TWI508973B - 親和力成熟之ＣＲＩｇ變體 - Google Patents

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Description

親和力成熟之CRIg變體
本發明係關於親和力成熟之CRIg變體。特定言之，本發明係關於相較於C3而言對C3b之結合親和力有所增強且保持對C3b之選擇性結合的CRIg變體。
本申請案主張2008年8月20日申請之美國臨時專利申請案第61/189,653號及2008年5月6日申請之美國臨時專利申請案第61/050,888號之權利，該等專利申請案之揭示內容係以全文引用之方式併入本文中。
補體系統
補體系統為由通常以非活性酶原形式存在之一系列血清醣蛋白組成的複雜酶級聯系統。三種主要路徑(亦即經典路徑、替代路徑及甘露糖結合凝集素路徑)可活化補體，三者在C3之層面上可合併至一起，其中兩種類似之C3轉化酶使C3分裂成C3a及C3b。
巨噬細胞為已顯現能識別細胞表面表現之鑑別標記(所謂分子模式)的細微結構差異之先天能力的專門細胞(Taylor等人，Eur J Immunol 33,2090-1097(2003)；Taylor等人，Annu Rev Immunol 23,901-944(2005))。雖然此等表面結構之直接識別為先天免疫之一基本態樣，但調理作用允許一般巨噬細胞受體可介導吞噬(engulfment)，此使吞噬細胞之功效增加且使吞噬細胞之識別譜系多樣化(Stuart及Ezekowitz,Immunity 22,539-550(2005))。吞噬作用之過程涉及多種配體-受體相互作用，且現已清楚，各種調理素(opsonin)(包括免疫球蛋白、膠凝素(collectin)及補體組分)經由與巨噬細胞表面受體相互作用而引導為病原體內化所需之細胞活性(綜述於Aderem及Underhill,Annu Rev Immunol 17 ,593-623(1999)；Underhill及Ozinsky,Annu Rev Immunol 20 ,825-852(2002))。雖然由生殖系基因編碼之天然免疫球蛋白可識別多種病原體，但大部分調理IgG係經由適應性免疫而形成，且因此經由Fc受體達成之有效清除並非立即的(Carroll,Nat Immunol 5 ,981-986(2004))。另一方面，補體可快速識別病原體表面分子且使粒子致敏以便由補體受體吸收(Brown,Infect Agents Dis 1 ,63-70(1991))。
補體由超過30種可調理多種病原體以便由補體受體識別之血清蛋白組成。視級聯之初始觸發而定，可辨別出三種路徑(綜述於(Walport,N Engl J Med 344 ,1058-1066(2001))。所有三種路徑皆具有活化中心組分C3之共同步驟，但其根據識別性質及引起C3活化之初始生物化學步驟而有所不同。經典路徑係由與病原體表面結合、又與C1q補體組分結合之抗體活化，從而引發絲胺酸蛋白酶級聯，最終使C3分裂為其活性形式C3b。凝集素路徑係在由凝集素蛋白識別碳水化合物基元之後活化。此路徑之三個成員迄今已被鑑別：甘露糖結合凝集素(MBL)、凝集素之SIGN-R1家族及纖維膠凝蛋白(Pyz等人，Ann Med 38 ,242-251(2006))。MBL與纖維膠凝蛋白均與絲胺酸蛋白酶有關，其如同經典路徑中之C1般起作用，活化組分C2及C4，產生中心C3步驟。替代路徑與經典路徑及凝集素路徑之區別在於替代路徑係由於內部C3酯與病原體表面上之識別基元直接反應而活化。經由替代路徑蛋白酶因子B及因子D之作用，最初C3結合至活化表面引起C3b沈積之快速擴增。重要的是，經由因子B及D之作用，藉由經典路徑或凝集素路徑所沈積之C3b亦會引起C3b沈積之擴增。在補體活化之所有三種路徑中，關鍵性調理步驟為使組分C3轉化為C3b。補體級聯中之酶使C3分裂可使硫酯暴露於親核攻擊，從而允許C3b經由硫酯域共價連接於抗原表面上。在補體調理作用中，此為初始步驟。所結合之C3b隨後發生蛋白質水解反應，產生可由不同受體識別之iC3b、C3c及C3dg片段(Ross及Medof,Adv Immunol 37 ,217-267(1985))。此裂解會消除C3b進一步擴增C3b沈積及活化補體級聯之後期組分(包括能夠直接損害膜之膜攻擊複合物)的能力。然而，巨噬細胞吞噬受體優先識別C3b及其片段；由於酯鍵形成之方式多種多樣，因此C3介導之調理作用對於病原體識別而言係重要的(Holers等人，Immunol Today 13 ,231-236(1992))，且因此不同C3降解產物之受體在宿主免疫反應中起重要作用。
C3本身為一種由13個不同結構域組成之複雜撓性蛋白質。分子核心係由8個所謂巨球蛋白(MG)結構域組成，此等結構域構成C3之緊密堆積之α鏈及β鏈。此結構中插有CUB(C1r/C1s、Uegf及骨形成蛋白-1)及TED域，後者含有允許C3b與病原體表面共價結合之硫酯鍵。剩餘結構域含有C3a或充當核心結構域之連接子及間隔基。C3b及C3c結構與C3之比較展示，在各自蛋白質水解作用下分子經歷較大之構型重排，此不僅暴露TED，而且使可與細胞受體相互作用之分子之其他新表面暴露(Janssen及Gros,Mol Immunol 44 ,3-10(2007))。
吞噬細胞上之補體C3受體
存在三個已知之補體受體基因超家族：編碼CR1及CR2、β-2整合素家族成員CR3及CR4以及免疫球蛋白Ig-超家族成員CRIg之短一致重複序列(SCR)模組。
CR1為由30個短一致重複序列(SCR)組成之180-210kDa醣蛋白且在免疫複合物清除中起重要作用。SCR為具有約60個胺基酸之模組結構，各自具有兩對二硫鍵，從而提供結構剛度。經由兩個各自由3個SCR組成之獨特位點發生與C3b及C4b之高親和力結合(綜述於Krych-Goldberg及Atkinson,Immunol Rev 180 ,112-122(2001))。CR1之SCR 15-17(位點2)內所含的C3b結合位點之結構已藉由MRI測定(Smith等人，Cell 108 ,769-780(2002))，該MRI揭示出三個模組呈延長之頭尾排列形式，其在16-17接合點處具有撓性。結構引導性突變誘發可確定模組15上對C4b結合而言關鍵之帶正電荷表面區域。此小片區域以及在CR1之同一面上所暴露的模組16之鹼基側鏈係C3b結合所必需的。最初描述為免疫黏附受體(Rothman等人，J Immuno l115 ,1312-1315(1975))之CR1之主要功能係捕獲紅血球上之IC以便藉由肝轉運並清除(Taylor等人，Clin Immunol Immunopathol 82 ,49-59(1997))。對於嗜中性白血球上而非組織巨噬細胞中之CR1而言，在吞噬中起著一定作用(Sengelov等人，J Immunol 153 ,804-810(1994))。除在免疫複合物清除中之作用外，CR1經由其與相應轉化酶之相互作用亦為經典路徑與替代路徑活化之強抑制劑(Krych-Goldberg及Atkinson,2001，同上 ；Krych-Goldberg等人，J Biol Chem 274 ,31160-31168(1999))。在小鼠中，CR1及CR2為藉由替代性剪接所形成之同一基因之兩種產物且主要與B-淋巴細胞及濾泡性樹突狀細胞相關且主要發揮調節B細胞反應之功能(Molina等人，1996)。CR1之小鼠功能等效物Crry可使經典路徑及替代路徑酸失活且充當補體活化之內在調節劑而非充當吞噬細胞受體(Molina等人，Proc Natl Acad Sci USA 93 ,3357-3361(1992))。
CR2(CD21)結合iC3b及C3dg且為可增強B細胞免疫力之主要補體受體(Carroll,Nat Immunol 5 ,981-986(2004);Weis等人，Proc Natl Acad Sci USA 81 ,881-885(1984))。由同源B細胞經由B細胞抗原受體吸收塗有C3d之抗原引起信號增強。因此，CD21-CD19-CD81共受體(coreceptor)與B細胞抗原受體之共接合使B細胞活化之臨限值降低且提供重要的存活信號(Matsumoto等人，J Exp Med 173 ,55-64(1991))。iC3b上之CR2結合位點已部分地定位於TED與MG1域之間的界面上(Clemenza及Isenman,J Immunol 165 ,3839-3848(2000))。
CR3及CR4為由α亞單位(分別為CD11b或αM 及CD11c或αX )及共同β鏈(CD18或β2 )組成之跨膜異二聚體，且涉及黏著至細胞外基質及其他細胞以及識別iC3b。其屬於整合素家族且不僅在吞噬作用中、而且在白血球運輸及遷移、突觸形成及共刺激中發揮功能(綜述於(Ross,Adv Immunol 37 ,217-267(2000))。整合素黏著性係經由稱為內向外信號轉導之過程調節，從而使整合素由低親和力結合狀態轉化為高親和力結合狀態(Liddington及Ginsberg,J Cell Biol 158 ,833-839(2002))。此外，配體結合使信號自胞外域轉導至細胞質。iC3b之結合位點已定位於CR3及CR4之α鏈上之若干結構域(Diamond等人，J Cell Biol 120 ,1031-1043(1993)；Li及Zhang,J Biol Chem 278 ,34395-34402(2003)；Xiong及Zhang,J Biol Chem 278 ,34395-34402(2001))。CR3之多種配體(iC3b、β-葡聚糖及ICAM-1)似乎結合至CD11b之I域內所含的部分重疊位點(Balsam等人，1998；Diamond等人，1990；Zhang及Plow,1996)。基於針對在C3b之CUB域展開後變得暴露(藉由補體調節性蛋白酶因子I使α'鏈分裂後發生)之殘基定位CR3結合位點的結構性研究(Nishida等人，Proc Natl Acad Sci USA 103 ,19737-19742(2006))，預測其特異性識別C3b、iC3b之蛋白質裂解失活形式。
CRIg為與A33抗原及JAM1同源且為自血流中清除病原體所需之巨噬細胞相關受體。人類CRIg蛋白最初係使用識別人類JAM1之保守Ig域之簡併引子自人類胎兒cDNA文庫中選殖。若干純系之測序顯示具有400個胺基酸之開放閱讀框架。Blast搜尋證實與Z39Ig(l型跨膜蛋白)類似(Langnaese等人，Biochim Biophys Acta 1492(2000)522-525)。已發現此分子之胞外區係由兩個Ig樣域(包含N-末端V-set域及C-末端C2-set域)組成。其新穎之人類蛋白質最初係命名為「與巨噬細胞相關之單跨膜Ig超家族成員」(huSTIgMA)。隨後，使用3'及5'引子選殖huSTIgMA之剪接變體，此變體缺乏膜近側IgC域且短了50個胺基酸。因此，將此人類蛋白質之較短剪接變體命名為huSTIgMAshort。huSTIgMA(稱作PRO362)之胺基酸序列及編碼聚核苷酸序列揭示於2002年6月25日頒布之美國專利第6,410,708號中。此外，huSTIgMA與huSTIgMAshort以及鼠類STIgMA(muSTIgMA)蛋白及核酸序列揭示於2004年4月15日公開之PCT公開案WO 2004031105中。
CRIg及C3b:CRIg複合物之晶體結構揭示於2008年2月21日公開之美國申請公開案第2008/0045697號中。
駐留於肝竇狀隙之內腔內的庫弗氏細胞(Kupffer cell；KC)形成體內之最大巨噬細胞群體。儘管KC具有與其他組織駐留的巨噬細胞一樣之標記，但其發揮特定功能，此等功能適於有效清除自消化道之微血管系統排出之存在於門靜脈血液中的腸源性細菌、微生物碎屑、細菌內毒素、免疫複合物及死細胞(Bilzer等人，Liver Int 26 ,1175-1186(2006))。病原體有效結合至KC表面為第一線免疫防禦病原體之關鍵步驟(Benacerraf等人，J Exp Med 110 ,27-48(1959))。KC使病原體自循環系統中快速清除之中心作用可由缺乏KC之小鼠之死亡率的明顯增加來說明(Hirakata等人，Infect Immun 59 ,289-294(1991))。CRIg之鑑別進一步突出補體及KC在第一線免疫防禦循環病原體中之關鍵作用。
於小鼠KC上鑑別出之僅有的補體C3受體為CRIg及CR3(Helmy等人，Cell 124 ,915-927(2006))，而人類KC顯示CR1及CR4之額外表現(Hinglais等人，1989)。KC上之CRIg與CR3促進活體外結合至iC3b調理粒子(Helmy等人，Lab Invest 61 ,509-514(2006))。KC表現之CR3在活體內結合至塗有iC3b之病原體中的作用尚未清楚。已提出CR3經由嗜中性白血球之募集及與嗜中性白血球表現之ICAM1之相互作用間接地促進病原體之清除(Conlan及North,Exp Med 179 ,259-268(1994)；Ebe等人，Pathol Int 49 ,519-532(1999)；Gregory等人，J Immunol 157 ,2514-2520(1996)；Gregory及Wing,J Leukoc Biol 72 ,239-248(2002)；Rogers及Unanue,Infect Immun 61 ,5090-5096(1993))。相比之下，CRIg藉由捕獲通過肝竇狀隙內腔之病原體而發揮直接作用(Helmy等人，2006，同上 )。CRIg與CR3之生物學差異可部分地由此等兩種受體之結合特性之差異來反應。KC上所表現之CRIg組成性地結合至單體C3片段，而CR3僅結合至iC3b調理粒子(Helmy等人，2006，同上 )。CRIg有效捕獲單體C3b及iC3b以及塗有C3b/iC3b之粒子的能力反映出由在巨噬細胞之膜突起部分之頂端處所集中之CRIg分子(Helmy等人，2006，同上 )與病原體表面上所存在之C3b及iC3b之多聚體之間的多價相互作用所產生之增強之親和力。CR3僅結合塗有iC3b之粒子，而CRIg另外結合至C3b(其為血清調理病原體上所形成之最初的C3分裂產物)(Croize等人，Infect Immun 61 ,5134-5139(1993))。因為結合至病原體表面之大量C3b分子經因子H及I保護而免於分裂(Gordon等人，J Infect Dis 157 ,697-704(1988))，所以由CRIg識別C3b配體可確保快速結合及清除。因此，雖然CRIg與CR3均表現於KC上，但其展示不同的配體特異性、不同的結合特性及不同的病原體清除動力學概況。
利用細胞表面受體進入細胞之病原體的實例為病毒，如人類免疫缺乏病毒(HIV)；及細胞內細菌，如結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosum )、麻瘋分枝桿菌(Mycobacterium leprae )、假結核耶爾森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium )及單核球增多性李氏菌(Listeria Monocytogenes )；及寄生蟲，如類前氣門亞目(prostigmatoid)碩大利什曼原蟲(Leishmania major )(Cossart 及Sansonetti,Science 304：242-248(2004)；Galan,Cell 103：363-366(2000)；Hornef等人，Nat.Immunol. 3：1033-1040(2002)；Stoiber等人，Mol.Immunol. 42：153-160(2005))。
如上所論述，CRIg為最近發現之表現於組織駐留巨噬細 胞亞群體上的補體C3受體。除作為C3蛋白之補體受體起作用以外，CRIg之細胞外IgV域亦藉由結合至C3b且抑制C3及C5之蛋白質水解活化來選擇性地抑制補體之替代路徑。然而，轉化酶亞單位C3b之CRIg結合親和力低(IC50>1μM)，因此需要蛋白質濃度相對較高以達成接近完全之補體抑制。因此，需要具有改良之治療功效的CRIg多肽。本發明提供此等多肽。
本發明至少部分係基於具有增強之結合親和力的CRIg變體之構建。具有組合之胺基酸取代Q64R與M86Y的CRIg-ECD蛋白相較於野生型CRIg變體而言展示強30倍之結合親和力及高7倍之補體抑制活性。此外，在小鼠關節炎模型中用親和力提高之CRIg融合蛋白處理與用野生型CRIg蛋白處理相比使得臨床評分顯著減小。
因此，本發明係關於CRIg變體。
在一態樣中，本發明係關於一種在選自由SEQ ID NO：68之胺基酸序列之E8-K15、R41-T47、S54-Q64、E85-Q99及Q105-K111組成之群的區域中包含胺基酸取代之CRIg變體。
在一項實施例中，該變體結合C3b或其片段之選擇性超過C3。
在另一項實施例中，相較於SEQ ID NO：68之天然序列人類CRIg而言，該變體對C3b具有增強之結合親和力，其中結合親和力可(例如)增強至少2倍，或至少3倍，或至少4 倍，或至少5倍，或至少6倍，或至少7倍，或至少9倍，或至少10倍，或至少15倍，或至少20倍，或至少30倍，或至少40倍，或至少50倍，或至少70倍，或至少80倍，或至少90倍，或至少100倍。
在另一項實施例中，該變體為比SEQ ID NO：68之天然序列人類CRIg更強的替代補體路徑抑制劑。
在另一項實施例中，該變體在選自由SEQ ID NO：68之胺基酸序列中之位置8、14、18、42、44、45、60、64、86、99、105及110組成之群的一或多個胺基酸位置處包含胺基酸取代。
在另一項實施例中，該變體在SEQ ID NO：68之胺基酸序列中之胺基酸位置60、64、86、99、105及110的一或多者處包含胺基酸取代。
在另一項實施例中，該變體包含選自由以下者組成之群之一或多個取代：E8W、W14F、E84Y/W14F；P45F；G42D/D44H/P45F；Q60I；Q64R；Q60I/Q64R；M86Y；M86W、M86F、M86W/Q9R；M86F/Q99R；K110D、K11N；Q105R/K110N；Q105R/K110Q；及Q105K/K110D。
在另一項實施例中，該變體包含選自由以下者組成之群之一或多個取代：Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/E8Y；Q60I/Q64R/G42D；Q60I/Q64R/P45F；Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F；Q60I/Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/Q105R；Q60I/Q64R/Q105K；Q60I/Q64R/K110N；Q60I/Q105R/K110N；M86Y/E8Y；M86Y/G42D/D44H/P45F；M86Y/P45F； M86Y/G42D/D44H/P45F；及M86Y/Q99K/M86Y/Q99R/M86Y/Q105R/M86Y/Q105K/M86Y/Q105R/K110N。
在另一項實施例中，該變體包含選自由以下者組成之群之一或多個取代：Q60I；Q64R；Q60I/Q64R；M86Y；Q99L；Q105K/K110D；E8W/Q105R/K110N；Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/E8Y；Q60I/Q64R/G42D；Q60I/Q64R/P45F；Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F；Q60I/Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/Q105R；Q60I/Q64R/Q105K；Q60I/Q64R/K110N；M86Y/P45F；及M86Y/Q105K。
在一項更特定之實施例中，該變體包含Q60I/Q64R/M86Y或Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F取代。
在另一態樣中，本發明係關於一種包含如本文中定義之CRIg變體的嵌合體。
在一項實施例中，該嵌合分子為免疫黏附素。
在另一項實施例中，該免疫黏附素包含比SEQ ID NO：68之全長CRIg短的CRIg變體。
在另一項實施例中，該嵌合分子包含CRIg胞外域。
在另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其包含CRIg變體或嵌合分子(例如本發明之免疫黏附素)與醫藥學上可接受之賦形劑的混合物。
在另一態樣中，本發明係關於一種預防或治療補體相關性疾病或病狀之方法，該方法包含向需要此治療之個體投與預防性或治療性有效量之CRIg變體或包含此變體之嵌合分子(諸如免疫黏附素)。
在一項實施例中，補體相關性疾病為發炎性疾病或自體免疫性疾病。
在另一項實施例中，補體相關性疾病係選自由以下者組成之群：類風濕性關節炎(RA)、成人呼吸窘迫症候群(ARDS)、缺血及再灌注後之遠端組織損傷、心肺繞道手術期間之補體活化、皮肌炎、天疱瘡、狼瘡腎炎以及所致之絲球體腎炎及血管炎、心肺繞道術、心臟麻痹誘導之冠脈內皮功能障礙、II型膜增生性絲球體腎炎、IgA腎病、急性腎衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂症候群、年齡相關性黃斑變性、葡萄膜炎、糖尿病性視網膜病變、同種異體移植、超急性排斥反應、血液透析、慢性阻塞性肺病症候群(COPD)、哮喘、吸入性肺炎、蕁麻疹、慢性特發性蕁麻疹、溶血性尿毒癥症候群、子宮內膜異位、心因性休克、缺血再灌注損傷及多發性硬化(MS)。
在另一實施例中，補體相關性疾病係選自由以下者組成之群：發炎性腸病(IBD)、全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、青少年慢性關節炎、脊椎關節病、全身性硬化症(硬皮症)、特發性發炎性肌病(皮肌炎、多發性肌炎)、休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、全身性血管炎、肉狀瘤病、自體免疫性溶血性貧血(免疫性全血球減少症、陣發性夜間血紅素尿症)、自體免疫性血小板減少症(特發性血小板減少性紫癜、免疫介導性血小板減少症)、甲狀腺炎(格雷氏病(Grave's disease)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、青少年淋巴球性甲狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎)、糖尿病、免疫介導性腎病(絲球體腎炎、腎小管間質腎炎)、中樞及周邊神經系統之脫髓鞘疾病(諸如多發性硬化症)、特發性多發性神經病、肝膽疾病(諸如傳染性肝炎(A、B、C、D、E型肝炎及其他非嗜肝病毒)、自體免疫性慢性活動性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎及硬化性膽管炎)、發炎性及纖維化肺疾病(例如囊腫性纖維化)、麩質敏感性腸病變、惠普爾氏病(Whipple's disease)、自體免疫性或免疫介導性皮膚病(包括大皰性皮膚病、多形性紅斑及接觸性皮炎)、牛皮癬、肺之過敏性疾病(諸如嗜伊紅性肺炎、特發性肺纖維化及過敏性肺炎)、移植相關疾病(包括移植物排斥反應、移植物抗宿主疾病)、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、陣發性夜間血紅素尿症、遺傳性血管水腫、動脈粥樣硬化症及II型膜增生性絲球體腎炎。
在一項較佳實施例中，補體相關性疾病為類風濕性關節炎(RA)。
在另一項較佳實施例中，補體相關性疾病為補體相關性眼睛病狀。
在另一項實施例中，補體相關性眼睛病狀係選自由以下者組成之群：年齡相關性黃斑變性(AMD)之所有階段、葡萄膜炎、糖尿病性及其他缺血相關性視網膜病、眼內炎及其他眼內新生血管性疾病。
在另一項實施例中，眼內新生血管性疾病係選自由以下者組成之群：糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、逢希伯-林道疾病(von Hippel-Lindau disease)、眼組織胞漿菌病、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)、角膜新生血管及視網膜新生血管。
在另一項實施例中，補體相關性眼睛病狀係選自由年齡相關性黃斑變性(AMD)、脈絡膜新生血管(CNV)、糖尿病性視網膜病變(DR)及眼內炎組成之群，其中AMD包括濕性與乾性或萎縮性AMD。
在一項實施例中，患者為哺乳動物，較佳為人類。
在另一態樣中，本發明係關於一種抑制哺乳動物中C3b補體片段之產生的方法，該方法包含將有效量之本發明之CRIg變體或包含此變體之免疫黏附素投與該哺乳動物。
在另一態樣中，本發明係關於一種選擇性抑制哺乳動物體內之替代補體路徑的方法，該方法包含將有效量之本發明之CRIg變體或包含此變體之免疫黏附素投與該哺乳動物。
I.定義
術語「CRIg」、「PRO362」、「JAM4」與「STIgMA」可互換使用且係指天然序列及變體CRIg多肽。
「天然序列」CRIg為無論製備模式如何均具有與來源於自然界之CRIg多肽相同之胺基酸序列的多肽。因此，天然序列CRIg可自自然界中分離或可藉由重組及/或合成方法製備。術語「天然序列CRIg」特定言之涵蓋天然存在之截短型或分泌型CRIg(例如胞外域序列)、天然存在之變體型CRIg(例如，替代剪接型)及天然存在之CRIg對偶基因變體。天然序列CRIg多肽特定言之包括具有或不具有N-末端信號序列、在SEQ ID NO:2之位置1處具有或不具有起始甲硫胺酸及在SEQ ID NO:2之大致胺基酸位置277至307處具有或不具有任何或全部跨膜域的SEQ ID NO:2之全長399個胺基酸長的人類CRIg多肽(huCRIg，圖1A及1B中所示)。在另一項實施例中，天然序列CRIg多肽為具有或不具有N-末端信號序列、在SEQ ID NO:4之位置1處具有或不具有起始甲硫胺酸及在SEQ ID NO:4之大致位置183至213處具有或不具有任何或全部跨膜域的人類CRIg之305個胺基酸的短形式(huCRIg-短，SEQ ID NO:4，圖2A及2B中所示)。在一項不同的實施例中，天然序列CRIg多肽為具有或不具有N-末端信號序列、在SEQ ID NO:6之位置1處具有或不具有起始甲硫胺酸及在SEQ ID NO:6之大致胺基酸位置181至211處具有或不具有任何或全部跨膜域的SEQ ID NO:6之280個胺基酸長的全長鼠類CRIg多肽(muCRIg，圖3A-3C中所示)。在此定義內特定言之包括其他非人類動物(包括高級靈長類動物及哺乳動物)之CRIg多肽。
CRIg「胞外域」或「ECD」係指CRIg多肽之一種形式，其基本上不含相應全長分子之跨膜域及細胞質域。通常，CRIg ECD具有不及1%之此等跨膜域及/或細胞質域且較佳具有不及0.5%之此等域。CRIg ECD可包含SEQ ID NO:2、4或6之胺基酸殘基1或約21至X，其中X為SEQ ID NO:2中之約271至281之任何胺基酸、SEQ ID NO:4中之約178至186之任何胺基酸及SEQ ID NO：6中之約176至184之任何胺基酸。
如本文中所使用之術語「CRIg變體」意謂與天然序列CRIg多肽具有至少約80%胺基酸序列一致性且如下文所定義之活性CRIg多肽，其包括(但不限於)各自具有或不具有N-末端起始甲硫胺酸、具有或不具有N-末端信號序列、具有或不具有跨膜域之全部或部分及具有或不具有胞內域的全長huCRIg(SEQ ID NO：2)、huCRIg-短(SEQ ID NO：4)及muCRIg(SEQ ID NO：6)。在一項特別實施例中，CRIg變體與SEQ ID NO：2之序列範圍內之成熟全長多肽具有至少約80%胺基酸序列同源性。在另一項實施例中，CRIg變體與SEQ ID NO：4之序列範圍內之成熟全長多肽具有至少約80%胺基酸序列同源性。在另一項實施例中，CRIg變體與SEQ ID NO：6之序列範圍內之成熟全長多肽具有至少約80%胺基酸序列同源性。通常，CRIg變體與SEQ ID NO：2、4或6內之成熟胺基酸序列具有至少約80%胺基酸序列一致性，或至少約85%胺基酸序列一致性，或至少約90%胺基酸序列一致性，或至少約95%胺基酸序列一致性，或至少約98%胺基酸序列一致性，或至少約99%胺基酸序列一致性。在整個說明書(包括實例)中，術語「野生型」或「WT」係指人類CRIg之成熟全長短形式(CRIg(S))(SEQ ID NO：4)，且CRIg變體中之胺基酸殘基之編號係指SEQ ID NO：4之序列。
本發明之CRIg變體為如下文所定義之CRIg激動劑。特 定而言，相較於對C3，本文中之CRIg變體維持選擇性結合於C3b，其中「選擇性結合」係用於指與C3b結合，但不與C3結合。此外，在一個較佳實施例中，本發明之CRIg變體相對於天然序列CRIg多肽(諸如CRIg之人類長形式(SEQ ID NO：68))對C3b具有增強之結合親和力。在多個實施例中，相對於SEQ ID NO：68之天然序列人類CRIg多肽，結合親和力增強至少約2倍，或至少約3倍，或至少約4倍，或至少約5倍，或至少約6倍，或至少約7倍，或至少約8倍，或至少約9倍，或至少約10倍，或至少約15倍，或至少約20倍，或至少約25倍，或至少約30倍，或至少約35倍，或至少約40倍，或至少約45倍，或至少約50倍，或至少約55倍，或至少約60倍，或至少約65倍，或至少約70倍，或至少約75倍，或至少約80倍，或至少約85倍，或至少約90倍，或至少約95倍，或至少約100倍。在其他實施例中，相對於SEQ ID NO：68之天然序列人類CRIg多肽，對C3b之結合親和力增強約5-10倍，或約5-15倍，或約5-20倍，或約5-25倍，或約5-25倍，或約5-30倍，或約5-35倍，或約5-40倍，或約5-45倍，或約5-50倍，或約5-55倍，或約5-60倍，或約5-65倍，或約5-70倍，或約5-75倍，或約5-80倍，或約5-85倍，或約5-90倍，或約5-95倍，或約5-100倍。
本文中關於CRIg變體之「胺基酸序列一致性百分比(%)」係定義為在比對序列且必要時引入缺口(gaps)以達成最大序列一致性百分比且不將任何保守性取代視作序列一致性之一部分後，CRIg變體序列中之胺基酸殘基與其所對比之天然CRIg序列中之胺基酸殘基一致之百分比。對於長度不同之序列而言，序列一致性百分比係相對於較長序列沿著較長序列之全長測定。為測定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以此項技術內之各種方法，例如使用公開可得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體達成。熟習此項技術者可確定適用於測量比對之參數，包括在所比較序列之全長上達成最大比對所需的任何演算法。接著相對於較長序列計算序列一致性，亦即，即使較短序列顯示與較長序列之一部分100%序列一致，但總序列一致性仍小於100%。
本文中關於經鑑別之CRIg變體編碼序列的「核酸序列一致性百分比(%)」係定義為在比對序列且必要時引入缺口以達成最大序列一致性百分比之後候選序列中相應地與CRIg變體編碼序列中之核苷酸一致的核苷酸之百分比。出於測定核酸序列一致性百分比之目的，比對可以屬於此項技術技能範圍內之多種方法(例如使用公開可獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體)達成。熟習此項技術者可確定適用於量測比對之參數，包括在所比較之序列之全長上達成最大比對所需的任何演算法。接著相對於較長序列計算序列一致性，亦即，即使較短序列顯示與較長序列之一部分100%序列一致，但總的序列一致性仍小於100%。
無論鑑別模式或製備模式如何，在CRIg變體之定義中皆包括如上文中所定義之所有胺基酸序列變體。特定言之，本文中包括已藉由取代、化學方式、酶促方式或其他適當方式修飾、具有不同於天然存在之胺基酸之部分的變體，只要其保持天然序列CRIg之定性生物學性質即可。例示性非天然存在之胺基酸取代包括下文中所述之彼等取代。
胺基酸殘基可分為四大類：酸性：殘基在生理性pH值下因失去H離子而具有負電荷且殘基被水溶液吸引以便當含有其之肽處於水溶液中時找出其在該肽之構形中的表面位置。
鹼性：殘基在生理性pH值下因與H離子結合而具有正電荷且殘基被水溶液吸引以便當含有其之肽處於生理性pH值之水性介質中時找出其在該肽之構形中的表面位置。
中性/非極性：殘基在生理性pH值下不帶電荷且殘基被水溶液排斥以便當含有其之肽處於水性介質中時找出其在該肽之構形中的內部位置。此等殘基亦被稱為「疏水性殘基」。
中性/極性：殘基在生理性pH值下不帶電荷，但殘基被水溶液吸引以便當含有其之肽處於水性介質中時找出其在該肽之構形中的外部位置。
胺基酸殘基就其側鏈基團而言可進一步分類為環狀或非環狀、芳族或非芳族殘基，此等名稱為熟習此項技術者所共知。
並非由遺傳密碼編碼之常見胺基酸包括：2-胺基己二酸(Aad)(對於Glu及Asp而言)；2-胺基庚二酸(Apm)(對於Glu及Asp而言)；2-胺基丁酸(Abu)(對於Met、Leu及其他脂族胺基酸而言)；2-胺基庚酸(Ahe)(對於Met、Leu及其他脂族胺基酸而言)；2-胺基異丁酸(Aib)(對於G1y而言)；環己基丙胺酸(Cha)(對於Val及Leu及Ile而言)；高精胺酸(Har)(對於Arg及Lys而言)；2,3-二胺基丙酸(Dpr)(對於Lys、Arg及His而言)；N-乙基甘胺酸(EtGly)(對於Gly、Pro及Ala而言)；N-乙基甘胺酸(EtGly)(對於Gly、Pro及Ala而言)；N-乙基天冬醯胺(EtAsn)(對於Asn及Gln而言)；羥基離胺酸(Hyl)(對於Lys而言)；別羥基離胺酸(AHyl)(對於Lys而言)；3-羥基脯胺酸及4-羥基脯胺酸(3Hyp、4Hyp)(對於Pro、ser及Thr而言)；別異白胺酸(AIle)(對於Ile、Leu及Val而言)；ρ-甲脒基苯丙胺酸(對於Ala而言)；N-甲基甘胺酸(MeGly，肌胺酸)(對於Gly、Pro及Ala而言)；N-甲基異白胺酸(MeIle)(對於Ile而言)；正纈胺酸(Nva)(對於Met及其他脂族胺基酸而言)；正白胺酸(Nle)(對於Met及其他脂族胺基酸而言)；鳥胺酸(Orn)(對於Lys、Arg及His而言)；瓜胺酸(Cit)及甲硫胺酸亞碸(MSO)(對於Thr、Asn及Gln而言)；N-甲基苯丙胺酸(MePhe)、三甲基苯丙胺酸、鹵代(F、Cl、Br及I)苯丙胺酸、三氟苯丙胺酸(對於Phe而言)。
如本文中所使用之術語「免疫黏附素」指示兼有異源蛋白(一種「黏附素」)之結合特異性與免疫球蛋白恆定域之效應功能的抗體樣分子。在結構上，免疫黏附素包含具有所要結合特異性之胺基酸序列(其並非抗體之抗原識別及結合位點，亦即為「異源」的)與免疫球蛋白恆定域序列的融合體。免疫黏附素分子之黏附素部分通常為至少包含受體或配體之結合位點的毗連胺基酸序列。免疫黏附素中之免疫球蛋白恆定域序列可獲自任何免疫球蛋白，諸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-1及IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
「治療」為出於防止病症病理之發展或改變病症病理之目的而執行的一種干預。因此，「治療」係指治療性治療與防治性或預防性措施。需治療者包括患病者及待預防病症者。
如本文中所使用之「改善」在本文中係定義為使得變好或改良。
如本文中所使用之術語「哺乳動物」係指歸類為哺乳動物之任何動物，包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物、家畜及農畜以及動物園、運動型或寵物型動物，諸如馬、豬、牛、犬、貓及雪貂等。在本發明之一項較佳實施例中，哺乳動物為高級靈長類動物，最佳為人類。
術語「補體相關性疾病」在本文中係以最廣泛之含義使用且包括發病機制涉及補體系統活化之異常(諸如補體缺乏)的所有疾病及病理性病狀。該術語特定言之包括可受益於C3轉化酶之抑制的疾病及病理性病狀。該術語另外包括可受益於替代補體路徑之抑制(包括選擇性抑制)的疾病及病理性病狀。補體相關性疾病包括(但不限於)發炎性疾病及自體免疫性疾病，諸如類風濕性關節炎(RA)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、缺血及再灌注後之遠端組織損傷、心肺繞道手術期間之補體活化、皮肌炎、天疱瘡、狼瘡腎炎以及所致之絲球體腎炎及血管炎、心肺繞道術、心臟麻痹誘導之冠脈內皮功能障礙、II型膜增生性絲球體腎炎、IgA腎病、急性腎衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂症候群、年齡相關性黃斑變性、葡萄膜炎、糖尿病性視網膜病變、同種異體移植、超急性排斥反應、血液透析、慢性阻塞性肺病症候群(COPD)、哮喘及吸入性肺炎。在一項較佳實施例中，「補體相關性疾病」為補體之替代路徑起著顯著作用的疾病，包括類風濕性關節炎(RA)、補體相關性眼睛病狀(諸如年齡相關性黃斑變性)、抗磷脂症候群、腸及腎之缺血再灌注損傷及II型膜增生性絲球體腎炎。
術語「補體相關性眼睛病狀」在本文中係以最廣泛之含義使用且包括病理涉及補體(包括經典路徑及替代路徑)且尤其為涉及補體之替代路徑的所有眼睛病狀及疾病。此群組內特定言之包括與替代路徑相關之所有眼睛病狀及疾病，其發生、發展或進展可藉由抑制替代路徑來控制。補體相關性眼睛病狀包括(但不限於)黃斑變性疾病(諸如年齡相關性黃斑變性(AMD)之所有階段，包括乾性及濕性(非滲出性及滲出性)形式)、脈絡膜新生血管(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性及其他缺血相關性視網膜病、眼內炎及其他眼內新生血管性疾病(諸如糖尿病性黃斑水腫)、病理性近視、逢希伯-林道疾病、眼組織胞漿菌病、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)、角膜新生血管及視網膜新生血管。補體相關性眼睛病狀之一較佳群組包括年齡相關性黃斑變性(AMD)(包括非滲出性(濕性)及滲出性(乾性或萎縮性)AMD)、脈絡膜新生血管(CNV)、糖尿病性視網膜病變(DR)及眼內炎。
術語「發炎性疾病」與「發炎性病症」可互換使用且意謂哺乳動物之免疫系統之組分引起、介導或以其他方式促成導致哺乳動物發病之發炎反應的疾病或病症。亦包括減輕發炎反應對疾病之進展具有改良效應的疾病。在此術語內包括免疫介導性發炎性疾病，包括自體免疫性疾病。
術語「T-細胞介導性」疾病意謂T細胞直接或間接地介導或以其他方式導致哺乳動物之發病的疾病。T細胞介導性疾病可能與細胞介導性效應、淋巴因子介導性效應等相關，且若刺激B細胞(例如藉由T細胞所分泌之淋巴因子刺激B細胞)，則甚至與B細胞相關之效應相關。
免疫相關性疾病及發炎性疾病(其中一些為T細胞介導性疾病)之實例包括(但不限於)發炎性腸病(IBD)、全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、青少年慢性關節炎、脊椎關節病、全身性硬化症(硬皮症)、特發性發炎性肌病(皮肌炎、多發性肌炎)、休格連氏症候群、全身性血管炎、肉狀瘤病、自體免疫性溶血性貧血(免疫性全血球減少症、陣發性夜間血紅素尿症)、自體免疫性血小板減少症(特發性血小板減少性紫癜、免疫介導性血小板減少症)、甲狀腺炎(格雷氏病、橋本氏甲狀腺炎、青少年淋巴球性甲狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎)、糖尿病、免疫介導性腎病(絲球體腎炎、腎小管間質腎炎)、中樞及周邊神經系統之脫髓鞘疾病(諸如多發性硬化症)、特發性多發性神經病、肝膽疾病(諸如傳染性肝炎(A、B、C、D、E型肝炎及其他非嗜肝病毒)、自體免疫性慢性活動性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎及硬化性膽管炎)、發炎性及纖維化肺疾病(例如囊腫性纖維化)、麩質敏感性腸病變、惠普爾氏病、自體免疫性或免疫介導性皮膚病(包括大皰性皮膚病、多形性紅斑及接觸性皮炎)、牛皮癬、肺之過敏性疾病(諸如嗜伊紅性肺炎、特發性肺纖維化及過敏性肺炎)、移植相關疾病(包括移植物排斥反應、移植物抗宿主疾病)、阿茲海默氏症及動脈粥樣硬化症。
「與一或多種其他治療劑組合」投藥包括同時(並行)投藥及依任何次序之連續投藥。
「活性」在本發明之CRIg多肽之變體的情況下係指保持本發明之天然或天然存在的多肽之生物活性及/或免疫活性的此等多肽之形式。較佳生物活性為能夠結合C3b及/或影響補體或補體活化、尤其為抑制替代補體路徑及/或C3轉化酶之能力。C3轉化酶之抑制可(例如)藉由在膠原或抗體誘導性關節炎期間量測正常血清中C3轉換之抑制或藉由量測關節炎關節中C3沈積之抑制來量測。
「生物活性」在可模擬CRIg生物活性之多肽的情況下在某種程度上係指此等分子能夠結合C3b及/或影響補體或補體活化、尤其為抑制替代補體路徑及/或C3轉化酶之能力。
術語CRIg「激動劑」係以最廣泛之含義使用，且包括可模擬天然序列CRIg多肽之定性生物活性(如上文中所定義)的任何分子。
「可操作地連接」係指使得可執行組分之正常功能的併接(juxtaposition)。因此，「可操作地連接」至控制序列之編碼序列係指一種構型，其中可在此等控制序列之控制下表現該編碼序列且其中所連接之DNA序列係毗連的且在分泌性前導序列(secretory leader)之情況下係毗連的且處於閱讀相(reading phase)中。舉例而言，若前序列(presequence)或分泌性前導序列之DNA被表現為參與分泌多肽之前體蛋白(preprotein)，則其可操作地連接至多肽之DNA；若啟動子或強化子影響編碼序列之轉錄，則將其可操作地連接至編碼序列；或若核糖體結合位點經定位成有助於轉譯，則將其可操作地連接至編碼序列。藉由在適宜的限制性位點處接合來實現連接。若此等位點不存在，則根據習知操作使用合成寡核苷酸接頭或連接子。
「控制序列」係指在特定宿主有機體中表現可操作地連接之編碼序列所必需的DNA序列。適用於原核生物之控制序列(例如)包括啟動子、視需要使用之操縱序列(operator sequence)及核糖體結合位點。已知真核細胞可使用啟動子、聚腺苷酸化信號及強化子。
「表現系統」係指含有可操作地鍵聯之所要編碼序列及控制序列的DNA序列，以使得經此等序列轉型之宿主能夠產生經編碼之蛋白質。為實現轉型，表現系統可包括於載體上；然而，有關DNA可接著亦整合於宿主染色體內。
如本文中所使用之「細胞」、「細胞株」與「細胞培養物」可互換使用且所有此等名稱均包括子代。因此，「轉化體」或「轉型細胞」包括來源於其之原代個體細胞及培養物，而不考慮轉移次數。亦應瞭解，所有子代因可能存在有意突變或偶然突變而在DNA含量方面不完全一致。包括具有與在最初轉型之細胞中所篩檢出之功能相同之功能的突變子代。在預期不同名稱之情況下，其根據上下文應為清楚的。
「質體」係以位於大寫字母及/或編號之前及/或之後的小寫字母「p」指定。本文中之起始質體在市面上有售，可在不受限制之基礎上公開獲得，或可根據公開程序由此等可獲得之質體建構。此外，其他等效質體於此項技術中係已知的且應為一般技術者所顯而易見。
「噬菌體呈現文庫」為一種表現與噬菌體外殼蛋白融合之經選殖蛋白質序列之集合的蛋白質表現文庫。因此，片語「噬菌體呈現文庫」在本文中係指噬菌體(例如絲狀噬菌體)之集合，其中噬菌體表現外來(通常為異源)蛋白質。外來蛋白質能夠自由地與噬菌體所接觸之其他部分相互作用(結合至噬菌體所接觸之其他部分)。呈現外來蛋白質之各種噬菌體為噬菌體呈現文庫之「成員」。
術語「絲狀噬菌體」係指一種能夠在表面上呈現異源多肽之病毒顆粒且包括(但不限於)fl、fd、Pfl及M13。絲狀噬菌體可含有可選擇標記，諸如四環素(tetracycline)(例如「fd-tet」)。各種絲狀噬菌體呈現系統已為熟習此項技術者所熟知(參見例如Zacher等人，Gene,9:127-140(1980)；Smith等人，Science,228:1315-1317(1985)；及Parmley及Smith,Gene,73:305-318(1988))。
術語「淘選」係用於指在含有對標靶具有高親和力及特異性之化合物(諸如抗體)之噬菌體的鑑別及分離中進行多輪篩檢過程。
片語「保守肽基酸殘基」係用於指互相對準之兩種或兩種以上胺基酸序列之間一致的胺基酸殘基。
II.詳細說明
補體為先天性及適應性免疫反應之重要組分，然而經由三種補體路徑(經典路徑、替代路徑及凝集素路徑)中之每一者之活化所形成的補體裂解產物會引起發炎及組織損壞。因此，因缺乏適當補體調節所致之補體活化失控與多種慢性發炎性疾病相關。在此發炎級聯反應中佔優勢的是補體裂解產物C3a及C5a，其經由C3a及C5a受體起嗜中性白血球及發炎性巨噬細胞之化學引誘劑及活化劑之作用(Mollnes,T.E.,W.C. Song及J.D. Lambris. 2002. Complement in inflammatory tissue damage and disease.Trends Immunol . 23:61-64)。
CRIg為最近發現之補體受體，其係表現於組織駐留巨噬細胞之亞群體上。作為功能性受體，CRIg之胞外IgV域為一種補體之替代路徑的選擇性抑制劑(Wiesmann等人，Nature,444(7116):217-20,2006)。已顯示CRIg之可溶形式可在關節炎之實驗模型中藉由抑制關節中補體之替代路徑來逆轉發炎及骨質流失。亦已顯示補體之替代路徑不僅為疾病誘導所需要，而且為疾病進展所需要。因此，藉由CRIg抑制替代路徑構成一種用於預防及治療發病機制涉及補體之替代路徑之疾病及病症的有前景之治療方法。欲知詳情，請參見(例如)Helmy等人，Cell,125(1):29-32(2006)及Katschke等人，J. Exp Med 204(6):1319-1325(2007)。
然而，CRIg對轉化酶亞單位C3b之親和力低(微莫耳範圍)。為產生更強之抑制劑以開發治療試劑，使用與C3b複合之CRIg之晶體結構作為指南且使用噬菌體呈現技術來產生對C3b具有改良之結合親和力的CRIg變體。
因此，本發明係關於具有改良之特性(諸如具有改良之針對C3b之結合親和力及增強之抑制功效)之CRIg變體。
親和力成熟之CRIg變體的鑑 別
如實例中更詳細描述，蛋白質或肽文庫之噬菌體呈現為選擇具有改良之針對C3b之結合親和力及/或其他改良之特性(諸如增強之生物活性)的CRIg變體提供一種有用的方法(Smith,G. P.,(1991)Curr. Opin. Biotechnol. 2:668-673)。作為與M13基因III外殼蛋白之融合體以單價方式呈現的高親和力蛋白(Clackson,T.等人，(1994),Trends Biotechnol.12:173-183)可藉由在數輪結合選擇之後將封裝於噬菌粒顆粒中之相應DNA選殖並測序來鑑別。
使用噬菌體呈現之親和力成熟法已(例如)描述於Lowman等人，Biochemistry 30(45):10832-10838(1991)中，亦參見Hawkins等人，J. Mol Biol. 254:889-896(1992)，以及以下實例。雖然不嚴格受限於以下說明，但此方法可簡述為：使預定區域內之若干位點突變以在各位點處產生所有可能的胺基酸取代。由此產生之抗體突變體係以單價方式自絲狀噬菌體顆粒作為與各顆粒內所封裝之M13之基因III產物的融合體呈現。表現各種突變體之噬菌體可經由多輪結合選擇、隨後對呈現高親和力之彼等突變體進行分離並測序來循環使用。該方法亦描述於1998年5月12日頒布之美國專利第5,750,373號中。
涉及混合親和力呈現之經修改程序描述於Cunningham,B. C.等人，EMBO J. 13(11),2508-2515(1994)中。該方法提供一種用於選擇新穎結合多肽之方法，該方法包含：a)建構一種可複製表現載體，該表現載體包含編碼多肽之第一基因、編碼天然或野生型噬菌體外殼蛋白之至少一部分的第二基因(其中該第一基因與該第二基因為異源的)及與該第一基因及該第二基因可操作地連接之轉錄調控元件，進而形成編碼融合蛋白之基因融合體；b)使該載體在該第一基因內之一或多個選定位置處突變，進而形成相關質體之家族；c)用該等質體使適當宿主細胞轉型；d)用具有編碼噬菌體外殼蛋白之基因之輔助噬菌體感染經轉型宿主細胞；e)在適於形成含有質體之至少一部分之重組噬菌粒顆粒且能夠使宿主轉型的條件下培養經轉型之受感染宿主細胞，該等條件經調整成使得僅僅少量噬菌粒顆粒呈現顆粒表面上之融合蛋白的一個以上之複本；f)使噬菌粒顆粒與靶分子接觸以使得該等噬菌粒顆粒之至少一部分結合至靶分子；及g)使結合之噬菌粒顆粒與未結合之噬菌粒顆粒分離。較佳地，該方法進一步包含用結合至靶分子之重組噬菌粒顆粒使適當宿主細胞轉型且重複步驟d)至g)一或多次。
應注意，雖然已使用噬菌體呈現技術鑑別出本發明之CRIg變體，但亦可使用其他技術及其他呈現技術來鑑別具有改良特性之CRIg變體，包括親和力成熟之CRIg變體。
將本發明之親和力成熟之CRIg變體設計成可覆蓋CRIg與C3b之間的接觸區域，此接觸區域係使用美國申請公開案第20080045697號中所揭示之CRIg及C3b：CRIg複合物之晶體結構來鑑別。特定而言，如表1中所示，文庫1-5被設計成可分別覆蓋SEQ ID NO：68之天然序列全長CRIg分子之殘基E8-K15、R41-T47、S54-Q64、E85-Q99及Q105-K111。
在一項實施例中，本文中之CRIg變體在選自由SEQ ID NO：68之胺基酸序列中之位置8、14、18、42、44、45、60、64、86、99、105及110組成之群的一或多個胺基酸位置處含有胺基酸取代。
本文中之代表性CRIg變體列於表3中。
該取代較佳係處於SEQ ID NO：68之全長天然CRIg的胺基酸序列之胺基酸位置60、64、86、99、105及110的一或多處。
在不受限制之情況下，親和力成熟之CRIg變體特定言之包括SEQ ID NO：68內之以下取代中之一或多者：E8W、 W14F、E84Y/W14F；P45F；G42D/D44H/P45F；Q60I；Q64R；Q60I/Q64R；M86Y；M86W、M86F、M86W/Q9R；M86F/Q99R；K110D、K11N；Q105R/K110N；Q105R/K110Q；Q105K/K110D。
具有兩個或兩個以上胺基酸取代之SEQ ID NO：68之天然序列CRIg的其他變體展示於表3中。此群組內特定言之包括：Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/E8Y；Q60I/Q64R/G42D；Q60I/Q64R/P45F；Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F；Q60I/Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/Q105R；Q60I/Q64R/Q105K；Q60I/Q64R/K110N；Q60I/Q105R/K110N；M86Y/E8Y；M86Y/G42D/D44H/P45F；M86Y/P45F；M86Y/G42D/D44H/P45F；M86Y/Q99K/M86Y/Q99R/M86Y/Q105R/M86Y/Q105K/M86Y/Q105R/K110N。
本文中之較佳CRIg變體包含選自由以下者組成之群之突變：Q60I；Q64R；Q60I/Q64R；M86Y；Q99L；Q105K/K110D；E8W/Q105R/K110N；Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/E8Y；Q60I/Q64R/G42D；Q60I/Q64R/P45F；Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F；Q60I/Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/Q105R；Q60I/Q64R/Q105K；Q60I/Q64R/K110N；M86Y/P45F；M86Y/Q105K。
尤其較佳之變體包含突變Q60I/Q64R/M86Y或Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F。
本文中特定言之包括含有以上所列或表3及表4中所列之一或多個突變、但是卻保持SEQ ID NO：68之天然CRIg序 列的變體。此等變體在本文中將藉由列出特定突變後跟「CRIg」來命名。因此，舉例而言，與SEQ ID NO：68之天然序列CRIg不同之處僅在於突變E8W的變體係命名為「E8W CRIg」，與SEQ ID NO：68之天然序列CRIg不同之處僅在於突變Q60I/Q64R/M86Y的變體係命名為「Q60I/Q64R/M86Y CRIg」等。
CRIg變體之製備
可利用可用以製備能夠編碼用於重組合成本發明之CRIg變體的蛋白質之DNA的各種技術。舉例而言，有可能基於天然存在之DNA序列獲得編碼所得蛋白質之胺基酸序列之變化的DNA。此等突變DNA可用於獲得本發明之CRIg變體。此等技術以簡化形式涵蓋：獲得編碼天然CRIg多肽之基因；藉由重組技術(諸如下文所述之技術)修飾基因；將基因插入適當表現載體中；將載體插入適當宿主細胞中；培養宿主細胞以促成所要CRIg變體之表現；及純化由此所產生之分子。
在某種程度上，更特定而言，編碼本發明之CRIg變體的DNA序列係如標準教科書(諸如Sambrook,J.等人，Molecular Cloning(第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.,(1989))中所述藉由DNA序列之合成建構來獲得。
a.寡核苷酸介導之突變誘發
寡核苷酸介導之突變誘發為用於製備天然CRIg多肽或其片段之取代變體、缺失變體及插入變體的較佳方法。此技 術於此項技術中係熟知的，其如Zoller等人，Nucleic Acids Res.10：6487-6504(1987)所述。簡而言之，藉由使編碼所要突變之寡核苷酸與DNA模板雜交來改變編碼起始多肽序列之核酸，其中該模板為含有編碼核酸之未改變或天然DNA序列的質體之單股形式。在雜交之後，將DNA聚合酶用於合成模板之整個第二互補股，此互補股因此合併寡核苷酸引子且將對起始核酸之選定改變進行編碼。
通常，使用長度為至少25個核苷酸之寡核苷酸。最佳寡核苷酸在編碼突變之核苷酸之任一側上具有與模板完全互補之12至15個核苷酸。此確保寡核苷酸可與單股DNA模板分子正確地雜交。該等寡核苷酸係容易地使用此項技術中已知之技術(諸如Crea等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 75：5765(1978)中所述之技術)來合成。
若使用噬菌體呈現技術，則DNA模板可僅由源自噬菌體M13載體之彼等載體(通常可獲得之M13mp18及M13mp19載體為合適的)或含有單股噬菌體起點或複製之彼等載體產生，此如Viera等人，Meth.Enzymol.153：3(1987)中所述。因此，必須將待突變之DNA插入此等載體中之一者中以產生單股模板。單股模板之產生描述於Sambrook等人之同上文獻之章節4.21-4.41中。
為改變天然DNA序列，在適當之雜交條件下使寡核苷酸與單股模板雜交。接著添加DNA聚合酶(一般為DNA聚合酶I之克列諾片段(Klenow fragment))以使用寡核苷酸作為合成引子來合成模板之互補股。如此形成異源雙鏈分子，以使得DNA中之一股編碼CRIg之突變形式，而另一股(原始模板)編碼CRIg之天然、未改變之序列。接著使此異源雙鏈分子轉型於合適宿主細胞(一般為原核生物，諸如大腸桿菌JM-101)中。在使細胞生長之後，將其塗於瓊脂糖板上且使用經32 磷酸鹽放射性標記之寡核苷酸引子篩檢以鑑別含有突變DNA之菌落。
可修改以上剛剛所述之方法，以便產生同源雙鏈分子，其中質體之兩股均含有突變。修改係如下：將單股寡核苷酸與如上所述之單股模板黏接。將三種脫氧核糖核苷酸(脫氧核糖腺苷(dATP)、脫氧核糖鳥苷(dGTP)及脫氧核糖胸苷(dTTP))之混合物與經修飾之硫代脫氧核糖胞苷(稱為dCTP-(aS)(Amersham))組合。將此混合物添加至模板-寡核苷酸複合物中。向此混合物中添加DNA聚合酶後，產生除突變鹼基外與模板一致之一股DNA。此外，此股新的DNA可含有用於保護其以防限制性核酸內切酶消化之dCTP-(aS)而非dCTP。雙股異源雙鏈體之模板股經適當限制酶切割之後，可將模板股用ExoIII核酸酶或另一種適當核酸酶穿過含有待誘變之位點之區域而消化。接著使反應停止以保留僅部分為單股之分子。接著使用DNA聚合酶在所有四種三磷酸脫氧核糖核苷酸、ATP及DNA連接酶存在下形成完整的雙股DNA同源雙鏈體。接著可如上所述將此同源雙鏈分子轉型於適當宿主細胞(諸如大腸桿菌JM101)中。
一個以上胺基酸有待取代之突變體可以若干方式中之一種來產生。若該等胺基酸緊密靠攏地位於多肽鏈中，則可使用一種編碼全部所要胺基酸取代之寡核苷酸使其同時突變。然而，若該等胺基酸彼此所處位置相隔一定距離(被超過約十個胺基酸隔開)，則較為難以產生編碼全部所要變化之單個寡核苷酸。反之，可使用一或兩種替代方法。
在第一方法中，針對有待取代之各胺基酸產生單獨的寡核苷酸。接著使寡核苷酸與單股模板DNA同時黏接，且由模板合成之第二股DNA將編碼全部的所要胺基酸取代。替代方法涉及兩輪或兩輪以上之突變誘發以產生所要突變體。第一輪係如針對單一突變體所述：對於模板使用野生型DNA，且將編碼第一所要的胺基酸取代之寡核苷酸與此模板黏接，且接著產生異源雙鏈DNA分子。第二輪之突變誘發利用第一輪突變誘發中所產生之突變DNA作為模板。因此，此模板已含有一或多個突變。接著將編碼其他所要的胺基酸取代之寡核苷酸與此模板黏接，且所得之DNA股現編碼來自第一輪與第二輪突變誘發之突變。此所得DNA可在第三輪等突變誘發中用作模板。
b.卡匣突變誘發
此方法亦為用於製備CRIg之取代變體、缺失變體及插入變體的較佳方法。此方法係基於Wells等人，Gene 34:315(1985)中所述之內容。起始物質為包含基因1(待突變之基因)之質體(或其他載體)。鑑別出編碼起始CRIg分子之核酸中待突變的密碼子。在經鑑別之突變位點之各側上須存在獨特的限制性核酸內切酶位點。若無此等限制性位點存在，則其可使用上述寡核苷酸介導之突變誘發方法將其引入基因1中之適當位置處來產生。在已將限制性位點引入質體中之後，在此等位點處將質體切割以使其線性化。使用標準程序合成編碼限制性位點之間的DNA之序列、但含有所要突變的雙股寡核苷酸。此兩股係分開地加以合成且接著使用標準技術雜交在一起。此雙股寡核苷酸被稱為卡匣。將此卡匣設計成可具有與線性化質體之末端相容以便可與此質體直接連接的3'端及5'端。此質體現含有CRIg之突變DNA序列。
c.CRIg變體之重組產生
接著將DNA編碼變體插入適當質體或載體中。使用載體使宿主細胞轉型。通常，將含有源自與宿主細胞相容之物種之複製及控制序列的質體載體與彼等宿主聯合使用。此載體通常攜有複製位點以及編碼能夠在經轉型細胞中提供表型選擇之蛋白質的序列。
舉例而言，大腸桿菌可使用pBR322(一種源自大腸桿菌種類之質體)而轉型(Mandel,M.等人，(1970)J. Mol. Biol. 53:154)。質體pBR322含有安比西林(ampicillin)及四環素抗性基因，且因此提供簡易的選擇方法。其他載體包括不同的特徵，諸如不同的啟動子，其在表現中通常為重要的。舉例而言，質體pKK223-3、pDR720及pPL-λ為目前可利用之具有tac、trp或PL 啟動子的表現載體(Pharmacia Biotechnology)。
其他較佳載體可使用標準技術藉由將本文中所述之載體之相關特徵組合來建構。載體之相關特徵包括啟動子、核糖體結合位點、變體基因或基因融合體、信號序列、抗生素抗性標記、複本數及適當的複製起點。
適用於選殖或表現本文載體中DNA的宿主細胞包括原核生物、酵母或高級真核生物細胞。適用於此目的之原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性(Gram-negative)或革蘭氏陽性(Gram-positive)生物體，例如腸內菌科(Enterobacteriaceae)，諸如埃希氏桿菌屬(Escherichia)，例如大腸桿菌；腸桿菌屬(Enterobacter)；歐文氏菌屬(Erwinia)；克雷伯氏菌屬(Klebsiella)；變形桿菌屬(Proteus)；沙門氏菌屬(Salmonella)，例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌屬(Serrafia)，例如黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans)；及志賀桿菌屬(Shigeila)；以及芽孢桿菌屬(Bacilli)，諸如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)及地衣芽胞桿菌(B. licheniformis)(例如1989年4月12日公開之DD 266,710中所揭示之地衣芽胞桿菌41P)；假單胞菌屬(Pseudomonas)，諸如銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)；及鏈黴菌屬(Streptomyces)。一種較佳之大腸桿菌選殖宿主為大腸桿菌294(ATCC 31,446)，不過其他菌株(諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X 1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌W3110(ATCC 27,325))亦適用。此等實例為說明性而非限制性。
除原核生物外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)為適用於編碼抗體之載體的選殖或表現宿主。在低級真核宿主微生物中最常使用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通麵包酵母(baker's yeast)。然而，許多其他屬、種及株通常可得且適用於本文中，諸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；刻魯維拉菌(Kluyvero-myces)宿主，諸如乳酸刻魯維拉菌(K. lactis)、脆壁刻魯維拉菌(K. fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞刻魯維拉菌(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、魏氏刻魯維拉菌(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、瓦爾特刻魯維拉菌(K. waltii)(ATCC 56,500)、果蠅刻魯維拉菌(K. drosophila-rum)(ATCC 36,906)、耐熱刻魯維拉菌(K. thermotolerans)及馬克斯刻魯維拉菌(K. marxianus)；耶氏酵母(yarrowia)(EP 402,226)；甲醇酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌屬(Candida)；里氏木黴(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)；許旺酵母屬(Schwanniomyces)，諸如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；及絲狀真菌，諸如脈孢菌屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、彎頸黴屬(Tolypocladium)及麴菌屬(Aspergillus)宿主，諸如構巢麴菌(A. nidulans)及黑麴菌(A. niger)。
適用於表現糖基化抗體之宿主細胞係源自多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別多種桿狀病毒株及變體以及諸如草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)及家蠶(Bombyx mori)宿主的相應許可昆蟲宿主細胞。用於轉染之多種病毒株公開可得，例如加州苜蓿夜蛾NPV(Autographa californica NPV)之L-1變體及家蠶NPV之Bm-5病毒株，此等病毒可根據本發明用作本文之病毒，尤其用於轉染草地黏蟲細胞。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛花(petunia)、番茄及菸草之植物細胞培養物亦可用作宿主。
然而，脊椎動物細胞最受關注，且脊椎動物細胞於培養物(組織培養物)中之繁殖已成為一種常規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40轉型之猴腎CV1株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎株(經次選殖而生長於懸浮培養物中之293或293細胞，Graham等人，J. Gen Virol. 36:59(1977))；幼小倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980))；小鼠足細胞(sertoli cell)(TM4，Mather,Biol. Reprod. 23:243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝癌細胞株(Hep G2)。
用上述用於產生本文中之CRIg變體的表現或選殖載體將宿主細胞轉型且培養於酌情改良之習知營養培養基中以誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所要序列之基因。
用於產生本發明之CRIg變體的宿主細胞可培養於多種培養基中。市售培養基(諸如漢姆氏F10(Ham's F10)(Sigma)、最低必需培養基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM，Sigma))適用於培養該等宿主細胞。此外，以下文獻中所述之任一種培養基可用作該等宿主細胞之培養基：Ham等人，Meth. Enz. 58:44(1979)；Barnes等人，Anal. Biochem. 102:255(1980)；美國專利第4,767,704號；第4,657,866號；第4,927,762號；第4,560,655號；或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利第Re.30,985號。此等培養基中之任一者可視需要補充有激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM )、痕量元素(係定義為一般以微莫耳範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能源。亦可包括將會為熟習此項技術者所知之適當濃度的任何其他必要補充物。培養條件(諸如溫度、pH值及其類似條件)為先前針對選用於表現之宿主細胞所用的彼等條件，且對於一般技術者而言將為顯而易見的。
當使用重組技術時，CRIg變體可產生於細胞內、周質間隙中，或直接分泌於培養基中。若CRIg變體產生於細胞內，則作為第一步驟，(例如)藉由離心或超濾來移除宿主細胞或溶解細胞之微粒碎屑。若CRIg變體分泌於培養基中，則通常首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置)來濃縮來自此等表現系統之上層清液。在上述步驟中之任一者中可包括蛋白酶抑制劑(諸如PMSF)以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物之生長。
由細胞製備之CRIg變體可藉由已知技術使用(例如)羥基磷灰石層析法、凝膠電泳法、透析及/或親和性層析法來純化。
CRIg變體之進一步修飾
本發明之CRIg變體亦可以形成嵌合分子之方式來修飾，其中該嵌合分子包含與另一種異源多肽或胺基酸序列融合之CRIg變體(包括其片段)。在一項實施例中，此類嵌合分子包含CRIg變體或其片段與提供抗標記抗體可選擇性結合於之抗原決定基之標記多肽的融合體。抗原決定基標記一般被置於變體CRIg多肽之胺基末端或羧基末端處。可使用針對標記多肽之抗體來偵測CRIg變體之此等抗原決定基標記形式之存在。又，抗原決定基標記之提供使CRIg多肽能夠容易地藉由親和純化法使用結合於抗原決定基標記之抗標記抗體或另一類型之親和基質來純化。各種標記多肽及其各自抗體在此項技術中係熟知的。實例包括聚-組胺酸(poly-his)或聚-組胺酸-甘胺酸(poly-his-gly)標記；flu HA標記多肽及其抗體12CA5[Field等人，Mol. Cell. Biol.,8:2159-2165(1988)]；c-myc標記及其8F9、3C7、6E10、G4、B7及9E10抗體(Evan等人，Molecular and Cellular Biology,5:3610-3616(1985))；及單純性疱疹病毒醣蛋白D(gD)標記及其抗體(Paborsky等人，Protein Engineering,3(6):547-553(1990))。其他標記多肽包括Flag-肽(Hopp等人，BioTechnology,6:1204-1210(1988))；KT3抗原決定基肽(Martin等人，Science,255:192-194(1992))；α-微管蛋白抗原決定基肽[Skinner等人，J. Biol. Chem.,266:15163-15166(1991)]；及T7基因10蛋白肽標記(Lutz-Freyermuth等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87:6393-6397(1990))。
在另一項實施例中，嵌合分子可包含CRIg變體或其片段與免疫球蛋白或免疫球蛋白之特定區域之融合體。對於嵌合分子之二價形式而言，此類融合體可為與IgG分子之Fc區域之融合體。此等融合多肽為抗體樣分子，其兼有異源蛋白(「黏附素」)之結合特異性與免疫球蛋白恆定域之效應功能且通常被稱作免疫黏附素。在結構上，免疫黏附素包含具有所要結合特異性之胺基酸序列(其並非抗體之抗原識別及結合位點，亦即為「異源」的)與免疫球蛋白恆定域序列的融合體。免疫黏附素分子之黏附素部分通常為至少包含受體或配體之結合位點的毗連胺基酸序列。免疫黏附素中之免疫球蛋白恆定域序列可獲自任何免疫球蛋白，諸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-1及IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
最簡單且最直接之免疫黏附素設計係將「黏附素」蛋白之結合區域與免疫球蛋白重鏈之鉸鏈區及Fc區域組合。通常，當製備本發明之CRIg-免疫球蛋白嵌合體時，使編碼CRIg之胞外域的核酸在C-末端與編碼免疫球蛋白恆定域序列之N-末端的核酸融合，然而N-末端融合亦為有可能的。
通常，在此等融合體中，所編碼之嵌合多肽將保留免疫球蛋白重鏈之恆定區的至少具功能活性之鉸鏈及CH2及CH3域。亦可與恆定域之Fc部分之C-末端融合，或直接在N-末端與重鏈之CH1或輕鏈之相應區域融合。
融合所在之準確位點並非關鍵；特定位點為熟知的且可對其加以選擇以便優化CRIg-免疫球蛋白嵌合體之生物活性、分泌或結合特性。
在一些實施例中，基本上如WO 91/08298中所說明，將CRIg-免疫球蛋白嵌合體組裝成單體或異源多聚體或同源多聚體且尤其組裝為二聚體或四聚體。
在一項較佳實施例中，CRIg胞外域序列與含有免疫球蛋白(例如免疫球蛋白G.sub.1(IgG 1))之效應功能之抗體的C-末端部分(詳言之，Fc域)之N-末端融合。有可能使整個重鏈恆定區與CRIg胞外域序列融合。然而，更佳地，在融合中利用始於鉸鏈區、剛好位於木瓜蛋白酶裂解位點(其在化學上界定IgGFc；殘基216(重鏈恆定區之第一殘基視為114)，或其他免疫球蛋白之類似位點)上游的序列。在一項特別較佳的實施例中，CRIg胺基酸序列與IgG1、IgG2或IgG3重鏈之鉸鏈區及CH2及CH3融合，或與IgG1、IgG2或IgG3重鏈之CH1、鉸鏈區、CH2及CH3域融合。融合所處之準確位點並非關鍵，且最佳位點可藉由常規實驗來確定。
在一些實施例中，將CRIg-免疫球蛋白嵌合體組裝成多聚體，且尤其組裝成同源二聚體或同源四聚體。通常，此等組裝之免疫球蛋白具有已知的單元結構。基本4鏈結構單元為存在IgG、IgD及IgE之形式。4單元在較高分子量之免疫球蛋白中重複出現；IgM一般以藉由二硫鍵固持在一起之基本4單元之五聚體形式存在。IgA球蛋白及偶爾有之IgG球蛋白亦可以多聚體形式存在於血清中。在多聚體之情況下，各4單元可相同或不同。
或者，可將CRIg胞外域序列插入免疫球蛋白重鏈與輕鏈序列之間，以便獲得包含嵌合重鏈之免疫球蛋白。在此項實施例中，CRIg序列係於鉸鏈區與CH2域之間或於CH2與CH3域之間與免疫球蛋白之各臂中之免疫球蛋白重鏈的3'端融合。類似構築體已由Hoogenboom等人，Mol. Immunol.,28:1027-1037(1991)中所報導。
雖然在本發明之免疫黏附素中無需存在免疫球蛋白輕鏈，但可能存在與CRIg-免疫球蛋白重鏈融合多肽共價結合或與CRIg胞外域直接融合之免疫球蛋白輕鏈。在前者情況下，通常使編碼免疫球蛋白輕鏈之DNA與編碼CRIg-免疫球蛋白重鏈融合蛋白之DNA共表現。在分泌後，雜合重鏈與輕鏈共價結合以提供包含兩個由二硫鍵連接之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的免疫球蛋白樣結構。適用於製備此等結構之方法(例如)揭示於1989年3月28日頒布之美國專利第4,816,567號中。
醫藥組合物
本發明之CRIg變體可為了治療病理涉及替代補體路徑之疾病而投與。
治療調配物係藉由將具有所要純度之活性分子與視情況使用之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編[1980])混合以凍乾調配物或水溶液之形式來製備以便儲存。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒性，且包括：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸與甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇糖；形成鹽之平衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如，鋅蛋白錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如TWEENTM 、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG)。
亦可使用脂質轉染或脂質體將多肽、抗體或抗體片段傳遞至細胞中。若使用抗體片段，則特異性結合至靶蛋白之結合域的最小片段係較佳的。舉例而言，可基於抗體之可變區序列設計保留能結合靶蛋白序列之能力的肽分子。此等肽可以化學方式合成得之及/或藉由DNA重組技術來產生(參見例如Marasco等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,7889-7893[1993])。
當為所治療之特定適應症所需要時，本文中之調配物亦可含有一種以上的活性化合物，較佳為具有互補活性且彼此間無不利影響之彼等化合物。此等分子適宜以可有效達成預定目的之量組合存在。
活性分子亦可包埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微膠囊(分別例如為羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中；包埋於膠態藥物傳遞系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中；或包埋於巨乳液中。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.編(1980)中。
待用於活體內投藥之調配物必須為無菌的。此容易藉由經由無菌過濾膜過濾來實現。
可製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之合適實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物的半透性基質，此等基質呈成形物品(例如薄膜或微膠囊)之形式。持續釋放型基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM (由乳酸-乙醇酸共聚物與醋酸亮丙立德(leuprolide acetate)組成之可注射微球體))及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物使分子能夠釋放歷時超過100天，但某些水凝膠釋放蛋白質歷時較短時間。當囊封之抗體長時間保留於體內時，其可能由於暴露於37℃下之水分而變性或聚集，從而導致生物活性之損失及免疫原性可能之變化。視所涉及之機制而定，可設計合理的穩定化策略。舉例而言，若發現聚集機制為經由硫基-二硫鍵互換形成分子間S--S鍵，則可藉由修飾硫氫基殘基、自酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用適當添加劑及開發特定聚合物基質組合物來達成穩定化。
治療方法
本發明之CRIg變體因其能夠抑制補體活化、尤其為抑制替代補體路徑而可用於預防及/或治療補體相關性疾病及病理性病狀。此等疾病及病狀包括(但不限於)補體相關性疾病、發炎性疾病及自體免疫性疾病。
本文中之CRIg變體可靶向的補體相關性疾病、發炎性疾病及免疫相關性疾病與病症之特定實例已於上文中列出。
本發明之更多細節係藉由以下非限制性實例來說明。
實例1 親和力成熟之CRIg變體的製備
材料及方法
材料：
材料 -酶及M13-KO7輔助噬菌體(New England Biolabs)；Maxisorp免疫板(Nunc. Roskilde,Denmark)；96孔U形底聚丙烯板(COSTAR；目錄號#3365)；96孔平底非結合板(NUNC；目錄號#269620)；辣根過氧化酶/抗-M13抗體接合物(Pharmacia)；3,3',5,5'-四甲基-聯苯胺-H2 O2 過氧化酶受質(TEB)(Kirkegaard and Perry Laboratories,Inc)；大腸埃希氏菌XL1-藍及大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene)；牛血清白蛋白(BSA)及Tween 20(Sigma)；Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)；兔RBC(Colorado Serum Company；目錄號#CS1081)；明膠佛羅那緩衝液(Gelatin Veronal Buffer；GVB)[100mL佛羅那緩衝液(BioWhittaker；目錄號#12-624E)；明膠(B型牛皮；SIGMA；目錄號#G9391-100G)]；缺乏Clq之血清(CompTech；目錄號#A300)；fH蛋白(Complement Technology；目錄號#A137)；抗-FLAG-HRP(50%甘油中之mAb)(Sigma目錄號Cat#A-8592)1.1mg/mL
噬菌體呈現CRIg文庫之建構
將編碼CRIg之DNA片段接合於經XhoI及SpeI消化之噬菌粒載體(p3DvlzPDZ-gD)(Kunkel等人，Methods Enzymol. 154:367-382(1987))作為野生型對照物及設計CRIg變體之模板。接著，由CJ239大腸桿菌細胞製備在為了隨機化而靶向之各殘基處具有TAA終止密碼子的模板(Kunkel等人，1987，同上)。對於CRIg變體選擇而言，使用軟隨機化策略，其中藉由使用利用偏向於野生型核苷酸之70-10-10-10鹼基混合物之中毒寡核苷酸策略將約50%之突變率引入選定位置。在文庫設計中：5=50% A、10% G、10% C及10% T；6=50% G、10% A、10% C及10% T；7=50% C、10% A、10% G及10% T；8=50% T、10% A、10% G及10% C。已設計五個文庫。
文庫1：BCRl,ATC CTG GAA GTG CAA 656(SEQ ID NO:7)AGT GTA ACA GGA CCT 866(SEQ ID NO:8)555 GGGGAT GTG AAT CTT(SEQ ID NO:9)；文庫2：BCR2,AAG TGG CTG GTA CAA 768(SEQ ID NO:10)668 TCA 657 775 688 577 ATC TTT(SEQ ID NO:11)786 CGT 657 TCT TCT GGA GAC CAT(SEQ ID NO:12)；文庫3：BCR3,TTT CTA CGT GAC TCT(SEQ ID NO:13)877 668 657 757 588 756 756 678 555 TAC 756 GGC CGC CTG CAT GTVG(SEQ ID NO:14)；文庫4：BCR4,CAA TTG AGC ACC CTG(SEQ ID NO:15)656 586 657 GAC 768 AGC CAC TAC ACG TGT 656(SEQ ID NO:16)GTC ACC TGG 756(SEQ ID NO:17)ACT CCT GAT GGC AAC(SEQ ID NO:18)；文庫5：BCR5,ACT CCT GAT GGC AAC 756(SEQ ID NO:19)GTC 688 768 657 555 ATT ACT GAG CTC CGT(SEQ ID NO:20)。
藉由使用適當密碼子如上進行點突變之定點突變誘發以產生相應突變,且由序列證實正確純系。
旨在選擇CRIg變體之文庫分選及篩檢
將Maxisorp免疫板在4℃下用C3b(5vg/ml)塗佈隔夜且在室溫下用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)及0.05%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)阻斷1小時。將噬菌體文庫添加至塗有C3b之板中且在室溫下培育3小時。將板洗滌十次且將所結合之噬菌體用50mM HCl溶離且用等體積之1.0M Tris鹼(pH 7.5)中和。將所回收之噬菌體藉由經由大腸桿菌XL1-藍繼代來擴增且用於其他輪之結合選擇。在5輪之後，自各文庫中選擇12個獨立純系且使其以96孔格式生長在500μl補充有羧苄西林(carbenicillin)及M13-KO7輔助噬菌體之2YT肉湯中。將兩倍連續稀釋之培養物上層清液直接添加於在設計位置塗有C3b、抗-gD、BSA及無關蛋白質之384孔板中。量測結合親和力以估算噬菌體濃度，從而得知C3b明顯高於抗-gD，但不高於BSA及無關蛋白質。將噬菌體濃度固定，以相同格式自各文庫中篩檢約200個純系且自各文庫中選擇24-48個明顯展示與C3b之結合力超過抗-gD的純系，接著對其測序以供分析。
競爭性噬菌體ELISA
為了估算結合親和力，使用經修改之噬菌體ELISA。將96孔微量滴定板在4℃下用50mM碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)中之2μg/ml 3Cb塗佈隔夜。接著將板在室溫下用PBS、0.5%BSA阻斷1小時。將呈現CRIg變體之噬菌體連續稀釋於PBT緩衝液中且量測結合以估算噬菌體濃度，從而得知為在飽和時之信號的50%。將噬菌體之亞飽和濃度(Subsaturating concentration)固定且與連續稀釋之C3b一起預培育2小時，接著將混合物轉移至塗有C3b之檢定板中。培育15分鐘之後，將板用PBS、0.05% Tween 20洗滌且與辣根過氧化酶/抗-M13抗體接合物(1:5000稀釋於PBT緩衝液中)一起培育30分鐘。將板洗滌，用TMB受質顯色，用1.0M H3 PO4 中止且在450nm下用分光光度法讀取。以導致半數最大噬菌粒結合之競爭C3b之濃度計算親和力(Ic50)。
蛋白質純化
將含有表現質體之大腸桿菌BL21(DE3)之單個菌落接種於30mL補充有50μg/mL羧苄西林之LB培養基(LB/carb培養基)中且使其在37℃下生長隔夜。將細菌收穫，加以洗滌，使其再懸浮且接種於500mL之LB/carb培養基中。使培養物在37℃下生長至對數中期(A 600 =0.8)。用0.4mM異丙基1-硫基--D-吡喃半乳糖苷誘導蛋白質表現，且使培養物在30℃下生長24小時。將細菌藉由以4000g離心15分鐘而粒化，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌兩次，且在-80℃下冷凍8小時。將離心塊再懸浮於50mL PBS中，且藉由通過微射流器處理設備或超音處理設備來溶解細菌。將CRIg變體蛋白質經由2ml NI-NTA瓊脂糖及凝膠過濾法純化。
mutCRIg-huFc流體相競爭性結合ELISA：
將huCRIg(L)-LFH於PBS(pH 7.4)中稀釋至2μg/mL，且塗佈於Maxisorp 384孔平底板(Nunc,Neptune,NJ)(25微升/孔)上，在4℃下培育隔夜(16-18小時)。將板用洗滌緩衝液(PBS，pH 7.4，0.05% Tween 20)洗滌3次，且向各孔中添加50微升/孔阻斷緩衝液(PBS，pH 7.4，0.5% BSA)。將板阻斷1-3小時；此培育及所有隨後之培育皆在室溫下在迴轉式震盪器上執行。在阻斷步驟期間，將C3b(經純化，Genentech)於檢定緩衝液(PBS pH 7.4、0.5% BSA、0.05% Tween-20)中稀釋至20nM，且將mutCRIg-huFc分子在20,000-0.34nM之濃度範圍內連續稀釋於檢定緩衝液中。接著將C3b與mutCRIg-huFc分子1:1混合且預培育0.5-1小時。將經阻斷之板洗滌三次(如上所述)，且將C3b:mutCRIg-huFc複合物添加至反應板(25微升/孔)中。培育1-2小時之後，將ELISA板洗滌三次(如上所述)且藉由添加抗人類C3b抗體(純系5F202，US Biological,Swampscott,MA；600ng/mL，25微升/孔)來偵測結合板之C3b。將板培育1-2小時且如上所述加以洗滌。接著添加1:2,000稀釋之接合HRP之抗鼠類Fc IgG(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)(25微升/孔)，且將板培育1-2小時。最後洗滌之後，將25微升/孔之TMB受質(Kirkegaard ＆ Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)添加至ELISA板中。約8分鐘後，藉由添加25微升/孔之1.0M磷酸來中止顯色。使用SpectraMax 250微量滴定板讀取器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)測定450nm及650nm下之吸光度。
補體活化檢定 ：
使用WieslabTM 補體系統替代路徑套組(Alpco Diagnostics,Salem,NH)評估mutCRIg-Fc抑制補體活化之能力。分兩次製備最終所要濃度的經連續稀釋之mutCRIg-Fc(400至0.2nM)及缺乏Clq之人類血清(5%)(Complement Technology,Tyler,TX)，1:1混合且在300RPM之迴轉式震盪器上預培育5分鐘，然後添加至塗有LPS之ELISA板(100微升/孔)中。檢定之其餘部分係遵循製造商說明書。簡而言之，將ELISA板中之樣本在37℃下培育60-70分鐘且接著於洗滌緩衝液(PBS pH 7.4、0.05% Tween 20)中洗滌三次。向ELISA板中每孔添加100微升之抗-C5b-9接合物。在室溫下培育30分鐘之後，如上所述洗滌ELISA板，且每孔添加100微升受質，且再將板在室溫下培育30分鐘。藉由每孔添加50微升5mM EDTA來中止顯色。使用MultiSkan Ascent微量滴定板讀取器(Thermo Fisher Scientific,Milford,MA)測定405nm下之吸光度。
溶血抑制檢定：
將兔紅血球(Colorado Serum Company,Denver,CO)用含有0.1%牛皮明膠(Sigma)(GVB)之佛羅那緩衝液(Sigma,St. Louis,MO)洗滌三次，每次洗滌後在4℃下以1500rpm離心10分鐘。在最後離心步驟之後，將細胞以2×109 個細胞/毫升之最終濃度再懸浮於GVB中。將連續稀釋於GVB中之補體抑制劑以50微升/孔添加至96孔U形底聚丙烯板(Costar,Cambridge,MA)中，隨後每孔添加20微升1:2稀釋於0.1M MgCl2 /0.1M EGTA/GVB中之兔紅血球。藉由每孔添加30微升經GVB 1:3預稀釋之缺乏Clq之血清(Complement Technology,Tyler,TX)來觸發板內補體級聯。在輕柔攪拌下，將板在室溫下培育30分鐘，再用每孔100微升10mM EDTA/GVB中止反應。以1500rpm將板離心5分鐘之後，將上層清液轉移至透明平底、未結合之96孔板(Nunc,Neptune,NJ)，且使用微板讀取器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)、在412nm下讀取光學密度。
a篩檢競爭性檢定：
使用AlphaScreen組胺酸(鎳螯合物)偵測套組(PerkinElmer,Waltham,MA)評估突變型CRIg分子與C3之潛在交叉反應性。分三次製備最終所要濃度的經連續稀釋之人類C3及C3b(3,000至0.7nM)以及固定濃度之經生物素標記之iC3b(30nM)以及突變型CRIg(mutCRIg)與野生型CRIg分子(15-60nM)，1:1:1混合，且環境溫度下，在迴轉式震盪器上以3000TPM預培育30分鐘。分四次製備最終所要濃度的抗生蛋白鏈菌素供體珠粒與鎳螯合物受體珠粒(各自為0.1mg/ml)之1:1混合物且添加至反應物中。將反應板在環境溫度下，在避光之迴轉式震盪器上以3000rpm培育60分鐘。將板用AlphaQuest-HTS微板分析器(PerkinElmer,Waltham,MA)分析。
表面電漿共振
藉由在BiacoreA100儀器(GE healthcare)上使用表面電漿共振量測法來測定C3b對於突變型CRIg及野生型CRIg之親和力。使用抗-Fc捕獲格式且根據平衡結合量測計算K D 。使用抗-muFc捕獲套組(BR-1008-38)依據製造商所提供之說明書製備感測器晶片。將突變型或野生型CRIg於運行緩衝液(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、0.01% Tween-20)中稀釋至1μg/mL，且進行60μL之注射以便使約100RU之融合蛋白捕獲於晶片表面之一個點上。針對CRIg點上不同C3b濃度之溶液的10min注射，記錄感測圖，其中扣除含有捕獲抗體、但不含CRIg之參考點的信號。在10μL/min之流速下及在25℃之溫度下，獲得濃度在4μM至15.6nM範圍內之一系列2倍稀釋之C3b的資料。在結合循環之間，藉由30秒注射10mM Gly-HCl pH 1.7來使表面再生。使用Biacore A100評估軟體v1.1之親和算法(Safsten等人，(2006)Anal. Biochem. 353:181)，使用每次C3b注射結束時獲得之平穩值來計算K D 。
結果
噬菌體文庫設計
使用與C3b複合之CRIg之晶體結構來設計靶文庫。設計五個文庫以覆蓋CRIg與C3b之間的接觸區域(圖4)。CRIg文庫係以與g3p次要外殼蛋白之融合體形式於單價噬菌體呈現載體中建構(Zhang等人，J Biol Chem 281(31):22299-311(2006))。在待隨機化之各殘基處，藉由突變誘發將終止密碼子引入噬菌體質體之CRIg編碼部分中。接著使用含有終止密碼子之各構築體來產生噬菌體呈現文庫(參見材料及方法)。使用「軟隨機化」策略來選擇黏合劑以維持野生型序列偏向(bias)以便使選定位置當時僅50%突變。以每個文庫>1010 個獨立序列之平均多樣性獲得所有五個文庫(表1)。
CRIg噬菌體文庫之選擇
在四輪結合選擇之後，自該等五個文庫中獲得38個獨特純系(表2)。在文庫1中，保留位置15之離胺酸。在位置8處，芳族殘基(酪胺酸及色胺酸)置換麩胺酸。位置14為親代色胺酸或同源苯丙胺酸所佔據。在文庫2中，對24個純系測序且其均顯示一致。位置42、46及47保留為野生型。在位置43、44及45處，天冬醯胺、組胺酸及苯丙胺酸置換野生型序列。在文庫3中，將10個位置隨機化且該等序列在位置54、55、56、57、58、61、62及63處呈現完全的保守性。異白胺酸或離胺酸佔據位置60。在位置64處，麩醯胺酸經精胺酸置換或被保留。在文庫4中，芳族殘基佔據位置86且同源鹼性殘基精胺酸及離胺酸佔據位置99。位置85、87及95亦經軟隨機化，但顯現高度保守性。在文庫5中，在位置105處，較佳為兩個明顯同源之鹼性殘基離胺酸及精胺酸而非麩醯胺酸。帶負電之殘基天冬胺酸或酸性殘基天冬醯胺酸佔據位置110。
藉由競爭性噬菌體ELISA估算一些突變體之親和力(資料未展示)，且發現文庫3中存在作為比野生型CRIg好約八倍之C3b黏合劑的純系。
活體外結合親和力及活體內生物效力之測定
為了在溶血抑制檢定中鑑別對於增大與C3b之結合親和力及效力起關鍵作用之殘基，緊接著的步驟係如下設計第二代CRIg變體：合併顯性單突變且使其他位置保留為野生型，或自藉由噬菌體ELISA所確定之第一代噬菌體文庫中選擇2-3個高親和力純系。為了準確地量測本發明突變體之親和力及效力，使所有變體表現為分離蛋白。溶血抑制檢定之結果(表3)展示，在溶血檢定中，與野生型相比，文庫1之L12、文庫3之L33及文庫4之L41使效力明顯增大4至10倍。文庫3之L32展示比野生型CRIg改良10倍之IC50。資料亦展示細胞基檢定中之結合親和力與效力並不相關。
突變體之組合
基於第二代文庫之結果，設計第三代突變體以便進一步改良溶血檢定中之效力及結合親和力。選擇三種生物學上最有效之突變體(L12-8W、L33-Q60I/L32-Q64R及L41-M86Y)及一種結合親和力最高之突變體(L32-Q64R)作為模板。接著將此等突變體與獲自第二代文庫中之其他生物學有效純系組合以確定可在溶血檢定中增大效力及結合親和力之一組最佳的突變。使CRIg變體表現並加以純化以供詳細分析。資料展示(表4)，與親代突變體相比，儘管WL41及WL59突變體之結合親和力高3-6倍，但L12之結合突變體並未改良抑制效力且甚至呈現較低活性。在溶血檢定中，於L32之突變體內，RL41展示比野生型好1.8倍之結合親和力及好6倍之效力。L33群組之所有突變體展示明顯增大之結合親和力(與野生型相比增大約27-226倍)，不過溶血檢定中之效力並未明顯增大。亦注意到，60I-64R及86Y與大部分親和力改良之結合純系有關。
CRIg Q64R M86Y突變體之改良結合親和力及補體抑制活性
選擇在競爭性ELISA中具有最高親和力之突變體Q64RM86Y(參見圖4及表3)以供進一步分析。為了測定CRIg wt及CRIg Q64R M86Y對於C3b之結合親和力，對CRIg wt及CRIg Q64R M86Y進行Biacore分析。CRIg Q64R M86Y之親和力比野生型CRIg改良5倍(圖6)。先前研究已顯示CRIg wt選擇性結合至C3b而非結合至天然C3(Wiesman等人，Nature,444(7116):217-20,2006)。因為突變誘發會改變此選擇性，所以在α篩檢流體相競爭性檢定中比較CRIg Q64R M86Y相對於C3與C3b之親和力。CRIg Q64R M86Y與可溶性C3b競爭，但不與可溶性C3競爭，此表明突變誘發並不影響CRIg對活性組分C3b之選擇性(圖7)。藉由對與C3b複合之CRIg Q64R M86Y之結構中的此等殘基之分析進一步證實此選擇性(資料未展示)。
為測試改良之親和力及對C3b保持之選擇性是否轉化為改良之功效，在對補體之替代路徑具有選擇性的基於紅血球之溶血檢定中對CRIg Q64R M86Y與CRIg wt進行測試。與CRIg wt相比，CRIg Q64R M86Y展示IC50有了4倍的改良(圖8A)。為進一步證實針對補體替代路徑抑制之效力的改良，在對補體之替代路徑具有選擇性的基於LPS之檢定中對CRIg Q64R M86Y與CRIg wt之抑制活性進行比較。此處，與野生型重組蛋白質相比，CRIg展示IC50有了180倍之改良。CRIg wt及CRIg Q64R M86Y不影響補體經由經典路徑之活化。因此，在對補體之替代路徑具有選擇性的兩種不同檢定中，CRIg-C3b結合界面中之兩個胺基酸取代產生具有改良之結合親和力及優良之補體抑制活性的分子。
為進一步測定增大之結合親和力及效力是否轉化為改良之治療功效，在血清轉移關節炎模型中對CRIg之野生型及Q64R M86Y型之保護作用進行比較。先前研究已顯示CRIg在膠原蛋白誘導之關節炎及抗體誘導之關節炎中有效地抑制發炎及骨組織破壞(Katschke等人，J. Exp Med 204(6):1319-1325(2007))。
此處，在免疫複合物介導性關節炎之第三臨床前模型中測試CRIg功效。類風濕性關節炎之自發鼠類模型K/BxN模擬人類關節炎疾病之諸多臨床及組織學特徵。第0日將獲自K/BxN小鼠之50微升血清注入小鼠。每日檢查動物且藉由目測法對疾病程度評分。第6日處死所有小鼠。
在第1日開始每日將指定量之於100μl無菌鹽水中之同型對照物或hCRIg-mIgG1或hCRIg-RL41-mIgG1重組蛋白質皮下注入小鼠。
監測及評分：
各爪之評分。
0=無紅斑及腫脹跡象
1=限於中足(跗骨)或踝之紅斑及輕度腫脹
2=自踝擴展至中足之紅斑及輕度腫脹
3=自踝擴展至蹠骨關節之紅斑及中度腫脹
4=包括踝、足及趾之紅斑及嚴重腫脹
平均評分=4個爪評分之總和。
疾病階段：輕度(平均分數1-3)、中度(平均分數4-8)及嚴重疾病(平均分數9以上)。平均分數可反映所涉及之關節數目。
第6日，藉由在麻醉下心內穿刺來收集血樣，然後處死。使用血清來量測hCRIg-Fc融合蛋白之量。收集關節用於組織學評估。
將來自KRN小鼠之血清轉移至Balb/c接受者體內會產生特徵為對稱性關節發炎之快速且強的免疫反應。關節炎誘導係由在關節內形成促炎性免疫複合物之抗葡萄糖-6-磷酸酯異構酶自體抗體所介導(Kouskoff,V.,Korganow,A.S.,Duchatelle,V.,Degott,C.,Benoist,C.及Mathis,D.(1996).Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity.Cell87 ,811-822)。如由在缺乏替代路徑補體組分之小鼠及缺乏共同fc-受體γ重鏈之小鼠中不存在疾病所證明，關節炎之形成完全取決於整個替代補體路徑及Fc受體功能(Ji,H.,Ohmura,K.,Mahmood,U.,Lee,D.M.,Hofhuis,F.M.,Boackle,S.A.,Takahashi,K.,Holers,V.M.,Walport,M.,Gerard,C.等人(2002)。Arthritis critically dependent on innate immune system players.Immunity16 ,157-168)。由於疾病之發作快且程度嚴重，因此用CRIg wt-Fc融合蛋白處理使關節炎評分降低僅22%(圖9A、9B)。用CRIg Q64R M86Y處理展示關節炎評分降低66%。組織學檢查顯示，相對於經CRIg wt或對照融合蛋白處理之小鼠，在經CRIg Q64R M86Y處理之小鼠中主要由嗜中性白血球及巨噬細胞組成之免疫細胞之浸潤明顯減少(圖9C、9D)。CRIg wt與CRIg Q64R M86Y之血清濃度相似，此表 明關節炎評分之差異並非歸因於CRIg wt與CRIg Q64R M86Y蛋白之半衰期之差異。因此證明，CRIg與其靶C3b之增強之結合親和力轉化為明顯改善之療效。
本說明書中所引用之全部專利及參考文獻係明確地以全文引用之方式併入本文中。
雖然已參考被認為是特定實施例之內容描述了本發明，但應瞭解本發明不限於此等實施例。相反，本發明意欲涵蓋隨附申請專利範圍之精神及範疇內所包括的各種變體及等效體。
<110> 美商建南德克公司
<120> 親和力成熟之CRIg變體
<130> GNE-0322
<140> 098115004
<141> 2009-05-06
<150> 61/189,653
<151> 2008-08-20
<150> 61/050,888
<151> 2008-05-06
<160> 68
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1372
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (65)..(1261)
<400> 1
<210> 2
<211> 399
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
<210> 68
<211> 380
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
圖1A-1B展示天然人類CRIg之399個胺基酸的全長長形式之核苷酸及胺基酸序列(huCRIg，分別為SEQ ID NO：1及2)；圖2A-2B展示天然人類CRIg之305個胺基酸的短形式之核苷酸及胺基酸序列(huCRIg-短，分別為SEQ ID NO：3及4)；圖3A-3C展示280個胺基酸的天然鼠類CRIg之核苷酸及胺基酸序列(muCRIg，分別為SEQ ID NO：5及6)；圖4：旨在產生更強之抑制劑的CRIg之基於結構之親和力成熟。CRIg突變體在結合檢定及抑制檢定中之活性。CRIg之結合親和力係根據C3b之競爭性置換(A)來量測，且生物活性係藉由溶血抑制檢定來量測。PUR10680為野生型對照物(紅)，且RIL 41(藍)及RL41(綠)為兩種突變體(B)。(C)CRIg結合界面之逐步優化； 圖5：競爭性ELISA與溶血檢定之間的相關性；圖6：藉由Biacore分析得知，CRIg突變體Q64R/M86Y顯示改良之結合親和力。(A)藉由注射漸增濃度之C3b所產生的關於經塗佈之CRIg wt及CRIg Q64R M86Y蛋白之SPR感測圖。B.對結合資料之穩態分析指示Q64R/M86Y突變體之Kd為0.2微莫耳且野生型CRIg之Kd為1.1微莫耳；圖7：親和力改良之CRIg保持對C3b之選擇性。將α篩檢競爭性檢定用於經純化之C3及C3b；圖8：CRIg Q64R M86Y與野生型CRIg相比活體外補體抑制效力有了改良。(A)使用替代路徑選擇性溶血檢定，使用兔紅血球及缺乏C1q之人類血清對野生型CRIg與CRIg Q46R M86Y之補體抑制進行比較。(B)使用基於ELISA之替代路徑檢定，利用微孔板所塗之LPS及缺乏C1q之人類血清對野生型CRIg與CRIg Q46R M86Y之補體抑制進行比較；及圖9：CRIg Q64R M86Y相對於CRIg WT展示改良之活體內功效。
(A)經KRN血清注射且經不同濃度及不同型式之野生型及親和力成熟之重組人類及小鼠CRIg蛋白處理的小鼠之臨床評分。資料為每組4-7隻小鼠之平均值。(B)在血清轉移後第6日之個別小鼠之臨床評分之散布圖。(C)在血清轉移後第6日經CRIg wt或CRIg Q64R M86Y處理之小鼠的經蘇木素及伊紅染色之切片。(D)在血清轉移後第6日經CRIg wt或CRIg Q64R M86Y處理之小鼠的組織學評分之散布圖。
表1：噬菌體文庫。設計五個軟隨機化文庫以覆蓋CRIg 與C3b之間的接觸區域。
表2：藉由噬菌體呈現技術達成之較高親和力CRIg的逐步產生。自五個軟隨機化文庫中選擇CRIg抗-C3b之突變體。各圖展示基於與C3b之結合親和力自各文庫中選出的純系。序列係以單字母胺基酸碼表示。各圖將個別突變體與一致及親代野生型(WT)序列比較。如下相應地將殘基著色：藍色-軟隨機化位置；灰色-未隨機化；黃色-不同於野生型(WT)之選定殘基。依出現順序，表2分別揭示SEQ ID NO：21-63及63-67。
表3：針對選定突變體藉由競爭性ELISA及活體內溶血抑制檢定所測定之結合親和力之比較。結合親和力或活體內效力增大5倍以上之突變體係以黃色陰影標出。
表4：第二代突變體之結合親和力及活體內溶血抑制之比較(親代序列以灰色展示)。結合親和力比親代突變體增大5倍以上之突變體以藍色突出顯示，結合親和力增大90倍以上之突變體以黃色突出顯示。類似地，活體內效力比親代序列大之突變體以橙色突出顯示。
(無元件符號說明)

Claims (21)

  1. 一種CRIg變體，或其生物活性片段，其在SEQ ID NO：68之胺基酸序列之一或多個胺基酸位置包含胺基酸取代，其中該取代係選自由E8W；W14F；E8Y/W14F；G42D/D44H/P45F；Q60I；Q64R；Q60I/Q64R；M86Y；M86W；M86F；M86W/Q99R；M86F/Q99R；K110D；K110N；Q105R/K110N；Q105R/K110Q；Q105K/K110D；Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/E8Y；Q60I/Q64R/G42D；Q60I/Q64R/P45F；Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F；Q60I/Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/Q105R；Q60I/Q64R/Q105K；Q60I/Q64R/K110N；Q60I/Q105R/K110N；M86Y/E8Y；M86Y/G42D/D44H/P45F；M86Y/P45F；M86Y/G42D/D44H/P45F；M86Y/Q99K；M86Y/Q99R；M86Y/Q105R；M86Y/Q105K；M86Y/Q105R/K110N所組成之群；及其中該CRIg變體或其片段為比SEQ ID NO：68之天然序列人類CRIg更強至少兩倍的替代補體路徑抑制劑，且視情況相較於SEQ ID NO：68之天然序列人類CRIg，對C3b具有增強至少兩倍之結合親和力。
  2. 如請求項1之變體，或其生物活性片段，其結合C3b或其片段之選擇性超過C3。
  3. 如請求項1之變體，其中該結合親和力增強至少5倍。
  4. 如請求項1之變體，其中該結合親和力增強至少10倍。
  5. 如請求項1之變體，其中該結合親和力增強至少90倍。
  6. 如請求項1之變體，其在SEQ ID NO：68之胺基酸序列之胺基酸位置60、64、86、99、105及110的一或多者包含胺基酸取代。
  7. 一種嵌合分子，其為比SEQ ID NO：68之天然序列人類CRIg更強至少兩倍的替代補體路徑抑制劑，且視情況相較於SEQ ID NO：68之天然序列人類CRIg，對C3b具有增強至少兩倍之結合親和力，其包含如請求項1至6中任一項之變體與另一個異源多肽或胺基酸序列融合。
  8. 如請求項7之嵌合分子，其為免疫黏附素。
  9. 如請求項8之嵌合分子，其中該CRIg變體比SEQ ID NO：68之全長CRIg短。
  10. 如請求項9之嵌合分子，其包含CRIg細胞外域。
  11. 一種用於治療有需要之個體之補體相關疾病之醫藥組合物，其包含有效量之如請求項1至6中任一項之CRIg變體或如請求項8至10中任一項之嵌合分子與醫藥學上可接受之賦形劑混合。
  12. 如請求項11之醫藥組合物，其中該個體為哺乳動物。
  13. 如請求項12之醫藥組合物，其中該哺乳動物為人類。
  14. 一種如請求項1至6中任一項之CRIg變體或如請求項8至10中任一項之嵌合分子的用途，其係用於製備用以治療補體相關疾病或病狀的藥劑。
  15. 如請求項14之用途，其中該補體相關疾病為發炎疾病或自體免疫疾病。
  16. 如請求項14之用途，其中該補體相關疾病係：(i)選自由以下組成之群：類風濕性關節炎(RA)、成人呼吸窘迫症候群(ARDS)、缺血及再灌注後之遠端組織損傷、心肺繞道手術期間之補體活化、皮肌炎、天疱瘡、狼瘡腎炎以及所致之絲球體腎炎及血管炎、心肺繞道術、心臟麻痺誘發之冠脈內皮功能障礙、II型膜增生性絲球體腎炎、IgA腎病、急性腎衰竭、冷球蛋白血症、抗磷脂症候群、年齡相關性黃斑變性、葡萄膜炎、糖尿病性視網膜病變、同種異體移植、超急性排斥反應、血液透析、慢性阻塞性肺病症候群(COPD)、哮喘、吸入性肺炎、蕁麻疹、慢性特發性蕁麻疹、溶血性尿毒症候群、子宮內膜異位、心因性休克、缺血再灌注損傷及多發性硬化(MS)；或(ii)選自由以下組成之群：發炎性腸病(IBD)、全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、青少年慢性關節炎、脊椎關節病、全身性硬化症(硬皮症)、特發性發炎性肌病(皮肌炎、多發性肌炎)、休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、全身性血管炎、肉狀瘤病、自體免疫溶血性貧血(免疫性全血球減少症、陣發性夜間血紅素尿症)、自體免疫血小板減少症(特發性血小板減少性紫癜、免疫介導性血小板減少症)、甲狀腺炎(格雷氏病(Grave's disease)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、青少年淋巴球性甲狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎)、糖尿病、免疫介導性腎病(絲球體腎炎、腎小管間質腎炎)、中樞及周邊神經系統之脫髓鞘疾病(諸如多發 性硬化症)、特發性多發性神經病、肝膽疾病(諸如傳染性肝炎(A、B、C、D、E型肝炎及其他非嗜肝病毒)、自體免疫慢性活動性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎及硬化性膽管炎)、發炎及纖維化肺疾病(例如囊腫性纖維化)、麩質敏感性腸病變、惠普爾氏病(Whipple's disease)、自體免疫或免疫介導性皮膚病(包括大皰性皮膚病、多形性紅斑及接觸性皮炎)、牛皮癬、肺之過敏性疾病(諸如嗜伊紅性肺炎、特發性肺纖維化及過敏性肺炎)、移植相關疾病(包括移植物排斥反應、移植物抗宿主疾病)、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、陣發性夜間血紅素尿症、遺傳性血管水腫、動脈粥樣硬化症及II型膜增生性絲球體腎炎；或(iii)類風濕性關節炎(RA)；或(iv)補體相關眼睛病狀。
  17. 如請求項16之用途，其中該補體相關眼睛病狀係選自由以下組成之群：年齡相關性黃斑變性(AMD)之所有階段、葡萄膜炎、糖尿病及其他缺血相關視網膜病、眼內炎及其他眼內新生血管疾病。
  18. 如請求項17之用途，其中該眼內新生血管疾病係選自由以下組成之群：糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、逢希伯-林道疾病(von Hippel-Lindau disease)、眼組織胞漿菌病、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)、角膜新生血管及視網膜新生血管。
  19. 如請求項16之用途，其中該補體相關眼睛病狀係選自由 以下組成之群：年齡相關性黃斑變性(AMD)、脈絡膜新生血管(CNV)、糖尿病性視網膜病變(DR)及眼內炎。
  20. 如請求項19之用途，其中該AMD為濕性AMD。
  21. 如請求項19之用途，其中該AMD為乾性或萎縮性AMD。
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