JPH04506298A - 生きている細胞の中のｎ末端の法則の経路の抑制 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞内ツユ／バク質の半減期は数秒ないし多数日である。細胞内タンパク質の分 解の１つの主要な機能は、損傷あるいはそうでなければ異常なタンパク質の選択 的排除である。分解経路の他の役割は、その細胞内濃度が時間の機能として変化 しな（ではならない損傷されていないタンパク質に、永久的にあるいは一時的に 、短い半減期を与える。多数の他のタンパク質は、より大きい巨大分子の複合体 、例えば、リポソームまたはオリゴマーのタンパク質の成分として長く生きるが 、遊離の（アソシ工−ションしない）状態で代謝的に使用不可能である。

選択的タンパク質の分解の速度は、細胞の生理学的状態の関数であり、そして個 々のタンパク質について示差的にコントロールされるように思われる。常態で短 い寿命のタンパク質の代謝的不安定性は、合成または分解の速度の調節した変化 を通して、それらの細胞内濃度の急速な調節を可能とする。細胞内タンパク質の 代謝的不安定性がその機能のために必須であることが示された僅かの例は、バク テリオファージラムダのＣＩＩタンパク賀および酵母サブ力ロミセス・セレビシ アエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｅｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＨＯエンドヌク レアーゼを包含する。

通常の代謝的条件下の細胞内タンパク質の選択的回転の大部分は、ＡＴＰ依存性 でありそして、真核生物において、非すリゾーム的である。

最近の生化学的および遺伝学的証拠は、真核生物において、寿命が短い細胞内タ ンパク質に対すするウビクイチン（ｕｂ　ｉｑｕ　ｉ　ｔ　ｉｎ）の共有接合が それらの選択的分解のために必須であることを示す。所定のタンパク質が生体内 で代謝的に安定または不安定であるかどうかを決定する法則は、従来未知である 。

バチマイアー（Ｂａｃｈｍａ　ｉ　ｒ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２ ３４：１７９−１８６　（１９８６）：細胞（Ｃｅｌ　１）、５６：１０１９− １０３１　（１９８９）は、タンパク質の中で所望のアミノ末端残基を発生する 方法およびＮ末端の法則を使用してタンパク質の代謝的安定性に影響を及ぼす方 法を記載している。バチマイア（Ｂａｃｈｍａｉｒ）らは、細胞内タンパク質の アミノ末端において暴露されているアミノ酸の性質は、あるタンパク質が生体内 で代謝的に安定であるか、あるいは寿命が短いかどうかを特定する決定子である ことを発見した。個々のアミノ酸は、それらがタンパク質のアミノ末端において 暴露されたとき、タンパク質に与える代謝的安定性（半減期）の程度に関して、 安定化性または不安定化性のアミノ酸としてカテゴリーに分けることができる。

不安定化性アミノ酸残基は短い半減期を与え、この半減期は不安定化性アミノ酸 のあるものについて数分程度に短いことがある。安定化性アミノ酸残基は、多数 時間の長さであることができる、長い半減期を与える。タンパク質の半減期のそ のアミノ末端残基の性質へのこの依存性は、Ｎ末端の法則と呼ぶ。最初の工程が タンパク質分解の基質のアミノ末端の認識を包含する、分解の経路は、Ｎ末端の 法則の経路（Ｎ−ｅｎｄ　ｒｕｌｅ　ｐａｔｈｗａｙ）と呼ばれてきテイル。

上に引用したバチマイアー（Ｂａｃｈｍａ　ｉ　ｒ）らによるタンパク質の分解 のＮ末端の法則の発見以来、その存在は同一グループおよび他の研究者ら〔レイ ス（Ｒｅｉｓｓ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２６３　（６）、２６９３−９８　（１８８）］の両 者によるそれ以上の研究において反復して確証されてきている。多数の応用のた めに、生きている細胞におけるＮ末端の法則の経路依存性のタンパク質の分解を 特別に抑制することは極めて有用であろう。なぜなら、細胞のプロセス、例えば 、細胞の増殖および分化に影響を及ぼすか、あるいは特別に混乱させることは可 畦であろうからである。

発明の開示 本発明は、完全な細胞および全動物の中（すなわち、生体内）のタンパク質の特 別の群の分解を選択的に抑制する方法、ならびにこの方法において有用な組成物 に関する。本発明の方法は、生きている細胞におけるＮ末端の法則の経路を抑制 する方法と呼び、タンパク質のアミノ末端に存在するアミノ酸の性質がそのタン パク質の半減期の重要な決定子であるという知識を使用する。本発明の方法およ び組成物を使用することによって、特定のタンパク質の半減期またはタンパク質 の型を変更（延長）しそして、その結果、これらのタンパク質が関係する細胞の プロセス、例えば、細胞の増殖および分化に影響を与えることができる。本発明 の方法において、レギュレーターと呼ぶ因子をそれが特定のＮ末端認識タンパク 質因子に結合しその有意の比率を抑制し、そして、これにより、生体内のＮ末端 の法則の経路の特定のサブセットを抑制する条件下に、細胞の中に導入する。特 定のサブセットは、レギュレーターにより抑制されるＮ末端認識活性により支配 される、Ｎ末端の法則の経路の部分である。例えば、基本的アミノ末端残基を有 するレギュレーターは、Ｎ末端の法則の経路のサブセットを形成する基杢鉋Ｎ末 端認識活性を抑制するであろう。その結果、それらのアミノ末端に同一のアミノ 酸残基または同様な残基を有する細胞内タンパク質は、レギュレーターが存在し ない場合それらがＮ末端の法則の経路に参加する程度より少ない程度にそれに参 加し、そしてそれらのそれぞれの生体内の半減期は増加する。

レギュレーターはアミノ酸誘導体、例えば、ペプチド、小さいポリペプチドまた は、その代謝安定性を増加すべき細胞内タンパク質のアミノ末端残基と同一であ るか、あるいはそれに類似するアミノ酸の他のカルボキシル末端の誘導体である 。

タンパク質のアミノ末端に存在するアミノ酸残基の性質は、そのタンパク質の決 定子である。例えば、酵母のサツカロミセス・セレビシアエ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ）において、アミノ末端残基の不安定化性クラスは、アミノ酸、例えば 、イソロイシン、グルタミン酸、チロシン、グルタミン、フェニルアラニン、ロ イシン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、トリプトファン およびヒスチジンを包含する。同一の法則に従い、アミノ末端残基の安定化性ク ラスは、アミノ酸、例えば、メチオニン、セリン、グリシン、アラニン、スレオ ニン、バリン、システィンおよびプロリンを包含する。

本発明の方法は、Ｎ末端の法則の経路を有するすべての有機体において使用する ことができる。なぜなら、アミノ末端アミノ酸残基の２つのクラス（安定化性お よび不安定化性）の特定のメンバーは異なる真核生物の間で多少の変化するが、 特定のＮ末端の法則は各クラスにおいて応用することができ、そして両者の不安 定化性および安定化性のアミノ酸は特定の真核生物のために容易に同定すること ができるからである。例えば、哺乳動物の網状赤血球の最近決定されたＮ末端の 法則［ボンダら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｊ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、印刷中〕において、酵母の中でアミノ酸を安定化するシス ティン、アラニン、セリンおよびスレオニンは、網状赤血球の中で不安定化性の ものであることが示された。逆に、酵母において不安定化性であるイソロイシン は網状赤血球において安定化性である。上に引用したボンダらが記載する方法に 類似する方法において、選択した細胞または有機体におけるＮ末端の法則の正確 な形態を確認することができる。

本発明のレギュレーターは、完全な細胞内タンパク質のアミノ末端に存在すると き、細胞の中のそのタンパク質の半減期を減少するアミノ末端残基を包含する。

しかしながら、本発明の方法において使用するとき、レギュレーターの中に存在 する不安定化性アミノ末端残基は、事実、Ｎ末端の法則の経路のＮ末端認識成分 への結合について、寿命が短い細胞内タンパク質と競争する［デコイ（ｄｅｃｏ ｙ）Ｊとして作用することによって、細胞内タンパク質の半減期を増加する。そ の結果、そうでなければ寿命が短いタンパク質は、Ｎ末端の法則の経路により劣 った効率で標的され、そして細胞の中のその半減期を増加する。

本発明の組成物および方法は、種々の異化状態、例えば、筋肉のるいそうにおい て観察されるか、あるいは本発明によるその人工的代謝安定化が病気を停止また は逆転することができる、常態で寿命が短いタンパク質のレベルが不十分である ことから観察される、特定のタンパク質の異常な（例えば、過剰の）生体内の分 解から生ずる病気を処置するとき、有用であることができる。また、この方法を 使用して、レギュレーター（Ｎ末端の法則の経路の抑制因子）の不存在下に生ず るであろうものを越えて、生物学的産生プロセスにおける収量を増加することが できる。

本発明の結果、最初に、生体内で（完全な細胞、および全動物において）Ｎ末端 の法則の経路を抑制することができる。予期せざることには、物質、例えば、生 体内でメタノールおよび（不活性の）遊離ロイシンに容易に加水分解するロイシ ンメチルエステルを、完全な細胞において、Ｎ末端の法則の経路の有効な抑制に 十分なレベルに蓄積することができる。しかしながら、これは今回真実であるこ とが示された。こうして、本発明は、完全な細胞および全動物における特定のタ ンパク質の分解を選択的に抑制する新しい道を開く。

図面の簡単な説明 第１図は、Ａｒｇ−βｇａｌまたはＬｅｕ−βｇａｌを発現するプラスミド（Ｎ 末端の法則の経路を経て分解する特定の寿命が短いタンパクｊｉ）を収容する、 指数的に成長する酵母（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞に、ロイシンのメチル エステル（１０ミリモルの最終濃度）を添加する効果を示すグラフである。細胞 の成長はは６００ｎｍにおける光学密度を測定することによってモニターした。

第２図は、変化する初期ＯＤ６゜・細胞密度におけるＬｅｕメチルエステルの生 体内効果のグラフ表示である。

第３図は、Ｌｅｕ−βｇａｌの定常状態のレベルで７時間にわたるＬｅｕメチル エステルの効果のグラフ表示である。Ｌｅｕメチルエステル（ゼロ時間において １０ミリモルの最終濃度）を、Ｌｅｕ−βｇａｌを発現するプラスミドを収容す る、指数的に成長する酵母細胞に添加した。

第４図は、酵母細胞の中のＡｒｇ−βｇａｌの定常状態のレベルへの７時間にわ たる１．アミノ末端Ａｒｇ残基を含有するジペプチドの効果のグラフ表示である 。Ａｒｇを含有するジペプチドを、Ａｒｇ−βｇａｌを発現するプラスミドを収 容する指数的に成長する酵母細胞に添加した。

第５図は、大きい疎水性のアミノ末端残基をもつβｇａｌタンパク質の定常状態 のレベルへのＬｅｕメチルエステルの効果のグラフ表示である。Ｐｈｅ−βｇａ ｌ、Ｌｅｕ−βｇａｌ、Ｔｒｐ−βｇａｌ、Ｔｙｒ−βｇａｌ、および１ｉｅ− βｇａｌを発現するプラスミドを収容する、指数的に成長する酵母細胞に、０〜 １０ミリモルの濃度範囲のＬｅｕメチルエステルを補充し、１時間インキュベー ションし、そして細胞内βｇａｌ活性についてアッセイした。Ｘ−βｇａｌタン パク質の半減期［バチマイア（Ｂａｃｈｍａ　ｉ　ｒ）ら、サイエンス（Ｓｃｉ ｅｎｃｅ）、２３４　：　１７９−１８６　（１９８６）の方法に従い決定した ］は括弧内に記載されている。

第６図は、成長する酵母細胞の中のＬｅｕメチルエステルによるＬｅＵ−βｇａ ｌの代謝安定性を示す写真である。この写真は、Ｖａｌ−βｇａｌ（Ａ）、また はＬｅｕ−βｇａｌｌｏミリモルのＬｅｕメチルエステルとの３時間のインキュ ページ厘ンの存在（Ｂ）または不存在（Ｃ）におけるＬｅｕ−βｇａｌを発現す る細胞を使用する、パルス−チェース電気泳動の実験（５分のパルス）から生ず るゲルを描写する。時点はレーン１について０分、レーン２について１０分、そ してレーン３について３０分である。バンドはβｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ ）、９０ｋＤ（βｇａｌの明確な、代謝的に安定な切断産生物；代謝的に安定な 特表平４−５Ｏｆ；２９８　（４） Ｖａｌ−βｇａｌを使用するレーンからのその不存在に注意する）、およびＸ（ βｇａｌに対するモノクローナル抗体と交差反応する、無関係の内因性酵母タン パク質）としてラベルする。

第７図は、Ｌ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−ジペプチドによるが、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｔｒｐ −ジペプチドによらない、生体内のＬｅｕ−βｇａｌの安定化を示す写真である 。この写真は、Ｖａｌ−βｇａ　Ｉ　（Ａ）　、Ｌｅｕ−βｇａ、１　（Ｂ）　 、１０ミリモルのＬ−Ａｌ　ａ−Ｌ−Ｔｒｐの存在下にＬｅｕ−βｇａｌ（Ｃ） 、および１０ミリモルのＬ−Ｔｒｐ−Ａｌａの存在下にＬｅｕ−βｇａｌ（Ｄ） を発現する酵母細胞を使用する、パルス−チェース実験（５分のパルス）の結果 を描写する。細胞をジペプチドとともに３０℃において４時間インキュベーショ ンする。時点はレーン１について０分、レーン２について１０分、そしてレーン ３について３０分である。バンドについての標識は第５図の説明の中にバンド「 Ｓ」、長い寿命のβｇａ１種に対して特異的のβｇａｌ切断産生物、を付加して 上に記載する。

第８図は、ＬｅｕメチルエステルによるＴｙｒ−βｇａｌの生体内代謝安定化を 示す写真である。この写真は、１０ミリモルのＬｅｕメチルエステルとともの４ 時間のインキユベーションの不存在（Ａ）または存在（Ｂ）におけるＴｙｒ−β ｇａｌを発現する酵母細胞を使用する、パルス−チェース実験（３分のパルス） の結果を示す。時点はレーン１について０分、レーン２について１０分、レーン ３について３０分、そしてレーン４について６０分である。長い寿命のβｇａｌ とともにのみ通常見られるβｇａｌ破壊存在（「Ｓ」）の蓄積に注意する。また 、ＬｅＵメチルエステルの存在下の９０ｋＤの切断産生物の量の減少に注意す第 ９図は、Ａｒｇ−ＡＪａジペプチドの中でアミノ酸残基の立体配置の代謝的に安 定化したＡｒｇ−βｇａｌに対するその安定性の効果を実証する棒グラフである 。Ａｒｇ−βｇａｌおよびＶａｌ−βｇａｌを発現する酵母細胞を、示したジペ プチド（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ＡｌａまたはＬ−Ａ　ｒ　 ｇ−Ｄ−Ａ　Ｉ　ａ）の存在下に２時間インキュベーションした。次いで、細胞 中のβｇａｌ活性を決定し、そして未処理対照（ｒｃｏｎＪ）の活性に関してプ ロットした。実際のβｇａｌ活性を各欄の上にに記載する。アミノ酸残基の立体 配置は、特記しない限り、ｒＬＪ型である。

発明の詳細な説明 本発明は、タンパク質の特定の型またはクラスの分解を生きている細胞の中で（ 部分的または完全に）抑制であることができるいう決定に基づく。本発明の方法 に従い、選択した型またはクラスの分解の抑制は、レギュレーターと呼ぶ因子を 組み込むか、あるいは導入することによって実施され、前記レギュレーターはそ の分解を抑制すべきタンパク質のアミノ末端残基と同一であるか、あるいはそれ に類似するアミノ酸を包含する。本発明は、さらに、レギュレーターそれら自体 に関し、前記レギュレーターはアミノ酸誘導体、例えば、ジペプチド、小さいポ リペプチドまたは、その分解を減少すべき（すなわち、その代謝安定性または半 減期を増加すべき）細胞のタンパク質のアミノ末端残基と同一であるか、あるい はそれに類似するアミノ末端残基をもつ、カルボキシル末端の誘導体に関する。

本発明のカルボキシル末端の誘導体は、アミノＮ末端残基上の遊離（ブロッキン グされていない）α−アミノ酸およびブロッキングされたまたは「置換された」 カルボキシル末端（例えば、他ののアミノ酸により（ジペプチドまたはポリペプ チドを得るために）またはアルキルエステルにより）を有する。

Ｎ末端の法則 同時継続米国出願第０７／１０３，９１０号、１９８７年１０月１日提出、に記 載されているように、Ｎ末端の法則は、細胞内の経路により細胞内タンパク質が 分解する速度を決定する細胞内タンパク質の基準または特性を定める。この法則 およびＮ末端の法則の経路は、ここで、次の節において要約して、本発明の引き 続（詳細な説明のためのバックグラウンドを提供する。試験タンパク質、酵素の β−ガラクトシダーゼ（βｇａｌ）の研究は、選択したアミノ酸残基がプロセシ ングしたアミノ末端に存在し、ウビクイチン（ｕｂｉｑｕｉ　ｔ　ｔｎｅ）との 融合タンパク質として最初に産生された、種々の形態の操作したタンパク質を使 用して実施した。ウビクイチンーβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質をエンコ ードするキメラ遺伝子を酵母Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの中で発現したとき、ウ ビクイチンは形成期の融合から切断されて、脱つビクイチンしたβ−ガラクトシ ダーゼ（βｇａｌ）を生ずることが示された。この切断は、ウビクイチンーβｇ ａｌ接合に存在するβｇａｌのアミノ酸残基、Ｘｌの性質に無関係に起こる。こ の結果は、そうでなければＸ−βｇａｌタンパク質のアミノ末端において所望の アミノ酸残基の暴露を可能とした。そのように設計したＸ−βｇａｔタンパク質 は、生体内で顕著に異なる半減期を示した（例えば、はぼ３分〜２０時間以上） 。所定のＸ−βｇａｌタンパク質の半減期は、Ｘ−βｇａｌのアミノ末端におけ るアミノ酸残基の性質に依存することが示された。

その結果、そのアミノ末端において暴露したときβｇａｌにそれらが与える半減 期に従い、２０アミノ酸の基本的な組を序列することが可能になる。Ｎ末端の法 則と呼ぶ、生ずるコードまたは法則を表に示す。

酵母および哺乳動物の網状赤血球におけるＮ末端の法則Ｘ−βｇａｌの半減期 ＊Ｕｂ−Ｐｒｏ−βｇａｌの生体自脱ウビクィチン速度は酵母および哺乳動物細 胞の両者において低い。示したｔ、／！はＰｒｏ−βｇａｌタンパク質のそれで ある。

表に示すように、アミノ酸のメチオニン、セリン、アラニン、スレオニン、バリ ン、グリシンおよびシスティンは、Ｘ−βｇａｌ上のアミノ末端において暴露さ れたとき、Ｘ−βｇａｌに酵母の中の２０時間以上の半減期を与える。これらは アミノ酸の最高の「安定化Ｊである。〔安定化性アミノ末端残基を有するＸ−β ｇａｌタンパク質の長い半減期は、これらの残基に対して特異的なＥ３Ｎ末端認 識性タンパク質の不存在の「欠陥のある」結果と考えることができる］。イソロ イシンおよびグルタミン酸はほぼ３０分の半減期を与え、そしてチロシン、グル タミンおよびヒスチジンはほぼ１０分の半減期をを与える。フェニルアラニン、 ロイシン、アスパラギン酸、アスパラギン、およびリジンは、Ｘ−βｇａ１のア ミノ末端に存在するとき、はぼ３分の半減期を生じ、モしてアルギニン、最も不 安定化性のアミノ酸、はほぼ２分の半減期を与える。

原核生物および真核生物の両者における比較的長い寿命の（ｔｌ／！＞１時間） 非区画化細胞内タンパク質は、Ｎ末端の法則により予測されるように、安定化性 クラスのアミノ末端残基を有することが示された。同一の研究により、タンパク 質のアミノ末端残基における不安定化性残基の存在は生体内のタンパク質の代謝 的不安定化ためにしばしば十分であるが、これは常にはそうではないことか実証 された。このような代謝的不安定化が比較的小さい程度に起こるとき、それ以上 の分析はアミノ末端残基の不十分な立体的許容性または完全なアミノ末端の分解 シグナルの第２決定子の欠如を示す。アミノ末端の分解シグナルの第２決定子は 、単独で、また、タンパク質を代謝的に不安定化するために不十分であり、特別 の内部のりジン残基であることが発見された。第２決定子として働くこの臨界的 なりジン残基の能力は、残基を取り囲む独特のアミノ酸配列に大きく無関係であ ることが示された。その代わり、臨界的なりジン残基の必須の特徴は、リジン残 基を含有する領域のタンパク質のアミノ末端および高いセグメントの移動度に対 して空間的近似性にあることが示された。第２決定子の機械論的意味は、標的し た寿命が短いタンパク質において、分枝鎖のウビクイチンーウビクイチン接合体 の鎖が分解の第２決定子と上の研究において同定されたりジン残基に限られると いう発見により例示される［バチマイアー（Ｅ３ａｃｈｍａｉ　ｒ）およびバル シャフスキイ（ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ）　、細胞（Ｃｅｌｌ）、５旦：１０１９ −１０３１　（１９８９）；チャウ（Ｃｈ　ａ　ｕ）ら、サイエンス（Ｓｃ　ｉ 　ｅｎｃｅ）　、２４３　：１５１６−１５８３　（１９８９）］。

Ｎ末端の法則の軽路 どこかで記載したように、はとんどの形成期のタンパク質はウビクイチン部分を 欠如するように思われる。［バルシャフスキイ（Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ）ら、「 選択的タンパク質回転のＮ末端の法則（Ｔｈｅ　Ｎ−Ｅｎｄ　Ｒｕ１ｅ　ｏｆ　 ５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｐｒｏｔｅｆｎ　Ｔｕｒｏｖｅｒ）Ｊ、ウビクイチン（Ｕ ＢＩＱＵＩＴＩＮ）（Ｍ、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ編）、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂ ｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、（１９８ｇ）；バチマイア（Ｂａｃｈｍａ　ｉ　ｒ ）およびバルシャフスキイ（ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ）　、細胞（Ｃｅ　Ｉ　Ｉ） 　、５６　：１０１９−１０’３２　（１９８９）］。形成期の非区画化タンパ ク質の成熟アミノ末端は、その基質特異性か部分的に特性決定されているプロテ アーゼの作用を通して、生体内で発生される。比較的に長い寿命の非区画化タン パク質の成熟アミノ末端から不安定化性残基の首尾一貫した不存在はとくに重要 である。これは大部分酵素メチオニンアミノペプチダーゼの基質特異性のためで ある。この酵素は、第２メチオニン残基、あるいはＮ末端の法則に従い不安定化 される１２アミノ酸残基の１つが後続しない場合および場合のみ、形成期のタン パク質においてアミノ末端のメチオニン残基（Ｎ末端の法則に従い安定化性残基 ）を切断することが示された。Ｎ末端の法則とメチオニンアミノペプチダーゼの 基質特異性との間の逆対応性は、この酵素の性質についての部分的機能の説明を 提供する：長い寿命のタンパク質のプロセシングに関係するメチオニン−クリッ ピングアミノペプチダーゼは、アミノ末端におけるその存在が基質タンパク質を 代謝的に不安定化することができる残基を暴露ＩＪ　ｔｘ　Ｌ　％ことが期待さ れるであろう。

類似のプロテアーゼは、このようなプロテアーゼにより認識される部位を含有す るアミノ末端配列をもつ、ある種のタンパク質の中に不安定化性アミノ酸を有す るアミノ末端発生の原因となりうろことが示唆される。［バルシャフスキイ（Ｖ ａｒｓｈａｖｓｋｙ）ら、「選択的タンパク質回転のＮ末端の法則（Ｔｈｅ　Ｎ −Ｅｎｄ　Ｒｕ１ｅ　ｏｆ　５ｅＩｅｃｔｉｖｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｕｒｏｖ ｅｒ）Ｊ、ウビクイチン（ＵＢＩＱＵＩＴＩＮ）（Ｍ、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ 編）、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、（１９８８）］。

前に提供された生化学的および遺伝学的証拠は、また、Ｎ末端の法則の経路のＮ 末端認識成分が、基質タンパク質のアミノ末端の不安定化性残基に対して直接か つ特別の親和性を有することを示唆する。標的した分解において引き続く工程は 、結合したタンパク質分解の基質におけるウビクイチンータンパク質リガーゼ複 合体のアセンブリー、基質のウビクイチン化、およびウビクイチン部分が認識シ グナルまたは変性装置または両者として働く「下流の」の酵素によるその分解を 包含する。初期の工程がタンパク質分解構造のアミノ末端の認識を含む、この分 解経路をＮ末端の法則の経路と呼ぶ。

生きている細胞におけるＮ末端の法則の経路の抑制この出願に記載する実験によ り、生きている細胞においてＮ末端の法則の経路を抑制しそして、その結果、寿 命が短いタンパク質の特別の型またはクラスの生きている細胞の中の分解を選択 的に抑制することが可能とすることが、今回、決定された。

その生体内の分解が本発明の方法により抑制することができるタンパク質の共通 の特徴は、Ｎ末端の法則に従い不安定化されているアミノ末端残基の存在である 。本発明の方法において、Ｎ末端の法則の経路の抑制が、選択した型またはクラ スの細胞内タンパク質に適用されるように、望まれる細胞の中に、レギュレータ ーと呼ぶ因子を導入する。この方法において使用されるレギュレーターはアミノ 酸誘導体（例えば、ジペプチド、小さいポリペプチド、または他のカルボキシル 末端のアミノ酸誘導体）であり、ここでアミノ末端アミノ酸はＮ末端の法則の経 路を経るその分解を抑制すべきタンパク質のアミノ末端アミノ酸残基と同一であ るか、あるいはそれに類似する。

特表平４−５０６２９８　（６） 例えば、アミノ末端のロイシン残基を有する細胞内タンパク質の生体内の分解（ 半減期の増加）の抑制の場合において、アミノ末端残基としてロイシン（大きい 疎水性の残基）を含有するアミノ酸誘導体（例えば、メチルエステル）を、タン パク質分解基質としてそのタンパク質のＮ末端の法則仲介認識を妨害することが できる。あるいは、トリプトファン（他の大きい疎水性の残基）を包含するアミ ノ酸誘導体（例えば、メチルエステルまたはジペプチド）を使用して同一タンパ ク質の分解を抑制することができる。実施例５．６および７に記載するように、 ロイシン−βｇａｌの半減期は、酵母細胞において、ロイシンメチルエステル（ 第６図）またはＬ−）リプトファンーＬ−Ａｌａジペプチド（第７図）の存在下 に延長される。

所定の不安定化性アミノ酸の他の不安定化性アミノ酸に対する類似性を支配する 法則は、表により提供される。この表に示されているように、哺乳動物の細胞、 例えば、網状赤血球におけるＮ末端認識活性の３つの実験的に区別可能なりラス （Ｉ〜ＩＩＩ型）および酵母の中のＮ末端認識活性の２つのクラス（■および！ Ｉ型）が存在する。こうして、標的タンパク質の中の不安定化性アミノ末端残基 と同一の型（ＬＩＩまたはＩＩｌ、参照、表）の不安定化性アミノ末端アミノ酸 残基をもつレギュレーターは、タンパク質の分解を生体内で完全に抑制するが、 異なる型に属する不安定化性アミノ末端残基をもつＮ末端の法則の経路の他の基 質の分解を抑制しないであろう（第２図および５）。

各真核生物のための安定化および不安定化基は、上に引用したバチマイア−（Ｂ ａｃｈｉｍａｉｒ）らが記載するように決定することができる。ウビクイチンー Ｘ−βｇａｌ技術を使用して、それらのアミノ末端残基のみが異なるタンパク質 の組を産生ずることができ、次いで安定化性および不安定化性残基の同定を選択 した真核生物の中で各Ｘ−βｇａｌの分解速度を観測することによって決定する ことができる。

また、下に記載するように（実施例５）、アミノ末端が疎水性アミノ酸残基（フ ェニルアラニン−βｇａｌ、）リプトファンーβｇａ　１１チロシン−βｇａｌ およびイソロイシン−βｇａｌ）である、４つの追加のＸ−βｇａｌタンパク質 の代謝安定性（生体内半減期）は、ロイシンメチルエステルの存在下に増加した 。こうして、Ｎ末端の法則の経路は、完全な細胞において、アミノ末端アミノ酸 残基がその代謝安定性を増加すべき１または２以上のタンパク質のアミノ末端残 基と同一であるか、あるいはそれに類似する、アミノ酸誘導体により選択的に抑 制することができることが示された。

一般に、本発明において有用であるレギュレーターは、ジペプチド、小さいポリ ペプチド、大きい疎水性のエステルおよび不安定化性アミノ酸のｔｏｒカルボキ シル末端の誘導体である。例えば、適当なアミノ末端アミノ酸残基（Ｎ末端の法 則により定めらた）をもつ小さいポリペプチドは本発明の範囲内レギュレーター として使用することができる。カルボキシル末端のブロッキング基の例は、有機 部分、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチルおよびイソブチル基である。

本発明の目的に有用であるは、完全な細胞または全動物により容易に吸収され、 そして細胞の中で生理学的に十分なレベルに蓄積すべきである。レギュレーター の他の有用な性質は、細胞の中への途中でおよびいったん細胞の中に入った両者 の場合における、不活性化性代謝的転化物質に対するその相対的抵抗性である。

不活性化に対するレギュレーターの抵抗性を増加する操作の１つの例は、構成成 分のアミノ酸残基の巨竜がＬ立体配置を有するＬ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｌ−Ａ　１　ａ ジペプチドの代わりにＬ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａを使用することである。Ｌ−Ａｒ ｇとＤ−Ａｌａとの間のペプチドは結合は、このジさプ千ドの標準の変異型であ るＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａの中のペプチド結合より、細胞の内側のタンパク質分 解攻撃に対して抵抗性であるように思われる。事実、第９図に示すように、Ｌ− Ａ　ｒ　ｇ−Ｄ−Ａ　１　ａの使用は、Ｌ−Ａ　ｌ　ａ−Ｌ−Ａ　１　ａジペプ チドの使用より強い生体内のＡｒｇ−βｇａｌの代謝的安定化を生ずる。

本発明の方法に従い、分離した細胞の場合において、レギュレーターを成長培地 に直接添加するか、あるいは特定した一時的方法の下で供給することができる。

全動物の場合において、レギュレーターは経口的に、皮下または他の注射により 、静脈内に、非経口的に、皮膚を通して、経直腸的にまたはレギュレーターを含 有する移植した受容体を経て投与することかで舎る。レギュレーターを投与する 形態（例えば、粉末、錠剤、カプセル、溶液、乳濁液）は、それを投与するルー トに依存するであろう。投与すべきレギュレーターの量は、個々の基準に基づい て決定され、そして少なくとも一部分個体の大きさ、処置すべき症候のひどさ、 およびめる結果に基づくであろう。レギュレーターはこれらのルートのいずれか により投与すべき組成物の中に含めることができる。このような組成物は、１ま たは２以上のレギュレーターに加えて、キャリヤー（例えば、レギュレーターを ゆっ（り解放するポリマー）、生理学的に許容されうる緩衝剤および操作したま たは自然のタンパク質を含むことができ、前記タンパク質は体の中で所望の機能 を有し、そしてその代謝安定性は本発明の方法に従うレギュレーターの同時投与 により増加すべきものである。この場合において、レギュレーターはそのアミノ 末端アミノ酸残基が問題のアミノ末端（不安定化性）残基と同一であるか、ある いはそれに類似する方法で設計する。このようにして、レギュレーターはＮ末端 認識タンパク質のアミノ末端認識部位と相互作用し、これによりＮ末端の法則の 経路を競争的に抑制することによって、タンパク質の代謝安定性を増加する作用 をする。

あるいは、レギュレーターの所望のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオヂド 配列を含むＤＮＡ構成体を、特定の型またはクラスのタンパク質の分解の抑制を 望む細胞の中に導入することができる。ＤＮＡ配列は、適当なベクター、例えば 、レトロウィルスのベクターにより導入することができる。すべてのＤＮＡがエ ンコードしたタンパク質およびペプチドはメチオニンで開始し、したがって、所 望のペプチドを産生ずるように細胞によりプロセシングすることができるタンパ ク質のを発現するを生ずるように設計した構成体が使用されるであろう。使用す べきＤＮＡ構成体は、バチマイアー（Ｂ　ａ　ｃ　ｈｍａ　ｉ　ｒ）ら、サイエ ンス（ＳｃｉｅｎｃｅＬ呈３４　：　１．７９−１８６　（１９８６）　、その 内容をここに引用によって加える、に記載されＣいるウビクイチンの融合アプロ ーチに基づく。簡単に述べると、構成体は１つのウビクイチンおよび引き続くア ミノ酸残基Ｘ（ここでＸは２０のアミノ酸のいずれか１つである）、および所望 のペプチド配列から成る融合タンパク質をエンコードするであろう。標的細胞の 中のこのタンパク質の発現は、バチマイア−（Ｂａ　ｅｈｍａ　ｉ　ｒ）らが前 に示したように、融合タンパク質の急速な脱つビクイチンを生成し、遊離のウビ クィチンと所望のアミノ末端残基Ｘをもつタンパク質を生ずるであろう。このペ プチドは、細胞の中に十分なレベルで蓄積するとき、Ｎ末端の法則の経路を特異 的に抑制するであろう。

Ｎ末端の法則の経路の生体内抑制は「ゼロ時間の」増強効果を示す生体内の分解 に対する形成期のタンパク質の感受性は、一般に、成熟しそして完全にフォルデ ィングしたとき、同一タンパク質の感受性と異なる。この差の１つの理由は、新 しく形成したタンパク質がその成熟した立体配置に適合するために有限の時間を 取るという事実から由来する。

この時間間隔はタンパク質毎に変化し、この時間間隔の間に、部分的にフォルデ ィングしたタンパク質分子は、生体内分解経路による、そしてとくにＮ末端の法 則の経路による、切断に対する感受性である可縫性が強い。後者の経路は、例え ば、部分的にフォルディングしたタンパク質を優先的に標的する。なぜなら、こ のようなタンパク質はそれらのアミノ末端におけるタンパク質分解的「ニブリン グ（ｎｉｂｌｉｎｇ）Ｊに対してより感受性であるように思われるからである。

ある点において、このような「ニブリング」は不安定化性アミノ末端残基を暴露 し、これによりタンパク質をＮ末端の法則の経路のための基質に転化する。成熟 旦な寿命が短いタンパク質の反応速度論に１次（指数）の分解と、同一タンパク 質が新しく形成しかつなお立体配置的成熟していないときの、そのタンパク質の １次でない分解とを区別するために、後者の型の分解を「指数前の（ｐｒｅ−ｅ ｘｐｏｎｅｎｔ　１ａｌ）Ｊものと呼ぶ。興味あることには、本発明のレギュレ ーター物質（Ｎ末端の法則の経路の生体内レギュレ−ター）は、生きている細胞 のＮ末端の法則の経路におけするタンパク質の定常状態のレベルは、その細胞に おいてレギュレーターにより、成熟タンパク質のそれらの代謝的安定化を通して ばかりでなく、かつまたリポソーム上の５：れらのタンパク質の合成の間および 直後に増加される（いわゆる「ゼ１コ時間」効果）。

振り返って見ると、レギュレーター物質、例えば、ロイシンメチルエステル、こ れは生体内で容易に加水分解されてメタノールおよび（不活性の）遊離ロイシン となる、は、好中球体の特異的抑制に十分な定常状態のレベルに生きている細胞 の中で蓄積することを示すすることができることは顕著でありか・つ推定的に予 期せざることである。本発明において記載する実験の結果が示すように、蓄積は 事実起こり、こうして完全な細胞および全動物における特定のタンパク質の分解 を選択的に抑制する新しい道を開く。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を限定 しない。

実施例１　酵母細胞の成長へのロイシンメチルエステルの効果この実施例および 引ぎ読〈実施例において、試薬、菌株およびアッセイの方法は下に記載した。

試薬 ′アミノ酸誘導体（メチルエステルおよびジペプチド）は、ベイチェム・バイオ サイエンス・インコーホし・−テッド（ＢＡＣＨＥＭ　Ｂ　１ｏｓｃｉｅｎｃｅ 　Ｉｎｃ、、ベンンルベニア州フィラデルフィア）およびジグ’？−ケミカル・ カンバ−−−（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、ミゾリー州セントルイ ス）から入手した。

菌株 ＢＷＧＩ−７ａ（ＭＡＴａ　ｈｉｓ４　ａｄｅｌ　尿素３　１ｅｕ２）株のサツ カロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ）の細胞を、普通の技術［Ｆ、ジャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）ら、酵母遺伝学 における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コールド・スプリ ング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク、１９８１］を使用して、プラスミドで形質 転換した。形質転換した細胞を３０℃において２％のガラクトース、０．６７％ のアミノ酸不含の酵母窒素塩基（Ｄｉｆｅｏ）、アデニン（１０μｇ／ｍｌ）、 ヒスチジン（２０μｇ／ｍｌ）およびロイシン（６０μｇ／ｍりの媒質の中で成 長させた。

プラスミド 使用したプラスミドは、バチマイアー（Ｂａｃｈｍａｉｒ）ら、サイエンス（Ｓ ｃ　１ｅｎｃｅ）　、２３４　：１７９−１８６　（１９８６）　、その内容を ここに引用によって加える、に記載されているものであった。

簡単に述べると、それらは１つのウビクイチン部分および引き続くアミノ酸残基 Ｘ（ここでＸは２０のアミノ酸の任意の１つである）、およびβ−ガラクトシダ ーゼ（βｇａ　Ｊ）タンパク質から成る融合タンパク質をエンコードする。この 融合タンパク質の発現は、誘発可能なＧＡＬプロモーターの制御下にある。酵母 の中でいったん発現されると、融合タンパク質のウビクイチン部分は内因性ウビ クイチン特真的プロテアーゼにより急速に切断されて、Ｘ−βｇａｌタンパク質 のアミノ末端において残留Ｘを生ずる。

定常状態のβ−ガラクトシダーゼのアッセイ細胞は、前述したように、Ａ６゜。

において０．　２〜０．５の光学密度に成長させた。下に記載するアミノ酸誘導 体を濃縮したスＩ・ツク（リン酸カリウムでｐＨ７，０緩衝した）から細胞に、 所望の最終濃度が得られるまで、添加した。インキュベーションは３０℃におい て続けた。寿命が短い（０，５ｍ１）を示した時間において取り出し、そして細 胞を遠心により集めた。沈澱を３．５ｍｌのＺ緩衝液（０，１モルのリン酸ナト リウムｐＨ７，０，１０ミリモルのＫＣＬＩミリモルのＭｇＳＯ４，３８ミリモ ルの２−メルカプトエタノール）の中に再懸濁し、ＣＨＣｌｇ（２滴）および０ ．１％のＳＤＳ　（１滴）を添加し、そしてこの混合物を１０秒間渦形成した。

次いで、βｇａｌの酵素活性のアッセイをＱ、１ｍｌの４ｍｇ／ｍｌの０−ニト ロフェニル−β−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）溶液を添加し、次いで３０℃ においてインキュベーションした。このアッセイはＱ、５ｍｌの１モルＮａ＠Ｃ Ｏｓの添加により停止した。混合物を遠心により清浄にした後、４２０ｎｍにお ける吸収を測定した。ある場合において、細胞は沈澱しないが、５０μｌの培養 物を０．４５ｍ１のＺ緩衝液に直接添加した。

生体内のパルス−チェース実験 形質転換した細胞を、前述したようにであるが、メチオニン（２０μｓ／ｍｌ） に添加して、６００ｎｍにおいて約０．　５の光学密度に成長させた。アミノ酸 誘導体を添加し、そして光学密度がほぼ０．　１となるマチ、４〜５時間インキ ュベーションした。１０ｍ、Ｉの培養物からの細胞を、マイクロタイター濾過プ レートのウェルを通して濾過することによって収穫した。引き続いて、細胞をフ ィルター上でメチオニンを欠如する媒質中で数回洗浄し、そしてＱ、４．ｍ、Ｉ の１％のガラクトース、５０ミリモルのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）の 中に再懸濁した。

次いで、（”Ｓ）メチオニン（１００μＣｉ）を特定したパルス時間に添加した 。細胞を濾過により集め、そして０．４ｍｌのシクロヘキシイミド（領　２ｍｇ ／ｍりおよびトリコダーミン（５０μｇ／ｍりを含有する培地の中に再懸濁した 。試料（０，１ｍ１）を示した時間に取り出し、そして０．４ｍｌのガラスピー ズに加えて、０．８ｍｌのロイペプチン、ペプスタチンＡ１アンチパイン、アプ ロチニンおよびキモスタチン（ＳｉｇｍａＸ各々２０　ｕ　ｇ／ｍ　１　）を含 有する冷緩衝液Ａ（５０ミリモルのＮａ−ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，５，０，１５モ ルのＮａＣ１゜５ミリモルのＥＤＴＡ、１％のトリトンＸ−１００）に添加した 。細胞を４℃において１分間３回渦形成して崩壊した。抽出物を１２．０００ｇ において１０分間遠心し、そして上澄み液の中の酸不溶性ｓｓＳの放射畦決定し た。等しい量の合計の酸不溶性ｓｓＳを含有する上澄み液のアリコートを、βｇ ａｌに対するモノクローナル抗体との免疫沈澱のためにプロセシングした。モル 過剰の抗体（少なくとも１０倍）を含有する腹水を各アリコートに添加し、引き 続いて氷上で１〜２時間インキュベーションした。次いで、プロティンＡ−セフ ァローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）Ｅファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］を添 加し、懸濁液を４℃において３０分間インキュベーションし、そして１２，００ ０ｇにおいて３０秒間ロッキングしながら遠心した。プロティンＡ−セファロー ズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）の沈澱を１１％のＳＤＳを含有する緩衝液Ａを３回洗 浄し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する電気泳動試料緩衝液の中に再懸 濁し、１００℃に３分間加熱し、そして１２．０００ｇにおいて２０秒間遠心し た。［ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、２２ ユ、６８０　（１９７０）ｌｏ上澄み液を６％の不連続のポリアクリルアミド− ５ＤＳゲル（１５０Ｘ１５０Ｘ１．５ｍｍ）の中の電気泳動にかけ、引き続いて フルオログラフィーにかけた。

生体内の半減期の決定 パルス−チェースのゲルのフルオログラフィー後、各バンドにおける放射能の量 をそれぞれのゲルのスライスのシンチレーションカウンティングにより検出した 。半減期をこれらの値（ブランクのゲルのスライスからの値を使用して適当に調 節した）から計算して、タンパク質の破壊の１次の反応速度論を仮定する。

アルギニン−βｇａｌ（Ａｒｇ−８ｇ　ａ　１１０ｓ・）またはロイシン−βｇ ａｌ（Ｌｅｕ−βｇａ　ｌ、口、■）を発現するプラスミドを収容する指数的に 成長する酵母細胞の成長への１０ミリモルのロイシンメチルエステル（Ｌｅｕメ チルエステル）の効果を、なにも補充しない（口、■）で、あるいはＬｅｕメチ ルエステルを１０ミリモルの最終濃度に補充して（■、・）アッセイした。結果 を第１図に表す。それらの条件の各々の下の成長を６００ｎｍにおける光学密度 によりモニターした。第１図に示すように、Ｌｅｕメチルエステルは細胞の成長 に悪影響を及ぼさなかった。また、ジペプチドＡｒｇ−ＡｌａおよびＡｌａ−Ａ ｒｇ（実施例４において使用した）、Ｔｒｐ−Ａｌａ、またはＡｌａ−Ｔｒｐ（ 実施例７において使用した）による酵母細胞の成長の悪影響がないことは、使用 した期間にわたって明らかであった（データは示さない）ことに注意すべきであ る。

Ａｒｇ−βｇａｌ（○、・）またはＬｅｕ−βｇａｌ（口、■）を発現するプラ スミドを有する酵母細胞に、変化する初期ＯＤ＠ｅｓにおいて、Ｌｅｕメチルエ ステルを１０ミリモルの最終濃度（・、履）に補充し、そして３時間インキュベ ーション後、βｇａｌ活性についてアッセイした。対照培養物（０，口）にメチ ルエステルを添加しなかつた。

第２図に示す結果が示すように、Ｌｅｕメチルエステル（、Ｌｅｕ−ＯＭ　ｅ　 ）はＬｅｕ−βｇａｌ（大きい疎水性のアミノ末端）の定常状態活性（量）を特 異的に増加するが、Ａｒｇ−βｇａｌ（塩基性アミノ末端）の量を増加しない。

また、第２図の結果が示すように、効果は指数的に成長する細胞（すなわち、よ り低い光学密度において）より顕著である。

したがって、引き続（研究において、はぼ０．５〜１゜、０のＯＤ、、。におい て培養物を使用した。

実施例３　生体内のロイシン−βａｌの定常状態のレベルへの１０ミリモルのロ イシンメチルエステルの効果の経時的研究Ｌｅｕ−βｇａｌを収容する指数的に 成長する酵母細胞に、Ｌｅｕメチルエステルを１０ミリモルの最終濃度（ゼロ時 間）に補充し、そしてβｇａｌ活性について７時間にわたってアッセイした（■ ）。対照の培養物（ロ）にメチルエステルを添加しなかった。

結果を第３図に表しそしてこれらの結果が示すように、Ｌｅｕ−βｇａｌレベル へのＬｅｕ−ＯＭｅの効果の大きさは経時的に直線的に増加する（少なくとも最 初の７時間の間）。最良の適合の線の傾斜は、Ｌｅｕ−ＯＭｅ濃度が１０ミリモ ルであるとき（対照のレベルと比較したとき）、βｇａｌレベルの１１倍／時間 の増加を生ずる。

実施例４　生体内の定常状態のＡｒ　−β　ａｌレベルへのアルギニンを含有す るジペプチドの効果の経時的研究Ａｒｇ−βｇａｌを発現するプラスミドを収容 する指数的に成長する酵母細胞に、次のものを補充した：試料の緩衝液（■）、 １０ミリモル（最終）のＬ−アルギニン−Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａ　ｌ　ａ−Ｌ− Ａ　１　ａ。

■）、および１０ミリモル（最終）のＬ−アラニン−Ｌ−アルギニン（Ｌ−Ａ　 １　ａ−Ｌ−Ａ　ｒ　ｇ、　Ｏ）。βｇａｌ活性は７時間の時間経過にわたって アッセイし、そして時間の関数としてプロットした。

結果を第４図に示す。Ｌｅｕ−βｇａｌレベルへのジペプチドＬ−ＡＩａ−Ｌ− Ａｌａの効果の大きさは経時的に直線的に増加する。最良の適合の線の傾斜は、 Ｌ−Ａ　１　ａ−Ｌ−Ａ　１　ａの濃度が１０ミリモルであるとき（対照のレベ ルと比較したとき）、βｇａｌレベルの８．５倍／時間の増加を生ずる。Ｌ−Ａ ｌａ−Ｌ−Ａｒｇは効果をもたなかった。

これが示すように、ジペプチドの中のアミノ酸の序列はその抑制活性のためにき わめて重要である。詳しくは、Ａｒｇは効果を有するためにはジペプチドのアミ ノ末端に存在しなくてはならない。

実施例５　大きい疎水性のアミノ末端残基をもつすべてのＸ−βｇａｌ試験タン パク質の生体内の定常状態のレベルをロイシンメチルエステルは増加する フェニルアラニン−βｇａｌ　（Ｐｒｏ−βｇａｌ、ＩＩ）、ｏイシンーβｇａ ｌ（Ｌｅｕ−βｇａ　ＬＯ）　、）リブトファンーβｇａｌ（Ｔｙｐ−βｇａｌ 、・）、チロシン−βｇａｌ（ＴＹｒ−βｇａｌ、ム）およびインロイシン−β ｇａｌ（Ｉｌｅ−βｇａ　Ｉ、◆）を発現するプラスミドを収容する指数的に成 長する酵母細胞に、ＬｅｕメチルエステルをＯ〜１０ミリモルの範囲の濃度で補 充し、これを１時間インキュベーションし、そしてβｇａｌ活性についてアッセ イした。対照として、Ａｒｇ−βｇａｌ（ロ）およびＶａｌ−βｇａｌ（＊）プ ラスミドを収容する細胞を同じように試験した。Ｘ−βｇａｌタンパク質の半減 期［バチマイアー（Ｂａｃｈｍａｉ　ｒ）ら、サイエンス（Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ ）。

２３４　：１７９−１８６　（１９８６）により決定した］を括弧内に記載する 。結果を第５図に表し、ここで比較的寿命が短いＸ−βｇａｌを含む実験からの データをより大きい規模で明瞭のためにプロットされている（左のパネル）。

結果が示すように、Ｌｅｕ−ＯＭｅの不存在下の種々のＸ−βｇａｌの濃度の変 動はＸ−βｇａｌの半減期が変化するためである［参照、バチマイア−（Ｂａｃ ｈｍａｉｒ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３４　：１７９−１８６　 （１９８６）］。半減期が長くなるほど、観測されるゼロ時間の活性は高（なる 。また、結果がが示すように、大きい疎水性のアミノ末端をもつすべての５つの Ｘ−βｇａｌタンパク質のレベルは、ＯＭｅを添加しない各々の量を越えて、Ｌ ｅｕ−ＯＭｅの存在下に増加する。一般に、この効果はほぼ５〜ｌＯミリモルの Ｌｅｕ−ＯＭｅで飽和に到達する。塩基性アミノ末端およびほぼ２分の半減期を 有するＡｒｇ−βｇａｌ、または長い寿命（半減期〉２０時間）のＶａｌ−βｇ ａｌでは、効果が見られなかった。

Ｖａｌ−βｇａｌ（Ａ）、あるいは１０ミリモルのＬｅｕメチルエステルの３時 間のンンキュベーションの存在（Ｃ）または不存在（Ｃ）にＬｅｕ−βｇａｌを 発現する細胞を使用して、パルス−チェース実験（５分のパルス）を実施した。

時点：０分（レーン１）；１０分（レーン２）：および３０分（レーン３）。バ ンドを標識した：βｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）；９０ｋＤ（βｇａｌの切 断産生物；代謝的に安定なＶａｌ−βｇａｌのレーンをもつレーンからのその不 存在に注意）；Ｘ（βｇａＩに対するモノクローナル抗体と交差反応性の無関係 のタンパク質権）；およびＳ（代謝的に安定なＸ−βｇａｌに対して明らかに特 異的なβｇａｌ産生物；種）。

結果を第６図に表す。それらが示すように、Ｌｅｕ−βｇａｌの半減期はＬｅｕ −ＯＭｅの存在下に増加する。計算した半減期（０〜１０分の時点の値）：マイ ナスＯＭｅ−４分、プラスＯＭｅ−１２分：すなわち、３倍の増加。また、それ らが示すように、ＯＭｅの存在下にＬｅｕ−βｇａＪの量の「ゼロ時間の」促進 が存在する（参照、βｇａｌのバンド、ＢおよびＣにおけるレーン１）。このバ ンドにおいて１．９倍のタンパク質の量の増加が存在する。また、ＯＭｅの存在 下の９０ｋＤのβｇａｌ切断産生物の非常な減少に注意すべきであり、これはこ のタンパク質分解のルートによりより少ないβｇａｌが破壊されていることを示 す。

実施例７　ロイシン−βｇａｌは生体内でＬ−Ｔ　ｒ　ｐ−Ｌ−Ａ　１　ａによ り安定化されるが、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｔｒｐにより安定化されない Ｖａｌ−３ｇ　ａ　ｌ　（Ａ）　、Ｌ　ｅ　ｕ−βｇａ１　（Ｂ）　、Ｌｅｕ− βｇａｌ＋１０ミリモルのＬ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｌ−Ｔ　ｒ　ｐ（Ｃ）　、およびＬ ｅｕ−βｇａ　Ｉ＋１０ミリモルのＬ−Ｔ　ｒ　ｐ−Ｌ　−Ａ　ｌ　ａ　（Ｄ） を発現する細胞を使用して、パルス−チェース実験（５分のパルス）を実施した 。各ジペプチドを使用するインキュベーションを４時間実施した。時点：０分（ レーン１）；１０分（レーン２）：および３０分（レーン３）。バンドについて は第６図の凡例を参照されたい。

結果を第７図に表す。それらが示すように、Ｌｅｕ−βｇａｌの半減期はＬ−Ｔ 　ｒ　ｐ−Ｌ−Ａ　ｌ　ａ　（Ｄ）の存在下に長くなるが、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｔ ｒｐ　（Ｃ）の存在下に長くならない。βｇａｌ切断度生物ｒＳＪは代謝的に安 定なＶａｌ−βｇａｌのレーンにおいてのみ観測される（参照、第８図の論考） 。

１０ミリモルのＬｅｕメチルエステルとの４時間のインキュベーションの不存在 （Ａ）または存在（Ｂ）においてＴｙｒ−βｇａｌを発現する細胞を使用して、 パルス−チェース実験（３分のパルス）を実施した。

時点二〇分（レーン１）；１０分（レーン２）；３０分（レーン３）；および６ ０分（レーン４）。バンドの表示については、第６図への凡例を参照。結果を第 ８図に示す。それらが示すように、Ｔｙｒ−βｇａｌの生体内の半減期はＬｅｕ −ＯＭｅの存在下に増加する。計算した半減期：マイナスＯＭｅ−７．５分、プ ラスＯＭｅ−３６．４分：すなわち、４．８倍の増加。

また、ゼロ時間の促進を再び注意すべきである；ＯＭｅの存在下にタンパク賀の ３．６倍の増加が存在する。Ｔｙｒ−βｇａｌのこの効果のよりよい実証因子で ある。なぜなら、使用するパルス時間（３分）はＴｙｒ−βｇａｌの半減期（７ ゜５分）より非常に短く、それゆえ「ゼロ時間の」の量の増加はもっばら半減期 の増加のためのβｇａｌの蓄積によるからである。パルスが半減期よりちょうど 長い（５分封４分）ＬｅＵ−βｇａｌ（第６図）の場合において、ゼロ時間の促 進は一部分このパルスの間のβｇａｌの蓄積のためであることがある。なぜなら 、ＯＭｅはβｇａｌの半減期を延長しているからである。代謝的に安定なＸ−β ｇａｌを使用したときにのみ通常見られる、パネルＢにおけるβｇａｌ破壊産生 物の存在に注意する。こうして、Ｌｅｕ−ＯＭｅの存在下に、細胞の分解メカニ ズムはＴｙｒ−βｇａｌを代謝的に「安定な」βｇａ１種として処理されている 。

実施例９　生体内でＡｒｇ−βｇａｌを安定化するその能力へのＡｒｇ−Ａｌａ ジペプチドの中のペプチド結合の立体配置の効果Ａｒｇ−βｇａｌおよびＶａｌ −βｇａｌを発現する細胞を３つのジペプチドの１つのの存在下に２時間インキ ュベーションした：Ｌ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａ　１　ａＳＬ−Ａ　１　ａ−Ｌ−Ａ　１ 　ａまたはＬ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｌ−Ａ　ｒｇ０次いで、βｇａｌ活性を前述したよ うに決定し、そして未処理対照（ｒｃｏｎＪ　）の活性に関してプロットした。

実際のβｇａｌ活性を各欄の上に記載する。立体配置は、特記しない限り、ｒＬ Ｊ型である。

結果を表９に記載する。それらが示すように、Ｌ−Ａ　ｒ　ｇ−Ｄ−Ａ　Ｉａは Ｌ−Ａ　ｌ　ａ−Ｌ−Ａ　１　ａより非常にすぐれＡｒｇ−βｇａｌのた生体内 の安定化因子であるが、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｒｇは効果をもたない。

多分、ペプチド結合のｒＤＪの立体配置は生体内の切断に対してより抵抗性であ り、その結果Ｎ末端の法則の経路の生体内抑制因子としてジペプチドの不活性化 速度を低下する。

１０ミリモルのＬｅｕメチルエステルの添加におけるＯＤ６００時　間　（時間 ） 時　間　（時間） ！、、、＋　ｅ　Ｉ−１メナルエステル濃、Ｉ！（ミリモル）Ｌｅｕメチルエス テル濃度（ミリモル）ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、８ Ａｒｇ−Ａｌａジペプチド中のペプチド結合の立体配置の効果Ａｒｇ−βｇａＬ 　Ｖｏｌ−ρｇａｌ 国際調査報告 国際調査報告 υＳ　９００３６６９ Ｓ＾　３８７０８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生きている細胞の中にレギュレーターをＮ末端の法則の経路におけるレギュ レーターの参加のために適当な条件下に導入することからなり、前記レギュレー ターは細胞内タンパク質のアミノ末端アミノ酸残基と同一であるか、あるいはそ れに類似するアミノ末端アミノ酸残基を有する、生きている細胞の中の細胞内タ ンパク質の代謝安定性を選択的に増強する方法。 ２、レギュレーターは、細胞内タンパク質のアミノ末端アミノ酸残基と同一であ るか、あるいはそれに類似するアミノ末端アミノ酸残基のカルボキシル末端の誘 導体である、上記第１項記載の方法。 ３、レギュレーターは、ジペプチド、小さいポリペプチド、および大きい疎水性 エステルから成る群より選択される、上記第２項記載の方法。 ４、細胞の中にレギュレーターをＮ末端の法則の経路におけるレギュレーターの 参加のために適当であるかつＮ末端の法則の経路における細胞内タンパク質の参 加を減少する条件下に導入することからなり、前記レギュレーターは細胞内タン パク質のアミノ末端アミノ酸残基と同一であるか、あるいはそれに類似するアミ ノ末端アミノ酸残基からなる、Ｎ末端の法則の経路を経る細胞内タンパク質の生 体内の分解を選択的に抑制する方法。 ５、レギュレーターは、ジペプチド、小さいポリペプチド、および大きい疎水性 エステルから成る群より選択される、上記第４項記載の方法。 ６、大きい疎水性のアミノ酸であるアミノ末端アミノ酸残基を有するタンパク質 の真核生物の細胞の中の代謝安定性を増強する方法であって、前記細胞の中に大 きい疎水性アミノ酸からなるエステルを、Ｎ末端の法則の経路における前記エス テルの参加に適当でありかつＮ末端の法則の経路を経る前記タンパク質の分解を 減少する条件下に、導入するからなる方法。 ７、前記エステルはアルキルエステルである、上記第６項記載の方法。 ８、アミノ末端アミノ酸残基は、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、リ ジン、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン 、チロシンおよびイソロイシンから成る群より選択される、上記第６項記載の方 法。 ９、前記エステルはメチルエステルである、上記第７項記載の方法。 １０、酵母細胞の中のＮ末端の法則の経路を経る非区画化細胞内タンパク質の分 解を選択的に抑制する方法であって、酵母細胞の中に、細胞内タンパク質のアミ ノ末端アミノ酸残基と同一であるか、あるいはそれに類似するアミノ酸からなる レギュレーターを、Ｎ末端の法則の経路におけるレギュレーターの参加に適当で ありかつＮ末端の法則の経路における前記タンパク質の参加を減少する条件下に 、導入することからなる方法。 １１、レギュレーターは、ジペプチド、小さいポリペプチド、および大きい疎水 性エステルから成る群より選択される、上記第１０項記載の方法。 １２、レギュレーターは、大きい疎水性のアミノ酸のアルキルエステル、アミノ 末端に大きい疏水性のアミノ酸を含むジペプチド、およびアミノ末端に大きい疎 水性のアミノ酸を含む小さいポリペプチドから成る群より選択される、上記第１ １項記載の方法。 １３、Ｎ末端の法則の経路を経て細胞の中に導入されたタンパク質の分解を選択 的に抑制する方法であって、細胞の中に、前記タンパク質のアミノ末端アミノ酸 残基と同一であるか、あるいはそれに類似するアミノ酸からなるレギュレーター を、Ｎ末端の法則の経路における前記レギュレーターの参加に適当な条件下に、 導入することからなる方法。 １４、選択したタンパク質のアミノ末端アミノ酸残基と同一であるか、あるいは それに類似するアミノ酸からなるレギュレーターからなる、選択したタンパク質 の生きている細胞の中のＮ末端の法則の経路を経る分解を選択的に抑制する組成 物。 １５、ａ）前記タンパク質のアミノ末端アミノ酸残基と同一であるか、あるいは それに類似するアミノ末端アミノ酸からなるジペプチド；ｂ）前記タンパク質の アミノ末端アミノ酸と同一であるか、あるいはそれに類似するアミノ末端アミノ 酸からなる小さいポリペプチド；ｃ）前記タンパク質のアミノ末端アミノ酸残基 と同一であるか、あるいはそれに類似するアミノ酸のエステル；から成る群より 選択されるレギュレーターからなる、上記第１２項記載の組成物。 １６、ジペプチドまたは小さいポリペプチドをエンコードするＤＮＡ構成体から なり、前記ジペプチドまたは小さいポリペプチドは細胞内タンパク質のアミノ末 端アミノ酸残基と同一であるか、あるいはそれに類似するアミノ末端アミノ酸残 基を有する、真核生物の細胞の中のＮ末端の法則の経路を経る細胞内タンパク質 の分解を選択的に抑制するのための組成物。 １７、生物学的産生系の中に、産生されているタンパク質のアミノ末端アミノ酸 残基と同一であるか、あるいはそれに類似するアミノ末端アミノ酸残基を有する レギュレーターを導入することからなる、生物学的産生系における選択したタン パク質の収量を増加する方法。 １８、真核生物の細胞の中にレギュレーターを導入することからなり、前記レギ ュレーターは、 ａ）前記タンパク質のアミノ末端アミノ酸残基と同一であるか、あるいはそれに 類似するアミノ末端アミノ酸からなるジペプチド；ｂ）前記タンパク質のアミノ 末端アミノ酸と同一であるか、あるいはそれに類似するアミノ末端アミノ酸から なる小さいポリペプチド；ｃ）前記タンパク質のアミノ末端アミノ酸残基と同一 であるか、あるいはそれに類似するアミノ酸のアルキルエステル；から成る群よ り選択される、常態でＮ末端の法則の経路を経て分解する　選択したタンパク質 を真核生物の細胞の中で産生する方法。 １９、選択したタンパク質のアミノ末端アミノ酸残基と同一であるか、あるいは それに類似するアミノ酸レギュレーターをエンコードするＤＮＡ構成体からなる 、選択したタンパク質のＮ末端の法則の経路を経る分解を選択的に抑制するため の組成物。