CN102257001A - 治疗自体免疫和炎性病症的可溶性多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用作药物，特别是用于预防或治疗自体免疫和炎性病症如过敏性哮喘和炎性肠病的可溶性CD47结合多肽。本发明更具体地涉及用作药物的可溶性CD47结合多肽，其包含SIRPα(CD172a)的胞外结构域或其结合人CD47的功能衍生物。

Description

治疗自体免疫和炎性病症的可溶性多肽

本发明涉及用作药物，特别是用于预防或治疗自体免疫和炎性病症如过敏性哮喘和炎性肠病的可溶性CD47结合多肽。本发明更具体地涉及用作药物的可溶性CD47结合多肽，其包括SIRPα(CD172a)的胞外结构域或其结合人CD47的功能衍生物。

CD47是一种细胞表面糖蛋白，其结合相对细胞的SIRPα(又称作SHPS-1)和SIRPγ。这一相互作用造成对免疫细胞功能的负调控或者可以用于介导细胞粘附和迁移。提出将CD47用于治疗自体免疫病症的生物产品(WO1999/040940)。相反，对CD47配体(如SIRPα)用于相似治疗目的的潜在用途少有证据。一种解释是CD47的广泛表达将阻止CD47结合多肽用作潜在药物。Yu等人，2006(J Invest Dermatol，126，797-807)所示的数据表明通过将SIRPα的胞外结构域融合免疫球蛋白Fc结构域得到的融合蛋白在小鼠中可以防止从源自皮肤的树突细胞(DC)迁移至引流淋巴结，并从而(至少部分地)减弱小鼠的接触性过敏反应。DC的迁移和功能对于免疫或炎性应答是至关重要的。在疾病状况下，DC的这些加剧的应答可以造成疾病的永存。干扰病原性DC从组织迁移到淋巴器官对于停止引起自体免疫或炎性疾病的恶性循环将是很有吸引力的机会。本发明首先提供了在疾病动物模型中，SIRPα-Fc构建体适于预防或停止Th1/Th17以及Th2所引起的疾病的体内证据。这些数据提供了本发明的基础并且支持了源自SIRPα的蛋白疗法的可药性。本发明部分地基于下述发现：对于CD47/SIRPα通路的操作会抑制免疫原性CD103^-树突细胞推进的Th1/Th17引起的疾病(关节炎和结肠炎)以及Th2引起的疾病(过敏性哮喘)的病理。这些新的发现提供了对于之前未知的疾病潜在成因的共同机制并且代表了对于多种自体免疫和炎性病症的治疗前景。此外，在近来发表的报告中的证据表明CD47的配体对于治疗若干种癌症可能是有益的(Majeti等人，Cell 2009)。但是该报告表明了CD47抗体的应用，而本发明涉及源自SIRPα的多肽在治疗这些疾病中的应用。

因此，一方面，本发明提供用作药物的可溶性CD47结合多肽，包含选自下组的源自SIRPα的多肽：a)SIRPα的胞外结构域(SEQ ID NO：3)；b)SEQ ID NO：1的片段，和c)与SEQ ID NO：3具有至少75％同一性的SEQID NO：1的变体多肽；其中所述源自SIRPα的多肽结合人CD47(SEQ IDNO：24)。在某些实施方式中，SEQ ID NO：3的变体多肽与SEQ ID NO：3具有至少80％、85％、90％、95％或99％的同一性。

为了便于阅读，下文将本发明的可溶性CD47结合多肽称作“本发明的可溶性多肽”。

在一个实施方式中，所述源自SIRPα的多肽选自CD47的拮抗剂，即，竞争性抑制CD47配体与CD47结合的多肽。CD47配体包含但不限于SIRPα、SIRPγ或TSP1。

在另一实施方式中，所述源自SIRPα的多肽选自CD47的激动剂，即能够诱导CD47信号活性的多肽。

在一个实施方式中，所述可溶性CD47结合多肽选自以2μM或更小的K_D与人CD47结合和/或由在免疫复合物刺激的树突细胞细胞因子释放检测中所测量的抑制所诱导的细胞因子分泌的那些。

在另一实施方式中，所述源自SIRPα的多肽是包含至少SIRPα的V区的SIRPα胞外结构域(SEQ ID NO：2)。

在某些实施方式中，本发明的可溶性多肽是一种融合多肽，包含由与第二异源多肽融合的源自SIRPα的多肽组成的第一组分。在一个实施方式中，该可溶性多肽进一步包含在第二异源多肽和源自SIRPα的多肽之间的间隔区。在一个具体实施方式中，源自SIRPα的多肽与IgG Fc结构域融合。在优选的实施方式中，所述Fc结构域是人IgG1同种型的沉默Fc片段。在一个实施方式中，所述Fc结构域是人IgG1同种型的无糖基化(aglycosylated)突变变体。

在另一相关实施方式中，本发明的可溶性多肽用作治疗自体免疫和炎性病症的药物。优选的适应症选自Th2-介导的气道炎症、过敏性病症、哮喘、炎性肠病和缺血性疾病。此外，本发明的可溶性多肽可用作治疗白血病或癌症的药物。

为了可以更加容易地理解本发明，首先定义某些术语。其他定义在详细说明中提出。

术语CD47指人CD47。人CD47包含SEQ ID NO：24，以及人CD47的任何天然多态性，例如包含单核苷酸多态性(SNP)或剪接变体。在人类中发现的CD47核苷酸序列的剪接变体或SNP的实例描述于表1。

表1：CD47蛋白的变体

术语SIRPα指显示出与CD47整联蛋白相关联蛋白粘附的信号调控蛋白α(也称作CD172a或SHPS-1)。在一些实施方式中，术语SIRPα指如SEQ ID NO：23所限定的人SIRPα。人SIRPα含有氨基酸胞外结构域(SEQ ID NO：3)，具有一个V-型结构域(SEQ ID NO：2)，和两个C1型Ig结构域以及三个潜在的N-糖基化位点。它具有110个氨基酸胞质序列，具有ITIM模体，当磷酸化时ITIM模体募集酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2。术语人SIRPα还包含但不限于任何天然的多态性，例如包含人SIRPα的单核苷酸多态性(SNP)或剪接变体。在人类中发现的SIRPα核苷酸序列的剪接变体或SNP的实例描述于表2。

表2：SIRPα蛋白的变体

如在此使用，多肽在缺少任何将该多肽锚定或整合到表达此多肽的细胞之细胞膜的跨膜结构域或蛋白结构域时是“可溶的”。特别地，本发明的可溶性多肽可类似地不含有SIRPα的跨膜和细胞内结构域。

如在此使用，“结合CD47”的多肽旨在指以20μM或更小，2μM或更小，0.2μM或更小的K_D结合人CD47的多肽。在一些实施方式中，结合CD47的多肽进一步结合表面活性蛋白A(SP-A)和/或表面活性蛋白D(SP-D)。

如在此使用，在由免疫复合物刺激的树突细胞细胞因子释放检测法所测量的抑制所诱导的细胞因子分泌的多肽是抑制从外周血单核细胞、常规树突细胞(DC)以及由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)Cowan1(Pansorbin)或可溶性CD40L和IFN-γ刺激的单核细胞源性DC释放细胞因子(例如IL-6，IL-10，IL-12p70，IL-23，IL-8和/或TNF-α)的多肽。在下面的实施例中更具体地描述免疫复合物刺激的树突细胞细胞因子释放检测法的一个实例。在一些实施方式中，如由免疫复合物刺激的树突细胞细胞因子释放检测法所测量，本发明的可溶性多肽以1μM或更小，100nM或更小或者10nM或更小的IC₅₀抑制细胞因子分泌。

如在此使用，抑制T细胞增殖的多肽可在如实施例中所述的混合的淋巴细胞反应检测法中测量。

如在此使用，术语“K_assoc”或“K_a”旨在指特定蛋白质-蛋白质相互作用的结合速率，而如在此使用，术语“K_Dis”或“K_d”旨在指特定蛋白质-蛋白质相互作用的解离速率。如在此使用，术语“K_D”旨在指解离常数，其获自K_d与Ka比(即，K_d/Ka)并且表示为摩尔浓度(M)。蛋白质-蛋白质相互作用的K_D值可以使用本领域充分确立的方法来测定。测定蛋白质/蛋白质相互作用的K_D的方法是使用表面等离振子共振，或者使用生物传感器系统，例如

系统。

如在此使用，术语“亲和性”指多肽及其靶标之间在单个位点的相互作用强度。在每个位点内，多肽的结合区通过弱的非共价力在多个位点与其靶标相互作用；相互作用越多，亲和性越强。

如在此使用，用于结合多肽的术语“高亲和性”指对其靶标具有10nM或更小，例如1nM或更小的K_D的多肽。

如在此使用，术语“受试者”包含任何人或非人动物。

术语“非人动物”包含所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。

如在此使用，术语“优化的”指改变核苷酸序列以使用在生产细胞或生物体中(或者是真核细胞如毕氏酵母属(Pichia)或酵母属(Saccharomyces)细胞、木霉属(Trichoderma)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞，或者原核细胞如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株)优选的密码子来编码氨基酸序列。

改造优化的核苷酸序列以全部或尽可能多地保留原本由起始核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述起始核苷酸序列也称作“亲本”序列。在此，优化的序列被改造成具有在相应的生产细胞或生物体(如哺乳动物细胞)中优选的密码子，然而，这些序列在其他原核或真核细胞中的优化表达也在此提出。由优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也称作优化的。

在下面的部分进一步详细描述本发明的多个方面。

在实施例中进一步详细地描述评估本发明的可溶性多肽对CD47功能特性的作用的检测法。

源自SIRPα的多肽

本发明的可溶性多肽包含源自SIRPα的多肽，其选自：a)SIRPα的胞外结构域(SEQ ID NO：3)；b)SEQ ID NO：3的片段，和c)SEQ ID NO：3的变体多肽；其中所述源自SIRPα的多肽结合人CD47(SEQ ID NO：24)。

本发明的可溶性多肽及其源自SIRPα的片段应保留与CD47结合的能力。SEQ ID NO：3的片段可以因此选自包含SIRPα的CD47结合结构域的那些片段。那些片段通常不包含SIRPα的跨膜和细胞内结构域。在非限制的说明性实施方式中，源自SIRPα的多肽基本上由SEQ ID NO：3或SEQID NO：2组成。源自SIRPα的多肽还包含但不限于SEQ ID NO：3的变体多肽，其氨基酸残基通过氨基酸缺失、插入或置换而得到突变，但与SEQID NO：3具有至少60、70、80、90或95％的同一性；条件是对天然序列的改变基本上不影响分子的生物活性，特别是它与CD47的结合。在一些实施方式中，变体多肽包含突变氨基酸序列，其中相比于SEQ ID NO：2，在源自SIRPα多肽中有不超过1、2、3、4或5个氨基酸通过氨基酸缺失、插入或置换而得到突变。突变氨基酸序列的实例是源自单核苷酸多态性的那些序列(参见表2)。

如在此使用，两序列之间的同一性百分数是考虑需要引入以用于两序列最佳比对的空位数和每个空位的长度时，由序列共享的相同位置数的函数(即，同一性％＝相同位置数/位置总数x 100)。可以使用如下所述的数学算法完成两序列之间的序列比较以及同一性百分数的测定。

两氨基酸序列之间的同一性百分数可以使用整合入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17，1988)算法，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分为12以及空位罚分为4来测定。此外，两氨基酸序列之间的同一性百分数可以使用整合入GCG软件包(可获自http://www.gcg.com)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol，Biol.48：444-453，1970)算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，以及空位权重为16、14、12、10、8、6或4以及长度权重为1、2、3、4、5或6来测定。

在具体实施方式中，源自SIRPα的多肽包含对SEQ ID NO：3或SEQID NO：2的改变，所述改变含有保守氨基酸置换。

保守的氨基酸置换是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所替代的那些。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中有所定义。这些家族包含具有碱性侧链(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β支化的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香基侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，在源自SIRPα的多肽的CD47结合区中的一或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基所替代，并且可以使用在此所述的结合或功能检测法来检测新的多肽变体所保留的功能。

在一些实施方式中，源自SIRPα的多肽选自由免疫复合物刺激的树突细胞细胞因子释放检测所测量的那些多肽，该多肽保留至少与包含人SIRPα胞外结构域的SEQ ID NO：3的多肽相同程度的抑制细胞因子分泌的能力。

在一些实施方式中，源自SIRPα的多肽选自由混合的淋巴细胞反应检测所测量的保留有抑制T细胞增殖能力的那些多肽。

在另一实施方式中，源自SIRPα的多肽选自与非人的灵长类动物CD47交叉反应的那些多肽。

融合多肽

一方面，本发明的可溶性多肽是包含源自SIRPα的多肽的融合多肽。

在优选的实施方式中，本发明的可溶性多肽是包含源自SIRPα的多肽和第二异源氨基酸序列(如除了SIRPα以外的一或多种蛋白质的一部分)，以及任选地包含接头的融合多肽，该第二氨基酸序列在源自SIRPα的多肽的N和/或C末端结合该源自SIRPα的多肽。

非源自SIRPα的蛋白质可以优选是可溶性单链多肽，其在与另一异源蛋白融合时，能够增加所得到的融合蛋白在血液中的半衰期。替代地或者此外，非源自SIRPα的蛋白质包含用于使融合多肽多聚化的结构域。

非源自SIRPα的蛋白质可以例如是免疫球蛋白、血清白蛋白及其片段。非源自SIRPα的蛋白质也可以是能够结合血清白蛋白以在给予受试者时增加得到的分子的半衰期的多肽。此种手段描述于例如Nygren等人，EP 0486 525中。

在一个具体实施方式中，非源自SIRPα的蛋白质是Fc结构域。Fc部分用于生产具有在人类中增加的体内半衰期的可溶构建体是本领域公知的并且例如描述于Capon等人，(US5,428,130)。

如在此使用，术语“Fc结构域”指免疫球蛋白的恒定区。Fc结构域包含至少CH2和CH3结构域，任选地，在重链CH1结构域和CH2之间定位的铰链区。Fc片段可获自例如免疫球蛋白的木瓜蛋白酶消化。如在此使用，术语Fc结构域还包含其中已经引入至少一个氨基酸置换、缺失或插入的Fc变体。

在一个实施方式中，CH1的铰链区被修饰使得铰链区中的半胱氨酸数改变，例如增加或减少。这一手段进一步描述于Bodmer等人的美国专利No.5,677,425。改变CH1的铰链区中的半胱氨酸残基数以例如促进轻链和重链的组装或者以增加或减小融合多肽的稳定性。

在另一实施方式中，Fc区域被修饰以增加其生物半衰期。多种手段是可能的。例如，如Ward在美国专利No.6,277,375所述，可以引入一或多种下面的突变：T252L、T254S、T256F。

在又另一实施方式中，通过将至少一个氨基酸残基用不同的氨基酸残基代替来改变Fc区域以改变Fc部分的效应子功能。例如，一或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基代替使得Fc部分对于效应子配体具有改变的亲和性。对其亲和性改变的效应子配体可以例如是Fc受体或者补体的C1组分。这一手段进一步详细描述于Winter等人的美国专利No.5,624,821和5,648,260。

在另一实施方式中，选自氨基酸残基的一或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基代替使得得到的Fc部分具有改变的C1q结合和/或降低的或废除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这一手段进一步详细描述于Idusogie等人的美国专利No.6,194,551。

在另一实施方式中，一或多个氨基酸残基被改变从而改变Fc区固定补体的能力。这一手段进一步详细描述于Bodmer等人的PCT公开WO94/29351。

在又另一实施方式中，Fc区通过修饰一或多个氨基酸而被修饰以增加融合多肽介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或增加或减小Fc区对Fcγ受体的亲和性的能力。这一手段进一步详细描述于Presta的PCT公开WO00/42072。此外，已经绘制了人IgG1对FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点并且描述了结合改善的变体(参见，Shields，R.L.等人，2001J.Biol.Chem.276：6591-6604)。

在一个实施方式中，Fc结构域是人源的并且可来自任何的免疫球蛋白类别，例如IgG或IgA并且来自任何亚型如人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在其他实施方式中，Fc结构域来自非人动物，例如但不限于小鼠、大鼠、兔、骆驼、鲨鱼、非人灵长类动物或仓鼠。

在某些实施方式中，使用IgG1同种型的Fc结构域。在一些具体的实施方式中，使用IgG1Fc片段的突变变体，例如，降低或消除融合多肽介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或结合Fcγ受体能力的沉默的IgG1Fc。IgG1同种型沉默突变的实例是所谓的LALA突变，其中氨基酸位置234和235处的亮氨酸残基被丙氨酸残基所代替，如Hezareh等人在J.Virol2001Dec；75(24)：12161-8所述。在某些实施方式中，Fc结构域是防止Fc结构域在位置297处的残基糖基化的突变。例如，在Fc结构域第297位置处的天冬酰胺残基的氨基酸置换。此种氨基酸置换的实例是N297被甘氨酸或丙氨酸代替。

在一个实施方式中，Fc结构域包含二聚化结构域，优选通过能够在包含此Fc结构域的两融合多肽之间产生共价二硫键的半胱氨酸。

源自SIRPα的多肽可以直接框内融合非源自SIRPα的蛋白或者通过多肽接头(间隔区)。此种间隔区可为单个氨基酸(例如甘氨酸残基)或者5-100个氨基酸，例如5-20个氨基酸。接头应允许源自SIRPα的结构域呈现适合的空间定向以形成与CD47的结合位点。合适的多肽接头可以选自那些采用灵活构象的接头。此种接头的实例是(非限制)包含甘氨酸和丝氨酸残基的那些接头，例如(Gly₄Ser)_n，其中n＝1-12。

糖基化修饰

在另一实施方式中，相比于典型的哺乳动物糖基化模式(如在CHO或人细胞系中获得的那些)，可以改变本发明的可溶性多肽的糖基化模式。例如，可以使用原核细胞系作为宿主细胞或者已经被改造过而缺少糖基化的哺乳动物细胞来产生非糖基化的多肽。碳水化合物修饰也可以通过例如改变该可溶性多肽内的一或多个糖基化位点来实现。

此外或替代地，可以产生具有改变的糖基化类型的糖基化多肽。此种碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达该可溶性多肽来实现，即该可溶性多肽的糖基化模式相比于在相应的野生型细胞中观察到的糖基化模式有所改变。具有改变的糖基化机制的细胞已在本领域进行了描述并且可以用作表达本发明重组可溶性多肽的宿主细胞从而产生此种具有改变的糖基化的可溶性多肽。例如，Hang等人的EP1,176,195描述了具有功能性遭到破坏编码岩藻糖转移酶的FUT8基因的细胞系，使得在此种细胞系中表达的糖蛋白展现出低岩藻糖基化(hypofucosylation)。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了一种变体CHO细胞系，Lecl3细胞，其将岩藻糖与Asn(297)-连接的碳水化合物连接的能力降低，也造成在该宿主细胞中表达的糖蛋白的低岩藻糖基化(也参见Shields，R.L.等人，2002J.Biol.Chem.277：26733-26740)。替代地，本发明的可溶性多肽可以在针对哺乳动物样糖基化模式进行改造过的酵母如巴斯德毕氏酵母菌(Pichia pastoris)，或丝状真菌如里氏木霉(Trichodermareesei)中生产(参见例如EP1297172B1)。那些经糖基化改造过(glycoengineered)的宿主细胞的优点尤其是提供具有同源性糖基化模式和/或更高产率的多肽组合物。

PEG化的可溶性多肽及其他缀合物

本发明考虑的可溶性多肽的另一实施方式是PEG化。例如实质上由源自SIRPα的多肽组成的本发明的可溶性多肽可以被PEG化。PEG化是相比于没有PEG化的相同生物产品而言，增加得到的生物产品的生物(例如血清)半衰期的公知技术。为了使多肽PEG化，该多肽通常在一或多个PEG基团与该多肽相连的条件下，与聚乙二醇(PEG)反应，例如PEG的反应性酯或醛衍生物。PEG化可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶聚合物)的酰化反应或烷基化反应而进行。如在此使用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖任何形式的已被用于衍生其他蛋白的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基聚乙二醇或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。使蛋白质pEG化的方法是本领域已知的并且可以应用于本发明的可溶性多肽。参见例如，Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401384。

可以使用替代的缀合物或聚合物载体，尤其来提高得到的缀合物的药物动力学特性。聚合物载体可包含至少一种天然的或合成的、分支、线性或树枝状聚合物。聚合物载体优选可溶于水和体液中并且优选是可药用的聚合物。水溶性聚合物部分包含但不限于例如，聚亚烷基二醇及其衍生物，包含PEG、PEG均聚物、mPEG、聚丙二醇均聚物、乙二醇与聚乙二醇的共聚物，其中所述均聚物和共聚物是未取代的或者是在一端被取代的，例如被酰基；聚甘油或聚唾液酸所取代；碳水化合物，多糖，纤维素和纤维素衍生物，包含甲基纤维素和羧甲基纤维素；淀粉(例如羟基烷基淀粉(HAS)，特别是羟乙基淀粉(HES)和糊精，及其衍生物；葡聚糖和葡聚糖衍生物，包含葡聚糖硫酸酯(dextransulfat)、交联糊精、和羧甲基糊精；脱乙酰壳多糖(一种线性多糖)，肝素及肝素片段；聚乙烯醇和聚乙烯乙醚；聚乙烯吡咯酮(polyvinylpyrrollidon)；α，β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺；以及聚氧乙基化多醇。

可溶性多肽作为药物的应用

本发明的可溶性多肽已经在动物模型中显示出预防炎性病症如过敏性哮喘或炎性肠病，并因此可用作药物，特别是用作(以统计学或生物学上显著的方式)减少或抑制受试者炎症和/或自体免疫应答的药物，所述应答特别是在受试者中通过SIRPα+细胞介导的应答。

编码本发明可溶性多肽的核酸分子

本发明的另一方面涉及编码本发明的可溶性多肽或至少源自SIRPα的多肽的核酸分子，包含但不限于涉及融合多肽的实施方式。编码本发明的可溶性多肽的核苷酸序列的实例包含SEQ ID NO：26或27。

核酸可存在于整个细胞中、存在于细胞裂解物中，或者可以是部分纯化的或基本上纯形式的核酸。在通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)纯化出后，核酸是“分离的”或“成为基本上纯的”，标准技术包含碱/SDS处理、CsCl梯度离心、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和其他本领域公知的技术。参见，F.Ausubel等人编，1987Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and WileyInterscience，New York。本发明的核酸可以是例如，DNA或RNA并且可含有或不含有内含子序列。在一个实施方式中，该核酸是cDNA分子。该核酸可存在于诸如噬菌体展示载体的载体中，或者存在于重组质粒载体中。

一旦获得编码本发明的可溶性多肽(例如包含上述源自SIRPα的多肽的融合多肽)的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术来进一步操作这些DNA片段，例如以包含任何用于在表达体系中适当分泌的信号序列，用于进一步纯化步骤的任何纯化标签以及可切割标签。在这些操作中，DNA片段有效地连接另一DNA分子，或者连接编码另一蛋白质的片段，例如纯化/分泌标签或者可灵活的接头。如在这一上下文中使用，术语“有效连接”旨在指两个DNA片段以功能性的方式相连，例如使得由该两个DNA片段编码的氨基酸序列保留在框内，或者使得该蛋白在想要的启动子控制下表达。

产生源自SIRPα的多肽或可溶性多肽的转染瘤的产生

本发明的可溶性多肽可以使用，例如本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合，在宿主细胞转染瘤中生产。

例如，为了表达本发明的可溶性多肽或其中间产物，如源自SIRPα的多肽，可以通过标准分子生物学技术(例如PCR扩增或使用表达目的多肽的杂交瘤的cDNA克隆)获得编码相应的多肽的DNA，并且该DNA可以插入表达载体使得相应的基因有效地连接到转录和翻译控制序列。在这一上下文中，术语“有效连接”旨在指将基因连接到载体，使得在该载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调控该基因的转录和翻译的预期功能。表达载体和表达控制序列选择为与所用表达宿主细胞相容。编码可溶性多肽或中间产物的基因通过标准方法(例如基因片段和载体的互补性限制位点的连接，或者如果没有限制位点，那么平末端连接)插入表达载体中。另外或者替代地，重组表达载体可以编码促进该多肽链从宿主细胞分泌的信号肽。基因可以克隆到载体中使得信号肽框内连接多肽链的氨基末端。信号肽可以是SIRPα的信号肽或者异源信号肽(即，并非天然与SIRPα序列相关联的信号肽)。

除了编码多肽的序列，本发明的重组表达载体还携带控制基因在宿主细胞中表达的调控序列。术语“调控序列”旨在包含启动子、增强子和其他控制多肽链基因转录或翻译的表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。此种调控序列描述于，例如Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA 1990)。本领域技术人员应理解的是，表达载体的设计，包含调控序列的选择，可取决于如要转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包含引导在哺乳动物细胞中表达高水平蛋白质的病毒元件，如源自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))，和多瘤病毒的启动子和/或增强子。替代地，可使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或P-珠蛋白启动子。还进一步地，由不同来源的序列组成调控元件，例如Sra启动子体系，其含有来自SV40早期启动子和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复的序列(Takebe，Y.等人，1988Mol.Cell.Biol.8：466-472)。

除此之外，本发明的重组表达载体还可携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制(例如复制起点)以及筛选标记基因的序列。筛选标记基因促进引入有载体的宿主细胞的选择(参见，例如Axel等人的美国专利No.4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，典型地，筛选标记基因赋予引入有载体的宿主细胞以药物抗性，例如G418，潮霉素或氨甲蝶呤。筛选标记基因包含二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于以氨甲蝶呤筛选/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。

对于多肽表达，通过标准技术将编码可溶性多肽或中间产物如源自SIRPα的多肽的表达载体转染到宿主细胞中。多种形式的术语“转染”旨在涵盖通常用来将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。理论上在原核或者真核宿主细胞中表达本发明的可溶性多肽都是可能的。讨论了糖蛋白在真核细胞，特别是哺乳动物宿主细胞中的表达，因为相比原核细胞，此种真核细胞，并且特别是哺乳动物细胞更可能组装，并且分泌适当折叠的并具有生物活性的糖蛋白，如本发明的可溶性多肽。

用于表达本发明的可溶性多肽和中间产物，例如源自SIRPα的多肽的哺乳动物宿主细胞包含中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包含dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub and Chasin，1980Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220，其与DH FR筛选标记一起使用，例如描述于R.J.Kaufmanand P.A.Sharp，1982Mol.Biol.159：601-621，NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞)或者人细胞系(包含PER-C6细胞系，Crucell)。特别地，为了与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一表达体系是WO 87/04462、WO89/01036和EP 338,841所示的GS基因表达体系。当将编码多肽的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞后，通过培养宿主细胞足以允许该重组多肽在宿主细胞中表达或重组多肽分泌到宿主细胞所生长的培养基中的一段时间来生产可溶性多肽或中间产物，如源自SIRPα的多肽。然后可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收该多肽。

多价蛋白质

在另一方面，本发明提供包含与CD47结合的至少两种相同或不同的本发明可溶性多肽的多价蛋白质。在一个实施方式中，多价蛋白质包含至少两种、三种或四种本发明的可溶性多肽。可溶性的CD47^-结合多肽可以通过蛋白质融合或者共价或非共价键连接在一起。本发明的多价蛋白质可以使用本领域已知的方法，通过缀合组分结合特异性来制备。例如，可以单独产生该多价蛋白质的每种结合特异性然后彼此缀合。

可以使用多种偶联或交联剂用于共价缀合。交联剂的实例包含蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺-3-2-吡啶二硫代-丙酸酯(SPDP)、和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky等人，1984J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等人，1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：8648)。其他方法包含Paulus，1985Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan等人，1985Science 229：81-83，以及Glennie等人，1987J.Immunol.139：2367-2375描述的那些。可以通过两个半胱氨酸之间的二硫键，例如Fc结构域的半胱氨酸的二硫键来获得共价键。

在具体实施方式中，在缀合前，修饰与源自SIRPα的多肽融合的Fc结构域的铰链区以含有基数(例如一个)巯基残基。替代地，两种结合特异性可以在同一载体中编码并且在同一宿主细胞中表达和组装。

药物组合物

在另一方面，本发明提供组合物，例如药物组合物，其含有与可药用载体一起配制的本发明的可溶性多肽之一或其组合。

包含本发明的可溶性多肽的药物制剂可通过混合具有所需纯度的多肽与任选的生理上可接受的介载体、赋形剂或稳定剂(Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第20版(2000))来制备，以水溶液、冻干的或其他干燥的制剂形式储存。因此，本发明进一步涉及至少包含本发明可溶性多肽的冻干组合物。

本发明的药物组合物也可联合疗法来给予，即与其他试剂联合。例如，联合疗法可以包含与至少一种其他抗炎症或另一种化疗剂联合的本发明可溶性多肽。在下面的本发明的可溶性多肽的用途部分更详细地描述可以用于联合疗法的治疗剂的实例。

如在此使用，“可药用介载体”包含药学上相容的任何以及所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂以及吸收延迟剂等。介载体应适于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮给药(例如，通过注射或灌注)。根据给药途径，可将活性化合物包在材料中以保护该化合物免于可能使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。

本发明的药物化合物可包含一或多种可药用盐。“可药用盐”指保留亲本化合物的所需的生物活性并且不赋予任何不想要的毒理学作用的盐(参见，例如Berge，S.M.等人，1977J.Pharm.Sci.66：1-19)。此种盐的实例包含酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包含源自非毒性无机酸以及非毒性有机酸的那些，非毒性无机酸例如盐酸、硝酸(nitric)、磷酸(phosphoric)、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、含磷的酸(phosphorous)，等等，非毒性有机酸例如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳酸、脂肪族和芳香族磺酸等。碱加成盐包含源自碱土金属以及非毒性有机胺的那些，碱土金属例如钠、钾、镁、钙等，非毒性有机胺例如N，N′-二苄基乙烯二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等。

本发明的药物组合物可包含可药用抗氧化剂。可药用抗氧化剂的实例包含：水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

可用于本发明的药物组合物的适合的水性或非水性介载体的实例包含水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)，以及其适当的混合物，植物油如橄榄油，以及可注射的有机酯如油酸乙酯。例如，可以通过使用包衣材料如卵磷脂，在分散剂的情形下通过维持所需粒径，以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

这些组合物也可含有佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过上文的灭菌步骤，以及通过包含诸如对羟苯甲酸、三氯叔丁醇、酚山梨酸的多种抗细菌和抗真菌剂可确保对微生物存在的预防。可能也想要在组合物中包含等渗剂，如糖、氯化钠等。此外，可通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶而得到吸收延长的可注射药物形式。

可药用介载体包含灭菌水性溶液或分散剂以及用于即时制备灭菌注射液或分散液的灭菌粉剂。此种介质和试剂在药学活性物质中的应用是本领域已知的。除了与活性化合物不相容的以外，考虑任何常规介质或试剂它们在本发明的药物组合物中的使用。也可将补充性活性化合物加入该组物中。

治疗组合物通常必须是灭菌的以及在制造和存储条件下稳定的。该组合物可以配制成溶液、微乳剂、脂质体、或适于高药物浓度的其他有序结构。介载体可以是含有，例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、和液态聚乙二醇等)以及其适当的混合物的溶剂或分散剂介质。例如，可以通过使用包衣材料如卵磷脂，在分散剂的情形下通过维持所需粒径，以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情形下，组合物可以包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸盐和明胶而得到延长吸收的可注射组合物。

可以按照需要，通过以所需量将活性组合物加入具有上面枚举的成分之一或组合的适当的溶剂中，之后灭菌微滤来制备灭菌的可注射溶液。通常，通过将活性化合物加入含有基础分散介质和来自上面枚举的那些所需其他成分的灭菌运载体来制备分散液。在用于制备灭菌可注射溶液的灭菌粉末的情形下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，从其之前的灭菌过滤溶液中得到活性成分加其他想要的成分的粉末。

可以与介载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量将根据被治疗的受试者，以及给药的具体模式来变化。可以与介载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量将通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这一量将在约0.01％至约99％的活性成分的范围，约0.1％至约70％的范围，或约1％至约30％活性成分的范围组合可药用介载体。

调整剂量方案以提供最佳的所需应答(例如，治疗应答)。例如，可给予单次快速浓注剂量，可随时间给予若干分开的剂量或者该剂量可按治疗状况的紧急性所示来成比例减少或增加。尤其有益的是配制易于给药和剂量均匀性的剂量单元形式的胃肠外组合物。如在此使用，剂量单元形式指适于被治疗的受试者的单一剂量的物理上离散的单元；每个单元含有经计算用来生产所需的治疗效果的预定量的活性化合物，以及与之联合的需要的药学介载体。用于本发明的剂量单元形式的规格由活性化合物特有的特性以及要实现的特定治疗效果，以及化合物领域固有的限制(如治疗个体敏感性的活性化合物)来指示或者直接取决于它们。

对于本发明可溶性多肽的给药，剂量在约0.0001mg/kg的宿主体重至100mg/kg的宿主体重，以及更通常为0.01mg/kg的宿主体重至5mg/kg的宿主体重之间变化。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重，1mg/kg体重，3mg/kg体重，5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg体重的范围内。示例性的治疗方案应每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每季度一次或者每三至六个月一次。用于本发明可溶性多肽的剂量方案包含通过静脉给药，1mg/kg体重或3mg/kg体重，其使用下面的配量方案之一来给予多肽：每四周六个剂量，然后每季度；每三周；3mg/kg体重一次，随后每三周1mg/kg体重。

通常以多种时机给予可溶性多肽。单剂量之间的间隔可以例如为每周、每月、每季度或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者的可溶性多肽的血液水平来指示。在一些方法中，调节剂量以实现约1-1000μg/ml的血浆多肽浓度，在一些方法中，实现约25-300μg/ml的血浆多肽浓度。

或者，该可溶性多肽可以作为缓释制剂来给予，这种情形需要不太频繁的给药。剂量和频率基于可溶性多肽在患者中的半衰期而变化。给药剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在很长的时间段以相对不频繁的间隔给予相对低的剂量。一些患者在其余生持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要在相对短的间隔的相对高的剂量直到疾病进展降低或者停止或者直到患者显示出疾病症状的部分或完全改善。此后，可以给予患者预防性方案。

活性成分在本发明的药物组合物中的实际剂量水平可能不同以获得对于实现特定患者的所需治疗应答、组合物以及给药模式有效而对患者无毒的活性成分量。所选剂量水平将取决于多种药物动力学因素，包含所用的本发明特定组合物或其酯，盐或胺的活性、给药途径、给药时间、排泄所用特定化合物的速率、治疗的持续期、与所用组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、被治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和之前的医疗史等医学领域公知的因素。

本发明的可溶性多肽的“治疗有效剂量”可以造成疾病症状严重性的减少、无疾病症状期的频率和持续期的增加，或者由于疾病折磨造成的损伤或残疾的预防。

本发明的组合物可以通过一或多种给药途径，使用本领域已知的多种方法中的一或多种来给予。如本领域技术人员应理解，给药途径和/或模式将根据想要的结果而改变。用于本发明可溶性多肽的给药途径包含静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他胃肠外给药途径，例如通过注射或灌注。如在此使用，短语“胃肠外给药”意指除了肠内和局部以外的其他给药模式，通常是注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内、硬膜上和intrastemal注射及灌注。

替代地，本发明的可溶性多肽可以通过非注射途径(nonparenteralroute)来给予，例如局部、表皮或粘膜途径给药，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部。

活性化合物可以用保护该化合物免于快速释放的介载体来制备，例如缓释制剂，包含植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、和聚乳酸。多种制备此种制剂的方法被授予专利或者是本领域技术人员大体知晓的。参见，例如Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems，J.R.Robinson编，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

可以用本领域已知的医学器械来给予治疗组合物。例如，在一个实施方式中，本发明的治疗组合物可以用无针皮下注射器械来给予，例如美国专利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556所示的器械。可用于本发明的公知的植入物和模块的实例包括：美国专利No.4,487,603，其示出了用于以受控速度分散药物的可植入的微灌注泵；美国专利No.4,486,194，其示出了经皮给予药物的治疗器械；美国专利No.4,447,233，其示出了用于以精确的灌注速度来递送药物的药物灌注泵；美国专利No.4,447,224，其示出了用于连续药物递送的变速流可植入的灌注装置；美国专利No.4,439,196，其示出了具有多腔室的渗透药物递送系统；以及美国专利No.4,475,196，其示出了渗透药物递送系统。许多其他的此种植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。

在某些实施方式中，本发明的可溶性多肽可以制备为确保体内适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高亲水化合物。为了确保本发明的治疗化合物穿过BBB(如果需要)，可以将它们配制，例如成脂质体。对于制造脂质体的方法，参见例如美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可包含一或多个部分以选择性地被运送到特异的细胞或器官从而增强靶药物递送(参见例如V.V.Ranade，1989J.Cline Pharmacol.29：685)。示例性的靶部分包含叶酸或生物素(参见例如，Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，1988 Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等人，1995 FEBS Lett.357：140；M.Owais等人，1995 Antimicrob.Agents Chernother.39：180)；表面活性蛋白A受体(Briscoe等人，1995 Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等人，1994 J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen，1994 FEBSLett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler，1994Imrnunomethods 4：273。

本发明的应用和方法

本发明的可溶性多肽具有体外和体内诊断以及治疗的用途。例如，这些分子可以给予培养中的细胞(例如体外或体内)，或者给予受试者(例如体内)以治疗、预防或诊断多种疾病。

如在此使用，术语“受试者”旨在包含人和非人动物。非人动物包含所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物。

本方法尤其适用于治疗、预防或诊断由SIRPα+细胞介导的自体免疫和炎性病症，例如，过敏性哮喘或溃疡性结肠炎。这些包含炎性状况、过敏症和过敏状况、自体免疫疾病、缺血性疾病、严重感染、以及细胞、器官或组织移植排斥，包括细胞、组织或器官的异种移植(即从不同物种的移植，例如从非人物种到人)。

自体免疫疾病的实例包含但不限于关节炎(例如类风湿性关节炎、arthritis chronica progrediente和变形性关节炎)和风湿性疾病、包含炎性状况和风湿性疾病包含骨损失、炎性疼痛、脊柱炎包含强直性脊柱炎、莱特尔综合征、反应性关节炎、银屑病关节炎、和肠源性关节炎(enterophathisarthritis)、超敏性反应(包含气道超敏性反应和皮肤超敏性反应)和过敏症。自体免疫疾病包含自体免疫血液病(包含例如，溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞再生障碍性贫血和原发性血小板减少)、系统性红斑狼疮、炎性肌病症、多软骨炎、硬皮病、韦格纳肉芽肿、皮肌炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、银屑病、Steven-Johnson综合征、特发性口炎性腹泻、内分泌眼病、Graves病、结节病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、青少年糖尿病(I型糖尿病)、眼色素层炎(前和后)、干燥性角结膜炎和春季角膜结膜炎、间质性肺纤维化、银屑病关节炎和肾小球肾(有或无肾病综合征，例如包含特发性肾病综合征或微小病变性肾病)、肿瘤，多发性硬化、皮肤和角质层的炎性疾病、肌炎、骨植入物松动，代谢紊乱如动脉粥样硬化、糖尿病和脂血症(dislipidemia)。

本发明的可溶性多肽也可用于治疗、预防或改善哮喘、支气管炎、肺尘埃沉着病、肺气肿、以及气道的其它阻塞性或炎性疾病。

本发明的可溶性多肽也可用于治疗IgE介导的病症。IgE介导的病症包含过敏性病症，其表征为遗传性倾向以免疫地应答许多普遍天然发生的吸入性和消化性抗原以及IgE抗体的持续生产。特定的过敏性病症包含过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎和过敏性胃肠病。

然而，与升高的IgE水平相关的病症不限于具有遗传性(特应性)病因的那些。其他与升高的IgE水平相关的病症包含超敏性反应(例如，过敏性超敏性反应)、湿疹、荨麻疹、过敏性支气管肺曲霉病、寄生虫病、高IgE综合征、共济失调毛细血管扩张、Wiskott-Aldrich综合征、胸腺无淋巴发育不良、IgE骨髓瘤以及移植物对宿主反应，这些病症似乎是IgE介导的并且是可用本发明的制剂治疗的。

本发明的可溶性多肽可作为单个活性成分给予或者例如作为其他药物的佐剂结合给予或者与其他药物组合给予，例如用于治疗或预防上面提及的疾病，其他药物诸如免疫抑制或免疫调节剂或其他抗炎剂。例如，本发明的可溶性多肽可组合DMARD、例如金盐、柳氮磺吡啶、抗疟剂、氨甲蝶呤、青霉胺、硫唑嘌呤、麦考酚酸、环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司、米诺环素、来氟米特、葡萄糖皮质素；神经钙蛋白制剂、例如环孢菌素A或FK 506；淋巴细胞再循环调节剂，例如FTY720和FTY720类似物；mTOR抑制物，例如雷帕霉素、40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、CCI779、ABT578、AP23573或TAFA-93；具有免疫抑制特性的子囊霉素，例如ABT-281，ASM981等；皮质类固醇；环磷酰胺；硫唑嘌呤；氨甲蝶呤；来氟米特；咪唑立宾；霉酚酸；吗替麦考酚酯；15-脱氧精胍菌素或其免疫抑制同源物、类似物或衍生物；免疫抑制单克隆抗体，例如白细胞受体的单克隆抗体，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86或它们的配体的单克隆抗体；其他免疫调节化合物，例如具有至少部分的CTLA4胞外结构域或其突变体的重组结合分子，例如至少CTLA4的胞外部分或其突变体与非CTLA4蛋白序列的连接，例如CTLA4Ig(例如，称作ATCC 68629)或其突变体，例如LEA29Y；粘附分子抑制剂，例如LFA-1拮抗剂、ICAM-1或-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂；或化疗剂，例如紫杉醇、吉西他滨、顺铂、多柔吡星或5-氟尿嘧啶；抗TNF剂，例如TNF的单克隆抗体，例如英利昔单抗、阿达木单抗、CDP870，或TNF-RI或TNF-RII的受体构建体，例如Etanercept、PEG-TNF-RI；促炎性细胞因子阻断物、IL-1阻断物，例如Anakinra或IL-1trap、AAL160、ACZ 885、IL-6阻断物；趋化因子阻断物，例如蛋白酶的抑制物或活化物，例如金属蛋白酶，抗-IL-15抗体，抗-IL-6抗体，抗-CD20抗体，抗-CD22抗体，抗-IL17抗体，NSAIDs，例如阿司匹林或抗感染剂(列表不限于提及的试剂)。

本发明的可溶性多肽也可与抗炎症或支气管扩张药物物质结合使用作为共治疗剂，尤其用于治疗气道的阻塞性或炎性疾病，例如上文提及的那些，例如作为此种药物的治疗活性的增效剂或者作为降低此种药物的所需剂量或潜在副作用的手段。本发明的试剂可与抗炎症或支气管扩张药物在固定的药物组合物中混合或者它可以在抗炎症或支气管扩张药物之前、与之同时或之后单独给予。此种抗炎症药物包含类固醇，特别是糖皮质激素如布地奈德、倍氯米松、氟替卡松或莫美他松、以及多巴胺受体激动剂如卡麦角林、溴隐亭或罗匹尼罗。此种支气管扩张药物包含抗胆碱能药或抗毒蕈碱剂，特别是异丙托溴铵、氧托溴铵和噻托溴铵。

可使用本发明的试剂与类固醇的组合，例如，来治疗COPD或者，尤其是哮喘。可使用本发明试剂和抗胆碱能药或抗毒蕈碱剂或多巴胺受体激动剂的组合，例如，来治疗哮喘或者，尤其是COPD。

根据前述，本发明也提供治疗阻塞性或炎性气道疾病的方法，其包括给予有需要的受试者，特别是人受试者，如本文上述的可溶性多肽。在另一方面，本发明提供如本文上述的可溶性多肽在制备用于治疗阻塞性或炎性气道疾病的药物中的应用。

本发明的可溶性多肽尤其也可用于治疗、预防或改善慢性胃肠炎症，例如炎性肠病、包含克罗恩病和溃疡性结肠炎。

“慢性胃肠炎症”指胃肠道的粘膜的炎症，其表征为相对更长的发病期，是持久的(例如若干天、周、月或年以及高达受试者的寿命)，并且与单核细胞的侵入或涌入相关，以及可以进一步与自行缓解和自发性发生期相关。因此，可能期望慢性胃肠炎症受试者需要长期的监督、观察或护理。具有此种慢性炎症的“慢性胃肠炎症状况”(也称作“慢性胃肠炎性疾病”)包含但不必然限于炎性肠病(IBD)、环境伤害诱发的结肠炎(例如由诸如施用化疗、放疗等的治疗方案造成的或与之相关(例如作为副作用)的胃肠炎症(例如结肠炎))，在例如慢性肉芽肿的情况中的结肠炎(Schappi等人，Arch Dis Child.2001 February；1984(2)：147-151)、乳糜泻、口炎性腹泻(一种遗传病，其中响应称作谷蛋白的蛋白质的消化，肠内壁发炎)、食物过敏症、胃炎、传染性胃炎或肠结肠炎(例如幽门螺杆菌感染的慢性活动性胃炎)以及由传染剂造成的其他形式的胃肠炎症，以及其他相似状况。

如在此使用，“炎性肠疾病”或“IBD”指表征为所有或部分肠炎症的多种疾病中的任一种。炎性肠疾病的实例包含但不限于克罗恩病和溃疡性结肠炎。贯穿本说明书对IBD的提及通常在此说明书中指示例性的胃肠炎性状况，但不意味着限制。

根据前述，本发明也提供治疗慢性胃肠炎症或炎性肠病，例如溃疡性结肠炎的方法，其包括给予有需要的受试者，特别是人受试者，如本文上述的可溶性多肽。在另一方面，本发明提供如本文上述的可溶性多肽在制备用于治疗慢性胃肠炎症或炎性肠病的药物中的应用。

本发明也可用于治疗、预防或改善白血病或其他癌症疾病。

本发明范围内也涵盖如上所限定的方法，包括共同给予，如伴随地，或顺序给予治疗有效量的可溶性多肽和至少一种第二药物物质，所述第二药物物质是免疫抑制性/免疫调节、抗炎症化疗或抗感染的药物，例如，如上所示。

或者，一种治疗组合，例如试剂盒，其包括治疗有效量的a)本发明的可溶性多肽和b)选自免疫抑制性/免疫调节、抗炎症化疗或抗感染的药物的至少一种第二物质，例如，如上所示。该试剂盒可包含用于其给药的说明书。

当本发明的可溶性多肽与其他免疫抑制/免疫调节、抗炎症化疗或抗感染的疗法组合施予时，共同给予的组合化合物的剂量自然根据所用共同药物的类型，或者被治疗的状况等而改变。

在一个实施方式中，本发明的可溶性多肽可以用于检测CD47⁺树突细胞的水平，或者含有CD47的细胞的水平。这可以通过，例如在允许本发明的可溶性多肽与CD47表达细胞之间形成复合物的条件下，将样品(例如体外样品)和对照样品与本发明可溶性多肽接触而实现。检测任何形成的复合物并比较样品和对照。例如，可以使用本发明的化合物，进行本领域公知的标准检测方法，例如流式细胞术检测。

因此，在一个方面，本发明进一步包括检测样品中CD47(例如人CD47)的存在，或者测量CD47的量的方法，包括在允许本发明的可溶性多肽与CD47之间形成复合物的条件下，使该可溶性多肽接触该样品以及对照样品。然后检测复合物的形成，其中相比于对照样品，在该样品与对照样品间所形成的复合物差异指示样品中存在CD47。

由本发明的组合物和使用说明组成的试剂盒也在本发明范围内。该试剂盒也可以含有至少一种其他反应剂。试剂盒通常包含指示该试剂盒内容物的目的用途的标记。术语标记包含任何提供在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或者以其他方式伴随该试剂盒的书写的或记录的材料。该试剂盒可进一步包含用于诊断患者是否如上所述属于将应答治疗的一组患者的工具。

已经全面描述了本发明，进一步通过下面的实例和权利要求来说明本发明，它们都是说明性的而不意味着进一步的限制。

附图简要说明

图1、鼠SIRPα-Fc结合CD47⁺/+(WT)而不结合CD47^-/-(KO)细胞。如所述，通过流式细胞术检测结合CD47⁺/+(WT)或CD47^-/-(KO)鼠脾细胞的鼠SIRPα-Fc。SIRPα-Fc结合(SIRP)的荧光结果绘制成针对FL3的点阵图。

图2、人SIRPα-Fc结合表达CD47⁺/+的细胞(Jin8CD47)而非CD47缺陷型Jurkat T细胞(Jin8)。按所述通过流式细胞术来量化SIRPα-Fc结合。SIRPα-Fc结合(SIRP)的荧光结果以粗线绘制成柱状图。粗线表示在10ug/mL抗CD47克隆B6H12存在下的结合。

图3、在BALB/c小鼠中，阻断CD47/SIRPα引发对过敏性疾病发展的抑制。(3a)在SIRPα-Fc融合分子存在或不存在时，小鼠在第0和5天腹膜内注射OVA致敏，在第12、16和20天接受OVA雾化攻击，以及在第21天安乐死(n＝每组4至7只小鼠)。(3b)用H&E和PAS染色的未经处理的(PBS)、OVA免疫的、OVA加SIRP-α-Fc-处理的小鼠的肺切片。数据表示3个单独分析的肺。(3c)通过流式细胞术分析的不同BALF的细胞数。(3d)在第21天测量的OVA-特异的IgE的血清水平(3e)在用OVA再次体外刺激3天后在mLN细胞培养物上清中的IL-4、IL-5和IL-13水平。(3f)在第21天，通过流式细胞术评估离体分离的mLNs中的CD4+T细胞％以及生产IL-13的CD4+T细胞％。示出了三个实验中的一个代表性实验。(3g)肺外植体中的IL-4、IL-5、IL-13的释放和(h)肺外植体中的嗜酸细胞活化趋化因子释放。数据是平均值±SEM。^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01，^＊＊＊P＜0.001。

图4、SIRPα-Fc处理的BALB/c小鼠的疾病保护机制。在SIRPα-Fc融合分子存在或不存在时，小鼠在第0和5天OVA致敏，在第12、16和20天接受OVA雾化攻击，以及在第21天安乐死。(4a)在mLNs中，CD11b低CD103+和CD11b高CD103-DC(以CD11c+设门(gated on CD11c+))的亚群。数据以DC亚群％表示(n＝每组3至4只小鼠)。(4b)在SIRPα-Fc不存在(PBS)或存在时，腹膜内注射OVA-alumn接种前一天，用CFSE-标记的CD47⁺/+CD4+Tg T细胞被动转移BALB/c小鼠并且在2天后在mLNs中检测CFSE细胞稀释。数据是在每组4只小鼠上进行的一个代表性实验。(4c)在第21天，通过流式细胞术评估离体分离的mLNs中的嗜酸性粒细胞(CCR3+)的绝对值。数据是平均值±SEM(每组n＝3至4小鼠)。

图5、通过SIRPα-Fc给药对TNBS-结肠炎的保护

如所述诱导并评估结肠炎。在第0天和腹膜内注射后24h，以100ug/动物施用鼠SIRPα-Fc。或者，腹膜内注射PBS。评估动物的体重直到TNBS注射后4天，。

实施例

1、本发明可溶多肽的实施例

下表3提供了可通过重组方法，使用编码所公开的氨基酸序列的DNA，生产本发明可溶性多肽的实例。

表3：

2、亲和性测定

2.1、与CD47的亲和性

可以通过Biacore来评估人SIRPα-Fc与单体CD47或二价CD47-Fc蛋白的亲和性。CD47V-结构域与SIRPα的单价相互作用被报道为约1μM(Heatherley等人，Mol Cell.2008)。

例如，在HEK293细胞中表达带APP-标签的CD47V结构域蛋白并且与作为配体的二价-CD47-Fc蛋白进行比较。测量出与SIRPα-Fc的单价相互作用是K_D为0.8μM而二价CD47-Fc蛋白的结合强度(亲和力)增加10倍至K_D＜60nM。相比之下，不会观察到鼠CD47-Fc融合蛋白的结合，表明所评估的相互作用的特异性。

表4、通过Biacore分析测定的结合亲和性

	摩尔质量Da	对SIRPα-Fc的KD[uM]
			小鼠CD47-huFc(对照)	80805	＞10(非可检测的结合)
huCD47-huFc(二价)	81317	0.06
			huCD47-APP(单价)	16916	0.8

2.2、与鼠细胞CD47的细胞结合

在4℃，将5×10⁵来自野生型或CD47敲除小鼠的CD47⁺和CD47^-鼠脾细胞在50μl含有200μg/ml人IgG和5μg/ml鼠SIRPα-Fc的FACS BUFFER(PBS 2％ FCS 2mM EDTA)中重悬浮30min。冲洗后，在4℃用FITC-标记的链霉抗生物素(1/1000)染色细胞30min。结果显示SIRPα-Fc结合CD47⁺/+的淋巴细胞但不结合来自CD47^-/-敲除小鼠的淋巴细胞(图1)。

2.3、与人细胞CD47的细胞结合

在4℃，将5×10⁵CD47⁺和CD47^-Jurkat T细胞系在50μl含有200μg/ml人IgG和5μg/ml的SIRPα-Fc的FACS BUFFER(PBS 2％FCS 2mMEDTA)中重悬浮30min。冲洗后，在4℃用FITC-标记的链霉抗生物素(1/1000)染色细胞30min。

结果显示SIRPα-Fc结合CD47⁺/⁺Jurkat细胞的淋巴细胞(Jin8CD47)但不结合不表达CD47的Jurkat细胞(Jin8)(图2)。如由用抗CD47抗体B6H12的完全阻断所表示，与细胞的结合是特异的。

2.4、生物素化的SIRPα-Fc与CHO CD47细胞系的结合的抑制/阻断研究

替代地，可使用针对不同表位的抗-CD47mAb(即B6H12、2D3、BRIC126、IF7和10G2克隆)，不同的抗-人SIRP-α(CD172a)mAb，重组人血小板反应蛋白-1(TSP-1)或TSP-1c-末端(4N1K)和对照(4NGG)肽来进行生物素化的SIRPα-Fc与CHO CD47细胞系的结合的抑制/阻断研究。

2.5、直接标记的抗-CD47mAb与CHO CD47细胞系的结合的阻断/抑制研究

作为补充的手段，可使用非生物素化的人SIRP-α-Fc来进行直接标记的抗-CD47mAb与CHO CD47细胞系的结合的抑制/阻断研究。

也可以使用SIRPα-Fc评估生物素化的CD47^-Fc与转染有人SIRPα-Fc的L细胞结合的抑制/阻断研究。

3、SIRP-α-Fc功能检测

3.1、免疫复合物刺激的树突细胞因子释放检测

按所述(Latour等人，J of Immunol，2001：167：2547)来制备外周血单核细胞(CD14+CD16-)以及单核细胞源性树突细胞(DC)。通过FACS Aria(BD Biosciences)，常规(DC)分离为CD11c+，谱系-，使用别藻蓝蛋白(APC)-标记的抗-CD11c(B-ly6)，FITC-标记的针对谱系标记CD3、CD14、CD15、CD16、CD19和CD56的mAbs的混合物，以及APC-Cy7-标记的CD4(RPA-T4)，以达到＞99％的纯度。在无血清HB101培养基中，存在多种浓度的人SIRPα-Fc下(1至20μg/ml)，用1/40.000(Pansorbin)的金黄色葡萄球菌Cowan 1或者用可溶性CD40L(1μg/ml)和IFN-γ(500U/ml)刺激APCs。通过ELISA在24h或48h培养上清中评估细胞因子(IL-1、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-23、IL-8和TNF-α)的释放。

3.2、混合的淋巴细胞反应(MLR)检测

在本发明可溶性多肽存在(5至50μg/ml)或不存在时，以多种刺激物(DC)/应答物(T细胞)比例，将丝裂霉素c-处理的成熟DC(SAC或LPS刺激的)与同种异源的、未分级的(unfractionated)、未经处理的(CD45RA⁺CD62L^High)或记忆性(CD45RO⁺CD62L^low)成年CD4⁺T细胞(10⁶/ml)共培养。在原代培养5至6天的培养物上清中评估T细胞增殖(³H胸腺嘧啶摄取)和IFN-γ释放。

4、在鼠动物模型中使用SIRPα-Fc治疗哮喘的体内数据

在第0和5天，将吸附到1mg Imject Alum(Pierce)上的10μg OVA(Sigma，Grade V)腹膜内注射BALB/c小鼠致敏。第12、16和20天用通过震动筛孔喷雾器系统(vibrating mesh nebulizer system，Omron)递送的0.5％OVA雾化剂(Sigma，Grade V)来攻击小鼠30分钟。最后的攻击后24小时，用75mg/kg过量戊巴比妥钠处死小鼠并放血。用0.5ml生理盐水收集BAL 3次并分离肺和mLN。三分之一的肺用补充有抗生素的PBS漂洗，切成小片并放入平底24孔板中1ml补充有10％胎牛血清、500U/ml青霉素、500μg/ml链霉素、10mM HEPES缓冲液和1mM 2-ME的RPMI1640(Wisent Inc.)中培养24h。将MLN细胞(4×10⁶细胞/ml)在平底96孔板中培养并用OVA(100μ/ml)再次刺激72h。冲洗总BAL细胞、计数并用抗-CCR3PE(R&D systems)，抗-CD3 FITC(克隆145-2C11)和抗-B220 FITC(R&Dsystems)染色30分钟。如Van Rijt L.S.等人(Immunol Methods.2004May；288(1-2)：111-21)所述，发现粒性白细胞是颗粒的、非自发荧光的，缺乏CD3和B220的表达。嗜酸性粒细胞与嗜中性粒细胞的CCR3表达不同。淋巴细胞是小的，非颗粒的，非自发荧光的，表达CD3或B220的细胞以及其他包括巨噬细胞和DC的单核细胞，其缺乏CD3、B220和CCR3。为了鉴定CD亚群，首将mLN和肺先用释放酶(liberase)处理、切碎并且对细胞计数。用NH4Cl处理肺细胞悬浮液用于红血细胞裂解并且冲洗然后染色。用抗CD11c FITC(BD Biosciences)或抗-CD11c APC(克隆N418)，抗-CD11b PE(Caltag)，抗-I-Ad/I-Ed PE(BD Biosciences)，抗-GR1，抗-B220FITC(R&D systems)，120G8FITC和抗-CD103-生物素化的抗体染色细胞，随后用SA-APC或CD103PE(BD Biosciences)抗-CD47和抗-SIRP-αmAbs染色细胞。在肺中，从分析的门(gate)中排除自发荧光的肺泡巨噬细胞。为了鉴定调控性T细胞，使用抗-CD4FITC或APC(BDBiosciences)，抗-CD25PE(Caltag)或FITC(BD Biosciences)，抗-CD44APC(克隆IM7 8.1)。为了离体测量IL-13产生，首先用胞外抗-IgE-生物素化的和抗-CD117(c-Kit，BioLegend)鉴定肥大细胞和嗜碱粒细胞并且用抗-CD4 APC染色CD4 T细胞。固定细胞、渗透化并用抗-IL-13 PE(eBioscience)染色。首先针对胞外标记(抗-CD4 APC和抗-CD25 FITC)对细胞染色、固定、渗透化以及用抗-FoxP3 PE(来自eBioscience的试剂盒)染色。肥大细胞和嗜碱粒细胞+胞质内IL-13染色。在FACSCalibur或CantoII Flow Cytometer(BD Biosciences)中获得所有数据并用Cellquest或DIVA软件(BD Biosciences)进行分析。

细胞因子测量

通过ELISA，在mLNs培养物上清和肺外植体中测量IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ(BD Biosciences)、IL-13(R&D Systems)。

将来自OVA致敏的并受到攻击的小鼠的纵膈LN细胞用OVA蛋白(1mg/ml)再次体外刺激3天并且通过ELISA来量化培养物上清中的IL-4、IL-5和IL-13产生。在完全培养基中过夜培养肺外植体并且收集培养物上清来测量细胞因子释放。

结果

在鼠动物模型中使用SIRPα-Fc治疗过敏性哮喘的体内数据

CD47和SIRPα似乎是使SIRP-α+CD103-DC-引起的Th2免疫起始和永存的重要分子。因此，它们可能被治疗性地利用来减少肺炎症以及改善气道疾病。在此评估了SIRP-α+人IgG1的Fc区(SIRPα-Fc)对于过敏性气道炎症发展的效力。在OVA免疫第0和5天向BALB/c小鼠给予SIRPα-Fc(图3a)，在OVA雾化攻击后具有很少的或者没有肺组织的炎性细胞侵入(图3b)。在BALF中发生嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞的强烈减少或缺少(图3c)以及血清OVA-特异性IgE的降低(图3d)，在mLNs中，淋巴结细胞结构(cellularity)有50％降低并且IL-4、IL-5和IL-13产生受到显著抑制(图3e和f)。对于免于气道疾病发展与IL-10以及IFN-γ释放都不相关，其事实上在处理的小鼠中也受到抑制(数据未示出)。接下来检查了CD47^-和SIRPα-Fc-处理小鼠的肺外植体的培养物上清中的细胞因子和趋化因子释放，并且发现IL-5、IL-13和嗜酸细胞活化趋化因子释放受到抑制而IL-4表达保持不变(图3g和h)。

接下来探究了控制这一抑制并引起免于气道疾病的潜在机制。发现在CD47^-Fc处理小鼠中的mLNs中的SIRP-α+CD103-DC的积累减少(图4a)。给予SIRPα-Fc也造成在CD47^-Fc处理的OVA-免疫小鼠的mLNs中CFSE-标记的Tg T细胞比例减少(图4b)。最后，观察到在SIRPα-Fc-处理的小鼠的mLNs中嗜酸性粒细胞的比例和积累减少(图4c)。

这些数据表明在最初的Ag致敏作用期CD47/SIRPα的中断显著降低mLNs和肺以及IgE-依赖的气道炎症中的2型应答。

5、在鼠动物模型中使用SIRPα-Fc治疗结肠炎的体内数据

将三硝基苯磺酸(TNBS)(2或3mg)溶解于50％乙醇中并且通过3.5F导管慢慢灌注到雄性Balb/c小鼠(WT和CD47KO)的结肠。对照小鼠只给予乙醇。小鼠在每24小时称重并且在第2天(早期时间点)或第4天处死。在慢性TNBS结肠炎模型中，在第0天直肠内向小鼠慢慢灌注1.5mg的TNBS，在第7天再次进行，并且在第12天处死小鼠。收集血清、肠系膜淋巴结和结肠用于进一步分析。使用Wallace标准来宏观地对结肠评分，该标准考虑存在的腹泻、粘连、肠壁厚度以及溃疡。也使用Ameho标准针对炎症的微观标记对它们评估，该Ameho标准是基于粘膜下层的厚度、单核细胞对粘膜下层以及固有层的侵入、粘液损耗、隐窝结构的损失、以及水肿(未示出)的计分体系。就在诱发TNBS结肠炎之前以及此后24小时，腹膜内给予重组小鼠SIRPα-Fc融合蛋白(100μg/小鼠)。对照小鼠只接受生理盐水。如通过体重损失来评估，在第0天，TNBS诱发前30分钟以及第1天，注射鼠SIRPα-Fc 100μg/小鼠统计上显著地阻断疾病发展。

6、在鼠动物模型中使用SIRPα-Fc治疗关节炎的体内数据

胶原诱导的关节炎模型：

将结核分枝杆菌与Freund’s完全佐剂混合并彻底振荡(＝溶液A)。将等份牛胶原溶液与灭菌PBS在冰上充分混合(＝溶液B)。将溶液A和溶液B作为乳剂注射未经处理的DBA/1雄性小鼠。通过皮下注射灭菌过滤的氯胺酮混合物麻醉小鼠。麻醉时，刮每只小鼠的尾根部，按每只小鼠0.1ml的胶原-乳剂(含有100μg胶原)皮内注射尾基部。在第一次接种后22天第二次腹膜内注射给予100μl胶原/PBS(1∶5稀释)(＝加强剂)。按照Brand等人在Nat Protoc.2007；2(5)：1269-75所述评估疾病的隆起和评分。

7、用于实践本发明的有用氨基酸和核苷酸序列

表3：

SEQ ID	序列
		SEQ ID NO：1	野生型Sirpα前导序列
SEQ ID NO：2	野生型SirpαD1结构域序列
		SEQ ID NO：3	野生型SirpαD1-D2-D3结构域序列
SEQ ID NO：4	SirpαD1结构域多态性序列T50S
		SEQ ID NO：5	SirpαD1结构域多态性序列D95E
SEQ ID NO：6	野生型SirpαD1-D2-D3结构域多态性序列V302L
		SEQ ID NO：7	来自IgG1的野生型FC接头序列
SEQ ID NO：8	来自IgG1的FC接头突变序列(Cys被Ser替代)
		SEQ ID NO：9	来自IgG1的野生型FC接头序列
SEQ ID	序列
		SEQ ID NO：10	来自IgG1的FC接头突变序列(Cys被Ser替代)
SEQ ID NO：11	无野生型接头序列
		SEQ ID NO：12	无野生型接头序列
SEQ ID NO：13	IgG1沉默FC序列
		SEQ ID NO：14	SEQ ID：1+SEQ ID：2+SEQ ID：13
SEQ ID NO：15	SEQ ID：1+SEQ ID：2+SEQ ID：9+SEQ ID：13
		SEQ ID NO：16	SEQ ID：1+SEQ ID：2+SEQ ID：12+SEQ ID：13
SEQ ID NO：17	SEQ ID：1+SEQ ID：3+SEQ ID：7+SEQ ID：13
		SEQ ID NO：18	SEQ ID：1+SEQ ID：3+SEQ ID：8+SEQ ID：13
SEQ ID NO：19	SEQ ID：1+SEQ ID：5+SEQ ID：13
		SEQ ID NO：20	SEQ ID：1+SEQ ID：5+SEQ ID：9+SEQ ID：13
SEQ ID NO：21	SEQ ID：1+SEQ ID：6+SEQ ID：7+SEQ ID：13
		SEQ ID NO：22	SEQ ID：1+SEQ ID：6+SEQ ID：10+SEQ ID：13
SEQ ID NO：23	全长人SIRPα(NP_542970.1)
		SEQ ID NO：24	人CD47(NP_001768.1)
SEQ ID NO：25	SEQ ID NO：1的DNA编码序列
		SEQ ID NO：26	SEQ ID NO：2的DNA编码序列
SEQ ID NO：27	SEQ ID NO：3的DNA编码序列
		SEQ ID NO：28	SEQ ID NO：4的DNA编码序列
SEQ ID NO：29	SEQ ID NO：5的DNA编码序列
		SEQ ID NO：30	SEQ ID NO：6的DNA编码序列

Claims (16)

1.一种用作药物的可溶性CD47结合多肽，包含选自下组的源自SIRPα的多肽：

a)SIRPα的胞外结构域(SEQ ID NO：3)；

b)SEQ ID NO：3的片段，和

c)与SEQ ID NO：2具有至少75％同一性的SEQ ID NO：3的变体多肽；

其中所述源自SIRPα的多肽结合人CD47(SEQ ID NO：24)。

2.根据权利要求1的可溶性CD47结合多肽，其中所述可溶性CD47结合多肽以2μM或更小的K_D与人CD47结合，并且如由免疫复合物刺激的树突细胞细胞因子释放检测所测量，抑制所诱导的细胞因子分泌。

3.根据权利要求1或2的可溶性CD47结合多肽，其中所述源自SIRPα的多肽是与IgG Fc片段融合的。

4.根据权利要求1、2或3的可溶性CD47结合多肽，其中所述IgG Fc片段是突变的未糖基化的Fc片段。

5.根据前述权利要求中任一项的可溶性CD47结合多肽，其中所述SIRPα的胞外结构域包含至少SIRPα的V区(SEQ ID NO：2)。

6.根据前述权利要求中任一项的可溶性CD47结合多肽，用作治疗自身免疫和炎性病症的药物。

7.根据权利要求1-6中任一项的可溶性CD47结合多肽，用作药物来治疗

a)Th2-介导的气道炎症；

b)过敏性病症；

c)哮喘；

d)炎性肠病；

e)关节炎；

f)缺血性疾病；或

g)白血病或癌症。

8.根据权利要求1-7中任一项的可溶性CD47结合多肽，其中所述多肽基本上由与人IgG的Fc片段融合的SIRPα的胞外结构域组成。

9.包含根据权利要求1-8中任一项的可溶性CD47结合多肽的至少两种的蛋白质。

10.包含根据权利要求1-8中任一项的可溶性CD47结合多肽或根据权利要求9的蛋白质的药物组合物。

11.权利要求10的药物组合物，与一或多种的可药用赋形剂、稀释剂或介载体组合。

12.编码根据权利要求1-8中任一项的可溶性CD47结合多肽的分离的核酸。

13.包含根据权利要求12的一或多种核酸的克隆或表达载体。

14.根据权利要求13的克隆或表达载体，其包含SEQ ID NO：25或26的至少一种核酸。

15.包含根据权利要求13或14的一或多种克隆或表达载体的宿主细胞。

16.根据权利要求15的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO细胞。

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