KR20170001711A - 친화력-성숙 ＣＲＩｇ 변이체 - Google Patents

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멘노 반 루케렌 캄파그네
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Abstract

본 발명은 친화력-성숙 CRIg 변이체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 C3b에 대한 결합 친화력이 증가되었고 C3에 비해 C3b에 대한 선택적 결합을 유지하는 CRIg 변이체에 관한 것이다.

Description

친화력-성숙 ＣＲＩｇ 변이체{AFFINITY MATURED CRIg VARIANTS}
본 발명은 친화력-성숙 CRIg 변이체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 C3b에 대한 결합 친화력이 증가되었고 C3에 비해 C3b에 대한 선택적 결합을 유지하는 CRIg 변이체에 관한 것이다.
보체 시스템
보체 시스템은 정상적으로는 불활성의 효소전구체(pro-enzyme) 형태로 존재하는 일련의 혈청 당단백질들로 구성된 복합적인 효소 케스케이드이다. 3가지 주요 경로인 고전적 경로, 대안적 경로 및 만노스-결합 렉틴 경로가 보체를 활성화시킬 수 있고, 이들은 C3 수준에서 병합되며, 이때 2개의 유사한 C3 전환효소가 C3을 C3a 및 C3b로 절단한다.
대식세포는 세포-표면에서 발현된 확인 태그(tag), 소위 분자 패턴에서의 미세한 차이를 인식하는 선천적인 능력이 발달된 전문가 세포이다 ([Taylor, et al., Eur J Immunol 33, 2090-1097 (2003)]; [Taylor, et al., Annu Rev Immunol 23, 901-944 (2005)]). 이러한 표면 구조들의 직접적인 인식이 선천 면역의 기초적인 양상인 한편, 옵소닌화는 일반적인 대식세포 수용체가 포식을 매개하도록 허용하여, 포식세포의 효능을 증가시키고 이의 인식 레퍼토리를 다양화시킨다 ([Stuart and Ezekowitz, Immunity 22, 539-550 (2005)]). 포식작용 프로세스는 다중 리간드-수용체 상호작용을 수반하고, 면역글로불린, 콜렉틴 및 보체 성분이 포함되는 다양한 옵소닌이 대식세포 세포 표면 수용체와의 상호작용을 통한 병원체 내재화에 필요한 세포 활성들을 안내한다는 것이 현재 자명하다 ([Aderem and Underhill, Annu Rev Immunol 17, 593-623 (1999)]; [Underhill and Ozinsky, Annu Rev Immunol 20, 825-852 (2002)]에 리뷰되어 있음). 생식계열 유전자에 의해 코딩되는 천연 면역글로불린은 광범위한 병원체를 인식할 수 있는 한편, 대다수의 옵소닌화 IgG는 적응 면역을 통해 생성되고, 따라서 Fc 수용체를 통한 효율적인 소거는 즉각적이지 않다 ([Carroll, Nat Immunol 5, 981-986 (2004)]). 반면에, 보체는 병원체 표면 분자를 신속하게 인식하고, 입자를 보체 수용체에 의한 흡수에 대해 준비시킨다 ([Brown, Infect Agents Dis 1, 63-70 (1991)]).
보체는 보체 수용체에 의한 인식을 위해 광범위한 병원체를 옵소닌화하는 30가지를 초과하는 혈청 단백질로 구성된다. 케스케이드의 초기 방아쇠에 따라, 3가지 경로가 구별될 수 있다 ([Walport, N Engl J Med 344, 1058-1066 (2001)]에 리뷰되어 있음). 3가지 경로 모두 중심 성분인 C3을 활성화시키는 공통적인 단계를 공유하지만, 인식의 성질, 및 C3 활성화에 이르는 최초의 생화학적 단계에 따라 상이하다. 고전적 경로는 병원체 표면에 결합된 항체에 의해 활성화되고, 차례로 상기 항체가 C1q 보체 성분에 결합하여, 세린 프로티에이스 케스케이드를 시작하게 하고, 이러한 케스케이드가 궁극적으로 C3을 이의 활성 형태인 C3b로 절단한다. 렉틴 경로는 렉틴 단백질에 의한 탄수화물 모티프의 인식 후에 활성화된다. 현재까지, 이러한 경로의 3개의 구성원이 확인되어 있다: 만노스-결합 렉틴 (MBL), SIGN-R1 패밀리의 렉틴 및 피콜린 ([Pyz et al., Ann Med 38, 242-251 (2006)]). MBL 및 피콜린 양쪽 모두 세린 프로티에이스와 회합되고, 이는 고전적 경로에서의 C1과 유사하게 작용하여, 성분 C2 및 C4를 활성화시켜 중심 C3 단계에 이르게 한다. 대안적 경로는 내부 C3 에스테르와 병원체 표면 상의 인식 모티프의 직접적인 반응으로 인해 활성화된다는 점에서 고전적 경로 및 렉틴 경로 양쪽 모두와 대조적이다. 활성화 표면에 대한 최초의 C3 결합은 대안적 경로 프로티에이스 인자 B 및 인자 D의 작용을 통한 C3b 축적의 신속한 증폭에 이른다. 중요하게, 고전적 경로 또는 렉틴 경로에 의해 축적된 C3b 또한 인자 B 및 인자 D의 작용을 통한 C3b 축적의 증폭에 이를 수 있다. 보체 활성화의 3가지 경로 모두에서, 옵소닌화에서의 중추적인 단계는 성분 C3이 C3b로 전환되는 것이다. 보체 케스케이드의 효소에 의한 C3의 절단은 티오에스테르를 친핵성 공격에 노출시켜, C3b가 티오에스테르 도메인을 통해 항원 표면 상에 공유결합으로 부착되도록 한다. 이는 보체 옵소닌화에서의 최초의 단계이다. 이어지는 결합된 C3b의 단백질분해로 상이한 수용체들에 의해 인식되는 단편들인 iC3b, C3c 및 C3dg가 생산된다 ([Ross and Medof, Adv Immunol 37, 217-267 (1985)]). 추가로 C3b 축적을 증폭시키고, 막 손상을 지시할 수 있는 막 공격 복합체가 포함되는 보체 케스케이드의 후기 성분들을 활성화시키는 C3b의 능력이 이러한 절단에 의해 폐지된다. 그러나, 대식세포 포식 수용체가 C3b 및 이의 단편을 우선적으로 인식한다; 에스테르-결합 형성의 다능성으로 인해, C3-매개 옵소닌화가 병원체 인식에 중요하고 ([Holers et al., Immunol Today 13, 231-236 (1992)]), 따라서 다양한 C3 분해 생성물에 대한 수용체가 숙주 면역 응답에서 중요한 역할을 한다.
C3 자체는 13개의 독특한 도메인들로 구성된 복합적이고 가요성인 단백질이다. 분자의 코어(core)는 8개의 소위 마크로글로불린 (MG) 도메인으로 만들어지고고, 이들은 C3의 단단하게 패킹(packing)된 α 및 β 사슬을 구성한다. CUB (C1r/C1s, Uegf & 골 형태형성 단백질(Bone morphogenetic protein)-1), 및 C3b와 병원체 표면의 공유결합에 의한 회합을 허용하는 티오에스테르 결합을 함유하는 TED 도메인이 이러한 구조 내로 삽입된다. 나머지 도메인은 C3a를 함유하거나, 코어 도메인들의 링커 또는 스페이서로 작용한다. C3b 및 C3c 대 C3의 구조 비교는 각각의 단백질분해로 분자에 주요 입체형상 재배열이 진행되고, 이는 TED, 뿐만 아니라 세포 수용체와 상호작용할 수 있는 분자의 추가적인 새로운 표면을 노출시킨다는 것을 나타낸다 ([Janssen and Gros, Mol Immunol 44, 3-10 (2007)]).
포식 세포 상의 보체 C3 수용체
보체 수용체의 3가지 유전자 수퍼패밀리가 공지되어 있다: CR1 및 CR2를 코딩하는 짧은 컨센서스 반복물 (SCR: short consensus repeat) 모듈, 베타-2 인테그린 패밀리 구성원 CR3 및 CR4, 및 면역글로불린 Ig-수퍼패밀리 구성원 CRIg.
CR1은 30개의 짧은 컨센서스 반복물 (SCR)로 구성된 180-210 kDa의 당단백질이고, 면역 복합체 소거에서 중요한 기능을 한다. SCR은 아미노산 약 60개의 모듈형 구조이고, 구조적 강직성을 제공하는 2쌍의 디술피드 결합이 각각 있다. C3b 및 C4b 양쪽 모두에 대한 고친화력 결합이 각각 3개의 SCR로 구성되는 2개의 독특한 부위를 통해 발생한다 ([Krych-Goldberg and Atkinson, Immunol Rev 180, 112-122 (2001)]에 리뷰되어 있음). CR1의 SCR 15-17 내에 함유된 C3b 결합 부위 (부위 2)의 구조가 MRI에 의해 결정되어 ([Smith et al., Cell 108, 769-780 (2002)]), 3개의 모듈이 16-17 접합부에서의 가요성이 있는 확장된 머리-꼬리(head-to-tail)배열로 존재한다는 것이 밝혀졌다. 구조에 의해 안내된 돌연변이유발로 C4b 결합에 결정적인 모듈 15 상에서 양성 전하를 띠는 표면 영역이 확인되었다. 이러한 패치(patch)가, CR1의 동일한 측면 상에 노출된 모듈 16의 염기성 측쇄와 함께, C3b 결합에 필요하다. 면역 부착 수용체로서 최초로 기술된 CR1 ([Rothman et al., J Immunol 115, 1312-1315 (1975)])의 주요 기능은 운송 및 간에 의한 소거를 위해 적혈구 상의 IC를 포획하는 것이다 ([Taylor et al., Clin Immunol Immunopathol 82, 49-59 (1997)]). 중성구 상에서 CR1에 대해 포식작용에서의 역할이 있지만, 조직 대식세포에서는 없다 ([Sengelov et al., J Immunol 153, 804-810 (1994)]). 면역 복합체의 소거에서의 역할에 더하여, CR1은 각각의 전환효소와의 상호작용을 통해 고전적 경로 및 대안적 경로 양쪽 모두의 활성화의 강력한 억제제이다 (Krych-Goldberg and Atkinson, 2001, 상기 문헌]; [Krych-Goldberg et al., J Biol Chem 274, 31160-31 168 (1999)]). 마우스에서, CR1 및 CR2는 별법적인 스플라이싱(splicing)에 의해 형성된 동일한 유전자의 2가지 생성물이고, B-림프구 및 여포상 수지 세포와 우선적으로 회합되며, 주로 B-세포 응답의 조절에서 기능을 한다 ([Molina et al., 1996]). CR1의 마우스의 기능적 등가물인 Crry는 고전적 경로 및 대안적 경로 효소를 불활성화시키고, 포식성 수용체보다는 보체 활성화의 내인성 조절인자로서 작용한다 ([Molina et al., Proc Natl Acad Sci USA 93, 3357-3361 (1992)]).
CR2 (CD21)는 iC3b 및 C3dg에 결합하고, B 세포 면역을 강화시키는 주요 보체 수용체이다 ([Carroll, Nat Immunol 5, 981-986 (2004)]; [Weis et al., Proc Natl Acad Sci USA 81, 881-885 (1984)]). C3d로 코팅된 항원이 동족 B 세포에 흡수되면, B 세포 항원 수용체를 통해 강화된 신호가 초래된다. 따라서, CD21-CD19-CD81 공동수용체와 B 세포 항원 수용체의 공동고용(coengagement)은 B 세포 활성화의 역치를 낮추고, 중요한 생존 신호를 제공한다 ([Matsumoto et al., J Exp Med 173, 55- 64 (1991)]). iC3b 상의 CR2 결합 부위가 TED와 MG1 도메인 간의 계면 상에서 부분적으로 지도로 작성되었다 ([Clemenza and Isenman, J Immunol 165, 3839-3848 (2000)]).
CR3 및 CR4는 알파 서브유닛 (각각 CD11b 또는 αM 및 CD11c 또는 αX) 및 공통적인 베타 사슬 (CD18 또는 β2)로 구성된 막횡단 이종이량체이고, 세포외 매트릭스 및 다른 세포에 대한 부착, 뿐만 아니라 iC3b의 인식에서 수반된다. 이들은 인테그린 패밀리에 속하고, 포식작용뿐만 아니라 백혈구 트래피킹(trafficking) 및 이동, 시냅스 형성 및 공동자극에서 또한 기능을 수행한다 ([Ross, Adv Immunol 37, 217-267 (2000)]에 리뷰되어 있음). 인테그린 부착성은 인테그린을 저친화력에서 고친화력 결합 상태로 전환시키는 인사이드-아웃(inside-out) 신호전달로 칭해지는 프로세스를 통해 조절된다 ([Liddington and Ginsberg, J Cell Biol 158, 833-839 (2002)]). 또한, 리간드 결합은 신호를 세포외 도메인으로부터 세포질로 변환시킨다. iC3b의 결합 부위가 CR3 및 CR4의 알파 사슬 상의 여러 도메인에 대해 지도로 작성되었다 ([Diamond et al., J Cell Biol 120, 1031-1043 (1993)]; [Li and Zhang, J Biol Chem 278, 34395-34402 (2003)]; [Xiong and Zhang, J Biol Chem 278, 34395-34402 (2001)]). CR3에 대한 여러 리간드인 iC3b, 베타-글루칸 및 ICAM-1은 CD11b의 I 도메인 내에 함유된 부분적으로 중복되는 부위에 결합하는 것으로 보인다 ([Balsam et al., 1998]; [Diamond et al., 1990]; [Zhang and Plow, 1996]). 단백질분해에 의해 불활성화된 형태의 C3b인 iC3b의 특이적 인식이 CR3 결합 부위를 C3b 내의 CUB 도메인의 언폴딩(unfolding) 시 노출되게 되는 잔기에 위치시키는 구조적 연구를 기초로 예측되고 ([Nishida et al., Proc Natl Acad Sci USA 103, 19737-19742 (2006)]), 상기 언폴딩은 보체 조절 프로티에이스인 인자 I에 의한 α' 사슬 절단 시에 발생한다.
CRIg는 혈류로부터의 병원체의 소거에 요구되는 JAM1 및 A33 항원에 대한 상동성이 있는 대식세포-회합 수용체이다. 인간 JAM1의 보존된 Ig 도메인을 인식하는 다의성(degenerate) 프라이머를 사용하여 인간 태아 cDNA로부터 인간 CRIg 단백질이 최초로 클로닝되었다. 여러 클론의 서열분석은 아미노산 400개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 나타냈다. BLAST 검색으로 제1형 막횡단 단백질인 Z39Ig에 대한 유사성이 확인되었다 ([Langnaese et al., Biochim Biophys Acta 1492 (2000) 522-525]). 이러한 분자의 세포외 영역은 N-말단 V-set 도메인 및 C-말단 C2-set 도메인을 포함하는 2개의 Ig-유사 도메인으로 구성되는 것으로 발견되었다. 이러한 신규 인간 단백질은 "단일 막횡단 Ig 수퍼패밀리 구성원 대식세포 회합물" (huSTIgMA: single transmembrane Ig superfamily member macrophage associated)로 최초로 칭해졌다. 이어서, 3' 및 5' 프라이머를 사용하여, huSTIgMA의 스플라이스 변이체가 클로닝되었고, 이는 막 인접 IgC 도메인이 없고, 아미노산 50개가 더 짧다. 따라서, 이러한 인간 단백질의 더 짧은 스플라이스 변이체는 huSTIgMAshort로 칭해졌다. huSTIgMA의 아미노산 서열 (PRO362로 지칭됨) 및 코딩 폴리뉴클레오티드 서열이 미국 특허 번호 6,410,708 (2002년 6월 25일 허여)에 개시되어 있다. 또한, huSTIgMA 및 huSTIgMAshort 양쪽 모두가, 뮤린(murine) STIgMA (muSTIgMA) 단백질 및 핵산 서열과 함께, PCT 공개 WO 2004031105 (2004년 4월 15일 공개)에 개시되어 있다.
CRIg 및 C3b:CRIg 복합체의 결정 구조가 미국 출원 공개 번호 2008/0045697 (2008년 2월 21일 공개)에 개시되어 있다.
간 굴모양혈관의 내강 내에 존재하는 쿠퍼(Kupffer) 세포 (KC)는 신체 내의 대식세포의 최대 집단을 형성한다. 다른 조직 거주 대식세포와 공통적인 마커가 KC에 있지만, 이는 소화관의 미세혈관 시스템으로부터 배수되는 문맥혈 내에 존재하는 장-유래 박테리아, 미생물 잔해물, 박테리아 내독소, 면역 복합체 및 죽은 세포의 효율적인 소거를 향해 조정된 특수 기능을 수행한다 ([Bilzer et al., Liver Int 26, 1175-1186 (2006)]). KC 표면에 대한 병원체의 효율적인 결합은 병원체에 대한 일선 면역 방어에서 결정적인 단계이다 ([Benacerraf et al., J Exp Med 110, 27-48 (1959)]). 순환으로부터의 병원체의 신속한 소거에서의 KC의 중심적인 역할은 KC가 결핍된 마우스에서의 현저하게 증가된 사망률에 의해 예증된다 ([Hirakata et al., Infect Immun 59, 289-294 (1991)). CRIg의 확인은 순환 병원체에 대한 일선 면역 방어에서의 보체 및 KC의 결정적인 역할을 추가로 강조한다.
마우스 KC 상에서 확인된 유일한 보체 C3 수용체는 CRIg 및 CR3인 한편 ([Helmy et al., Cell 124, 915-927 (2006)]), 인간 KC는 CR1 및 CR4의 추가적인 발현을 나타낸다 ([Hinglais et al., 1989]). KC 상의 CRIg 및 CR3 양쪽 모두 시험관 내에서 iC3b 옵소닌화 입자에 대한 결합에 기여한다 ([Helmy et al., Lab Invest 61, 509-514 (2006)]). 생체내에서, iC3b-코팅 병원체에 대한 결합에서의 KC-발현 CR3의 역할은 덜 명확하다. CR3은 중성구의 고용 및 중성구-발현 ICAM1과의 상호작용을 통해 간접적으로 병원체의 소거에 기여하는 것으로 제안되었다 ([Conlan and North, Exp Med 179, 259-268 (1994)]; [Ebe et al., Pathol Int 49, 519-532 (1999)]; [Gregory et al., J Immunol 157, 2514-2520 (1996)]; [Gregory and Wing, J Leukoc Biol 72, 239-248 (2002)]; [Rogers and Unanue, Infect Immun 61, 5090-5096 (1993)]). 반면에, CRIg는 간 굴모양혈관 내강을 통과하는 병원체를 포획함으로써 직접적인 역할을 수행한다 ([Helmy et al., 2006, 상기문헌]). CRIg 대 CR3의 생물학에서의 차이가 이러한 2가지 수용체의 결합 특성에서의 차이에 의해 부분적으로 반영된다. KC 상에 발현된 CRIg는 단량체성 C3 단편에 구성적으로 결합하는 반면, CR3은 iC3b-옵소닌화 입자에만 결합한다 ([Helmy et al., 2006, 상기문헌]). 단량체성 C3b 및 iC3b, 뿐만 아니라 C3b/iC3b-코팅 입자를 효율적으로 포획하는 CRIg의 능력은 대식세포의 막 확장물의 첨단부에 농축된 CRIg 분자들 ([Helmy et al., 2006, 상기문헌])과 병원체 표면 상에 존재하는 C3b 및 iC3b의 다량체들 간의 다가 상호작용에 의해 생성된 증가된 결합력(avidity)을 반영한다. CR3은 iC3b-코팅 입자에만 결합하는 한편, CRIg는 혈청-옵소닌화 병원체 상에 형성된 최초의 C3 절단 생성물인 C3b에 추가적으로 결합한다 ([Croize et al., Infect Immun 61, 5134-5139 (1993)]). 병원체 표면에 결합된 다수의 C3b 분자가 인자 H 및 I에 의한 절단으로부터 보호되기 때문에 ([Gordon et al., J Infect Dis 157, 697-704 (1988)]), CRIg에 의한 C3b 리간드의 인식은 신속한 결합 및 소거를 확실하게 한다. 따라서, CRIg 및 CR3 양쪽 모두 KC 상에서 발현되지만, 이들은 상이한 리간드 특이성, 별개의 결합 성질, 및 별개의 병원체 소거 동역학을 나타낸다.
세포 진입을 위해 세포 표면 수용체를 활용하는 병원체의 예는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)와 같은 바이러스, 및 결핵균(Mycobacterium tuberculosum), 나병균(Mycobacterium leprae), 예르시니아 슈도투베르큘로시스(Yersinia pseudotuberculosis), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) 및 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria Monocytogenes)와 같은 세포내 박테리아, 및 프로스티그마토이드(prostigmatoid) 큰 리슈만편모충(Leishmania major)과 같은 기생충이다 ([Cossart and Sansonetti, Science 304:242-248 (2004]); [Galan, Cell 103:363-366 (2000)]; [Hornef et al., Nat. Immunol. 3:1033-1040 (2002)]; [Stoiber et al., Mol. Immunol 42: 153-160 (2005)]).
상기 논의된 바와 같이, CRIg는 조직 거주 대식세포의 하위집단 상에서 발현되는 최근에 발견된 보체 C3 수용체이다. C3 단백질에 대한 보체 수용체로서 기능하는 것 이외에, C3b에 결합하고 C3 및 C5의 단백질분해성 활성화를 억제함으로써 CRIg의 세포외 IgV 도메인은 보체의 대안적 경로를 선택적으로 억제한다. 그러나, 전환효소 서브유닛 C3b에 대한 CRIg 결합 친화력이 낮아서 (IC50 > 1 μM), 거의 완전한 보체 억제에 도달하기 위해 비교적 높은 농도의 단백질이 필요하다. 따라서, 치료 효능이 개선된 CRIg 폴리펩티드가 요구된다. 본 발명은 이같은 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 결합 친화력이 강화된 CRIg 변이체의 구축을 기초로 한다. 아미노산 치환 Q64R 및 M86Y가 조합된 CRIg-ECD 단백질이 야생형 CRIg 변이체에 비해 30배 증가된 결합 친화력 및 7배 개선된 보체 억제 활성을 나타냈다. 또한, 마우스 관절염 모델에서의 친화력-성숙 CRIg 융합 단백질로의 치료가 야생형 CRIg 단백질로의 치료와 비교하여 임상 점수에서의 유의한 감소를 초래하였다.
따라서, 본 발명은 CRIg 변이체에 관한 것이다.
한 양상에서, 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열의 E8-K15, R41-T47, S54-Q64, E85-Q99, 및 Q105-K111로 이루어진 군으로부터 선택된 영역에서의 아미노산 치환을 포함하는 CRIg 변이체에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 변이체는 C3에 비해 C3b, 또는 이의 단편에 선택적으로 결합한다.
또다른 실시양태에서, 변이체는 서열 2의 천연 서열 인간 CRIg에 비해 C3b에 대한 결합 친화력이 증가되었고, 이때 결합 친화력은, 예를 들어, 2배 이상, 또는 3배 이상, 또는 4배 이상, 또는 5배 이상, 또는 6배 이상, 또는 7배 이상, 또는 9배 이상, 또는 10배 이상, 또는 15배 이상, 또는 20배 이상, 또는 30배 이상, 또는 40배 이상, 또는 50배 이상, 또는 70배 이상, 또는 80배 이상, 또는 90배 이상, 또는 100배 이상 증가될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 변이체는 서열 2의 천연 서열 인간 CRIg보다 대안적 보체 경로의 더욱 강력한 억제제이다.
추가적인 실시양태에서, 변이체는 서열 2의 아미노산 서열 내의 위치 8, 14, 18, 42, 44, 45, 60, 64, 86, 99, 105 및 110으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함한다.
추가적인 실시양태에서, 변이체는 서열 2의 아미노산 서열 내의 아미노산 위치 60, 64, 86, 99, 105 및 110 중 하나 이상에서의 아미노산 치환을 포함한다.
추가적인 실시양태에서, 변이체는 E8W, W14F, E84Y/W14F; P45F; G42D/D44H/P45F; Q60I; Q64R; Q60I/Q64R; M86Y; M86W, M86F, M86W/Q9R; M86F/Q99R; K110D, K11N; Q105R/K110N; Q105R/K110Q; 및 Q105K/K110D로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 변이체는 Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/E8Y; Q60I/Q64R/G42D; Q60I/Q64R/P45F; Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F; Q60I/Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/Q105R; Q60I/Q64R/Q105K; Q60I/Q64R/K110N; Q60I/Q105R/K110N; M86Y/E8Y; M86Y/G42D/D44H/P45F; M86Y/P45F; M86Y/G42D/D44H/P45F; 및 M86Y/Q99K/M86Y/Q99R/M86Y/Q105R/M86Y/Q105K/M86Y/Q105R/K110N으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 변이체는 Q60I; Q64R; Q60I/Q64R; M86Y; Q99L; Q105K/K110D; E8W/Q105R/K110N; Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/E8Y; Q60I/Q64R/G42D; Q60I/Q64R/P45F; Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F; Q60I/Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/Q105R; Q60I/Q64R/Q105K; Q60I/Q64R/K110N; M86Y/P45F; 및 M86Y/Q105K로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함한다.
더욱 구체적인 실시양태에서, 변이체는 Q60I/Q64R/M86Y 또는 Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F 치환을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본원에서 정의된 바와 같은 CRIg 변이체를 포함하는 키메라에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 키메라 분자는 면역부착소(immunoadhesin)이다.
또다른 실시양태에서, 면역부착소는 서열 2의 전장 CRIg보다 짧은 CRIg 변이체를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 키메라 분자는 CRIg 세포외 도메인을 포함한다.
추가적인 양상에서, 본 발명은 제약상 허용되는 부형제와 혼합된 본 발명의 CRIg 변이체 또는 키메라 분자, 예를 들어 면역부착소를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
추가적인 양상에서, 본 발명은 예방적 또는 치료적 유효량의 CRIg 변이체 또는 이같은 변이체를 포함하는 키메라 분자, 예컨대 면역부착소를 보체-관련 질환 또는 용태의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 보체-관련 질환 또는 용태의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 보체-관련 질환은 염증성 질환 또는 자가면역 질환이다.
또다른 실시양태에서, 보체-관련 질환은 류머티스성 관절염 (RA), 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 허혈 및 재관류 후의 원거리 조직 손상, 심폐 우회술 도중의 보체 활성화, 피부근염, 천포창, 루푸스 신염 및 결과적인 사구체신염 및 혈관염, 심폐 우회술, 심장마비-유도 관상동맥 내피 기능장애, 제II형 막증식성 사구체신염, IgA 신장병, 급성 신부전증, 한랭글로불린혈증, 항-인지질 증후군, 연령-관련 황반 변성, 포도막염, 당뇨성 망막병증, 타가이식, 초급성 거부, 혈액투석, 만성 폐쇄성 폐 곤란 증후군 (COPD), 천식, 흡인 폐렴, 두드러기, 만성 특발성 두드러기, 용혈성 요독 증후군, 자궁내막증, 심장성 쇼크, 허혈 재관류 손상 및 다발경화증 (MS)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, 보체-관련 질환은 염증성 장 질환 (IBD), 전신성 홍반 루푸스, 류머티스성 관절염, 소아 만성 관절염, 척추관절병, 전신성 경화증 (피부경화증), 특발성 염증성 근육병 (피부근염, 다발성근염), 쇼그렌(Sjogren) 증후군, 전신성 혈관염, 사르코이드증, 자가면역 용혈 빈혈 (면역 범혈구감소증, 발작성 야간 헤모글로빈뇨), 자가면역 혈소판감소증 (특발성 혈소판감소성 자반증, 면역-매개 혈소판감소증), 갑상선염 (그레이브병(Grave's disease), 하시모토(Hashimoto) 갑상선염, 소아 림프구성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 진성 당뇨병, 면역-매개 신장 질환 (사구체신염, 세뇨관간질성 신염), 다발경화증, 특발성 다발신경병증과 같은 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환, 감염성 간염 (A형, B형, C형, D형, E형 간염 및 기타 비-간친화성 바이러스), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담관 간경화, 육아종성 간염 및 경화성 담관염과 같은 간담도 질환, 염증성 및 섬유증성 폐 질환 (예를 들어, 낭성 섬유증), 글루텐-민감성 장병증, 휘플병(Whipple's disease), 수포성 피부 질환, 다형성 홍반 및 접촉성 피부염이 포함되는 자가면역 또는 면역-매개 피부 질환, 건선, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증 및 과민성 폐렴과 같은 폐의 알레르기성 질환, 이식 거부, 이식편-대 숙주 질환이 포함되는 이식 관련 질환, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 발작성 야간 헤모글로빈뇨, 유전성 맥관부종, 죽상동맥경화증 및 제II형 막증식성 사구체신염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 보체-관련 질환은 류머티스성 관절염 (RA)이다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 보체-관련 질환은 보체-관련 눈 용태이다.
추가적인 실시양태에서, 보체-관련 눈 용태는 모든 단계의 연령-관련 황반 변성 (AMD), 포도막염, 당뇨성 및 기타 허혈-관련 망막병증, 안내염 및 기타 안내 신생혈관 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가적인 실시양태에서, 안내 신생혈관 질환은 당뇨성 황반 부종, 병적 근시, 폰 히펠-린다우(von Hippel-Lindau) 질환, 눈 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐쇄 (CRVO), 각막 혈관신생 및 망막 혈관신생으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, 보체-관련 눈 용태는 연령-관련 황반 변성 (AMD), 맥락막 혈관신생 (CNV), 당뇨성 망막병증 (DR) 및 안내염으로 이루어진 군으로부터 선되고, 이때 AMD에는 습식 AMD 및 건식 또는 위축성 AMD 양쪽 모두가 포함된다.
한 실시양태에서, 환자는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 본 발명의 CRIg 변이체 또는 이같은 변이체를 포함하는 면역부착소를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서의 C3b 보체 단편의 생산을 억제하는 방법에 관한 것이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 본 발명의 CRIg 변이체 또는 이같은 변이체를 포함하는 면역부착소를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서의 대안적 보체 경로의 선택적 억제 방법에 관한 것이다.
도 1a-1b는 아미노산 399개의 긴 형태의 전장 천연 인간 CRIg의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다 (huCRIg, 각각 서열 1 및 2).
도 2a-2b는 아미노산 305개의 짧은 형태의 천연 인간 CRIg의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다 (huCRIg-short, 각각 서열 3 및 4).
도 3a-3c는 아미노산 280개의 천연 뮤린 CRIg의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다 (muCRIg, 각각 서열 5 및 6).
도 4: 결합 분석법 및 억제 분석법에서의 CRIg 돌연변이체의 활성. C3b의 경쟁적 교체로서 CRIg에 대한 결합 친화력이 측정되었고 (A), 용혈 억제 분석법에 의해 생물학적 활성이 측정되었다. PUR10680은 야생형 대조군이었고 (적색), RIL 41 (청색) 및 RL41 (녹색)은 2개의 돌연변이체였다 (B). (C) CRIg 결합 계면의 계단식 최적화.
도 5: 경쟁적 ELISA와 용혈 분석법 간의 상관관계.
도 6: 비아코어(Biacore) 분석에 의해 CRIg 돌연변이체 Q64R/M86Y가 개선된 결합 친화력을 나타낸다. (A) 증가되는 농도의 C3b를 코팅된 CRIg wt 및 CRIg Q64R M86Y 단백질 상에 주입함으로써 생성된 SPR 센소그램. B. 결합 데이터의 항정 상태 분석이 Q64R / M86Y 돌연변이체에 대한 0.2 마이크로몰 및 야생형 CRIg에 대한 1.1 마이크로몰의 Kd를 가리킨다.
도 7: 친화력-개선 CRIg가 여전히 C3b에 대해 선택적이다. 알파 스크린(Alpha Screen) 경쟁적 분석법이 정제된 C3 및 C3b 상에서 이용되었다.
도 8: 야생형 CRIg에 비교된 CRIg Q64R M86Y의 개선된 보체 억제 효능. (A) 토끼 적혈구 세포 및 C1q-결핍 인간 혈청을 사용하는 대안적 경로-선택적 용혈 분석법을 사용하여 야생형 CRIg 및 CRIg Q46R M86Y에 의한 보체 억제를 비교하였다. (B) 마이크로웰에 코팅된 LPS 및 C1q-결핍 인간 혈청으로의 ELISA-기반 대안적 경로 분석법을 사용하여 야생형 CRIg 및 CRIg Q46R M86Y에 의한 보체 억제를 비교하였다.
도 9: CRIg Q64R M86Y가 CRIg WT에 비해 생체 내에서 개선된 효능을 나타낸다.
(A) KRN 혈청이 주사되고 다양한 농도 및 버젼의 야생형 및 친화력-성숙 재조합 인간 및 마우스 CRIg 단백질로 치료된 마우스의 임상 점수. 데이터는 군 당 4-7마리의 마우스의 평균을 나타낸다. (B) 혈청 전달 6일 후 개별적인 마우스들로부터의 임상 점수의 산점도. (C) 혈청 전달 6일 후의 CRIg wt 또는 CRIg Q64R M86Y로 치료된 마우스의 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 절편. (D) 혈청 전달 6일 후의 CRIg wt 또는 CRIg Q64R M86Y로 치료된 마우스로부터의 조직학적 점수의 산점도.
표 1: 파지 라이브러리. CRIg와 C3b 사이의 접촉 구역을 포함하도록 5개의 소프트(soft)-무작위화된 라이브러리가 디자인되었다.
표 2: 파지 디스플레이에 의한 친화력이 더 높은 CRIg의 계단식 생성. 5개의 소프트-무작위화된 라이브러리로부터의 CRIg 항-C3b의 선택된 돌연변이체. 각각의 패널은 C3b에 대한 결합 친화력을 기초로 각각의 라이브러리로부터 선택된 클론을 나타낸다. 단일 문자 아미노산 코드로 서열이 표시된다. 각각의 패널은 개별적인 돌연변이체들을 컨센서스 및 어버이 야생형 (WT) 서열과 비교한다. 잔기들이 이에 따라 채색된다: 청색 - 소프트-무작위화된 위치; 회색- 무작위화되지 않음; 황색 - 야생형 (WT)과 상이한, 선택된 잔기. 표 2는 나타난 순서대로 각각 서열 21-63 및 63-67을 개시한다.
표 3: 선택된 돌연변이체들의 경쟁적 ELISA에 의해 결정된 결합 친화력 및 생체내 용혈 억제의 비교. 결합 친화력 또는 생체내 효능이 5배를 초과하여 증가된 돌연변이체들이 황색 음영으로 표시된다.
표 4: 제2 세대 돌연변이체에 대한 결합 친화력 및 생체내 용혈 억제의 비교 (어버이 서열이 회색으로 표시됨). 결합 친화력이 어버이 돌연변이체에 비해 5배를 초과하여 증가된 돌연변이체가 청색으로 강조되고, 결합 친화력이 90배를 초과하여 증가된 돌연변이체가 황색으로 강조된다. 유사하게, 어버이 서열에 비해 생체내 효능이 더 큰 돌연변이체가 주황색 음영으로 표시된다.
I. 정의
용어 "CRIg", '"PRO362", "JAM4", 및 "STIgMA"는 상호교환가능하게 사용되고, 천연 서열 및 변이체 CRIg 폴리펩티드를 지칭한다.
"천연 서열" CRIg는, 이의 제조 방식과 상관 없이, 천연으로부터 유래된 CRIg 폴리펩티드와 아미노산 서열이 동일한 폴리펩티드다. 따라서, 천연 서열 CRIg는 천연으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 및/또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열 CRIg"는 천연-발생 말단절단 또는 분비 형태의 CRIg (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 천연-발생 변이체 형태 (예를 들어, 별법적으로 스플라이싱된 형태) 및 CRIg의 천연-발생 대립유전자 변이체를 특히 포함한다. 천연 서열 CRIg 폴리펩티드에는 N-말단 신호 서열이 있거나 없고, 위치 1의 개시 메티오닌이 있거나 없으며, 서열 2의 대략적인 아미노산 위치 277 내지 307의 임의의 또는 모든 막횡단 도메인이 있거나 없는, 서열 2의 아미노산 399개 길이의 전장 인간 CRIg 폴리펩티드 (huCRIg, 도 1a 및 1b에 제시됨)가 특히 포함된다. 추가적인 실시양태에서, 천연 서열 CRIg 폴리펩티드는 N-말단 신호 서열이 있거나 없고, 위치 1의 개시 메티오닌이 있거나 없으며, 서열 4의 대략적인 위치 183 내지 213의 임의의 또는 모든 막횡단 도메인이 있거나 없는, 아미노산 305개의 짧은 형태의 인간 CRIg (huCRIg-short, 서열 4, 도 2a 및 2b에 제시됨)이다. 또다른 실시양태에서, 천연 서열 CRIg 폴리펩티드는 N-말단 신호 서열이 있거나 없고, 위치 1에 개시 메티오닌이 있거나 없으며, 서열 6의 대략적인 아미노산 위치 181 내지 211의 임의의 또는 모든 막횡단 도메인이 있거나 없는, 서열 6의 아미노산 280개 길이의 전장 뮤린 CRIg 폴리펩티드 (muCRIg, 도 3a-3c에 제시됨)이다. 고등 영장류 및 포유류가 포함되는 기타 비-인간 동물의 CRIg 폴리펩티드가 이러한 정의 내에 특히 포함된다.
CRIg "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 각각의 전장 분자의 막횡단 및 세포질 도메인이 본질적으로 없는 형태의 CRIg 폴리펩티드를 지칭한다. 통상적으로, CRIg ECD에는 1％ 미만의 이같은 막횡단 및/또는 세포질 도메인이 있을 것이고, 바람직하게는 0.5％ 미만의 이같은 도메인들이 있을 것이다. CRIg ECD는 서열 2, 4, 또는 6의 아미노산 잔기 1 또는 약 21에서 X까지 포함할 수 있고, 이때 X는 서열 2의 약 271 내지 281 중 임의의 아미노산, 서열 4의 약 178 내지 186 중 임의의 아미노산, 및 서열 6의 약 176 내지 184 중 임의의 아미노산이다.
본원에서 사용된 용어 "CRIg 변이체"는 전장 huCRIg (서열 2), huCRIg-short (서열 4) 및 muCRIg (서열 6) (각각 N-말단 개시 메티오닌이 있거나 없고, N-말단 신호 서열이 있거나 없으며, 막횡단 도메인 모두 또는 이의 일부분이 있거나 없고, 세포내 도메인이 있거나 없음)이 비제한적으로 포함되는 천연 서열 CRIg 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상인 하기 정의되는 바와 같은 활성 CRIg 폴리펩티드를 의미한다. 특정 실시양태에서, CRIg 변이체는 서열 2의 서열 내로부터의 성숙형 전장 폴리펩티드와의 아미노산 서열 상동성이 약 80％ 이상이다. 또다른 실시양태에서, CRIg 변이체는 서열 4의 서열 내로부터의 성숙형 전장 폴리펩티드와의 아미노산 서열 상동성이 약 80％ 이상이다. 또다른 실시양태에서, CRIg 변이체는 서열 6의 서열 내로부터의 성숙형 전장 폴리펩티드와의 아미노산 서열 상동성이 약 80％ 이상이다. 통상적으로, CRIg 변이체는 서열 2, 4, 또는 6 내로부터의 성숙형 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 또는 약 85％ 이상, 또는 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상, 또는 약 98％ 이상, 또는 약 99％ 이상일 것이다. 실시예가 포함되는 명세서 전반에 걸쳐, 용어 "야생형" 또는 "WT"는 짧은 형태의 성숙형 전장 인간 CRIg (CRIg(S)) (서열 4)를 지칭하고, CRIg 변이체 내의 아미노산 잔기의 번호매김은 서열 4의 서열을 지칭한다.
본 발명의 CRIg 변이체는 하기에 정의되는 바와 같은 CRIg 작동제이다. 특히, 본원에서의 CRIg 변이체는 C3에 비해 C3b에 대한 선택적 결합을 유지하고, 이때 "선택적 결합"은 C3b에 결합하는 것 및 C3에 결합하는 것의 결여를 지칭하도록 사용된다. 또한, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 CRIg 변이체는 천연 서열 CRIg 폴리펩티드, 예컨대 긴 형태의 인간 CRIg (서열 2)에 비해 C3b에 대한 결합 친화력이 증가되었다. 다양한 실시양태에서, 결합 친화력에서의 증가는 서열 2의 천연 서열 인간 CRIg 폴리펩티드에 비해 약 2배 이상, 또는 약 3배 이상, 또는 약 4배 이상, 또는 약 5배 이상, 또는 약 6배 이상, 또는 약 7배 이상, 또는 약 8배 이상, 또는 약 9배 이상, 또는 약 10배 이상, 또는 약 15배 이상, 또는 약 20배 이상, 또는 약 25배 이상, 또는 약 30배 이상, 또는 약 35배 이상, 또는 약 40배 이상, 또는 약 45배 이상, 또는 약 50배 이상, 또는 약 55배 이상, 또는 약 60배 이상, 또는 약 65배 이상, 또는 약 70배 이상, 또는 약 75배 이상, 또는 약 80배 이상, 또는 약 85배 이상, 또는 약 90배 이상, 또는 약 95배 이상, 또는 약 100배 이상이다. 또다른 실시양태에서, 서열 2의 천연 서열 인간 CRIg 폴리펩티드에 비해 C3b에 대한 결합 친화력에서의 증가는 약 5-10배, 또는 약 5-15배, 또는 약 5-20배, 또는 약 5-25배, 또는 약 5-25배, 또는 약 5-30배, 또는 약 5-35배, 또는 약 5-40배, 또는 약 5-45배, 또는 약 5-50배, 또는 약 5-55배, 또는 약 5-60배, 또는 약 5-65배, 또는 약 5-70배, 또는 약 5-75배, 또는 약 5-80배, 또는 약 5-85배, 또는 약 5-90배, 또는 약 5-95배, 또는 약 5-100배이다.
본원에서의 CRIg 변이체에 관한 "백분율 (％) 아미노산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭(gap)을 도입하여, 최대 백분율의 서열 동일성을 달성한 후의 자신이 비교되는 천연 CRIg 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 CRIg 변이체 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되고, 이때 어떠한 보존성 치환도 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 길이가 상이한 서열들에 대해, 백분율 서열 동일성은 더 긴 서열의 전체 길이를 따라 더 긴 서열에 관하여 결정된다. 백분율 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터들을 결정할 수 있다. 그 후, 더 긴 서열에 관하여 서열 동일성이 계산되고, 즉, 더 짧은 서열이 더 긴 서열의 일부분과의 100％ 서열 동일성을 나타내더라도, 전체적인 서열 동일성은 100％ 미만일 것이다.
본원에서 확인된 CRIg 변이체 코딩 서열에 관한 "백분율 (％) 핵산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭을 도입하여, 최대 백분율의 서열 동일성을 달성한 후의 CRIg 변이체 코딩 서열 내의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드의 백분율로 정의된다. 백분율 핵산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터들을 결정할 수 있다. 그 후, 더 긴 서열에 관하여 서열 동일성이 계산되고, 즉, 더 짧은 서열이 더 긴 서열의 일부분과의 100％ 서열 동일성을 나타내더라도, 전체적인 서열 동일성은 100％ 미만일 것이다.
CRIg 변이체의 정의에는, 이의 확인 또는 제조 방식과 관계 없이, 모든 아미노산 서열 변이체가 포함된다. 천연 서열 CRIg의 정성적인 생물학적 성질을 유지하는 한, 치환에 의해, 화학적으로, 효소에 의해, 또는 기타 적합한 수단에 의해 천연 발생 아미노산 이외의 모이어티(moiety)로 변형된 변이체가 본원에서 명확하게 포함된다. 예시적인 비-천연 발생 아미노산 치환에는 본원에서 하기에 기술된 것들이 포함된다.
아미노산 잔기는 4가지 주요 군으로 분류된다:
산성: 잔기가 생리학적 pH에서 H 이온의 상실로 인해 음성 전하를 띠고, 잔기가 이를 함유하는 펩티드가 수용액 내에 있을 때 이러한 펩티드의 입체구조에서 표면 위치를 향하도록 수용액에 의해 끌어당겨진다.
염기성: 잔기가 생리학적 pH에서 H 이온과의 회합으로 인해 양성 전하를 띠고, 잔기가 이를 함유하는 펩티드가 생리학적 pH에서 수성 매질 내에 있을 때 이러한 펩티드의 입체구조에서 표면 위치를 향하도록 수용액에 의해 끌어당겨진다.
중성/비-극성: 잔기가 생리학적 pH에서 전하를 띠지 않고, 잔기가 이를 함유하는 펩티드가 수성 매질 내에 있을 때 이러한 펩티드의 입체구조에서 내부 위치를 향하도록 수용액에 의해 반발된다. 이러한 잔기는 "소수성 잔기"로 또한 칭해진다.
중성/극성: 잔기가 생리학적 pH에서 전하를 띠지 않지만, 잔기가 이를 함유하는 펩티드가 수성 매질 내에 있을 때 이러한 펩티드의 입체구조에서 외부 위치를 향하도록 수용액에 의해 끌어당겨진다.
아미노산 잔기는 이의 측쇄 기에 관하여 고리형 또는 비-고리형, 방향족 또는 비-방향족으로 추가로 분류될 수 있고, 이러한 호칭은 당업자에게 일상적이다.
유전자 코드에 의해 코딩되지 않는 통상적으로 사용되는 아미노산에는 Glu 및 Asp에 대한 2-아미노 아디프산 (Aad); Glu 및 Asp에 대한 2-아미노피멜산 (Apm); Met, Leu 및 기타 지방족 아미노산에 대한 2-아미노부티르산 (Abu); Met, Leu 및 기타 지방족 아미노산에 대한 2-아미노헵탄산; Gly에 대한 2-아미노이소부티르산 (Aib); Val, 및 Leu 및 Ile에 대한 시클로헥실알라닌 (Cha); Arg 및 Lys에 대한 호모아르기닌 (Har); Lys, Arg 및 His에 대한 2,3-디아미노프로피온산 (Dpr); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신 (EtGly); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신 (EtGly); Asn 및 Gln에 대한 N-에틸아스파라긴 (EtAsn); Lys에 대한 하이드록시라이신 (Hyl); Lys에 대한 알로하이드록시라이신 (AHyl); Pro, Ser 및 Thr에 대한 3-(및 4)하이드록시프롤린 (3Hyp, 4Hyp); Ile, Leu 및 Val에 대한 알로-이소류신 (AIle); Ala에 대한 로(rho)-아미디노페닐알라닌; Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-메틸글리신 (MeGly, 사르코신); Ile에 대한 N-메틸이소류신 (MeIle); Met 및 기타 지방족 아미노산에 대한 노르발린 (Nva); Met 및 기타 지방족 아미노산에 대한 노르류신 (Nle); Lys, Arg 및 His에 대한 오르니틴 (Orn); Thr, Asn 및 Gln에 대한 시트룰린 (Cit) 및 메티오닌 술폭시드 (MSO); Phe에 대한 N-메틸페닐알라닌 (MePhe), 트리메틸페닐알라닌, 할로 (F, Cl, Br, 및 I)페닐알라닌, 트리플로우릴페닐알라닌이 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "면역부착소"는 이종성 단백질 ("부착소")의 결합 특이성이 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 조합된 항체-유사 분자를 의미한다. 구조적으로, 면역부착소는 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌 (즉, "이종성"인) 원하는 결합 특이성이 있는 아미노산 서열과 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합물을 포함한다. 전형적으로 면역부착소 분자의 부착소 부분은 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 적어도 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역부착소 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD, 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.
"치료"는 장애의 발달을 방지하거나 이의 병리학을 변경시키려는 의도로 수행되는 개입이다. 따라서, "치료"는 치유적 치료, 및 예방적 또는 방지성 수단 양쪽 모두를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상에는 이미 장애가 있는 대상, 뿐만 아니라 장애를 방지하려는 대상이 또한 포함된다.
본원에서 사용된 "완화시킨다"는 더 양호하게 하거나 개선시키는 것으로 본원에서 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "포유동물"은 인간, 비-인간 영장류, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 운동 또는 애완 동물 예컨대 말, 돼지, 소, 개, 고양이 및 흰족제비 등이 비제한적으로 포함되는, 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 포유동물은 고등 영장류이고, 가장 바람직하게는 인간이다.
용어 "보체-관련 질환"은 가장 넓은 의미로 본원에서 사용되고, 질환 및 용태의 발병기전이 보체 시스템의 활성화의 이상, 예를 들어, 보체 결핍을 수반하는 모든 질환 및 병리학적 용태를 포함한다. 이러한 용어는 C3 전환효소의 억제가 이로운 질환 및 병리학적 용태를 특히 포함한다. 이러한 용어는 대안적 보체 경로의 억제 (선택적 억제 포함)가 이로운 질환 및 병리학적 용태를 추가적으로 포함한다. 보체-관련 질환에는 염증성 질환 및 자가면역 질환, 예를 들어, 류머티스성 관절염 (RA), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 허혈 및 재관류 후의 원거리 조직 손상, 심폐 우회술 도중의 보체 활성화, 피부근염, 천포창, 루푸스 신염 및 결과적인 사구체신염 및 혈관염, 심폐 우회술, 심장마비-유도 관상동맥 내피 기능장애, 제II형 막증식성 사구체신염, IgA 신장병, 급성 신부전증, 한랭글로불린혈증, 항인지질 증후군, 연령-관련 황반 변성, 포도막염, 당뇨성 망막병증, 타가이식, 초급성 거부, 혈액투석, 만성 폐쇄성 폐 곤란 증후군 (COPD), 천식, 및 흡인 폐렴이 비제한적으로 포함된다. 바람직한 실시양태에서, "보체-관련 질환"은 류머티스성 관절염 (RA), 보체-관련 눈 용태, 예컨대 연령-관련 황반 변성, 항인지질 증후군, 장 및 신장 허혈-재관류 손상 및 제II형 막증식성 사구체신염이 포함되는, 보체의 대안적 경로가 우세한 역할을 하는 질환이다.
용어 "보체-관련 눈 용태"는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용되고, 용태 및 질환의 병리학이 보체 (보체의 고전적 경로 및 대안적 경로, 특히 대안적 경로 포함)를 수반하는 모든 눈 용태 및 질환을 포함한다. 용태 및 질환의 발생, 발달 또는 진행이 대안적 경로의 억제에 의해 제어될 수 있는, 대안적 경로와 관련된 모든 눈 용태 및 질환이 이러한 군에 특히 포함된다. 보체-관련 눈 용태에는 황반 변성 질환, 예컨대 모든 단계의 연령-관련 황반 변성 (AMD) (전식 및 습식 (비-삼출성 및 삼출성) 형태 포함), 맥락막 혈관신생 (CNV), 포도막염, 당뇨성 및 기타 허혈-관련 망막병증, 안내염, 및 기타 안내 신생혈관 질환, 예컨대 당뇨성 황반 부종, 병적 근시, 폰 히펠-린다우 질환, 눈 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐쇄 (CRVO), 각막 혈관신생 및 망막 혈관신생이 비제한적으로 포함된다. 보체-관련 눈 용태의 바람직한 군에는 연령-관련 황반 변성 (AMD) (비-삼출성 (습식) 및 삼출성 (건식 또는 위축성) AMD 포함), 맥락막 혈관신생 (CNV), 당뇨성 망막병증 (DR), 및 안내염이 포함된다
용어 "염증성 질환" 및 "염증성 장애"는 상호교환가능하게 사용되고, 포유동물의 면역계의 성분이 포유동물에서의 이환율에 기여하는 염증성 응답을 야기하거나, 이를 매개하거나 또는 다른 방식으로 이에 기여하는 질환 또는 장애를 의미한다. 염증성 응답의 감소가 질환의 진행에 대한 완화 효과가 있는 질환이 또한 포함된다. 이러한 용어에는 자가면역 질환이 포함되는 면역-매개 염증성 질환이 포함된다.
용어 "T-세포 매개" 질환은 T 세포가 직접적으로 또는 간접적으로 포유동물에서의 이환율을 매개하거나 또는 다른 방식으로 이에 기여하는 질환을 의미한다. T 세포 매개 질환은 세포 매개 효과, 림포카인 매개 효과 등, 심지어 B 세포가, 예를 들어, T 세포에 의해 분비된 림포카인에 의해 자극되는 경우 B 세포와 관련된 효과와 관련될 수 있다.
면역-관련 및 염증성 질환의 예 (이들 중 일부는 T 세포 매개 질환임)로는 염증성 장 질환 (IBD), 전신성 홍반 루푸스, 류머티스성 관절염, 소아 만성 관절염, 척추관절병, 전신성 경화증 (피부경화증), 특발성 염증성 근육병 (피부근염, 다발성근염), 쇼그렌 증후군, 전신성 혈관염, 사르코이드증, 자가면역 용혈 빈혈 (면역 범혈구감소증, 발작성 야간 헤모글로빈뇨), 자가면역 혈소판감소증 (특발성 혈소판감소성 자반증, 면역-매개 혈소판감소증), 갑상선염 (그레이브병, 하시모토 갑상선염, 소아 림프구성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 진성 당뇨병, 면역-매개 신장 질환 (사구체신염, 세뇨관간질성 신염), 다발경화증, 특발성 다발신경병증과 같은 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환, 감염성 간염 (A형, B형, C형, D형, E형 간염 및 기타 비-간친화성 바이러스), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담관 간경화, 육아종성 간염 및 경화성 담관염과 같은 간담도 질환, 염증성 및 섬유증성 폐 질환 (예를 들어, 낭성 섬유증), 글루텐-민감성 장병증, 휘플병, 수포성 피부 질환, 다형성 홍반 및 접촉성 피부염이 포함되는 자가면역 또는 면역-매개 피부 질환, 건선, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증 및 과민성 폐렴과 같은 폐의 알레르기성 질환, 이식 거부, 이식편-대 숙주 질환이 포함되는 이식 관련 질환, 알츠하이머병, 및 죽상동맥경화증이 비제한적으로 포함된다.
하나 이상의 추가적인 치료제와의 "조합" 투여는 동시 (공동) 투여 및 임의 순서의 연속 투여를 포함한다.
본 발명의 CRIg 폴리펩티드의 변이체의 문맥에서 "활성인" 또는 "활성"은 본 발명의 천연 또는 천연-발생 폴리펩티드의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 유지하는 이같은 폴리펩티드의 형태(들)을 지칭한다. 바람직한 생물학적 활성은 C3b에 결합하고/하거나, 보체 또는 보체 활성화에 영향을 미치는, 특히 대안적 보체 경로 및/또는 C3 전환효소를 억제하는 능력이다. 예를 들어, 콜라겐- 또는 항체-유도 관절염 동안 정상 혈청 내의 C3 교체(turnover)의 억제, 또는 관절염성 관절 내의 C3 침착의 억제를 측정함으로써 C3 전환효소의 억제를 측정할 수 있다.
CRIg 생물학적 활성을 모방하는 폴리펩티드의 문맥에서의 "생물학적 활성"은, 부분적으로, C3b에 결합하고/하거나 보체 또는 보체 활성화에 영향을 미치는, 특히 대안적 보체 경로 및/또는 C3 전환효소를 억제하는 이같은 분자의 능력을 지칭한다.
용어 CRIg "작동제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 천연 서열 CRIg 폴리펩티드의 정성적 생물학적 활성 (상기 정의된 바와 같음)을 모방하는 임의의 분자를 포함한다.
"작동가능하게 연결된"은 성분들의 정상적인 기능이 수행될 수 있도록 하는 병치(juxtaposition)를 지칭한다. 따라서, 제어 서열에 "작동가능하게 연결된" 코딩 서열은 코딩 서열이 이러한 제어 서열의 제어 하에 발현될 수 있고, 연결되는 DNA 서열들이 인접하며, 분비 리더(leader)의 경우에는 인접하고 리딩 프레임 내에 있는 형상을 지칭한다. 예를 들어, 전서열(presequence) 또는 분비 리더에 대한 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우에 상기 DNA가 상기 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이거나; 프로모터 또는 인핸서가 코딩 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우에 프로모터 또는 인핸서가 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이거나; 또는 리보솜 결합 부위가 번역을 용이하게 하도록 배치된 경우에 리보솜 결합 부위가 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 이같은 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 관례에 따라 사용된다.
"제어 서열"은 특정 숙주 생물에서의 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 예를 들어, 원핵생물에 적절한 제어 서열은 프로모터, 임의적으로는 오퍼레이터(operator) 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서를 이용하는 것으로 공지되어 있다.
"발현 시스템"은 이러한 DNA 서열로 형질전환된 숙주가 코딩된 단백질을 생산할 수 있도록, 작동가능하게 연결된 원하는 코딩 서열 및 제어 서열을 함유하는 DNA 서열을 지칭한다. 형질전환을 초래하기 위해, 발현 시스템이 벡터 내에 포함될 수 있다; 그러나, 그후 관련 DNA가 숙주 염색체 내로 또한 통합될 수 있다.
본원에서 사용된 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되고, 모든 이같은 명칭들은 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 또는 "형질전환된 세포"는 1차 대상 세포, 및 계대 회수와 관계없이 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 고의적인 또는 우연한 돌연변이가 일어날 수 있기 때문에, DNA 함량 면에서 모든 자손이 정확하게 동일하지 않을 수 있는 것으로 또한 이해된다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능이 있는 돌연변이체 자손이 포함된다. 별개의 명칭이 의도되는 경우, 이는 문맥으로부터 명백할 것이다.
"플라스미드"는 대문자 및/또는 숫자가 선행 및/또는 후행하는 소문자 "p"로 표시된다. 본원에서의 출발 플라스미드는 시판되거나, 제한없이 공개적으로 입수가능하거나, 또는 이같은 입수가능한 플라스미드로부터 공개된 절차에 따라 구축될 수 있다. 또한, 또다른 등가의 플라스미드들이 당업계에 공지되어 있고, 당업자에게 명백할 것이다.
"파지 디스플레이 라이브러리"는 클로닝된 단백질 서열의 선집을 파지 코트 단백질과의 융합물로서 발현하는 단백질 발현 라이브러리이다. 따라서, "파지 디스플레이 라이브러리"라는 구절은 파지가 외부 (전형적으로는 이종성) 단백질을 발현하는 파지 (예를 들어, 필라멘트성 파지)의 선집을 본원에서 지칭한다. 외부 단백질은 파지가 접촉하는 다른 모이어티들과 자유롭게 상호작용한다 (이에 결합한다). 외부 단백질을 디스플레이하는 각각의 파지가 파지 디스플레이 라이브러리의 "구성원"이다.
용어 "필라멘트성 파지"는 이종성 폴리펩티드를 자신의 표면 상에 디스플레이할 수 있는 바이러스 입자를 지칭하고, 여기에는 f1, fd, Pf1, 및 M13이 비제한적으로 포함된다. 필라멘트성 파지는 선별성 마커 예컨대 테트라사이클린 (예를 들어, "fd-tet")을 함유할 수 있다. 다양한 필라멘트성 파지 디스플레이 시스템이 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, [Zacher et al., Gene, 9:127-140 (1980)], [Smith et al., Science, 228:1315-1317 (1985)]; 및 [Parmley and Smith, Gene 73:305-318 (1988)] 참조).
용어 "패닝(panning)"은 표적에 대한 높은 친화력 및 특이성이 있는 화합물, 예컨대 항체를 보유하는 파지의 확인 및 단리에서의 여러 라운드의 스크리닝 프로세스를 지칭하도록 사용된다.
"보존된 아미노산 잔기"라는 구절은 서로 배열된 2개 이상의 아미노산 서열 간에 동일한 아미노산 잔기를 지칭하도록 사용된다.
II. 상세한 설명
보체는 선천 면역 및 적응 면역 응답의 중요한 성분이지만, 3가지 보체 경로 (고전적, 대안적 및 렉틴) 각각의 활성화를 통해 생성된 보체 분할 생성물은 염증 및 조직 파괴를 야기한다. 따라서, 적합한 보체 조절의 결여로 인한 제어되지 않은 보체 활성화가 다양한 만성 염증성 질환과 관련되었다. C3a 및 C5a 수용체를 통해 중성구 및 염증성 대식세포의 화학유인제 및 활성화제로서 기능하는 보체 분할 생성물 C3a 및 C5a가 이러한 염증성 케스케이드에서 우세하다 ([Mollnes, T.E., W.C. Song, and J.D. Lambris. 2002. Complement in inflammatory tissue damage and disease. Trends Immunol. 23:61-64]).
CRIg는 조직 거주 대식세포의 하위집단 상에서 발현되는 최근에 발견된 보체 수용체이다. 기능성 수용체로서, CRIg의 세포외 IgV 도메인은 보체의 대안적 경로의 선택적 억제제이다 ([Wiesmann et al., Nature, 444(7116):217-20, 2006]). 가용성 형태의 CRIg가 관절 내의 보체의 대안적 경로를 억제함으로써 관절염의 실험 모델에서 염증 및 골 손실을 역전시키는 것으로 나타났다. 보체의 대안적 경로가 질환 유도뿐만 아니라, 질환 진행에도 필요한 것으로 또한 나타났다. 따라서, CRIg에 의한 대안적 경로의 억제는 질환 및 장애의 발병기전이 보체의 대안적 경로를 수반하는 질환 및 장애의 예방 및 치료에 대한 유망한 치료 수단을 구성한다. 추가적인 상세사항을 위해, 예를 들어 [Helmy et al., Cell, 125(1):29-32 2006)] 및 [Katschke et al., J. Exp Med 204(6):1319-1325 (2007)] 참조.
그러나, 전환효소 서브유닛 C3b에 대한 CRIg 친화력이 낮다 (마이크로몰 범위). 치료 시약을 개발하도록 더욱 강력한 억제제를 생성시키기 위해, C3b와의 복합체 내의 CRIg의 결정 구조가 안내물로서 사용되었고, 본 발명가들은 파지 디스플레이 기술을 사용하여, C3b에 대한 결합 친화력이 개선된 CRIg 변이체를 생성시켰다.
따라서, 본 발명은 성질이 개선된, 예컨대 C3b에 대한 결합 친화력이 개선되고 억제 효능이 강화된 CRIg 변이체에 관한 것이다.
친화력-성숙 CRIg 변이체의 확인
실시예에 더욱 상세하게 기술되는 바와 같이, 단백질 또는 펩티드 라이브러리의 파지 디스플레이는 C3b에 대한 개선된 결합 친화력 및/또는 또다른 개선된 성질, 예컨대 강화된 생물학적 활성을 지니는 CRIg 변이체의 선별을 위한 유용한 방법을 제공한다 ([Smith, G. P., (1991) Curr. Opin. Biotechnol. 2:668-673]). M13 유전자 III 코트 단백질 ([Clackson, T., (1994) et al., Trends Biotechnol. 12:173-183])과의 융합물로서 1가 방식으로 디스플레이된 고친화력 단백질이 다수의 라운드의 결합 선별 후 파지미드 입자 내에 패키징된 상응하는 DNA의 클로닝 및 서열분석에 의해 확인될 수 있다.
파지 디스플레이를 사용하는 친화력 성숙이, 예를 들어, [Lowman et al., Biochemistry 30(45): 10832-10838 (1991)]에서 기술되었고, [Hawkins et al, J. Mol Biol. 254: 889-896 (1992)], 및 하기의 실시예를 또한 참조한다. 하기의 설명에 엄격하게 제한되지 않으면서, 이러한 프로세스는 미리 정해진 영역 내의 여러 부위가 각각의 부위에서의 모든 가능한 아미노산 치환이 생성되도록 돌연변이되는 것으로 간략하게 기술될 수 있다. 이렇게 생성된 항체 돌연변이체가 각각 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합물로서 필라멘트성 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 여러 라운드의 결합 선별을 통해 다양한 돌연변이체를 발현하는 파지가 사이클링(cycling)될 수 있고, 높은 친화력을 디스플레이하는 돌연변이체들의 단리 및 서열분석이 이어진다. 미국 특허 번호 5,750,373 (1998년 5월 12일 허여)에 방법이 또한 기술되어 있다.
풀링(pooling)된 친화력 디스플레이가 수반되는 변형된 절차가 [Cunningham, B. C. et al, EMBO J. 13(11), 2508-2515 (1994)]에 기술되어 있다. 이러한 방법은 a) 폴리펩티드를 코딩하는 제1 유전자, 천연 또는 야생형 파지 코트 단백질의 적어도 일부분을 코딩하는, 제1 유전자와 이종성인 제2 유전자, 및 제1 유전자 및 제2 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소를 포함하는 복제가능한 발현 벡터를 구축함으로써 융합 단백질을 코딩하는 유전자 융합물을 형성시키는 단계; b) 제1 유전자 내의 하나 이상의 선택된 위치에서 벡터를 돌연변이시킴으로써 관련 플라스미드들의 패밀리를 형성시키는 단계; c) 적절한 숙주 세포를 이러한 플라스미드들로 형질전환시키는 단계; d) 형질전환된 숙주 세포를 파지 코트 단백질을 코딩하는 헬퍼 파지로 감염시키는 단계; e) 플라스미드의 적어도 일부분을 함유하고 숙주를 형질전환시킬 수 있는 재조합 파지미드 입자를 형성시키는데 적절한, 미량의 파지미드 입자만이 입자의 표면 상에 융합 단백질의 1개를 초과하는 카피를 디스플레이하도록 조정된 조건 하에, 형질전환된 감염된 숙주 세포를 배양하는 단계; f) 파지미드 입자의 적어도 일부분이 표적 분자에 결합하도록 파지미드 입자를 표적 분자와 접촉시키는 단계; 및 g) 결합한 파지미드 입자를 그렇지 않은 것들로부터 분리하는 단계를 포함하는 신규 결합 폴리펩티드의 선별 방법을 제공한다. 바람직하게는, 이러한 방법은 적절한 숙주 세포를 표적 분자에 결합하는 재조합 파지미드 입자로 형질전환시키는 것, 및 단계 d) 내지 g)를 1회 이상 반복하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 CRIg 변이체가 파지 디스플레이를 사용하여 확인되었지만, 또다른 기술 및 또다른 디스플레이 기술이 친화력-성숙 CRIg 변이체가 포함되는 성질이 개선된 CRIg 변이체를 확인하는데 또한 사용될 수 있음을 주지한다.
미국 출원 공개 번호 20080045697에 개시된 CRIg 및 C3b:CRIg 복합체의 결정 구조를 사용하여 확인된, CRIg와 C3b 사이의 접촉 구역을 포함하도록 본 발명의 친화력-성숙 CRIg 변이체가 디자인되었다. 특히, 표 1에 나타난 바와 같이, 서열 2의 천연 서열 전장 CRIg 분자의 잔기 E8-K15, R41-T47, S54-Q64, E85-Q99, 및 Q105-K111를 각각 포함하도록 라이브러리 1-5가 디자인되었다.
한 실시양태에서, 본원에서의 CRIg 변이체는 서열 2의 아미노산 서열 내의 위치 8, 14, 18, 42, 44, 45, 60, 64, 86, 99, 105 및 110으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 함유한다.
대표적인 본원에서의 CRIg 변이체가 표 3에 기재된다.
바람직하게는, 서열 2의 전장 천연 CRIg의 아미노산 서열의 아미노산 위치 60, 64, 86, 99, 105 및 110 중 하나 이상에서 치환된다.
비제한적으로, 친화력-성숙 CRIg 변이체는 서열 2 내에 하기의 치환들 중 하나 이상을 특히 포함한다: E8W, W14F, E84Y/W14F; P45F; G42D/D44H/P45F; Q60I; Q64R; Q60I/Q64R; M86Y; M86W, M86F, M86W/Q9R; M86F/Q99R; K110D, K11N; Q105R/K110N; Q105R/K110Q; Q105K/K110D.
2개 이상의 아미노산 치환이 있는 서열 2의 천연 서열 CRIg의 추가적인 변이체가 표 3에서 제시된다. Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/E8Y; Q60I/Q64R/G42D; Q60I/Q64R/P45F; Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F; Q60I/Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/Q105R; Q60I/Q64R/Q105K; Q60I/Q64R/K110N; Q60I/Q105R/K110N; M86Y/E8Y; M86Y/G42D/D44H/P45F; M86Y/P45F; M86Y/G42D/D44H/P45F; M86Y/Q99K/M86Y/Q99R/M86Y/Q105R/M86Y/Q105K/M86Y/Q105R/K110N이 이러한 군에 특히 포함된다.
바람직한 본원에서의 CRIg 변이체는 Q60I; Q64R; Q60I/Q64R; M86Y; Q99L; Q105K/K110D; E8W/Q105R/K110N; Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/E8Y; Q60I/Q64R/G42D; Q60I/Q64R/P45F; Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F; Q60I/Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/Q105R; Q60I/Q64R/Q105K; Q60I/Q64R/K110N; M86Y/P45F; M86Y/Q105K로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다.
특히 바람직한 변이체는 돌연변이 Q60I/Q64R/M86Y 또는 Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F를 포함한다.
상기에 또는 표 3 및 4에 열거된 돌연변이들 중 하나 이상을 함유하지만 다른 면에서는 서열 2의 천연 CRIg 서열을 유지하는 변이체가 본원에 특히 포함된다. 특정 돌연변이를 열거한 후 "CRIg"가 뒤따르는 것에 의해 이같은 변이체들이 본원에서 명명될 것이다. 따라서, 예를 들어, 돌연변이 E8W에 의해서만 서열 2의 천연 서열 CRIg와 상이한 변이체는 "E8W CRIg"로 명명될 것이고, 돌연변이 Q60I/Q64R/M86Y에 의해서만 서열 2의 천연 서열 CRIg와 상이한 변이체는 "Q60I/Q64R/M86Y CRIg"로 명명될 것이다.
CRIg 변이체의 제조
본 발명의 CRIg 변이체의 재조합 합성을 위한 단백질을 코딩할 수 있는 DNA를 생산하기 위해 사용될 수 있는 다양한 기술이 입수가능하다. 예를 들어, 생성된 단백질의 아미노산 서열에서의 변화를 코딩하는 천연 발생 DNA 서열을 기초로 하는 DNA를 유도할 수 있다. 이러한 돌연변이체 DNA를 사용하여 본 발명의 CRIg 변이체를 수득할 수 있다. 단순화된 형태로, 천연 CRIg 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 수득하는 단계, 유전자를 하기에 논의되는 것들과 같은 재조합 기술에 의해 변형시키는 단계, 유전자를 적합한 발현 벡터 내로 삽입하는 단계, 벡터를 적합한 숙주 세포 내로 삽입하는 단계, 숙주 세포를 배양하여 원하는 CRIg 변이체의 발현을 야기하는 단계, 및 이에 의해 생산된 분자를 정제하는 단계가 이러한 기술에서 고려된다.
더욱 특히, 예를 들어 [Sambrook, J. et al., Molecular Cloning (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., (1989)]와 같은 표준 교재에 기술된 바와 같은 DNA 서열의 합성 구축에 의해 본 발명의 CRIg 변이체를 코딩하는 DNA 서열이 수득된다.
a. 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이유발
올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이유발은 천연 CRIg 폴리펩티드 또는 이의 단편의 치환, 결실 및 삽입 변이체를 제조하기 위한 바람직한 방법이다. 이러한 기술은 [Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10: 6487-6504 (1987)]에 기술된 바와 같이 당업계에 주지되어 있다. 간략하게, 출발 폴리펩티드 서열을 코딩하는 핵산이 DNA 주형에 원하는 돌연변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 혼성화시킴으로써 변형되고, 이때 상기 주형은 코딩 핵산의 변경되지 않은 또는 천연 DNA 서열을 함유하는 단일 가닥 형태의 플라스미드이다. 혼성화 후, DNA 중합효소를 사용하여 주형의 전체적인 제2 상보적 가닥이 합성되고, 따라서 상기 가닥에 올리고뉴클레오티드 프라이머가 혼입될 것이고, 상기 가닥이 출발 핵산의 선택된 변경을 코딩할 것이다.
일반적으로, 뉴클레오티드 25개 이상 길이의 올리고뉴클레오티드가 사용된다. 최적의 올리고뉴클레오티드에는 돌연변이를 코딩하는 뉴클레오티드(들)의 어느 한쪽 측면 상의 주형에 대해 완전히 상보적인 12개 내지 15개의 뉴클레오티드가 있을 것이다. 이는 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 DNA 주형 분자에 정확하게 혼성화될 것을 확실하게 한다. 당업계에 공지된 기술 예컨대 [Crea et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 75: 5765 (1978)]에 기술된 기술을 사용하여 올리고뉴클레오티드가 쉽게 합성된다.
파지 디스플레이가 사용되는 경우, 박테리오파지 M13 벡터로부터 유래된 벡터 (통상적으로 입수가능한 M13mp18 및 M13mp19 벡터가 적절함), 또는 [Viera et al., Meth. Enzymol., 153: 3 (1987)]에 기술된 바와 같이 단일 가닥의 파지 복제 기원을 함유하는 벡터에 의해서만 DNA 주형이 생성될 수 있다. 따라서, 돌연변이될 DNA가 단일 가닥 주형을 생성시키기 위해 이러한 벡터들 중 하나 내로 삽입되어야 한다. 단일 가닥 주형의 생산이 [Sambrook et al., 상기 문헌]의 섹션 4.21-4.41에 기술되어 있다.
천연 DNA 서열을 변경시키기 위해, 올리고뉴클레오티드를 적절한 혼성화 조건 하에 단일 가닥 주형에 혼성화시킨다. 그후, DNA 중합 효소, 일반적으로 DNA 중합효소 I의 클레노우(Klenow) 단편이 첨가되어, 올리고뉴클레오티드를 합성용 프라이머로 사용하여 주형의 상보적 가닥이 합성된다. 1개의 DNA의 가닥은 돌연변이된 형태의 CRIg를 코딩하고, 다른 가닥 (원래의 주형)은 CRIg의 변경되지 않은 천연 서열을 코딩하도록 헤테로듀플렉스(heteroduplex) 분자가 이렇게 하여 형성된다. 그후, 이러한 헤테로듀플렉스 분자를 적절한 숙주 세포, 일반적으로는 원핵생물 예컨대 대장균 JM101 내로 형질전환시킨다. 세포를 성장시킨 후, 이를 아가로스 플레이트 상에 플레이팅하고, 32P 포스페이트로 방사성-표지된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 스크리닝하여, 돌연변이된 DNA를 함유하는 박테리아 콜로니를 확인한다.
플라스미드의 양쪽 가닥 모두가 돌연변이(들)를 함유하는 호모듀플렉스(homoduplex) 분자가 생성되도록 바로 위에서 기술된 방법이 변형될 수 있다. 변형은 하기와 같다: 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 상기 기술된 바와 같이 단일 가닥 주형에 어닐링(annealing)시킨다. 데옥시리보아데노신 (dATP), 데옥시리보구아노신 (dGTP), 및 데옥시리보티미딘 (dTTP)의 3가지 데옥시리보뉴클레오티드의 혼합물을 dCTP-(aS)로 칭해지는 변형된 티오-데옥시리보사이토신 (Amersham)과 조합한다. 이러한 혼합물을 주형-올리고뉴클레오티드 복합체에 첨가한다. 이러한 혼합물에 DNA 중합효소를 첨가하면, 돌연변이된 염기를 제외하고 주형과 동일한 DNA의 가닥이 생성된다. 또한, DNA의 이러한 새로운 가닥은 dCTP 대신 dCTP-(aS)를 함유할 것이고, 이는 제한 효소 소화로부터 DNA를 보호하는 작용을 한다. 이중 가닥 헤테로듀플렉스의 주형 가닥을 적절한 제한 효소로 니킹(nicking)시킨 후, 돌연변이유발될 부위(들)를 함유하는 영역 뒤에서 주형 가닥을 ExoIII 뉴클리에이스 또는 또다른 적합한 뉴클리에이스로 소화시킬 수 있다. 그후, 반응을 정지시켜, 부분적으로만 단일 가닥인 분자를 남긴다. 그후, 4가지 모두의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, ATP, 및 DNA 라이게이스의 존재 하에 DNA 중합효소를 사용하여 완전한 이중 가닥 DNA 호모듀플렉스가 형성된다. 그후, 이러한 호모듀플렉스 분자를 상기 기술된 바와 같이 대장균 JM101과 같은 적절한 숙주 세포 내로 형질전환시킨다.
치환될 아미노산이 1개를 초과하는 돌연변이체가 여러 방식 중 하나에 의해 생성될 수 있다. 이러한 아미노산들이 폴리펩티드 사슬 내에 서로 가깝게 위치한다면, 원하는 아미노산 치환 모두를 코딩하는 하나의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 이들이 동시에 돌연변이될 수 있다. 그러나, 아미노산들이 서로 어느 정도 거리에 위치한다면 (약 10개를 초과하는 아미노산에 의해 분리되면), 원하는 변화 모두를 코딩하는 단일 올리고뉴클레오티드를 생성시키는 것이 더욱 어렵다. 대신, 1가지 또는 2가지의 별법적인 방법이 사용될 수 있다.
첫번째 방법에서, 치환될 아미노산 각각에 대해 개별적인 올리고뉴클레오티드가 생성된다. 그후, 올리고뉴클레오티드들이 단일 가닥 주형 DNA에 동시에 어닐링되고, 주형으로부터 합성되는 제2 DNA 가닥이 원하는 아미노산 치환 모두를 코딩할 것이다. 별법적인 방법은 원하는 돌연변이체를 생산하기 위한 2회 이상의 라운드의 돌연변이유발을 수반한다. 제1 라운드는 단일 돌연변이체에 대해 기술된 대로이다: 야생형 DNA가 주형용으로 사용되고, 첫번째 원하는 아미노산 치환(들)을 코딩하는 올리고뉴클레오티드가 이러한 주형에 어닐링된 후, 헤테로듀플렉스 DNA 분자가 생성된다. 제2 라운드의 돌연변이유발은 제1 라운드의 돌연변이유발에서 생산된 돌연변이된 DNA를 주형으로 사용한다. 따라서, 이러한 주형은 하나 이상의 돌연변이를 이미 함유한다. 그후, 추가적인 원하는 아미노산 치환(들)을 코딩하는 올리고뉴클레오티드가 이러한 주형에 어닐링되고, 생성된 DNA 가닥은 이제 제1 라운드 및 제2 라운드의 돌연변이유발 양쪽 모두로부터의 돌연변이를 코딩한다. 생성된 이러한 DNA가 제3 라운드의 돌연변이유발에서 주형으로 사용될 수 있고, 이러한 방식으로 계속될 수 있다.
b. 카세트 돌연변이유발
이러한 방법 또한 CRIg의 치환, 결실 및 삽입 변이체를 제조하기 위한 바람직한 방법이다. 이 방법은 [Wells et al. Gene 34: 315 (1985)]에 기술된 것을 기초로 한다. 출발 물질은 돌연변이될 유전자 1을 포함하는 플라스미드 (또는 기타 벡터)이다. 출발 CRIg 분자를 코딩하는 핵산 내의 돌연변이될 코돈(들)을 확인한다. 확인된 돌연변이 부위(들)의 각각의 측면 상에 독특한 제한 엔도뉴클리에이스 부위가 있어야 한다. 이같은 제한 부위가 존재하지 않으면, 유전자 1 내의 적합한 위치에 제한 부위가 도입되도록 상기 기술된 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이유발 방법을 사용하여 제한 부위가 생성될 수 있다. 제한 부위가 플라스미드 내로 도입된 후, 플라스미드를 이러한 부위에서 절단하여 이를 선형화시킨다. 제한 부위들 사이의 DNA의 서열을 코딩하지만 원하는 돌연변이(들)을 함유하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 표준 절차를 사용하여 합성한다. 2개의 가닥을 따로따로 합성한 후, 표준 기술을 사용하여 함께 혼성화시킨다. 이러한 이중 가닥 올리고뉴클레오티드가 카세트로 지칭된다. 이러한 카세트는 선형화된 플라스미드의 끝부분과 호환성인 3' 및 5' 말단이 있도록 디자인되어, 플라스미드에 직접적으로 결찰될 수 있다. 이러한 플라스미드는 이제 CRIg의 돌연변이된 DNA 서열을 함유한다.
c. CRIg 변이체의 재조합 생산
그후, 변이체를 코딩하는 DNA를 적합한 플라스미드 또는 벡터 내로 삽입한다. 벡터는 숙주 세포를 형질전환시키도록 사용된다. 일반적으로, 숙주 세포와 호환성인 종으로부터 유래된 복제 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 이러한 숙주와 함께 사용된다. 통상적으로 벡터는 복제 부위, 뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 단백질을 코딩하는 서열을 보유한다.
예를 들어, 대장균이 대장균 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322로 형질전환될 수 있다 ([Mandel, M. et al., (1970) J. Mol. Biol. 53:154]). 플라스미드 pBR322는 앰피실린 및 테트라사이클린 저항성에 대한 유전자를 함유하고, 따라서 선별을 위한 용이한 수단을 제공한다. 또다른 벡터들이 상이한 특색 예컨대 상이한 프로모터를 포함하고, 이는 종종 발현에서 중요하다. 예를 들어, 플라스미드 pKK223-3, pDR720, 및 pPL-λ는 현재 입수가능한 tac, trp, 또는 PL 프로모터가 있는 발현 벡터를 나타낸다 (Pharmacia Biotechnology).
본원에 기술된 벡터들의 관련된 소질들을 조합함으로써 표준 기술을 사용하여 또다른 바람직한 벡터들이 구축될 수 있다. 벡터의 관련된 소질에는 프로모터, 리보솜 결합 부위, 변이체 유전자 또는 유전자 융합물, 신호 서열, 항생제 저항성 마커, 카피수, 및 적합한 복제 기원이 포함된다.
본원에서의 벡터 내의 DNA의 클로닝 또는 발현을 위한 적절한 숙주 세포에는 원핵생물, 효모, 또는 고급 진핵생물 세포가 포함된다. 이러한 목적을 위한 적절한 원핵생물에는 유박테리아(eubacteria), 예컨대 그람(Gram)-음성 또는 그람-양성 생물, 예를 들어, 장내세균 예컨대 에쉐리키아(Escherichia), 예를 들어, 대장균, 엔테로박테르(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실러스(Bacillus) 예컨대 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, DD 266,710 (1989년 4월 12일 공개)에 개시된 바실러스 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas) 예컨대 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함된다. 한 바람직한 대장균 클로닝 숙주는 대장균 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주 예컨대 대장균 B, 대장균 X1776 (ATCC 31,537), 및 대장균 W3110 (ATCC 27,325)도 적절하다. 이러한 예들은 제한적이기보다는 예시적이다.
원핵생물에 더하여, 진핵생물 미생물 예컨대 필라멘트형 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 대한 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상적인 베이커(baker) 효모가 저급 진핵생물 숙주 미생물들 중에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis), 클루이베로마이세스 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 클루이베로마이세스 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 클루이베로마이세스 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 클루이베로마이세스 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 클루이베로마이세스 드라소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 클루이베로마이세스 테르모톨레란스(K. Thermotolerans), 및 클루이베로마이세스 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 리시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 예컨대 슈완니오마이세스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 필라멘트형 진균, 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주 예컨대 아스페르길루스 니둘란스(A. nidulans) 및 아스페르길루스 니게르(A. niger)와 같은 다수의 또다른 속, 종, 및 계통이 통상적으로 이용가능하고 본원에서 유용하다.
글리코실화 항체의 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster) (과일파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 수많은 배큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 상응하는 증식허용성 곤충 숙주 세포가 확인되어 있다. 다양한 형질감염용 바이러스 균주, 예를 들어, 오토그래파 칼리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수가능하고, 이같은 바이러스들은, 특히 스포롭테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해, 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로 사용될 수 있다. 면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물 또한 숙주로서 사용될 수 있다.
그러나, 척추동물 세포가 가장 흥미롭고, 배양물 (조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되어 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁액 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, [Graham, et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, 예를 들어, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포 (TM4, [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트(buffalo rat) 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 ([Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포를 본원에서의 CRIg 변이체의 생산을 위한 상기 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터 유도, 형질전환체 선별 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적합하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
본 발명의 CRIg 변이체를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판되는 배지 예컨대 햄(Ham) F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지 ((DMEM), Sigma)가 숙주 세포를 배양하는데 적절하다. 또한, [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re.30,985에 기술된 배지들 중 임의의 것을 숙주 세포에 대한 배양 배지로 사용할 수 있다. 임의의 이러한 배지에 필요하다면 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 GENTAMYCIN™), 미량원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 일반적으로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원이 보충될 수 있다. 임의의 또다른 필요한 보충물이 당업자에게 공지된 적합한 농도로 또한 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현에 선택된 숙주 세포와 함께 기존에 사용된 것들이고, 당업자에게 명백할 것이다.
재조합 기술을 사용하는 경우, CRIg 변이체는 세포 내에서 생산되거나, 원형질막 주위공간 내에서 생산되거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. CRIg 변이체가 세포 내에서 생산되는 경우, 첫번째 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 입상물질 잔해물을, 예를 들어, 원심분리 또는 초여과에 의해 제거한다. CRIg 변이체가 배지 내로 분비되는 경우, 일반적으로 이같은 발현 시스템으로부터의 상등액을 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 초여과 유닛을 사용하여 먼저 농축한다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로티에이스 억제제 예컨대 PMSF가 임의의 상기 단계에서 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 CRIg 변이체를, 예를 들어, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 및/또는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 공지된 기술에 의해 정제할 수 있다.
CRIg 변이체의 추가적인 변형
본 발명의 CRIg 변이체는 또다른 이종성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 CRIg 변이체 (이의 단편 포함)를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 또한 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, 이같은 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 CRIg 변이체 또는 이의 단편의 융합물을 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 변이체 CRIg 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 놓인다. 이같은 에피토프 태그가 부착된 형태의 CRIg 변이체의 존재를 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그의 제공은 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또다른 유형의 친화력 매트릭스를 사용하여 친화력 정제에 의해 CRIg 폴리펩티드를 쉽게 정제할 수 있도록 한다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들의 각각의 항체가 당업계에 주지되어 있다. 예로는 폴리-히스티딘 (폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (폴리-his-gly) 태그; 플루 HA 태그 폴리펩티드 및 이의 항체 12CA5 ([Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]); c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 ([Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]); 및 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 이의 항체 ([Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)])가 포함된다. 또다른 태그 폴리펩티드에는 Flag-펩티드 ([Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]); KT3 에피토프 펩티드 ([Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]); □-튜불린 에피토프 펩티드 ([Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]); 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 ([Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)])가 포함된다.
또다른 실시양태에서, 키메라 분자는 CRIg 변이체 또는 이의 단편과 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역의 융합물을 포함할 수 있다. 2가 형태의 키메라 분자에 대해서, 이같은 융합물은 IgG 분자의 Fc 영역에 대한 것일 수 있다. 이러한 융합 폴리펩티드는 이종성 단백질 ("부착소")의 결합 특이성이 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 조합된 항체-유사 분자이고, 종종 면역부착소로 지칭된다. 구조적으로, 면역부착소는 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌 (즉, "이종성"인) 원하는 결합 특이성이 있는 아미노산 서열과 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합물을 포함한다. 전형적으로 면역부착소 분자의 부착소 부분은 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 적어도 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역부착소 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.
가장 간단하고 가장 직선적인 면역부착소 디자인은 "부착소" 단백질의 결합 영역(들)을 면역글로불린 중쇄의 힌지(hinge) 및 Fc 영역과 조합시킨다. 통상적으로, 본 발명의 CRIg-면역글로불린 키메라를 제조할 때, CRIg의 세포외 도메인을 코딩하는 핵산이 C-말단에서 면역글로불린 불변 도메인 서열의 N-말단을 코딩하는 핵산에 융합될 것이지만, N-말단 융합물 또한 가능하다.
전형적으로, 이같은 융합물에서, 코딩되는 키메라 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 기능적으로 활성인 힌지 및 및 CH2 및 CH3 도메인을 적어도 유지할 것이다. 불변 도메인의 Fc 부분의 C-말단에 대해, 또는 중쇄의 CH1 또는 경쇄의 상응하는 영역에 대해 바로 N-말단에 융합물이 또한 제조될 수 있다.
융합이 이루어지는 정확한 부위는 결정적이지 않다; 특정 부위들이 주지되어 있고, CRIg-면역글로불린 키메라의 생물학적 활성, 분비 또는 결합 특성을 최적화하기 위해 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, CRIg-면역글로불린 키메라는, 본질적으로 WO 91/08298에 설명된 바와 같이, 단량체, 이종다량체 또는 동종다량체로서, 특히 이량체 또는 사량체로서 조립된다.
바람직한 실시양태에서, 면역글로불린, 예를 들어 면역글로불린 G1 (IgG 1)의 이펙터 기능부를 함유하는 항체의 C-말단 부분 (특히 Fc 도메인)의 N-말단에 CRIg 세포외 도메인 서열이 융합된다. 전체 중쇄 불변 영역을 CRIg 세포외 도메인 서열에 융합시킬 수 있다. 그러나, 더욱 바람직하게는, 파파인 절단 부위 (IgG Fc를 화학적으로 규정함; 중쇄 불변 영역의 첫번째 잔기를 114로 했을 때 잔기 216, 또는 기타 면역글로불린의 유사 부위) 바로 상류의 힌지 영역에서 시작하는 서열이 융합에서 사용된다. 특히 바람직한 실시양태에서, CRIg 아미노산 서열이 힌지 영역 및 CH2 및 CH3에, 또는 IgG1, gG2, 또는 IgG3 중쇄의 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인에 융합된다. 융합이 이루어지는 정확한 위치는 결정적이지 않고, 최적의 부위가 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, CRIg-면역글로불린 키메라는 다량체로서, 특히 동종이량체 또는 동종사량체로서 조립된다. 일반적으로, 이러한 조립된 면역글로불린들은 공지된 유닛 구조를 지닐 것이다. 기본적인 4쇄 구조는 IgG, IgD, 및 IgE가 존재하는 형태이다. 4개의 유닛이 고분자량 면역글로불린에서 반복된다; 일반적으로 IgM은 디설피드 결합에 의해 함께 유지되는 기본적인 4개의 유닛의 오량체로서 존재한다. IgA 글로불린, 및 종종 IgG 글로불린이 혈청 내에서 다량체성 형태로 또한 존재할 수 있다. 다량체의 경우, 각각의 4개의 유닛은 동일하거나 상이할 수 있다.
별법적으로, 키메라 중쇄를 포함하는 면역글로불린이 수득되도록 면역글로불린 중쇄 서열과 경쇄 서열 사이에 CRIg 세포외 도메인 서열이 삽입될 수 있다. 이러한 실시양태에서, CRIg 서열이 힌지와 CH2 도메인 사이 또는 CH2 도메인과 CH3 도메인 사이에서 면역글로불린의 각각의 팔 내의 면역글로불린 중쇄의 3' 말단에 융합된다. 유사한 구축물이 [Hoogenboom et al., Mol. Immunol., 28:1027-1037 (1991)]에서 보고되었다.
면역글로불린 경쇄의 존재가 본 발명의 면역부착소에서 요구되지는 않지만, 면역글로불린 경쇄가 CRIg-면역글로불린 중쇄 융합 폴리펩티드에 공유결합으로 회합되어 또는 CRIg 세포외 도메인에 직접 융합되어 존재할 수 있다. 전자의 경우, 전형적으로, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA가 CRIg-면역글로불린 중쇄 융합 단백질을 코딩하는 DNA와 함께 공동발현된다. 분비 시, 하이브리드 중쇄와 경쇄가 공유결합으로 회합되어, 2개의 디설피드-연결 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 면역글로불린-유사 구조물이 제공될 것이다. 이같은 구조물의 제조에 적절한 방법이, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (1989년 3월 28일 허여)에 개시되어 있다.
제약 조성물
본 발명의 CRIg 변이체가 질환의 병리학에 대안적 보체 경로가 수반되는 질환의 치료를 위해 투여될 수 있다.
치료 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 활성 분자를 임의적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 ([Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]])와 혼합함으로써 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 보관용으로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌이 포함되는 항산화제; 방부제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린이 포함되는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이팅제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터 이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
리포펙션 또는 리포솜을 또한 사용하여 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편을 세포 내로 전달할 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우에는, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열을 기초로, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력이 유지된 펩티드 분자를 디자인할 수 있다. 이같은 펩티드는 화학적으로 합성되고/되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다 (예를 들어, [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)] 참조.
본원에서의 제형은 치료될 특정 적응증에 필요하다며 1가지를 초과하는 활성 화합물, 특히 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 보완성인 활성이 있는 것들을 또한 함유할 수 있다. 적절하게는 이같은 분자들은 의도되는 목적에 효과적인 양으로 조합되어 존재한다.
코아세르베이션(coascervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 예를 들어 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀션 내에 활성 성분들이 또한 포획될 수 있다. 이같은 기술이 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용될 제형은 반드시 무균성이어야 한다. 이는 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적절한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로젤 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 루프론 디포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일을 초과하여 분자가 방출될 수 있게 하는 한편, 특정 하이드로젤은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 항체가 신체 내에 장기간 동안 유지되는 경우, 37℃에서 습도에 노출된 결과로 이들이 변성되거나 응집될 수 있어, 생물학적 활성의 손실, 그리고 가능하게는 면역원성의 변화를 초래한다. 수반되는 메커니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-디설피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견되면, 설프하이드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 제어, 적합한 첨가제의 사용, 및 특정 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화가 달성될 수 있다.
치료 방법
보체 활성화, 특히 대안적 보체 경로를 억제하는 능력의 결과로서, 본 발명의 CRIg 변이체는 보체-관련 질환 및 병리학적 용태의 예방 및/또는 치료에서 유용성이 발견된다. 이같은 질환 및 용태에는 보체-관련, 염증성 및 자가면역 질환이 비제한적으로 포함된다.
본원에서의 CRIg 변이체에 의해 표적화될 수 있는 보체-관련, 염증성 및 면역 관련 질환 및 장애의 구체적인 예가 앞서 열거되어 있다.
본 발명의 추가적인 상세사항이 하기의 비제한적인 실시예들에 의해 설명된다.
실시예 1
친화력-성숙 CRIg 변이체의 제조
물질 및 방법
물질
물질 - 효소 및 M13-KO7 헬퍼 파지 (New England Biolabs); 맥시소프(Maxisorp) 면역플레이트 플레이트 (Nunc. Roskilde, Denmark); 96웰 U-바닥 폴리리프로필렌 플레이트 (COSTAR; 카탈로그 # 3365); 96웰 편평바닥 비-결합형 플레이트 (NUNC; 카탈로그 # 269620); 양고추냉이 과산화효소/항-M13 항체 접합체 (Pharmacia); 3,3',5,5'-테트라메틸-벤지딘, H2O2 과산화효소 기질 (TEB) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc); 대장균 XL1-블루 및 대장균 BL21(DE3) (Stratagene); 소 혈청 알부민 (BSA) 및 트윈(Tween) 20 (Sigma); Ni-NTA 아가로스 (Qiagen); 토끼 RBC (Colorado Serum Company; 카탈로그 # CS1081); 젤라틴 베로날 완충제 (GVB) [100 ㎖ 베로날 완충제 (BioWhittaker; 카탈로그 # 12-624E); 젤라틴 (소 피부 유형 B; SIGMA; 카탈로그 # G9391-100G); C1q-결핍 혈청 (CompTech; 카탈로그 # A300); fH 단백질 (Complement Technology; 카탈로그 # A137); 50％ 글리세롤 내의 항-FLAG-HRP mAb (Sigma 카탈로그 #A-8592 1.1 ㎎/㎖)
파지-디스플레이 CRIg 라이브러리의 구축
CRIg를 코딩하는 DNA 단편을 야생형 대조군 및 CRIg 변이체를 디자인하기 위한 주형으로서의 XhoI 및 SpeI로 소화된 파지미드 벡터 (p3DvlzPDZ-gD) ([Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)]) 내로 결찰시켰다. 그후, 무작위화에 대해 표적화된 각각의 잔기에 TAA 정지 코돈이 있는 주형을 CJ239 대장균 세포 ([Kunkel et al., 1987, 상기 문헌])로부터 제조하였다. 야생형 뉴클레오티드를 선호하는 염기들의 70-10-10-10 혼합물과 함께 포이즌(poisoned) 올리고뉴클레오티드 전략을 사용함으로써 약 50％의 돌연변이율이 선택된 위치에서 도입되는 소프트 무작위화 전략이 CRIg 변이체 선별에 사용되었다. 라이브러리 디자인에서, 5 = 50％ A, 10％ G, 10％ C 및 10％ T; 6 = 50％ G, 10％ A, 10％ C 및 10％ T; 7 = 50％ C, 10％ A, 10％ G 및 10％ T; 8 = 50％ T, 10％ A, 10％ G 및 10％ C.
5개의 라이브러리가 디자인되었다.
Figure pat00001
각각의 돌연변이가 생산되도록 적합한 코돈을 사용함으로써 상기와 같이 점 돌연변이에 대한 부위-지정 돌연변이유발을 수행하였고, 정확한 클론이 서열에 의해 확인되었다.
CRIg 변이체를 선별하기 위한 라이브러리 분류 및 스크리닝:
맥시소프 면역플레이트를 하룻밤 동안 4℃에서 C3b (5 ㎍/㎖)로 코팅하고, 실온에서 1시간 동안 포스페이트-완충 염수 (PBS) 및 0.05％ (w/v) 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단하였다. 파지 라이브러리를 C3b가 코팅된 플레이트에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 10회 세정하고, 결합된 파지를 50 mM HCl로 용출시키고, 동일한 부피의 1.0 M 트리스(Tris) 염기 (pH 7.5)로 중화시켰다. 회수된 파지가 대장균 XL1-블루를 통한 계대에 의해 증폭되었고, 추가적인 라운드의 결합 선별에 사용되었다. 5회의 라운드 후, 본 발명가들은 각각의 라이브러리로부터 12개의 개별적인 클론을 선별하였고, 이들을 카르베니실린 및 M13-KO7 헬퍼 파지가 보충된 500 ㎕의 2YT 브로스에서 96웰 포맷으로 성장시켰다. 단계적으로 2배 희석된 배양 상등액을 지정된 위치에서 C3b, 항-gD, BSA 및 관련되지 않은 단백질로 코팅된 384웰 플레이트에 직접 첨가하였다. 결합 친화력을 측정하여, 항-gD보다 유의하게 높은 C3b를 제공하지만 BSA 및 관련되지 않은 단백질에 대해서는 그렇지 않은 파지 농도를 추정하였다. 본 발명가들은 파지 농도를 확정하고, 동일한 포맷 내의 각각의 라이브러리로부터 약 200개의 클론을 스크리닝하였고, 각각의 라이브러리로부터 유의하게 항-gD에 비해 C3b에 결합하는 것을 나타낸 24-48개의 클론을 선별한 후, 분석을 위해 이들의 서열을 확인하였다.
경쟁적 파지 ELISA
결합 친화력을 추정하기 위해, 변형된 파지 ELISA가 사용되었다. 96웰 미량역가 플레이트를 50 mM 카르보네이트 완충제 (pH 9.6) 내의 2 ㎍/㎖ 3Cb로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 그후, 플레이트를 PBS, 0.5％ BSA로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. CRIg 변이체를 디스플레이하는 파지를 PBT 완충제 내에 단계식으로 희석하였고, 결합을 측정하여, 포화 시의 신호의 50％를 제공하는 파지 농도를 추정하였다. 준포화 농도의 파지를 확정하고, 단계식 C3b 희석물과 함께 2시간 동안 예비-인큐베이션한 후, 혼합물을 C3b로 코팅된 분석 플레이트로 옮겼다. 15분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS, 0.05％ 트윈 20으로 세정하고, 30분 동안 양고추냉이 과산화효소/항-M13 항체 접합체 (PBT 완충제 내의 1:5000 희석물)와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 세정하고, TMB 기질로 발색시키고, 1.0 M H3PO4로 켄칭(quenching)하고, 450 nm에서 분광광도법에 의해 판독하였다. 절반-최대 파지미드 결합을 초래한 경쟁 C3b의 농도로서 친화력 (Ic50)이 계산되었다.
단백질 정제
발현 플라스미드가 있는 대장균 BL21(DE3)의 단일 콜로니를 30 ㎖의 50 ㎍/㎖ 카르베니실린이 보충된 LB 배지 (LB/carb 배지) 내로 접종하고, 하룻밤 동안 37℃에서 성장시켰다. 박테리아를 수확하고, 세정하고, 재현탁시키고, 500 ㎖의 LB/carb 배지 내로 접종하였다. 배양물을 37℃에서 미드-로그(mid-log) 단계 (A600 = 0.8)로 성장시켰다. 0.4 mM 이소프로필 1-티오-D-갈락토피라노시드로 단백질 발현을 유도하고, 배양물을 24시간 동안 30℃에서 성장시켰다. 박테리아를 4000g에서 15분 동안의 원심분리에 의해 펠렛화하고, 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 2회 세정하고, 8시간 동안 -80℃에서 동결시켰다. 펠렛을 50 ㎖의 PBS에 재현탁시키고, 마이크로플루이다이저 프로세싱(Microfluidizer Processing) 또는 초음파처리 설비에 통과시킴으로써 박테리아를 용해시켰다. CRIg 변이체 단백질을 2 ㎖ NI-NTA 아가로스 및 젤 여과로 정제하였다.
mutCRIg - huFc 유체상 경쟁적 결합 ELISA:
huCRIg(L)-LFH를 PBS (pH 7.4)에서 2 ㎍/㎖로 희석하고, 하룻밤 동안 (16-18시간) 4℃에서 인큐베이션함으로써 맥시소프 384웰 편평바닥 플레이트 (Nunc, Neptune, NJ) 상에 코팅하였다 (25 ㎕/웰). 플레이트를 세정 완충제 (PBS, pH 7.4, 0.05％ 트윈 20)에서 3회 세정하고, 50 ㎕/웰의 차단 완충제 (PBS, pH 7.4, 0.5％ BSA)를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1-3 시간 동안 차단하였다; 이러한 인큐베이션 및 모든 후속 인큐베이션을 궤도형 진탕기 상에서 실온에서 수행하였다. 차단 단계 동안, C3b (Genentech에서 정제)를 분석 완충제 (PBS pH 7.4, 0.5％ BSA, 0.05％ 트윈-20)에서 20 nM로 희석하고, mutCRIg-huFc 분자를 단계식으로 분석 완충제에서 20,000 - 0.34 nM 농도 범위에 걸쳐 희석하였다. 그후, C3b와 mutCRIg-huFc 분자를 1:1 혼합하고, 0.5-1 시간 동안 예비-인큐베이션하였다. 차단된 플레이트를 3회 세정하고 (상기 기술된 대로), C3b:mutCRIg-huFc 복합체를 반응 플레이트에 첨가하였다 (25 ㎕/웰). 1-2 시간 인큐베이션 후, ELISA 플레이트를 3회 세정하고 (상기 기술된 대로), 플레이트에 결합된 C3b를 항-인간 C3b 항체 (클론 5F202, US Biological (Swampscott, MA); 600 ng/㎖, 25 ㎕/웰)의 첨가에 의해 검출하였다. 플레이트를 1-2 시간 동안 인큐베이션하고, 상기 기술된 대로 세정하였다. 그후, 1:2,000 희석된 HRP-접합 항-뮤린 Fc IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)를 첨가하고 (25 ㎕/웰), 플레이트를 1-2 시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 세정 후, 25 ㎕/웰의 TMB 기질 (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)을 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 약 8분 후 25 ㎕/웰의 1.0M 인산을 첨가함으로써 발색을 정지시켰다. 450 nm 및 650 nm에서의 흡광도를 스펙트라맥스(SpectraMax) 250 미량역가 플레이트 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 결정하였다.
보체 활성화 분석법:
보체 활성화를 억제하는 mutCRIg-Fc의 능력을 <Wieslab™ Complement System Alternative Pathway Kit> (Alpco Diagnostics, Salem, NH)를 사용하여 평가하였다. 단계식으로 희석된 mutCRIg-Fc (400 내지 0.2 nM) 및 C1q 결핍 인간 혈청 (5％) (Complement Technology, Tyler, TX)을 원하는 최종 농도의 2배로 제조하고, 1:1 혼합하고, 5분 동안 300 RPM의 궤도형 진탕기 상에서 예비-인큐베이션한 후, LPS가 코팅된 ELISA 플레이트에 첨가하였다 (100 ㎕/웰). 나머지 분석법은 제조사의 지침을 따랐다. 간략하게, ELISA 플레이트 내의 샘플을 60-70분 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 세정 완충제 (PBS, pH 7.4, 0.05％ 트윈 20)에서 3회 세정하였다. 100 ㎕/웰의 항-C5b-9 접합체를 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, ELISA 플레이트를 상기 기술된 대로 세정하고, 웰 당 100 ㎕의 기질을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 추가로 30분 동안 인큐베이션하였다. 50 ㎕/웰의 5 mM EDTA를 첨가함으로써 발색을 정지시켰다. 405 nm에서의 흡광도를 멀티스캔 어센트(MultiSkan Ascent) 미량역가 플레이트 판독기 (Thermo Fisher Scientific, Milford, MA)를 사용하여 결정하였다.
용혈 억제 분석법:
토끼 적혈구 (Colorado Serum Company, Denver, CO)를 0.1％ 소 피부 젤라틴 (Sigma)을 함유하는 베로날 완충제 (Sigma, St. Louis, MO) (GVB)로 3회 세정하였고, 이때 각각의 세정에 대해 1500 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 최종 원심분리 단계 후, 세포를 GVB에 2×109개의 세포/㎖의 최종 농도로 재현탁시켰다. GVB 내에 단계식으로 희석된 보체 억제제를 96웰 U-바닥 폴리프로필렌 플레이트(들) (Costar, Cambridge, MA)에 50 ㎕/웰로 첨가하였고, 여기에 0.1M MgCl2/0.1M EGTA/GVB에 1:2 희석된 20 ㎕/웰의 토끼 적혈구가 이어졌다. GVB로 미리 1:3 희석된 30 ㎕/웰 C1q-결핍 혈청 (Complement Technology, Tyler, TX)을 첨가함으로써 인-플레이트(in-plate) 보체 케스케이드가 촉발되었다. 플레이트(들)을 부드럽게 교반하면서 30분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 100 ㎕/웰의 10 mM EDTA/GVB로 반응을 정지시켰다. 플레이트(들)을 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 상등액을 투명한 편평 바닥 비-결합형 96웰 플레이트(들) (Nunc, Neptune, NJ)로 옮기고, 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 412 nm에서 광학 밀도를 판독하였다.
알파 스크린 경쟁 분석법:
C3에 대한 돌연변이체 CRIg 분자의 잠재적인 교차-반응성을 <AlphaScreen® Histidine (Nickel Chelate) Detection Kit> (PerkinElmer, Waltham, MA)를 사용하여 평가하였다. 단계식으로 희석된 인간 C3 및 C3b (3,000 내지 0.7 nM), 뿐만 아니라 고정된 농도의 비오틴화 iC3b (30 nM), 및 돌연변이체 CRIg (mutCRIg) 및 야생형 CRIg 분자 (15-60 nM) 양쪽 모두를 원하는 최종 농도의 3배로 제조하고, 1:1:1로 혼합하고, 3000 RPM의 궤도형 진탕기 상에서 주위 온도에서 30분 동안 예비-인큐베이션하였다. 스트렙타비딘 도너 비드 및 니켈 킬레이트 어셉터 비드 (각각 0.1 mg/㎖)의 1:1 혼합물을 원하는 최종 농도의 4배로 제조하고, 반응물에 첨가하였다. 반응 플레이트를 빛으로부터 보호된 3000 rpm의 궤도형 진탕기 상에서 주위 온도에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 알파퀘스트(AlphaQuest)®-HTS 마이크로플레이트 분석기 (PerkinElmer, Waltham, MA) 상에서 분석하였다.
표면 플라즈몬 공명
비아코어(Biacore)® A100 장치 (GE healthcare) 상에서의 표면 플라즈몬 공명 측정을 사용함으로써 돌연변이체 및 야생형 CRIg에 대한 C3b의 친화력을 결정하였다. 항-Fc 포획 포맷을 사용하였고, 평형 결합 측정으로부터 KD가 계산되었다. 제조사가 공급한 지침서에 따라 항-muFc 포획 키트 (BR-1008-38)를 사용하여 센서 칩을 제조하였다. 돌연변이체 또는 야생형 CRIg를 러닝(running) 완충제 (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.01％ 트윈-20)에서 1 ㎍/㎖로 희석하고, 약 100 RU의 융합 단백질이 칩 표면의 1개의 지점에서 포획되도록 60 ㎕를 주입하였다. CRIg 지점에 대한 다양한 C3b 농도의 용액의 10분 주입에 대해 센소그램을 기록하였고, 이때 포획 항체를 함유하지만 CRIg는 함유하지 않는 기준 지점에 대한 신호를 차감하였다. 10 ㎕/분의 유속 및 25℃의 온도로 4 μM에서 15.6 nM까지의 농도 범위의 C3b의 연속식 2배 희석물에 대해 데이터를 수득하였다. 10 mM Gly-HCl pH 1.7의 30초 주입에 의해 결합 사이클들 사이에 표면을 재생시켰다. 각각의 C3b 주입 말기에 수득된 플래토(plateau) 값을 사용하여, <Biacore A100 Evaluation Software v1.1>의 친화력 알고리즘을 사용하여 KD를 계산하였다 ([Safsten et al. (2006) Anal. Biochem. 353:181]).
결과
파지 라이브러리 디자인
C3b와의 복합체 내의 CRIg의 결정 구조를 사용하여, 표적 라이브러리를 디자인하였다. CRIg와 C3b 사이의 접촉 구역을 포함하도록 5개의 라이브러리가 디자인되었다 (도 4). 1가 파지 디스플레이 벡터에서 g3p 마이너 코트 단백질에 대한 융합물로서 CRIg 라이브러리들이 구축되었다 ([Zhang et al., J Biol Chem 281(31): 22299-311 (2006)]). 무작위화될 각각의 잔기에서 파지 플라스미드의 CRIg-코딩 부분 내로의 돌연변이유발에 의해 정지 코돈을 도입하였다. 그후, 정지 코돈을 함유하는 각각의 구축물을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시켰다 (물질 및 방법 섹션 참조). 선택된 위치가 50％의 경우에만 돌연변이되도록 야생형 서열 바이어스(bias)를 유지시키기 위해 "소프트-무작위화" 전략을 사용하여 결합제를 선택하였다. 5가지 라이브러리 모두 라이브러리 당 >1010 개의 독립적인 서열의 평균 다양성으로 수득되었다. (표 1).
CRIg 파지 라이브러리로의 선별
4회 라운드의 결합 선별 후, 이러한 5개의 라이브러리로부터 38개의 독특한 클론을 수득하였다. (표 2). 라이브러리 1에서, 위치 15의 라이신이 보존되었다. 방향족 잔기인 타이로신 및 트립토판이 위치 8의 글루탐산을 교체하였다. 위치 14는 어버이 트립토판 또는 상동성 페닐알라닌이 차지하였다. 라이브러리 2에서, 본 발명가들은 24개의 클론의 서열을 확인하였고, 이들 모두가 컨센서스를 나타냈다. 위치 42, 46 및 47이 야생형으로서 보존되었다. 아스파라긴, 히스티딘 및 페닐알라닌이 위치 43, 44 및 45에서 야생형 서열을 교체하였다. 라이브러리 3에서, 본 발명가들은 10개의 위치를 무작위화하였고, 서열들이 위치 54, 55, 56, 57, 58, 61, 62 및 63에서의 완전한 보존을 나타냈다. 이소류신 또는 라이신이 위치 60을 차지하였다. 위치 64에서, 글루타민이 아르기닌으로 교체되거나 보존되었다. 라이브러리 4에서, 방향족 잔기가 위치 86에서 우세하였고, 상동성 염기성 잔기인 아르기닌 및 라이신이 위치 99에서 우세하였다. 위치 85, 87 및 95가 또한 소프트-무작위화되었지만, 고도로 보존되는 것으로 나타났다. 라이브러리 5에서, 2개의 유의한 상동성 염기성 잔기인 라이신 및 아르기닌이 위치 105에서 글루타민에 비해 선호되었다. 음성 전하를 띠는 잔기인 아스파르트산 또는 산성 잔기인 아스파라긴이 위치 110에서 우세하였다.
본 발명가들은 경쟁적 파지 ELISA에 의해 돌연변이체들 중 일부의 친화력을 추정하였고 (데이터는 제시되지 않음), 야생형 CRIg보다 약 8배 더 양호한 C3b 결합제인 클론이 라이브러리 3 내에 있었음을 발견하였다.
시험관내 결합 친화력 및 생체내 생물학적 효능의 결정
C3b에 대한 결합 친화력 및 용혈성 억제 분석법에서의 효능을 증가시키는데 결정적인 잔기를 확인하기 위해, 다음 접근법은 우세한 단일 돌연변이를 혼입시키고 다른 위치들은 야생형을 유지시킴으로써, 또는 파지 ELISA에 의해 결정된 제1 세대 파지 라이브러리로부터의 2-3개의 고-친화력 클론을 선택함으로써 CRIg 변이체의 제2 세대를 디자인하는 것이었다. 본 발명의 돌연변이체의 친화력 및 효능을 정확하게 측정하기 위해, 본 발명가들은 모든 변이체를 단리된 단백질로서 발현시켰다. 용혈 억제 분석법으로부터의 결과 (표 3)는 라이브러리 1로부터의 L12, 라이브러리 3으로부터의 L33 및 라이브러리 4로부터의 L41이 용혈 분석법에서 야생형과 비교하여 효능을 4배 내지 10배만큼 유의하게 증가시켰음을 나타냈다. 라이브러리 3으로부터의 L32는 야생형 CRIg와 비교하여 10배 개선된 IC50을 나타냈다. 데이터는 세포-기반 분석법으로부터의 효능과 결합 친화력이 상관되지 않았음을 또한 나타냈다.
돌연변이체들의 조합
제2 세대 라이브러리로부터의 결과를 기초로, 본 발명가들은 용혈 분석법에서의 효능 및 결합 친화력을 추가로 개선하기 위해 제3 세대의 돌연변이체들을 디자인하였다. 본 발명가들은 생물학적으로 가장 강력한 돌연변이체 3개 (L12-8W, L33-Q60I/L32-Q64R 및 L41-M86Y) 및 결합 친화력이 가장 높은 돌연변이체 1개 (L32-Q64R)를 주형으로 선택하였다. 그후, 본 발명가들은 이러한 돌연변이체들을 제2 세대의 라이브러리에서 수득된 다른 생물학적으로 강력한 클론과 조합하여, 용혈 분석법에서의 효능 및 결합 친화력을 증가시키는 돌연변이들의 최적의 셋트를 결정하였다. 본 발명가들은 상세한 분석을 위해 CRIg 변이체들을 발현시키고 정제하였다. L12로부터의 콤보(combo) 돌연변이체는 억제 효능을 개선시키지 않았고, 심지어 WL41 및 WL59 돌연변이체의 3-6배 더 높은 결합 친화력에도 불구하고 어버이 돌연변이체와 비교하여 더 낮은 활성을 나타냈음이 데이터가 나타냈다 (표 4). L32로부터의 돌연변이체 내에서, RL41은 야생형보다 1.8배 더 양호한 결합 친화력 및 6배 더 양호한 용혈 분석법에서의 효능을 나타냈다. 용혈 분석법에서의 효능은 유의하게 증가하지 않았지만, L33 군으로부터의 모든 돌연변이체는 유의한 증가된 결합 친화력을 나타냈다; 야생형과 비교하여 약 27-226배 증가. 본 발명가들은 60I-64R 및 86Y가 친화력이 개선된 콤보 클론 대부분에서 수반되었음을 또한 인지하였다.
CRIg Q64R M86Y 돌연변이체의 개선된 결합 친화력 및 보체 억제 활성
본 발명가들은 경쟁적 ELISA에서 친화력이 가장 높았던 돌연변이체 Q64R M86Y (도 4 및 표 3)를 추가적인 분석용으로 선택하였다. C3b에 대한 CRIg wt 및 CRIg Q64R M86Y의 결합 친화력을 결정하기 위해, CRIg wt 및 CRIg Q64R M86Y의 비아코어 분석을 수행하였다. CRIg Q64R M86Y의 친화력이 야생형 CRIg에 비해 5배 개선되었다 (도 6). 기존의 연구는 CRIg wt가 C3b에 선택적으로 결합하지만 천연 C3에는 그렇지 않다는 것을 나타냈다 ([Wiesman et al., Nature, 444(7116):217-20, 2006]). 돌연변이유발이 이러한 선택성을 변화시킬 수 있기 때문에, 본 발명가들은 C3에 비해 C3b에 대한 CRIg Q64R M86Y의 친화력을 알파-스크린 유체-상 경쟁 분석법에서 비교하였다. CRIg Q64R M86Y는 가용성 C3b와 경쟁하였지만, 가용성 C3와는 경쟁하지 않았고, 이는 돌연변이유발이 활성 성분 C3b에 대한 CRIg의 선택성에 영향을 미치지 않았음을 가리킨다 (도 7). C3b와의 복합체 내의 CRIg Q64R M86Y의 구조 내의 이러한 잔기들의 분석에 의해 이러한 선택성이 추가로 확증되었다 (데이터는 제시되지 않음).
C3b에 대한 개선된 친화력 및 보존된 선택성이 개선된 효능으로 번역되는지 여부를 테스트하기 위해, 본 발명가들은 보체의 대안적 경로에 대해 선택적인 적혈구-기반 용혈 분석법에서 CRIg Q64R M86Y 대 CRIg wt를 테스트하였다. CRIg Q64R M86Y는 CRIg wt에 비교하여 4배 개선된 IC50을 나타냈다 (도 8A). 대안적 경로 보체 억제에 대한 개선된 효능을 추가로 실체화하기 위해, 본 발명가들은 보체의 대안적 경로에 대해 선택적인 LPS-기반 분석법에서 CRIg Q64R M86Y의 억제 활성을 CRIg wt와 비교하였다. 여기에서, CRIg는 야생형 재조합 단백질과 비교하여 IC50에서 180배 개선을 나타냈다. CRIg wt 및 CRIg Q64R M86Y는 고전적 경로를 통한 보체 활성화에 영향을 미치지 않았다. 따라서, CRIg-C3b 결합 계면에서의 2개의 아미노산 치환이 보체의 대안적 경로에 대한 선택성과 함께 2가지 상이한 분석법에서 개선된 결합 친화력 및 우수한 보체 억제 활성을 지니는 분자를 초래한다.
개선된 결합 친화력 및 효능이 개선된 치료 효능으로 번역되는지 여부를 추가로 결정하기 위해, 본 발명가들은 wt 및 Q64R M86Y 버젼의 CRIg의 보호 효과를 관절염의 혈청-전달 모델에서 비교하였다. 기존의 연구는 CRIg가 콜라겐- 및 항체-유도 관절염에서 염증 및 골 파괴를 강력하게 억제한다는 것을 나타냈다 ([Katschke et al., J. Exp Med 204(6):1319-1325 (2007)]).
본원에서, CRIg 효능을 면역 복합체-매개 관절염의 제3 전임상 모델에서 테스트하였다. 류머티스성 관절염의 자발적인 뮤린 모델인 K/BxN은 인간 관절염 질환의 임상적 및 조직학적 양상들 중 다수를 모방한다. 제0일에 K/BxN 마우스로부터 수득된 혈청 50 ㎕를 마우스에게 주사하였다. 동물들을 매일 점검하였고, 질환 정도를 육안 관찰에 의해 채점하였다. 모든 마우스를 제6일에 희생시켰다.
제-1일에 시작하여 100 ㎕ 무균성 염수 내의 지시된 양의 이소타입(isotype) 대조군 또는 hCRIg-mIgG1 또는 hCRIg-RL41-mIgG1 재조합 단백질을 마우스에게 매일 피하 주사하였다.
모니터링 및 채점:
각각의 발에 대한 점수.
0 = 홍반 및 팽윤의 증거 없음
1 = 중족 (족근골) 또는 발목에 국한된 홍반 및 가벼운 팽윤
2 = 발목에서 중족까지 이르는 홍반 및 가벼운 팽윤
3 = 발목에서 중족 관절까지 이르는 홍반 및 중간 정도의 팽윤
4 = 발목, 발 및 발가락을 포함하는 홍반 및 중증 팽윤
평균 점수 = 4개의 발의 점수의 합계.
질환 단계, 경증 (평균 점수 1-3), 중등도 (평균 점수 4-8) 및 중증 질환 (평균 점수 9 이상). 평균 점수는 수반된 관절의 수를 반영한다.
제6일에, 혈액 샘플을 마취 후의 희생 하에 심장내 천자에 의해 수집하였다. hCRIg-Fc 융합 단백질의 양이 혈청을 사용하여 측정되었다. 조직학 평가를 위해 관절을 수집하였다.
KRN 마우스로부터 Balb/c 수령체로의 혈청의 전달은 관절의 대칭성 염증을 특징으로 하는 신속하고 로버스트(robust)한 면역 응답을 초래한다. 관절 내에 전-염증성 면역 복합체를 형성하는 항 글루코스-6-포스페이트 아이소머레이스 자가 항체에 의해 관절염 유도가 매개된다 ([Kouskoff, V., Korganow, A.S., Duchatelle, V., Degott, C., Benoist, C., and Mathis, D. (1996). Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell 87, 811-822]). 대안적 경로 보체 성분이 부족한 마우스 및 통상적인 fc-수용체 감마 사슬이 부족한 마우스에 질환이 없는 것에 의해 제시되는 바와 같이 관절염의 발달은 손상되지 않은 대안적 보체 경로 및 Fc 수용체 기능에 완전히 의존적이다 ([Ji, H., Ohmura, K., Mahmood, U., Lee, D.M., Hofhuis, F.M., Boackle, S.A., Takahashi, K., Holers, V.M., Walport, M., Gerard, C., et al. (2002). Arthritis critically dependent on innate immune system players. Immunity 16, 157-168]). 질환의 급속한 발병 및 중증도로 인해, CRIg wt-Fc 융합 단백질로의 치료는 관절염 점수를 단지 22％만큼만 감소시켰다 (도 9A, B). CRIg Q64R M86Y로의 치료는 66％만큼의 관절염 점수에서의 감소를 나타냈다. 조직학적 검사는 CRIg wt 또는 대조군 융합 단백질로 치료된 마우스에 비해 CRIg Q64R M86Y로 치료된 마우스에서 중성구 및 대식세포로 주로 구성되는 면역 세포의 침윤에서의 유의한 감소를 나타냈다 (도 9C, D). CRIg wt 및 CRIg Q64R M86Y의 혈청 농도는 유사하였고, 이는 관절염 점수에서의 차이가 CRIg wt 대 CRIg Q64R M86Y 단백질의 반감기의 차이로 인한 것이 아니였음을 가리킨다. 따라서, 본 발명가들은 CRIg의 이의 표적 C3b에 대한 증가된 결합 친화력이 유의하게 개선된 치료 효능으로 번역된다는 것을 나타냈다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 문헌은 전체적으로 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다.
본 발명이 특정 실시양태로 간주되는 것을 참조로 기술되었지만, 본 발명이 이같은 실시양태에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 이와 반대로, 본 발명은 첨부된 청구항의 취지 및 범주 내에 포함되는 다양한 변형 및 등가물을 포함하는 것으로 의도된다.
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. <120> AFFINITY MATURED CRIG VARIANTS <130> GNE-0322PCT <140> Not yet Assigned <141> Herewith <150> 61/189,653 <151> 2008-08-20 <150> 61/050,888 <151> 2008-05-06 <160> 67 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1372 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (65)..(1261) <400> 1 ccaactgcac ctcggttcta tcgataggag gctggaagaa aggacagaag tagctctggc 60 tgtg atg ggg atc tta ctg ggc ctg cta ctc ctg ggg cac cta aca gtg 109 Met Gly Ile Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Gly His Leu Thr Val 1 5 10 15 gac act tat ggc cgt ccc atc ctg gaa gtg cca gag agt gta aca gga 157 Asp Thr Tyr Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly 20 25 30 cct tgg aaa ggg gat gtg aat ctt ccc tgc acc tat gac ccc ctg caa 205 Pro Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln 35 40 45 ggc tac acc caa gtc ttg gtg aag tgg ctg gta caa cgt ggc tca gac 253 Gly Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp 50 55 60 cct gtc acc atc ttt cta cgt gac tct tct 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Ile 165 170 175 Trp Tyr Lys Gln Gln Thr Asn Asn Gln Glu Pro Ile Lys Val Ala Thr 180 185 190 Leu Ser Thr Leu Leu Phe Lys Pro Ala Val Ile Ala Asp Ser Gly Ser 195 200 205 Tyr Phe Cys Thr Ala Lys Gly Gln Val Gly Ser Glu Gln His Ser Asp 210 215 220 Ile Val Lys Phe Val Val Lys Asp Ser Ser Lys Leu Leu Lys Thr Lys 225 230 235 240 Thr Glu Ala Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr 245 250 255 Val Lys Gln Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr Leu Gly 260 265 270 Glu Thr Ser Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro Val Phe Ala Ile Ile 275 280 285 Leu Ile Ile Ser Leu Cys Cys Met Val Val Phe Thr Met Ala Tyr Ile 290 295 300 Met Leu Cys Arg Lys Thr Ser Gln Gln Glu His Val Tyr Glu Ala Ala 305 310 315 320 Arg Ala His Ala Arg Glu Ala Asn Asp Ser Gly Glu Thr Met Arg Val 325 330 335 Ala Ile Phe Ala Ser Gly Cys Ser Ser Asp Glu Pro Thr Ser Gln Asn 340 345 350 Leu Gly Asn Asn Tyr Ser Asp Glu Pro Cys Ile Gly Gln Glu Tyr Gln 355 360 365 Ile Ile Ala Gln Ile Asn Gly Asn Tyr Ala Arg Leu Leu Asp Thr Val 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165 170 175 Leu Gly Glu Thr Ser Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro Val Phe Ala 180 185 190 Ile Ile Leu Ile Ile Ser Leu Cys Cys Met Val Val Phe Thr Met Ala 195 200 205 Tyr Ile Met Leu Cys Arg Lys Thr Ser Gln Gln Glu His Val Tyr Glu 210 215 220 Ala Ala Arg Ala His Ala Arg Glu Ala Asn Asp Ser Gly Glu Thr Met 225 230 235 240 Arg Val Ala Ile Phe Ala Ser Gly Cys Ser Ser Asp Glu Pro Thr Ser 245 250 255 Gln Asn Leu Gly Asn Asn Tyr Ser Asp Glu Pro Cys Ile Gly Gln Glu 260 265 270 Tyr Gln Ile Ile Ala Gln Ile Asn Gly Asn Tyr Ala Arg Leu Leu Asp 275 280 285 Thr Val Pro Leu Asp Tyr Glu Phe Leu Ala Thr Glu Gly Lys Ser Val 290 295 300 Cys 305 <210> 5 <211> 1590 <212> DNA <213> Mus sp. <220> <221> CDS <222> (134)..(973) <400> 5 gtccaactgc acctcggttc tatcgattcg aattcggcca cactggccgg atcctctaga 60 gatccctcga cctcgaccca cgcgtccgag cagcaagagg atggaaggat gaatagaagt 120 agcttcaaat agg atg gag atc tca tca ggc ttg ctg ttc ctg ggc cac 169 Met Glu Ile Ser Ser Gly Leu Leu Phe Leu Gly His 1 5 10 cta ata gtg ctc acc 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att gag ctc cgt gtt cgg aaa tat aat cca 553 Val Ile Arg Asp Lys Ile Ile Glu Leu Arg Val Arg Lys Tyr Asn Pro 125 130 135 140 cct aga atc aat act gaa gca cct aca acc ctg cac tcc tct ttg gaa 601 Pro Arg Ile Asn Thr Glu Ala Pro Thr Thr Leu His Ser Ser Leu Glu 145 150 155 gca aca act ata atg agt tca acc tct gac ttg acc act aat ggg act 649 Ala Thr Thr Ile Met Ser Ser Thr Ser Asp Leu Thr Thr Asn Gly Thr 160 165 170 gga aaa ctt gag gag acc att gct ggt tca ggg agg aac ctg cca atc 697 Gly Lys Leu Glu Glu Thr Ile Ala Gly Ser Gly Arg Asn Leu Pro Ile 175 180 185 ttt gcc ata atc ttc atc atc tcc ctt tgc tgc ata gta gct gtc acc 745 Phe Ala Ile Ile Phe Ile Ile Ser Leu Cys Cys Ile Val Ala Val Thr 190 195 200 ata cct tat atc ttg ttc cgc tgc agg aca ttc caa caa gag tat gtc 793 Ile Pro Tyr Ile Leu Phe Arg Cys Arg Thr Phe Gln Gln Glu Tyr Val 205 210 215 220 tat gga gtg agc agg gtg ttt gcc agg aag aca agc aac tct gaa gaa 841 Tyr Gly Val Ser Arg Val Phe Ala Arg Lys Thr Ser Asn Ser Glu Glu 225 230 235 acc aca 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aatcatgaca tcaaaaaaaa aaaaaaaaag ggcggccgcg 1523 actctagagt cgacctgcag tagggataac agggtaataa gcttggccgc catggcccaa 1583 cttgttt 1590 <210> 6 <211> 280 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 6 Met Glu Ile Ser Ser Gly Leu Leu Phe Leu Gly His Leu Ile Val Leu 1 5 10 15 Thr Tyr Gly His Pro Thr Leu Lys Thr Pro Glu Ser Val Thr Gly Thr 20 25 30 Trp Lys Gly Asp Val Lys Ile Gln Cys Ile Tyr Asp Pro Leu Arg Gly 35 40 45 Tyr Arg Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Arg His Gly Ser Asp Ser 50 55 60 Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Thr Gly Asp His Ile Gln Gln Ala 65 70 75 80 Lys Tyr Arg Gly Arg Leu Lys Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val 85 90 95 Ser Leu Gln Ile Asn Thr Leu Gln Met Asp Asp Arg Asn His Tyr Thr 100 105 110 Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Ile Arg Asp 115 120 125 Lys Ile Ile Glu Leu Arg Val Arg Lys Tyr Asn Pro Pro Arg Ile Asn 130 135 140 Thr Glu Ala Pro Thr Thr Leu His Ser Ser Leu Glu Ala Thr Thr Ile 145 150 155 160 Met Ser Ser Thr Ser Asp Leu Thr Thr Asn Gly Thr Gly Lys Leu Glu 165 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Unknown <220> <223> Description of Unknown: Unknown wild-type sequence <400> 21 Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Pro Tyr Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Pro Trp Ser Val Thr Gly Pro Phe Lys Gly 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Pro Tyr Ser Val Thr Gly Pro Phe Lys Gly 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Trp or Phe <400> 25 Pro Tyr Ser Val Thr Gly Pro Xaa Lys Gly 1 5 10 <210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Unknown wild-type sequence 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Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr Trp Arg 1 5 10 15 Thr <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Leu Glu Tyr Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr Trp Lys 1 5 10 15 Thr <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Leu Glu Tyr Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr Trp Lys 1 5 10 15 Thr <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Leu Glu Tyr Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr Trp Arg 1 5 10 15 Thr <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Leu Glu Tyr Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr Trp Leu 1 5 10 15 Thr <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 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Arg <400> 50 Leu Glu Xaa Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr Trp Xaa 1 5 10 15 Thr <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Unknown wild-type sequence <400> 51 Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile 1 5 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Asn Arg Val Val Arg Asp Asn Ile 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Asn Arg Val Val Arg Asp Asp Ile 1 5 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Asn Arg Val Val Arg Asp Gln Ile 1 5 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Asn Arg Val Ile Arg Asp Gln Ile 1 5 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Asn Arg Val Ile Arg Asp His Ile 1 5 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Asn Lys Val Ile Arg Asp Gln Ile 1 5 <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Asn Lys Val Ile Ala Asp Asn Ile 1 5 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Asn Lys Val Ile Ser Asp Asn Ile 1 5 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Asn Gln Val Ile Arg Ser Asp Ile 1 5 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Asn Lys Val Thr Arg Asp Asn Ile 1 5 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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<400> 67 Asn Xaa Val Xaa Arg Asp Xaa Ile 1 5

Claims (1)

  1. 예방적 또는 치료적 유효량의 CRIg 변이체 또는 이 변이체를 포함하는 면역부착소를 보체-관련 질환 또는 용태의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 CRIg 변이체는 서열 2의 아미노산 서열의 E8-K15, R41-T47, S54-Q64, E85-Q99 및 Q105-K111로 이루어진 군으로부터 선택된 영역에서의 아미노산 치환을 포함하는 것인, 보체-관련 질환 또는 용태의 예방 또는 치료 방법.
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