DE69131929T2

DE69131929T2 - Methoden zur trans-destabilisierung von spezifischen proteinen in vivo

Info

Publication number: DE69131929T2
Application number: DE69131929T
Authority: DE
Inventors: K. Gonda; Mark Hochstrasser; S. Johnson; J. Varshavsky
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1990-05-17
Filing date: 1991-05-14
Publication date: 2000-08-17
Anticipated expiration: 2011-05-15
Also published as: JPH05506360A; EP0532587A1; US5122463A; CA2079584A1; DK0532587T3; ATE188994T1; CA2079584C; JP3406314B2; ES2140390T3; WO1991018096A1; DE69131929D1; EP0532587B1; GR3033094T3

Description

Hintergrund der Erfindung

Ubiquitin, ein Protein mit 76 Resten, liegt in Eukaryonten entweder frei oder durch seinen Glycinrest mit endständiger Carboxylgruppe kovalent an verschiedene cytoplasmische, nukleare und integrale Membranproteine gebunden vor. Das Koppeln von Ubiquitin an derartige Proteine wird durch eine Familie von Ubiquitin-konjugierenden Enzymen (auch E2-Enzyme genannt) katalysiert. Die Tatsache, dass die Aminosäuresequenz von Ubiquitin bei Eukaryonten in einem Ausmaß konserviert ist, das bei bekannten Proteinen keine Parallelen findet, legte nahe, dass Ubiquitin eine grundlegende Zellfunktion vermittelt. Jedoch blieb die biologische Rolle von Ubiquitin bis verhältnismäßig unlängst ein Geheimnis.
Es wurde gefunden, dass Ubiquitin einer von mehreren Faktoren ist, welche für den ATP-abhängigen Proteinabbau in eukaryontischen Zellen erforderlich ist. Eine Funktion des intrazellulären Proteinabbaus, der größtenteils ATP-abhängig ist, ist die selektive Ausscheidung beschädigter oder sonstwie abnormer Proteine. Eine andere ist, unbeschädigten Proteinen, deren Konzentrationen in der Zelle als Funktionen der Zeit schwanken müssen, wie es z. B. bei vielen Regulatorproteinen der Fall ist, kurze Halbwertzeiten zu verleihen. Viele andere Proteine, während sie als Komponenten größerer makromolekularer Komplexe, wie z. B. Ribosome und oligomere Proteine, langlebig sind, sind in einem freien, nicht-assoziierten Zustand metabolisch instabil. (Der Begriff "metabolische Instabilität" impliziert eine verhältnismäßig kurze Halbwertzeit eines Proteins als eine physikalische Ganzheit in vivo, wobei das Adjektiv "metabolisch" benutzt wird, um diese Eigenschaft von einer "Stabilität" als solcher zu unterscheiden, die oftmals entweder eine Konformationsstabilität oder chemische Stabilität eines Proteins meint, jedoch nicht ihre Existenz als eine physikalische Ganzheit in vivo.)
Neuere Arbeiten zeigten, dass ein selektiver Abbau vieler kurzlebiger Proteine eine vorausgehende Stufe einer Ubiquitinkonjugation an ein proteolytisches Zielsubstrat erfordert. Es wurde vorgeschlagen, dass eine Rolle von Ubiquitin ist, als ein Signal für den Angriff von Proteasen zu dienen, welche für Ubiquitin-Protein- Konjugate spezifisch sind (Übersicht: vgl. Finley und Varshavsky, Trends Biochem. Sci. 10, S. 343-348 (1985)).
Dieses Verständnis ließ jedoch das Problem der Zielsetzung ungelöst: Wie werden intrazelluläre Proteine anfänglich als proteolytische Substrate erkannt? Mindestens einige kurzlebige Proteine werden als solche erkannt, weil sie Sequenzen (Abbausignale) enthalten, welche diese Proteine zu Substraten spezifischer proteolytischer Wege machen. Das erste Abbausignal, das in bestimmten Einzelheiten zu verstehen ist, umfasst zwei unterschiedliche Determinanten: Den Rest des Proteins mit endständiger Aminogruppe und einen speziellen internen Lysinrest (Bachmair u. a., Science 234, S. 179-186 (1986); Bachmair und Varshavsky, Cell 56, S. 1013-1032 (1989)). Die N-Terminus-Regel, ein Code, der die Stoffwechselstabilität des Proteins mit der Identität seines aminoterminalen Rests in Beziehung setzt (Bachmair u. a., Science 234, S. 179-186 (1986)), ist insofern allgemeingültig, als unterschiedliche Versionen der N-Terminus-Regel bei allen der geprüften eukaryontischen Organismen, von Hefe bis zu Säugetieren, funktionieren (Gonda u. a., J. Biol. Chem. 264, S. 16700-16712 (1989)).
Die zweite wesentliche Determinante des Abbausignals auf Basis der N-Terminus-Regel, im vorliegenden als zweite Determinante bezeichnet, ist ein spezieller innerer Lysinrest im Substratprotein, der als die Stelle der Verknüpfung mit einer Multiubiquitinkette dient. Die Bildung der Multiubiquitinkette an einem kurzlebigen Zielprotein ist für den nachfolgenden Abbau des Proteins wesentlich (Fig. 1). Die enzymatische Konjugation von Ubiquitin an andere Proteine umfasst die Bildung einer Isopeptidbindung zwischen dem carboxylterminalen Glycinrest von Ubiquitin und der &epsi;-Aminogruppe eines Lysinrests in einem Akzeptorprotein. In einer Multiubiquitinkette dient Ubiquitin selbst als ein Akzeptor, wobei mehrere Ubiquitinreste nacheinander an ein anfängliches Akzeptorprotein unter Bildung einer Kette aus verzweigten Ubiquitin-Ubiquitin-Konjugaten gebunden sind (Chau u. a., Science 243, S. 1576-1583 (1989)).
Die Aufklärung der fundamentalen Regeln, welche die Stoffwechselstabilität von Proteinen in Zellen beherrschen, und insbesondere das Entziffern des Abbausignals auf Basis der N-Terminus-Regel machte die Manipulation von Proteinen möglich, um ihre Halbwertzeiten in vivo zu variieren (Bachmair und Varshavsky, Cell 56, S. 1019-1032 (1989)). Ein detaillierteres Verständnis dieser Abbausignale, deren Komponenten und ihrer Wechselbeziehungen ist notwendig, um das volle Potential dieser wirkungsvollen Methodik zu realisieren.

Zusammenfassung der Erfindung

Vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Stoffwechselstabilisierung eines Proteins oder Peptids von Interesse (d. h. das Abzielen auf ein Protein oder Peptid für den Abbau). Das Protein oder Peptid von Interesse [in den Patentansprüchen als "zielaffines Protein bzw. Peptid" bezeichnet] muß eine zweite Determinante des Abbausignals auf Basis der N-Terminus- Regel enthalten. Das Verfahren umfasst das In-Berührung-Bringen des Proteins oder Peptids von Interesse mit einem Zielprotein oder -peptid, welches mit dem Protein oder Peptid von Interesse in Wechselwirkung tritt. Das Zielpeptid oder - protein zeichnet sich dadurch aus, dass es eine destabilisierende Aminosäure mit endständiger Aminogruppe gemäß der N-Terminus-Regel des Proteinabbaus besitzt, dass ihm jedoch eine zweite Determinante des Abbausignals auf Basis der N-Terminus-Regel fehlt.
Gemäß einem ersten Aspekt vorliegender Erfindung wird ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß Patentanspruch 1 zur Verfügung gestellt. Gemäß einem zweiten Aspekt vorliegender Erfindung wird das Verfahren gemäß Anspruch 2 bereitgestellt. Gemäß einem dritten Aspekt vorliegender Erfindung wird die Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls gemäß Anspruch 7 zur Verfügung gestellt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind das Protein oder Peptid von Interesse und das Zielpeptid oder -protein Untereinheiten oder Teile von Untereinhei ten des gleichen oligomeren Proteins in einer lebenden Zelle. Die Zelle wird mit einem exprimierbaren DNA-Konstrukt transformiert, dass ein Zielpeptid oder -protein codiert, welches eine destabilisierende aminoterminale Aminosäure gemäß der N-Terminus-Regel des Proteinabbaus besitzt, dem jedoch eine zweite Determinante des Abbausignals auf Basis der N-Terminus-Regel fehlt.
Ein Verfahren zur Bildung eines Zielpeptids oder -proteins mit einem destabilisierenden Aminosäurerest mit endständiger Aminogruppe ist die Transformation einer eukaryontischen Zelle mit einem exprimierbaren DNA-Konstrukt, umfassend Ubiquitin, welches in Phase an eine DNA-Sequenz fusioniert ist, die ein Peptid oder Protein codiert, das spezifisch mit dem Protein oder Peptid von Interesse in Wechselwirkung tritt.
Die im vorliegenden beschriebenen Verfahren erleichtern die Stoffwechseldestabilisierung eines Proteins oder Peptids von Interesse. Ein Erfordernis des Verfahrens ist, dass es notwendig ist, ein Peptid oder Protein, das spezifisch in Wechselwirkung mit dem Protein oder Peptid von Interesse tritt, zu identifizieren. Weil nahezu alle Proteine spezifisch mit anderen Proteinen in Wechselwirkung treten, ist dies ein breites Anwendungsverfahren zur Stoffwechseldestabilisierung eines Proteins oder Polypeptids von Interesse.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 ist ein Diagramm, welches die Organisation mit zwei Determinanten des Abbausignals auf Basis der N-Terminus-Regel in einem monomeren Protein zeigt, wobei d und s einen destabilisierenden bzw. stabilisierenden aminoterminalen Rest bezeichnen, und die an Lysin als zweite Determinante (K) gebundenen schwarzen Ovale eine Multiubiquitinkette bezeichnen.
Fig. 2 ist ein Diagramm, dass die cis- und trans-Erkennung auf dem Weg der N- Terminus-Regel veranschaulicht.
Fig. 3 ist ein Schaubild, welches die Verwendung von Ubiquitin-Proteinfusionen, wie z. B. Ub-X-βgal, veranschaulicht, um Testproteine mit zuvor festgelegten ami noterminalen Resten zu bilden.
Fig. 4 ist ein Schaubild, das die Anwendung einer trans-Erkennung zur Stoffwechseldestabilisierung eines Proteins von Interesse veranschaulicht.
Fig. 5 ist ein Diagramm, welches die Verwendung von Peptiden mit einer Aminosäuresequenz, die mit einem Teil der Aminosäuresequenz eines Proteins von Interesse identisch oder im wesentlichen Homolog ist, zur Stoffwechseldestabilisierung eines Proteins von Interesse in vivo veranschaulicht.
Fig. 6 ist ein Diagramm, welches die Anwendung eines genetischen Screenings zur Identifizierung von Polypeptiden mit einer Aminosäuresequenz veranschaulicht, welche mit einem Teil der Aminosäuresequenz eines Proteins von Interesse identisch oder im wesentlichen zu diesem homolog ist, das im Stoffwechsel das Protein von Interesse in vivo destabilisiert.
Fig. 7 ist ein Schaubild, das mehrere genetische Konstrukte und ihre Verwendung beim Zergliedern des Abbausignals auf Basis der N-Terminus-Regel veranschaulicht.
Fig. 8 ist ein Schaubild, dass die ATP-abhängige Ubiquitinierung und den Abbau von X-βgal-Homotetrameren im Reticulocytenextrakt veranschaulicht.
Fig. 9 ist ein Diagramm, welche die ATP-abhängige Ubiquitinierung und den Abbau von X-βgal-Heterotetrameren im Reticuloytenextrakt veranschaulicht.
Fig. 10 ist ein Diagramm, welches den trans-erkennungsabhängigen Abbau von X-βgal-Subeinheiten mit einem stabilisierenden aminoterminalen Rest veranschaulicht.
Fig. 11 ist ein Diagramm, welches die Stoffwechselinstabilität eines α2-βgal-Fusionsproteins zeigt.
Fig. 12 ist ein Schaubild, das zeigt, das der α2-Repressor in vivo kurzlebig ist.
Fig. 13 ist ein Schaubild, dass die Ergebnisse der Deletionsanalyse von Abbausignalen in α2-βgal veranschaulicht.
Fig. 14 ist ein Schaubild, dass die Isolierung von S. cerevisiae-Mutanten veranschaulicht, welche bei einem α2-Abbau defekt sind.
Fig. 15 ist ein Schaubild, welches zeigt, dass zwei Abbausignale in α2 auf verschiedenen Wege anvisiert werden.
Fig. 16 ist ein Diagramm, welche das Muster von in vivo Untereinheitmischversu chen veranschaulicht.
Fig. 17 ist ein Schaubild, das zeigt, dass der Abbau eines oligomeren Proteins Subeinheit-spezifisch ist.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die in vorliegender Anmeldung offenbarte Erfindung betrifft eine neue Klasse von Verfahren zum Manipulieren der Stoffwechselstabilität eines Proteins oder Polypeptids von Interesse. Die Begriffe "Protein", "Polypeptid" und "Peptid" werden oft auf dem Fachgebiet untereinander austauschbar benutzt, wobei "Peptide" bisweilen, jedoch nicht immer, sich auf verhältnismäßig kurze Polypeptide mit einer Größenordnung von -50 Reste oder weniger bezieht. Im vorliegenden wird unter dem Begriff "Protein" gemeint, dass er sowohl Proteine als auch Polypeptide umfasst, während unter dem Begriff "Peptid" gemeint wird, dass er verhältnismäßig kurze Polypeptide umfaßt. Wie nachfolgend diskutiert, ist ein gemeinsames Merkmal dieser Methodik die Anwendung einer trans-Erkennung, die in vorliegender Patentanmeldung beschrieben ist, um metabolisch langlebige Proteine zu destabilisieren, indem man sie für einen selektiven Abbau in trans-Stellung ins Auge fasst.
Bei einem monomeren Proteinsubstrat liegen per definitionem beide Determinanten des Abbausignals innerhalb der gleichen Polypeptidkette (cis-Rekognition). Jedoch ist es im Fall eines Multisubeinheit-Proteinsubstrats begreiflich, dass die erste und zweite Determinante des Signals innerhalb unterschiedlicher Subeinheiten des Substrats liegen kann (trans-Rekognition). Eine Frage, die angesprochen werden könnte, ist, ob die Zielkomponenten und Abbaukomponenten eines proteolytischen Wegs zwischen den Subeinheiten eines oligomeren Proteins, welche die Abbausignale tragen, von denjenigen, die dies nicht tun, unterscheiden, oder ob das ganze oligomere Protein für den Abbau ins Auge gefaßt wird, auch wenn lediglich einige ihrer Subeinheiten Abbausignale tragen. Ob eine trans-Rekognition von proteolytischen Substraten, oder deren Subeinheit-spezifischen Abbau, oder aber beides möglich war (Fig. 2), hat wichtige funktionelle und praktische Auswirkungen:
Der proteolytische Weg gemäß der N-Terminus-Regel war Gegenstand zahlreicher wissenschaftlicher Artikel während der vergangenen mehreren Jahre. Diese Untersuchungen zeigten, dass sich das Abbausignal auf Basis der N-Terminus- Regel aus zwei unterschiedlichen Determinanten zusammensetzt: dem aminoterminalen Rest des Proteins und einem spezifischen internen Lysinrest (Fig. 1).
Die erste Determinante, am Anfang von Bachmair u. a. (Science 234, S. 179-186 (1986)) berichtet, ist der aminoterminale Aminosäurerest des Proteins (in Fig. 1 als "d" für die Destabilisierung, oder als "s" für die Stabilisierung dargestellt). Der anfängliche Bericht von Bachmair u. a. beschreibt einen Test, der zur Untersuchung der Wirkung des aminoterminalen Rests auf die Stoffwechselstabilität eines Testproteins angewandt wurde. Bei der Hefe S. cervisiae wurde ermittelt, dass die Gruppe der destabilisierenden aminoterminalen Reste aus Ile, Glu, His, Tyr, Gln, Phe, Leu, Asp, Asn, Lys, Arg und Trp bestand. Eine spätere Arbeit von Gonda u. a. (J. Biol. Chem. 264, S. 16700-16712 (1989)) dienten zur Aufklärung des Satzes destabilisierender Reste in Säugetier-Retikulocyten. Dieser Satz bestand aus Asn, Gln, Asp, Glu, Cys, Arg, Lys, His, Phe, Leu, Trp, Tyr, Ala, Ser und Thr. Wie im folgenden beschrieben, können die Tests, welche zur Bestimmung der destabilisierenden Reste in diesen beiden Systemen benutzt wurden, leicht und direkt angepasst werden, um eine analoge Bestimmung in jeglichem eukaryontischen System durchzuführen.
In allen geprüften Eukaryonten werden Ubiquitin-X-βgal-Fusionsproteine (Ub-X- βgal-Fusionsproteine) entweder in vivo oder in zellfreien Extrakten durch eine endogene Verarbeitungsprotease genau von Ubiquitin befreit, unter Bildung von X-βgal-Testproteinen mit dem (vorbestimmten) Rest X am Aminoterminus (Fig. 3) (Bachmair u. a., Science 234, S. 179-186 (1986)). Je nach der Art von X, sind die X-βgal-Proteine entweder langlebig oder metabolisch instabil, wobei destabilisierende aminoterminale Reste den entsprechenden X-βgal's kurze Halbwertzeiten verleihen. Dieses aminoterminale Abbausignal äußert sich als die N-Terminus- Regel.
Es wurde schon früher gefunden, dass die exakte Form der N-Terminus-Regel zwischen verschiedenen Zelltypen variiert. Die Verfahren zur Bestimmung der exakten Form der N-Terminus-Regel in jedem gegebenen Zelltyp sind technisch unkompliziert und umfassen das Exprimieren in einem Zelltyp von Interesse, unter Verwendung von Standardexpressionsvektoren, eines Satzes von Ub-X-βgal- Fusionsproteinen, die weiter oben beschrieben wurden, und die Bestimmung, unter Anwendung von pulse-chase-Standardprotokollen und Immunpräzipitation, die Halbwertzeiten eines jeden der 20 unterschiedlichen X-βgal-Proteine. Im speziellen wird ein X-βgal-Protein (das von Ub-X-βgal durch Freisetzung von Ubiquitin abgeleitet ist) in vivo mit einer radioaktiven Aminosäure pulsmarkiert, gefolgt von einem kalten Auswaschen (chase); auf diese Weise wird das metabolische Schicksal der pulsmarkierten Gattung bestimmt. Der Weg zur Durchführung dieses letzteren Teils des Protokolls ist ebenfalls dem Fachmann gut bekannt; er besteht in der Immunpräzipitation eines jeden der X-βgal-Proteine aus den pulsmarkierten und ausgewaschenen Proben der entsprechenden Rohextrakte unter Verwendung eines Antikörpers gegenüber βgal, gefolgt von einer elektrophoretischen Analyse der immunausgefällten X-βgal's, welche diese direkte Bestimmung der N-Terminus-Regel in einen Zelltyp von Interesse vervollständigt (Bachmair u. a., Science 234, S. 179-186 (1986); Bachmair und Varshavsky, Cell 56, S. 1019-1032 (1989)).
Während die erste Determinante des Abbausignals auf Basis der N-Terminus- Regel der aminoterminale Rest des Proteins ist, ist die zweite, ebenfalls wesentliche Determinante dieses Signals ein spezifischer innerer Lysinrest im gleichen Protein (als "K" in Fig. 1 gezeigt). Der zur Verfügung stehende Beweis zeigt, dass die relevanten Merkmale des Lysins als zweite Determinante ihre räumlichen (jedoch nicht notwendigerweise "lineare") Nachbarschaft zum aminoterminalen Rest des Proteins und die segmentale Mobilität der das Lysin enthaltenden Region sind. In stochastischer Sicht der zweiten Determinate kann jedem Lysin eines proteolytischen Substrats eine Wahrscheinlichkeit zugeordnet werden, dass es als Ubiquitinierungsstelle, je nach der Durchschnittszeit-Raumlage und Mobilität des Lysins, benutzt wird. Für die meisten oder alle Lysinreste in einem gegebenen Protein ist die Wahrscheinlichkeit, dass sie als eine Stelle der Multiubiquitinierung dienen, entweder gering oder verschwindend klein, und zwar auf Grund ihrer räumlichen Entferntheit von dem aminoterminalen Rest des Proteins, des Fehlens von Mobilität oder auf Grund beider (Bachmair und Varshavsky, Cell 56, S. 1013-1032 (1989)).
Während das Verständnis, in präzisen physio-chemischen Begriffen, was genau einen Lysinrest in einem Protein zu einer zweiten Determinante (Ubiquitinierungsstelle) des Abbausignals auf Basis der N-Terminus-Regel macht, noch nicht vollständig ist, ist das Verfahren zur Bestimmung in jedem speziellen Fall, ob ein gegebenes Protein oder Polypeptid von Interesse eine wirksame zweite Determinante hat, gut definiert und technisch unkompliziert. In der Tat ist es, um zu ermitteln, ob ein gegebenes Protein von Interesse eine wirksame Multiubiquitinierungsstelle (die zweite Determinante des Abbausignals auf Basis der N-Terminus-Regel) hat, ausreichend, zu bestimmen, ob die in vivo Halbwertzeit dieses Proteins eine Funktion seines aminoterminalen Rests ist. Da die Anwesenheit der ersten und der zweiten Determinante für die Funktion des Abbausignals auf Basis der N-Terminus-Regel wesentlich ist, könnte man direkt bestimmen, ob die zweite Determinante in einem Protein von Interesse vorliegt, indem man frägt, ob die in vivo-Halbwertzeit dieses Proteins kurz ist, wenn dessen aminoterminaler Rest gemäß der N-Terminus-Regel destabilisierend ist. Mit anderen Worten: Wenn die Stoffwechselstabilität eines Proteins eine zwingende Funktion seines aminoterminalen Rests ist (wie es z. B. der Fall bei X-βgal's ist, wo Arg-βgal ~500fach kurzlebiger als Val-βgal ist), hat dieses Protein per definitionem eine wirksame zweite Determinante des Abbausignals auf Basis der N-Terminus-Regel. Auch die Abwesenheit einer Abhängigkeit oder eine schwache Abhängigkeit der Halbwertzeit eines Proteins von der Identität seines aminoterminalen Rests definieren dieses Protein als ein solches, dem eine wirksame zweite Determinante fehlt.
Die Information darüber, wo genau das zweite Determinantenlysin (die Multiubiquitinierungsstelle) innerhalb eines Proteins oder Peptids von Interesse liegt, kann durch direktes chemisches Kartieren (Chau u-a., Science 243, S. 1576-1583 (1989)) oder durch andere Mittel erhalten werden. Jedoch ist diese Zusatzinformation für die Zwecke der vorliegenden Erfindung in den meisten Fällen unnötig.
Der selektive Abbau von langlebigen Proteinen, der durch die Methodik der vorliegenden Erfindung ermöglicht wird, kann in einem größeren Zusammenhang als ein neuer Weg zur Bildung spezifischer Null-Phenotypen angesehen werden. Die Herstellung von Null- oder nahezu Null-Phenotypen spezieller Gene ist ein immer wieder auftretendes Thema in der biologischen Grundlagenforschung und angewandten Forschung. Die zugrundelegenden Ziele reichen von der Unterdrückung der Funktionen toxischer und sonst unerwünschter Proteine, wie z. B. diejenigen pathogener Viren oder annormalen Protoonkogenprodukten, bis zur Analyse der Funktion eines Proteins von Interesse durch selektives Eliminieren der Funktion und Beobachten der Wirkungen einer derartigen Elimination. Deletionen von vorbestimmten Genen liefern direkt die erwünschten Null-Phenotypen. Derartige Zieldeletionen sind für einige einzellige Organismen, wie z. B. Bakterien und Hefe, unkompliziert, sind jedoch derzeit bei den meisten Pflanzen und Tieren entweder schwierig oder unmöglich.
Alternative Verfahren zur Herstellung von Null- oder nahezu Null-Phenotypen spezieller Gene umfassen eine "herkömmliche" Pharmakologie, beispielsweise die Verwendung von Inhibitoren spezieller Enzyme. Beispielsweise erzeugt Penicillin durch spezifische Hemmung eines der für die Synthese der Bakterienwand erforderlichen Enzyme tatsächlich einen (partiellen) Null-Phenotyp des Gens für dieses Enzym. Auf ähnliche Weise wirken Inhibitoren der Monoaminooxidase des Gehirns tatsächlich als Tranquilizer oder Antidepressionsmittel, indem sie in der Tat einen (partiellen) Null-Phenotyp des Gens für dieses Enzym bilden. Acetylsalicylsäure (Aspirin) bildet einen (partiellen) Null-Phenotyp des Gens für dieses Enzym durch Hemmung eines spezifischen Enzyms, das in die Synthese eines der Prostaglandine involviert ist, wodurch die Synthese spezieller Prostaglandine gehemmt, und, als Ergebnis, die Entzündung vermindert wird.
Bei einem unterschiedlichen Beispiel stören "antisense"-Oligonucleotide durch Bindung über eine Watson-Crick-Basenpaarung an eine Region des "sense"- Strangs einer spezifischen mRNA deren Translation, beispielsweise durch Hemmung der Bindung von Initiationsfaktoren an die 5'-Region der mRNA. Diese Hemmung führt in der Tat zu einem (partiellen) Null-Phenotyp eines Gens, auf dessen mRNA das Oligonucleotid abzielt.
Die vorherige "Null-Phenotyp"-Terminologie, obgleich diese noch nicht weit verbreitet ist, macht eine einheitliche Beschreibung der verschiedensten pharmakologischen (auf einem Inihibitor basierenden) und genetischen (auf einer Genmanipulation basierenden) Eingriffen möglich, deren gemeinsames Merkmal die Hemmung der Funktionen spezieller Proteine oder Proteinkomplexe ist.
Einem Alternativverfahren für spezifische Null-Phenotypen liegt der Aufbau vorherrschender negativer Mutationen zugrunde (Übersicht: Herskowitz, I., Nature 329, S. 219-222 (1987)). Letztere stören per definitionem die Funktion eines Proteins von Interesse auch in Gegenwart seiner Wildtypversion, beispielsweise durch Einführung einer Mutantenform eines Proteins, das einen funktionell inaktiven Komplex mit dem Protein von Interesse bildet.
Wie im folgenden gezeigt wird, ermöglicht die Existenz der trans-Erkennung auf dem Weg der N-Terminus-Regel und die Spezifizität der Subeinheit des selektiven Proteinabbaus den Aufbau einer Klasse dominanter negativer Mutationen, die Gegenstand vorliegender Patentanmeldung ist. Das unterscheidende Merkmal dieser neuen Klasse ist eine selektive Stoffwechseldestabilisierung eines sonst langlebigen Proteins von Interesse, indem man es für den Abbau in trans- Stellung ins Auge fasst. Eine abfallende Stoffwechselstabilität eines Proteins erniedrigt seine Konzentration in der Zelle, wodurch ein alternativer Weg zum Null- Phenotyp bereitgestellt wird. Eine Version des trans-Abbauverfahrens, veran schaulicht in Fig. 4, erfordert ein Gen für ein Protein (oder einen Teil desselben), dass mit dem Protein oder Peptid von Interesse in spezifische Wechselwirkung tritt. (Die meisten natürlichen Proteine existieren entweder als Dimere oder als höhere Oligomere; sogar jene Proteine, welche als Monomere in vitro auftreten, treten in den meisten Fällen mit anderen Proteinen während ihres Funktionierens in vivo in Wechselwirkung.) Das Gen für ein Zielprotein oder -peptid, das spezifisch mit dem Protein oder Peptid von Interesse in Wechselwirkung tritt, wird modifiziert, beispielsweise unter Anwendung des zuvor entwickelten Ubiquitin-Fusionsverfahrens (Fig. 3; Bachmair u. a., Science 234, S. 179-186 (1966); Bachmair und Varshavsky, Cell 56, S. 1013-1032 (1989)), zur Codierung einer Variante des Zielproteins oder -peptids, das nach seiner in vivo-Expression einen destabilisierenden aminoterminalen Rest trägt, dem jedoch eine wirksame zweite Determinante (Multiubiquitinierungsstelle) des Abbausignals auf Basis der N-Terminus- Regel fehlt. Die Bildung des Zielproteins oder -peptids in vivo führt zur Komplexbildung mit dem Protein oder Peptid von Interesse, das sodann für einen Abbau in trans-Stellung ins Auge gefaßt wird (Fig. 4). Ein bemerkenswertes Merkmal dieses neuen Verfahrens, das von der Subeinheit-Spezifizität des Proteinabbaus stammt, ist, dass das Zielprotein, dem die zweite Determinante des Abbausignals fehlt, nicht zerstört wird. Infolgedessen wirkt es bei der trans-Zielsetzung (dem trans-targeting) des Proteins von Interesse für einen selektiven Abbau katalytisch, und nicht stoichiometrisch.
In Fig. 4 geben die Ovale, "A" und, "B" Polypeptidsubeinheiten wieder. Die erste Determinante des Abbausignals auf Basis der N-Terminus-Regel (ein aminoterminaler Aminosäurerest) ist als "s", was für stabilisierend steht, oder "d", was für destabilisierend steht, bezeichnet. Die zweite Determinante des Abbausignals auf Basis der N-Terminus-Regel (ein spezieller Lysinrest) ist mit "K" bezeichnet. Ubiquitin wird in Fig. 4 als, "Ub" bezeichnet. Wie in Fig. 4 veranschaulicht, ist das trans-Abbauverfahren auf sowohl homomere (Fig. 4b) oder heteromere (Fig. 4a) Ziele anwendbar. Im speziellen wird zur Zerstörung einer Untereinheit A in einem langlebigen Heterodimeren AB eine modifizierte Subeinheit B mit einem destabilisierenden aminoterminalen Rest und der eine wirksame zweite Determinante des Abbausignals fehlt, in eine Zelle eingeführt, beispielsweise indem man sie aus einem Vektor, der die modifizierte Subeinheit B codiert, exprimiert (Fig. 4a). Die Zielsetzung für den Abbau eines langlebigen Homodimeren AA ist dem zuvor beschriebenen Verfahren ähnlich, jedoch mit der Ausnahme, dass die Zielsubeinheit zusätzlich modifiziert wird, um eine Variante (A*) der Subeinheit A zu codieren, die zumindest als ein Homodimer (d-A*/d-A*) funktionell inaktiv ist. Die Einführung einer derart modifizierten Subeinheit A* in eine Zelle führt entweder zu einem Heterodimeren, indem die modifizierte Subeinheit d-A* auf die trans- Stellung der Subeinheit A zum Abbau abzielt, oder zu einem langlebigen, jedoch funktionell inaktiven Homodimeren d-A*/d-A* (Fig. 4b).
Da Protein-Protein-Wechselwirkungen oft verhältnismäßig kurze benachbarte Aminosäuresequenzen umfassen, die ihre Bindungsspezifität als Peptide beibehalten (O'Shea u. a., Science 245, S. 646-648 (1989)), sollten auch letztere oder ihre in eine Zelle eintretenden chemischen Analogen in dem trans-Abbauverfahren verwendet werden können. Ferner ist, während der experimentelle Nachweis der Möglichkeit einer trans-Erkennung derzeit auf das Abbausignal auf Basis der N-Terminus-Regel begrenzt ist, die trans-Erkennung wahrscheinlich auch für andere Abbausignale in Proteinen charakteristisch. Die Merkmale eines Abbausignals, welche es zu einem Kandidaten für die cis/trans-Erkennung machen sollten, sind die Anwesenheit von mehr als einer unterschiedlichen Determinante und das Fehlen einer strikten "linearen" Abstandsbeschränkung auf die Anordnung der Determinanten. Die experimentellen Verfahren, welche benutzt wurden, um zu zeigen, dass das Abbausignal auf Basis der N-Terminus-Regel eine Multikomponente ist und entweder in cis- oder in trans-Stellung funktionieren kann, können leicht angepasst werden, um auf eine ähnliche Weise andere Abbausignale in kurzlebigen Proteinen zu zergliedern und um zu beweisen, ob die cis/trans-Erkennung und damit die Verfahren der vorliegenden Erfindung auch für diese Signale relevant sind. Wie nachfolgend gezeigt wird, ist die Spezifität einer Subeinheit bei dem Proteinabbau ein anderes unabhängiges Element des trans- Abbauverfahrens, nicht auf den Weg der N-Terminus-Regel beschränkt, insofern als mindestens eines der Abbausignale in einen natürlichen kurzlebigen Hefe-α2- Repressor auf eine Subeinheit-spezifische Weise arbeitet.
Indem die Analyse des Abbausignals auf Basis der N-Terminus-Regel und der in einem α2-Repressor vorliegenden Abbausignale einen Weg begründen, sich obigen Fragen zu nähern, kann der Fachmann direkt für irgend ein angetroffenes Abbausignal bestimmen, ob das trans-Abbauverfahren der vorliegenden Erfindung relevant und anwendbar ist.
In einem anderen Aspekt betrifft vorliegende Erfindung nicht nur die Zielproteine oder -peptide, welche mit voll entwickelten Formen eines Proteins von Interesse in Wechselwirkung treten, sondern auch die Zielproteine oder -peptide, die mit unvollständig gefalteten bzw. geknäulten Formen eines Proteins oder Peptids von Interesse in vivo in Wechselwirkung treten. Jedes in vivo-synthetisierte Protein muss einer Konformationsreifung eingehen, ein Verfahren, welches eine verhältnismäßig ungeordnete Polypeptidkette eines Proteins, wenn es aus dem Ribosom hervorgeht, in eine gut definierte gefaltene Struktur umwandelt, welche für ein voll entwickeltes Protein charakteristisch ist. Obgleich manche Aspekte dieses komplizierten Verfahrens verstanden werden, sind die tatsächlichen Faltungswege für sehr wenige Proteine in vitro bekannt, und tatsächlich für keine Proteine in vivo, wo die Faltungswege nicht mit denjenigen in vitro identisch oder auch diesen ähnlich sein können. Die Gründe für letztere Komplikation umfassen die Anwesenheit vieler anderer Proteine in einer Zelle, von denen manche mit dem naszierenden Protein von Interesse eine Wechselwirkung eingehen können, sowie die Tatsache, dass die Faltung in vivo, - während Faltungstests in vitro üblicherweise mit einem ungefalteten Protein voller Länge beginnen - beginnt, während die carboxylterminale Region des Proteins noch aus dem Ribosom hervorgeht.
Eine neuere Studie von Hall und Frieden (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, S. 3060-3064 (1989)) unter Verwendung einer Modell-Proteindihydrofolatreduktase (DHFR) zeigte, dass einige Fragmente von DHFR das Zurückfalten in vitro der gleichen DHFR voller Länge von ihrem anfänglich ungefalteten (denaturierten) Zustand hemmen können. Ferner zeigten diese Autoren, dass einige DHFR- Fragmente die Faltung der DHFR voller Länge viel wirksamer als andere hemmten, d. h., dass die Hemmungswirkung gegenüber der Fragmentsequenz und -zusammensetzung extrem empfindlich ist. Diese Ergebnisse führten Hall und Frieden dazu, die Verwendung von Proteinfragmenten als Sonden zur Untersuchung der Mechanismen der Proteinfaltung in vitro vorzuschlagen.
Die Entdeckung der trans-Zielsetzung und des Subeinheit-spezifischen Abbaus von reifen (gefalteten) Proteinen macht eine neue Anwendung der Entdeckungen von Hall und Frieden in vitro möglich. Im speziellen können die Faltung störende Zielpeptide, deren Aminosäuresequenz mit einem Teil der Aminosäuresequenz eines Proteins oder Peptids von Interesse identisch oder im wesentlichen homolog zu ihm ist, benutzt werden, um auf das Protein von Interesse in trans-Stellung zu einem Abbau oder einer funktionellen Verschlechterung in vivo abzuzielen. Bei dem Verfahren in vitro von Hall und Frieden waren die wenigen Fragmente von DHFR, welche tatsächlich benutzt wurden, aus Gründen ihrer verhältnismäßig leichten Herstellung ausgewählt worden, und nicht wegen ihrer erwarteten Wirkung auf das Falten von DHFR. Im Gegensatz hierzu stellt vorliegendes Verfahren, ganz abgesehen davon, dass es auf in vivo-Basis arbeitet und auf den Proteinabbau gerichtet ist, ein systematisches genetisches Verfahren für irgend ein Protein von Interesse zur direkten Ermittlung zur Verfügung, welches seiner Fragmente diejenigen sind, die am wirksamsten die Faltung, Funktion und/oder die Stoffwechselstabilität des Proteins voller Länge stören.
Fig. 5 veranschaulicht die Verwendung eines die Faltung störenden Peptids, um auf ein Protein von Interesse für den Abbau abzuzielen. Die Störung kann entweder während des Faltens des Proteins voller Länge, wie in Fig. 5 gezeigt, oder auch während des Faltens der Aminoterminus-proximalen Region des Proteins auftreten, wenn dieses aus dem Ribosom hervorgeht.
Wenn ein die Faltung störendes Zielpeptid das Falten eines Proteins (von dem das Peptid abgeleitet worden war) entweder irreversibel oder mindestens wäh rend eines verhältnismäßig langen Zeitraums vor einer Dissoziation und der Wiederaufnahme der Faltung unterbricht, wird die resultierende funktionelle Verschlechterung des Proteins von Interesse in vivo erhalten, auch in Abwesenheit der begleitenden Stoffwechseldestabilisierung (Zerstörung) des Komplexes Zielpeptid-Protein. Da jedoch ein derartiger eingefangener (trapped) Komplex wahrscheinlich einem "missgefalteten" Protein für die intrazellulären proteolytischen "Überwachungswege" ähnlich ist, ist es wahrscheinlich, dass die wirksame Herabsetzung der Konzentration eine aktiven Proteingattung in einer Zelle durch eine Kombination einer funktionellen Verschlechterung und eines tatsächlichen Abbaus eines Zielkomplexes durch die obigen proteolytischen Wege verursacht wird. Ob ein abgefangener Peptid-Protein-Komplex (Fig. 5) abgebaut wird oder ob er langlebig, aber funktionell inaktiv bleibt, hängt von der Aminosäuresequenz des Proteins von Interesse und dem die Faltung störenden Zielpeptid ab (dessen Sequenz mit einem Subset der Sequenz des Proteins von Interesse identisch oder zu diesem homolog ist).
Zur Erhöhung der Wahrscheinlichkeit, dass ein abgefangener Peptid-Protein- Komplex in vivo kurzlebig ist, kann ein die Faltung störendes Zielpeptid dazu bestimmt werden, als eine Ubiquitin-Peptid-Fusion gebildet zu werden, deren wirksame Freisetzung von Ubiquitin in vivo (Fig. 3) einen vorbestimmten destabilisierenden Rest am Aminoterminus des Peptids zu erzeugen (Fig. 5). Wenn ein derartiges Peptid ein sich faltendes Protein von Interesse abfängt, macht dessen destabilisierender Rest ein trans-targeting des (partiell gefalteten) abgefangenen Proteins von Interesse für den Abbau über den Weg der N-Terminus-Regel möglich, wie weiter oben diskutiert (Fig. 2). Überdies ist eine durch das Zielpeptid abgefangene Proteingattung per definitionem partiell gefaltet (Fig. 5). Die unvermeidliche Konformationsinstabilität dieser Gattung (bezüglich der gefalteten Gattung des gleichen Proteins) liefert erwartungsgemäß zusätzliche hinsichtlich der Konformation mobile Lysinreste, welche als zweite Determinanten (Ubiquitinierungsstellen) des Abbausignals auf Basis der N-Terminus-Regel dienen. Infolgedessen ist zu erwarten, dass das durch die N-Terminus-Regel vermittelte transtargeting eines abgefangenen Peptid-Protein-Komplexes unüblicherweise wirk sam ist, und zwar auf Grund des Fehlens einer Konformationsstabilisierung von Lysinresten (potentielle zweite Determinanten des Abbausignals) innerhalb eines unvollständig gefalteten Proteins von Interesse. Ferner ist es, wenn einmal die besten (d. h. wirksamsten) die Faltung störenden Zielpeptide für ein gegebenes Protein von Interesse identifiziert sind (vgl. Fig. 6 und die folgende Diskussion), eine Routineangelegenheit, die Lysinreste der Peptide (wenn überhaupt welche vorliegen) durch homologe nicht-ubiquitinierbare (Arginin-) Reste zu ersetzen, so dass keine cis-Erkennung des Peptids selbst durch den Weg der N Terminus- Regel möglich ist. Die Exprimierung von Zielpeptiden als Ubiquitinfusionen stabilisiert vorübergehend diese Peptide gegenüber einem intrazellulären Abbau, wie früher für verschiedene sonst kurzlebige Peptide, anfusioniert an Ubiquitinreste, gefunden wurde (Finley u. a., Nature 338. S. 394401 (1989)). Somit kann, während eine Multiubiquitinkette ein Signal für den Proteinabbau ist (vgl. z. B. Fig. 1 und 2), ein aminoterminaler Monoubiquitinrest (unter bestimmten, durch Finley u. a. identifizierten Bedingungen) die in vivo-Halbwertzeit eines Protein- oder Peptidrestes, der "stromabwärts" des Ubiquitinrests liegt, erhöhen.
Da die Anzahl möglicher Fragmente auch eines Proteins von Interesse mit mäßiger Größe ziemlich groß ist, sollte das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung, um allgemein anwendbar zu sein, einen systematischen, von Annahmen freien Weg zur Unterscheidung zwischen wirksam und unwirksam wirkenden, die Faltung störenden Zielpeptiden zur Verfügung stellen, und zur positiven Identifizierung ersterer für ein gegebenes Protein von Interesse. Ein allgemein anwendbares Verfahren auf genetischer Basis, das eine derartige Identifikation bereitstellt, ist in Fig. 6 dargestellt.
Anfänglich wird eine Fusion eines Proteins von Interesse mit einem Markerprotein, wie z. B. β-Galaktosidase (βgal) in einer Wirtszelle zur Verfügung gestellt. Ein Konstrukt, das eine derartige Fusion codiert, kann beispielsweise durch Fusionieren eines ein Protein von Interesse codierenden Gens an ein, ein Markerprotein codierendes Gen, wie z. B. βgal, hergestellt werden, um ein Fusionsprotein mit einem Gehalt an dem Protein von Interesse vor dem βgal-Rest zu liefern (Fig. 6-I). Sodann wird eine Ubiquitinfusion an verschiedene Fragmente des Proteins von Interesse codierende DNA-Bibliothek konstruiert (Fig. 6-II). Ein Weg des Aufbaus einer Bibliothek ist folgender:
(i) Ein Satz von carboxylterminal abgestumpften (truncated) Derivaten des Proteins von Interesse wird erhalten, indem man stufenweise Deletionen vom 3'- Ende eines das Protein von Interesse codierenden Gens vornimmt. Derartige "nestect-Deletionsverfahren sind dem Fachmann gut bekannt (vgl. z. B. Sambrook u. a.. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989).
(ii) Auf ähnliche Weise wird ein Satz stufenweiser aminoterminaler Deletionen des Proteins von Interesse konstruiert. Die Gesamtzahl unterschiedlicher Deletionsderivate, welche 1 voll entwickeltes Ende des Proteins von Interesse beibehalten (entweder das carboxylterminale oder das aminoterminale Ende) wird so nahe wie möglich dem Zweifachen der Anzahl von Aminosäureresten in dem Protein von Interesse gemacht (es gibt so viel wie mögliche carboxylterminal abgestumpfte Derivate eines Proteins wie es Aminosäurereste in dem Protein gibt; dasselbe trifft für aminoterminal abgestumpfte Derivate).
(iii) In einer getrennten Klonierungsstufe werden die aminoterminal abgestumpften Derivate des Proteins von Interesse codierende Gene stufenweisen carboxylterminalen Deletionen unterworfen, um einen Satz von Genen zu liefern, welche innere Fragmente des Proteins von Interesse codieren.
(iv) Alle drei Klassen der Gene, welche derart hergestellte Deletionsderivate codieren (intern, carboxylterminal und aminoterminal) werden an ein Gen fusioniert, dass den stromaufwärts gelegenen Ubiquitinrest codieren, entweder mit einem zusätzlichen (vorbestimmten) Rest X an der Verbindung von Ubiquitin und Peptid, oder ohne einen derartigen Rest.
(v) Entweder Hefe (wie z. B. S. cerevisiae) oder bakterielle Zellen (wie z. B. E. coli), denen β-Galaktosidase fehlt, werden mit einem Expressionsvektor transformiert, der das Zielprotein von Interesse, das an βgal fusioniert ist (Fig. 6-I) codiert und sodann mit der zuvor beschriebenen Bibliothek von Genen transformiert, welche verschiedene Fragmente des Proteins von Interesse codieren und in den Hintergrund eines Expressionsvektors mit einem induzierbaren Promotor (wie z. B. GAL-Promotor in S. cerevisiae der Hefe oder Ptrc-Promotor in E. coli gebracht.
(vi) Transformanten von der Stufe (v) lässt man auf einem festen Medium mit einem Gehalt an X-Gal, einem Farbindikator für die βgal-Aktivität (Sambrook u. a., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989), und gescreent für hellblaue oder weiße Kolonien (d. h. diejenigen, welche wenig oder gar kein βgal produzieren) unter Bedingungen wachsen, bei denen ein induzierbarer Promotor der Stufe (v) aktiv ist.
(vii) Wenn irgend eine derartige Kolonie gefunden wird, werden die entsprechenden Transformanten abermals unter Bedingungen getestet, bei denen ein induzierbarer Promotor der Stufe (v) inaktiv ist (geringe oder gar keine Expression eines die Faltung störenden Zielpeptids). Wenn die derart getesteten Transformanten in Abwesenheit einer Peptidexpression blau, jedoch in Anwesenheit einer Peptidexpression weiß oder hellblau sind, werden die entsprechenden Zellklonen einer detaillierteren Analyse unterzogen. Insbesondere werden aus den obigen Transformanten Plasmide isoliert, die spezielle Ubiquitin-Peptid-Fusionen codieren, und die Sequenz des entsprechenden Peptids bzw. der entsprechenden Peptide wird bewiesen, indem man die Nukleotidsequenz(en) des entsprechenden Gens bzw. der entsprechenden Gene bestimmt. Diese Ubiquitin-Peptid- Fusionen werden sodann unabhängig in Zellen transformiert, welche das ursprüngliche Protein-βgal-target exprimieren (Fig. 6-I), zur Bestätigung, das das Peptid tatsächlich die βgal-Aktivität in den Empfängerzellen stark verringert. Detailliertere Versuche konnten auch durchgeführt werden, um das bzw. die die Faltung störende(n) Peptid(e) zu charakterisieren, beispielsweise eine direkte Bestimmung des metabolischen Schicksals einer βgal Testfusion (Fig. 6-I) in An- oder Abwesenheit der die Faltung störenden Peptid-Expression. Diese Bestimmung wird durch pulse-chase-Analyse (Bachmair u. a., Science 234, S. 179-186 (1986)) durchgeführt, ein dem Fachmann gut bekanntes Verfahren.
Das Grundprinzip für die experimentellen, zuvor und in Fig. 6 beschriebenen Stufen ist folgendes: Wenn ein wirksames die Faltung störendes Peptid die Konformationsreifung eines Proteins von Interesse in vivo verhindert oder sonst stört, ist es wahrscheinlich, dass der resultierende (abgefangene) Peptid-Protein- Komplex und der stromabwärts gelegene βgal-Rest aus den zuvor angegebenen Gründen auf einen Abbau abzielt. Als Folge fällt das Fließgteichgewichtsniveau (steady-state level) von βgal entweder mäßig oder stark ab, je nach der Wirksamkeit eines die Faltung störenden Zielpeptids, und die resultierende Veränderung der βgal Aktivität kann durch das zuvor beschriebene Screening auf Basis von X-Gal nachgewiesen werden. Das in Fig. 6 veranschaulichte Verfahren macht einen direkten Nachweis und eine direkte Identifizierung derjenigen Fragmente eines Proteins von Interesse möglich, das auf das Protein von Interesse in dessen Fusion an βgal für einen Abbau in vivo abzielt. Dieses Verfahren ist auf jedes Protein anwendbar, für das ein Gen zur Verfügung steht, ist bei seiner Ausführung im wesentlichen von Annahmen frei und technisch unkompliziert, indem alte relevanten Verfahren dem Fachmann gut bekannt sind.
Das in Fig. 6 veranschaulichte Verfahren kann die Faltung störende Zielpeptide, die, während sie die Faltung des Proteins stören, nicht auf dessen Abbau abzielen, entdecken. Obgleich derartige Fragmente für die Zwecke vorliegender Erfindung unnötig sind (weil die Faltung störende, auf den Abbau abzielende Fragmente des Proteins von Interesse nicht selten sind) könnten diese Fragmente auch auf dem in Fig. 6 veranschaulichten Weg identifiziert werden, wenn eine funktionelle Aktivität des Proteins von Interesse entweder an einen Test vom Selektionstyp oder einen Test vom Screen-Typ angepasst werden könnte, wodurch die Notwendigkeit für einen Markerproteinrest umgangen wird. In diesem Fall dient ein Protein selbst (nicht seine Fusion an βgal oder ein anderes Markerprotein) als Marker, wobei der Rest des Verfahrens gemäß Fig. 6 intakt bleibt.
Wenn einmal die wirksamsten, die Faltung störenden Zielpeptide durch das Verfahren der Fig. 6 oder dessen Äquivalente identifiziert sind, können diese Zielpeptide modifiziert werden, um sie gegenüber einem Abbau in vivo widerstandsfähiger zu machen. Überdies können auch Zielpeptide der "zweiten Generation" vorgesehen werden, welche, während sie bezüglich ihrer die Faltung störenden Kapazität den ursprünglich identifizierten Peptiden äquivalent sind, in der Lage sind, direkt in die Zellen einzudringen, wodurch die Notwendigkeit des Exprimie rens dieser Peptide über DNA-Konstrukte aus innerhalb der Zellen vermieden wird.
Die Erfindung wird weiter durch nachfolgende Beispiele veranschaulicht.

BEISPIELE

Beispiel 1

Das Abbausignal auf Basis der N-Terminus-Regel in einem kurzlebigen Protein umfasst einen destabilisierenden aminoterminalen Rest und einen spezifischen internen Lysinrest (Bachmair, A. u. a.. Science 234, S. 179-186 (1986); Varshavsky, A, u. a., in "Ubiquitin" (Herausg. Rechsteiner, M.) 287-324 (Plenum, New York, 1988); Bachmair, A. und A. Varshavsky, Gell 56, S. 1019-1032 (1989); Chau, V. u. a., Science 243, S. 1576-1583 (1989) und Gonda, D. K. u. a., J. Biol. Chem. 264. S. 16700-16712 (1989); vgl. auch Fig. 7). In diesem Beispiel wird gezeigt, dass in einem Multisubeinheit-Protein diese beiden Determinanten an verschiedenen Subeinheiten liegen können und noch das Protein zur Zerstörung anvisieren. Überdies wird in diesem Fall (trans-Erkennung) lediglich die Subeinheit, welche die zweite (Lysin) Determinante trägt, tatsächlich abgebaut. Deshalb kann ein oligomeres Protein sowohl kurzlebige als auch langlebige Subeinheiten enthalten.

trans-Erkennung auf dem Weg der N-Terminus-Regel

In einem monomeren Substrat des Wegs der N-Terminus-Regel liegen per definitionem beide Determinanten des Abbausignals innerhalb der gleichen Polypeptidkette, weshalb man sagt, dass sie in cis zu erkennen sind (Fig. 1 und 2a). Jedoch könnte im Falle eines Multisubeinheit-Proteins wie eines X-βgal-Tetrameren die Zielsetzung einer einzelnen X-βgal-Subeinheit durch die Anwesenheit anderer Subeinheiten in dem Tetrameren beeinflußt werden. Insbesondere kann man die Möglichkeit einer trans-Erkennung in Erwägung ziehen, bei der die erste und die zweite Determinante des Abbausignals innerhalb unterschiedlicher Subeinheiten von X-βgal liegt (Fig. 2b, 2c). Auch kann man fragen, ob die Ziel- und Abbaukomponenten des Wegs der N-Terminus-Regel zwischen denjenigen Subeinheiten eines X-βgal-Heterotetrameren, welche das Abbausignal tragen, von denjenigen unterscheidet, bei denen dies nicht der Fall ist, oder ob ein ganzes Tetramer zur Zerstörung anvisiert ist, auch wenn lediglich einige seiner Subeinheiten Abbausignale tragen (Fig. 2c). (Zur Erleichterung der Diskussion sind in Fig. 2 für ein dimeres Protein die cis- und trans-konzepte veranschaulicht. Die D&sub2;- Symmetrie und verwandte Eigenschaften (Edwards, L. A. u. a., J Biol. Chem. 263, S. 1848-1858 (1988); Kania, J. und D. T. Brown, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, S. 3529-3533 (1976)) des βgal-Tetrameren legen nahe, dass seine aminoterminalen Regionen innerhalb eines jeden Paares von das Tetramer bildenden Dimeren räumlich nahe, jedoch zwischen den Dimeren beabstandet, liegen.) Um das Schicksal einzelner X-βgal-Subeinheiten innerhalb eines X-βgal-Tetrameren zu verfolgen, stellten wir radioaktiv markierte Ub-X-βgal-Heterotetramere her, von denen der größere Teil eine markierte Subeinheit und drei unmarkierte Subeinheiten pro Tetramer enthielt (Fig. 9a), und verwendeten diese Proteine, um die zuvor angegebenen Fragen anzusprechen.
Fig. 8 und 9 veranschaulichen die ATP-abhängige Ubiquitinierung und den Abbau von X-βgal-Homotetrameren bzw. -Heterotetrameren. Die Ergebnisse zeigen die Kinetik des Abbaus in einem ATP-ergänzten Retikulocytenextrakt von mit ³&sup5;S- markierten X-βgal-Proteinen, die entweder einen stabilisierenden (Val) oder destabilisierenden (Arg) aminoterminalen Rest tragen und die zweite Determinante des Abbausignals entweder enthalten oder aber nicht enthalten. Bevor die Ergebnisse des Verfahrens mit gemischtem Oligomeren beschrieben werden, wird darauf hingewiesen, dass das rekonstituierte V~K~βgal* / V~K~βgal-Tetramer (die ³&sup5;S-markierte Subeinheit ist mit einem * bezeichnet) im retikulocytischen Extrakt mit einer geringfügig höheren Rate als das anfängliche V~K~βgal-Tetramer abgebaut war, das nicht der Dissoziations/Reassoziationsbehandlung (tn ~20 Stunden bzw. ~50 Stunden; Fig. 8a, Kurve 3; Fig. 9b, Kurve 3) unterzogen worden war. Dieser Abbau, während er ATP-abhängig ist, war nicht durch den Weg der N-Terminus-Regel vermittelt, weil die markierte Untereinheit innerhalb des V~ΔK~ βgal*/V~ΔK~βgal-Tetrameren (allein Subeinheiten desselben fehlten beide Determinanten des Abbausignals) im Retikulocytenextrakt bei einer ähnlichen Rate abgebaut wurde (Fig. 9b, Kurven 3 und 6). Dieser zusätzliche langsame Abbau war infolgedessen der Hintergrund unserer Tests mit rekonstituierten X-βgal-Tetrameren. Alls Zeitverläufe in Fig. 9 waren quantitativ sowohl innerhalb als auch zwischen verschiedenen Versuchen reproduzierbar.
Wenn die markierte V~K~βgal-Subeinheit innerhalb des V~K~βgal*/R~K~βgal- Heterotetrameren vorlag, war sie mehrfach ubiquitiniert und im Retikulocytenextrakt mit einem tn-Wert von ~3,3 Stunden (Fig. 9b, Kurve 1) abgebaut. Im Gegensatz hierzu war, wenn die gleiche V~K~βgal-Subeinheit in dem V~K~βgal*/V~K~ βgal-Tetrameren vorlag, ihr tn-Wert 20 Stunden, und sie zeigte sehr geringe Ubiquitinierung (Fig. 9b, Kurve 3). In ein Kontrollversuch wurde das markierte V~ K~βgal-Homotetramer mit einem Überschuss an dem unmarkierten R~K~ βgal-Homotetramer vermischt und im Retikulocytenextrakt ohne die Dissoziations/Reassoziations-Vorbehandlung inkubiert. Unter diesen Bedingungen war V~K~βgal langlebig, mit einem tn-Wert von ~50 Stunden, was identisch mit dem tn-Wert von V~K~βgal in Abwesenheit von R~K~βgal ist (Fig. 8a, Kurve 3).
Zusammen betrachtet zeigen diese Ergebnisse, dass eine Subeinheit mit einem stabilisierenden aminoterminalen Rest im Stoffwechsel destabilisiert werden kann, wenn sie physikalisch mit Subeinheiten assoziiert ist, welche das Abbausignal auf Basis der N-Terminus-Regel enthalten. Diese Ergebnisse legten auch das Vorhandensein einer trans-Erkennung auf den Weg der N-Terminus-Regel nahe (Fig. 2b), d. h., dass die Erkennung eines destabilisierenden aminoterminalen Rests in einer R~K~βgal-Subeinheit des V~K~βgal*/R~K~βgal-Tetrameren die mehrfache Ubiquitinierung der zweiten Deteminante Lysin (Lys 15 oder Lys 17; Fig. 7) in der Subeinheit V~K~βgal des gleichen Heterotetrameren begünstigt, was zum Abbau dieser sonst langlebigen Subeinheit führt.
Bemerkenswerterweise hing die Stoffwechselinstabilität des V~K~βgal*/R~K~βgal- Heterotetrameren nicht vom Abbau der eigentlich kurzlebigen R~K~ βgal-Subeinheiten des Tetrameren ab: Die Subeinheit V~K~βgal hatte einen tn-Wert von ~3,3 Stunden im Retikulocytenextrakt innerhalb entweder V~K~βgal*/R~K~βgal oder V~K~βgal*/R~ΔK~βgal (Fig. 9b, Kurven 1 und 2). Den Subeinheiten R~ΔK~βgal des letzteren Heterotetrameren fehlte das zweite determinante Lys 15/17 (Fig. 1 und 7) und sie waren deshalb viel langlebiger im Retikulocytenextrakt als die sonst identischen Subeinheiten R~K~βgal (Fig. 8a, Kurven 1 und 2). Zusammengenommen bewiesen diese Ergebnisse (Fig. 9b, Kurven 1 bis 3) die Existenz einer trans-Erkennung von kurzlebigen Subeinheiten innerhalb von X-βgal Tetrameren.
In einem zusätzlichen Kontrollversuch bestätigten wir, dass der trans-Erkennungabhängige Abbau von Subeinheiten X-βgal mit einem stabilisierenden aminoterminalen Rest tatsächlich durch den Weg der N-Terminus-Regel vermittelt wurde. Um dies zu verwirklichen, zogen wir aus der zuvor begründeten Existenz von sekundären destabilisierenden Resten in der N-Terminus-Regel Nutzen (Bachmair, A. u. a.. Science 234. S. 179-186 (1986); Gonda, D. K. u. a., J. Biol. Chem. 264. S. 16700-16712 (1989); Ferber, S. und A. Ciechanover, Nature 326, S. 808-811 (1987)). Im speziellen sind aminoterminales Glu (E) und Asp (sowie Cys in Retikulocyten) sekundäre Destabilisierungsreste, indem sie Kraft ihrer Fähigkeit, konjugiert zu werden, funktionieren, und zwar über eine Arg-tRNA-Proteintransferase zu einem primären Destabilisierungsrest, Arg (Gonda, D. K. u. a., J. Biol. Chem. 264, S. 16700-16712 (1989); Ferber, S. und A. Ciechanover, Nature 326, S. 808-811 (1987)). Die Arg-Konjugation, und die erhaltene Destabilisierungseigenschaft eines sekundären destabilisierenden Rests können durch eine tRNA- entziehende Vorbehandlung von Retikulocytenextrakt mit RNAase gehemmt werden (Gonda, D. K. u. a., J. Biol. Chem. 264, S. 16700-16712 (1989)). Wie in Fig. 10 gezeigt ist, war die Subeinheit V~K~βgal innerhalb entweder des V~K~ βgal*/R~ΔK~βgal- oder des V~K~βgal*/E~ΔK~βgal-Tetrameren kurzlebig (wobei letzteres E, einen sekundär destabilisierenden Rest trägt) (Bachmair, A. u. a., Science 234, S. 179-186 (1986); Gonda, D. K u. a., J Biol. Chem. 264, S. 16700- 16712 (1989); Ferber, S. und A. Ciechanover, Nature 326, S. 808-811 (1987)), wenn diese in einem Retikulocytenextrakt inkubiert wurden. Jedoch wurde, wenn der gleiche Test in einem Retikulocytenextrakt, dem tRNA entzogen worden war, durchgeführt wurde, die Subeinheit V~K~βgal im V~K~βgal*/E~ΔK~βgal langlebig (Fig. 10b), im Gegensatz zur gleichen Subeinheit in V~K~βgal*/R~ΔK~βgal, wo sie stoffwechselinstabil blieb (Fig. 10a). Dieses Ergebnis bestätigte direkt, dass der von einer trans-Erkennung abhängige Abbau der Subeinheit V~K~βgal in einem Tetrameren, dessen andere Subeinheiten X-βgal destabilisierende aminoterminale Reste tragen, durch den Weg der N-Terminus-Regel vermittelt wird.

Der Abbau eines Multisubeinheiten-Proteins auf dem Weg der N-Terminus-Regel ist Subeinheit-spezifisch

Während die markierte Subeinheit V~K~βgal innerhalb des V~K~βgal*/R~K~βgal- Tetrameren kurzlebig war, war die sonst identische Subeinheit V~ΔK~βgal, welcher das zweit-determinante Lys 15/17 (Fig. 7) fehlte, in dem gleichen tetrameren Hintergrund viel stabiler (Fig. 9b, Kurven 1 und 4). Eine Folge dieses Ergebnisses ist, dass der durch trans-Erkennung vermittelte Abbau einer Subeinheit mit einem stabilisierenden aminoterminalen Rest von der Anwesenheit der zweiten Determinante (Multiubiquitinierungsstelle) innerhalb der trans-Zieleinheit abhängt. Bemerkenswerterweise zeigte dieses Ergebnis auch, dass ein oligomeres Protein sowohl kurzlebige als auch langlebige Subeinheiten enthalten kann. Tatsächlich waren, während die Subeinheit V~ΔK~βgal von V~ΔK~βgal*/R~K~ βgal im Retikulocytenextrakt langlebig war (tn-Wert ~11,5 Stunden; Fig. 9b, Kurve 4), waren die Subeinheiten R~K~βgal dieses Heterotetrameren viel instabiler, wobei die Subeinheit R~K~βgal von R~K~βgal*/V~ΔK~βgal einen tn-Wert von ~2,0 Stunden hatte (Fig. 9c, Kurve 10). Eine andere Folge dieser Ergebnisse ist, dass der Abbau der kurzlebigen Subeinheiten nicht durch die Anwesenheit langlebiger Subeinheiten innerhalb des gleichen oligomeren Proteins gehemmt wird. Im speziellen war der tn-Wert von 2,0 Stunden für die Subeinheit R~K~βgal im Retikulocytenextrakt der gleiche, ungeachtet dessen, ob diese Subeinheit innerhalb eines Homotetrameren lag (Fig. 9c, Kurve 7) oder von den langlebigen Subeinheiten V~ΔK~βgal (Fig. 9c, Kurve 10) umgeben war.
Der differenzierte Abbau einzelner Subeinheiten innerhalb von X-βgal-Heterotetrameren beruhte nicht auf einer schnellen Dissoziation/Reassoziation von X- βgal-Subeinheiten im Retikulocytenextrakt, die ermöglichen könnte, dass kurzlebige Subeinheiten anvisiert und abgebaut werden, während sie sich in einem monomeren Übergangszustand befinden. Das βgal Tetramer ist bekanntlich hoch stabil, was stark denaturalisierende Lösungsmittel für seine Dissoziation erfordert (Zipser, D., J. Mol. Biol. 7, S. 113-121 (1963); Gicol, D. u. a.. Biochim. Biophys. Acta. 113, S. 120-125 (1966)). Ferner, wenn markierte V~K~βgal-Homotetramere und ein Überschuss von unmarkierten R~ΔK~βgal-Homotetrameren zusammen im Retikulocytenextrakt inkubiert waren, waren die Subeinheiten V~K~βgal langlebig (tn-Wert ~50 Stunden), im Gegensatz zur Stoffwechselinstabilität der Subeinheit V~K~βgal in dem V~K~βgal*/R~ΔK~βgal-Heterotetrameren (tn-Wert ~3,3 Stunden; Fig. 9b, Kurve 2). Es wurde gefolgert, dass der Abbau eines oligomeren Proteins auf dem Weg der N-Terminus-Regel Subeinheit-spezifisch ist.

cis- gegen trans-Erkennung

Subeinheiten X~K~βgal mit einem stabilisierenden aminoterminalen Rest können zum Abbau lediglich in trans-Stellung (siehe weiter oben und Fig. 2b) anvisiert werden. Andererseits ist die Subeinheit R~K~βgal, welche beide Determinanten des Abbausignals enthält, entweder in cis oder in trans innerhalb von R~K~βgal*/ R~K~βgal und R~K~βgal*/R~ΔK~βgal, jedoch lediglich in cis innerhalb von R~K~ βgal*N~K~βgal und R~K~βgal*/V~ΔK~βgal anvisierbar (targetable) (Fig. 2 und 9c). Dessen ungeachtet waren die zeitlichen Abbauverläufe (ebenso wie die Ubiquitinierungsgrade) der Subeinheit R~K~βgal in einem Retikulocytenextrakt bei allen diesen tetrameren Hintergründen nicht unterscheidbar (Fig. 9c, Kurven 7 bis 10).
Diese Ergebnisse zeigten, dass die Möglichkeit einer trans-Erkennung die Abbaurate einer X-βgal-Subeinheit nicht erhöht, wenn die cis-Erkennungsart ebenfalls zugänglich ist. Gleichzeitig ist bei X-βgal die trans-Erkennung allein hinsichtlich ihrer Wirksamkeit der cis-Erkennung allein vergleichbar, weil die Unter einheit V~K~βgal (lediglich in trans anvisierbar) innerhalb von V~K~βgal*/R~K~ βgal oder V~K~βgal*/R~AK~βgal zu ~65% der für der für die Subeinheiten R~K~βgal beobachteten Rate abgebaut war, welche zumindest in cis anvisiert werden konnten (tn-Wert von ~3,3 Stunden bzw. ~2,0 Stunden; Fig. 9b, Kurven 1 und 2; Fig. 9c, Kurven 7 bis 10). Das Fehlen des Einflusses einer trans-Erkennung in Gegenwart der Option cis-Erkennung beruht nicht auf einer Hemmung der trans- Erkennungsart durch die cis-Art, insofern als die Subeinheit V~K~βgal mit nicht unterscheidbaren Raten innerhalb von V~K~βgal*/R~K~βgal oder V~K~βgal*/R~ ΔK~βgal abbaut war (Fig. 9b, Kurven 1 und 2). Eine wahrscheinliche Erklärung dieser Ergebnisse ist, dass die cis-Erkennung allein aus eichend für den Abbau einer Subeinheit X-βgal sein kann, um mit einer Rate zu verlaufen, die durch irgend eine andere Stufe auf dem Weg der N-Terminus-Regel begrenzt ist.

Über den Mechanismus und die allgemeine Gültigkeit der trans-Erkennung

Die Existenz des trans-targeting auf dem Weg der N-Terminus-Regel (Fig. 2, 9 und 10) zeigt, dass die Substraterkennung durch dieses proteolytische System Reinen linearen "tracking"-Mechanismus umfaßt, der benutzt werden könnte; um vor der Stufe der Ubiquitinierung zu ermitteln, ob beide Determinanten des Abbausignals innerhalb der gleichen Polypeptidkette liegen. Ein trans-targeting ist infolgedessen mit dem früher vorgeschlagenen Modell (Bachmair, A. und A. Varshavsky; Cell 56, S. 1019-1032 (1989)) übereinstimmend, bei dem ein N-Terminus-erkennendes (E3) Protein (entweder allein oder komplexiert mit einen spezifischen Ubiquitin-konjugierenden (E2) Enzym) eine Bindungsstelle für einen destabilisierenden aminoterminalen Rest des Substrats und eine lysinbindende Stelle aufweist Beide dieser Stellen müssen für die mehrfache Ubiquitinierung besetzt werden, um am gebundenen Lysin eines proteolytischen Substrats zu beginnen.
Wenn die beiden Bindungstellen der Erkennungskomponente untereinander räumlich festgelegt sind, erfordert das Binden des Substrats entweder eine spezielle räumliche Anordnung der beiden Determinanten des Substrats oder eine Konformationsbeweglichkeit dieser Determinanten untereinander, so dass ihre korrekte räumliche Anordnung vorübergehend, jedoch häufig genug für beide erreicht wird, um durch den Erkennungskomplex gebunden zu werden (Bachmair, A. und A. Varshavsky, Geil 56, S. 1019-1032 (1989)).
Eine segmentale Mobilität der die Determinante enthaltenden Region (bzw. Regionen) kann sowohl die cis- als auch trans-Erkennung in einem kurzlebigen X-βgal ausmachen. In der Tat ist die Nicht-βgal-Extension an den Aminotermini der X- βgal-Proteine (Fig. 7), die von einer internen Region des lac-Repressors abgeleitet sind, wahrscheinlich gestört (segmentmäßig mobil), wenn sie in einer unnatürlichen (aminoterminalen) Stellung innerhalb eines nicht-verwandten Proteins wie βgal vorliegen (Bachmair, A. und A. Varshavsky, Cell 56, S. 10-19-1032 (1989)). Aufgrund der segmentalen Mobilität der Extension könnten ihre Reste Lys 15/17 (Fig. 7) vorübergehend in räumlicher Nachbarschaft zu einem destabilisierenden aminoterminalen Rest von entweder ihrer eigenen oder einer unterschiedlichen Subeinheit innerhalb desselben X-βgal-Tetrameren auftreten, wobei letzteres eine trans-Erkennung erlaubt.

Spezifität der Subeinheit beim Proteinabbau

Wir zeigten (Fig. 9 und vorhergehende Diskussion), dass lediglich jene Subeinheiten eines stoffwechselinstabilen X-βgat-Tetrameren, welche die zweite (Jedoch nicht notwendigerweise die erste) Determinante des Abbausignals enthalten, tatsächlich abgebaut werden. Mit anderen Worten: Der Abbau ist denjenigen Subeinheiten zuzuordnen, die ubiquitiniert werden können. Was könnte der diesem neuen Aspekt des Proteinumsatzes zugrundeliegende Mechanismus sein? In einer Klasse von Modellen ist der selektive (und offensichtlich prozessive) Abbau (Chau, V. u. a., Science 243, S. 1576-1583 (1989); Hershko, A., J. Biol. Chem. 263, S. 15237-15240 (1988)) einer Subeinheit mit einer Multiubiquitinkette vorübergehend an ihre Dissoziation von benachbarten Subeinheiten innerhalb eines oligomeren Substrats gekoppelt. Damit dies eintritt, erkennt die ATP-abhängige "stromabwärts gelegene" Protease (Hershko, A., J. Biol. Chem. 263, S. 15237- 15240 (1988)) die Multiubiquitinkette (Chau, V. u. a., Science 243, S. 1576-1583 (1989)), benutzt sie, um die Subeinheit zu identifizieren und zu zerstören, und geht der Polypeptidkette der Subeinheit entlang, vermutlich unter Entfaltung derselben vor dem Abbau. A priori brauchen die Dissoziation und der Abbau zeitlich nicht gekoppelt zu sein Ein mechanochemisches Verfahrensanalogon zum obigen könnte angewandt werden, um die Subeinheit, welche die Multiubiquitinkette enthält, von einem oligomeren Substrat zu dissoziieren, mit dem Abbau der Subeinheit, eher nach ihrer Dissoziation als diese begleitend. (Es wurde weiter ober gezeigt, dass die spontane Dissoziation/Reassoziation von X-βgal-Subeinheiten nicht für die beobachtete Subeinheit-Spezifizität des X-βgal-Abbaus nach dem Weg der N-Terminus-Regel verantwortlich ist.)
Die Subeinheit-Spezifizität zeigt sich wahrscheinlich als ein allgemeines Merkmal eines selektiven Proteinabbaus, weil die Veränderung der Funktionen von Proteinkomplexen über eine kombinatorische Variation ihrer Subeinheitzusammensetzung ein allgemeines Thema bei der biologischen Regulation ist (Abel, T. und T. Maniatis, Nature 341, S. 24-25 (1989); Goutte, C. und A. D. Johnson, Cell 52, S. 875-882 (1988)). Beispielweise werden viele regulatorische Proteine in unterschiedlichen, jedoch sich überlappenden Regionen eines sich entwickelnden Embryos exprimiert, wobei die Zelldetermination mindestens teilweise von der exakten Kombination dieser Proteine abhängt (von denen viele kurzlebig sind), welche in einer gegebenen Region bei unterschiedlichen Stadien der Embryogenese vorliegen (Ingham, P. W., Nature 335, S. 25-34 (1988); Scott. M.P. und S. B. Carroll, Cell 51, S. 689-698 (1987)). Ein Subeinheit-spezifischer Abbau kann auch der periodischen Zerstörung von Cyclin, eine Subeinheit des Multiproteinkomplexes, der den Zellzyklusverlauf in Eukaryonten reguliert (Evans, T. u.a., Cell 33, S. 389-396 (1983); Murray, NW. u. a., Nature 339, S. 280-286 (1989)) Die Zweideterminanten-Natur des Abbausignals, und die Möglichkeit einer cis- oder trans-Erkennung kann einem Subeinheit-spezifischen Abbau eine zusätzliche Flexibilität verleihen, indem man die Zugänglichkeit einer der Determinanten von spezifischen Phophorylierungsvorgängen innerhalb eines Multisubeinheitsubstrats abhängig macht.
Die Allgemeingültigkeit dieses neuen Aspekts des Proteinumsatzes wird ferner durch die neuerliche Entdeckung gestützt, dass ein Subeinheit-spezifischer Abbau auch für zumindest eines der beiden Abbausignale charakteristisch ist, welche in den natürlichen kurzlebigen Transkriptionsrepressor MATα2 der Hefe S. cerevisiae vorliegt. Keines dieser Signale arbeitet über den Weg der N-Terminus- Regel (vgl. Beispiel 2).

Verfahren

Die E. coli-Expressionsvektoren pKKUb-Arg-βgal und pKKUb-Val-βgal auf Basis von pKK233-2, welche Ub-R~K~βgal bzw. Ub-V~K~βgal codieren, wurden beschrieben (Gonda, D. K u. a., J. Biol. Chem. 264, S. 16700-16712 (1989)). Die Konstrukte, welche Ub-R~ΔK~βgal Ub-V~ΔK~βgal codieren, wurden wie folgt hergestellt. Das kleine SalI/MstII-Fragment von pKKUb-Val-βgal wurde in M13mpl8Δ (ein Derivat von M13mpl8 (Ausubet, F. M. u. a., Gurrent Protocols in Molecular Biology, Wiley-Interscience, New York, 1987), dem die Region zwischen den Steilen AvaII und EcoRI fehlt) subgeklont und eine Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese (Ausubel, F. M. u. a., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley- Interscience, New York, 1987) wurde zur Erzeugung einer Steile Bio/II an der die Codonen 39 und 40 des Leserasters V~K~βgal umfassenden Stellung durchgeführt. Das kleine Fragment SalI/MstII des erhaltenen Konstrukts wurde mit dem vektorhaltigen Fragment SalI/MstII von pKKUb-Val-βgal verknüpft. Das große Fragment BamHI/BalII des erhaltenen Konstrukts wurde mit dem kleinen Fragment BamHI des früher beschriebenen Leu-DHFR-Konsfiutcts V (Bachrnair, A. und A. Varshavsky, Cell 56, S. 1019-1032 (1989)) verknüpft, was zu pKKUb- Val~ΔLys~βgal führte. Infolge des übernommenen Konstruktionswegs wurde Leu- Ala an den Stellungen 39 bis 40 des ursprünglichen V~K~βgal in V~ΔK~βgal durch Gly-Ser ersetzt. Diese Veränderungen waren auf die E. coli tacl-codierte 45- Reste-Extension beschränkt, welche an den Aminotermini unserer X-βgal- Testproteine vorlagen (Bachmair, A. und A. Varshavsky, Cell 56. S. 1019-1032 (1989)). Zum Aufbau von pKKUb-Arg~ΔLys~βgal wurde das große Fragment SalI/BamHI von pKKUb-Val~ΔLys~βgal mit dem kleinen Fragment SalI/BamHI von pKKUb Arg-βgal verknüpft. Ub-X-βgal-Proteine wurden in E. coli exprimiert, mit [³&sup5;S]Methionin metabolisch markiert und durch Affinitätschromatographie an Aminophenylthiopyranogalactosid- (APTG-) Agarose gereinigt, wie beschrieben (vgl. Gonda, D. K. u. a., J. Biol. Chem. 264, 16700-16712 (1989)), jedoch mit der Ausnahme, dass 3 mCi von ³&sup5;S-Translabel (ICN) zur Markierung benutzt wurden, und aus dem Endlagerungspuffer MgCl&sub2; weggelassen wurde. Die spezifische Radioaktivität von Ub-X-βgal war 6-8 · 10&sup5; cpm/ug. Es wurde ein Kaninchen-Retikulocytenextrakt hergestellt und auf den Abbau von X-βgal-Proteinen getestet, wie früher beschrieben (Gonda, D. K. u. a., J. Biol. Chem. 264. S. 16700-16712 (1989)), einschließlich einer 10minütigen Vorinkubation im ATP-verarmten Extrakt (Gonda, D. K. u. a., J Biol. Chem. 264, S. 16700-16712 (1989)), um Ub-X- βgal Ubiquitin zu entziehst In 6,5% Polyacrylamid-, 0,18% Bisacrylamid-Gelen wurde eine SDS-PAGE [SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese] durchgeführt, woran sich die Fluorographie anschloss. Der ATP- und Ubiquitin-abhängige Abbau von X-βgal im Retikulocytenextrakt gehorchte zumindest die ersten zwei Stunden einer Kinetik der ersten Drdnung, was es möglich machte, den Abbau verschiedener X-βgal-Proteine durch Vergleich ihrer Halbwertzeiten im Extrakt zu vergleichen (Gonda, D. K. u. a., J. Biol. Chem. 264, S. 16700-16712 (1989)). Der tn-Wert von R~K~βgal veränderte sich nicht, wenn seine Anfang im Extrakt auf das 20fache herabgesetzt wurde.
Varianten von Ub-X-βgal-Subeinheiten wurden konstruiert, (als Homotetramere) hergestellt und wie zuvor beschrieben gereinigt. Die Proteingesamtkonzentration wurde unter Anwendung des Bradford-Tests (BioRad) gemessen. Zur Herstellung von Heterotetrameren (Ullman, A. und J. Monod, Biochem. Biophys. Res. Commun. 35, S. 35-42 (1969)) von Ub-X-βgal wurde ein Gemisch von 18 ug [³&sup5;S]Ub-X- βgal und 180 ug unmarkiertem Ub-X-βgal (deren Aminosäuresequenz entweder identisch mit oder unterschiedlich von derjenigen des markierten Ub-X-βgal war) bei einer Gesamtproteinkonzentration von 1,5 bis 3 mg/ml in einem Lagerungspuffer [50% (Volumen/Volumen) Glycerin, 0,1 mM Na-EDTA, 1 mM Dithiothreit (DTT), 40 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5)] auf eine Proteinkonzentration von 80 ug/ml mit dem Puffer A (10 mM Na-EDTA, 5 mM DTT, 20 mM Na-HEPES (pH- Wert 7,2)) mit einem Gehalt an 2 M NaCl und 8 M (entionisiertem) Harnstoff ver dünnt. Nach 1 Stunde bei 0ºC wurde die Lösung gegen Veränderungen des Puffers A dialysiert, der nach und nach 8 M Harnstoff, 4 M Harnstoff und 10 mM NaGI, 2 M Harnstoff und 10 mM NaCl, 1 M Harnstoff und 10 mM NaCl enthielt, und schließlich gegenüber 2 Veränderungen des Puffers A plus 10 mM NaCl. Die Dialyse wurde mit 10 Ub-X-βgal-Proben zusammen bei 4ºC in einer Dialysevorrichtung Multiple Dialyzer (Spectrum) während ~14 Stunden pro Pufferveränderung durchgeführt. Jede der dialysierten Proben wurde auf 1,6 M in NaCl und 10 mM in MgCl&sub2; gebracht, zu ~0,4 ml APTG-Agarose gegeben (Gonda, D. K. u. a., J Biol. Chem. 264, S. 16700-16712 (1989)) und über Nacht bei 4ºC geschüttelt. Die Suspension wurde sodann in Säulen gebracht, die wie beschrieben (Gonda, D. K. u. a., J. Biol. Chem. 264, S. 16700-16712 (1989)) für die Affinitätsreinigung von Ub-X-βgal vorbereitet waren. Bei einem Verhältnis 1 zu 10 von markierten zu unmarkierten Ub-X-βgal-Subeinheiten sollte eine statistische Reassoziation zu 75 % der markierten Subeinheiten führen, welche in Tetrameren mit einem Gehalt an einer markierten Subeinheit pro Tetramer liegen, wobei der größte Teil des Rests der markierten Subeinheiten (23%) bei zwei Subeinheiten pro Tetramer vorliegen. In einem Test auf diese Voraussage wurde ein Gemisch 1 zu 10 von zwei Homotetrameren auf Basis von βgal mit einem Gehalt an aminoterminalen Extensionen verschiedener Größen dem Dissoziations/Reassoziationsprotokoll unterzogen. Die Elektrophorese der erhaltenen Tetrameren in einem nicht-denaturierenden Gel ergab die erwartete Verteilung von heterotetrameren Zusammensetzungen. Die enzymatische Aktivität der rekonstituierten Ub-X-βgal-Proteine (bestimmt wie beschrieben von Guarente, L., Meth. Enzymol. 101, S. 181-182 (1983)) schwankte zwischen verschiedenen Präparaten von 50 bis 75% der Aktivität ihrer anfänglichen (homotetrameren) Gegenstücke. Abbauversuche in Retikulocytenextrakt und die SDS-PAGE wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt. Weniger als 0,4% der anfänglichen oder rekonstituierten X-βgal- Tetrameren waren in einem ATP-verarmten Retikulocytenextrakt innerhalb von 2 Stunden abgebaut.
Der Ub-E~ΔK~βgal codierende Expressionsvektor pKKUb-Glu~ΔLys~βgal wurde, wie weiter oben für pKKUb-Arg~ΔLys~βgal beschrieben, konstruiert. Ub-X-βgal- Heterotetramere wurden aus den entsprechenden Homotetrameren wie zuvor beschrieben hergestellt. Die Behandlung mit RNAase (Gonda, D. K. u. a., J. Biol. Chem. 264, S. 16700-16712 (1989)) wurde durch Inkubieren des Retikulocytenextrakts während 45 Minuten bei 37ºC mit 3 Einheiten/ml von RNAase A-Agarose (Sigma), Zentrifugieren zur Entfernung der immobilisierten RNAase und Zugabe von RNAsin (RNAase-Inhibitor (Promega Biotech)) zu 1.500 Einheiten/ml. Reaktionen, ergänzt mit tRNA, umfassten 50 ug/ml gereinigte Gesamt-tRNA von Rinderleber (Boehringer).

Beispiel 2

Eine Stoffwechselinstabilität ist für Regulatorproteine charakteristisch, deren Konzentrationen in vivo als Funktion der Zeit schwanken müssen. In diesem Beispiel wird gezeigt, dass der Zelltyp-spezifische α2-Repressor der Hefe S. cerevisiae eine Halbwertzeit von lediglich ~5 Minuten besitzt. Jede der beiden strukturellen Domänen von α2 trägt eine Sequenz, die unabhängig auf ein normalerweise langlebiges Protein zur schnellen Zerstörung abzielen kann. Überdies wird hier gezeigt, dass diese beiden Abbausignale über unterschiedliche Mechanismen arbeiten. Es wurden Mutanten, die des Abbaus von α2 ermangeln, isoliert, und es wurde gefunden, dass diese eine Anzahl weiterer Defekte haben, was zeigt, dass die für den α2-Umsatz verantwortlichen Wege Komponenten mit Mehrfachfunktionen umfassen. Diese Einblicke ermöglichten auch den Nachweis, dass eine kurzlebige Subeinheit eines oligomeren Proteins in vivo abgebaut werden kann, ohne andere, langlebige Subeinheiten des gleichen Proteins zu destabilisieren. Mit anderen Worten: Es wird weiter unten gezeigt, dass mindestens eines der beiden Abbausignale in α2 (von denen beide von dem Signal auf Basis der N-Terminus-Regel verschieden sind) auf eine Subeinheit-spezifische Weise arbeiten, wodurch gezeigt wird, dass ein Subeinheit-spezifischer Abbau nicht auf den Weg der N-Terminus-Regel beschränkt ist.

Die Fusion von α2 an β-Galactosidase führt zu einem kurzlebigen Protein

Zur Untersuchung des Abbaus in vivo von α2 wurde E. coli-β-galactosidase (βgal) als eine immunologische Markierung [tag] verwendet, welche eine Immunopräzipitation von α2-βgal-Fusionsproteinen mit einem monoklonalen Antikörper gegenüber βgal ermöglicht. Ein hohes Kopieplasmid, das α2-βgal codiert, tragende Zellen wurden mit [³&sup5;S]-Methionin 7 Minuten bei 30ºC markiert, gefolgt von einer Pulsmarkierung (chase) in Gegenwart von Translationsinhibitoren, einer Extraktion, einem Ausfällen mit dem Antikörper gegenüber βgal und der Elektrophorese SDS-PAGE. βgal, das lediglich die ersten 3 Reste von α2 an seinem Aminoterminus trug, war stoffwechselstabil, ohne einen nachweisbaren Abbau während des Pulsmarkierungszeitraums (Fig. 11c). Im Gegensatz hierzu führte die Bindung der α2-Sequenz voller Länge mit 210 Resten an βgal zu einem kurzlebigen Protein (Fig. 11b).
Der Abbau von α2-βgal in vivo folgte nicht der Kinetik erster Ordnung sondern verlangsamte sich vielmehr mit der Zeit. Eine ähnliches Phänomen wurde mit βgal-Derivaten beobachtet, die zum Abbau über den Weg der N-Terminus-Regel bestimmt waren (Bachmair, A. u. a., Science 234, S. 179-186 (1986)). Da eine einzelne Halbwertzeit nicht einem Protein zugeordnet werden kann, das mit einer Kinetik, die nicht erster Ordnung ist, abgebaut wurde, wurden "anfängliche Halbwertzeiten berechnet (nachfolgend mit "" bezeichnet) unter der Annahme einer Kinetik erster Ordnung zwischen der Zugabezeit (pulse) (Zeit 0) und den Zeitpunkten des frühesten Auswaschens (chase) (10 oder 15 Minuten). Beispielsweise war der Wert "tn" von α2-βgal ~15 Minuten bei 30ºC.
Ein Teil des kurzlebigen α2-βgal wurde in ein kleineres Protein homeo in Fig. 11b) übergeführt, das während des Auswaschens akkumulierte und infolgedessen wahrscheinlich das Produkt einer Spaltung in vivo war. Die Aminosäuresequenzierung des gereinigten Spaltprodukts ergab, dass die Hauptspaltstelle innerhalb der DNA-bindenden Homeodomäne bei α2 (Laughon, A. und M. P. Scott, Nature 310, S. 25-31 (1984); Shepherd, J. C. W. u. a., Nature 310, S. 70-71 (1984); Porter, S. D. und M. Smith, Nature 320, S. 766-768 (1986); Hall, M. N. und A. D. Johnson, Science 237, S. 1007-1012 (1987)) zwischen den Resten 165 und 166 (Fig. 11d) in der Positionierungsspirale des Motivs Helix-Wende-Helix lag. Die Fließgleichgewichtskonzentration des Spaltprodukts war um das 6fache höher als diejenige des intakten α2-βgal, zumindest teilweise auf Grund seiner längeren Halbwertzeit (~2 Stunden). Da zu erwarten ist, dass diese Spaltung den Repressor inaktiviert, kann sie einen Mechanismus für das Freimachen von α2 von dessen DNA-Bindungsstellen während eines Wechsels von einer α- zu einer a-Zelle bereitstellen; diese Möglichkeit bleibt noch zu testen.

Der intakte α2-Repressor ist extrem kurzlebig

Zur Prüfung des Abbaus in vivo des unmodifizierten α2-Repressors wurde ein polyklonaler Antikörper gegenüber α2 erzeugt. Dieser affinitätgereinigte Antikörper immunopräzipitierte spezifisch das 24-kD α2-Protein aus Extrakten von α- Zellen der Hefe (Fig. 12a). Durch immunofluoreszentes Anfärben unter Verwendung dieses Antikörpers wurde auch ermittelt, dass α2 ein überwiegend nukleares Protein ist.
Durch pulse-chase-Analyse wurde gefunden, dass der α2-Repressor in vivo extrem kurzlebig ist (Fig. 12b, 12c). Seine Halbwertzeit von ~5 Minuten bei 30ºC war ~ um das 3fache kürzer als "t¹/2" des α2-βgal-Proteins (Fig. 12b). Überdies war der α2-Repressor, im Unterschied von α2-βgal, mit einer Kinetik von offensichtlich erster Ordnung abgebaut, was zeigt, dass der größte Teil der α2- Moleküle in der Zelle in gleicher Weise gegenüber Abbau empfindlich war. Keine diskreten α2-Abbauzwischenprodukte akkumulierten zu nachweisbaren Mengen während des Auswaschens bei der Pulsmarkierung (wobei man entweder mit [³&sup5;S]Methionin oder [³H]-Leucin markierte), was entweder eine schnelle Zerstörung von Zwischenprodukten oder eine hochprozessive Art der Proteolyse impliziert. Auf Grund der geringen Menge von α2 in α-Zellen, wurde gemäß Fig. 12b, c eine pulse-chase-Analyse unter Verwendung von Zeilen vorgenommen, welche MATα auf einem hohen Kopieplasmid trugen. Jedoch beruhte der schnelle Abbau von α2 nicht auf seiner Überproduktion (durch Analogie z. B. zur Stoffwechselinstabilität ribosomaler Proteine, synthetisiert in stöchiometrischem Überschuss (Mai- cas, E u. a., Mol. Cell Biol. 8, S. 169-175 (1988); Tsay, Y-R., u. a., Genes Dev. 2, S. 664-676 (1988)), insofern als die Halbwertzeit von α2, exprimiert aus einer einzelnen chromosomalen Kopie von MATα ~4 Minuten bei 30ºC war, nahe dem obigen Wert t¹/&sub2;. Eine andere Folgerung aus diesem Ergebnisses ist, dass der Weg bzw. die Wege, die für einen α2 Abbau verantwortlich ist bzw. sind, ziemlich unterhalb der Sättigung bei normalen Zellspiegeln des Repressors arbeitet bzw. arbeiten.

Jede der beiden Domänen von α2 enthält ein Abbausignal

Die Stoffwechselinstabilität von α2 könnte eine Folge entweder einer globalen Eigenschaft des Proteins, wie z. B. eine geringe Konformationsstabilität (Parsell, D. A. und R. T. Sauer, J. Biol. Chem. 264, S. 7590-7595 (1989)) oder ein lokalisierten Strukturmerkmals sein. Letzteres wäre analog zur Signalsequenz, die auf Proteine abzielen zur Unterscheidung von subzellulären Abschnitten (Dingwall, C. und R. A. Laskey, Ann. Rev. Cell Biol. 2, S. 367-390 (1986); Colman, A. und C. Robinson, Cell 46, S. 321-322 (1986); Warren, G., Nature 327, S. 17-18 (1987)). Eine Untersuchung der Abbausignale in α2 wurde durch Prüfung eines Satzes von α2-βgal-Fusionen mit Deletionen in dem α2-Rest durchgeführt (Fig. 13). Zwei Reihen von Deletionsderivaten von α2-βgal, die entweder an dem Aminoterminus von α2 oder an dem Carboxylterminus (die Verbindung zwischen der α2- und βgal-Sequenzen) begannen, wurden in S. cerevisiae exprimiert, und die Raten des Abbaus in vivo wurden bestimmt. Alle Konstrukte teilen die gleichen Wildtyp- Codierungssequenzen des E. coli βgal-Gens (lacZ), subgeklont aus pMC1871. Stoffwechselstabile (S) und -instabile (U) Proteine werden arbeitsmäßig als solche mit anfänglichen Halbwertzeiten in vivo von mehr als ~3 Stunden (geringer oder nicht nachweisbarer Abbau während der Auswaschperiode) bzw. weniger als ~20 Minuten definiert.
Über 2/3 der carboxylterminalen Region des α2-Rests mit 210 Resten konnten ohne signifikante Veränderung der Abbaurate entfernt werden. Fig. 13 zeigt zwei Reihen von Deletionsderivaten von α2-βgal, die entweder am Amino- oder an dem Carboxylterminus von α2 beginnen (an der Verbindung zwischen den α2- und βgal-Sequenzen), welche in S. cerevisiae exprimiert wurden, sowie die Raten des Abbaus in vivo. Beispielsweise war Δ68-210, das nur die ersten 67 Reste von α2 enthält, etwa so kurzlebig ("tn" von ~10 Minuten) wie das α2-βgal-Protein voller Länge. Jedoch führte die Deletion von 15 weiteren Resten in Richtung des Aminoterminus (Δ53-210) zu einem langlebigen α2-βgal-Derivat (Fig. 13). Deletionen, welche sich ferner in Richtung des Aminoterminus erstreckten, führten ebenfalls zu stoffwechselstabilen Proteinen. Es wurde gefolgert, dass die aminoterminale Region von α2 ein Abbausignal trägt, das auf ein normales langlebiges Protein, wie z. B. βgal, zum schnellen Abbau in vivo abzielt, und eine wesentliche Komponente dieses Signals innerhalb der Reste 53 bis 67 des Repressors liegt. Der genetische Beweis (siehe weiter unten) zeigte, dass dieses Abbausignal, unbelegt unter Verwendung von α2-βgal-Fusionen, auch für den Abbau des intakten (unfusionierten) α2 relevant ist.
Bemerkenswerterweise kann eine völlig unterschiedliche Region von α2 auch als ein Abbausignal wirken. Wenn nahezu 2/3 der aminoterminalen Region der α2- Sequenz entfernt waren, war das erhaltene α2-βgal-Derivat Δ2-135 annähernd zu kurzlebig ("nt": ~15 Minuten) wie α2-βgal von voller Länge (Fig. 13). Wie bei den carboxylterminalen Deletionen, wurde ein scharfer Übergang zwischen stoffwechselinstabilen und -stabilen α2-βgal-Derivaten ebenfalls beobachtet: Die Entfernung von gerade 5 Resten mehr jenseits des Rests 135 ergab ein langlebiges Protein (Δ4-140, Fig. 13). Infolgedessen kann die carboxylterminale 75-Reste- Region von α2 einem sonst langlebigen Protein Stoffwechselinstabilität verleihen, und die Information innerhalb der Reste 136 bis 140 ist für diese Eigenschaft wesentlich.
Als Auftakt für ein detaillierteres Herausschneiden (dissection) des carboxylterminalen Abbausignals in α2 entfernten wir die Reste 158 bis 210 von dem kurz lebigen Protein Δ2-135. Das erhaltene Derivat, Δ2-135/158-210, war stoffwechselstabil (Fig. 13). Infolgedessen ist die Information stromabwärts vom Rest 157 und stromaufwärts vom Rest 141 für das Funktionieren des Abbausignals erforderlich.
Die in dem α2-Repressor unbelegten beiden unabhängigen Abbausignale gemäß obiger Analyse liegen in dessen aminoterminalen bzw. carboxylterminalen Bereichen. Schon früher wurde gezeigt, dass diese gleichen Bereiche als strukturell und funktionell unterschiedliche globuläre Domänen in dem Repressor vorliegen (Hall, M. N. und A. D. Johnson, Science 237, S. 1007-1012 (1987); Sauer, R. T. u. a., Genes Dev. 2, 807-816 (1988)). Überdies, wie weiter unten gezeigt wird, arbeiten die beiden Abbausignale in α2 über genetisch unterscheidbare Wege.

Isolierung von Mutanten, die bei dem α2 Abbau defekt sind

Die Halbwertzeit von α2 blieb in S. cerevisiae-Mutanten, defekt bei der vakuolaren (lysosomalen) Proteolyse oder auf dem Weg der N-Terminus-Regel, unverändert. Infolgedessen wurde ein genetisches Screening für in einem α2-Abbau beeinträchtigte Mutanten ausgedacht. Da der intrazelluläre Spiegel von α2-βgal eine Funktion von dessen Halbwertzeit ist, sollte ein Plattentest mit dem chromogenen βgal-Substrat X-Gal den Nachweis von Mutanten erlauben, bei denen α2- βgal stoffwechselstabilisiert ist. Beim aktuellen Screening wurde das kurzlebige Δ68-210-Protein (Fig. 13) verwendet, das das aminoterminale, aber nicht das carboxylterminale Abbausignal von α2 trägt. Zusätzlich zur Umgehung möglicher durch die Anwesenheit beider Signale in dem Protein voller Länge verursachter Komplikationen vermied auch die Verwendung von Δ68-210 die Bildung des verhältnismäßig langlebigen, βgal-enthaltenden Spaltprodukts, das mit dem α2-βgal voller Länge auftritt. Die Anwesenheit dieses Produkts würde die Empfindlichkeit des Screenings gegenüber Veränderungen im Fließgleichgewichtsgrad von α2- βgal beträchtlich verringert haben.
Aktuell wurden 20 Mutanten, bei denen das Δ68-210-Protein stoffwechselstabilisiert war, aus einen Screening von ~40.000 Überlebenden einer Ethylmethansulfonat-Mutagenese (EMS-Mutagenese) (Experimentelle Verfahren) erhalten. Die entsprechenden Mutationen umfassten mindestens 4 Komplementierungsgruppen. Pulse-chase-Versuche mit repräsentativen Allelen von Zweien der doa- (Abbau von alpha) Mutanten, die Mutanten doa1 und doa2, wurden durchgeführt. In diesen Mutanten war die Stoffwechselstabilität von Δ68-210 beträchtlich erhöht, mit keinem oder nur geringem Abbau innerhalb einer Stunde des Auswaschens (chase), im Gegensatz zum Wildtyp "tn" von ~10 Minuten (Fig. 13 und 14).
Fig. 14a fasst die Ergebnisse des genetischen Screenings für Mutanten zusammen, die beim Abbau des Δ68-210-Derivats von α2-βgal, das einen, jedoch nicht beide α2-Abbausignale trägt, defekt sind. Fig. 14b zeigt Ergebnisse der pulse- chase-Analyse des Δ68-210-Proteins in Wildtypzellen und in doa-Mutanten bei 36ºC. Fig. 14c zeigt Ergebnisse von Tests, welche die Fähigkeit verschiedener Stämme, den intakten (nicht an βgal fusionierten) Repressor α2 bei 36ºC messen.
Die doa-Mutanten wurden sodann auf ihre Fähigkeit geprüft, den intakten (unfusionierten) α2-Repressor abzubauen (Fig. 14c). In jedem getesteten Fall (wobei 5 Mutanten zumindest 3 Komplementierungsgruppen repräsentieren) war die Stoffwechselstabilität von α2 erhöht, wobei die Halbwertzeit bezüglich des Wildtyps um das 2- bis 7fache anstieg. Es wurde gefolgert, dass das aminoterminale Abbausignal in α2, identifiziert durch die Analyse von α2-βgal-Fusionen, in dem bona fide-Repressor ebenfalls arbeitet. Diese Ergebnisse bestätigen die Anwendung von α2-βgal-Fusionen, um vermeintliche Abbausignale in α2 ausfindig zu machen, und eines Screenings auf Basis von βgal, um Mutanten bei einem α2 Abbau zu isolieren.
Während eine detaillierte Beschreibung der doa-Mutanten außerhalb des Bereichs vorliegender Erfindung liegt, bemerken wir, dass bei Tetraden-Analysen eine Anzahl zusätzlicher Phenotypen sich zusammen mit dem α2-Abbaudefekt abtrennten (vgl. Experimentelle Verfahren). Einige der doa-Mutanten waren unfähig, als homozygote doa/doa-Diploide Sporen zu bilden. Das Wachstum von mindestens zwei Mutanten war temperaturempfindlich, und mehrere Mutanten hatten verringerte Wachstumsraten bei Normaltemperaturen (23-30ºC). Insofern als die pleiotropen Wirkungen unwahrscheinlich auf die Stoffwechselstabilisation von α2 als solchem zurückzuführen sind (Nasmyth, K und D. Shore, Science 237, S. 1162-1170 (1987); Herskowitz, I., Microbiol. Rev. 52, S. 536-553 (1988)) zeigen sie, dass die Wege, auf denen α2 abgebaut wird, Mehrfachfunktionen in Hefe besitzen. Diese Funktionen umfassen vermutlich den Abbau anderer Proteine, deren schneller Umsatz physiologisch wesentlich ist.

Die beiden Abbausignale in α2 arbeiten über unterschiedliche Wege

Das Δ2-135-Derivat von α2-βgal, welches nur das carboxylterminale Abbauprodukt von α2 trägt (Fig. 13), wurde in 3 der doa-Mutanten, identifiziert durch ihre Defekte beim Abbau eines α2-βgal-Derivats mit einem Gehalt an lediglich dem aminoterminalen Signal, eingeführt. Das Δ2-135-Protein wurde weiter bei Wildtyp-Raten in den Mutanten abgebaut (Fig. 15a). Es wurde gefolgert, dass die beiden in α2 unter Verwendung des α2-βgal-Verfahrens nachweisbaren Abbausignale auf genetisch unterscheidbaren Wegen arbeiten. Wie zuvor diskutiert (Fig. 14), ist das aminoterminale Abbausignal nicht nur innerhalb von α2-βgal, sondern auch innerhalb des intakten (unfusionierten) α2-Repressors aktiv. Ob das carboxylterminale Signal tatsächlich zur Stoffwechselinstabilität von intaktem α2 beiträgt, bleibt noch zu ermitteln. Diese Ungewissheit beeinflusst jedoch nicht die Folgerung über die mechanistische Differenz zwischen den amino- und carboxylterminalen Abbauprodukten in α2. Ein unabhängiger Beleg für diese Schlussfolgerung wird im folgenden präsentiert.

Der Abbau eines Proteins mit Multisubeinheiten ist Subeinheit-spezifisch

Eine neuere Arbeit hat gezeigt, dass das α2-Homodimer, während es einer selektiven Bindung an die Operatoren a-zellspezifischer Gene fähig ist, es selbst für deren transkriptionale Repression unzureichend ist (Hall, M. N. und A. D. Johnson, Science 237, S. 1007-1012 (1987)). Es ist auch ein zweites Protein, MCM1 (GRM, PRTF) erforderlich (Keleher, C. A. u. a., Gell 53, S. 927-936 (1988); Passmore, S. u. a., Genes Dev. 3, S. 921-935 (1989); Jarvis, E E u. a., Genes Dev. 3, S. 936-945 (1989)). Ein α2-Dimer und ein MCM1-Dimer bilden offensichtlich einen tetrameren Repressor, der die Transkription von a-zellspezifischen Genen abbiegt. MGM1 liegt in allen drei Zelltypen von S. cerevisiae vor und bildet mit mehreren verschiedenen Regulatorproteinen Komplexe. Infolgedessen ist es wahrscheinlich, dass MCM1 ein reichlicheres und stoffwechselstabileres Protein als α2 ist. Dies lässt die Frage erheben, ob das Schicksal von MCM1 in einem tetrameren Komplex mit dem kurzlebigen α2-Protein von demjenigen des α2 selbst verschieden ist. Allgemeiner gesagt, es könnte gefragt werden, ob die Mechanismen des Proteinabbaus in vivo derart sind, dass ein oligomeres Protein sowohl langlebige als auch kurzlebige Subeinheiten enthalten kann. Die Gestaltung der Versuche eines "Subeinheitvermischens" in vivo, welche diese Frage ansprechen, ist in Fig. 16 dargestellt.
Wie zuvor beschrieben, liegen in vivo die anfängliche α2-βgal-Fusion und einige von deren Deletionsvarianten als extrem kurzlebige Homotetramere vor (Fig. 13 und 16a), während andere homotetramere Derivate von α2-βgal stoffwechselstabil sind (Fig. 13 und 16b). Was wäre das metabolische Schicksal von einzelnen Subeinheiten innerhalb eines α2-βgal-Heterotetrameren, in dem ein Großteil von Subeinheiten entweder vom kurzlebigen oder vom langlebigen Typ ist (Fig. 16c, d)? Beispielsweise, wenn eine α2-βgal-Subeinheit, die langlebig ist, innerhalb eines Homotetrameren (Fig. 16b) vorliegt, anstelle innerhalb eines Heterotetrameren mit einem Gehalt an einem Überschuß von kurzlebigen α2-βgal-Derivaten (Fig. 16c), bleibt dann die langlebige Subeinheit langlebig? Mit anderen Worten: Es wurde gefragt, ob die Abbaumaschinerie in vivo diese Subeinheiten eines ein Abbausignal tragenden oligomeren Proteins von denjenigen unterscheiden kann, die keines aufweisen, oder ob ein ganzes Oligomer auf eine Zerstörung anvisiert wird, auch wenn nur ein Subset seiner Untereinheiten Abbausignale trägt.
Es wurden gemischte Tetramere mit beeinflussten (biased) Subeinheitverhältnissen durch Exprimieren einer der α2-βgal-Subeinheiten aus einem hohen Kopieplasmid, und der anderen aus einem niederen Kopieplasmid in der gleichen Zelle in vivo gebildet (Hall, M. N. u. a., Cell 36, S. 1057-1065 (1984); Hall, M. N. und A. D. Johnson, Science 237, S. 1007-1012 (1987)). Weil die kurzlebigen (ein Abbausignal enthaltenden) α2-βgal-Subeinheiten größer als ihre langlebigen Gegenstücke sind (Fig. 13 und 16), können sie durch SDS-PAGE analysiert werden, was die gleichzeitige Bestimmung der Stoffwechselstabilitäten beider Gattungen ermöglicht. In zwei derartigen Versuchen, bei denen ein Überschuss an der das Abbausignal enthaltenden Subeinheit Δ68-210 mit sowohl der langlebigen Subeinheit Δ4-210 als auch der Subeinheit Δ14-210 coexprimiert wurde, blieben die Subeinheiten, welche in einem Homotetrameren langlebig waren, auch innerhalb eines Heterotetrameren langlebig, das einen Überschuss an Subeinheiten enthielt, die das aminoterminale Abbausignal von α2 trugen (Fig. 17a). Eine alternative Auslegung dieses Ergebnisses (Fig. 17a) ist, dass beim Coexprimieren beider Typen von α2-βgal-Subeinheiten sich Homotetramere mit einer starken Bevorzugung gegenüber Heterotetrameren gebildet haben. Eine andere Möglichkeit ist, dass langlebige Subeinheiten wie Δ14-210 den Abbau von sonst kurzlebigen Subeinheiten wie Δ68-210, wenn sie innerhalb des gleichen Heterotetrameren vorliegen, gehemmt haben können.
Kontrollversuche belegten, dass die zuvor beschriebenen Ergebnisse nicht aus dem Fehlen der Bildung eines Heterotetrameren in vivo resultieren können. Diese Kontrollversuche wurden durch die Tatsache möglich gemacht, dass der affinitätsgereinigte Antikörper gegen α2 (vgl. Experimentelle Verfahren) keine α2-βgal- Fusionen mit weniger als 26 aminoterminalen Resten des Rests α2 ausfällt. Z. B. wurde das Protein Δ26-210 (Fig. 13) durch den Antikörper gegen βgal ausgefällt, wurde jedoch nicht aus dem gleichen Extrakt durch den Antikörper gegen α2 ausgefällt (Fig. 17b). Im Gegensatz hierzu konnten, wenn Zellen Δ26-210 (aus einem hohen Kopieplasmid) und Δ68-210 (aus einem niederen Kopieplasmid) coexprimierten, die Subeinheit Δ26-210 durch ein Anti-βgal oder Anti-α2 ausgefällt werden (Fig. 17c). Infolgedessen bildeten sich Δ26-210/Δ68-210-Heterotetramere tatsächlich in vivo, was die Copräzipitation von Δ26-210 durch den Antikörper gegen α2 ermöglicht. Eine derartige Copräzipitation wurde auch mit Δ14-210 erhalten, das anstelle von Δ26-210 eingesetzt wurde, und wurde durch Vorbehandlung der Proben mit SDS völlig zerstört.
Wenn Anti-α2 zur Immunpräzipitation verwendet wurde, fand man, das die Untereinheit Δ26-210 zusammen mit Δ68-210 während des Auswaschens (Fig. 17c) verschwand. Im Gegensatz hierzu, wenn Anti-βgal verwendet wurde, zeigte der gleiche Versuch, dass Δ26-210 in Gegenwart eines Überschusses der das Abbausignal tragenden Subeinheit Δ68-210 nicht kurzlebig wurde (Fig. 17). Das offensichtliche Verschwinden von Δ26-210 während des Auswaschens (Fig. 17c) musste deshalb aufgrund des Abbaus von Δ68-210, das in gemischten Tetrameren mit Δ26-210 vorliegt, erfolgen, wobei letztere Subeinheit mit Anti-α2 nur über die Subeinheit Δ68-210 innerhalb des gleichen Heterotetrameren ausfällbar ist. Somit hemmten Subeinheiten, denen das aminoterminate Abbausignal fehlt, nicht die Zerstörung der das Signal tragenden Subeinheiten, auch wenn letztere innerhalb des Heterotetrameren in der Minderheit waren. Wir folgern, dass der Abbau in vivo eines Proteins mit Multisubeinheiten, wie z. B. α2-βgal, Subeinheit-spezifisch ist, d. h., dass ein oligomeres Protein sowohl langlebige als auch kurzlebige Subeinheiten enthalten kann.

Hemmung des carboxylterminalen Abbausignals von α2 in heteromeren Proteinkomplexen

Es wurde eine Reihe von Subeinheitmischversuchen in vivo analog denjenigen in Fig. 17a, durchgeführt, unter Verwendung von Δ2-135, ein α2-βgal-Derivat, welches nur das carboxylterminale Abbausignal trägt (Fig. 13 und 15b, c). Wie bei dem aminoterminalen Signal (Fig. 17a) wurde gefunden, dass eine Überexpression von Δ2-135 die lange Halbwertzeit der coexprimierten Subeinheit Δ26- 210, der ein Abbausignal fehlt, nicht beeinflusst (Fig. 13 und 15b). Kontrollversuche analog denjenigen mit dem aminoterminalen Abbausignal, unter Verwendung des Antikörpers gegen α2, bestätigten die Bildung gemischter Tetramerer in Zellen, die Δ2-135 und Δ26-210 coexprimieren. Interessanterweise wurde jedoch gefunden, dass eine Überexpression von Δ26-210 den Abbau der in den gleichen Zellen exprimierten Subeinheiten Δ2-135, welche das carboxylterminale Signal tragen, hemmen (Fig. 15c). Es ist unwahrscheinlich, dass diese Wirkung auf einem sterischen Abschirmen des carboxylterminalen Abbausignals in Heterotetrameren mit einem Gehalt an Δ2-135 beruht, da langlebige Deletionsderivate von α2-βgal, die nur kurze Segmente von beiden Enden des α2-Rests die gleiche trans-Inaktivierung des Abbausignals verursachten. Infolgedessen ist es wahrscheinlich, dass im Gegensatz zum aminoterminalen Abbausignal das carboxylterminale Signal von α2 inaktiv ist, wenn es in nur einer einzigen Subeinheit innerhalb eines oligomeren Zusammenbaus vorliegt. Die D&sub2;-Symmetrie des tetrameren βgal-Rests (Langley, K. E. u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, S. 1254- 1257 (1975); Kania, J. und D. T. Brown, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, S. 3529- 3533 (1976)), und die dimere Natur des α2-Repressors (Hall, M. N. und A. D. Johnson, Science 237, S. 1007-1012 (1987); Sauer, R. T. u. a., Genes Dev. 2, S. 807-816 (1988)) führen zur Nahelegung, dass ein dimerer Zustand der carboxylterminalen Domäne von α2 für die Aktivität ihres Abbausignals erforderlich ist. Die Subeinheit-autonome Natur des aminoterminalen Abbausignals in α2, und das Fehlen dieser Eigenschaft in dem carboxylterminalen Abbausignal stützt den genetischen Beweis, dass diese beiden Signale mechanistisch unterschiedlich sind.

Experimentelle Verfahren

Hefestämme

Die bei vorliegender Studie benutzten Stämme S. cerevisiae waren DBY1705 (MATαleu2-3, 112 ura3-52 lys2-801 gal2), DBY1826 (MATαleu2-3, 112 ura3-52 trp1 his3-Δ200 ade2-101), und HR125-5Dalf(Δ(MAT)::CAN1-14 leu2-3, 112 ura3- 52 trp1 his3 his4) (Hall, M. N. und A. D. Johnson, Science 237, S. 1007-1012 (1987)).

Plasmidkonstruktionen

Expressionsvektoren pKKα2-lacZ und pKKα2 zur Bildung von α2-βgal und α2 in E. coli wurden wie folgt aufgebaut: Ein BamHI-HindIII-Fragment des E. coli-Expressionsvektors pKK233-2, der den Ptrc-Promotor trägt (Amann, E. und J. Brosius, Gene 40, S. 183-190 (1985)), wurde mit einem HindIII-SacI-Fragment von M13mp19, das α2-lacZ' trägt, verknüpft. Ein 38-meres synthetisches Oligodeoxynucleotid wurde zur einsträngigen DNA des erhaltenen M13mp19-Phagenderivats hybridisiert, was bewirkte, dass die zwischen Ptrc und dem Startcodon von α2 liegenden Sequenz ausgeschleift wurde (loop out). Nach Einfüllen in den mit Lücken versehenen (gapped) duplex und Transformieren in E. coli BMH71- 18mutS (Kramer, W. u. a., Nucl. Acids Res. 12, S. 9441-9456 (1984)) wurden Phagen-DNAs für die erwünschte Deletion durch Agarosegel-Elektrophorese gescreent. Das (Ptrc-α2-lacZ')-enthaltende Fragment SalI-SacI wurde sodann mit dem SalI-SacI-Vektorfragment von pKK233-2 verknüpft, welches die Region von lacZ 3' bis zur Stelle SacI trug. Der erhaltene Vektor pKKα2-IacZ bildete ein βgal- Fusionsprotein der erwarteten Größe in E. coli JM101 nach Induktion mit IPTG. Die Anwesenheit des korrekten α2-Rests wurde durch aminoterminale Mikrosequenzierung (siehe weiter unten) des gereinigten Fusionsproteins bestätigt. Der pKKα2-Expressionsvektor wurde aus pKKα2-lacZ durch Verknüpfung von dessen Fragment BamHI-XbaI, das den Promotor Ptrc und ~75% der α2-Codierungsregion trägt, an das auf pUC19 basierende Fragment XbaI-XhoI des αX152- Derivats von MATα hergestellt (Tatchell, K u. a., Cell 27, S. 25-35 (1981)), das den Rest des α2-Leserasters trägt. Das erhaltene Fragment wurde sodann mit dem größeren Fragment BamHI-HindIII von pKK233-2 verknüpft, was zu pKKα2 führte.
Das Δ53-210 α2-βgal-Derivat (Fig. 13) wurde durch Subklonen eines ~3 kb SalI- Fragments von pMC1871 (Casadaban, M. J. u. a., Meth. Enzymol. 100, S. 293-308 (1983)), dass E. coli βgal in die Linkerstelle XhoI von matα2::αX182, welche in dem Plasmid YRp7 (Tatchell, K. u. a., Cell 27, S. 25-35 (1981)) getragen wird, aufgebaut. Das erhaltene Δ53-210-Konstrukt codierte eine Fusion der ersten 52 Reste von α2 an βgal. Das Δ53-210 enthaltende Fragment HindIII wurde sodann in hohe Kopie- (YEp13) und niedere Kopieplasmide (YCp50) subgeklont (Parent. S. A. u. a., Yeast 1; S. 83-138 (1985)). Lediglich das niedere, Δ53-210 codierende Kopieplasmid führte zu Transformanten in S. cerevisiae. Hall u. a., Cell 8. 1057-1065 (1984) berichteten, dass die Proteine Δ14-210 und Δ26-210 (Fig. 13) lethal waren, wenn sie von dem Promotor MATα2 in hohen Kopieplasmiden im Stamm HR125-5Dα exprimiert wurden. Diese Wirkung wurde in DBY1705 nicht beobachtet, noch konnten wir mit unseren Hefestämmen die früher berichtete (Hall, M. N. u. a., Cell 36, S. 1057-1065 (1984)) Toxizität von Δ68-210 nach ihrer Expression aus hohen Kopieplasmiden bestätigen. Das Derivat Δ2-135/158-210 (Fig. 13) wurde wie folgt aufgebaut: Δ2-135 in YEp13 (Hall, M. N. und A. D. Johnson, Science 237, S. 1007-1012 (1987)) wurde mit XbaI digeriert, mit exoVII behandelt und sodann mit HindIII digeriert. Das erhaltene ~2kb-Fragment, das den Aminoterminus von α2 aus A2-135 codiert, wurde an das Fragment SmaI- SacI lacZ' aus pMC1871 gebunden sowie an das Fragment SacI-HindIII von Δ2- 135, das die carboxylterminale Region von βgal codiert. Das Nucleotidsequenzieren des Endplasmidkonstrukts (Kraft, R. u. a., Biotechniques 6, S. 544-546 (1988)) zeigte, dass es das Protein Δ2-135/158-210 codierte (Fig. 13).

Pulse-chase-Analyse

S. cerevisiae-Zellen, transformiert (Ito, H. u. a., J. Bacteriol. 153, S. 163 (1983)) mit Plasmiden von Interesse, ließ man bei 30ºC in einem minimalen SD-Medium (Sherman, F. u. a., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1986) auf einen A&sub6;&sub0;&sub0;-Wert von annähernd 1 (exponentielle Mittelphase) wachsen. Zellen aus einer 10 ml Kultur wurden durch Filtration auf einer Millipore-Mikrotiterfiltrationsplatte geerntet, mehrere Male mit methioninfreiem SD-Medium gewaschen, in 0,3 ml 0,5%iger Glucose, 40 mM Kaliumphosphat (pH-Wert 7,4) resuspendiert, und während 5 Minuten bei 30ºC (wenn nicht anders angegeben) mit 0,15 mCi ³&sup5;S-Translabel (ICN; ~80% [³&sup5;S]-Methionin, ~20 % [³&sup5;S]-Cystein) markiert. Markierte Zellen wurden durch Filtration gesammelt und in SD-Medium, ergänzt mit 10 mM L-Methionin, 0,2 mg/ml Cycloheximid und 50 ug/ml Trichodermin (eine Spende von Leo Pharmaceutical Products, Ballerup, Dänemark) resuspendiert. (Bei einigen Versuchen wurden die Translationsinhibitoren weggelassen; eine leichte Erhöhung bei der Markierung, während der Fall beobachtet wurde, führte zu einer weniger als 10% offensichtlichen Erhöhung der Halbwertzeitwerte (die Daten sind nicht angegeben).) Die Proben (0,1 ml) wurden zu den angegebenen Zeiten abgezogen und mit 0,8 ml kaltem Puffer A (1 % Triton X-100, 0,15 M NaCl, 5 mM Na-EDTA, 50 mM Na-HEPES, pH-Wert enthaltend Leupeptin, Pepstatin A, Chymostatin, Antipain und Aprotinin (Sigma) (jeweils zu 20 ug/ml) zusätzlich zu 0,4 ml Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,5 mm, vermischt. Wenn nicht anders angegeben, wurden die Zellen durch 3maliges Aufwirbeln in Abständen von einer Minute bei 4ºC zertrümmert; die Extrakte wurden bei 12.000 g während 10 Minuten zentrifugiert. (Ein alternatives Lyseverfahren wurde bei manchen Versuchen, wie in den Angaben zu den Figuren angegeben, angewandt. Gleiche Teile von Zellsuspensionen wurden mit einem gleichen Volumen von 2% SDS, 30 mM Dithiothreit, 90 mM Na-HEPES, mit einem pH-Wert von 7,5 vermischt und bei 100ºC 3 Minuten inkubiert. Die Extrakte wurden 10fach mit dem Puffer A plus den Proteaseinhibitoren verdünnt und wie oben zentrifugiert.) Der säureunlösliche Anteil von ³&sup5;S im Überstand wurde bestimmt, und Proben, die gleiche Mengen an in Säure unlöslichem ³&sup5;S enthielten, wurden immunpräzipitiert mit einem molaren Überschuss von einem affinitätsgereinigten Antikörper von α2 (vgl. weiter unten) oder einem monoklonalen Antikörper von βgal (eine Spende von J. Partaledis und T. Mason, Universität von Massachusetts, Amherst, erhalten über J. Paul und R. Hynes (M. I. T.); vgl. Bachmair, A. u. a., Science 234, S. 179-186 (1986)). Nach Inkubieren bei 4ºC während ~2 Stunden, wurde Protein A-Agarose (der Firmen Repligen oder Pharmacia) zugegeben, und die Suspensionen wurden unter Schütteln bei 4ºC während etwa einer Stunde inkubiert, gefolgt von einer 15 sekundigen Zentrifugation bei niederer Geschwindigkeit. Die Pellets wurden dreimal im 0,1% SDS enthaltenden Puffer A gewaschen, in dem Puffer für die Elektrophoreseprobe resuspendiert (Laemmli, U. K, Nature 227, S. 680-685 (1970)), 3 Minuten bei 100 ºC inkubiert, wie zuvor beschrieben zentrifugiert und einer Elektrophorese in 6 %igen Polyacrylamid-SDS-Gelen und einer nachfolgenden Fluorographie unter zogen.

Aminosäuresequenzierung

Annähernd 10¹¹ DBY1705-Zellen, die ein Hochkopieplasmid auf Basis von YEp13 tragen, welche aus dem Promotor MATα2 (Hall, M. N. u. a., Cell 36, S. 1057-1065 (1984)) α2-βgal exprimierten, wurden bis zur späten Exponentialphase in SD- Medium wachsen gelassen und nach dem Triton/Glasperlenverfahren zerstört. Der Extrakt wurde bei 13.000 g eine Stunde bei 4ºC zentrifugiert, und der Überstand wurde mit dem Antikörper gegen βgal immunpräzipitiert. Das ausgefällte α2- βgal und sein in vivo-Spaltprodukt wurde einer SDS-PAGE unterzogen und auf einem PVDF-Filter (Millipore) (Matsudaira, P., J. Biol. Ghem. 262, S. 10035-10038 (1987)) elektrogeblottet. Nach einem kurzen Anfärben mit Coomassie-Blau wurde das α2-βgal-Spaltprodukt herausgeschnitten und einer Aminosäuresequenzierung durch einen Edman-Abbau für s Zyklen unter Verwendung eines 470A-Proteinsequenzers der Firma Applied Biosystems, der mit einem Online 120A PTH- Analysators ausgerüstet war, sequenziert.

Antikörper gegen α2-Protein

Das α2-βgal-Protein wurde vom Isopropylthiogalactosid-(IPTG)-induziertem, pKKα2-lacZ tragenden E. coli gereinigt, indem man einen wie in Gonda u. a., (J. Biol. Chem. 264, S. 16700-16712 (1989)) hergestellten Extrakt der Affinitätschromatographie an Aminophenylthiopyranogalactosid-Sepharose (APTG-Sepharose) (Ullmann, A., Gene 29, S. 27-31 (1984)) unterzog. Das affinitätsgereinigte α2- βgal wurde ferner durch Elektrophorese in einem präparativen Maßstab auf 6 %igem Polyacrylamid-SDS-Gel gereinigt. Die α2-βgal-Bande wurde herausgeschnitten, und mazerierte Gelschnitzel, suspendiert in Freunds vollständigem Hilfsmittel, wurden subkutan in weibliche weiße Neuseeland-Kaninchen infiziert (entweder 0,1 oder 0,2 mg α2-βgal pro Kaninchen) (Carroll, S. B. und A. Laughton, DNA Cioning: A Practical Approach, D. M. Glover, Herausg. IRL Press, Oxford, S. 89-111, 1987). Das Antiserum gegen α2-βgal wurde mit 18%igem (Gewicht/Volumen) Na&sub2;SO&sub4; ausgefällt, was zu einer an IgG angereicherten Fraktion führte. Die erste Affinitätssäule enthielt E. coli βgal (Sigma), gebunden an CNBr aktivierte Sepharose; die zweite Säule enthielt α2-βgal, vernetzt mit Dimethylpimelimidat (Pierce) zu Anti-βgal-Sepharose (letztere wurde unter Verwendung des Eluats der ersten Säule hergestellt). Der Durchfluss von der ersten Säule wurde auf die zweite Säule aufgebracht, und die gebundene Fraktion wurde mit 4 M Guanidinhydrochlorid eluiert. Das Eluat wurde gegen 0,15 M NaCl, 10 mM K&sub2;HPO&sub4; (pH-Wert 7,2) bei 4ºC eluiert und durch die βgal-Sepharosekolonne geleitet, um jegliche Restantikörper gegen βgal zu entfernen. Das affinitätsgereinigte Anti-α2 wurde in "Centriprep-Rohren" (Amicon) konzentriert, auf 40% (Volumen/Volumen) in Glycerin eingestellt und entweder bei -20ºC oder -85ºC gelagert. Die Immunpräzipitation mit diesem Antikörper der Extrakte von [³&sup5;S]-Methionin-makierten S. cerevisiae führte, nach SDS-PAGE, zu einer einzigen Bande einer vorhergesagten Molekülmasse mit α-, jedoch nicht a-Zellen (Fig. 1d). Ferner wurden elektrophoretische Banden der erwarteten Molekülmasse durch lmmunoblotanalysen der Extrakte von E. coli sichtbar, die entweder α2 oder α2-βgal, jedoch nicht in Kontrollextrakten, exprimierten. Das Anti-α2 fällte die gleichen α2- βgal-Derivate aus, welche unter Anwendung eines Antikörpers gegen βgal nachweisbar waren, und stellte das in dem bzw. den erforderlichen Epitop(en) von α2 (Fig. 13) zurückgehaltene Derivat zur Verfügung.

Isolierung von DOA-Mutanten

Δ68-210 tragende Zellen DBY1705 (Fig. 3) in dem niederen Kopievektor YCp50 (Hall, M. N. u. a., Cell 36, S. 1057-1065 (1984)) wurden bis zur stationären Phase in einen Minimalmedium wachsen gelassen, mutagenisiert mit EMS auf ein etwa 20%iges Überleben, und ausgebreitet auf Minimalplatten (~40.000 Überlebende). Die Zellen wurden sodann auf Platten mit einem Gehalt an dem chromogenen βgal-Substrat X-Gal (Rose, M. u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, S. 2460-2464 (1981)) replica-plattiert und bei 23ºC 3 Tage und danach bei 36ºC 3 Tage inkubiert. Kolonien, die bei 23ºC oder 36ºC in Blau umschlugen (Wildtyp-Kolonien sind Weiß), wurden herausgesucht und durch Dispergieren der Zellen in Wasser in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen dispergiert und Prägen (stamping) der Zellen auf frische X-Gal-Indikatorplatten abermals gescreent. Stämme, welche den Rescreening-Test bestanden, wurden in flüssigen Kulturen wachsen gelassen und quantitativ auf ihre βgal-Aktivität unter Verwendung von ortho-Nitrophenylgalactosid (ONPG) als Substrat getestet. 60 mögliche Mutanten (mit βgal-Aktivitätsgraden mit einer mindestens 3fach höheren Aktivität als der Wildtyp) wurden isoliert. pulse-chase-Analysen dieser Mutanten identifizierten 25 Stämme, die eine signifikante (mindestens 2fache) Erhöhung des Wertes "tn" des Δ68-210-Fusionsproteins zeigten. Eine Immunofluoreszenzanalyse zeigte, dass bei allen dieser doa-Mutanten (Abbau von Alpha-Mutanten) das Δ68-210-Protein im Kern konzentriert war.
Diese Stämme wurden auf 5-Fluor-orotische Säureplatten (Boeke, J. D. u. a., Mol. Gen. Genet. 197, S. 345-346 (1984)) aufgetragen, um Kolonien zu isolieren, von denen das Δ68-210 tragende Plasmid verloren wurde. Zellen von diesen Kolonien wurden sodann mit dem Wildtyp YCp50::Δ68-210-Plasmid retransformiert. Tests auf die βgal-Aktivität in sowohl Platten- als auch flüssigen Kulturen verringerten die Anzahl von Stämmen, die fortgesetzt höhere Grade als Wildtypgrade von Δ68- 210 zeigten, auf 20, was zeigt, dass die entsprechenden Mutationen chromosomal und nicht plasmidgebunden waren.
Die plasmidbehandelten doa-Mutanten wurden mit MHY101 zurückgekreuzt, einen Stamm, der von DBY1826 durch Vereinigung des Δ68-210-Fusionskonstrukts in den Ort LEU2 abgeleitet ist, unter Verwendung des Vektors YIp33 (Parent, S. A. u. a., Yeast 1, S. 83-138 (1985); Orr-Weaver, T. L. u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, S. 6354-6358 (1981)). Die Stelle der Integration wurde durch Southern-Hybridisierungsanalyse und Allelismustests nachgewiesen. Die Abtrennungsprodukte von Diploiden, welche Sporen bildet und sowohl das integrierte Reportergen, welches Δ68-210 codiert und den doa-Abbaudefekt tragen, wurden sodann identifiziert. Diese Abtrennungsprodukte wurden für das nachfolgende backcrossing, Komplementieren und die Abtrennungsanalysen benutzt. Komplementierungstests zwischen unterschiedlichen doa-Mutanten wurden auf X-Gal- Platten vorgenommen. In Zweifelsfällen wurden Tetradenanalysen angewandt, um das Abtrennungsmuster eines jeden Mutationspaares zu testen. Rückkreuzungen zwischen doa-Mutanten und MHY101, gefolgt von Sporenbildung und Tetradendissectionen, ermöglichten Tests auf eine Cosegregation des α2-Abbaudeffekts mit anderen Mutantenphenotypen, wie z. B. die Unfähigkeit zur Sporenbildung.

Claims

1. Rekombinantes DNA-Molekül mit einer DNA-Sequenz, welche in Phase an eine DNA-Sequenz fusioniert ist, die ein zielaffines Peptid oder Protein codiert, das spezifisch mit einem Zielprotein oder -peptid in Wechselwirkung tritt, wobei dem zielaffinen Peptid oder Protein eine zweite Determinante des Abbausignals nach der N-Terminus-Regel fehlt, es aber einen destabilisierenden aminoendständigen Aminosäure-Rest gemäß der N-Terminus-Regel des Proteinabbaus aufweist, wobei das Zielprotein oder -peptid und das zielaffine Peptid oder Protein Untereinheiten eines einzelnen oligomeren Proteins mit Ausnahme von β-Galactosidase sind und das zielaffine Peptid oder Protein kein Fusionsprotein der Aminosäure-Reste 318-355 des stromaufwärts zur DHFR fusionierten lac-Repressor-Proteins umfaßt.

2. Verfahren zur Stoffwechseldestabilisierung eines Zielproteins oder -peptids in einer Eukaryontenzelle, welches Zielprotein oder -peptid eine zweite Determinante für die N-Terminus-Regel des Proteinabbaus enthält, in den Schritten: Transformation der Zelle mit einem exprimierbaren DNA-Konstrukt, welches eine Ubiquitin codierende DNA-Sequenz aufweist, die in Phase mit und unmittelbar in 5'-Position zu einer DNA-Sequenz fusioniert ist, welche ein zielaffines Protein- oder Peptid mit einem nach der N-Terminus-Regel des Proteinabbaus destabilisierenden, unmittelbar auf Ubiquitin folgenden Aminosäurerest codiert, jedoch keine zweite Abbau-Signal- Determinante nach der N-Terminus-Regel aufweist, wobei das Zielprotein oder - peptid und das zielaffine Peptid oder Protein Untereinheiten oder Teile von Untereinheiten eines einzelnen oligomeren Proteins sind und die Assoziation des zielaffinen Proteins oder Peptids mit dem Zielprotein oder -peptid eine Destabilisierung des Zielproteins oder -peptids zur Folge hat.

3. Verfahren nach Anspruch 2, in welchem die Eukaryontenzelle eine Hefezelle ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, in welchem der destabilisierende Aminosäurerest ausgewählt ist aus der Gruppe Ile, Glu, His, Tyr, Gln, Phe, Leu, Asp, Asn, Lys, Arg und Trp.

5. Verfahren nach Anspruch 2, in welchem das einzelne oligomere Protein ein homomeres Protein ist.

6. Verfahren nach Anspruch 2, in welchem das einzelne oligomere Protein ein heteromeres Protein ist.

7. Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls mit einer DNA-Sequenz, welche in Phase an eine DNA-Sequenz fusioniert ist, die ein zielaffines Peptid oder Protein codiert, das spezifisch mit einem Zielprotein oder -peptid in Wechselwirkung tritt, wobei dem zielaffinen Peptid oder Protein eine zweite Determinante des Abbausignals nach der N-Terminus-Regel fehlt, es aber einen destabilisierenden aminoendständigen Aminosäure-Rest gemäß der N-Terminus-Regel des Proteinabbaus aufweist, wobei das Zielprotein oder -peptid und das zielaffine Peptid oder Protein Untereinheiten eines einzelnen oligomeren Proteins sind, zur Stoffwechseldestabilisierung eines Zielproteins oder -peptids in einer Eukaryontenzelle, wobei das Zielprotein oder -peptid eine zweite Determinante für die N-Terminus-Regel des Proteinabbaus enthält.