JP2004503202A - 結晶性ＴＮＦ−α変換酵素およびその使用 - Google Patents
結晶性ＴＮＦ−α変換酵素およびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
腫瘍壊死因子−α変換酵素（ＴＡＣＥ）が、産生、精製および結晶化される。結晶の三次元座標がＸ線回折によって得られる。座標はコンピュータ可読媒体またはビデオメモリの一部に記録可能であり、それらはＴＡＣＥを研究するためのシステムの一部として用いうる。座標は、ＴＡＣＥと会合する化合物の設計、スクリーニングおよび開発にも用いられる。
Description
【０００１】
関連出願に関する情報
本出願は、１９９８年２月４日に提出された米国仮特許出願第６０／０７３，７０９号、１９９８年３月３０日に提出された米国特許出願第０９／０５０，０８３号（１９９９年１月２７日に提出された請願に従って米国仮出願に変更される予定）、および１９９９年１月２７日に提出された「結晶性ＴＮＦ−α変換酵素およびその使用」と題する米国仮特許出願による優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
サイトカインである腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）は、炎症反応において一定の役割を果たすほか、腫瘍細胞に対する細胞傷害性をもつことが知られている。しかし、ＴＮＦαは過剰に産生されると、最終的には多臓器不全および死に至るような重篤な障害を人体にもたらすことがある。ビーメルマンス（Ｂｅｍｅｌｍａｎｓ）ら、「腫瘍壊死因子：機能、放出および排出（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、ＲｅｌｅａｓｅおよびＣｌｅａｒａｎｃｅ）」、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎ． １６：１〜１１（１９９６）を参照のこと。
【０００３】
腫瘍壊死因子−αは、単核食細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞およびＮＫ細胞などの活性化細胞によって産生される。ＴＮＦαには２つの存在形態がある：１つは相対分子質量が２６ｋＤのＩＩ型膜蛋白質であり、もう１つは膜型蛋白質の分解によって生じる可溶性１７ｋＤ型である。ＴＮＦα膜蛋白質は２２３アミノ酸からなる膜アンカー型前駆体から合成される。可溶性ＴＮＦαは膜アンカー型プロテイナーゼによって膜結合型前駆体から放出される。最近、このプロテイナーゼは、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）と呼ばれる多ドメイン型メタロプロテイナーゼとして同定された。ブラック（Ｂｌａｃｋ）ら、「細胞から腫瘍壊死因子−αを放出させるメタロプロテイナーゼであるディスインテグリン（Ａ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｄｉｓｉｎｔｉｇｒｉｎ ｔｈａｔ ｒｅｌｅａｓｅｓ ｔｕｍｏｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：７２９〜７３３（１９９７）、モス（Ｍｏｓｓ）ら、「腫瘍壊死因子−α前駆体のプロセシングを行うディスインテグリン・メタロプロテイナーゼのクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｄｉｓｉｎｔｉｇｒｉｎ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｔｈａｔ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｔｕｍｏｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α）」、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：７３３〜７３６（１９９７）参照のこと。ＴＡＣＥは最近、Ｎ末端シグナルペプチド、プロドメイン、フリン（ｆｕｒｉｎ）切断部位（２１１〜２１４残基）の前に位置する２６３残基の触媒ドメイン（ＴＣＤ）、ディスインテグリンドメイン、ＥＧＦ様ドメインおよびクランビン（ｃｒａｍｂｉｎ）様ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ヘリックスと思われる部分、ならびに細胞内Ｃ末端尾部からなるジンクエンドペプチダーゼとして同定された。腫瘍壊死因子−α変換酵素（ＴＡＣＥ）は、ポリヌクレオチド配列を含め、刊行されたＰＣＴ出願・国際公開公報第９６／４１６２４号に詳細に記載されており、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０００４】
上記の通り、ＴＮＦαの過剰産生または無秩序な産生は、生理的に重大な脅威をもたらす。これは、慢性関節リウマチ、悪液質および内毒素ショックなどの種々の有害な生理的疾患に関与するとみなされている。また、これが最終的に臓器不全および死に至ることもある。このため、ＴＮＦαの循環系への放出を抑制または遮断する手法が必要である。ＴＡＣＥがＴＮＦαの変換に関与することから、ＴＡＣＥの阻害、修飾または調節は、ＴＮＦαの循環系への放出に影響を及ぼすと考えられる。メタロプロテイナーゼの阻害物質、および構造に基づくその設計は、ザスク（Ｚａｓｋ）ら、「マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害：構造に基づく設計（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｂａｓｅｄ Ｄｅｓｉｇｎ）」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ、２：６２４〜６６１（１９９６）に記載されている。したがって、阻害物質、受容体または修飾物質（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）などのＴＡＣＥと会合する化合物は、腫瘍壊死因子−αの過剰産生または無秩序な産生に伴う有害作用から患者を保護するために有用と考えられる。
【０００５】
発明の概要
本発明の１つの局面によれば、ポリペプチドがＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドである、結晶形状にあるポリペプチドを含む組成物が提供される。１つの態様において、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドはＴＮＦ−α変換酵素の触媒ドメインを含む。もう１つの態様において、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドは、ＴＮＦ−α変換酵素のプロドメインおよび触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドの発現産物である。１つのさらなる態様において、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドは、ＴＮＦ−α変換酵素のアミノ酸残基１〜４７７位をコードするポリヌクレオチドの発現産物である。さらにもう１つの態様において、ポリヌクレオチドはアミノ酸残基Ｓｅｒ２６６がＡｌａに変化し、アミノ酸残基Ａｓｎ５４２がＧｌｎに変化するように置換され、配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）６をコードする第２のポリヌクレオチドはＣ末端と融合される。
【０００６】
本発明のもう１つの局面によれば、上記の組成物は、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドとの共結晶化（ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）に適した結合パートナー（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ）をさらに含む。１つの態様において、結合パートナーはヒドロキサム酸に基づく結合パートナーである。もう１つの態様において、結合パートナーはＮ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ヒドロキシアミノカルボニル）メチル−４−メチルペンタノイル｝−Ｌ−３−アミノ−２−ジメチルブタノイル−Ｌ−アラニン，２−（アミノ）エチルアミド（Ｎ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ｈｙｄｒｏｘｙａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−４−ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ｝−Ｌ−３−ａｍｉｎｏ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ，２−（ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ ａｍｉｄｅ）である。
【０００７】
さらなる態様によれば、上記の組成物は、２．０Åで回折し、単斜晶系であって、結晶学的に独立した４つのＴＮＦ−α変換酵素触媒ドメイン（ＴＣＤ）分子を含む単位格子を有し、ＴＣＤ分子が非対称格子内にあり、ならびに／または単斜空間群Ｐ２１であって、格子定数がａ＝６１．３８Ａ、ｂ＝１２６．２７Ａ、ｃ＝８１．２７Ａおよびβ＝１０７．４１゜である、結晶構造を有する。
【０００８】
本発明のさらにもう１つの態様において、上記のポリペプチドは、表１による構造座標またはその実質的部分を特徴とする。
【０００９】
本発明の１つのさらなる局面によれば、（Ａ）ＴＡＣＥポリペプチドおよび結合パートナーを含む溶液を結晶化緩衝液と混合する段階、ならびに（Ｂ）結晶性沈殿物を形成させるためにドロップ蒸気拡散法（ｄｒｏｐ ｖａｐｏｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）によって段階（Ａ）の混合物を結晶化させる段階を含む、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの結晶化のための方法が提供される。１つの態様において、本方法はさらに、（Ｃ）ドロップ蒸気拡散法によって形成された結晶性沈殿物からの種（ｓｅｅｄ）および結晶化促進物質を、ＴＡＣＥポリペプチドおよび結合パートナー基質を含む濃縮溶液と結晶化緩衝液との混合物中に移す段階、ならびに（Ｄ）結晶を形成させるためにドロップ蒸気拡散法によって段階（Ｃ）の混合物を結晶化させる段階を含む。もう１つの態様において、結晶化緩衝液は０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ ５．４）、２０％ｗ／ｖ ＰＥＧ ４０００および２０％ｖ／ｖイソプロパノールである。さらにもう１つの態様において、結合パートナーはＮ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ヒドロキシアミノカルボニル）メチル−４−メチルペンタノイル｝−Ｌ−３−アミノ−２−ジメチルブタノイル−Ｌ−アラニン，２−（アミノ）エチルアミドである。さらにもう１つの態様において、結晶化は４〜２０℃の範囲の温度で行われる。もう１つの態様において、ＴＡＣＥポリペプチドおよび阻害物質を含む溶液は、緩衝液中に約５ｍｇ／ｍＬから約１２ｍｇ／ｍＬまでの濃度である。１つのさらなる態様において、ＴＡＣＥポリペプチドおよび結合パートナーを含む溶液は結晶化緩衝液と１：１の比で混合される。
【００１０】
本発明のさらにもう１つの局面によれば、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドと共結晶化基質との共結晶化によって作られる腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）変換酵素結晶が提供される。
【００１１】
本発明のさらにもう１つの局面によれば、ＴＮＦ−α変換酵素の触媒ドメインまたはその一部に関するＸ線結晶学的座標データが記録されたコンピュータ可読媒体（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｒｅａｄａｂｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）が提供される。１つの態様において、コンピュータ可読媒体上には、表１に示すＸ線結晶学的座標データまたはその一部が記録される。もう１つの態様において、媒体はフロッピーディスク、ハードディスク、コンピュータテープ、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＣＤ、ＤＶＤ、磁気ディスクおよび光ディスクからなる群から選択される。さらにもう１つの態様において、データ利用のための指示がプログラムされた装置とともに用いた場合にＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドまたはその一部の三次元画像表示用の画像シグナルを生成しうるコンピュータ可読媒体であるようなコンピュータ可読媒体上に、機械可読データが記録される。
【００１２】
本発明の１つのさらなる局面によれば、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドを研究するためのシステムであって、（ａ）ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部を表す情報を記憶しうるメモリであって、前記メモリが三次元空間における位置を特定する一組の空間座標を含む少なくとも１つの第１種の記憶領域と、複数のアミノ酸のうち１つの特徴を表す方法を含む少なくとも１つの第２種の記憶領域とを含み、前記第２種の記憶領域が前記三次元空間における前記ＴＮＦ−α変換酵素ペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の幾何学的配置を表すために前記メモリにおいて前記第１種の記憶領域と論理的に関連づけられているようなメモリ、（ｂ）前記第１種の記憶領域および前記第２種の記憶領域にアクセスするために前記メモリと連結されたプロセッサであって、前記メモリからのデータに基づいて前記三次元空間における前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の三次元像を表す画像を描写するための画像シグナルを生成するプロセッサ、ならびに（ｃ）前記画像シグナルを受け取るために前記プロセッサと連結されたディスプレイであって、前記画像シグナルに基づく前記三次元空間における前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の三次元画像を描写するディスプレイ、を含むシステムが提供される。本発明の１つの態様において、画像シグナルには、前記三次元空間における前記ＴＮＦα変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部のリボン構造の三次元画像を描写するためのシグナルが含まれる。本発明のもう１つの態様において、画像シグナルには、前記三次元空間における前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部のソリッドモデル表示による画像を描写するためのシグナルが含まれる。本発明のさらにもう１つの態様において、画像シグナルには、 前記三次元空間における前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の静電表面ポテンシャル（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）の三次元画像を描写するためのシグナルが含まれる。本発明のさらにもう１つの態様において、画像シグナルには、前記三次元空間における前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の三次元立体画像を描写するためのシグナルが含まれる。本発明の１つのさらなる態様において、システムはさらに、前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド以外の組成物の特徴の幾何学的配置を表すデータを記憶しうる記憶装置、およびオペレータからの指示を受け取るためのオペレータ・インターフェースであって、前記プロセッサが前記記憶装置および前記オペレータ・インターフェースと連結され、オペレータ・インターフェースからの指示に基づいて前記ディスプレイ上に前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の前記三次元画像と対比して前記組成物の前記特徴の前記幾何学的配置を描写するための付加的な画像シグナルを生成するような、記憶装置およびオペレータ・インターフェースを含む。１つの態様において、記憶装置は前記メモリの一部である。もう１つの態様において、システムは複数の第１種および第２種の記憶領域を含む。
【００１３】
本発明のもう１つの局面によれば、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の表示画面を生成するための情報を記憶しうるビデオメモリであって、以下の特徴を備えるビデオメモリが提供される：（ａ）それぞれが三次元空間における位置を特定する一組の空間座標を含む、少なくとも１つの第１種の記憶領域、および（ｂ）それぞれが複数のアミノ酸のうち１つの特徴を画像表示するための情報を含む、少なくとも１つの第２種の記憶領域であって、前記三次元空間における前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の幾何学的配置を表すための前記ビデオメモリにおいて前記第１種の記憶領域と論理的に関連づけられている第２種の記憶領域。１つの態様において、第２種の記憶領域は、前記三次元空間における前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの触媒ドメイン部分の少なくとも１つの特徴の幾何学的配置を表すための前記ビデオメモリにおいて前記第１種の記憶領域と論理的に関連づけられている。もう１つの態様において、第１種の記憶領域および前記第２種の記憶領域は半導体メモリの領域である。さらにもう１つの態様において、第１種の記憶領域および前記第２種の記憶領域は光ディスクの領域である。さらにもう１つの態様において、第１種の記憶領域および前記第２種の記憶領域は磁気メモリの領域である。１つのさらなる態様において、ビデオメモリは複数の第１種および第２種の記憶領域を含む。
【００１４】
本発明のさらにもう１つの局面において、ＴＮＦ−α変換酵素と会合する化合物を同定する方法であって、（Ａ）ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド結晶のＸ線回折座標に基づく、ＴＮＦ−α変換酵素触媒ドメインと結合を形成する前記ポリペプチドに対する会合性化合物の設計、（Ｂ）前記化合物の合成、および（Ｃ）前記化合物の前記ＴＮＦ−α変換酵素との会合能の決定、を含む方法が提供される。１つの態様において、会合性化合物は阻害物質、修飾物質またはＴＮＦ−α変換酵素活性を調節するその他の化合物である。もう１つの態様において、会合性化合物は競合的阻害物質、不競合的阻害物質または非競合的阻害物質である。さらにもう１つの態様において、座標は表１の座標またはその実質的部分である。１つのさらなる態様において、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド結晶はＴＮＦ−α変換酵素の触媒ドメインを含む。さらにもう１つの態様において、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドはＴＮＦ−α変換酵素のプロドメインおよび触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドの発現産物である。さらにもう１つの態様において、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドはＴＮＦ−α変換酵素のアミノ酸残基１〜４７７位をコードするポリヌクレオチドの発現産物である。もう１つの態様において、ポリヌクレオチドはアミノ酸残基Ｓｅｒ２６６がＡｌａに変化し、アミノ酸残基Ａｓｎ５４２がＧｌｎに変化するように置換され、配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）６をコードする第２のポリヌクレオチドはＣ末端と融合される。１つのさらなる態様において、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド結晶は結合パートナーとともに共結晶化される。さらにもう１つの態様において、結合パートナーは、ヒドロキサム酸に基づく結合パートナーまたはＮ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ヒドロキシアミノカルボニル）メチル−４−メチルペンタノイル｝−Ｌ−３−アミノ−２−ジメチルブタノイル−Ｌ−アラニン，２−（アミノ）エチルアミドである。さらに他の態様において、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド結晶は、２．０Åで回折し、単斜晶系であり、結晶学的に独立した４つのＴＮＦ−α変換酵素触媒ドメイン（ＴＣＤ）分子を含む単位格子を有し、ＴＣＤ分子が非対称格子内にあり、ならびに／または単斜空間群Ｐ２１であって格子の定数がａ＝６１．３８Å、ｂ＝１２６．２７Å、ｃ＝８１．２７Åおよびβ＝１０７．４１゜である、結晶構造を有する。本発明のさらにもう１つの態様において、会合性化合物はＴＮＦ−α変換酵素のＳ１’領域と会合するように設計される。さらにもう１つの態様において、会合性化合物はＴＮＦ−α変換酵素のＳ１’Ｓ３’ポケットと会合するように設計される。本発明のさらに他の態様において、会合性化合物は（ｉ）亜鉛をキレート化する部分を組み入れる、（ｉｉ）ＴＮＦ−α変換酵素のＬｅｕ３４８もしくはＧｌｙ３４９と水素結合を形成する、（ｉｉｉ）ＴＮＦ−α変換酵素のＳ１’ポケットを占有する非極性基を導入する、（ｉｖ）ＴＮＦ−α変換酵素のＳ１’−Ｓ３’ポケットをつなぐ経路（ｃｈａｎｎｅｌ）内に位置し、その経路と適切なファンデルワールス接触を行う基を導入する、および／または（ｖ）ＴＮＦ−α変換酵素の骨格アミド基上のＬｅｕ３４８またはＧｌｙ３４９と水素結合を形成するように設計される。
【００１５】
本発明の以上およびその他の局面は、本明細書に含まれる教示に鑑みて、当業者には明らかになると考えられる。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、高度に精製された腫瘍壊死因子−α変換酵素（ＴＡＣＥ）ポリペプチド、ＴＡＣＥポリペプチドの製造および精製の方法、ＴＡＣＥポリペプチドの結晶化の方法、ならびにＴＡＣＥポリペプチド結晶に関する。本発明はさらに、ＴＡＣＥポリペプチド結晶を用いたＸ線回折法、およびＴＡＣＥポリペプチドのＸ線結晶学的構造座標を得る方法、ならびに構造座標それ自体に関する。さらにまた、本発明は、ＴＡＣＥポリペプチドの三次元構造を解明するためのＴＡＣＥポリペプチドの構造座標の使用、ならびにＴＡＣＥと会合する化合物の設計および開発に関する。本発明に従って提供される三次元構造および構造座標の知見が得られれば、当業者はＴＡＣＥと相互作用すると思われる化合物を製造することができる。このような相互作用性化合物は、蛋白質工学（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）（ＯｘｅｎｄｅｒおよびＦｏｘ編）（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９８７）に開示されているものを含む、種々の技法および設計基準によって製造することができる。
【００１７】
本明細書で用いるＴＡＣＥとは、２６ｋＤの細胞膜結合型ＴＮＦαをＴＮＦα蛋白質のＣ末端１５６残基を含む可溶性１７ｋＤ型へと変換しうる一群のポリペプチドを意味する。ＴＡＣＥには、その全体が参照として本明細書に組み入れられるＰＣＴ出願・国際公開公報第９６／４１６２４号に記載されたアミノ酸配列を有する蛋白質のほか、このような配列とアミノ酸レベルでの相同性がある、好ましくは５０％以上、より好ましくは少なくとも８０％の相同性、さらにより好ましくは９０％の相同性がある蛋白質のうち任意のものが含まれる。さらにＴＡＣＥは、ＰＣＴ出願・国際公開公報第９６／４１６２４号に開示されたヌクレオチド配列の発現産物のことも指す。ＴＡＣＥにはさらに、生物活性を保持していて分泌可能である、蛋白質の細胞外部分を含む膜結合型蛋白質および可溶性もしくは切断型蛋白質が含まれる。このような蛋白質の例はＰＣＴ出願・国際公開公報第９６／４１６２４号に記載されている。
【００１８】
ＴＡＣＥのアミノ酸配列またはその任意の部分もしくは残基は、ブラック（Ｂｌａｃｋ）ら、「細胞から腫瘍壊死因子−αを放出させるメタロプロテイナーゼディスインテグリン（Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ｔｈａｔ ｒｅｌｅａｓｅｓ ｔｕｍｏｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α ｆｒｏｍ Ｃｅｌｌ）」、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：７２９〜７３３（Ｆｅｂ． １９９７）に見いだすことができ、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。ＴＡＣＥのアミノ酸配列における変形物（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）も本発明の範囲に含まれる。本明細書に含まれるＴＡＣＥアミノ酸配列に対する言及はすべて、ブラック（Ｂｌａｃｋ）ら、前記における配列に対する言及である。
【００１９】
本明細書で用いるＴＡＣＥ触媒ドメイン（ＴＣＤ）とは、残基２１５から４７７位の間、およびその前に位置するフリン（ｆｕｒｉｎ）切断部位（残基２１１〜２１４位）を含むＴＡＣＥポリペプチドの部分、またはペプチドＰＬＡＱＡＶＲＳＳＳを切断しうるその任意の部分を意味する。
【００２０】
ＴＡＣＥ ポリペプチドの発現、単離および精製
腫瘍壊死因子−α変換酵素（ＴＡＣＥ）は、刊行されたＰＣＴ出願・国際公開公報第９６／４１６２４号に記載されている。その出願は、ＴＡＣＥまたはＴＡＣＥの一部をコードする単離された核酸、ＴＡＣＥまたはその一部をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクター、およびＴＡＣＥまたはＴＡＣＥの一部をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターによる形質転換またはトランスフェクションを受けた宿主細胞を記載している。その出願はさらに、例えば、ＴＡＣＥを発現するように操作されたトランスフェクト細胞を培養し、続いて組換え的に産生されたＴＡＣＥまたはその一部を精製することなどにより、ＴＡＣＥおよびその一部を産生させるための工程も記載している。ＴＡＣＥポリペプチドの単離、発現および精製の方法は、刊行されたＰＣＴ出願・国際公開公報第９６／４１６２４号に詳細に記載されている。ＰＣＴ（特許協力条約）第９６／４１６２４号の全体は参照として本明細書に組み入れられる。
【００２１】
本発明によれば、ＴＡＣＥのシグナルペプチド、プロドメイン、および触媒ドメイン、すなわちアミノ酸残基１〜４７７位をコードするｃＤＮＡを適切な発現ベクター中に挿入し、適切な細胞系において発現させる。ｃＤＮＡは、発現を促進する、または本発明の本質から逸脱しないその他の目的を達成する、隣接領域などのその他の領域を含んでもよい。
【００２２】
ＴＡＣＥポリペプチドまたはＴＣＤなどのその機能的部分をコードするｃＤＮＡを、付加、置換、欠失または挿入によって変更することも可能である。このような変更は、例えば、グリコシル化の防止、不適切もしくは望ましくないジスルフィド結合の形成の防止、および／または発現増強のために施しうる。このような変更の例は国際公開公報第９６／４１６２４号に記載されており、それに記載された方法およびその他の従来の方法によって行うことができる。ＴＡＣＥを複合体化してもよい。このような複合体は、精製および／または同定を容易にするために添加されたペプチドを含むことができる。このようなペプチドには、例えば、ポリＨｉｓペプチドが含まれる。複合体化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、米国特許第５，０１１，９１２号およびホップ（Ｈｏｐｐ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４（１９８８）に記載されている。
【００２３】
本発明の１つの態様において、ｃＤＮＡは、ＴＡＣＥのシグナルペプチド、プロドメイン、および触媒ドメイン（ＴＣＤ）、すなわち残基１〜４７７位を含み、Ｓｅｒ２６６がＡｌａに変化し、Ａｓｎ４５２がＧｌｎに変化したＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドをコードする。これらの置換は、Ｎ結合型グリコシル化の防止に有用である。さらに、配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｈｉｓ）６をＣ末端に付加してもよい。配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｈｉｓ）６は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂などの金属キレート親和性樹脂を用いるポリペプチドの精製を容易にする。
【００２４】
ＴＡＣＥまたはその一部をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターは、よく知られた方法を用いて調製しうる。ＴＡＣＥポリペプチドの発現のために適した宿主細胞には、原核細胞、酵母細胞およびより高等な真核細胞が含まれる。本発明における使用に適したベクターおよび宿主細胞は、国際公開公報第９６／４１６２４号に記載されている。本発明による組換えＴＡＣＥの発現に用いうる適切な発現系のさらなる例には、昆虫細胞におけるバキュロウイルス系（ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）参照のこと）およびＣＯＳ−７細胞などの哺乳動物細胞系（Ｇｌｕｚｍａｎら、Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１））を含む、哺乳動物または昆虫宿主細胞の培養発現系が含まれる。 他の例も当技術分野で知られており、これには国際公開公報第９６／４１６２４号に記載されたものが含まれる。本発明の１つの態様において、ＴＡＣＥポリペプチドはＣＨＯ細胞内で発現される。この態様において、細胞はＶａｌ２１２およびＡｒｇ２１５に始まるＴＡＣＥポリペプチドの混合物を分泌する。
【００２５】
１つの態様においては、ベクターを取り込んでいない細胞を死滅させる薬物の存在下で細胞を培養することによって、安定的発現を行う細胞を選択しうる。適した選択法の例は、例えば、カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｒ．Ｊ．）、「哺乳動物細胞における異種遺伝子の選択および共増幅（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５３７〜５６６（１９９０）に記載されている。
【００２６】
発現されたＴＡＣＥポリペプチドの精製は、国際公開公報第９６／４１６２４号に記載されたものなどの任意の適した手段によって行いうる。本発明の１つの局面によれば、結晶化のために適したＴＡＣＥポリペプチドを入手することが好ましい。結晶化のために適したＴＡＣＥポリペプチドの入手に際しては、ＴＡＣＥポリペプチドを精製するための工程が、適切な結晶化が起こる程度に純粋なポリペプチドを得る上で十分であることが重要である。
【００２７】
好ましい精製方法の一つは、ＴＡＣＥ分泌細胞の培養物から得た適切な量の培地から始まる。この培地は一般に培養物の上清である。培地は精製しようとするＴＡＣＥポリペプチドを含む。好ましくは、ＴＡＣＥポリペプチドは、精製を容易にする１つの複合体または複数の複合体をコードするように改変された配列を有するＴＡＣＥポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて組換え的に産生される。例えば、金属キレート樹脂を用いる精製を容易にするために、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）６をコードする配列をＣ末端に付加してもよい。
【００２８】
培地は、例えば透析濾過などによって濃縮される。適した透析濾過ユニットには、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社のカットオフ値１０Ｋの１ｆｔ２ ＴＦＦ透析濾過ユニットが含まれる。続いて、適した緩衝液を濃縮培地に添加する。任意の適した緩衝液を用いてよい。このような適した緩衝液の一つは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）および３００ｍＭ ＮａＣｌを含む。
【００２９】
試料には多数回にわたって再濃縮および希釈を行う。例えば、試料を再濃縮し、緩衝液で２回目の希釈を行い、さらに再濃縮し、緩衝液で３回目の希釈を行い、最後の再濃縮を行う。透析濾過ユニット中に残った試料を、バックフラッシュ法などの適切な方法によって回収する。回収した材料を続いて適した膜を通して濾過してもよい。適した膜には、例えば、孔径０．４５または０．２２ミクロンの膜が含まれる。続いてアジ化物を添加する。濾過した試料を約２〜９℃などの低温で一晩保存してもよい。一晩保存した後、濾過した試料に対して、貯蔵水溶液からのイミダゾールおよび貯蔵水溶液からのＺｎＣｌ２を添加する。続いて試料を適切なカラムにかける。適切なカラムの一つは、特にＴＡＣＥポリペプチドを配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）６と結合させる場合には、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂などの金属キレート樹脂である。
【００３０】
カラムを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾールおよび５μＭ ＺｎＣｌ２からなる緩衝液などの緩衝液で洗浄する。続いて、イミダゾールの濃度を徐々に高める勾配により、ＴＡＣＥポリペプチドを溶出させる。画分はグリセリン、Ｔｒｉｓ ｐＨ ８の水溶液を入れた管に回収する。グリセリン溶液はカラム処理を行う当日に調製することが好ましい。
【００３１】
各画分からのアリコートを膜にスポットとして転写した後にアミドブラックで染色し、どの画分が意味のある量の蛋白質を含むかを判定する。または、各画分から少量、例えば５μｌを採取し、クーマシー染色を用いるゲル分析のために用いてもよい。意味のある量の蛋白質がみられた画分をプールし、続いてそのプールを、例えば透析濾過ユニットを用いて濃縮する。
【００３２】
場合によっては、ポリペプチドが凝集することもありうる。凝集物を除去し、精製をさらに容易にするために、濃縮した試料に対して、ヒドロキサム酸に基づく阻害物質などのＴＡＣＥの阻害物質を貯蔵水溶液から添加してもよく、オクチルグルコシド（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社の市販品）を貯蔵水溶液から添加してもよい。続いて、試料を室温で１５〜２４時間インキュベーションする。
【００３３】
インキュベーションの後に、試料をサイズ排除カラムにかける。カラムをまず、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセリンからなる緩衝液などの適切な緩衝液で平衡化する。適したサイズ排除カラムには、例えば、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷＧまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００などの類似物が充填されたＬＫＢ ２１３５−３６５が含まれる。続いて緩衝液をカラムに通す。高度に精製されたＴＡＣＥポリペプチドは２８０ｎｍでの吸収によって検出可能である。
【００３４】
意味のある蛋白質がみられた全画分に関して、どの画分をプールすべきかを判定するためにゲル分析を行う。サイズ排除クロマトグラフィーのプールは、例えば透析濾過ユニットを用いて濃縮する。
【００３５】
続いて、精製した試料に阻害物質などの結合パートナーを添加してもよい。結合パートナーはＴＡＣＥポリペプチドの安定化に特に有用である。結合パートナーは任意の適した化合物でよい。適した結合パートナーには、例えば、ヒドロキサム酸に基づく阻害物質が含まれる。適した阻害物質の一つは 、Ｎ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ヒドロキシアミノカルボニル）メチル−４−メチルペンタノイル｝−Ｌ−３−アミノ−２−ジメチルブタノイル−Ｌ−アラニン，２−（アミノ）エチルアミドである。この阻害物質は、その他の阻害物質と並んで、その全体が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第５，５９４，１０６号（Ｂｌａｃｋら）に記載されている。
【００３６】
この蛋白質複合体は、例えば約４℃などの低温で保存可能である。
【００３７】
ＴＡＣＥ 結晶および ＴＡＣＥ ポリペプチドの結晶化の方法
本発明の１つの局面は、ＴＡＣＥポリペプチドの結晶化の方法に関する。１つの好ましい方法は、ＴＡＣＥポリペプチドと上記の結合パートナーとの共結晶化を含む。ＴＡＣＥポリペプチドの入手ならびにポリペプチドの精製のための手段の例は先に述べた。
【００３８】
結晶は、ドロップ蒸気拡散法、バッチ法、液体ブリッジ法および透析法を含む任意の適した方法により、任意の適した条件下で成長または形成させうる。ドロップ蒸気拡散法による結晶化が好ましいことがしばしばである。さらに、結晶化の条件はさまざまであることを当業者は理解すると思われる。当技術分野ではポリペプチド結晶化のさまざまな方法が一般に知られている。例えば、国際公開公報第９５／３５３６７号、国際公開公報第９７／１５５８８号、欧州特許６４６ ５９９ Ａ２号、英国特許第２ ３０６ ９６１ Ａ号および国際公開公報第９７／０８３００号を参照されたい。
【００３９】
本発明の１つの態様においては、Ｓｅｒ２６６がＡｌａに変化し、Ａｓｎ４５２がＧｌｎに変化し、配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）６がＣ末端に付加されたＴＡＣＥ残基１〜４７７位を含むＤＮＡ構築物をＣＨＯ細胞内で発現させる。これらの細胞はプロセシングを受けたＴＡＣＥの混合物を主として分泌し、その約半分はＶａｌ２１２より始まり、約半分はＡｒｇ２１５より始まる。この混合物を上記の通りに精製する。精製されたＴＡＣＥポリペプチドを、添加した結合パートナーとともに、上記の緩衝液中で保存する。
【００４０】
ＴＡＣＥポリペプチドおよび結合パートナーを共結晶化させる。上記のＴＡＣＥ緩衝液におけるポリペプチド濃度が約５ｍｇ／ｍｌから約１２ｍｇ／ｍｌまでの範囲であるＴＡＣＥ／結合パートナー溶液を、適切な結晶化緩衝液と混合し、ドロップ蒸気拡散法などの適切な結晶化法を用いて結晶化させる。適した結晶化緩衝液には、例えば以下のものが含まれる：０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．３）、０．２Ｍ ＣａＣｌ２、３０％ｖ／ｖエタノール；０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ ５．０）、４０％ｖ／ｖエタノール；０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ ８．７）、２０％ｗ／ｖ ＰＥＧ ４０００、２０％ｖ／ｖイソプロパノール；および０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ ５．４）、２０％ｗ／ｖ ＰＥＧ ４０００、２０％ｖ／ｖイソプロパノール。試料を約４〜２０℃の範囲の温度でインキュベーションする。これにより、結晶性沈殿物が形成される。
【００４１】
得られた結晶性沈殿物からの種（ｓｅｅｄ）を結晶全体または粉砕結晶の懸濁液として、ウサギの毛などの適切な結晶化促進物質とともに、結晶化緩衝液中にある濃縮ＴＡＣＥ／基質溶液に添加する。これにより、Ｘ線データの収集に適した結晶が形成される。
【００４２】
本発明のもう１つの局面は、ＴＡＣＥポリペプチド結晶に関する。このような結晶の一つは、阻害物質とともに共結晶化したＴＮＦ−α変換酵素触媒ドメイン（ＴＣＤ）ポリペプチドを含む。この結晶は約２Ａで回折し、単斜晶系空間群Ｐ２１に属する。この結晶の単位格子は結晶学的に独立した４つのＴＣＤ分子を含む。ＴＣＤ分子は非対称格子内にあり、分離した四量体としてのクラスターは形成せず、無限周期的構造へと統合される。結晶の格子定数は以下の通りである：ａ＝６１．３８Å（オングストローム）、ｂ＝１２６．２７Å、ｃ＝８１．２７Åおよびβ＝１０７．４１゜。
【００４３】
Ｘ 線回折
本発明のもう１つの局面は、ＴＡＣＥの構造、特にＴＡＣＥ触媒ドメイン（ＴＣＤ）の構造に関する。ＴＡＣＥの構造は、上記のＴＡＣＥポリペプチドを含む結晶を用いて決定することができる。本発明によれば、ＴＡＣＥ、特にＴＣＤの構造がＸ線結晶学を用いて決定される。ポリペプチドの三次元構造座標を得るための任意の適したＸ線回折法を用いうる。三次元構造座標、またはＴＡＣＥ触媒ドメインもしくはペプチドＰＬＡＱＡＶＲＳＳＳを切断しうるその一部などの、関心対象のＴＡＣＥポリペプチドの一部を特徴づけるその任意の部分を、本明細書で説明する通りに用いることができる。
【００４４】
ＴＡＣＥ の Ｘ 線回折座標の使用方法
本発明は、ＴＡＣＥ触媒ドメインに関する上記のＸ線回折試験から得られた構造座標の使用にも関する。座標は、直接解析により、コンピュータ利用により、またはそれらの組み合わせにより、ＴＡＣＥ触媒ドメインの二次および三次構造を含む構造を決定するために利用しうる。ＴＡＣＥ触媒ドメインの構造座標は、ＴＡＣＥと会合する化合物の開発、設計および／またはスクリーニングにも用いることができる。本明細書で用いる「会合する」とは、化合物がＴＡＣＥとイオン的、共有結合的、水素結合、ファンデルワールス相互作用、塩橋、立体相互作用、親水性相互作用および疎水性相互作用によって結合または相互作用することを意味する。さらに、「会合する」という用語は、ＴＡＣＥ触媒ドメインの任意の部分との会合を含む。例えば、ＴＡＣＥと会合する化合物は、競合的阻害物質、不競合的阻害物質および非競合的阻害物質として作用する化合物でありうる。ＴＡＣＥと会合する化合物が、メディエーターまたは他の調節性化合物として作用する化合物であってもよい。また、ＴＡＣＥと会合する化合物は、基質のＴＡＣＥとの化学反応において異性化して短寿命の反応中間体となる化合物であってもよい。特に、ＴＡＣＥと会合するように設計された化合物は、阻害物質、メディエーターおよび他の調節性化合物として治療的に用いうる。
【００４５】
他のポリペプチドと会合する化合物の構造決定、分子設計および選択ならびに合成のためのＸ線座標の使用は、当技術分野で周知である。刊行されたＰＣＴ出願・国際公開公報第９５／３５３６７号は、酵素の活性部位と会合する化合物の設計、評価、合成および使用のためのＸ線構造座標の使用を記載している。英国特許出願第２３０６９６１Ａ号は、理論的薬剤設計におけるＸ線座標の使用を記載している。刊行されたＰＣＴ出願・国際公開公報第９７／１５５８８号は、Ｘ線回折パターンを用いたポリペプチドの構造決定、ならびに関心対象のポリペプチドと会合する化合物の探索における座標および三次元構造の使用を記載している。しかし、ＴＡＣＥと会合する化合物の構造決定、分子設計および選択ならびに合成のための、ＴＡＣＥポリペプチドに関するＸ線座標の使用は本発明によって初めて可能になった。
【００４６】
本発明の１つの局面においては、上記の方法によって得られた構造座標を三次元形態表示を含む画像表示として表示してもよく、それに変換してもよい。これは、一組の構造座標から分子またはその一部の表示画像を生成しうる市販のコンピュータプログラムを用いて行いうる。一組の構造座標から分子またはその一部の表示画像を生成しうるコンピュータプログラムの例は、刊行されたＰＣＴ出願・国際公開公報第９７／０８３００号に記載されており、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００４７】
本発明のもう１つの局面においては、構造座標および構造を、他のメタロプロテイナーゼなどの他の類似分子と比較する、または重ね合わせることができる。例えば、ＴＡＣＥの構造座標および構造を、アダマリシンＩＩなどのヘビ毒メタロプロテイナーゼの構造座標または構造と比較する、または重ね合わせることが可能である。ＴＡＣＥの構造座標および構造を、ヒトＡＤＡＭ １０を含むＡＤＡＭ １０などのマトリックスメタロプロテイナーゼの構造座標または構造と比較しても、または重ね合わせてもよい。ＴＡＣＥと画像構造または三次元構造座標が得られた他の分子との比較を、分子類似性におけるアプリケーションであるＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）などの入手可能なソフトウエアアプリケーションを利用して行うことも可能である。
【００４８】
化学的実体（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｔｉｔｙ）または断片をそれらのＴＡＣＥ、特にＴＡＣＥ触媒ドメインとの会合能に関してスクリーニングおよび選択することにより、ＴＡＣＥと会合する化合物を、コンピュータ計算によって評価および設計することもできる。本発明のこの局面を実現するために用いうる方法はいくつかある。１つの態様においては、本明細書で述べた構造座標に基づくＴＡＣＥ、特に触媒ドメインのコンピュータ生成モデルを画像として検討することができる。続いて、例えばＣＨＡＲＭＭまたはＡＭＢＥＲなどの入手可能なプログラムを用い、エネルギー最小化および分子動力学に基づいて、化学的実体および特定の化学的部分のコンピュータ生成モデルを触媒ドメインの内部または周囲に位置づけて評価することが可能である。化学的実体または断片の位置決定は、例えば、ＱｕａｎｔａおよびＳｙｂｙｌなどのドッキング用ソフトウエアを用いて行いうる。さらに、既知および市販のコンピュータプログラムを、化学的実体または断片の選択に用いることもできる。適した化学的実体または断片がいったん選択されれば、それらを組み合わせて、阻害物質、メディエーターまたはその他の調節性化合物などの単一の化合物を作り出すことができる。既知および市販のモデル作製ソフトウエアは組み立ての一助になると思われる。
【００４９】
本発明の１つの局面においては、ＴＡＣＥ、特にＴＡＣＥ触媒ドメインと会合する化合物を、特定の化学的部分または化学的実体の組み合わせによるのではなく、全体として設計しうる。この態様は、ＬＵＤＩ（Ｂｉｏｓｙｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＬＥＧＥＮＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）およびＬｅａｐ Ｆｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）などのコンピュータプログラムを用いて行いうる。
【００５０】
１つの態様において、候補化合物は、これまでに同定された相互作用部位に鑑みて、ＴＡＣＥと候補化合物との望ましい相互作用部位に基づいて選択される。特異的な候補化合物−ＴＡＣＥ相互作用がいったん決定されれば、選択された候補化合物とＴＡＣＥとの予備的に「モデル化された」複合体を得るために、市販のドッキング用ソフトウエアを用いるドッキング試験を行う。
【００５１】
拘束的配座解析（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、例えば、モデル化されたＴＡＣＥ−阻害物質複合体の完全性を検査するために、分子動力学（ＭＤ）を用いて行われる。複合体がいったん最も都合のよい立体配座状態に到達したところで、ＭＤ試験によって提示された構造の画像解析を行い、測定された結合親和性に基づいて、モデル化された複合体が既知の実験的ＳＡＲ／ＱＳＡＲ（構造−活性相関／定量的構造−活性相関）と適合することを確かめる。
【００５２】
その他のモデリング法を本発明に従って用いることも可能である。これらの技法の例は、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、「医薬品化学のための分子モデリングソフトウエアおよび方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３３：８８３〜８９４（１９９０）、およびナビア（Ｎａｖｉａ）ら、「薬剤設計における構造情報の使用（Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２：２０２〜２１０（１９９２）に開示されており、これらはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００５３】
ＴＡＣＥと会合するように開発または設計された化合物は、当技術分野で知られた数多くの方法を用いて最適化することもでき、会合効率を検討することも可能である。例えば、変形エネルギーおよび静電相互作用の決定および最適化を行うことができる。既知および市販のソフトウエアおよびハードウエアシステムも用いうる。このようなソフトウエアの例は国際公開公報第９５／０７６１９号に開示されている。阻害物質の効力、選択性および物理的薬物様特性を反復的な様式で最適化するための、構造に基づく類似体化（ａｎａｌｏｇｉｎｇ）も、薬剤設計の当業者は行いうる。
【００５４】
選択または設計された化合物に対して置換を施してもよい。これらの置換は、化合物の会合特性を改善または変更するために施すことができる。このような置換は、例えば、化合物の側鎖内または特定の原子に施すことができる。一般には、大きさ、形態、電荷およびその他の特徴が本来の基または原子とほぼ同一である保存的置換から始めるべきである。置換された化合物を、上記の通りにさらに解析および最適化してもよい。
【００５５】
本発明の１つのさらなる局面においては、このような化合物の合成および試験を実際に行う前に、例えば市販のコンピュータソフトウエアを用いて、化合物に関して予想される阻害、修飾、調節または他の結合効果を解析および評価しうる。この方式により、無効な化合物の合成および試験を行う確率を評価することが可能である。
【００５６】
阻害を評価するための手順は当技術分野で一般に知られており、例えばＰＣＴ（特許協力条約）第９６／４１６２４号に開示されている。このような方法にはペプチド基質との反応に基づくアッセイ法が含まれる。
【００５７】
ＴＡＣＥ 触媒ドメインの構造
記載した方法を用いて得られたＸ線回折データに基づいて決定されたＴＣＤの物理的特徴、およびＴＣＤの分子モデルの作製におけるその使用に関して、図面を参照しながらさらに説明する。
【００５８】
図１に描かれた本ドメインは、扁平な楕円体の平坦面に刻み目が入った形状をしており、これにより、小さな「下方」のサブドメインを「上方」の分子本体から隔てる比較的小さな活性部位のくぼみが生じている（図２ａ）。ＴＣＤポリペプチド鎖は分子表面（下方の奥の方、図１）から始まり、 Ａｓｐ２１７とＭｅｔ２２１との間で鎖が明確に規定される（図３参照）。分子の中心には５本の鎖からなるβプリーツシートがあり、ここではβ鎖がｓＩＩ、ｓＩ、ｓＩＩＩ、ｓＶおよびｓＩＶの順（奥から手前の順、図１参照）に並び（図３参照）、「辺縁」鎖であるｓＩＶが他のものとは逆平行に走行する。このβシートは大きくねじれており、凸面に２本のαヘリックス（ｈＢおよびｈＢ２）、凹面に２本のヘリックス（ｈＡおよびｈＣ）が隣接している。β鎖ｓＩおよびｓＩＩは、短いαヘリックスｈＡＩおよび長いαヘリックスｈＡ（後方を斜めに走行するヘリックス、図１）によって連結されている。β鎖ｓＩＩおよびｓＩＩＩは、長い「多ターンループ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｔｕｒｎ ｌｏｏｐ）」、長い「中間」αヘリックスｈＢ、および隣接する短いαヘリックスｈＢ２によって連結され、これらはすべてβシートの「上方」に並ぶことにより、その中央部をバルク水（ｂｕｌｋ ｗａｔｅｒ）から完全に遮蔽する（図１）。多ターンループは２カ所で突出し、それぞれ「拍車様（ｓｐｕｒ−ｌｉｋｅ）」および酸性度の強い突出部を生じる（図２ａでは分子の上方に認められる）。ｓＩＩＩ−ｓＩＶリンカーの終端には、辺縁鎖であるｓＩＶに入る前に短い「突出」がある。ｓＩＶ−ｓＶ連結セグメントには、表面に位置する２つの大きな「耳様」ループがあり、その一方は分子本体に囲まれ（図２ａ、中央左の「青い」表面を生じる）、もう一方の長いβヘアピンループ（ｓＩＩａ−ｓｌＩｂ）は分子表面から突出している（図１および２の上左）。突出したループは、ｓＶを、分子の中心に位置し、鎖がねじれて下方のサブドメインが生じる部位である厳密に保存されたＧｌｙ４１２の箇所で急に終わる「活性部位ヘリックス」ｈＣと結合する。
【００５９】
Ｃ末端鎖は最後の６１個のＴＣＤ残基（図３）を含み、これはまず、２つの「狭い」スーパーツイストループによって連結された、短い直線状のほぼ垂直に並んだ３つのセグメントを形成し、強固な「Ｍｅｔターン」Ｔｙｒ４３３−Ｖａｌ４３４−Ｍｅｔ４３５−Ｔｙｒ４３６を介して表面に戻り、そこでＰｒｏ４３７の箇所でねじれてＳ１’くぼみのＰｒｏ４３７−Ｉｌｅ４３８−Ａｌａ４３９外「壁」を形成し、幅広いループを経てＣ末端αヘリックスｈＤに至ってその中を通過し、Ｎ末端に近接した分子の「後方」表面で終わるが、最後の規定された残基Ａｒｇ４７３−Ｓｅｒ４７４は水素結合によって分子本体に固定される。２つの「狭い」ループの１つ目はＣｙｓ４２３−Ｃｙｓ４５３を介してヘリックスｈＤのＮ末端とジスルフィド結合し、続いてｈＤのＣ末端はＣｙｓ３６５−Ｃｙｓ４６９を介して「耳様」ｓＩＶ−ｓＶリンカーペプチドに固定される。空間的に隣接したＴＣＤの第３のジスルフィド架橋であるＣｙｓ２２５−Ｃｙｓ３３３はβ鎖ｓＩおよびｓＩＩＩのＮ末端部分同士をつなぐ。インタクトのＴＡＣＥ分子では、Ｓｅｒ４７４の下流の４残基が、密に伸長したディスインテグリンドメインの必須領域であるＣｙｓ４７８の位置にあると考えられる（Ｓａｕｄｅｋら、「最小の活性ＲＧＤ蛋白質であるエキスタチンの三次元構造（Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ， ｔｈｅ ｓｍａｌｌｅｓｔ ａｃｔｉｖｅ ＲＧＤ ｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０、７３６９〜７３７２（１９９１））。Ｓｅｒ４７４およびこのＣｙｓ４７８がそれぞれのドメインの中心的箇所であると考えると、この３残基リンカーはディスインテグリンドメインを触媒ドメインの「左側」表面に対して比較的拘束されない形でドッキングさせると考えられる。
【００６０】
ＴＡＣＥの活性部位のくぼみ（図２ａ）は、比較的平坦な左側（非プライム側）にあるが、右側に向かって刻み目が生じている。その中心に位置する触媒性亜鉛はＨｉｓ４０５、Ｈｉｓ４０９およびＨｉｓ４１５の３つのイミダゾールＮ∈２原子（活性部位ヘリックス、およびそれに続く、保存された亜鉛結合性共通モチーフＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨを含む「下行」鎖によって提供される）、ならびに阻害物質のヒドロキサム酸部分のカルボニルおよびヒドロキシル酸素により五配位を受ける（図１、２ａおよび４参照）。この亜鉛−イミダゾール集団は、メトジンシンクラン（ｍｅｔｚｉｎｃｉｎ ｃｌａｎ）に関するＭｅｔターン特徴部分にある、厳密に保存されたＭｅｔ４３５の末端にあるε−メチル硫黄部分に基づく（Ｂｏｄｅら、「アスタシン、セラリシン、ヘビ毒およびマトリックスメタロプロテイナーゼは同一の亜鉛結合環境（ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨおよびＭｅｔターン）およびトポロジーを示し、共通のファミリー「メトジンシン」に分類されるべきである（Ａｓｔａｃｉｎｓ、ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎｓ、ｓｎａｋｅ ｖｅｎｏｍ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｚｉｎｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ（ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨ ａｎｄ Ｍｅｔ−ｔｕｒｎ）ａｎｄ ｔｏｐｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｇｒｏｕｐｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｆａｍｉｌｙ， ｔｈｅ ’ｍｅｔｚｉｎｃｉｎｓ’）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３３１、１３４〜１４０（１９９３）、ステッカー（Ｓｔｏｃｋｅｒ）ら、「メトジンシン：アスタシン、アダマリシン、セラリシンおよびマトリキシン（コラゲナーゼ）とのトポロジー的および配列上の関係から、ジンクペプチダーゼの１つのスーパーファミリーが規定される（Ｔｈｅ ｍｅｔｚｉｎｃｉｎｓ：Ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ａｓｔａｃｉｎｓ、ａｄａｍａｌｙｓｉｎｓ、ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎｓ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘｉｎｓ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ）ｄｅｆｉｎｅ ａ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｚｉｎｃ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ）」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ４、８２３〜８４０（１９９５））。Ｈｉｓ４０５の亜鉛配位性イミダゾールと辺縁鎖との間に入り込んだ「触媒性」Ｇｌｕ４０６の２つのカルボン酸酸素（触媒の際に一般的な塩基として作用する）（Ｇｒａｍｓら、「ヒドロキサム酸ペプチドおよびペプチドチオール阻害物質と複合体を形成したヒト好中球コラゲナーゼのＸ線構造：基質結合および理論的薬剤設計に対する意義（Ｘ−ｒａｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ｐｅｐｔｉｄｅ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｉｏｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ）」Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２８、８３０〜８４１（１９９５））はいずれも、ヒドロキサム酸のヒドロキシル基およびＮ−Ｈ基と水素結合を形成する（図４参照）。触媒性亜鉛の右側には深いＳ１’ポケットが開いており、これはＳ１’壁形成セグメント（下、図１および２ａ）のほか、Ｈｉｓ４０５およびＧｌｕ４０６の側鎖（左）、ｓＩＶ主鎖およびＬｅｕ３４５側鎖（上）ならびにＶａｌ４４０側鎖（後方）およびＡｌａ４３９（右）が境界をなしている。Ａｌａ４３９の右には第２の（Ｓ３’）ポケットが開いており、これは分子内でＳ１’ポケットと融合し、Ａｌａ４３９およびＬｅｕ３４８の対向性側鎖から形成される小さな架橋が生じている（図２ａ）。
【００６１】
阻害物質の（偽）ペプチド部分は、活性部位のくぼみの刻み目の入った右側に伸長した形状で入り込み、生産的結合を生じたペプチド基質のプライム化残基との相互作用を模倣する（図２ａ）。これは上方の短い突出であるＧｌｙ３４６−Ｔｈｒ３４７−Ｌｅｕ３４８とは逆平行に、Ｓ１’壁形成セグメントであるＰｒｏ４３７−Ｉｌｅ４３８−Ａｌａ４３９とは平行に走行し、それぞれ２つずつの主鎖間水素結合を形成する。主な分子間相互作用は、阻害物質のＰ１’イソブチル（偽ロイシル）側鎖および本質的に疎水性であるＳ１’ポケットによって生じるが、これは大きいため、部分的に規則化した３つの溶媒分子をさらに収容する。Ｐ２’のｔ−ブチル側鎖は酵素から離れるように伸長するが、酵素の隆起によって形成される上記の疎水性キャノピーに囲まれて位置する。Ｐ３’ Ａｌａ側鎖は負に荷電した大きなＳ３’ポケット内に入るが、小さすぎるために最適な接触は起こらない。Ｃ末端のジアミノエチル基は４つの分子において異なる立体配座をとる。
【００６２】
結合型プロＴＮＦαのＰ１’〜Ｐ３’セグメントであるＶａｌ７７−Ａｒｇ７８−Ｓｅｒ７９は、おそらく同様の様式で、おそらくはさらに高い適合度で下部のくぼみと結合すると思われる。その際、前に位置するＰ３〜Ｐ１残基Ａｌａ７４−Ｇｌｎ７５−Ａｌａ７６は辺縁鎖に対してほぼ確実に逆平行に並び、それらの側鎖はそれぞれ（部分的に荷電した）Ｓ３ポケット内および（負に荷電した）浅いＳ２陥凹内に伸長し、中心のくぼみから突出すると考えられる。ＴＡＣＥのプライム化サブサイトおよび周囲の分子表面は主として負に荷電し、非プライム化サブサイトは本質的には疎水性である（図２ａ）。さらに距離を隔てた相互作用もプロＴＮＦαのプロセシングに関するＴＡＣＥの特異性に関与すると思われる。プロＴＮＦα切断部位を含む１２残基の基質もＭＭＰの一部によって切断可能であるが、特異性および有効性は落ちる（Ｂｌａｃｋら、「マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の特異性の低さ、およびＴＩＭＰが腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）産生に対する反応性をもたないことは、主要なＴＮＦ−α変換酵素がＭＭＰでない可能性を示唆する（Ｒｅｌａｘｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ（ＭＭＰｓ）ａｎｄ ＴＩＭＰ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｒｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α（ＴＮＦ−α）ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ＴＮＦ−α ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｓ ｎｏｔ ａｎ ＭＭＰ）」Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２５、４００〜４０５（１９９６））。したがって、（おそらくは三量体である）（Ｔａｎｇら、「ヒトプロ腫瘍壊死因子はホモ三量体である（Ｈｕｍａｎ ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｉｓ ａ ｈｏｍｏｔｒｉｍｅｒ」Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５、８２１６〜８２２５（１９９６ａ）、Ｔａｎｇら、「ヒトプロ腫瘍壊死因子のリンキングドメインの長さが切断プロセシングを決定する（Ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｎｋｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５、８２２６〜８２３３（１９９６ｂ））膜結合型プロＴＮＦαがインビボで優先的プロセシングを受けることは、一部には組み立て（ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ）の補正による、すなわちプロＴＮＦα切断セグメントがＴＡＣＥ活性部位に対してアンカー膜から一定の距離をもって適切に提示されるためであると考えられる。いくつかの実験的証拠（Ｔａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５、８２１６〜８２２５（１９９６ａ）、Ｔａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５、８２２６〜８２３３（１９９６ｂ））からは、切断部位が切断配列のみによって決定されるのではなく、ＴＮＦα三分子が会合したＣ末端セグメントによって形成される密な円錐体（Ｊｏｎｅｓら、「腫瘍壊死因子の構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）」Ｎａｔｕｒｅ ３３８、２２５〜２２８（１９８９））の基部との距離も一定の役割を果たす可能性が示唆されている。生産的なＴＡＣＥ−プロＴＮＦα複合体の場合には、このＴＮＦα三量体円錐体（その内部に不規則なＮ末端が入り込む）の基部は、ＴＡＣＥ触媒ドメインの「右」側によって認識され（図２ａ）、約１０残基長のスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）がプロＴＮＦαＡｌａ７６〜Ｖａｌ７７の切断されやすいペプチド結合をＴＡＣＥの活性部位内に正しく配置させる。
【００６３】
ポリペプチドのトポロジー、特に触媒性亜鉛の表面提示により、ＴＡＣＥの触媒ドメインが典型的なメトジンシンであることが証明される（Ｂｏｄｅら、「アスタシン、セラリシン、ヘビ毒およびマトリックスメタロプロテイナーゼは同一の亜鉛結合環境（ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨおよびＭｅｔターン）およびトポロジーを示し、共通のファミリー「メトジンシン」に分類されるべきである（Ａｓｔａｃｉｎｓ、ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎｓ、ｓｎａｋｅ ｖｅｎｏｍ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｚｉｎｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ（ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨ ａｎｄ Ｍｅｔ−ｔｕｒｎ）ａｎｄ ｔｏｐｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｇｒｏｕｐｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｆａｍｉｌｙ， ｔｈｅ ’ｍｅｔｚｉｎｃｉｎｓ’）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３３１、１３４〜１４０（１９９３）、ステッカー（Ｓｔｏｃｋｅｒ）ら、「メトジンシン：アスタシン、アダマリシン、セラリシンおよびマトリキシン（コラゲナーゼ）とのトポロジー的および配列上の関係から、ジンクペプチダーゼの１つのスーパーファミリーが規定される（Ｔｈｅ ｍｅｔｚｉｎｃｉｎｓ：Ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ａｓｔａｃｉｎｓ、ａｄａｍａｌｙｓｉｎｓ、ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎｓ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘｉｎｓ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ）ｄｅｆｉｎｅ ａ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｚｉｎｃ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ）」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ４、８２３〜８４０（１９９５））。しかし、他のメトジンシンとの重ね合わせにより、そのトポロジーは、アダマリシンＩＩなどのヘビ毒メタロプロテイナーゼの触媒ドメインのものと最も類似することが示された（図５）（Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈら、「ヘビ毒メタロプロテイナーゼの最初の構造：マトリックスメタロプロテイナーゼ／コラゲナーゼのプロトタイプ（Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｓｎａｋｅ ｖｅｎｏｍｅ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ：ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ｆｏｒ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ／ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ）」ＥＭＢＯ Ｊ． １２、４１５１〜４１５７（１９９３）、Ｚｈａｎｇら、「天然および合成型の阻害物質とヘビ毒メタロプロテイナーゼ、アストロリシンＣ（ｄ型）との構造的相互作用（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｖｅｎｏｍ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ａｔｒｏｌｙｓｉｎ Ｃ（ｆｏｒｍ ｄ））」Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１、８４４７〜８４５１（１９９４）、Ｋｕｍａｓａｋａら、「ハブ毒由来のＨ２プロテイナーゼの結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｈ２−ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｅｎｏｍ ｏｆ Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ）」Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１９、４９〜５７（１９９６））。この密接な相同性は、中心シートおよび大きなヘリックスの同時重ね合わせが極めて優れることを反映するが、特にＴＡＣＥがアダマリシンのみと共有する以下の一連の構造的特徴も反映する：長いヘリックスｈＢおよびその前にあるβシートの上部に並んだ多ターンループ、典型的な配置および形状を有するＣ末端ヘリックスｈＣ、ならびに後方表面に位置する伸長したＣ末端。ＴＡＣＥの２６３個、アダマリシンの２０１個のα原子のうち約１７５個はトポロジー的に等価である（ｒｍｓ偏差は１．３Åであり、そのうち３９個は同一の側鎖を有する）（図３）。これらの数値は、異なるメトジンシンファミリーに属するメンバー間の比較によって得られた値と近い（Ｓｔｏｃｋｅｒら、前記）。さらに、以下の詳細な構造的特徴から、ＴＡＣＥがアダマリシンと密接な関係にあることが証明される：比較的保存されているコア構造、固定されずに並んだＮ末端、同一の分子間水素結合相互作用に関与する特徴的なＡｓｐ４１６（亜鉛結合性共通モチーフの直後に位置する、図３）、第１の狭いループをＣ末端ヘリックスｈＤ（ＴＡＣＥはこれをアダマリシンＩＩとは共有しないが、ハブ毒Ｈ２プロテイナーゼとは共有する）（Ｋｕｍａｓａｋａら、前記）とつなぐ隣接ジスルフィド架橋Ｃｙｓ４２３−Ｃｙｓ４５３、ｓＩＶ−ｓＶリンカーをＣ末端ヘリックスｈＤと連結するジスルフィド結合Ｃｙｓ３６５−Ｃｙｓ４６９、Ｓ１’ポケットおよびその他のプライム化サブサイトにおいて特に高い類似性が認められる類似した形態の活性部位のくぼみ。
【００６４】
ＴＡＣＥの触媒ドメイン（ＴＣＤ）には、以下のいくつかの点でアダマリシンＩＩとの違いもある：２６３残基であって連鎖がはるかに長いこと、ＴＡＣＥの付加的残基の大部分がクラスター化し、より突出したｈＡ−ｓＩＩターン、多ターンループの２つの表面隆起、ｓＩＶ−ｓＶリンカーの２つの「耳」およびより突出したｓＶ−ｈＣ連結部（図３および図５参照）を生じること、ＴＡＣＥにはカルシウム結合部位は存在しないが第３のジスルフィド架橋Ｃｙｓ２２５−Ｃｙｓ３３３が存在し、いずれの要素もＮ末端鎖を鎖ｓＩＩＩに固定するという同じ機能を果たすこと、ＴＡＣＥの非常に深いＳ３’ポケットはＳ１’ポケットと融合していること、プライム化サブサイトの内部および周辺の荷電パターンがほとんど反対であり、アダマリシンでは正の荷電が完全に主であること。
【００６５】
以上から、その配列およびおそらくはその三次元構造によれば、ＴＡＣＥ触媒ドメインは哺乳動物ＡＤＡＭ（アダマリシンと極めて相同性の高い触媒ドメインを有する膜結合型細胞表面蛋白質のファミリー（Ｗｏｌｆｓｂｅｒｇら、「受精および発生におけるＡＤＡＭｓ（ＡＤＡＭｓ ｉｎ Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」Ｄｅｖｅｌｏｐｍ． Ｂｉｏｌ． １８０、３８９〜４０１（１９９６）））の典型的なメンバーではない。ＴＡＣＥはおそらくはその「アウトサイダー」的な役割を、同じく若干のＴＡＣＥ様活性を示す上に（Ｌｕｎｎら、「ウシ脾臓からのＴＮＦα転換酵素としてのＡＤＡＭ １０の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＡＭ １０ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｌｅｅｎ ａｓ ａ ＴＮＦα ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）」、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４００、３３３〜３３５（１９９７））、そのショウジョウバエでの相当物（ｋｕｚ）がＮｏｔｃｈ受容体のプロセシングを行うことが最近示された（Ｒｏｏｋｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３、１２２７〜１２３１（１９９６））、（ウシ）ＡＤＡＭ １０（図３）と共有すると考えられる。ＡＤＡＭ １０にもおそらくＴＡＣＥに典型的な伸長型ｈＡ−ｓＩＩループおよび２つの「耳」は認められるものの、多ターン中間物の大きさはＴＡＣＥとアダマリシンとの中間であると思われる（図３参照）。ＡＤＡＭ １０の触媒ドメイン残基のうち９０個がＴＡＣＥと同一であることも密接な相同性をさらに裏づけるものであるが（図３参照）、その他の哺乳動物ＡＤＡＭはおそらくはアダマリシンＩＩとはるかに類似性が高いと思われる（Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈら、「ヘビ毒ジンクエンドペプチダーゼであるアダマリシンＩＩの精密化された２．０Ａ結晶構造（Ｒｅｆｉｎｅｄ ２．０Ａ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｎａｋｅ ｖｅｎｏｍ ｚｉｎｃ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ａｄａｍａｌｙｓｉｎ ＩＩ）」Ｊ． Ｍｄ． Ｂｉｄ． ２３９、５１３〜５４４（１９９４））。
【００６６】
ＴＡＣＥのＭＭＰとの構造的相同性は著しく低い。共通の二次構造要素の相対的配置はさらに異なり（トポロジー的に等価な約１２０個のＣα原子のｒｍｓ偏差が１．６Åと有意に大きいことに反映される）、ＭＭＰには特徴的なＴＡＣＥ／アダマリシン構造要素（中間ヘリックスｈＢおよび多ターンループ、第３の亜鉛結合性ヒスチジンの後方にあるＡｓｐ残基など）がないか、またはＴＡＣＥには認められない典型的な決定要因（構造性亜鉛、およびカルシウムイオンの組み込みなど）が認められる。しかし、二次構造の差はあるものの、ＴＡＣＥの活性部位のくぼみはＭＭＰのものと若干類似していて、非プライム化（左）側は平坦であり、狭いプライム化側は深いＳ１’ポケットの中心に位置する（図２ｂ）。このＭＭＰとのサブサイトの類似性は、種々のＭＭＰの阻害のために本来設計された合成ヒドロキサム酸阻害物質に対してＴＮＦα転換酵素の部分的感受性が認められていることの説明となる（ＤｉＭａｒｔｉｎｏら、「マトリックスメタロプロテイナーゼおよびＴＮＦαプロセシングに対するヒドロキサム酸に基づく偽ペプチド阻害物質の抗関節炎活性（Ａｎｔｉ−ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ ｐｓｅｕｄｏｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ＴＮＦα ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」Ｉｎｆｌａｍｍ． Ｒｅｓ． ４６、２１１〜２１５（１９９７））。ＴＩＭＰ−１構造を用いたモデル構築実験（Ｇｏｍｉｓ−Ｒｔｉｔｈら、「ヒトマトリックスメタロプロテイナーゼであるストロメライシン−１のＴＩＭＰ−１による阻害の機序（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−１ ｂｙ ＴＩＭＰ−１）」Ｎａｔｕｒｅ ３８９、７７〜８１（１９９７））では、ＴＡＣＥの活性部位領域内に明らかな障害物は認められず、このことから、ＴＩＭＰによる遮断に対する抵抗性が容易に説明されると考えられる。
【００６７】
以上の通り、このＴＣＤ結晶構造から、ＴＡＣＥの触媒ドメインがアダマリシン／ＡＤＡＭのそれとトポロジー的に類似しており、その基質結合部位がＭＭＰのものと共通するという科学的根拠が得られた。しかし、ＴＡＣＥは、表面輪郭、荷電および形状の点でいくつか特殊性があり、このために強力な選択的合成阻害物質の設計が容易となる。
【００６８】
阻害物質、メディエーターおよび生物的意義のある活性を有するその他の化合物などの、ＴＡＣＥと会合する化合物の設計および開発に際しては、ＴＡＣＥ触媒ドメインに特有の表面輪郭、荷電および形状ならびに他の物理的特徴を標的とする化合物を選択することが望ましい。一般に、この種の化合物はＴＡＣＥと物理的および構造的に会合しうることに加えて、そのＴＡＣＥとの会合を許容するような立体配座をとりうる。上記の特徴は当業者をこの点に関して指向させると考えられる。特に直鎖状官能基を備えた化合物は特に適すると思われる。このような化合物は、ＴＡＣＥ触媒ドメインの深いポケットを考慮すれば特に適すると考えられる。
【００６９】
ＴＡＣＥと会合する化合物を、例えば、ＴＡＣＥのＳ１’領域またはＳ１’Ｓ３’ポケットと会合するように設計してもよい。ＴＡＣＥと会合する化合物を（ｉ）亜鉛をキレート化する部分が組み入れられるように設計することも可能である。例となるさらなる化合物には、ＴＡＣＥのＬｅｕ３４８またはＧｌｙ３４９と水素結合を形成するように、（ｉｉ）ＴＡＣＥのＳ１’ポケットを占有する非極性基の導入、（ｉｉｉ）ＴＡＣＥのＳ１’−Ｓ３’ポケットをつなぐ経路の内部に位置し、経路と適切なファンデルワールス接触を生じる基の導入、および（ｉｖ）ＴＮＦ−α変換酵素の骨格アミノ基上のＬｅｕ３４８もしくはＧｌｙ３４９との水素結合の形成、または（ｖ）上記の任意の組み合わせが設計された化合物が含まれる。
【００７０】
コンピュータ可読媒体
本発明は、結晶性ＴＡＣＥポリペプチドのＸ線回折構造座標が記録されたコンピュータ可読媒体にも関する。本発明のコンピュータ可読媒体は、ＴＡＣＥ構造座標の保存、転送およびソフトウエアによる利用のために有用である。コンピュータ可読媒体は、フロッピーディスク、ハードディスク、コンピュータ型ランダムアクセスメモリ、読み出し専用メモリ、 フラッシュメモリ、ＣＤ−ＲＯＭ、記録可能および書換可能ＣＤ、記録可能および書換可能ＤＶＤ、光磁気ディスク、ＺＩＰドライブ、ＪＡＺドライブ、シクィスト（Ｓｙｑｕｉｓｔ）ドライブ、デジタルテープドライブなどを非制限的に含む、任意の適したデータ記憶材料であってよい。その他の適した媒体は当業者に周知であると考えられる。
【００７１】
１つの態様において、コンピュータ可読媒体は表１の座標またはその実質的部分を含む。コンピュータ可読媒体は、ＴＡＣＥポリペプチドまたはその任意の部分の三次元画像表示のための、明細書の全体を通じて特定された１つまたは複数のプログラムがロードされたコンピュータなどの、媒体上に記録されたデータを用いる指示によってプログラムされた機器とともに用いてもよい。
【００７２】
コンピュータを用いたシステム
図６は、ＴＡＣＥポリペプチドを検討するためのシステム１０００を示している。本システムは、ＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部を表す情報を記憶するビデオメモリ１１０を含む。メモリは、三次元空間における位置を特定する一組の空間座標が記録された少なくとも１つの第１種の記憶領域１１２、および複数のアミノ酸のうち１つの特徴を表す情報が記録された少なくとも１つの第２種の記憶領域１１４を含む。第２種の記憶領域は、三次元空間におけるＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の幾何学的配置を表すためにビデオメモリ１１０内で第１種の記憶領域と論理的に関連づけられている。メモリ１１２および１１４は、例えば、表１に示されたデータなどを含みうる。システム１０００は、メモリ１１０からのデータに基づいて三次元空間におけるＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の三次元画像を表示するための画像シグナルを生成することを目的として、第１種の記憶領域１１２および第２種の記憶領域１１４にアクセスするために連結されたプロセッサも含む。プロセッサは、ＣＰＵ、レジスタ、メモリなどを備えた任意の汎用プロセッサであってよい。ディスプレイ１３０は、画像データに基づいて三次元空間におけるＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の三次元画像をスクリーン１３２上に表示するために、画像シグナルを受け取る回線１２５を介してプロセッサ１２０と連結される。
【００７３】
本発明の１つの態様において、画像データには、図１に示されたものなどの、三次元空間におけるＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部のリボン構造の三次元画像を表示するためのデータが含まれる。もう１つの態様において、画像データには、図２に示されたものなどの、三次元空間における前記ＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部のソリッドモデル表示による三次元画像を表示するためのデータが含まれる。さらにもう１つの態様において、画像データには、図２に示されたものなどの、三次元空間におけるＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部の静電表面ポテンシャルの三次元画像を表示するためのデータが含まれる。さらにもう１つの態様において、画像データには、図４に示されたものなどの、三次元空間におけるＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部の三次元立体画像を表示するためのデータが含まれる。
【００７４】
本発明のシステム１０００は、ＴＡＣＥポリペプチド以外の組成物の特徴の幾何学的配置を表すデータを記憶するための記憶装置１４５、およびオペレータからの指示を受け取るためのマウス１３５などのオペレータ・インターフェースをさらに含む。記憶装置１４５は、例えば、他の化学的実体に関する三次元Ｘ線座標データを含みうる。プロセッサ１２０は、記憶装置１４５および前記オペレータ・インターフェース １３５に連結され、オペレータ・インターフェースからの指示に基づいて、ＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の前記三次元画像に対する組成物の特徴の幾何学的配置をスクリーン１３２上に表示するための付加的な画像データを生成する。図６の態様において、記憶装置１４５はメモリ１１０の一部である。
【００７５】
第１種の記憶領域１１２および前記第２種の記憶領域１１４は、例えば、半導体メモリ、光ディスクの領域または磁気メモリの領域などの領域である。
【００７６】
１つの態様において、プロセッサ１２０およびビデオメモリ１１０は、シリコングラフィックス（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ）社、サンマイクロシステムズ（Ｓｕｎ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）社およびＩＢＭ社などから販売されている、ＵＮＩＸまたはＶＡＸコンピュータ形式である。しかし、本発明はこの特定のハードウエアおよびソフトウエアの使用に限定されない。
【００７７】
以下の例示的な実施例において、本発明をさらに詳しく説明する。実施例は本発明の主な態様のみを表すものに過ぎないと思われるが、以下の実施例は例示的であって制限的ではないことが理解される必要がある。
【００７８】
実施例 １ ― ＴＡＣＥ ポリペプチドの発現、単離および精製
ブラック（Ｂｌａｃｋ）ら、「細胞から腫瘍壊死因子−αを放出させるメタロプロテイナーゼであるディスインテグリン（Ａ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｄｉｓｉｎｔｉｇｒｉｎ ｔｈａｔ ｒｅｌｅａｓｅｓ ｔｕｍｏｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：７２９〜７３３（１９９７年２月）に開示された通りの、ＴＡＣＥのシグナルペプチド、プロドメイン、および触媒ドメインであるアミノ酸残基１〜４７７位においてＳｅｒ２６６がＡｌａに変化し、Ａｓｎ４５２がＧｌｎに変化し、配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）６がＣ末端に付加されたものをコードするｃＤＮＡを、ＣＨＯ細胞用の発現ベクター中に挿入した。ＴＡＣＥポリペプチドをＣＨＯ細胞内で発現させたところ、Ｖａｌ２１２またはＡｒｇ２１５で始まるＴＡＣＥポリペプチドの混合物が分泌された。ベクターを取り込んでいない細胞を死滅させる薬物であるメトトレキサートの存在下で細胞を培養した。
【００７９】
発現されたＴＡＣＥポリペプチドを次に精製した。精製は、発現されたＴＡＣＥポリペプチドを含む５リットルの培地を用いて開始した。ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社のカットオフ値１０Ｋの１ｆｔ２ＴＦＦ透析濾過ユニットを用いて培地を約２００ｍＬに濃縮した。排出速度は５０〜１００ｍＬ／分とした。続いて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）および３００ｍＭ ＮａＣｌからなる緩衝液（緩衝液Ｅ）２リットルを試料に添加した。
【００８０】
試料を上記の通りに再濃縮し、２リットルの緩衝液Ｅで２回目の希釈を行い、再び再濃縮し、２リットルの緩衝液Ｅで３回目の希釈を行った後に約１００ｍＬに再濃縮した。．透析濾過ユニット内に残った試料をバックフラッシュ法によって回収した。続いて、この材料を０．４５μｍで濾過し、アジ化物を０．０５％となるように添加した。濾過した試料を４℃で一晩保存した。
【００８１】
濾過した試料を一晩保存した後に、イミダゾールを２００ｍＭの貯蔵水溶液から５ｍＭとなるように添加し、ＺｎＣｌ２を１Ｍの貯蔵水溶液から５μＭとなるように添加した。続いて試料を２．２ｍＬのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）Ｎｉ−ＮＴＡスーパーフロー（Ｓｕｐｅｒｆｉｏｗ）樹脂（カタログ番号３０４３０）に対して流速３ｍＬ／分で通過させた（カラムサイズ７．５×５０ｍｍ）。
【００８２】
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾールおよび５μＭ ＺｎＣｌ２からなる緩衝液（緩衝液Ａ）１００ｍＬにより、カラムを流速５ｍＬ／分で洗浄した。続いて、緩衝液Ａ中にて１分間で最大２００ｍＭまでイミダゾールの濃度を高める勾配を加え（総容積５ｍＬ）、続いて２００ｍＭイミダゾールを３５ｍＬ流すことにより、ＴＡＣＥポリペプチドを溶出させた。２ｍＬずつの画分を回収したが、ＴＡＣＥは一般に約６ｍＬから溶出する。画分は、５００μｌの５０％グリセリン水溶液および２００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８を含む管に回収した。グリセリン水溶液はカラム処理の当日に調製した。
【００８３】
各画分からの３μｌのドットブロットをアミドブラックで染色し、どの画分が意味のある量の蛋白質を含むかを判定した。意味のある量の蛋白質がみられた画分をプールした。続いてそのプールをカットオフ値１０Ｋのアミコンセントリプレップ（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）濃縮装置で１〜２ｍＬに濃縮した。
【００８４】
この濃縮試料に対して、阻害物質Ｎ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ヒドロキシアミノカルボニル）メチル−４−メチルペンタノイル｝−Ｌ−３−アミノ−２−ジメチルブタノイル−Ｌ−アラニン，２−（アミノ）エチルアミドを５０ｍＭの貯蔵水溶液から１ｍＭとなるように添加し、オクチルグルコシドを１０％貯蔵水溶液から１％となるように添加した。続いて、試料を室温で１５〜２４時間インキュベーションした。
【００８５】
インキュベーションの後に試料を、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷＧを充填し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセリンで平衡化した２１．５×６００ｍｍのサイズ排除カラムＬＫＢ ２１３５−３６５にかけた。続いてこの緩衝液をカラムに流速２．５ｍＬ／分で１００分間通した。溶出液中のＴＡＣＥポリペプチドは２８０ｎｍでの吸収によって検出した。除外した材料は一般に約３８分後に溶出した。ＴＡＣＥは一般に約７８分後またはそれ以後に溶出した。
【００８６】
どの画分をプールすべきかを判定するために、意味のある蛋白質がみられた全画分を１５μｌずつ用いてゲル分析を行った。サイズ排除クロマトグラフィーのプールを、カットオフ値１０Ｋのアミコンセントリプレップ濃縮装置で約１ｍＬに濃縮した。
【００８７】
続いて、この精製試料に対して、阻害物質Ｎ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ヒドロキシアミノカルボニル）メチル−４−メチルペンタノイル｝−Ｌ−３−アミノ−２−ジメチルブタノイル−Ｌ−アラニン，２−（アミノ）エチルアミドを１ｍＭの濃度となるように添加した。蛋白質は４℃で保存可能である。
【００８８】
実施例 ２ ―蛋白質の結晶化
ヒトＴＡＣＥのプロドメインおよび触媒ドメイン（残基１〜４７７位）を含むＤＮＡ構築物を、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティーカラムによる蛋白質の精製が容易になるように配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）６と融合させた。蛋白質の発現にはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を用いた。この細胞は、Ｖａｌ２１２またはＡｒｇ２１５のいずれかで始まる成熟型ＴＡＣＥの混合物を分泌した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムから得られたＴＡＣＥ含有画分を、オクチルグルコシドおよび結合パートナーＮ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ヒドロキシアミノカルボニル）メチル−４−メチルペンタノイル｝−Ｌ−３−アミノ−２−ジメチルブタノイル−Ｌ−アラニンを含む緩衝液中でインキュベーションした。最終的な精製段階はゲル濾過カラムで行った。精製されたＴＡＣＥを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ（ｐＨ ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセリンおよび１ｍＭの阻害物質を含む緩衝液（ＴＡＣＥ緩衝液）中で保存した。
【００８９】
結晶化実験は、ＴＡＣＥ（ＴＡＣＥ緩衝液中）を以下に列挙する結晶化緩衝液と１：１の比で混合することによってＴＡＣＥ濃度を約５ｍｇ／ｍＬとし、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて行った。実験は２回ずつ行い、インキュベーションは約４℃または２０℃のいずれかで行った。結晶性沈殿物は２０℃で以下の結晶化緩衝液中に得られた：
緩衝液Ａ） ０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．３）、０．２Ｍ ＣａＣＩ２、３０％ｖ／ｖエタノール
緩衝液Ｂ） ０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ ５．０）、４０％ｖ／ｖエタノール
緩衝液Ｃ） ０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ ８．７）、２０％ｗ／ｖ ＰＥＧ ４０００、２０％ｖ／ｖイソプロパノール
【００９０】
結晶性沈殿物からの種を、ウサギ毛とともに、ＴＡＣＥ濃縮試料（１２ｍｇ／ｍＬ、ＴＡＣＥ緩衝液中）と緩衝液ＢまたはＣのいずれかとの１：１混合物中に移したところ、小さな結晶が得られた。緩衝液Ｃをさらに改良した結果、緩衝液Ｄが得られ、これによってＸ線データの収集に適した結晶の作製が可能となった。
緩衝液Ｄ） ０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ ５．４）、２０％ｗ／ｖ ＰＥＧ ４０００、２０％ｖ／ｖイソプロパノール
【００９１】
第１のデータセットは、グラファイトで単色化されたＣｕＫα放射線が得られる５．４ｋＷで動作させた理学電機（Ｒｉｇａｋｕ−Ｄｅｎｋｉ）トータリングＣｕ陽極線発生装置に装着したＭＡＲ３００イメージングプレートスキャナーを用いて、分解能２．５Åで測定した。データ処理にはＭＯＳＦＬＭ ｖ． ５．２３プログラムおよびＣＣＰ４パッケージソフト（ｓｕｉｔｅ）のルーチンを用いた。アダマリシンＩＩ、アダマリシンＩＩの全アラニンモデルおよび生成されたモデルを用いる分子置換法によって構造を解明しようとの試みではいずれもフェージングのための有用な開始点は得られなかった。このため、異常差に関するパターソン合成を利用して、独立した４つの亜鉛原子の位置を決定した。ＭＡＤデータを測定するために結晶を液体窒素中で急速冷凍した。このためには、適切なサイズの絹糸ループを利用して結晶を冷凍緩衝液（１７％ｖ／ｖグリセリンを含む８０％ｖ／ｖ緩衝液Ｄ）中に移し、約１０秒間浸漬した後に９０Ｋ゜で直ちに急速冷凍した。
【００９２】
得られた結晶は単斜晶系空間群Ｐ２１に属し、格子定数はａ＝６１．３８Å（オングストローム）、ｂ＝１２６．２７Å、ｃ＝８１．２７Å、β＝１０７．４１゜であり、非対称格子内に４分子を含む。
【００９３】
実施例 ３ ― Ｘ 線回折
実施例２で述べた結晶を用いて、第１のデータセットを、グラファイトで単色化されたＣｕＫα放射線が得られる５．４ｋＷで動作させた理学電機（Ｒｉｇａｋｕ−Ｄｅｎｋｉ）トータリングＣｕ陽極線発生装置に装着したＭＡＲ３００イメージングプレートスキャナーを用いて、分解能２．５Åで測定した。データ処理にはＭＯＳＦＬＭ ｖ． ５．２３プログラムおよびＣＣＰ４パッケージソフトのルーチンを用いた。
【００９４】
アダマリシンＩＩ、アダマリシンＩＩの全アラニンモデルおよびその他のモデルを用いる分子置換法によって構造を解明しようとの試みではいずれもフェージングのための有用な開始点は得られなかった。
【００９５】
このため、異常差に関するパターソン合成を利用して、独立した４つの亜鉛原子の位置を決定した。ＭＡＤデータを測定するために、液体窒素の温度まで冷却した窒素気流中で結晶を急速冷凍した。８０％ｖ／ｖ緩衝液Ｄである冷凍緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ ５．４）、２０％ｗ／ｖ ＰＥＧ ４０００、２０％ｖ／ｖイソプロパノール）に１７％ｖ／ｖグリセリンを含むものの中に結晶をまず移した。冷凍緩衝液への移行には適切なサイズの絹糸ループを用いた。結晶を冷凍緩衝液中に約１０秒間浸漬した後、９０Ｋ゜で直ちに急速冷凍した。
【００９６】
分解能２．０Åまでの異常回折データを、ドリス（ＤＯＲＩＳ）（ＤＥＳＹ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＢＷ６ウィグラービームライン装置に装着したＭＡＲ３４５イメージングプレートスキャナーにより、亜鉛のＫ吸収端である最大ｆ’’（１．２７６９Å）および最小ｆ’’（１．２７７６Å）の波長、ならびに隔たった波長（１．０６０Å）の単色Ｘ線放射線を用いて、９０Ｋで収集した。データのスキャニングおよび評価はＤＥＮＺＯ／ＳＣＡＬＥＰＡＣＫを用いて行い、１０５１８３６回の測定で７７６５３個の独立した反射が得られた（完全性９６．９％、Ｒ融合（Ｒ−ｍｅｒｇｅ）強度０．０３１）。
【００９７】
ＭＡＤフェーズの精密化および算出は、解像度２．０Åまでのすべての測定データを含め、ＭＬＰＨＡＲＥを用いて行った。平均性能示数（ｍｅａｎ−ｆｉｇｕｒｅ−ｏｆ−ｍｅｒｉｔ） の初期値は０．５３であり、ＤＭを用いる溶媒フラットニング／ヒストグラムマッチング法によって０．７６に高まった。この密度により、４つの独立したＴＡＣＥ触媒ドメインおよび結合したヒドロキサム酸基質の完全鎖をＳＧＩシステム上でＴＵＲＢＯ−ＦＲＯＤＯを用いて構築することが可能となった。このモデルをＸＰＬＯＲおよびＣＣＰ４ルーチンを用いて結晶学的に精密化し、解像度１２．０から２Åまでの独立した７９４００個の反射を用いて、結晶学的Ｒ因子を１８．６％（Ｒｆｒｅｅ ２７．４％）とした。
【００９８】
４つの独立したＴＡＣＥ分子は周期的配置を生じる。
【００９９】
分子１および２、ならびに３および４はそれぞれＡｓｐ２１９およびＭｅｔ２２１からＳｅｒ４７４までと定義される。
【０１００】
実施例 ４ ― Ｘ 線回折
分解能２．０Åまでの異常回折データを、ドリス（ＤＯＲＩＳ）社（ＤＥＳＹ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のウィグラービームライン装置に装着したＭＡＲ３４５イメージングプレートスキャナーにより、亜鉛のＫ吸収端である最大ｆ’（１．２７９７Å）および最小ｆ’（１．２８０４Å）の波長、ならびに隔たった波長（１．０６０Å）の単色Ｘ線放射線を用いて、１００Ｋで収集した。これらのデータの評価およびスキャニングはＤＥＮＺＯ／ＳＣＡＬＥＰＡＣＫを用いて行い、７７，６５３個の独立した反射を得た（完全性９６．９％、Ｒ融合強度０．０３１）。
【０１０１】
得られた構造座標を表１に転載する。
【表１】
【０１０２】
実施例 ５ ― ＴＡＣＥ 阻害物質の設計
ＴＡＣＥのＸ線回折座標をＳｙｂｙｌ ｖ．６．３（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）ソフトウエアパッケージにて読み取り、Ｘ線構造の画像解析を行った。本来のＸ線座標内部の領域をキラリティーおよび原子の種類に関して補正した。補正されたＴＡＣＥのＸ線モデルに対して、すべてのＴＡＣＥ構造パラメーターが平衡または最適値に達するまでエネルギー最小化を行った。エネルギー最小化が得られた構造を本来の構造と比較し、異常がないことを確かめた。
【０１０３】
ＴＡＣＥと共結晶化された阻害物質との間の特異的相互作用の部位を同定した。続いて、阻害物質をＸ線複合体モデルから除去し、ＴＡＣＥ構造モデルのみが残るようにした。
【０１０４】
候補阻害物質は、共結晶化された阻害物質に関して以前に同定された相互作用部位に鑑み、ＴＡＣＥと候補阻害物質との相互作用部位に基づいて選択した。特異的な候補阻害物質−ＴＡＣＥ相互作用が決定されたところで、選択された候補化合物とＴＡＣＥとの予備的に「モデル化された」複合体を得るために、市販のドッキング用ソフトウエアを用いるドッキング試験を行った。
【０１０５】
モデル化されたＴＡＣＥ−阻害物質複合体の完全性を検査するために、分子動力学（ＭＤ）を用いて拘束的配座解析（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。複合体が最も都合のよい立体配座状態に到達したところで、ＭＤ試験によって提示された構造の画像解析を行い、測定された結合親和性に基づいて、モデル化された複合体が既知の実験的ＳＡＲ／ＱＳＡＲと適合することを確かめた。
【０１０６】
モデル化された候補阻害物質−ＴＡＣＥ複合体を解析した。少量の溶媒に露出された経路（ｃｈａｎｎｅｌ）を含むＴＡＣＥのＳ１’領域と会合する複合体の領域を、修飾のための標的領域として選択した。コンピュータ計算および合成化学の原理に基づき、１つのベンジル基が標的領域内部に埋め込まれるようになる単独の修飾を選択した。このベンジル基を、Ｓ１’ Ｓ３’ポケット内に入り込むように適切な亜鉛キレーターコアに対して配向させた。この修飾により、一般にＭＭＰ選択性であった阻害物質がＴＡＣＥ選択性となった。ベンジル修飾を加えた阻害物質に関するＩＣ５０データから、この選択性が裏づけられた。
【０１０７】
阻害物質の効力、選択性および物理的薬物様特性の最適化のための構造に基づく類似体化（ａｎａｌｏｇｉｎｇ）を、反復的な様式で行った。
【０１０８】
実施例 ６ ― ＴＡＣＥ 阻害の測定
２５０μＭのペプチド基質（Ａｃ−ＳＰＬＡＱＡＶＲＳＳＳＲ−ＮＨ２）を、１０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１０％グリセリンを含む２５℃の緩衝液中で３．７Ｕ／μＬのＴＡＣＥとともにインキュベーションした。２時間後に１％ＴＦＡ（最終濃度）によって反応を停止させた。ヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）１１５０を用いるＨＰＬＣによって反応混合物を分離した。産物の形成は２２０ｎｍでの吸光度によってモニターした。
【０１０９】
反応の線形性が確認された（ｒ２＞０．８５）。対照速度の平均値（ｘ±ｓｅｍ）を算出し、ダネットの多重比較検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ）を用いて、統計学的有意性（ｐ＜０．０５）に関して薬物試験時の速度と比較した。複数の投薬量を用いて用量反応関係を検討し、線形回帰を用いて、ＩＣ５０値を９５％ＣＩとともに推定した。
【０１１０】
以上の説明および実施例により、当業者は本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明の範囲または精神を逸脱することなく、さまざまな用途および条件に適合するように本発明に変更、修正および変化を加えることができる。さらに、米国仮特許出願第６０／０７３，７０９号および米国特許出願第０９／０５０，０８３号を含む、上記に言及されたすべての刊行物および特許出願の開示は、それぞれが参照として組み込まれるように個別に示されている場合と同程度にそれらの全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＡＣＥ触媒ドメイン（ＴＣＤ）のリボン図（ｒｉｂｂｏｎ ｄｉａｇｒａｍ）である。鎖は左下の奥の方から始まり、構造要素ｓＩ、ｈＡＩ、ｈＡ、ｓＩＩ、ｈＢ、ｈＢ２、ｓＩＩＩ、ＩＶ、ＩＶａ、ｓＩＶｂ、ｓＶ、ｈＣ、ＭｅｔターンおよびｈＤを経て、左上の奥で終わる。３つのジスルフィド結合を結線として示し、硫黄を小球として表している。触媒性亜鉛（中央の球）はＨｉｓ４０５、Ｈｉｓ４０９およびＨｉｓ４１５という３つのイミダゾール基、ならびに阻害物質のヒドロキサム酸基のヒドロキシルおよびカルボニル酸素原子による配位を受ける。ペプチド基質のプライム化部位残基の相互作用を模倣する阻害物質の全体を示している。図１はＳＥＴＯＲを用いて作成した。エバンス（Ｅｖａｎｓ， Ｓ．）「ＳＥＴＯＲ：ハードウエア照光による巨大分子の三次元ソリッドモデル表示（ＳＥＴＯＲ：Ｈａｒｄｗａｒｅ Ｌｉｇｈｔｅｄ Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｓｏｌｉｄ Ｍｏｄｅｌ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」Ｊ． Ｍｏｌ． Ｇｒａｐｈ． １１：１３４〜１３８（１９９３）を参照されたい。
【図２ａおよび２ｂ】ＴＡＣＥ（ＴＣＤ）（図２ａ）およびＭＭＰ−３（図２ｂ）の触媒ドメインのソリッドサーフェス（ｓｏｌｉｄ ｓｕｒｆａｃｅ）表示である。静電表面ポテンシャルを−１５（濃い赤）から１５（濃い青）ｋ８Ｔ／ｅまで色分けしている。活性部位のくぼみ（ｃｌｅｆｔ）は両方とも左から右に延び、触媒性亜鉛原子（球）が中央に位置する。ＴＡＣＥの内部に結合した阻害物質の全体構造が示されており、イソブチル（Ｐ１’）およびＡｌａ（Ｐ３’）側鎖がＳ１’および新規Ｓ３’ポケットの深部に結合している。配向は図１と類似している。図２ａおよび２ｂはＧＲＡＳＰを用いて作成した。ニコリス（Ｎｉｃｏｌｌｓ， Ａ．）、バラドワジ（Ｂｈａｒａｄｗａｊ， Ｒ．）およびフイグ（Ｈｏｕｉｇ， Ｂ．）、「Ｇｒａｓｐ―表面特性の画像表示および解析（Ｇｒａｓｐ−Ｇｒａｐｈｉｃａｌ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、Ｂｉｏｐｈｙｓ． ６４、Ａ１６６（１９９３）。
【図３】アダマリシン（ａｄａｍａｌｙｓｉｎ）ＩＩ（ＡＤＡＭ＿ＣＲＯＡＤ）、ＴＡＣＥおよびヒトＡＤＡＭ １０（ｈＡＤＡＭ１０）の触媒ドメイン配列を、それらのトポロジー的同等性および配列類似性に従ってそれぞれ整列化したものである。残基数は一般的なＴＡＣＥの番号付けによる。矢印および中括弧は、ＴＡＣＥにおけるβ鎖およびαヘリックスを表す。
【図４】触媒性亜鉛（中央の大きな球）の周囲の最終的な２．０Å電子密度の立体断片図を最終的なＴＡＣＥモデルと重ね合わせたものである。亜鉛に配位するＨｉｓ４０５（上）、Ｈｉｓ４０９（左）およびＨｉｓ４１５（下）の３つのイミダゾール環、「触媒性」Ｇｌｕ４０６ならびに阻害物質のヒドロキサム酸部分が認められる。配向は図１と類似している。図４はＴＵＲＢＯ−ＦＲＯＤＯを用いて作成した。ルーセル（Ｒｏｕｓｓｅｌ， Ａ．）およびカンベロー（Ｃａｍｂｉｌｌｅａｕ， Ｃ．）、「シリコングラフィックス式形態におけるＴｕｒｂｏ−Ｆｒｏｄｏ（Ｔｕｒｂｏ−Ｆｒｏｄｏ ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｇｅｏｍｅｔｒｙ）」、Ｐａｒｔｎｅｒｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ（１９８９）。
【図５】ＴＡＣＥ（明）およびアダマリシン（暗）の触媒ドメインのリボン図を重ね合わせたものである。ＴＡＣＥの触媒性亜鉛（球）ならびに３つ（ＴＡＣＥ）および２つの（アダマリシン）ジスルフィド架橋も示されている。配向は図１と類似している。図５はＧＲＡＳＰを用いて作成した。
【図６】ＴＮＦ−α変換酵素の少なくとも一部の表示画面を生成するための情報を記憶するビデオメモリを含む、ＴＮＦ−α変換酵素を研究するためのシステムを示している。
関連出願に関する情報
本出願は、１９９８年２月４日に提出された米国仮特許出願第６０／０７３，７０９号、１９９８年３月３０日に提出された米国特許出願第０９／０５０，０８３号（１９９９年１月２７日に提出された請願に従って米国仮出願に変更される予定）、および１９９９年１月２７日に提出された「結晶性ＴＮＦ−α変換酵素およびその使用」と題する米国仮特許出願による優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
サイトカインである腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）は、炎症反応において一定の役割を果たすほか、腫瘍細胞に対する細胞傷害性をもつことが知られている。しかし、ＴＮＦαは過剰に産生されると、最終的には多臓器不全および死に至るような重篤な障害を人体にもたらすことがある。ビーメルマンス（Ｂｅｍｅｌｍａｎｓ）ら、「腫瘍壊死因子：機能、放出および排出（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、ＲｅｌｅａｓｅおよびＣｌｅａｒａｎｃｅ）」、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎ． １６：１〜１１（１９９６）を参照のこと。
【０００３】
腫瘍壊死因子−αは、単核食細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞およびＮＫ細胞などの活性化細胞によって産生される。ＴＮＦαには２つの存在形態がある：１つは相対分子質量が２６ｋＤのＩＩ型膜蛋白質であり、もう１つは膜型蛋白質の分解によって生じる可溶性１７ｋＤ型である。ＴＮＦα膜蛋白質は２２３アミノ酸からなる膜アンカー型前駆体から合成される。可溶性ＴＮＦαは膜アンカー型プロテイナーゼによって膜結合型前駆体から放出される。最近、このプロテイナーゼは、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）と呼ばれる多ドメイン型メタロプロテイナーゼとして同定された。ブラック（Ｂｌａｃｋ）ら、「細胞から腫瘍壊死因子−αを放出させるメタロプロテイナーゼであるディスインテグリン（Ａ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｄｉｓｉｎｔｉｇｒｉｎ ｔｈａｔ ｒｅｌｅａｓｅｓ ｔｕｍｏｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：７２９〜７３３（１９９７）、モス（Ｍｏｓｓ）ら、「腫瘍壊死因子−α前駆体のプロセシングを行うディスインテグリン・メタロプロテイナーゼのクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｄｉｓｉｎｔｉｇｒｉｎ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｔｈａｔ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｔｕｍｏｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α）」、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：７３３〜７３６（１９９７）参照のこと。ＴＡＣＥは最近、Ｎ末端シグナルペプチド、プロドメイン、フリン（ｆｕｒｉｎ）切断部位（２１１〜２１４残基）の前に位置する２６３残基の触媒ドメイン（ＴＣＤ）、ディスインテグリンドメイン、ＥＧＦ様ドメインおよびクランビン（ｃｒａｍｂｉｎ）様ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ヘリックスと思われる部分、ならびに細胞内Ｃ末端尾部からなるジンクエンドペプチダーゼとして同定された。腫瘍壊死因子−α変換酵素（ＴＡＣＥ）は、ポリヌクレオチド配列を含め、刊行されたＰＣＴ出願・国際公開公報第９６／４１６２４号に詳細に記載されており、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０００４】
上記の通り、ＴＮＦαの過剰産生または無秩序な産生は、生理的に重大な脅威をもたらす。これは、慢性関節リウマチ、悪液質および内毒素ショックなどの種々の有害な生理的疾患に関与するとみなされている。また、これが最終的に臓器不全および死に至ることもある。このため、ＴＮＦαの循環系への放出を抑制または遮断する手法が必要である。ＴＡＣＥがＴＮＦαの変換に関与することから、ＴＡＣＥの阻害、修飾または調節は、ＴＮＦαの循環系への放出に影響を及ぼすと考えられる。メタロプロテイナーゼの阻害物質、および構造に基づくその設計は、ザスク（Ｚａｓｋ）ら、「マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害：構造に基づく設計（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｂａｓｅｄ Ｄｅｓｉｇｎ）」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ、２：６２４〜６６１（１９９６）に記載されている。したがって、阻害物質、受容体または修飾物質（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）などのＴＡＣＥと会合する化合物は、腫瘍壊死因子−αの過剰産生または無秩序な産生に伴う有害作用から患者を保護するために有用と考えられる。
【０００５】
発明の概要
本発明の１つの局面によれば、ポリペプチドがＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドである、結晶形状にあるポリペプチドを含む組成物が提供される。１つの態様において、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドはＴＮＦ−α変換酵素の触媒ドメインを含む。もう１つの態様において、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドは、ＴＮＦ−α変換酵素のプロドメインおよび触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドの発現産物である。１つのさらなる態様において、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドは、ＴＮＦ−α変換酵素のアミノ酸残基１〜４７７位をコードするポリヌクレオチドの発現産物である。さらにもう１つの態様において、ポリヌクレオチドはアミノ酸残基Ｓｅｒ２６６がＡｌａに変化し、アミノ酸残基Ａｓｎ５４２がＧｌｎに変化するように置換され、配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）６をコードする第２のポリヌクレオチドはＣ末端と融合される。
【０００６】
本発明のもう１つの局面によれば、上記の組成物は、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドとの共結晶化（ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）に適した結合パートナー（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ）をさらに含む。１つの態様において、結合パートナーはヒドロキサム酸に基づく結合パートナーである。もう１つの態様において、結合パートナーはＮ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ヒドロキシアミノカルボニル）メチル−４−メチルペンタノイル｝−Ｌ−３−アミノ−２−ジメチルブタノイル−Ｌ−アラニン，２−（アミノ）エチルアミド（Ｎ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ｈｙｄｒｏｘｙａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−４−ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ｝−Ｌ−３−ａｍｉｎｏ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ，２−（ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ ａｍｉｄｅ）である。
【０００７】
さらなる態様によれば、上記の組成物は、２．０Åで回折し、単斜晶系であって、結晶学的に独立した４つのＴＮＦ−α変換酵素触媒ドメイン（ＴＣＤ）分子を含む単位格子を有し、ＴＣＤ分子が非対称格子内にあり、ならびに／または単斜空間群Ｐ２１であって、格子定数がａ＝６１．３８Ａ、ｂ＝１２６．２７Ａ、ｃ＝８１．２７Ａおよびβ＝１０７．４１゜である、結晶構造を有する。
【０００８】
本発明のさらにもう１つの態様において、上記のポリペプチドは、表１による構造座標またはその実質的部分を特徴とする。
【０００９】
本発明の１つのさらなる局面によれば、（Ａ）ＴＡＣＥポリペプチドおよび結合パートナーを含む溶液を結晶化緩衝液と混合する段階、ならびに（Ｂ）結晶性沈殿物を形成させるためにドロップ蒸気拡散法（ｄｒｏｐ ｖａｐｏｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）によって段階（Ａ）の混合物を結晶化させる段階を含む、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの結晶化のための方法が提供される。１つの態様において、本方法はさらに、（Ｃ）ドロップ蒸気拡散法によって形成された結晶性沈殿物からの種（ｓｅｅｄ）および結晶化促進物質を、ＴＡＣＥポリペプチドおよび結合パートナー基質を含む濃縮溶液と結晶化緩衝液との混合物中に移す段階、ならびに（Ｄ）結晶を形成させるためにドロップ蒸気拡散法によって段階（Ｃ）の混合物を結晶化させる段階を含む。もう１つの態様において、結晶化緩衝液は０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ ５．４）、２０％ｗ／ｖ ＰＥＧ ４０００および２０％ｖ／ｖイソプロパノールである。さらにもう１つの態様において、結合パートナーはＮ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ヒドロキシアミノカルボニル）メチル−４−メチルペンタノイル｝−Ｌ−３−アミノ−２−ジメチルブタノイル−Ｌ−アラニン，２−（アミノ）エチルアミドである。さらにもう１つの態様において、結晶化は４〜２０℃の範囲の温度で行われる。もう１つの態様において、ＴＡＣＥポリペプチドおよび阻害物質を含む溶液は、緩衝液中に約５ｍｇ／ｍＬから約１２ｍｇ／ｍＬまでの濃度である。１つのさらなる態様において、ＴＡＣＥポリペプチドおよび結合パートナーを含む溶液は結晶化緩衝液と１：１の比で混合される。
【００１０】
本発明のさらにもう１つの局面によれば、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドと共結晶化基質との共結晶化によって作られる腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）変換酵素結晶が提供される。
【００１１】
本発明のさらにもう１つの局面によれば、ＴＮＦ−α変換酵素の触媒ドメインまたはその一部に関するＸ線結晶学的座標データが記録されたコンピュータ可読媒体（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｒｅａｄａｂｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）が提供される。１つの態様において、コンピュータ可読媒体上には、表１に示すＸ線結晶学的座標データまたはその一部が記録される。もう１つの態様において、媒体はフロッピーディスク、ハードディスク、コンピュータテープ、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＣＤ、ＤＶＤ、磁気ディスクおよび光ディスクからなる群から選択される。さらにもう１つの態様において、データ利用のための指示がプログラムされた装置とともに用いた場合にＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドまたはその一部の三次元画像表示用の画像シグナルを生成しうるコンピュータ可読媒体であるようなコンピュータ可読媒体上に、機械可読データが記録される。
【００１２】
本発明の１つのさらなる局面によれば、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドを研究するためのシステムであって、（ａ）ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部を表す情報を記憶しうるメモリであって、前記メモリが三次元空間における位置を特定する一組の空間座標を含む少なくとも１つの第１種の記憶領域と、複数のアミノ酸のうち１つの特徴を表す方法を含む少なくとも１つの第２種の記憶領域とを含み、前記第２種の記憶領域が前記三次元空間における前記ＴＮＦ−α変換酵素ペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の幾何学的配置を表すために前記メモリにおいて前記第１種の記憶領域と論理的に関連づけられているようなメモリ、（ｂ）前記第１種の記憶領域および前記第２種の記憶領域にアクセスするために前記メモリと連結されたプロセッサであって、前記メモリからのデータに基づいて前記三次元空間における前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の三次元像を表す画像を描写するための画像シグナルを生成するプロセッサ、ならびに（ｃ）前記画像シグナルを受け取るために前記プロセッサと連結されたディスプレイであって、前記画像シグナルに基づく前記三次元空間における前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の三次元画像を描写するディスプレイ、を含むシステムが提供される。本発明の１つの態様において、画像シグナルには、前記三次元空間における前記ＴＮＦα変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部のリボン構造の三次元画像を描写するためのシグナルが含まれる。本発明のもう１つの態様において、画像シグナルには、前記三次元空間における前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部のソリッドモデル表示による画像を描写するためのシグナルが含まれる。本発明のさらにもう１つの態様において、画像シグナルには、 前記三次元空間における前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の静電表面ポテンシャル（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）の三次元画像を描写するためのシグナルが含まれる。本発明のさらにもう１つの態様において、画像シグナルには、前記三次元空間における前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の三次元立体画像を描写するためのシグナルが含まれる。本発明の１つのさらなる態様において、システムはさらに、前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド以外の組成物の特徴の幾何学的配置を表すデータを記憶しうる記憶装置、およびオペレータからの指示を受け取るためのオペレータ・インターフェースであって、前記プロセッサが前記記憶装置および前記オペレータ・インターフェースと連結され、オペレータ・インターフェースからの指示に基づいて前記ディスプレイ上に前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の前記三次元画像と対比して前記組成物の前記特徴の前記幾何学的配置を描写するための付加的な画像シグナルを生成するような、記憶装置およびオペレータ・インターフェースを含む。１つの態様において、記憶装置は前記メモリの一部である。もう１つの態様において、システムは複数の第１種および第２種の記憶領域を含む。
【００１３】
本発明のもう１つの局面によれば、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の表示画面を生成するための情報を記憶しうるビデオメモリであって、以下の特徴を備えるビデオメモリが提供される：（ａ）それぞれが三次元空間における位置を特定する一組の空間座標を含む、少なくとも１つの第１種の記憶領域、および（ｂ）それぞれが複数のアミノ酸のうち１つの特徴を画像表示するための情報を含む、少なくとも１つの第２種の記憶領域であって、前記三次元空間における前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の幾何学的配置を表すための前記ビデオメモリにおいて前記第１種の記憶領域と論理的に関連づけられている第２種の記憶領域。１つの態様において、第２種の記憶領域は、前記三次元空間における前記ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの触媒ドメイン部分の少なくとも１つの特徴の幾何学的配置を表すための前記ビデオメモリにおいて前記第１種の記憶領域と論理的に関連づけられている。もう１つの態様において、第１種の記憶領域および前記第２種の記憶領域は半導体メモリの領域である。さらにもう１つの態様において、第１種の記憶領域および前記第２種の記憶領域は光ディスクの領域である。さらにもう１つの態様において、第１種の記憶領域および前記第２種の記憶領域は磁気メモリの領域である。１つのさらなる態様において、ビデオメモリは複数の第１種および第２種の記憶領域を含む。
【００１４】
本発明のさらにもう１つの局面において、ＴＮＦ−α変換酵素と会合する化合物を同定する方法であって、（Ａ）ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド結晶のＸ線回折座標に基づく、ＴＮＦ−α変換酵素触媒ドメインと結合を形成する前記ポリペプチドに対する会合性化合物の設計、（Ｂ）前記化合物の合成、および（Ｃ）前記化合物の前記ＴＮＦ−α変換酵素との会合能の決定、を含む方法が提供される。１つの態様において、会合性化合物は阻害物質、修飾物質またはＴＮＦ−α変換酵素活性を調節するその他の化合物である。もう１つの態様において、会合性化合物は競合的阻害物質、不競合的阻害物質または非競合的阻害物質である。さらにもう１つの態様において、座標は表１の座標またはその実質的部分である。１つのさらなる態様において、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド結晶はＴＮＦ−α変換酵素の触媒ドメインを含む。さらにもう１つの態様において、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドはＴＮＦ−α変換酵素のプロドメインおよび触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドの発現産物である。さらにもう１つの態様において、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドはＴＮＦ−α変換酵素のアミノ酸残基１〜４７７位をコードするポリヌクレオチドの発現産物である。もう１つの態様において、ポリヌクレオチドはアミノ酸残基Ｓｅｒ２６６がＡｌａに変化し、アミノ酸残基Ａｓｎ５４２がＧｌｎに変化するように置換され、配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）６をコードする第２のポリヌクレオチドはＣ末端と融合される。１つのさらなる態様において、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド結晶は結合パートナーとともに共結晶化される。さらにもう１つの態様において、結合パートナーは、ヒドロキサム酸に基づく結合パートナーまたはＮ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ヒドロキシアミノカルボニル）メチル−４−メチルペンタノイル｝−Ｌ−３−アミノ−２−ジメチルブタノイル−Ｌ−アラニン，２−（アミノ）エチルアミドである。さらに他の態様において、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド結晶は、２．０Åで回折し、単斜晶系であり、結晶学的に独立した４つのＴＮＦ−α変換酵素触媒ドメイン（ＴＣＤ）分子を含む単位格子を有し、ＴＣＤ分子が非対称格子内にあり、ならびに／または単斜空間群Ｐ２１であって格子の定数がａ＝６１．３８Å、ｂ＝１２６．２７Å、ｃ＝８１．２７Åおよびβ＝１０７．４１゜である、結晶構造を有する。本発明のさらにもう１つの態様において、会合性化合物はＴＮＦ−α変換酵素のＳ１’領域と会合するように設計される。さらにもう１つの態様において、会合性化合物はＴＮＦ−α変換酵素のＳ１’Ｓ３’ポケットと会合するように設計される。本発明のさらに他の態様において、会合性化合物は（ｉ）亜鉛をキレート化する部分を組み入れる、（ｉｉ）ＴＮＦ−α変換酵素のＬｅｕ３４８もしくはＧｌｙ３４９と水素結合を形成する、（ｉｉｉ）ＴＮＦ−α変換酵素のＳ１’ポケットを占有する非極性基を導入する、（ｉｖ）ＴＮＦ−α変換酵素のＳ１’−Ｓ３’ポケットをつなぐ経路（ｃｈａｎｎｅｌ）内に位置し、その経路と適切なファンデルワールス接触を行う基を導入する、および／または（ｖ）ＴＮＦ−α変換酵素の骨格アミド基上のＬｅｕ３４８またはＧｌｙ３４９と水素結合を形成するように設計される。
【００１５】
本発明の以上およびその他の局面は、本明細書に含まれる教示に鑑みて、当業者には明らかになると考えられる。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、高度に精製された腫瘍壊死因子−α変換酵素（ＴＡＣＥ）ポリペプチド、ＴＡＣＥポリペプチドの製造および精製の方法、ＴＡＣＥポリペプチドの結晶化の方法、ならびにＴＡＣＥポリペプチド結晶に関する。本発明はさらに、ＴＡＣＥポリペプチド結晶を用いたＸ線回折法、およびＴＡＣＥポリペプチドのＸ線結晶学的構造座標を得る方法、ならびに構造座標それ自体に関する。さらにまた、本発明は、ＴＡＣＥポリペプチドの三次元構造を解明するためのＴＡＣＥポリペプチドの構造座標の使用、ならびにＴＡＣＥと会合する化合物の設計および開発に関する。本発明に従って提供される三次元構造および構造座標の知見が得られれば、当業者はＴＡＣＥと相互作用すると思われる化合物を製造することができる。このような相互作用性化合物は、蛋白質工学（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）（ＯｘｅｎｄｅｒおよびＦｏｘ編）（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９８７）に開示されているものを含む、種々の技法および設計基準によって製造することができる。
【００１７】
本明細書で用いるＴＡＣＥとは、２６ｋＤの細胞膜結合型ＴＮＦαをＴＮＦα蛋白質のＣ末端１５６残基を含む可溶性１７ｋＤ型へと変換しうる一群のポリペプチドを意味する。ＴＡＣＥには、その全体が参照として本明細書に組み入れられるＰＣＴ出願・国際公開公報第９６／４１６２４号に記載されたアミノ酸配列を有する蛋白質のほか、このような配列とアミノ酸レベルでの相同性がある、好ましくは５０％以上、より好ましくは少なくとも８０％の相同性、さらにより好ましくは９０％の相同性がある蛋白質のうち任意のものが含まれる。さらにＴＡＣＥは、ＰＣＴ出願・国際公開公報第９６／４１６２４号に開示されたヌクレオチド配列の発現産物のことも指す。ＴＡＣＥにはさらに、生物活性を保持していて分泌可能である、蛋白質の細胞外部分を含む膜結合型蛋白質および可溶性もしくは切断型蛋白質が含まれる。このような蛋白質の例はＰＣＴ出願・国際公開公報第９６／４１６２４号に記載されている。
【００１８】
ＴＡＣＥのアミノ酸配列またはその任意の部分もしくは残基は、ブラック（Ｂｌａｃｋ）ら、「細胞から腫瘍壊死因子−αを放出させるメタロプロテイナーゼディスインテグリン（Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ｔｈａｔ ｒｅｌｅａｓｅｓ ｔｕｍｏｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α ｆｒｏｍ Ｃｅｌｌ）」、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：７２９〜７３３（Ｆｅｂ． １９９７）に見いだすことができ、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。ＴＡＣＥのアミノ酸配列における変形物（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）も本発明の範囲に含まれる。本明細書に含まれるＴＡＣＥアミノ酸配列に対する言及はすべて、ブラック（Ｂｌａｃｋ）ら、前記における配列に対する言及である。
【００１９】
本明細書で用いるＴＡＣＥ触媒ドメイン（ＴＣＤ）とは、残基２１５から４７７位の間、およびその前に位置するフリン（ｆｕｒｉｎ）切断部位（残基２１１〜２１４位）を含むＴＡＣＥポリペプチドの部分、またはペプチドＰＬＡＱＡＶＲＳＳＳを切断しうるその任意の部分を意味する。
【００２０】
ＴＡＣＥ ポリペプチドの発現、単離および精製
腫瘍壊死因子−α変換酵素（ＴＡＣＥ）は、刊行されたＰＣＴ出願・国際公開公報第９６／４１６２４号に記載されている。その出願は、ＴＡＣＥまたはＴＡＣＥの一部をコードする単離された核酸、ＴＡＣＥまたはその一部をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクター、およびＴＡＣＥまたはＴＡＣＥの一部をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターによる形質転換またはトランスフェクションを受けた宿主細胞を記載している。その出願はさらに、例えば、ＴＡＣＥを発現するように操作されたトランスフェクト細胞を培養し、続いて組換え的に産生されたＴＡＣＥまたはその一部を精製することなどにより、ＴＡＣＥおよびその一部を産生させるための工程も記載している。ＴＡＣＥポリペプチドの単離、発現および精製の方法は、刊行されたＰＣＴ出願・国際公開公報第９６／４１６２４号に詳細に記載されている。ＰＣＴ（特許協力条約）第９６／４１６２４号の全体は参照として本明細書に組み入れられる。
【００２１】
本発明によれば、ＴＡＣＥのシグナルペプチド、プロドメイン、および触媒ドメイン、すなわちアミノ酸残基１〜４７７位をコードするｃＤＮＡを適切な発現ベクター中に挿入し、適切な細胞系において発現させる。ｃＤＮＡは、発現を促進する、または本発明の本質から逸脱しないその他の目的を達成する、隣接領域などのその他の領域を含んでもよい。
【００２２】
ＴＡＣＥポリペプチドまたはＴＣＤなどのその機能的部分をコードするｃＤＮＡを、付加、置換、欠失または挿入によって変更することも可能である。このような変更は、例えば、グリコシル化の防止、不適切もしくは望ましくないジスルフィド結合の形成の防止、および／または発現増強のために施しうる。このような変更の例は国際公開公報第９６／４１６２４号に記載されており、それに記載された方法およびその他の従来の方法によって行うことができる。ＴＡＣＥを複合体化してもよい。このような複合体は、精製および／または同定を容易にするために添加されたペプチドを含むことができる。このようなペプチドには、例えば、ポリＨｉｓペプチドが含まれる。複合体化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、米国特許第５，０１１，９１２号およびホップ（Ｈｏｐｐ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４（１９８８）に記載されている。
【００２３】
本発明の１つの態様において、ｃＤＮＡは、ＴＡＣＥのシグナルペプチド、プロドメイン、および触媒ドメイン（ＴＣＤ）、すなわち残基１〜４７７位を含み、Ｓｅｒ２６６がＡｌａに変化し、Ａｓｎ４５２がＧｌｎに変化したＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドをコードする。これらの置換は、Ｎ結合型グリコシル化の防止に有用である。さらに、配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｈｉｓ）６をＣ末端に付加してもよい。配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｈｉｓ）６は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂などの金属キレート親和性樹脂を用いるポリペプチドの精製を容易にする。
【００２４】
ＴＡＣＥまたはその一部をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターは、よく知られた方法を用いて調製しうる。ＴＡＣＥポリペプチドの発現のために適した宿主細胞には、原核細胞、酵母細胞およびより高等な真核細胞が含まれる。本発明における使用に適したベクターおよび宿主細胞は、国際公開公報第９６／４１６２４号に記載されている。本発明による組換えＴＡＣＥの発現に用いうる適切な発現系のさらなる例には、昆虫細胞におけるバキュロウイルス系（ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）参照のこと）およびＣＯＳ−７細胞などの哺乳動物細胞系（Ｇｌｕｚｍａｎら、Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１））を含む、哺乳動物または昆虫宿主細胞の培養発現系が含まれる。 他の例も当技術分野で知られており、これには国際公開公報第９６／４１６２４号に記載されたものが含まれる。本発明の１つの態様において、ＴＡＣＥポリペプチドはＣＨＯ細胞内で発現される。この態様において、細胞はＶａｌ２１２およびＡｒｇ２１５に始まるＴＡＣＥポリペプチドの混合物を分泌する。
【００２５】
１つの態様においては、ベクターを取り込んでいない細胞を死滅させる薬物の存在下で細胞を培養することによって、安定的発現を行う細胞を選択しうる。適した選択法の例は、例えば、カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｒ．Ｊ．）、「哺乳動物細胞における異種遺伝子の選択および共増幅（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５３７〜５６６（１９９０）に記載されている。
【００２６】
発現されたＴＡＣＥポリペプチドの精製は、国際公開公報第９６／４１６２４号に記載されたものなどの任意の適した手段によって行いうる。本発明の１つの局面によれば、結晶化のために適したＴＡＣＥポリペプチドを入手することが好ましい。結晶化のために適したＴＡＣＥポリペプチドの入手に際しては、ＴＡＣＥポリペプチドを精製するための工程が、適切な結晶化が起こる程度に純粋なポリペプチドを得る上で十分であることが重要である。
【００２７】
好ましい精製方法の一つは、ＴＡＣＥ分泌細胞の培養物から得た適切な量の培地から始まる。この培地は一般に培養物の上清である。培地は精製しようとするＴＡＣＥポリペプチドを含む。好ましくは、ＴＡＣＥポリペプチドは、精製を容易にする１つの複合体または複数の複合体をコードするように改変された配列を有するＴＡＣＥポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて組換え的に産生される。例えば、金属キレート樹脂を用いる精製を容易にするために、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）６をコードする配列をＣ末端に付加してもよい。
【００２８】
培地は、例えば透析濾過などによって濃縮される。適した透析濾過ユニットには、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社のカットオフ値１０Ｋの１ｆｔ２ ＴＦＦ透析濾過ユニットが含まれる。続いて、適した緩衝液を濃縮培地に添加する。任意の適した緩衝液を用いてよい。このような適した緩衝液の一つは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）および３００ｍＭ ＮａＣｌを含む。
【００２９】
試料には多数回にわたって再濃縮および希釈を行う。例えば、試料を再濃縮し、緩衝液で２回目の希釈を行い、さらに再濃縮し、緩衝液で３回目の希釈を行い、最後の再濃縮を行う。透析濾過ユニット中に残った試料を、バックフラッシュ法などの適切な方法によって回収する。回収した材料を続いて適した膜を通して濾過してもよい。適した膜には、例えば、孔径０．４５または０．２２ミクロンの膜が含まれる。続いてアジ化物を添加する。濾過した試料を約２〜９℃などの低温で一晩保存してもよい。一晩保存した後、濾過した試料に対して、貯蔵水溶液からのイミダゾールおよび貯蔵水溶液からのＺｎＣｌ２を添加する。続いて試料を適切なカラムにかける。適切なカラムの一つは、特にＴＡＣＥポリペプチドを配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）６と結合させる場合には、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂などの金属キレート樹脂である。
【００３０】
カラムを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾールおよび５μＭ ＺｎＣｌ２からなる緩衝液などの緩衝液で洗浄する。続いて、イミダゾールの濃度を徐々に高める勾配により、ＴＡＣＥポリペプチドを溶出させる。画分はグリセリン、Ｔｒｉｓ ｐＨ ８の水溶液を入れた管に回収する。グリセリン溶液はカラム処理を行う当日に調製することが好ましい。
【００３１】
各画分からのアリコートを膜にスポットとして転写した後にアミドブラックで染色し、どの画分が意味のある量の蛋白質を含むかを判定する。または、各画分から少量、例えば５μｌを採取し、クーマシー染色を用いるゲル分析のために用いてもよい。意味のある量の蛋白質がみられた画分をプールし、続いてそのプールを、例えば透析濾過ユニットを用いて濃縮する。
【００３２】
場合によっては、ポリペプチドが凝集することもありうる。凝集物を除去し、精製をさらに容易にするために、濃縮した試料に対して、ヒドロキサム酸に基づく阻害物質などのＴＡＣＥの阻害物質を貯蔵水溶液から添加してもよく、オクチルグルコシド（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社の市販品）を貯蔵水溶液から添加してもよい。続いて、試料を室温で１５〜２４時間インキュベーションする。
【００３３】
インキュベーションの後に、試料をサイズ排除カラムにかける。カラムをまず、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセリンからなる緩衝液などの適切な緩衝液で平衡化する。適したサイズ排除カラムには、例えば、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷＧまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００などの類似物が充填されたＬＫＢ ２１３５−３６５が含まれる。続いて緩衝液をカラムに通す。高度に精製されたＴＡＣＥポリペプチドは２８０ｎｍでの吸収によって検出可能である。
【００３４】
意味のある蛋白質がみられた全画分に関して、どの画分をプールすべきかを判定するためにゲル分析を行う。サイズ排除クロマトグラフィーのプールは、例えば透析濾過ユニットを用いて濃縮する。
【００３５】
続いて、精製した試料に阻害物質などの結合パートナーを添加してもよい。結合パートナーはＴＡＣＥポリペプチドの安定化に特に有用である。結合パートナーは任意の適した化合物でよい。適した結合パートナーには、例えば、ヒドロキサム酸に基づく阻害物質が含まれる。適した阻害物質の一つは 、Ｎ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ヒドロキシアミノカルボニル）メチル−４−メチルペンタノイル｝−Ｌ−３−アミノ−２−ジメチルブタノイル−Ｌ−アラニン，２−（アミノ）エチルアミドである。この阻害物質は、その他の阻害物質と並んで、その全体が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第５，５９４，１０６号（Ｂｌａｃｋら）に記載されている。
【００３６】
この蛋白質複合体は、例えば約４℃などの低温で保存可能である。
【００３７】
ＴＡＣＥ 結晶および ＴＡＣＥ ポリペプチドの結晶化の方法
本発明の１つの局面は、ＴＡＣＥポリペプチドの結晶化の方法に関する。１つの好ましい方法は、ＴＡＣＥポリペプチドと上記の結合パートナーとの共結晶化を含む。ＴＡＣＥポリペプチドの入手ならびにポリペプチドの精製のための手段の例は先に述べた。
【００３８】
結晶は、ドロップ蒸気拡散法、バッチ法、液体ブリッジ法および透析法を含む任意の適した方法により、任意の適した条件下で成長または形成させうる。ドロップ蒸気拡散法による結晶化が好ましいことがしばしばである。さらに、結晶化の条件はさまざまであることを当業者は理解すると思われる。当技術分野ではポリペプチド結晶化のさまざまな方法が一般に知られている。例えば、国際公開公報第９５／３５３６７号、国際公開公報第９７／１５５８８号、欧州特許６４６ ５９９ Ａ２号、英国特許第２ ３０６ ９６１ Ａ号および国際公開公報第９７／０８３００号を参照されたい。
【００３９】
本発明の１つの態様においては、Ｓｅｒ２６６がＡｌａに変化し、Ａｓｎ４５２がＧｌｎに変化し、配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）６がＣ末端に付加されたＴＡＣＥ残基１〜４７７位を含むＤＮＡ構築物をＣＨＯ細胞内で発現させる。これらの細胞はプロセシングを受けたＴＡＣＥの混合物を主として分泌し、その約半分はＶａｌ２１２より始まり、約半分はＡｒｇ２１５より始まる。この混合物を上記の通りに精製する。精製されたＴＡＣＥポリペプチドを、添加した結合パートナーとともに、上記の緩衝液中で保存する。
【００４０】
ＴＡＣＥポリペプチドおよび結合パートナーを共結晶化させる。上記のＴＡＣＥ緩衝液におけるポリペプチド濃度が約５ｍｇ／ｍｌから約１２ｍｇ／ｍｌまでの範囲であるＴＡＣＥ／結合パートナー溶液を、適切な結晶化緩衝液と混合し、ドロップ蒸気拡散法などの適切な結晶化法を用いて結晶化させる。適した結晶化緩衝液には、例えば以下のものが含まれる：０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．３）、０．２Ｍ ＣａＣｌ２、３０％ｖ／ｖエタノール；０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ ５．０）、４０％ｖ／ｖエタノール；０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ ８．７）、２０％ｗ／ｖ ＰＥＧ ４０００、２０％ｖ／ｖイソプロパノール；および０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ ５．４）、２０％ｗ／ｖ ＰＥＧ ４０００、２０％ｖ／ｖイソプロパノール。試料を約４〜２０℃の範囲の温度でインキュベーションする。これにより、結晶性沈殿物が形成される。
【００４１】
得られた結晶性沈殿物からの種（ｓｅｅｄ）を結晶全体または粉砕結晶の懸濁液として、ウサギの毛などの適切な結晶化促進物質とともに、結晶化緩衝液中にある濃縮ＴＡＣＥ／基質溶液に添加する。これにより、Ｘ線データの収集に適した結晶が形成される。
【００４２】
本発明のもう１つの局面は、ＴＡＣＥポリペプチド結晶に関する。このような結晶の一つは、阻害物質とともに共結晶化したＴＮＦ−α変換酵素触媒ドメイン（ＴＣＤ）ポリペプチドを含む。この結晶は約２Ａで回折し、単斜晶系空間群Ｐ２１に属する。この結晶の単位格子は結晶学的に独立した４つのＴＣＤ分子を含む。ＴＣＤ分子は非対称格子内にあり、分離した四量体としてのクラスターは形成せず、無限周期的構造へと統合される。結晶の格子定数は以下の通りである：ａ＝６１．３８Å（オングストローム）、ｂ＝１２６．２７Å、ｃ＝８１．２７Åおよびβ＝１０７．４１゜。
【００４３】
Ｘ 線回折
本発明のもう１つの局面は、ＴＡＣＥの構造、特にＴＡＣＥ触媒ドメイン（ＴＣＤ）の構造に関する。ＴＡＣＥの構造は、上記のＴＡＣＥポリペプチドを含む結晶を用いて決定することができる。本発明によれば、ＴＡＣＥ、特にＴＣＤの構造がＸ線結晶学を用いて決定される。ポリペプチドの三次元構造座標を得るための任意の適したＸ線回折法を用いうる。三次元構造座標、またはＴＡＣＥ触媒ドメインもしくはペプチドＰＬＡＱＡＶＲＳＳＳを切断しうるその一部などの、関心対象のＴＡＣＥポリペプチドの一部を特徴づけるその任意の部分を、本明細書で説明する通りに用いることができる。
【００４４】
ＴＡＣＥ の Ｘ 線回折座標の使用方法
本発明は、ＴＡＣＥ触媒ドメインに関する上記のＸ線回折試験から得られた構造座標の使用にも関する。座標は、直接解析により、コンピュータ利用により、またはそれらの組み合わせにより、ＴＡＣＥ触媒ドメインの二次および三次構造を含む構造を決定するために利用しうる。ＴＡＣＥ触媒ドメインの構造座標は、ＴＡＣＥと会合する化合物の開発、設計および／またはスクリーニングにも用いることができる。本明細書で用いる「会合する」とは、化合物がＴＡＣＥとイオン的、共有結合的、水素結合、ファンデルワールス相互作用、塩橋、立体相互作用、親水性相互作用および疎水性相互作用によって結合または相互作用することを意味する。さらに、「会合する」という用語は、ＴＡＣＥ触媒ドメインの任意の部分との会合を含む。例えば、ＴＡＣＥと会合する化合物は、競合的阻害物質、不競合的阻害物質および非競合的阻害物質として作用する化合物でありうる。ＴＡＣＥと会合する化合物が、メディエーターまたは他の調節性化合物として作用する化合物であってもよい。また、ＴＡＣＥと会合する化合物は、基質のＴＡＣＥとの化学反応において異性化して短寿命の反応中間体となる化合物であってもよい。特に、ＴＡＣＥと会合するように設計された化合物は、阻害物質、メディエーターおよび他の調節性化合物として治療的に用いうる。
【００４５】
他のポリペプチドと会合する化合物の構造決定、分子設計および選択ならびに合成のためのＸ線座標の使用は、当技術分野で周知である。刊行されたＰＣＴ出願・国際公開公報第９５／３５３６７号は、酵素の活性部位と会合する化合物の設計、評価、合成および使用のためのＸ線構造座標の使用を記載している。英国特許出願第２３０６９６１Ａ号は、理論的薬剤設計におけるＸ線座標の使用を記載している。刊行されたＰＣＴ出願・国際公開公報第９７／１５５８８号は、Ｘ線回折パターンを用いたポリペプチドの構造決定、ならびに関心対象のポリペプチドと会合する化合物の探索における座標および三次元構造の使用を記載している。しかし、ＴＡＣＥと会合する化合物の構造決定、分子設計および選択ならびに合成のための、ＴＡＣＥポリペプチドに関するＸ線座標の使用は本発明によって初めて可能になった。
【００４６】
本発明の１つの局面においては、上記の方法によって得られた構造座標を三次元形態表示を含む画像表示として表示してもよく、それに変換してもよい。これは、一組の構造座標から分子またはその一部の表示画像を生成しうる市販のコンピュータプログラムを用いて行いうる。一組の構造座標から分子またはその一部の表示画像を生成しうるコンピュータプログラムの例は、刊行されたＰＣＴ出願・国際公開公報第９７／０８３００号に記載されており、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００４７】
本発明のもう１つの局面においては、構造座標および構造を、他のメタロプロテイナーゼなどの他の類似分子と比較する、または重ね合わせることができる。例えば、ＴＡＣＥの構造座標および構造を、アダマリシンＩＩなどのヘビ毒メタロプロテイナーゼの構造座標または構造と比較する、または重ね合わせることが可能である。ＴＡＣＥの構造座標および構造を、ヒトＡＤＡＭ １０を含むＡＤＡＭ １０などのマトリックスメタロプロテイナーゼの構造座標または構造と比較しても、または重ね合わせてもよい。ＴＡＣＥと画像構造または三次元構造座標が得られた他の分子との比較を、分子類似性におけるアプリケーションであるＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）などの入手可能なソフトウエアアプリケーションを利用して行うことも可能である。
【００４８】
化学的実体（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｔｉｔｙ）または断片をそれらのＴＡＣＥ、特にＴＡＣＥ触媒ドメインとの会合能に関してスクリーニングおよび選択することにより、ＴＡＣＥと会合する化合物を、コンピュータ計算によって評価および設計することもできる。本発明のこの局面を実現するために用いうる方法はいくつかある。１つの態様においては、本明細書で述べた構造座標に基づくＴＡＣＥ、特に触媒ドメインのコンピュータ生成モデルを画像として検討することができる。続いて、例えばＣＨＡＲＭＭまたはＡＭＢＥＲなどの入手可能なプログラムを用い、エネルギー最小化および分子動力学に基づいて、化学的実体および特定の化学的部分のコンピュータ生成モデルを触媒ドメインの内部または周囲に位置づけて評価することが可能である。化学的実体または断片の位置決定は、例えば、ＱｕａｎｔａおよびＳｙｂｙｌなどのドッキング用ソフトウエアを用いて行いうる。さらに、既知および市販のコンピュータプログラムを、化学的実体または断片の選択に用いることもできる。適した化学的実体または断片がいったん選択されれば、それらを組み合わせて、阻害物質、メディエーターまたはその他の調節性化合物などの単一の化合物を作り出すことができる。既知および市販のモデル作製ソフトウエアは組み立ての一助になると思われる。
【００４９】
本発明の１つの局面においては、ＴＡＣＥ、特にＴＡＣＥ触媒ドメインと会合する化合物を、特定の化学的部分または化学的実体の組み合わせによるのではなく、全体として設計しうる。この態様は、ＬＵＤＩ（Ｂｉｏｓｙｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＬＥＧＥＮＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）およびＬｅａｐ Ｆｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）などのコンピュータプログラムを用いて行いうる。
【００５０】
１つの態様において、候補化合物は、これまでに同定された相互作用部位に鑑みて、ＴＡＣＥと候補化合物との望ましい相互作用部位に基づいて選択される。特異的な候補化合物−ＴＡＣＥ相互作用がいったん決定されれば、選択された候補化合物とＴＡＣＥとの予備的に「モデル化された」複合体を得るために、市販のドッキング用ソフトウエアを用いるドッキング試験を行う。
【００５１】
拘束的配座解析（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、例えば、モデル化されたＴＡＣＥ−阻害物質複合体の完全性を検査するために、分子動力学（ＭＤ）を用いて行われる。複合体がいったん最も都合のよい立体配座状態に到達したところで、ＭＤ試験によって提示された構造の画像解析を行い、測定された結合親和性に基づいて、モデル化された複合体が既知の実験的ＳＡＲ／ＱＳＡＲ（構造−活性相関／定量的構造−活性相関）と適合することを確かめる。
【００５２】
その他のモデリング法を本発明に従って用いることも可能である。これらの技法の例は、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、「医薬品化学のための分子モデリングソフトウエアおよび方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３３：８８３〜８９４（１９９０）、およびナビア（Ｎａｖｉａ）ら、「薬剤設計における構造情報の使用（Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２：２０２〜２１０（１９９２）に開示されており、これらはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００５３】
ＴＡＣＥと会合するように開発または設計された化合物は、当技術分野で知られた数多くの方法を用いて最適化することもでき、会合効率を検討することも可能である。例えば、変形エネルギーおよび静電相互作用の決定および最適化を行うことができる。既知および市販のソフトウエアおよびハードウエアシステムも用いうる。このようなソフトウエアの例は国際公開公報第９５／０７６１９号に開示されている。阻害物質の効力、選択性および物理的薬物様特性を反復的な様式で最適化するための、構造に基づく類似体化（ａｎａｌｏｇｉｎｇ）も、薬剤設計の当業者は行いうる。
【００５４】
選択または設計された化合物に対して置換を施してもよい。これらの置換は、化合物の会合特性を改善または変更するために施すことができる。このような置換は、例えば、化合物の側鎖内または特定の原子に施すことができる。一般には、大きさ、形態、電荷およびその他の特徴が本来の基または原子とほぼ同一である保存的置換から始めるべきである。置換された化合物を、上記の通りにさらに解析および最適化してもよい。
【００５５】
本発明の１つのさらなる局面においては、このような化合物の合成および試験を実際に行う前に、例えば市販のコンピュータソフトウエアを用いて、化合物に関して予想される阻害、修飾、調節または他の結合効果を解析および評価しうる。この方式により、無効な化合物の合成および試験を行う確率を評価することが可能である。
【００５６】
阻害を評価するための手順は当技術分野で一般に知られており、例えばＰＣＴ（特許協力条約）第９６／４１６２４号に開示されている。このような方法にはペプチド基質との反応に基づくアッセイ法が含まれる。
【００５７】
ＴＡＣＥ 触媒ドメインの構造
記載した方法を用いて得られたＸ線回折データに基づいて決定されたＴＣＤの物理的特徴、およびＴＣＤの分子モデルの作製におけるその使用に関して、図面を参照しながらさらに説明する。
【００５８】
図１に描かれた本ドメインは、扁平な楕円体の平坦面に刻み目が入った形状をしており、これにより、小さな「下方」のサブドメインを「上方」の分子本体から隔てる比較的小さな活性部位のくぼみが生じている（図２ａ）。ＴＣＤポリペプチド鎖は分子表面（下方の奥の方、図１）から始まり、 Ａｓｐ２１７とＭｅｔ２２１との間で鎖が明確に規定される（図３参照）。分子の中心には５本の鎖からなるβプリーツシートがあり、ここではβ鎖がｓＩＩ、ｓＩ、ｓＩＩＩ、ｓＶおよびｓＩＶの順（奥から手前の順、図１参照）に並び（図３参照）、「辺縁」鎖であるｓＩＶが他のものとは逆平行に走行する。このβシートは大きくねじれており、凸面に２本のαヘリックス（ｈＢおよびｈＢ２）、凹面に２本のヘリックス（ｈＡおよびｈＣ）が隣接している。β鎖ｓＩおよびｓＩＩは、短いαヘリックスｈＡＩおよび長いαヘリックスｈＡ（後方を斜めに走行するヘリックス、図１）によって連結されている。β鎖ｓＩＩおよびｓＩＩＩは、長い「多ターンループ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｔｕｒｎ ｌｏｏｐ）」、長い「中間」αヘリックスｈＢ、および隣接する短いαヘリックスｈＢ２によって連結され、これらはすべてβシートの「上方」に並ぶことにより、その中央部をバルク水（ｂｕｌｋ ｗａｔｅｒ）から完全に遮蔽する（図１）。多ターンループは２カ所で突出し、それぞれ「拍車様（ｓｐｕｒ−ｌｉｋｅ）」および酸性度の強い突出部を生じる（図２ａでは分子の上方に認められる）。ｓＩＩＩ−ｓＩＶリンカーの終端には、辺縁鎖であるｓＩＶに入る前に短い「突出」がある。ｓＩＶ−ｓＶ連結セグメントには、表面に位置する２つの大きな「耳様」ループがあり、その一方は分子本体に囲まれ（図２ａ、中央左の「青い」表面を生じる）、もう一方の長いβヘアピンループ（ｓＩＩａ−ｓｌＩｂ）は分子表面から突出している（図１および２の上左）。突出したループは、ｓＶを、分子の中心に位置し、鎖がねじれて下方のサブドメインが生じる部位である厳密に保存されたＧｌｙ４１２の箇所で急に終わる「活性部位ヘリックス」ｈＣと結合する。
【００５９】
Ｃ末端鎖は最後の６１個のＴＣＤ残基（図３）を含み、これはまず、２つの「狭い」スーパーツイストループによって連結された、短い直線状のほぼ垂直に並んだ３つのセグメントを形成し、強固な「Ｍｅｔターン」Ｔｙｒ４３３−Ｖａｌ４３４−Ｍｅｔ４３５−Ｔｙｒ４３６を介して表面に戻り、そこでＰｒｏ４３７の箇所でねじれてＳ１’くぼみのＰｒｏ４３７−Ｉｌｅ４３８−Ａｌａ４３９外「壁」を形成し、幅広いループを経てＣ末端αヘリックスｈＤに至ってその中を通過し、Ｎ末端に近接した分子の「後方」表面で終わるが、最後の規定された残基Ａｒｇ４７３−Ｓｅｒ４７４は水素結合によって分子本体に固定される。２つの「狭い」ループの１つ目はＣｙｓ４２３−Ｃｙｓ４５３を介してヘリックスｈＤのＮ末端とジスルフィド結合し、続いてｈＤのＣ末端はＣｙｓ３６５−Ｃｙｓ４６９を介して「耳様」ｓＩＶ−ｓＶリンカーペプチドに固定される。空間的に隣接したＴＣＤの第３のジスルフィド架橋であるＣｙｓ２２５−Ｃｙｓ３３３はβ鎖ｓＩおよびｓＩＩＩのＮ末端部分同士をつなぐ。インタクトのＴＡＣＥ分子では、Ｓｅｒ４７４の下流の４残基が、密に伸長したディスインテグリンドメインの必須領域であるＣｙｓ４７８の位置にあると考えられる（Ｓａｕｄｅｋら、「最小の活性ＲＧＤ蛋白質であるエキスタチンの三次元構造（Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ， ｔｈｅ ｓｍａｌｌｅｓｔ ａｃｔｉｖｅ ＲＧＤ ｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０、７３６９〜７３７２（１９９１））。Ｓｅｒ４７４およびこのＣｙｓ４７８がそれぞれのドメインの中心的箇所であると考えると、この３残基リンカーはディスインテグリンドメインを触媒ドメインの「左側」表面に対して比較的拘束されない形でドッキングさせると考えられる。
【００６０】
ＴＡＣＥの活性部位のくぼみ（図２ａ）は、比較的平坦な左側（非プライム側）にあるが、右側に向かって刻み目が生じている。その中心に位置する触媒性亜鉛はＨｉｓ４０５、Ｈｉｓ４０９およびＨｉｓ４１５の３つのイミダゾールＮ∈２原子（活性部位ヘリックス、およびそれに続く、保存された亜鉛結合性共通モチーフＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨを含む「下行」鎖によって提供される）、ならびに阻害物質のヒドロキサム酸部分のカルボニルおよびヒドロキシル酸素により五配位を受ける（図１、２ａおよび４参照）。この亜鉛−イミダゾール集団は、メトジンシンクラン（ｍｅｔｚｉｎｃｉｎ ｃｌａｎ）に関するＭｅｔターン特徴部分にある、厳密に保存されたＭｅｔ４３５の末端にあるε−メチル硫黄部分に基づく（Ｂｏｄｅら、「アスタシン、セラリシン、ヘビ毒およびマトリックスメタロプロテイナーゼは同一の亜鉛結合環境（ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨおよびＭｅｔターン）およびトポロジーを示し、共通のファミリー「メトジンシン」に分類されるべきである（Ａｓｔａｃｉｎｓ、ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎｓ、ｓｎａｋｅ ｖｅｎｏｍ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｚｉｎｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ（ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨ ａｎｄ Ｍｅｔ−ｔｕｒｎ）ａｎｄ ｔｏｐｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｇｒｏｕｐｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｆａｍｉｌｙ， ｔｈｅ ’ｍｅｔｚｉｎｃｉｎｓ’）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３３１、１３４〜１４０（１９９３）、ステッカー（Ｓｔｏｃｋｅｒ）ら、「メトジンシン：アスタシン、アダマリシン、セラリシンおよびマトリキシン（コラゲナーゼ）とのトポロジー的および配列上の関係から、ジンクペプチダーゼの１つのスーパーファミリーが規定される（Ｔｈｅ ｍｅｔｚｉｎｃｉｎｓ：Ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ａｓｔａｃｉｎｓ、ａｄａｍａｌｙｓｉｎｓ、ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎｓ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘｉｎｓ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ）ｄｅｆｉｎｅ ａ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｚｉｎｃ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ）」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ４、８２３〜８４０（１９９５））。Ｈｉｓ４０５の亜鉛配位性イミダゾールと辺縁鎖との間に入り込んだ「触媒性」Ｇｌｕ４０６の２つのカルボン酸酸素（触媒の際に一般的な塩基として作用する）（Ｇｒａｍｓら、「ヒドロキサム酸ペプチドおよびペプチドチオール阻害物質と複合体を形成したヒト好中球コラゲナーゼのＸ線構造：基質結合および理論的薬剤設計に対する意義（Ｘ−ｒａｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ｐｅｐｔｉｄｅ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｉｏｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ）」Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２８、８３０〜８４１（１９９５））はいずれも、ヒドロキサム酸のヒドロキシル基およびＮ−Ｈ基と水素結合を形成する（図４参照）。触媒性亜鉛の右側には深いＳ１’ポケットが開いており、これはＳ１’壁形成セグメント（下、図１および２ａ）のほか、Ｈｉｓ４０５およびＧｌｕ４０６の側鎖（左）、ｓＩＶ主鎖およびＬｅｕ３４５側鎖（上）ならびにＶａｌ４４０側鎖（後方）およびＡｌａ４３９（右）が境界をなしている。Ａｌａ４３９の右には第２の（Ｓ３’）ポケットが開いており、これは分子内でＳ１’ポケットと融合し、Ａｌａ４３９およびＬｅｕ３４８の対向性側鎖から形成される小さな架橋が生じている（図２ａ）。
【００６１】
阻害物質の（偽）ペプチド部分は、活性部位のくぼみの刻み目の入った右側に伸長した形状で入り込み、生産的結合を生じたペプチド基質のプライム化残基との相互作用を模倣する（図２ａ）。これは上方の短い突出であるＧｌｙ３４６−Ｔｈｒ３４７−Ｌｅｕ３４８とは逆平行に、Ｓ１’壁形成セグメントであるＰｒｏ４３７−Ｉｌｅ４３８−Ａｌａ４３９とは平行に走行し、それぞれ２つずつの主鎖間水素結合を形成する。主な分子間相互作用は、阻害物質のＰ１’イソブチル（偽ロイシル）側鎖および本質的に疎水性であるＳ１’ポケットによって生じるが、これは大きいため、部分的に規則化した３つの溶媒分子をさらに収容する。Ｐ２’のｔ−ブチル側鎖は酵素から離れるように伸長するが、酵素の隆起によって形成される上記の疎水性キャノピーに囲まれて位置する。Ｐ３’ Ａｌａ側鎖は負に荷電した大きなＳ３’ポケット内に入るが、小さすぎるために最適な接触は起こらない。Ｃ末端のジアミノエチル基は４つの分子において異なる立体配座をとる。
【００６２】
結合型プロＴＮＦαのＰ１’〜Ｐ３’セグメントであるＶａｌ７７−Ａｒｇ７８−Ｓｅｒ７９は、おそらく同様の様式で、おそらくはさらに高い適合度で下部のくぼみと結合すると思われる。その際、前に位置するＰ３〜Ｐ１残基Ａｌａ７４−Ｇｌｎ７５−Ａｌａ７６は辺縁鎖に対してほぼ確実に逆平行に並び、それらの側鎖はそれぞれ（部分的に荷電した）Ｓ３ポケット内および（負に荷電した）浅いＳ２陥凹内に伸長し、中心のくぼみから突出すると考えられる。ＴＡＣＥのプライム化サブサイトおよび周囲の分子表面は主として負に荷電し、非プライム化サブサイトは本質的には疎水性である（図２ａ）。さらに距離を隔てた相互作用もプロＴＮＦαのプロセシングに関するＴＡＣＥの特異性に関与すると思われる。プロＴＮＦα切断部位を含む１２残基の基質もＭＭＰの一部によって切断可能であるが、特異性および有効性は落ちる（Ｂｌａｃｋら、「マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の特異性の低さ、およびＴＩＭＰが腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）産生に対する反応性をもたないことは、主要なＴＮＦ−α変換酵素がＭＭＰでない可能性を示唆する（Ｒｅｌａｘｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ（ＭＭＰｓ）ａｎｄ ＴＩＭＰ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｒｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α（ＴＮＦ−α）ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ＴＮＦ−α ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｓ ｎｏｔ ａｎ ＭＭＰ）」Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２５、４００〜４０５（１９９６））。したがって、（おそらくは三量体である）（Ｔａｎｇら、「ヒトプロ腫瘍壊死因子はホモ三量体である（Ｈｕｍａｎ ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｉｓ ａ ｈｏｍｏｔｒｉｍｅｒ」Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５、８２１６〜８２２５（１９９６ａ）、Ｔａｎｇら、「ヒトプロ腫瘍壊死因子のリンキングドメインの長さが切断プロセシングを決定する（Ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｎｋｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５、８２２６〜８２３３（１９９６ｂ））膜結合型プロＴＮＦαがインビボで優先的プロセシングを受けることは、一部には組み立て（ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ）の補正による、すなわちプロＴＮＦα切断セグメントがＴＡＣＥ活性部位に対してアンカー膜から一定の距離をもって適切に提示されるためであると考えられる。いくつかの実験的証拠（Ｔａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５、８２１６〜８２２５（１９９６ａ）、Ｔａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５、８２２６〜８２３３（１９９６ｂ））からは、切断部位が切断配列のみによって決定されるのではなく、ＴＮＦα三分子が会合したＣ末端セグメントによって形成される密な円錐体（Ｊｏｎｅｓら、「腫瘍壊死因子の構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）」Ｎａｔｕｒｅ ３３８、２２５〜２２８（１９８９））の基部との距離も一定の役割を果たす可能性が示唆されている。生産的なＴＡＣＥ−プロＴＮＦα複合体の場合には、このＴＮＦα三量体円錐体（その内部に不規則なＮ末端が入り込む）の基部は、ＴＡＣＥ触媒ドメインの「右」側によって認識され（図２ａ）、約１０残基長のスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）がプロＴＮＦαＡｌａ７６〜Ｖａｌ７７の切断されやすいペプチド結合をＴＡＣＥの活性部位内に正しく配置させる。
【００６３】
ポリペプチドのトポロジー、特に触媒性亜鉛の表面提示により、ＴＡＣＥの触媒ドメインが典型的なメトジンシンであることが証明される（Ｂｏｄｅら、「アスタシン、セラリシン、ヘビ毒およびマトリックスメタロプロテイナーゼは同一の亜鉛結合環境（ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨおよびＭｅｔターン）およびトポロジーを示し、共通のファミリー「メトジンシン」に分類されるべきである（Ａｓｔａｃｉｎｓ、ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎｓ、ｓｎａｋｅ ｖｅｎｏｍ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｚｉｎｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ（ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨ ａｎｄ Ｍｅｔ−ｔｕｒｎ）ａｎｄ ｔｏｐｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｇｒｏｕｐｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｆａｍｉｌｙ， ｔｈｅ ’ｍｅｔｚｉｎｃｉｎｓ’）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３３１、１３４〜１４０（１９９３）、ステッカー（Ｓｔｏｃｋｅｒ）ら、「メトジンシン：アスタシン、アダマリシン、セラリシンおよびマトリキシン（コラゲナーゼ）とのトポロジー的および配列上の関係から、ジンクペプチダーゼの１つのスーパーファミリーが規定される（Ｔｈｅ ｍｅｔｚｉｎｃｉｎｓ：Ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ａｓｔａｃｉｎｓ、ａｄａｍａｌｙｓｉｎｓ、ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎｓ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘｉｎｓ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ）ｄｅｆｉｎｅ ａ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｚｉｎｃ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ）」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ４、８２３〜８４０（１９９５））。しかし、他のメトジンシンとの重ね合わせにより、そのトポロジーは、アダマリシンＩＩなどのヘビ毒メタロプロテイナーゼの触媒ドメインのものと最も類似することが示された（図５）（Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈら、「ヘビ毒メタロプロテイナーゼの最初の構造：マトリックスメタロプロテイナーゼ／コラゲナーゼのプロトタイプ（Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｓｎａｋｅ ｖｅｎｏｍｅ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ：ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ｆｏｒ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ／ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ）」ＥＭＢＯ Ｊ． １２、４１５１〜４１５７（１９９３）、Ｚｈａｎｇら、「天然および合成型の阻害物質とヘビ毒メタロプロテイナーゼ、アストロリシンＣ（ｄ型）との構造的相互作用（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｖｅｎｏｍ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ａｔｒｏｌｙｓｉｎ Ｃ（ｆｏｒｍ ｄ））」Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１、８４４７〜８４５１（１９９４）、Ｋｕｍａｓａｋａら、「ハブ毒由来のＨ２プロテイナーゼの結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｈ２−ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｅｎｏｍ ｏｆ Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ）」Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１９、４９〜５７（１９９６））。この密接な相同性は、中心シートおよび大きなヘリックスの同時重ね合わせが極めて優れることを反映するが、特にＴＡＣＥがアダマリシンのみと共有する以下の一連の構造的特徴も反映する：長いヘリックスｈＢおよびその前にあるβシートの上部に並んだ多ターンループ、典型的な配置および形状を有するＣ末端ヘリックスｈＣ、ならびに後方表面に位置する伸長したＣ末端。ＴＡＣＥの２６３個、アダマリシンの２０１個のα原子のうち約１７５個はトポロジー的に等価である（ｒｍｓ偏差は１．３Åであり、そのうち３９個は同一の側鎖を有する）（図３）。これらの数値は、異なるメトジンシンファミリーに属するメンバー間の比較によって得られた値と近い（Ｓｔｏｃｋｅｒら、前記）。さらに、以下の詳細な構造的特徴から、ＴＡＣＥがアダマリシンと密接な関係にあることが証明される：比較的保存されているコア構造、固定されずに並んだＮ末端、同一の分子間水素結合相互作用に関与する特徴的なＡｓｐ４１６（亜鉛結合性共通モチーフの直後に位置する、図３）、第１の狭いループをＣ末端ヘリックスｈＤ（ＴＡＣＥはこれをアダマリシンＩＩとは共有しないが、ハブ毒Ｈ２プロテイナーゼとは共有する）（Ｋｕｍａｓａｋａら、前記）とつなぐ隣接ジスルフィド架橋Ｃｙｓ４２３−Ｃｙｓ４５３、ｓＩＶ−ｓＶリンカーをＣ末端ヘリックスｈＤと連結するジスルフィド結合Ｃｙｓ３６５−Ｃｙｓ４６９、Ｓ１’ポケットおよびその他のプライム化サブサイトにおいて特に高い類似性が認められる類似した形態の活性部位のくぼみ。
【００６４】
ＴＡＣＥの触媒ドメイン（ＴＣＤ）には、以下のいくつかの点でアダマリシンＩＩとの違いもある：２６３残基であって連鎖がはるかに長いこと、ＴＡＣＥの付加的残基の大部分がクラスター化し、より突出したｈＡ−ｓＩＩターン、多ターンループの２つの表面隆起、ｓＩＶ−ｓＶリンカーの２つの「耳」およびより突出したｓＶ−ｈＣ連結部（図３および図５参照）を生じること、ＴＡＣＥにはカルシウム結合部位は存在しないが第３のジスルフィド架橋Ｃｙｓ２２５−Ｃｙｓ３３３が存在し、いずれの要素もＮ末端鎖を鎖ｓＩＩＩに固定するという同じ機能を果たすこと、ＴＡＣＥの非常に深いＳ３’ポケットはＳ１’ポケットと融合していること、プライム化サブサイトの内部および周辺の荷電パターンがほとんど反対であり、アダマリシンでは正の荷電が完全に主であること。
【００６５】
以上から、その配列およびおそらくはその三次元構造によれば、ＴＡＣＥ触媒ドメインは哺乳動物ＡＤＡＭ（アダマリシンと極めて相同性の高い触媒ドメインを有する膜結合型細胞表面蛋白質のファミリー（Ｗｏｌｆｓｂｅｒｇら、「受精および発生におけるＡＤＡＭｓ（ＡＤＡＭｓ ｉｎ Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」Ｄｅｖｅｌｏｐｍ． Ｂｉｏｌ． １８０、３８９〜４０１（１９９６）））の典型的なメンバーではない。ＴＡＣＥはおそらくはその「アウトサイダー」的な役割を、同じく若干のＴＡＣＥ様活性を示す上に（Ｌｕｎｎら、「ウシ脾臓からのＴＮＦα転換酵素としてのＡＤＡＭ １０の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＡＭ １０ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｌｅｅｎ ａｓ ａ ＴＮＦα ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）」、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４００、３３３〜３３５（１９９７））、そのショウジョウバエでの相当物（ｋｕｚ）がＮｏｔｃｈ受容体のプロセシングを行うことが最近示された（Ｒｏｏｋｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３、１２２７〜１２３１（１９９６））、（ウシ）ＡＤＡＭ １０（図３）と共有すると考えられる。ＡＤＡＭ １０にもおそらくＴＡＣＥに典型的な伸長型ｈＡ−ｓＩＩループおよび２つの「耳」は認められるものの、多ターン中間物の大きさはＴＡＣＥとアダマリシンとの中間であると思われる（図３参照）。ＡＤＡＭ １０の触媒ドメイン残基のうち９０個がＴＡＣＥと同一であることも密接な相同性をさらに裏づけるものであるが（図３参照）、その他の哺乳動物ＡＤＡＭはおそらくはアダマリシンＩＩとはるかに類似性が高いと思われる（Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈら、「ヘビ毒ジンクエンドペプチダーゼであるアダマリシンＩＩの精密化された２．０Ａ結晶構造（Ｒｅｆｉｎｅｄ ２．０Ａ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｎａｋｅ ｖｅｎｏｍ ｚｉｎｃ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ａｄａｍａｌｙｓｉｎ ＩＩ）」Ｊ． Ｍｄ． Ｂｉｄ． ２３９、５１３〜５４４（１９９４））。
【００６６】
ＴＡＣＥのＭＭＰとの構造的相同性は著しく低い。共通の二次構造要素の相対的配置はさらに異なり（トポロジー的に等価な約１２０個のＣα原子のｒｍｓ偏差が１．６Åと有意に大きいことに反映される）、ＭＭＰには特徴的なＴＡＣＥ／アダマリシン構造要素（中間ヘリックスｈＢおよび多ターンループ、第３の亜鉛結合性ヒスチジンの後方にあるＡｓｐ残基など）がないか、またはＴＡＣＥには認められない典型的な決定要因（構造性亜鉛、およびカルシウムイオンの組み込みなど）が認められる。しかし、二次構造の差はあるものの、ＴＡＣＥの活性部位のくぼみはＭＭＰのものと若干類似していて、非プライム化（左）側は平坦であり、狭いプライム化側は深いＳ１’ポケットの中心に位置する（図２ｂ）。このＭＭＰとのサブサイトの類似性は、種々のＭＭＰの阻害のために本来設計された合成ヒドロキサム酸阻害物質に対してＴＮＦα転換酵素の部分的感受性が認められていることの説明となる（ＤｉＭａｒｔｉｎｏら、「マトリックスメタロプロテイナーゼおよびＴＮＦαプロセシングに対するヒドロキサム酸に基づく偽ペプチド阻害物質の抗関節炎活性（Ａｎｔｉ−ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ ｐｓｅｕｄｏｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ＴＮＦα ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」Ｉｎｆｌａｍｍ． Ｒｅｓ． ４６、２１１〜２１５（１９９７））。ＴＩＭＰ−１構造を用いたモデル構築実験（Ｇｏｍｉｓ−Ｒｔｉｔｈら、「ヒトマトリックスメタロプロテイナーゼであるストロメライシン−１のＴＩＭＰ−１による阻害の機序（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−１ ｂｙ ＴＩＭＰ−１）」Ｎａｔｕｒｅ ３８９、７７〜８１（１９９７））では、ＴＡＣＥの活性部位領域内に明らかな障害物は認められず、このことから、ＴＩＭＰによる遮断に対する抵抗性が容易に説明されると考えられる。
【００６７】
以上の通り、このＴＣＤ結晶構造から、ＴＡＣＥの触媒ドメインがアダマリシン／ＡＤＡＭのそれとトポロジー的に類似しており、その基質結合部位がＭＭＰのものと共通するという科学的根拠が得られた。しかし、ＴＡＣＥは、表面輪郭、荷電および形状の点でいくつか特殊性があり、このために強力な選択的合成阻害物質の設計が容易となる。
【００６８】
阻害物質、メディエーターおよび生物的意義のある活性を有するその他の化合物などの、ＴＡＣＥと会合する化合物の設計および開発に際しては、ＴＡＣＥ触媒ドメインに特有の表面輪郭、荷電および形状ならびに他の物理的特徴を標的とする化合物を選択することが望ましい。一般に、この種の化合物はＴＡＣＥと物理的および構造的に会合しうることに加えて、そのＴＡＣＥとの会合を許容するような立体配座をとりうる。上記の特徴は当業者をこの点に関して指向させると考えられる。特に直鎖状官能基を備えた化合物は特に適すると思われる。このような化合物は、ＴＡＣＥ触媒ドメインの深いポケットを考慮すれば特に適すると考えられる。
【００６９】
ＴＡＣＥと会合する化合物を、例えば、ＴＡＣＥのＳ１’領域またはＳ１’Ｓ３’ポケットと会合するように設計してもよい。ＴＡＣＥと会合する化合物を（ｉ）亜鉛をキレート化する部分が組み入れられるように設計することも可能である。例となるさらなる化合物には、ＴＡＣＥのＬｅｕ３４８またはＧｌｙ３４９と水素結合を形成するように、（ｉｉ）ＴＡＣＥのＳ１’ポケットを占有する非極性基の導入、（ｉｉｉ）ＴＡＣＥのＳ１’−Ｓ３’ポケットをつなぐ経路の内部に位置し、経路と適切なファンデルワールス接触を生じる基の導入、および（ｉｖ）ＴＮＦ−α変換酵素の骨格アミノ基上のＬｅｕ３４８もしくはＧｌｙ３４９との水素結合の形成、または（ｖ）上記の任意の組み合わせが設計された化合物が含まれる。
【００７０】
コンピュータ可読媒体
本発明は、結晶性ＴＡＣＥポリペプチドのＸ線回折構造座標が記録されたコンピュータ可読媒体にも関する。本発明のコンピュータ可読媒体は、ＴＡＣＥ構造座標の保存、転送およびソフトウエアによる利用のために有用である。コンピュータ可読媒体は、フロッピーディスク、ハードディスク、コンピュータ型ランダムアクセスメモリ、読み出し専用メモリ、 フラッシュメモリ、ＣＤ−ＲＯＭ、記録可能および書換可能ＣＤ、記録可能および書換可能ＤＶＤ、光磁気ディスク、ＺＩＰドライブ、ＪＡＺドライブ、シクィスト（Ｓｙｑｕｉｓｔ）ドライブ、デジタルテープドライブなどを非制限的に含む、任意の適したデータ記憶材料であってよい。その他の適した媒体は当業者に周知であると考えられる。
【００７１】
１つの態様において、コンピュータ可読媒体は表１の座標またはその実質的部分を含む。コンピュータ可読媒体は、ＴＡＣＥポリペプチドまたはその任意の部分の三次元画像表示のための、明細書の全体を通じて特定された１つまたは複数のプログラムがロードされたコンピュータなどの、媒体上に記録されたデータを用いる指示によってプログラムされた機器とともに用いてもよい。
【００７２】
コンピュータを用いたシステム
図６は、ＴＡＣＥポリペプチドを検討するためのシステム１０００を示している。本システムは、ＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部を表す情報を記憶するビデオメモリ１１０を含む。メモリは、三次元空間における位置を特定する一組の空間座標が記録された少なくとも１つの第１種の記憶領域１１２、および複数のアミノ酸のうち１つの特徴を表す情報が記録された少なくとも１つの第２種の記憶領域１１４を含む。第２種の記憶領域は、三次元空間におけるＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の幾何学的配置を表すためにビデオメモリ１１０内で第１種の記憶領域と論理的に関連づけられている。メモリ１１２および１１４は、例えば、表１に示されたデータなどを含みうる。システム１０００は、メモリ１１０からのデータに基づいて三次元空間におけるＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の三次元画像を表示するための画像シグナルを生成することを目的として、第１種の記憶領域１１２および第２種の記憶領域１１４にアクセスするために連結されたプロセッサも含む。プロセッサは、ＣＰＵ、レジスタ、メモリなどを備えた任意の汎用プロセッサであってよい。ディスプレイ１３０は、画像データに基づいて三次元空間におけるＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の三次元画像をスクリーン１３２上に表示するために、画像シグナルを受け取る回線１２５を介してプロセッサ１２０と連結される。
【００７３】
本発明の１つの態様において、画像データには、図１に示されたものなどの、三次元空間におけるＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部のリボン構造の三次元画像を表示するためのデータが含まれる。もう１つの態様において、画像データには、図２に示されたものなどの、三次元空間における前記ＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部のソリッドモデル表示による三次元画像を表示するためのデータが含まれる。さらにもう１つの態様において、画像データには、図２に示されたものなどの、三次元空間におけるＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部の静電表面ポテンシャルの三次元画像を表示するためのデータが含まれる。さらにもう１つの態様において、画像データには、図４に示されたものなどの、三次元空間におけるＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部の三次元立体画像を表示するためのデータが含まれる。
【００７４】
本発明のシステム１０００は、ＴＡＣＥポリペプチド以外の組成物の特徴の幾何学的配置を表すデータを記憶するための記憶装置１４５、およびオペレータからの指示を受け取るためのマウス１３５などのオペレータ・インターフェースをさらに含む。記憶装置１４５は、例えば、他の化学的実体に関する三次元Ｘ線座標データを含みうる。プロセッサ１２０は、記憶装置１４５および前記オペレータ・インターフェース １３５に連結され、オペレータ・インターフェースからの指示に基づいて、ＴＡＣＥポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の前記三次元画像に対する組成物の特徴の幾何学的配置をスクリーン１３２上に表示するための付加的な画像データを生成する。図６の態様において、記憶装置１４５はメモリ１１０の一部である。
【００７５】
第１種の記憶領域１１２および前記第２種の記憶領域１１４は、例えば、半導体メモリ、光ディスクの領域または磁気メモリの領域などの領域である。
【００７６】
１つの態様において、プロセッサ１２０およびビデオメモリ１１０は、シリコングラフィックス（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ）社、サンマイクロシステムズ（Ｓｕｎ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）社およびＩＢＭ社などから販売されている、ＵＮＩＸまたはＶＡＸコンピュータ形式である。しかし、本発明はこの特定のハードウエアおよびソフトウエアの使用に限定されない。
【００７７】
以下の例示的な実施例において、本発明をさらに詳しく説明する。実施例は本発明の主な態様のみを表すものに過ぎないと思われるが、以下の実施例は例示的であって制限的ではないことが理解される必要がある。
【００７８】
実施例 １ ― ＴＡＣＥ ポリペプチドの発現、単離および精製
ブラック（Ｂｌａｃｋ）ら、「細胞から腫瘍壊死因子−αを放出させるメタロプロテイナーゼであるディスインテグリン（Ａ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｄｉｓｉｎｔｉｇｒｉｎ ｔｈａｔ ｒｅｌｅａｓｅｓ ｔｕｍｏｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：７２９〜７３３（１９９７年２月）に開示された通りの、ＴＡＣＥのシグナルペプチド、プロドメイン、および触媒ドメインであるアミノ酸残基１〜４７７位においてＳｅｒ２６６がＡｌａに変化し、Ａｓｎ４５２がＧｌｎに変化し、配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）６がＣ末端に付加されたものをコードするｃＤＮＡを、ＣＨＯ細胞用の発現ベクター中に挿入した。ＴＡＣＥポリペプチドをＣＨＯ細胞内で発現させたところ、Ｖａｌ２１２またはＡｒｇ２１５で始まるＴＡＣＥポリペプチドの混合物が分泌された。ベクターを取り込んでいない細胞を死滅させる薬物であるメトトレキサートの存在下で細胞を培養した。
【００７９】
発現されたＴＡＣＥポリペプチドを次に精製した。精製は、発現されたＴＡＣＥポリペプチドを含む５リットルの培地を用いて開始した。ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社のカットオフ値１０Ｋの１ｆｔ２ＴＦＦ透析濾過ユニットを用いて培地を約２００ｍＬに濃縮した。排出速度は５０〜１００ｍＬ／分とした。続いて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）および３００ｍＭ ＮａＣｌからなる緩衝液（緩衝液Ｅ）２リットルを試料に添加した。
【００８０】
試料を上記の通りに再濃縮し、２リットルの緩衝液Ｅで２回目の希釈を行い、再び再濃縮し、２リットルの緩衝液Ｅで３回目の希釈を行った後に約１００ｍＬに再濃縮した。．透析濾過ユニット内に残った試料をバックフラッシュ法によって回収した。続いて、この材料を０．４５μｍで濾過し、アジ化物を０．０５％となるように添加した。濾過した試料を４℃で一晩保存した。
【００８１】
濾過した試料を一晩保存した後に、イミダゾールを２００ｍＭの貯蔵水溶液から５ｍＭとなるように添加し、ＺｎＣｌ２を１Ｍの貯蔵水溶液から５μＭとなるように添加した。続いて試料を２．２ｍＬのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）Ｎｉ−ＮＴＡスーパーフロー（Ｓｕｐｅｒｆｉｏｗ）樹脂（カタログ番号３０４３０）に対して流速３ｍＬ／分で通過させた（カラムサイズ７．５×５０ｍｍ）。
【００８２】
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾールおよび５μＭ ＺｎＣｌ２からなる緩衝液（緩衝液Ａ）１００ｍＬにより、カラムを流速５ｍＬ／分で洗浄した。続いて、緩衝液Ａ中にて１分間で最大２００ｍＭまでイミダゾールの濃度を高める勾配を加え（総容積５ｍＬ）、続いて２００ｍＭイミダゾールを３５ｍＬ流すことにより、ＴＡＣＥポリペプチドを溶出させた。２ｍＬずつの画分を回収したが、ＴＡＣＥは一般に約６ｍＬから溶出する。画分は、５００μｌの５０％グリセリン水溶液および２００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８を含む管に回収した。グリセリン水溶液はカラム処理の当日に調製した。
【００８３】
各画分からの３μｌのドットブロットをアミドブラックで染色し、どの画分が意味のある量の蛋白質を含むかを判定した。意味のある量の蛋白質がみられた画分をプールした。続いてそのプールをカットオフ値１０Ｋのアミコンセントリプレップ（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）濃縮装置で１〜２ｍＬに濃縮した。
【００８４】
この濃縮試料に対して、阻害物質Ｎ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ヒドロキシアミノカルボニル）メチル−４−メチルペンタノイル｝−Ｌ−３−アミノ−２−ジメチルブタノイル−Ｌ−アラニン，２−（アミノ）エチルアミドを５０ｍＭの貯蔵水溶液から１ｍＭとなるように添加し、オクチルグルコシドを１０％貯蔵水溶液から１％となるように添加した。続いて、試料を室温で１５〜２４時間インキュベーションした。
【００８５】
インキュベーションの後に試料を、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷＧを充填し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセリンで平衡化した２１．５×６００ｍｍのサイズ排除カラムＬＫＢ ２１３５−３６５にかけた。続いてこの緩衝液をカラムに流速２．５ｍＬ／分で１００分間通した。溶出液中のＴＡＣＥポリペプチドは２８０ｎｍでの吸収によって検出した。除外した材料は一般に約３８分後に溶出した。ＴＡＣＥは一般に約７８分後またはそれ以後に溶出した。
【００８６】
どの画分をプールすべきかを判定するために、意味のある蛋白質がみられた全画分を１５μｌずつ用いてゲル分析を行った。サイズ排除クロマトグラフィーのプールを、カットオフ値１０Ｋのアミコンセントリプレップ濃縮装置で約１ｍＬに濃縮した。
【００８７】
続いて、この精製試料に対して、阻害物質Ｎ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ヒドロキシアミノカルボニル）メチル−４−メチルペンタノイル｝−Ｌ−３−アミノ−２−ジメチルブタノイル−Ｌ−アラニン，２−（アミノ）エチルアミドを１ｍＭの濃度となるように添加した。蛋白質は４℃で保存可能である。
【００８８】
実施例 ２ ―蛋白質の結晶化
ヒトＴＡＣＥのプロドメインおよび触媒ドメイン（残基１〜４７７位）を含むＤＮＡ構築物を、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティーカラムによる蛋白質の精製が容易になるように配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）６と融合させた。蛋白質の発現にはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を用いた。この細胞は、Ｖａｌ２１２またはＡｒｇ２１５のいずれかで始まる成熟型ＴＡＣＥの混合物を分泌した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムから得られたＴＡＣＥ含有画分を、オクチルグルコシドおよび結合パートナーＮ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ヒドロキシアミノカルボニル）メチル−４−メチルペンタノイル｝−Ｌ−３−アミノ−２−ジメチルブタノイル−Ｌ−アラニンを含む緩衝液中でインキュベーションした。最終的な精製段階はゲル濾過カラムで行った。精製されたＴＡＣＥを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ（ｐＨ ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセリンおよび１ｍＭの阻害物質を含む緩衝液（ＴＡＣＥ緩衝液）中で保存した。
【００８９】
結晶化実験は、ＴＡＣＥ（ＴＡＣＥ緩衝液中）を以下に列挙する結晶化緩衝液と１：１の比で混合することによってＴＡＣＥ濃度を約５ｍｇ／ｍＬとし、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて行った。実験は２回ずつ行い、インキュベーションは約４℃または２０℃のいずれかで行った。結晶性沈殿物は２０℃で以下の結晶化緩衝液中に得られた：
緩衝液Ａ） ０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．３）、０．２Ｍ ＣａＣＩ２、３０％ｖ／ｖエタノール
緩衝液Ｂ） ０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ ５．０）、４０％ｖ／ｖエタノール
緩衝液Ｃ） ０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ ８．７）、２０％ｗ／ｖ ＰＥＧ ４０００、２０％ｖ／ｖイソプロパノール
【００９０】
結晶性沈殿物からの種を、ウサギ毛とともに、ＴＡＣＥ濃縮試料（１２ｍｇ／ｍＬ、ＴＡＣＥ緩衝液中）と緩衝液ＢまたはＣのいずれかとの１：１混合物中に移したところ、小さな結晶が得られた。緩衝液Ｃをさらに改良した結果、緩衝液Ｄが得られ、これによってＸ線データの収集に適した結晶の作製が可能となった。
緩衝液Ｄ） ０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ ５．４）、２０％ｗ／ｖ ＰＥＧ ４０００、２０％ｖ／ｖイソプロパノール
【００９１】
第１のデータセットは、グラファイトで単色化されたＣｕＫα放射線が得られる５．４ｋＷで動作させた理学電機（Ｒｉｇａｋｕ−Ｄｅｎｋｉ）トータリングＣｕ陽極線発生装置に装着したＭＡＲ３００イメージングプレートスキャナーを用いて、分解能２．５Åで測定した。データ処理にはＭＯＳＦＬＭ ｖ． ５．２３プログラムおよびＣＣＰ４パッケージソフト（ｓｕｉｔｅ）のルーチンを用いた。アダマリシンＩＩ、アダマリシンＩＩの全アラニンモデルおよび生成されたモデルを用いる分子置換法によって構造を解明しようとの試みではいずれもフェージングのための有用な開始点は得られなかった。このため、異常差に関するパターソン合成を利用して、独立した４つの亜鉛原子の位置を決定した。ＭＡＤデータを測定するために結晶を液体窒素中で急速冷凍した。このためには、適切なサイズの絹糸ループを利用して結晶を冷凍緩衝液（１７％ｖ／ｖグリセリンを含む８０％ｖ／ｖ緩衝液Ｄ）中に移し、約１０秒間浸漬した後に９０Ｋ゜で直ちに急速冷凍した。
【００９２】
得られた結晶は単斜晶系空間群Ｐ２１に属し、格子定数はａ＝６１．３８Å（オングストローム）、ｂ＝１２６．２７Å、ｃ＝８１．２７Å、β＝１０７．４１゜であり、非対称格子内に４分子を含む。
【００９３】
実施例 ３ ― Ｘ 線回折
実施例２で述べた結晶を用いて、第１のデータセットを、グラファイトで単色化されたＣｕＫα放射線が得られる５．４ｋＷで動作させた理学電機（Ｒｉｇａｋｕ−Ｄｅｎｋｉ）トータリングＣｕ陽極線発生装置に装着したＭＡＲ３００イメージングプレートスキャナーを用いて、分解能２．５Åで測定した。データ処理にはＭＯＳＦＬＭ ｖ． ５．２３プログラムおよびＣＣＰ４パッケージソフトのルーチンを用いた。
【００９４】
アダマリシンＩＩ、アダマリシンＩＩの全アラニンモデルおよびその他のモデルを用いる分子置換法によって構造を解明しようとの試みではいずれもフェージングのための有用な開始点は得られなかった。
【００９５】
このため、異常差に関するパターソン合成を利用して、独立した４つの亜鉛原子の位置を決定した。ＭＡＤデータを測定するために、液体窒素の温度まで冷却した窒素気流中で結晶を急速冷凍した。８０％ｖ／ｖ緩衝液Ｄである冷凍緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ ５．４）、２０％ｗ／ｖ ＰＥＧ ４０００、２０％ｖ／ｖイソプロパノール）に１７％ｖ／ｖグリセリンを含むものの中に結晶をまず移した。冷凍緩衝液への移行には適切なサイズの絹糸ループを用いた。結晶を冷凍緩衝液中に約１０秒間浸漬した後、９０Ｋ゜で直ちに急速冷凍した。
【００９６】
分解能２．０Åまでの異常回折データを、ドリス（ＤＯＲＩＳ）（ＤＥＳＹ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＢＷ６ウィグラービームライン装置に装着したＭＡＲ３４５イメージングプレートスキャナーにより、亜鉛のＫ吸収端である最大ｆ’’（１．２７６９Å）および最小ｆ’’（１．２７７６Å）の波長、ならびに隔たった波長（１．０６０Å）の単色Ｘ線放射線を用いて、９０Ｋで収集した。データのスキャニングおよび評価はＤＥＮＺＯ／ＳＣＡＬＥＰＡＣＫを用いて行い、１０５１８３６回の測定で７７６５３個の独立した反射が得られた（完全性９６．９％、Ｒ融合（Ｒ−ｍｅｒｇｅ）強度０．０３１）。
【００９７】
ＭＡＤフェーズの精密化および算出は、解像度２．０Åまでのすべての測定データを含め、ＭＬＰＨＡＲＥを用いて行った。平均性能示数（ｍｅａｎ−ｆｉｇｕｒｅ−ｏｆ−ｍｅｒｉｔ） の初期値は０．５３であり、ＤＭを用いる溶媒フラットニング／ヒストグラムマッチング法によって０．７６に高まった。この密度により、４つの独立したＴＡＣＥ触媒ドメインおよび結合したヒドロキサム酸基質の完全鎖をＳＧＩシステム上でＴＵＲＢＯ−ＦＲＯＤＯを用いて構築することが可能となった。このモデルをＸＰＬＯＲおよびＣＣＰ４ルーチンを用いて結晶学的に精密化し、解像度１２．０から２Åまでの独立した７９４００個の反射を用いて、結晶学的Ｒ因子を１８．６％（Ｒｆｒｅｅ ２７．４％）とした。
【００９８】
４つの独立したＴＡＣＥ分子は周期的配置を生じる。
【００９９】
分子１および２、ならびに３および４はそれぞれＡｓｐ２１９およびＭｅｔ２２１からＳｅｒ４７４までと定義される。
【０１００】
実施例 ４ ― Ｘ 線回折
分解能２．０Åまでの異常回折データを、ドリス（ＤＯＲＩＳ）社（ＤＥＳＹ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のウィグラービームライン装置に装着したＭＡＲ３４５イメージングプレートスキャナーにより、亜鉛のＫ吸収端である最大ｆ’（１．２７９７Å）および最小ｆ’（１．２８０４Å）の波長、ならびに隔たった波長（１．０６０Å）の単色Ｘ線放射線を用いて、１００Ｋで収集した。これらのデータの評価およびスキャニングはＤＥＮＺＯ／ＳＣＡＬＥＰＡＣＫを用いて行い、７７，６５３個の独立した反射を得た（完全性９６．９％、Ｒ融合強度０．０３１）。
【０１０１】
得られた構造座標を表１に転載する。
【表１】
実施例 ５ ― ＴＡＣＥ 阻害物質の設計
ＴＡＣＥのＸ線回折座標をＳｙｂｙｌ ｖ．６．３（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）ソフトウエアパッケージにて読み取り、Ｘ線構造の画像解析を行った。本来のＸ線座標内部の領域をキラリティーおよび原子の種類に関して補正した。補正されたＴＡＣＥのＸ線モデルに対して、すべてのＴＡＣＥ構造パラメーターが平衡または最適値に達するまでエネルギー最小化を行った。エネルギー最小化が得られた構造を本来の構造と比較し、異常がないことを確かめた。
【０１０３】
ＴＡＣＥと共結晶化された阻害物質との間の特異的相互作用の部位を同定した。続いて、阻害物質をＸ線複合体モデルから除去し、ＴＡＣＥ構造モデルのみが残るようにした。
【０１０４】
候補阻害物質は、共結晶化された阻害物質に関して以前に同定された相互作用部位に鑑み、ＴＡＣＥと候補阻害物質との相互作用部位に基づいて選択した。特異的な候補阻害物質−ＴＡＣＥ相互作用が決定されたところで、選択された候補化合物とＴＡＣＥとの予備的に「モデル化された」複合体を得るために、市販のドッキング用ソフトウエアを用いるドッキング試験を行った。
【０１０５】
モデル化されたＴＡＣＥ−阻害物質複合体の完全性を検査するために、分子動力学（ＭＤ）を用いて拘束的配座解析（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。複合体が最も都合のよい立体配座状態に到達したところで、ＭＤ試験によって提示された構造の画像解析を行い、測定された結合親和性に基づいて、モデル化された複合体が既知の実験的ＳＡＲ／ＱＳＡＲと適合することを確かめた。
【０１０６】
モデル化された候補阻害物質−ＴＡＣＥ複合体を解析した。少量の溶媒に露出された経路（ｃｈａｎｎｅｌ）を含むＴＡＣＥのＳ１’領域と会合する複合体の領域を、修飾のための標的領域として選択した。コンピュータ計算および合成化学の原理に基づき、１つのベンジル基が標的領域内部に埋め込まれるようになる単独の修飾を選択した。このベンジル基を、Ｓ１’ Ｓ３’ポケット内に入り込むように適切な亜鉛キレーターコアに対して配向させた。この修飾により、一般にＭＭＰ選択性であった阻害物質がＴＡＣＥ選択性となった。ベンジル修飾を加えた阻害物質に関するＩＣ５０データから、この選択性が裏づけられた。
【０１０７】
阻害物質の効力、選択性および物理的薬物様特性の最適化のための構造に基づく類似体化（ａｎａｌｏｇｉｎｇ）を、反復的な様式で行った。
【０１０８】
実施例 ６ ― ＴＡＣＥ 阻害の測定
２５０μＭのペプチド基質（Ａｃ−ＳＰＬＡＱＡＶＲＳＳＳＲ−ＮＨ２）を、１０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１０％グリセリンを含む２５℃の緩衝液中で３．７Ｕ／μＬのＴＡＣＥとともにインキュベーションした。２時間後に１％ＴＦＡ（最終濃度）によって反応を停止させた。ヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）１１５０を用いるＨＰＬＣによって反応混合物を分離した。産物の形成は２２０ｎｍでの吸光度によってモニターした。
【０１０９】
反応の線形性が確認された（ｒ２＞０．８５）。対照速度の平均値（ｘ±ｓｅｍ）を算出し、ダネットの多重比較検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ）を用いて、統計学的有意性（ｐ＜０．０５）に関して薬物試験時の速度と比較した。複数の投薬量を用いて用量反応関係を検討し、線形回帰を用いて、ＩＣ５０値を９５％ＣＩとともに推定した。
【０１１０】
以上の説明および実施例により、当業者は本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明の範囲または精神を逸脱することなく、さまざまな用途および条件に適合するように本発明に変更、修正および変化を加えることができる。さらに、米国仮特許出願第６０／０７３，７０９号および米国特許出願第０９／０５０，０８３号を含む、上記に言及されたすべての刊行物および特許出願の開示は、それぞれが参照として組み込まれるように個別に示されている場合と同程度にそれらの全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＡＣＥ触媒ドメイン（ＴＣＤ）のリボン図（ｒｉｂｂｏｎ ｄｉａｇｒａｍ）である。鎖は左下の奥の方から始まり、構造要素ｓＩ、ｈＡＩ、ｈＡ、ｓＩＩ、ｈＢ、ｈＢ２、ｓＩＩＩ、ＩＶ、ＩＶａ、ｓＩＶｂ、ｓＶ、ｈＣ、ＭｅｔターンおよびｈＤを経て、左上の奥で終わる。３つのジスルフィド結合を結線として示し、硫黄を小球として表している。触媒性亜鉛（中央の球）はＨｉｓ４０５、Ｈｉｓ４０９およびＨｉｓ４１５という３つのイミダゾール基、ならびに阻害物質のヒドロキサム酸基のヒドロキシルおよびカルボニル酸素原子による配位を受ける。ペプチド基質のプライム化部位残基の相互作用を模倣する阻害物質の全体を示している。図１はＳＥＴＯＲを用いて作成した。エバンス（Ｅｖａｎｓ， Ｓ．）「ＳＥＴＯＲ：ハードウエア照光による巨大分子の三次元ソリッドモデル表示（ＳＥＴＯＲ：Ｈａｒｄｗａｒｅ Ｌｉｇｈｔｅｄ Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｓｏｌｉｄ Ｍｏｄｅｌ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」Ｊ． Ｍｏｌ． Ｇｒａｐｈ． １１：１３４〜１３８（１９９３）を参照されたい。
【図２ａおよび２ｂ】ＴＡＣＥ（ＴＣＤ）（図２ａ）およびＭＭＰ−３（図２ｂ）の触媒ドメインのソリッドサーフェス（ｓｏｌｉｄ ｓｕｒｆａｃｅ）表示である。静電表面ポテンシャルを−１５（濃い赤）から１５（濃い青）ｋ８Ｔ／ｅまで色分けしている。活性部位のくぼみ（ｃｌｅｆｔ）は両方とも左から右に延び、触媒性亜鉛原子（球）が中央に位置する。ＴＡＣＥの内部に結合した阻害物質の全体構造が示されており、イソブチル（Ｐ１’）およびＡｌａ（Ｐ３’）側鎖がＳ１’および新規Ｓ３’ポケットの深部に結合している。配向は図１と類似している。図２ａおよび２ｂはＧＲＡＳＰを用いて作成した。ニコリス（Ｎｉｃｏｌｌｓ， Ａ．）、バラドワジ（Ｂｈａｒａｄｗａｊ， Ｒ．）およびフイグ（Ｈｏｕｉｇ， Ｂ．）、「Ｇｒａｓｐ―表面特性の画像表示および解析（Ｇｒａｓｐ−Ｇｒａｐｈｉｃａｌ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、Ｂｉｏｐｈｙｓ． ６４、Ａ１６６（１９９３）。
【図３】アダマリシン（ａｄａｍａｌｙｓｉｎ）ＩＩ（ＡＤＡＭ＿ＣＲＯＡＤ）、ＴＡＣＥおよびヒトＡＤＡＭ １０（ｈＡＤＡＭ１０）の触媒ドメイン配列を、それらのトポロジー的同等性および配列類似性に従ってそれぞれ整列化したものである。残基数は一般的なＴＡＣＥの番号付けによる。矢印および中括弧は、ＴＡＣＥにおけるβ鎖およびαヘリックスを表す。
【図４】触媒性亜鉛（中央の大きな球）の周囲の最終的な２．０Å電子密度の立体断片図を最終的なＴＡＣＥモデルと重ね合わせたものである。亜鉛に配位するＨｉｓ４０５（上）、Ｈｉｓ４０９（左）およびＨｉｓ４１５（下）の３つのイミダゾール環、「触媒性」Ｇｌｕ４０６ならびに阻害物質のヒドロキサム酸部分が認められる。配向は図１と類似している。図４はＴＵＲＢＯ−ＦＲＯＤＯを用いて作成した。ルーセル（Ｒｏｕｓｓｅｌ， Ａ．）およびカンベロー（Ｃａｍｂｉｌｌｅａｕ， Ｃ．）、「シリコングラフィックス式形態におけるＴｕｒｂｏ−Ｆｒｏｄｏ（Ｔｕｒｂｏ−Ｆｒｏｄｏ ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｇｅｏｍｅｔｒｙ）」、Ｐａｒｔｎｅｒｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ（１９８９）。
【図５】ＴＡＣＥ（明）およびアダマリシン（暗）の触媒ドメインのリボン図を重ね合わせたものである。ＴＡＣＥの触媒性亜鉛（球）ならびに３つ（ＴＡＣＥ）および２つの（アダマリシン）ジスルフィド架橋も示されている。配向は図１と類似している。図５はＧＲＡＳＰを用いて作成した。
【図６】ＴＮＦ−α変換酵素の少なくとも一部の表示画面を生成するための情報を記憶するビデオメモリを含む、ＴＮＦ−α変換酵素を研究するためのシステムを示している。
Claims (63)
- ポリペプチドがＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドである、結晶形状にあるポリペプチドを含む組成物。
- ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドがＴＮＦ−α変換酵素触媒ドメインを含む、請求項１記載の組成物。
- ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドがＴＮＦ−α変換酵素のプロドメインおよび触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドの発現産物である、請求項１記載の組成物。
- ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドがＴＮＦ−α変換酵素のアミノ酸残基１〜４７７位をコードするポリヌクレオチドの発現産物である、請求項１記載の組成物。
- ポリヌクレオチドのアミノ酸残基Ｓｅｒ２６６がＡｌａに変化し、アミノ酸残基Ａｓｎ５４２がＧｌｎに変化するように置換され、配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）６をコードする第２のポリヌクレオチドがＣ末端と融合される、請求項４記載の組成物。
- ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドとの共結晶化のために適した結合パートナー（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ）をさらに含む、請求項１記載の組成物。
- 結合パートナーがヒドロキサム酸に基づく結合パートナーである、請求項６記載の組成物。
- 結合パートナーがＮ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ヒドロキシアミノカルボニル）メチル−４−メチルペンタノイル｝−Ｌ−３−アミノ−２−ジメチルブタノイル−Ｌ−アラニン，２−（アミノ）エチルアミド（Ｎ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ｈｙｄｒｏｘｙａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−４−ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ｝−Ｌ−３−ａｍｉｎｏ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ，２−（ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ ａｍｉｄｅ）である、請求項６記載の組成物。
- 結晶が２．０Åで回折する結晶構造を有する、請求項１記載の組成物。
- 結晶が単斜晶系である、請求項１記載の組成物。
- 結晶の単位格子が結晶学的に独立した４つのＴＮＦ−α変換酵素触媒ドメイン（ＴＣＤ）分子を含む、請求項１記載の組成物。
- ＴＣＤ分子が非対称格子内にある、請求項１１記載の組成物。
- 結晶が単斜空間群Ｐ２１であり、格子定数がａ＝６１．３８Ａ、ｂ＝１２６．２７Ａ、ｃ＝８１．２７Ａおよびβ＝１０７．４１゜である、請求項１記載の組成物。
- ポリペプチドが表１による構造座標またはその実質的部分を特徴とする、請求項１記載の組成物。
- 以下の段階を含む、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの結晶化のための方法：
（Ａ）ＴＡＣＥポリペプチドおよび結合パートナーを含む溶液を結晶化緩衝液と混合する段階、ならびに
（Ｂ）結晶性沈殿物を形成させるためにドロップ蒸気拡散法（ｄｒｏｐ ｖａｐｏｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）によって段階（Ａ）の混合物を結晶化させる段階。 - 以下の段階をさらに含む、請求項１５記載の方法：
（Ｃ）ドロップ蒸気拡散法によって形成された結晶性沈殿物からの種（ｓｅｅｄ）、および結晶化促進物質を、ＴＡＣＥポリペプチドおよび結合パートナー基質を含む濃縮溶液と結晶化緩衝液との混合物中に移す段階、ならびに
（Ｄ）結晶を形成させるためにドロップ蒸気拡散法により段階（Ｃ）の混合物を結晶化させる段階。 - 結晶化緩衝液が０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ ５．４）、２０％ｗ／ｖ ＰＥＧ ４０００および２０％ｖ／ｖイソプロパノールである、請求項１５または１６記載の方法。
- 結合パートナーがＮ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ヒドロキシアミノカルボニル）メチル−４−メチルペンタノイル｝−Ｌ−３−アミノ−２−ジメチルブタノイル−Ｌ−アラニン，２−（アミノ）エチルアミドである、請求項１５または１６記載の方法。
- 結晶化が４〜２０℃の範囲の温度で行われる、請求項１５または１６記載の方法。
- ＴＡＣＥポリペプチドおよび阻害物質を含む溶液が、緩衝液中に約５ｍｇ／ｍＬから約１２ｍｇ／ｍＬまでの濃度である、請求項１５または１６記載の方法。
- ＴＡＣＥポリペプチドおよび結合パートナーを含む溶液が結晶化緩衝液と１：１の比で混合される、請求項２０記載の方法。
- ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドと共結晶化基質との共結晶化によって製造される腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）変換酵素結晶。
- ＴＮＦ−α変換酵素の触媒ドメインまたはその一部に関するＸ線結晶学的座標データが記録されたコンピュータ可読媒体。
- 表１に示すＸ線結晶学的座標データまたはその一部が記録されたコンピュータ可読媒体。
- 媒体がフロッピーディスク、ハードディスク、コンピュータテープ、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＣＤ、ＤＶＤ、磁気ディスクおよび光ディスクからなる群から選択される、請求項２３または２４記載のコンピュータ可読媒体。
- 記録された機械可読データを有する記録されたコンピュータ可読媒体であって、データ利用のための指示がプログラムされた装置とともに用いた場合にＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドまたはその一部の三次元画像表示用の画像シグナルを生成しうるコンピュータ可読媒体。
- 以下の特徴を有する、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドを研究するためのシステム：
（ａ）ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部を表す情報を記憶しうるメモリであって、該メモリが三次元空間における位置を特定する一組の空間座標を含む少なくとも１つの第１種の記憶領域と、複数のアミノ酸のうち１つの特徴を表す情報を含む少なくとも１つの第２種の記憶領域とを含み、該第２種の記憶領域が該三次元空間における該ＴＮＦ−α変換酵素ペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の幾何学的配置を表すために、該メモリにおいて該第１種の記憶領域と論理的に関連づけられているようなメモリ、
（ｂ）該第１種の記憶領域および該第２種の記憶領域にアクセスするために該メモリと連結されたプロセッサであって、該メモリからのデータに基づいて該三次元空間における該ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の三次元像を表す画像を描写するための画像シグナルを生成するプロセッサ、ならびに
（ｃ）該画像シグナルを受け取るために該プロセッサと連結されたディスプレイであって、該画像シグナルに基づく該三次元空間における該ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の三次元画像を描写するディスプレイ。 - 画像シグナルが、三次元空間におけるＴＮＦα変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部のリボン構造の三次元画像を描写するためのシグナルを含む、請求項２７記載のシステム。
- 画像シグナルが、三次元空間におけるＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部のソリッドモデル表示による画像を描写するためのシグナルを含む、請求項２７記載のシステム。
- 画像シグナルが、三次元空間におけるＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の静電表面ポテンシャルの三次元画像を描写するためのシグナルを含む、請求項２７記載のシステム。
- 画像シグナルが、三次元空間におけるＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の三次元立体画像を描写するためのシグナルを含む、請求項２７記載のシステム。
- 以下の特徴をさらに含む、請求項２７記載のシステム：
ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド以外の組成物の特徴の幾何学的配置を表すデータを記憶しうる記憶装置、および
オペレータからの指示を受け取るためのオペレータ・インターフェースであって、プロセッサが、オペレータ・インターフェースからの指示に基づいてディスプレイ上に該ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の該三次元画像と対比して該組成物の特徴の幾何学的配置を描写するための付加的な画像シグナルを生成するような、記憶装置およびオペレータ・インターフェースに連結される、オペレータ・インターフェース。 - 記憶装置がメモリの一部である、請求項３２記載のシステム。
- 複数の第１種および第２種の記憶領域を含む、請求項２７記載のシステム。
- 以下の特徴を有する、ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の表示画面を生成するための情報を記憶しうるビデオメモリ：
（ａ）それぞれが三次元空間における位置を特定する一組の空間座標を含む、少なくとも１つの第１種の記憶領域、および
（ｂ）それぞれが複数のアミノ酸のうち１つの特徴を画像表示するための情報を含む、少なくとも１つの第２種の記憶領域であって、三次元空間におけるＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴の幾何学的配置を表すための該ビデオメモリにおいて該第１種の記憶領域と論理的に関連づけられている、第２種の記憶領域。 - 第２種の記憶領域が、三次元空間におけるＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドの触媒ドメイン部分の少なくとも１つの特徴の幾何学的配置を表すためにビデオメモリにおいて第１種の記憶領域と論理的に関連づけられている、請求項３５記載のビデオメモリ。
- 第１種の記憶領域および第２種の記憶領域が半導体メモリの領域である、請求項３５記載のビデオメモリ。
- 第１種の記憶領域および第２種の記憶領域が光ディスクの領域である、請求項３５記載のビデオメモリ。
- 第１種の記憶領域および第２種の記憶領域が磁気メモリの領域である、請求項３５記載のビデオメモリ。
- 複数の第１種および第２種の記憶領域を含む、請求項３５記載のビデオメモリ。
- 以下の段階を含む、ＴＮＦ−α変換酵素と会合する化合物を同定する方法：
（Ａ）ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド結晶のＸ線回折座標に基づく、ＴＮＦ−α変換酵素触媒ドメインと結合を形成するポリペプチドに対する会合性化合物の設計、
（Ｂ）該化合物の合成、および
（Ｃ）該化合物の該ＴＮＦ−α変換酵素との会合能の決定。 - 会合性化合物が阻害物質、修飾物質またはＴＮＦ−α変換酵素活性を調節するその他の化合物である、請求項４１記載の方法。
- 会合性化合物が競合的阻害物質、不競合的阻害物質または非競合的阻害物質である、請求項４２記載の方法。
- 座標が表１の座標またはその実質的部分である、請求項４１記載の方法。
- ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド結晶がＴＮＦ−α変換酵素の触媒ドメインを含む、請求項４１記載の方法。
- ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドがＴＮＦ−α変換酵素のプロドメインおよび触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドの発現産物である、請求項４１記載の方法。
- ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチドがＴＮＦ−α変換酵素のアミノ酸残基１〜４７７位をコードするポリヌクレオチドの発現産物である、請求項４１記載の方法。
- ポリヌクレオチドのアミノ酸残基Ｓｅｒ２６６がＡｌａに変化し、アミノ酸残基Ａｓｎ５４２がＧｌｎに変化するように置換され、配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｈｉｓ）６をコードする第２のポリヌクレオチドがＣ末端と融合される、請求項４７記載の方法。
- ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド結晶が結合パートナーとともに共結晶化される、請求項４１記載の方法。
- 結合パートナーがヒドロキサム酸に基づく結合パートナーである、請求項４９記載の方法。
- 結合パートナーがＮ−｛Ｄ，Ｌ−２−（ヒドロキシアミノカルボニル）メチル−４−メチルペンタノイル｝−Ｌ−３−アミノ−２−ジメチルブタノイル−Ｌ−アラニン，２−（アミノ）エチルアミドである、請求項４９記載の方法。
- ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド結晶が２．０Åで回折する結晶構造を有する、請求項４１記載の方法。
- ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド結晶が単斜晶系である、請求項４１記載の方法。
- ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド結晶が結晶学的に独立した４つのＴＮＦ−α変換酵素触媒ドメイン（ＴＣＤ）分子を含む単位格子を有する、請求項４１記載の方法。
- ＴＣＤ分子が非対称格子内にある、請求項５４記載の方法。
- ＴＮＦ−α変換酵素ポリペプチド結晶が単斜空間群Ｐ２１であり、格子定数がａ＝６１．３８Å、ｂ＝１２６．２７Å、ｃ＝８１．２７Åおよびβ＝１０７．４１゜である、請求項４１記載の方法。
- 会合性化合物がＴＮＦ−α変換酵素のＳ１’領域と会合するように設計される、請求項４１記載の方法。
- 会合性化合物がＴＮＦ−α変換酵素のＳ１’Ｓ３’ポケットと会合するように設計される、請求項４１記載の方法。
- 会合性化合物が亜鉛をキレート化する部分を組み入れるように設計される、請求項４１記載の方法。
- 会合性化合物がＴＮＦ−α変換酵素のＬｅｕ３４８またはＧｌｙ３４９と水素結合を形成するように設計される、請求項４１記載の方法。
- 会合性化合物がＴＮＦ−α変換酵素のＳ１’ポケットを占有する非極性基を導入するように設計される、請求項４１記載の方法。
- 会合性化合物がＴＮＦ−α変換酵素のＳ１’−Ｓ３’ポケットをつなぐ経路（ｃｈａｎｎｅｌ）内に位置し、その経路と適切なファンデルワールス接触を行う基を導入するように設計される、請求項４１記載の方法。
- 会合性化合物がＴＮＦ−α変換酵素の骨格アミド基上のＬｅｕ３４８またはＧｌｙ３４９と水素結合を形成するように設計される、請求項４１記載の方法。
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