CN106232810A - 新的治疗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有蛋白酶活性的多肽，用于治疗或预防患有或易患免疫缺陷的受试者中的微生物感染。例如，该多肽可以以口喷剂、鼻喷剂、含片、锭剂、口香糖或液体的形式给药，以治疗或预防原发性免疫缺陷患者的微生物感染。特别是，该多肽在治疗或预防鼻液溢和/或口腔和/或牙龈溃疡的真菌感染中是有用的。在一个实施方式中，该多肽是源自大西洋鳕鱼的胰蛋白酶，或其片段或变异体。

Description

新的治疗

技术领域

本发明涉及用于治疗或预防具有免疫缺陷或易发生免疫缺陷的对象中的微生物感染的基于多肽的药剂。

背景技术

原发性免疫缺陷(primary immunodeficiencies,PIDs)是超过300种遗传疾病的一大类别，其从根本上影响免疫系统的发育和/或功能。它们中的大多数是罕见的单基因疾病，但随着新的免疫缺陷综合征的鉴别，PID疾病谱通过下一代测序技术和提高的临床显著性而不断扩大。患者通常对不寻常生物的感染存在更高的易感性，并且还可发生自身免疫或自身炎症性疾病以及淋巴网状恶性肿瘤(lymphoreticular malignancies)。虽然最小的或支持性治疗对这些病症中的很多都有效，但最严重的病症还需要明确的早期治疗，以便预防慢性病的发病率和早期病死率。

由于缺乏政府健康调查机构的国家登记或报告，大多数原发性免疫缺陷的发病率是不确定的。在美国，多达500,000人患有已知的原发性免疫缺陷疾病中的一种，其中每年确诊有约50,000例。原发性免疫缺陷似乎大约同样地影响男性和女性。

PID在欧洲还是一个未解决的公共卫生问题，其中估计有二百万儿童和成年人患有在成员国中未被诊断并因此未被提供治疗的复发性感染。

已经开发出许多不同的治疗策略用于原发性免疫缺陷的控制，包括：

(a)静脉注射免疫球蛋白(iv Ig)

在过去20年中，静脉施用免疫球蛋白(ivIg)已被用于治疗无丙种球蛋白血症agammaglobulin。该药剂是目前大多数抗体缺乏的标准治疗。最常见的是，IVIG用于患有下述疾病的患者：X-连锁无丙种球蛋白血症、普通易变免疫缺陷病common variableimmunodeficien、X-连锁高IgM、重症联合免疫缺陷(severe combinedimmunodeficiency)、威-奥综合征和选择性IgG类缺乏症。

IVIG也被使用，或者正在被考虑用于多种其他疾病。因此，其有限的可获得性是一个问题。

(b)骨髓移植

来自具有相同HLA的供体的骨髓移植可以治愈患有例如下述细胞免疫缺陷的患者：重症联合免疫缺陷、威-奥综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)和迪乔治综合征(DiGeorge syndrome)，并且可能对患有慢性肉芽肿性疾病的患者有益。骨髓移植目前在治疗抗体缺乏中并没有作用。

并不总是有相同HLA的供体。采用来自半相合供体的骨髓移植的长期存活率可能更低。因此，对于可替代策略(例如基因治疗)的研究可有益于患有原发性免疫缺陷病的患者的管控，否则后者将需要骨髓移植。

(c)抗生素及其他治疗方法

当反复感染本身成为问题时，许多患有原发性免疫缺陷的患者用抗生素单独或联合IVIG进行处理。例如，在患有慢性肉芽肿性疾病的患者中，采用甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑(Bactrim,Septra Bactrim,Septra)进行预防性治疗使严重感染的发生率减少50％。同样，对于补体缺乏的治疗针对的是预防感染，并且由抗生素预防和荚膜细菌的免疫(例如五价肺炎球菌疫苗、b型流感嗜血杆菌缀合物疫苗、脑膜炎球菌多糖疫苗)组成。

对于原发性免疫缺陷病的其他治疗包括患有腺苷脱氨酶缺乏症(重症联合免疫缺陷病的一个亚型)的患者中的酶替代以及患有慢性肉芽肿病的患者中的细胞因子治疗。

最近，在对于原发性免疫缺陷病的基因治疗方面也已经取得了进展(参见例如Rivat等,2012,Hum.Gene Ther.23(7):668-675)。

然而，仍然需要改进的用于控制患有免疫缺陷(例如原发性免疫缺陷或药物引起的免疫缺陷)的对象中微生物感染的治疗，以便提高这些患者的生活质量。

发明内容

本发明第一方面提供了一种具有蛋白酶活性的多肽，用于治疗或预防具有免疫缺陷或易发生免疫缺陷的对象中的微生物感染。

“蛋白酶”包括任何能够在哺乳动物(例如人)体内催化蛋白质体内水解的酶。因此，任何类型的蛋白酶均可用于本发明，包括但不限于丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶))、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。

“免疫缺陷”意指对象完全或部分缺乏免疫的免疫疾病状态。免疫缺陷可以是获得性的或是继发性的，例如在采用免疫抑制疗法治疗后，或者可以是原发性的，例如是自然发生的病症，其中机体免疫系统的部分缺失或不能正常发挥功能。因此，在一个实施方案中，免疫缺陷是继发性的或获得性的免疫缺陷。

例如，对象中的免疫缺陷可以因接受免疫抑制疗法(例如糖皮质激素、细胞抑制剂、抗体、作用于亲免蛋白的药物、干扰素、阿片类药物，TNF-结合蛋白、麦考酚酯和放射疗法)的治疗而产生。

免疫抑制疗法在医学上是常用的，例如：

用于防止移植器官和组织(例如骨髓、心、肾、肝)的排斥反应；

用于治疗自身免疫疾病或自身免疫来源的疾病(例如类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、系统性红斑狼疮、结节病、局灶节段性肾小球硬化、克罗恩氏病、白塞氏病、天疱疮和溃疡性结肠炎)；以及

用于治疗其他的非自身免疫性炎性疾病(例如长期过敏性哮喘控制)。

免疫缺陷是一种自然发生的免疫缺陷。例如，免疫缺陷可能由于原发性免疫缺陷(参见下面)、癌症(例如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤)、慢性感染(例如获得性免疫缺陷综合征或AIDS)、营养不良和/或老化引起的。

原发性免疫缺陷病包括使患者更容易感染的多种病症。如果不及时治疗，这些感染可能是致命的。常见的原发性免疫缺陷包括体液免疫紊乱(影响B细胞分化或抗体产生)、T细胞缺陷和组合B细胞和T细胞缺陷、吞噬障碍以及补体缺陷。这些病症的主要指征包括：尽管有积极治疗的多发性感染、不寻常有机体或机会感染性有机体(opportunisticorganisms)的感染、发育停止或生长不良，以及阳性家族史。早期识别和诊断可以显著改变原发性免疫缺陷的病程，并且对患者预后具有积极作用。

在一个实施方式中，患者具有选自由表I至表VIII中列出的适应症组成的组的原发性免疫缺陷。

表I

联合的T细胞和B细胞免疫缺陷

在这些病症中，T淋巴细胞和B淋巴细胞都功能失调或数量减少。主要的成员为各种类型的重症联合免疫缺陷(SCID)。

1.T-/B+SCID(主要缺乏T细胞)：γc缺陷、JAK3缺陷、白介素7受体α链缺陷、CD45缺陷、CD3δ/CD3ε缺陷。

2.T-/B-SCID(无T和B细胞)：RAG 1/2缺陷、DCLRE1C缺陷、腺苷脱氨酶(ADA)缺陷、网状组织发育不全

3.Omenn综合征

4.DNA连接酶IV型缺陷

5.Cernunnos缺陷

6.CD40配体缺陷

7.CD40缺陷

8.嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺陷

9.CD3γ缺陷

10.CD8缺陷

11.ZAP-70缺陷

12.Ca++通道缺陷

13.MHC I类缺陷

14.MHC II类缺陷

15.翼状螺旋缺陷

16.CD25缺陷

17.STAT5b缺陷

18.Itk缺陷

19.DOCK8缺陷

表II

抗体为主的缺陷

在原发性抗体缺陷中，免疫球蛋白的一种或多种同型减少或无法正常起作用。

1.具有造成的各类抗体的严重减少的缺乏的B细胞：X连锁无丙种球蛋白血症(btk缺陷或Bruton型无丙种球蛋白血症)、μ-重链缺陷、I 5缺陷、Igα缺陷、BLNK缺陷、胸腺瘤免疫缺陷

2.B细胞低，但存在或者正常，但具有2种或更多种同型减少(通常是IgG和IgA，有时是IgM)：普通变异型免疫缺陷病(CVID)、ICOS缺陷、CD19缺陷、TACI(TNFRSF13B)缺陷、BAFF受体缺陷。

3.具有减少的IgG和IgA以及增加的IgM的正常数量的B细胞：高IgM综合征

4.具有同型或轻链缺陷的正常数量的B细胞：重链缺失、κ链缺陷、分离的IgG亚类缺陷、具有IgG亚类缺陷的IgA、选择性免疫球蛋白A缺陷

5.对于具有正常B细胞和正常Ig浓度的特异性抗原的特异性抗体缺陷

6.婴幼儿短暂性低丙球蛋白血症(THI)

表III

其他很好(完备，well)定义的免疫缺陷综合征

许多综合征脱离正式的分类，但在其他方面却可由特定的临床或免疫特征来识别。

1.Wiskott-Aldrich综合征(维斯科特-奥尔德里奇综合征)

2.不会造成分离的SCID的DNA修复缺陷：毛细血管扩张性共济失调、步态不稳样综合征、Nijmegen断裂综合征(奈梅亨破损综合症)、布卢姆综合征(Bloom syndrome)

3.迪格奥尔格综合征(DiGeorge syndrome)(当与胸腺缺陷有关时)

4.各种免疫骨发育不良(具有免疫问题的骨骼发育异常)：软骨-毛发发育不全、席姆克综合征(Schimke syndrome)

5.海普二氏综合征2型(Hermansky-Pudlak syndrome 2)

6.高IgE综合征

7.慢性皮肤粘膜念珠菌病

8.具有免疫缺陷的肝静脉闭塞病(VODI)

9.XL-先天性角化不良(Hoyeraal-Hreidarsson综合征)

表IV

免疫失调疾病

在某些疾病下，调节而非对免疫系统部分的固有活性是主要的问题。

1.具有色素减退或白化病的免疫缺陷：柯-里综合征(Chediak-Higashisyndrome)，格里西综合征2型(Griscelli syndrome type 2)

2.家族性噬血淋巴组织细胞增生症：穿孔缺陷(perforin deficiency)、MUNC13D缺陷、突触11缺陷(syntaxin 11deficiency)

3.X连锁淋巴增生综合征

4.具有自身免疫的综合征：

(a)自身免疫性淋巴增生综合征：1a型(CD95缺陷)、1b型(Fas配体缺陷)、2a型(CASP10缺陷)、2b型(CASP8缺陷)

(b)APECED(自身免疫增多内分泌病变—念珠菌病—外胚层营养不良)

(c)IPEX(免疫功能失调、多发性内分泌病、肠病及X染色体连锁综合征)

(d)CD25缺陷

表V

吞噬细胞的数量、功能或两者都有的先天性缺陷

在某些疾病下，吞噬细胞的数目减少了或者它们的功能性能力受损。

1.重型先天性中性粒细胞减少症：由于ELA2缺陷(伴有脊髓发育不良)

2.重型先天性中性粒细胞减少症：由于GFI1缺陷(有T/B淋巴细胞)

3.Kostmann综合征

4.具有心脏和泌尿生殖系统畸形的中性粒细胞减少症

5. 1b型糖原贮积病

6.周期性中性粒细胞减少症

7.X-连锁中性粒细胞/骨髓增生异常

8.P14缺陷

9. 1型白细胞粘附缺陷

10. 2型白细胞粘附缺陷

11. 3型白细胞粘附缺陷

12.RAC2缺陷(中性粒细胞性免疫缺陷综合症)

13.β-肌动蛋白缺陷

14.局部型青少年牙周炎

15.Papillon-Lefèvre综合征

16.特异性颗粒缺陷

17.Shwachman-Diamond综合征

18.慢性肉芽肿病：X连锁

19.慢性肉芽肿病：常染色体(CYBA)

20.慢性肉芽肿病：常染色体(NCF1)

21.慢性肉芽肿病：常染色体(NCF2)

22.IL-12和IL-23的β1链缺陷

23.IL-12p40缺陷

24.干扰素γ受体1缺陷

25.干扰素γ受体2缺陷

26.STAT1缺陷(2种形式)

27.AD高IgE

28.AR高IgE

29.肺泡蛋白沉积症

表VI

先天免疫缺陷

一些罕见的疾病是由于先天免疫系统的缺陷。这些疾病中的许多与皮肤问题相关联。

1.少汗型外胚层发育不良

(a)NEMO缺陷

(b)IKBA缺陷

2.EDA-ID

3.IRAK-4缺陷

4.MyD88缺陷

5.WHIM综合征(疣、低丙种球蛋白血症、感染、先天性骨髓粒细胞缺乏症(myleokathexis))

6.疣状表皮发育不良

7.单纯疱疹病毒性脑炎

8.慢性皮肤粘膜念珠菌病

9.锥虫病

表VII

自身炎症性病症

并不是易于感染，大多数自身炎症性病症导致了过度的炎症。许多表现为周期性发热综合征。

1.家族性地中海发热

2.TNF受体相关的周期性综合征(TRAPS)

3.高IgD的综合征(HIDS)

4.CIAS1相关疾病：

(a)Muckle-Wells综合征

(b)家族性寒冷自身炎症综合征

(c)新生儿发病多系统炎症性疾病

5.PAPA综合征(化脓性关节炎不育、坏疽性脓皮病、痤疮)

6.Blau综合征

7.慢性复发性多灶性骨髓炎和先天性红细胞生成异常性贫血(Majeed综合征)

8.DIRA(IL-1受体拮抗剂的缺陷)

表VIII

补体缺陷

易患感染但也易患自身免疫性疾病的补体缺陷。

1.C1q缺陷(狼疮样综合征、类风湿疾病、感染)

2.C1r缺陷(同上)

3.C1s缺陷

4.C4缺陷(同上)

5.C2缺陷(狼疮样综合征、血管炎、多发性肌炎、化脓性感染)

6.C3缺陷(经常性化脓性感染)

7.C5缺陷(奈瑟氏菌感染、SLE)

8.C6缺陷(同上)

9.C7缺陷(同上、血管炎)

10.C8a缺陷

11.C8b缺陷

12.C9缺陷(奈瑟氏菌感染)

13.C1抑制剂缺陷(遗传性血管水肿)

14.因子I缺陷(化脓性感染)

15.因子H缺陷(溶血性尿毒综合症、膜增生性肾炎)

16.因子D缺陷(奈瑟氏菌感染)

17.备解素缺陷(奈瑟氏菌感染)

18.MBP缺陷(化脓性感染)

19.MASP2缺陷

20.补体受体3(CR3)缺陷

21.膜辅助因子蛋白(CD46)缺陷

22.攻膜复合物抑制剂(CD59)缺陷

23.阵发性睡眠性血红蛋白尿

24.与ficolin 3相关的免疫缺陷

本领域的技术人员将理解，本发明的多肽不为原发性免疫缺陷本身提供治疗。相反，多肽设法减轻或预防与此类病症相关的微生物感染的一种或多种症状。

因此，“治疗”包括减轻，微生物感染的部分或全部的症状，包括但不限于在患有原发性免疫缺陷的患者的细菌、病毒和真菌感染。

“预防”包括降低患有免疫缺陷的患者发展微生物感染的风险。然而，应当理解的是，这样的预防可能不是绝对的，即，它可能无法预防所有的这类患者发展微生物感染。因此，术语“预防(prevention)”和“预防(prophylaxis)”可以互换使用。

在一个实施方式中，该微生物感染选自由细菌感染、病毒感染、真菌感染和酵母菌感染组成的组。

特别地，本发明的多肽用于治疗或预防口腔和/或咽(例如，口咽部)的继发性感染。例如，该多肽可用于治疗或预防鼻液溢和/或口腔和/或牙龈溃疡的真菌感染。

本发明的多肽对于遭受经常性感染(例如，一年至少五次微生物感染，例如一年至少十次、十五次、二十次、三十次或更多次微生物感染)的PI患者的微生物感染的治疗和预防是特别有用的。

本发明的多肽可以显示出胰蛋白酶活性。“胰蛋白酶活性”指的是该多肽显示出胰蛋白酶(EC 3,4,21,4)或相关肽酶(诸如胰凝乳酶，EC 3,4,21,1)的肽酶活性。

本发明的多肽可以是天然存在的或非天然存在的。

在一个实施方式中，该多肽直接或间接地来源自鱼类，诸如大西洋鳕鱼(Gadusmorhua)、大西洋和太平洋鲑鱼(例如Salmo salar和Oncorhynchus种)以及阿拉斯加狭鳕(Theragra chalcogra mMa)。

胰蛋白酶的三种主要同工酶已由大西洋鳕鱼表征，称为胰蛋白酶I、II和III(参见等人,1989,Eur.J.Biochem.180:85-94，其公开内容通过引用并入本文)。例如，参见GenBank登录号ACO90397。

此外，大西洋鳕鱼表达了糜蛋白酶的两种主要同工酶，称为糜蛋白酶A和B(参见&Bjarnason,1991,Comp.Biochem.Physiol.B 998:327-335，其公开内容通过引用并入本文)。例如，参见GenBank登录号CAA55242.1。

在一个实施方式中，该多肽包括来源于大西洋鳕鱼(Gadus morhua)的胰蛋白酶I的氨基酸序列，即SEQ ID NO：1：

IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEGTEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSGWGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY[SEQ ID NO:1]

或保留了所述氨基酸序列的胰蛋白酶活性的其片段、变异体、衍生物或融合物(或所述片段、变异体或衍生物的融合物)，或者由其组成。

在一个优选的实施方式中，该多肽包含或由根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。这种多肽可以纯化自大西洋鳕鱼，例如等人,1989,Eur.J.Biochem.180:85-94中所描述的(其公开内容通过引用并入本文)。

本发明的合适的示例性多肽，以及其制备方法，也描述于欧洲专利号1 202 743 B(其公开的内容通过引用并入本文)中。

如本文所使用的术语“氨基酸”包括标准的二十种基因编码的氨基酸以及它们相应的以“D”型(相比于天然的“L”型)的立体异构体、ω-氨基酸和其他天然存在的氨基酸、非常规氨基酸(如，α,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸等)和化学衍生的氨基酸(参见下面)。

当氨基酸被具体列举时，诸如“丙氨酸”或“Ala”或“A”，该术语是指L-丙氨酸和D-丙氨酸两者，除非明确说明。其他非常规氨基酸也可是用于本发明多肽的合适组分，只要所期望的功能特性被该多肽保留。对于所示的肽，每个编码的氨基酸残基在适当的情况下由一个单字母命名来表示，其对应于常规氨基酸的俗名。

按照惯例，本文所公开的氨基酸序列是以从N-末端至C-末端的方向提供的。

在一个实施方式中，本发明的多肽包括或由L-氨基酸组成。

在该多肽包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的情况下，除了SEQ ID NO：1的那些氨基酸，它可在其N-末端和/或C-末端包含额外的氨基酸，例如，该多肽可在其C-末端包含额外的氨基酸酸。同样地，在该多肽包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段、变异体或衍生物的情况下，该多肽在其N-末端和/或C-末端可包含额外的氨基酸。

本领域技术人员将理解的是，本发明的多肽不必对应于全长的、天然存在的胰蛋白酶蛋白质。相反，该多肽可对应于这样的野生型胰蛋白酶的片段，只要所述片段保留(至少部分地)其衍生自的天然存在的胰蛋白酶蛋白质的胰蛋白酶活性。

胰蛋白酶活性可使用本领域公知的方法来确定。例如，胰蛋白酶测试试剂盒购自Abcam公司，剑桥，英国(参见Cat编号ab102531)和其他供应商。在一个实施方式中，胰蛋白酶活性是使用Cbz-Gly-Pro-Arg-对硝基苯胺(Cbz-GPR-pNA)作为底物来测得的，得到至少10U/mg的特异性活性，例如至少50U/mg或至少100U/mg(参见EP 1 202 743 B)。

因此，在一个实施方式中，该多肽包含或由根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段组成。

因此，该多肽可包含或由SEQ ID NO:1的至少15个连续氨基酸，例如SEQ ID NO:1的至少16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230或240个连续氨基酸组成。

例如，该片段可包含或由SEQ ID NO:1的61位至77位氨基酸残基组成。

可替换地，或另外地，该片段可包含或由SEQ ID NO:1的225位至241位氨基酸残基组成。

本领域的技术人员将理解的是，本发明的多肽可以可替换地包含或由根据SEQ IDNO:1的氨基酸序列的变异体(或其片段)组成。此种变异体可以是非天然存在的变异体。

该多肽的“变异体”，包括插入、缺失和替换，无论是保守的或非保守的。特别是，包括该多肽的变异体，其中这种变化(至少部分地)保留了所述多肽的胰蛋白酶活性。

这样的变异体可以使用蛋白质工程以及使用本领域中公知的使用重组多核苷酸的定点突变的方法来制备(参见实例，参见Molecular Cloning:a Laboratory Manual,3rdedition,Sambrook&Russell,2000,Cold Spring Harbor Laboratory Press(《分子克隆：实验室手册》，第3版，Sambrook与Russell，2000，冷泉港实验室出版社)，其通过引用并入本文)。

在一个实施方式中，该变异体具有与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其片段具有至少50％同一性的氨基酸序列，例如至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的同一性。

可使用合适的计算机程序(例如威斯康星大学，遗传计算研究组的GAP程序)来测定两个多肽之间的百分比序列同一性，并且应当理解的是，百分比同一性是相对于其序列已被最佳化比对的多肽所计算的。

该比对可以可替换地使用Clustal W程序(如在Thompson等人,1994,Nuc.AcidRes.22:4673-4680中所描述的，其通过引用并入本文)来进行。

所使用的参数可以是如下：

快速成对比对参数：K元组(字体)大小；1、窗口大小；5、空位罚分；3、顶对角线的数目；5.打分方法：x百分比。

多重比对参数：空位开放罚分；10、空位拓展罚分；0.05。

打分矩阵：BLOSUM。

可替代地，BESTFIT程序可用于侧定局部序列比对。

在一个实施方式中，具有蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:1的变异体，其包含一种或多种选自由下列氨基酸位置组成的组中的突变的氨基酸：

E21、H25、H29、V47、K49、D50、L63、H71、H72、R74、N76、T79、Y82、S85、S87、S89、N98、I99、V121、M135、V138、M145、V148、D150、K154、L160、M175、S179、A183、L185、V212、Y217、P225、A229、V233、L234、V238、N240、Y241和/或M242。

(其中该氨基酸序列和编号根据Protein Data Bank[PDB]，条目“2EEK！”，其中EQID NO:1的起始异亮氨酸编号为位置I-16)。

因此，具有蛋白酶活性的多肽可能是SEQ ID NO:1的变异体，其包含一种或多种选自由以下组成的组中的氨基酸突变：

E21T、H25Y、H29(Y/N)、V47I、K49E、D50Q、L63I、H71D、H72N、R74(K/E)、N76(T/L)、T79(S/N)、Y82F、S85A、S87(K/R)、S89R、N98T、I99L、V121I、M135Q、V138I、M145(T/L/V/E/K)、V148G、D150S、K154(T/V)、L160(I/A)、M175(K/Q)、S179N、A183V、L185G、V212I、Y217(D/H/S)、P225Y、A229V、V233N、L234Y、V238I、N240S、Y241N和/或M242I。

例如，具有蛋白酶活性的多肽可包含或由SEQ ID NO：1的具有以下限定的突变之一(或其组合)的氨基酸序列组成：

(a)N240S,Y241N,S87K(“EZA-002”)；

(b)K154T(“EZA-003”)；

(c)K154L(“EZA-004”)；

(d)K154V(“EZA-005”)；

(e)K154E(“EZA-006”)；

(f)N98T(“EZA-007”)；

(g)I99L(“EZA-008”)；

(h)L185G,P225Y(“EZA-009”)；

(i)V212I(“EZA-0010”)；

(j)Y217D,M175K(“EZA-011”)；

(k)Y217H(“EZA-012”)；

(l)Y217S(“EZA-013”)；

(m)A229V(“EZA-014”)；

(n)H25Y(“EZA-015”)；

(o)H25N(“EZA-016”)；

(p)H29Y(“EZA-017”)；

(q)H71D(“EZA-018”)；

(r)H72N(“EZA-019”)；

(s)R74K(“EZA-020”)；

(t)R74E(“EZA-021”)；

(u)N76T(“EZA-022”)；

(v)N76L,Y82F(“EZA-023”)；

(w)T79S(“EZA-0024”)；

(x)T79N(“EZA-025”)；

(y)K49E,D50Q(“EZA-026”)；

(z)S87R(“EZA-027”)；

(aa)E21T,H71D,D150S,K154V(“EZA-028”)；

(bb)S179N,V233N(“EZA-029”)；

(cc)M135Q(“EZA-030”)；

(dd)M145K,V148G(“EZA-031”)；

(ee)M175Q(“EZA-032”)；

(ff)L63I,S85A(“EZA-033”)；

(gg)L160I(“EZA-034”)；

(hh)V138I,L160A,A183V(“EZA-035”)；

(ii)V121I(“EZA-036”)；

(jj)V47I,V238I,M242I(“EZA-037”)；

(kk)V238I(“EZA-038”)；和

(ll)L234Y(“EZA-039”)

同样地，具有蛋白酶活性的多肽可包含或由SEQ ID NO：1的具有以下限定的突变之一(或其组合)的氨基酸组成：

(a)H25N,N76T

(b)H25N,H29Y

(c)H25N,M135Q

(d)H29Y,T79N,M135Q

(e)I99L,V121I,L160I,Y217H

(f)V121I,L160I

(g)H72N,R74E,S87K

(h)H25N,M135Q,Y217H

(i)T79N,V121I,V212I

(j)H29Y,N76T,I99L,M135Q

(k)K49E,D50Q,N76L,Y82F,S179N,V233N

(l)M145K,V148G,N76L,Y82F,S179N,V233N

(m)H25N,N76T,S87K,K154T

(n)H25Q

(o)H25D

(p)H25S

(q)K24E,H25N

(r)Y97N

(s)N100D

(t)A120S,A122S

(u)M135E

(v)V204Q,A122S

(w)T79D

(x)R74D

(y)K49E

(z)K49S,D50Q

(aa)D50Q

(bb)Q178D

(cc)S87R

在一个优选的实施方式中，具有蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:1的氨基酸序列的变异体，其不包含在25位的组氨酸。

例如，具有蛋白酶活性的多肽可包含或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列(包含H25N突变；参见下面序列中的方框)组成

16

I

IVGGYECTKSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEG

79

I

TEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADAMCTVSG

141

I

WGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPV

200

I

VCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY

[SEQ ID NO:2]

在一个可替换的优选实施方式中，具有蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:1的氨基酸序列的变异体，其不包含在160位的赖氨酸。

例如，具有蛋白酶活性的多肽可包含或由SEQ ID NO：3的氨基酸序列(包含L160I突变；参见下面序列中的方框)组成：

16

I

IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEG

79

I

TEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADAMCTVSG

141

I

WGNTMSSVADGDKLQCLSIPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPV

200

I

VCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY[SEQ ID NO:3]

本领域的技术人员将理解的是，上述已识别的突变(如参照大西洋鳕鱼的胰蛋白酶I的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)所限定的)也可以在来自其他物种的胰蛋白酶中进行。例如，在SEQ ID NO：2和3(分别为H25N和L160I)中突出显示的特异性突变可以在来自阿拉斯加狭鳕的胰蛋白酶中进行(例如参见GenBank：BAH70476.3，其中该活性胰蛋白酶的氨基酸序列开始于位置120，使得H25对应于BAH70476.3中的H29，等等)。

在可替换的实施方式中，具有蛋白酶活性的多肽包括或由天然存在的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列组成。因此，具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽可由天然存在的真核或原核来源的胰蛋白酶的氨基酸序列组成。具体地所包括的是适冷性胰蛋白酶，诸如来源于大西洋鳕鱼(Gadus morhua)、大西洋和太平洋鲑鱼(例如Salmo salar和Oncorhynchus种)以及阿拉斯加狭鳕(Theragra chalcogramma)的胰蛋白酶。

在本发明第一方面的另一实施方式中，该多肽包括或由融合蛋白组成。

多肽的“融合”包括对应于SEQ ID NO:1(或其片段或变异体)的融合至任何其他多肽的氨基酸序列。例如，所述多肽可以融合至诸如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或蛋白A的多肽，以便促进所述多肽的纯化。此融合的实例是本领域普通技术人员所公知的。类似地，所述多肽可以融合至诸如His6的寡聚组氨酸标签，或融合至被抗体所识别的表位(诸如公知的Myc标签表位)。融合至所述多肽的任何变异体或衍生物也包括在本发明的范围内。

该融合可包括赋予本发明的所述多肽的期望特征的另一部分；例如，该部分可能对增强或延长治疗效果是有用的。例如，在一个实施方式中，该融合包括人血清白蛋白或类似的蛋白。

可替换地，该融合部分可以是，例如，生物素部分、放射性部分、荧光部分，例如如本领域技术人员所熟知的小荧光团或绿色荧光蛋白(GFP)荧光团。所述部分可以是免疫原性的标签，例如如本领域技术人员所熟知的Myc标签，或者可以是如本领域技术人员所熟知的能够促进多肽的细胞摄取的亲脂性分子或多肽结构域。

在本发明的第一方面的另一实施方式中，该多肽包括或由一种或多种被修饰的或衍生的氨基酸组成。

一种或多种氨基酸的化学衍生物可通过与侧链官能团反应来实现。这样衍生的分子包括，例如，在其中游离氨基被衍生形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可以被衍生化以形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯和酰肼。游离羟基可以被衍生化以形成O-酰基或O-烷基衍生物。含有20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的那些肽也被包括作为化学衍生物。例如：4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸，以及鸟氨酸可以取代赖氨酸。衍生物也包括含有一种或多种添加或缺失的肽，只要所需的活性被保留。其他所包括的修饰是酰胺化、氨基末端酰化(例如乙酰化或巯基乙酸酰胺化)、末端羧酸酰胺化(例如具有氨或甲胺)以及类似的末端修饰。

本领域技术人员将进一步理解的是，拟肽类化合物也可以是有用的。因此，“多肽”包括是具有SEQ ID NO：1的多肽的抗炎活性的拟肽类化合物。术语“拟肽”是指模拟作为治疗药剂的特定肽的构象和期望特征的化合物。

例如，本发明的多肽不仅包括其中氨基酸残基被肽(-CO-NH-)键连接的分子，还包括其中肽键反转的分子。这种反转型拟肽可以使用本领域已知的方法制备，例如诸如描述于Meziere等人，(1997)J.I mMunol.159,3230-3237，其通过引用并入本文。这种方法涉及制备包含涉及骨架而非侧链方向的变化的伪肽。含有NH-CO键而非CO-NH肽键的反转型的肽更耐蛋白水解作用。可替换地，本发明的多肽可以是其中一种或多种氨基酸残基由-y(CH₂NH)-键取代常规酰胺键的拟肽类化合物。

在另一可替换的实施方式中，可以完全不需要肽键，只要使用了合适的保留氨基酸残基的碳原子之间间隔的连接部分；有利的是，该连接部分具有和肽键基本相同的电荷分布和基本相同的平面性。

应当理解的是，该多肽可方便地在其N-末端或C-末端被封闭，以帮助降低外部蛋白水解消化的易感性。

各种未编码或修饰的各种氨基酸(诸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸)也已经被用于修饰多肽。此外，推定的生物活性构象可以被共价修饰来稳定，诸如环化或通过内酰胺或其他类型桥的掺入，例如参见Veber等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:2636和Thursell等人,1983,Biochem.Biophys.Res.Co mM.111:166，其通过引用并入本文。

然而在一个优选的实施方式中，本发明的多肽包括一种或多种通过PEG化、酰胺化、酯化、酰化、乙酰化和/或烷基化修饰的或衍生化的氨基酸。

本领域技术人员将理解的是，本发明的多肽可以具有任何合适的长度。优选地，该多肽的长度在10个到30个氨基酸之间，例如其长度在10个到20个、12个到18个、12个到16个或15个到20个氨基酸之间。可替换地，该多肽的长度可以在150个到250个氨基酸之间，例如其长度在200个到250个、210个到240个、220个到230个或220个到225个氨基酸之间。

在一个实施方式中，该多肽是直链的。

在另一实施方式中，该多肽是重组多肽。

有利地，该多肽以适于递送到口腔和/或咽(例如口咽)粘膜的形式被提供。例如，该多肽可以以口喷剂、鼻喷剂、含片、锭剂、口香糖或液体的形式被提供。

本发明第二个相关的方面提供了如在上述用于治疗或预防患有或易患免疫缺陷的受试者的微生物感染的药物的制备中所限定的多肽。

本发明的第二方面的示例性实施方式在上文相对于本发明的第一方面被描述。

本发明的多肽以及核酸分子、载体和用于产生载体的宿主细胞可使用本领域中公知的方法(例如，参见Sambrook&Russell,2000,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,Third Edition,Cold Spring Harbor,New York(Sambrook与Russell，2000，《分子克隆，实验室手册》，第三版，冷泉港，纽约)，在该文件中的相关公开内容通过引用并入本文)来制备。

可替换地，本发明的多肽可以通过已知的方法来合成，诸如液相合成和固相合成(例如，t-Boc固相肽合成和BOP-SPPS)。

本领域技术人员将理解的是，本发明还包括上述多肽的药学上可接受的酸或碱加成盐。用来制备在本发明中有用的上述碱性化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸是那些能形成无毒酸加成盐的酸，即，含有药理学上可接受的阴离子的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、醋酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、蔗糖酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐[即1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐)]，等等。

药学上可接受的碱加成盐也可用于制备多肽的药学上可接受的盐形式。可用作制备天然为酸性的本发明化合物的药学上可接受的碱盐的试剂的化学碱是那些能与本发明化合物形成无毒碱盐的碱。这种无毒碱盐包括但不限于衍生于这些药理学上可接受的阳离子(诸如碱金属阳离子(如钾和钠)和碱土金属阳离子(如钙和镁))的那些碱、铵或水溶性胺加成盐(诸如N-甲基葡糖胺(葡甲胺))以及低级烷醇铵和药学上可接受的有机胺的其他碱盐，等等。

应当进一步理解的是，本发明的多肽可被冻干用于贮存，并在使用前于合适的载体中重构。可以采用任何合适的冻干方法(例如喷雾干燥、原丝筒干燥)和/或重构技术。本领域技术人员将理解的是，冻干和重构可导致不同程度的活性损失，并且使用水平可能必须向上调整以补偿。优选地，当被复水时，冻干的(冷冻干燥的)多肽失去不超过约20％、或不超过约25％、或不超过约30％、或不超过约35％、或不超过约40％、或不超过约45％、或不超过约50％的活性(在冻干之前)。

本发明的多肽通常以治疗组合物的形式提供，其中该多肽与药学上可接受的缓冲液、稀释剂、载体、佐剂或赋形剂一起配制。额外的化合物可包括在该组合物中，包括螯合剂，诸如EDTA、柠檬酸盐、EGTA或谷胱甘肽。抗微生物/治疗组合物可以以本领域已知的有足够的贮存稳定性并适于对人类和动物给药的方式来制备。该治疗组合物可被冻干，例如，通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷却或通过使用来自超临界颗粒形成的颗粒形成。

“药学上可接受的”意思是指不降低本发明的多肽的胰蛋白酶活性的有效性的无毒材料。这类药学上可接受的缓冲液、载体或赋形剂在本领域中是公知的(参见《Remington药物科学》，第18版，A.R.Gennaro编，Mack出版公司(1990)，以及《药用辅料手册》，第3版，A.Kibbe，医药出版社(2000)，其公开的内容通过引用并入本文)。

术语“缓冲剂”意指含有以稳定pH为目的的酸碱混合物的水溶液。缓冲剂的实例是Trizma、N-二羟乙基甘氨酸、三羟甲基甘氨酸、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、羟乙酸盐、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、二甲基胂酸盐、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES。

术语“稀释剂”意指以稀释治疗制剂中的肽为目的的水性或非水性溶液。该稀释剂可以是一种或多种盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(诸如红花油、玉米油、花生油、棉子油或芝麻油)。

术语“佐剂””意指加入到制剂中以增强本发明的多肽的生物效应的任何化合物。该佐剂可以是一种或多种的锌、铜或银与不同阴离子的盐，例如，但不限于氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸盐(tiocyanate)、亚硫酸盐、氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、乳酸盐、羟乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐盐、酒石酸盐以及不同的酰基组成的乙酸盐。佐剂也可以是阳离子聚合物，诸如阳离子纤维素醚、阳离子纤维素酯、脱乙酰透明质酸、脱乙酰壳多糖、阳离子树枝状聚合物、阳离子合成聚合物(诸如聚(乙烯咪唑))和阳离子多肽(诸如聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸)和含有这些氨基酸的肽。

所述赋形剂可以是碳水化合物、聚合物、脂质类和矿物质中的一种或多种。碳水化合物的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇和环糊精，其被添加到组合物，例如，为了便于冻干。聚合物的实例是淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐、角叉菜胶、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸、聚乙二醇/聚环氧乙烷、聚环氧乙烷/聚环氧丙烷共聚物、不同水解程度的聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯和聚乙烯吡咯烷酮，所有不同的分子量，将其加入到组合物，例如用于粘度控制、用于实现生物粘附或用于保护脂质免受化学的和蛋白水解的降解。脂质类的实例是脂肪酸、磷脂、单酸甘油酯、二酸甘油酯和三酸甘油酯、神经酰胺、鞘脂和糖脂、所有不同的酰基链长度和饱和度、蛋卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化蛋卵磷脂和氢化大豆卵磷脂，其由于与聚合物类似的原因被添加到该组合物。矿物质的实例是滑石、氧化镁、氧化锌和氧化钛，将它们添加到组合物中以获得诸如减少液体积累或有利的颜料性质的益处。

在一个实施方式中，该多肽可以与稳定剂诸如氯化钙一起提供。

本发明的多肽可以配制成适于多肽药剂递送的本领域中已知的任何类型的治疗组合物。

在一个实施方式中，多肽可简单地溶解在水、盐水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(诸如红花油、玉米油、花生油、棉子油或芝麻油)、黄芪胶和/或各种缓冲液中。例如，在该多肽被配制为口服给药(诸如在口腔喷剂中)的情况下，该治疗组合物可包含溶解在水、甘油和薄荷醇中的多肽。示例性的口腔喷雾制剂在斯堪的纳维亚内以(由Enzymatica AB，隆德，瑞典)销售。

在优选的实施方式中，本发明提供了如上所述的渗透活性溶液中的蛋白酶多肽。例如，所述多肽可以在甘油(glycerol)或甘油(丙三醇)中配制。不希望受理论的束缚，认为这种渗透活性溶液促进从微生物细胞向细胞外环境中的液体的移动。反过来，认为通过创建抑制(至少部分地)通过(如咽的)宿主上皮细胞对微生物细胞(诸如细菌和病毒)的摄取的薄的、活性屏障薄来促进本发明的多肽的治疗效果。

在进一步的实施方式中，本发明的治疗组合物可以是脂质体的形式，其中除了其他药学上可接受的载体，该多肽与以聚集形式(如胶束、不溶性单层和液晶)存在的两亲试剂(诸如脂质类)结合。用于脂质体制剂的合适脂质类包括但不限于，单酸甘油酯、甘油二酯、硫苷、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。合适的脂质类还包括用聚乙二醇在极性头部基团修饰的以用于延长血流循环时间的上述脂质类。此类脂质体制剂的制备可在例如US4,235,871中找到，其公开的内容通过引用并入本文。

本发明的治疗组合物还可以是可生物降解的微球形式。脂肪族聚酯(诸如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)或聚己内酯(PCL)和聚酐)已经作为可生物降解的聚合物被广泛用于微球的制备。这种微球的制备可在US 5851451中和EP 0 213303中找到，其公开的内容通过引用并入本文。

在另一实施方式中，本发明的治疗组合物是以聚合物凝胶的形式提供的，其中诸如淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐、角叉菜胶、透明质酸和其衍生物、聚丙烯酸、聚乙烯基咪唑、聚磺酸、聚乙二醇/聚环氧乙烷、聚环氧乙烷/聚环氧丙烷共聚物、聚乙烯醇/不同水解程度的聚乙烯醋酸酯和聚乙烯吡咯烷酮的聚合物用于含有肽的溶液的增稠。该聚合物还可包括明胶或胶原蛋白。

应该理解的是，本发明的治疗组合物可包括用于增强多肽作用的离子和规定的pH值。此外，该组合物可以施用于诸如灭菌的常规治疗操作和/或可含有常规的佐剂，诸如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂、填充剂等。

在一个优选的实施方式中，该治疗组合物包括在Tris或磷酸盐缓冲液中的多肽，连同EDTA、木糖醇、山梨糖醇、丙二醇和甘油中的一种或多种。

本发明的特别优选的治疗组合物在下面的实施例A中描述。

根据本发明的治疗组合物可以通过本领域技术人员公知的任何合适的途径给药。因此，可能的给药途径包括口服、经颊、胃肠外(静脉内、皮下和肌肉内)、局部、眼、鼻、肺部、肠胃外、阴道和直肠。从植入物给药也是可能的。

在一个优选的实施方式中，该治疗组合物被口服给药。例如，该多肽可以被配制为口喷剂、鼻喷剂、含片、锭剂、口香糖或者用于口服给药的常规液体。

在可替换的实施方式中，该治疗组合物被胃肠外给药，例如，静脉内、脑室内、关节内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌内或皮下、或它们可以通过输注技术给药。它们以无菌水溶液的形式方便地使用，该无菌水溶液可以含有其他物质，例如，使溶液与血液等渗的足够的盐或葡萄糖。如果必要的话，该水溶液应被适当缓冲(优选至3至9的pH)。合适的肠胃外制剂在无菌条件下的制备可通过本领域技术人员众所周知的标准药学技术来完成。

适于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使该制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。该制剂可以存在于单位剂量或多剂量的容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且在使用前直接可以存储于仅需要加入无菌液体载体(例如注射用水)的冷冻干燥(冻干)条件中。临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和先前描述种类的片剂制备。

可替换地，该治疗组合物可以通过鼻内或通过吸入(例如，从加压容器、泵、喷雾器或与使用合适推进剂(诸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷的形式、二氯四氟乙烷、诸如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A3)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EA3)的氢氟烷、二氧化碳或其他适合的气体)的雾化器以气雾剂喷雾呈现的形式)给药。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可通过提供阀门以递送计量的量来确定。加压容器、泵、喷雾器或雾化器可包含活性多肽的的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可另外含有润滑剂，如脱水山梨醇三油酸酯。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如由明胶制成)可配制成含有本发明的化合物和诸如乳糖或淀粉的合适的粉末基质的粉末混合物。

治疗组合物将以药学上有效剂量施用给患者。如本文所使用的“治疗有效量”或“有效量”或“治疗有效的”，指的是对于给定的条件和给药方案提供了治疗效果的量。这是经计算结合所需的添加剂和稀释剂(即载体或给药载体)产生期望的治疗效果的活性物质的预确定的量。另外，其意指足以减少及最优选防止宿主在活性、功能和应答方面的临床上显著的缺陷的量。可替换地，治疗有效量在宿主身上足以引起临床显著条件的改善。正如本领域的技术人员所理解的，化合物的量根据其特定的活性而变化。合适的剂量可含有经计算结合所需的稀释剂产生期望的治疗效果的活性组合物的预确定的量。在用于生产本发明的组合物的方法和使用中，提供了治疗有效量的活性成分。医学或兽医普通技术工作者可以基于患者的特征(诸如年龄、体重、性别、状态、并发症、其他疾病等)来确定治疗有效量，正如本领域中所众所周知的。药学有效剂量的施用可以通过以单独剂量单位的形式单次给药，或者以几个较小的剂量单位的形式通过细分剂量以特定的间隔多次给药来进行。可替换地，该剂量可以在延长的时间以连续输液来提供。

该多肽可以以各种浓度来配制，这取决于所使用的化合物的功效/毒性。优选地，该制剂包含浓度为0.1μM到1mM之间的活性药剂，更优选为1μM到500μM之间、500μM到1mM之间、300μM到700μM之间、1μM到100μM之间、100μM到200μM之间、200μM到300μM之间、300μM到400μM之间、400μM到500μ之间，最优选为约500μM。

因此，治疗性制剂可包含足以杀死或减缓在口腔和/或咽(例如口咽)内微生物(诸如病毒、细菌和酵母)的生长的多肽或其片段、变异体、融合物或衍生物的量。

本发明的第三方面提供了一种用于治疗或预防患有或易患免疫缺陷的受试者的微生物感染的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的如上述与本发明的第一方面相关的所限定的多肽。

本发明的第三方面的示例性实施方式在上面与本发明的第一方面相关地被描述。

在一个实施方式中，微生物感染选自由细菌感染、病毒感染、真菌感染和酵母菌感染组成的组。

在一个实施方式中，本发明的多肽用于治疗或预防口腔和/或咽(例如，口咽部)的继发性感染。

例如，该多肽可以用于治疗或预防鼻液溢和/或口腔和/或牙龈溃疡真菌感染。

这样的微生物感染可以方便地通过以口喷剂、鼻喷剂、锭剂或类似物的形式施用本发明的多肽而被治疗/预防。这种制剂允许本发明的多肽长时间地暴露于口腔和/或咽(例如口咽)的粘膜，由此多肽的胰蛋白酶活性暴露于浸润(infiltrating)微生物。

通常，本发明的多肽将在数天、数周或更长的时期重复施用。

本领域技术人员将理解的是，本发明的多肽可与一种或多种另外的治疗药剂联合使用。

例如，本发明的多肽可与如下联合使用：

(a)常规抗生素药剂(诸如头孢菌素类、四环素类、氨基糖苷类和青霉素类)；

(b)抗病毒药剂(诸如奥塞米韦和扎那米韦)；和/或

(c)抗真菌剂(诸如制霉菌素、克霉唑和flucanozole)

此外，本发明的多肽可与“非处方”感冒和流感药物联合使用，例如镇痛剂(诸如对扑热息痛和布洛芬)和减充血剂(诸如苯肾上腺素)。

本领域的技术人员将进一步理解的是，本发明的使用和方法在医学和兽医领域都有实用性。因此，多肽药物可用于治疗人类和非人类的动物(诸如马、狗和猫)。

然而，优选地，该患者是人类。

优选地，体现了本发明某些方面的非限制性的实例将进行说明。

图1.诊断患有CVID并每周以皮下注射(人IgG)治疗的12岁男性患者的每周各种感染症状的百分比。基准数据收集于2012年和2013年一月至九月期间。治疗从2013年十月至十一月持续9周。

图2.诊断患有CVID并每周以皮下注射(IgG)治疗的12岁男性患者的花费在家中而非学校的每周的平均天数。基准数据收集于2012年和2013年一月至九月期间。治疗从2013年十月至十一月持续9周。

具体实施方式

实施例A：示例性的治疗制剂

本发明的多肽的示例性原液，来源于大西洋鳕鱼的胰蛋白酶I(SEQ ID NO：1)，可以如表1所示配制：

表1

项目描述	量
		纯化的水	50L
甘油	50L
		Tris缓冲液原液	1L
来源于大西洋鳕鱼的胰蛋白酶I	300 000U

将pH调至7.5。

来源于大西洋鳕鱼的胰蛋白酶I(SEQ ID NO：1)的合适的治疗组合物也是作为(Enzymatica AB，瑞典，隆德)可商购的。

实施例B：病例研究

患者：12岁男性

诊断：CVID(普通变异型免疫缺陷)

治疗史：皮下免疫球蛋白(人类)

阿莫西林，口服

治疗：每次1U，每天服用2次

自2003年以来，受试者已每周接受人免疫球蛋白(每周4g)的皮下注射。然而，在于2013年年末使用本发明的多肽治疗之前，受试者罹患了耳部、鼻窦、鼻、支气管和肺部复发性微生物感染。受试者频繁表现出连续流涕、口腔中真菌生长以及在牙龈中具有伤口的牙龈炎。因此，受试者的生活质量已被严重损害，并通常需要每周至少一天留在家里而不去学校。十一月往往是特别具有挑战性的月份，由于受试者因为反复感染常发展成肺炎。

从2012年8月至2013年5月用阿莫西林一段时间的预防性治疗，对受试者的反复发作症状影响不大。

在2013年10月，受试者开始每日两次用口喷雾的治疗(早晨和晚上)；在此期间持续每周给药

在开始治疗的仅仅三天之内，受试者经历了症状和生活质量的显著改善(见表2)：

表2

用治疗的效果也可以从图1和图2中清楚地看到。

图1(A)示出了在三个时间段受试者每周经历的各种感染症状的百分比：

(a)该整个2012年期间(和阿莫西林)；

(b)从2013年1月至9月(和阿莫西林)；以及

(c)从2013年10月至2013年11月(和)。

在用治疗期间，所观察到的感染症状的显著减轻是一目了然的。

图1(B)示出了在58周的延长研究期间，相同的受试者每周经历的各种感染症状的百分比

图2(A)示出了在与图1中相同的三个时间段期间，受试者由于感染症状的严重程度而上学缺席的每周的平均天数。从用治疗开始之后的感染症状的显著改善再次是一目了然的。

在用本发明的多肽治疗的受试者身上这样快速的起效以及接近感染症状的彻底根除完全是出乎意料的，特别是考虑到治疗初期(10月-11月)适逢该年受试者通常经历最严重感染的时期。可以理解的是，受试者与他的母亲都因在超过十年的使人衰弱的反复感染之后的生活质量的改善而受到鼓舞。

图2(B)示出了在与图1(B)中相同的延长研究时期，受试者由于感染症状的严重程度而上学缺席的每周的平均天数。

实施例C-重组丝氨酸蛋白酶多肽的产生

克隆

编码感兴趣的丝氨酸蛋白酶多肽的合成基因在没有任何标记的情况下被克隆到E.coli表达E3载体(GenScript)中。

编码来源于大西洋鳕鱼的野生型胰蛋白酶I的核酸显示在如下的SEQ ID NO：4(在pUC57中)中。

编码来自大西洋鳕鱼的胰蛋白酶I的突变型的大量核酸分子通过常规技术(即，通过PCR定向诱变)来合成。

胰蛋白酶的复性(refolding)与纯化

化学感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞使用标准方法(即热休克转化)用含有编码感兴趣的丝氨酸蛋白酶多肽(胰蛋白酶)的核苷酸序列的E3载体转化。

酶原多肽(胰蛋白酶原)在宿主细胞的细胞质中过表达并形成包涵体。

诱导后的细胞被收获并通过超声处理裂解。在离心后，包涵体在缓冲液(50mMTris，10mM EDTA，2％Triton X-100，300mM NaCl，2mM DTT，pH 8.0)中洗涤，并溶解在50mMTris，8M尿素，pH 8.0，然后在4℃下过夜透析到1×PBS，10％甘油，pH 7.4。

来源于复性的所表达的酶原多肽的纯度表现出>90％的纯度，并且没有其他的纯化被认为是必要的。

该重组酶原多肽然后通过加入纯化自大西洋鳕鱼的野生型胰蛋白酶I(0.2U/ml)并在室温下孵育24小时来进行活化(参见实施例D)。

示例性多肽

获得或制备了以下多肽：

(a)纯化自大西洋鳕鱼的野生型胰蛋白酶I(“WT-Tryp”或“野生型”)；

(b)大西洋鳕鱼的重组表达野生型胰蛋白酶I(SEQ ID NO：1，“R-Tryp”)；以及

(c)大西洋鳕鱼的胰蛋白酶I的38种不同的突变型(即，SEQ ID NO：1的突变序列)。

鳕鱼胰蛋白酶I的三十八种不同的突变型的序列突变示于下面的表3中。

表3

示例性胰蛋白酶多肽的序列

*氨基酸的编号是根据蛋白质数据库(PDB)条目'2EEK'

示例性胰蛋白酶多肽最初表达为具有融合至N-末端的活化肽MEEDK(SEQ ID NO：5)的酶原多肽。

实施例D：重组表达的野生型和突变形式的大西洋鳕鱼的胰蛋白酶I的稳定性

本实施例总结了在E.coli.中所表达的39种重组胰蛋白酶突变体的活化的结果。重组胰蛋白酶多肽(R-Tryp)的活性在24小时培养后通过纯化自大西洋鳕鱼的野生型胰蛋白酶I(WT-Tryp)而活化。

材料与方法

重组胰蛋白酶的表达

参见实施例C

稳定性的评估

为重组样品的活化和稳定性分析所设计的实验如下进行：

第1天：重组胰蛋白酶的活化

将重组酶(0.2U/ml)在室温下在酶标板中通过野生型胰蛋白酶(0.2U/ml)活化24小时。将该样品与20mM Tris-HCl，1mM CaCl₂，50％甘油，pH 7.6混合至200μl的最终体积。

第2天：活性和稳定性的测量

将活化的重组酶转移至新的酶标板(II)并保持在冰上以保持酶的稳定且停止活化过程。

(a)初始活性A0的测定

该活化的酶的活性(A0)通过将测定缓冲液中245μl的Gly-Pro-Arg与来源于酶标板(II)的5μl的重组酶混合而在新的酶标板(III)中测定。随后是410nm处的吸光度，并根据下面的公式计算活性：

其中，斜率是在200秒期间，在30℃胰蛋白酶活性的动力学测量的线性回归的斜率；df是稀释因子，60是秒向分钟的转化，ε是消光系数，等于8800M^-1cm^-1，l是光路的长度，等于0.7109cm，10³是将mol/l转换至μmol/ml。

(b)温度失活

100μl的活化的酶从酶标板(II)转移至新的酶标板(IV)中，并稀释至200μl以达到50％甘油，pH 7.6的最终浓度。板(IV)在60℃下孵育3.5小时(WT-Tryp失去90％的初始活性)。在(a)下测定剩余的活性。

第3天：自催化

100μl的活化的酶从酶标板(II)转移至含有溶于25％甘油和测定缓冲液，pH 7.6的100μl的0.1U/ml胰蛋白酶的新的酶标板(V)。该板在25℃下孵育8小时(WT-Tryp失去90％的初始活性)。在(a)所描述的测定活性(A_AX)。

结果

三十九种示例性丝氨酸蛋白酶多肽的活性、热稳定性和自催化报道于表4中(重组野生型鳕鱼胰蛋白酶、EZA-001和其三十八种突变体)。突变体之间的活性有相当大的差异。与仅有5％的剩余活性的野生型胰蛋白酶相比，几种表达的突变体提高了温度稳定性，并且与野生型胰蛋白酶相比几种突变体显示出本质上提高的自催化稳定性。

表4

39种示例性丝氨酸蛋白酶多肽的活性

实施例E：重组突变形式的鳕鱼胰蛋白酶I的活性测定

材料与方法

重组多肽的表达

使用实施例C中所描述的方法来生产对应于来源于大西洋鳕鱼的胰蛋白酶I的野生型氨基酸序列的多肽和其38种突变型。

活化

重组酶(约0.01mg/ml)的活化通过在室温下加入野生型胰蛋白酶(0.2U/ml)并孵育24小时来实现。在20mM Tris-盐酸，1mM CaCl₂，50％甘油，pH 8.0中混合至200μl的最终体积。

确定动力学常数的活性测定

底物(Gly-Pro-Arg)以0.005-0.15mM的浓度在含有1％DMSO的测试缓冲液中使用。245μL的底物溶液移液至96孔板中。该反应通过加入5μL的样品混合物(上面的)开始，并在SpectraMax酶标仪中在410nm处监测。动力学测两每一分钟进行一次，并连续运行15分钟。

结果

结果示于下面的表5中。

表5

Claims (56)

1.一种具有蛋白酶活性的多肽，用于治疗或预防患有或易患免疫缺陷的受试者中的微生物感染。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述蛋白酶选自由丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶组成的组。

3.根据权利要求2所述的多肽，其中，所述蛋白酶为丝氨酸蛋白酶。

4.根据权利要求3所述的多肽，其中，所述蛋白酶是胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。

5.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述免疫缺陷是继发性或获得性免疫缺陷。

6.根据权利要求5所述的多肽，其中，所述受试者接受用免疫抑制剂疗法的治疗。

7.根据权利要求6所述的多肽，其中，所述免疫抑制剂疗法选自由糖皮质激素、细胞抑制剂、抗体、作用于亲免蛋白的药物、干扰素、阿片类药物、TNF-结合蛋白、麦考酚酯和放射疗法组成的组。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中，所述免疫缺陷是天然存在的。

9.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述免疫缺陷是由于原发性免疫缺陷、癌症(诸如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤)、慢性感染(诸如获得性免疫缺陷综合征或AIDS)、营养不良和/或老化引起的。

10.根据权利要求9所述的多肽，其中，所述受试者具有原发性免疫缺陷。

11.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述患者具有选自由表I至VIII中列出的适应症组成的组中的原发性免疫缺陷。

12.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，用于治疗或预防口腔和/或咽的继发性感染。

13.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，用于治疗或预防鼻液溢和/或口腔和/或牙龈溃疡的真菌感染。

14.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述微生物感染选自由细菌感染、病毒感染、真菌感染和酵母菌感染组成的组。

15.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述多肽与一种或多种额外的抗微生物治疗联合使用。

16.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述受试者是人类。

17.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述多肽是天然存在的。

18.根据权利要求1至16中任一项所述的多肽，其中，所述多肽是非天然存在的。

19.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或保留所述氨基酸序列的胰蛋白酶活性的其片段、变异体、衍生物或融合物(或所述片段、变异体或衍生物的融合物)或由上述组成：

IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEGTEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSGWGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY[SEQID NO:1]。

20.根据权利要求19所述的多肽，其中，所述多肽包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列或者由其组成。

21.根据权利要求20所述的多肽，其中，所述多肽纯化自鳕鱼。

22.根据权利要求1至19中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段或者由其组成。

23.根据权利要求22所述的多肽，其中，所述片段包含SEQ ID NO：1的至少15个连续氨基酸，例如SEQ ID NO:1的至少16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230或240个连续氨基酸或者由其组成。

24.根据权利要求22或23所述的多肽，其中，所述片段包含SEQ ID NO:1的61至77位氨基酸残基或者由其组成。

25.根据权利要求22或23所述的多肽，其中，所述片段包含SEQ ID NO:1的225至241位氨基酸残基或者由其组成。

26.根据权利要求1至19中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的变异体或者由其组成。

27.根据权利要求26所述的多肽，其中，所述变异体是非天然存在的变异体。

28.根据权利要求26或27所述的多肽，其中，所述变异体具有与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其片段具有至少50％同一性的氨基酸序列，例如至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性。

29.根据权利要求26至28中任一项所述的多肽，其中，所述具有蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:1的变异体，其包含选自由下列氨基酸位置组成的组中的一种或多种突变的氨基酸或显示出抗微生物活性的其片段：

E21、H25、H29、V47、K49、D50、L63、H71、H72、R74、N76、T79、Y82、S85、S87、S89、N98、I99、V121、M135、V138、M145、V148、D150、K154、L160、M175、S179、A183、L185、V212、Y217、P225、A229、V233、L234、V238、N240、Y241和/或M242。

30.根据权利要求29所述的多肽，其中，所述具有蛋白酶活性的多肽是SEQ ID NO:1的变异体，其包含选自由下列组成的组中的一种或多种突变的氨基酸或显示出抗微生物活性的其片段：

E21T、H25Y、H29(Y/N)、V47I、K49E、D50Q、L63I、H71D、H72N、R74(K/E)、N76(T/L)、T79(S/N)、Y82F、S85A、S87(K/R)、S89R、N98T、I99L、V121I、M135Q、V138I、M145(T/L/V/E/K)、V148G、D150S、K154(T/V)、L160(I/A)、M175(K/Q)、S179N、A183V、L185G、V212I、Y217(D/H/S)、P225Y、A229V、V233N、L234Y、V238I、N240S、Y241N和/或M242I。

31.根据权利要求26至30中任一项所述的多肽，其中，所述具有蛋白酶活性的多肽选自表3中的多肽的组。

32.根据权利要求26至31中任一项所述的多肽，其中，所述具有蛋白酶活性的多肽包含SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列，或显示出抗微生物活性的其片段，或者由上述组成。

33.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述多肽包含融合蛋白或者由融合蛋白组成。

34.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述多肽、或者其片段、变异体、融合物或衍生物包含L-氨基酸或者由L-氨基酸组成。

35.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述多肽或其片段、变异体、融合物或衍生物包含经修饰或衍生的一种或多种氨基酸。

36.根据权利要求35所述的多肽，其中，所述一种或多种氨基酸通过PEG化、酰胺化、酯化、酰化、乙酰化和/或烷基化被修饰或衍生。

37.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述多肽的长度在10个到30个氨基酸之间，例如其长度在10个到20个、12个到18个、12个到16个、或者15个到20个氨基酸之间。

38.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述多肽的长度在150个到250个氨基酸之间，例如其长度在200个到250个、210个到240个、220个到230个、或者220个到225个氨基酸之间。

39.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述多肽是直链的。

40.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述多肽是重组多肽。

41.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述多肽以适于递送至口腔和/或咽的粘膜的形式提供。

42.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述多肽以口喷剂、鼻喷剂、含片、锭剂、口香糖或液体提供。

43.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中，所述多肽以口喷剂提供。

44.根据权利要求1至39中任一项所限定的多肽在制备用于治疗或预防患有或易患免疫缺陷的受试者中的微生物感染的药物中的应用。

45.根据权利要求44所述的应用，其中，所述多肽是胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。

46.根据权利要求44或45所述的应用，其中，所述多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或保留了所述氨基酸序列的胰蛋白酶活性的其片段、变异体、衍生物或融合物(或所述片段、变异体或衍生物的融合物)，或者由上述组成。

47.根据权利要求44至46中任一项所述的应用，其中，所述多肽以口喷剂、鼻喷剂、含片、锭剂、口香糖或液体提供。

48.根据权利要求44至47中任一项所述的应用，其中，所述受试者具有原发性免疫缺陷。

49.一种用于治疗或预防患有或易患免疫缺陷的受试者中的微生物感染的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的根据权利要求1至39中任一项所限定的多肽。

50.根据权利要求49所述的方法，其中，所述多肽是胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。

51.根据权利要求49或50所述的方法，其中，所述多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或保留了所述氨基酸序列的胰蛋白酶活性的其片段、变异体、衍生物或融合物(或所述片段、变异体或衍生物的融合物)，或者由上述组成。

52.根据权利要求49至51中任一项所述的方法，其中，所述多肽以口喷剂、鼻喷剂、含片、锭剂、口香糖或液体给予。

53.根据权利要求49至52中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有原发性免疫缺陷。

54.一种多肽，用于治疗或预防患有如本文参考说明书所描述的原发性免疫缺陷的患者中的微生物感染。

55.一种多肽在制备用于治疗或预防如本文参考说明书所描述的患者中的微生物感染的药物中的应用。

56.一种用于治疗或预防患有参考说明书的原发性免疫缺陷的患者中的微生物感染的方法。