DE69231001T2 - Ubiquitinspezifische proteasen - Google Patents
Ubiquitinspezifische proteasenInfo
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Description
- Ubiquitin (Ub), ein hochkonserviertes Protein mit 76 Resten, liegt in eukaryontischen Zellen entweder frei, oder an die verschiedensten Proteine kovalent gebunden, vor. Das posttranslationale Koppeln von Ubiquitin an andere Proteine wird durch eine Familie von Ub-konjugierenden (E2) Enzymen katalysiert und umfasst die Bildung einer Isopeptidbindung zwischen dem C-terminalen Rest Gly von Ubiquitin und der ε-Aminogruppe eines Rests Lys in einem Akzeptorprotein. Eine Funktion von Ubiquitin ist die Markierung von Proteinen, die für einen selektiven Abbau bestimmt sind. Es wurde auch nachgewiesen, dass Ubiquitin eine Chaperonfunktion besitzt, indem seine vorübergehende (cotranslationale) kovalente Verbindung mit spezifischen ribosomalen Proteinen den Aufbau ribosomaler Untereinheiten fördert.
- Im Gegensatz zu verzweigten Ub-Proteinkonjugaten, die sich posttranslational bilden, werden lineare Ub-Proteinaddukte als die translationalen Produkte natürlicher oder biotechnischer Genfusionen gebildet. So wird beispielsweise in der Hefe Saccharomyces cerevisiae Ubiquitin ausschließlich durch proteolytische Verarbeitung von Vorläufern erzeugt, bei denen Ubiquitin entweder mit sich selbst, wie in dem linearen Polyubiquitinprotein Ubi4, oder mit nicht-verwandten Aminosäuresequenzen verbunden ist, wie in den Hybridproteinen Ubi1-Ubi3. In wachsenden Hefezellen wird Ubiquitin aus den Vorläufern Ubi1-Ubi3 reichlich erzeugt, bei denen die "Endglieder" spezielle ribosomale Proteine sind. Das Polyubiquitingen (UBI4-Gen) ist in wachsenden Zellen entbehrlich, wird jedoch (als Hauptlieferant von Ubiquitin) während Beanspruchung wesentlich. Das Fehlen von reifes Ubiquitin codierenden Genen, und die Fusionsstruktur von Ubiquitinvorläufern in Hefe sind ebenfalls für andere Eukaryonten charakteristisch.
- Ub-spezifische, ATP-unabhängige Proteasen, welche der Abspaltung von Ubiquitin aus seinen linearen oder verzweigten Konjugaten fähig sind, wurden in allen untersuchten Eukaryonten nachgewiesen, jedoch nicht in Bakterien wie Escherichia coli, dem Ubiquitin und Ub-spezifische Enzyme fehlen. Miller u. a. (Biotechnology 1, S. 698-704 (1989)) klonten ein als YUH1 bezeichnetes S. cerevisiae-Gen, das eine Ub-spezifische Protease codiert, welche Ubiquitin von seinen verhältnismäßig kurzen C-terminalen Extensionen abspaltet, jedoch bei größeren Fusionen, wie z. B. Ub-β-galactosidase (Ubβgal) tatsächlich unwirksam ist. Wilkinson u. a. (Science 246, S. 670-673 (1989)) klonten auch eine cDNA, welche ein Säugetierhomologes der Hefeprotease YUH1 codiert. Tobias und Varshavsky (J. Biol. Chem. 266, S. 12021-12028 (1991)) berichteten über das Klonen und eine funktionelle Analyse eines anderen Hefegens, nämlich UBP1, das eine Ub-spezifische Verarbeitungsprotease codiert, deren Aminosäuresequenz sich von denjenigen der Protease YUH1 und anderen bekannten Proteinen unterscheidet. Im Gegensatz zu YUH1 und dessen bekannten Homologen in anderen Gattungen, setzt UBP1 aus Ubiquitinfusionsproteinen ungeachtet ihrer Größe oder der Anwesenheit einer N-terminalen Ubiquitinextension Ubiquitin frei.
- Vorliegende Erfindung betrifft eine Gattungsklasse von Ubiquitin-spezifischen Proteasen, welche speziell am C-Terminus des Ubiquitinrests in einem Ubiquitinfusionsprotein ungeachtet der Größe des Ubiquitinfusionsproteins spaltet. Insbesondere betrifft vorliegende Erfindung Ubiquitin-spezifische Proteasen dieser Klasse, welche aus einer Zelle isoliert wurden. Die Erfindung betrifft auch isolierte DNA-Sequenzen, die die Proteasen dieser Klasse codieren.
- Eine brauchbare Eigenschaft von Ubiquitin-spezifischen Proteasen ist, das sie Ubiquitin von seinen C-terminalen Extensionen ungeachtet der Identität des an die Spaltstelle angrenzenden Rests der Extensionen abspalten. Diese Eigenschaft der Ubp-Proteasen macht die Bildung von Proteinen oder Peptiden mit vorbestimmten N-terminalen Resten in vivo oder in vitro möglich, ein Verfahren mit Anwendungen sowohl in der Grundlagenforschung als auch Biotechnologie.
- Gemäß vorliegender Erfindung wird eine isolierte, eine Ubiquitin-spezifische Protease codierende DNA bereitgestellt, welche sich durch die Fähigkeit auszeichnet, unter scharfen Hybridisierungsbedingungen mit DNA spezifisch zu hybridisieren, die durch die Sequenz ID Nr. 5 oder 7 wiedergegeben wird, wobei die Protease ein Ubiquitinfusionsprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 120 kilodaltons spezifisch spaltet, die spezifische Spaltung in vitro oder in einer prokaryontischen Zelle zwischen dem C-terminalen Rest von Ubiquitin und dem N- terminalen Rest des Proteins oder Peptids stattfindet, und wobei das Fusionsprotein durch die DNA, die durch die Sequenz ID Nr. 1 wiedergegeben wird, codiert wird.
- Vorliegende Erfindung stellt auch ein isoliertes DNA-Expressionskonstrukt zur Verfügung, dass eine biologisch aktive Ubiquitin-spezifische Protease codiert, umfassend eine DNA, welche durch eine aus der Gruppe, welche aus der Sequenz ID Nr. 5 und Sequenz ID Nr. 7 besteht, ausgewählte Sequenz gekennzeichnet ist.
- Ferner stellt die Erfindung eine mit einem DNA-Expressionskonstrukt transformierte Zelle zur Verfügung, das eine biologisch wirksame Ubiquitin-spezifische Protease codiert, umfassend eine aus der Gruppe ausgewählte DNA-Sequenz, die aus der Sequenz ID Nr. 5 und Sequenz lD Nr. 7 besteht, welche eine prokaryontische Zelle wie E. coli sein kann.
- Schließlich stellt die Erfindung Verfahren zum Abspalten von Ubiquitin aus Fusionsproteinen zur Verfügung, die in den Patentansprüchen 10 und 11 beansprucht sind.
- Fig. 1 ist ein Diagramm, welches das Plasmid pJT60 wiedergibt.
- Fig. 2 ist ein Diagramm, welches das Plasmid pJTUP wiedergibt.
- Fig. 3 ist ein Diagramm, das eine Restriktionskartierung von UBP2 wiedergibt.
- Fig. 4 ist ein Diagramm, das eine Restriktionskartierung von UBP3 wiedergibt.
- Ein Ubiquitinfusionsprotein wird im vorliegenden als ein Fusionsprotein definiert, das Ubiquitin oder sein funktionelles Homolog umfasst, dessen C-terminaler Aminosäurerest mit dem N-terminalen Aminosäurerest eines Proteins oder Peptids, das kein Ubiquitin ist, verschmolzen ist. Wie in den folgenden Beispielen diskutiert wird, kann das Ubiquitinfusionsprotein ein natürlich auftretendes Fusionsprotein oder ein durch die rekombinante DNA-Technologie hergestelltes Fusionsprotein sein. Die spezifische Spaltung findet entweder in vivo oder in vitro zwischen dem C-terminalen Rest von Ubiquitin und dem N-terminalen Rest des Proteins oder Peptids statt.
- Im Gegensatz zu der im vorliegenden offenbarten Klasse Ubiquitin-spezifischer Proteasen spaltet das früher isolierte Enzym YUH1 Ubiquitin von einem Ubiquitinfusionsprotein nur ab, wenn der nicht aus Ubiquitin bestehende Teil des Fusionsprodukts verhältnismäßig kurz (kürzer als etwa 60 Reste) ist. Da z. B. viele der pharmazeutisch wichtigen Proteine viel länger als 60 Reste sind, kann die Protease YUH1 nicht zur Freisetzung von Ubiquitin aus Fusionsprodukten dieser Proteine mit Ubiquitin verwendet werden. Die Proteasen der im vorliegenden offenbarten Klasse können jedoch zu diesem Zweck verwendet werden, wodurch die Bildung von gewünschten Resten an den N-Termini von großen oder kleinen Proteinen, Polypeptiden oder Peptiden ermöglicht wird (die Begriffe Protein, Polypeptid und Peptid werden auf dem Fachgebiet oftmals untereinander austauschbar verwendet).
- In den folgenden Beispielen sind DNA-Sequenzen offenbart, welche drei der Proteasen codieren, die Proteasen der Klasse Ubiquitin-spezifischer Proteasen sind, auf welche sich vorliegende Erfindung bezieht. Diese Proteasen wurden als UBP1, die bekannt ist, UBP2 und UBP3 bezeichnet. Die DNA-Sequenzen, welche UBP2 und UBP3 codieren, und ihre abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind in der Sequenz ID Nrn. 5 bis 6 bzw. Sequenz ID Nrn. 7 bis 8 dargelegt. Die im vorliegenden offenbarten DNA-Sequenzen, welche die Proteasen codieren, kön nen nach den nachfolgend beschriebenen Verfahren oder unter Anwendung des Polymerasekettenreaktions-Amplifikationsverfahrens isoliert und unter Bezugnahme auf nachfolgende DNA-Sequenzauflistung bestimmt werden.
- Die Proteasen UBP1 und UBP2 zeigen sowohl in vivo als auch in vitro Aktivität, während die Protease UBP3 lediglich in vivo Aktivität zeigt. Es erwies sich, dass jede dieser Proteasen ein Ubiquitinfusionsprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 120 Kilodaltons spaltet (Ubiquitin-Methionin-β-Galactosidase). Im Gegensatz hierzu ist die Ubiquitin-spezifische Protease YUH1 tatsächlich mit diesem Ubiquitinfusionsprodukt sowohl in vitro als auch in vivo inaktiv. Die DNA-Sequenz, welche dieses 120 Kilodalton Fusionsprotein codiert, ist in der Sequenz ID Nr. 1 wiedergegeben. Die Aminosäuresequenz ist in der Sequenz ID Nrn. 1 bis 2 wiedergegeben.
- Der Erfindungsumfang umfasst eine isolierte DNA-Sequenz, die eine Ubiquitinspezifische Protease codiert, welche sich durch die Fähigkeit auszeichnet, unter scharfen Hybridisierungsbedingungen mit der in der Sequenz ID Nr. 5 oder Sequenz ID Nr. 7 repräsentierten DNA-Sequenz spezifisch zu hybridisieren. Eine isolierte DNA-Sequenz, die eine Ubiquitin-spezifische Protease codiert, welche sich durch die Fähigkeit auszeichnet, spezifisch mit der DNA-Sequenz zu hybridisieren, welche durch die Sequenz ID Nr. 3 wiedergeben ist, liegt außerhalb des Umfangs der beanspruchten Erfindung. DNA-Sequenzen, welche zu den aufgelisteten Sequenzen unter scharfen Hybridisierungsbedingungen hybridisieren, sind entweder völlig komplementär oder im hohen Maße homolog zur aufgelisteten Sequenz. Der im vorliegenden benutzte Begriff "homolog" bezieht sich auf DNA- Sequenzen, welche sich von der aufgelisteten Sequenz unterscheiden, wobei jedoch der Unterschied keine wesentliche Wirkung auf die biologische Aktivität (d. h. die Spaltungseigenschaften) der codierten Protease hat. Einer der möglichen Sets scharfer Hybridisierungsbedingungen ist 50% Formamid, 5 · SSPE (1 · SSPE ist 0,15 mNaCl, 1 mM Na-EDTA, 10 mM Na-phosphat, pH 7,0), 5 · Denhardt's Lösung (0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% Ficoll) bei 45ºC.
- Die isolierten DNA-Sequenzen, welche in den Erfindungsumfang fallen, können zum Exprimieren der codierten Protease in großen Mengen entweder in prokaryotischen oder eukaryontischen Wirtszellen verwendet werden. Zu diesem Zweck wird die DNA in einen prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionsvektor mit den geeigneten Regulatorsignalen eingefügt und zur Zelltransformation benutzt. Die verschiedensten geeigneten Vektoren und Regulatorsignale wurden bislang zu diesem Zweck entwickelt und sind dem Fachmann gut bekannt.
- Wie in den nachfolgenden Beispielen zur Diskussion gestellt wird, wurden die Proteasen gemäß vorliegender Erfindung in E. coli in dem Ausmaß überexprimiert, dass sie einen wesentlichen Teil des gesamten Zellproteins darstellen. Die Reinigung eines Proteins, das in solch wesentlichen Mengen exprimiert wird, und für das ein einfaches Testsystem eingerichtet wird, ist für den Fachmann eine unkomplizierte Angelegenheit.
- Gemäß der Erfindung kann isoliertes UBP2, oder ein Zellextrakt mit einem Gehalt an UBP2, gebildet aus einem rekombinanten DNA-Expressionsvektor zur Abspaltung von Ubiquitin aus Ubiquitinfusionen in vitro verwendet werden. Ein Zellextrakt kann aus einer Kultur von Wirtszellen hergestellt werden, die einen rekombinanten DNA-Expressionsvektor exprimieren, indem man einfach die Zellkultur einengt und lysiert. An die Lyse können sich, wie weiter oben beschrieben, verschiedene Reinigungsgrade anschließen. Der Bereich der für eine Spaltung in vitro geeigneten Bedingungen kann vom Fachmann unter Anwendung von nichts mehr als Routineversuchen unter Zugrundelegung der in den nachfolgenden Beispielen zur Verfügung gestellten Information empirisch bestimmt werden.
- Ferner können erfindungsgemäß die Proteasen UBP2 und UBP3 zur Freisetzung von Ubiquitin aus Fusionsproteinen in vivo verwendet werden. Beispielsweise können prokaryontische Zellen, welche einen die Protease codierenden Expressionsvektor beherbergen, mit einem Expressionsvektor transformiert werden, der ein Ubiquitinfusionsprotein codiert. Solche Zellen bilden ein von Ubiquitin befreites Produkt mit einem vorbestimmten N-terminalen Aminosäurerest. Es viele gut bekannte Vorteile, rekombinante Proteine in prokaryontischen Organismen wie E. coli zu bilden.
- Bei manchen Fusionen von Ubiquitin an ein nicht-Ubiquitin-Protein oder -Peptid kann die Anwesenheit des Ubiquitinrests die funktionelle Wirksamkeit des nicht- Ubiquitin-Proteins oder -Peptids hemmen oder modifizieren. In diesem Fall kann Ubiquitin als temporärer Inhibitor (oder temporäres Modifizierungsmittel) der funktionellen Wirksamkeit des nicht-Ubiquitin-Proteins oder -Peptids benutzt werden, mit der Fähigkeit, die ursprüngliche funktionelle Aktivität zu einer beliebigen gewünschten Zeit, sei es in vitro oder in vivo, wiederherzustellen, indem man das entsprechende Ubiquitinfusionsprodukt mit der Ubiquitin-spezifischen Protease zur Entfernung des Ubiquitinrests in Berührung bringt.
- Die Erfindung wird ferner durch folgende Offenbarung veranschaulicht, wobei das Bezugsbeispiel 1 und die Protease UBP1 außerhalb des Bereichs der beanspruchten Erfindung liegen.
- Escherichia coli (Stamm HB101), transformiert mit einer Saccharomyces cerevisiae-Genombibliothek wurde für eine sib-Selektionsstrategie verwendet. Die Bibliothek, RB237, wurde durch partielles Digerieren von genomischer Hefe-DNA mit SauIIIA und Verknüpfen der Fragmente mit der Stelle BamH1 im Gen TetR des Hefe/E. Coli-shuttle-Vektors YCp50 gebildet. Nach anfänglicher Analyse enthielt die Bibliothek inserts mit einer mittleren Größe von ~19 Kb.
- Mit der vorherigen Bibliothek transformierte E. coli wurden auf Agar mit einem Gehalt an Luria Brühe (LB) und Ampicillin (amp) (100 ug/ml) mit einer Dichte von etwa 40 lebensfähigen Zellen pro Platte plattiert. Die Platten wurden bei 36ºC 16 Stunden inkubiert. Die Kolonien wurden sodann auf LB/amp-Platten repliziert. Die ursprünglichen Platten wurden bei 4ºC gelagert, und ihre Replikas ließ man 24 Stunden bei 36ºC wachsen. Jedes Replikat wurde mit 1 ml LB/amp (50 ug/ml) durch wiederholtes Waschen der Plattenoberfläche eluiert, bis sämtliche Kolonien in die Flüssigkeit freigesetzt waren. Das gesamte Eluat wurde sodann zu 4 ml LB/amp gegeben und auf einer Walzentrommel bei 36ºC über Nacht inkubiert.
- Die E. coli-Zellen in diesen (Stationärphasen-) Übernachtkulturen wurden sodann lysiert. 1,7 mf jeder Kultur wurden in einen Mikrozentrifugenrohr auf Eis gestellt und sodann eine Minute bei 12.000 · g und 4ºC zentrifugiert. Das Zellenpellet wurde abermals durch Aufwirbeln bei hoher Geschwindigkeit in 50 ul 25%iger Saccharose (Gewicht/Volumen) und 250 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0) abermals suspendiert. Sodann wurden 10 ul frisch zubereiteter Lysozymlösung (10 mg/ml Hühnereiweis-Lysozym (Sigma) in 0,25 M Tris-HCl (pH-Wert 8,0)) zugesetzt und durch leichtes aufwirbeln eingemischt. Die Suspension wurde auf Eis 5 Minuten inkubiert, 150 ul 75 mM EDTA, 0,33 M Tris-HCl (pH-Wert 8,0) wurden sodann zugegeben, durch leichtes Aufwirbeln eingemischt, und das Rohr wurde auf Eis 5 Minuten unter gelegentlichem Rühren inkubiert. Danach wurde 1 ul von 10%igem Triton X-100 (Pierce) zu jedem Rohr zugegeben und durch Pipettieren eingemischt. Das Zelllysat wurde mit 12.000 · g 15 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde auf Eis gehalten, und das Pellet wurde verworfen.
- Zelllysate wurden auf ihre Ub-spezifische Proteaseaktivität unter Verwendung eines ³&sup5;S-markierten Substrats getestet. ³&sup5;S-markierte Ubiquitin-Methionin-Dihydrofolatreduktase (Ub-Met-DHFR) wurde wie folgt hergestellt: Luriabrühe (50 mf), ergänzt mit 50 ug/ml Ampicillin, wurde mit 1 ml einer gesättigten Übernachtkultur von E. coli, Stamm JM101, mit einem Gehalt an einem Plasmid, das das Ub-Met- DHFR-Fusionsprotein aus einem IPTG-induzierbaren, hoch aktiven Derivat des lac-Promotors exprimiert, inokuliert. Unter Schütteln ließ man die Zellen bei 37ºC wachsen bis sie einen A&sub6;&sub0;&sub0;-Wert von ~0,9 erreichten. Die Kultur wurde 15 Minuten auf Eis abgeschreckt, sodann mit 3.000 · g 5 Minuten zentrifugiert und 2 · mit M9- Salzen bei 0ºC gewaschen. Die Zellen wurden nach der Endwäsche in 25 ml M9- Salzen abermals suspendiert, welche durch 0,2% Glucose, 1,8 ug/ml Thiamin, 40 ug/ml Ampicillin, 1 mM IPTG, 0,0625% (Gewicht/Volumen) Methionin- Testmedium (Difco) ergänzt waren. Die Suspension wurde sodann eine Stunde bei 37ºC geschüttelt, und die Zellen wurden durch Zugabe von 1 mCi ³&sup5;S-Translabel (ICN) markiert, gefolgt von einer 5minütigen Inkubation unter Schütteln. Nicht-markiertes L-Methionin wurde sodann bis zu einer Endkonzentration von 0,0032% (Gewicht/Volumen) zugegeben, und die Zellen wurden weitere 10 Minuten geschüttelt. Die Zellen wurden sodann geerntet (3.000 · g während 5 Minuten) und einmal in kalten M9-Salzen gewaschen. Nach der M9-Wäsche wurde das Zellenpellet abermals in 0,5 ml 25%iger Saccharose, 50 mM Tris-HCl (pH- Wert 8,0) suspendiert und auf Eis 5 Minuten inkubiert. Während dieser Zeit wurde Hühnereiweiß-Lysozym (Sigma) in 250 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0) auf eine Konzentration von 10 mg/ml frisch aufgelöst. 10 ul der Lysozymlösung wurden zur Zellsuspension zugesetzt, wonach vermischt und 5 Minuten bei 0ºC inkubiert wurde. 5 ul von 0,5 M EDTA (pH-Wert 8,0) wurden sodann zugegeben, und die Suspension wurde bei 0ºC 5 Minuten unter gelegentlichem Mischen stehengelassen. Die Zellsuspension wurde sodann in ein Zentrifugenrohr gebracht, das 0,975 ml von 65 mM EDTA (pH-Wert 8,0), 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0) und die Proteaseinhibitoren Antipain, Chymostatin, Leupeptin, Aprotinin und Pepstatin zu jeweils 25 ug/ml enthielt. Sodann wurden 10 ul 10%iges Triton X-100 (Pierce) zugesetzt und durch Pipettieren dispergiert. Das Lysat wurde mit 39.000 · g 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde zurückgehalten, in flüssigem Stickstoff schnell gefroren und bei -85ºC gelagert.
- Zur Affinitätsreinigung der ³&sup5;S-markierten Ub-Met-DHFR wurde nach dem Verfahren von Kaufman (Meth. Enzymol. 34, S. 272-281 (1974)) eine Methotrexat-(MTX- )Agarose-Affinitätsmatrix hergestellt. Eine Säule mit einem Bettvolumen von 0,5 ml wurde mit der MTX-Agarose gefüllt und mit 10 ml MTX-Säulenpuffer (20 mM Hepes (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA, 200 mM NaCl, 0,2 mM Dithiothreit) gewaschen. Der ³&sup5;S-markierte Überstand der vorhergehenden Stufe wurde getaut und auf die MTX-Agarosesäule aufgebracht. Die Säule wurde mit 50 ml MTX- Säulenpuffer, 50 ml 2M Harnstoff enthaltendem MTX-Säulenpuffer und abermals mit 50 ml MTX-Säulenpuffer gewaschen. Die markierte Ub-Met-DHFR wurde aus der Säule mit Folsäureelutionspuffer (0,2 M Kaliumborat (pH-Wert 9,0), 1 M KCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA und 10 mM Folsäure) eluiert. Der Elutionspuffer wurde in gleichen Teilen von 1 ml auf die Säule aufgebracht, und Fraktionen von 1 ml wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden sodann auf ihre ³&sup5;S-Radioaktivität getestet, und diejenigen Fraktionen, welche den radioaktiven Hauptpeak enthielten, wurden vereint. Die vereinten Fraktionen wurden etwa 20 Stunden gegen zwei Veränderungen eines Lagerungspuffers dialysiert, welcher 40 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM EDTA und 50% Glyzerin enthielt. Die gereinigte ³&sup5;S-markierte Ub-Met-DHFR wurde durch SDS-PAGE [SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese] getestet, gefolgt von einer Fluorographie; sie erwies sich zu mehr als 95% rein.
- Die Zelllysate wurden auf ihre Ubiquitin-spezifische Proteaseaktivität getestet, indem man 9 ul des Zelllysatüberstands mit 1 ul der affinitätsgereinigten, ³&sup5;S-markierten Ub-Met-DHFR-Fusion in einem 0,5 ml Mikrozentrifugenrohr vereinte und 3 Stunden bei 36ºC inkubierte. Sodann wurden 5 ul eines 3fach konzentrierten elektrophoretischen Probepuffers (30% Glyzerin, 3% SDS (Gewicht/Volumen), 15 mM EDTA, 0,2 M 2-Mercaptoethanol, 0,3 ug/ml Bromphenolblau, 375 mM Tris- HCl (pH-Wert 6,8)) zugegeben, und jedes Rohr wurde 3 Minuten in ein siedendes Wasserbad gestellt. Die Proben wurden auf ein 12%iges Polyacrylamid- SDS-Gel aufgebracht und bei 50 Volt der Elektrophorese unterzogen, bis der Bromphenolfarbstoff den Boden des Gels erreichte. Die Lagen der radioaktiv markierten Proteine in dem Gel wurden durch Fluorographie sichtbar gemacht. Das Gel wurde in 10%iger Essigsäure, 25%igem Methanol während 15 Minuten gewaschen, 15 Minuten in Wasser gespült und mit Autofluor (National Diagnos tics) 1 Stunde inkubiert. Das Gel wurde sodann bei 80ºC unter Vakuum getrocknet und in einer lichtdichten Kassette auf einen Film Kodak XAR-5 gebracht und bei -85ºC über Nacht gelagert.
- Der zuvor beschriebene Test auf Freisetzung von Ubiquitin wurde mit Lysaten von verschiedenen Pools von E. coli-Transformanten wiederholt, bis die Gelanalyse ein Lysat zeigte, das eine an der Verbindung Ubiquitin-DHFR wirkende proteolytische Aktivität aufwies. Dieser Test zeigte, dass mindestens eine der annähernd 40 E. coli-Kolonien auf der ursprünglichen LB/amp-Platte (von der das vereinte Lysat abgeleitet wurde) ein auf YCp50 basierendes Plasmid enthielt, welches ein Hefe-DNA-insert hat, das eine Ub-spezifische proteolytische Aktivität verleiht.
- Die nächste Stufe dieses sib-Selektionsversuchs zum Klonen des UBP1-Gens war die Durchführung eines ähnlichen Ub-Met-DHFR-Spaltversuchs, um zu ermitteln, welche der annähernd 40 Kolonien das erwünschte Plasmid in einem "positiven" Pool enthielt. Um dies zu machen, wurde eine Probe jeder einzelnen Kolonie von Interesse auf der Platte in LB/amp inokuliert und über Nacht wachsen gelassen. Der Ub-Met-DHFR-Spaltungsversuch wurde sodann genau wie oben wiederholt, aber dieses Mal war jede Lysatprobe für einen einzigen klonalen E. coli- Transformanten anstelle eines Gemischs von etwa 40 derartiger Transformanten repräsentativ. Diese Analyse zeigte eine einzige Kolonie, welche ein Plasmid enthielt, das die Fähigkeit verlieh, speziell an der Verbindung Ub-DHFR zu spalten.
- Die Analyse des anfänglich isolierten Plasmids (pJT55) zeigte ein etwa 15 kb insert von genomischer Hefe-DNA in dem Vektor YCp50. Die SphI-Digestion dieses Plasmids führte zu einem ~14 kb-Fragment, das nach dem Subklonen in den Vektor pUC19 die gleiche proteolytische Aktivität verlieh. Dieses Plasmid wurde pJT57 genannt. Das ~14 kb-Fragment wurde weiter subgeklont, indem man es mit SphI und XhoI schnitt, die ~5,5 kb der insert-DNA isolierte und diese in den mit SphI und SalI vorgeschnittenen Vektor pUC19 subklonte. Dies führte zum ~8,1 kb Plasmid pJT60, welches das ~5,5 kb Hefe-DNA-insert enthielt, das die gleichen Ubiquitin-spezifische proteolytische Aktivität wie das ursprüngliche Plasmid verlieh.
- In Fig. 1 ist eine Kartierung dargestellt, welche die Restriktions-Endonuklease- Erkennungsstellen im Plasmid pJT60 zeigt. In der Kartierung sind Basenpaarstellungen durch eine Zahl in Klammern im Anschluß an eine Restriktionsstelle angegeben. Das Hefe-DNA-insert in pJT60 enthielt eine Stelle KpnI in Nähe seines Mittelpunkts, die das insert in zwei kleinere Fragmente A und B (Basen 423 und 5830) unterteilte. In diesem Fragment gibt der offene Pfeil das UBP1 wiedergebende offene Leseraster (ORF) an. Das ganze ORF, und die dieses einklammernde dünnen Linien geben das Ausmaß der in der Sequenz I. D. Nr. 3 gezeigten sequenzierten DNA wieder. Beide Fragmente wurden in pUC19 subgeklont, was zu pJT60A und pJT60B führte. Das Fragment A wurde nach dem Schnitt von pJT57 mit KpnI und SphI isoliert. Dieses Fragment wurde in pUC19 subgeklont, das mit den gleichen Restriktionsendonucleasen geschnitten worden war. Das Fragment B wurde von pJT57 isoliert, das durch KpnI und XhoI geschnitten worden war; es wurde in pUC19 subgeklont, das durch KpnI und SalI geschnitten worden war. Weder pJT60A noch pJT60B war fähig, eine Ubiquitin-spezifische proteolytische Wirksamkeit zu verleihen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass das Gen von Interesse sich nicht auf die Stelle KpnI des ~5,5 kb inserts von pJT60 festlegen wollte (straddled).
- Zur Sequenzierung des geklonten Gens wurden die inserts von pJT60A und pJT60B in den Phagenvektor M13mp19 subgeklont. Die Nucleotidsequenz wurde (unter Anwendung des Kettenterminierungsverfahrens) in beide Richtungen von der inneren Stelle KpnI in pJT60 bestimmt. Es wurde gefunden, dass sich die Stelle KpnI innerhalb eines offenen Leserasters versteckte, das sich von dieser Stelle in beide Richtungen erstreckte. Nach den Verfahren von Dale u. a. (Plasmid 13, S. 31-40 (1989)) wurden sodann in den Sequenzierungsschablonen Deletionen in einer Richtung vorgenommen, und das ganze offene Leseraster (ORF) wurde ermittelt. Das Ende 5' des ORF war im Fragment B, und das Terminationscodon war im Fragment A. Das ORF war 2.427 Nucleotide lang und codierte ein 809-Rest-Protein mit einer Molekularmasse von 93 kD. Das sequenzierte ORF wurde sodann auf einem 2,8 kb Fragment durch Schneiden von pJT60 mit AccI, Füllen der 5'-Überhänge (overhangs) mit Klenow PolI und Verknüpfen von SalI-Linker mit den blunt ends. Dieses Konstrukt wurde mit SalI und BamHI digeriert, das 2,8 kb Fragment wurde elektrophoretisch gereinigt und in pUC19 ligiert, das mit BamHI und SalI digeriert worden war. Das erhaltene Plasmid wurde pJT70 genannt. Dieses Plasmid war, wenn es in E. coli transformiert wurde, fähig, die Ubiquitin-spezifische proteolytische Aktivität in gleichem Ausmaß zu verleihen, wie entweder das ursprüngliche ~15 kb insert in YCp50 oder das ~5,5 kb insert des Plasmids pJT60, das das ~2,8 kb Fragment von pJT70 umfasst. Das Plasmid pJT60 wurde bei der American Type Culture Collection (Rockville, MD) hinterlegt und erhielt die ATCC-Bezeichnung 68211. Das 2,8 kb Fragment enthielt keine anderen Leseraster signifikanter Größe, was zeigt, dass das sequenzierte, in der Sequenz I. D. Nr. 3 gezeigte Leseraster die Ub-spezifische Protease codierte. Dieses neue Gen wurde UBP1 benannt, was für Ubiquitinspezifische Protease steht.
- Die Substratspezifität in vitro des UBP1 codierten Produkts wurde anhand verschiedener Substrate durch Testen auf Spaltung geprüft. Diese Versuche zeigten die Fähigkeit von UBP1 aus [³&sup5;S]Ub-Met-DHFR und [³&sup5;S]Ubiquitin-Methionin-β- Galactosidase (Ub-Met-βgal) Ubiquitin freizusetzen. Der Aufbau dieses [³&sup5;S]Ub- Met-βgal-Fusionsproteins wurde zuvor beschrieben (Bachmair u. a., Science 234, S. 179-186 (1986)). Die markierten Substrate wurden in einem Ubiquitinfreisetzungstest, wie zuvor beschrieben, eingesetzt. Beide Fusionsproteine wurden spezifisch von Ubiquitin befreit. Fluorogramme elektrophoretischer Muster von diesen Versuchen zur Freisetzung von Ubiquitin zeigten von Ubiquitin freigesetzte Reaktionsprodukte der erwarteten Molekülmasse.
- Es wurde auch gezeigt, dass die Protease UBP1 natürliche Ubiquitinfusionen in vitro unter Freisetzung von Ubiquitin und Erhalt von ribosomalen Hefeproteinen (Ubi2 und Ubi3) führten. Ein Ubi2 codierendes Expressionskonstrukt, eine natürliche Fusion von Ubiquitin und ribosomalem Protein von S. cerevisiae wurde zur Transformation von E. coli verwendet. Ein Zellextrakt einer Kultur der transformierten Zellen wurde mit einem E. coli-Extrakt aus UBP1 exprimierenden Zellen behandelt, gefolgt von einer Elektrophorese in einem Polyacrylamid-SDS-Gel, Blotten auf einer Polyvinylidendifluorid-Membran und einem Nachweis unter Verwendung eines Kaninchen-Antiubiquitin-Antikörpers mit nachfolgender Anwendung eines sekundären Ziegen-Antikaninchen-Antikörpers, gebunden an alkalische Phosphatase und farberzeugende Substrate alkalischer Phosphatase. Diese Versuche zeigten, dass ein Extrakt von E. coli, welches das UBP1-Genprodukt exprimiert, die natürlichen Ubiquitinfusionsproteine Ubi2 und Ubi3 wirksam von Ubiquitin befreite.
- Um zu ermitteln, ob ein Ubiquitinfusionsprotein vom Sandwichtyp, bei dem der Ubiquitinrest eine N-terminale Extension hatte, ein Substrat für UBP1 war, wurde ein Plasmid aufgebaut, das ein dreifaches Fusionsprotein codierte, welches aus einem Rest einer N-terminalen Dihydrofolat-Reduktase (DHFR), einer flexiblen Linkerregion von 3 Glycinresten und einem Serin bestand, gefolgt von Ubiquitin- und Met-βgalresten. Das Mäuse-DHFR-Gen wurde auf einem Fragment BamHI/HindIII aus einem Ub-Met-DHFR codierenden Plasmid (Bachmair und Varshavsky, Cell 56, S. 1019-1032 (1989)) isoliert. Dieses Fragment wurde mit Klenow PolI zum Ausfüllen der Enden behandelt, und KpnI-Linker wurden ligiert. Das Fragment wurde sodann mit KpnI unter Erhalt eines 678 bp Fragments geschnitten, das in die Stelle KpnI in einem modifizierten Ub-Met-βgal-Expressionsvektor geklont war, in welchem das zweite Codon des Ubiquitinrestes verändert war, um eine KpnI-Stelle zu codieren (Gonda u. a., J. Biol. Chem. 264, S. 16700-16712 (1989)). Dieses Verfahren führte zu einem Plasmid, das DHFR, Ubiquitin (ohne das anfängliche Codon Met) und Met-βgal codierte, wobei die offenen Leseraster für jeden Rest noch nicht in ein einziges offenes Leseraster ausgerichtet waren. Um die Ausrichtung der offenen Leseraster zu bewirken und das Initiatorcodon bezüglich des Promotors GAL in dem Vektor in die richtige Lage zu bringen, wurde an zwei Stellen im Plasmid eine stellengerichtete Mutagenese durchgeführt.
- Das Plasmid wurde mit BamHI und HindIII geschnitten, und das ~2,76 kb Fragment, das DHFR, Ubiquitin und die ersten wenigen Reste von Met-βgal codiert, wurde in M13mp19 geklont, welches mit den gleichen Enzymen geschnitten worden war. Die Oligonucleotid-vermittelte, stellengerichtete Mutagenese wurde unter Verwendung des einsträngigen M13-Derivats und von Standartprotokollen durchgeführt. Das erste Oligodeoxynucleotid war dazu bestimmt, eine 20 bp Deletion herbeizuführen, welche das Initiatorcodon von DHFR bezüglich des Promotors GAL5 des Vektors in richtige Stellung bringt. Das zweite Oligodeoxynucleotid war dazu bestimmt, die Leseraster von DHFR und Ubiquitin zusammenzubringen und den 4-Reste-Spacer (-Gly-Gly-Gly-Ser-) zwischen den DHFR- und Ubiquitinrest einzufügen. Nach Mutagenese wurden die DNA-Klone auf die Einverleibung beider Veränderungen durch ein direktes Nucleotidsequenzieren unter Verwendung der Kettenterminationsmethode getestet.
- Doppelsträngige, replikative Form (RF) des erwünschten Klons M13 wurde isoliert und mit BamHI und XhoI digeriert. Das erhaltene ~1,2 kb Fragment wurde in das ~9,87 kb Fragment eines Ub-Met-βgal-Expressionsvektors, digeriert mit den gleichen Enzymen, geklont, wobei das Ub-Met-codierende Fragment durch das DHFR-Ub-Met-codierende, durch stellengerichtete Mutagenese hergestellte Fragment ersetzt wurde. Diese letzte Stufe führte zu einem Expressionsvektor, der das dreifache Fusionsprodukt DHFR-Ub-Met-βgal codierte. Der Vektor wurde pJTUP genannt (Fig. 2).
- pJTUP wurde benutzt, um zu testen, ob eine Ubiquitinfusion, bei der der Ubiquitinrest zwischen den beiden Nicht-Ubiquitinresten liegt, ein Substrat für die Spaltung durch UBP1 sein würde. In metabolisch mit [³&sup5;S]Methionin markierter E. coli wurde das Schicksal von exprimiertem DHFR-Ub-Met-βgal in Gegenwart oder Abwesenheit von UBP1 unter Anwendung der Immunopräzipitation mit einem monoklonalen Antikörper gegenüber β-Galactosidase ermittelt, gefolgt von Poly acrylamid-SDS-Gelelektrophorese und Fluorographie. Diese Versuche zeigten, dass UBP1 das Dreifachfusionsprotein spaltete.
- Die Fähigkeit, ein derartiges Sandwichkonstrukt zu spalten, ist besonders in Situationen brauchbar, wo der erste Nicht-Ubiquitinrest eine gewisse erwünschte Eigenschaft der Sandwich-Ubiquitinfusion verleiht. Beispielsweise kann der erste Nicht-Ubiquitinrest die Affinitätsreinigung des Ubiquitinfusionsproteins erleichtern. In einem derartigen Fall kann das Fusionsprotein in einer Zelle (z. B. E. coli) exprimiert werden, welcher Ubiquitin-spezifische Proteasen fehlen, und ein Zelllysat kann über eine für den ersten Nicht-Ubiquitinrest spezifische Affinitätssäule geleitet werden. Ein Beispiel für ein Protein, das für die Affinitätsreinigung brauchbar ist, ist Streptavidin. Im Anschluß an die Affinitätsreinigung des Fusionsproteins wird das letztere mit der Ubiquitin-spezifischen Protease in Berührung gebracht. Der zweite Nicht-Ubiquitinrest wird hierdurch aus dem Ubiquitinfusions- Sandwichkonstrukt freigesetzt.
- Die zum Klonen der Ub-spezifischen Proteasen von S. cerevisiae codierenden Gene, die sich von UBP1 und Yuh1 unterscheiden, angewandte Strategie profitiert von der Tatsache, dass Bakterien, wie z. B. E. coli, Ubiquitin und Ub-spezifische Enzyme fehlen, und es lag ihr auch der neuerliche Nachweis zugrunde, dass die N-Terminus-Regel, eine Beziehung zwischen der in vivo Halbwertzeit eines Proteins und der Identität seines N-terminalen Rests, nicht nur in Eukaryonten, sondern auch in E. coli gilt. In Eukaryonten werden Ubiquitinfusionen an Testproteine wie β-Galactosidase, durch Ub-spezifische Verarbeitungsproteasen ungeachtet der Identität, eines Rests an der Ub-βgal-Verbindung von Ubiquitin befreit, was es möglich macht, unterschiedliche Reste an den N-Termini von sonst identischen Testproteinen in vivo aufzudecken. Diese Technik, die zum Nachweis und zur Analyse der N-Terminus-Regel in Eukaryonten erforderlich ist, wurde durch Isolierung des Hefegens UBP1 (vgl. Beispiel 1) in Bakterien anwendbar, insofern als mit UBP1 transformierte E. coli die Fähigkeit erwirbt, Ubi quitinfusionen von Ubiquitin zu befreien. Die Entdeckung, dass ein X-βgal- Testprotein, wie z. B. Arg-βgal, in E. coli kurzlebig ist, während Ub-Arg-βgal langlebig ist, machte ein neues auf E. coli basierendes in vivo Screening für Ub- spezifische Proteasen möglich. E. coli, die das (langlebige) Fusionsprotein Ub- Arg-βgal exprimieren, bilden auf X-Gal, ein chromogenes Substrat von βgal, enthaltenden Platten blaue Kolonien. Wenn jedoch in den Zellen ebenfalls eine Ubiquitin freisetzende Aktivität vorliegt, wird Ub-Arg-βgal in kurzlebiges Arg-βgal umgewandelt, dessen niederer Fließgleichgewichtsgrad (steady-state level) zu wießen E. coli-Kolonien auf X-Gal-Platten führt.
- Um nach dieser Strategie unter Verwendung einer herkömmlichen genomischen Hefe-DNA-Bibliothek klonierbar zu sein, muss ein Hefegen einen Promotor haben, der in E. coli funktioniert (eine Minderheit von Hefepromotoren kann das tun), es müssen ihm Intronen in seiner Codierungsregion fehlen (den meisten Hefegenen fehlen Intronen), und es muss eine Ub-spezifische Verarbeitungsprotease codieren, welche als ein Monomer oder ein Homooligomer funktioniert. Ein Vorteil dieses in vivo Screenings über das bislang angewandte in vitro Screening, das zu UBP1 führte, ist, dass ersteres eine relevante Protease erfordert, die in vivo, jedoch nicht notwendigerweise in vitro (in E. coli-Extrakten) wirksam sein muss.
- Das Ub-Arg-βgal exprimierende Plasmid pACUb-R-βgal wurde durch Subklonen des ~5 kb ScaI-Fragments von pUB23-R [Bachmair u. a., Science 234, S. 179-186 (1986)] aufgebaut, das die Ub-Arg-βgal-Codierungsregion stromabwärts von dem Promotor GAL10 enthält, in mit HincII digeriertem pACYC184, dessen Ursprung P15A der Replikation dieses Plasmids mit E. coli-Vektoren auf Grundlage von pMB1 (ColE1), wie z. B. pUC19 und pBR322, kompatibel macht. pACUb-R-βgal exprimierte Ub-Arg-βgal in E. coli aus dem galactoseinduzierbaren Hefepromotor GAL10, der eine Funktion als schwacher konstitutiver Promotor in E. coli ausübt. Das Ub-Met-βgal exprimierende Plasmid pACUb-M-βgal wurde iden tisch mit pACUb-R-βgal, jedoch mit der Ausnahme aufgebaut, dass anstelle von pUB23-R pUB23-M verwendet wurde. Die Plasmide pKKUBI2, pKKUBI3 und pUB17 exprimierten in E. coli die natürlichen Hefeubiquitinfusionen (Ubiquitinvorläufer) Ubi2, Ubi3 bzw. Ubi4 (Polyubiquitin) (Ozkaynak u. a., EMBO J. 6, S. 1429- 1439 (1987)), wobei man ein Isopropylthiogalactosid- (IPTG-) induzierbaren Promotor in dem Vektor pKK223-3 benutzte (Ausubel u. a., Current Protocols in Molecular Bioloav, J. Wiley & Sons, N. Y. (1989)). Die Plasmide pKKHUb2 bzw. pK- KHUb3, welche exprimierten, das menschliche Diubiquitin und Triubiquitin (welche beide die natürlich auftretende C-terminale 1-Restextension, Cystein, enthalten), wurden wie folgt aufgebaut. Ein 1,77 kb BamHI-Fragment mit einem Gehalt an dem menschlichen UbB-Gen (Triubiquitingen) aus dem Plasmid pB 8,3 wurde in BamHI-digeriertes pUC19 in der Richtung legiert, die das 3'-Ende von UbB in Nachbarschaft zur Stelle SmaI des Polylinkers in pUC19 brachte, was zu pUbB führte. Ein 1,04 kb Fragment DraI/SmaI von pUbB mit einem Gehalt an der UbB-Codierungsregion und an der flankierenden Region 3' (die Stelle DraI liegt 10 bp stromaufwärts des UbB-Startcodons) wurde in das SmaI/HincII-digerierte pUC19 subgeklont, wobei das UbB-Startcodon in Nachbarschaft zur Stelle EcoRI im Polylinker gebracht wurde, was zu pHUb3 führte. Dieses Plasmid wurde partiell mit SalI digeriert, welches innerhalb jedes Ub-codierenden repeat's einmal spaltet (die Stelle SalI des Polylinkers wurde während des Aufbaus von pHUb3 entfernt); das den Vektor enthaltende Fragment, dass die beiden Ub-codierenden repeats zurückhielt, wurde isoliert und mit sich selbst legiert, was zu pHUb2 führte. Die inserts von pHUb2 und pHUb3 wurden mit EcoRI und PstI herausgeschnitten und in EcoRI/PstI-geschnittenes pKK223-3 subgeklont, was zu pKKH-Ub2 bzw. pKKHUb3 führte. Das Startcodon der Ub-codierenden Region in diesen Plasmiden liegt 36 bp stromabwärts der Shine-Dalgarno-Sequenz in pKK223-3.
- Bakterien E. coli, welche ein Ub-Arg-βgal-exprimierendes Plasmid trugen, wurden mit der genomischen S. cerevisiae DNA-Bibliothek RB237, getragen im Plasmid YCp50, transformiert, auf X-Gal-Platten mit einem Gehalt an für die Anwesenheit beider Plasmide ausgewählten Antibiotika plattiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Von ~800 derart gescreenten Kolonien waren 6 (pRBW1 bis pRBW6 benannte) Kolonien weiß oder fahlblau, während die anderen Kolonien dunkelblau waren (vergleichbar mit Kontrollkolonien von E. coli, transformiert mit dem Vektor YCp50 allein). 3 der 6 Kandidatenkolonien erwiesen sich als fälschlicherweise positiv, 2 enthielten Plasmide (pRBW1 und pRBW6 benannt) mit sich überlappenden inserts von Hefe-DNA, während die restliche Kolonie ein Plasmid (pRB- W2 benannt) mit einem unterschiedlichen Hefe-DNA-insert enthielt. Die Plasmide pRBW1 und pRBW2 wurden isoliert und in E. coli unter Exprimierung von entweder Ub-Arg-βgal oder Ub-Met-βgal retransformiert. Die Ub-Arg-βgal exprimierenden Transformanten bildeten auf X-Gal-Platten weiße Kolonien, was die ursprünglichen Ergebnisse bestätigt, während die Ub-Met-βgal exprimierenden Transformanten auf diesen Platten blaue Kolonien bildeten, was anzeigt, dass die metabolische Destabilisierung von Ub-Arg-βgal durch inserts in pRBW1 und pRBW2 N-Terminusregel-spezifisch war. (Arg und Met sind destabilisierende bzw. stabilisierende Reste in der E. coli-N-Terminusregel).
- Überraschenderweise waren Extrakte von E. coli, welche pRBW1 oder pRBW2 trugen, in einen in vitro Test auf Ubiquitinfreisetzung mit Ub-Met-DHFR inaktiv, was nahelegt, dass durch pRBW1 und pRBW2 codierte Ub-spezifische Proteasen entweder in Zellextrakten inaktiviert waren oder aber Ubiquitin aus Ubiquitinfusionsprodukten cotranslational, jedoch nicht posttranslational, freigeben konnten. Die E. coli durch pRBW1 und pRBW2 verliehenen Ub-spezifischen Proteaseaktivitäten wurden infolgedessen in vivo durch pulse-chase-Analysen mit Ub-Met-βgal unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen βgal getestet. Die Ergebnisse bestätigten, dass pRBW1 und pRBW2 (jedoch nicht der Vektor YCp50 allein) E. coli die Aktivität der Ubiquitinfreisetzung verliehen. Eine nachfolgende Überexpression von Ub-spezifischen Proteasen, codiert durch pRBW1 und pRBW2 machte auch ihren Nachweis in E. coli-Extrakten möglich.
- Die ORF-codierende Aktivität der Ubiquitinfreisetzung von pRBW2 wurde durch Subklonungsversuche und Nukleotidsequenzierung identifiziert und als das UBP2-Gen bezeichnet (vgl. Fig. 3 und Sequenz I. D. Nr. 5). Die Lage des Startcodons (ATG-Codon) im UBP2 wurde so gefolgert, dass es zur längsten (3715 bp) ORF führt, welche ein saures (berechneter pI-Wert: 4,95), Protein mit 1264-Resten (145 kDa) codiert.
- Die ORF, welche die Ubiquitin freisetzende Protease von pRBW1 codiert, wurde durch Subklonungsversuche und Nukleotidsequenzierung identifiziert und als das UBP3-Gen bezeichnet (vgl. Fig. 4 und Sequenz I. D. Nr. 7). Die Lage des Startcodons (ATG-Codon) wurde so gefolgert, dass es zur längsten (2736 bp) ORF führt, die ein schwach basisches (berechneter pI-Wert: 7,92) Protein mit 912-Resten (102 kDa) codiert. Ein diese ORF enthaltendes Plasmid (pRB143) stromabwärts eines E. coli-Promotors verlieh E. coli eine Ubiquitin freisetzende Wirksamkeit.
- Die zuvor aufgebauten Plasmide pJT70 (auf Basis von pUC19) und pJT184 (auf Basis von pACYG184) exprimierten Hefe-UBP1 in E. coli aus dem Hefe-UBP1- Promotor, der in E. coli schwach aktiv ist. Obgleich ein 1,9 kb HindIII-Subklon von pRBW2 E. coli eine Ubiquitin freisetzende Wirkung verlieh, enthielt es lediglich die Hälfte 3' von UBP2-ORF. Vorversuche zeigten, dass das beschnittene Ubp2- Protein zu verschiedenen Graden der Ubiquitin freisetzenden Wirksamkeit in Extrakten von E. coli führte. Zum Aufbau eines Plasmids, das Ubp2 in E. coli in voller Länge exprimierte, wurde ein 5'-Teil von UBP2, isoliert als das 1,56 kb HindIII-/XbaI-Fragment von pRB6 (vgl. Fig. 3) in pRS316 (Sikorski und Hieter, Genetics 122, S. 19-27 (1989)) subgeklont, welches einen Polylinker enthält, unter Plazierung einer EcoRI-Stelle in Nachbarschaft zur Stelle HindIII in UBP2. Das erhaltene insert wurde sodann als das 1,57 kb EcoRI-/XbaI-Fragment herausgeschnitten. Ein 3'-Teil von UBP2 wurde als das ~3,4 kb XbaI/BamHI-Fragment von pRB11 (vgl. Fig. 3) isoliert und in pRS316 subgeklont, unter Plazierung einer PstI-Stelle in Nachbarschaft zur Stelle BamHI in UBP2. Das erhaltene insert wurde sodann als ein ~3,4 kb XbaI/PstI-Fragment herausgeschnitten. Die ses Fragment und das zuvor genannte Fragment 1,57 kb EcoRI/XbaI wurden in das EcoRI/XbaI-beschnittene pKK223-3 ligiert, was (neben anderen Produkten) zum Plasmid pRB105 führte, das UBP2 in der richtigen Lage enthielt, nämlich 50 bp stromabwärts von der Shine-Dalgarno-Sequenz von pKK223-3. Für Versuche, welche die gleichzeitige Anwesenheit zweier unterschiedlicher Plasmide in E. coli erforderten, wurde die UBP2/rrnB-Terminatorregion von pRB105 als das Fragment ~6,4 kb Sph/ScaI herausgeschnitten und in SphI/EcoRV-beschnittene pACYC184 subgeklont, was zu pRB173 führte.
- Da in den Anfangsversuchen die Ubiquitin-spezifische Proteaseaktivität von Ubp3 in vivo, jedoch nicht in Extrakten von E. coli nachgewiesen werden konnte, wurde ein UBP3-überexprimierendes Plasmid aufgebaut. Das ~2,9 kb KpnI/DraI- Fragment von pRB27, das das gesamte UBP3-Gen enthielt, wurde in das KpnI/HincII-geschnittene pUC19 subgeklont, wobei die Stellen EcoRI und PstI des Plasmids nahe der Stelle KpnI bzw. der Stelle DraI des eingeführten inserts plaziert wurden. Das insert wurde sodann mit EcoRI/PstI herausgeschnitten und in das EcoRI/PstI-geschnittene pKK223-3 subgeklont, was zu pRB143 führte, das UBP3 in der richtigen Ausrichtung enthielt, 50 bp stromabwärts von der Shine- Dalgarno-Sequenz von pKK223-3. Für Versuche, welche die gleichzeitige Anwesenheit zweier unterschiedlicher Plasmide in E. coli erforderten, wurde die UBP3/rrnB-Terminatorregion von pRB143 als das ~4,2 kb SphI/ScaI-Fragment herausgeschnitten und in das SphI/EcoRV-geschnittene pACYC184 subgeklont, was zu pRB175 führte.
- In neueren Versuchen wurden UBP1, UBP2 und UBP3 in E. coli von einem Expressionsvektor auf Basis von pKK überexprimiert (Ausubel u. a., Current Protocols in Molecular Bioloav, J. Wiley & Sons, N. Y. (1989)). Jedes der UBP-Proteine wurde auf einen Grad exprimiert, wo es einen wesentlichen Anteil (1-5%) des gesamten Zellproteins umfasste.
- Die Sequenzausrichtung (alignment) des 809-Rest-Ubp1, 1264-Rest-Ubp2 und des 912-Rest-Ubp3 zeigte das Fehlen einer Gesamtsequenzähnlichkeit zwischen diesen Proteinen sowie das Vorliegen von zwei kurzen Regionen einer statistisch signifikanten Ähnlichkeit, welche in jeder der Ubp-Proteasen wenige 100 Reste beabstandet waren. Die beiden Bereiche mit Ähnlichkeit sind um einen Rest Cys und 2 Reste His konzentriert. Wie bei Ubp1 gesehen wurde, haben weder Ubp2 noch Ubp3 signifikante Sequenzähnlichkeiten mit der vierten Ub-spezifischen Protease von Hefe, Yuh1 oder deren Säugetierhomologen. Die Region in Yuh1 und deren Säugetierhomologen, die einen mutmaßlichen Aktivstellenrest Cys enthält, ist nicht der konservierten "Cys"-Region von Ubp1 bis Ubp3 ähnlich: Abgesehen vom Rest Cys ist in allen 6 Proteinen nur eine andere Restestellung durch einen identischen Rest (Asn) belegt. Bei einer analogen Ausrichtung der beiden konservierten Reste His in Yuh1-ähnlichen Proteasen mit einem der konservierten Reste His in Ubp1 bis Ubp3 sind derartige Identitäten nicht zu sehen.
- Die zuvor charakterisierte Protease Ubp1 kann in vitro aus den verschiedensten linearen Ubiquitinfusionsproteinen Ubiquitin wirksam freisetzen, einschließlich aus den natürlichen Ubiquitinvorläufern Ubi1 bis Ubi3 und synthetisierten Fusionsprodukten, wie z. B. Ub-X-βgal und Ub-X-DHFR. Ähnliche Tests, bei denen ein Extrakt von E. coli, der ein Plasmid auf Basis eines Überexpressionsvektors trägt, das entweder Ubp2 (pRB105), Ubp3 (pRB143) oder Yuh1 (pKKYUH1) exprimiert, mit Ub-enthaltenden Testproteinen inkubiert wird, wurden angewandt, um in vitro die Substratspezifizität dieser Proteasen zu analysieren. Bei diesen Tests wurden auch Extrakte von E. coli verwendet, welche das UBP1-exprimierende Plasmid pJT70 oder den Vektor allein tragen. Die Spaltungsprodukte wurden durch SDS- PAGE fraktioniert und durch Immunoblotten unter Verwendung von Anti-Ub- Antikörpern oder mit gereinigten, ³&sup5;S-markierten Testproteinen direkt durch Fluorographie sichtbar gemacht.
- Bei diesen in vitro-Tests setzte die Protease Ubp2 aus Ub-Met-βgal und Ub-Met- DHFR sowie aus Ubi2 und Ubi3, den natürlichen Vorläufern von Ubiquitin, in denen dieses an spezifische ribosomale Proteine fusioniert ist, wirksam Ubiquitin frei. Sowohl Ubp1 als auch Ubp2 gaben den Rest Cys aus Ub-Ub-Cys (Diubiquitin, das eine C-terminale Extension mit einem Rest trägt) frei, waren jedoch nicht in der Lage, an der Bindung Ub-Ub in Ub-Ub-Cys zu spalten. Ebenso wenig waren Ubp1 und Ubp2 in der Lage, an der Bindung Ub-Ub im Hefe-Polyubiquitin zu spalten, einem natürlichen Ubiquitinvorläufer mit einem Gehalt an 5 Kopf-zu- Schwanz-Ubiquitin-repeats, wie es zuvor für Ubp1 berichtet wurde. Somit spalteten Ubp1 und Ubp2 wirksam in vitro nach dem letzten Rest (Gly&sup7;&sup6;) von Ubiquitin bei allen den getesteten Ubiquitinfusionen, wobei die Bindung Ub-Ub in Polyubiquitinen die einzige Ausnahme ist. Jedoch sind, wie nachfolgend gezeigt wird, diese Proteasen in der Lage, Polyubiquitin zu spalten, wenn es mit E. coli coexprimiert wird.
- Obgleich die Expression von Ubp3 in E. coli aus dem auf dem pKK Überexpressionsvektor basierenden Plasmid pRB143 zu einer wesentlichen Überproduktion eines Proteins mit der erwarteten Molekülmasse führte, fehlte Extrakten aus Ubp3-exprimierenden E. coli eine Aktivität der Freisetzung von Ubiquitin. Da Ubp3 in vivo in E. coli sicher aktiv ist, ist es entweder in Zellextrakten inaktiviert oder in der Lage, Ubiquitinfusionen ausschließlich während oder kurz nach ihrer ribosomenvermittelten Synthese zu spalten. In Übereinstimmung mit früher berichteten Entdeckungen setzten Extrakte von Yuh1 exprimierenden E. coli aus kurzen Ubiquitinfusionen, wie z. B. Ubi2 und Ubi3, Ubiquitin frei. Jedoch war Yuh1 gegenüber dem größeren Fusionsprodukt Ub-Met-DHFR (einer C-terminalen Extension von Ubiquitin mit 229-Rest) viel weniger aktiv, wobei es höchstens etwa 50% des Fusionsprodukts von Ubiquitin befreite, auch nach einer verlängerten Inkubation, und war tatsächlich gegenüber Ub-Met-βgal (Sequenz I. D. Nr. 1) inaktiv.
- Wie aufgrund ihrer Aktivitäten in E. coli-Extrakten zu erwarten war, waren Ubp1, Ubp2 und Yuh1 in vivo gegenüber den natürlichen Ubiquitinfusionen Ubi2 und Ubi3 aktiv. Ubp3, das in E. coli-Extrakten inaktiv war, setzte aus Ubi2 und Ubi3, wenn mit diesen in E. coli coexprimiert wurde, Ubiquitin wirksam frei. Während Ubp1 und Ubp2 nicht in der Lage waren, in vitro an der Bindung Ub-Ub in Polyubiquitinen zu spalten, waren beide gegenüber Hefe-Polyubiquitin aktiv, wenn man mit diesem in E. coli coexprimierte. Im Gegensatz hierzu war unter den gleichen Bedingungen die Protease Ubp3 gegenüber Polyubiquitin inaktiv, während sie in vivo gegenüber Ubiquitinfusionen, wie z. B. Ubi2 und Ubi3, aktiv war. Diese Unterschiede zwischen Ub-spezifischen Verarbeitungsproteasen zeigen feine Unterschiede in ihren Erfordernissen für die Konformation von Proteindomänen in Nachbarschaft von Ub-X-Peptidbindungen. An die Freisetzung von Ubiquitin aus Ubiquitinfusionen, wie z. B. Ub-Met-βgal, durch Ubp2 und Ubp3 schloss sich eine pulse-chase-Analyse an, teilweise, um die Ergebnisse des ursprünglichen X-Gal- Screenings zu bestätigen. Wie erwartet setzten beide Proteasen in vivo aus Ub- Met-βgal Ubiquitin frei, jedoch mit der Ausnahme, dass die Spaltung durch Ubp3 unvollständig war, und ein signifikanter Anteil von pulsmarkiertem Ub-Met-βgal, 15 Minuten nach dem pulse intakt blieb. Diese Ergebnisse stimmen mit dem Muster der Ubiquitinfreisetzung durch Ubp3 überein, die strikter cotranslational als diejenige durch Ubp2 ist. Bei einem ähnlichen pulse-chase-Versuch war Yuh1 nicht in der Lage, aus Ub-Met-βgal in vivo Ubiquitin freizusetzen, was zeigt, dass eine offensichtlich größere Empfindlichkeit der Ub-Met-Peptidbindung in einem naszierenden (im Gegensatz zu reifem) Ub-Met-βgal unzureichend ist, um aus ihm eine Freisetzung von Ubiquitin durch Yuh1 zu erreichen. Im Gegensatz hierzu ist dieser Unterschied ausreichend, um eine cotranslationale (aber offensichtlich nicht posttranslationale) Freisetzung von Ubiquitin aus Ub-Met-βgal durch Ubp3 zu erreichen.
- (i) ANMELDER: Baker, Rohan T. Tobias, John W. Varshavsky, Alexander
- (ii) TITEL DER ERFINDUNG: Ubiquitin-spezifische Proteasen
- (iii) ANZAHL VON SEQUENZEN: 8
- (iv) KORRESPONDENZADRESSE:
- (A) ADRESSAT: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P. C.
- (B) STRASSE: Two Militia Drive
- (C) STADT: Lexington
- (D) STAAT: Massachusetts
- (E) LAND: U. S. A.
- (F) ZIP: 02173
- (v) COMPUTERLESBARE FORM:
- (A) ART DES MEDIUMS: Floppy disk
- (B) COMPUTER: IBM PC compatible
- (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
- (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
- (vi) LAUFENDE ANMELDUNGSDATEN:
- (A) ANMELDUNGSNUMMER:
- (B) EINREICHUNGSDATUM:
- (C) KLASSIFIZIERUNG:
- (vii) DATEN DER FRÜHEREN ANMELDUNG:
- (A) ANMELDUNGSNUMMER: 07/789,915
- (B) EINREICHUNGSDATUM: 08. November 1991
- (viii) INFORMATION ÜBER DEN ANWALT/AGENTEN:
- (A) NAME: Brook, David E.
- (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 22,592
- (C) BEZUG/AKTENNUMMER: MIT-5091AA
- (ix) INFORMATION ZUR TELEKOMUNIKATION:
- (A) TELEFON: 617-861-6240
- (B) TELEFAX: 617-861-9540
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 3366 Basenpaare
- (B) TYP: Nucleinsäure
- (C) STRANGART: doppelt
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ix) MERKMAL:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
- (B) LAGE: 1..3366
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ I. D. Nr. 1:
- (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 1121 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. I. D. Nr. 2:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 2845 Basenpaare
- (B) TYP: Nucleinsäure
- (C) STRANGART: Doppelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ix) MERKMAL:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
- (B) LAGE: 193..2620
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. I. D. Nr. 3:
- (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 809 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. I. D. Nr. 4:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 6008 Basenpaare
- (B) TYP: Nucleinsäure
- (C) STRANGART: Doppelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ix) MERKMAL:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
- (B) LAGE: 983..4776
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. I. D. Nr. 5:
- (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 1264 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. I. D. Nr. 6:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 4887 Basenpaare
- (B) TYP: Nucleinsäure
- (C) STRANGART: Doppelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ix) MERKMAL:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
- (B) LAGE: 1278..4015
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. I. D. Nr. 7:
- (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 912 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ. I.D. Nr. 8:
Claims (11)
1. Eine isolierte DNA,
die eine Ubiquitin-spezifische Protease codiert, welche durch
die Fähigkeit charakterisiert ist, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen
spezifisch mit DNA hybridisieren, die durch Sequenz ID Nr. 5 oder 7
repräsentiert ist, und welche Protease ein Ubiquitinfusions-Protein mit einem
Molekulargewicht von etwa 120 Kilodaltons spezifisch spaltet, wobei die
spezifische Spaltung in vitro oder in einer prokaryontischen Zelle zwischen dem
C-terminalen Rest des Ubiquitins und dem N-terminalen Rest des Proteins oder
des Peptids stattfindet, wobei das Fusionsprotein durch die in Sequenz ID Nr. 1
dargestellte DNA codiert wird.
2. Eine isolierte Ubiquitin-spezifische Protease, die durch die DNA des Anspruchs
1 codiert wird.
3. Eine isolierte Protease gemäß Anspruch 2, welche durch die in Sequenz ID Nr. 5
dargestellte DNA codiert wird.
4. Eine isolierte Protease gemäß Anspruch 2, welche durch die in Sequenz ID Nr. 7
dargestellte DNA codiert wird.
5. Ein isoliertes DNA-Expressionskonstrukt, welches eine biologisch aktive
Ubiquitin-spezifische Protease codiert, aufweisend eine DNA, die durch eine
Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenz ID Nr. 5 und
Sequenz-ID Nr. 7 charakterisiert ist.
6. Eine Zelle transformiert mit einem DNA-Expressionskonstrukt, welches eine
biologisch aktive Ubiquitin-spezifische Protease codiert, aufweisend eine DNA-
Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenz ID Nr. 5 und
Sequenz ID Nr. 7.
7. Eine Zelle gemäß Anspruch 6, welche auch einem zweiten
DNA-Expressionskonstrukt transformiert ist, welches Ubiquitin codiert, das an eine DNA-Sequenz
gebunden ist, welches ein Ubiquitinfusions-Protein oder ein Polypeptid von
Interesse mit einem vorbestimmten Aminosäurerest an seinem Aminoterminus
codiert, wobei das Ubiquitin proteolytisch durch eine Ubiquitin-spezifische
Endoprotease an der Verbindung mit dem Aminoterminus gespalten werden
kann, so daß eine Spaltung bei Exposition an dem vorbestimmten
aminoterminalen Rests des Proteins oder des Polypeptids von Interesse resultiert.
8. Eine Zelle gemäß Anspruch 6 oder Anspruch 7, welche eine prokaryontische
Zelle ist.
9. Eine Zelle gemäß Anspruch 6 oder Anspruch 7, welche eine E. coli ist.
10. Ein Verfahren zur Spaltung von Ubiquitin von einem Fusionsprotein zwischen
Ubiquitin und einem Nicht-Ubiquitin-Protein oder -Peptid aufweisend ein
Kontaktieren des Fusionsproteins mit einer Ubiquitin-spezifischen Protease
gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.
11. Ein Verfahren zur Spaltung von Ubiquitin von einem Sandwich-Fusions-Protein,
aufweisend ein Ubiquitin-Rest, der zwischen einem ersten Nicht-Ubiquitin-Rest,
beispielsweise Streptavidin und einem zweiten Nicht-Ubiquitin-Rest fusioniert ist,
wobei das Verfahren das Kontaktieren des Sandwich-Fusions-Protein mit einer
Ubiquitin-spezifischen Protease gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 umfaßt.
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|---|---|---|---|
| US07/789,915 US5212058A (en) | 1990-05-09 | 1991-11-08 | Nucleic acid encoding ubiquitin-specific proteases |
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