DE69009476T2

DE69009476T2 - Hemmung des reaktionswegs für die n-ende-regel in lebenden zellen.

Info

Publication number: DE69009476T2
Application number: DE69009476T
Authority: DE
Inventors: Rohan Baker; David Gonda
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1989-06-30
Filing date: 1990-06-27
Publication date: 1994-12-22
Anticipated expiration: 2010-06-28
Also published as: CA2063400A1; WO1991000356A1; JPH04506298A; JP2904921B2; EP0479912A1; ES2054365T3; DE69009476D1; DK0479912T3; AU5963290A; US5766927A; CA2063400C; EP0479912B1; ATE106449T1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Halbwertszeiten von intrazellulären Proteinen liegen zwischen einigen Sekunden und vielen Tagen. Eine Hauptfunktion des Zerfalls von intrazellulärem Protein ist die selektive Beseitigung von beschädigten oder anderweitig abnormalen Proteinen. Eine weitere Rolle von Zerfallsstrecken ist die entweder dauerhafte oder übergangsweise Übertragung von kurzen Halbwertszeiten auf unbeschädigte Proteine, deren intrazelluläre Konzentrationen sich als eine Funktion der Zeit ändern müssen. Viele andere Proteine sind zwar als Bestandteile von größeren makromolekularen Komplexen langlebig, wie etwa Ribosomen oder oligomere Proteine, sind jedoch in einem freien (nichtassozierten) Zustand metabolisch instabil.
Die Raten bzw. Geschwindigkeiten des Proteinzerfalls sind eine Funktion des physiologischen Zustands der Zelle und werden anscheinend für einzelne Proteine differentiell gesteuert. Die metabolische Instabilität von normalerweise kurzlebigen Proteinen erlaubt eine rasche Einstellung ihrer intrazellulären Konzentrationen durch regulierte Änderungen der Synthese- oder der Zerfallsraten. Die wenigen Fälle, in denen die metabolische Instabilität eines intrazellulären Proteins als für seine Funktion wesentlich aufgezeigt wurde, umfassen das cII-Protein von Bakteriophage Lambda und die HO-Endonuclease der Hefe Saccharomyces cerevisiae.
Der größte Teil des selektiven Umsatzes von intrazellulären Proteinen unter normalen Stoffwechselbedingungen ist ATP- abhängig und bei Eukaryonten nichtlysosomal. Neuere biochemische und genetische Anhaltspunkte zeigen, daß bei Eukaryonten die kovalente Konjugation von Ubiquitin an kurzlebigen intrazellulären Proteinen für deren selektiven Zerfall wesentlich ist. Die Regeln, die festlegen, ob ein gegebenes Protein in vivo Stoffwechselstabil oder -instabil ist, waren bisher nicht bekannt.
Bachmair et al., Science, 234:179-186 (1986); Cell, 56:1019-1031 (1989), beschreiben Verfahren zum Erzeugen von gewünschten Amino-terminalen Resten in Proteinen und Verfahren zur Beeinflussung der Stoffwechselstabilität von Proteinen unter Nutzung der N-Ende-Regel. Bachmair et al. haben entdeckt, daß die Beschaffenheit der Aminosäure, die am Aminoende eines intrazellulären Proteins exponiert ist, eine wichtige Determinante ist, die angibt, ob ein Protein in vivo metabolisch stabil oder kurzlebig ist. Einzelne Aminosäuren können als entweder stabilisierende oder destabilisierende Aminosäuren kategorisiert werden in bezug auf den Grad der Stoffwechselstabilität (Halbwertszeit), den sie einem Protein verleihen, wenn sie an dem Aminoende des Proteins exponiert sind. Destabilisierende Aminosäurereste verleihen kurze Halbwertszeiten, die bei einigen der destabilisierenden Aminosäuren nur einige Minuten betragen können. Stabilisierende Aminosäurereste verleihen lange Halbwertszeiten, die viele Stunden betragen können. Diese Abhängigkeit der Halbwertszeit eines Proteins von der Beschaffenheit seines aminoendständigen Rests wird als die N-Ende- Regel bezeichnet. Die Zerfallsstrecke, deren Anfangsschritte die aminoendständige Erkennung von proteolytischen Substraten umfassen, wird als die N-terminale bzw. N-Ende- Regelstrecke bezeichnet.
Seit der Entdeckung der N-Ende-Regel des Proteinzerfalls durch Bachmair et al. (siehe oben) ist ihre Existenz wiederholt bestätigt worden, und zwar sowohl in weiteren Untersuchungen derselben Gruppe und von anderen Forschern (Reiss et al., J. Biol. Chem., 263 (6), 2693-98 (1988)). Für viele Anwendungsgebiete wäre es äußerst nützlich, den von der N- Ende-Regelstrecke abhängigen Proteinzerfall in lebenden Zellen spezifisch zu hemmen, weil dies eine Beeinflussung oder spezifische Störung von zellulären Prozessen wie Zellvermehrung und differenzierung ermöglichen würde.

Offenbarung der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum selektiven Hemmen des Zerfalls von spezifischen Gruppen von Proteinen in intakten Zellen und ganzen Tieren (d. h. in vivo), sowie Zusammensetzungen, die bei dem Verfahren nützlich sind. Das Verfahren, das als ein Verfahren zur Hemmung der N-Ende- Regelstrecke in lebenden Zellen bezeichnet wird, nutzt das Wissen, daß die Beschaffenheit der Aminosäure, die an dem Aminoende eines Proteins anwesend ist, eine wichtige Determinante der Halbwertszeit dieses Proteins ist. Durch Anwendung dieses Verfahrens und der Zusammensetzungen ist es möglich, die Halbwertszeiten bestimmter Proteine oder Arten von Proteinen zu verändern (zu verlängern) und infolgedessen zelluläre Prozesse zu beeinflussen, bei denen diese Proteine betroffen sind, wie etwa Zellvermehrung und -differenzierung. Bei dem Verfahren wird ein als Regulator bezeichnetes Agens in Zellen unter geeigneten Bedingungen eingeführt, die ihm erlauben, an einen signifikanten Anteil eines spezifischen N-Ende-erkennenden Proteinfaktors zu binden und diesen zu hemmen und dadurch eine spezifische Untergruppe der N- Ende-Regelstrecke in vivo zu hemmen. Die spezifische Untergruppe ist derjenige Bereich der N-Ende-Regelstrecke, der von der N-Ende-erkennenden Aktivität beherrscht wird, die von dem Regulator gehemmt wird. Beispielsweise hemmt ein Regulator, der einen basischen Amino-terminalen Rest hat, die basische N-Ende-erkennende Aktivität, die eine Untergruppe der N-Ende-Regelstrecke bildet. Infolgedessen partizipieren intrazelluläre Proteine, die den gleichen Aminosaurerest oder einen gleichartigen Rest an ihren Aminoenden haben, an der N-Ende-Regelstrecke in geringerem Umfang, als das der Fall wäre, wenn der Regulator nicht anwesend wäre, und ihre jeweiligen Halbwertszeiten in vivo werden verlängert.
Der Regulator ist ein Aminosäurederivat wie etwa ein Dipeptid, ein kleines Polypeptid oder ein anderes Carboxylendständiges Derivat einer Aminosäure, die die gleiche oder gleichartig wie der Amino-terminale Rest des intrazellulären Proteins (der intrazellulären Proteine) ist, dessen Stoffwechselstabilität erhöht werden soll.
Die Beschaffenheit des Aminosäurerests, der an dem Aminoende eines Proteins anwesend ist, ist eine Determinante der Halbwertszeit des Proteins. Beispielsweise bei der Hefe S. cerevisiae umfaßt die destabilisierende Klasse von Aminoendständigen Resten solche Aminosäuren wie Isoleucin, Glutaminsäure, Tyrosin, Glutamin, Phenylalanin, Leucin, Asparagin, Asparaginsäure, Lysin, Arginin, Tryptophan und Histidin. Nach derselben Regel umfaßt die stabilisierende Klasse von Amino-endständigen Resten Aminosäuren wie Methionin, Serin, Glycin, Alanin, Threonin, Valin, Cystein und Prolin.
Die Methode der Erfindung kann bei allen Organismen angewandt werden, die die N-Ende-Regelstrecke besitzen. Das ist so, weil zwar die spezifischen Mitglieder der beiden Klassen (stabilisierend und destabilisierend) von Amino-terminalen Aminosäureresten bei verschiedenen Eukaryonten etwas verschieden sind, aber in jedem Fall eine bestimmte N-Ende- Regel gilt und sowohl destabilisierende als auch stabilisierende Aminosäuren ohne weiteres für einen bestimmten Eukaryonten identifiziert werden können. Beispielsweise bei der vor kurzem bestimmten N-Ende-Regel von Säuger-Reticulocyten (Gonda et al., J. Biol. Chem., im Druck) wurden Cystein, Alanin, Serin und Threonin, die in Hefe stabilisierende Aminosäuren sind, als destabilisierend in Reticulozyten aufgezeigt. Umgekehrt ist Isoleucin, das in Hefe destabilisierend ist, in Reticulozyten stabilisierend. Auf ähnliche Weise wie von Gonda et al., siehe oben, beschrieben ist es möglich, die exakte Form der N-Ende-Regel in jeder gewählten Zelle oder jedem gewählten Organismus festzustellen.
Ein Regulator gemäß der Erfindung weist einen Aminoterminalen Rest auf, der, wenn er an dem Aminoende eines intakten intrazellulären Proteins anwesend ist, die Halbwertszeit dieses Proteins in der Zelle herabsetzt. Bei Anwendung in dem vorliegenden Verfahren jedoch erhöht der in einem Regulator anwesende destabilisierende Amino-terminale Rest tatsächlich die Halbwertszeit des intrazellulären Proteins, indem er als "Köder" wirkt, der mit einem kurzlebigen intrazellulären Protein für die Bindung an eine N-Ende- erkennende Komponente der N-Ende-Regelstrecke konkurriert. Infolgedessen wird das im übrigen kurzlebige Protein weniger effizient von der N-Ende-Regelstrecke zielgerichtet, und seine Halbwertszeit in der Zelle wird verlängert.
Die Zusammensetzungen und Methoden der Erfindung können nützlich sein bei der Behandlung von Krankheiten, die aus einem abnormalen (z. B. übermäßigen) ln-vivo-Zerfall von bestimmten Proteinen resultieren, was bei einer Vielzahl von katabolischen Zuständen wie etwa bei Muskelschwund beobachtet wird, oder aus ungenügenden Werten eines normalerweise kurzlebigen Proteins, dessen künstliche Stoffwechselstabilisierung durch die Erfindung die Krankheit aufhalten oder zur Umkehr veranlassen kann. Die Methode kann auch angewandt werden, um Ausbeuten in einem biologischen Produktionsverfahren gegenüber denjenigen zu steigern, die bei Abwesenheit des Regulators (eines Inhibitors der N-Ende-Regelstrecke) resultieren würden.
Als Ergebnis der Erfindung ist es erstmals möglich, die N- Ende-Regelstrecke in vivo (d. h. in intakten Zellen und ganzen Tieren) zu hemmen. Es ist unerwartet, daß ein Stoff wie beispielsweise ein Leucinmethylester, der in vivo ohne weiteres zu Methanol und (inaktivem) freiem Leucin hydrolysiert wird, sich in intakten Zellen auf einen Wert ansammeln könnte, der für die wirkungsvolle Hemmung der N- Ende-Regelstrecke ausreicht. Es wurde aber nunmehr gezeigt, daß dies der Fall ist. Die Erfindung zeigt daher einen neuen Weg auf, um den Zerfall von bestimmten Proteinen in intakten Zellen und ganzen Tieren selektiv zu hemmen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist ein Diagramm, das die Auswirkung der Zugabe von Leucinmethylester (10 mM Endkonzentration) zu exponentiell wachsenden Hefezellen (S. cerevisiae) zeigt, die ein Plasmid enthalten, das entweder Arg-βgal oder Leu-βgal exprimiert (das sind bestimmte kurzlebige Proteine, die über die N- Ende-Regelstrecke zerfallen). Das Wachstum der Zellen wurde durch Messen der optischen Dichte bei 600 nm überwacht.
Figur 2 ist ein Diagramm des In-vivo-Effekts von Leumethylester bei veränderlicher anfänglicher OD&sub6;&sub0;&sub0;-Zelldichte.
Figur 3 ist ein Diagramm der Auswirkung von Leumethylester über einen Zeitraum von sieben Stunden auf im stabilen Zustand befindliche Pegel von Leu-βgal. Leumethylester (10 mM Endkonzentration zur Zeit Null) wurde exponentiell wachsenden Hefezellen zugefügt, die ein Plasmid enthielten, das Leu-βgal exprimiert.
Figur 4 ist ein Diagramm der Auswirkung von Dipeptiden, die den Amino-terminalen Arg-Rest enthalten, auf im stabilen Zustand befindliche Pegel von Arg-βgal in Hefezellen über einen Zeitraum von sieben Stunden. Arg enthaltende Dipeptide wurden exponentiell wachsenden Hefezellen, die ein Arg-βgal exprimierendes Plasmid enthielten, zugefügt.
Figur 5 ist ein Diagramm der Auswirkung von Leumethylester auf im stabilen Zustand befindliche Pegel von βgal-Proteinen mit sterisch anspruchsvollen hydrophoben Amino-terminalen Resten. Exponentiell wachsende Hefezellen, die Plasmide enthielten, die Phe-βgal, Leu-βgal, Trp-βgal, Tyr-βgal und Ile-βgal exprimieren, wurden mit Leumethylester in Konzentrationen zwischen 0 und 10 mM ergänzt, für 1 h inkubiert und auf die intrazelluläre βgal-Aktivität analysiert. Die Halbwertszeiten der X-βgal-Proteine (bestimmt nach den Methoden von Bachmair et al., Science, 234:179 (1986)) sind in Klammern angegeben.
Figur 6 ist eine Photographie, die die Stoffwechselstabilisierung von Leu-βgal durch Leumethylester in wachsenden Hefezellen zeigt. Die Aufnahme zeigt das Gel, das aus einem elektrophoretischen Pulse-Chase-Experiment (5-Minuten-Puls) mit Zellen resultiert, die Val-βgal (A) oder Leu-βgal in Anwesenheit (B) oder Abwesenheit (c) einer dreistündigen Vorinkubation mit 10 mM Leumethylester exprimieren. Die Zeitpunkte sind 0 min für Bahn 1, 10 min für Bahn 2 und 30 min für Bahn 3. Die Bahnen sind als βgal (β-Galactosidase), 90 kD (ein diskretes, metabolisch stabiles Spaltprodukt von βgal; seine Abwesenheit in den Bahnen mit metabolisch stabilen Val-βgal ist bemerkenswert) und X (ein nicht verwandtes, endogenes Hefeprotein, das mit dem monoklonalen Antikörper für βgal kreuzreagiert) bezeichnet.
Figur 7 ist eine Photographie, die die Stabilisierung von Leu-βgal in vivo durch L-Trp-L-Ala-Dipeptid, aber nicht durch L-Ala-L-Trp-Dipeptid zeigt. Die Aufnahme zeigt die Resultate eines Pulse-Chase-Experiments (5-Minuten-Puls) mit Hefezellen, die Val-βgal (A), Leu-βgal (B), Leu-βgal in Gegenwart von 10 mM L-Ala-L-Trp (C) und Leu-βgal in Gegenwart von 10 mM L-Trp-L-Ala (D) exprimieren. Die Zellen wurden mit einem Dipeptid für 4 h bei 30 ºC inkubiert. Die Zeitpunkte sind 0 min für Bahn 1, 10 min für Bahn 2 und 30 min für Bahn 3. Die Bezeichnungen für die Bahnen sind oben in der Erläuterung von Figur 5 beschrieben mit der zusätzlichen Bahn "S", einem βgal-Spaltprodukt, das für langlebige βgal-Spezies spezifisch ist.
Figur 8 ist eine Photographie, die die In-vivo-Stoffwechselstabilisierung von tyr-βgal durch Leumethylester zeigt. Die Aufnahme zeigt die Resultate eines Pulse-Chase-Experiments (3-Minuten-Puls) mit Hefezellen, die Tyr-βgal exprimieren, bei Abwesenheit (A) oder Anwesenheit (B) einer 4-h-Inkubation mit 10 mM Leumethylester. Die Zeitpunkte sind 0 min für Bahn 1, 10 min für Bahn 2, 30 min für Bahn 3 und 60 min für Bahn 4. Man beachte die Ansammlung eines βgal-Abbauprodukts ("S"), die normalerweise nur bei langlebigen βgal's zu sehen ist. Ferner ist die Abnahme der Mengen des 90 kD-Spaltprodukts in Gegenwart von Leumethylester zu beachten.
Figur 9 ist ein Säulendiagramm, das die Auswirkung der Stereokonfiguration der Aminosäurereste in dem Arg-Ala-Dipeptid auf dessen Fähigkeit zur Stoffwechselstabilisierung von Arg- βgal zeigt. Hefezellen, die Arg-βgal und Val-βgal exprimieren, wurden für 2 h in Gegenwart des angegebenen Dipeptids (entweder L-Ala-L-Arg, L-Arg-L-Ala oder L-Arg-D-Ala) inkubiert. Dann wurde die βgal-Aktivität in den Zellen bestimmt und relativ zu der Aktivität einer unbehandelten Kontrolle ("Con") aufgetragen. Die tatsächliche βgal-Aktivität ist über jeder Säule aufgetragen. Stereokonfigurationen von Aminosäureresten sind, wenn nichts anderes angegeben ist, die "L"-Form.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung basiert auf die Feststellung, daß der Zerfall von bestimmten Typen oder Klassen von Proteinen in lebenden Zellen gehemmt werden kann (entweder teilweise oder vollständig). Nach der Methode der Erfindung wird die Hemming des Zerfalls von ausgewählten Proteintypen oder -klassen ausgeführt durch Einbauen oder Einschleusen eines als Regulator bezeichneten Agens in Zellen, wobei der Regulator eine Aminosäure enthält, die gleich oder gleichartig ist wie die Amino-terminale Aminosäure des Proteins (der Proteine), dessen Zerfall gehemmt werden soll. Regulatoren sind Aminosäurederivate wie Dipeptide, kleine Polypeptide oder andere Carboxyl-terminale Derivate, bei denen der Amino-terminale Reste gleich oder gleichartig wie der Amino-terminale Rest des zellulären Proteins ist, dessen Zerfall verringert werden soll (d. h. dessen Stoffwechselstabilität oder Halbwertszeit gesteigert werden soll). Carboxy-terminale Derivate der Erfindung haben eine freie (nichtblockierte) α- Aminogruppe an dem Amino-N-terminalen Rest und ein blockiertes oder "substituiertes" Carboxyl-Ende (z. B. durch eine andere Aminosäure (um ein Dipeptid oder Polypeptid zu ergeben) oder durch einen Alkylester).

Die N-Ende-Regel

Wie in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung Serial-Nr. 07/103 910 vom 1. Okt. 1987 beschrieben ist, definiert die N-Ende-Regel die Kriterien oder die Charakteristiken eines intrazellulären Proteins, die die Geschwindigkeit bestimmen, mit der es durch intrazelluläre Pfade abgebaut wird. Diese Regel und die N-Ende-Regelstrecke werden nun in den folgenden Abschnitten zusammengefaßt, um als Hintergrund für die anschließende genaue Erläuterung der Erfindung zu dienen. Eine Untersuchung des Testproteins, einer Enzym-β-galactosidase (βgal), wurde durchgeführt unter Anwendung verschiedener Formen des gentechnisch hergestellten Proteins, wobei ein ausgewählter Aminosäurereste an dem Aminoende des prozessierten Proteins anwesend war, das ursprünglich als ein fusioniertes Protein mit Ubiquitin hergestellt worden war. Nachdem ein Chimären-Gen, das ein Ubiquitin/β-Galactosidase-Fusionsprotein codiert, in der Hefe S. cerevisiae exprimiert wurde, erwies sich Ubiquitin als von dem entstehenden Fusionsprotein abgespalten unter Erhalt einer desubiquitinierten β-Galactosidase (βgal). Diese Spaltung erfolgte ungeachtet der Beschaffenheit des Aminosäurerests X des βgal, der an der Ubiquitin/βgal-Verbindungsstelle gegenwärtig war. Dieses Resultat ermöglichte es, jeden gewünschten Aminosäurerest an den Aminoenden von anderweitig identischen X-βgal-Proteinen freizulegen. Die so aufgebauten X-βgal-Proteine zeigten sehr verschiedene Halbwertszeiten in vivo (z. B. ungefähr 3 min bis mehr als 20 h). Die Halbwertszeit eines gegebenen X-βgal-Proteins erwies sich als abhängig von der Beschaffenheit des Aminosäurerests X an dem Aminoende von X-βgal.
Infolgedessen wurde es möglich, die Hauptgruppe von 20 Aminosäuren nach den Halbwertszeiten zu ordnen, die sie βgal verleihen, wenn sie an dessen Aminoende exponiert sind. Der resultierende Code oder die Regel, als die N-Ende-Regel bezeichnet, ist in der Tabelle gezeigt. DIE N-ENDE-REGEL IN HEFE- UND SÄUGETIER-RETICULOZYTEN Halbwertszeit von X-βgal Primärer destabilisierender Rest X Sekundärer destabilisierender Rest X Tertiärer destabilisierender Rest X Stabilisierender Rest X Hefe (in vivo) Reticulozyten (in vitro) * Die Rate der Desubiquitinierung in vivo von Ub-Pro-βgal ist sowohl bei Hefe- als auch bei Säugetierzellen niedrig. Die gezeigte t1/2 ist die des Pro-βgal- Proteins.
Wie die Tabelle zeigt, verleihen die Aminosäuren Methionin, Serin, Alanin, Threonin, Valin, Glycin und Cystein, wenn sie an dem Aminoende an X-βgal exponiert sind, dem X-βgal Halbwertszeiten von mehr als 20 h in Hefe. Dies sind die am meisten "Stabilisierenden" Aminosäuren. [Lange Halbwertszeiten der X-βgal-Proteine, die stabilisierende Aminoterminale Reste tragen, können als eine " default "-Konsequenz der Abwesenheit von für diese Reste spezifischen, N- Ende-erkennenden E3-Proteinen angesehen werden.] Isoleucin und Glutaminsäure verleihen Halbwertszeiten von ungefähr 30 min, und Tyrosin, Glutamin und Histidin verleihen Halbwertszeiten von ungefähr 10 min. Phenylalanin, Leucin, Asparaginsäure, Asparagin und Lysin, wenn sie an dem Amino- Ende von X-βgal anwesend sind, resultieren in einer Halbwertszeit von ungefähr 3 min, und Arginin, die am meisten destabilisierende Aminosäure, verleiht eine Halbwertszeit von ungefähr 2 min.
Von relativ langlebigen (t1/2 > 1 h), nicht-kompartimentierten intrazellulären Proteinen sowohl in Prokaryonten als auch Eukaryonten wurde gezeigt, daß sie Amino-terminale Reste der Stabilisierenden Klasse haben, wie durch die N- Ende-Regel vorhergesagt wird. Die gleiche Arbeit zeigte, daß zwar die Gegenwart eines destabilisierenden Rests an dem Aminoende eines Proteins häufig ausreicht, um das Protein in vivo metabolisch zu destabilisieren, daß dies aber nicht immer der Fall ist. Wenn eine solche metabolische Destabilisierung in einem relativ kleinen Umfang auftritt, zeigt die weitere Analyse entweder eine ungenügende sterische Zugänglichkeit des Amino-terminalen Rests oder einen Mangel der zweiten Determinante des kompletten Amino-terminalen Zerfallssignals. Von der zweiten Determinante des Amino- terminalen Zerfallssignals, die alleine ebenfalls nicht ausreicht, um ein Protein metabolisch zu destabilisieren, wurde gefunden, daß sie ein spezifischer interner Lysinrest ist. Die Fähigkeit dieses kritischen Lysinrests, als die zweite Determinante zu dienen, hat sich als weitgehend unabhängig von den speziellen Aminosäure-Sequenzen erwiesen, die den Rest umgeben. Stattdessen wurde gezeigt, daß die wesentlichen Merkmale des kritischen Lysinrests seine räumliche Nähe zu dem Aminoende des Proteins und die hohe Segmentmobilität des Bereichs, der den Lysinrest enthält, sind. Die mechanistische Bedeutung der zweiten Determinante wurde durch die Feststellung erhellt, daß in einem zielgerichteten, kurzlebigen Protein eine Kette von verzweigten Ubiquitin-Ubiquitinkonjugaten auf einen Lysinrest beschränkt ist, der in der obigen Arbeit als die zweite Determinante des Zerfallssignals identifiziert wurde (Bachmair und Varshavsky, Cell 56:1019-1031 (1989); Chau et al., Science, 243:1516-1583 (1989)).

Die N-Ende-Regelstrecke

Wie anderswo beschrieben wird, scheinen die meisten entstehenden Proteine keine Ubiquitinanteile aufzuweisen (A. Varshavsky et al., "The N-End-Rule of Selective Protein Turnover", In: UBIQUITIN (M. Rechsteiner, ed.), Plenum Publishing Corp. (1988); Bachmair und Varshavsky, Cell 56:1019-1032 (1989)). Die reifen Aminoenden von entstehenden, nicht-kompartimentierten Proteinen werden in vivo durch die Wirkung von Proteasen erzeugt, deren Substrat-Spezifitäten teilweise charakterisiert worden sind. Von besonderem Interesse ist die beständige Abwesenheit von destabilisierenden Resten an den reifen Aminoenden von relativ langlebigen, nicht-kompartimentierten Proteinen. Das ist weitgehend auf die Substrat-Spezifität des Enzyms Methionin- Aminopeptidase zurückzuführen. Von diesem Enzym wurde gezeigt, daß es den Amino-terminalen Methioninrest (einen stabilisierenden Rest nach der N-Ende-Regel) in einem entstehenden Protein abspaltet, wenn - und nur wenn - er nicht von einem zweiten Methioninrest oder einem der 12 Aminosäurereste, die nach der N-Ende-Regel destabilisierend sind, gefolgt wird. Die umgekehrte Übereinstimmung zwischen der N-Ende-Regel und der Substrat-Spezifität von Methionin- Aminopeptidase liefert eine teilweise funktionelle Erklärung für die Eigenschaften dieses Enzyms: Von einer Methioninbegrenzenden Aminopeptidase, die an der Prozessierung von langlebigen Proteinen beteiligt ist, würde man erwarten, daß sie einen Rest, dessen Gegenwart an dem Aminoende das Substratprotein metabolisch destabilisierenden könnte, nicht exponiert.
Es wurde vorgeschlagen, daß analoge Proteasen für die Erzeugung von Aminoenden tragenden destabilisierenden Aminosäureresten bei bestimmten Proteinen, deren Amino-terminale Sequenzen von solchen Proteasen zu erkennende Stellen enthalten, verantwortlich sein können (A. Varshavsky et al., "The N-End Rule of Selective Protein Turnover", In: UBIQUITIN (M. Rechsteiner, ed.), Plenum Publishing Corp. (1988)).
Die bisher vorliegenden biochemischen und genetischen Beweismaterialien deuten außerdem darauf hin, daß die N-Ende- erkennenden Komponenten der N-Ende-Regelstrecke eine direkte und spezifische Affinität für die Amino-terminalen destabilisierenden Reste von Substratproteinen haben. Anschließende Schritte beim Zerfall eines zielgerichteten Proteins umfassen das Zusammensetzen eines Ubiquitin-Proteinliagse-Komplexes an dem gebundenen proteolytischen Substrat, die Ubiquitinierung des Substrats und seinen Abbau durch ein "abstromseitiges" Enzym, für das die Ubiquitinanteile entweder als Erkennungssignale oder als Denaturierungsmittel oder beides dienen. Diese Zerfallsstrecke, bei der die Anfangsschritte die Amino-terminale Erkennung von proteolytischen Substraten umfassen, wird als die N-Ende-Regelstrecke bezeichnet.

Hemmung der N-Ende-Regelstrecke in lebenden Zellen

Durch die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Experimente wurde nunmehr festgestellt, daß es möglich ist, die N-Ende-Regelstrecke in lebenden Zellen zu hemmen und infolgedessen den Zerfall von bestimmten Typen oder Klassen von kurzlebigen Proteinen in lebenden Zellen selektiv zu hemmen.
Ein gemeinsames Merkmal der Proteine, deren In-vivo-Zerfall durch das vorliegende Verfahren gehemmt werden kann, ist die Gegenwart von Amino-terminalen Resten, die nach der N-Ende- Regel destabilisierend sind. Bei der vorliegenden Methode wird ein Agens, das als ein Regulator bezeichnet wird, in Zellen eingeführt, in denen die Hemmung der N-Ende-Regelstrecke, soweit sie auf eine ausgewählte Art oder Klasse von intrazellulären Proteinen zutrifft, gewünscht wird. Der bei der Methode eingesetzte Regulator ist ein Aminosäurederivat (z. B. ein Dipeptid, ein kleines Polypeptid oder ein anderes Carboxyxl-terminales Aminosäurederivat), bei dem die Amino- terminale Aminosäure die gleiche wie oder von derselben Klasse wie der Amino-terminale Aminosäurerest des Proteins (der Proteine) ist, dessen Zerfall über die N-Ende-Regelstrecke gehemmt werden soll.
Beispielsweise im Fall der Hemmung des In-Vivo-Zerfalls (erhöhte Halbwertszeit) eines intrazellulären Proteins, das einen Amino-terminalen Leucinrest hat, kann ein Aminosäurederivat (z. B. ein Methylester), das Leucin (einen sterisch anspruchsvollen hydrophoben Rest) als den Amino-terminalen Rest enthält, in Zellen in ausreichender Menge eingeschleust werden, um die durch die N-Ende-Regel vermittelte Erkennung dieses Proteins als ein proteolytisches Substrat zu stören. Alternativ kann ein Aminosäurederivat (z. B. ein Methylester oder ein Dipeptid), das Tryptophan (einen weiteren sterisch anspruchsvollen hydrophoben Rest) aufweist, eingesetzt werden, um den Zerfall desselben Proteins zu hemmen. Wie in den Beispielen 5, 6 und 7 beschrieben wird, wird die Halbwertszeit von Leucin-βgal in Hefezellen in Gegenwart entweder von Leucinmethylester (Fig. 6) oder L-Tryptophan-L-Alanin- Dipeptid (Fig. 7) verlängert.
Die Regel, die die "Gleichartigkeit" einer gegebenen destabilisierenden Aminosäure gegenüber einer anderen destabilisierenden Aminosäure bestimmt, ist durch die Tabelle gegeben. Wie die Tabelle zeigt, gibt es drei experimentell unterscheidbare Klassen von N-Ende-erkennenden Aktivitäten in Säugetierzellen wie etwa Reticulozyten (Typ I-III) und zwei Klassen von N-Ende-erkennenden Aktivitäten in Hefe (Typ I und II). Ein Regulator, dessen destabilisierender Amino- terminaler Aminosäurerest vom gleichen Typ (I, II oder III; siehe die Tabelle) ist wie ein destabilisierender Amino- terminaler Rest in einem Zielprotein, hemmt daher kompetitiv den Zerfall dieses Proteins in vivo, hemmt jedoch nicht den Zerfall eines anderen Substrats der N-Ende-Regelstrecke, dessen destabilisierender Amino-terminaler Rest zu einem anderen Typ gehört (Fig. 2 und 5).
Stabilisierende und destabilisierende Gruppen für jeden Eukaryonten können nach der Beschreibung von Bachmair et al., siehe oben, bestimmt werden. Die Ubiquitin-X-βgal- Technologie kann angewandt werden, um ein Set von Proteinen zu erzeugen, die sich nur in bezug auf ihren Amino-terminalen Rest unterscheiden, und dann können die Identitäten von stabilisierenden und destabilisierenden Resten bestimmt werden durch Beobachten der Zerfallsrate jedes X-βgal in dem gewählten Eukaryonten.
Wie ebenfalls nachstehend erörtert wird (Beispiel 5), wurden die Stoffwechselstabilitäten (In-vivo-Halbwertszeiten) von vier zusätzlichen X-βgal-Proteinen, bei denen das Aminoende ein sterisch anspruchsvoller hydrophober Aminosäurerest ist (Phenylalanin-βgal, Tryptophan-βgal, Tyrosin-βgal und Isoleucin-βgal), in Gegenwart von Leucinmethylester gesteigert (Fig. 5 und 8). Damit ist gezeigt worden, daß die N-Ende- Regelstrecke in lebenden Zellen selektiv gehemmt werden kann durch Aminosäurederivate, in denen der Amino-terminale Aminosäurerest der gleiche wie oder gleichartig wie der Amino-terminale Rest eines Proteins oder von Proteinen ist, deren Stoffwechselstabilität erhöht werden soll.
Im allgemeinen sind bei der Erfindung brauchbare Regulatoren Dipeptide, kleine Polypeptide, sterisch anspruchsvolle hydrophobe Ester und andere Carboxyl-terminale Derivate von destabilisierenden Aminosäuren. Beispielsweise kann jedes kleine Polypeptid mit dem geeigneten Amino-terminalen Aminosäurerest (durch die N-Ende-Regel definiert) als ein Regulator innerhalb der Erfindung eingesetzt werden. Beispiele von Carboxyl-terminalen blockierenden Gruppen sind organische Komponenten wie Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl- und Isobutylgruppen.
Der Regulator, der für die Zwecke der Erfindung brauchbar ist, sollte von einer intakten Zelle oder einem ganzen Tier leicht aufgenommen werden und sollte in den Zellen auf physiologisch bedeutsame Werte akkumulieren. Eine andere nützliche Eigenschaft eines Regulators ist sein relativer Widerstand gegen inaktivierende metabolische Transformationen, und zwar sowohl auf dem Weg in die Zelle als auch nach dem Eintritt in die Zelle. Ein Beispiel einer Manipulation, die den Widerstand eines Regulators gegen Inaktivierung steigert, ist der Einsatz von L-Arg-D-Ala-Dipeptid anstelle von L-Arg-L-Ala-Dipeptid, wobei beide Aminosäurerest-Bestandteile die L-Konfiguration haben. Die Peptidbindung zwischen L-Arg und D-Ala ist gegen einen proteolytischen Angriff innerhalb der Zelle wahrscheinlich widerstandsfähiger als die Peptidbindung in L-Arg-L-Ala, einer Standardversion dieses Dipeptids. Wie Fig. 9 zeigt, resultiert auch tatsächlich der Einsatz von L-Arg-D-Ala-Dipeptid in einer stärkeren Stoffwechselstabilisierung von Arg-βgal in vivo als der Einsatz von L-Arg-L-Ala-Dipeptid.
Gemäß dem vorliegenden Verfahren kann im Fall von isolierten Zellen der Regulator dem Kulturmedium direkt oder nach einem bestimmten zeitlichen Schema zugefügt werden. Im Fall von ganzen Tieren kann der Regulator oral, durch subkutane oder sonstige Injektion, intravenös, parenteral, transdermal, rektal oder über ein implantiertes Reservoir, das den Regulator enthält, verabreicht werden. Die Form, in der der Regulator verabreicht wird (z. B. als Pulver, Tablette, Kapsel, Lösung, Emulsion), hängt von der Route ab, auf der er verabreicht wird. Die zu verabreichende Menge des Regulators wird auf individueller Basis bestimmt und basiert wenigstens zum Teil auf Aspekten wie der Größe des Individums, der Schwere der zu behandelnden Symptome und dem gewünschten Resultat. Regulatoren können in eine Zusammensetzung eingebaut werden, die auf irgendeinem dieser Wege zu verabreichen ist. Eine solche Zusammensetzung kann zusätzlich zu ein oder mehr Regulatoren folgendes aufweisen: einen Träger (z. B. ein Polymer, das einen Regulator langsam freisetzt), einen physiologisch akzeptablen Puffer und ein manipuliertes oder natürliches Protein, das im Körper eine gewünschte Funktion hat und dessen Stoffwechselstabilität durch die gleichzeitige Verabreichung eines Regulators nach der Methode der Erfindung erhöht werden soll. In diesem Fall ist der Regulator auf solche Weise aufgebaut, daß sein Amino- terminaler Aminosäurerest der gleiche wie oder gleichartig wie (gemäß der Definition in der Tabelle) der Amino-terminale (destabilisierende) Rest des interessierenden Proteins ist. Auf diese Weise wirkt der Regulator in Richtung einer Erhöhung der Stoffwechselstabilität des Proteins durch Wechselwirkung mit der Aminoende-Erkennungsstelle des N- Ende-erkennenden Proteins und hemmt dadurch kompetitiv die N-Ende-Regelstrecke.
Alternativ kann ein DNA-Konstrukt, das eine Nucleotidsequenz enthält, die die gewünschte Aminosäuresequenz des Regulators codiert, in Zellen eingeschleust werden, in denen eine Hemmung des Zerfalls eines bestimmten Typs oder einer Klasse von Proteinen gewünscht wird. Die DNA-Sequenz kann mittels eines geeigneten Vektors, z. B. eines Retrovirus-Vektors, eingeschleust werden. Alle DNA-codierten Proteine und Peptide beginnen mit Methionin, und daher wird ein Konstrukt eingesetzt, das ausgelegt ist, um in der Expression eines Proteins zu resultieren, das von der Zelle prozessiert werden kann, um das gewünschte Peptid zu erzeugen. Die inzusetzenden DNA-Konstrukte basieren auf der Anwendung der Ubiquitin-Fusion nach der Beschreibung von Bachmair et al., Science 234:179-186 (1986), auf deren Inhalt hier Bezug genommen wird. Kurz gesagt codieren die Konstrukte ein Fusionsprotein, das aus einem Ubiquitinanteil, gefolgt von einem Aminosäurerest X (wobei X irgendeine der zwanzig Aminosäuren ist) und einer gewünschten Peptidsequenz besteht. Die Expression dieses Proteins in einer Zielzelle resultiert, wie bereits von Bachmair et al. gezeigt wurde, in einer raschen Desubiquitinierung des Fusions-Proteins unter Erhalt von freiem Ubiquitin und eines Peptids mit dem gewünschten Amino-terminalen Rest X. Wenn das Peptid in der Zelle auf ausreichende Werte akkumuliert ist, hemmt es spezifisch die N-Ende-Regelstrecke.

In-vivo-Inhibitoren der N-Ende-Regelstrecke zeigen "Zeit-0"-Verstärkungseffekte

Die Empfänglichkeit eines entstehenden Proteins für den Zerfall in vivo ist im allgemeinen von der Empfänglichkeit desselben Proteins im reifen und vollständig gefalteten Zustand verschieden. Ein Grund für diese Verschiedenheit ergibt sich daraus, daß es eine endliche Zeit dauert, bis ein neu geformtes Protein seine reife Struktur annimmt. Während dieses Zeitraums, der von einem Protein zum nächsten verschieden ist, besteht für ein teilweise gefaltetes Proteinmolekül eine größere Wahrscheinlichkeit, daß es für eine Spaltung durch In-vivo-Zerfallsstrecken und insbesondere durch die N-Ende-Regelstrecke empfänglich ist. Die letztgenannte Strecke kann bevorzugt auf teilweise gefaltete Proteine zielen, weil beispielsweise solche Proteine wahrscheinlich für ein proteolytisches "Anknabbern" an ihren Aminoenden anfälliger sind. Zu irgendeinem Zeitpunkt wird durch dieses "Anknabbern" ein destabilisierender Amino- terminaler Rest freigelegt, wodurch das Protein in ein Substrat für die N-Ende-Regelstrecke umgewandelt wird. Zur Unterscheidung zwischen dem Zerfall kinetisch erster Ordnung (exponentiell) eines reifen kurzlebigen Proteins und dem Zerfall nicht-erster Ordnung des gleichen Proteins, wenn es neu geformt und noch nicht strukturell reif ist, wird der letztgenannte Zerfallstyp als "prä-exponentieller" Zerfall bezeichnet. Interessanterweise hemmen die Regulator-Substanzen der Erfindung (die In-vivo-Inhibitoren der N-Ende- Regelstrecke) sowohl die prä-exponentiellen als auch die exponentiellen Moden des Proteinzerfalls in der N-Ende- Regelstrecke von lebenden Zellen. Infolgedessen werden die im stabilen Zustand befindlichen Pegel von relevanten Proteinen von den Regulatoren in der Zelle nicht nur durch ihre Stoffwechselstabilisierung der reifen Proteine erhöht, sondern auch während und unmittelbar nach der Synthese dieser Proteine an Ribosomen (das ist der Sogenannte "Zeit-0"- Effekt).
Im nachhinein ist es erstaunlich und vor allem unerwartet, daß von den Regulatorsubstanzen wie beispielsweise Leucinmethylester, der in vivo leicht zu Methanol und (inaktivem) freiem Leucin hydrolysierbar ist, gezeigt werden konnte, daß sie in lebenden Zellen auf Stationärzustandswerte akkumulieren, die für die spezifische Hemmung der N-Ende-Regelstrecke ausreichend sind. Die Resultate von Experimenten, die in der Erfindung beschrieben werden, zeigen, daß eine solche Akkumulation tatsächlich stattfindet, und öffnen daher einen neuen Weg zur selektiven Hemmung des Zerfalls von spezifischen Proteinen in intakten Zellen und ganzen Tieren.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele verdeutlicht, die keine Einschränkung darstellen sollen.

Beispiel 1 Effekt von Leucinmethylester auf Hefezellwachstum

In diesem Beispiel und in den folgenden Beispielen waren die Reagenzien, Stämme und Assaymethoden wie nachstehend beschrieben.

Reagenzien

Aminosäurederivate (Methylester und Dipeptide) wurden von BACHEM Bioscience Inc., Philadelphia, PA, und von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, erhalten.

Stämme

Saccharomyces cerevisiae-Zellen vom Stamm BWG1-7a (MATa his4 adel ura3 leu2) wurden mit Plasmiden unter Anwendung herkömmlicher Techniken transformiert (F. Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1981). Die transformierten Zellen wurden bei 30 ºC in einem Medium aus 2 % Galactose, 0,67 % Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren (Difco), Adenin (10 ug/ml), Histidin (20 ug/ml) und Leucin (60 ug/ml) gezüchtet.

Plasmide

Eingesetzte Plasmide waren die von Bachmair et al., Science, 234:179 (1986) beschriebenen, wobei hier auf den Inhalt dieses Dokuments Bezug genommen wird. Kurz gesagt codieren sie ein Fusionsprotein, bestehend aus einem Ubiquitinanteil, gefolgt von einem Aminosäurerest X (wobei X irgendeine der zwanzig Aminosäuren ist) und einem β-Galactosidase-Protein (βgal-Protein). Die Expression dieses Fusionsproteins erfolgt unter Steuerung durch den induzierbaren GAL-Promotor. Nachdem er einmal in Hefe exprimiert wurde, wird der Ubiquitinanteil eines Fusionsproteins sehr rasch von einer endogenen Ubiquitin-spezifischen Protease gespalten, um den Rest X an dem Aminoende eines X-βgal-Proteins zu ergeben.

Analyse der Aktivität von β-Galactosidase im Stationärzustand

Zellen wurden wie oben beschrieben bis zu einer optischen Dichte von 0,2-0,5 bei A&sub6;&sub0;&sub0; gezüchtet. Aminosäurederivate, die nachstehend beschrieben werden, wurden den Zellen aus konzentrierten Beständen (mit Kaliumphosphat auf pH 7,0 gepuffert) zugefügt, bis die gewünschte Endkonzentration erhalten wurde. Die Inkubation wurde bei 30 ºC fortgesetzt. Proben (0,5 ml) wurden zu den bezeichneten Zeitpunkten entnommen, und die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt. Pellets wurden in 0,5 ml Z-Puffer (0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0, 10 mM KCl, 1 mM MgSO&sub4;, 38 mM 2-Mercaptoethanol) erneut suspendiert, CHCl&sub3; (2 Tropfen) und 0,1 % SDS (1 Tropfen) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde für 10 s verwirbelt. Der Assay auf enzymatische βgal-Aktivität begann dann mit der Zugabe von 0,1 ml einer 4 mg/ml Lösung aus o- Nitrophenyl-β-galactopyranosid (ONPG), gefolgt von Inkubation bei 30 ºC. Der Assay wurde durch die Zugabe von 0,5 ml von 1 M Na&sub2;CO&sub3; beendet. Das Absorptionsvermögen bei 420 nm wurde nach Klären des Gemischs durch Zentrifugieren gemessen. In manchen Fällen wurden die Zellen nicht pelletiert, sondern es wurden 50 ul Kultur direkt zu 0,45 ml Z-Puffer zugegeben.

Pulse-Chase-Experimente in vivo

Transformierte Zellen wurden wie oben beschrieben gezüchtet mit der Ausnahme, daß Methionin (20 ug/ml) vorgesehen wurde, und zwar auf eine optische Dichte von ca. 0,5 bei 600 nm. Aminosäurederivate wurden zugegeben, und die Inkubation wurde für 4-5 h fortgesetzt, bis die optische Dichte ungefähr 1,0 war. Zellen aus einer 10-ml-Kultur wurden mittels Filtration durch die Vertiefung einer Mikrotiter-Filtrationsplatte geerntet. Anschließend wurden die Zellen mehrmals auf dem Filter in dem Kulturmedium ohne Methionin gewaschen und erneut in 0,4 ml von 1 % Galactose, 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) suspendiert. (³&sup5;S)Methionin (100 uCi) wurde dann für eine bestimmte Pulsdauer zugegeben. Die Zellen wurden mittels Filtration gesammelt und erneut in 0,4 ml des Kulturmediums suspendiert, das Cycloheximid (0,2 mg/ml) und Trichodermin (50 ug/ml) enthielt. Proben (0,1 ml) wurden zu bezeichneten Zeitpunkten entnommen und 0,8 ml kaltem Puffer A (50 mM Na-HEPES pH 7,5, 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, 1 % Triton X-100), der Leupeptin, Pepstatin A, Antipain, Aprotinin und Chymostatin (Sigma) enthielt (jeweils zu 20 ug/ml), zusätzlich zu 0,4 ml Glasperlen zugegeben. Die Zellen wurden durch dreimaliges Verwirbeln für jeweils 1 min bei 4 ºC zerstört. Die Extrakte wurden bei 10.000 g für 10 min zentrifugiert, und die Radioaktivität von säureunlöslichem ³&sup5;S in den Überständen wurde bestimmt. Teilmengen der Überstände, die gleiche Mengen des gesamten säureunlöslichen ³&sup5;S enthielten, wurden auf Immunpräzipitation mit einem monoklonalen Antikörper zu βgal prozessiert. Aszitesfluid, das einen molaren Überschuß des Antikörpers enthielt (mindestens zehnfach), wurde jeder Teilmenge zugegeben unter anschließender Inkubation auf Eis für 1-2 h. Protein-A-Sepharose (Pharmacia) wurde dann zugegeben, und die Suspension wurde unter Schütteln bei 4 ºC für 30 min inkubiert und bei 12.000 g für 30 s zentrifugiert. Die Pellets der Protein-A-Sepharose wurden dreimal in Puffer A, der 0,1 % SDS enthielt, gewaschen, in einem elektrophoretischen SDS-Probenpuffer, der Dithiothreitol (DTT) enthielt, erneut suspendiert, für 3 min bei 100 ºC erwärmt und mit 12.000 g für 20 s zentrifugiert. (Laemmli, Nature 227, 680 (1970)). Die Überstände wurden der Elektrophorese in einem 6 % diskontinuierlichen Polyacrylamid-SDS-Gel (150 x 150 x 1,5 mm) mit anschließender Photofluorographie unterzogen.

Halbwertszeitbestimmung in vivo

Nach der Photofluorographie der Pulse-Chase-Gele wurde der Wert der Radioaktivität in jeder Bahn mittels Szintillationszählung der jeweiligen Gelstücke nachgewiesen. Die Halbwertszeiten wurden aus diesen Werten berechnet (mit geeigneter Einstellung unter Nutzung des Werts von einem blinden Gelstück) unter der Annahme einer Kinetik erster Ordnung des Proteinabbaus.
Die Auswirkung von 10 mM Leucinmethylester (Leumethylester) auf das Wachstum von exponentiell wachsenden Hefezellen, die ein Plasmid enthalten, das entweder Arginin-βgal (Arg-βgal, 0, oder Leucin-βgal (Leu-βgal, ) exprimiert, ergänzt mit nichts (0, ) oder mit Leumethylester auf eine 10 mM Endkonzentration ( , ), wurde ausgewertet. Die Resultate sind in Fig. 1 dargestellt. Das Wachstum unter jeder dieser Bedingungen wurde durch die optische Dichte bei 600 nm überwacht. Wie Fig. 1 zeigt, hatte der Leumethylester keine nachteiligen Auswirkungen auf das Zellwachstum. Es ist ferner zu beachten, daß keine nachteilige Auswirkung auf das Hefezellwachstum durch die Dipeptide Arg-Ala und Ala-Arg (in Beispiel 4 eingesetzt), Trp-Ala oder Ala-Trp (in Beispiel 7 eingesetzt) über die angewandten Zeiträume (Daten nicht gezeigt) ersichtlich war.

Beispiel 2 Auswirkung von Leucinmethylester bei veränderlicher anfänglicher Zelldichte

Hefezellen, die ein Plasmid enthalten, das entweder Arg-βgal (0, ) oder Leu-βgal ( , ) exprimiert, wurden mit Leumethylester auf 10 mM Endkonzentration ( , ) bei veränderlicher anfänglicher OD&sub6;&sub0;&sub0; ergänzt und nach 3 h Inkubation auf βgal-Aktivität analysiert. Kontrollkulturen (0, ) erhielten keinen Methylester.
Die Resultate, die in Fig. 2 wiedergegeben sind, zeigen, daß Leumethylester (Leu-OMe) insbesondere die Stationärzustands- Aktivität (Menge) von Leu-βgal (einem sterisch anspruchsvollen hydrophoben Aminoende) erhöht, jedoch die Menge von Arg-βgal (einem basischen Aminoende) nicht erhöht. Die Resultate von Fig. 2 zeigen außerdem, daß die Auswirkung in exponentiell wachsenden Zellen (d. h. bei niedrigeren OD) stärker hervortritt. Daher wurden in folgenden Arbeiten Kulturen mit OD&sub6;&sub0;&sub0; von ungefähr 0,5-1,0 verwendet.

Beispiel 3 Untersuchung des zeitlichen Ablaufs der Auswirkung von 10 mM Leucinmethylester auf Stationärzustandswerte von Leucin-βgal in vivo

Exponentiell wachsende Hefezellen, die ein Plasmid tragen, das Leu-βgal exprimiert, wurden mit Leumethylester auf die 10 mM Endkonzentration ergänzt (Zeit Null) und über einen Zeitraum von 7 h ( ) auf βgal-Aktivität analysiert. Eine Kontrollkultur ( ) erhielt keinen Methylester.
Die Resultate sind in Fig. 3 wiedergegeben und zeigen, daß die Größe der Auswirkung von Leu-OMe auf Leu-βgal-Werte linear mit der Zeit ansteigt (mindestens während der ersten sieben Stunden). Die Steigung der Linie der besten Anpassung ergibt eine elffache Steigerung des βgal-Werts pro Stunde, wenn die Leu-OMe-Konzentration 10 mM war (verglichen mit Kontrollwerten).

Beispiel 4 Untersuchung des zeitlichen Ablaufs der Auswirkung von Arginin enthaltenden Dipeptiden auf Stationärzustandswerte von Arg-βgal in vivo

Exponentiell wachsende Hefezellen, die ein Plasmid tragen, das Arg-βgal exprimiert, wurden ergänzt mit: Probenpuffer ( ), 10 mM (am Ende) L-Arginin-L-Alanin (L-Arg-L-Ala, ) und 10 mM (am Ende) L-Alanin-L-Arginin (L-Ala-L-Arg,0). Die βgal-Aktivität wurde über einen Zeitraum von 7 h analysiert und als eine Funktion der Zeit aufgetragen.
Die Resultate sind in Fig. 4 gezeigt. Die Größe der Auswirkung des Dipeptids L-Arg-L-Ala auf Leu-βgal-Werte steigt linear über die Zeit an. Die Neigung der Linie der besten Anpassung ergibt eine 8,5fache Steigerung des βgal-Werts pro Stunde bei einer L-Arg-L-Ala-Konzentration von 10 mM (verglichen mit Kontrollwerten). L-Ala-L-Arg hatte keine Auswirkung. Das zeigt, daß die Ordnung der Aminosäuren in dem Dipeptid für seine Hemmwirksamkeit ausschlaggebend ist. Insbesondere muß sich Arg am Aminoende des Dipeptids befinden, um eine Auswirkung zu haben.

Beispiel 5 Leucinmethylester erhöht In-Vivo-Stationärzustandswerte aller X-βgal-Testproteine mit sterisch anspruchsvollen hydrophoben Amino-terminalen Resten

Exponentiell wachsende Hefezellen, die Plasmide trugen, die Phenylalanin-βgal (Phe-βgal, ), Leucin-βgal (Leu-βgal, 0), Tryptophan-βgal (Trp-βgal, ), Tyrosin-βgal (Tyr-βgal, ) und Isoleucin-βgal (Ile-βgal, ) exprimieren, wurden mit Leumethylester in Konzentrationen zwischen 0 und 10 mM ergänzt, für 1 h inkubiert und auf βgal-Aktivität analysiert. Als Kontrollen wurden Zellen, die die Plasmide Arg-βgal ( ) und Val-βgal (*) trugen, identisch behandelt. Die Halbwertszeiten der X-βgal-Proteine (bestimmt nach Bachmair et al., Science 234:179-186 (1986)) sind in Klammern angegeben. Die Resultate sind in Fig. 5 dargestellt, wobei die Daten von Experimenten, die die relativ kurzlebigen X-βgal's betreffen, der Klarheit halber in größerem Maßstab aufgetragen sind (linkes Feld).
Die Resultate zeigen, daß eine Änderung der Konzentrationen der verschiedenen X-βgal's bei Abwesenheit von Leu-OMe auf die veränderlichen Halbwertszeiten von X-βgal's zurückgeht (siehe Bachmair et al., Science 234:179-186 (1986)). Je länger die Halbwertszeit, umso höher die beobachtete Aktivität zur Zeit Null. Die Resultate zeigen außerdem, daß die Werte von allen fünf X-βgal-Proteinen mit sterisch anspruchsvollen hydrophoben Aminoenden in Gegenwart von Leu- OMe über den Wert eines jeden hinaus ohne die Zugabe von OMe zunehmen. Im allgemeinen erreicht dieser Effekt die Sättigung bei ungefähr 5-10 mM Leu-OMe. Keine Auswirkung wurde bei Arg-βgal, das ein basisches Aminoende und eine Halbwertszeit von ungefähr 2 min hat, oder bei Val-βgal, das langlebig ist (Halbwertszeit > 20 h), beobachtet.

Beispiel 6 Stabilisierung von Leucin-βgal in vivo durch Leucinmethylester

Ein Pulse-Chase-Experiment (5-min-Puls) wurde durchgeführt mit Zellen, die Val-βgal (A) oder Leu-βgal in Gegenwart (B) oder in Abwesenheit (C) einer 3-h-Inkubation mit 10 mM Leumethylester exprimieren. Zeitpunkte: 0 min (Bahn 1); 10 min (Bahn 2); und 30 min (Bahn 3). Die Bahnen sind wie folgt bezeichnet: βgal (β-Galactosidase); 90 kD (ein Spaltprodukt von βgal; man beachte seine Abwesenheit aus den Bahnen mit metabolisch stabilen Val-βgal-Bahnen); X (eine nicht-verwandte Proteinspezies, die mit dem monoklonalen Antikörper für βgal kreuzreagiert); und S (ein βgal-Spaltprodukt, das anscheinend für stoffwechselstabile X-βgal-Spezies spezifisch ist).
Die Resultate sind in Fig. 6 dargestellt. Sie zeigen, daß die Halbwertszeit von Leu-βgal in Gegenwart von Leu-OMe erhöht wird. Berechnete Halbwertszeiten (von den Zeitpunktwerten 0 bis 10 min): minus OMe = 4 min, plus OMe = 12 min; d. h. eine dreifache Erhöhung. Sie zeigen außerdem, daß eine "Zeit-Null"-Verstärkung hinsichtlich der Menge von Leu-βgal in Gegenwart von OMe auftritt (vergleiche βgal-Bande, Bahn 1 in B und C). Es gibt eine 1,9fache Erhöhung der Proteinmenge in dieser Bande. Man beachte auch das stark verringerte 90 kD βgal-Spaltprodukt in Gegenwart von OMe, was anzeigt, daß auf dieser proteolytischen Route weniger βgal abgebaut wird.

Beispiel 7 Stabilisierung von Leucin-βgal in vivo durch L-Trp-L-Ala, jedoch nicht L-Ala-L-Trp

Ein Pulse-Chase-Experiment (5-min-Puls) wurde durchgeführt mit Zellen, die Val-βgal (A), Leu-βgal (B), Leu-βgal plus 10 mM L-Ala-L-Trp (C) und Leu-βgal plus 10 mM L-Trp-L-Ala (D) exprimieren. Die Inkubation mit jedem Dipeptid wurde für 4 h durchgeführt. Zeitpunkte: 0 min (Bahn 1); 10 min (Bahn 2); und 30 min (Bahn 3). Siehe die Legende in Fig. 6 für die Bahnbezeichnungen.
Die Resultate sind in Fig. 7 dargestellt. Sie zeigen, daß die Halbwertszeit von Leu-βgal in Gegenwart von L-Trp-L-Ala (D), jedoch nicht in Gegenwart von L-Ala-L-Trp (C) verlängert wird. Man beachte, daß das βgal-Spaltprodukt "S" nur in den Bahnen von stoffwechselstabilem Val-βgal beobachtet wird (siehe Diskussion von Fig. 8).

Beispiel 8 Stabilisierung von Tyr-βgal in vivo durch Leumethylester

Ein Pulse-Chase-Experiment (3-min-Puls) wurde durchgeführt mit Zellen, die Tyr-βgal in Abwesenheit (A) oder in Gegenwart (B) einer 4-h-Inkubation mit 10 mM Leumethylester exprimieren. Zeitpunkte: 0 min (Bahn 1); 10 min (Bahn 2); 30 min (Bahn 3); und 60 min (Bahn 4). Siehe die Legende von Fig. 6 hinsichtlich der Bahnbezeichnungen. Die Resultate sind in Fig. 8 dargestellt. Sie zeigen, daß die In-vivo- Halbwertszeit von Tyr-βgal in Gegenwart von Leu-OMe verlängert wird. Berechnete Halbwertszeiten: minus OMe = 7,5 min, plus OMe = 36,4 min; d. h. eine 4,8fache Verlängerung.
Man beachte auch wiederum die Verstärkung zur Zeit Null; es gibt eine 3,3fache Zunahme der Proteinmenge in Gegenwart von OMe. Tyr-βgal ist ein besserer Demonstrator dieser Auswirkung, da die angewandte Pulsdauer (3 min) weit kürzer als die Halbwertszeit von Tyr-βgal (7,5 min) ist und daher jegliche Erhöhung der " Zeit-Null"-Menge offensichtlich nicht auf eine Akkumulation von βgal nur wegen der Erhöhung seiner Halbwertszeit zurückgeht. Im Fall von Leu-βgal (Fig. 6), wobei der Puls nur gerade länger als die Halbwertszeit (5 gegenüber 4 min) ist, könnte die Verstärkung zur Zeit Null teilweise auf die Akkumulation von βgal während des Pulses zurückgehen, weil der OMe die Halbwertszeit von βgal verlängert. Man beachte die Anwesenheit des βgal-Abbauprodukts "S" in Bahn B, die normalerweise nur bei stoffwechselstabilen X-βgal's zu sehen ist. In Gegenwart von Leu-OMe behandeln daher die Zerfallsmechanismen der Zelle Tyr-βgal als eine metabolisch "stabile" βgal-Spezies.

Beispiel 9 Auswirkung der Stereokonfiguration der Peptidbindung in dem Arg-Ala-Dipeptid auf seine Fähigkeit, Arg-βgal in vivo zu stabilisieren

Zellen, die Arg-βgal und Val-βgal exprimieren, wurden für 2 h in Gegenwart eines der drei Dipeptide: L-Arg-D-Ala, L- Arg-L-Ala oder L-Ala-L-Arg inkubiert. Die βgal-Aktivittät wurde dann wie oben beschrieben bestimmt und relativ zu der Aktivität einer unbehandelten Kontrolle ("con") aufgetragen. Die tatsächliche βgal-Aktivität ist über jeder Säule angegeben. Die Stereokonfigurationen sind, wenn nichts anderes angegeben ist, die "L"-Form.
Die Resultate sind in Fig. 9 dargestellt. Sie zeigen, daß L- Arg-D-Ala ein viel besserer metabolischer in-vivo-Stabilisator von Arg-βgal als L-Arg-L-Ala ist, wohingegen L-Ala-L- Arg keine Auswirkung hat. Vermutlich ist die "D"-Stereokonfiguration der Peptidbindung gegenüber einer Spaltung in vivo weit widerstandsfähiger, was in einer geringeren Inaktivierungsrate des Dipeptids als ein in-vivo-Hemmer der N- Ende-Regelstrecke resultiert.

Claims

1. Methode zur Hemmung des Zerfalls über die N-terminale Regelstrecke eines nicht kompartimentierten, intrazellulären Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß in die Zellen eine regulatorische Verbindung eingeführt wird, die einen amino-endständigen Aminosäurerest aufweist, der derselbe wie der amino- endständige Aminosäurerest des Proteins oder ein amino-endständiger Aminosäurerest ist, der durch denselben, N-Ende erkennenden Proteinfaktor erkannt wird wie der, der den amino-endständigen Aminosäurerest des Proteins erkennt.

2. Methode zur Erhöhung der Stoffwechselstabilität in Zellen eines nicht kompartimentierten, intrazellulären Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß in die Zellen eine regulatorische Verbindung eingeführt wird, die einen amino-endständigen Aminosäurerest aufweist, der derselbe wie der amino-endständige Aminosäurerest des Proteins oder ein amino-endständiger Aminosäurerest ist, der durch denselben, N-Ende erkennenden Proteinfaktor erkannt wird wie der, der den amino-endständigen Aminosäurerest des Proteins erkennt.

3. Methode nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen eukaryotische Zellen, z. B. Hefezellen, sind.

4. Methode nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorische Verbindung ein carboxyl-endständiges Derivat eines amino-endständigen Aminosäurerestes ist.

5. Methode nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht kompartimentierte, intrazelluläre Protein einen amino-endständigen Aminosäurerest aufweist, der eine sterisch anspruchsvolle, hydrophobe Aminosäure ist, und in die Zellen ein Ester eingeführt wird, der eine sterisch anspruchsvolle, hydrophobe Aminosäure aufweist.

6. Methode nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Ester ein Alkylester ist, z. B. ein Methylester.

7. Methode nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der amino-endständige Aminosäurerest aus Glutaminsäure, Glutamin, Asparagin, Lysin, Arginin, Histidin, Leucin, Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin und Isoleucin ausgewählt wird.

8. Methode nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorische Verbindung aus Dipeptiden, kleinen Polypeptiden, sterisch anspruchsvollen, hydrophoben Estern, Alkylestern von sterisch anspruchsvollen, hydrophoben Aminosäuren, Dipeptiden, die eine sterisch anspruchsvolle, hydrophobe Aminosäure am Aminoende aufweisen, und kleinen Polypeptiden, die eine sterisch anspruchsvolle, hydrophobe Aminosäure am Aminoende aufweisen, ausgewählt wird.

9. Methode zur Erhöhung der Ausbeute eines ausgewählten Proteins in einem biologischen Produktionssystem, dadurch gekennzeichnet, daß in das System ein regulatorisches Peptid mit einem amino-endständigen Aminosäurerest eingeführt wird, der derselbe wie der amino-endständige Aminosäurerest des Proteins oder ein amino-endständiger Aminosäurerest ist, der durch denselben, N-Ende erkennenden Proteinfaktor erkannt wird wie der, der den amino- endständigen Aminosäurerest des erzeugten Proteins erkennt.

10. Methode zur Bildung eines ausgewählten Proteins in eukaryotischen Zellen, das normalerweise über die N- terminale Regelstrecke abgebaut wird, dadurch gekennzeichnet, daß in die Zellen eine regulatorische Verbindung eingeführt wird, die ausgewählt wird aus:

a) Dipeptiden, die einen amino-endständigen Aminosäurerest aufweisen, der derselbe wie der aminoendständige Aminosäurerest des Proteins oder ein amino-endständiger Aminosäurerest ist, der durch denselben, N-Ende erkennenden Proteinfaktor erkannt wird wie der, der den amino-endständigen Aminosäurerest des Proteins erkennt,

b) kleinen Polypeptiden, die einen amino-endständigen Aminosäurerest aufweisen, der derselbe wie der amino-endständige Aminosäurerest des Proteins oder ein amino-endständiger Aminosäurerest ist, der durch denselben, N-Ende erkennenden Proteinfaktor erkannt wird wie der, der den amino-endständigen Aminosäurerest des Proteins erkennt, und

c) Alkylestern einer Aminosäure, die dieselbe wie der amino-endständige Aminosäurerest des Proteins oder ein amino-endständiger Aminosäurerest ist, der durch denselben, N-Ende erkennenden Proteinfaktor erkannt wird wie der, der den amino-endständigen Aminosäurerest des Proteins erkennt.

11. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur selektiven Hemmung des Zerfalls über die N-terminale Regelstrecke in lebenden Zellen eines ausgewählten Proteins, das folgende Schritte umfaßt:

(A) Bestimmung der Identität der amino-endständigen Aminosäure des ausgewählten Proteins,

(B) Auswahl eines amino-endständigen Aminosäurerestes, der derselbe wie der amino-endständige Aminosäurerest des Proteins oder ein amino- endständiger Aminosäurerest ist, der durch denselben, N-Ende erkennenden Proteinfaktor erkannt wird wie der, der den amino-endständigen Aminosäurerest des ausgewählten Proteins erkennt, und

(C) Herstellung (i) eines DNA Elements, das eine regulatorische Verbindung kodiert, die den in Schritt (B) ausgewählten amino-endständigen Aminosäurerest aufweist, oder (ii) eines DNA Elements, das ein Dipeptid oder kleines Polypeptid kodiert, das einen amino-endständigen Aminosäurerest aufweist, der derselbe wie der amino-endständige Aminosäurerest des Proteins oder ein amino-endständiger Aminosäurerest ist, der durch denselben, N-Ende erkennenden Proteinfaktor erkannt wird wie der, der den aminoendständigen Aminosäurerest des ausgewählten Proteins erkennt, oder (iii) eines Regulators, der eine Aminosäure aufweist, die dieselbe wie der amino-endständige Aminosäurerest des proteins oder ein amino-endständiger Aminosäurerest ist, der durch denselben, N-Ende erkennenden Proteinfaktor erkannt wird wie der, der den amino-endständigen Aminosäurerest des ausgewählten Proteins erkennt, oder (iv) eines Regulators, der folgende Merkmale aufweist:

a) Dipeptide, die eine amino-endständige Aminosäure aufweisen, die dieselbe wie der amino-endständige Aminosäurerest des Proteins oder ein amino-endständiger Aminosäurerest ist, der durch denselben, N-Ende erkennenden Proteinfaktor erkannt wird wie der, der den amino-endständigen Aminosäurerest des ausgewählten Proteins erkennt,

b) kleine Polypeptide, die eine amino-endständige Aminosäure aufweisen, die dieselbe wie der amino-endständige Aminosäurerest des Proteins oder ein amino-endständiger Aminosäurerest ist, der durch denselben, N-Ende erkennenden Proteinfaktor erkannt wird wie der, der den amino-endständigen Aminosäurerest des ausgewählten Proteins erkennt,

c) Ester einer Aminosäure, die dieselbe wie der amino-endständige Aminosäurerest des Proteins oder ein amino-endständiger Aminosäurerest ist, der durch denselben, N-Ende erkennenden Proteinfaktor erkannt wird wie der, der den amino-endständigen Aminosäurerest des ausgewählten Proteins erkennt.

12. Regulatorische Verbindung mit einem amino-endständigen Aminosäurerest, der derselbe wie der amino- endständige Aminosäurerest des Proteins oder ein amino-endständiger Aminosäurerest ist, der durch denselben, N-Ende erkennenden Proteinfaktor erkannt wird wie der, der den amino-endständigen Aminosäurerest eines intrazellulären Proteins erkennt, zur Verwendung für die Therapie, z. B. zur Erhöhung der Stoffwechselstabilität des intrazellulären Proteins.

13. Verwendung einer regulatorischen Verbindung mit einem amino-endständigen Aminosäurerest, der derselbe wie der amino-endständige Aminosäurerest des Proteins oder ein amino-endständiger Aminosäurerest ist, der durch denselben, N-Ende erkennenden Proteinfaktor erkannt wird wie der, der den amino- endständigen Aminosäurerest eines intrazellulären Proteins erkennt, zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Stoffwechselstabilität des intrazellulären Proteins.