JP2000511884A - Ｉｍｐｄｈ様結合ポケットを含む分子およびそれらをグラフィック表示することが可能なコード化データ記憶媒体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、IMPDHの活性部位結合ポケットを含む結晶化分子および分子複合体の構造座標でコードされたデータ記憶媒体に関する。このようなデータ記憶物質は、このような分子および分子複合体、あるいは構造ホモログを３次元グラフィック表示としてコンピューター画面上に表示することが可能である。本発明はまた、相同タンパク質またはタンパク質複合体の構造を解析するために構造座標を用いる方法に関する。さらに、本発明は、IMPDHまたはそのホモログに結合する化合物(阻害化合物を含む)をスクリーニングおよび設計するために構造座標を用いる方法に関する。本発明はまた、IMPDHの活性部位結合ポケットまたは活性部位結合ポケットの密接な構造ホモログを含む分子および分子複合体に関する。本発明はまた、IMPDHの阻害剤である化合物および薬学的組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 IMPDH 様結合ポケットを含む分子および それらをグラフィック表示することが可能なコード化データ記憶媒体 発明の技術分野 本発明は、IMPDHの活性部位結合ポケットを含む結晶化分子および分子複合体 の構造座標でコードされたデータ記憶媒体に関する。このようなデータ記憶物質 は、このような分子および分子複合体、あるいは構造ホモログを３次元グラフィ ック表示としてコンピューター画面上に表示することが可能である。本発明はま た、相同タンパク質またはタンパク質複合体の構造を解析するために構造座標を 用いる方法に関する。さらに、本発明は、IMPDHまたはそのホモログに結合する 化合物(阻害化合物を含む)をスクリーニングおよび設計するために構造座標を用 いる方法に関する。本発明はまた、IMPDHの活性部位結合ポケットまたは活性部 位結合ポケットの密接な構造ホモログを含む分子および分子複合体に関する。本 発明はまた、IMPDHの阻害剤である化合物および薬学的組成物に関する。 発明の背景 生物体におけるヌクレオチドの合成は、分裂および複製するためにこれらの生 物体の細胞に必要とされる。哺乳類におけるヌクレオチド合成は、２つの経路の 内の１つによって達成され得る：新規の合成経路またはサルベージ経路。異なる 細胞型は、異なる程度にこれらの経路を使用する。 イノシン-5'-モノホスフェートデヒドロゲナーゼ(IMPDH；EC 1.1.1.205)は、 グアノシンヌクレオチドの新規合成に関与する酵素である。IMPDHは、イノシン- 5'-モノホスフェート(IMP)からキサントシン-5'-モノホスフェート(XMP)へのNAD 依存性酸化を触媒し、これはグアノシンヌクレオチド合成に関連の(committed) 工程である[R.C．Jacksonら、Nature、256、331-333頁(1975)]。 IMPDHは真核生物、細菌および原生動物に遍在する[Y．NatsumedaおよびS.F.Ca rr、Ann ．N.Y．Acad．Sci.、696、88-93頁(1993)]。原核生物の形態は、ヒト の酵素と30〜40％配列同一性を占める。種に関係なく、この酵素は秩序化された Bi-Bi反応配列に従い、ここでIMP結合はNADのそれに先行し、そしてNADHはXMPに 先だって放出される[S.F．Carrら、J ．Biol．Chem．268、27286-27290頁(1993) ；E.W．Holmes；Biochim．Biophys．Acta 364、209-217頁(1974)]。この機構は 、ほとんどの他の公知のNAD依存性デヒドロゲナーゼ(これらは基質添加のランダ ムな秩序を有するか、またはNADが基質より前に結合することを要求するかのい ずれかである)のものとは異なる。 グアノシンヌクレオチドの新規の合成、従ってIMPDHの活性は、Bリンパ球また はTリンパ球に特に重要である。これらの細胞は新規の経路に依存し、マイトジ ェンまたは抗原に対する増殖応答を開始するのに必要な十分なレベルのヌクレオ チドを生じるサルベージ経路には依存しない[A.C．Allisonら、Lancet II、1179 (1975)およびA.C．Allisonら、Ciba Found ．Symp.、48、207(1977)]。従って、I MPDHは、免疫系を選択的に阻害する誘引性の標的であり、また他の細胞の増殖を 阻害することはない。 免疫抑制は、例えば、ホスファターゼカルシニュリン(シクロスポリンAおよび FK-506によって阻害される)；ピリミジンの生合成に含まれる酵素である、ジヒ ドロオロテート(dihydroorotate)デヒドロゲナーゼ(レフノミドおよびブレキナ ルによって阻害される)；キナーゼFRAP(ラパマイシンによって阻害される)；お よび熱ショックタンパク質hsp70(デオキシスペルグアリンによって阻害される) を含む種々の酵素を阻害することによって達成されている。（B.D．Kahan、Immu nological Reviews 、36、pp.29-49(1993)；R.E．Morris、The Journal of Heart and Lung Transplntation 、12(6)、S275-S286頁(1993)を参照のこと。） IMPDHの阻害剤もまた公知である。米国特許第5,380,879号および米国特許第5, 444,072号およひPCT国際公開番号WO94/01105およびWO94/12184は、ヒトIMPDH I 型およびII型の強力で、不競合的な、可逆性阻害剤としてミコフェノール酸(MPA )およびその誘導体のいくつかを記載する。MPAはマイトジェンまたは抗原に対す るＢおよびＴ細胞の応答をブロックすることが示された[A.C．Allisonら、Ann.N ．Y．Acad．Sci. ，696，63(1993)]。 免疫抑制剤(例えばMPA)は、移植拒絶および自己免疫疾患の処置に有用な薬物 である[R.E．Morris、Kidney Intel.、49、Suppl．53、S-26(1996)]。しかし、M PAは望ましくない薬学的特性(例えば、消化管毒性および低いバイオアベイラビ リティー)によって特徴づけられている[L.M．Shawら、Therapeutic Drug Monito ring 、17、pp.690−699(1995)]。 チアゾフリン、リバビリンおよびミゾリビンのような核酸アナログもまた、IM PDHを阻害する[L．Hedstromら、Biochemistry、29、pp.849−854(1990)]。しか し、これらの化合物はIMPDHに対して特異的ではない。 インビボで遊離MPAを急速に遊離するプロドラッグである、ミコフェノール酸 モフェチル(mofetil)は、腎臓移植後の急性腎臓同種移植拒絶を予防することが 最近認められた[L.M．Shawら、Therapeutic Drug Monitoring、17、pp.690-699( 1995)；H.W．Sollinger，Transplantation、60、pp.225-232(1995)]。しかし、 消化管および他の副作用のため、この薬物の治療的潜在能力が限定されるようで ある[L.M．Shawら、Therapeutic Drug Monitoring、17、pp.690-699(1995)；A.C .AllisonおよびE.M．Eugui、Immunological Rev.，136，5-28(1993)]。 IMPDHは他の代謝事象において機能することも公知である。増加したIMPDH活性 は、ヒト白血病性細胞株および他の腫瘍細胞株を急速に増殖する際に観察され、 このことはIMPDHが抗ガンおよび免疫抑制化学療法の標的であることを示す[M．N agaiら、Cancer Res.、51．pp.3886−3890(1991)]。 IMPDHはまた、平滑筋細胞の増殖に機能することが示され、このことはIMPDHの 阻害剤(例えば、MPAまたはラパマイシン)が再狭窄または他の過剰増殖血管疾患 の予防に有用であり得ることを示している[C.R．Gregoryら、Transplantation、 59、pp.655-61(1995)；PCT国際公開番号WO94/12184；およびPCT国際公開番号WO9 4/01105]。 さらに、IMPDHはいくつかのウイルス性細胞株におけるウイルス複製に機能す ることが示されている[S.F．Carr、J ．Biol．Chem.、268、pp．27286-27290(199 3)]。リンパ球および腫瘍細胞株に類似して、サルベージよりもむしろ新規の経 路がウイルス複製プロセスにおいて重大であると解される。 従って、改良された薬学的特性を有する強力なIMPDH阻害剤に対する必要性が 残存する。このような阻害剤は免疫抑制剤、抗ガン剤、抗血管過剰増殖剤および 抗ウイルス剤として治療的潜在能力を有する。特に、このような化合物は移植拒 絶および自己免疫疾患(例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、若年性糖尿 病、喘息、炎症性腸炎)、ならびにガンおよび腫瘍(例えば、リンパ腫および白血 病)、血管疾患(例えば、再狭窄)、およびウイルス複製疾患(例えば、レトロウイ ルス疾患およびヘルペス)の処置に使用され得る。 ヒトIMPDHの２つのイソ型(I型およびII型と命名されている)が同定された[F.R ．CollartおよびE．Huberman，J ．Blol．Chem.、263、15769-15772頁(1988);Y.N atsumedaら、J ．Biol．Chem.、265、5292-5295頁(1990)]。それぞれは514アミノ 酸であり、そして84％の配列同一性を共有する。両方のIMPDH I型およびII型は 、溶液中で活性テトラマーを形成し、56kDaの分子量のサブユニットを有する[Y ．Yamadaら、Biochemistry、27、2737−2745頁(1988)]。 両方のヒトIMPDHイソ型は、それらのcDNAおよびアミノ酸配列によって特徴づ けられた[Y．Natsumedaら、J ．Biol．Chem.、265、5222-5295頁(1990)]。チャイ ニーズハムスタ−IMPDHは、そのcDNAおよびアミノ酸配列によって特徴づけられ た[F.R．CollartおよびE．Huberman、J ．Biol．Chem.、263、15769-15772頁(198 8)]。しかし、IMPDHの１次構造の知識（すなわち、アミノ酸配列）から、その３ 次構造の予測はできない。または、それからはMPA、IMP、あるいは他の化合物ま たは阻害剤とのIMPDHの構造的、立体配座的および化学的相互作用の理解は得ら れない。 IMPDHの結晶構造は報告されていない。IMPDHのアナログまたはIMPDHの共複合 体の結晶構造もまた報告されていない。従って、IMPDHの構造のより正確な記述 を提供し、改良されたIMPDH阻害剤の設計を助けるために、IMPDHの結晶構造を決 定する必要性がある。IMPDH、IMPおよびMPAを含む複合体の結晶構造は、そのよ うな記載を提供する。 発明の要旨 本出願人らは、XMP^*およびMPAの複合体のチャイニーズハムスターII型IMPDHの 結晶化を達成することによりこの問題を初めて解決し、そして、この複合体の３ 次元構造を解明した。IMPDHのこのイソ型は、類似の酵素的特性およびMPAにより 阻害される能力を維持しながら、ヒトII型酵素由来の６アミノ酸のみが異なる。 この結晶構造の解明は、本出願人が、IMPDHの鍵となる構造的特性（特に、そのX MP^*結合ポケットの形状およびそのMPA結合ポケットの形状）を決定することを可 能にした。 従って、本発明は、これらの結合ポケットの１つまたは２つのいずれかの全て または一部、あるいは類似の３次元形状を有するこれらの結合ポケットのホモロ グを含む分子もしくは分子複合体を提供する。 本発明はまた、IMPDHの構造座標を含む、機械読み出し可能な記憶媒体（これ は、XMP^*およびMPAの結合ポケットの全てまたは任意の部分を含んでいる）を提 供する。これらのデータでコード化されるこのような記憶媒体は、コンピュータ ー画面または同様の視覚装置上で、分子もしくは分子複合体（これは、このよう な結合ポケットまたは同様の形状であるホモログ性結合ポケットを含む）の３次 元グラフィック表示を表示し得る。 本発明はまた、上記結合ポケットの全てまたは一部に結合する化合物を設計、 評価、および同定するための方法を提供する。このような化合物は、IMPDHまた はそのホモログの潜在的な阻害剤である。 本発明はまた、IMPDHまたはそのホモログの阻害剤として有用な、新規なクラ スの化合物およびそれらの薬学的組成物を提供する。 本発明はまた、IMPDHに少なくともいくらか構造的に類似する特徴を含む分子 もしくは分子複合体の３次元構造体の少なくとも一部を決定するための方法を提 供する。これは、チャイニーズハムスターII型IMPDH/XMP^*/MPA複合体について得 られた構造座標の少なくともいくらかを用いることにより達成される。 本発明はまた、チャイニーズハムスターII型IMPDH/XMP^*/MPA複合体および関連 する複合体を結晶化させるための方法を提供する。 本発明はまた、チャイニーズハムスターII型IMPDH/XMP^*/MPA複合体および関連 する複合体の結晶形態を提供する。 図面の簡単な説明 図１は、XMP^*およひMPAとの複合体の結晶からのＸ線回折により得られた、XMP^* およびMPAとの複合体のチャイニーズハムスターIMPDHII型（本明細書の以下でI MPDHという）についての原子構造座標を列挙する。以下の略号は、図１において 用いられる： 「原子タイプ」は、その座標が測定される元素を意味する。この欄の最初の文 字は、元素を定義する。 「Ｘ、Ｙ、Ｚ」は、測定される元素の原子の位置を結晶学的に定義する。 「Ｂ」は、原子中心の周囲の原子の運動を測定する熱的因子である。 「0cc」は、その中で各原子が座標により特定される位置を占める分子の割合 を示す占有因子である。「１」の値は、各原子が、結晶の全ての分子中で同じコ ンフォメーション（すなわち、同じ位置）を有することを示す。 図２Ａおよび２Ｂは、Ｘ線結晶解析により決定されたIMPDHの折り畳みおよび コンフォメーションを３次元で図示する立体リボン図を描写する。 図３は、IMPDHの折り畳みの位相図である。 図４は、IMPDHテトラマーのリボン図である。 図５Ａおよび５Ｂは、XMP^*およびMPAのコンフォメーションおよび電子密度、 ならびにこれらのリガンドを取り囲むIMPDH活性部位のアミノ酸残基のいくつか の立体図を図示する。 図６は、XMP^*-IMPDH相互作用を概略的に図示する。 図７は、MPA-IMPDH相互作用を概略的に図示する。 図８は、IMP基質に対するIMPDH変異体の比活性およびMPAによる変異体の阻害 を示す。 図９は、図10および図11の記憶媒体によりコード化される命令を実行するため に用いられるシステムのダイヤグラムを示す。 図10は、磁気記憶媒体の断面図を示す。 図11は、光学的に読み出し可能なデータ記憶媒体の断面図を示す。 発明の詳細な説明 以下の略号は、本出願を通して用いられる： Ａ＝Ala＝アラニン Ｔ＝Thr＝トレオニン Ｖ＝Val＝バリン Ｃ＝Cys＝システイン Ｌ＝Leu＝ロイシン Ｙ＝Tyr＝チロシン Ｉ＝Ile＝イソロイシン Ｎ＝Asn＝アスパラギン Ｐ＝Pro＝プロリン Ｑ＝Gln＝グルタミン Ｆ＝Phe＝フェニルアラニン Ｄ＝Asp＝アスパラギン酸 Ｗ＝Trp＝トリプトファン Ｅ＝Glu＝グルタミン酸 Ｍ＝Met＝メチオニン Ｋ＝Lys＝リジン Ｇ＝Gly＝グリシン Ｒ＝Arg＝アルギニン Ｓ＝Ser＝セリン Ｈ＝His＝ヒスチジン IMPDH＝チャイニーズハムスターII型イノシンモノホスフェートデヒドロゲナ ーゼ IMP＝イノシンモノホスフェート MPA＝ミコフェノール酸 NAD＝ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド KCl＝塩化カリウム BME＝2-メルカプトエタノール EDTA＝エチレンジアミン四酢酸 Tris＝トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン PEG＝ポリエチレングリコール LiCl＝塩化リチウム MES＝モルホリノエチル硫酸 MeP＝1-メチル-2-ピロリジノン PMSF＝フェニルメチルスルホニルフルオライド XMP^*＝２位の水素が、IMPDHのCys 331への共有結合で置換されている、IMPの 形態。 IMPDH/IMP/MPA＝IMPおよびMPAとの複合体のIMPDH IMPDH/XMP^*/MPA＝XMP^*およびMPAとの複合体のIMPDH 必要であれば、さらなる定義は、明細書中に記載されている。 本明細書中に記載の発明をより完全に理解することができるように、以下の詳 細な説明が記載されている。 本出願人らは、Ｘ線結晶解析に適切な、IMPDH/XMP^*/MPAを含む結晶を提供した 。IMPDH/XMP^*/MPA複合体は、IMPのC2炭素とCys331のイオウ原子との間に共有結 合が形成されているIMPDH/IMP複合体（図５〜７）から得られ、酸化されたIMPチ オイミデート中間体(XMP^*)を生じる。これは、MPAによりトラップされている。 本出願人らは、高分解能Ｘ線結晶解析を用いて、IMPDH/XMP^*/MPA複合体の３次 元構造を解明した。従って、本発明の１つの実施態様では、IMPDH/XMP^*/MPAの結 晶が提供される。好ましくは、結晶は、正方晶空間群P4を有する。より好ましく は、この結晶は、長方形の単位格子を有し、各単位格子は、ａ＝ｂ＝110.6±５ Åおよびｃ＝110.0±５Åの寸法を有する。最も好ましくは、この結晶化された 酵素は、テトラマーである。 重要なことに、本出願人らの発明は、IMPDHのXMP^*およびMPA活性部位結合ポケ ットの形状および構造についての情報を最初に提供した。 結合ポケットは、薬物の発見などの分野において重要な用途を有する。天然の リガンドまたは基質と、それらの対応するレセプターまたは酵素の結合ポケット との会合は、多くの生物学的作用機構の基礎である。同様に、多くの薬物は、レ セプターまたは酵素の結合ポケットとの会合を通じてそれらの生物学的効果を発 揮する。このような会合は、結合ポケットの全てまたは任意の部分で起こり得る 。このような会合を理解することは、標的レセプターまたは酵素とより好適に会 合 する薬物を設計し、それにより生物学的効果を改良することを導くための助けと なる。従って、この情報は、IMPDH様結合ポケットの潜在的な阻害剤を設計する のに有用である。 本明細書中で用いられる用語「結合ポケット」は、その形状の結果として、他 の化学物質または化合物と好適に会合する、分子もしくは分子複合体の領域を意 味する。 用語「IMPDH様結合ポケット」は、その形状が、一般的なリガンドと結合する ために、IMPDHのXMP^*およびMPAの活性部位結合ポケットの全てまたは任意の部分 と十分に類似する、分子もしくは分子複合体の一部を意味する。この形状の共通 性は、IMPDHにおける結合ポケットを構成するアミノ酸の骨格原子の構造座標（ 図１中に記載される）からの1.5Å以下の根二乗平均偏差により定義される。こ の計算を得る方法を、以下に記載する。 IMPDHの「活性部位結合ポケット」または「活性部位」は、IMPからXMPへの転 化が起こり、かつ、MPAがその阻害効果を発揮する、IMPDH酵素表面上の領域を意 味する。チャイニーズハムスターIMPDHII型の結晶構造の解明において、本出願 人らは、IMPDHアミノ酸67、68、69、70、73、93、273、274、275、276、277、30 3、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335 、337、339、340、364、365、366、367、368、385、386、387、388、389、391、 411、412、413、414、415、416、419、420、439、440、441、442、443、469、47 0、500、501、502、503、504、505、および506が、リガンド（XMP^*またはMPAの いずれか）と相互作用するのに十分に近く（７Å以内）配置されていることを測 定した。IMPDHの他のイソ型におけるアミノ酸の番号付けが、チャイニーズハム スターから単離されたアミノ酸の番号付けとは異なることは、当業者には容易に 明らかである。 これらの各アミノ酸は、図１に示されるような構造座標のセットにより定義さ れる。用語「構造座標」は、結晶型IMPDH複合体の原子（散乱中心）によりＸ線 の単色ビームの回折上で得られるパターンに関する数式に由来する直交座標をい う。回折データを使用して結晶の反復単位の電子密度マップを計算する。次いで 、電子密度マップを使用して、IMPDH酵素または酵素複合体の個々の原子の位置 を 確定する。 当業者は、酵素または酵素複合体またはその一部についての構造座標のセット が、３次元における形状を定義する相対的な点のセットであることを理解する。 従って、座標の全体の異なるセットが類似のまたは同一の形状を定義することが 可能である、さらに、個々の座標におけるわずかな変化は、全体の形状において はほとんど影響はない。結合ポケットに関しては、これらの変化は、これらのポ ケットに会合し得るリガンドの性質を顕著に変化させるとは予測されない。 用語「会合する」は、化学物質または化合物、もしくはその一部と、IMPDH分 子またはその一部との間の近接の条件をいう。会合は、非共有結合であり得る（ ここで、結合点は、エネルギー的に水素結合またはファンデルワールスもしくは 静電気的相互作用により好都合である）か、または共有結合であり得る。 上記の座標における変化は、IMPDH/XMP^*/MPA構造座標の数学的操作によって生 成され得る。例えば、図１に示される構造座標は、構造座標の結晶学的な置換、 構造座標の分割、構造座標のセットへの整数的加算または減算、もしくは任意の 上記の組合せにより操作され得る。 あるいは、アミノ酸の変異、付加、置換および／または欠損に起因する結晶構 造における改変、あるいは結晶を構成する任意の成分における他の変化はまた、 構造座標における変化の原因であり得る。このような変化が、元の座標に比較し て受容可能な標準誤差の範囲内である場合、得られる３次元形状は同じであると みなされる。従って、例えば、IMPDHの活性部位結合ポケットに結合するリガン ドはまた、別の結合ポケットに結合すると予測される。この結合ポケットの結合 座標は、受容可能な誤差の範囲内におちつくような形状で定義した。このような 改変複合体またはその結合ポケットはまた、本発明の範囲内である。 それゆえ、種々のコンピューター分析が、分子またはその結合ポケット部分が 、上記のIMPDH結合ポケットのすべてまたは一部に十分に類似しているかどうか を決定するために必要である。このような分析は、現在のソフトウェアアプリケ ーション（例えば、QUANTAバージョン4.1（Molecular Simulations Inc.，San D iego，CA）のMolecular Similarityアプリケーション）において、添付のユーザ ーズガイドに記載されるように実施され得る。 Molecular Similarityアプリケーションは、異なる構造、同じ構造の異なるコ ンフォメーション、および同じ構造の異なる部分の間の比較を可能にする。構造 を比較するためにMolecular Similarityにおいて使用される手順は、４つの工程 に分割される：１）比較される構造をロードする；２）これらの構造における原 子当量を定義する；３）適合操作を実施する；および４）結果を分析する。 各構造は、名称で特定される。１つの構造は、標的として特定される（すなわ ち、固定構造）；すべての残りの構造は、作業構造である（すなわち、可変構造 ）。原子当量は、QUANTA内でユーザーインプットにより定義されるので、本発明 の目的のために、比較される２つの構造間の保存残基のすべてについて等価な原 子を、タンパク質骨格原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ，およびＯ）として本発明者らは定義 する。本発明者らはまた、強固な適合操作のみを考慮する。 強固な適合操作が使用される場合、作業構造は翻訳され、そして回転されて、 標的構造との最適適合を得る。適合作業は、可変構造に適用される最適な翻訳お よび回転を計算するアルゴリズムを使用し、その結果、等価な原子の特定の対に ついての適合の根二乗平均差は絶対最低である。この数は、オングストロームで 与えられ、QUANTAによって報告される。 本発明の目的のために、図１にリストされる構造座標により記載される関連す る骨格原子に重ね合わせた場合に1.5Å未満の保存された残基骨格原子（Ｎ、Ｃ α、Ｃ，Ｏ）の根二乗平均偏差を有する任意の分子もしくは分子複合体、もしく はそれらの結合ポケットは、同一であるとみなされる。より好ましくは、根二乗 平均偏差は、1.0Å未満である。 用語「根二乗平均偏差」は、平均からの偏差の二乗の算術的平均の二乗根を意 味する。これは、傾向または目的からの偏差(deviation)または偏差(variation) を表現する方法である。本発明の目的のために、「根二乗平均偏差」は、IMPDH またはその結合ポケット部分の骨格からのタンパク質の骨格における偏差を、本 明細書に記載のIMPDHの構造座標により定義されるように、定義する。 それゆえ、１つの実際態様によれば、本発明は、結晶において、MPAの約７Å 以内に位置するIMPDHアミノ酸、すなわち、図１に記載のアミノ酸68、69、93、2 73、274、275、276、277、303、322、324、325、326、327、328、330、331、332 、 333、334、337、339、340、364、413、414、415、416、420、439、440、441、44 2、469、および470の構造座標により定義される結合ポケットのすべてまたは一 部を含む、分子もしくは分子複合体、または1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子 からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む該分子もしくは分子複合体の ホモログを提供する。 好ましくは、前記結合ポケットが、結晶において、MPAの約５Å以内に位置す るIMPDHアミノ酸、すなわち、図１に記載のアミノ酸274、275、276、277、303、 322、324、325、326、331、333、414、415、および441の構造座標により定義さ れる結合ポケットであるか、または1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根 二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む該分子もしくは分子複合体のホモログ である。 より好ましくは、前記結合ポケットが、結晶において、MPAの約3.5Å以内に位 置するIMPDHアミノ酸、すなわち、図１に記載のアミノ酸275、276、303、325、3 26、331、333、および441の構造座標により定義される結合ポケットであるか、 または1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポ ケットを含む該分子もしくは分子複合体のホモログである。 別の実施態様によれば、本発明は、結晶において、XMP^*の約７Å以内に位置す るIMPDHアミノ酸、すなわち、図１に記載のアミノ酸67、68、69、70、73、274、 275、276、303、322、323、324、325、326、327、328、329、330、33L332、333 、334、335、364、365、366、367、368、385、386、387、388、389、391、411、 412、413、414、415、416、419、440、441、442、443、500、501、502、503、50 4、505、および506の構造座標により定義される結合ポケットのすべてまたは一 部を含む、分子もしくは分子複合体、または1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子 からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む該分子もしくは分子複合体の ホモログを提供する。 好ましくは、前記結合ポケットが、結晶において、XMP^*の約５Å以内に位置す るIMPDHアミノ酸、すなわち、図１に記載のアミノ酸68、69、70、303、322、326 、327、328、329、330、331、332、333、335、364、365、366、367、385、386、 387、388、411、413、414、415、416、419、441、442、443、501、502、503、お よ び504の構造座標により定義される結合ポケットであるか、または1.5Å以下の該 アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む該分子も しくは分子複合体のホモログである。 より好ましくは、前記結合ポケットが、結晶において、XMP^*の約3.5Å以内に 位置するIMPDHアミノ酸、すなわち、図１に記載のアミノ酸68、70、322、328、 ３29、331、332、335、364、366、387、388、411、413、414、415、441、442、5 01、および502の構造座標により定義される結合ットであるか、または１.5Å以 下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む該 分子もしくは分子複合体のホモログである。 別の実施態様によれば、本発明は、結晶において、MPAもしくはXMP^*のいずれ かの約７Å以内に位置するIMPDHアミノ酸、すなわち、図１に記載のアミノ酸67 、68、69、70、73、93、273、274、275、276、277、303、322、323、324、325、 326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、339、340、364、36 5、366、367、368、385、386、387、388、389、391、411、412、413、414、415 、416、419、420、439、440、441、442、443、469、470、500、501、502、503、 504、505、および506の構造座標により定義される結合ポケットのすべてまたは 一部を含む、分子もしくは分子複合体、または1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原 子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む該分子もしくは分子複合体 のホモログを提供する。 好ましくは、前記結合ポケットが、結晶において、MPAもしくはXMP^*のいずれ かの約５Å以内に位置するIMPDHアミノ酸、すなわち、図１に記載のアミノ酸68 、69、70、274、275、276、277、303、322、324、325、326、327、328、329、33 0、331、332、333、335、364、365、366、367、385、386、387、388、411、413 、414、415、416、441、442、443、501、502、503、および504の構造座標により 定義される結合ポケットであるか、または1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子か らの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む該分子もしくは分子複合体のホ モログである。 より好ましくは、前記結合ポケットが、結晶中のMPAもしくはXMP^*のいずれか の約3.5Å以内に位置するIMPDHアミノ酸、すなわち、図１に記載のアミノ酸68、 70、275、276、303、322、325、326、328、329、331、332、333、335、364、366 、387、388、411、413、414、415、441、442、501、および502の構造座標、＋／ −1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均により定義される。 さらにより好ましいのは、図１における構造座標の全セットにより定義される 分子もしくは分子複合体、＋／−1.5Å以下の該アミノ酸の保存された骨格原子 からの根二乗平均である。代替のより好ましい本発明の実施態様は、IMPDHのア ミノ酸１〜514、XMP^*、およびMPAを含む分子複合体である。 IMPDH/XMP^*/MPA複合体またはその結合ポケットもしくはそのホモログについて 生成された構造座標を使用するために、それらを３次元形状に変換することがと きに必要である。これは、市販のソフトウェアの使用により達成される。このソ フトウェアは、構造座標のセットから分子またはその一部の３次元グラフィック 表示をし得る。 それゆえ、本発明の別の実施態様によれば、前記のデータを使用するための命 令がプログラムされた機械を使用する場合、上記の本発明の分子もしくは分子複 合体のいずれかのグラフィック３次元表示を表し得る、機械で読み込み可能なデ ータでコードされるデータ記憶物質を含む機械読み取り可能記憶媒体が提供され る。 別の実施態様によれば、本発明は、機械読み取り可能データを用いてコードさ れたデータ記憶物質を含む機械読み取り可能データ記憶媒体を提供し、該データ を使用するための命令を用いてプログラムされた機械を使用する場合、該機械読 み取り可能データ記憶媒体は、分子もしくは分子複合体のグラフィック３次元表 示を表示し得、該分子もしくは分子複合体は、結晶中のMPAの約７Å以内に位置 するIMPDHアミノ酸、すなわち、図１に記載のアミノ酸68、69、93、273、274、2 75、276、277、303、322、324、325、326、327、328、330、331、332、333、334 、337、339、340、364、413、414、415、416、420、439、440、441、442、469、 および470、または該分子もしくは分子複合体のホモログの構造座標により定義 される結合ポケットの全てのもしくは任意の部分を含み、ここで、該ホモログは 、1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケッ トを含む。 好ましくは、前記結合ポケットは、結晶中のMPAの約５Å以内に位置するIMPDH アミノ酸、すなわち、図１に記載のアミノ酸274、275、276、277、303、322、32 4、325、326、331、333、414、415、および441、または前記分子もしくは分子複 合体のホモログの構造座標により定義され、ここで、該ホモログは、1.5Å以下 の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む。 より好ましくは、前記結合ポケットは、結晶中のMPAの約3.5Å以内に位置する IMPDHアミノ酸、すなわち、図１に記載のアミノ酸275、276、303、325、326、33 1、333、および441、または前記分子もしくは分子複合体のホモログ構造座標に より定義され、ここで、該ホモログは、1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子から の根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む。 別の実施態様によれば、本発明は、機械読み取り可能データを用いてコードさ れたデータ記憶物質を含む機械読み取り可能データ記憶媒体を提供し、該データ を使用するための命令を用いてプログラムされた機械を使用する場合、該機械読 み取り可能データ記憶媒体は、分子もしくは分子複合体のグラフィック３次元表 示を表示し得、該分子もしくは分子複合体は、結晶中のXPM^*の約７Å以内に位置 するIMPDHアミノ酸、すなわち、図１に記載のアミノ酸67、68、69、70、73、274 、275、276、303、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、 333、334、335、364、365、366、367、368、385、386、387、388、389、391、41 1、412、413、414、415、416、419、440、441、442、443、500、501、502、503 、504、505、および506、または該分子もしくは分子複合体のホモログの構造座 標により定義される結合ポケットの全てのもしくは任意の部分を含み、ここで、 該ホモログは、1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有す る結合ポケットを含む。 好ましくは、前記結合ポケットは、結晶中のXMP^*の約５Å以内に位置するIMPD Hアミノ酸、すなわち、図１に記載のアミノ酸68、69、70、303、322、326、327 、328、329、330、331、332、333、335、364、365、366、367、385、386、387、 388、411、413、414、415、416、419、441、442、443、501、502、503、および5 04、または前記分子もしくは分子複合体のホモログの構造座標により定義され、 ここで、該ホモログは、1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏 差を 有する結合ポケットを含む。 より好ましくは、前記結合ポケットは、結晶中のXMP^*の約3.5Å以内に位置す るIMPDHアミノ酸、すなわち、図１に記載のアミノ酸68、70、322、328、329、33 1、332、335、364、366、387、388、411、413、414、415、441、442、501、およ び502、または前記分子もしくは分子複合体のホモログの構造座標により定義さ れ、ここで、該ホモログは、1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平 均偏差を有する結合ポケットを含む。 別の実施態様によれば、本発明は、機械読み取り可能記憶媒体を提供し、該機 械読み取り可能データ記憶媒体は、分子もしくは分子複合体のグラフィック３次 元表示を表示し得、該分子もしくは分子複合体は、結晶中のMPAまたはXMP^*の約 ７Å以内に位置するIMPDHアミノ酸、すなわち、図１に記載のアミノ酸67、68、6 9、70、73、93、273、274、275、276、277、303、322、323、324、325、326、32 7、328、329、330、331、332、333、334、335、337、339、340、364、365、366 、367、368、385、386、387、388、389、391、411、412、413、414、415、416、 419、420、439、440、441、442、443、469、470、500、501、502、503、504、50 5、および506、または該分子もしくは分子複合体のホモログの構造座標により定 義される結合ポケットの全てのもしくは任意の部分を含み、ここで、該ホモログ は、1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケ ットを含む。 好ましくは、前記結合ポケットは、結晶中のMPAまたはXMP^*の約５Å以内に位 置するIMPDHアミノ酸の構造座標、すなわち、図１に記載のアミノ酸68、69、70 、274、275、276、277、303、322、324、325、326、327、328、329、330、331、 332、333、335、364、365、366、367、385、386、387、388、411、413、414、41 5、416、441、442、443、501、502、503、および504、＋／−1.5Å以下の該アミ ノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差により定義される。 より好ましくは、前記結合ポケットは、結晶中のMPAまたはXMP^*の約3.5Å以内 に位置するIMPDHアミノ酸、すなわち、図１に記載のアミノ酸68、70、275、276 、303、322、325、326、328、329、331、332、333、335、364、366、387、388、 411、413、414、415、441、442、501、および502、＋／−1.5Å以下の該アミノ 酸 の骨格原子からの根二乗平均偏差により定義される。 さらにより好ましいのは、図１における全てのアミノ酸、＋／−1.5Å以下の 該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差の構造座標により定義される、分子 もしくは分子複合体のグラフィック３次元表示を表示し得る機械読み取り可能デ ータ記憶媒体である。 別の実施態様によれば、機械読み取り可能データ記憶媒体は、上記の図１に記 載の構造座標のフーリエ変換を含む機械読み取り可能データの第一のセットを用 いてコードされるデータ記憶物質を含み、該データを使用するための命令を用い てプログラムされた機械を使用する場合、該第一のセットは、機械読み取り可能 データの第二のセットと対応する構造座標の少なくとも一部を決定するために、 分子もしくは分子複合体のＸ線回折パターンを含む機械読み取り可能データの第 二のセットと組み合わせられ得る。 図９は、これらの実施例の１つのバージョンを示す。システム10は、中央演算 処理装置（「CPU」）20を含むコンピューター11、作業メモリ22（例えば、RAM（ ランダムアクセスメモリ）または「コア」メモリであり得る）、大容量記憶メモ リ(mass storage memory)24（例えば、１つ以上のディスクドライブまたはCD-RO Mドライブ）、１つ以上の陰極線管（「CRT」）ディスプレイ端末26、１つ以上の キーボード28、１つ以上の入力ライン30、１つ以上の出力ライン40を含み、これ らの全ては従来の双方向システムバス50により相互に接続される。 入力ライン30によりコンピューター11に接続された入力ハードウェア36は、種 々の方法で実行され得る。本発明の機械読み取り可能データは、電話回線または 専用データ回線34により接続されたモデム32の使用を介して入力され得る。ある いはまたはさらに、入力ハードウェア36は、CD-ROMドライブまたはディスクドラ イブ24を含み得る。ディスプレイ端末26と共に、キーボード28もまた、入力装置 として使用され得る。 出力ライン40によりコンピューター11に接続された出力ハードウェア46は、通 常の装置により同様に実行され得る。例として、出力ハードウェア46は、本明細 書中で記載されるQUANTAのようなプログラムを使用して本発明の結合ポケットの グラフィック表示を表示するために、CRTディスプレイ端末26を含み得る。出力 ハードウェアはまた、後の使用のためにシステム出力を保存するために、ハード コピー出力を行い得るようにプリンター42を、またはディスクドライブ24を含み 得る。 操作において、CPU20は、種々の入力および出力装置36、46と連係し、大容量 記憶装置24からデータアクセスならびに作業メモリ22へのおよびここからのアク セスと連係し、そして配列のデータ処理ステップを決定する。多数のプログラム が、本発明の機械読み取り可能データを処理するために使用され得る。このよう なプログラムは、本明細書中に記載されるように薬物発見のコンピューター的方 法を参照して検討される。データ記憶媒体の以下の記載の全体にわたって適切で あるような、ハードウェアシステム10の構成装置の特定の参考文献が含められる 。 図10は、図９のシステム10のようなシステムにより実行され得る機械読み取り 可能データを用いてコードされ得た、磁気データ記憶媒体100の横断面を示す。 媒体100は、片面または両面に、従来のものであり得る適切な基材101および従来 のものであり得る適切なコーティング102を有する、従来のフロッピーディスケ ットまたはハードディスクであり得る。これは、その極性または配向が磁気的に 変化され得る磁区（目に見えない）を含む。媒体100はまた、ディスクドライブ または他のデータ記憶装置24の軸を受けるための開口部（示さない）を有し得る 。 媒体100のコーティング102の磁区は、図９のシステム10のようなシステムによ る実行のために、従来の様式で、本明細書中に記載されるような機械読み取り可 能データをコードするように、極性化されるかまたは配向化される。 図11は、図９のシステム10のようなシステムにより実行され得る、このような 機械読み取り可能データまたは命令のセットを用いてまたコードされ得る光学的 読み取り可能データ記憶媒体110の横断面を示す。媒体110は、従来のコンパクト ディスク読み取り専用メモリ(CD-ROM)、または光学的に読み取り可能でありそし て光磁気的に書き込み可能である光磁気ディスクのような再書き込み可能媒体で あり得る。媒体100は、好ましくは、従来のものであり得る適切な基材111、およ び通常は基材111の片面に従来のものであり得る適切なコーティング112を有する 。 周知であるようなCD-ROMの場合において、コーティング112は、反射的であり そして機械読み取り可能データをコードするために複数のピット113で押印され る(impress)。ピットの配列は、レーザー光をコーティング112の表面に反射させ る(reflect off)ことにより読まれる。好ましくは実質的に透明である保護コー ティング114が、コーティング112の表面上に提供される。 周知であるような光磁気ディスクの場合において、コーティング112は、ピッ ト113を有さないが、レーザ（図示しない）により一定の温度を超えて加熱され た場合にその極性または配向が磁気的に変化され得る、複数の磁区を有する。こ の区の配向は、コーティング112から反射されたレーザー光の偏光を測定するこ とにより読み取られ得る。この区の配列は、上記のようにデータをコードする。 それゆえ、本発明に従って、IMPDHおよびその一部ならびにそれらの構造的に 類似のホモログの３次元構造を表示し得るデータは、構造のグラフィック３次元 表示を表示し得る機械読み取り記憶媒体中に保存される。このようなデータは、 薬物発見のような種々の目的のために使用され得る。 例えば、データによりコードされる構造は、化学物質と会合するその能力につ いて、計算的に評価され得る。IMPDHと会合する化学物質は、IMPDHを阻害し得、 そしてこれは潜在的な候補薬物である。あるいは、データによりコードされる構 造は、コンピューター画面上にグラフィック３次元表示で表示され得る。このこ とは、構造の視覚的検査、ならびに化学物質との構造の会合の視覚的検査を可能 にする。 従って、別の実施態様によれば、本発明は、化学物質が上記の任意の分子もし くは分子複合体と会合する潜在能力を評価するための方法に関する。本方法は以 下の工程を包含する：ａ）計算手段を用いて、化学物質と分子もしくは分子複合 体の結合ポケットとの間の適合操作を行う工程：およびｂ）この適合操作の結果 を分析して、化学物質と結合ポケットとの間の会合を定量化する工程。本明細書 中で使用される用語「化学物質」は、化学化合物、少なくとも２つの化学化合物 の複合体、およびこのような化合物または複合体のフラグメントを意味する。 本発明は、分子設計技術の使用により、IMPDH様結合ポケットに結合可能な化 学物質（阻害化合物を含む）を同定、選択、および設計することを初めて可能に する。 IMPDH上のXMP^*およびMPA結合部位に関する本出願人らの解明は、IMPDH様結合 ポケットのいずれかまたはその両方と相互作用し得る新規な化学物質および化合 物を設計するために必要な情報を、全部または一部について提供する。この解明 はまた、IMPDH様結合ポケットに結合するMPAまたは他の化合物のアナログについ ての構造活性データの評価を可能にする。 このセクションを通じて、物質が、IMPDH様結合ポケットに結合するか、これ と会合するか、またはこれを阻害する能力に関する議論は、物質の特徴のみを参 照する。化合物がIMPDHに結合するかどうかを決定するためのアッセイは、当該 分野で周知である［B．Magasanikら，J ．Biol．Chem.，226，p.339(1957)］。 本発明による、IMPDH様結合ポケットに結合するかまたはこれを阻害する化合 物の設計は、一般的に２つのファクターの考慮を伴う。第１に、この物質は、IM PDH様結合ポケットの一部または全部と物理的および構造的に会合し得なければ ならない。この会合において重要な非共有結合的分子相互作用は、水素結合、フ ァンデルワールス相互作用、疎水的相互作用、および静電的相互作用を含む。 第２に、この物質は、それをIMPDH様結合ポケットと直接会合可能にするコン ホメーションをとり得なければならない。この物質の特定の部分はこれらの会合 に直接関与しないが、この物質のこれらの部分はなお、分子の全体のコンホメー ションに影響を及ぼし得る。次いで、これが効力に重大な影響を有し得る。この ようなコンホメーション要件は、結合ポケットの全部または一部に関連する化学 物質の３次元構造全体および配向、あるいはIMPDH様結合ポケットまたはそのホ モログと直接相互作用するいくつかの化学物質を包含する物質の官能基間の空間 的間隔（spacing）を含む。 IMPDH様結合ポケットに対する化学物質の潜在的な阻害効果または結合効果は 、その実際の合成および試験の前にコンピューターモデリング技術の使用により 分析され得る。所与の物質の理論的構造が、その物質とIMPDH様結合ポケットと の間での不十分な相互作用および会合を示唆するのであれば、物質の試験は除外 される。しかし、コンピューターモデリングが強い相互作用を示すのであれば、 次いで、この分子は合成され得、そしてIMPDH様結合ポケットへのその結合能力 について試験され得る。これは、実施例７および８に記載されるアッセイを用い て、この分子のIMPDHを阻害する能力を試験することにより達成され得る。この よう にして、効力のない化合物の合成は避けられ得る。 IMPDH様結合ポケットの潜在的な阻害剤は、化学物質またはフラグメントが、I MPDH様結合ポケットとのそれらの会合能力についてスクリーニングされ、そして 選択される一連の工程により計算的に評価され得る。 当業者は、IMPDH様結合ポケットと会合する能力について化学物質またはフラ グメントをスクリーニングするためのいくつかの方法のうちの１つを使用し得る 。このプロセスは、例えば、図１のIMPDH構造座標または機械読み取り可能記憶 媒体から生じる同様の形状を定義する他の座標に基づく、コンピューター画面上 でのIMPDH様結合ポケットの視覚的検査により開始され得る。次いで、選択され たフラグメントまたは化学物質を、上記に定義される結合ポケット内に、種々の 配向で配置させ得るか、またはドッキングさせ得る。ドッキングは、Quantaおよ びSybylのようなソフトウェア、続いて、CHARMMおよびAMBERのような標準的な分 子力学的力場によるエネルギー最小化および分子動力学を用いて達成され得る。 専門のコンピュータープログラムもまた、フラグメントまたは化学物質を選択 するプロセスの助けとなり得る。これらは、以下を含む： １．GRID（P.J．Goodford，「A Computational Procedure for Determining Ene rgetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecu les」，J ．Med．Chem.，28，849-857頁(1985)）。GRIDは、Oxford University， Oxford，UKから入手可能である。 ２．MCSS（A．Mirankerら，「Functionality Maps of Binding Sites:AMultiple Copy Simultaneous Search Method」Proteins:Structure ，Function and Genet ics ，11，29-34頁(1991)）。MCSSは、Molecular Simulations，San Diego，CAか ら入手可能である。 ３．AUTODOCK（D.S．Goodsellら，「Automated Docking of Substrates to Prot eins by Simulated Annealing」，Proteins:Structure ，Function，and Genetic s ，8，195-202頁(1990)）。AUTODOCKは、Scripps Research Institute，La Joll a，CAから入手可能である。 ４．DOCK（I.D．Kuntzら，「A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand I nteractions」，J ．Mol．Biol.，161，269-288頁(1982)）。DOCKは、Universit y of California，San Francisco，CAから入手可能である。 一旦、適切な化合物質またはフラグメントが選択されると、それらは、単一化 合物または複合体に組み立てられ得る。構築に先だって、IMPDHの構造座標に関 連してコンピューター画面上に表示される３次元イメージ上で、互いのフラグメ ントの関連性の視覚的検査が行われ得る。これに続き、QuantaまたはSybyl[Trip os Associates，St．Louis，MO]のようなソフトウェアを用いるマニュアルでの モデル構築が行われる。 個々の化学物質またはフラグメントを連結させる際に当業者を補助する有用な プログラムは、以下を含む： １．CAVEAT（P.A．Bartlettら、「CAVEAT:A Program to Facilitate the Struct ure-Derived Design of Biologically Active Molecules」（Molecular Recogni tion in Chemical and Biological Problems ，Special Pub.，Royal Chem．Soc. ，78，182-196頁(1989)）;G，LauriおよびP.A．Bartlett，「CAVEAT:a Program to Facilitate the Design of Organic Molecules」，J ．Comput．Aided Mol．D es. ，8，51-66頁(1994)）。CAVEATは、University of California，Berkeley，C Aから入手可能である。 ２．ISIS（MDL Information Systems，San Leandro，CA）のような3Dデータベー スシステム。この分野は、Y.C．Martin，「3D Database Searching in Drug Des ign」，J ．Med．Chem.，35，2145-2154頁(1992)において概説される。 ３．HOOK(M.B．Eisenら，「HOOK:AProgram for Finding Novel Molecular Archi tectures that Satisfy the Chemical and Steric Requirements of a Macro mo lecule Binding Site」，Proteins:Struct. ，Funct.，Genet.，19，199-221頁(1 994)）。HOOKは、Molecular Simulations，San Diego，CAから入手可能である。 上記のように一度に１つのフラグメントまたは化学物質を段階的様式でIMPDH 様結合ポケットの阻害剤として構築することを進める代わりに、阻害性または他 のIMPDH結合化合物は、空の結合部位を使用するか、または必要に応じていくつ かの既知の阻害剤の部分を含めるかのいずれかで、全体的にまたは「新規に」設 計され得る。以下を含む、多くの新規リガンド設計方法が存在する： １．LUDI（H.-J．Bohm，「The Computer Program LUDI:A New Method for the D e Novo Design of Enzyme Inhibitors」，J ．Comp．Aid．Molec．Design，6 61- 78頁(1992)）。LUDIは、Molecular Simulations Incorporated，San Diego，CA から入手可能である。 ２．LEGEND（Y．Nishibataら，Tetrahedron，47，8985頁(1991)）。LEGENDは、M olecular Simulations Incorporated，San Diego，CAから入手可能である。 ３．LeapFrog（Tripos Associates，St．Louis，MOから入手可能である）。 ４．SPROUT（V．Gilletら，「SPROUT:A Program for Structure Generation」，J ．Comput．Aided Mol．Design ，7，127-153頁(1993)）。SPROUTは、University of Leeds，UKから入手可能である。 他の分子モデリング技術もまた、本発明に従って使用され得る［例えば、N.C. Cohenら，「Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistr y」，J ．Med．Chem.，33，883-894頁(1990)を参照のこと；M.A．NaviaおよびM.A ．Murcko，「The Use of Structural Information in Drug Design」，Current Op inions in Structural Biology ，2，202-210頁(1992)もまた参照のこと；L.M.Ba lbesら，「A Perspective of Modern Methods in Computer-Aided Drug Design 」，(Reviews in Computational Chemistry，vol．5，K.B．LipkowitzおよびD.B ．Boyd編，VCH，New York，337-380頁(1994)）;W.C．Guida，「Software For Str ucture-Based Drug Design」，Curr ．Opin．Struct．Biology.，4，777-781頁(1 994)］。 一旦上記の方法により化合物が設計されるかまたは選択されると、その物質が IMPDH結合ポケットに結合し得る効率が、計算による評価により試験され、そし て最適化され得る。例えば、有効なIMPDH結合ポケット阻害剤は、好ましくは、 その結合状態と遊離状態との間に相対的に小さなエネルギー差（すなわち、結合 の小さな変形エネルギー）を示さなければならない。従って、最も効率的なIMPD H結合ポケット阻害剤は、好ましくは、約10kcal/モル以下（より好ましくは、７ kcal/モル以下）結合の変形エネルギーを用いて設計されるべきである。IMPDH結 合ポケット阻害剤は、全結合エネルギーにおいて類似する１つより多いコンホメ ーションで結合ポケットと相互作用し得る。これらの場合、結合の変形エネルギ ーは、遊離物質のエネルギーと阻害剤がタンパク質に結合するとき観察されるこ れらのコンホメーションの平均エネルギーとの間の差であると考えられる。 IMPDH結合ポケットに結合するとして設計または選択される物質は、その結合 状態において、好ましくは、標的酵素および周囲の水分子との静電的斥力相互作 用がないように、計算によりさらに最適化され得る。このような非相補的静電的 相互作用は、電荷−電荷斥力相互作用、双極子−双極子斥力相互作用および電荷 −双極子斥力相互作用を含む。 特定のコンピューターソフトウェアは、化合物変形エネルギーおよび静電的相 互作用を評価する分野において入手可能である。このような使用のために設計さ れたプログラムの例として、以下が挙げられる：Gaussian 94，revision C（M.J . tum Chemistry Program Exchange，Indiana University）。これらのプログラム は、例えば、Silicon Graphicsワークステーション（例えば、「IMPACT」グラフ ィクスを備えるIndigo²）を用いて実行され得る。他のハードウェアシステムお よびソフトウェアパッケージは当業者に公知である。 本発明により可能な別のアプローチは、IMPDH結合ポケットに全体または部分 的に結合し得る化学物質または化合物についての小分子データベースの計算的な スクリーニングである。このスクリーニングにおいて、結合部位へのこのような 物質の適合の質は、形状的相補性または見積もられた相互作用エネルギーのいず れかにより判定され得る［E.C．Mengら，J ．Comp．Chem.，16，505-524頁(1992) ］。 従って、MPA結合部位と直接会合することによりIMPDHを阻害する化合物が、本 発明により可能となる。１つの実施態様では、このような化合物は、MPAの二環 式環部分の代替物およびIMPDHとの親和性を提供する他の官能性を含む。好まし くは、これらの化合物は、結合XMP^*中間体および１以上の以下のIMPDH残基との ファンデルワールス接触を生じ得る実質的に疎水性のコアを含む：Asp 274、Ser 275、Ser 276、Gln 277、Asn 303、Arg 322、Gly 324、Met 325、Gly 326、Thr 333、Met 414、Gly 415、およびGln 441、そしてさらに、その実質的に疎水性 のコア上のリンカーを介して置換される１以上の原子（これらの原子は、Asp274 、Thr 333、Gln 441、Gly 326のような残基またはIMPDH上の近傍の残基と、１以 上の水素結合を形成し得る）を含む。好ましくは、これらのリンカーは、以下の 残基とのさらなるファンデルワールス相互作用を形成する：His 93、Gly 251，T hr 252、His 253、Asp 256、Arg 259、Leu 273、Phe 282、およびGln 283または 近傍の残基。より好ましくは、このような化合物は、10kcal/mol以下のひずみエ ネルギーを有する。さらにより好ましくは、これらの化合物は、３未満の第２級 アミン結合を含む。最も好ましくは、これらの化合物は、1000未満の分子量を有 する。 例えば、他の実施態様によれば、これらの化合物は、式(Ｉ)のものである： ここで： Aは、−C(O)−または−S(O)₂−である； Bは、−O−または−N(R¹)−である； Dは、−CH₂−または−CH₂CH₂−である； Eは、C(OH)、C(SH)、C(NH₂)、C(NHR¹)、C(F)、Nおよび−N(O^-)−からなる群か ら選択される； Gは、C_1-5直鎖または分枝鎖アルキル基またはC_1-5直鎖または分枝鎖アルケニ ル基またはアルキニル基であり、ここで、任意のCH₂基は、必要に応じて、−O− または−N(H)−で置き換えられる； Jは、CH₂、O、N、S、および５〜６員の単環式の環系からなる群から選択され 、この環系は、−O−、−N−および−S−からなる群から選択された０個〜４個 のヘテロ原子を含有し、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合を含有し 、 ここで、ヘテロ原子が少なくとも１個の−CH₂−に結合されるとき、この−CH₂− は、必要に応じて、＝0で置換されている； Kは、C_1-5直鎖または分枝鎖アルキル基またはC_1-5直鎖または分枝鎖アルケニ ル基またはアルキニル基であり、ここで、このアルキル基、アルケニル基または アルキニル基の任意のCH₂は、必要に応じて、−O−、−N(H)−または−S−で置 き換えられる； Lは、−R¹、−OH、−OR¹、−NH₂および−N(H)(R¹)からなる群から選択される ； Mは、C_0-3直鎖または分枝鎖アルキル基またはC_2-5直鎖または分枝鎖アルケニ ル基である； Nは、−OH、−OR¹、−NH₂、−N(H)(R¹)、−CO₂H、−F、−Cl、−S(O₂)NH₂、− S(O₂)N(H)(R¹)、−NO₂および−CNからなる群から選択される； 但し、Mが−CH₂−のとき、Nは、−OHではない； Uは、Kのアルキル炭素原子に結合した置換基であり、−OH、−OR¹、−NH₂、− N(H)(R¹)、−CO₂H、−F、−S(O₂)NH₂、−S(O₂)N(H)(R¹)、−NO₂および−CNから なる群から選択される；そして R₁は、C_1-4直鎖または分枝アルキルである。 他の実施態様では、本発明は、式(II)の化合物を提供する： ここで、 A、B、E、G、J、KおよびUは、式(Ｉ)にて上で定義したものと同じである； 各Dは、独立して、−CH₂−または−CH₂CH₂−から選択される； Qは、−O−、−N(H)−、−N(R¹)−および−CH₂−からなる群から選択される； そして Tは、−CH₂−、−C(O)−および−S(O₂)−からなる群から選択される。 他の実施態様では、本発明は、式(III)の化合物を提供する： ここで： A、B、D、E、G、J、KおよびUは、式(Ｉ)にて上で定義のものと同じである； 各Dは、式(II)にて上で定義のものと同じである； Qは、−O−、−N(H)−、−N(R¹)−および−CH₂−からなる群から選択される； そして Tは、−CH₂−、−C(O)−および−S(O₂)−からなる群から選択される。 本明細書で使用される用語「−SO₂−」および「−S(O)₂−」は、そうでないこ とが明白に述べられていないなら、スルホンまたはスルホン誘導体(すなわち、 この両方のSに連結された付加基)を意味し、スルフィネートエステルではない。 用語「免疫抑制剤」は、免疫応答阻害活性を有する化合物または薬剤を意味す る。このような薬剤の例には、シクロスポリンＡ、FK506、ラパマイシン、レフ ルノミド、デオキシスペルグアリン、プレドニゾン、アザチオプリン、ミコフェ ノール酸モフェチル、OKT3、ATAGおよびミゾリビンが包含される。 IMPDH媒介疾患とは、このIMPDH酵素が、その疾患の代謝経路において、規制的 な役割を果たす任意の疾患状態を意味する。IMPDH媒介疾患の例には、移植拒絶 および自己免疫疾患(例えば、リウマチ様関節炎、多発硬化症、若年性糖尿病、 喘息および炎症性腸疾患)ならびに、癌、ウイルス性複製疾患および血管疾患が 包含される。 本発明の薬剤組成物は、式Ｉ〜IIIの化合物またはそれらの薬学的に受容可能 な塩；免疫抑制剤、抗癌剤、抗ウイルス剤または抗血管過剰増殖化合物から選択 した追加薬剤；および任意の薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたは ビヒクルを含有する。本発明の別の組成物は、式Ｉ〜IIIの化合物またはそれら の薬学的に受容可能な塩；および薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントま たはビヒクルを含有する。このような組成物は、必要に応じて、免疫抑制剤、抗 癌剤、抗ウイルス剤または抗血管過剰増殖化合物から選択された追加薬剤を含有 できる。 本発明の薬剤組成物は、経口、非経口、吸入スプレー、局所、直腸、鼻腔、口 内、膣、または移植されたリザーバー(reservoir)により投与され得る。経口投 与または注射による投与が好ましい。本発明の薬剤組成物は、任意の従来の非毒 性薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、またはビヒクルを含有し得る。 いくつかの場合には、処方物のpHは、薬学的に受容可能な酸、塩基、または緩衝 液を用いて調節され得、処方された化合物またはその送達形態の安定性を増強し 得る。本明細書で用いられる、用語非経口は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、動 脈内、滑膜内、胸骨内、胞膜内、病変内局注、および頭蓋内注射または注入技術 を包含する。 １日当たり約0.01mg／kg体重と約100mg／kg体重との間、好ましくは１日当た り約0.5mg／kg体重と約75mg／kg体重との間の本明細書で記載のIMPDH阻害化合物 の投与量レベルが、IMPDH媒介疾患の予防および治療のための単一療法において 有用である。代表的には、本発明の薬剤組成物は、１日当たり約１回〜約５回投 与されるか、あるいは連続的な注入物として投与され得る。このような投与は、 慢性治療または急性治療で用いられ得る。単一の投与形態を与えるためにキャリ ア物質と組み合わせられ得る活性成分量は、治療される宿主および特定の投与方 法に応じて変化する。代表的な調製物は、約５％〜約95％（w/w）の活性化合物 を含有する。好ましくは、このような調製物は、約20％〜約80％の活性化合物を 含有する。 本発明の組成物が、式Ｉ〜IIIのIMPDH阻害剤および１種またはそれ以上の追加 の治療剤または予防剤の組合せを含有する場合、このIMPDH阻害剤および追加薬 剤の両方は、単一療法レジメンで通常投与される投薬量の約10〜100％の間、さ らに好ましくは、約10〜80％の間の投薬量レベルで、与えられるべきである。 図１で示した構造座標はまた、他の結晶化分子もしくは分子複合体についての 構造的な情報を得る際に、補助するのに使用できる。これは、任意の多くの分子 置換を含む周知技術により、達成できる。 従って、他の実施態様では、本発明は、構造が未知の分子もしくは分子複合体 についての構造的な情報を得るために、分子置換を利用する方法を提供する。該 方法は、以下の工程を包含する： a) 未知の構造の該分子もしくは分子複合体を結晶化する工程； b) 該結晶化分子もしくは分子複合体から、Ｘ線回折パターンを得る工程；お よび c) 図１で示した構造座標の少なくとも一部を、該Ｘ線回折パターンに適用し て、構造が未知の該分子もしくは分子複合体の３次元電子密度マップを得る工程 。 分子置換を使用することにより、本発明で提供される(そして図１で示す)よう なIMPDH/XMP^*/MPA複合体の構造座標の全部または一部は、このような情報をabin itio法で決定する試みよりも迅速かつ効率的に、構造が未知の結晶化分子もしく は分子複合体の構造を決定するのに使用され得る。 分子置換は、未知の構造の位相の正確な見積もりを提供する。位相は、直接決 定できない結晶構造を解明するのに使用する式の因子である。分子置換以外の方 法によって、位相の正確な値を得ることは、概算および洗練(refinement)の反復 サイクルを含む多くの時間を要するプロセスであり、そして結晶構造の解明を非 常に妨げる。しかしながら、少なくとも相同部分を含むタンパク質の結晶構造が 解明されたとき、既知構造の位相は、未知構造の位相の申し分のない見積もりを 提供する。 それゆえ、この方法は、構造が未知の分子もしくは分子複合体の結晶の観察さ れたＸ線回折パターンを最もよく説明するよう、未知の分子もしくは分子複合体 の結晶の単位格子内に、図１に記載のIMPDH/XMP^*/MPA複合体の関連部分を配向し 位置を決めることによって、構造座標が未知の分子もしくは分子複合体の予備モ デルを作成することを包含する。次いで、位相がこのモデルから計算され、そし て観察されたＸ線回折パターン振幅と組み合わせて、座標が未知の構造の電子密 度マップを作成し得る。今度は、これは、任意の周知のモデル構築および構造洗 練技術に供され、未知の結晶化分子もしくは分子複合体の最終的で正確な構造を 提供し得る[E．Lattman、「Use of the Rotation and Translation Functions」 、in Meth ．Enzymol.、115、55〜77頁(1985);M．G．Rossmann編、「The Molecul ar Replacement Method」、Int ．Sci．Rev．Ser.、No．13、Gordon & Breach、N ew York(1972)]。 IMPDH/XMP^*/MPA複合体の任意の部分と充分に相同である任意の結晶化分子もし くは分子複合体の任意の部分の構造は、この方法により解明され得る。 好ましい実施態様では、分子置換方法は、分子もしくは分子複合体についての 構造的な情報を得るのに使用され、ここで、この複合体は、少なくとも１個のIM PDHサブユニットまたはホモログを含有する。 本発明により提供されるIMPDHの構造座標は、IMPDHまたはIMPDH複合体の他の 結晶形態の構造を解明するのに、特に有用である。 さらに、本発明により提供されるIMPDHの構造座標は、IMPDH変異体の構造(こ れは、必要に応じて、化学物質との共複合体で、結晶化されていてもよい)を解 明するのに有用である。次いで、一連のこのような複合体の結晶構造は、分子置 換により解明され、そして野生型IMPDHの結晶構造と比較され得る。この酵素の 種々の結合部位内での潜在的な修飾部位は、このように同定され得る。この情報 は、IMPDHと化学物質または化合物との間の最も効率的な結合相互作用(例えば、 増大した疎水性相互作用)を決定するさらなる手段を提供する。 この構造座標はまた、種々の化学物質と共複合体化したIMPDHまたはIMPDHホモ ログの結晶構造を解明するのに、特に有用である。このアプローチは、IMPDH阻 害剤候補を含む化学物質とIMPDHとの間の相互作用のための最適部位の決定を可 能とする。例えば、異なるタイプの溶媒に曝露した結晶から回収した高分解能Ｘ 線回折データは、各タイプの溶媒分子が存在する場所の決定を可能とする。次い で、これらの部位に堅く結合する小分子が設計および合成され、そしてそれらの IMPDH阻害活性について試験され得る。 上で述べた全ての複合体は、周知のＸ線回折技術を用いて研究され得、そして ular Simulations、Inc.により配布；例えば、BlundellおよびJohnson、上記；M eth．Enzymol.、114および115巻、H．W．Wyckoffら著、Academic Press(1985)を 参照のこと])を用いて、R値約0.20以下までの分解能1.5〜3ÅのＸ線データと対 比して、洗練され得る。それゆえ、この情報は、既知のIMPDH阻害剤を最適化す るのに、そしてより重要には、新規のIMPDH阻害剤を設計するのに、使用され得 る。 本発明の他の実施態様では、IMPDH/XMP^*/MPA結晶を調製する方法が提供され、 該方法は、以下の工程を包含する： a. IMPDHおよびIMPの間で複合体を形成する工程； b. 工程aで形成された複合体に、NADおよびMPAを添加する工程； c. 該IMPDH/XMP^*/MPA複合体の蓄積をモニターする工程；および d. MePの存在下にて、工程cで形成された複合体を結晶化する工程。 本発明がさらに充分に理解されるために、以下の実施例を示す。これらの実施 例は、例示の目的のみであり、いずれの様式でも、本発明の範囲を限定するもの としては解釈されない。 実施例１ 結晶化のためのIMPDHの精製およびIMPDH/XMP^*/MPA複合体の調製 チャイニーズハムスターのIMPDH II型を、以下の改良を加えた公開方法[H．J. Gilbertら、Biochem ．J.、183、pp．481〜494(1979)；およびT．Ikegamiら、Lif e Sci. 、40、pp．2277〜2282(1987)]により精製した。典型的には、過剰発現タ ンパク質を含むE．coli細胞ペースト100ｇを、５容量の緩衝液a(50mM Tris-HCl 、300mM KCl、２mM EDTA、10mM BME、1.5M尿素、４℃でpH8.0)に懸濁させた。プ ロテアーゼ阻害剤を添加し(0.2mM PMSF、およびペプスタチン、ロイペプチンお よびE-64のそれぞれ１mg/リットル)、これらの細胞を、約４℃で、マイクロフル イダイザー(Microfluidics Corporation)で溶解させた。４℃で40分間にわたり 、45,000×ｇでの遠心分離により、細胞壊死片を取り除いた。４℃で撹拌しつつ 、その上澄みに、上澄み100mlあたり25ｇの最終濃度まで、結晶性硫酸アンモニ ウムをゆっくりと添加した。この硫酸アンモニウム溶液を、４℃で１時間安定化 させ、それから、上記のようにして、遠心分離により、沈殿したIMPDHを採取し た。この硫酸アンモニウムペレットを、緩衝液B(50mM Tris-HCl、300mM KCl、２ mM EDTA、10mM BME、10％グリセロール、４℃でpH8.0)に再懸濁し、そしてIMP-S epharose(これは、実質的にGilbertら(1979)により記載のようにエポキシ活性化 Sepharose(Pharmacia)から調製した)のカラム(５×12.5cm)に充填した(残りを− 70℃で保存しつつ、一度に20％)。このアフィニティーカラム を、カラムの容量の４倍以上の緩衝液Ｂで洗浄し、次いで、酵素を、10mM IMPを 含む同じ緩衝液(pHは、KOHを用いて、４℃で8.0に再調整した)で、このカラムか ら溶出した。 この時点で、タンパク質は、SDS PAGEにより判定したところ、純度が95％より 高いと思われたが、サイズ排除クロマトグラフィーおよび光散乱分析を組み合わ せは、このタンパク質の約30％が、高分子量集塊物として存在していることを示 した。IMPDH含有画分をプールし、そして限外濾過により、約５mg/ml(50ml)まで 濃縮し、次いで、Sephacryl S-300(Pharmacia)サイズ排除カラム(５×90cm、４ ℃で、緩衝液Ｂ中にて、３ml/分で溶出する)上で分別した。この工程は、集塊タ ンパク質、およびアフィニティーマトリックスから酵素を溶出するのに使用した 事実上全てのIMPを取り除いた。集塊したIMPDHは、再濃縮では、再び現れること はなかったが、一部の精製試料は、依然として、少量のIMPを含有していた。必 要なとき、残留IMPを、完全な透析により取り除いた。SDS PAGEおよびN-末端配 列の分析により、このIMPDH試料は、この時点では、99％より高い純度であるこ とが明らかとなった。 結晶化研究の試料は、以下のようにして製造した。精製したapo-IMPDH(２〜４ mg/ml)100ミリグラムを、30KDa MWの遮断膜を用いて、撹拌した限外セルに入れ た。MeP中の100mM MPAのストックを、２mM MPAの最終濃度まで添加した。次いで 、IMPDHプロトマーよりも２倍モル過剰で、IMPおよびNADを添加し、これらの溶 液を、室温で30分間にわたって、平衡化した。試料を濃縮し、そして高速キャピ ラリー電気泳動法(HPCE)により、IMP、NADまたはNADHが検出できなくなるまで、 ２mM MPAを含有する新鮮な緩衝液Ｂに交換した。完全に阻害した試料を20〜60mg /mlまで濃縮し、採取し、そして４℃で20分間にわたって、45,000×ｇで遠心分 離した。結晶化実験での使用まで、100mlのアリコートを、−70℃で保存した。 実施例２ IMPDH/XMP^*/MPA 複合体の結晶化 緩衝液Ｂ中で20mg/mlのタンパク質を、４：２の比で、レザバー(10％ポリエ チレングリコール6000、1M LiCl、100mMモルホリノエチルスルホン(MES)酸、5.4 ％ MeP(v/v)、36mM BME、pH5.88)と混合し、そしてこのレザバー溶液を22℃で放 置したとき、蒸気拡散により、阻害IMPDHの結晶が成長した。結晶は72時間以内 に成長して、近似寸法が0.15mm×0.15mm×0.5mmのブロックが形成した。この結 晶は、空間群P4に属し、単位格子寸法ａ＝ｂ＝110.6Å、ｃ＝111.0Åおよび角度 α＝β＝γ＝90°を有していた。この結晶の非対称単位あたり、２個のIMDPH/XM P^*/MPA複合体が存在している。溶解した結晶の分析は、その初期複合体溶液と同 じタンパク質組成を示した。 MePの添加は、うまく回折する結晶を得る際に重要であり、引き続いて、この 結晶内の２個のフェニルアラニン残基間に位置する電子密度マップで確認された 。チャイニーズハムスター形態のIMPDHを使用することもまた、重要であった。 ヒトのII型IMPDHは、チャイニーズハムスターのII型IMPDHの充分に回折する結晶 を生じる条件下では、充分に回折する結晶を生じなかった。 当業者は、上記結晶化条件を変えても、依然として、構造分析に適当なIMPDH またはIMPDH複合体またはホモログの結晶を生成できることを理解する。このよ うな変更は、単独でまたは組み合わせて使用でき、これには、１mg/mlと100mg/m lの間の最終タンパク質複合体濃度；沈殿剤に対するIMPDH/XMP^*/MPA複合体の任 意の組合せ比；１mMと500mMとの間のpH緩衝液濃度；０mMと100mMの間のBMEまた は他のイオウ低減剤の任意の濃度；4.0と9.0の間のpH範囲；１％と25％(ｇ/100m l)の間のポリエチレングリコール(PEG)濃度；2000と20000の間のPEG重量；50mM と2000mMの間のLiClまたは他の塩の濃度；界面活性剤の任意の濃度またはタイプ ；−５℃と30℃の間の任意の温度；およびこれらの条件またはそれらの変形を用 いたバッチ法、液体ブリッジ法または透析法によるIMPDH/XMP^*/MPA複合体の結晶 化が挙げられる。 実施例３ IMPDH/XMP^*/MPA 複合体の結晶構造の決定 結晶を、重原子誘導化またはネイティブデータ収集の前に、10％ PEG 6000、1 M LiCl、100mM MES、９％グリセロール、３％ MeP、２mM MPA、pH5.88で平 衡化し、次いで、−165℃でのＸ線データ収集の直前に、このストックの15％グ リセロールバージョンに移した。50kVおよび100mAで操作するRigaku RU200回転 アノード発生器(Molecular Structure Corp.、Houston、TX)に取り付けたRigaku R-AXIS IIC蛍光体画像形成領域検出器上の振動写真により、凍結結晶上にて、 ネイティブおよび誘導データセットを集めた。測定した強度を、業者(Molecular Structure Corp.、Houston、TX)から提供されるソフトウェアを用いて、積算し 、評価し、そして併合した。35個の重原子試薬を試験し、IMPDHと結合しIMPDH/X MP^*/MPA複合体の電子密度マップの算出用の初期位相角を決定するのに有用な化 合物として、K₂WO₄、PCMBS、PbCl、EuCl₃、tet-HgCl、フラン、ビス-Hgビチオフ ェン、およびビス-Hgベンゾフランを確認した。 重原子位置は、PHASESを用いたPatterson合成または差Fourier合成で位置決め し、そして確認した[W．Fureyら、S ．Am．Cryst．Assoc．Mtg．Summ．18、p．73 (1990)]。重原子パラメーターをPHASESで洗練し、そして多重同型置換(MIR)位相 を算定するのに使用した。メリットの平均形状は、0.65〜4.0Åであった。MIR位 相を、溶媒平坦化のサイクル(B．C．Wang、Meth ．Enzym．115、pp．90〜112(198 5))、およびSIGMAAを用いた位相の組合せ(R．J．Reed、Acta Crystallogr.、A42 、pp．140〜149(1986))により、改良し、そして拡張した。その初期電子密度マ ップにより、バレルコアのαヘリックスおよびβストランドが明らかになったが 、各サブユニット内の挿入ドメイン(残基110〜224)は、充分には見えなかった。 IMPDH/XMP^*/MPAに対する分子モデルを、QUANTA(Quanta version 4.1、Molecular Simulations Inc.、Burlington MA、1995)を用いて、電子密度マップに構築し た。このモデルから算出した位相への切り換えを行うことができるまで、XPLOR- 3.1を用いたモデル構築、位置洗練および模擬アニーリングのサイクル(A．T．Br unger、X-PLOR(Version 3.1)、Yale Univ.、New Haven(1993))、および位相の組 合せを行った。現在のモデルは、チャイニーズハムスターIMPDHの由来アミノ酸 配列、および重原子置換の化学的性質と一致している。Ｒ因子は、８Åと2.6Å の間の解像度で、Ｘ線データに対して21.7％であり、理想的な結合長および角度 からの２乗平均偏差は、それぞれ、0.007Åおよび1.63°である。Patterson合成 、Fourier合成、Ｒ因子、メリット形状、多重同型置換、および先に定義 していないこの節での他の語句の定義は、T.L．BlundellおよびL．N．Johnson、Protein Crystallography 、Academic Press(1976)で見出され得る。さらなるデ ータの収集および構造決定の統計は、表１に挙げる。 実施例４ IMPDH に対するIMPおよびMPA結合 結晶構造は、XMP^*、MPAおよびIMPDHの間の相互作用(これは、これらのリガン ドの堅い結合を生じる)を明らかにする。この構造は、IMPのC2炭素とCys 331の イオウ原子との間で共有結合が形成されて(図５〜７)、酸化IMPチオイミデート 中間体(XMP^*)を生じることを明らかにする。Cys 331はまた、NADが存在するとき 、[8-¹⁴C]IMPと共有結合を形成し[J．A．Huete-Perezら、Biochemistry、34、pp ．13889〜13894(1995)]、そしてIMPDHを不活性化する6-Cl-IMPのプリン環と共有 結合を形成する[L．C．Antoninoら、Biochemistry、33、pp．1760〜1765(1994)] ことを明らかにした。同時に、これらの観察は、触媒作用におけるこの残基の重 要な役割を確認する。 XMP^*と酵素との間で、多くの別の相互作用が観察されている(図５〜７)。XMP^* ホスフェートは、Ser 329、Gly 366、Gly 387およびSer 388のアミド窒素原子お よびSer 329およびTyr 411の側鎖水酸基と水素結合を形成する。Gly 387に近接 した２個の水分子はまた、リン酸部分の水素結合距離内にある。ヒポキサンチン 環は、IMPDHと３個の水素結合を形成する。第一の水素結合は、Met 414のアミド 窒素とN7窒素の間にあり、第二の水素結合は、C6カルボニル酸素とGly 415のア ミド窒素の間にあり、そして第三の水素結合は、N1窒素とGln 441のカルボニル 酸素の間にある。ヒポキサンチン環はまた、N3窒素と水分子の間の相互作用によ り、安定化され得る。 C3'-エンドコンホメーションを採用するリボース環はまた、結合に著しく寄与 している。この構造は、02'および03'水酸基が、Ser 68およびAsp 364に対する 水素結合ネットワークを形成することを示している。リボース03'水酸基は、Ser 68側鎖からのプロトンを受容し、そしてAsp 364のカルボキシレート基へプロト ンを供与する。XMP^*、Met 70およびIle 330の間のファンデルワールス接触もま た、観察される。 ミコフェノール酸は、チャイニーズハムスターIMPDHの強力で非競合的な阻害 であり、その構造は、MPAおよびIMPDH活性部位残基の間の多くの相互作用を明ら かにしている(図５〜７)。二環式環系の１つの面は、XMP^*ヒポキサンチン環に重 なっているのに対して、他は、Ser 276の主鎖原子と接触している。同時に、MPA のヘキセン酸尾部、メチル置換基およびメトキシ基は、Asp 274、Ser 275、Ser 276、Asn 303、Arg 322およびGln 441の側鎖原子とファンデルワールス接触して いる。薬剤およびIMPDHの間では、また、６個の水素結合が観察される。これら には、Gly 326の02ラクトン酸素およびアミド窒素の間の水素結合、およびThr 3 33のC1カルボニル酸素および水酸基の間の水素結合が含まれる。MPAのヘキセン 酸尾部は、NMR研究[G．M．Makaraら、J ．Med．Chem.、39、pp．1236〜1242(1996 )]および遊離MPAの結晶構造[W．Harrisonら、Ｊ．Chem．Soc.、Perkin Trans．I I 、pp．1542〜1544(1972)]で見られる拡張コンホメーションと異なり、ベントコ ンホメーションを採用しており、これにより、カルボキシレート基が、Ser 276 のアミド窒素および側鎖水酸基と水素結合を形成することが可能となる[F．Ｈ． Allenら、J ．Chem．Info．Comp．Sci．31、p．187(1991)]。さらに、C7フェノー ル性酸素は、Thr 333の側鎖水酸基およびGln 441の側鎖アミドと水素結合を形成 する。IMPDH の酵素的機構およびミコフェノール酸による阻害 IMPDH触媒反応の局面は、結晶構造に向けることができる。IMPのIMPDH触媒酸 化の結果として、NADのニコチンアミド環への水素移動が起こり、NADHおよびXMP が形成される。水素化物の直接移動は、エネルギー的に好ましくないので、イノ シンC2位でのIMPの活性化を含む２つの機構が提案されている[L．Hedstromおよ びC．C．Wang、Biochemistry、29、849〜854(1990)]。第一の機構では、活性部 位塩基により補助されてOH^-攻撃を与える水は、初期工程において、C2で付加さ れる。次いで、そのように形成された四面体中間体から、NADへの水素化物の移 動が起こり、XMPのエノール互変異性体が生成する。第二の機構では、活性部位 システインチオールからの、IMPに対する求核攻撃が起こる。これに続いて、NAD ４への水素化物移動が起こり、共有結合したチオイミデート中間体が生じ、これ は、 引き続く工程にて、XMPに加水分解される。結晶構造は、IMPDH−基質共有結合付 加物の形成も示している最近の結果[J．A．Huete-Perezら、Biochemistry、34、 pp．13889〜13894(1995)；J．O．LinkおよびK．Straub、J ．Am．Chem．Soc.、11 8、pp．2091〜2092(1996)]と組み合わせて、第二の機構を強く支持している。 酸化IMP中間体としての共有結合チオイミデートの直接的な観察により、IMPの酵 素触媒酸化は、C2位にて、Cys 331の攻撃によって起こり、先の工程にて、水が イノシン環に付加される一般的な塩基機構は除外されることが確認される。 IMPDH触媒反応の他の局面は、結晶構造に向けることができる。MPA阻害複合体 は、NADまたはNADHを含有しないが、構造的な証拠および化学的な証拠の組合せ により、ニコチンアミド環は、活性部位にモデル化され得る。ニコチンアミド環 は、IMPのC2位からNADのC4位へと水素化物の移動が可能なように、配向されなけ ればならない。さらに、ニコチンアミド環およびヒポキサンチン環が、グルタチ オンレダクターゼ(lGET)およびNADHペルオキシダーゼ(2NPX)の構造で観察される ように、ニコチンアミド環および結合基質の間で重なることにより得られる好ま しい相互作用と一致して、ほぼ平行となるなら[Y．-D．Wuら、J ．Am．Chem．Soc . 、117、pp．4100〜4108(1995)]、水素化物の移動は、さらに容易に起こる。NAD のβ面上で水素化物の移動が起こることもまた、公知である[D．Cooneyら、Bioc him ．Biophys．Acta 、pp．89〜93(1987)]。NADAが離れる時点とMPAが結合する時 点の間で、大きなコンホメーション上の変化が起こらないなら、これらの構造的 な要件は、水素化物の移動中に、NADのニコチンアミドが、MPAの６、５環系に類 似の位置を占めるという先の予測を支持する[L．HedstromおよびC．C．Wang、Bi ochemistry 、29、pp．849〜854(1990)]。この配向では、ニコチンアミドアミド 部位は、Gly-324、Thr 333、Gly-326およびAsn-303と水素結合を形成する。 阻害複合体の構造もまた、MPAのフェノール性水酸基(これは、Thr 333およびG ln 441と水素結合を形成する)が、チオイミデート中間体を加水分解してXMPを生 成する触媒水の代替物であり得ることを示している。MPAの非存在下では、MPAヒ ドロキシルの近傍の水分子は、Thr 333およびGln 441との水素結合により安定化 され、チオイミデート中間体のC2炭素における求核攻撃に対して、適切に配置さ れる。従って、MPAの結合配向の構造的な特徴は、それが、ニコチンアミド環お よび触媒水擬態物の両方であることを示している。この仮説は、des-ヒドロキシ -MPAが、細胞アッセイにおいて、MPAよりも少なくとも1,000倍少ない効力がある という報告と一致している[Y．S．Orら、ACS Meeting、Chicago、Poster No．11 2(1995)]。触媒水分子を擬態できる水酸基の存在は、結合において、10kcal/mol 程度の改善を生じ得ることも、明らかとなった[R．WolfendenおよびW．M．Kati 、Acc ．Chem．Res.、24、pp．209〜215(1991)]。IMPDH の他の酵素との類似性 関連酵素の構造および機構への洞察は、IMPDHの構造により、一部明らかとな っている。配列データベースの検索により、活性部位システインおよびリン酸結 合部位を含む150アミノ酸の領域にわたって、63％の類似性および37％の同一性 で、最も近いIMPDHホモログとして、GMPレダクターゼを同定した。活性部位の回 りの高レベルの配列保存は、GMPレダクターゼが、IMPDHと類似の折り畳みおよび 活性部位幾何形状を有することを示唆している。このことは、GMPレダクターゼ が、IMPDHと同様に、補因子の前の基質を結合するという観察により、支持され る[T．Spectorら、J ．Biol．Chem.、254、pp．2308〜2315(1979)]。 このIMPDHα/βバレルの構造は、他のフラビンおよびニコチンアミド依存性酸 化還元酵素(グリコール酸オキシダーゼ、NADPH依存性アルド−ケトレダクターゼ およびトリエチルアミンデヒドロゲナーゼを含む)の構造と類似している。Ｃ末 端配列でコード化されたリン酸結合部位もまた保存されるが、IMPDHでは、この 部位は、他の酵素で見られるようなフラビンまたはNAD(P)補因子のリン酸によっ てよりも、むしろ、IMPリボースリン酸により、占有される。このことは、IMPDH 中のNAD結合部位が新規であることを示唆し、この部位で結合する阻害剤(例えば 、MPAおよびチアゾールアデニンジヌクレオチド)で見られる特異性[H．J．Leeら 、Cancer Res.、45、5512〜5520頁(1985)；L．HedstromおよびC．C．Wang、Bioc hemistry 、29、849〜854頁(1990)]の説明を助け得る。対照的に、IMPと競合する ヌクレオシドアナログ阻害剤(例えば、ミゾリビンおよびリバビリンリン酸)は、 他の酵素で見られる共通ヌクレオチドリン酸結合部位をさらに認識しやすく、そ れゆえ、MPAよりも特異性が低いと思われる。 図２〜７は、IMPDH/XMP^*/MPA複合体の構造をさらに図示している。それゆえ、 図２は、Ｘ線結晶構造解析で決定したIMPDHの折り畳みおよびコンフォメーショ ンを３次元で図示している。この構造は、α/βバレルを形成するβストランド のＣ末端から眺めている。このバレルの外側のαヘリックスをα1からα8と標識 する。順に並べたサブドメインの部分を示す。Cys 331を標識し、これは、この バレルの一端に位置している。矢印は、活性部位ループと共に、活性部位ポケッ トの形成を助けるフラップ(残基400〜450)の位置を印している。 図３は、IMPDH折り畳みの位相図を図示している。二次構造は、視覚的検査に 沿って、KabschおよびSanderのアルゴリズムを用いて帰属させる[W．Kabschおよ びC．Sander、Biopolymers、22、2577〜2637頁(1983)]。α/βバレルコアを形成 するβストランドおよびαヘリックスをβ1〜β8およびα1〜α8と標識する。こ のバレルの一部ではないストランドおよびヘリックスをβA〜βPおよびαA〜αG と標識する。Cys 331は、ストランドβ6とヘリックスαDとの間のループに位置 している。そのサブドメインは、ヘリックスα2の後で開始し、ストランドβ3で 終了し、ストランドβF〜βIおよびヘリックスβBおよびαCを含む。この構造の うち、電子密度マップで見えない部分は、「???」と印している。ストランドβ8 とヘリックスα8との間のフラップ(残基400〜450)には、ストランドβJ〜βNお よびヘリックスαEが含まれる。このα/βバレルを形成するストランドおよびヘ リックスの残基帰属は、以下の通りである：β1、残基65〜68；α1、76〜85；β 2、88〜91；α2、98〜109；β3、245〜250；α3、256〜266；β4、270〜274；α 4、281〜293；β5、298〜302；α5、307〜316；β6、320〜324；α6、343〜355 ；β7、360〜364；α7、370〜378；β8、382〜386；およびα8、456〜469。残り の二次構造要素の残基帰属は、以下の通りである：βA、残基18〜19；βB、35〜 38；βC、40〜42；βD、53〜55；βE、59〜61；βF、114〜116；βG、186〜189 ；βH、206〜212；βI、220〜223；βJ、400〜402；βK、406〜409；βL、411〜 413；βM、438〜440；βN、443〜448；β0、489〜492；βP、509〜513；αA、21 〜23；αB、194〜200；αC、225〜232；αD、333〜337；αE、416〜420；αF、4 76〜484；およびαG、495〜501。 図４は、IMPDHテトラマーのリボン図を図示し、結晶４重軸を見下ろしている[ M．Carson、J ．Appl．Cryst.、24、958〜961頁(1991)]。テトラマーに関連し た接触の殆どは、隣接バレル間で起こり、各サブユニットの界面に埋もれた表面 積は、およそ4000Ųである。結合したカリウムイオンは、各サブユニット界面 においてCys 331と隣接して見られる。他のいくつかの接触は、注目に値する。 残基41〜43は、隣接サブユニット中の残基279〜281と平行なβストランドを形成 する。残基502〜503は、隣接サブユニット中のCys 331とファンデルワールス接 触する。残基507〜510は、隣接サブユニットの活性部位フラップの残基444〜447 と逆平行なβストランドを形成し、これらの２個のストランドは、このカリウム イオンの上部に見られ得る。 図５は、IMPDH活性部位電子密度の立体図を図示している[M．Carson、J ．Appl ．Cryst. 、24、958〜961頁(1991)]。XMP^*チオイミデート中間体およびMPAの洗練 された座標を、2.0σで輪郭を示したSigmaA秤量[R．J．Read、Acta Cryst.、A42 、140〜149頁(1986)]2F_obs-F_calc電子密度マップに重ねた太線で示す。このヒポ キサンチン環は、Cys 331のイオウに対する共有結合を形成する。基質または阻 害剤と相互作用して活性部位ポケットを形成する側鎖のいくつかを、細線を用い て示す。チャイニーズハムスターおよびヒトのII型IMPDHの間では、アミノ酸配 列において、６個の差異しかない(R173C、N215D、L265Q、M290I、E292DおよびC3 27S)。これらは、C327S(これは、保存的変異であり、この活性部位ポケットとは 外れている)を除いて、全て、この活性部位から少なくとも15Å離れている。そ れゆえ、これらの相互作用はまた、ヒトII型形態のIMPDHにも当てはまる。 図６は、XMP^*-IMPDH相互作用の模式図を図示している。Cys 331のイオウ原子 とヒポキサンチン環のC2炭素との間には、共有結合が存在する。 図７は、MPA-IMPDH相互作用の模式図を図示している。電子密度差異マップで 観察された全ての近接する水分子を「H₂O」と標識する。全ての距離は、非水素 原子に関連している。 実施例５ 活性部位の変異および速度論分析 一連の変異体を生成して、触媒作用および阻害剤結合におけるヒトII型IMPDH の活性部位残基の役割を決定した(図８)。 本発明者が決定した３次元構造の知見により、観察した表現型の合理化が可能 となる。Cys 331またはAsp 364のいずれかのAlaへの突然変異は、野生型に対し てIMPDH活性を効果的に破壊した。結晶構造は、これらの２個の残基が、XMP^*と 直接接触していることを示す。Cys 331は、XMP^*との共有結合を形成し、触媒作 用におけるその役割を裏付けているのに対して、Asp 364の側鎖は、XMP^*のリボ ース部分との水素結合を形成する。Ser 329をAlaに変えることにより、野生型の 13％まで酵素活性が低下する。この側鎖は、XMP^*のリン酸に対する水素結合を形 成する。MPAと直接接触する残基もまた改変した。Thr 333をIleで置換し、Gln 4 41をAlaで置換することにより、MPAのK_i app.が、それぞれ、300倍および25倍増 加した。このThr 333からIleへの変異は、MPAに対する10,000倍増加した耐性に ついて選択したマウス芽腫細胞において観察されているので、特に興味深い[S.D ．Hodgesら、J ．Biol．Chem．264、18137頁(1989)；T．LightfootおよびF．F．S ynder、Biochem ．Biophys、Acta、1217、156頁(1994)]。この結晶構造は、Thr 3 33、Gln 441およびMPAの間の水素結合ネットワークを示しており、フェノール酸 素は、Thr 333の側鎖ヒドロキシルと、特に良好な水素結合距離および幾何形状 である(図５〜７)。MPAのヘキセン酸尾部のカルボン酸基は、Ser 276と、２個の 水素結合を形成する。この残基をAlaに変異させることにより、この相互作用は 破壊され、K_i app.の７倍の増加が生じる。対照的に、他の活性部位残基(例えば 、Ser 275、Ser 327およびGln 368)の変異は、触媒活性または薬物阻害には、ほ とんど影響がない。この構造は、これらの残基が、基質または阻害剤と直接接触 しないことを示している。 ヒトIMPDHの速度論実験により、IMPがカリウムなしでこの酵素に結合し得るも のの、この反応を進行させるには、このイオンが必要であることが明らかとなっ た[B．Xiangら、J ．Biol．Chem.、271、1435〜1440頁(1996)]。本発明の結晶構 造は、この観察を説明している。本発明者は、水分子および５個の主鎖のカルボ ニル酸素（Cys 331のものを含む）により取り囲まれた差異電子密度マップにお いて、大きなピークを観察した(データは示さず)。このピークの中心から周囲の 各リガンドまでの平均距離は、3.1Åであり、このピークは、六方晶状に配位し ていた。これらのリガンドの性質および配置は、カリウム結合部位を示唆してい た。それゆえ、カリウムは、この活性部位の回りのタンパク質コンフォメーショ ンを組織化し得、触媒作用に対するCys 331の配置を助け得る。さらに、このカ ルボニル酸素リガンドの３個は、隣接したIMPDHサブユニットのＣ末端近くの残 基上に存在し、このことは、カリウムがまた、テトラマー形状のIMPDHを安定化 し得ることを示唆している(図４)。 図８は、IMP基質についてのIMPDH変異体の比活性を図示している。変異は、Pf u DNAポリメラーゼ(Stratagen)を用いた４プライマーPCR法によりpT7ブルーベク ター(Novagen)にクローン化したヒトII型IMPDH cDNAにて行った[A．Rashchianら 、PCR Methods and Applications、2、124〜130頁(1992)]。PCR産物は、適当な 制限酵素で消化して、IMPDH cDNA内の固有部位にクローン化した。変異体を、PC R産物およびその周囲の制限部位を含む領域で配列決定した。次いで、確認した 変異を有する全長IMPDH cDNAを、IMPDH欠損E．coli株H712[H．J．J．Nijkampお よびP．G．Haan、Biochim ．Biophys．Acta 145、31〜40頁(1967)]にて、pSPC27 ベクターにサブクローン化した。IPTG誘導後、培養物(500ml)を、37℃で14〜16 時間増殖させると、典型的には、２グラムの細胞ペーストが得られた。細胞は、 50mM Tris(pH8.0)、150mM KCl、3mM EDTA、10％尿素を含む２mM DTT緩衝液に再 懸濁し、次いで、リゾチームの添加(１mg/ｇ細胞ペースト)および超音波処理に より溶解した。粗溶解物から、25％(w/v)硫酸アンモニウムにより、IMPDH野生型 および変異タンパク質を沈殿させた。この単一の精製工程により、150mgまでの 少なくとも65％〜70％純度のIMPDHを得た。部分的に精製したIMPDHは、50mM Tri s(pH 8.0)、100mM KCl、３mM EDTA、２mM DTT、10％グリセロール緩衝液に再懸 濁し、そして速度論分析に使用した。飽和状態(400mM)で、IMP滴定データから、 二次速度定数(k cat/Km、M^-1sec^-1)を算出した。37℃で340nmにて、NADH生成速 度をモニターすることにより、NAD濃度を得た。図８はまた、MPAによる種々の変 異IMPDHタンパク質の阻害を提示する。MPAに対するK_i app.値は、飽和IMPおよび NAD濃度にて、IMPDH変異体の速度−阻害剤データから得た。このデータを、プロ グラムKineTic 3.0を用いて、密着結合型非競合阻害に対する式に適合させた[D ．W．Marquardt、J ．Soc．Ind．Appl．Math.、11、431〜441頁(1963)]。実施例６ 阻害剤設計に対するIMPDH/XMP^*/MPA座標の使用 図１の座標は、IMPDHまたはIMPDHホモログと会合する化合物（阻害性化合物を 含む）を設計するのに使用する。この方法は、一組の機械実行可能命令でコード 化された機械読み取り可能データ記憶媒体を用いて補助され得、ここで、記録さ れた命令は、IMPDH/XMP^*/MPA複合体またはそれらの一部の３次元表示を表示し得 る。グラフィック表示は、IMPDHに結合する化合物(阻害性化合物を含む)を設計 するために、本明細書中に記載の方法に従って使用される。このような化合物は 、この活性部位、XMP^*結合部位、MPA結合部位、または両部位の一部または全部 にて、IMPDHと会合し得る。MPA 結合部位で結合する化合物 上で概説した方法は、MPA結合部位と直接会合させることによりIMPDHを阻害す る化合物を設計するのに使用され、そしてMPA結合部位で結合すると予想される 。このような化合物は、MPAの二環式の環部分、およびIMPDHに親和性を与える追 加の官能性に対する代理を有する。この化合物は、結合XMP^*中間体およびIMPDH 上の１個以上の以下の残基とファンデルワールス接触を形成し得る実質的に疎水 性のコアを含む：Asp 274、Ser 275、Ser 276、Gln 277、Asn 303、Arg 322、Gl y 324、Met 325、Gly 326、Thr 333、Met 414、Gly 415およびGln 441。この疎 水性コアは、IMPDH上のAsp 274、Thr 333、Gln 441、Gly 326のような残基また は近接残基と共に１個以上の水素結合を形成し得る１個以上の原子と置換されて いる。これらの水素結合原子は、リンカーにより、実質的に疎水性のコアと接続 されている。これらのリンカーは、残基His 93、Gly 251、Thr 252、His 253、A sp 256、Arg 259、Leu 273、Phe 282およびGln 283または近接残基と、別のファ ンデルワールス相互作用を形成できる。最低エネルギー結合のコンフォメーショ ンでは、この分子は、10kcal/mol以下の歪みエネルギーを有する。さらに、この 分子は、３個より少ない第二級アミド結合を含有し、そして1000未満の分子量を 有する。 実施例７ IMPDH 活性阻害アッセイ IMP脱水素酵素活性を、最初に報告された方法[B．Magasanikら、J ．Biol．Che m. 、226、339頁(1957)]の適応に従ってアッセイした。酵素活性は、NADHの形成 による340nmでの吸光度の増加をモニターすることにより、分光光度的に測定し た(e340は、6220M^-1cm^-1)。この反応混合物は、0.1M Tris(pH8.0)、0.1M KCl、 ３mM EDTA、２mM DDT、0.1M IMPおよび15〜50nMの濃度の酵素(IMPDHヒトII型)を 含有した。この溶液を、37℃で10分間インキュベートする。反応を、0.1Mの最終 濃度までNADを添加することにより開始させ、初期速度を、340nmでの吸光度の線 形増加を10分間追跡することにより測定する。標準的な分光光度計(経路長１cm) での読み取りのためには、キュベットの最終容量は1.0mlである。このアッセイ はまた、96ウェルのマイクロタイタープレートフォーマットに適合させた。この 場合、全ての試薬の濃度は同じ状態とし、最終容量を200μｌに減少させる。 阻害剤の分析のためには、問題の化合物を、20mMの最終濃度までDMSOに溶解し 、そして２〜５％(v/v)の最終容量で、酵素との前インキュベーションのために 、この初期アッセイ混合物に添加する。反応を、NADの添加により開始させ、初 期速度を上述のようにして測定する。K_iの決定は、種々の量の阻害剤の存在下に て初期速度を測定し、そしてHendersonの密着結合式[P．J．F．Henderson、Bioc hem ．J. 、127、321頁(1972)]を用いてそのデータを適合させることにより行う。 実施例８ 免疫抑制(有糸分裂誘発)アッセイの細胞供給源および培養物 LeukoPak細胞からの新鮮な末梢血リンパ球(PBL)またはランダムな正常献血者( 試験したところ、HIV陰性および肝炎陰性であった)由来の全血を、Histopaque 1 077(Sigma Chemical Co.、St．Louis、MO)による密度遠心分離により、単離し、 そして分離した。マウスCTLL細胞傷害性Ｔ細胞株およびヒトJurkatＴ細胞株は、 ATCCから入手できる(CTLL-2 ATCC TIB214、JRKAT CLONE E6-1 ATCC TIB152)。新 鮮なPBLの活性化に使用するヒト異質遺伝型Ｂ細胞株は、正常で健康な成人献血 者由来のEBV形質転換リンパ球であり、これらは、２つの完全に異なるHLAハプ ロタイプを有する。全ての細胞株は、Gibco Mycotect試験キットを用いて、Myco plasma 汚染の存在について通常通りに試験したところ、Mycoplasmaが存在しない ことが分かった。培養培地は、ペニシリン(50U/ml)およびストレプトマイシン(5 0μｇ/ml)を含有するRPMI 1640(Gibco、Grand Island、NY)、L-グルタミン２mM 、BME(５×10^-5)、10％熱不活性化FCSおよび10mM HEPESから成っていた。化合物溶解および滴定 全ての化学ストックをDMSOに溶解する。化合物の滴定を、１μＭまたは10μＭ のストック溶液からの複数の３倍希釈液を用いて、最終希釈濃度について個々の アッセイを行う培地(すなわち、完全RPMIまたはHB 104)中で行う。有糸分裂誘発アッセイ(「PMA」および「OKT3」) 有糸分裂促進剤に応答するヒトPBLの増殖に対する試験化合物の阻害効果[W．K ．Waitheら、Handbook of Experimental Immunology 、第３版、Blackwell Scien tific Publications、Oxford(1978)；B．B．Mishellら、Selected Methods in C ellular Immunology 、W．H．Freeman and Co.、San Francisco、CA(1980)]を、 異なる濃度の試験化合物およびコントロール薬物(CsA、FK506、ラパマイシン)の 存在下または非存在下にて、１ウェルあたり200μｌの最終容量で、96ウェル丸 底プレートにおいて、５×10⁴個の細胞をOKT3(10^-4の最終希釈)またはPMA(10ng/ ml)+イオノマイシン(250ng/ml)で刺激することにより評価する。48時間のインキ ュベーション(37℃、５％CO₂)の後、細胞を、１μCiの³H-ロイシンでパルス標識 し、24時間後に、Tom Tek細胞採取機で採取し、そしてLKB β-シンチレーション カウンターでカウントする。結果(cpm)を、培地のみのコントロールと比較し、 カウントの50％低下を生じる濃度(IC₅₀)を計算する。 本発明者らは、本発明の多数の実施態様を記載したが、本発明者らの基本的な 例が、本発明の生成物および方法を利用する他の実施態様を提供するために変更 され得ることは明らかである。従って、本発明の範囲は、実施例により表される 特定の実施態様よりはむしろ添付の請求項により定義されると理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/365 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 Ｇ０６Ｆ 15/60 ６３８ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 シンチャック，マイケル ディー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01890，ウィンチェスター，ロイド スト リート 34 (72)発明者 フレミング，マーク アンドリュー アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02141，ケンブリッジ，カーディナル メ デイロス アベニュー 413 (72)発明者 アーミステッド，デイビッド エム. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01754，メイナード，カッティング ドラ イブ ５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．図１に記載のIMPDHアミノ酸68、69、93、273、274、275、276、277、303、3 22、324、325、326、327、328、330、331、332、333、334、337、339、340、364 、413、414、415、416、420、439、440、441、442、469、および470の構造座標 により定義される結合ポケットを含む、結晶化された分子もしくは分子複合体、 または1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポ ケットを含む該分子もしくは分子複合体の結晶ホモログ。 ２．前記結合ポケットが、図１に記載のIMPDHアミノ酸274、275、276、277、303 、322、324、325、326、331、333、414、415、および441の構造座標により定義 される結合ポケットである、請求項１に記載の結晶化された分子もしくは分子複 合体、または1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する 結合ポケットを含む該分子もしくは分子複合体の結晶ホモログ。 ３．前記結合ポケットが、図１に記載のIMPDHアミノ酸275、276、303、325、326 、331、333、および441の構造座標により定義される結合ポケットである、請求 項２に記載の結晶化された分子もしくは分子複合体、または1.5Å以下の該アミ ノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む該分子もしく は分子複合体の結晶ホモログ。 ４．図１に記載のIMPDHアミノ酸67、68、69、70、73、274、275、276、303、322 、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、364、 365、366、367、368、385、386、387、388、389、391、411、412、413、414、41 5、416、419、440、441、442、443、500、501、502、503、504、505、および506 の構造座標により定義される結合ポケットを含む、結晶化された分子もしくは分 子複合体、または1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有 する結合ポケットを含む該分子もしくは分子複合体の結晶ホモログ。 ５．前記結合ポケットが、図１に記載のIMPDHアミノ酸68、69、70、303、322、3 26、327、328、329、330、331、332、333、335、364、365、366、367、385、386 、387、388、411、413、414、415、416、419、441、442、443、501、502、503、 および504の構造座標により定義される、請求項４に記載の結晶化された分子も しくは分子複合体、または1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均 偏差を有する結合ポケットを含む該分子もしくは分子複合体の結晶ホモログ。 ６．前記結合ポケットが、図１に記載のIMPDHアミノ酸68、70、322、328、329、 331、332、335、364、366、387、388、411、413、414、415、441、442、501、お よび502の構造座標により定義される、請求項５に記載の結晶化された分子もし くは分子複合体、または1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏 差を有する結合ポケットを含む該分子もしくは分子複合体の結晶ホモログ。 ７．図１に記載のIMPDHアミノ酸67、68、69、70、73、93、273、274、275、276 、277、303、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、 334、335、337、339、340、364、365、366、367、368、385、386、387、388、38 9、391、411、412、413、414、415、416、419、420、439、440、441、442、443 、469、470、500、501、502、503、504、505、および506の構造座標により定義 される、請求項４に記載の結晶化された分子もしくは分子複合体、または1.5Å 以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む 該分子もしくは分子複合体の結晶ホモログ。 ８．前記結合ポケットが、図１に記載のIMPDHアミノ酸68、69、70、274、275、2 76、277、303、322、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、335 、364、365、366、367、385、386、387、388、411、413、414、415、416、441、 442、443、501、502、503、および504の構造座標により定義される、請求項７に 記載の結晶化された分子もしくは分子複合体、または1.5Å以下の該アミノ酸の 骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む該分子もしくは分子 複合体の結晶ホモログ。 ９．前記結合ポケットが、図１に記載のIMPDHアミノ酸68、70、275、276、303、 322、325、326、328、329、331、332、333、335、364、366、387、388、411、41 3、414、415、441、442、501、および502の構造座標により定義される、請求項 ８に記載の結晶化された分子もしくは分子複合体、または1.5Å以下の該アミノ 酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む該分子もしくは 分子複合体の結晶ホモログ。 １０．前記分子もしくは分子複合体が図１に記載の構造座標のセットにより定義 される、請求項７に記載の結晶化された分子もしくは分子複合体、または1.5Å 以下の該アミノ酸の保存された骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケ ットを含む該分子もしくは分子複合体の結晶ホモログ。 １１．前記分子または複合体分子が、IMPDHのアミノ酸1〜514、XMP^*、およMPAを 含む、請求項７に記載の結晶化された分子もしくは分子複合体。 １２．機械読み取り可能データを用いてコードされたデータ記憧物質を含む、機 械読み取り可能データ記憶媒体であって、該データを使用するための命令によっ てプログラムされた機械を使用する場合、該機械読み取り可能データ記憧媒体は 、分子もしくは分子複合体のグラフィック３次元表示を表示し得、該分子もしく は分子複合体は、図１に記載のIMPDHアミノ酸68、69、93、273、274、275、276 、277、303、322、324、325、326、327、328、330、331、332、333、334、337、 339、340、364、413、414、415、416、420、439、440、441、442、469、および4 70、または該分子もしくは分子複合体のホモログの構造座標により定義される結 合ポケットの全てのもしくは任意の部分を含み、該ホモログは、1.5Å以下の該 アミノ酸の骨格原子の根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む、機械読み取 り可能データ記憶媒体。 １３．請求項１２に記載の機械読み取り可能データ記憶媒体であって、ここで、 前記結合ポケットは、図１に記載のIMPDHアミノ酸274、275、276、277、303、32 2、324、325、326、331、333、414、415、および441、または前記分子もしくは 分子複合体のホモログの構造座標により定義され、該ホモログは、1.5Å以下の 該アミノ酸の骨格原子の根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む、機械読み 取り可能データ記憶媒体。 １４．請求項１３に記載の機械読み取り可能データ記憶媒体であって、ここで、 前記結合ポケットは、図１に記載のIMPDHのアミノ酸275、276、303、325、326、 331、333、および441、または前記分子もしくは分子複合体のホモログの構造座 標により定義され、該ホモログは、1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子の根二乗 平均偏差を有する結合ポケットを含む、機械読み取り可能データ記憶媒体。 １５．機械読み取り可能データを用いてコードされたデータ記憶物質を含む、機 械読み取り可能データ記憶媒体であって、該データを使用するための命令を用い てプログラムされた機械を使用する場合、該機械読み取り可能データ記憧媒体は 、分子もしくは分子複合体のグラフィック３次元表示を表示し得、該分子もしく は分子複合体は、図１に記載のIMPDHアミノ酸67、68、69、70、73、274、275、2 76、303、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334 、335、364、365、366、367、368、385、386、387、388、389、391、411、412、 413、414、415、416、419、440、441、442、443、500、501、502、503、504、50 5、および506、または該分子もしくは分子複合体のホモログの構造座標により定 義される結合ポケットの全てのもしくは任意の部分を含み、該ホモログは、1.5 Å以下の該アミノ酸の骨格原子の根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む、 機械読み取り可能データ記憶媒体。 １６．請求項１５に記載の機械読み取り可能データ記憶媒体であって、ここで、 前記結合ポケットは、図１に記載のIMPDHアミノ酸68、69、70、303、322、326、 327、328、329、330、331、332、333、335、364、365、366、367、385、386、38 7、388、411、413、414、415、416、419、441、442、443、501、502、503、およ び504、または前記分子もしくは分子複合体のホモログの構造座標により定義さ れ、該ホモログは、1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子の根二乗平均偏差を有す る結合ポケットを含む、機械読み取り可能データ記憶媒体。 １７．請求項１６に記載の機械読み取り可能データ記憶媒体であって、ここで、 前記結合ポケットは、図１に記載のIMPDHアミノ酸68、70、322、328、329、331 、332、335、364、366、387、388、411、413、414、415、441、442、501、およ び502、または前記分子もしくは分子複合体のホモログの構造座標により定義さ れ、該ホモログは、1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子の根二乗平均偏差を有す る結合ポケットを含む、機械読み取り可能データ記憶媒体。 １８．請求項１５に記載の機械読み取り可能データ記憶媒体であって、ここで、 前記結合ポケットは、図１に記載のIMPDHアミノ酸67、68、69、70、73、93、273 、274、275、276、277、303、322、323、324、325、326、327、328、329、330、 331、332、333、334、335、337、339、340、364、365、366、367、368、385、38 6、387、388、389、391、411、412、413、414、415、416、419、420、439、440 、441、442、443、469、470、500、501、502、503、504、505、および506、また は前記分子もしくは分子複合体のホモログの構造座標により定義され、該ホモロ グは、1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子の根二乗平均偏差を有する結合ポケッ トを含む、機械読み取り可能データ記憶媒体。 １９．請求項１８に記載の機械読み取り可能データ記憶媒体であって、ここで、 前記結合ポケットは、図１に記載のIMPDHアミノ酸68、69、70、274、275、276、 277、303、322、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、335、36 4、365、366、367、385、386、387、388、411、413、414、415、416、441、442 、443、501、502、503、および504、または前記分子もしくは分子複合体のホモ ログの構造座標により定義され、該ホモログは、1.5Å以下の該アミノ酸の骨格 原子の根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む、機械読み取り可能データ記 憶媒体。 ２０．請求項１９に記載の機械読み取り可能データ記憶媒体であって、ここで、 前記結合ポケットは、図１に記載のIMPDHアミノ酸68、70、275、276、303、322 、325、326、328、329、331、332、335、364、366、387、388、411、413、414、 415、441、442、501、および502、または前記分子もしくは分子複合体のホモロ グの構造座標により定義され、該ホモログは、1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原 子の根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む、機械読み取り可能データ記憶 媒体。 ２１．請求項１８に記載の機械読み取り可能データ記憶媒体であって、ここで、 前記分子もしくは分子複合体は、図１に記載のIMPDH、または該分子もしくは分 子複合体のホモログについての構造座標のセットにより定義され、該ホモログは 、1.5Å以下の該アミノ酸の骨格原子の根二乗平均偏差を有する、機械読み取り 可能データ記憶媒体。 ２２．機械読み取り可能データの第一のセットでコードされたデータ記憶物質を 含む、機械読み取り可能データ記憶媒体であって、機械読み取り可能データの第 二のセットと組み合わせられる場合、該データの第一のセットおよび該データの 第二のセットについての命令によってプログラムされた機械を使用して、該第一 のセットは機械読み取り可能データの該第二のセットと対応する構造座標の少な くとも一部を決定し得、ここで：該データの第一のセットは、図１に記載のIMPD Hの構造座標の少なくとも一部のフーリエ変換を含み；そして該データの第二の セットは、未知の構造の分子もしくは分子複合体のＸ線回折パターンを含む、機 械読み取り可能データ記憶媒体。 ２３．化学物質の、請求項１〜１１のいずれかに記載の分子もしくは分子複合体 と会合する能力を評価するための方法であって、以下の工程を包含する、方法： a. 化学物質と分子もしくは分子複合体の結合ポケットとの間の適合操作を実施 するためにコンピューター的手段を利用する工程；および b. 前記適合操作の結果を分析して、化学物質と結合ポケットとの間の会合を定 量化する工程。 ２４．図１に記載の構造座標を使用することにより未知の構造の分子もしくは分 子複合体についての構造情報を得るために、分子置換を利用する方法であって、 以下の工程を包含する、方法： a. 該分子もしくは分子複合体を結晶化する工程； b. 該結晶化された分子もしくは分子複合体からＸ線解折パターンを生成する工 程； c. 図１に記載の構造座標の少なくとも一部をＸ線解折パターンに適用して、そ の構造が未知である分子もしくは分子複合体の少なくとも一部の３次元電子密度 マップを生成する工程。 ２５．分子もしくは分子複合体がIMPDHサブユニットまたはIMPDHホモログから選 択されるポリペプチドを含む、請求項２４に記載の方法。 ２６．IMPDH/XMP^*/MPA結晶を調製する方法であって、以下の工程を包含する、方 法； a. IMPDHとIMPとの間で複合体を形成する工程； b. NADおよびMPAを工程aで形成された複合体に添加する工程； c. IMPDH/XMP^*/MPA複合体の蓄積をモニターする工程；および d. MePの存在下で、工程cで形成された複合体を結晶化する工程。