JP2904921B2 - 生きている細胞の中のｎ末端の法則の経路の抑制 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 細胞内タンパク質の半減期は数秒ないし多数日であ
る。細胞内タンパク質の分解の１つの主要な機能は、損
傷あるいはそうでなければ異常なタンパク質の選択的排
除である。分解経路の他の役割は、その細胞内濃度が経
時的に変化しなくてはならない損傷されていないタンパ
ク質に、永久的にあるいは一時的に、短い半減期を与え
る。多数の他のタンパク質は、より大きい巨大分子の複
合体、例えば、リボソームまたはオリゴマーのタンパク
質の成分として長く生きるが、遊離の（アソシエーショ
ンしない）状態では代謝的に不安定である。

選択的タンパク質の分解の速度は、細胞の生理学的状
態の関数であり、そして個々のタンパク質について示差
的にコントロールされるように思われる。常態で短い寿
命のタンパク質の代謝的不安定性は、合成または分解の
速度の調節した変化を通して、それらの細胞内濃度の急
速な調節を可能とする。細胞内タンパク質の代謝的不安
定性がその機能のために必須であることが示された僅か
の例は、バクテリオファージラムダのcIIタンパク質お
よび酵母サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyce
s cerevisiae）のHOエンドヌクレラーゼを包含する。

通常の代謝的条件下の細胞内タンパク質の選択的回転
の大部分は、ATP依存性でありそして、真核生物におい
て、非リソソーム的である。最近の生化学的および遺伝
学的証拠や、真核生物において、寿命が短い細胞内タン
パク質に対するユビキチン（ubiquitin）の共有接合が
それらの選択的分解のために必須であることを示す。所
定のタンパク質が生体内で代謝的に安定または不安定で
あるかどうかを決定する法則は、従来未知である。

バチマイアー（Bachimair）ら、サイエンス（Scienc
e）、234:179−186（1986）；細胞（Cell）、56:1019−
1031（1989）は、タンパク質の中で所望のアミノ末端残
基を発生する方法およびＮ末端の法則を使用してタンパ
ク質の代謝的安定性に影響を及ぼす方法を記載してい
る。バチマイア（Bachmair）らは、細胞内タンパク質の
アミノ末端において暴露されているアミノ酸の性質は、
あるタンパク質が生体内で代謝的に安定であるか、ある
いは寿命が短いがどうかを特定する決定子であることを
発見した。個々のアミノ酸は、それらがタンパク質のア
ミノ末端において暴露されたとき、タンパク質に与える
代謝的安定性（半減期）の程度に関して、安定化性また
は不安定化性のアミノ酸としてカテゴリーに分けること
ができる。不安定化性アミノ酸残基は短い半減期を与
え、この半減期は不安定化性アミノ酸のあるものについ
ては数分程度に短いことがある。安定化性アミノ酸残基
は、多数時間の長さであることができる、長い半減期を
与える。タンパク質の半減期のそのアミノ末端残基の性
質へのこの依存性は、Ｎ末端の法則と呼ぶ。最初の工程
がタンパク質分解の基質のアミノ末端の認識を包含す
る、分解の経路は、Ｎ末端の法則の経路（Ｎ−end rule
pathway）と呼ばれてきている。

上に引用したバチマイアー（Bachmair）らによるタン
パク質の分解のＮ末端の法則の発見以来、その存在は同
一グループおよび他の研究者ら［レイス（Reiss）ら、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol.Chem.）、263（６）、2693−98（188）］の両者に
よるそれ以上の研究において反復して確証されてきてい
る。多数の応用のために、生きている細胞におけるＮ末
端の法則の経路依存性のタンパク質の分解を特異的に抑
制（または阻害）することは極めて有用であろう。なぜ
なら、細胞のプロセス、例えば、細胞の増殖および分化
に影響を及ぼすか、あるいは特別に混乱させることは可
能であろうからである。

発明の開示 本発明は、完全な細胞および全動物の中（すなわち、
生体内）のタンパク質の特別な群の分解を選択的に抑制
する方法、ならびにこの方法において有用な組成物に関
する。本発明の方法は、生きている細胞におけるＮ末端
の法則の経路を抑制する方法と呼び、タンパク質のアミ
ノ末端に存在するアミノ酸の性質がそのタンパク質の半
減期の重要な決定子であるという知識を使用する。本発
明の方法および組成物を使用することによって、特定の
タンパク質の半減期またはタンパク質の型を変更（延
長）しそして、その結果、これらのタンパク質が関係す
る細胞のプロセス、例えば、細胞の増殖および分化に影
響を与えることができる。本発明の方法において、レギ
ュレーターと呼ぶ因子をそれが特定のＮ末端認識タンパ
ク質因子に結合しその有意の比率を抑制し、そして、こ
れにより、生体内のＮ末端の法則の経路の特定のサブセ
ットを抑制する条件下に、細胞の中に導入する。特定の
サブセットは、レギュレーターにより抑制されるＮ末端
認識活性により支配される、Ｎ末端の法則の経路の部分
である。例えば、塩基性アミノ末端基を有するレギュレ
ーターは、Ｎ末端の法則の経路のサブセットを形成する
塩基性Ｎ末端認識活性を抑制するであろう。その結果、
それらのアミノ末端に同一のアミノ酸残基または同様な
残基を有する細胞内タンパク質は、レギュレーターが存
在しない場合それらがＮ末端の法則の経路に参加する程
度より少ない程度にそれに参加し、そしてそれらのそれ
ぞれの生体内の半減期は増加する。

レギュレーターはアミノ酸誘導体、例えば、ペプチ
ド、小さいポリペプチドまたは、その代謝安定性を増加
すべき細胞内タンパク質のアミノ末端残基と同一である
か、あるいはそれに類似するアミノ酸の他のカルボキシ
ル末端の誘導体である。

タンパク質のアミノ末端に存在するアミノ酸残基の性
質は、そのタンパク質の決定子である。例えば、酵母の
サッカロミセス・セレビシアエ（S.cerevisiae）におい
て、アミノ末端残基の不安定化性クラスは、アミノ酸、
例えば、イソロイシン、グルタミン酸、チロシン、グル
タミン、フェニルアラニン、ロイシン、アスパラギン、
アスパラギン酸、リジン、アルギニン、トリプトファン
およびヒスチジンを包含する。同一の法則に従い、アミ
ノ末端残基の安定化性クラスは、アミノ酸、例えば、メ
チオニン、セリン、グリシン、アラニン、スレオニン、
バリン、システインおよびプロリンを包含する。

本発明の方法は、Ｎ末端の法則の経路を有するすべて
の有機体において使用することができる。なぜなら、ア
ミノ末端アミノ酸残基の２つのクラス（安定化性および
不安定化性）の特定のメンバーは異なる真核生物の間で
多少の変化するが、特定のＮ末端の法則は各クラスにお
いて応用することができ、そして両者の不安定化性およ
び安定化性のアミノ酸は特定の真核生物のために容易に
同定することができるからである。例えば、哺乳動物の
網状赤血球の最近決定されたＮ末端の法則［ゴンダら、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol.Chem.）印刷中］において、酵母の中でアミノ酸を
安定化するシステイン、アラニン、セリンおよびスレオ
ニンは、網状赤血球の中で不安定化性のものであること
が示された。逆に、酵母において不安定化性であるイソ
ロイシンは網状赤血球において安定化性である。上に引
用したゴンダらが記載する方法に類似する方法におい
て、選択した細胞または有機体におけるＮ末端の法則の
正確な形態を確認することができる。

本発明のレギュレーターは、完全な細胞内タンパク質
のアミノ末端に存在するとき、細胞の中のそのタンパク
質の半減期を減少するアミノ末端残基を包含する。しか
しながら、本発明の方法において使用するとき、レギュ
レーターの中に存在する不安定化性アミノ末端残基は、
事実、Ｎ末端の法則の経路のＮ末端認識成分への結合に
ついて、寿命が短い細胞内タンパク質と競争する「デコ
イ（decoy）」として作用することによって、細胞内タ
ンパク質の半減期を増加する。その結果、そうでなけれ
ば寿命が短いタンパク質は、Ｎ末端の法則の経路により
劣った効率で標的にされ、そして細胞の中のその半減期
を増加する。

本発明の組成物および方法は、種々の異化状態、例え
ば、筋肉のるいそうにおいて観察されるか、あるいは本
発明によるその人工的代謝安定化が病気を停止または逆
転することができる、常態で寿命が短いタンパク質のレ
ベルが不十分であることから観察される、特定のタンパ
ク質の異常な（例えば、過剰の）生体内の分解から生ず
る病気を処置するとき、有用であることができる。ま
た、この方法を使用して、レギュレーター（Ｎ末端の法
則の経路の抑制因子）の不存在下に生ずるであろうもの
を越えて、生物学的産生プロセスにおける収量を増加す
ることができる。

本発明の結果、最初に、生体内で（完全な細胞、およ
び全動物において）Ｎ末端の法則の経路を抑制すること
ができる。予期せざることには、物質、例えば、生体内
でメタノールおよび（不活性の）遊離ロイシンに容易に
加水分解するロイシンメチルエステルを、完全な細胞に
おいて、Ｎ末端の法則の経路の有効な抑制に十分なレベ
ルに蓄積することができる。しかしながら、これは今回
真実であることが示された。こうして、本発明は、完全
な細胞および全動物における特定のタンパク質の分解を
選択的に抑制する新しい道を開く。

図面の簡単な説明 第１図は、Arg−βgalまたはLeu−βgalを発現するプ
ラスミド（Ｎ末端の法則の経路を経て分解する特定の寿
命が短いタンパク質）を収容する、指数的に成長する酵
母（S.cerevisiae）細胞に、ロイシンのメチルエステル
（10ミリモルの最終濃度）を添加する効果を示すグラフ
である。細胞の成長はは600nmにおける光学密度を測定
することによってモニターした。

第２図は、変化する初期OD₆₀₀細胞密度におけるLeuメ
チルエステルの生体内効果のグラフ表示である。

第３図は、Leu−βgalの定常状態のレベルで７時間に
わたるLeuメチルエステルの効果のグラフ表示である。L
euメチルエステル（ゼロ時間において10ミリモルの最終
濃度）を、Leu−βgalを発現するプラスミドを収容す
る、指数的に成長する酵母細胞に添加した。

第４図は、酵母細胞の中のArg−βgalの定常状態のレ
ベルへの７時間にわたる、アミノ末端Arg残基を含有す
るジペプチドの効果のグラフ表示である。Argを含有す
るジペプチドを、Arg−βgalを発現するプラスミドを収
容する指数的に成長する酵母細胞に添加した。

第５図は、大きい疎水性のアミノ末端残基をもつβga
lタンパク質の定常状態のレベルへのLeuメチルエステル
の効果のグラフ表示である。Phe−βgal、Leu−βgal、
Trp−βgal、Tyr−βgal、およびIle−βgalを発現する
プラスミドを収容する、指数的に成長する酵母細胞に、
０〜10ミリモルの濃度範囲のLeuメチルエステルを補充
し、１時間インキュベーションし、そして細胞内βgal
活性についてアッセイした。Ｘ−βgalタンパク質の半
減期［バチマイア（Bachmair）ら、サイエンス（Scienc
e）、234:179−186（1986）の方法に従い決定した］は
括弧内に記載されている。

第６図は、成長する酵母細胞の中のLeuメチルエステ
ルによるLeu−βgalの代謝安定性を示す写真である。こ
の写真は、Val−βgal（Ａ）、またはLeu−βgal10ミリ
モルのLeuメチルエステルとの３時間のインキュベーシ
ョンの存在（Ｂ）または不存在（Ｃ）におけるLeu−βg
alを発現する細胞を使用する、パルス−チェース電気泳
動の実験（５分のパルス）から生ずるゲルを描写する。
時点はレーン１について０分、レーン２について10分、
そしてレーン３について30分である。バンドはβgal
（β−ガラクトシダーゼ）、90kD（βgalの明確な、代
謝的に安定な切断産生物；代謝的に安定なVal−βgalを
使用するレーンからその不存在に注意する）、およびＸ
（βgalに対するモノクローナル抗体と交差反応する、
無関係の内因性酵母タンパク質）としてラベルする。

第７図は、Ｌ−Trp−Ala−ジペプチドによるが、Ｌ−
Ala−Ｌ−Trp−ジペプチドによらない、生体内のLeu−
βgalの安定化を示す写真である。この写真は、Val−β
gal（Ａ）、Leu−βgal（Ｂ）、10ミリモルのＬ−Ala−
Ｌ−Trpの存在下にLeu−βgal（Ｃ）、および10ミリモ
ルのＬ−Trp−Alaの存在下にLeu−βgal（Ｄ）を発現す
る酵母細胞を使用する、パルス−チェース実験（５分の
パルス）の結果を描写する。細胞をジペプチドとともに
30℃において４時間インキュベーションする。時点はレ
ーン１について０分、レーン２について10分、そしてレ
ーン３について30分である。バンドについての標識は第
５図の説明の中にバンド「Ｓ」、長い寿命のβgal種に
対して特異的のβgal切断産生物、を付加して上に記載
する。

第８図は、LeuメチルエステルによるTyr−βgalの生
体内代謝安定化を示す写真である。この写真は、10ミリ
モルのLeuメチルエステルとともの４時間のインキュベ
ーションの不存在（Ａ）または存在（Ｂ）におけるTyr
−βgalを発現する酵母細胞を使用する、パルス−チェ
ース実験（３分のパルス）の結果を示す。時点はレーン
１について０分、レーン２について10分、レーン３につ
いて30分、そしてレーン４について60分である。長い寿
命のβgalとともにのみ通常見られるβgal破壊存在
（「Ｓ」）の蓄積に注意する。また、Leuメチルエステ
ルの存在下の90kDの切断産生物の量の減少に注意する。

第９図は、Arg−Alaジペプチドの中でアミノ酸残基の
立体配置の代謝的に安定化したArg−βgalに対するその
安定性の効果を実証する棒グラフである。Arg−βgalお
よびVal−βgalを発現する酵母細胞を、示したジペプチ
ド（Ｌ−Ala−Ｌ−Arg、Ｌ−Ala−Ｌ−AlaまたはＬ−Ar
g−Ｄ−Ala）の存在下に２時間インキュベーションし
た。次いで、細胞中のβgal活性を決定し、そして未処
理対照（「Con」）の活性に関してプロットした。実際
のβgal活性を各欄の上にに記載する。アミノ酸残基の
立体配置は、特記しない限り、「Ｌ」型である。

発明の詳細な説明 本発明は、タンパク質の特定の型またはクラスの分解
を生きている細胞の中で（部分的または完全に）抑制す
ることができるいう決定に基づく。本発明の方法に従
い、選択した型またはクラスの分解の抑制は、レギュレ
ーターと呼ぶ因子を組み込むか、あるいは導入すること
によって実施され、前記レギュレーターはその分解を抑
制すべきタンパク質のアミノ末端残基と同一であるか、
あるいはそれに類似するアミノ酸を包含する。本発明
は、さらに、レギュレーターそれら自体に関し、前記レ
ギュレーターはアミノ酸誘導体、例えば、ジペプチド、
小さいポリペプチドまたは、その分解を減少すべき（す
なわち、その代謝安定性または半減期を増加すべき）細
胞のタンパク質のアミノ末端残基と同一であるか、ある
いはそれに類似するアミノ末端残基をもつ、カルボキシ
ル末端の誘導体に関する。本発明のカルボキシル末端の
誘導体は、アミノＮ末端残基上の遊離（ブロッキングさ
れていない）α−アミノ酸およびブロッキングされたま
たは「置換された」カルボキシル末端（例えば、他のア
ミノ酸により（ジペプチドまたはポリペプチドを得るた
めに）またはアルキルエステルにより）を有する。

Ｎ末端の法則 同時継続米国出願第07/103,910号、1987年10月１日提
出、に記載されているように、Ｎ末端の法則は、細胞内
の経路により細胞内タンパク質が分解する速度を決定す
る細胞内タンパク質の基準または特性を定める。この法
則およびＮ末端の法則の経路は、ここで、次の節におい
て要約して、本発明の引き続く詳細な説明のためのバッ
クグラウンドを提供する。試験タンパク質、酵素のβ−
バラクトシダーゼ（βgal）の研究は、選択したアミノ
酸残基がプロセシングしたアミノ末端に存在し、コビキ
チン（本明細書では、「ウビクイチン」という場合あ
り）との融合タンパク質として最初に産生された、種々
の形態の操作したタンパク質を使用して実施した。ウビ
クイチン−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質をエン
コードするキメラ遺伝子を酵母S.cerevisiaeの中で発現
したとき、ウビクイチンは形成期の融合から切断され
て、脱ウビクイチンしたβ−ガラクトシダーゼ（βga
l）を生ずることが示された。この切断は、ウビクイチ
ン−βgal接合に存在するβgalのアミノ酸残基、Ｘ、の
性質に無関係に起こる。この結果は、そうでなければＸ
−βgalタンパク質のアミノ末端において所望のアミノ
酸残基の暴露を可能とした。そのように設計したＸ−β
galタンパク質は、生体内で顕著に異なる半減期を示し
た（例えば、ほぼ３分〜20時間以上）。所定のＸ−βga
lタンパク質の半減期は、Ｘ−βgalのアミノ末端におけ
るアミノ酸残基の性質に依存することが示された。

その結果、そのアミノ末端において暴露したときβga
lにそれらが与える半減期に従い、20アミノ酸の基本的
な組を序列することが可能になる。Ｎ末端の法則と呼
ぶ、生ずるコードまたは法則を表に示す。

表に示すように、アミノ酸のメチオニン、セリン、アラ
ニン、スレオニン、バリン、グリシンおよびシステイン
は、Ｘ−βgal上のアミノ末端において暴露されたと
き、Ｘ−βgalに酵母の中の20時間以上の半減期を与え
る。これらはアミノ酸の最高の「安定化」である。［安
定化性アミノ末端残基を有するＸ−βgalタンパク質の
長い半減期は、これらの残基に対して特異的なE3N末端
認識性タンパク質の不存在の「欠陥のある」結果と考え
ることができる］。イソロイシンおよびグルタミン酸は
ほぼ30分の半減期を与え、そしてチロシン、グルタミン
およびヒスチジンはほぼ10分の半減期をを与える。フェ
ニルアラニン、ロイシン、アスパラギン酸、アスパラギ
ン、およびリジンは、Ｘ−βgalのアミノ末端に存在す
るとき、ほぼ３分の半減期を生じ、そしてアルギニン、
最も不安定化性のアミノ酸、はほぼ２分の半減期を与え
る。

原核生物および真核生物の両者における比較的長い寿
命の（ｔ₁/₂＞１時間）非区画化細胞内タンパク質は、
Ｎ末端の法則により予測されるように、安定化性クラス
のアミノ末端残基を有することが示された。同一の研究
により、タンパク質のアミノ末端残基における不安定化
性残基の存在は生体内のタンパク質の代謝的不安定化た
めにしばしば十分であるが、これは常にはそうではない
ことが実証される。このような代謝的不安定化が比較的
小さい程度に起こるとき、それ以上の分析はアミノ末端
残基の不十分な立体的許容性または完全なアミノ末端の
分解シグナルの第２決定子の欠如を示す。アミノ末端の
分解シグナルの第２決定子は、単独で、また、タンパク
質を代謝的に不安定化するために不十分であり、特別の
内部のリジン残基であることが発見された。第２決定子
として働くこの臨界的なリジン残基の能力は、残基を取
り囲む独特のアミノ酸配列に大きく無関係であることが
示された。その代わり、臨界的なリジン残基の必須の特
徴は、リジン残基を含有する領域のタンパク質のアミノ
末端および高いセグメントの移動度に対して空間的近似
性にあることが示された。第２決定子の機械論的意味
は、標的した寿命が短いタンパク質において、分枝鎖の
ウビクイチン−ウビクイチン接合体の鎖が分解の第２決
定子と上の研究において同定されたリジン残基に限られ
るという発見により例示される［バチマイアー（Baachm
air）およびバルシャフスキイ（varshavsky）、細胞（C
ell）、56:1019−1031（1989）；チャウ（Chau）ら、サ
イエンス（Science）、243:1516−1583（1989）］。

Ｎ末端の法則の経路 どこかで記載したように、ほとんどの形成期のタンパ
ク質はウビクイチン部分を欠如するように思われる。
［バルシャフスキイ（Varshavsky）ら、「選択的タンパ
ク質回転のＮ末端の法則（The N−End Rule of Selecti
ve Protein Turover）」、ウビクイチン（UBIQUITIN）
（M.Rechsteiner編）、Plenum Publishing Corp.（198
8）；バチマイア（Bachmair）およびバルシャフスキイ
（varshavsky）、細胞（Cell）、56:1019−1032（198
9）］。形成期の非区画化タンパク質の成熟アミノ末端
は、その基質特異性が部分的に特性決定されているプロ
テアーゼの作用を通して、生体内で発生される。比較的
に長い寿命の非区画化タンパク質の成熟アミノ末端から
不安定化性残基の首尾一貫した不存在はとくに重要であ
る。これは大部分酵素メチオニンアミノペプチダーゼの
基質特異性のためである。この酵素は、第２メチオニン
残基、あるいはＮ末端の法則に従い不安定化される12ア
ミノ酸残基の１つが後続しない場合および場合のみ、形
成期のタンパク質においてアミノ末端のメチオニン残基
（Ｎ末端の法則に従い安定化性残基）を切断することが
示された。Ｎ末端の法則とメチオニンアミノペプチダー
ゼの基質特異性との間の逆対応性は、この酵素の性質に
ついての部分的機能の説明を提供する：長い寿命のタン
パク質のプロセシングに関係するメチオニン−クリッピ
ングアミノペプチダーゼは、アミノ末端におけるその存
在が基質タンパク質を代謝的に不安定化することができ
る残基を暴露しないことが期待されるであろう。

類似のプロテアーゼは、このようなプロテアーゼによ
り認識される部位を含有するアミノ末端配列をもつ、あ
る種のタンパク質の中に不安定化性アミノ酸を有するア
ミノ末端発生の原因となりうることが示唆される。［バ
ルシャフスキイ（Varshavsky）ら、「選択的タンパク質
回転のＮ末端の法則（The N−End Rule of Selective P
rotein Turover）」、ウビクイチン（UBIQUITIN）（M.R
echsteiner編）、Plenum Publishing Corp.（198
8）］。

前に提供された生化学的および遺伝学的証拠は、ま
た、Ｎ末端の法則の経路のＮ末端認識成分が、基質タン
パク質のアミノ末端の不安定化性残基に対して直接かつ
特別の親和性を有することを示唆する。標的した分解に
おいて引き続く工程は、結合したタンパク質の基質にお
けるウビクイチン−タンパク質リガーゼ複合体のアセン
ブリー、基質のウビクイチン化、およびウビクイチン部
分が認識シグナルまたは変性装置または両者として働く
「下流の」の酵素によるその分解を包含する。初期の工
程がタンパク質分解構造のアミノ末端の認識を含む、こ
の分解経路をＮ末端の法則の経路と呼ぶ。

生きている細胞におけるＮ末端の法則の経路の抑制 この出願に記載する実験により、生きている細胞にお
いてＮ末端の法則の経路を抑制しそして、その結果、寿
命が短いタンパク質の特別の型またはクラスの生きてい
る細胞の中の分解を選択的に抑制することが可能とする
ことが、今回、決定された。

その生体内の分解が本発明の方法により抑制すること
ができるタンパク質の共通の特徴は、Ｎ末端の法則に従
い不安定化されているアミノ末端残基の存在である。本
発明の方法において、Ｎ末端の法則の経路の抑制が、選
択した型またはクラスの細胞内タンパク質に適用される
ように、望まれる細胞の中に、レギュレーターと呼ぶ因
子を導入する。この方法において使用されるレギュレー
ターはアミノ酸誘導体（例えば、ジペプチド、小さいポ
リペプチド、または他のカルボキシル末端のアミノ酸誘
導体）であり、ここでアミノ末端アミノ酸はＮ末端の法
則の経路を経るその分解を抑制すべきタンパク質のアミ
ノ末端アミノ酸残基と同一であるか、あるいはそれに類
似する。

例えば、アミノ末端のロイシン残基を有する細胞内タ
ンパク質の生体内の分解（半減期の増加）の抑制の場合
において、アミノ末端残基としてロイシン（大きい疎水
性の残基）を含有するアミノ酸誘導体（例えば、メチル
エステル）を、タンパク質分解基質としてそのタンパク
質のＮ末端の法則仲介認識を妨害することができる。あ
るいは、トリプトファン（他の大きい疎水性の残基）を
包含するアミノ酸誘導体（例えば、メチルエステルまた
はジペプチド）を使用して同一タンパク質の分解を抑制
することができる。実施例５、６および７に記載するよ
うに、ロイシン−βgalの半減期は、酵母細胞におい
て、ロイシンメチルエステル（第６図）またはＬ−トリ
プトファン−Ｌ−Alaジペプチド（第７図）の存在下に
延長される。

所定の不安定化性アミノ酸の他の不安定化性アミノ酸
に対する類似性を支配する法則は、表により提供され
る。この表に示されているように、哺乳動物の細胞、例
えば、網状赤血球におけるＮ末端認識活性の３つの実験
的に区別可能なクラス（Ｉ〜III型）および酵母の中の
Ｎ末端認識活性の２つのクラス（ＩおよびII型）が存在
する。こうして、標的タンパク質の中の不安定化性アミ
ノ末端残基を同一の型（Ｉ、IIまたはIII;参照、表）の
不安定化性アミノ末端アミノ酸残基をもつレギュレータ
ーは、タンパク質の分解を生体内で完全に抑制するが、
異なる型に属する不安定化性アミノ末端残基をもつＮ末
端の法則の経路の他の基質の分解を抑制しないであろう
（第２図および５）。

各真核生物のための安定化および不安定化基は、上に
引用したバチマイアー（Bachimair）らが記載するよう
に決定することができる。ウビクイチン−Ｘ−βgal技
術を使用して、それらのアミノ末端残基のみが異なるタ
ンパク質の組を産生することができ、次いで安定化性お
よび不安定化性残基の同定を選択した真核生物の中で核
Ｘ−βgalの分解速度を観測することによって決定する
ことができる。

また、下に記載するように（実施例５）、アミノ末端
が疎水性アミノ酸残基（フェニルアラニン−βgal、ト
リプトファン−βgal、チロシン−βgalおよびイソロイ
シン−βgal）である、４つの追加のＸ−βgalタンパク
質の代謝安定性（生体内半減期）は、ロイシンメチルエ
ステルの存在下に増加した。こうして、Ｎ末端の法則の
経路は、完全な細胞において、アミノ末端アミノ酸残基
がその代謝安定性を増加すべき１または２以上のタンパ
ク質のアミノ末端残基と同一あるか、あるいはそれに類
似する、アミノ酸誘導体により選択的に抑制することが
できることが示された。

一般に、本発明において有用であるレギュレーター
は、ジペプチド、小さいポリペプチド、大きい疎水性の
エステルおよび不安定化性アミノ酸のtorカルボキシル
末端の誘導体である。例えば、適当なアミノ末端アミノ
酸残基（Ｎ末端の法則により定めらた）をもつ小さいポ
リペプチドは本発明の範囲内レギュレーターとして使用
することができる。カルボキシル末端のブロッキング基
の例は、有機部分、例えば、メチル、エチル、プロピ
ル、ブチルおよびイソブチル基である。

本発明の目的に有用であるは、完全な細胞または全動
物により容易に吸収され、そして細胞の中で生理学的に
十分なレベルに蓄積すべきである。レギュレーターの他
の有用な性質は、細胞の中への途中でおよびいったん細
胞の中に入った両者の場合における、不活性化性代謝的
転化物質に対するその相対的抵抗性である。不活性化に
対するレギュレーターの抵抗性を増加する操作の１つの
例は、構成成分のアミノ酸残基の両者がＬ立体配置を有
するＬ−Ala−Ｌ−Alaジペプチドの代わりにＬ−Arg−
Ｄ−Alaを使用することである。Ｌ−ArgとＤ−Alaとの
間のペプチドは結合は、このジペプチドの標準の変異型
であるＬ−Ala−Ｌ−Alaの中のペプチド結合より、細胞
の内側のタンパク質分解攻撃に対して抵抗性であるよう
に思われる。事実、第９図に示すように、Ｌ−Arg−Ｄ
−Alaの使用は、Ｌ−Ala−Ｌ−Alaジペプチドの使用よ
り強い生体内のArg−βgalの代謝的安定化を生ずる。

本発明の方法に従い、分離した細胞の場合において、
レギュレーターを成長培地に直接添加するか、あるいは
特定した一時的方法の下で供給することができる。全動
物の場合において、レギュレーターは経口的に、皮下ま
たは他の注射により、静脈内に、非経口的に、皮膚を通
して、経直腸的にまたはレギュレーターを含有する移植
した受容体を経て投与することができる。レギュレータ
ーを投与する形態（例えば、粉末、錠剤、カプセル、溶
液、乳濁液）は、それを投与するルートに依存するであ
ろう。投与すべきレギュレーターの量は、個々の基準に
基づいて決定され、そして少なくとも一部分個体の大き
さ、処置すべき症候のひどさ、および求める結果に基づ
くであろう。レギュレーターはこれらのルートのいずれ
かにより投与すべき組成物の中に含めることができる。
このような組成物は、１または２以上のレギュレーター
に加えて、キャリヤー（例えば、レギュレーターをゆっ
くり解放するポリマー）、生理学的に許容されうる緩衝
剤および操作したまたは自然のタンパク質を含むことが
でき、前記タンパク質は体の中で所望の機能を有し、そ
してその代謝安定性は本発明の方法に従うレギュレータ
ーの同時投与により増加すべきものである。この場合に
おいて、レギュレーターはそのアミノ末端アミノ酸残基
が問題のアミノ末端（不安定化性）残基と同一である
か、あるいはそれに類似する方法で設計する。このよう
にして、レギュレーターはＮ末端認識タンパク質のアミ
ノ末端認識部位と相互作用し、これによりＮ末端の法則
の経路を競争的に抑制することによって、タンパク質の
代謝安定性を増加する作用をする。

あるいは、レギュレーターの所望のアミノ酸配列をエ
ンコードするヌクレオチド配列を含むDNA構成体を、特
定の型またはクラスのタンパク質の分解の抑制を望む細
胞の中に導入することができる。DNA配列は、適当なベ
クター、例えば、レトロウイルスのベクターにより導入
することができる。すべてのDNAがエンコードしたタン
パク質およびベプチドはメチオニンで開始し、したがっ
て、所望のペプチドを産生するように細胞によりプロセ
シングすることができるタンパク質の発現が生ずるよう
に設計した構成体が使用されるであろう。使用すべきDN
A構成体は、バチマイアー（Bachmair）ら、サイエンス
（Science）、234:179−186（1986）、その内容をここ
に引用によって加える、に記載されているウビクイチン
の融合アプローチに基づく。簡単に述べると、構成体は
１つのウビクイチンおよび引き続くアミノ酸残基Ｘ（こ
こでＸは20のアミノ酸のいずれか１つである）、および
所望のペプチド配列から成る融合タンパク質をエンコー
ドするであろう。標的細胞の中のこのタンパク質の発現
は、バチマイアー（Bachmair）らが前に示したように、
融合タンパク質の急速な脱ウビクイチンを生成し、遊離
のウビクイチンと所望のアミノ末端残基Ｘをもつタンパ
ク質を生ずるであろう。このペプチドは、細胞の中に十
分なレベルで蓄積するとき、Ｎ末端の法則の経路を特異
的に抑制するであろう。

Ｎ末端の法則の経路の生体内抑制は「ゼロ時間の」増強
効果を示す 生体内の分解に対する形成期のタンパク質の感受性
は、一般に、成熟しそして完全にフォルディングしたと
き、同一タンパク質の感受性と異なる。この差の１つの
理由は、新しく形成したタンパク質がその成熟した立体
配置に適合するために有限の時間を取るという事実から
由来する。この時間間隔はタンパク質毎に変化し、この
時間間隔の間に、部分的にフォルディングしたタンパク
質分子は、生体内分解経路による、そしてとくにＮ末端
の法則の経路による、切断に対する感受性である可能性
が強い。後者の経路は、例えば、部分的にフォルディン
グしたタンパク質を優先的に標的とする。なぜなら、こ
のようなタンパク質はそれらのアミノ末端におけるタン
パク質分解的「ニブリング（nibling）」に対してより
感受性であるように思われるからである。ある点におい
て、このような「ニブリング」は不安定化性アミノ末端
残基を暴露し、これによりタンパク質をＮ末端の法則の
経路のための基質に転化する。成熟した寿命が短いタン
パク質の反応速度論に１次（指数）の分解と、同一タン
パク質が新しく形成しかつなお立体配置的成熟していな
いときの、そのタンパク質の１次でない分解とを区別す
るために、後者の型の分解を「指数前の（pre−exponen
tial）」ものと呼ぶ。興味あることには、本発明のレギ
ュレーター物質（Ｎ末端の法則の経路の生体内レギュレ
ーター）は、生きている細胞のＮ末端の法則の経路にお
ける指数前および指数前の両者のモードの分解を抑制す
る。その結果、関係するタンパク質の定常状態のレベル
は、その細胞においてレギュレーターにより、成熟タン
パク質のそれらの代謝的安定化を通してばかりでなく、
かつまたリボソーム上のこれらのタンパク質の合成の間
および直後に増加される（いわゆる「ゼロ時間」効
果）。

振り返って見ると、レギュレーター物質、例えば、ロ
イシンメチルエステル、これは生体内で容易に加水分解
されてメタノールおよび（不活性の）遊離ロイシンとな
る、は、好中球体の特異的抑制に十分な定常状態のレベ
ルに生きている細胞の中で蓄積することを示すすること
ができることは顕著でありかつ推定的に予期せざること
である。本発明において記載する実験の結果が示すよう
に、蓄積は事実起こり、こうして完全な細胞および全動
物における特定のタンパク質の分解を選択的に抑制する
新しい道を開く。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これ
らの実施例は本発明を限定しない。

実施例１ 酵母細胞の成長へのロイシンメチルエステル
の効果 この実施例および引き続く実施例において、試薬、菌
株およびアッセイの方法は下に記載した。

試薬 アミノ酸誘導体（メチルエステルおよびジペプチド）
は、ベイチェム・バイオサイエンス・インコーポレーテ
ッド（BACHEM Bioscience Inc.、ペンシルベニア州フィ
ラデルフィア）およびシグマ・ケミカル・カンパニー
（Sigma Chemical Co.、ミゾリー州セントルイス）から
入手した。

菌株 BWG1−7a（MATa his4 adel 尿素3 leu2）株のサッカ
ロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）
の細胞を、普通の技術［F.シャーマン（Sherman）ら、
酵母遺伝学における方法（Methods in Genetics）、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold S
pring Harbor Laboratory）、ニューヨーク、1981］を
使用して、プラスミドで形質転換した。形質転換した細
胞を30℃において２％のガラクトース、0.67％のアミノ
酸不含の酵母窒素塩基（Difco）、アデニン（10μg/m
l）、ヒスチジン（20μg/ml）およびロイシン（60μg/m
l）の媒質の中で成長させた。

プラスミド 使用したプラスミドは、バチマイアー（Bachmair）
ら、サイエンス（Science）、234:179−186（1986）、
その内容をここに引用によって加える、に記載されてい
るものであった。簡単に述べると、それらは１つのウビ
クイチン部分および引き続きアミノ酸残基Ｘ（ここでＸ
は20のアミノ酸の任意の１つである）、およびβ−ガラ
クトシダーゼ（βgal）タンパク質から成る融合タンパ
ク質をエンコーダする。この融合タンパク質の発現は、
誘発可能なGALプロモーターの制御下にある。酵母の中
でいったん発現されると、融合タンパク質のウビクイチ
ン部分は内因性ウビクイチン特異的プロテアーゼにより
急速に切断されて、Ｘ−βgalタンパク質のアミノ末端
において残留Ｘを生ずる。

定常状態のβ−ガラクトシダーゼのアッセイ 細胞は、前述したように、A₆₀₀において0.2〜0.5の光
学密度に成長させた。下に記載するアミノ酸誘導体を濃
縮したストック（リン酸カリウムでpH7.0緩衝した）か
ら細胞に、所望の最終濃度が得られるまで、添加した。
インキュベーションは30℃において続けた。寿命が短い
（0.5ml）を示した時間において取り出し、そして細胞
を遠心により集めた。沈澱を0.5mlのＺ緩衝液（0.1モル
のリン酸ナトリウムpH7.0、10ミリモルのKCl、１ミリモ
ルのMgSO₄、38ミリモルの２−メルカプトエタノール）
の中に再懸濁し、CHCl₃（２滴）および0.1％のSDS（１
滴）を添加し、そしてこの混合物を10秒間渦形成した。
次いで、βgalの酵素活性のアッセイを0.1mlの4mg/mlの
ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシド（ONPG）
溶液を添加し、次いで30℃においてインキュベーション
した。このアッセイは0.5mlの１モルNa₂CO₃の添加によ
り停止した。混合物を遠心により清浄にした後、420nm
における吸収を測定した。ある場合において、細胞は沈
澱しないが、50μｌの培養物を0.45mlのＺ緩衝液に直接
添加した。

生体内のパルス−チェース実験 形質転換した細胞を、前述したようにであるが、メチ
オニン（20μg/ml）に添加して、600nmにおいて約0.5の
光学密度に成長させた。アミノ酸誘導体を添加し、そし
て光学密度がほぼ0.1となるまで、４〜５時間インキュ
ベーションした。10mlの培養物からの細胞を、マイクロ
タイター濾過プレートのウェルを通して濾過することに
よって収穫した。引き続いて、細胞をフィルター上でメ
チオニンを欠如する媒質中で数回洗浄し、そして0.4ml
の１％のガラクトース、50ミリモルのリン酸カリウム緩
衝液（pH7.4）の中に再懸濁した。次いで、（³⁵S）メチ
オニン（100μCi）を特定したパルス時間に添加した。
細胞を濾過により集め、そして0.4mlのシクロヘキシイ
ミド（0.2mg/ml）およびトリコダーミン（50μg/ml）を
含有する培地の中に再懸濁した。試料（0.1ml）を示し
た時間に取り出し、そして0.4mlのガラスビーズに加え
て、0.8mlのロイペプチン、ペプスタチンＡ、アンチパ
イン、アプロチニンおよびキモスタチン（Sigma）（各
々20μg/ml）を含有する冷緩衝液Ａ（50ミリモルのNa−
HEPES pH7.5、0.15モルのNaCl、５ミリモルのEDTA、１
％のトリトンＸ−100）に添加した。細胞を４℃におい
て１分間３回渦形成して崩壊した。抽出物を12,000gに
おいて10分間遠心し、そして上澄み液の中の酸不溶性³⁵
Sの放射能決定した。等しい量の合計の酸不溶性³⁵Sを含
有する上澄み液のアリコートを、βgalに対するモノク
ローナル抗体との免疫沈澱のためにプロセシングした。
モル過剰の抗体（少なくとも10倍）を含有する腹水を各
アリコートに添加し、引き続いて氷上で１〜２時間イン
キュベーションした。次いで、プロテインＡ−セファロ
ーズ（Sepharose）［ファーマシア（Pharmacia）］を添
加し、懸濁液を４℃において30分間インキュベーション
し、そして12,000gにおいて30秒間ロッキングしながら
遠心した。プロテインＡ−セファローズ（Sepharose）
の沈澱を0.1％のSDSを含有する緩衝液Ａを３回洗浄し、
ジチオスレイトール（DTT）を含有する電気泳動試料緩
衝液の中に再懸濁し、100℃に３分間加熱し、そして12,
000gにおいて20秒間遠心した。［ラエムリ（Laemml
i）、ネイチャー（Nature）、227、680（1970）］。上
澄み液を６％の不連続のポリアクリルアミド−SDSゲル
（150×150×1.5mm）の中の電気泳動にかけ、引き続い
てフルオログラフィーにかけた。

生体内の半減期の決定 バルス−チェースのゲルのフルオログラフィー後、各
バンドにおける放射能の量をそれぞれのゲルのスライス
のシンチレーションカウンティングにより検出した。半
減期をこれらの値（ブランクのゲルのスライスからの値
を使用して適当に調節した）から計算して、タンパク質
の破壊の１次の反応速度論を仮定する。

アルギニン−βgal（Arg−βgal、○、●）またはロ
イシン−βgal（Leu−βgal、□、■）を発現するプラ
スミドを収容する指数的に成長する酵母細胞の成長への
10ミリモルのロイシンメチルエステル（Leuメチルエス
テル）の効果を、なにも補充しない（□、■）で、ある
いはLeuメチルエステルを10ミリモルの最終濃度に補充
して（■、●）アッセイした。結果を第１図に表す。そ
れらの条件の各々の下の成長を600nmにおける光学密度
によりモニターした。第１図に示すように、Leuメチル
エステルは細胞の成長に悪影響を及ぼさなかった。ま
た、ジペプチドArg−AlaおよびAla−Arg（実施例４にお
いて使用した）、Trp−Ala、またはAla−Trp（実施例７
において使用した）による酵母細胞の成長の悪影響がな
いことは、使用した期間にわたって明らかであった（デ
ータは示さない）ことに注意すべきである。

実施例２ 変化する初期細胞密度におけるロイシンメチ
ルエステルの効果 Arg−βgal（○、●）またはLeu−βgal（□、■）を
発現するプラスミドを有する酵母細胞に、変化する初期
OD₆₀₀において、Leuメチルエステルを10ミリモルの最終
濃度（●、■）に補充し、そして３時間インキュベーシ
ョン後、βgal活性についてアッセイした。対照培養物
（○、□）にメチルエステルを添加しなかった。

第２図に示す結果が示すように、Leuメチルエステル
（Leu−OMe）はLeu−βgal（大きい疎水性のアミノ末
端）の定常状態活性（量）を特異的に増加するが、Arg
−βgal（塩基性アミノ末端）の量を増加しない。ま
た、第２図の結果が示すように、効果は指数的に成長す
る細胞（すなわち、より低い光学密度において）より顕
著である。したがって、引き続く研究において、ほぼ0.
5〜1.0のOD₆₀₀において培養物を使用した。

実施例３ 生体内のロイシン−βalの定常状態のレベル
への10ミリモルのロイシンメチルエステルの効果の経時
的研究 Leu−βgalを収容する指数的に成長する酵母細胞に、
Leuメチルエステルを10ミリモルの最終濃度（ゼロ時
間）に補充し、そしてβgal活性について７時間にわた
ってアッセイした（■）。対照の培養物（□）にメチル
エステルを添加しなかった。

結果を第３図に表しそしてこれらの結果が示すよう
に、Leu−βgalレベルへのLeu−OMeの効果の大きさは経
時的に直線液に増加する（少なくとも最初の７時間の
間）。最良の適合の線の傾斜は、Leu−OMe濃度が10ミリ
モルであるとき（対照のレベルと比較したとき）、βga
lレベルの11倍／時間の増加を生ずる。

実施例４ 生体内の定常状態のArg−βgalレベルへのア
ルギニンを含有するジペプチドの効果の経時的研究 Arg−βgalを発現するプラスミドを収容する指数的に
成長する酵母細胞に、次のものを補充した：試料の緩衝
液（■）、10ミリモル（最終）のＬ−アルギニン−Ｌ−
アラニン（Ｌ−Ala−Ｌ−Ala、■）、および10ミリモル
（最終）のＬ−アラニン−Ｌ−アルギニン（Ｌ−Ala−
Ｌ−Arg、○）。βgal活性は７時間の時間経過にわたっ
てアッセイし、そして時間の関数としてプロットした。

結果を第４図に示す。Leu−βgalレベルへのジペプチ
ドＬ−Ala−Ｌ−Alaの効果の大きさは経時的に直線的に
増加する。最良の適合の線の傾斜は、Ｌ−Ala−Ｌ−Ala
の濃度が10ミリモルであるとき（対照のレベルと比較し
たとき）、βgalレベルの8.5倍／時間の増加を生ずる。
Ｌ−Ala−Ｌ−Argは効果をもたなかった。これが示すよ
うに、ジペプチドの中のアミノ酸の序列はその抑制活性
のためにきわめて重要である。詳しくは、Argは効果を
有するためにはジペプチドのアミノ末端に存在しなくて
はならない。

実施例５ 大きい疎水性のアミノ末端残基をもつすべて
のＸ−βgal試験タンパク質の生体内の定常状態のレベ
ルをロイシンメチルエステルは増加する フェニルアラニン−βgal（Pro−βgal、■）、ロイ
シン−βgal（Leu−βgal、○）、トリプトファン−βg
al（Typ−βgal、●）、チロシン−βgal（Tyr−βga
l、▲）およびイソロイシン−βgal（Ile−βgal、◆）
を発現するプラスミドを収容する指数的に成長する酵母
細胞に、Leuメチルエステルを０〜10ミリモルの範囲の
濃度で補充し、これを１時間インキュベーションし、そ
してβgal活性についてアッセイした。対照として、Arg
−βggal（□）およびVal−βgal（＊）プラスミドを収
容する細胞を同じように試験した。Ｘ−βgalタンパク
質の半減期［バチマイアー（Bachmair）ら、サイエンス
（Science）、234:179−186（1986）により決定した］
を括弧内に記載する。結果を第５図に表し、ここで比較
的寿命が短いＸ−βgalを含む実験からのデータをより
大きい規模で明瞭のためにプロットされている（左のパ
ネル）。

結果が示すように、Leu−OMeの不存在下の種々のＸ−
βgalの濃度の変動はＸ−βgalの半減期が変化するため
である［参照、バチマイアー（Bachmair）ら、サイエン
ス（Science）、234:179−186（1986）］。半減期が長
くなるほど、観測されるゼロ時間の活性は高くなる。ま
た、結果がが示すように、大きい疎水性のアミノ末端を
もつすべての５つのＸ−βgalタンパク質のレベルは、O
Meを添加しない各々の量を越えて、Leu−OMeの存在下に
増加する。一般に、この効果はほぼ５〜10ミリモルのLe
u−OMeで飽和に到達する。塩基性アミノ末端およびほぼ
２分の半減期を有するArg−βgal、または長い寿命（半
減期＞20時間）のVal−βgalでは、効果が見られなかっ
た。

実施例６ ロイシンメチルエステルによる生体内のロイ
シン−βgalの安定化 Val−βgal（Ａ）、あるいは10ミリモルのLeuメチル
エステルの３時間のインキュベーションの存在（Ｃ）ま
た不存在（Ｃ）にLeu−βgalを発現する細胞を使用し
て、パルス−チェース実験（５分のパルス）を実施し
た。時点:0分（レーン１）;10分（レーン２）；および3
0分（レーン３）。バンドを標識した：βgal（β−ガラ
クトシダーゼ）;90kD（βgalの切断産生物；代謝的に安
定なVal−βgalのレーンをもつレーンからのその不存在
に注意）;X（βgalに対するモノクローナル抗体と交差
反応性の無関係のタンパク質種）；およびＳ（代謝的に
安定なＸ−βgalに対して明らかに特異的なβgal産生
物；種）。

結果を第６図に表す。それらが示すように、Leu−βg
alの半減期はLeu−OMeの存在下に増加する。計算した半
減期（０〜10分の時点の値）：マイナスOMe−４分、プ
ラスOMe−12分：すなわち、３倍の増加。また、それら
が示すように、OMeの存在下にLeu−βgalの量の「ゼロ
時間の」促進が存在する（参照、βgalのバンド、Ｂお
よびＣにおけるレーン１）。このバンドにおいて1.9倍
のタンパク質の量の増加が存在する。また、OMeの存在
下の90kDのβgal切断産生物の非常な減少に注意すべき
であり、これはこのタンパク質分解のルートによりより
少ないβgalが破壊されていることを示す。

実施例７ ロイシン−βgalは生体内でＬ−Trp−Ｌ−Al
aにより安定化されるが、Ｌ−Ala−Ｌ−Trpにより安定
化されない Val−βgal（Ａ）、Leu−βgal（Ｂ）、Leu−βgal＋
10ミリモルのＬ−Ala−Ｌ−Trp（Ｃ）、およびLeu−βg
al＋10ミリモルのＬ−Trp−Ｌ−Ala（Ｄ）を発現する細
胞を使用して、パルス−チェース実験（５分のパルス）
を実施した。各ジペプチドを使用するインキュベーショ
ンを４時間実施した。時点:0分（レーン１）;10分（レ
ーン２）；および30分（レーン３）。バンドについては
第６図の凡例を参照されたい。

結果を第７図に表す。それらが示すように、Leu−βg
alの半減期はＬ−Trp−Ｌ−Ala（Ｄ）の存在下に長くな
るが、Ｌ−Ala−Ｌ−Trp（Ｃ）の存在下に長くならな
い。βgal切断産生物「Ｓ」は代謝的に安定なVal−βga
lのレーンにおいてのみ観測される（参照、第８図の論
考）。

実施例８ Leuメチルエステルによる生体内のTyr−βga
lの安定化 10ミリモルのLeuメチルエステルとの４時間のインキ
ュベーションの不存在（Ａ）または存在（Ｂ）において
Tyr−βgalを発現する細胞を使用して、パルス−チェー
ス実験（３分のパルス）を実施した。時点:0分（レーン
１）;10分（レーン２）;30分（レーン３）；および60分
（レーン４）。バンドの表示については、第６図への凡
例を参照。結果を第８図に示す。それらが示すように、
Tyr−βgalの生体内の半減期はLeu−OMeの存在下に増加
する。計算した半減期：マイナスOMe−7.5分、プラスOM
e−36.4分：すなわち、4.8倍の増加。

また、ゼロ時間の促進を再び注意すべきである;OMeの
存在下にタンパク質の3.6倍の増加が存在する。Tyr−β
galのこの効果のよりよい実証因子である。なぜなら、
使用するパルス時間（３分）はTyr−βgalの半減期（7.
5分）より非常に短く、それゆえ「ゼロ時間の」の量の
増加はもっぱら半減期の増加のためのβgalの蓄積によ
るからである。パルスの半減期よりほんのわずかに長い
（５分対４分）Leu−βgal（第６図）の場合において、
ゼロ時間の促進は一部分このパルスの間のβgalの蓄積
のためであることがある。なぜなら、OMeはβgalの半減
期を延長しているからである。代謝的に安定なＸ−βga
lを使用したときにのみ通常見られる、パネルＢにおけ
るβgal破壊産生物の存在に注意する。こうして、Leu−
OMeの存在下に、細胞の分解メカニズムはTyr−βgalを
代謝的に「安定な」βgal種として処理されている。

実施例９ 生体内でArg−βgalを安定化するその能力へ
のArg−Alaジペプチドの中のペプチド結合の立体配置の
効果 Arg−βgalおよびVal−βgalを発現する細胞を３つの
ジペプチドの１つの存在下に２時間インキュベーション
した:L−Arg−Ｄ−Ala、Ｌ−Ala−Ｌ−AlaまたはＬ−Al
a−Ｌ−Arg。次いで、βgal活性を前述したように決定
し、そして未処理対照（「con」）の活性に関してプロ
ットした。実際のβgal活性を各欄の上に記載する。立
体配置は、特記しない限り、「Ｌ」型である。

結果を表９に記載する。それらが示すように、Ｌ−Ar
g−Ｄ−AlaはＬ−Ala−Ｌ−Alaより非常にすぐれたArg
−βgalの生体内の安定化因子であるが、Ｌ−Ala−Ｌ−
Argは効果をもたない。多分、ペプチド結合の「Ｄ」の
立体配置は生体内の切断に対してより抵抗性であり、そ
の結果Ｎ末端の法則の経路の生体内抑制因子としてジペ
プチドの不活性化速度を低下する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バーシヤブスキー，アレクサンダー アメリカ合衆国マサチユセツツ州02115 ボストン・アパートメント30・コモンウ エルスアベニユー311 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/67 C12P 21/00 - 21/02 C07K 2/00 C07K 4/00

Claims (19)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】生きている細胞の中にレギュレーターをＮ
   末端の法則の経路におけるレギュレーターの参加のため
   に適当な条件下に導入することからなり、前記レギュレ
   ーターが細胞内タンパク質のアミノ末端アミノ酸残基と
   同一であるか、あるいはそれに類似するアミノ末端アミ
   ノ酸残基を有用することを特徴とする、生きている細胞
   の中の細胞内タンパク質の代謝安定性を選択的に増強す
   る方法。
2. 【請求項２】レギュレーターが、細胞内タンパク質のア
   ミノ末端アミノ酸残基と同一であるか、あるいはそれに
   類似するアミノ末端アミノ酸残基のカルボキシル末端の
   誘導体である、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】レギュレーターが、ジペプチド、小さいポ
   リペプチド、および大きい疎水性エステルから成る群よ
   り選択される、請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】細胞の中にレギュレーターをＮ末端の法則
   の経路におけるレギュレーターの参加のために適当であ
   るかつＮ末端の法則の経路における細胞内タンパク質の
   参加を減少する条件下に導入することからなり、前記レ
   ギュレーターが細胞内タンパク質のアミノ末端アミノ酸
   残基と同一であるか、あるいはそれに類似するアミノ末
   端アミノ酸残基からなることを特徴とする、Ｎ末端の法
   則の経路を経る細胞内タンパク質の生体内の分解を選択
   的に抑制する方法。
5. 【請求項５】レギュレーターが、ジペプチド、小さいポ
   リペプチド、および大きい疎水性エステルから成る群よ
   り選択される、請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】大きい疎水性のアミノ酸であるアミノ末端
   アミノ酸残基を有するタンパク質の真核生物の細胞の中
   の代謝安定性を増強する方法であって、前記細胞の中に
   大きい疎水性アミノ酸からなるエステルを、Ｎ末端の法
   則の経路における前記エステルの参加に適当でありかつ
   Ｎ末端の法則の経路を経る前記タンパク質の分解を減少
   する条件下に、導入することを特徴とする方法。
7. 【請求項７】前記エステルがアルキルエステルである、
   請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】アミノ末端アミノ酸残基が、グルタミン
   酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、
   ヒスチジン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトフ
   ァン、チロシンおよびイソロイシンから成る群より選択
   される、請求項６記載の方法。
9. 【請求項９】前記エステルがメチルエステルである、請
   求項７記載の方法。
10. 【請求項１０】酵母細胞の中のＮ末端の法則の経路を経
    る非区画化細胞内タンパク質の分解を選択的に抑制する
    方法であって、酵母細胞の中に、細胞内タンパク質のア
    ミノ末端アミノ酸残基と同一であるか、あるいはそれに
    類似するアミノ酸からなるレギュレーターを、Ｎ末端の
    法則の経路におけるレギュレーターの参加に適当であり
    かつＮ末端の法則の経路における前記タンパク質の参加
    を減少する条件下に、導入することを特徴とする方法。
11. 【請求項１１】レギュレーターが、ジペプチド、小さい
    ポリペプチド、および大きい疎水性エステルから成る群
    より選択される、請求項10記載の方法。
12. 【請求項１２】レギュレーターが、大きい疎水性のアミ
    ノ酸のアルキルエステル、アミノ末端に大きい疎水性の
    アミノ酸を含むジペプチド、およびアミノ末端に大きい
    疎水性のアミノ酸を含む小さいポリペプチドから成る群
    より選択される、請求項11記載の方法。
13. 【請求項１３】Ｎ末端の法則の経路を経て細胞の中に導
    入されたタンパク質の分解を選択的に抑制する方法であ
    って、細胞の中に、前記タンパク質のアミノ末端アミノ
    酸残基と同一であるか、あるいはそれに類似するアミノ
    酸からなるレギュレーターを、Ｎ末端の法則の経路にお
    ける前記レギュレーターの参加に適当な条件下に、導入
    することを特徴とする方法。
14. 【請求項１４】選択したタンパク質のアミノ末端アミノ
    酸残基と同一であるか、あるいはそれに類似するアミノ
    酸からなるレギュレーターからなる、選択したタンパク
    質の生きている細胞の中のＮ末端の法則の経路を経る分
    解を選択的に抑制するための組成物。
15. 【請求項１５】酵母細胞におけるＮ末端の法則の経路を
    経る非区画化細胞内タンパク質の分解を選択的に抑制す
    る方法で使用するためのレギユレーター分子であって、
    嵩高い疎水性アミノ酸であるか、または非区画化細胞内
    タンパク質のアミノ末端アミノ酸残基と同一であるか、
    あるいはそれに類似する、アミノ酸残基を含み、かつ ａ）前記タンパク質のアミノ末端アミノ酸残基と同一で
    あるか、あるいはそれに類似するアミノ末端アミノ酸残
    基からなるジペプチド； ｂ）前記タンパク質のアミノ末端アミノ酸と同一である
    か、あるいはそれに類似するアミノ末端アミノ酸残基か
    らなる小さいポリペプチド；および ｃ）前記タンパク質のアミノ末端アミノ酸残基と同一で
    あるか、あるいはそれに類似するアミノ酸残基のエステ
    ル； から成る群より選択されることを特徴とするレギュレー
    ター分子。
16. 【請求項１６】ジペプチドまたは小さいポリペプチドを
    エンコードするDNA構成体からなり、前記ジペプチドま
    たは小さいポリペプチドが細胞内タンパク質のアミノ末
    端アミノ酸残基と同一であるか、あるいはそれに類似す
    るアミノ末端アミノ酸残基を有する、真核生物の細胞の
    中のＮ末端の法則の経路を経る細胞内タンパク質の分解
    を選択的に抑制するための組成物。
17. 【請求項１７】生物学的産生系の中に、産生されている
    タンパク質のアミノ末端アミノ酸残基と同一であるか、
    あるいはそれに類似するアミノ末端アミノ酸残基を有す
    るレギュレーターを導入することを特徴とする、生物学
    的産生系における選択したタンパク質の収量を増加する
    方法。
18. 【請求項１８】真核生物の細胞の中にレギュレーターを
    導入することからなり、前記レギュレーターが、 ａ）前記タンパク質のアミノ末端アミノ酸残基と同一で
    あるか、あるいはそれに類似するアミノ末端アミノ酸残
    基を含むジペプチド； ｂ）前記タンパク質のアミノ末端アミノ酸と同一である
    か、あるいはそれに類似するアミノ末端アミノ酸残基を
    含む小さいポリペプチド； ｃ）前記タンパク質のアミノ末端アミノ酸残基と同一で
    あるか、あるいはそれに類似するアミノ酸のアルキルエ
    ステル； から成る群より選択される、常態でＮ末端の法則の経路
    を経て分解する選択したタンパク質を真核生物の細胞の
    中で産生する方法。
19. 【請求項１９】選択したタンパク質のアミノ末端アミノ
    酸残基と同一であるか、あるいはそれに類似するアミノ
    酸レギュレーターをエンコードするDNA構成体からな
    る、選択したタンパク質のＮ末端の法則の経路を経る分
    解を選択的に抑制するための組成物。