分割、構造座標のセッ
トへの整数値の付加または挿入、構造座標の反転または上記の任意の組み合わせ
により操作され得る。

【００３９】あるいは、アミノ酸の変異、付加、置換、および／もしくは欠失に起因する結
晶構造の改変、または結晶を構成する成分のいずれかにおけるその他の変化もま
た、構造座標の変化の原因であり得る。このような変化が、元の座標と比較した
場合に許容誤差範囲内である場合は、得られた三次元形態は、同一と考えられる
。

【００４０】従って、種々のコンピュータ解析は、分子または分子複合体またはこれらの部
分が、上記同一と考えられるようなカスパーゼ−７／インヒビター構造の全部ま
たは一部と十分に類似しているか否かを決定する必要がある。このような解析は
、現在のソフトウエアアプリケーション（例えば、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓＩｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）ｖｅ
ｒｓｉｏｎ４．１のＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｉｌａｒｉｔｙアプリケーシ
ョン）において添付の使用者ガイドに記載されるように実行され得る。

【００４１】ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｉｌａｒｉｔｙアプリケーションは、異なる構造
、同一の構造の異なる立体配座、および同一の構造の異なる部分間の比較を可能
にする。構造を比較するためにＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｉｌａｒｉｔｙにお
いて使用される手順は、以下の４つの工程に分けられる：１）比較すべき構造を
ロードする工程；２）これらの構造における原子当量を規定する工程；３）適応
する操作を実施する工程；および４）結果を解析する工程。

【００４２】各構造は、名称によって同定される。ある構造が、標的（すなわち、固定され
た構造）として同定され；残りの全ての構造は、作業構造（ｗｏｒｋｉｎｇｓ
ｔｒｕｃｒｅ）（すなわち、可動構造（ｍｏｖｉｎｇｓｔｒｕｃｔｕｒｅ））
である。ＱＵＡＮＴＡ中の原子当量は、使用者のインプットにより規定されるた
め、本発明の目的のために、我々は比較される２つの構造間の全ての保存された
残基についてタンパク質骨格原子（Ｎ、Ｃα、ＣおよびＯ）のような原子当量を
規定する。我々はまた、強固に適合した（ｒｉｇｉｄｆｉｔｔｉｎｇ）操作の
みを考慮する。

【００４３】強固に適合した方法が使用される場合、作業構造は、標的構造と最適な適合が
得られるように翻訳および回転される。この適合操作は、可動構造に適用される
べき最適翻訳および回転を、等価な原子の特定の対にわたる適合の根平均二乗偏
差が絶対最小値であるように計算するアルゴリズムを使用する。この数は、オン
グストロームで規定され、ＱＵＡＮＴＡにより報告される。

【００４４】本発明の目的のために、任意の分子または分子複合体（これは、図７に列挙さ
れた構造座標により記載された関連の骨格原子で重ね合せた場合、１．５Å未満
の保存された残基の骨格原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ、Ｏ）の根平均二乗偏差を有する）
は、同一であると考えられる。より好ましくは、根平均二乗偏差は、１．０Å未
満である。

【００４５】用語「根平均二乗偏差」とは、平均からの偏差の二乗の平均の二乗根を意味す
る。傾向または対象からの偏差または変動を表す方法である。本発明の目的のた
めに、この「根平均二乗偏差」は、本明細書中に記載される構造座標により規定
されるようなタンパク質の骨格または複合体のカスパーゼ−７ポリペプチドの一
部分の骨格に関連する部分に由来するタンパク質複合体の骨格における変動を規
定する。

【００４６】一旦、タンパク質結晶の構造座標が決定されると、これらは種々の目的で有用
である（例えば、薬物の発見および関連するタンパク質の結晶学的決定）。

【００４７】従って、本発明に従って、カスパーゼ−７ポリペプチド／インヒビター複合体
、およびこれらの部分の構造座標が提供される。このようなデータは、例えば、
薬物設計および分子置換の目的で使用され得る。

【００４８】従って、本発明の１つの実施形態は、図７によるカスパーゼ−７のアミノ酸２
３４、２３５、２３７、２７６、２７８、２８１、および２８４、またはこの分
子または分子複合体のホモログの構造座標により規定される結合ポケットの全て
または任意の部分を含む分子または分子複合体を提供する。ここで、このホモロ
グは、１．５Åを超えないこのアミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏差を有す
る結合ポケット含み、そしてここでこの分子または分子複合体は、カスパーゼ３
のＳ４結合領域よりもより親水性であるＳ４結合領域を有する。

【００４９】本発明の別の実施形態は、カスパーゼ−７のアミノ酸８５、８６、８７、８８
、１４４、１４５、１８４、１８６、１９１、２２３、２３０、２３１、２３２
、２３３、２３４、２３５、２３７、２４０、２７６、２７８、２８１、２８２
、および２８４、またはこの分子または分子複合体のホモログの構造座標により
規定された結合ポケット全てまたは任意の一部分を含む分子または分子複合体を
提供する。ここで、このホモログは、１．５Åを超えないこのアミノ酸の骨格原
子からの根平均二乗偏差を有する結合ポケットを含み、そしてここでこの分子ま
たは分子複合体は、カスパーゼ３のＳ４結合領域よりもより親水性であるＳ４結
合領域を有する。

【００５０】本発明のなお別の実施形態は、図７に記載の構造座標の全てまたは一部により
規定される分子もしくは分子複合体、またはこの分子もしくは分子複合体のホモ
ログを提供し、ここでこのホモログは、このアミノ酸の保存性骨格原子から１．
５Å以下の根平均二乗偏差を有し、そしてここで、この分子または分子複合体は
、カスパーゼ−３のＳ４結合領域よりも親水性であるＳ４結合領域を有する。好
ましくは、分子または分子複合体は、図７に記載の構造座標の全てまたはそのホ
モログによって規定される。

【００５１】本発明のなお別の実施形態は、図７に記載のカスパーゼ−７アミノ酸５８〜３
０２の構造座標の全てまたは一部により規定される分子もしくは分子複合体、ま
たはこの分子もしくは分子複合体のホモログを提供し、ここでこのホモログは、
このアミノ酸の保存性骨格原子から１．５Å以下の根平均二乗偏差を有し、そし
てここで、この分子または分子複合体は、カスパーゼ−３のＳ４結合領域よりも
親水性であるＳ４結合領域を有する。好ましくは、分子または分子複合体は、図
７に記載のカスパーゼ−７アミノ酸５８〜３０２の構造座標の全てまたはそのホ
モログによって規定される。

【００５２】好ましくは、これらの実施形態の任意において、このホモログは、このアミノ
酸の保存性骨格原子から１．０Å以下の根平均二乗偏差を有する。

【００５３】より好ましい実施形態において、分子または分子複合体は、図７に記載のカス
パーゼ−７アミノ酸５８〜３０２の構造座標によって規定される。

【００５４】本発明はまた、機械読取り可能なデータ記憶媒体を提供し、これは、機械読取
り可能なデータをコード化するデータ記憶材料を含み、ここで、このデータは、
図７に記載のカスパーゼ−７複合体の構造座標の全てまたは一部、あるいはこの
複合体のホモログにより規定され、ここで、このホモログは、この複合体の骨格
原子から１．５Å以下の根平均二乗偏差を有する骨格原子を含む。

【００５５】好ましくは、データは、図７に記載のカスパーゼ−７アミノ酸２３４、２３５
、２３７、２７６、２７８、２８１、および２８４の構造座標、またはこの複合
体のホモログの構造座標によって規定され、ここで、このホモログは、骨格原子
から１．５Å以下の根平均二乗偏差を有する骨格原子を含む。

【００５６】より好ましくは、データは、図７に記載のカスパーゼ−７アミノ酸８５、８６
、８７、８８、１４４、１４５、１８４、１８６、１９１、２２３、２３０、２
３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３７、２４０、２７６、２７８、２
８１、２８２および２８４の構造座標、またはこの複合体のホモログの構造座標
によって規定され、ここで、このホモログは、この複合体の骨格原子から１．５
Å以下の根平均二乗偏差を有する骨格原子を含む。

【００５７】なおより好ましくは、データは、図７に記載のカスパーゼ−７アミノ酸５８〜
３０２の構造座標、あるいはこの分子または複合体のホモログの構造座標によっ
て規定され、このホモログは、骨格原子から１．５Å以下の根平均二乗偏差を有
する。

【００５８】好ましくは、これらの実施形態の任意において、このホモログは、このアミノ
酸の保存性骨格原子から１．０Å以下の根平均二乗偏差を有する。

【００５９】より好ましくは、データは、図７に記載のカスパーゼ−７アミノ酸５８〜３０
２の構造座標によって規定される。

【００６０】本発明に従って、これらのカスパーゼ−７複合体およびそのホモログは、カス
パーゼ−３のＳ４結合領域よりも親水性であるＳ４結合領域を有する。

【００６１】カスパーゼ−７複合体またはその結合ポケットの１つあるいはそのホモログに
ついて生成される構造座標を使用するために、これらを三次元形状に変換するこ
とが時々必要である。これは、１セットの構造座標から分子またはその一部の三
次元表示を生成し得る市販のソフトウェアの使用によって達成される。三次元表
示は、図形的な表示で表示され得る。

【００６２】従って、本発明の別の実施形態に従って、機械読取り可能なデータ記憶媒体が
提供され、これは、機械読取り可能なデータをコード化するデータ記憶材料を含
み、このデータを使用するための指示書とともにプログラムされた機械を使用す
る場合、任意の分子または分子複合体あるいはそのホモログの三次元表示を作製
し得、これらは、本明細書中に記載される。

【００６３】本発明はまた、以下：ａ．分子または分子複合体であって、図７に記載のカスパーゼ−７のアミノ酸
２３４、２３５、２３７、２７６、２７８、２８１、および２８４の構造座標に
よって規定される結合ポケットを含む、分子または分子複合体；あるいはｂ．この分子もしくは分子複合体のホモログであって、１．５Å以下のアミノ
酸の骨格原子からの根平均二乗偏差を有する結合ポケット含む、ホモログ、の三次元表示を作製するためのコンピュータを提供し、ここで、このコンピュー
タは：ｉ．機械読みとり可能データでコード化されたデータ記憶材料を含む機械読み
とり可能なデータ記憶媒体であって、ここでデータが、図７に記載のカスパーゼ
−７のアミノ酸２３４、２３５、２３７、２７６、２７８、２８１、および２８
４の構造座標を含む、データ記憶媒体；ｉｉ．機械読みとり可能データを三次元表示へと処理するための指示書を備える。

【００６４】好ましくは、コンピュータは、図７に記載のカスパーゼ−７アミノ酸８５、８
６、８７、８８、１４４、１４５、１８４、１８６、１９１、２２３、２３０、
２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３７、２４０、２７６、２７８、
２８１、２８２および２８４の構造座標のセットによって規定される分子または
分子複合体の三次元表示を作製するためにあるか、あるいは三次元表示は、この
分子または分子複合体のホモログの三次元表示であり、このホモログは、このア
ミノ酸の骨格原子から１．５Å以下の根平均二乗偏差を有する。

【００６５】より好ましくは、コンピュータは、図７に記載の構造座標のセットの全てまた
は一部によって規定される分子または分子複合体、あるいはこの分子または分子
複合体のホモログの三次元表示を作製するためにあり、このホモログは、このア
ミノ酸の骨格原子から１．５Å以下の根平均二乗偏差を有する。

【００６６】最も好ましくは、コンピュータは、図７に記載のカスパーゼ−７アミノ酸５８
〜３０２、あるいはこの分子または分子複合体のホモログ、あるいはこのホモロ
グの構造座標のセットによって規定される三次元を作製するためにあり、ホモロ
グは、このアミノ酸の骨格原子から１．５Å以下の根平均二乗偏差を有する。

【００６７】好ましくは、これらの実施形態の任意において、このホモログは、このアミノ
酸の保存性骨格原子から１．０Å以下の根平均二乗偏差を有する。

【００６８】最も好ましくは、コンピュータは、図７に記載のカスパーゼ−７アミノ酸５８
〜３０２の構造座標のセットによって規定される三次元を作製するためにある。

【００６９】好ましい実施形態において、本発明に従うコンピュータはまた、機械読み取り
可能なデータを処理するための指令を記憶するためのワーキングメモリ、ワーキ
ングメモリおよび三次元表示にこの読み取り可能なデータを処理するための読み
取り可能データ記憶媒体に連結された中央処理装置、または三次元表示を表示す
るためのディスプレイを備える。より好ましくは、本発明に従うコンピュータは
、ディスプレイを備える。最も好ましくは、本発明に従うコンピュータは、上記
ワーキングメモリ、中央処理装置およびディスプレイを備える。

【００７０】図８は、３つの実施形態の１つのバージョンを示す。システム１０は、中央処
理装置（「ＣＰＵ」）２０、ワーキングメモリ２２、例えば、ＲＡＭ（ランダム
アクセスメモリ）または「コア」メモリ、大容量記憶装置２４（例えば、１つ以
上のディスクドライブまたはＣＤ−ＲＯＭドライブ）、１つ以上の陰極線チュー
ブ（「ＣＲＴ」）ディスプレイ端末２６、１つ以上のキーボード２８、１つ以上
の入力ライン３０、および１つ以上の出力ライン４０を備えるコンピュータ１１
を含み、この全てが、従来の二方向性システムバス５０によって相互接続される
。

【００７１】入力ハードウェア３６は、入力ライン３０によってコンピュータ１１に接続さ
れ、種々の方法で実施され得る。本発明の機械読み取り可能なデータは、電話線
または専用データライン３４によって接続されるモデム３２の使用によって入力
され得る。あるいは、またはこれらに加えて、入力ハードウェア３６は、ＣＤ−
ＲＯＭドライブまたはディスクドライブ２４を備え得る。ディスプレイ端末２６
と組み合わせて、キーボード２８はまた、入力デバイスとして使用され得る。

【００７２】出力ハードウェア４６は、出力ライン４０によってコンピュータ１１に接続さ
れ、同時に従来のデバイスによって実行され得る。例として、出力ハードウェア
４６は、本明細書中に記載されるような、ＱＵＡＮＴＡのようなプログラムを使
用して、本発明の結合ポケットの図形的な表示を表示するために、ＣＲＴディス
プレイ端末２６を備え得る。出力ハードウェアはまた、プリンター４２を備え得
、その結果、ハードコピー出力が、作製され得るか、ディスクドライブ２４を備
え得、後の使用のためにシステムの出力を記憶し得る。

【００７３】操作において、ＣＰＵ２０は、種々の入力および出力デバイス３６、４６の使
用を調整し、大容量記憶装置２４からのデータアクセスおよびワーキングメモリ
２２へのまたはワーキングメモリ２２からのアクセスを調整し、そしてデータ処
理工程の順序を決定する。多くのプログラムが、本発明の機械読み取り可能なデ
ータを処理するために使用され得る。このようなプログラムは、本明細書中に記
載される薬物発見のコンピュータ方法を参照して議論される。ハードウェアシス
テム１０の成分に対する特定の参照は、データ記憶媒体についての以下の記載全
体を通じて適切に含まれる。

【００７４】図９は、図８のシステム１０のようなシステムによって実行され得る機械読み
取り可能なデータでコード化され得る磁気データ記憶媒体１００の断面を示す。
媒体１００は、従来のフロッピー（登録商標）ディスケットまたはハードディス
クであり得、これは、片面または両面に、適切な基板１０１（従来のものであり
得る）および適切なコーティング１０２（従来のものであり得る）を有し、極性
または配向が磁気的に変化され得る磁気ドメイン（見えない）を含む。媒体１０
０はまた、ディスクドライブまたは他のデータ記憶デバイス２４のスピンドルを
受容するための開口部（図示しない）を有し得る。

【００７５】媒体１００のコーティング１０２の磁気ドメインは、図８のシステム１０のよ
うなシステムによって実行するために、本明細書中に記載されるような従来の機
械読み取り可能データであり得る様式でコード化されるように、極性があるかま
たは配向する。

【００７６】図１０は、図８のシステム１０のようなシステムによって実行され得る、機械
読み取り可能なデータまたは指令のセットでまたコード化され得る光学読み取り
可能データ記憶媒体１１０の断面を示す。媒体１１０は、従来のコンパクトディ
スク読み取り専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）または光学的に読み取り可能であり、
磁気光学的に書き込み可能である磁気光学ディスクのような書き換え可能媒体で
あり得る。媒体１１０は、通常、基板１１１の片面の、適切な基板１１１（従来
のものであり得る）および適切なコーティング１１２（従来のものであり得る）
を有する。

【００７７】ＣＤ−ＲＯＭの場合、周知なように、コーティング１１２は、反射性であり、
複数のピット１１３で印加（ｉｍｐｒｅｓｓ）されて、機械的読み取り可能デー
タをコード化する。ピットの配置は、コーティング１１２の表面からのレーザー
光の反射によって読まれる。保護コーティング１１４（好ましくは、実質的に透
明である）は、コーティング１１２の上部に提供される。

【００７８】磁気光学ディスクの場合、周知なように、コーティング１１２は、ピット１１
３を有さないが、極性または配向が、レーザー（図示しない）によるように、特
定の温度より上に加熱される場合、磁気的に変化し得る複数の磁気ドメインを有
する。ドメインの配向は、コーティング１１２から反射されるレーザー光の極性
を測定することによって読み出され得る。ドメインの配置は、上記のようにデー
タをコード化する。

【００７９】初めて、本発明は、化学実体（カスパーゼ−７に結合し得る阻害性化合物また
はその任意の部分を含む）を設計、選択および／または合成するための薬物発見
技術（構造ベースの合理的な薬物設計を含む）、またはデータベーススクリーニ
ング技術の使用を可能にする。

【００８０】例えば、このデータによってコードされる構造は、化学実体と会合するその能
力についてコンピュータにより評価され得る。カスパーゼ−７と関連する化学実
体は、カスパーゼ−７を阻害し得、潜在的な薬物候補である。あるいは、このデ
ータによってコードされる構造は、コンピュータスクリーン上で図形的な三次元
表示で表示され得る。これによって、構造の視覚的検査、ならびに化学実体と構
造の関連についての視覚的検査が可能になる。

【００８１】従って、別の実施形態に従って、本発明は、上記の分子または分子複合体の任
意と会合する化学実体の潜在性または可能性を評価するための方法に関連する。
この方法は、以下の工程：ａ）化学実体と分子もしくは分子複合体の結合ポケッ
トとの間の一致操作を実行するためのコンピュータ手段を使用する工程；および
ｂ）化学実体と結合ポケットとの間の結合を定量するための一致操作の結果を分
析する工程を包含する。用語「化学実体」は、本明細書中で使用される場合、化
合物、少なくとも２つの化合物の複合体、およびこのような化合物または複合体
のフラグメントをいう。

【００８２】初めて、本発明は、カスパーゼ−７様結合ポケットに結合し得る阻害性化合物
を含む化学実体を同定、選択および設計するための分子設計技術の使用を可能に
する。

【００８３】カスパーゼ−７結合部位の出願人の解明は、カスパーゼ−７結合ポケットと相
互作用し得る新規な化学実体および化合物を設計するための必要な情報を全体ま
たは一部で提供する。この解明はまた、カスパーゼ−７結合ポケットに結合する
化合物についての構造−機能活性データの評価を可能にする。カスパーゼ−７結
合部位の出願人の解明はまた、カスパーゼ−７結合ポケットと相互作用するため
の要件を、選択的にまたは加えて、他のカスパーゼ結合ポケットと比較するため
の重要な構造情報もまた提供する。

【００８４】従って、別の実施形態に従って、本発明は、上記の任意の分子または分子複合
体の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための方法に関する。
この方法は、以下の工程：ａ．分子もしくは分子複合体の三次元構造を作製する
工程；ｂ．三次元構造を使用して、潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストを
設計または選択する工程；ｃ．潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストを提供
する工程；およびｄ．潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストを分子と接触さ
せて相互作用させる工程を包含する。

【００８５】このセクション全体を通じて、カスパーゼ−７結合ポケットと結合するか、会
合するか、または阻害する物質の能力についての議論は、その物質のみの特徴を
いう。化合物がカスパーゼに結合するか否かを決定するためのアッセイは、当該
分野において周知である［例えば、ＷＯ９７／２２６１９に記載されるアッセイ
を参照のこと］。

【００８６】本発明に従うカスパーゼ−７に結合するかまたは阻害する化合物の設計は、一
般的に、２つの因子についての考慮を含む。最初に、この物質は、カスパーゼ−
７結合ポケットの一部または全てと物理的および構造的に会合し得なければなら
ない。この会合において重要な非共有結合分子相互作用としては、水素結合、フ
ァンデルワールス相互作用、疎水性相互作用および静電的相互作用が挙げられる
。

【００８７】第２に、この物質は、その物質がカスパーゼ−７結合ポケットに直接会合し得
るコンフォメーションを想定し得なければならない。この物質の特定の部分は、
これらの会合に直接関与しないが、この物質のこれらの部分は、この分子の全体
的なコンフォメーション全体になお影響し得る。次いで、これは、効力に対して
有意な影響を有し得る。このようなコンフォメーションの要件としては、結合ポ
ケットの全てまたは一部に関連した化学実体の全体的な三次元構造および配向、
またはカスパーゼ−７結合ポケットまたはそのホモログと直接相互作用するいく
つかの化学実体を含む物質の官能基間の間隔が挙げられる。

【００８８】カスパーゼ−７結合ポケットに対する化学実体の強力な阻害効果または結合効
果は、その実際の合成およびコンピューターモデリング技術の使用による試験の
前に分析され得る。所定の実体の理論構造が所定の実体とカスパーゼ−７結合ポ
ケットとの間の不十分な相互作用および会合を示唆する場合、この実体の試験は
除去される。しかし、コンピューターモデリングが強力な相互作用を示す場合、
この分子は提供されるかまたは合成され、そしてカスパーゼ−７結合ポケットに
結合する能力について試験される。これは、当業者に公知のアッセイを使用して
、カスパーゼ−７を阻害するその分子の能力を試験することによって達成され得
る。このようにして、効力のない分子を得ることおよび効力ない分子を試験する
ことは回避され得る。

【００８９】カスパーゼ−７の強力なインヒビターは、一連の工程の手段によってコンピュ
ーターで評価され得、ここで化学実体またはフラグメントは、カスパーゼ−７結
合ポケットと会合するそれらの能力についてスクリーニングおよび選択される。

【００９０】当業者は、化学実体またはフラグメントを、カスパーゼ−７結合ポケットに会
合するそれらの能力についてスクリーニングするためのいくつかの方法のうちの
１つを使用し得る。このプロセスは、例えば、図７におけるカスパーゼ−７構造
座標、または機械読み取り可能記憶媒体から生成した類似の形状を規定する他の
座標に基づいて、コンピュータースクリーン上でカスパーゼ−７結合ポケットを
目視検査することによって、始められ得る。選択されたフラグメントまたは化学
実体は、次いで、様々な配向に配置されるか、またはドッキングされて、ここで
、結合ポケットは前出のように規定される。ドッキングは、Ｑｕａｎｔａおよび
Ｓｙｂｙｌのようなソフトウェア、次いで、エネルギー最小化およびＣＨＡＲＭ
ＭおよびＡＭＢＥＲのような標準的な分子力学的力場を使用する分子動力学によ
って達成され得る。

【００９１】専用のコンピュータープログラムはまた、フラグメントまたは化学実体を選択
するプロセスを援助し得る。これらには、以下が挙げられる：１．ＧＲＩＤ（Ｐ．Ｊ．Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，「ＡＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ
ＰｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒＤｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇＥｎｅｒｇｅｔｉｃ
ａｌｌｙＦａｖｏｒａｂｌｅＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅｓｏｎＢｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌｌｙＩｍｐｏｒｔａｎｔＭａｃｒｏｍｏｅｃｕｌｅｓ」，Ｊ．
Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８，８４９−８５７頁（１９８５））。ＧＲＩＤは、Ｏ
ｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫから入手可能である。２．ＭＣＳＳ（Ａ．Ｍｉｒａｎｋｅｒら、「ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙＭａ
ｐｓｏｆＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅｓ：ＡＭｕｌｔｉｐｌｅＣｏｐｙ
ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓＳｅａｒｃｈＭｅｔｈｏｄ」、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＦｕｎｃｔｉｏｎａｎｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，１１，
２９−３４頁（１９９１））。ＭＣＳＳは、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａ
ｔｉｏｎｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。３．ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｄ．Ｓ．Ｇｏｏｄｓｅｌｌら、「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ
ＤｏｃｋｉｎｇｏｆＳｕｂｓｔｒａｔｅｓｔｏＰｒｏｔｅｉｎｓｂｙ
ＳｉｍｕｌａｔｅｄＡｎｎｅａｌｉｎｇ」、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，８，１９５−２０２
頁（１９９０））。ＡＵＴＯＤＯＣＫは、ＳｃｒｉｐｐｓＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡから入手可能である。４．ＤＯＣＫ（Ｉ．Ｄ．Ｋｕｎｔｚら、「ＡＧｅｏｍｅｔｒｉｃＡｐｐｒｏ
ａｃｈｔｏＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ−ＬｉｇａｎｄＩｎｔｅｒａｃｔ
ｉｏｎｓ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１，２６９−２８８頁（１９８２）
）。ＤＯＣＫは、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ
Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡから入手可能である。

【００９２】一旦、適切な化学実体またはフラグメントが選択されると、これらは単一の化
合物または結合体に構築され得る。構築は、これらのフラグメントの互いの関係
を、カスパーゼ−７の構造座標に関して、コンピュータースクリーンに表示され
る三次元画像を目視検査することによって先行され得る。これは、Ｑｕａｎｔａ
またはＳｙｂｙｌ［ＴｒｉｐｏｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
ＭＯ］のようなソフトウェアを使用する手動モデル構築に従う。

【００９３】当業者が個々の化学実体またはフラグメントを連結するのを援助するために有
用なプログラムとしては、以下が挙げられる：１．ＣＡＶＥＡＴ（Ｐ．Ａ．Ｂａｒｒｌｅｔｔら、「ＣＡＶＥＡＴ：ＡＰｒｏ
ｇｒａｍｔｏＦａｃｉｌｉｔａｔｅｔｈｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｄｅｒ
ｉｖｅｄＤｅｓｉｇｎｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙＡｃｔｉｖｅＭ
ｏｌｅｃｕｌｅｓ」、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｉｎＣ
ｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＰｒｏｂｌｅｍｓ」、Ｓｐｅ
ｃｉａｌＰｕｂ．，ＲｏｙａｌＣｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７８，１８２−１９６
頁（１９８９）；Ｇ．ＬａｕｒｉおよびＰ．Ａ．Ｂａｒｒｌｅｔｔ，「ＣＡＶＥ
ＡＴ：ａＰｒｏｇｒａｍｔｏＦａｃｉｌｉｔａｔｅｔｈｅＤｅｓｉｇ
ｎｏｆＯｒｇａｎｉｃＭｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄ
ｅｄＭｏｌ．Ｄｅｓ．，８，５１−６６頁（１９９４））。ＣＡＶＥＡＴは、
ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ
から入手可能である。２．ＩＳＩＳ（ＭＤＬＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ，ＳａｎＬ
ｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）のような３Ｄデータベースシステム。この分野は、Ｙ．Ｃ
．Ｍａｒｔｉｎ、「３ＤＤａｔａｂａｓｅＳｅａｒｃｈｉｎｇｉｎＤｒ
ｕｇＤｅｓｉｇｎ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３５，２１４５−２１５４頁
（１９９２）に論評される。３．ＨＯＯＫ（Ｍ．Ｂ．Ｅｉｓｅｎら、「ＨＯＯＫ：ＡＰｒｏｇｒａｍｆｏ
ｒＦｉｎｄｉｎｇＮｏｖｅｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕ
ｒｅｓｔｈａｔＳａｔｉｓｆｙｔｈｅＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＳｔ
ｅｒｉｃＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆａＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ
ＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅ」、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．，Ｆｕｎｃ
ｔ．，Ｇｅｎｅｔ．，１９，１９９−２２１頁（１９９４）。ＨＯＯＫは、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡから入手
可能である。

【００９４】上記のように、１つのフラグメントまたは化学実体を同時に、カスパーゼ−７
結合ポケットのインヒビターに段階的様式で構築する処理にもかかわらず、阻害
または他のカスパーゼ−７結合化合物は、空の結合部位を使用してかまたは必要
に応じて既知のインヒビターのいくつかの部分を含んで、全体としてまたは「新
規」として設計され得る。多くの新規のリガンド設計方法があり、これには以下
が挙げられる：１．ＬＵＤＩ（Ｈ．Ｊ．Ｂｏｈｍ，「ＴｈｅＣｏｍｐｕｔｅｒＰｒｏｇｒａ
ｍＬＵＤＩ：ＡＮｅｗＭｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅＤＥＮｏｖｏ
ＤｅｓｉｇｎｏｆＥｎｚｙｍｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」，Ｊ．Ｃｏｍｐ．
Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６，６１−７８頁（１９９２））。ＬＵＤ
Ｉは、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ
ｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。２．ＬＥＧＥＮＤ（Ｙ．Ｎｉｓｈｉｂａｔａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７
，８９８５頁（１９９１））。ＬＥＧＥＮＤは、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕ
ｌａｔｉｏｎｓＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡから入
手可能である。３．ＬｅａｐＦｒｏｇ（ＴｒｉｐｏｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ，ＭＯから入手可能である）。４．ＳＰＲＯＵＴ（Ｖ．Ｇｉｌｌｅｔら、「ＳＰＲＯＵＴ：ＡＰｒｏｇｒａｍ
ｆｏｒＳｔｒｕｃｔｕｒｅＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ」，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．
ＡｉｄｅｄＭｏｌ．Ｄｅｓｉｇｎ，７，１２７−１５３頁（１９９３））。Ｓ
ＰＲＯＵＴは、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＬｅｅｄｓ，ＵＫから入手可能で
ある。

【００９５】他の分子モデリング技術もまた、本発明に従って用いられ得る［例えば、Ｎ．
Ｃ．Ｃｏｈｅｎら、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｏｄｅｌｉｎｇＳｏｆｔｗａｒ
ｅａｎｄＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３３，８８３−８９４（１９９０）を参照のこと
。Ｍ．Ａ．ＮａｖｉａおよびＭ．Ａ．Ｍｕｒｃｋｏ，「ＴｈｅＵｓｅｏｆ
ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎＤｒｕｇＤｅｓｉｇ
ｎ」、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｓｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉ
ｏｌｏｇｙ，２，２０２−２１０頁（１９９２）；Ｌ．Ｍ．Ｂａｌｂｅｓら、「
ＡＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｏｆＭｏｄｅｒｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣ
ｏｍｐｕｔｅｒ−ＡｉｄｅｄＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ」、Ｒｅｖｉｅｗｓｉ
ｎＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，第５巻、Ｋ．Ｂ．Ｌｉ
ｐｋｏｗｉｔｚおよびＤ．Ｂ．Ｂｏｙｄ編、ＶＣＨ，ＮｅｗＹｏｒｋ，３３７
−３８０頁（１９９４）もまた参照のこと。Ｗ．Ｃ．Ｇｕｉｄａ，「Ｓｏｆｔｗ
ａｒｅＦｏｒＳｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＢａｓｅｄＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ」
、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌｏｇｙ，４，７７７−７８１頁
（１９９４）もまた参照のこと］。

【００９６】一旦、化合物が上記の方法によって設計または選択されると、カスパーゼ−７
結合ポケットに結合し得る有効性を有する化合物は、コンピューター評価によっ
て試験および最適化され得る。例えば、有効なカスパーゼ−７結合ポケットイン
ヒビターは、好ましくは、その結合状態と遊離状態との間のエネルギーの比較的
小さな差（すなわち、小さな結合変形エネルギー）を示すべきである。従って、
最も有効なカスパーゼ−７結合ポケットインヒビターは、好ましくは、約１０ｋ
ｃａｌ／ｍｏｌ以下、より好ましくは７ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の結合変形エネル
ギーを有するように設計されるべきである。カスパーゼ−７結合ポケットインヒ
ビターは、結合エネルギー全体において同様の１つ以上の配置で結合ポケットと
相互作用し得る。これらの場合において、結合の変形エネルギーは、遊離実体の
エネルギーとインヒビターがタンパク質に結合する場合に観察される配置の平均
エネルギーとの間の差異となるようにとられる。

【００９７】カスパーゼ−７結合ポケットへの結合するように設計または選択された実体は
、その結合状態で、その実体が好ましくは標的酵素および周りの水分子との反発
静電相互作用を欠くように、さらにコンピューターで最適化され得る。このよう
な、非相補的静電相互作用としては、反発電荷−電荷相互作用、双極子−双極子
相互作用、および電荷−双極子相互作用が挙げられる。

【００９８】特定のコンピューターソフトウェアは、化合物の変形エネルギーおよび静電相
互作用を評価するために当該分野で利用可能である。このような用途のために設
計されるプログラムの例としては、以下が挙げらる：Ｇａｕｓｓｉａｎ９４，
改訂版Ｃ（Ｍ．Ｊ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂ
ｕｒｇｈ，ＰＡ，１９９５）；ＡＭＢＥＲ，バージョン４．１（Ｐ．Ａ．Ｋｏｌ
ｌｍａｎ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＳａｎＦｒ
ａｎｃｉｓｃｏ，１９９５）；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ、１９９５
）；ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕ
ｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ、１９９５）；ＤｅｌＰ
ｈｉ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉ
ｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）；およびＡＭＳＯＬ（ＱｕａｎｔｕｍＣｈｅｍｉｓ
ｔｒｙＰｒｏｇｒａｍＥｘｃｈａｎｇｅ，ＩｎｄｉａｎａＵｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ）。これらのプログラムは、例えば、ＳｉｌｉｃｏｎＧｒａｐｈｉｃｓ
ワークステーション（例えば、Ｉｎｄｉｇｏ²）を「ＩＭＰＡＣＴ」グラフィク
スと共に使用して実行され得る。他のハードウェアシステムおよびソフトウェア
パッケージは、当業者に公知である。

【００９９】本発明によって可能になる別のアプローチは、カスパーゼ−７結合ポケットに
全体的または部分的に結合し得る化学実体または化合物についての低分子データ
ベースのコンピュータースクリーニングである。このスクリーニングにおいて、
この結合部位へのこのような実体のフィットの量は、形状相補性または予測相互
作用エネルギーのいずれかによって判断され得る［Ｅ．Ｃ．Ｍｅｎｇら、Ｊ．Ｃ
ｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１３，５０５−５２４頁（１９９２）］。

【０１００】従って、本発明によって、化合物は、カスパーゼ−７活性部位に直接会合する
ことによって、カスパーゼ−７を阻害し得る。好ましくは、このような化合物は
、１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下のひずみエネルギーを有する。より好ましくは、こ
れらの化合物は、３個以下の２級アミド結合を含む。さらにより好ましくは、こ
れらの化合物は、１０００未満の分子量を有する。

【０１０１】当業者は、天然リガンドまたは置換基と、それらの対応するレセプターまたは
酵素の結合ポケットとの会合は、作用の多くの生物学的機構の基礎であることを
理解する。同様に、多くの薬剤は、レセプターおよび酵素の結合ポケットとの会
合によって、それらの生物学的効果を発揮する。このような会合は、結合ポケッ
トの全てまたは任意の部分で生じ得る。このような会合の理解は、それらの標的
レセプターまたは酵素とのより有利な会合、従って改善された生物学的効果を有
する薬剤の設計を助ける。従って、この情報は、レセプターまたは酵素の強力な
リガンドまたはインヒビター（例えば、カスパーゼ−７のインヒビター）を設計
する際に役立つ。

【０１０２】用語「会合する」は、化学的要素または化合物、あるいはその一部の間の近接
した状態をいう。この会合は、非共有結合（この近位が水素結合またはファンデ
ルワールス力または静電気的な相互作用によって強力に好まれる）であり得るか
、または共有結合であり得る。

【０１０３】本発明によって可能になる、別の特に有用な薬物設計技術は、相互作用的な設
計である。相互作用的な薬物設計は、タンパク質／化合物複合体の連続的なセッ
トの三次元構造を決定および評価することによって、タンパク質と化合物の間の
会合を最適化するための方法である。

【０１０４】相互作用的な薬物設計において、タンパク質またはタンパク質複合体の一連の
結晶が獲得され、次いで、各結晶構造の三次元構造が解析される。このようなア
プローチは、各複合体のタンパク質と化合物との間の会合についての洞察を提供
する。阻害的な活性を有する化合物を選択すること、この新しいタンパク質／化
合物複合体の結晶を獲得すること、この複合体の三次元構造を解析すること、お
よび新しいタンパク質／化合物複合体と以前に解析されたタンパク質／化合物複
合体との間の会合を比較することによって、この方法は達成され得る。化合物に
おける変化が、どれくらいタンパク質／化合物会合に影響するかを観察すること
によって、これらの会合は最適化され得る。

【０１０５】いくつかの場合において、相互作用的な薬物設計は、連続的なタンパク質／化
合物複合体を形成することによって実施され、次いで、新しい複合体の各々を結
晶化する。あるいは、以前に形成されたタンパク質結晶が、インヒビターの存在
下で、浸漬され、それによって、タンパク質／化合物複合体を形成し、そして個
々のタンパク質／化合物複合体の各々を結晶化する必要を軽減する。有利なこと
に、本発明によって提供されるカスパーゼ−７／インヒビター結晶は、化合物（
単数または複数）の存在下で浸漬され得、他の結晶複合体を提供する。

【０１０６】本明細書で使用される場合、用語「浸漬される（た）」は、結晶が目的の化合
物を含む溶液に移されるプロセスをいう。

【０１０７】本発明の別の実施形態において、実施例１および２に記載される工程を包含す
る、カスパーゼ−７を含む組成物を調製するための方法が提供される。好ましく
は、この組成物は、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯとの複合体中にカスパーゼ−７を含
む。

【０１０８】一旦タンパク質結晶の構造座標が決定されると、それらは、他の結晶構造を解
析する際に有用である。従って、図７に開示される構造座標はまた、別の結晶化
分子または分子複合体についての構造的な情報を獲得する際、補助するために使
用され得る。これは、分子置換を含む、多数の周知の技術のいずれかによって達
成され得る。

【０１０９】第１のセットの機械読み取り可能データを用いてコード化されたデータ保存材
料を含む機械読み取り可能データ保存媒体は、前記第１のセットのデータおよび
前記第２のセットのデータを使用するための指示を用いてプログラムされた機械
を使用する第２のセットの機械読み取り可能データと組み合わせる場合、第２の
セットの機械読み取り可能データに対応する構造座標の少なくとも一部を決定し
得、ここで：前記第１のセットのデータおよび前記第２のセットのデータは、図
７に従って、カスパーゼ−７についての構造座標の少なくとも一部のフーリエ変
換を含む；前記第２のセットのデータは、未知の構造の分子または分子複合体の
Ｘ線解析パターンを含む。

【０１１０】図７において開示される構造座標はまた、カスパーゼ−７に対する少なくとも
いくらか構造的に類似した特徴を含む分子または分子複合体の三次元構造の少な
くとも一部を決定するために使用され得る。特に、別の結晶化分子または分子複
合体についての構造情報が獲得され得る。これは、分子置換を含む多数の周知の
技術のいずれかによって達成され得る。

【０１１１】従って、別の実施形態において、本発明は、その構造が未知である結晶体化分
子または分子複合体についての構造情報を獲得するために分子置換を利用する方
法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）前記結晶化分子または分子複合体からＸ線解析パターンを作成する工程；ｂ）図７に開示される構造座標の少なくとも一部をＸ線解析パターンに適用す
ることによって、その構造が未知である分子または分子複合体の三次元電子密度
マップを作成する工程。

【０１１２】好ましくは、結晶化分子または分子複合体は、カスパーゼ−７を含む。さらに
好ましくは、結晶化分子または分子複合体は、本発明の結晶を溶液中に浸漬する
ことによって獲得される。

【０１１３】分子置換を使用することによって、本発明によって提供される（そして図７に
おいて開示される）カスパーゼ−７複合体のすべてまたは一部の構造座標を使用
して、最初からこのような情報を決定する試みよりも、その構造が未知である結
晶化分子または分子複合体の構造をより迅速にそして効率的に決定し得る。

【０１１４】分子置換は、未知の構造についての相の正確な推定を提供する。相は、直接決
定され得ない結晶構造を解析するために使用される式における因子である。分子
置換以外の方法によってこの相についての正確な値を得ることは、近似および精
製の相互作用的なサイクルを包含する時間を浪費するプロセスであり、結晶構造
の解析を大いに妨げる。しかし、少なくとも相同な部分を含むタンパク質の結晶
構造が解析される場合、公知の構造由来の相は、未知の構造についての相の良好
な推定を提供する。

【０１１５】従って、この方法は、その構造が未知である分子または分子複合体の結晶の観
察されたＸ線解析パターンを最も上手に説明するように、未知の分子または分子
複合体の結晶の単位細胞内で、図７に従ってカスパーゼ−７複合体の関連部分を
方向付けそして位置決めることによって、その構造座標が未知である分子または
分子複合体の予備的なモデルを作成する工程を包含する。次いで、相がこのモデ
ルから計算され、そして観察されたＸ線解析パターン振幅と組み合わされ、その
座標が未知である構造の電子密度マップを作成する。これは、次いで、周知モデ
ル構築および構造精製技術のいずれかに供され得、未知の結晶化分子または分子
複合体の最終的な正確な分子構造を提供する［Ｅ．Ｌａｔｔｍａｎ，Ｍｅｔｈ．
Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１５、５５−７７頁（１９８５）；Ｍ．Ｇ．Ｒｏｓｓｍａ
ｎｎ編、Ｉｎｔ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｓｅｒ．，Ｎｏ．１３，Ｇｏｒｄｏｎおよび
Ｂｒｅａｃｈ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９７２）］。

【０１１６】カスパーゼ−７のいずれか一部に十分相同な結晶化分子または分子複合体のい
ずれかのいずれか一部の構造は、この方法によって解析され得る。

【０１１７】好ましい実施形態において、分子置換の方法は、複合体がカスパーゼ−７を含
む分子または分子複合体についての構造情報を獲得するために利用される。好ま
しくは、カスパーゼ−７は、インヒビターＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯと複合体化す
る、本明細書中に記載されるカスパーゼ−７である。

【０１１８】本発明によって提供されるカスパーゼ−７の構造座標は、カスパーゼ−７、ま
たはその複合体の他の結晶形態の構造を解析する際に特に有用である。

【０１１９】この構造座標はまた、カスパーゼ−７複合体、特に、種々の化学的要素と共同
複合体化されたカスパーゼ−７の構造を解析するために特に有用であり得る。こ
のアプローチは、カスパーゼ−７と候補カスパーゼ−７インヒビターとの相互作
用を含む、化学的要素間の相互作用のための最適な部位の決定を可能にする。例
えば、異なった型の溶媒に曝露された結晶から回収された高分解能Ｘ線解析デー
タは、溶媒分子の各々の型が存在する場所の決定を可能にする。次いで、これら
の部位に密接に結合する低分子が設計および合成され、それらのカスパーゼ−７
阻害活性について試験される。

【０１２０】上記参照されるすべての複合体は、周知のＸ線分析技術を使用して研究され得
、そしてコンピューターソフトウェア（例えば、Ｘ−ＰＬＯＲ）を使用する約０
．２０以下のＲ値に対する１．５〜３Å分解Ｘ線データに対して精製され得る［
ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９２，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌ
ａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．によって配給される；例えば、Ｂｌｕｎｄｅｌｌおよび
Ｊｏｈｎｓｏｎ、前出、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，第１１４巻および第１１
５巻、Ｈ．Ｗ．Ｗｙｃｋｏｆｆら編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９８５
）］。この情報は、従って、公知のカスパーゼインヒビターを最適化するために
、そして、さらに重要なことに、新しいカスパーゼインヒビターを設計するため
に使用され得る。

【０１２１】本発明をさらに十分に理解するために、以下の実施例が開示される。これらの
実施例は、例示的な目的のみであって、いずれの点においても、本発明の範囲を
制限するために構築されるのではない。

【０１２２】（実施例１）（結晶化のためのカスパーゼ−１、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、および
カスパーゼ−８の発現および精製）組換えヒトカスパーゼ−１をｐ４５前駆体の残基１２０−４０４にわたる不溶
性ｐ３２タンパク質として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中で発現した［
Ｎ．Ａ．Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３５６，７６８−７７４頁（
１９９２）］。不溶性ｐ３２タンパク質をカオトロピズム条件下で可溶化および
精製し、次いで再び折り畳まれ、そしてインビトロで自己プロセシングし、ｐ２
０およびｐ１０活性サブユニットを産生する。以前のＸ線結晶学的分析を含む詳
細が他に記載されている［Ｋ．Ｐ．Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３７０、２
７０−２７５頁（１９９４）；Ｎ．Ｍａｒｇｏｌｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２７２，７２２３−７２２８頁（１９９７）］。Ｎ末端（Ｈｉｓ）₆アフ
ィニティータグおよびトロンビン切断部位を含む、カスパーゼ−３（残基２９−
２７７）およびカスパーゼ−７（残基１−３０３）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ中で発現した［Ｙ．Ｇｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１０８
１６−１０８２０頁（１９９６）；Ｊ．Ａ．Ｌｉｐｐｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７１，１８２５−１８２８頁（１９９６）］。両方のカスパーゼが可
溶性であり、そして、それらのｐ２０／ｐ１０サブユニットとして活性であり、
それぞれ０．０５および１ｍｇ／ｇｍ細胞のカスパーゼ−３およびカスパーゼ−
７を生成した。いずれかのタンパク質の精製のために、細胞ペーストを１０％（
ｖ／ｖ）グリセロール、３００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭ β−メルカプトエタノ
ール（β−ＭＥ）、０．０５％（ｗ／ｖ）β−ＯＧ、２５ｍＭイミダゾール、０
．１ｍＭＰＭＳＦ、ｐＨ８．０を含む１０倍容量の５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩
衝液で再懸濁した。細胞の機械的破壊の後、可溶性画分を４℃３０分間、３０，
０００×ｇでの遠心分離によって収集した。上清を推定カスパーゼ−３またはカ
スパーゼ−７の５〜１０ｍｇあたり１ｍｌのＮｉ−アフィニティー樹脂（Ｑｉａ
ｇｅｎ）を使用して一晩バッチ式にインキュベートした。この樹脂を５０カラム
容量の抽出緩衝液で洗浄し、ｐＨ７．０に調整された５０カラム容量の抽出緩
衝液が後に続いた。カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７を、それぞれ、１０％
（ｖ／ｖ）グリセロール、１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭ β−ＭＥを含む、５
０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０中で、５０および３００ｍＭイミダゾールを用
いて溶出した。

【０１２３】組換えカスパーゼ−８（残基２３３−４７９）を従来の方法によるバキュロウ
イルス発現ベクター系を使用するハイファイブ（Ｈｉｇｈ−ｆｉｖｅ）昆虫細胞
におけるＮ末端Ｈｉｓタグ融合体として発現した［Ｗ．Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｔｅ
ｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｉｔｏｎ，９，６９−
７５頁（１９９７）］。カスパーゼ−８／Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの結晶化は、
３つのＬｙｓ→Ａｒｇ点変異（残基２４６、２５０および２５３における）、お
よびＰｒｏ３７０およびＶａｌ３７１の除去（これは、配列整列中で他のカスパ
ーゼには存在していないようである）によって増強された。カスパーゼ−８を細
胞内でプロセシングし、そして、発現中に培地に分泌した。この細胞培養培地を
１，６００×ｇで遠心分離して細胞を除去し、そして、上清（ｐＨ６．４）は
、５０％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウムに調整され、そして氷上で６０分間、穏や
かに撹拌した。４℃４５分間、５４，０００×ｇで遠心分離した後、上清をデカ
ントし、０．２μＭのろ液および硫酸アンモニウム濃度を８５％（ｗ／ｖ）に増
加させそして氷上でさらに６０分間撹拌した。４℃４５分間、５４，０００×ｇ
での遠心分離は、カスパーゼ−８の沈殿を生じた。ペレットを１００ｍＭＮａ
Ｃｌ、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）および５ｍＭ β−ＭＥを含む１００ｍ
ＭＨＥＰＳ、ｐＨ８．０を使用する培地の撹拌容量の２％で再懸濁した。こ
の溶液を、５〜１０ｍｇの推定カスパーゼ−８あたり１ｍｌのＴａｌｏｎアフィ
ニティー樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてインキュベートし、４℃で一晩穏や
かに撹拌した。この樹脂を１００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール（ｖ／ｖ
）および５ｍＭ β−ＭＥを含む、１５０カラム容量の２０ｍＭＨＥＰＥＳ，
ｐＨ７．０を用いて洗浄した。２５ｍＭイミダゾールを用いる同じ緩衝液を使
用する５０カラム容量の二回目の洗浄を行なった。カスパーゼ−８を３５０ｍＭ
イミダゾールに調整した洗浄緩衝液を用いて溶出した。

【０１２４】（三重変異カスパーゼ−８の特徴付け）野生型および変異型カスパーゼ−８酵素を蛍光発生基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭ
Ｃ（ＡｌｅｘｉｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を
使用して特徴付けた。活性酵素の濃度をＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（Ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）を用いる活
性部位滴定によって決定した。すべてのアッセイを９６ウェルＦｍａｘプレート
リーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）
を使用して、３７℃で、１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＤＴＴおよび０．１％
（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳを含む１００ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ８中で行なった。
Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ基質濃度は２μＭと１００μＭの間で変化し、そして反
応を２ｎＭ酵素の添加によって開始した。酵素速度データをプログラムＥＺ−Ｆ
ｉｔ（ＰｅｒｒｅｌｌａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｍｊｕｒｓｔ，ＮＨ）中で
非線形回帰によって分析した。

【０１２５】（実施例２）（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯとの複合体におけるカスパーゼ−１、カスパーゼ−
３、カスパーゼ−７、およびカスパーゼ−８の特徴付け）カスパーゼ−１／Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ複合体のタンパク質精製および結晶
化の詳細が報告されている［Ｎ．Ｍａｒｇｏｌｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，２７２、７２２３−７２２８頁（１９９７）］。金属アフィニティー精製カ
スパーゼ−３、カスパーゼ−７またはカスパーゼ−８を２倍モル濃度の過剰のＡ
ｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（ＰｅｐｔｉｄｅｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の添
加によって阻害した。次いで、Ｎ末端（Ｈｉｓ）₆タグを３７℃で６０分間のト
ロンビン切断（２０ユニットのトロンビン／ｍｇカスパーゼ）によってカスパー
ゼ−３、カスパーゼ−７またはカスパーゼ−８から除去した。トロンビンを１０
０μｌのベンズアミジンセファロースを用いて５分間のインキュベートによって
除去した。遊離（Ｈｉｓ）₆タグおよび凝集したカスパーゼを、Ｓｕｐｅｒｄｅ
ｘ−７５樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて充填したカラム（６０×１．５ｃ
ｍ）を使用するサイズ除外クロマトグラフィーによって除去した。このカラムを
、１ｍｌ／分の流速で、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、１００ｍＭＮａＣｌ
、５ｍＭ β−ＭＥを含む２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中で４℃で平衡
化した。サイズ除外クロマトグラフィーの間にＬｉｇｈｔ−ｓｃａｔｔｅｒｉｎ
ｇ（ＰＤ−２０００，ＰｒｅｓｉｃｉｏｎＤｅｔｅｃｔｏｒｓ，Ｆｒａｎｋｌｉ
ｎ，ＭＡ）分析は、凝集したタンパク質を同定した（これは、プールされた画分
から除外された）。２ｍＭＤＴＴ緩衝液を含む５０ｍＭクエン酸、ｐＨ６．
５が使用されたことを除いて、同じサイズ除外カラム上で、カスパーゼ−１／Ａ
ｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯを精製した。サイズ除外の後、結晶化のためのカスパーゼ
／Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ共同複合体の濃縮の前に、等モルのＡｃ−ＤＥＶＤ−
ＣＨＯを添加した。すべてのタンパク質サンプルを−７０℃で貯蔵した。

【０１２６】阻害されたカスパーゼ−３の結晶を蒸気拡散およびマクロ接種によって成長す
る。タンパク質（２０ｍＭＮａＨＥＰＥＳ，２．０ｍＭＤＴＴ，０．１Ｍ
ＮａＣｌ，１０％グリセロール、ｐＨ７．０中で４．６ｍｇ／ｍｌ）を、３μ
ｌ：２μｌタンパク質溶液対リザーバ率で、リザーバ（０．２Ｍ酢酸アンモニウ
ム、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、３０％ｗ／ｖＰＥＧ４０００）と混合さ
せ、そして室温で静置させた場合、最初に１２時間で数千の微小結晶を獲得した
。２％（ｖ／ｖ）メチル−ピロリジノン（ＭｅＰ）をリザーバに添加した以外は
、同じ方法で、セットアップした結晶化液滴は、結晶を生成しなかった。次いで
、微小結晶この第２の液滴に移し、そしてこのシード結晶は、０．４ｍｍ×０．
３ｍｍ×０．２５ｍｍのサイズに１０日にわたって成長した。

【０１２７】Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯをタンパク質サンブル中に滴定することによって、自
己タンパク分解する活性形態カスパーゼ−７を阻害した。この複合体をさらにサ
イズ除外クロマトグラフィーによってさらに精製した。プールされた画分を結晶
化のために約５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ゆっくりとした蒸気拡散を使用して、４
℃で数週間にわたって、カスパーゼ−７／Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ複合体のＸ線
の良質な結晶を得た。

【０１２８】カスパーゼ−８をＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（１２．０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳｐＨ７．０，０．１ＭＮａＣｌ，５．０ｍＭ β−ＭＥ）を使用
して滴定し、そして引き続き、２μｌ：２μｌの割合でリザーバ溶液（０．１Ｍ
リン酸カリウム、ｐＨ６．０、５％ｔ−ブタノール、４０％（ｗ／ｖ）硫酸ア
ンモニウム）に添加し、そして室温で１．０ｍｌのリザーバ上に懸濁した。単一
の結晶が二週間以内に収集され、そして０．４０×０．２０×０．１０ｍｍの寸
法を有する。同じ結晶を、データ収集の前にＮ₂気体蒸気中１７０^○Ｋにフラッ
シュ冷却した。

【０１２９】（実施例３）（結晶構造決定）カスパーゼ−１−Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯおよびカスパーゼ−３−Ａｃ−ＤＥ
ＶＤ−ＣＨＯの結晶を、それぞれ−７℃および−４℃で、Ｘ線データ収集のため
にキャピラリーガラスに取りつけた。カスパーゼ−１／Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ
およびカスパーゼ−３複合体の両方のＸ線データを、Ｒｉｇａｋｕ回転アノード
発生器を備えたＲａｘｉｓＩＩＣイメージプレートで収集し、そして製造者（
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓＣｏｒｐ．，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ
，Ｔｅｘａｓ）によって提供されたソフトウェアを使用して処理した。このデー
タのＲマージ（ｍｅｒｇｅ）は、２．２Åの分解能で６．１％であった。単位セ
ルの寸法の分析は、各非対称性単位が、２つのカスパーゼ−３ヘテロダイマーを
含むことを示唆した。単一のカスパーゼ−１へテロダイマーのポリアラニンモデ
ルを、プログラムＡＭｏＲｅ［Ｊ．Ｎａｖａｚａ，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌ
ｌｏｇｒａｐｈｙ，Ａ５０，ｐｐ．１５７−１６３（１９９４）］を使用するカ
スパーゼ−３ヘテロダイマーのための、成功する回転および転換機能溶液を得る
ために使用した。次いで、第２のポリアラニンモデルの回転および転換機能を試
みる間に、最初の溶液を固定したまま保持した。この２つの溶液の組み合わせは
、ヘテロダイマーのカスパーゼ−３ダイマーのポリアラニンモデルを生成し、８
Åと２．８Åとの間の分解能で観測された全ての反射について４５．１％のＲ因
子を有し、そして洗練の開始時に取っておいた反射の１０％について４７．５％
のＲ−遊離を有した。このマップおよびモデルの分解能を、モデル形成、位置の
洗練および熱的因子の洗練のサイクルによって２．２Åの分解能まで次第に増加
させ、ねじり動力学作動によって分散した。全てのモデルの洗練を、ＸＰＬＯＲ
パッケージプログラム［Ａ．Ｂｒｕｎｇｅｒ，「Ｘ−ＰＬＯＲ，Ａｓｙｓｔｅ
ｍｆｏｒＸ−ｒａｙｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙａｎｄＮＭＲ」
ＮｅｗＨａｖｅｎ，ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９６
）］を使用して実施した。

【０１３０】カスパーゼ−７−Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ複合体の結晶を、凍結防止器に移し
、そしてデータ収集の前にＮ₂気体流中で１００Ｋまで瞬間冷却した。回折像を
、ＢｒｏｏｋｈａｖｅｎＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＮ
Ｌ），Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ，ＮＹ．で、ＣＣＤ２Ｘ２Ｋ検出器によって記録
した。このデータを、ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＰＡＣＫソフトウェア［Ｚ．Ｏ
ｔｗｉｎｏｗｓｋｉ＆Ｗ．Ｍｉｎｏｒ，ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ（ＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｐ
ａｒｔＡ），２７６，ｐｐ．３０７−３２６（１９９７）］を使用して処理し
た。この結晶は、８８．２Å、８８．２Å、１８６．２Å、α＝９０．０°、β
＝９０．０°、γ＝１２０．０°の単位セル寸法を有し、空間群Ｐ３２２１に属
する。非対称性単位中に１つのテトラマーが存在すると仮定すると、算出される
Ｍａｔｔｈｅｗの比体積は、２．６Å³／ｄである。この構造は、調査テンプレ
ートとして短縮型カスパーゼ−３テトラマー分子を使用する分子置換法によって
解析する。最初のＲ因子および相関計数因子は、それぞれ４４％および６５％で
ある。この溶液からのポリアラニンモデルを、最初に、８．０Å〜３．０Åの間
のデータについて洗練した。個々のアミノ酸の側鎖を、タンパク質配列に従って
電子密度マップにモデル化した。このモデルを、ＸＰＬＯＲを使用して洗練し、
そしてＱＵＡＮＴＡ（ＱＵＡＮＴＡ９７，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔ
ｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を使用して手動で補正した。最終モデルは、６５４残基、
２つの硫酸アニオン、および３７４の水分子の完全なテトラマー集合体を有する
。

【０１３１】カスパーゼ−８−Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ複合体の単一の結晶を、ＢＮＬでの
シンクロトロンデータ収集の前に、Ｎ₂冷却気体流中で瞬間冷却した。データを
、Ｘ２５ビームライン上に取り付けられた２Ｘ２ＫＣＣＤイメージプレート上
に記録した。この結晶の空間群はＣ２２２１であり、単位セルは、６２．１２Å
、３４４．３３Å、１９０．９９Å、α＝９０．０、β＝９０．０、γ＝９０．
０を有することが決定された。Ｍａｔｔｈｅｗの比体積計算は、この非対称単位
中に３つの独立したテトラマー分子が存在し、５４％の計算された溶媒含有量を
与えることを示唆する［Ｂ．Ｗ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，３３，ｐｐ．４９１−４９７（１９６８）
］。この結晶は、ａ^*、ｂ^*、およびｃ^*軸に沿って、それぞれ２．３５Å、２．
８０Å、および２．６５Åに、非常に異方的に回折する。このデータセットを、
２．６５Åの分解能についてＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＰＡＣＫソフトウェアを
使用して、処理した。この構造物の溶液を、ＡＭｏＲｅを使用し、そして調査テ
ンプレートとして短縮型カスパーゼ−３テトラマー分子を使用することによって
得た。このポリアラニンモデルの剛体および位置の洗練を、最初にＸＰＬＯＲを
使用して行った。この分子の側鎖、挿入および欠失を、手動でＱＵＡＮＴＡプロ
グラムを使用して電子密度マップにモデル化した。最終モデルは、１４５４のア
ミノ酸、３１６の溶媒分子および活性部位システイン残基に共有結合した６のＡ
ｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ化合物を含む。

【０１３２】カスパーゼ−７−Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ構造の座標を、登録コード１Ｆ１Ｊ
でＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋに寄託した。

【０１３３】（実施例４）（結晶学）４つ全ての構造のモデルの質を、ＰＲＯＣＨＥＣＫを使用して評価し、そして
この結晶学的統計値を、表１に示した［Ｒ．Ａ．Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｊｏｕｒ
ｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，２６，ｐｐ
．２８３−２９１（１９９３）］。

【０１３４】

【表１】 ^*Ｒ_sym＝Σ｜Ｉ_i−＜Ｉ＞｜／ΣＩ_i ここで、Ｉ_iおよび＜Ｉ＞は、それぞれ、
この観測の強度および反射の平均である。^# Ｒ因子＝Σ｜Ｆ_obs−Ｆ_cal｜／Σ｜Ｆ_obs｜ここで、Ｆ_obsおよびＦ_calは、観
測されたモデル構造因子および算出されたモデル構造因子である。

【０１３５】（カスパーゼ−３／Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ複合体に対するカスパーゼ−７／
Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ複合体の比較）カスパーゼ−７−Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ複合体は、カスパーゼ−３−Ａｃ−
ＤＥＶＤ−ＣＨＯ複合体と同様である。カスパーゼ−７の洗練モデルは、２つの
ｐ２０−ｐ１０へテロダイマーを含む完全な触媒単位を含む。このｐ２０および
ｐ１０ポリペプチド鎖は、それぞれ残基５７〜１９６および２１２〜３０２から
なる。この２つの互いに入り込むヘテロダイマーは、会合して球状の形態のテト
ラマーを形成する。カスパーゼ−７複合体のリボン状立体図を図１に図示する。
予期されるように、カスパーゼ−７の全体的な折り畳みは、カスパーゼ−１、カ
スパーゼ−３、およびカスパーゼ−８の折り畳みと非常に類似している。４つの
サブユニットの全ては、中心のβシートを含む合計１２の鎖に寄与する。これは
、酵素の核を形成し、これはこのβ鎖にほぼ平行な１０のαへリックスに隣接す
る。詳細には、ｐ２０ドメインのβシート構造（これは、触媒的なＨｉｓ２８５
およびＣｙｓ１８６残基を含む）は、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎの定義［Ｊ．Ｓ．Ｒ
ｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ａｄｖ．ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ．，３４，ｐｐ．１６
７−３３８（１９８１）］に従って、交差−１Ｘ、＋２Ｘ、＋１Ｘ連結トポロジ
ーを有する。このモチーフは、セリンヒドロラーゼにおいて広範に観察され、最
も著しくはこのα／βヒドロラーゼスーパーファミリーにおいて観察される［Ｄ
．Ｌ．Ｏｌｌｉｓら，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．，５，ｐｐ．５９９−６１１（
１９９２）］。

【０１３６】カスパーゼの３つのサブファミリーのうち、カスパーゼ−７は、カスパーゼ−
２およびカスパーゼ−３を含む第２の群に属する。プロペプチドおよびリンカー
領域に存在する差異を除いて、カスパーゼ−７は、構造的かつ機能的にカスパー
ゼ−３に非常に類似している。実際、カスパーゼ−７およびカスパーゼ−３は、
ポリペプチド鎖に沿った任意のアミノ酸欠失または挿入なしで、重ね合わされ得
（図２ａ）、骨格Ｃａ原子について０．３７Åの平方自乗平均（ＲＭＳ）偏差を
有する。３つ全てのカスパーゼサブファミリーにまたがるカスパーゼ−１、カス
パーゼ−３、カスパーゼ−７およびカスパーゼ−８の配列整列およびＣａ原子の
重ね合わせ（図２ａおよび３）は、その折り畳み間の主な差異が、３つの領域に
あることを実証した。これらの差異は、プライムサイド（ｐｒｉｍｅｓｉｄｅ
）上の２つのループおよびＳ４結合部位の近位の第３のループで生じる（図２ａ
）。

【０１３７】カスパーゼ−３と同様に、カスパーゼ−７もまた、鎖Ｃ２９０〜Ｍ２９４内に
単一残基欠損を有し（図３）、これはその対称的に関連する均等物と対を形成し
、酵素のテトラマー集合体を形成する。カスパーゼ−１および群１の他のカスパ
ーゼにおいて、アルギニン残基（カスパーゼ−１においてはＲ３９１）が存在し
、これはβ鎖において隆起を生じ、そして結果的に、１つのヘテロダイマーの、
他のダイマーに対する相対的な回転を誘導する。カスパーゼ−３［Ｐ．Ｒ．Ｅ．
Ｍｉｔｔｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，ｐｐ．６５３９−６５４７
（１９９７）］およびカスパーゼ−７において、これらの２つのダイマーサブユ
ニットは、有意に捻れが少ない。カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７における
この単一欠損およびより高い疎水性特定の組み合わせは、これらの酵素の４次構
造を変化するだけでなく、この２つのヘテロダイマーの境界面で形成される中心
空洞を新形態にする。カスパーゼ−７テトラマーの中心空洞は、２４個の水分子
によって占められた。この中心空洞は基質結合部位のプライムサイドに隣接する
ので、これは、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７への基質の結合に直接影響
しないかもしれない。しかし、カスパーゼの間の中心空洞における変化は、アポ
トーシスカスケードにおける巨大分子の基質認識の重要な決定因子であり得る。

【０１３８】（保存された折り畳みおよびトポロジー）カスパーゼ−１およびカスパーゼ−３のように、成熟形態のカスパーゼ−７お
よびカスパーゼ−８は、２つのｐ２０／ｐ１０のヘテロダイマーからなるテトラ
マーである。このヘテロダイマーは、構造的および機能的の両方で会合して単一
のドメインとして現れる。すべての４つのカスパーゼについて、そのタンパク質
コアは、６本のストランド（βストランドにほぼ平行に存在する５または６のα
ヘリックスに囲まれたβシート）である。Ｎ末端ヘリックスについての弱い電子
密度は、Ｃｓｐｌについて観察されている［Ｋ．Ｐ．Ｗｉｌｓｏｎ＆Ｄ．Ｊ．Ｌ
ｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０，ｐｐ．２７０−２７５（１９９４
）］が、カスパーゼ３、カスパーゼ−７およびカスパーゼ８においてこのヘリッ
クスについては、ほとんどまたはまったく電子密度が観察され得なかった。ｐ１
０およびｐ２０の両方のサブユニットは、４つすべてのカスパーゼ構造について
のリガンド結合部位に寄与する。カスパーゼ１、３、７および８についての折り
たたみの間の主な相違は、２つのループ領域において生じる：一方は、プライム
側であり、そして他方は、Ｓ４結合部位の近位である（図２Ａ）。

【０１３９】プライム側において、カスパーゼ−８は、残基２４５−２５３の範囲のヘリッ
クス−ターン−ヘリックスの挿入の存在によって他とは異なる（図２Ｃ）。これ
は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉにおいて発現される、最近報告されたカ
スパーゼ−８と合致する。このカスパーゼ−８はまた、この挿入ループに対する
いくつかのヘリックス内容物を有する［Ｈ．Ｂｌａｎｃｈａｒｄｅｔａｌ．
，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），７，ｐｐ．１１２５−１１３３（１９
９９）；Ｗ．Ｗａｔｔｅｔａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），
７，ｐｐ．１１３５−１１４３（１９９９）］。４つのカスパーゼ構造の重ねあ
わせに由来する配列整列の分析（図３）は、この挿入物がカスパーゼ−８に特有
であることを示唆する。この領域のリジンのうち３つ（Ｌｙｓ２４６、Ｌｙｓ２
５０、Ｌｙｓ２５３）を、回折品質の結晶を得るためにアルギニンに変異した。
野生型結晶構造を決定するために用いられたカスパーゼ−８の変異形態は、両方
の酵素が識別できないようであることを示し、１×１０⁵Ｍｌ−ｓ^l−^lのｋｃａ
ｔ／Ｋｍを、Ａｃ−ＤＥＶＤ−アミノメチルクマリン（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ
）加水分解について得た。これらの変異されたアルギニンのうち２つは、近くの
グルタミン残基で塩架橋により安定化する（Ａｒｇ２５０とＧｌｕ２４９、Ａｒ
ｇ２５３とＧｌｕ３３０、Ａｒｇ２４６と対称性に関連する近隣からのグルタミ
ン酸）。これらの変異された残基のいずれも、プライム側領域に向いておらず、
しかもテトラペプチドインヒビターの非常に近くにあるということもない。この
ヘリックス−ターン−ヘリックス挿入物からのＬｅｕ２５４は、プライム側領域
に向けて内向きに向いているようである。カスパーゼ−８についてのこのヘリッ
クス−ターン−ヘリックス挿入物の空間位置は、カスパーゼ−１の短い挿入ルー
プにもっとも密接に類似する（図２Ｃ：残基２３９−２５４）。これは、カスパ
ーゼ−１ファミリーのメンバーの中で保存されている。

【０１４０】この研究における４つのカスパーゼの中のＳ４ループの大きさにおける相違は
、驚くべきことである。これらのループは、以下の残基を包含する：カスパー
ゼ−１（３７８３８６）、カスパーゼ−３（２４４−２６２）、カスパーゼ−７
（２７０−２８８）、カスパーゼ−８（４５１−４６３）。図２Ｂは、このルー
プがカスパーゼ−３およびカスパーゼ−７について最大であることを例示する。
このループがこれら２つの密接に関連するカスパーゼについて長さが同一である
という事実にもかかわらず、これらは、組成において６３％しか同一ではない。
同じループは、カスパーゼ−８についてより短く、カスパーゼ−１についてはな
お短い。おのおのの場合において、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯのインヒビターのＰ
４アスパラギン酸と、このループにおけるある残基との間の相互作用が存在する
。

【０１４１】（すべての３つのファミリーからのカスパーゼに対するＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨ
Ｏの結合）本願において包含される４つのカスパーゼは、３つの異なる機能的および系統
発生的な群のカスパーゼにわたり、そしておのおのＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯに結
合する方法においてわずかな相違を示す。Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの結合に寄与
するおのおののカスパーゼからタンパク質アミノ酸のいくつかにおける相違が存
在するが、このインヒビターの立体配置全体は非常に保存されている。このペプ
チドインヒビターは、すべての４つの複合体における伸張した立体構造に適合さ
れている。触媒性二分しおよびＰ１位におけるアスパラギン酸残基を固定する２
つの残基は、ｐ２０ドメイン由来であり、初期の接触のほとんどは、テトラペプ
チドと、ｐ１０サブユニットからの基との間で存在する。Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨ
Ｏの結合に寄与するおのおののカスパーゼからタンパク質アミノ酸のいくつかに
おける相違が存在するが、このインヒビターの立体配置全体は非常に保存されて
いる。Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ結合と、カスパーゼ−１、カスパーゼ−３、カス
パーゼ−７およびカスパーゼ−８に対するＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの結合の模式
的な比較は図４に示され、他方、図５は、それぞれの結合部位の表面特性を示す
。

【０１４２】（カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−４の
Ｐ１−Ｐ４残基への結合の比較）カスパーゼ−１、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７およびカスパーゼ−８に対
するＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの模式的比較が図４に示される。図５は、それぞれ
の結合部位の表面特性を示す。

【０１４３】Ｐ１部位において、この複合体の４つすべては、インヒビターが活性部位にお
いて求核性しステインに共有結合していることを示す（図４）。しかし、古典的
オキシ化（ｏｘｙａｔｉｏｎ）の穴への結合は観察されなかった。おのおのの場
合において、アルデヒドカルボニルにおける求核性チオール攻撃からのチオヘミ
アセタール酸素は、酵素のシステイン−ヒスチジン二分子を含む隣接するヒスチ
ジンと水素結合を形成する。さらに、４つすべての複合体におけるチオヘミアセ
タール酸素は、求核性システイン骨格窒素および保存されたグリシン骨格の窒素
に対する種々の強度の水素結合を生成する。以前の研究により、いくつかの不可
逆性インヒビターがカスパーゼ−１およびカスパーゼ−３への古典的オキシ化穴
を示すことが示された［Ｎ．Ｐ．Ｃ．Ｗａｌｋｅｒｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，
７８，ｐｐ．３４３−３５２（１９９４）；Ｐ．Ｒ．Ｅ．Ｍｉｔｔｌｅｔａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，ｐｐ．６５３９−６５４７（１９９
７）］。Ｐ１における他の相互作用もまた、４つの構造の間で驚くほど保存され
ている。すべての場合において、Ｐ１アスパラギン酸側鎖と２つのアルギニン残
基との間の荷電−荷電相互作用が存在し、そして保存グルタミンとに水素結合が
存在するからである。図５は、この驚くほど電気的に陽性の部位の保存された特
性およびＰ１アスパラギン酸の埋め込まれた性質を示す。さらに、おのおのの複
合体は、Ｐ１骨格窒素と、保存されたセリンの骨格カルボニルとの間の水素結合
を保持する。

【０１４４】Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯのＰ２値について、疎水性相互作用の全体の性質は、
保存されているが、Ｓ２ポケットを含む残基に依存してバリン側鎖についてＸ１
値においてわずかな相違があるだけである。興味深いことに、カスパーゼ−３お
よびカスパーゼ−７は、Ｓ２部位に寄与し、そしてまたＳ４ループの部分である
、残余の残基（ファニルアラニン）を有する。カスパーゼ−８はまた、カスパー
ゼ−３のＰｈｅ２５６およびカスパーゼ−７のＰｈｅ２８２とほぼ同一の空間位
置において芳香族（Ｔｙｒ３６５）を有する。しかし、このチロシン残基は、ｐ
２０サブユニットのＣ末端付近の伸張されたストランドの一部である。カスパー
ゼ−８のＴｙｒ３６５に対応する慙愧は、Ｐｒｏ２９０（カスパーゼ−１）、Ｌ
ｅｕ（カスパーゼ−３）およびＬｅｕ１９１（カスパーゼ−７）である。これら
のいずれもが、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯとのこれらの複合体におけるＳ２部位の
直接寄与する。

【０１４５】テトラペプチドインヒビターのＰ３グルタミン酸は、４つすべてのカスパーゼ
複合体における保存されたアルギニンとの少なくとも荷電−荷電相互作用を生成
する（図４）。さらに、Ｐ３グルタミン酸のＰ３骨格の窒素およびカルボニルの
酸素は、表面電荷相互作用に関与する同じアルギニンの、それぞれのカルボニル
酸素および窒素と強力な水素結合を生成する。カスパーゼ−８はまた、第二のア
ルギニン（Ａｒｇ２５８）からのさらなる荷電−荷電相互作用を有する。このア
ルギニンには、ヘリックス−ターン−ヘリックス挿入ループが続く。これは、カ
スパーゼとの複合体を類似のペプチドインヒビターが形成するという最近の知見
に合致する［Ｈ．Ｂｌａｎｃｈａｒｄｅｔａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（
Ｌｏｎｄｏｎ），７，ｐｐ．１１２５−１１３３（１９９９）］。図３において
提示される配列整列は、カスパーゼ−６、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０お
よびカスパーゼ−１４もまた、この位置において残余の塩基性アミノ酸を提供し
得ることを示唆する。図５の分析により、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯインヒビター
のＰ３グルタミン酸がカスパーゼ−８のタンパク質表面におけるこの第二の（す
なわちＡｒｇ２５８）アルギニンに向けて配向されることが示される。結晶解析
用の水は、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７およびカスパーゼ−８についての保
存されたアルギニンと結合して観察される。

【０１４６】カスパーゼ−１、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７およびカスパーゼ−８に対
するＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの結合についての主な相違は、テトラペプチドのＰ
４アスパラギン酸およびアセチル化アミノ末端において生じる。この研究におい
て含まれるカスパーゼのすべては、Ｓ４ループによって直接または間接的にかの
いずれかでの結合を包含する。図４は、Ａｒｇ３８３との相互作用を通じて直接
カスパーゼ−１がＰ４アスパラギン酸の側鎖と相互作用することを示す。カスパ
ーゼ−３は、Ｐｈｅ２５０の骨格窒素およびＡｓｎ２０８の側鎖を介して相互作
用する。この場合において、水媒介性水素結合を通じたＴｒｐ２１４とＰ４アス
パラギン酸の相互作用もまた存在する。さらに、Ｐ４骨格の窒素およびカルボニ
ル酸素は、２つの異なる水分子と水素結合を形成し、これらの水分子の両方は、
Ｐｈｅ２５０のカルボニルに対して水素結合を形成する。カスパーゼ−７は、Ｐ
４アスパラギン酸と、Ｇｌｎ２７６の骨格および側鎖の両方の関与を介して結合
する。このＰ４骨格窒素は、Ｇｌｎ２７６の骨格カルボニルとさらなる水素結合
を形成し、他方、Ｐ４骨格カルボニル酸素は、Ｐ２骨格窒素との別の水素結合に
関与する同じ結晶解析用の水分子とに水素結合を形成する。カスパーゼ−３およ
びカスパーゼ−７の配列は、５７％の同一性および６７％の類似性を有するが（
図３）、Ｓ４結合領域の中および周りには顕著な相違が存在することに留意する
ことは面白い。カスパーゼ−３残基（Ａｓｎ２０８、Ｓｅｒ２０９、Ａｓｐ２１
１、Ｐｈｅ２５０、ｈｅ２５２、Ｔｈｒ２５５およびＡｌａ２５８）のそのそれ
ぞれのカスパーゼ−７残基（Ｓｅｒ２３４、Ｐｒｏ２３５、Ａｒｇ２３７、Ｇｌ
ｎ２７６、Ａｓｐ２７８、Ｈｉｓ２８１およびＧｌｕ２８４）への置き換えは、
Ｓ４結合領域における化学的含有量（図５）をより疎水性へと変化させる。

【０１４７】カスパーゼ−８は、Ｓ４ループの一部ではないＡｓｎ４１４およびＴｒｐ４２
０の側鎖窒素を介してＰ４アスパラギン酸残基と直接相互作用する。しかし、Ｐ
４アスパラギン酸カルボニル酸素は、水媒介性の水素結合を介してＤ４５５と相
互作用する。

【０１４８】ＮアセチルＰ４捕捉基もまた、水素結合および疎水性相互作用において相違を
呈する。カスパーゼ−１、カスパーゼ−７およびカスパーゼ−８はすべて、Ｎア
セチル末端メチルとプロリンとの間の疎水性作用を生成する（図４）。カスパー
ゼ−３は、この疎水性相互作用を欠如するが、Ｓ２０９との２つの水素結合を生
成し、このうち一方は、Ｓ２０９骨格窒素を含有し、そして他方は、Ｓ２０９側
鎖を伴う。カスパーゼ−７は、Ａｓｐ２７８の骨格窒素および側鎖の両方と水媒
介性の水素結合を形成する。カスパーゼ−８について、Ｎ−アセチルカルボニル
酸素は、Ａｎｓ４１４の側鎖に結合する水素を形成する。非水素結合は、カスパ
ーゼ−１とＮ−アセチル基との間で観察される。Ｎ−アセチル基を結合する再の
差異に関する１つの最終的な知見は、カスパーゼ−３と本研究に含まれる他の３
つのカスパーゼとの間で生じる。上記のように、カスパーゼ−３について、Ｎ−
アセチル基とＳ２０９との間に２つの強力な水素結合が存在する。しかし、カス
パーゼ−１、カスパーゼ−７およびカスパーゼ−８（およびカスパーゼ−９）に
おいて、Ｓｅｒ２０９に対応する残基は、プロリンであり；Ｎ−アセチル基の任
意の水素結合相互作用は、異なる残基を含む。プロリン環は水素結合を形成でき
ないことから、Ｐ４Ｎ−アセチル基は、約２．５Å移される。図６は、カスパ
ーゼ−３とカスパーゼ−７との間のこのシフトを例示する。そこには、同じカス
パーゼサブファミリーのメンバーが存在する。

【０１４９】Ｐ４の水素結合における差異および随伴カスパーゼ残基を有するＮ−アセチル
基は、Ｓ４部位の可変的な幅を生じ、カスパーゼ−８は、カスパーゼ−１よりも
最も幅広いＳ４部位を有し（図５）：カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７はよ
り狭いＳ４部位を有する。カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７について、Ｓ４
部位の減少した幅は、テトラペプチドのこの部分とＳ４基に向けてＳ４ポケット
の壁を「押す」ように機能するＳ４部位との間の水素結合ネットワークのより大
きな範囲に直接連結され得る。この点において、図５に例示される静電気的な表
面電位は、情報を与える。カスパーゼ−７の表面電位は、独特である。なぜなら
、これは、Ｐ４Ａｓｐの近くの非対塩基性残基（Ａｒｇ２３７）を有する、研究
された４つのカスパーゼのみであるからである。カスパーゼ−１およびカスパー
ゼ−８はまた、この領域における表面電位の静電部分に寄与する塩基性残基を有
するが、これらはまた、近くに釣り合う負荷電を有する。カスパーゼ−３は、中
性のＳ４領域を有する。これらの知見は、構造および関連する表面電位に関して
、Ｐ４における負に荷電した基に対する絶対的な必要性がないことを示唆する。

【０１５０】（構造的洞察および結合特異性）コンビナトリアル基質ライブラリーの位置的スキャニングに基づいて、Ｔｈｒ
ｎｂｅｒｒｙらは、１０のヒトカスパーゼについて最適なテトラペプチド基質配
列を決定することができた［Ｎ．Ａ．Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，２７２，１７９０７〜１７９１１（１９７７）］。この研究において
、切断可能なＡｓｐ−ＡＭＣは、Ｐ１において一定に保持され、そしてＰ２〜Ｐ
４におけるアミノ酸は変更された。彼らは、Ｉ群カスパーゼ（カスパーゼ−１、
カスパーゼ−４およびカスパーゼ−５）が、配列ＷＥＨＤを漠然と好み、一方、
ＩＩ群カスパーゼ（カスパーゼ−２、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７）は
、モチーフＤＥＸＤを非常に好む。ＩＩＩ群カスパーゼ（カスパーゼ−６、カス
パーゼ−７、カスパーゼ−９およびカスパーゼ−１０）は、モチーフ（Ｌ／Ｖ）
ＥＸＤを好んだ。この情報は、引き続き、テトラペプチドアルデヒドインヒビタ
ーを設計しそして発明するために使用された［Ｍ．Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｌｖｏら
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，３２６０８〜３２６１３（１９９８）］
。いくつかの伝統的な可逆的インヒビターおよび不可逆的なインヒビター（例え
ば、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）も、この研究に含まれた。

【０１５１】カスパーゼ−１、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７およびカスパーゼ−８に対
するＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯについての参照配列から、報告されたＫｉ値（ｎＭ
）は、各々以下のとおりであった：１８ｎＭ、０．２３ｎＭ、１．６ｎＭ、０．
９２ｎＭ［Ｍ．Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｌｖｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７
３．３２６０８〜３２６１３頁（１９９８）］。このテトラペプチドインヒビタ
ーは、ＩＩ群およびＩＩＩ群カスパーゼに対して最も強力であるが、これは、カ
スパーゼの３つ全ての群からの代表を有意に阻害する、報告されたテトラペプチ
ドアルデヒドだけである。ここで考慮される全てのカスパーゼがＰ２にバリンを
接続し得るという事実は、この位置における分岐アミノ酸についての一般的な耐
性を証明する。しかし、Ｐ２における分岐アミノ酸は、カスパーゼ−１、カスパ
ーゼ−４およびカスパーゼ−５に対するあまり最適でない基質を生成する傾向に
あり、そして代表的には、Ｉ群カスパーゼについての最も良好なインヒビターに
は存在しない［Ｎ．Ａ．Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
７２，１７９０７〜１７９１１（１９７７）］。一般に、大きな基は、３つ全て
のカスパーゼサブファミリーについての基質およびインヒビターの両方として許
容され、そして、トリプトファン、フェニルアラニンおよびチロシンをＰ２にお
いて含むテトラペプチド基質が次いで最適であるが、ヒスチジン含有テトラペプ
チド基質は、Ｉ群カスパーゼおよびＩＩ群カスパーゼに対して一般的に良好であ
った［Ｎ．Ａ．Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１
７９０７〜１７９１１（１９９７）］。さらに、以前の結晶学的研究において、
ピリドン（ｐｙｒｉｄｏｎｅ）環上の大きな６−ベンジル環置換基を含有する非
ペプチド性ポリドンアルデヒドインヒビターが、カスパーゼ−１中のＳ２部位に
わたり、ベンジル基のフェニル環を配置することが見出された［Ｊ．Ｍ．Ｃ．Ｇ
ｏｌｅｃ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，７，２１８１〜２１
８６頁（１９９７）］。

【０１５２】３つ全ての群のカスパーゼのＰ３位におけるコンビナトリアルテトラペプチド
基質ライブラリーによって同定された最適な残基は、グルタミン酸である［Ｎ．
Ａ．Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、１７９０７
−１７９１１頁（１９９７）］。本研究における全て４つのカスパーゼは、Ｐ３
グルタミン酸で少なくとも１つの電荷−電荷相互作用を作製する。この相互作用
の性質は、完全に保存されたＡｒｇを含むが、この塩架橋は、タンパク質の表面
上であり、そして曝露される溶媒である。基質特異性に関して、このような相互
作用は、ペプチド骨格の認識および正確な配置に関して最適であり得るが、この
相互作用は、全体的な結合エネルギー特性に対して最小に寄与すると予想される
［Ｓ．Ｄａｏ−Ｐｉｎ，ＣｉｂａＦｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｃｏｎｆｏｒｍ．）１６１，５２−６２頁（１９９１）］。これは、インヒビタ
ーＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯによって例証され、このインヒビターは、カスパーゼ
１に対して良好な阻害能力を示し、ＩＩＩ群のカスパーゼに対して緩やかな阻害
能力を示す。表面電荷−電荷相互作用は失われるが、Ｐ３バリンは、必要とされ
る骨格水素結合およびいずれかのプロリン（カスパーゼ−１、カスパーゼ−７、
カスパーゼ−８）、セリンのＰ−炭素（カスパーゼ−３）と可能性のある疎水性
相互作用をなお作製すると予想される。分枝Ｐ３バリンはまた、伸張されたテト
ラペプチドインヒビターの剛性を維持するためにはたらき、そして分子上の、あ
るあまり正式でない電荷に起因して細胞能力を潜在的に改善し得る。ペプチド模
倣カスパーゼインヒビターの近年の報告は、保存されたＳ３アルギニンと電荷−
電荷相互作用を作製し得ない、化合物クラス中の複数カスパーゼの適度に強力な
阻害を示す［Ｊ．Ｃ．Ｗｕ＆Ｌ．Ｃ．Ｆｒｉｔｚ，Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｏｒｌ
ａｎｄｏ，Ｆｌａ．）１７，３２０−３２８頁（１９９９）］。

【０１５３】基質特異性およびインヒビター選択性の両方に関して、Ｐ４位は、最多数の変
動性を提供する。一般的に、疎水性基およびアニオン性アスパルテートの両方は
、Ｐ４位において基質およびインヒビターの両方に対して耐性である。ＩＩ群お
よびＩＩＩ群のカスパーゼに関して、トリプトファンは、Ｓ４ポケットの底部に
ある。Ｉ群のカスパーゼに関して、この同じ残基は、最も小さい疎水性アミノ酸
（例えば、カスパーゼ−１中のＶａｌ３４８を含むＶａｌまたはＩｌｅ）である
。Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯのＣｓｐ１への結合は、研究された他のカスパーゼに
対して、Ｓ４残基とのより少ない総水素結合を産生し、これは、より広いＳ４ポ
ケットを可能にする。結合部位のこの位置における中性の静電気的な電位を伴う
比較的少ない水素結合の組合せは、Ｉ群のカスパーゼがＳ４に比較的大きな疎水
性基を適応させ、それによってインヒビター設計における選択性を得るための達
成方法を提供し得ることを示唆する。コンビナトリアルテトラペプチド基質研究
は、ＷＥＨＤがカスパーゼ−１に対する最適な基質であり、そして他のＩ群のカ
スパーゼ（カスパーゼ−４およびカスパーゼ−５）に対しても良好な基質であっ
たことを示した［Ｎ．Ａ．Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２７２，１７９０７−１７９１１頁（１９９７）］。しかし、ロイシンは、Ｐ４
において、これら２つのカスパーゼに対する基質としてトリプトファンとおおよ
そ等しかった。ＩＩ群のカスパーゼは、Ｐ４にアスパラギン酸を有する基質に関
する強力な優先度を有することが示された。上記に暗示したように、カスパーゼ
−３中の疎水性残基のカスパーゼ−７中の荷電残基または親水性残基による置換
は、これら２つの外見上同様なカスパーゼが、そのインビトロ基質優先度が同一
であるのにもかかわらず、異なる細胞型または細胞区画において異なる基質に対
して作用することを可能にし得る［Ｊ．Ｍ．Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．，２７３，１０８１５−１０８１８（１９９８）；Ｔ．Ｍａｃｈｌ
ｅｉｄｔ，ＦｅｄｅｒａｔｉｏｎｏｆＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌＳｔｕｄｉｅｓ，４３６，５１−５４頁（１９９８）］。ＩＩＩ群のカ
スパーゼは、Ｐ４においてバリンまたはロイシンのいずれかを好む。興味深いこ
とに、インヒビターに関して、ＡｃＷＥＨＤ−ＣＨＯは、カスパーゼ−１に対し
て最も強力な阻害を示し、これは、Ｓ４ポケットの底部におけるバリンが、適用
されるＰ４トリプトファンのための十分な場所を残していることを示唆する［Ｍ
．Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｌｖｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，３２６０
８−３２６１３頁（１９９８）］。図３の配列アラインメントに基づいて、カス
パーゼ−４およびカスパーゼ−５は、Ｓ４ポケット底部の同じ位置にバリンの換
わりにイソロイシンを保有すると予想される。この１つの余分なメチル基は、Ａ
ｃＷＥＨＤ−ＣＨＯ由来のＰ４トリプトファンが適応することをなお可能にする
が、完全に同様ではない（カスパーゼ−１、Ｋｉ＝０．０５６ｎＭ；カスパーゼ
−４、Ｋｉ＝９７ｎＭ；カスパーゼ−５、Ｋｉ＝４３ｎＭ）。ＡｃＷＥＨＤ−Ｃ
ＨＯは、全ての他のＩＩ群およびＩＩＩ群のカスパーゼ（カスパーゼ−８（Ｋｉ
＝２１ｎＭ）以外）の、弱いインヒビターである。カスパーゼ−８は、Ｓ４ポケ
ット底部に大きなトリプトファン残基を有するが、この結合部位のこの部分は、
適切に幅があり、そしてＡｃＷＥＨＤ−ＣＨＯのＰ４基を適用し得る。類似した
傾向が、チロシンまたはベンジルオキシカルボニル基をＰ４に含むインヒビター
に関して観察される。さらに、臨床試験を達成するための最初の選択的なＣｓｐ
１インヒビターであるＶＸ−７４０は、Ｐ４にイソキノリン基を保有する。この
インヒビターのＸ線結晶構造は、Ｓ４ポケットにおける適合して納まったＰ４イ
ソキノリンを明確に示す（準備中の原稿）。従って、大きな疎水性基のＰ４にお
ける組込みによって選択的なＣｓｐ１インヒビターを設計することは可能である
が、他のカスパーゼの選択的なインヒビターを設計するためにＰ４位を有効に利
用し得るかは明らかではない。

【０１５４】（実施例５）（インヒビター設計のためのカスパーゼ−７座標の使用）図７の座標を使用して、カスパーゼ−７またはカスパーゼ−７のホモログと結
合する化合物（阻害化合物を含む）を設計する。このプロセスは、機械読み取り
可能指示書のセットでコード化される機械読み取り可能データ保存媒体のセット
でコード化される、機械読み取り可能データ保存媒体を使用することによって補
助され得、ここで、記録された指示書は、カスパーゼ−７複合体またはその一部
の三次元表示を表示し得る。図形的な表示を、本明細書中に記載される方法に従
って使用して、カスパーゼ−７に結合する化合物（阻害化合物を含む）を設計す
る。このような化合物は、活性部位の全体または一部でカスパーゼ−７と結合し
得る。

【０１５５】本発明者らは、本発明の多数の実施形態を記載したが、本発明者らの基本的な
実施例が変更されて本発明の生成物および本発明のプロセスを使用する他の実施
形態を提供することは明らかである。従って、本発明の範囲は、例として示され
た特定の実施形態によってよりも、添付の特許請求の範囲によって規定されるこ
とが、理解される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ＲＩＢＢＯＮＳ［Ｍ．Ｃａｒｓｏｎ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃ
ｒｙｓｔ．，２４，第９５８〜９６１頁（１９９１）］を使用して作製された、
カスパーゼ−７四量体アセンブリの立体図を示す。ｐ２０、ｐ１０およびそれら
の対称性に関連する等価物、ｐ２０’およびｐ１０’は、それぞれ、図１Ａおよ
び図１Ｂにおいて、左から右へずらして示される。このボール−およびスティッ
クモデル、各々の図の左上近くに、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯインヒビターを示す
。

【図２】図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ
−３、カスパーゼ−７、およびカスパーゼ−８の第２の構造エレメントを示す。
図２Ａは、共有結合したテトラペプチドインヒビター（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ
）と重なり合ったカスパーゼ−１、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、カスパー
ゼ−８に関する、保存性折り畳みを示す。図２Ｂは、カスパーゼ−１（３７８−
３８６）、カスパーゼ−３（２４４−２６２）、カスパーゼ−７（２７０−２８
８）、およびカスパーゼ−８（４５１−４６３）に関して、重なり合ったＳ４ル
ープを示す。図２Ｃは、近位の残基２４５−２５３からカスパーゼ−１（残基２
４９−２５４）の重なり合った挿入ループまでの範囲のカスパーゼ−８中での、
プライム側鎖へリックス−ターン−へリックス挿入を示す。図２Ｂおよび２Ｃを
、図２Ａに対してわずかに回転させた。

【図３】図３は、カスパーゼ−１、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、およびカスパー
ゼ−８の配列アライメントを示す。このアライメントは、保存性第２構造エレメ
ントならびにカスパーゼ−１、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、およびカスパ
ーゼ−８の活性部位残基の重なりにおいて、かなり偏っていた。このアライメン
トは、ＭＶＰプログラムを用いて実施し、次いで手動で調製した［Ｍ．Ｈ．Ｌａ
ｍｂｅｒｔ，Ｐｒａｃｔ．Ａｐｐｌ．Ｃｏｍｐｕｔ．ＡｉｄｅｄＤｒｕｇＤ
ｅｓ．，第２４３〜３０３頁，Ｐ．Ｓ．Ｃｈａｒｆｓｏｎ編、Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ
ｅｗＹｏｒｋ．（１９９７）］。四角の中の残基は、図４に示されるような、
Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯと直接的な相互作用または水媒介相互作用を示す。

【図４】図４は、以下の結合部位残基と、共有結合したＡｃ−ＤＥＶＤ−チオヘミアセ
タールとの水素結合およびファンデアワールス相互作用を示す：ａ）カスパーゼ
−１；ｂ）カスパーゼ−３；ｃ）カスパーゼ−７；およびｄ）カスパーゼ−８。
「Ｗａｔ」は、水分子を示す。

【図５】図５Ａ〜５Ｄは、カスパーゼ−１、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、および
カスパーゼ−８の結合部位残基の分子表面上にマップされた、電位を示す。正電
位、負電位、および中性電位の領域が示される。この分子表面および電位を、Ｇ
ＲＡＳＰで計算した［Ａ．Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅＦｕｎｃｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１，第２８１〜２９６頁（
１９９１）］。

【図６】図６は、ＲＩＢＢＯＮＳによって生成されたカスパーゼ−７とカスパーゼ−３
との重なりを示す、立体図を示す。カスパーゼ−７に結合した、テトラペプチド
インヒビター、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯのＮ−アセチル基は、Ｐ４−結合部位の
同一の位置において、セリンの代わりのプロリン（２３５）の代用に起因して、
カスパーゼ−３と比較して約２．５Å平行移動される。

【図７】図７は、この複合体の結晶からＸ線回折により誘導されるように、合成テトラ
ペプチドインヒビターとの複合体である、カスパーゼ−７に関する原子構造配座
を列挙する。この複合体の調製は、実施例１および２に記載される。以下の略語
は、図７において使用される。「原子型」は、配座が決定されたエレメントを言
及する。エレメントは、このコラム中の第１文字によって規定される。「Ｘ，Ｙ
，Ｚ」は、各原子に対して決定された原子位置を結晶学的に規定する。「Ｏｃｃ
」は、分子のフラクションを言及する占有因子であり、各原子がこの配座によっ
て特定された位置を占有する。「ｌ」の値は、この結晶の全ての分子において、
各原子が同一のコンフォメーション（すなわち、同一の位置）を有することを示
す。「Ｂ」は、原子中心の周りの原子の動きを測定する熱因子である。

【図８】図８は、図９および１０の記憶媒体によってコードされた指示を実施するため
に使用されたシステムの図を示す。

【図９】図９は、磁気記憶媒体の断面図を示す。

【図１０】図１０は、光学的に読みとり可能データ記憶媒体の断面図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ウェイ，ユンイアメリカ合衆国マサチューセッツ 02478，ベルモント，トロウブリッジストリート 65ビーＦターム(参考） 4B050 CC07 DD11 FF17 4B063 QA01 QA11 QA18 QQ36 QR16 QR48 QR57 QS36 QX01 4H045 AA10 AA30 BA13 DA56 EA50 5B046 AA00 JA07

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】図７に記載のカスパーゼ−７のアミノ酸２３４、２３５、２
３７、２７６、２７８、２８１、および２８４の構造座標によって規定される結
合ポケットの全てまたは該ポケットの任意の部分を含む、分子もしくは分子複合
体、または該分子もしくは分子複合体のホモログであって、ここで、該ホモログ
は、１．５Åを超えない該アミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏差を有する結
合ポケット含み、ここで、該分子もしくは分子複合体は、カスパーゼ−３のＳ４
結合領域よりもより親水性であるＳ４結合領域を有する、分子もしくは分子複合体、または該分子もしくは分子複合体のホモログ。
【請求項２】前記ホモログが、１．０Åを超えない前記アミノ酸の骨格原
子からの根平均二乗偏差を有する結合ポケット含む、請求項１に記載の分子もし
くは分子複合体。
【請求項３】図７に記載のカスパーゼ−７のアミノ酸８５、８６、８７、
８８、１４４、１４５、１８４、１８６、１９１、２２３、２３０、２３１、２
３２、２３３、２３４、２３５、２３７、２４０、２７６、２７８、２８１、２
８２および２８４の構造座標によって規定される結合ポケットの全てまたは該ポ
ケットの任意の部分を含む、請求項１に記載の分子もしくは分子複合体、または
該分子もしくは分子複合体のホモログであって、ここで、該ホモログは、１．５
Åを超えない該アミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏差を有する結合ポケット
含み、ここで、該分子もしくは分子複合体は、カスパーゼ−３のＳ４結合領域よ
りもより親水性であるＳ４結合領域を有する、分子もしくは分子複合体、または該分子もしくは分子複合体のホモログ。
【請求項４】前記ホモログが、１．０Åを超えない前記アミノ酸の骨格原
子からの根平均二乗偏差を有する結合ポケット含む、請求項３に記載の分子もし
くは分子複合体。
【請求項５】請求項３に記載の分子もしくは分子複合体、または該分子も
しくは分子複合体のホモログであって、該分子もしくは分子複合体は、図７に記
載の構造座標によって規定され、該ホモログは、１．５Åを超えない該アミノ酸
の保存的骨格原子からの根平均二乗偏差を有する結合ポケット含み、ここで、該
分子もしくは分子複合体は、カスパーゼ−３のＳ４結合領域よりもより親水性で
あるＳ４結合領域を有する、分子もしくは分子複合体、または該分子もしくは分子複合体のホモログ。
【請求項６】前記ホモログが、１．０Åを超えない前記アミノ酸の骨格原
子からの根平均二乗偏差を有する結合ポケット含む、請求項５に記載の分子もし
くは分子複合体。
【請求項７】図７に記載のカスパーゼ−７のアミノ酸５８〜３０２の構造
座標を含む、請求項１に記載の分子もしくは分子複合体。
【請求項８】Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨＯと複合体化
したカスパーゼ−７またはそのホモログを含む、結晶化可能な組成物。
【請求項９】前記カスパーゼ−７が、アミノ酸１〜３０３を有する、請求
項８に記載の結晶化可能な組成物。
【請求項１０】Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨＯと複合体
化したカスパーゼ−７またはそのホモログを含む、結晶。
【請求項１１】前記カスパーゼ−７が、アミノ酸１〜３０３を有する、請
求項１０に記載の結晶。
【請求項１２】機械読みとり可能データでコード化されたデータ記憶材料
を含む、機械読みとり可能データ記憶媒体であって、ここで該データが、図７に
記載の分子もしくは分子複合体、または該分子もしくは分子複合体のホモログの
、構造座標の全てまたは該構造座標の一部によって規定され、ここで、該ホモロ
グは、１．５Åを超えない該複合体の骨格原子からの根平均二乗偏差を有する骨
格原子を含み、ここで、該分子もしくは分子複合体は、カスパーゼ−３のＳ４結
合領域よりもより親水性であるＳ４結合領域を有する、データ記憶媒体。
【請求項１３】請求項１２に記載の機械読みとり可能データ記憶媒体であ
って、該データが、図７に記載のカスパーゼ−７のアミノ酸５８〜３０２または
該カスパーゼ−７のホモログの、構造座標の全てまたは該構造座標の一部によっ
て規定され、該ホモログは、１．５Åを超えない該アミノ酸の骨格原子からの根
平均二乗偏差を有する、データ記憶媒体。
【請求項１４】第１セットの機械読みとり可能データでコード化されたデ
ータ記憶材料を含む、機械読みとり可能データの記憶媒体であって、該機械読み
取り可能データの記憶媒体は、該第１セットのデータおよび第２セットの機械読
みとり可能データを使用するための指示書を用いてプログラムされた機械を使用
して該第２セットのデータと合わされた場合、該第２セットの機械読みとり可能
データに対応する構造座標の少なくとも一部を決定し得、ここで：該第１セット
のデータおよび該第２セットのデータは、図７に記載のカスパーゼ−７の構造座
標の少なくとも一部のフーリエ変換を含み；該第２セットのデータは、未知構造
の分子または分子複合体のＸ線回折パターンを含む、データ記憶媒体。
【請求項１５】以下のａ．またはｂ．の三次元表示を作製するためのコン
ピュータであって、ａ．図７に記載のカスパーゼ−７のアミノ酸２３４、２３５、２３７、２７６
、２７８、２８１、および２８４の構造座標によって規定される結合ポケッの全
てまたは該結合ポケットの一部を含む、分子または分子複合体；またはｂ．該分子または分子複合体のホモログであって、該ホモログは、１．５Åを
超えない該アミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏差を有する結合ポケット含み
、ここで、該分子もしくは分子複合体は、カスパーゼ−３のＳ４結合領域よりも
より親水性であるＳ４結合領域を有し、ここで、該コンピューターは：ｉ．機械読みとり可能データでコード化されたデータ記憶材料を含む機械読み
とり可能なデータ記憶媒体であって、ここで該データが、図７に記載のカスパー
ゼ−７のアミノ酸２３４、２３５、２３７、２７６、２７８、２８１、および２
８４の構造座標を含む、データ記憶媒体；およびｉｉ．該機械読みとり可能データを該三次元表示へと処理するための指示書を備える、コンピュータ。
【請求項１６】請求項１５に記載のコンピューターであって、ここで、前
記ホモログは、１．０Åを超えない前記アミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏
差を有する結合ポケットを含む、コンピューター。
【請求項１７】請求項１５に記載のコンピューターであって、ここで：ａ．前記分子もしくは分子複合体が、図７に記載のカスパーゼ−７のアミノ酸
８５、８６、８７、８８、１４４、１４５、１８４、１８６、１９１、２２３、
２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３７、２４０、２７６、
２７８、２８１、２８２および２８４の構造座標によって規定される結合ポケッ
トの全てまたは該ポケットの任意の部分を含むか；またはｂ．該分子もしくは分子複合体のホモログは、１．５Åを超えない該アミノ酸
の骨格原子からの根平均二乗偏差を有する結合ポケット含み、ここで、該分子も
しくは分子複合体は、カスパーゼ−３のＳ４結合領域よりもより親水性であるＳ
４結合領域を有し、ここで、該コンピューターは：ｉ．機械読みとり可能データでコード化されたデータ記憶材料を含む機械読み
とり可能なデータ記憶媒体であって、ここで該データが、図７に記載のカスパー
ゼ−７のアミノ酸８５、８６、８７、８８、１４４、１４５、１８４、１８６、
１９１、２２３、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３７、
２４０、２７６、２７８、２８１、２８２および２８４の構造座標を含む、デー
タ記憶媒体；およびｉｉ．該機械読みとり可能データを該三次元表示へと処理するための指示書を備える、コンピュータ。
【請求項１８】請求項１７に記載のコンピューターであって、ここで、前
記ホモログは、１．０Åを超えない前記アミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏
差を有する骨格原子を含む、コンピューター。
【請求項１９】請求項１７に記載のコンピューターであって、ここで：ａ．前記分子もしくは分子複合体が、図７に記載の構造座標を含むか；またはｂ．該分子もしくは分子複合体のホモログであって、該ホモログは、１．５Å
を超えない該アミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏差を有する結合ポケット含
み、ここで、該分子もしくは分子複合体は、カスパーゼ−３のＳ４結合領域より
もより親水性であるＳ４結合領域を有し、ここで、該コンピューターは：ｉ．機械読みとり可能データでコード化されたデータ記憶材料を含む機械読み
とり可能なデータ記憶媒体であって、ここで該データが、図７に記載の構造座標
を含む、データ記憶媒体；ｉｉ．該機械読みとり可能データを該三次元表示へと処理するための指示書を備える、コンピュータ。
【請求項２０】請求項１９に記載のコンピューターであって、ここで、前
記ホモログは、１．０Åを超えない前記アミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏
差を有する結合ポケットを含む、コンピューター。
【請求項２１】請求項１７に記載のコンピューターであって、ここで：ａ．前記分子もしくは分子複合体は、図７に記載のカスパーゼ−７のアミノ酸
５８〜３０２の構造座標によって規定される結合ポケットの全てまたは該ポケッ
トの任意の部分を含み；ここで、該コンピューターは：ｉ．機械読みとり可能データでコード化されたデータ記憶材料を含む機械読み
とり可能なデータ記憶媒体であって、ここで該データが、図７に記載のカスパー
ゼ−７のアミノ酸５８〜３０２の構造座標を含む、データ記憶媒体；ｉｉ．該機械読みとり可能データを該三次元表示へと処理するための指示書を備える、コンピュータ。
【請求項２２】前記三次元表示を表示するためのディスプレイをさらに備
える、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載のコンピューター。
【請求項２３】分子または分子複合体から得られたＸ線回折データに対応
する構造座標の少なくとも一部を決定するためのコンピューターであって、ここで、該コンピューターは：ａ．機械読みとり可能データでコード化されたデータ記憶材料を含む機械読み
とり可能なデータ記憶媒体であって、ここで該データが、図７に記載のカスパー
ゼ−７の構造座標の少なくとも一部を含む、データ記憶媒体；ｂ．機械読みとり可能なデータでコード化されたデータ記憶材料を含む機械読
みとり可能なデータ記憶媒体であって、ここで該データは、該分子または分子複
合体から得られたＸ線回折データを含む、データ記憶媒体；およびｃ．（ａ）の機械読みとり可能データのフーリエ変換を実行するため、および
（ｂ）の該機械読みとり可能データを構造座標に処理するための指示書、を備える、コンピュータ。
【請求項２４】前記三次元表示を表示するためのディスプレイをさらに備
える、請求項２３に記載のコンピュータ。
【請求項２５】請求項１〜７のいずれか１項に記載の分子もしくは分子複
合体と会合する化学実体の能力を評価するための方法であって、該方法は、以下の工程：ａ．該化学実体と該分子もしくは分子複合体の結合ポケットとの間の一致操作
を実行するためのコンピュータ手段を使用する工程；およびｂ．該化学実体と該結合ポケットとの間の会合を定量するための該一致操作の
結果を分析する工程を包含する、方法。
【請求項２６】請求項１〜７のいずれか１項に記載の分子もしくは分子複
合体の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための方法であって
、該方法は、以下の工程：ａ．該分子もしくは分子複合体の三次元構造を作製する工程；ｂ．該三次元構造を使用して、該潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストを
設計または選択する工程；ｃ．該潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストを提供する工程；およびｄ．該潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストを該分子と接触させて相互作
用させる工程を包含する、方法。
【請求項２７】図７に示される構造座標を用いることによって、未知構造
の分子または分子複合体に関する構造情報を得るために分子置換を使用する方法
であって、該方法は、以下の工程：ａ．該分子または分子複合体を結晶化する工程；ｂ．該結晶化された分子または分子複合体からの該Ｘ線回折パターンを生成す
る工程；およびｃ．図７に示される構造座標の少なくとも一部を、該Ｘ線回折パターンに適用
して、その構造が未知である該分子または分子複合体の少なくとも一部の三次元
電子密度マップを作製する工程、を包含する、方法。
【請求項２８】前記未知構造の分子または分子複合体が、カスパーゼ−７
サブユニットまたはカスパーゼ−７ホモログから選択されるポリペプチドを含む
、請求項２７に記載の方法。