KR101224659B1

KR101224659B1 - 면역 관련 질환의 치료를 위한 신규 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR101224659B1
Application number: KR1020077013117A
Authority: KR
Inventors: 힐러리 클라크; 다니엘 엘. 이톤; 번드 라니크; 원쥔 어우양; 리노 곤잘레즈; 켈리 엠. 로예트; 오스틴 엘. 거니
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2004-11-12
Filing date: 2004-11-12
Publication date: 2013-01-21
Also published as: JP2008519599A; EP1812465B1; KR20070086020A; AU2004325035B2; ES2602731T3; WO2006054961A2; CN101421298A; IL182643A; MX2007005612A; CA2586615C; IL228819A0; CA2586615A1; AU2004325035A1; AU2004325035A2; EP1812465A1; IL182643A0; JP4901747B2; BRPI0419117A

Abstract

본 발명은 신규 단백질을 함유하는 조성물, 및 면역 관련 질환의 진단 및 치료를 위해 상기 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

면역 관련 질환, PRO87299 폴리펩티드, 서열 동일성, 진단, 치료

Description

면역 관련 질환의 치료를 위한 신규 조성물 및 방법{NOVEL COMPOSITION AND METHODS FOR THE TREATMENT OF IMMUNE RELATED DISEASES}

본 발명은 면역 관련 질환의 진단 및 치료에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

면역 관련 질환 및 염증성 질환은, 정상적인 생리 상태에서 상해 또는 손상에 대한 반응, 상해 또는 손상의 복구 개시 및 외래 유기체에 대항하는 선천적 방어 및 후천적 방어의 개시에 중요한, 매우 복잡하며 복합적으로 상호연관되기도 하는 생물학적 경로들의 징후 또는 결과이다. 이러한 정상적인 생리학적 경로들이 반응의 강도에 직접 관련되는 것, 비정상적인 조절 또는 과도한 자극의 결과 또는 자가 반응, 또는 이들의 조합으로서 추가의 상해 또는 손상을 초래하는 경우, 질환 또는 질병이 발생한다.

이러한 질환의 발병에는 종종 다단계 경로 및 다수의 상이한 생물학적 시스템/경로가 관여하는데, 이들 중 하나 이상의 경로의 중요 지점에 개입하여 개선 효과 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다. 치료적 개입은 유해한 과정/경로에 대한 길항 작용 또는 유익한 과정/경로에 대한 자극에 의해 일어날 수 있다.

다수의 면역 관련 질환이 알려져 있으며, 이들은 광범위하게 연구되어 왔다. 이러한 질환으로는 면역-매개성 염증성 질환, 비-면역-매개성 염증성 질환, 감염성 질환, 면역결핍성 질환, 신생물(neoplasia) 등이 있다.

T 림프구(T 세포)는 포유동물의 면역 반응에 중요한 성분이다. T 세포는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 내의 유전자에 의해 코딩되는 자가-분자에 결합된 항원을 인식한다. 이 항원은 항원 제시 세포, 바이러스에 의해 감염된 세포, 암세포, 이식편 등의 표면에서 MHC 분자들과 함께 디스플레이될 수 있다. T 세포계는 숙주 포유동물의 건강에 위협적인 변형된 세포들을 제거한다. T 세포에는 헬퍼(helper) T 세포 및 세포독성 T 세포 등이 있다. 헬퍼 T 세포는 항원 제시 세포 상의 항원-MHC 복합체를 인식한 후에 광범위하게 증식한다. 또한, 헬퍼 T 세포는 B 세포, 세포독성 T 세포 및 면역 반응에 참여하는 다른 다양한 세포들을 활성화시키는데 중추적 역할을 하는 여러 사이토카인, 즉 림포카인을 분비한다.

면역 관련 질환은 면역 반응을 억제하여 치료할 수 있다. 면역 자극 활성을 갖는 분자를 억제하는 중화 항체를 사용하는 것이 면역-매개성 질환 및 염증성 질환의 치료에 유익할 것이다. 면역 반응을 억제하는 분자를 사용하여 (단백질을 직접 사용하거나 또는 항체 효능제의 사용을 통함) 면역 반응을 억제시킴으로써 면역 관련 질환을 개선시킬 수 있다.

CD4+ T 세포는 염증의 중요한 조절인자로 알려져 있다. 본원에서는, CD4+ T 세포를 활성화시키고, 활성화시 상이하게 발현되는 유전자 프로파일을 분석한다. 이와 같이, 활성화 특이적 유전자는 잠재적인 치료 표적일 수 있다. 생산적인 면역 증식 반응에는 생체내 동시-자극이 필수적이다. 동시-자극성 분자의 목록은 매 우 광범위하며, 어떠한 동시-자극 분자가 상이한 유형 및 단계의 염증에 중추적 역할을 하는지는 여전히 불명확하다.

용어 염증성 장 장애("IBD")는 창자 (장)에 염증이 발생하고, 종종 복통 또는 설사가 재발하는 원인불명의 만성 염증성 장애 군을 나타낸다. 미국에서 IBD의 유병률은 10만 인구 당 약 200명인 것으로 추정된다. IBD 환자는 궤양성 대장염("UC") 환자군 및 크론병("CD") 환자군의 2가지 주요 군으로 분류할 수 있다.

UC 환자에서는, 주로 결장 점막과 관련된 염증성 반응이 나타난다. 통상적으로, 염증은 정상적인 점막이 개재된 영역이 없는 균일하고 연속적인 형태이다. 표면 점막 세포 뿐만 아니라 숨은 상피 세포 및 점막 아래 세포는 호중구 침윤을 수반하는 염증성 반응에 관여한다. 이러한 상태는 결과적으로는 통상적으로 다발성 궤양, 섬유증, 이형성증 및 결장의 종방향 수축을 유발하는 상피 세포가 결실되는 상피 손상으로 진행된다.

CD는 염증이 장벽의 모든 층을 통해 확산되고, 장간막 뿐만 아니라 림프절도 관련된다는 점에서 UC와 상이하다. CD는 입부터 항문까지의 소화관의 임의의 부분에 영향을 미칠 수 있다. 상기 질환은 종종 불연속적 형태로, 즉 중증의 장 질환의 환부 절편이 외관상 질환에 걸리지 않은 영역과 분리되어 있다. CD에서는, 또한 장벽이 두꺼워져 폐색이 유발될 수 있다. 또한, 누(瘻) 및 열창이 흔히 나타나는 증상이다.

임상적으로, IBD는 종종 예측할 수 없는 만성 경로로 진행하는 여러 징후를 특징으로 한다. 혈성 설사 및 복통은 종종 발열 및 체중 감소를 수반한다. 빈혈 이 흔히 나타나는 증상이며, 심각한 피로로도 나타난다. 관절통에서부터 급성 관절염을 비롯한 관절 징후 뿐만 아니라 간 기능 이상이 공통적으로 IBD와 관련이 있다. IBD 환자는 또한 일반적인 집단에 비해 결장 암종에 걸릴 위험이 증가한다. IBD의 급성 "발작"이 진행되는 동안에는 일반적으로 작업 및 다른 정상적인 활동이 불가능하며, 환자는 입원을 하기도 한다.

IBD의 원인은 아직 밝혀지지 않았지만, 유전적, 감염성 및 면역학적 감수성과 같은 여러 요인이 관련되어 있다. IBD는 백인, 특히 유대인 집단에서 훨씬 더 흔하게 나타난다. 만성 염증성 증상의 특성은 가능한 감염 원인에 대한 집중적인 연구를 촉구한다. 급성 염증을 자극하는 물질은 발견되었지만, IBD와 관련된 만성 염증을 유발하는 물질은 발견되지 않았다. IBD가 자가면역 질환이라는 가설은 관절염과 같은 종래 언급된 IBD의 장외 징후, 및 부신 글루코코르티코이드, 시클로스포린 및 아자티오프린과 같이 면역 반응을 억제하는 것으로 알려진 치료제로의 치료에 의한 것으로 공지된 IBD에 대한 양성 반응에 의해 뒷받침된다. 또한, 임의의 다른 인체 기관보다는 GI관이 음식으로부터의 단백질, 박테리아 부산물(LPS) 등과 같은 잠재적인 항원성 물질에 계속해서 노출된다.

또한, 결장암에 걸릴 위험은 중증의 궤양성 대장염 환자에서, 특히 수년 동안 질환을 앓고 있었던 경우에 크게 상승한다. IBD 환자의 약 20 내지 25％는 결국 대량 출혈, 만성 소모성 질병, 결장의 전형성(performation) 또는 암에 걸릴 위험 때문에 결장 제거 수술이 요구된다. 또한, 수술은 때때로 다른 유형의 의학적 처치가 실패하거나 또는 스테로이드 또는 다른 의약의 부작용이 환자의 건강을 위 협하는 경우에 수행한다. 수술은 침해성이며 생명을 크게 좌우하므로 매우 바람직한 치료 요법은 아니며, 통상적으로는 최후의 치료 수단이다. 상기 질환을 보다 잘 이해하고 치료할 수 있도록 하기 위해, 유전자가 정상적인 조직에 비해 CD 및 UC 둘 모두에서 상향조절된다는 것을 실험적으로 결정한다.

면역 장애 연구에 있어 상기한 바와 같은 확인된 진전에도 불구하고, 포유동물에서 면역 장애의 존재 여부를 검출할 수 있으며, 이들 장애를 효과적으로 감소시킬 수 있는 또다른 진단제 및 치료제가 크게 요망되고 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 다양한 면역 장애와 관련된, 다양한 면역 세포에서 과다발현되는 폴리펩티드를 동정 및 특성화하는 것, 및 이러한 폴리펩티드를 사용하여 포유동물에서의 면역 장애의 치료적 처치 및 진단적 검출에 유용한 조성물을 제조하는 것이다.

<발명의 개요>

A. 실시양태

본 발명은 인간을 비롯한 포유동물에서 면역 관련 질환의 진단 및 치료에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 포유동물에서 면역 반응을 자극하는 단백질 (효능제 및 길항제 항체를 포함함)의 동정을 기초로 한다. 면역 관련 질환은 면역 반응을 억제하거나 증대시켜 치료할 수 있다. 면역 반응을 증대시키는 분자들은 항원에 대한 면역 반응을 자극하거나 증강시킨다. 면역 반응의 증대가 유익할 경우에는 면역 반응을 자극하는 분자를 치료적으로 사용할 수 있다. 다르게는, 면역 반응의 약화가 유익할 경우에 (예를 들어, 염증) 항원에 대한 면역 반응을 약화시키거나 감소시키는 면역 반응 억제 분자 (예를 들어, 중화 항체)를 치료적으로 사용할 수 있다. 따라서, PRO87299 폴리펩티드, 그의 효능제 및 길항제는 또한 면역 관련 질환 및 염증성 질환 치료용 약제 및 의약의 제조에도 유용하다. 특정 측면에서, 이러한 약제 및 의약은 치료상 유효량의 PRO87299 폴리펩티드, 그의 효능제 또는 길항제를 제약상 허용되는 담체와 함께 포함한다. 이 혼합물은 멸균시키는 것이 바람직하다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 PRO87299 폴리펩티드를 후보 분자와 접촉시켜 상기 PRO87299 폴리펩티드에 의해 매개되는 생물학적 활성을 모니터링하는 것을 포함하는, PRO87299 폴리펩티드에 대한 효능제 또는 길항제의 동정 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, PRO87299 폴리펩티드는 천연 서열 PRO87299 폴리펩티드이다. 특정 측면에서, PRO87299 효능제 또는 길항제는 항-PRO87299 항체이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO87299 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드에 결합하는 효능제 또는 길항제 항체를 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 조성물은 치료상 유효량의 폴리펩티드 또는 항체를 포함한다. 다른 측면에서, 상기 조성물이 면역 자극 분자를 포함하는 경우, 이러한 조성물은 (a) 조직으로의 염증 세포의 침윤 증가를 필요로 하는 포유동물 조직으로의 염증 세포 침윤의 증가, (b) 면역 반응의 자극 또는 증대를 필요로 하는 포유동물에서의 면역 반응의 자극 또는 증대, (c) 항원에 대한 반응에서 면역 세포 증식의 증가를 필요로 하는 포유동물에서의 면역 세포 증식의 증가, (d) 면역 세포 활성의 자극, 또는 (e) 혈관 투과성의 증가에 유용하다. 추가의 측면에서, 상기 조성물이 면역 억제 분자를 포함하는 경우, 이러한 조성물은 (a) 조직으로의 염증 세포의 침윤 감소를 필요로 하는 포유동물 조직으로의 염증 세포 침윤의 감소, (b) 면역 반응의 억제 또는 감소를 필요로 하는 포유동물에서의 면역 반응의 억제 또는 감소, (c) 면역 세포 활성의 감소, 또는 (d) 항원에 대한 반응에서 면역 세포 증식의 감소를 필요로 하는 포유동물에서의 면역 세포 증식의 감소에 유용하다. 다른 측면에서, 상기 조성물은 예를 들면 추가의 항체 또는 세포독성제 또는 화학요법제일 수 있는 추가의 활성 성분을 포함한다. 상기 조성물은 멸균시키는 것이 바람직하다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 면역 관련 장애의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 PRO87299 폴리펩티드, 그의 효능제, 또는 이에 대한 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 면역 관련 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 측면에서, 면역 관련 장애는 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 골관절염, 유년형 만성 관절염, 척추관절증, 전신성 경화증, 특발성 염증성 근장애, 쇼그렌 증후군(Sjoegren's syndrome), 전신성 맥관염, 유육종증(sarcoidosis), 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판감소증, 갑상선염, 진성당뇨병, 면역-매개성 신장 질환, 중추신경계 및 말초신경계의 탈수초 질환 (예컨대, 다발성 경화증, 특발성 탈수초 다발성 신경염 또는 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 및 만성 염증성 탈수초 다발성 신경염), 간담즙성 질환 (예컨대, 감염성 및 자가면역성 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염 및 경화성 담관염), 염증성 장 질환, 글루텐(gluten) 민감성 장 질환, 휘플병(Whipple's diesase), 자가면역성 또는 면역-매개성 피부 질환 (수포성 피부 질환, 다형성 홍반 및 접촉성 피부염 포함), 건선, 알레르기성 질환 (예컨대, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증 및 두드러기), 폐의 면역 질환 (예컨대, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증 및 과민성 폐렴), 이식 관련 질환 (이식 거부반응 및 이식편-대-숙주 질환 포함)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 또는 하기에 기재된 임의의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의로는, 상기 항체는 모노클로날 항체, 인간화 항체, 항체 단편 또는 단쇄 항체이다. 한 측면에서, 본 발명은 PRO87299 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체에 관한 것이다. 다른 측면에서, 상기 항체는 PRO87299 폴리펩티드의 활성을 모방하거나 (효능제 항체), 또는 반대로 상기 항체는 PRO87299 폴리펩티드의 활성을 억제하거나 중화시킨다 (길항제 항체). 다른 측면에서, 상기 항체는 바람직하게는 비-인간 상보성 결정 영역(CDR) 잔기 및 인간 프레임워크 영역(FR) 잔기를 갖는 모노클로날 항체이다. 상기 항체는 표지될 수도 있고, 고체 지지체 상에 고정화될 수도 있다. 추가의 측면에서, 상기 항체는 항체 단편, 모노클로날 항체, 단쇄 항체 또는 항-이디오타입(idiotypic) 항체이다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 항-PRO87299 항체를 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 조성물은 치료상 유효량의 항체를 포함한다. 이 조성물은 멸균시키는 것이 바람직하다. 상기 조성물은 연장된 보관 안정성을 달성하도록 보존될 수 있는 액상 제약 제제의 형태로 투여될 수도 있다. 다르게는, 상기 항체는 모노클로날 항체, 항체 단편, 인간화 항 체 또는 단쇄 항체이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은

(a) PRO87299 폴리펩티드, 그의 효능제 또는 길항제를 포함하는 조성물,

(b) 상기 조성물을 함유하는 용기, 및

(c) 상기 용기에 부착된 라벨, 또는 상기 용기 내에 포함된 포장 삽입물

을 포함하며, 여기서 상기 라벨 또는 포장 삽입물은 면역 관련 질환의 치료에 있어 상기 PRO87299 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드의 효능제 또는 길항제의 사용을 나타내는 것인 제조 용품에 관한 것이다. 상기 조성물은 치료상 유효량의 PRO87299 폴리펩티드, 또는 그의 효능제 또는 길항제를 포함할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 포유동물로부터 수득한 조직 세포의 시험 샘플, 및 (b) 세포 유형이 동일한 공지의 정상 조직 세포의 대조군 샘플에서 PRO87299 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하며, 여기서 시험 샘플에서의 상기 유전자의 발현 수준이 대조군 샘플에 비해 더 높거나 낮은 것이 그 시험 조직 세포를 수득한 포유동물에 면역 관련 질환이 존재함을 나타내는 것인, 포유동물에서 면역 관련 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 항-PRO87299 폴리펩티드 항체를 포유동물로부터 수득한 조직 세포의 시험 샘플과 접촉시키고, (b) 시험 샘플 중에서, 상기 항체와 PRO87299 폴리펩티드 사이의 복합체 형성을 검출하는 것을 포함하며, 여기서 상기 복합체 형성이 상기 질환의 존재 또는 부재를 나타내는 것인, 포유동물에 서 면역 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 상기 검출법은 정성적 또는 정량적일 수 있고, 세포 유형이 동일한 공지된 정상 조직 세포의 대조군 샘플에서의 복합체 형성을 모니터링하여 비교함으로써 수행할 수 있다. 시험 샘플에서 더 많은 양의 복합체가 형성되는 것은 그 시험 조직 세포를 수득한 포유동물에 면역 질환이 존재 또는 부재함을 지시한다. 상기 항체는 검출가능한 표지를 갖는 것이 바람직하다. 복합체 형성은, 예를 들어 광학 현미경법, 유동세포측정법, 형광측정법, 또는 당업계에 공지된 다른 기술로 모니터링할 수 있다. 시험 샘플은 일반적으로 면역계에 결함이 있거나 면역계가 비정상적일 것으로 예상되는 개체로부터 얻는다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO87299 폴리펩티드를 함유할 것으로 예상되는 세포의 시험 샘플을 항-PRO87299 항체에 노출시켜 상기 세포 샘플에 대한 상기 항체의 결합 여부를 결정하는 것을 포함하는, 상기 샘플에서 PRO87299 폴리펩티드의 존재 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 상기 샘플은 PRO87299 폴리펩티드를 함유할 것으로 예상되는 세포를 포함하며, 항체는 상기 세포에 결합한다. 항체는 검출가능하게 표지되고/되거나 고체 지지체에 결합된 것이 바람직하다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 항-PRO87299 항체 및 담체를 적합한 포장 내에 포함하는, 면역 관련 질환 진단용 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 PRO87299 폴리펩티드의 존재 여부 검출을 위해 항체를 사용하는 것에 관한 지침을 함유하는 것이 바람직하다. 담체는 제약상 허용되는 것이 바람직하다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 항-PRO87299 항체를 적합한 포장 내에 함유하 는 진단용 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 PRO87299 폴리펩티드의 검출을 위해 항체를 사용하는 것에 관한 지침을 함유하는 것이 바람직하다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 포유동물로부터 수득한 조직 세포의 시험 샘플에서 PRO87299 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 상기 시험 샘플에서의 PRO87299 폴리펩티드 존재 또는 부재는 상기 포유동물에 면역 관련 질환이 존재함을 나타내는 것인, 포유동물에서 면역 관련 질환을 진단하는 방법을 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은

(a) PRO87299 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응의 유도에 적합한 조건 하에서 스크리닝될 시험 화합물과 세포를 접촉시키고,

(b) 상기 세포 반응의 유도 여부를 결정하여 시험 화합물이 효과적인 효능제인지 결정하는 것

을 포함하며, 여기서 상기 세포 반응의 유도가 상기 시험 화합물이 효과적인 효능제임을 나타내는 것인, PRO87299 폴리펩티드의 효능제를 동정하는 방법에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 후보 화합물과 PRO87299 폴리펩티드가 상호작용하기에 충분한 조건 하에서 상기 상호작용에 충분한 시간 동안 상기 두 성분을 접촉시키고, PRO87299 폴리펩티드의 활성이 억제되는지 여부를 결정하는 것을 포함하는, PRO87299 폴리펩티드의 활성을 억제할 수 있는 화합물의 동정 방법에 관한 것이다. 특정 측면에서, 후보 화합물 또는 PRO87299 폴리펩티드는 고체 지지체상 에 고정화시킨다. 다른 측면에서, 고정화되지 않은 성분은 검출가능한 표지를 지니고 있다. 바람직한 측면에서, 상기 방법은

(a) PRO87299 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응의 유도에 적합한 조건 하에서 PRO87299 폴리펩티드의 존재 하에 스크리닝될 시험 화합물과 세포를 접촉시키는 단계, 및

(b) 상기 세포 반응의 유도 여부를 결정하여 시험 화합물이 효과적인 길항제인지 결정하는 단계

를 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO87299 폴리펩티드를 정상적으로 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, PRO87299 폴리펩티드의 발현 억제 여부를 결정하는 것을 포함하는, 상기 세포에서 PRO87299 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 바람직한 측면에서, 상기 방법은

(a) PRO87299 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 스크리닝될 시험 화합물과 세포를 접촉시키는 단계, 및

(b) 상기 폴리펩티드의 발현 억제 여부를 결정하는 단계

를 포함한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 면역 관련 장애를 앓고 있는 포유동물에게, (a) PRO87299 폴리펩티드, (b) PRO87299 폴리펩티드의 효능제, 또는 (c) PRO87299 폴리펩티드의 길항제를 코딩하는 핵산 분자를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 효능제 또는 길항제는 항-PRO87299 항체일 수 있는, 상기 포유동물에서 면역 관 련 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 핵산은 생체외 유전자 요법을 통해 투여된다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 핵산은 벡터 내에 포함되고, 보다 바람직하게는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터 내에 포함된다.

또다른 측면에서, 본 발명은 본질적으로 프로모터; (a) PRO87299 폴리펩티드, (b) PRO87299 폴리펩티드의 효능제 폴리펩티드, 또는 (c) PRO87299 폴리펩티드의 길항제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산; 및 상기 폴리펩티드의 세포 분비에 대한 신호 서열로 구성된 바이러스 벡터를 포함하며, 여기서 상기 바이러스 벡터는 바이러스 구조 단백질과 결합되는, 재조합 바이러스 입자를 제공한다. 바람직하게는, 신호 서열은 포유동물로부터 유래한 것, 예컨대 천연 PRO87299 폴리펩티드로부터 유래한 것이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 레트로바이러스 구조 단백질을 발현하며, 또한 본질적으로 프로모터; (a) PRO87299 폴리펩티드, (b) PRO87299 폴리펩티드의 효능제 폴리펩티드, 또는 (c) PRO87299 폴리펩티드의 길항제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산; 및 상기 폴리펩티드의 세포 분비에 대한 신호 서열로 구성된 레트로바이러스 벡터를 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 생체외 생산자 세포에 관한 것이며, 여기서 상기 생산자 세포는 구조 단백질과 결합된 레트로바이러스 벡터를 패키징시킴으로써 재조합 레트로바이러스 입자를 생성한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에게 (a) PRO87299 폴리펩티드, (b) PRO87299 폴리펩티드의 효능제 또는 (c) PRO87299 폴리펩티드의 길항제를 투여하여 상기 포유동물에서 면역 세포의 활성을 증가시키는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에게 (a) PRO87299 폴리펩티드, (b) PRO87299 폴리펩티드의 효능제 또는 (c) PRO87299 폴리펩티드의 길항제를 투여하여 상기 포유동물에서 면역 세포의 증식을 증가시키는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 세포의 증식을 증가시키는 방법을 제공한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에게 (a) PRO87299 폴리펩티드, (b) PRO87299 폴리펩티드의 효능제 또는 (c) PRO87299 폴리펩티드의 길항제를 투여하여 상기 포유동물에서 면역 세포의 증식을 감소시키는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 세포의 증식을 감소시키는 방법을 제공한다.

B. 추가의 실시양태

본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 또한 이러한 임의의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 그 예로서, 숙주 세포는 CHO 세포, 이. 콜라이(E. coli) 또는 효모일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 제조하는 방법도 제공되는데, 이 방법은 원하는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고 이 세포 배양물로부터 원하는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 이러한 키메라 분자의 예로는 에피토프 태그 서열 또는 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 융합된 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드가 포함된다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 또는 하기에 기재된 임의의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의로는, 상기 항체는 모노클로날 항체, 인간화 항체, 항체 단편 또는 단쇄 항체이다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 게놈 및 cDNA 뉴클레오티드 서열을 단리하기에 유용하거나 안티센스 프로브로 유용한 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하며, 여기서 상기 프로브는 상기 또는 하기에 기재된 임의의 뉴클레오티드 서열로부터 유래될 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO87299 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.

한 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 개시된 바와 같은 전장 아미노산 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 없는 아미노산 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 있거나 없는 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 아미노산 서열의 임의의 다른 특정된 단편을 갖는 PRO87299 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 DNA 분자 (a)의 상보체와의 핵산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％ 이상, 다르게는 약 82％ 이상, 다르게는 약 83％ 이상, 다르게는 약 84％ 이상, 다르게는 약 85％ 이상, 다르게는 약 86％ 이상, 다르게는 약 87％ 이상, 다르게는 약 88％ 이상, 다르게는 약 89％ 이상, 다르게는 약 90％ 이상, 다르게는 약 91％ 이상, 다르게는 약 92％ 이상, 다르게는 약 93％ 이상, 다르게는 약 94％ 이상, 다르게는 약 95％ 이상, 다르게는 약 96％ 이상, 다르게는 약 97％ 이상, 다르게는 약 98％ 이상, 및 다르게는 약 99％ 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

다른 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 개시된 바와 같은 전장 PRO87299 폴리펩티드 cDNA의 코딩 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 없는 PRO87299 폴리펩티드의 코딩 서열, 또는 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 있거나 없는 막횡단 PRO87299 폴리펩티드의 세포외 도메인의 코딩 서열, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 아미노산 서열의 임의의 다른 특정된 단편의 코딩 서열을 포함하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 DNA 분자 (a)의 상보체와의 핵산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％ 이상, 다르게는 약 82％ 이상, 다르게는 약 83％ 이상, 다르게는 약 84％ 이상, 다르게는 약 85％ 이상, 다르게는 약 86％ 이상, 다르게는 약 87％ 이상, 다르게는 약 88％ 이상, 다르게는 약 89％ 이상, 다르게는 약 90％ 이상, 다르게는 약 91％ 이상, 다르게는 약 92％ 이상, 다르게는 약 93％ 이상, 다르게는 약 94％ 이상, 다르게는 약 95％ 이상, 다르게는 약 96％ 이상, 다르게는 약 97％ 이상, 다르게는 약 98％ 이상, 다르게는 약 99％ 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 도 2 (서열 2)에 도시된 것과 동일한 성숙한 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자와의 핵산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％ 이상, 다르게는 약 82％ 이상, 다르게는 약 83％ 이상, 다르게는 약 84％ 이상, 다르게는 약 85％ 이상, 다르게는 약 86％ 이상, 다르게는 약 87％ 이상, 다르 게는 약 88％ 이상, 다르게는 약 89％ 이상, 다르게는 약 90％ 이상, 다르게는 약 91％ 이상, 다르게는 약 92％ 이상, 다르게는 약 93％ 이상, 다르게는 약 94％ 이상, 다르게는 약 95％ 이상, 다르게는 약 96％ 이상, 다르게는 약 97％ 이상, 다르게는 약 98％ 이상, 다르게는 약 99％ 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 막횡단 도메인이 결실되거나 막횡단 도메인이 실활된 PRO87299 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 이러한 코딩 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공하며, 이러한 폴리펩티드의 막횡단 도메인(들)은 본원에 기재되어 있다. 따라서, 본원에 기재된 PRO87299 폴리펩티드들의 가용성 세포외 도메인이 고려된다.

또다른 실시양태는, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브로 사용될 수 있거나, 또는 임의로는 항-PRO87299 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 PRO87299 폴리펩티드의 코딩 단편에 대한 혼성화 프로브로 사용될 수 있는 PRO87299 폴리펩티드 코딩 서열 또는 그 상보체의 단편에 관한 것이다. 이러한 핵산 단편은 일반적으로 그 길이가 뉴클레오티드 약 20개 이상, 다르게는 약 30개 이상, 다르게는 약 40개 이상, 다르게는 약 50개 이상, 다르게는 약 60개 이상, 다르게는 약 70개 이상, 다르게는 약 80개 이상, 다르게는 약 90개 이상, 다르게는 약 100개 이상, 다르게는 약 110개 이상, 다르게는 약 120개 이상, 다르게는 약 130개 이상, 다르게는 약 140개 이상, 다르게는 약 150개 이상, 다르게는 약 160개 이상, 다르게는 약 170개 이상, 다르게는 약 180개 이상, 다르게는 약 190개 이상, 다르게는 약 200개 이상, 다르게는 약 250개 이상, 다르게는 약 300개 이상, 다르게는 약 350개 이상, 다르게는 약 400개 이상, 다르게는 약 450개 이상, 다르게는 약 500개 이상, 다르게는 약 600개 이상, 다르게는 약 700개 이상, 다르게는 약 800개 이상, 다르게는 약 900개 이상, 다르게는 약 1000개 이상이며, 여기서 용어 "약"은 문맥상 언급한 뉴클레오티드 서열 길이±언급된 길이의 10％를 의미한다. PRO87299 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 신규 단편은, 잘 알려진 다수의 서열 정렬 프로그램 중 임의의 것을 사용하여 상기 PRO87299 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 공지된 뉴클레오티드 서열과 함께 정렬시키고, 어떤 PRO87299 폴리펩티드 뉴클레오티드 서열 단편(들)이 신규한 것인지를 결정함으로써 통상적인 방식으로 결정할 수 있음에 유의한다. 본원에서는 상기 PRO87299 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 모두가 고려된다. 또한 상기 뉴클레오티드 분자 단편에 의해 코딩되는 PRO87299 폴리펩티드 단편, 바람직하게는 항-PRO87299 폴리펩티드 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 PRO87299 폴리펩티드 단편들도 고려된다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 상기에서 동정된 본 발명의 임의의 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 단리된 PRO87299 폴리펩티드를 제공한다.

특정 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 전장 아미노산 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 없는 아미노산 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 있거나 없는 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 아미노산 서열의 임의의 다른 특정된 단편을 갖는 PRO87299 폴 리펩티드와의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％ 이상, 다르게는 약 82％ 이상, 다르게는 약 83％ 이상, 다르게는 약 84％ 이상, 다르게는 약 85％ 이상, 다르게는 약 86％ 이상, 다르게는 약 87％ 이상, 다르게는 약 88％ 이상, 다르게는 약 89％ 이상, 다르게는 약 90％ 이상, 다르게는 약 91％ 이상, 다르게는 약 92％ 이상, 다르게는 약 93％ 이상, 다르게는 약 94％ 이상, 다르게는 약 95％ 이상, 다르게는 약 96％ 이상, 다르게는 약 97％ 이상, 다르게는 약 98％ 이상, 다르게는 약 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO87299 폴리펩티드에 관한 것이다.

추가의 측면에서, 본 발명은 도 2 (서열 2)에 도시된 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％ 이상, 다르게는 약 82％ 이상, 다르게는 약 83％ 이상, 다르게는 약 84％ 이상, 다르게는 약 85％ 이상, 다르게는 약 86％ 이상, 다르게는 약 87％ 이상, 다르게는 약 88％ 이상, 다르게는 약 89％ 이상, 다르게는 약 90％ 이상, 다르게는 약 91％ 이상, 다르게는 약 92％ 이상, 다르게는 약 93％ 이상, 다르게는 약 94％ 이상, 다르게는 약 95％ 이상, 다르게는 약 96％ 이상, 다르게는 약 97％ 이상, 다르게는 약 98％ 이상, 다르게는 약 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO87299 폴리펩티드에 관한 것이다.

특정 측면에서, 본 발명은 본원에서 앞서 기재한 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되며 N-말단 신호 서열 및/또는 개시 메티오닌을 갖지 않는 단리된 PRO87299 폴리펩티드를 제공한다. 또한 상기 단리된 PRO87299 폴리펩티드의 제조 방법도 본원에 기재되어 있으며, 이 방법은 적절한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 PRO87299 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하고, 이 세포 배양물로부터 PRO87299 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.

다른 측면에서 본 발명은 막횡단 도메인이 결실되거나 막횡단 도메인이 실활된 단리된 PRO87299 폴리펩티드를 제공한다. 또한 상기한 단리된 PRO87299 폴리펩티드의 제조 방법도 본원에 기재되어 있으며, 이 방법은 적절한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 PRO87299 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 이 세포 배양물로부터 PRO87299 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 천연 PRO87299 폴리펩티드의 효능제 및 길항제에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 효능제 또는 길항제는 항-PRO87299 항체 또는 소분자이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 PRO87299 폴리펩티드를 후보 분자와 접촉시켜 상기 PRO87299 폴리펩티드에 의해 매개되는 생물학적 활성을 모니터링하는 것을 포함하는, PRO87299 폴리펩티드에 대한 효능제 또는 길항제를 동정하는 방법에 관한 것이다. PRO87299 폴리펩티드는 천연 PRO87299 폴리펩티드인 것이 바람직하다.

또다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 PRO87299 폴리펩티드, 또는 PRO87299 폴리펩티드의 효능제 또는 길항제, 또는 항-PRO87299 항체를, 담체와 함께 포함하는 조성물에 관한 것이다. 임의로는, 담체는 제약상 허용되는 담체이다.

본 발명의 다른 실시양태는 PRO87299 폴리펩티드, 그의 효능제 또는 길항제, 또는 항-PRO87299 항체에 반응하는 증상의 치료에 유용한 의약을 제조하기 위한, 본원에서 앞서 기재한 바와 같은 PRO87299 폴리펩티드, 그의 효능제 또는 길항제, 또는 항-PRO87299 항체의 용도에 관한 것이다.

본 특허 명세서는 하나 이상의 컬러 도면을 함유한다. 컬러 도면을 포함한 본 특허의 사본은 이를 요청하고 사용료를 납부하면 특허 및 상표청에서 제공할 것이다.

도 1은 천연 서열 PRO87299 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 1)을 나타내며, 여기서 서열 1은 본원에서 "DNA332467"로 지칭되는 클론이다.

도 2는 도 1에 도시된 서열 1의 코딩 서열로부터 유래한 아미노산 서열 (서열 2)를 나타낸다.

도 3은 천연 서열 HVEM cDNA (HVEM)의 뉴클레오티드 서열 (서열 3)을 나타내며, 여기서 서열 3은 본원에서 "HVEM"으로 지칭되는 클론이다.

도 4는 도 3에 도시된 서열 3의 코딩 서열로부터 유래한 아미노산 서열 (서열 4)을 나타낸다.

도 5는 천연 서열 LIGHT의 뉴클레오티드 서열 (서열 5)을 나타내며, 여기서 서열 5는 본원에서 "LIGHT"로 지칭되는 클론이다.

도 6은 도 5에 도시된 서열 5의 코딩 서열로부터 유래한 아미노산 서열 (서 열 6)을 나타낸다.

도 7은 변이체 서열 PRO87299의 뉴클레오티드 서열 (서열 7)을 나타내며, 여기서 서열 7은 본원에서 "PRO87299.short"로 지칭되는 클론이다.

도 8은 도 7에 도시된 서열 7의 코딩 서열로부터 유래한 아미노산 서열 (서열 8)을 나타낸다.

도 9는 변이체 서열 PRO87299의 뉴클레오티드 서열 (서열 9)을 나타내며, 여기서 서열 9는 본원에서 "PRO87299.AFTNIP"로 지칭되는 클론이다.

도 10은 도 9에 도시된 서열 9의 코딩 서열로부터 유래한 아미노산 서열 (서열 10)을 나타낸다.

도 11은 PRO87299 cDNA의 핵산 변이체를 나타낸다.

도 12는 PRO87299 변이체의 폴리펩티드 번역을 보여준다.

도 13은 효능제 항체에 의한 CD4+ T 세포 증식의 억제를 보여준다.

도 14는 HVEM에 대한 PRO87299의 특이적인 결합을 보여준다.

도 15는 HVEM에 대한 PRO87299의 결합을 다른 족 구성원과 비교한 결과를 보여준다.

도 16은 HVEM에 대한 PRO87299의 결합이 pH에 민감함을 보여준다.

도 17은 HVEM로 형질감염된 세포에서의 HVEM에 대한 PRO87299의 결합을 보여준다.

도 18은 PRO87299에 대한 항체가 HVEM와의 상호작용을 차단할 수 있음을 보여준다.

도 19는 PRO87299 및 LIGHT가 HVEM에 동시에 결합할 수 있음을 보여준다.

도 20은 PRO87299가 LIGHT와 HVEM의 상호작용에 의해 차단되지 않음을 보여준다.

도 21은 BP-2 펩티드 및 gD가 PRO87299/HVEM 상호작용을 차단함을 보여준다.

도 22는 CD4+ T 세포에 대한 PRO87299의 억제 효과를 보여준다.

도 23은 HVEM-Fc에 의한 PRO87299의 활성화가 GVHR 모델에서 생존률을 증진시킨다는 것을 보여준다.

I. 정의

본원에 기재된 PRO87299 폴리펩티드는 인간 조직 유형 또는 다른 공급원과 같은 다양한 공급원에서 단리될 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수도 있다. "PRO87299 폴리펩티드"를 언급하는 본 명세서의 모든 개시 내용은 각각의 폴리펩티드를 개별적으로 나타내기도 하며, 또한 폴리펩티드들을 함께 나타내기도 한다. 예를 들어, ~의 제조, ~의 정제, ~의 유래, ~에 대한 항체의 형성, ~의 투여, ~을 함유하는 조성물, ~으로의 질환의 치료 등의 기재는 본 발명의 각각의 폴리펩티드와 개별적으로 관련된다. 또한, 용어 "PRO87299 폴리펩티드"는 본원에 개시된 PRO87299 폴리펩티드의 변이체도 포함한다.

"천연 서열 PRO87299 폴리펩티드"는 자연으로부터 유래한 상응하는 PRO87299 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 PRO87299 폴리펩티드는 자연으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 수단으로 제조될 수도 있다. 용어 "천연 서열 PRO87299 폴리펩티드"는 구체적으로는 특정 PRO87299 폴리펩티드의 자연발생적 말단 절단된 (truncated) 형태 또는 분비된 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 이러한 폴리펩티드의 자연발생적 변이체 형태 (예를 들어, 다르게 스플라이싱된 형태) 및 자연발생적 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 천연 서열 PRO87299 폴리펩티드는 첨부된 도면에 나타낸 전장 아미노산 서열을 포함하는 성숙한 또는 전장 천연 서열 폴리펩티드이다. 개시 및 정지 코돈은 도면에서 굵은 글씨 및 밑줄로 표시한다. 그러나, 본원에 첨부된 도면에 개시된 PRO87299 폴리펩티드는 도면에서 아미노산 위치 1로 본원에 지정된 메티오닌 잔기로 시작하는 것으로 나타나 있지만, 도면에서 아미노산 위치 1로부터 상류 또는 하류에 위치한 다른 메티오닌 잔기가 PRO87299 폴리펩티드의 출발 아미노산 잔기로 이용될 수 있음을 생각할 수 있으며, 또한 이러한 사용이 가능하다.

PRO87299 폴리펩티드의 "세포외 도메인" 또는 "ECD"란 본질적으로 막횡단 및 세포질 도메인이 없는 PRO87299 폴리펩티드 형태를 나타낸다. 통상적으로, PRO87299 폴리펩티드 ECD는 이러한 막횡단 및/또는 세포질 도메인을 1％ 미만으로 가질 것이며, 바람직하게는 상기 도메인들을 0.5％ 미만으로 가질 것이다. 본 발명의 PRO87299 폴리펩티드의 경우에 동정된 임의의 막횡단 도메인은 당업계에서 소수성 도메인의 유형을 확인하는데 통상적으로 사용되는 기준에 따라 동정된 것임을 이해할 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계선은 달라질 수 있지만, 대부분은 본원에서 처음 확인된 바와 같이 상기 도메인의 어느 한 말단에서 약 5개 이하의 아미노산 범위 내에 존재한다. 따라서, PRO87299 폴리펩티드의 세포외 도메인은 임의로는, 실시예 또는 상세한 설명에서 동정된 막횡단 도메인/세포외 도메인의 어느 한 측면에 약 5개 이하의 아미노산을 포함할 수 있고, 연결된 신호 펩티드가 있거나 없는 이러한 폴리펩티드, 및 이들을 코딩하는 핵산은 본 발명에 포함된다.

"PRO87299 폴리펩티드 변이체"는 본원에 개시된 전장 천연 서열 PRO87299 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 없는 PRO87299 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 있거나 없는 PRO87299 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 PRO87299 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상인, 상기 또는 하기에 정의된 활성 PRO87299 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 PRO87299 폴리펩티드 변이체로는, 예를 들어 전장 천연 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가되거나 결실된 PRO87299 폴리펩티드가 있다. 통상적으로, PRO87299 폴리펩티드 변이체는 본원에 개시된 전장 천연 서열 PRO87299 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 없는 PRO87299 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 있거나 없는 PRO87299 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 PRO87299 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 특정된 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％ 이상, 다르게는 약 82％ 이상, 다르게는 약 83％ 이상, 다르게는 약 84％ 이상, 다르게는 약 85％ 이상, 다르게는 약 86％ 이상, 다르게는 약 87％ 이상, 다르게는 약 88％ 이상, 다르게는 약 89％ 이상, 다르게는 약 90％ 이상, 다르게는 약 91％ 이상, 다르게는 92％ 이상, 다르게는 약 93％ 이상, 다르게는 약 94％ 이상, 다르게는 약 95％ 이상, 다르게는 약 96％ 이상, 다르게는 약 97％ 이상, 다르게는 약 98％ 이상, 다르게는 약 99％ 이상일 것이다. 통상적으로, PRO87299 변이체 폴리펩티드는 그 길이가 아미노산 약 10개 이상, 다르게는 약 20개 이상, 다르게는 약 30개 이상, 다르게는 약 40개 이상, 다르게는 약 50개 이상, 다르게는 약 60개 이상, 다르게는 약 70개 이상, 다르게는 약 80개 이상, 다르게는 약 90개 이상, 다르게는 약 100개 이상, 다르게는 약 150개 이상, 다르게는 약 200개 이상, 다르게는 약 300개 이상, 또는 그 이상이다.

본원에서 확인된 PRO87299 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성(％)"은 PRO87299 폴리펩티드 서열과 후보 서열을 정렬하고, 필요한 경우 서열 동일성 퍼센트의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 상태에서 특정 PRO87299 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성(％)을 결정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법으로, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign; DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대로 정렬시키기 위해 필요한 임의의 연산법을 비롯하여 정렬을 측정하기에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적에 있어 아미노산 서열 동일성 값(％)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 여기서 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 하기 표 1에 제공되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.)가 개발하였으며, 표 1에 제공한 원시 코드는 미국 저작권청 (미국 20559 워싱톤 D.C. 소재)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 제TXU510087호로서 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)를 통해 공개적으로 입수가능하거나, 하기 표 1에 기재된 원시 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 컴파일되어 이용되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변경되지 않는다.

ALIGN-2가 아미노산의 서열 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성(％), 상기 서열 A의 상기 서열 B와의 아미노산 서열 동일성(％), 또는 상기 서열 B에 비한 상기 서열 A의 아미노산 서열 동일성(％) (주어진 아미노산 서열 B에 대해, 상기 서열 B와, 또는 상기 서열 B에 비해 소정의 아미노산 서열 동일성(％)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 달리 표현할 수도 있음)은 하기와 같이 계산한다:

X/Y×100

여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 있는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성(％)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성(％)와 동일하지 않을 것임을 인지해야 할 것이다. 상기 방법을 이용한 아미노산 서열 동일성(％) 계산의 예로서, 표 2 및 표 3은 "PRO87299"로 지칭되는 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질"로 지칭되는 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성(％)을 계산하는 방법을 나타내며, 여기서, "PRO87299"는 가상의 대상 PRO87299 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "비교 단백질"은 대상 "PRO87299" 폴리펩티드와 비교될 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내며, "X", "Y" 및 "Z"는 각각 상이한 가상의 아미노산 잔기를 나타낸다.

달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 본원에 이용된 모든 아미노산 서열 동일성 값(％)은 바로 앞선 단락에 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻는다. 그러나, 아미노산 서열 동일성 값(％)은 하기 기재한 바와 같이 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (문헌 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-80 (1996)])을 이용하여 얻을 수도 있다. WU-BLAST-2 검색 파라미터의 대부분은 디폴트 값으로 설정된다. 디폴트 값으로 설정하지 않은 것들, 즉 조정가능한 파라미터는 다음과 같은 값으로 설정된다: 중복 스팬 = 1, 중복 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 스코어 매트릭스 = BLOSUM62. WU-BLAST-2를 이용하면 아미노산 서열 동일성 값(％)은, (a) 천연 PRO87299 폴리펩티드로부터 유래된 서열을 갖는 대상 PRO87299 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교 대상 아미노산 서열 (즉, 대상 PRO87299 폴리펩티드와 비교되는 서열로서 PRO87299 변이체 폴리펩티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 아미노산 잔기의 수 (WU-BLAST-2에 의해 결정됨)를 (b) 대상 PRO87299 폴리펩티드의 아미노산 총 잔기 수로 나누어 결정한다. 예를 들어, "아미노산 서열 B와의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상인 아미노산 서열 A를 포함하는 폴리펩티드"라는 언급에서, 아미노산 서열 A는 비교 대상 아미노산 서열이고 아미노산 서열 B는 대상 PRO87299 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.

아미노산 서열 동일성(％)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST-2를 이용하여 결정할 수도 있다 (문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)]). 상기 NCBI-BLAST-2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받거나, 또 다르게는 미국 메릴랜드주 베테스다 소재의 미국립보건원에서 얻을 수 있다. NCBI-BLAST-2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 검색 파라미터는 모두 디폴트 값으로 설정되며, 예를 들어, 언마스크(unmask) = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프(dropoff) = 25 및 스코어 매트릭스 = BLOSUM62이다.

NCBI-BLAST-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성(％), 상기 서열 A의 상기 서열 B와의 아미노산 서열 동일성(％), 또는 상기 서열 B에 비한 상기 서열 A의 아미노산 서열 동일성(％) (주어진 아미노산 서열 B에 대해, 상기 서열 B와, 또는 상기 서열 B에 비해 소정의 아미노산 서열 동일성(％)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 달리 표현할 수도 있음)은 하기와 같이 계산한다:

X/Y ×100

여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 있는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성(％)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성(％)과 동일하지 않을 것임을 인지해야 할 것이다.

"PRO87299 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO87299 변이체 핵산 서열"은 하기 정의된 바와 같은 활성 PRO87299 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, 본원에 개시된 바와 같은 전장 천연 서열 PRO87299 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 PRO87299 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 있거나 없는 PRO87299 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 PRO87299 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80％ 이상인 핵산 분자를 의미한다. 통상적으로, PRO87299 변이체 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 바와 같은 전장 천연 서열 PRO87299 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 PRO87299 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같은 신호 서열이 있거나 없는 PRO87299 폴리펩티드 서열의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 바와 같은 전장 PRO87299 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％ 이상, 다르게는 약 82％ 이상, 다르게는 약 83％ 이상, 다르게는 약 84％ 이상, 다르게는 약 85％ 이상, 다르게는 약 86％ 이상, 다르게는 약 87％ 이상, 다르게는 약 88％ 이상, 다르게는 약 89％ 이상, 다르게는 약 90％ 이상, 다르게는 약 91％ 이상, 다르게는 약 92％ 이상, 다르게는 약 93％ 이상, 다르게는 약 94％ 이상, 다르게는 약 95％ 이상, 다르게는 약 96％ 이상, 다르게는 약 97％ 이상, 다르게는 약 98％ 이상, 다르게는 약 99％ 이상일 것이다. 변이체는 천연 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.

통상적으로, PRO87299 변이체 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 뉴클레오티드 약 30개 이상, 다르게는 약 60개 이상, 다르게는 약 90개 이상, 다르게는 약 120개 이상, 다르게는 약 150개 이상, 다르게는 약 180개 이상, 다르게는 약 210개 이상, 다르게는 약 240개 이상, 다르게는 약 270개 이상, 다르게는 약 300개 이상, 다르게는 약 450개 이상, 다르게는 약 600개 이상, 다르게는 약 900개 이상, 또는 그 이상이다.

본원에서 확인된 PRO87299 코딩 핵산 서열에 대한 "핵산 서열 동일성(％)"은 대상 PRO87299 핵산 서열과 후보 서열을 정렬시키고, 필요한 경우 서열 동일성의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 대상 PRO87299 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열의 뉴클레오티드의 비율로서 정의된다. 핵산 서열 동일성(％)을 결정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린 (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 그러나, 본원의 목적에 있어 핵산 서열 동일성 값(％)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 하기 표 1에 제공되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.가 개발하였으며, 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (미국 20559 워싱톤 D.C. 소재)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 제TXU510087호로서 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크사 (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)를 통해 공개적으로 입수할 수 있거나, 하기 표 1에 제공한 원시 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 컴파일되어 이용되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정되며 변경되지 않는다.

ALIGN-2가 핵산 서열의 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 핵산 서열 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성(％), 상기 서열 D의 상기 서열 C와의 핵산 서열 동일성(％), 또는 상기 서열 D에 비한 상기 서열 C의 핵산 서열 동일성(％) (주어진 핵산 서열 D에 대해, 상기 서열 D와, 또는 상기 서열 D에 비해 소정의 핵산 서열 동일성(％)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C라는 어구로 달리 표현할 수도 있음)은 하기와 같이 계산한다:

W/Z ×100

여기서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 스코어링되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에 있는 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성(％)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성(％)과 동일하지 않을 것임을 인지해야 할 것이다. 핵산 서열 동일성(％) 계산의 예로서, 표 4 및 표 5는 "PRO87299-DNA"로 지칭되는 핵산 서열에 대한 "비교 DNA"로 지칭되는 핵산 서열의 핵산 서열 동일성(％)을 계산하는 방법을 나타내며, 여기서 "PRO87299-DNA"는 가상의 대상 PRO87299 코딩 핵산 서열을 나타내며, "비교 DNA"는 대상 "PRO87299-DNA" 핵산 분자를 비교할 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, "N", "L" 및 "V"는 각각 상이한 가상의 뉴클레오티드를 나타낸다.

달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 핵산 서열 동일성 값(％)은 바로 앞선 단락에 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻는다. 그러나, 핵산 서열 동일성 값(％)은 하기 기재한 바와 같이 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (문헌 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-80 (1996)])을 이용하여 얻는다. WU-BLAST-2 검색 파라미터의 대부분은 디폴트 값으로 설정된다. 디폴트 값으로 설정되지 않은, 즉 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정된다: 중복 스팬 = 1, 중복 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 스코어 매트릭스 = BLOSUM62. WU-BLAST-2가 사용된다면, 핵산 서열 동일성 값(％)은 (a) 천연 서열 PRO87299 폴리펩티드-코딩 핵산으로부터 유래된 서열을 갖는 대상 PRO87299 폴리펩티드 코딩 핵산 분자의 핵산 서열과 비교 대상 핵산 분자 (즉, 대상 PRO87299 폴리펩티드 코딩 핵산 분자와 비교되는 서열로서 PRO87299 변이체 폴리뉴클레오티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 뉴클레오티드의 수 (WU-BLAST-2에 의해 결정됨)를 (b) 대상 PRO87299 폴리펩티드 코딩 핵산 분자의 뉴클레오티드 총 수로 나누어 결정한다. 예를 들어, 핵산 서열 B와의 핵산 서열 동일성이 80％ 이상인 핵산 서열 A를 포함하는 단리된 핵산 분자"라는 언급에서, 핵산 서열 A는 비교 대상 핵산 분자의 서열이고, 핵산 서열 B는 PRO87299 폴리펩티드를 코딩하는 대상 핵산 분자의 핵산 서열이다.

핵산 서열 동일성(％)은 또한 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST-2를 이용하여 결정할 수도 있다 (문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)]). 상기 NCBI-BLAST-2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi. nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받거나, 다르게는 미국 메릴랜드주 베테스다 소재의 미국립보건원에서 얻을 수 있다. NCBI-BLAST-2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 검색 파라미터는 모두 디폴트 값으로 설정되며, 예를 들어 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 스코어 매트릭스 = BLOSUM62가 있다.

NCBI-BLAST-2가 서열의 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 핵산 서열 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성(％), 상기 서열 D의 상기 서열 C와의 핵산 서열 동일성(％), 또는 상기 서열 D에 비한 상기 서열 C의 핵산 서열 동일성(％) (주어진 핵산 서열 D에 대해, 상기 서열 D와, 또는 상기 서열 D에 비해 소정의 핵산 서열 동일성(％)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C라는 어구로 달리 표현할 수도 있음)은 하기와 같이 계산한다:

W/Z ×100

여기서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에 있는 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성(％)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성(％)과 동일하지 않을 것임을 인지해야 할 것이다.

다른 실시양태에서 PRO87299 변이체 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건 하에서 본원에 개시된 전장 PRO87299 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 활성 PRO87299 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이다. PRO87299 변이체 폴리펩티드는 PRO87299 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 설명하기 위해 사용된 "단리된"은 폴리펩티드가 동정되고, 그 자연 환경 요소로부터 분리 및/또는 회수되었음을 의미한다. 폴리펩티드의 자연 환경의 오염 성분은 이 폴리펩티드에 대한 진단 또는 치료적 사용을 통상적으로 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질원성 또는 비단백질원성 용질 등을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 하나의 밴드만 나타낼 정도로 정제될 것이다. PRO87299 폴리펩티드 자연 환경의 성분이 하나 이상 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포내의 제자리 (in situ) 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

"단리된" PRO87299 폴리펩티드 코딩 핵산 또는 다른 폴리펩티드 코딩 핵산은 폴리펩티드 코딩 핵산의 천연 공급원에서 통상적으로 결합되어 있는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 동정 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 폴리펩티드 코딩 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와 다르게 존재한다. 따라서, 단리된 폴리펩티드 코딩 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 특정 폴리펩티드 코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 폴리펩티드 코딩 핵산 분자는 예를 들어 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하며 통상적으로 폴리펩티드를 발현하는 세포에 함유된 폴리펩티드 코딩 핵산 분자를 포함한다.

용어 "제어 서열"이란 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 나타낸다. 원핵 생물에 적합한 제어 서열로는 예를 들어 프로모터, 임의로는 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위가 있다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열(presequence) 또는 분비 리더의 DNA는 해당 폴리펩티드가 분비에 관여하는 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 그 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 그 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 위치할 뿐만 아니라 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어답터 또는 링커를 통상적인 실시에 따라 사용한다.

용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 단일 항-PRO87299 모노클로날 항체 (효능제, 길항제 및 중화 항체 포함), 다중 에피토프 특이성을 지닌 항-PRO87299 항체 조성물, 단쇄 항-PRO87299 항체, 및 항-PRO87299 항체의 단편 (하기 참조)을 통칭하는 것이다. 본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 수득한 항체, 즉 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이체를 제외하고 동일한 집단을 이루는 개별 항체를 나타낸다.

혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로 보다 긴 프로브일수록 적절한 어닐링에 보다 높은 온도를 필요로 하며, 보다 짧은 프로브일수록 보다 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥이 자신들의 용융 온도보다 낮은 환경에 존재할 때 다시 어닐링되는 변성된 DNA의 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능한 서열 사이의 원하는 상동성의 정도가 더 높을수록, 사용할 수 있는 상대적인 온도가 더 높아진다. 따라서, 상대적 온도보다 높아질수록 반응 조건은 더욱 엄격해지는 반면, 상대적 온도가 낮을수록 반응조건은 덜 엄격해진다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련한 보다 자세한 정보 및 설명은 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995)]을 참조한다.

본원에서 정의되는 "엄격 조건" 또는 "고엄격 조건"이란 (1) 세척시 이온 강도가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들면 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1％ 나트륨 도데실 술페이트를 사용하는 조건, 또는 (2) 혼성화시에 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건, 예를 들어 42℃에서 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 포함된 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ 피콜(Ficoll)/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)과 함께 50％ (부피/부피) 포름아미드를 사용하는 조건, 또는 (3) 42℃에서 50％ 포름아미드, 5×SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5×덴하르트(Denhardt) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 술페이트를 사용하고, 42℃에서 0.2×SSC (염화나트륨/시트르산나트륨)에서 세척하고, 55℃에서 50％ 포름아미드로 세척한 후, 55℃에서 EDTA가 함유된 0.1×SSC를 이용한 고엄격 세척을 수행하는 것으로 정할 수 있다.

"중간 정도의 엄격 조건"이란 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press 1989]에 기재된 바와 같이 정할 수 있으며, 상기한 것보다 덜 엄격한 혼성화 조건 (예를 들어 온도, 이온 강도 및 SDS％) 및 세척 용액을 사용하는 것을 포함한다. 중간 정도의 엄격 조건의 예는 20％ 포름아미드, 5×SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5×덴하르트 용액, 10％ 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 변성된 전단 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후 필터를 약 37 내지 50℃에서 1×SSC로 세척하는 조건이다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 요인에 맞추기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인지하고 있을 것이다.

본원에 사용된 용어 "에피토프 태그가 부착된"은 "태그 폴리펩티드"에 융합된 PRO87299 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 나타낸다. 태그 폴리펩티드는 항체가 만들어질 수 있을 정도의 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 융합되는 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 또한 태그 폴리펩티드는 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 교차반응하지 않도록 아주 독특한 것이 바람직하다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 보통 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는 약 10 내지 20개의 아미노산 잔기)를 갖는다.

본원에 사용된 용어 "이뮤노어드헤신"은 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 이종 단백질 ("어드헤신")의 결합 특이성을 겸비한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로 보면 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌, 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열 (즉, 이종 서열)과 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 통상적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접한 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신 중 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 임의의 이뮤노글로불린으로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 목적에 있어서, "활성의" 또는 "활성"은 천연 또는 자연발생적 PRO87299의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 보유하는 PRO87299 폴리펩티드의 형태(들)을 지칭하는 것으로, 여기서 "생물학적" 활성은 천연 또는 자연발생적 PRO87299가 지닌 항원성 에피토프에 대한 항체의 생성을 유도하는 능력 이외에 천연 또는 자연발생적 PRO87299에 의해 유발되는 생물학적 기능 (억제 또는 자극 기능)을 나타내며, "면역학적" 활성은 천연 또는 자연발생적 PRO87299가 지닌 항원성 에피토프에 대한 항체의 생성을 유도하는 능력을 나타낸다.

용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 PRO87299 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 임의의 분자를 포함한다. 이와 유사한 방식으로, 용어 "효능제"도 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 PRO87299 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 임의의 분자를 나타낸다. 적합한 효능제 또는 길항제 분자로는 구체적으로 효능제 또는 길항제의 항체 또는 항체의 단편, 천연 PRO87299 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 유기 소분자가 있다. PRO87299 폴리펩티드의 효능제 또는 길항제를 동정하는 방법은 PRO87299 폴리펩티드를 후보 효능제 분자 또는 후보 길항제 분자와 접촉시키고, 이 PRO87299 폴리펩티드와 정상적으로 관련된 하나 이상의 생물학적 활성에서 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다.

"치료"란 치료적 처치 및 예방적 또는 방어적 측정 둘 모두를 나타내며, 그 목적은 목적하는 질병 상태 또는 장애를 예방하거나 완화(감소)시키는 것이다. 치료를 필요로 하는 대상은 이미 장애를 앓고 있는 대상 뿐만 아니라, 장애를 경험한 대상 또는 장애를 예방하고자 하는 대상까지도 포함한다.

"장기" 투여는 단기 투여 방식과 반대로 연속 방식으로 작용제(들)를 투여하여, 초기 치료 효과 (활성)를 장기간 동안 유지하는 것을 나타낸다. "단속적" 투여는 중단없이 계속해서 행하는 것이 아니라 성질상 주기적으로 이루어지는 처치이다.

치료 목적에 있어서 "포유동물"은 인간, 가축과 사육 동물, 및 동물원용, 경기용 또는 애완용 동물, 예컨대 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 비롯하여 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 나타낸다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.

하나 이상의 다른 치료제와 "병행하여" 투여된다는 것은 동시에 (수반하여) 투여하거나 임의의 순서로 연속하여 투여하는 것을 포함한다.

본원에서 사용된 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 대체로, 생리학상 허용되는 담체는 pH 완충 수용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예로는 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 비롯한 산화방지제; 저분자량 (잔기 약 10개 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당 알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(상표명), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 플루로닉스(상표명)가 있다.

"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체 (문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8 (10):1057-1062 (1995)]); 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체가 있다.

항체를 파파인(papain) 분해하면 각각 단일 항원 결합 부위가 있는 2개의 동일한 항원 결합 단편 ("Fab" 단편이라 불림), 및 나머지 "Fc" 단편 (쉽게 결정화되는 능력을 반영하여 명명됨)이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편이 생성된다.

"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비-공유 결합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 이량체로 구성된다. 이러한 구조에서는 각 가변 도메인에 있는 3개의 CDR이 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면에 항원 결합 부위를 지정한다. 결론적으로 보면, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 항원에 결합하는 능력을 갖는다.

또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지(hinge) 영역으로부터 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 첨가되었다는 점에서 Fab' 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 지칭한다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인이 있는 몇 쌍의 Fab' 단편으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.

임의의 척추동물 종으로부터 유래한 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 명백하게 상이한 유형 중의 하나로 분류될 수 있다.

이뮤노글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 이뮤노글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 클래스가 있고, 이들 중 몇 가지는 서브클래스 (이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 분류될 수 있다.

"단쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 필요한 구조를 형성하도록 할 수 있는 V_H 및 V_L 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv에 관해서는 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 검토한다.

용어 "디아바디"는 동일한 폴리펩티드 쇄 (V_H-V_L) 내에 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편을 나타낸다. 동일한 쇄에 있는 2개의 도메인을 페어링시키기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인을 다른 쇄의 상보성 도메인과 강제로 쌍을 형성시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097, WO 93/11611 및 문헌 [Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.

"단리된" 항체는 항체가 동정되고, 그 자연 환경 성분으로부터 분리 및/또는 회수된 것이다. 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단적 또는 치료적 사용을 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질원성 또는 비단백질원성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리법 (Lowry method)에 의해 측정시 항체가 95 중량％를 초과하도록, 가장 바람직하게는 99 중량％를 초과하도록 정제되거나, (2) 스피닝컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 하나의 밴드만 나타낼 정도로 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경 요소가 하나 이상 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내에 제자리 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인" 항체는, 다른 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않으면서 상기 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 항체이다.

"표지(label)"란 단어는 본원에 사용되는 경우, 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 표지는 그 자체로 (예를 들면, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지로) 검출될 수 있거나, 효소 표지인 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매할 수 있다.

"고상(solid phase)"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 고상의 예로는, 부분적으로 또는 전체적으로, 유리 (예를 들어, 세공 조절된 유리), 다당류 (예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘으로 형성된 것이 있다. 특정 실시양태에서, 고상은 문맥상 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있으며, 다른 실시양태에서 고상은 정제 컬럼 (예를 들어, 친화성 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 별개 입자의 비연속적 고상도 포함한다.

"리포좀"은 약물 (예컨대, PRO87299 폴리펩티드 또는 그에 대한 항체)을 포유동물에게 전달하는데 유용한 여러 형태의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 이루어진 소포이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생체막의 지질 정렬과 유사하게 이중층 형태로 정렬된다.

"소분자"는 본원에서 분자량이 약 500 달톤 미만인 것으로 정의된다.

용어 "면역 관련 질환"은 포유동물 면역계의 구성 성분이 그 포유동물에서의 질환을 야기하거나, 매개하거나, 또 다르게는 치사율에 기여하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 개입이 그 질환의 진행을 개선시키는 효과를 갖는 질환도 포함한다. 상기 용어에는 면역-매개성 염증성 질환, 비-면역-매개성 염증성 질환, 감염성 질환, 면역결핍성 질환, 신생물 등이 포함된다.

용어 "T 세포 매개성 질환"은, T 세포가 직접 또는 간접적으로 그 포유동물에서의 질환을 매개하거나, 또 다르게는 그의 치사율에 기여하는 질환을 의미한다. 상기 T 세포 매개성 질환은 세포 매개성 효과, 림포카인 매개성 효과 등과 관련이 있을 수 있고, 또한 예를 들어 T 세포에 의해 분비되는 림포카인에 의해 B 세포가 자극된다면 B 세포와 관련된 효과일 수도 있다.

몇몇이 면역 또는 T 세포 매개성이고 본 발명에 따라 치료될 수 있는 면역 관련 질환 및 염증성 질환의 예로는, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 유년형 만성 관절염, 척추관절증, 전신성 경화증 (경피증), 특발성 염증성 근장애 (피부근염, 다발성 근염), 쇼그렌 증후군, 전신성 맥관염, 유육종증, 자가면역 용혈성 빈혈 (면역성 범혈구감소증, 발작성 야간혈색소뇨증), 자가면역성 혈소판감소증 (특발성 혈소판감소성자반병, 면역-매개성 혈소판감소증), 갑상선염 (그레이브스병, 하시모토(Hashimoto) 갑상선염, 유년형 림프종성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 진성 당뇨병, 면역-매개성 신장 질환 (사구체신염, 세뇨관간질성신염), 중추신경계 및 말초신경계의 탈수초 질환 (예컨대, 다발성 경화증, 특발성 탈수초 다발성 신경염 또는 길랑-바레 증후군, 및 만성 염증성 탈수초 다발성 신경염), 간담즙성 질환 (예컨대, 감염성 간염 (A, B, C, D, E형 간염바이러스 및 다른 비-간친화성 바이러스), 자가면역성 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염 및 경화성 담관염), 염증성 장 질환 (궤양성 대장염, 크론병), 글루텐 민감성 장 질환 및 휘플병, 자가면역 또는 면역-매개성 피부 질환 (수포성 피부 질환, 다형성 홍반 및 접촉성 피부염 포함), 건선, 알레르기성 질환 (예컨대, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증 및 두드러기), 폐의 면역 질환 (예컨대, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유종 및 과민성 폐렴), 이식 관련 질환 (이식 거부반응 및 이식편-대-숙주 질환 포함)이 포함된다. 감염성 질환에는 AIDS (HIV 감염), A, B, C, D 및 E형 간염, 허피스 (herpes) 등의 바이러스 질환과, 박테리아 감염, 진균 감염, 원생동물 감염 및 기생충 감염이 포함된다.

용어 "유효량"은 특정하게 언급한 목적을 달성하게 하는 PRO87299 폴리펩티드 및/또는 효능제/길항제의 농도 또는 양이다. PRO87299 폴리펩티드 또는 그의 효능제나 길항제의 "유효량"은 경험적으로 결정될 수 있다. 더욱이, "치료상 유효량"은 언급한 치료 효과를 달성하는 데 효과적인 PRO87299 폴리펩티드 및/또는 효능제/길항제의 농도 또는 양이다. 이 양도 또한 경험적으로 결정될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고/하거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 나타낸다. 이러한 용어는 방사성 동위원소 (예를 들면, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제, 예를 들면 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 인터칼레이팅제(intercalating agent); 핵산분해 효소와 같은 효소 및 그의 단편; 항생제; 및 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 (이들의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 하기에 개시한 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하는 것으로 간주한다. 다른 세포독성제는 하기에 기재되어 있다. 항종양제는 종양 세포의 파괴를 유발한다. 세포독소는 항체에 공유 결합되어 항원을 발현시키는 특정 대상 세포에 독소를 표적화시킬 수 있다. 유용한 세포독소는 다음과 같은 링커를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다:

링커:

MC = 말레이미도카프로일

Val Cit = 발린-시트룰린 (프로테아제 절단가능한 링커의 디펩티드 부위)

시트룰린 = 2-아미노-5-우레이도 펜탄산

PAB = p-아미노벤질카르바모일 (링커의 "자기 희생" 부분)

Me = N-메틸-발린 시트룰린 (여기서 링커 펩티드 결합이 변형되어 카텝신 B에 의해 절단되는 것을 방지함)

MC(PEG)6-OH = 말레이미도카프로일-폴리에틸렌 글리콜 (항체 시스테인에 부착됨)

SPP = N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트

SMCC = N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1 카르복실레이트

세포독성 약물:

MMAE = 모노-메틸 아우리스타틴 E (MW 718)

MMAF = 약물의 C-말단에 페닐알라닌을 갖는 아우리스타틴 E(MMAE)의 변이체 (MW 731.5)

MMAF-DMAEA = C-말단 페닐알라닌에 대한 아미드 결합에 DMAEA (디메틸아미노에틸아민)를 갖는 MMAF (MW 801.5)

MMAF-TEG = 페닐알라닌에 대해 에스테르화된 테트라에틸렌 글리콜을 갖는 MMAF

MMAF-NtBu = MMAF의 C-말단에 아미드로서 부착된 N-t-부틸

AEVB = 아우리스타틴 E 발레릴 벤질히드라존 (AE의 C-말단을 통한 산 불안정 링커) (MW 732)

AFP = 아우리스타틴 F 페닐렌 디아민 (페닐렌 디아민 스페이서에 의해 C-말단을 통해 항체에 연결된 페닐알라닌 변이체) (MW 732).

본원에 사용된 "성장 억제제"는 세포의 시험관내 또는 생체내 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 따라서, 성장 억제제는 S기에서 세포의 비율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예로는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 시기에서) 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 작용제가 있다. 종래의 M기 차단인자로는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 있다. 또한, G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메톡트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C는 S기 정지에도 작용한다. 추가 정보는 문헌 [Murakami et al., The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" (WB Saunders: Philadelphia, 1995), Chapter 1, 특히 13면]에서 찾아볼 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 모두 주목으로부터 유래된 항암 약물이다. 유럽산 주목으로부터 유래된 도세탁셀(탁소테레(TAXOTERE; 등록상표), 프랑스 앙토니 소재 롱플랑 로레아(Rhone-Poulenc Rorer))은 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL; 등록상표), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재의 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology))의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미세소관의 어셈블리를 촉진하고, 탈중합체화를 방지함으로써 미세소관을 안정화시켜 세포에서의 유사분열을 억제한다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로는 아드리아마이신, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 시톡신, 탁소이드류 (예를 들어, 파클리탁셀 (탁솔, 미국 뉴저지주 프린스톤 소재의 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지) 및 독세탁셀 (탁소테레, 프랑스 앙토니 소재 롱플랑 로레아), 톡소테레, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 (미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 다른 관련 질소 머스타드류가 있다. 또한, 타목시펜 및 오나프리스톤과 같이 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 호르몬 제제도 상기 정의에 포함된다.

용어 "사이토카인"은 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 세포간 매개인자로서 다른 세포에 작용하는 단백질의 일반명이다. 이러한 사이토카인의 예로는 림포카인, 모노카인, 및 종래의 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토카인으로는 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체형성 호르몬(LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토젠; 종양 괴사 인자-α 및 종양 괴사 인자-β; 뮬러리안(mullerian) 억제 물질, 마우스 고나도트로핀 관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판 성장 인자; 형질전환 세포 성장 인자(TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 인슐린 유사 성장 인자-II, 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ; 콜로니 자극 인자(CSF), 예컨대 대식세포-CSF(M-CSF), 과립세포-대식세포-CSF(GM-CSF) 및 과립세포-CSF(G-CSF); 인터루킨(IL), 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; 종양 괴사인자, 예컨대 TNF-α 또는 TNF-β; 및 LIF 및 키트 리간드(KL)를 비롯한 다른 폴리펩티드 인자 등이 있다. 본원에 사용된 용어 사이토카인에는 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질, 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 등가물이 포함된다.

본원에 사용된 용어 "염증 세포"는 단핵세포, 호산구, 대식세포 및 다형핵 호중구 (PMN)와 같이 염증 반응을 증대시키는 세포를 지칭한다.

II . 본 발명의 조성물 및 방법

A. 전장 PRO87299 폴리펩티드

본 발명은 본 출원에서 PRO87299 폴리펩티드로 언급된 폴리펩티드를 코딩하는, 새로이 동정되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 하기 실시예에 보다 상세히 개시된 바와 같이, 다양한 PRO87299 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 동정하고 단리하였다.

당업자라면 당업계의 통상적인 방법을 이용하여 기탁된 클론의 서열을 분석함으로써 상기 클론의 실제 뉴클레오티드 서열을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 통상적인 기술을 이용하여 뉴클레오티드 서열로부터 예상되는 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 본원에 기재된 PRO87299 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산의 경우, 본 출원인은 당시 이용할 수 있었던 서열 정보를 이용하여 가장 잘 동정할 수 있는 리딩 프레임으로 여겨지는 것을 동정하였다.

B. PRO87299 폴리펩티드 변이체

본원에 기재된 전장 천연 서열 PRO87299 폴리펩티드 외에도, PRO87299 변이체를 제조할 수 있는 것으로 생각된다. PRO87299 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 PRO87299 DNA에 도입하고/하거나 원하는 PRO87299 폴리펩티드를 합성함으로써 제조될 수 있다. 당업자라면 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변화 또는 막 앵커링 특성의 변경과 같은 아미노산 변화가 PRO87299의 번역후 프로세싱을 변경시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본원에 기재된 천연 전장 서열 PRO87299 또는 PRO87299의 여러 도메인에서의 변이체는, 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호에 열거된 보존적 및 비보존적 돌연변이에 대한 임의의 기술 및 안내를 이용하여 제조할 수 있다. 변이는 PRO87299를 코딩하는 하나 이상의 코돈을 치환, 결실 또는 삽입함으로써 천연 서열 PRO87299에 비해 PRO87299의 아미노산 서열을 변화시키는 것일 수 있다. 임의로는, 변이는 PRO87299의 하나 이상의 도메인 내에서 하나 이상의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환시키는 것이다. 원하는 활성에 유해한 효과를 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 아미노산 잔기는, PRO87299의 서열을 공지된 상동성 단백질 분자의 서열과 비교하여 상동성이 높은 영역에서 생성된 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환시키는 것 (예컨대, 류신의 세린으로의 치환), 즉 보존적 아미노산 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로는 약 1 내지 5개 범위의 아미노산에서 발생할 수 있다. 허용되는 변이는 서열 내에 아미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환시켜서, 전장 또는 성숙한 천연 서열에 의해 나타난 활성에 대해 생성된 변이체를 시험함으로써 결정할 수 있다.

본원은 PRO87299 폴리펩티드 단편들을 제공한다. 예를 들어, 전장 천연 단백질과 비교하는 경우, 이러한 단편들은 N-말단 또는 C-말단이 절단되거나 내부 잔기가 결손된 것일 수 있다. 특정 단편은 PRO87299 폴리펩티드의 원하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결손되어 있다.

PRO87299 단편은 다수의 통상적인 기술 중 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 원하는 펩티드 단편은 화학적으로 합성될 수 있다. 다른 접근법은 효소적 분해 방법, 예를 들어 특정 아미노산 잔기에 의해 지정된 부위에서 단백질을 절단하는 것으로 알려진 효소로 단백질을 처리하거나, 적합한 제한 효소로 DNA를 분해함으로써 PRO87299 단편을 생성하는 단계, 및 원하는 단편을 단리하는 단계를 포함한다. 그러나, 또다른 적합한 기술은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 원하는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 증폭하는 단계를 포함한다. DNA 단편의 원하는 말단부를 지정하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머로 사용된다. 바람직하게는, PRO87299 폴리펩티드 단편은 본원에 개시된 천연 PRO87299 폴리펩티드와 하나 이상의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 공유한다.

특정 실시양태에서, 대상체의 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 표제로 표 6에 나타내었다. 이러한 치환에 의해 생물학적 활성이 변화하는 경우, 하기 표 6에서 치환예로서 명명되거나 아미노산 종류에 대해서 하기에서 보다 상세하게 설명된 바와 같은 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝하였다.

PRO87299 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 골격의 구조가, 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 유지되거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전하량 또는 소수성이 유지되거나, 또는 (c) 측쇄의 용적이 유지되도록 하는데 미치는 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연발생적 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 분류된다:

(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족; trp, tyr, phe.

비보존적 치환은 상기 한 클래스의 구성원을 다른 클래스의 것으로 교환시킬 것이다. 또한, 이렇게 치환되는 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나, 보다 바람직하게는 나머지 (비보존) 부위에 도입될 수 있다.

변이체는 올리고뉴클레오티드 매개 (부위 지정 (site-directed)) 돌연변이 유발법, 알라닌 스캐닝법 및 PCR 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 부위 지정 돌연변이 유발법 (문헌 [Carter et al., Nucl. Acids Res ., 13:4331 (1986)]; [Zoller et al., Nucl . Acids Res ., 10:6487 (1987)]), 카세트 돌연변이 유발법 (문헌 [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)]), 제한 선택 돌연변이 유발법 (문헌 [Wells et al., Philos . Trans . R. Soc . London SerA, 317:415 (1986)]) 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 대해 실시하여 PRO87299 변이체 DNA를 제조할 수 있다.

또한, 스캐닝 아미노산 분석법을 이용하여 인접한 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 통상적으로, 이 중에서 알라닌이 베타-탄소 밖의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 형태를 변화시킬 가능성이 적기 때문에 바람직한 스캐닝 아미노산이다 (문헌 [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]). 또한, 알라닌은 통상적으로 가장 흔한 아미노산이기 때문에 바람직하다. 또한, 알라닌은 파묻힌 위치 및 노출된 위치 모두에서 흔히 발견된다 (문헌 [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman ＆ Co., N.Y.)]; [Chothia, J. Mol . Biol ., 150:1 (1976)]). 알라닌 치환이 적절한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체(isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.

C. PRO87299 의 변형

PRO87299의 공유 결합성 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유 결합성 변형의 한 형태는 PRO87299의 선택된 측쇄 또는 N-말단 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 PRO87299 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제를 사용한 유도체화는 예를 들어 항-PRO87299 항체 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 PRO87299를 가교결합시키거나 그 반대로 가교결합시키는데 유용하다. 통상 사용되는 가교결합제는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 작용제를 포함한다.

다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 (문헌 [T.E. Creighton, Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)]), N-말단 아민의 아세틸화 및 임의의 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.

본 발명의 범위에 포함되는 PRO87299 폴리펩티드의 공유 결합성 변형의 다른 유형은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변경을 포함한다. 본원의 목적에 있어 "천연 글리코실화 패턴의 변경"은 천연 서열 PRO87299에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 (밑줄 친 글리코실화 부위를 제거하거나 화학적 및/또는 효소적 수단에 의해 글리코실화를 결실시킴) 및/또는 천연 서열 PRO87299에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다. 또한, 이 어구는 존재하는 여러 탄수화물 잔기의 특성 및 비율의 변화를 비롯한 천연 단백질의 글리코실화에 있어서의 정성적 변화를 포함한다.

PRO87299 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열을 변화시킴으로써 수행할 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어 천연 서열 PRO87299에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가 또는 치환시켜 이루어질 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우). 임의로는, PRO87299 아미노산 서열은 특히 원하는 아미노산으로 번역되는 코돈이 생성되도록 PRO87299 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이화시킴으로써, DNA 수준에서의 변화를 통해 변경시킬 수 있다.

PRO87299 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소적으로 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어 1987년 9월 11일자로 공개된 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit . Rev . Biochem ., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.

PRO87299 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 수행하거나 글리코실화에 대한 표적으로 작용하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이화에 의한 치환으로 수행할 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Hakimuddin, et al., Arch . Biochem. Biophys ., 259:52 (1987)] 및 [Edge et al., Anal . Biochem ., 118:131 (1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura et al., Meth . Enzymol ., 138:350 (1987)]에 기재된 바와 같이 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 수행할 수 있다.

PRO87299의 공유 결합성 변형의 다른 유형은 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 또는 동 제4,179,337호에 열거된 방식으로 다양한 비-단백질원성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 PRO87299 폴리펩티드를 연결시키는 것을 포함한다.

또한, 본 발명의 PRO87299는 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 PRO87299를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방법으로 변형될 수도 있다.

한 실시양태에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 PRO87299의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 PRO87299의 아미노-말단 또는 카르복실-말단에 위치한다. 이처럼 에피토프 태그가 부착된 형태의 PRO87299의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 유형의 친화성 매트릭스를 사용하는 친화성 정제법으로 PRO87299를 용이하게 정제할 수 있게 된다. 여러 태그 폴리펩티드 및 이들의 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘 (폴리-His) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (폴리-His-gly) 태그, flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 (문헌 [Field et al., Mol . Cell . Biol ., 8:2159-2165 (1988)]), c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (문헌 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3636 (1985)]) 및 허피스 단순 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 (문헌 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)])가 있다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드 (문헌 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]), KT3 에피토프 펩티드 (문헌 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]), α-튜불린 에피토프 펩티드 (문헌 [Skinner et al., J. Biol . Chem ., 266:15163-15166 (1991)]) 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 (문헌 [Lutz-Freyermuth et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 87:6393-6397 (1990)])를 포함한다.

다른 실시양태에서, 키메라 분자는 PRO87299와 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린의 특정 영역과의 융합체를 포함할 수 있다. 2가 형태의 키메라 분자 ("이뮤노어드헤신"으로 지칭되기도 함)의 경우, 이러한 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역과의 융합체일 수 있다. 상기 Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자 내에 존재하는 하나 이상의 가변 영역 부위에 PRO87299 폴리펩티드의 가용성 (결실 또는 실활된 막횡단 도메인) 형태가 치환되어 있는 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 융합체는 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3 영역, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 이뮤노글로불린 융합체를 제조하는 방법에 대해서는 1995년 6월 27일자로 허여된 미국 특허 제5,428,130호를 참조한다.

D. PRO87299 의 제조

하기의 설명은 주로 PRO87299 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 PRO87299를 제조하는 방법에 관한 것이다. 물론, 당업계에 공지된 다른 방법을 이용하여 PRO87299를 제조할 수도 있음이 고려된다. 예를 들어, PRO87299 서열 또는 그의 부분들은 고상 기술을 이용하는 직접 펩티드 합성법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Stewart et al., Solid - Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)], [Merrifield, J. Am . Chem . Soc ., 85:2149-2154 (1963)] 참조). 시험관내 단백질 합성은 수동 기술을 이용하거나 자동화 방법으로 수행할 수 있다. 자동화 합성법은, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems; 미국 캘리포니아주 포스터시티 소재)사의 펩티드 합성기를 제조업자의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. PRO87299의 여러 부분들을 개별적으로 화학적 합성한 후, 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 조합함으로써 전장 PRO87299를 제조할 수 있다.

1. PRO87299 를 코딩하는 DNA 의 단리

PRO87299를 코딩하는 DNA는 PRO87299 mRNA를 보유하여 그를 검출가능한 수준으로 발현할 것이라 여겨지는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 따라서, 하기 실시예에 기재된 바와 같이 인간의 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 인간 PRO87299 DNA를 편리하게 얻을 수 있다. 또한, PRO87299 코딩 유전자는 게놈 라이브러리로부터 얻거나 공지된 합성 방법 (예를 들어, 자동화 핵산 합성법)으로 얻을 수도 있다.

라이브러리는 대상 유전자 또는 그에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 고안된 프로브 (예컨대, PRO87299에 대한 항체 또는 약 20 내지 80개 이상의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드)로 스크리닝될 수 있다. 선택된 프로브를 사용하는 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은, 예컨대 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning :A Laboratory Manual (New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같은 표준 절차를 이용하여 수행될 수 있다. PRO87299 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 단리하기 위한 다른 수단은 PCR 방법을 이용하는 것이다 ([Sambrook et al., 상기 문헌]; 문헌 [Dieffenbach et al., PCR Primer :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]).

하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 가양성 (flase positive) 결과를 최소화하기 위해서는, 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열이 충분한 길이를 갖고 충분히 분명한 서열이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 스크리닝되는 라이브러리에서 DNA와의 혼성화시에 검출될 수 있도록 표지되는 것이 바람직하다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고, ³²P-표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 바이오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중간 정도의 엄격도 및 고엄격도를 비롯한 혼성화 조건은 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에서 제공된다.

이러한 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 진뱅크 (GenBank)와 같은 공공 데이타베이스 또는 다른 독점 서열 데이타베이스에 등록되어 있고 입수가능한 다른 공지된 서열과 비교하고 정렬시킬 수 있다. 분자의 지정된 영역 내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서의 동일성)은 당업계에 공지된 방법 및 본원에 기재된 방법을 이용하여 결정될 수 있다.

단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 먼저 본원에 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하고, 또한 필요하다면 전구체를 검출하기 위해 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같은 통상적인 프라이머 신장 절차를 이용하여 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, cDNA로 역전사되지 않았을 수도 있는 mRNA의 중간체를 프로세싱하여 얻을 수 있다.

2. 숙주 세포의 선택 및 형질전환

숙주 세포는 PRO87299의 생성을 위해 본원에 기재된 발현 벡터나 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환되고, 프로모터 유도, 형질전환체 선택 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자 증폭에 적절하도록 변형시킨 통상적인 영양 배지 중에서 배양된다. 당업자라면 과도한 실험 없이 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건을 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원리, 프로토콜 및 시행되는 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology :A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)] 및 [Sambrook et al., 상기 문헌]에서 찾아볼 수 있다.

진핵 세포의 형질감염 방법 및 원핵 세포의 형질전환 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어 CaCl₂, CaPO₄, 리포솜-매개 및 전기천공 방법). 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이러한 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 수행된다. 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같은 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리법, 또는 전기천공법이 일반적으로 원핵 세포의 경우에 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 문헌 [Shaw et al., Gene, 23:315 (1983)] 및 1989년 6월 29일자로 공개된 WO 89/05859에 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 이용된다. 이러한 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우에는 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 이용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 측면은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모로의 형질전환은 통상적으로 문헌 [Van Solingen et al., J. Bact ., 130:949 (1977)] 및 [Hsiao et al., Proc . Natl . Acad . Sci . ( USA ), 76:3829 (1979)]의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 세포에 DNA를 도입시키기 위한 다른 방법 (예컨대, 핵내 미세주입, 전기천공법, 온전한 세포와 박테리아 원형질체와의 융합, 또는 고분자 양이온 (polycation) (예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴))을 사용할 수도 있다. 포유동물 세포를 형질전환 시키기 위한 여러 기술에 대해서는 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)] 및 [Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조한다.

본원에서 클로닝하거나 벡터 내 DNA를 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 원핵 세포, 효모 세포 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 적합한 원핵 생물은 진정 박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체 (예를 들어, 이. 콜라이와 같은 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae))를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 여러 가지 이. 콜라이 균주, 예컨대 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)는 공개적으로 입수가능하다. 다른 적합한 원핵 숙주 세포는 에쉐리히아 (Esherichia)와 같은 엔테로박테리아세애, 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움 (typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스 (marcescans) 및 시겔라 (Shigella) 뿐만 아니라 바실러스 (Bacillus), 예컨대 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리체니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710호에 개시된 비. 리체니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예컨대 피. 애루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예는 설명을 위한 것이며 이에 제한되는 것은 아니다. 균주 W3110은 재조합 DNA 생성물 발효를 위한 통상적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주의 하나이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질 가수분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110을 변형시켜 숙주에 대한 내생성 단백질을 코딩하는 유전자에서 유전적 돌연변이가 일어나도록 할 수 있으며, 이러한 숙주의 예로는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2, 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4, 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 ( argF - lac )169 degP ompT kan ^r 를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244), 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 ( argF - lac )169 degP ompT rbs7 ilvG kan ^r 를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6, 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4, 및 1990년 8월 7일자로 허여된 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 주변세포질 프로테아제 돌연변이체를 갖는 이. 콜라이 균주가 있다. 다르게는, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 중합효소 반응이 적합하다.

원핵 세포에 이외에, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물도 PRO87299-코딩 벡터를 위한 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 통상적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 미생물에는 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (문헌 [Beach and Nurse, Nature, 290:140 (1989)], 1985년 5월 2일자로 공개된 EP 139,383), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 제4,943,529호; 문헌 [Fleer et al., Bio / Technology, 9:968-975 (1991)]), 예를 들어 케이. 락티스 (K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; 문헌 [Louvencourt et al., J. Baceriol ., 154(2):737-742 (1983)]), 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 윅케라미 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906; 문헌 [Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), 케이. 써모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070; 문헌 [Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)]); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa) (문헌 [Case et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 76:5259-5263 (1979)]); 슈와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예컨대 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis) (1990년 10월 31일자로 공개된 EP 394,538) 및 섬유상 진균, 예컨대 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) (1991년 1월 10일자로 공개된 WO 91/00357) 및 아스퍼길러스 (Aspergillus) 숙주, 예컨대 에이. 니둘란스 (A. nidulans) (문헌 [Ballance et al,, Biochem . Biophys . Res . Commun ., 112:284-289 (1983)]; [Tilburn et al., Gene, 26:205-221 (1983)]; [Yelton et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:1470-1474 (1984)]) 및 에이. 니게르 (A. niger) (문헌 [Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985)])가 포함된다. 본 발명에서는 메틸 영양요구성 효모가 적합하고, 한세눌라 (Hansenula), 칸디다, 클로엑케라 (Kloeckera), 피치아, 사카라로마이세스, 토룰롭시스 (Torulopsis) 및 로도토룰라 (Rhodotorula)로 구성된 속으로부터 선택된, 메탄올에서 성장할 수 있는 효모를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 종류의 효모를 예시하는 구체적인 종의 목록은 문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에서 찾아볼 수 있다.

글리코실화된 PRO87299의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 드로소필라 (Drosophila) S2 및 스포도프테라 (Spodoptera) Sf9와 같은 곤충 세포 뿐만 아니라 식물 세포를 포함한다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 COS 세포를 포함한다. 보다 구체적인 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아의 신장 세포주 (293 세포 또는 현탁 배양액 중에서 성장하도록 서브클로닝된 293 세포; 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol ., 36:59 (1997)]), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO; 문헌 [Urlaub and Chasin, Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 77:4216 (1980)]), 마우스 세르톨리 세포 (TM4; 문헌 [Mather, Biol . Reprod ., 23:243-251 (1980)]), 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065) 및 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)을 포함한다. 당업자라면 적절한 숙주 세포를 용이하게 선택할 수 있다.

3. 복제가능 벡터의 선택 및 사용

PRO87299를 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)을 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 복제가능한 발현용 벡터에 삽입할 수 있다. 여러 가지 벡터들을 공개적으로 입수할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지 형태일 수 있다. 적절한 핵산 서열은 다양한 절차에 의해 벡터에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 DNA를 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)에 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 하나 이상의 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 성분을 하나 이상 함유하는 적합한 벡터의 제작은 당업자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 이용한다.

PRO87299는 재조합 방법에 의해 직접 생성될 수 있을 뿐만 아니라 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드 또는 신호 서열일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생성될 수도 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 벡터에 삽입되는 PRO87299-코딩 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 내독소 II 리더로 구성된 군으로부터 선택된 원핵 생물 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, 알파 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더를 포함하며, 클루이베로마이세스 α-인자 리더는 미국 특허 제5,010,182호에 기재되어 있음) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일자로 공개된 EP 362,179) 또는 1990년 11월 15일자로 공개된 WO 90/13646에 기재된 신호일 수 있다. 포유동물 세포 발현시에, 포유동물 신호 서열 (예컨대, 동일하거나 관련된 종의 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 서열 및 바이러스 분비 리더)을 사용하여 단백질의 분비를 지시할 수 있다.

발현 벡터와 클로닝 벡터는 둘 모두 그 벡터가 1종 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제가능하도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 여러 가지 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다.

발현 벡터와 클로닝 벡터는 통상적으로 선별 유전자 (선별가능한 마커라고도 지칭됨)를 함유할 것이다. 통상적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩하거나, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질을 코딩하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 입수할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩한다 (예를 들어 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자).

포유동물 세포에 적합한 선별가능한 마커의 예는 PRO87299-코딩 핵산을 수용할 수 있는 세포 성분의 확인을 가능하게 하는 것, 예컨대 DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR이 이용되는 경우에 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 CHO 세포주이며, 문헌 [Urlaub et al, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조되고 증식된다. 효모에 사용하기 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (문헌 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]; [Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979)]; [Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]). trp1 유전자는 트립토판에서의 성장능이 없는 효모의 돌연변이체 균주 (예를 들어 ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선별 마커를 제공한다 (문헌 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]).

발현 벡터와 클로닝 벡터는 보통 mRNA 합성을 유도하는, PRO87299-코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 여러가지 가능한 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵 생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 (문헌 [Chang et al., Nature, 275:615 (1978)]; [Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)]), 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (문헌 [Goeddel, Nucleic acid Res ., 8:4057 (1980)]; EP 36,776) 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터 (문헌 [deBoer et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 80:21-25 (1983)])를 포함한다. 또한, 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 PRO87299를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno (S.D.)) 서열도 함유할 것이다.

효모 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 (문헌 [Hitzeman et al., J. Biol . Chem ., 255:2073 (1980)]) 또는 다른 당분해 효소 (문헌 [Hess et al., J. Adv . Enzyme Reg ., 7:149 (1968)]; [Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)]), 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.

성장 조건에 의해 조절되는 추가의 전사 잇점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터로는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 및 말토스와 갈락토스의 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이 있다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다.

포유동물 숙주 세포에 있는 벡터로부터의 PRO87299 전사는 바이러스 (예컨대, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (1989년 7월 5일자로 공개된 UK 2,211,504호), 아데노바이러스 (예컨대, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40))의 게놈, 이종 포유동물 프로모터 (예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터), 및 열-충격 프로모터로부터 수득한 프로모터에 의해 조절되며, 단 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템에 적합하다.

고등 진핵 세포에 의한 PRO87299 코딩 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가시킬 수 있다. 인핸서는 DNA의 시스-액팅 요소로서, 보통 약 10 내지 300 bp 길이이며, 프로모터에 작용하여 그의 전사를 증가시킨다. 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터의 다수의 인핸서 서열이 현재 공지되어 있다. 그러나, 통상적으로는 진핵 세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예로는 복제 기점 뒷편에 있는 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 뒷편에 있는 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 인핸서는 PRO87299 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터로 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터의 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.

또한, 진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열도 함유할 것이다. 이러한 서열은 공통적으로 진핵 세포나 바이러스의 DNA 또는 cDNA의 5', 및 때로는 3'의 번역되지 않은 영역으로부터 입수할 수 있다. 이들 영역은 PRO87299를 코딩하는 mRNA의 번역되지 않은 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로 전사되는 뉴클레오티드 절편을 함유한다.

재조합 척추동물 세포 배양시에 PRO87299의 합성에 적용하기에 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)], [Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)], EP 117,060 및 EP 117,058에 기재되어 있다.

4. 유전자 증폭/발현의 검출

유전자 증폭 및/또는 발현은 예를 들어 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블롯팅 (문헌 [Thomas, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77:5201-5205 (1980)]), 도트 블롯팅 (DNA 분석) 또는 본원에서 제공된 서열을 기초로 적절하게 표지된 프로브를 사용하는 제자리 혼성화에 의해 샘플에서 직접 측정할 수 있다. 다르게는, DNA 이합체, RNA 이합체 및 DNA-RNA 하이브리드 이합체 또는 DNA-단백질 이합체를 포함하는 특정 이합체를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 이후에는, 상기 항체를 표지한 후에 상기 이합체가 표면에 결합하는 분석법을 수행할 수 있는데, 이 때 표면상에 이합체가 형성되면 이합체에 결합한 항체의 존재를 검출할 수 있다.

다르게는, 유전자 발현은 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 생성물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양물 또는 체액의 분석법으로 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및/또는 샘플 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연 서열 PRO87299 폴리펩티드, 본원에서 제공되는 DNA 서열을 기초로 한 합성 펩티드, 또는 PRO87299 DNA에 융합되고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외생성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다.

5. 폴리펩티드의 정제

여러 형태의 PRO87299는 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. "막 결합된 형태"라면, 적합한 디터전트 용액 (예를 들어, Triton-X 100)을 사용하거나 효소적 절단시킴으로써 막으로부터 방출시킬 수 있다. PRO87299의 발현에 사용되는 세포는 동결-해동 순환, 초음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제와 같은 여러 가지 물리적 또는 화학적 수단으로 파괴할 수 있다.

재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 PRO87299를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 정제 방법의 예로는 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전법, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온 교환 수지 (예컨대, DEAE) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전법, 예를 들면 세파덱스 (Sephadex) G-75를 사용하는 겔 여과법, IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼, 및 PRO87299의 에피토프 태그가 부착된 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이트 컬럼 등이 있다. 여러 가지 단백질 정제 방법을 이용할 수 있고, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)], [Scopes, Protein Purification : Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 정제 단계(들)의 선택은 예를 들어 사용되는 생산 방법 및 생산되는 특정 PRO87299의 특성에 따라 달라질 것이다.

E. 조직 분포

PRO87299를 발현하는 조직의 위치는 다양한 인간 조직에서 mRNA 발현을 측정함으로써 확인될 수 있다. 이러한 유전자의 위치는 어떠한 조직이 PRO87299 폴리펩티드의 자극 및 억제 활성에 의해 가장 많이 영향을 받을 것인지에 대한 정보를 제공한다. 또한, 특정 조직에서의 유전자 위치는 하기 논의된 활성 차단 분석을 위한 샘플 조직을 제공한다.

앞서 언급한 바와 같이, 여러 조직에서의 유전자 발현은 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블롯팅 (문헌 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)]), 도트 블롯팅 (DNA 분석), 또는 본원에서 제공된 서열을 기초로 적절하게 표지된 프로브를 사용하는 제자리 혼성화에 의해 측정할 수 있다. 다르게는, DNA 이합체, RNA 이합체 및 DNA-RNA 하이브리드 이합체 또는 DNA-단백질 이합체 등을 포함하는 특정 이합체를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다.

다르게는, 여러 조직에서의 유전자 발현은 조직 절편의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 생성물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양물 또는 체액 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및/또는 샘플 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, PRO87299 폴리펩티드의 천연 서열 또는 PRO87299 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 기초로 한 합성 펩티드에 대한 항체를 제조할 수 있고, 또는 PRO87299 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 특정 항체 에피토프를 코딩하는 DNA에 융합된 외생성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다. 항체 제조에 관한 일반적 기술 및 노던 블롯팅 및 제자리 혼성화에 관한 구체적인 프로토콜은 하기에 제공된다.

F. 항체 결합 연구

추가로, PRO87299 폴리펩티드의 활성은 항-PRO87299 항체가 조직 세포에 대한 PRO87299 폴리펩티드들 각각의 효과를 억제하는 능력을 시험하는 항체 결합 연구로 증명할 수 있다. 항체의 예로는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체 및 이종접합 항체 등이 있고, 이들의 제조 방법을 하기에 기재할 것이다.

항체 결합 연구는 경쟁적 결합 분석법, 직접 및 간접 샌드위치 분석법 및 면역침전 분석법과 같은 임의의 공지된 분석법으로 수행할 수 있다 (문헌 [Zola, Monoclonal Antibodies :A Manual of Technique, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)]).

경쟁적 결합 분석법은 제한된 양의 항체와의 결합에 대해 시험 샘플 분석물과 경쟁하는 표지된 표준 물질의 능력에 따라 달라진다. 시험 샘플에 있는 표적 단백질의 양은 항체에 결합하게 되는 표준 물질의 양에 반비례한다. 결합하게 되는 표준 물질의 양을 용이하게 결정하기 위해서, 바람직하게는 경쟁 이전 또는 이후에 항체를 불용성화시켜, 항체에 결합된 표준 물질 및 분석물을 결합되지 않은 상태로 있는 표준 물질 및 분석물로부터 편리하게 분리해 낼 수 있다.

샌드위치 분석법은 검출될 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 2 가지 항체의 사용을 포함한다. 샌드위치 분석법에서, 시험 샘플 분석물이 고체 지지대 상에 고정화된 제1 항체에 결합된 후에 상기 분석물에 제2 항체가 결합하여 불용성의 3-부분 복합체가 형성된다. 예를 들면, 미국 특허 제4,376,110호를 참조한다. 제2 항체 그 자체를 검출가능한 잔기로 표지할 수도 있고 (직접 샌드위치 분석법) 또는 검출가능한 잔기로 표지된 항-이뮤노글로불린 항체를 사용하여 이를 측정할 수도 있다 (간접 샌드위치 분석법). 예를 들면, 샌드위치 분석의 한 가지 유형이 ELISA 분석법이고, 이 경우에서 검출가능한 잔기는 효소이다.

면역조직화학의 경우, 조직 샘플은 신선한 것이거나 동결된 것일 수 있고, 또는 예를 들어 파라핀에 포매시켜 포르말린과 같은 보존제로 고정화시킬 수 있다.

G. 세포-기재 분석

면역 관련 질환을 위해 세포-기재 분석 및 동물 모델을 사용하여 본원에서 동정된 유전자와 폴리펩티드 사이의 관계 및 면역 관련 질환의 발병 및 병원(病原) (pathogenesis)을 더 이해할 수 있다.

다른 접근법에서, 특정 면역 관련 질환에 관여하는 것으로 공지된 세포 유형의 세포를 본원에 기재된 cDNA로 형질감염시켜, 상기 cDNA가 면역 기능을 자극 또는 억제하는 능력을 분석한다. 적합한 세포를 원하는 유전자로 형질감염시키고, 면역 기능 활성을 모니터링할 수 있다. 이어서, 이와 같이 형질감염된 세포주를 사용하여 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 또는 항체 조성물의, 예를 들면 T-세포 증식 또는 염증 세포 침윤 조정과 같은 면역 기능 자극 또는 억제 능력을 시험할 수 있다. 또한, 본원에서 동정된 유전자의 코딩 서열로 형질감염시킨 세포를 사용하여 면역 관련 질환의 치료를 위한 약물 후보물질을 확인할 수도 있다.

또한, 안정한 세포주가 바람직하지만, 트랜스제닉 동물 (하기 기술된 바와 같음)로부터 유래된 초대 배양물도 본원의 세포-기재 분석에 사용할 수 있다. 트랜스제닉 동물로부터의 연속 세포주 유래 기술은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Small et al., Mol . Cell . Biol., 5, 642-648 (1985)] 참조).

한가지 적합한 세포 기재 분석법은 혼합림프구반응 (MLR)이다 (문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 3.12; J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Marglies, E. M. Shevach, W. Strober, National Institutes of Health, John Wiley ＆ Sons, Inc.] 참조). 상기 분석법에서는, 활성화된 T 세포의 증식을 자극 또는 억제하는 시험 화합물의 능력을 분석한다. 반응자 T 세포의 현탁액을 동종(同種) 자극인자 세포와 함께 배양하고, T 세포의 증식을 삼중수소화 티미딘의 흡수로 측정한다. 상기 분석법이 T 세포 반응성에 관한 일반적 측정법이다. 대부분의 T 세포가 반응하여 활성화되면 IL-2를 생성하므로, 상기 분석법에서의 반응성 차이는 부분적으로 반응 세포에 의한 IL-2 생성 차이를 반영한다. MLR 결과는 표준 림포카인 (IL-2) 검출 분석법으로 증명될 수 있다 (상기 문헌 [Current Protocols in Immunology, 3.15, 6.3]).

MLR 분석법에서 증식성 T 세포 반응은 분석된 분자의 직접적인 유사분열촉진 성질 또는 외부 항원에 의해 유도된 활성화에 기인할 수 있다. T 세포 활성화에는 T 세포 수용체 (TCR)를 통해 매개되는 항원 특이적 신호 및 제2 리간드 결합 상호작용, 예를 들어 B7 (CD80, CD86)/CD28 결합 상호작용을 통해 매개되는 동시-자극 신호가 필요하다. CD28 가교결합은 활성화된 T 세포에 의한 림포카인 분비를 증가시킨다. T 세포 활성화는 음성 또는 양성 효과를 갖는 리간드의 결합을 통해 음성 및 양성적으로 조절된다. CD28 및 CTLA-4는 B7에 결합하는 Ig 거대족의 관련 당단백질이다. B7에 결합하는 CD28은 T 세포 활성화에 양성 동시 자극 효과를 가지며, 반대로, B7에 결합하는 CTLA-4는 음성 T 세포 탈활성화 효과를 갖는다 (문헌 [Chambers, C. A. and Allison, J. P., Curr . Opin . Immunol. (1997) 9:396], [Schwartz, R. H., Cell (1992) 71:1065], [Linsey, P. S. and Ledbetter, J. A., Annu. Rev . Immunol. (1993) 11:191], [June, C. H. et al., Immunol . Today (1994) 15:321], [Jenkins, M. K., Immunity (1994) 1:405]). 동시 자극 분석법에서, PRO87299 폴리펩티드를 T 세포 동시-자극 또는 억제 활성에 대해 분석한다.

본 발명에서와 같은 자극 화합물의 직접적 용도는 프라이밍된 T 세포 상에서 발현되는 리간드 (4-1BBL)에 결합하고, T 세포의 활성화 및 성장에 신호를 전달하는, 종양 괴사인자 수용체 족의 한 구성원인 4-1BB 당단백질을 사용하는 실험으로 확인하였다 (문헌 [Alderson, M. E. et al., J. Immunol. (1994) 24:2219]).

또한, 효능제 자극 화합물의 용도가 실험적으로 확인되었다. 효능제 항-4-1BB 항체 처리에 의한 4-1BB의 활성화는 종양 근절을 증대시킨다 (문헌 [Hellstrom, I. and Hellstrom, K. E., Crit . Rev . Immunol. (1998) 18:1] 참조). 하기에 더욱 상세하게 기술하는, 종양 치료를 위한 면역보강제 요법은 본 발명의 자극 화합물 용도의 또다른 예이다.

다르게는, 면역 자극 또는 증대 효과는 혈관 투과성을 증대시키는 특성을 ㄱ갖는 PRO87299를 투여함으로써 달성될 수도 있다. 증대된 혈관 투과성은 면역 세포 (예를 들면, 단핵세포, 호산구, DMN)의 국부적 침윤 및 염증에 의해 약화될 수 있는 장애에 유익할 것이다.

한편, PRO87299 폴리펩티드 뿐만 아니라 본 발명의 다른 화합물은 T 세포 증식/활성화, 림포카인 분비 및/또는 혈관 투과성에 대한 직접적인 억제제이며, 면역 반응 억제에 직접 사용될 수 있다. 이들 화합물은 면역 반응의 정도 감소 및 과반응성, 과최적화 (superoptimal) 또는 자가면역 반응을 특징으로 하는 면역 관련 질환의 치료에 유용하다. 본 발명의 화합물의 이러한 용도는 수용체 B7에 결합한 CTLA-4가 T 세포를 탈활성화시키는 상기 기재된 실험에 의해 확인되었다. 본 발명의 직접적인 억제 화합물은 유사한 방식으로 기능한다. 혈관 투과성을 억제하는 화합물을 사용하는 것은 염증을 감소시킬 것으로 기대된다. 이러한 사용은 과도한 염증과 관련된 상태의 치료에 유익할 것이다.

다르게는, 자극성 PRO87299 폴리펩티드에 결합하고 이들 분자의 자극 효과를 차단하는 화합물, 예를 들어 항체는 순(net) 억제 효과를 생성하고, T 세포 증식/활성화 및/또는 림포카인 분비를 억제함으로써 T 세포-매개성 면역 반응의 억제에 사용될 수 있다. 상기 폴리펩티드의 자극 효과 차단은 포유동물의 면역 반응을 억제한다. 이러한 용도는 항-IL2 항체를 사용한 실험에서 확인되었다. 이 실험에서, 상기 항체는 IL2에 결합하여 그의 수용체에 대한 IL2의 결합을 차단함으로써 T 세포 억제 효과를 달성한다.

H. 동물 모델

세포 기재 시험관내 분석 결과는 생체내 동물 모델 및 T 세포 기능 분석을 사용하여 추가로 확인하였다. 공지된 여러 동물 모델을 사용하여 면역 관련 질환의 발병 및 병원에 있어서 본원에서 동정된 유전자의 역할을 더욱 잘 이해할 수 있고, 항체 및 소분자 길항제 등의 천연 폴리펩티드의 다른 길항제를 비롯한 후보 치료제의 효능을 시험할 수 있다. 이러한 모델들의 생체내 특성은 인간 환자에서의 반응을 예견하게 한다. 면역 관련 질환의 동물 모델에는 비-재조합 및 재조합 (트랜스제닉) 동물 둘 모두가 포함된다. 비-재조합 동물 모델로는, 예를 들어 쥐과동물 모델 등의 설치류 등이 있다. 이러한 모델은 예를 들어 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 신피막(腎被膜)하로의 이식 등과 같은 표준 기술을 이용하여 동계(同系) 마우스로 세포를 도입함으로써 생성될 수 있다.

면역적격 세포를 면역억제 또는 내성 환자에게 이식하는 경우, 이식편-대-숙주 질환이 발생한다. 공여자 세포는 숙주 항원을 인식하여 이에 반응한다. 이 반응은 생명을 위협하는 중증의 염증에서부터 설사 및 체중 감소의 경미한 경우에 이르기까지 다양할 수 있다. 이식편-대-숙주 질환 모델은 MHC 항원 및 소수의 이식 항원에 대한 T 세포 반응성을 평가하는 수단을 제공한다. 적합한 절차는 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 4.3]에 상세히 기재되어 있다.

피부 동종이계이식 거부반응에 대한 동물 모델은 T 세포의 생체내 조직 파괴를 매개하는 능력에 대해 시험하고, 이식 거부반응에서의 역할을 측정하는 수단이다. 가장 통상적으로 수용되는 모델은 쥐과동물 꼬리-피부 이식을 사용한다. 반복 실험으로 피부 동종이계이식 거부반응이 T 세포, 헬퍼 T 세포 및 살해-이펙터 T 세포에 의해 매개되는 것이며 항체에 의한 것이 아님을 알아내었다 (문헌 [Auchincloss, H. Jr. and Sachs, D. H., Fundamental Immunology, 2nd ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992]). 적합한 절차는 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 4.4]에 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 화합물 시험에 사용할 수 있는 다른 이식 거부반응 모델은 문헌 [Tanabe, M.. et al., Transplantation (1994) 58:23] 및 [Tinubu, S. A. et al., J. Immunol. (1994) 4330-4338]에 기재된 동종 심장 이식 모델이다.

지연형 과민증에 대한 동물 모델 역시 세포 매개 면역 기능에 관한 분석법을 제공한다. 지연형 과민성 반응은 항원을 투여하고 소정의 시간이 경과된 후에 최고조에 도달하지 못하는 염증을 특징으로 하는 T 세포 매개성 생체내 면역 반응이다. 또한, 이러한 반응은 다발성 경화증 (MS) 및 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE, MS를 위한 모델) 등의 조직 특이적 자가면역 질환에서 발생한다. 적합한 절차는 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 4.5]에 상세히 기재되어 있다.

EAE는 T 세포 및 단핵세포 염증 및 이후의 중추신경계에서 축삭의 탈수초화를 특징으로 하는 T 세포 매개성 자가면역 질환이다. EAE는 일반적으로 인간의 MS와 관련된 동물 모델인 것으로 고려된다 (문헌 [Bolton, C., Multiple Sclerosis (1995) 1:143]). 급성 및 재발-이장(弛張) (relapsing-remitting) 모델이 개발되었다. 본 발명의 화합물은 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 15.1 and 15.2]에 기재된 프로토콜을 사용하여 면역-매개성 탈수초 질환에 대한 T 세포 자극 또는 억제 활성에 대해 시험될 수 있다. 또한, 희소돌기아교세포 또는 쉬반세포가 문헌 [Duncan, I. D. et al., Molec . Med . Today (1997) 554-561]에 기재된 바와 같이 중추 신경계로 이식되는 수초 질환에 관한 모델을 참조한다.

접촉성 과민증은 세포-매개성 면역 기능을 생체내 분석하는 단순 지연형 과민증이다. 상기 절차에서, 지연형 과민성 반응을 일으키는 외생성 합텐에 대한 피부 노출을 측정하고 정량화하였다. 접촉성 민감증은 최초의 감응기에 이어 유발기를 포함한다. 유발기는 T 림프구가 이들이 이전에 접촉했던 항원을 만날 때 일어난다. 팽윤(膨潤) 및 염증이 발생하는데, 이는 인간 알레르기성 접촉성 피부염의 우수한 모델이 된다. 적합한 절차는 문헌 [Current Protocols in Immunology, J. E. Cologan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1994, unit 4.2]에 상세히 기재되어 있다. 또한, 문헌 [Grabbe, S. and Schwartz, T., Immun . Today 19(1):37-44 (1998)]을 참조한다.

관절염에 대한 동물 모델은 콜라겐-유도 관절염이다. 이 모델은 인간의 자가면역 류마티스성 관절염에 관한 임상적, 조직학적 및 면역학적 특성을 공유하며, 인간의 자가면역 관절염에 대한 허용가능한 모델이다. 마우스 및 래트 모델은 활막염, 연골 및 연골하골의 침식을 특징으로 한다. 본 발명의 화합물은 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 15.5]에 기재된 프로토콜을 이용하여 자가면역 관절염에 대한 활성에 대해 시험할 수 있다. 또한, 문헌 [Issekutz, A. C. et al., Immunology (1996) 88:569]에 기재된 CD18 및 VLA-4 인테그린에 대한 모노클로날 항체를 사용한 모델을 참조한다.

난알부민으로 동물을 감작화시킨 후에 그 동물에 동일 단백질을 에어로졸로 투여함으로써 항원 유도 기도 과반응성, 폐 호산구증다증 및 염증을 유도한 천식 모델이 기재된 바 있다. 몇몇 동물 모델 (기니아 피그, 래트, 비-인간 영장류)에서는 에어로졸 항원 투여시에 인간에서의 아토피성 천식과 유사한 징후가 나타났다. 쥐과동물 모델은 다수의 인간 천식의 특징을 나타낸다. 천식 치료에서의 활성 및 유효성에 대해 본 발명의 화합물을 시험하는데 적합한 절차는 문헌 [Wolyniec, W. W. et al., Am . J. Respir . Cell Mol . Biol. (1998) 18:777] 및 이 문헌에 인용된 참고 문헌에 기재되어 있다.

또한, 본 발명의 화합물을 건선류 질환에 대한 동물 모델에서 시험할 수도 있다. 건선에 대한 T 세포 병원을 암시하는 증거가 있다. 본 발명의 화합물은 문헌 [Schon, M. P. et al., Nat . Med. (1997) 3:183]에 기재된 면역부재(scid)/면역부재 마우스 모델에서 시험할 수 있고, 여기서 마우스는 건선과 유사한 조직병리학적 피부 병변을 입증한다. 다른 적합한 모델로는 문헌 [Nickoloff, B. J. et al., Am. J. Path. (1995) 146:580]에 기재된 바와 같이 제조된 인간 피부/면역부재 마우스 키메라가 있다.

재조합 (트랜스제닉) 동물 모델은 트랜스제닉 동물 제조를 위한 표준 기술을 이용하여 본원에서 동정된 유전자의 코딩 부분을 대상 동물의 게놈에 도입시킴으로써 조작할 수 있다. 트랜스제닉 조작을 위한 표적으로 작용할 수 있는 동물로는 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지 및 비-인간 영장류, 예를 들면 비비원숭이, 침팬지 및 원숭이 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 트랜스진 (transgene)을 상기 동물에 도입하기 위한 당업계에 공지된 기술로는 전핵 미세주입법 (호프 및 왕거 (Hoppe and Wanger)의 미국 특허 제4,873,191호), 생식선으로의 레트로바이러스 매개 유전자 전달법 (예를 들면 문헌 [Van der Putten et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 82:6148-615 (1985)]), 배아 줄기세포에서의 유전자 표적화 (문헌 [Thompson et al., Cell, 56:313-321 (1989)), 배아의 전기천공법 (Lo, Mol . Cell . Biol., 3:1803-1814 (1983)); 정자-매개성 유전자 전달법 (문헌 [Lavitrano et al., Cell. 57:717-73 (1989))이 있다. 이에 관해 살펴보기 위해서는 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호를 참조한다.

본 발명의 목적에 있어서, 트랜스제닉 동물에는 세포의 일부에만 트랜스진을 지니고 있는 동물 ("모자이크 동물")이 포함된다. 트랜스진은 단일 트랜스진으로서 통합되거나, 또는 콘카타머 (concatamer)로서 예컨대 머리 대 머리 또는 머리 대 꼬리 배열로 통합될 수 있다. 또한, 트랜스진의 특정 세포 유형으로의 선택적 도입은 예를 들어 문헌 [Lasko et al., Proc . Natl . Acd . Sci . USA. 89:6232-636 (1992)]의 기술에 따라 가능하다.

트랜스제닉 동물에서의 트랜스진 발현은 표준 기술을 이용하여 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 서던 블롯팅 분석 또는 PCR 증폭을 이용하여 트랜스진의 통합을 입증할 수 있다. 이어서, mRNA 발현 수준을 제자리 혼성화, 노던 블롯팅 분석, PCR 또는 면역세포화학과 같은 기술을 이용하여 분석할 수 있다.

동물에서는 예를 들어 조직학적 검사로 면역 질환 병리의 신호를 추가 조사하여 특정한 조직으로의 면역 세포 침윤을 결정할 수 있다. 또한, 트랜스제닉 동물을 본 발명의 화합물로 처리하여 상기 화합물이 T 세포 증식을 자극 또는 억제하는 정도를 측정하는 차단 실험을 수행할 수도 있다. 이들 실험에서는, 상기 기술된 바와 같이 제조된, PRO87299 폴리펩티드에 결합하는 차단 항체를 동물에게 투여하여 면역 기능에 대한 효과를 결정한다.

다르게는, 폴리펩티드를 코딩하는 내생성 유전자와 그 동물의 배아 세포에 도입된 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 변화된 게놈 DNA 사이에서 상동성 재조합이 일어나, 본원에서 동정된 폴리펩티드를 코딩하는 결함 또는 변경된 유전자를 갖는 "넉아웃 (knock out)" 동물을 제작할 수 있다. 예를 들어, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 그 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. 특정 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실되거나, 통합을 모니터링하는데 사용될 수 있는 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자와 같은 다른 유전자로 치환될 수 있다. 통상적으로, 수천 개 염기의 변경되지 않은 인접한 DNA (5' 및 3' 말단 모두에서)가 벡터에 포함된다 (예를 들어, 상동성 재조합 벡터에 대한 실험에 대해서는 문헌 [Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)] 참조). 상기 벡터를 배아 줄기 세포주에 도입 (예를 들어, 전기천공법에 의해 도입함)하고, 도입된 DNA와 내생성 DNA 사이에 상동성 재조합이 일어난 세포를 선택한다 (예를 들어, 문헌 [Li et al., Cell, 69:915 (1992)] 참조). 이어서, 선택된 세포를 동물 (예를 들어 마우스 또는 래트)의 배반포에 주입하여 응집 키메라를 형성한다 (예를 들어, 문헌 [Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach , E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152] 참조). 이어서, 키메라 배아를 적합한 가임신 대리모 동물에 이식할 수 있으며 이 배아가 "넉아웃" 동물을 생성하게 된다. 생식 세포내에 상동성 재조합된 DNA를 보유하는 자손 세포를 표준 기술로 확인할 수 있고, 이를 사용하여 모든 세포가 상동성 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 사육할 수 있다. 넉아웃 동물은 예를 들어 특정 병리학적 증상에 대한 방어 능력 및 폴리펩티드의 부재로 인한 병리학적 상태의 발병을 특징으로 할 수 있다.

I. 면역보강제 요법

한 실시양태에서, 본 발명의 면역 자극 화합물을 종양 (암) 치료를 위한 면역보강제 요법에 사용할 수 있다. T 세포가 인간의 종양 특이적 항원을 인식함은 잘 확립되어 있다. MAGE, BAGE 및 GAGE 유전자 군에 의해 코딩되는 종양 항원 군은 모든 성인 정상 조직에서는 발현되지 않지만, 흑색종, 폐암, 두부 및 경부 암과 같은 종양에서는 현저한 양으로 발현된다 (문헌 [DeSmet, C. et al., (1996) Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 93:7149). 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 T 세포의 동시 자극이 종양 퇴행 및 항종양 반응을 유도하는 것으로 나타났다 (문헌 [Melero, I. et al., Nature Medicine (1997) 3:682]; [Kwon, E. D., et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA (1997) 94:8099]; [Lynch, D. H. et al., Nature Medicine (1997) 3:625]; [Finn, O. J. and Lotze, M. T., J. Immunol. (1998) 21:114]). 본 발명의 자극성 화합물은 T 세포 증식/활성화 및 종양 항원에 대한 항종양 반응을 자극하기 위한 면역보강제로서 단독으로 투여될 수도 있고, 또는 성장 조절제, 세포독성제 또는 화학요법제와 함께 투여될 수도 있다. 성장 조절제, 세포독성제 또는 화학요법제는 공지된 투여 처방을 이용하여 통상적인 양으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물에 의한 면역 자극 활성은 성장 조절제, 세포독성제 또는 화학요법제의 양을 감소시켜 환자에 대한 독성을 잠재적으로 저하시킨다.

J. 약물 후보 물질의 스크리닝 분석법

약물 후보 물질의 스크리닝 분석법은 본원에서 동정된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 생물학적 활성 단편에 결합하거나 이들과 복합체를 이루는 화합물, 또 다르게는 상기 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포내 단백질과의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하기 위해서 고안된 것이다. 이러한 스크리닝 분석법은 화학 물질 라이브러리에 대해 고처리량 스크리닝을 할 수 있는 분석법을 포함하며, 이는 소분자의 약물 후보물질을 확인하는데 특히 적합할 것이다. 고려되는 소분자에는 펩티드, 바람직하게는 가용성 펩티드, (폴리)펩티드-이뮤노글로불린 융합체, 특히 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단쇄 항체, 항-이디오타입 항체 및 상기 항체 또는 단편의 키메라 항체 또는 인간화 항체 뿐만 아니라 인간 항체 및 항체 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체 등을 비롯한 합성 유기 또는 무기 화합물이 포함된다. 상기 분석법은 당업계에서 잘 특성화된 단백질-단백질 결합 분석법, 생화학적 스크리닝 분석법, 면역분석법 및 세포-기반 분석법을 비롯한 다양한 포맷으로 수행할 수 있다. 모든 분석법의 공통점은 약물 후보 물질과 본원에서 동정된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 상호작용하기에 충분한 조건 및 시간 동안 상기 2 가지 성분들의 접촉이 요구된다는 점이다.

결합 분석법에서, 상호작용은 결합하는 것이며, 반응 혼합물에서 형성된 복합체를 단리하거나 검출할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 동정된 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 약물 후보 물질은 공유 결합에 의한 부착 또는 비-공유 결합에 의한 부착을 통해 고상, 예를 들어 미세역가 플레이트에 고정화시킨다. 비-공유 결합에 의한 부착은 일반적으로 고체 표면을 폴리펩티드의 용액으로 코팅하고 건조시킴으로써 수행한다. 다르게는, 고정화시킬 폴리펩티드에 특이적인 고정화 항체, 예를 들어 모노클로날 항체를 사용하여 그를 고체 표면에 앵커링할 수 있다. 이 분석은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 고정화되지 않은 성분을 고정화 성분, 예를 들어 앵커링된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 첨가함으로써 수행한다. 반응이 완료되었을 때, 반응하지 않은 성분을 예를 들어 세척에 의해 제거하며, 고체 표면에 앵커링된 복합체를 검출한다. 본래 고정화되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 갖고 있는 경우, 표면에 고정화된 표지의 검출은 복합체화 반응이 일어났음을 나타낸다. 본래 고정화되지 않는 성분이 표지를 갖고 있지 않는 경우에는 예를 들어 고정화된 복합체와 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 복합체화 반응을 검출할 수 있다.

후보 화합물이 본원에서 동정된 유전자에 의해 코딩되는 특정 단백질과 상호작용하지만 결합하지는 않는 경우, 후보 화합물과 상기 단백질의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용 검출용으로 공지된 방법으로 분석할 수 있다. 이러한 분석법에는 종래의 접근법, 예를 들어 가교결합법, 동시면역침전법 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 동시정제법이 포함된다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 [Chevray and Nathans, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89, 5789-5793 (1991)]에 개시된 바와 같이 필즈 (Fields) 및 공동 연구자들의 문헌 [Fields and Song, Nature ( London ), 340, 245-246 (1989)] 및 [Chien et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 88, 9578-9582 (1991)]에 기재된 효모 기재 유전자 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있다. 다수의 전사 활성인자 (예컨대, 효모 GAL4)는 물리적으로 구별되는 2가지 모듈형 도메인으로 이루어져 있는데, 한 도메인은 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 나머지 한 도메인은 전사 활성화 도메인으로 기능한다. 상기 간행물에 기재된 효모 발현 시스템 (통상적으로 "2-하이브리드 시스템"이라고 지칭됨)는 이러한 특성의 이점을 활용하며, 2 가지 하이브리드 단백질을 사용하는데, 이 중 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인에 융합된 것이며, 다른 하나는 후보 활성 단백질이 활성화 도메인에 융합된 것이다. GAL4-활성화된 프로모터의 제어를 받는 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 따라 달라진다. 상호작용하는 폴리펩티드를 함유하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 발색 기질로 검출된다. 2-하이브리드 기술을 이용하여 2 종의 특정 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 완성형 키트 (매치마커(MATCHMAKER; 상표명))는 클론테크 (Clontech)사에서 구입할 수 있다. 또한, 상기 시스템을 확장하여 특정 단백질 상호작용에 관여하는 단백질 도메인을 맵핑할 수 있을 뿐 아니라, 이러한 상호작용에 결정적인 아미노산 잔기의 위치를 정확하게 나타낼 수도 있다.

본원에서 동정된 유전자와 시험할 수 있는 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 방해하는 화합물을 찾아내기 위해서, 통상적으로 유전자 생성물과 세포내 또는 세포외 성분을 함유하는 반응 혼합물을 이들 두 생성물의 상호작용 및 결합을 허용하는 조건 및 시간을 이용하여 제조한다. 시험 화합물에 의한 결합 억제 능력을 시험하기 위해, 시험 화합물의 부재 및 존재하에 반응을 수행한다. 추가로, 양성 대조군으로 작용하는 제3의 반응 혼합물에 위약을 첨가할 수 있다. 혼합물에 존재하는 시험 화합물과 세포내 또는 세포외 성분 사이의 결합 (복합체 형성)을 상기 기재된 바와 같이 모니터링한다. 대조군 반응물(들)에서는 복합체가 형성되나 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물에서는 복합체가 형성되지 않는다는 것은 시험 화합물이 시험 화합물과 그의 반응 대응물의 상호작용을 방해한다는 것을 지시한다.

K. 면역 관련 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법

면역 관련 질환의 치료에 유용한 조성물에는 예를 들어 T 세포 증식/활성화, 림포카인 방출 또는 면역 세포 침윤 등의 면역 기능을 억제하거나 자극하는 단백질, 항체, 유기 소분자, 펩티드, 포스포펩티드, 안티센스 및 리보자임 분자, 삼중나선 분자 등이 있으나 이에 한정되지 않는다.

예를 들면, 안티센스 RNA 및 RNA 분자는 표적화된 mRNA에 혼성화되어 단백질 번역을 억제함으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하는 작용을 한다. 안티센스 DNA가 사용되는 경우, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 내지 +10 위치 사이의 번역 개시 부위로부터 유래된 올리고데옥시리보뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 그와 상보적인 표적 RNA를 서열-특이적으로 혼성화시킨 후에 엔도뉴클레아제에 의한 절단을 수행함으로써 작용한다. 공지된 기술을 이용하여, 잠재적인 RNA 표적 내에서 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있다. 보다 상세한 사항은, 예를 들어 문헌 [Rossi, Current Biology, 4, 469-471 (1994)] 및 PCT 공개 WO 97/33551 (1997년 9월 18일 공개))을 참조한다.

전사를 억제하는데 사용되는 삼중나선 형태의 핵산 분자는 단일-가닥이어야하며, 데옥시뉴클레오티드로 구성되어 있어야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 그가 훅스틴 (Hoogsteen) 염기쌍 규칙을 통해 삼중나선 형성을 촉진하게끔 고안되어 있는데, 통상적으로 삼중나선의 형성에는 이합체 중 한쪽 가닥에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치가 필요하다. 보다 상세한 사항은, 예를 들어 PCT 공개 WO 97/33551 (상기 문헌)을 참조한다.

이들 분자들은 상기 논의된 임의의 스크리닝 분석법 또는 이들의 조합 및/또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 스크리닝 기술로 확인될 수 있다.

L. 항- PRO87299 항체

본 발명은 항-PRO87299 항체를 추가로 제공한다. 항체의 예로는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 이종접합 항체 등이 있다.

1. 폴리클로날 항체

항-PRO87299 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 예를 들어 면역화제 및 원하는 경우에는 면역보강제를 포유동물에게 1회 이상 주사함으로써 생성시킬 수 있다. 통상적으로, 면역화제 및/또는 면역보강제는 포유동물에게 피하 또는 복강내로 여러 회 주사할 것이다. 면역화제는 PRO87299 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화될 포유동물에 대해 면역원성인 것으로 알려진 단백질에 면역화제를 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 이러한 면역원성 단백질의 예로는 키홀 림펫 (keyhole limpet) 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 면역보강제의 예로는 프로인트 완전 면역보강제 및 MPL-TDM 면역보강제 (모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노마이콜레이트)가 있다. 당업자라면 과도한 실험 없이 면역화 프로토콜을 선택할 수 있다.

2. 모노클로날 항체

다르게는, 항-PRO87299 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기재된 바와 같은 하이브리도마 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 통상적으로 면역화제로 면역화시켜 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 이를 생성할 수 있는 림프구를 유도한다. 다르게는, 림프구를 시험관내 면역화시킬 수 있다.

면역화제는 통상적으로 PRO87299 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포를 원하는 경우에는 말초 혈액 림프구 ("PBL")를 사용하거나, 또는 비-인간 포유동물 공급원을 원하는 경우에는 비장 세포 또는 림프절 세포를 사용한다. 이어서, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 림프구와 무한증식 세포주를 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]). 무한증식 세포주는 통상적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로는 래트 또는 마우스의 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 무한증식 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들면, 모 세포에 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 통상적으로 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함 ("HAT 배지")할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제시킨다.

바람직한 무한증식 세포주는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생성 세포에 의해 항체가 높은 수준으로 안정하게 생성되도록 하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것이다. 보다 바람직한 무한증식 세포주는 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 매나서스 소재)으로부터 얻을 수 있는 쥐과동물 골수종 세포주이다. 또한, 인간 모노클로날 항체의 생성을 위한 인간 골수종 세포주 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 기술되어 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol ., 133:3001 (1984)] 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63]).

이어서, 하이브리도마 세포를 배양한 배양 배지를 PRO87299에 대해 지시된 모노클로날 항체의 존재에 대해 분석할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전법으로 측정하거나, 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석법으로 측정한다. 이러한 기술 및 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은 예를 들어 스캣차드 (Scatchard) 분석법 (문헌 [Munson and Pollard, Anal . Biochem ., 107:220 (1980)])으로 측정할 수 있다.

원하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 제한희석 절차에 따라 서브클로닝하고, 표준 방법 (문헌 [Goding, 상기문헌])으로 성장시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어 둘베코 변형된 이글스 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지가 있다. 다르게는, 하이브리도마 세포를 포유동물의 복수 (腹水)로서 생체내 배양할 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들어 단백질 A-세파로스, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리되거나 정제될 수 있다.

또한, 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수도 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 쥐과동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함) 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리하면, DNA를 발현 백터에 넣을 수 있고, 이후에는 이것을 별도로 이뮤노글로불린 단백질을 생성하지 않는 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성시킬 수 있다. 또한, 예를 들어 상동성 쥐과동물 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환하거나 (미국 특허 제4,816,567호; [Morrison et al., 상기 문헌]) 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유 결합에 의해 연결시켜 DNA를 변형시킬 수도 있다. 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드를 본 발명의 항체의 불변 도메인에 대해 치환시키거나, 본 발명의 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환시켜 2가의 키메라 항체를 생성시킬 수 있다.

항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 한 방법은 이뮤노글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄는 중쇄 가교결합을 방지하기 위해 일반적으로 Fc 영역의 임의의 지점에서 말단절단된다. 다르게는, 관련 시스테인 잔기는 가교결합을 방지하기 위해서 다른 아미노산 잔기로 치환 또는 결실된다.

또한, 시험관내 방법도 1가 항체의 제조에 적합하다. 항체 단편, 특히 Fab 단편을 제조하기 위한 항체의 분해는 당업계에 공지된 통상적인 기술을 이용하여 수행할 수 있다.

3. 인간 항체 및 인간화 항체

본 발명의 항-PRO87299 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 비-인간 (예를 들어, 쥐과동물) 항체의 인간화 형태는 키메라 이뮤노글로불린, 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 함유하는 이뮤노글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열)이다. 인간화 항체는, 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여 항체)의 CDR 잔기로 대체시킨 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 예에서, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열 어느 것에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 통상적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-인간 이뮤노글로불린의 영역에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 이뮤노글로불린 공통 서열의 영역에 상응한다. 또한, 인간화 항체는 가장 적합하게는 적어도 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 일부를 포함하며, 통상적으로는 적어도 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 일부도 포함할 것이다 (문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr . Op . Struct . Biol ., 2:593-596 (1992)]).

비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트 (import)" 잔기라고 지칭되며, 통상적으로는 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 본질적으로 윈터 (Winter)와 그의 공동 연구자의 방법 (문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)])에 따라 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 보다 적은 온전한 인간 가변 도메인이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로 몇몇 CDR 잔기 및 가능하게는 몇몇 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

또한, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯한 당업계에 공지된 여러 가지 기술을 이용하여 제조할 수도 있다 (문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol ., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol . Biol ., 222:581-597 (1991)]). 또한, 콜 (Cole) 등 및 뵈르너 (Boerner) 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용할 수 있다 (문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; 및 [Boerner et al., J. Immunol ., 147(1):86-95 (1991)]). 이와 마찬가지로, 예를 들어 내생성 이뮤노글로불린 유전자가 부분적으로 또는 전체적으로 실활된 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)에 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 도입하여 인간 항체를 제조할 수 있다. 항원투여 후, 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레파토리를 비롯한 모든 측면이 인간에서 관찰되는 바와 매우 유사한 인간 항체의 생성이 관찰된다. 이러한 접근법은, 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호, 동 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 제5,661,016호 및 과학 간행물 문헌 [Marks et al., Bio / Technology 10, 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368, 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)]; [Lonberg and Huszar, Intern . Rev . Immunol . 13, 65-93 (1995)]에 기재되어 있다.

또한, 항체는 상기 기재된 바와 같은 공지된 선택법 및/또는 돌연변이유발법을 이용하여 친화성 성숙 (affinity matured)될 수도 있다. 바람직한 친화성 성숙 항체의 친화성은 성숙한 항체가 제조되는 출발 항체 (일반적으로 쥐과동물, 인간화 또는 인간 항체)보다 5 배, 더욱 바람직하게는 10 배, 훨씬 더욱 바람직하게는 20 배 또는 30 배 더 높다.

4. 이중특이적 항체

이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 이 경우에, 결합 특이성 중 하나는 PRO87299에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 바람직하게는 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.

이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 종래, 이중특이적 항체의 재조합적 생성은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 동시발현을 기초로 하며, 여기에서, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위적인 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마; quadroma)는 10 가지의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성하며, 이 중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 올바른 분자의 정제는 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행된다. 유사한 절차는 1993년 5월 13일자로 공개된 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.

원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킬 수 있다. 융합에는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인을 이용하는 것이 바람직하다. 적어도 하나의 융합체에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체, 및 경우에 따라 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체에 동시에 형질감염시킨다. 이중특이적 항체를 생성하는 것과 관련한 보다 상세한 사항은, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.

WO 96/27011에 기재된 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서는, 제1 항체 분자의 계면으로부터 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체한다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써, 큰 측쇄(들)과 동일하거나 유사한 크기의 보충적 "공동 (cavity)"이 2차 항체 분자의 계면에 생성된다. 이는 이종이량체의 수율을 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물보다 높게 증가시키는 메카니즘을 제공한다.

이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')₂ 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 제조하는 기술은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]에는 온전한 항체를 단백질 가수분해에 의해 절단하여 F(ab')₂ 단편을 생성하는 절차가 기재되어 있다. 이러한 단편은 디티올 착화제인 나트륨 아르세니트의 존재하에 환원되어 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 이어서, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 다시 전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로 사용될 수 있다.

이. 콜라이로부터 Fab' 단편을 직접 회수하여 화학적으로 커플링킴으로써 이중특이적 항체를 형성시킬 수 있다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp . Med . 175:217-225 (1992)]은 완전하게 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')₂ 분자의 생성에 대해 기재하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 별도로 분비되며, 유도된 시험관내 화학적 커플링을 수행하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 세포용해 활성을 촉진시킬 수 있었다.

또한, 재조합 세포 배양물로부터 바로 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하기 위한 여러 가지 기술도 기재되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 이용하여 제조한다 (문헌 [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 2가지 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합으로 연결시킨다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성하게 한 다음, 이를 다시 산화시켜 항체 이종이량체를 형성시킨다. 또한, 이 방법은 항체 동종이량체의 제조에도 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하는 별도의 메카니즘을 제공한다. 상기 단편에는 너무 짧아서 동일 쇄상의 두 도메인의 쌍을 형성할 수 없는 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)이 포함된다. 따라서, 한 단편의 V_H 및 V_L 도메인은 다른 단편의 상보적인 V_H 및 V_L 도메인과 쌍을 이루게 되어, 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하는 또다른 전략도 보고된 바 있다 (문헌 [Gruber et al., J. Immunol . 152:5368 (1994)] 참조). 2가 초과의 결합가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 (문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)]).

예시 이중특이적 항체는 본원에 주어진 PRO87299 폴리펩티드 상의 2가지 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다르게는, 특정 PRO87299 폴리펩티드를 발현하는 세포에 대한 세포내 방어 메카니즘에 초점을 맞춰, 항-PRO87299 폴리펩티드 완(arm)을 백혈구상의 촉진 분자, 예컨대 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2, CD3, CD28 또는 B7) 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예컨대 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)에 결합하는 완과 연결시킬 수 있다. 또한, 이중특이적 항체를 사용하여 특정 PRO87299 폴리펩티드를 발현하는 세포에 세포독성제를 국부화시킬 수 있다. 이러한 항체는 PRO87299-결합 아암 및 세포독성제 또는 방사성핵종 킬레이트제, 예컨대 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA에 결합하는 아암을 보유한다. 또다른 대상 이중특이적 항체는 PRO87299 폴리펩티드에 결합하며 추가로 조직 인자 (TF)와 결합한다.

5. 이종접합 항체

이종접합 항체도 또한 본 발명의 범위에 속한다. 이종접합 항체는 공유 결합에 의해 연결된 2개의 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키고 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안된 바 있다. 이종접합 항체는 가교결합제의 사용을 포함하는 방법 등을 비롯하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 시험관내 제조할 수 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 이용하거나 티오에테르 결합을 형성시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트 및 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 시약이 있다.

6. 이펙터 기능 조작

예를 들어 암 치료에 있어서 항체의 유효성을 증대시키기 위해서, 본 발명의 항체를 이펙터 기능과 관련하여 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)을 Fc 영역에 도입하여 상기 영역에 쇄간 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이와 같이 생성된 동종이량체 항체는 내재화 능력이 개선되고/되거나 상보체-매개성 세포 사멸 및 항체-의존성 세포내 세포독성 (ADCC)이 증가될 수 있다 (문헌 [Caron et al., J. Exp Med ., 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)] 참조). 또한, 문헌 [Wolff et al. Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 이종이관능성 가교결합제를 사용하여 항종양 활성이 증대된 동종이량체 항체를 제조할 수도 있다. 다르게는, 이중의 Fc 영역을 갖는 항체를 조작함으로써 상보체 용해 능력 및 ADCC 능력을 증대시킬 수 있다. 예를 들어 문헌 [Stevenson et al., Anti - Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)]을 참조한다.

7. 면역접합체

본 발명은 또한 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이기도 하다.

이러한 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제는 상기에 기재하였다. 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래), 라이신(ricin) A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테세네스가 포함된다. 다양한 방사성핵종을 방사성접합된 항체의 제조에 이용할 수 있다. 예를 들면 ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y 및 ¹⁸⁶Re가 포함된다.

다양한 이관능성 단백질-커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 접합체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 라이신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오디드를 항체에 접합시키기 위한 킬레이트제의 예이다. WO 94/11026을 참조한다.

또다른 실시양태에서, 종양 예비표적화에 사용하기 위해서 항체를 "수용체" (예컨대, 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있으며, 여기서 상기 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 후에 제거제를 사용하여 순환으로부터 결합되지 않은 접합체를 제거한 다음, 세포독성제 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.

8. 면역리포좀

또한, 본원에 개시된 항체를 면역리포좀으로 제제화할 수도 있다. 상기 항체를 함유하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 82:3688 (1985)], [Hwang et al., Proc . Natl Acad . Sci . USA, 77:4030 (1980)], 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호에 기재된 방법으로 제조된다. 순환 시간이 증대된 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 지정된 공극 크기의 필터를 통해 리포좀을 압출시켜 원하는 직경을 갖는 리포좀을 수득한다. 문헌 [Martin et al., J. Biol . Chem ., 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 디술피드-상호교환 반응을 통해 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 접합시킬 수 있다. 임의로는 화학요법제 (예컨대, 독소루비신)를 리포좀에 함유시킨다. 문헌 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst ., 81(19):1484 (1989)]을 참조한다.

M. 제약 조성물

면역 관련 질환의 치료를 위해 본 발명의 활성 PRO87299 분자 (예를 들어 PRO87299 폴리펩티드, 항-PRO87299 항체 및/또는 각각의 변이체) 뿐만 아니라 상기 개시된 스크리닝 분석법에 의해 확인된 다른 분자들을 제약 조성물 형태로 투여할 수 있다.

활성 PRO87299 분자, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체의 치료 제제는 저장을 위해서, 원하는 정도의 순도를 갖는 활성 분자를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 인산, 시트르산 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 산화방지제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸), 저분자량 (잔기 약 10개 미만)의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 트윈 (상표명), 플루로닉스 (상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제가 포함된다.

본원에 개시된 스크리닝 분석법으로 확인된 화합물들은 당업계에 공지된 표준 기술을 이용하여 유사한 방식으로 제제화될 수 있다.

리포펙션 또는 리포좀을 사용하여 PRO87299 분자를 세포에 전달할 수도 있다. 항체 단편이 사용되는 경우에는, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소의 억제성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열을 기초로, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 지닌 펩티드 분자를 고안할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성되고/되거나 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Marasco et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:7889-7893 (1993)] 참조).

또한, 본원의 제제는 특정 증상을 치료하는데 필요한 1종 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부정적 영향을 주지 않는 상보적인 활성을 지닌 화합물들을 함유할 수도 있다. 별법으로 또는 추가로, 상기 조성물은 세포독성제, 사이토카인 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 배합물에 존재하는 것이 적합하다.

활성 PRO87299 분자는 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 거대에멀젼 중에서 각각 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐에 포획될 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

생체내 투여용으로 사용될 제제는 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.

서방형 제제 또는 PRO87299 분자를 제조할 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형품 형태 (예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐)이다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포트 (LUPRON DEPOT; 상표명) (락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 구성된 주입가능한 미소구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 있다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100 일 초과 동안 분자를 방출할 수 있지만, 특정 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 장기간 체내에 남아있는 경우, 이것들은 37℃에서 수분에 노출됨으로써 변성 또는 응집되어 생물학적 활성이 손실되고 면역원성이 변화될 수 있다. 관련 메카니즘에 따라 합리적인 안정화 전략을 고안해 낼 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화를 달성할 수 있다.

N. 치료 방법

본 발명의 폴리펩티드, 항체 및 다른 활성 화합물을 사용하여 염증 세포의 조직으로의 침윤, T 세포 증식의 자극, T 세포 증식의 억제, 혈관 투과성의 증가 또는 감소 또는 그의 억제를 특징으로 하는 질환을 포함하는 T 세포 매개성 질환과 같은 다양한 면역 관련 질환 및 상태를 치료할 수 있다고 여겨진다.

본 발명의 폴리펩티드, 항체 및 다른 화합물로 치료되는 상태 또는 장애의 예로는 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 유년형 만성 관절염, 골관절염, 척추관절증, 전신성 경화증 (경피증), 특발성 염증성 근장애 (피부근염, 다발성 근염), 쇼그렌 증후군, 전신성 맥관염, 유육종증, 자가면역 용혈성 빈혈 (면역성 범혈구감소증, 발작성 야간혈색소뇨증), 자가면역성 혈소판감소증 (특발성 혈소판감소성자반병, 면역-매개성 혈소판감소증), 갑상선염 (그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 유년형 림프종성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 진성 당뇨병, 면역-매개성 신장 질환 (사구체신염, 세뇨관간질성신염), 다발성 경화증, 특발성 탈수초 다발성 신경염 또는 길랑-바레 증후군 및 만성 염증성 탈수초 다발성 신경염과 같은 중추신경계 및 말초신경계의 탈수초 질환, 감염성 간염 (A, B, C, D, E형 간염바이러스 및 다른 비-간친화성 바이러스), 자가면역성 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염 및 경화성 담관염과 같은 간담즙성 질환, 염증성 장 질환 (궤양성 대장염, 크론병), 글루텐 민감성 장 질환 및 휘플병, 수포성 피부 질환, 다형성 홍반 및 접촉성 피부염을 비롯한 자가면역 또는 면역-매개성 피부 질환, 건선, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증 및 두드러기와 같은 알레르기성 질환, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유종 및 과민성 폐렴과 같은 폐의 면역 질환, 이식 거부반응 및 이식편-대-숙주 질환을 비롯한 이식 관련 질환이 있으나 이에 한정되지 않는다.

전신 홍반성 루푸스에서, 질환의 주요 매개인자는 자가 단백질/조직에 대한 자가반응성 항체의 생성 및 그 이후의 면역-매개성 염증의 발생이다. 항체는 직접 또는 간접적으로 조직 손상을 매개한다. T 림프구가 조직 손상에 직접 관여하는 것으로 나타나지 않더라도, T 림프구는 자가반응성 항체 생성에 필요하다. 그러므로, 상기 질환의 발병은 T 림프구에 의존적이다. 신장, 폐, 근골격계, 피부점막, 안구, 중추신경계, 심혈관계, 위장관, 골수 및 혈액을 비롯한 여러 기관 및 계는 임상적으로 영향을 받는다.

류마티스성 관절염 (RA)은 관절 연골의 손상과 함께 여러 관절의 활막이 주로 관련된 만성 전신성 자가면역 염증성 질환이다. 병원은 T 림프구 의존성이고, 류마티스성 인자, 자가 IgG 에 대해 지시된 자가항체의 생성과 관련되어 있으며, 결과적으로 면역 복합체가 형성되어 관절액 및 혈액에 높은 수준으로 존재하게 된다. 관절 내에서 이러한 복합체는 림프구 및 단핵세포가 활막으로 현저하게 침윤되도록 한 후에 활막에서 상당한 변화가 일어나도록 유도할 수 있다 (다수의 호중구가 추가되면서 유사한 세포들이 침윤하면 관절 공간/액이 변화함). 영향을 받는 조직은 주로 관절이며, 종종 대칭적인 패턴으로 나타난다. 그러나, 관절외 질환도 2 가지 주요 형태로 발생한다. 한 형태는 진행성 관절 질환이 진행중인 관절외 병변 및 폐 섬유증, 맥관염 및 피부 궤양의 전형적인 병변의 발생이다. 다른 한 형태의 관절외 질환은 이후에 때때로 RA 질환 과정의 후기, 때로는 관절 질환이 사라진 후에 발생하는 소위 펠티 증후군(Felty's syndrome)이며, 호중구감소증, 혈소판감소증 및 비종대의 존재를 포함한다. 이는 여러 기관에서 맥관염을 수반할 수 있으며, 경색증, 피부 궤양 및 괴저(壞疽)의 형성을 동반한다. 또한, 환자들에서는 종종, 영향을 받은 관절 바로 위쪽의 피하 조직에서 류마티스성 결절이 일어나고, 결절 후기 단계에서는 혼합 염증 세포 침윤물로 둘러싸인 괴사 중심을 갖게 된다. RA에서 발생할 수 있는 다른 징후로는 심막염, 흉막염, 관상 동맥염, 폐섬유증을 동반한 간질성 폐렴, 건성각결막염 및 류마티스성 결절이 있다.

유년형 만성 관절염은 종종 16 세 미만에 시작하는 만성 특발성 염증성 질환이다. 이 표현형은 RA와 몇가지 유사성이 있다: 류마티스성 인자가 양성인 몇몇 환자들은 유년형 류마티스성 관절염으로서 분류된다. 이 질환은 소수관절성(小數關節性), 다관절성 및 전신성의 3가지 주요 범주로 세분된다. 관절염은 중증일 수 있고, 통상적으로는 파괴적이며, 관절 강직 및 성장 지연을 초래한다. 다른 징후로는 만성 전포도막염 및 전신성 유전분증이 있다.

척추관절증은 HLA-B27 유전자 생성물의 발현과 몇몇 공통적인 임상적 특징 및 공통된 관련성을 갖는 장애군이다. 이러한 장애로는 강직성 척추염, 라이터 증후군(Reiter's syndrome) (반응성 관절염), 염증성 장 질환과 관련된 관절염, 건선과 관련된 경화증, 유년형 개시 척추관절증 및 비분화 척추관절증. 구별되는 특징으로는 척추염이 있거나 없는 천장골염; 염증성 비대칭 관절염; HLA-B27과의 관련성 (클래스 I MHC의 HLA-B 유전자좌의 혈청학적으로 한정된 대립유전자); 안구 염증, 및 다른 류마티스성 질환과 관련된 자가항체의 부재가 포함된다. 질환 유도의 핵심으로 가장 많이 관련된 세포는 CD8+ T 림프구이고, 이 세포는 제I 클래스 MHC 분자에 의해 제시되는 항원을 표적으로 한다. CD8+ T 세포는 제I 클래스 MHC 대립유전자 HLA-B27에 대해서 MHC 클래스 I 분자에 의해 발현된 외래 펩티드인 것처럼 반응할 수 있다. HLA-B27의 에피토프는 박테리아 또는 다른 미생물의 항원성 에피토프를 모방할 수 있어서 CD8+ T 세포 반응을 유도할 수 있을 것으로 추정된다.

전신성 경화증 (경피증)의 병인(病因)은 알려져 있지 않다. 이 질환의 징후는 피부 경화이고, 이는 활성 염증 과정에 의해 유도되기 쉽다. 경피증은 국부적 또는 전신적일 수 있다; 혈관 병변은 공통적이고, 미소혈관계에서의 내피 세포 손상이 전신성 경화증의 발생의 주요한 초기 사건이며, 혈관 손상은 면역-매개성일 수 있다. 피부 병변에서의 단핵세포 침윤의 존재 및 다수의 환자에서의 항-핵 항체의 존재에 의해 면역학적 근거가 암시된다. ICAM-1은 종종 피부 병변에 있는 섬유아세포의 세포 표면 상에서 상향조절되며, 이것은 이들 세포와 T 세포와의 상호작용이 질환의 병원에 소정의 역할을 할 수 있음을 시사한다. 다른 관련 기관으로는 위장관 (비정상적인 연동운동/운동성을 초래하는 섬유증 및 평활근 위축); 신장 (소궁상동맥(小弓狀動脈) 및 소엽간동맥(小葉間動脈)에 영향을 주어 결과적으로 신장 피질 혈류를 감소시키는 동심성 내피하층의 내막 증식은 단백뇨, 질소혈증 및 고혈압을 초래함); 골격근 (위측, 간질성 섬유증); 염증; 폐 (간질성 폐렴 및 간질성 섬유증); 및 심장 (수축 밴드 괴사, 반흔형성(班痕形成)/섬유증)이 있다.

피부근염, 다발성 근염 등을 비롯한 특발성 염증성 근장애는 병인이 알려져 있지 않은 만성 근육 염증 장애이며, 근육 약화를 초래한다. 근육 손상/염증은 종종 대칭적이고 진행성이다. 자가항체는 대부분의 형태와 연관이 있다. 이러한 근염(筋炎)-특이적 자가항체는 단백질 합성과 관련된 성분, 단백질 및 RNA에 대해 유도되어 이들의 기능을 억제한다.

쇼그렌 증후군은 면역-매개성 염증 및 이후의 눈물샘 및 침샘의 기능적 파괴에 기인한다. 이 질환은 염증성 결합 조직 질환과 관련되거나 이에 수반된다. 이 질환은 Ro 및 La 항원 (이 둘 모두가 작은 RNA-단백질 복합체임)에 대한 자가항체 생성과 관련되어 있다. 병변은 담도성경변증, 말초 또는 감각 신경병증 및 촉지성 자반병을 비롯한 다른 징후 또는 관련성을 갖는, 건성각결막염, 구강건조증(口腔乾燥症)을 초래한다.

전신성 맥관염은 1차 병변이 염증이고, 그 후에 혈관을 손상시켜 이런 영향을 받은 혈관에 의해 공급되는 조직에 허혈/괴사/퇴행을 초래하고, 몇몇 경우에서는 사실상의 말단 기관 기능부전을 초래하는 질환이다. 또한, 맥관염은 류마티스성 관절염, 전신성 경화증 등의 다른 면역 염증-매개성 질환, 특히 면역 복합체 형성과도 관련된 질환의 2 차 병변 또는 후유증으로서 발생할 수도 있다. 1차 전신성 맥관염 군에 속하는 질환으로는 전신성 괴사 맥관염: 결절성 다발 동맥염, 알레르기성 맥관염 및 육아종증, 다발성 맥관염; 베게너 육아종증; 림프종양 육아종증; 및 거대세포 동맥염이 있다. 기타 맥관염으로는 피부점막 림프절 증후군 (MLNS 또는 가와사키병(Kawasaki's disease)), 단리된 CNS 맥관염, 베체트병(Bechet's disease), 폐색성 혈전맥관염 (뵈르거병) 및 피부 괴사성 정맥염이 있다. 열거된 맥관염 유형 중 대부분의 병원성(病原性) 메카니즘은 주로 혈관벽에서의 이뮤노글로불린 복합체의 침착 및 그 후의 ADCC, 상보체 활성화, 또는 둘 다를 통한 염증 반응의 유도에 기인하는 것으로 여겨진다.

유육종증은 체내 거의 모든 조직에서의 상피양 육아종증의 존재를 특징으로 하는, 병인이 알려져 있지 않은 증상이며, 폐가 관련된다는 점이 가장 공통적이다. 병원은 환부에서 활성화된 대식세포 및 림프양 세포 존속을 수반하며, 이들 세포 유형에 의해 방출된 국부적 및 전신적 활성 생성물의 방출로부터 야기되는 후속 만성 후유증을 갖는다.

자가면역 용혈성 빈혈, 면역성 범혈구감소증 및 발작성 야간혈색소뇨증을 포함하는 자가면역 용혈성 빈혈은 적혈구 (몇몇 경우에는, 혈소판과 같은 다른 혈액 세포)의 표면에서 발현되는 항원과 반응하는 항체가 생성되어 야기된 결과이고, 상보체-매개성 용해작용 및/또는 ADCC/Fc 수용체-매개성 메카니즘을 통해 이러한 항체로 코팅된 세포를 제거한 결과이다.

임상 상태가 다른 면역-매개성 혈소판감소증 및 혈소판감소성자반병을 포함하는 자가면역성 혈소판감소증에서, 혈소판 파괴/제거는 혈소판에 대한 항체 또는 상보체 부착 및 그후의 상보체 용해작용, ADCC 또는 Fc 수용체 매개 메카니즘에 의한 제거의 결과로서 발생한다.

그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 유년형 림프종성 갑상선염, 및 위축성 갑성선염을 포함하는 갑상선염은 갑상선에 존재하고 종종 갑상선에 특이적인 단백질과 반응하는 항체의 생성으로 갑상선 항원에 대한 자가면역 반응의 결과이다. 실험 모델은 다음과 같은 모델들을 포함한다: 래트 (BUF 및 BB 래트) 및 닭 (비만 닭 종류 (strain)); 유도가능한 모델-티로글로불린, 갑상선 미소체 항원 (갑상선 퍼옥시다제)을 사용한 동물의 면역화.

제1 형 진성당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병은 췌장도(膵臟島) β세포의 자가면역 파괴인데, 이러한 파괴는 자가항체 및 자가반응성 T 세포에 의해 매개된다. 또한, 인슐린 또는 인슐린 수용체에 대한 항체는 인슐린 비반응성의 표현형을 생성할 수 있다.

사구체신염 및 세뇨관간질성 신염을 포함하는 면역-매개성 신장 질환은 직접적으로 신장 항원에 대한 자가반응성 항체 또는 T 세포의 생성 결과이거나, 간접적으로 신장에서 다른, 비신장 항원에 반응성인 항체 및/또는 면역 복합체 침착의 결과로서, 신장 조직에 대한 항체 또는 T 림프구-매개성 손상의 결과이다. 그러므로, 면역 복합체의 형성을 초래하는 다른 면역-매개성 질환은 간접적인 후유증으로 면역-매개성 신장 질환을 유도할 수도 있다. 직접 및 간접 면역 메카니즘 모두가 신장 조직에서 병변 발생을 생성/유도하는 염증성 반응을 초래하여 기관 기능 손상 및 몇몇 경우에는 신부전(腎不全)으로의 진행을 초래하게 된다. 체액성 및 세포성 면역 메카니즘 둘 모두가 병변의 병원에 관련될 수 있다.

다발성 경화증, 특발성 탈수초 다발성 신경염 또는 길랑-바레 증후군 및 만성 염증성 탈수초 다발성 신경염을 비롯한 중추신경계 및 말초신경계의 탈수초 질환은 자가면역원성이며, 희소돌기아교세포 또는 마이엘린에 직접 발생되는 손상의 결과로서 신경의 탈수초를 초래한다고 여겨진다. 다발성 경화증에서, 질환 유도 및 진행은 T 림프구에 의존적임을 제안하는 증거가 있다. 다발성 경화증은 T 림프구 의존성이고 재발-이장 과정 또는 만성 진행성 과정을 갖는 탈수초 질환이다. 병인은 알려져 있지 않지만, 바이러스 감염, 유전적 소인, 환경 및 자가면역성 모두가 기여한다. 병변은 주로 T 림프구 매개성, 소교세포(小膠細胞) 및 침윤성 대식세포의 침윤물을 함유하고, CD4+ T 림프구는 병변에서의 주된 세포 유형이다. 희소돌기아교세포의 사멸 및 이후의 탈수초 메카니즘은 알려져 있지 않지만, T 림프구에 의한 것으로 보인다.

호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증 및 과민성 폐렴을 비롯한 염증성 및 섬유성 폐 질환은 조절장애성 면역 염증 반응을 포함할 수 있다. 이러한 반응의 억제는 치료적으로 유익할 것이다.

수포성 피부 질환, 다형성 홍반 및 접촉성 피부염을 비롯한 자가면역 또는 면역-매개성 피부 질환은 자가-항체에 의해 매개되고, 이의 병원은 T 림프구 의존성이다.

건선은 T 림프구-매개성 염증성 질환이다. 병변은 T 림프구, 대식세포 및 항원 프로세싱 세포 및 몇몇 호중구의 침윤물을 포함한다.

천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증 및 두드러기를 비롯한 알레르기성 질환은 T 림프구 의존성이다. 이들 질환은 주로 T 림프구 유도성 염증, IgE 매개성 염증 또는 이 둘 모두의 조합에 의해 매개된다.

이식 거부반응 및 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)을 비롯한 이식 관련 질환은 T 림프구 의존성이고, T 림프구 기능을 억제하여 개선되었다.

면역 및/또는 염증 반응의 개입이 유익한 다른 질환으로는 바이러스 감염 (AIDS, A, B, C, D, E형 간염 및 허피스를 포함하나 이것으로 한정되는 것은 아님), 박테리아 감염, 진균성 감염, 및 원생동물 감염 및 기생충 감염 (MLR을 자극하는 분자 (또는, 유도체/효능제)는 감염제에 대한 면역 반응을 증대시키기 위해 치료적으로 이용될 수 있음), 면역 결핍 질환 (MLR을 자극하는 분자/유도체/효능제는 유전적, 후천적, (HIV 감염에서와 같은) 감염 유도적 상태, 또는 의원성(醫原性) (즉, 화학요법 등으로 인한) 면역결핍 상태에 대한 면역 반응을 증대시키기 위해 치료적으로 이용될 수 있음), 및 신생물을 포함하지만 이것으로 한정되지 않는 감염성 질환이다.

일부 인간 암 환자는 신생물 세포에서 항원에 대한 항체 및/또는 T 림프구 반응을 발생시키는 것이 입증되어 있다. 또한, 신생물 형성의 동물 모델에서 면역 반응의 증대가 특정 신생물을 거부 또는 억제할 수 있다는 것이 밝혀져 있다. MLR에서 T 림프구 반응을 증대시키는 분자는 신생물 형성에 대한 면역 반응을 증대시키는 생체내 유용성을 갖는다. 암 치료를 위해, MLR에서 T 림프구 증식성 반응을 증대시키는 분자 (또는, 동일한 수용체에 효능제 방식으로 영향을 미치는 소분자 효능제 또는 항체)를 치료 목적으로 사용할 수 있다. MLR에서 림프구 반응을 억제하는 분자는 또한 신생물이 형성되는 동안 생체내에서 신생물에 대한 면역 반응을 억제하는 기능을 하며, 이러한 분자는 신생물 세포 그 자체에 의해 발현되거나 또는 다른 세포에서 신생물에 의해 유도될 수 있다. 이러한 억제 분자의 길항 작용은 (항체, 소분자 길항제 또는 다른 수단과 함께) 면역-매개성 종양 거부반응을 증대시킨다.

또한, 염증전 특성을 갖는 분자의 억제는 재관류 손상, 졸중, 심근 경색, 아테롬성 동맥경화증, 급성 폐 손상, 출혈성 쇼크, 화상, 패혈증/패혈성 쇼크, 급성 관상 괴사, 자궁내막증, 퇴행성 관절 질환 및 췌장염에서 치료적으로 유익할 수 있다.

본 발명의 화합물, 예를 들면 폴리펩티드 또는 항체는 볼루스로서 또는 소정의 기간 동안의 연속 주입에 의한 정맥내 투여와 같은 공지의 방법에 따라, 또는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 동맥내, 활액낭내, 포막내, 경구, 국소 또는 흡입 (비내, 폐내) 경로에 의해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 폴리펩티드 및 항체의 정맥내 또는 흡입 투여가 바람직하다.

면역보강제 요법에서, 항암제 투여와 같은 다른 치료 처방이 본 발명의 단백질, 항체 또는 화합물의 투여와 병행될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 면역보강제로 치료되는 환자는 항암제 (화학요법제) 또는 방사성 요법도 받을 수도 있다. 이러한 화학요법제를 위한 제제 및 투약 스케쥴은 제조업자의 지시에 따라 또는 당업자가 실험적으로 결정하여 사용할 수 있다. 이러한 화학요법을 위한 제제 및 투약 스케쥴은 또한 문헌 [Chemotherapy Service, M. C. Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에도 기재되어 있다. 화학요법제는 면역보강제 투여 이전 또는 이후에 투여되거나 이와 동시에 투여될 수 있다. 부가적으로, 타목시펜과 같은 항에스트로겐 화합물 또는 오나프리스톤 (EP 616812 참조)과 같은 항프로게스테론은 상기 분자에 대해 공지된 투여량으로 제공될 수 있다.

또한, CD20, CD11a CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, 또는 혈관 내피 인자 (VEGF)에 결합하는 항체와 같은 다른 면역 질환 관련 또는 종양 관련 항원에 대한 항체를 투여하는 것이 바람직할 수도 있다. 다르게는 또는 부가적으로, 본원에 개시된 동일하거나 2가지 이상의 상이한 항원에 결합하는 2가지 이상의 항체를 환자에게 동시투여할 수 있다. 또한, 때로는 환자에게 하나 이상의 사이토카인을 투여하는 것이 유익할 수 있다. 한 실시양태에서, PRO87299 폴리펩티드를 성장 억제제와 동시에 투여한다. 예를 들면, 성장 억제제를 먼저 투여한 후에 PRO87299 폴리펩티드를 투여할 수 있다. 그러나, 동시에 투여하거나 또는 PRO87299 폴리펩티드를 먼저 투여하는 것도 고려된다. 성장 억제제의 적합한 투여량은 현재 사용되고 있는 투여량이며, 성장 억제제와 PRO87299 폴리펩티드의 조합 작용 (상승 작용) 때문에 감소시킬 수도 있다.

면역 관련 질환의 치료 또는 중증도를 완화시키기 위해, 본 발명의 화합물의 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같이 치료할 질환의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 상기 작용제가 예방 목적으로 투여되는지 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 상기 화합물에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 상기 화합물은 한 번에 또는 일련의 처치를 통해 환자에게 적합하게 투여된다.

예를 들면, 질환의 유형 및 중증도에 따라, 폴리펩티드 또는 항체 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들면, 0.1 내지 20 mg/kg)이 예를 들면, 1회 이상의 별도의 투여에 의해, 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 통상적인 일일 투여량은 상기 언급된 요인에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 상태에 따라 수일 이상에 걸쳐 반복 투여하는 동안, 질환의 증세가 원하는 정도로 억제될 때까지 처치를 지속한다. 그러나, 다른 투여 처방이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행 상황은 통상적인 기술 및 분석법으로 용이하게 모니터링된다.

O. 제조 용품

본 발명의 또다른 실시양태에서, 상기 기술된 장애의 진단 또는 치료에 유용한 물질 (예를 들면, PRO87299 분자)을 함유하는 제조 용품이 제공된다. 제조 용품은 용기 및 지침을 포함한다. 적합한 용기로는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 및 시험관 등이 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 제조할 수 있다. 이러한 용기에는 상태의 진단 또는 치료에 효과적인 조성물이 들어 있으며, 멸균된 입구를 가질 수 있다 (예를 들면, 상기 용기는 정맥내 용액제 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 이러한 조성물 중의 활성 제제는 통상적으로 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체이다. 지침 또는 라벨이 있거나 이와 관련된 용기는 이 조성물이 선택된 상태의 진단 또는 치료에 사용된다는 것을 표시한다. 제조 용품은 인산염-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 비롯한 제약상 허용되는 완충액을 포함하는 제2 용기를 더 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 지침이 있는 포장 삽입물을 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 더 포함할 수 있다.

P. 면역 관련 질환의 진단 및 예후

특정 면역 관련 질환에서 과다발현된 단백질과 같은 세포 표면 단백질은 약물 후보물질 또는 질환 치료를 위한 훌륭한 표적이다. 상기 단백질은 면역 관련 질환 상태에서 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 분비 단백질과 함께 상기 질환의 진단 및 예후에도 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염 또는 다른 면역 관련 질환에서 증폭된 유전자의 단백질 생성물에 대해 지시된 항체를 진단 또는 예후에 사용할 수 있다.

예를 들면, 항체 단편을 포함하는 항체를 사용하여 증폭되거나 과다발현된 유전자 ("마커 유전자 산물")에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 정성적 또는 정량적으로 검출할 수 있다. 항체는, 예를 들어 형광 표지 등의 검출가능한 표지가 장착되는 것이 바람직하고, 광학 현미경법, 유동세포측정법, 형광측정법, 또는 당업계에 공지된 다른 기술로 결합을 모니터링 할 수 있다. 이들 기술은 과다발현된 유전자가 세포 표면 단백질을 코딩하는 경우에 특히 적합하다. 이러한 결합 분석은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행한다.

마커 유전자 생성물에 결합하는 항체의 제자리 검출을 예를 들면, 면역형광법 또는 면역전자현미경법으로 수행할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 환자로부터 조직학적 표본을 취해, 표지된 항체를 바람직하게는 생물학적 샘플 상에 그 항체를 올려놓아 적용시킨다. 또한, 이러한 절차에 의해 조사되는 조직에서의 마커 유전자 산물의 분포를 결정할 수 있다. 당업자에게는 광범위한 조직학적 방법이 제자리 검출에 용이하게 이용가능함이 명백할 것이다.

하기 실시예는 오직 설명을 위한 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로도 제한하고자 함이 아니다.

본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고 문헌은 그 거명을 통해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

실시예에서 언급한 시판 시약들은 달리 지시하지 않는 한 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예와 명세서 전반에서 ATCC 기탁번호로 확인되는 세포들의 공급원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 버지니아주 매나서스 소재)이다.

실시예 1: PRO87299 클로닝

발현된 서열 태크 (EST) DNA 데이타베이스 (미국 워싱턴 유니버시티 소재의 머크(Merck))를 검색하여 대상 도메인, 특히 이뮤노글로불린(Ig) 도메인(들) 및 이뮤노 티로신 억제 모티프(들) (ITIM)을 함유하는 EST를 확인하였다. 검색은 대상 도메인을 서열의 6가지 프레임 전사체와 대조하는 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2 (문헌 [Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)])를 이용하여 수행하였다. 이러한 비교에서 BLAST 스코어가 70 (또는, 일부 경우에는 90) 이상 (공지된 단백질을 코딩하지 않음)인 서열을 모아, 필요에 따라 프로그램 "프랩(phrap)" (미국 워싱턴주 시애틀 워싱턴 유니버시티 소재의 필 그린(Phil Green))을 이용하여 공통 DNA 서열로 집합시켰다.

상기 기재된 서열에 기초하여, 1) PCR로 대상 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 확인하고, 2) PRO87299에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위해 프로브로 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 정방향 및 역방향 PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30개 뉴클레오티드 범위이며, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 생성물을 생성하도록 고안된다. 프로브 서열의 길이는 통상적으로 40 내지 55 bp이다. 몇몇 경우에, 공통 서열이 약 1 내지 1.5 kbp를 초과하면 추가의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 전장 클론에 대해 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 라이브러리로부터의 DNA를 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 상기 문헌]에 따라 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 의해 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용하고 프로브 올리고뉴클레오티드 및 한 쌍의 프라이머를 사용하여 대상 유전자를 코딩하는 클론을 단리하였다.

사용되는 올리고뉴클레오티드 프로브는 다음과 같다:

정방향 프라이머:

hBTig.EcoRI.F2 5' TTGAATTCATGAAGACATTGCCTGCCATGC 3' (서열 11)

역방향 프라이머:

hBTig.BamHI.R2 5': TTGGATCCTTAACTCCTCACACATATGGATGCATATTC 3' (서열 12)

인간 혈액 cDNA 라이브러리를 클로닝에 사용하였다. cDNA 클론의 단리에 사용되는 cDNA 라이브러리는 인비트로젠(Invitrogen) (미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)에서 시판하는 것과 같은 시판되는 시약을 사용하여 표준 방법에 의해 제작하였다. cDNA를 NotI 부위를 함유하는 올리고 dT로 프라이밍하고, SalI 헤미키나제 처치된 어답터에 블런트로 연결하고, NotI으로 절단하고, 적절하게는 겔 전기영동에 의해 크기에 따라 분류하고, 적합한 클로닝 벡터 (예컨대 pRKB 또는 pRKD; 여기서 pRK5B는 SfiI 부위를 함유하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 [Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991)] 참조)의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 지정된 방향으로 클로닝하였다.

본원에서 DNA332467로 지칭되는 클론의 전체 뉴클레오티드 서열을 도 1 (서열 1)에 나타내었다. DNA332467 클론은 뉴클레오티드 위치 24 내지 26에 식별가능한 번역 개시 부위를 갖고 뉴클레오티드 위치 891 내지 893에 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 함유한다 (도 1, 서열 1). 예상되는 폴리펩티드 전구체는 289개 아미노산 길이이고, 계산된 분자량은 대략 32781 달톤이며, pI는 대략 6.27로 추정된다. 도 2 (서열 2)에 도시한 전장 PRO87299 서열의 분석 결과는 도 2에 나타낸 바와 같이 다양한 중요 폴리펩티드 도메인이 존재한다는 것을 입증하며, 이들 폴리펩티드 도메인에 주어진 위치는 기재된 곳에 근접하다.

도 2 (서열 2)에 도시한 전장 서열의 ALIGN-2 서열 정렬 분석을 이용하는 최근의 단백질 데이타베이스 분석은 PRO87299 아미노산 서열과 알려지지 않은 단백질 서열 사이의 서열 동일성을 입증한다.

실시예 2: PRO87299 변이체 클로닝

PRO87299를 16가지 상이한 공여자로부터의 B-세포 RNA에서 서열 변이체에 대해 스크리닝하였다. RT-PCR을 상기 RNA에서 수행하여 전장 PRO87299를 제조하였다. PCR 생성물을 고처리량 서열분석을 허용하는 벡터에 클로닝하고, 이중-통과 서열분석에 의해 분석하였다. 몇몇 PRO87299 변이체는 최소의 변이를 나타내었다 (도 11A 내지 11F). 그러나, 막횡단 도메인이 결실된 엑손 3이 결여된 말단절단된 형태가 발견되었다 (도 7, 서열 7). 말단절단된 형태는 천연 단백질의 핵산 403 내지 547이 결실되어 변이체 PRO87299 폴리펩티드 (도 8, 서열 8)를 생성하며, 천연 PRO87299가 289개 아미노산 길이인데 반해 이는 241개 아미노산만의 길이를 갖는다. 막횡단 도메인의 결실은 이러한 PRO87299 변이체가 분비 형태라는 것을 의미할 수 있다.

엑손 3의 5' 말단에 18개의 뉴클레오티드 염기쌍이 삽입된 추가의 PRO87299 변이체가 발견되었다 (도 9, 서열 9). 이러한 18개 염기쌍의 삽입은 추가의 6가지 아미노산 (AFTNIP)을 코딩하며, PRO87299 코딩 핵산에 프레임에 맞게 삽입되어 295개 아미노산 길이의 변이체 PRO87299 폴리펩티드를 생성한다 (도 10, 서열 10). 짧은 형태 및 AFTNIP 형태 둘 모두를 도 12A 내지 12B에 다른 변이체와 함께 도시하였다.

모든 PRO87299 폴리펩티드의 아미노산 51 내지 117에서 발견되는 IgG 도메인은 PRO87299 폴리펩티드의 기능에 중요할 수 있다.

실시예 3: 자극시킨 T-세포의 마이크로어레이 분석

핵산 마이크로어레이 (수천개의 유전자 서열을 함유하기도 함)는 정상적인 대응 조직에 비해 환부 조직에서 상이하게 발현되는 유전자를 확인하는데 유용하다. 핵산 마이크로어레이를 이용하여, 시험 및 대조군 조직 샘플로부터의 시험 및 대조군 mRNA 샘플을 역전사시키고, 표지하여 cDNA 프로브를 제작하였다. 이어서, cDNA 프로브를 고체 지지체에 고정화시킨 핵산의 배열에 혼성화시켰다. 배열의 각 구성원의 서열 및 위치를 알 수 있도록 배열을 형성하였다. 예를 들면, 특정 질환 상태에서 발현되는 것으로 알려진 유전자로 선별된 것을 고체 지지체에 배열시킬 수 있다. 특정 배열 구성원으로 표지된 프로브의 혼성화는 상기 프로브가 유래된 샘플이 상기 유전자를 발현시킨다는 것을 나타낸다. 시험 (이 경우에는, 활성화된 CD4+ T 세포) 샘플로부터의 프로브의 혼성화 신호가 대조군 (이 경우에는, 자극시키지 않은 CD4+ T 세포) 샘플로부터의 프로브의 혼성화 신호보다 더 큰 경우, 시험 조직에서 과다발현되는 유전자(들)을 확인하였다. 이러한 결과는 시험 조직에서 과다발현되는 단백질이 질환 상태의 존재 여부를 진단하는 마커로서 뿐만 아니라 질환 상태의 치료를 위한 치료 표적으로서도 유용하다는 것을 의미한다.

핵산의 혼성화 방법 및 마이크로어레이 기술은 당업계에 공지되어 있다. 한가지 예로, 혼성화용 핵산, 프로브, 슬라이드의 구체적인 제조법, 및 혼성화 조건은 모두 PCT 특허 출원번호 PCT/US01/10482 (2001년 3월 30일 출원, 상기 문헌은 그 거명을 통해 본원에 참고로 포함됨)에 상세하게 기재되어 있다.

상기 실험에서, CD4+ T 세포는 단리된 CD4+ T 세포 집단을 생성하는데 사용되는 항-CD8, 항-CD16, 항-CD19, 항-CD36 및 항-CD56 항체를 함유하는 단일 공여자로부터 로제트셉 (RossetteSep; 상표명) 프로토콜 (캐나다 브리티시 컬럼비아주 밴 쿠버 소재의 스텝 셀 테크놀로지스(Stem Cell Technologies))을 이용하여 정제하였다. 단리된 CD4+ T 세포를 ICAM-1 또는 항-CD28 항체와 함께 항-CD3 항체 (증식을 자극하지 않은 농도로 사용됨)로 활성화시켰다. 제24시간 또는 제72시간에 세포를 수확하여, RNA를 추출하고, 아피맥스(Affimax; 상표명) (미국 캐리포니아주 산타 클라라 소재의 아피메트릭스 인크.(Affymetrix Inc.)) 마이크로어레이에서 분석을 수행하였다. 자극시키지 않은 (휴면) 세포를 정제 직후에 수확하여 동일한 분석을 수행하였다. 활성화된 세포 대 휴면 세포에서의 두 시점 중 한 시점에서 발현이 상향조절되는 유전자를 비교하였다.

상기 실험의 결과는 본 발명의 PRO87299 폴리펩티드가 단리된 휴면 CD4+ T 세포에 비해 항-CD3/ICAM-1 및 항-CD3/항-CD28에 의해 활성화된 단리된 CD4+ T 세포에서 유의하게 과다발현된다는 것을 나타낸다. 상기 기재된 바와 같이, 이들 데이타는 본 발명의 PRO87299 폴리펩티드가 1종 이상의 면역 장애의 존재 여부를 진단하는 마커로서 뿐만 아니라 상기 면역 장애의 치료를 위한 치료 표적으로 사용하기 유용하다는 것을 입증한다.

실시예 4: 림프종에서의 PRO87299

림프종은 미국에서 6번째로 가장 흔한 악성 종양이다. 1990년에 미국에서 43,000가지의 새로운 림프종 사례가 나타난 것으로 추정된다. 비-호지킨 림프종이 상기 사례의 대다수를 차지하며, 호지킨 림프종은 큰 차이로 2위를 차지한다. 비-호지킨 림프종의 발병률은 연령이 증가함에 따라 점차 증가한다. 그러나, 호지킨병은 20 내지 30세 연령의 환자에서 발병률이 높으며, 30 내지 55세 연령의 환자에 서는 발병률이 증가하지 않다가 55세 이후에 다시 증가한다. 남성이 여성보다 호지킨병 및 비-호지킨 림프종 둘 모두에 걸릴 위험이 더 높다. 악성 림프종의 주요 임상적 징후는 림프절의 팽윤, 및 발열, 불안감 및 체중 감소와 같은 징후이다. 림프종의 통상적인 원발성 부위는 쇄골상, 겨드랑이, 종격동, 대동맥주위, 자궁경부 및 서혜부 림프절을 포함한다. 림프종은 또한 다른 기관으로 전이될 가능성이 있다.

호지킨병은 1832년에 토마스 호지킨(homas Hodgkin)에 의해 최초로 기술되었다. 호지킨병은 림프계 세포가 무한증식하는 것이며, 이는 점점 더 커지며 풍부한 담세포질 및 거대한 핵소체를 함유하는 2가지 이상의 타원형 소엽상 핵을 갖는다. 이러한 외관을 나타내는 세포는 리드-스턴버그(Reed-Sternberg) 세포로 알려져 있다. 리드-스턴버그 세포는 호지킨병의 진단에 중요하지만, 이들의 존재만으로는 충분히 진단할 수 없다. 호지킨병은 세포 유형, 림프절 조직 구조, 및 발열과 같은 징후에 의해 비-호지킨 림프종과 구별된다. 호지킨병은 일반적으로 말초 림프절의 단일군이 확대된 형태로 존재하며, 인접하는 결절을 포함할 수 있으나 간혹 림프절외에 존재한다. 호지킨병의 원인은 알려져 있지 않지만, 선행 기술의 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스 감염 및 bcl-2 전위가 호지킨병의 발생과 관련이 있다.

비-호지킨 림프종은 림프절에서 발생하는 면역계 신생물이지만, 세포 유형 및 환자에서 나타나는 징후와 같은 요인에 의해 호지킨병과 구별된다. 대부분의 비-호지킨 림프종은 B 세포 표현형을 나타내며, 마커 CD19 및 CD20에 대해 양성이 다. 보다 적은 수의 비-호지킨 림프종은 T 세포 림프종이며, 마커 CD2 및 CD3에 대해 양성이다.

PRO87299 폴리펩티드 (및 그의 코딩 핵산)가 정상적인 림프 조직에 비해 림프종에서 유의하게 상향조절되는지 여부를 확인하기 위해, 유전자 발현 정보를 함유하는 독점 데이타베이스 (진익스프레스(GeneExpress; 등록상표), 미국 메릴랜드주 게더스버그 소재의 진 로직 인크.(Gene Logic Inc.))를 분석하였다. 특히, 진익스프레스(등록상표) 데이타베이스와 함께 사용하는 진 로직 인크. (미국 메릴랜드주 게더스버그 소재)에서 시판되는 소프트웨어를 이용하거나, 진익스프레스(등록상표) 데이타베이스와 함께 사용하는 제넨테크 인크.에서 설계 및 개발한 독점 소프트웨어를 이용하여 진익스프레스(등록상표) 데이타베이스 분석을 수행하였다. 분석에서 양성 히트(hit) 평가는, 예를 들면 조직 특이성, 종양 특이성, 및 정상적인 필수 조직 및/또는 정상적인 증식 조직에서의 발현 수준을 비롯한 여러 기준에 기초한다. 그 결과는 PRO87299가 다른 종양 및 정상적인 조직에 비해 림프종에서 높게 발현된다는 것을 입증한다.

실시예 5: 염증성 장 질환에서의 PRO87299

본 실험에서, 마이크로어레이 분석을 이용하여 정상적인 장 조직에 비해 IBD에서 과다발현되는 유전자를 조사하였다. IBD 환자로부터 생검을 수득하였다. 각각의 IBD 환자에 대해, 환부 (UC 또는 크론병) 조직 및 건강한 장으로부터 샘플을 채취하여 발현 패턴이 보다 양호하게 대조될 수 있도록 하였다. 모든 샘플을 RNA 단리가 준비될 때까지 -70℃에 보관하였다. 생검을 RLT 완충액 (+ BME) 600 ㎕에 서 균질화시키고, 제조업자의 안내에 따라 컬럼을 DNase 처치한 퀴아젠(Qiagen; 상표명) Rneasy 미니 컬럼 (퀴아젠)을 이용하여 RNA를 단리하였다. RNA 단리 후에, 제조업자의 안내에 따라 리보그린(RiboGreen; 상표명) (몰레큘라 프로브; Molecular Probe)을 이용하여 RNA를 정량하고, 아가로스 겔 상에서 완전성을 확인하였다. 마이크로어레이 분석을 위해 적절한 양의 RNA를 표지하고, 샘플에 대해 독점 제넨테크 마이크로어레이 및 아피메트릭스(상표명) 마이크로어레이를 수행하였다. 정상적인 장 조직에 비해 IBD 조직에서 발현이 상향조절된 유전자를 비교하여, 동일한 환자로부터 수득한 정상적인 장 조직 및 IBD 조직으로부터의 생검을 매치시켰다. 본 실험의 결과는 PRO87299가 정상적인 장 조직에 비해 크론병 샘플에서 유의하게 과다발현되는 것으로 확인되었음을 보여준다.

실시예 6: NK 세포에서의 PRO87299 발현

자연 살해 (NK) 세포는 선천성 면역계의 중요한 이펙터 세포이다. 이들은 바이러스, 기생충에 의해 감염되거나 또는 암이 되는 숙주 세포를 사멸시키는 효과를 특징으로 한다. 표현형질상, NK 세포는 순환 림프구 집단의 2％ 이하를 구성하는 거대 과립 림프구이다. 이들은 공통적으로 CD56 및 CD16의 세포 표면 발현에 의해 확인된다. 이들은 T 세포와 공유하는 CD34+ 전구체 세포로부터 골수에서 성숙된다. 성숙한 NK 세포는 T 세포와 CD8 (세포독성 기작) 및 일부 KIR의 발현을 공유하지만, CD3 및 T 세포 수용체가 결핍되어 있어 T 세포와는 여전히 구별된다. 세포독성 T 세포와 같이, 이들은 세공 형성 단백질, 세포독소, 세린 에스테라제, 및 표적 세포의 용해를 매개하는 프로테오글리칸으로 채워진 과립을 함유한다. 세 포독성 T 세포 및 NK 세포 둘 모두는 표적에 대한 결합에 의해 접촉시 사멸시키고, 표적 세포막에 구멍을 만드는 치사량의 화학 물질 분출물을 전달한다. 세포독성 T 세포와 달리, NK 세포는 세포용해 개시 전에 특이적인 항원을 인식할 필요가 없다. 더욱이, NK 세포 활성화는 성장 인자 및 사이토카인 (특히, IL-2, IL-12 및 IL-15는 증식 및 세포독성 활성을 매개하는 것으로 밝혀짐) 또는 2가지 군의 NK 세포 수용체 (하나의 군은 세포를 활성화시키고, 다른 군은 세포를 억제함) 사이의 섬세한 균형에 의해 매개될 수 있다. 살해 Ig-유사 수용체 (KIR)는 세포 표면에서 제I 클래스 MHC 분자와 만나는 경우 억제 신호를 전달하는 NK 세포 수용체이다. 이는 암성 세포 및 바이러스 감염된 세포 둘 모두를 사멸시키는데 중요하다. 바이러스는 이들이 감염시킨 세포에서 제I 클래스 MHC 발현을 억제하기도 하기 때문에, 바이러스-감염된 세포는 NK 세포에 의해 사멸되기 쉽게 된다. 이와 마찬가지로, 암 세포는 제I 클래스 MHC 발현을 감소시키거나 또는 전혀 발현시키지 않으며, 따라서 이들은 NK 세포에 의해 사멸되기 쉽다. 천연 세포독성 수용체 (NCR)는 NK 세포 상의 활성화 수용체 족을 구성한다. 일부 이펙터-표적 시스템에서, NCR의 표면 밀도는 NK 세포의 세포용해 활성과 서로 관련되어 있는 반면, 다른 시스템에서는 사멸에 NCR, 다른 활성화 수용체 NKG2D 및 그의 어답터 폴리펩티드 DAP10 사이의 협동 작용이 필요하다. 또한, 신호의 강도는 2B4 및 NTB-A와 같은 공수용체의 협력에 의해 영향을 받을 수 있다. NCR 및 NKG2D, 헤모글루타닌 및 MICA, MICB 각각에 대한 리간드는 대부분의 정상적인 세포에 의해서는 발현되지 않지만, 대부분의 종양 세포주에서 유도된다. 종양 세포에 의한 리간드의 발현은 급격한 면역 반응을 촉진 하여 종양 세포 거부반응을 유발한다. IL-15 또는 IL-12로의 NK 세포 활성화는 세포독성 및 증식 효과 둘 모두를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 접합부 접착 분자 2 (JAM2)는 NK 세포에 결합하는 것으로 밝혀졌으며, 염증 부위로의 림프구 분출에 소정의 역할을 담당할 것으로 추정된다.

따라서, 휴면 NK 세포로부터 수득한 유전자의 발현과 상이한 상기 3가지 활성화 방식으로부터 수득한 유전자의 발현을 비교하는 DNA 마이크로어레이 실험은 NK 세포 활성을 갖는 신규한 유전자 또는 신규한 유전자 결합을 나타낼 가능성이 있다. 면역-매개성 염증성 질환 및 악성 종양의 치료를 위해 치료적 항체, 펩티드 또는 소분자를 개발하여 상기 마이크로어레이에 의해 나타난 특정 유전자를 표적화할 수 있다. 말초 혈액 NK 세포는 MACS (상표명) 자성 세포 분류 시스템 (밀테나이 바이오텍(Miltenyi Biotec))을 갖는 NK 세포 단리 키트를 사용하는 음성 선별법에 의해 류코팩(leukopack)으로부터 단리하였다. 세포 순도는 FACS 분석에 사용되는 PE 항-CD56을 사용하는 염색으로 확인하였다. 세포 표본의 순도는 89％ 내지 96％ 범위이다. 세포 배양: 6 웰 플레이트 5 ml 배양물/웰에서 시험관내 배양 구축. 배지: RPMI 1640, 10％ 열-실활된 FBS, 100 유닛/mL의 페니실린, 100 mg/mL의 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 및 5.5×10^-5 β-머캅토에탄올. 실험적 처치: 제0시간 - 처치되지 않은 CD56(+) 세포. 제16시간 - 처치되지 않거나, IL2 (10 nM), IL15 (10 nM), JAM-IT (10 nM) 자극됨. NK 세포의 활성화는 CD56 및 CD69의 세포 표면 발현에 대한 FACS에 의해 모니터링하였다. 이러한 일련의 실험에서, PRO87299는 정상적인 휴면 NK 세포에 비해 CD56+ NK 세포에서 발현되는 것으로 결정되었다.

실시예 7: 혼성화 프로브로서의 PRO87299 의 용도

하기 방법은 혼성화 프로브로서의 PRO87299를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 용도를 설명한다.

본원에 개시된 전장 또는 성숙한 PRO87299의 코딩 서열을 포함하는 DNA는 인간 조직 cDNA 라이브러리 또는 인간 조직 게놈 라이브러리에서 상동성 DNA (예컨대, 자연발생적 PRO87299 변이체를 코딩하는 DNA)에 대한 스크리닝 프로브로 이용하였다.

혼성화, 및 어느 한 라이브러리 DNA를 함유하는 필터의 세척은 다음과 같은 고엄격도 조건 하에서 수행하였다. 방사성 표지된 PRO87299-유래 프로브의 필터로의 혼성화는 50％ 포름아미드, 5×SSC, 0.1％ SDS, 0.1％ 피로인산나트륨, 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 2×덴하르트 용액, 및 10％ 덱스트란 술페이트의 용액에서 42℃로 20 시간 동안 수행하였다. 필터의 세척은 0.1×SSC 및 0.1％ SDS의 수용액에서 42℃로 수행하였다.

이어서, 천연 전장 서열 PRO87299를 코딩하는 DNA와의 원하는 서열 동일성을 갖는 DNA는 당업계에 공지된 표준 기술을 이용하여 확인할 수 있었다.

실시예 8: 이. 콜라이에서의 PRO87299 의 발현

본 실시예는 이. 콜라이에서의 재조합적 발현에 의해 비글리코실화된 형태의 PRO87299를 제조하는 방법을 설명한다.

먼저 선택된 PCR 프라이머를 이용하여 PRO87299를 코딩하는 DNA 서열을 증폭시켰다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 상응하는 제한 효소 부위를 함유해야 한다. 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예로는 앰피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하는 pBR322 (이. 콜라이에서 유래; 문헌 [Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)] 참조)가 있다. 벡터를 제한 효소로 절단하고 탈인산화시켰다. 이어서, PCR 증폭된 서열을 벡터에 라이게이션시켰다. 벡터는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리-His 리더 (처음 6개의 STII 코돈, 폴리-His 서열 및 엔테로키나제 절단 부위를 포함), PRO87299 코딩 영역, 람다 전사 터미네이터 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 것이다.

그 후, 라이게이션 혼합물을 사용하여 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 방법을 이용하여 선택된 이. 콜라이 균주를 형질전환시켰다. LB 플레이트에서의 성장 능력으로 형질전환체를 확인한 후에 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선별하였다. 플라스미드 DNA를 제한 분석법 및 DNA 서열분석을 이용하여 단리하고 확인할 수 있다.

선택된 클론을 항생제가 보충된 LB 배지와 같은 액체 배양 배지에서 밤새 배양하였다. 이어서, 상기 밤새 배양한 배양물을 더 큰 규모의 배양물에 접종하는데 사용할 수 있다. 이어서, 세포를 원하는 광학 밀도까지 배양하되, 이 때 발현 프로모터가 작동되도록 하였다.

수시간 이상 동안 세포를 배양한 후에 원심분리로 세포를 수확할 수 있다. 원심분리로 얻어진 세포 펠렛을 당업계에 공지된 여러 시약을 사용해서 용해시킬 수 있고, 용해된 PRO87299 폴리펩티드 단백질을 단백질이 강하게 결합하도록 하는 조건 하에 금속 킬레이트 컬럼을 사용하여 정제할 수 있다.

하기 절차를 이용하여 이. 콜라이에서 폴리-His 태그가 부착된 형태로 PRO87299 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 먼저 선택된 PCR 프라이머를 이용하여 PRO87299 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 증폭시켰다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 상응하는 제한 효소 부위, 및 효율적이고 신뢰할 만한 번역 개시, 금속 킬레이트 컬럼을 통한 빠른 정제, 엔테로키나제를 사용한 단백질분해성 제거를 제공하는 다른 유용한 서열을 함유할 것이다. 이어서, PCR 증폭된, 폴리-His 태그가 부착된 서열을 발현 벡터에 라이게이션시키고, 이것을 사용하여 이. 콜라이 숙주 (균주 52 (W3110fuhA (tonA) lon galE rpoHts (htpRts) clpP (lacIq) 기재)를 형질전환시켰다. 우선 형질전환체를 50 ㎎/ml 카르베니실린을 함유하는 LB에서 O.D.600이 3 내지 5에 도달할 때까지 30℃에서 진탕 배양하였다. 이어서, 배양물을 CRAP 배지 (물 500 ml 중에 3.57 g의 (NH₄)₂SO₄, 0.71 g의 시트르산나트륨·2H₂O, 1.07 g의 KCl, 5.36 g의 디프코(Difco) 효모 추출물, 5.36 g의 쉐필드 히카아제(Sheffield hycase) SF 뿐 아니라 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55％ (중량/부피) 글루코스 및 7 mM MgSO₄을 혼합하여 제조함)로 50 내지 100 배 희석하고, 대략 20 내지 30 시간 동안 30℃에서 진탕 배양하였다. 샘플을 채취해 SDS-PAGE 분석법으로 발현을 확인하고 대규모 배양물을 원심분리하여 세포를 펠렛으로 만들 었다. 정제하고 리폴딩시킬 때까지 세포 펠렛을 냉동시켰다.

0.5 내지 1 ℓ 발효액으로부터 수득한 이. 콜라이 페이스트 (펠렛 6 내지 10 g)를 10 배 부피 (중량/부피)의 7 M 구아니딘, 20 mM Tris (pH 8) 완충액에 재현탁시켰다. 고체 아황산나트륨 및 테트라티온산나트륨을 각각 최종 농도 0.1 M과 0.02 M이 되도록 첨가하고 이 용액을 4℃에서 밤새 교반하였다. 이 단계에서 모든 시스테인 잔기가 아황산염화에 의해 차단된 변성 단백질이 생성된다. 이 용액을 벡크만 (Beckman) 초원심분리기로 40,000 rpm에서 30 분간 원심분리하였다. 상층액을 3 내지 5 배 부피의 금속 킬레이트 컬럼 완충액 (6 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 7.4)으로 희석하고 0.22 ㎛ 필터로 여과시켜 정화시켰다. 정화된 추출물을 금속 킬레이트 컬럼 완충액으로 평형화된 5 ml 퀴아젠 Ni-NTA 금속 킬레이트 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 50 mM 이미다졸 (칼바이오켐 (Calbiochem), 우트롤 (Utrol) 등급)을 함유하는 추가의 완충액 (pH 7.4)으로 세척하였다. 단백질을 250 mM 이미다졸을 함유하는 완충액으로 용출시켰다. 원하는 단백질을 함유하는 분획을 모아 4℃에 보관하였다. 아미노산 서열을 기초로 계산된 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서의 흡광도로 단백질 농도를 측정하였다.

새로 제조한 리폴딩 완충액 (20 mM Tris (pH 8.6), 0.3 M NaCl, 2.5 M 우레아, 5 mM 시스테인, 20 mM 글리신 및 1 mM EDTA로 구성됨)으로 샘플을 천천히 희석시켜 단백질을 리폴딩시켰다. 리폴딩 부피는 최종 단백질 농도가 50 내지 100 ㎍/ml가 되도록 정한다. 리폴딩 용액을 4℃에서 12 내지 36 시간 동안 서서히 교반하였다. 최종 농도가 0.4％ (대략 pH 3)가 되도록 TFA를 첨가하여 리폴딩 반응을 켄칭시켰다. 추가로 단백질을 정제하기 전에, 용액을 0.22 ㎛ 필터로 여과시키고 아세토니트릴을 최종 농도 2 내지 10％가 되도록 첨가하였다. 리폴딩된 단백질을 0.1％ TFA의 이동상 완충액을 사용하는 포로스 (Poros) R1/H 역상 컬럼에서 10 내지 80％의 아세토니트릴 구배로 용출하는 크로마토그래피를 수행하였다. A280 흡광도를 보이는 분획의 분취액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하여 균질하게 리폴딩된 단백질을 함유하는 분획을 모은다. 일반적으로, 적절하게 리폴딩된 단백질은 역상 수지와의 상호작용으로부터 가려지는 소수성 내부를 가져서 가장 압축되어 있기 때문에, 대부분의 단백질중에서 적절하게 리폴딩된 단백질 종은 아세토니트릴의 가장 낮은 농도에서 용출된다. 응집된 종은 보통 좀더 높은 아세토니트릴 농도에서 용출된다. 역상 단계는 원하는 형태의 단백질로부터 잘못 폴딩된 형태의 단백질을 분리해 낼 뿐 아니라, 샘플로부터 내독소를 제거하기도 한다.

원하는 폴딩된 PRO87299 폴리펩티드를 함유하는 분획을 모으고, 이 용액에 질소 기류를 서서히 흘려주어 아세토니트릴을 제거하였다. 투석법, 또는 제제화 완충액으로 평형화되고 멸균 여과된 G25 수퍼파인(Superfine) (파마시아) 수지를 사용한 겔 여과법을 이용하여 단백질을 0.14 M 염화나트륨 및 4％ 만니톨을 포함하는 20 mM Hepes (pH 6.8)로 제제화하였다.

본원에 개시된 PRO87299 폴리펩티드는 상기 기재한 바와 같이 성공적으로 발현되었다.

실시예 9: 포유동물 세포에서의 PRO87299 의 발현

본 실시예는 포유동물 세포에서 재조합 발현에 의해 잠재적으로 글리코실화 형태의 PRO87299를 제조하는 방법을 설명한다.

벡터 pRK5 (1989년 3월 15일 공개된 EP 307,247 참조)를 발현 벡터로 사용한다. 임의로는, 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같은 라이게이션 방법을 이용하고 PRO87299 DNA를 선택된 제한 효소를 사용하여 pRK5에 라이게이션시켜 PRO87299 DNA를 삽입시켰다. 생성된 벡터는 pRK5-PRO87299라고 지칭된다.

한 실시양태에서, 선택된 숙주 세포는 293 세포일 수 있다. 인간 293 세포 (ATCC CCL 1573)를 소 태아 혈청 및 임의로는, 영양소 및/또는 항생제가 보충된 DMEM과 같은 배지 중에 조직 배양 플레이트에서 전면성장할 때까지 배양하였다. pRK5-PRO87299 DNA 약 10 ㎍을 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA (문헌 [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)]) 약 1 ㎍과 혼합하고, 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M CaCl₂ 500 ㎕ 중에 용해시켰다. 이 혼합물에 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO₄ 500 ㎕를 적가하고, 25℃에서 10 분 동안 침전물을 형성시켰다. 침전물을 현탁시켜 293 세포에 첨가하고, 37℃에서 약 4 시간 동안 침강시켰다. 배양 배지를 흡인 제거하고 PBS 중의 20％ 글리세롤 2 ml를 30 초 동안 첨가하였다. 이어서, 293 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 신선한 배지를 첨가하고, 세포를 약 5일 동안 인큐베이션하였다.

형질감염 대략 24 시간 후에 배양 배지를 제거하고, 배양 배지 (단독) 또는 200 μCi/ml ³⁵S-시스테인 및 200 μCi/ml ³⁵S-메티오닌을 함유하는 배양 배지로 교체하였다. 12 시간 동안 인큐베이션한 후, 조건화 배지를 수집하고, 스핀 필터에 농축시켜 15％ SDS 겔에 로딩하였다. 처리된 겔을 건조시키고 선택된 시간 동안 필름에 노출시켜 PRO87299 폴리펩티드의 존재를 확인할 수 있다. 형질감염된 세포를 함유하는 배양물을 (무혈청 배지 중에서) 추가로 인큐베이션할 수 있으며, 선택한 생물분석법으로 배지를 시험한다.

다른 기술로, 문헌 [Somparyrac et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 12:7575 (1981)]에 기재되어 있는 덱스트란 술페이트 방법을 이용하여 PRO87299를 293 세포에 일시적으로 도입시킬 수도 있다. 293 세포를 스피너(spinner) 플라스크에서 최고 밀도가 되도록 배양하고 700 ㎍의 pRK5-PRO87299 DNA를 첨가하였다. 우선, 세포를 원심분리하여 스피너 플라스크로부터 농축하고 PBS로 세척한다. DNA-덱스트란 침전물을 4 시간 동안 세포 펠렛 상에서 인큐베이션하였다. 세포를 20％ 글리세롤로 90 초 동안 처리하고 조직 배양 배지로 세척한 후, 조직 배양 배지, 5 ㎍/ml의 소 인슐린 및 0.1 ㎍/ml의 소 트랜스페린을 함유하는 스피너 플라스크에 다시 도입시켰다. 약 4 일 후에 조건화 배지를 원심분리하고 여과시켜 세포와 잔해물을 제거하였다. 이어서, 발현된 PRO87299를 함유하는 샘플을 농축시켜, 임의의 선택된 방법 (예컨대, 투석 및/또는 컬럼 크로마토그래피)으로 정제할 수 있다.

다른 실시양태에서, PRO87299를 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다. pRK5-PRO87299를 공지된 시약 (예컨대, CaPO₄ 또는 DEAE-덱스트란)을 사용하여 CHO 세포로 형질감염시킬 수 있다. 상기한 바 같이, 세포 배양물을 인큐베이션할 수 있고, 배지를 배양 배지 (단독) 또는 ³⁵S-메티오닌과 같은 방사성 표지를 함유하는 배지로 교체할 수 있다. PRO87299 폴리펩티드의 존재를 결정한 후, 배양 배지를 무혈청 배지로 교체할 수 있다. 바람직하게는, 배양물을 약 6일 동안 인큐베이션하고, 조건화 배지를 수확하였다. 이어서, 발현된 PRO87299를 함유하는 배지를 농축하여 임의의 선택된 방법으로 정제할 수 있다.

에피토프 태그가 부착된 PRO87299도 CHO 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. PRO87299를 pRK5 벡터로부터 서브클로닝할 수 있다. 서브클론 삽입체를 PCR을 통해 폴리-His 태그와 같은 선택된 에피토프 태그가 부착된 형태로 배큘로바이러스 발현 벡터에 프레임에 맞게 융합시킬 수 있다. 폴리-His 태그가 부착된 PRO87299 삽입체를 안정한 클론 선별을 위해 DHFR과 같은 선별 마커를 함유하는 SV40 프로모터/인핸서 함유 벡터로 서브클로닝할 수 있다. 최종적으로, CHO 세포를 (상기 기재된 바와 같이) SV40 프로모터/인핸서 함유 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 발현을 확인하기 위해서 상기와 같은 방법으로 표지할 수 있다. 이어서, 폴리-His 태그가 부착된 PRO87299를 함유하는 배양 배지를 농축시켜 Ni² ⁺-킬레이트 친화성 크로마토그래피와 같이 임의의 선택된 방법으로 정제할 수 있다.

PRO87299는 또한 일시적 발현 절차를 통해 CHO 및/또는 COS 세포에서 발현시킬 수 있거나, 다른 안정한 발현 절차를 통해 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다.

하기 절차를 이용하여 CHO 세포에서의 안정한 발현을 수행하였다. 단백질은 각 단백질의 가용성 형태 (예를 들어 세포외 도메인)의 코딩 서열이 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 함유하는 IgG1 불변 영역 서열에 융합된 IgG 작제물 (이뮤노어드헤 신)로서 발현되고/되거나 폴리-His 태그가 부착된 형태이다.

PCR 증폭에 이어 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, Johnn Wiley and Sons (1997)]에 기재된 표준 기술을 이용하여 각 DNA를 CHO 발현 벡터에 서브클로닝하였다. CHO 발현 벡터는 대상 DNA의 5' 및 3'에 적합한 제한 부위를 갖도록 제작되어 cDNA가 편리하게 셔틀링될 수 있다. CHO 세포에서의 발현에 사용되는 벡터는 문헌 [Lucas et al., Nucl . Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996)]에 기재된 바와 같으며, 대상 cDNA와 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 발현시키기 위해 SV40 초기 프로모터/인핸서를 사용한다. DHFR 발현은 형질감염 후 플라스미드의 안정적 유지를 선별할 수 있게 한다.

원하는 플라스미드 DNA 12 ㎍을 시판되는 형질감염 시약 수퍼펙트(Superfect; 등록상표) (퀴아젠), 도스퍼(Dosper; 등록상표) 또는 퓨진(Fugene; 등록상표, 베링거 만하임; Boehringer Mannheim)을 이용하여 대략 1000만개의 CHO 세포에 도입시켰다. 문헌 [Lucas et al., 상기 문헌]에 기재된 방법에 따라 세포를 배양하였다. 대략 3 ×10⁷개의 세포를 하기에 기재된 바와 같은 추후 배양 및 생산을 위해 앰플에 냉동시켰다.

플라스미드 DNA를 함유하는 앰플을 수조에 넣어 해동한 후 볼텍싱하여 혼합하였다. 내용물을 배지 10 ml가 함유된 원심분리 튜브에 피펫으로 넣고 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 흡입해 내고 세포를 10 ml의 선별 배지 (0.2 ㎛ 투석 여과된 5％ 소 태아 혈청을 포함하는 0.2 ㎛ 여과된 PS20)에 재현탁 시켰다. 이어서, 세포를 90 ml의 선별 배지를 함유하는 100 mL 스피너에 분주하였다. 1 내지 2일 후, 세포를 150 mL 선별 배양 배지로 채워진 250 mL 스피너로 옮겨 37℃에서 인큐베이션하였다. 2 내지 3일 후에 250 mL, 500 mL 및 2000 mL 스피너에 3 ×10⁵개 세포/mL를 시딩하였다. 세포 배지를 원심분리하고 생산 배지에 재현탁하여 신선한 배지로 교체하였다. 임의의 적합한 CHO 배지를 사용할 수 있으나, 미국 특허 제5,122,469호 (1992년 6월 16일자로 허여됨)에 기재된 생산 배지를 실제로 사용할 수 있다. 3 L 생산 스피너에 1.2 ×10⁶개 세포/mL가 되도록 시딩하였다. 시딩 당일, pH를 측정하였다. 제1일, 스피너로부터 샘플을 채취하고 여과된 공기의 살포를 개시하였다. 제2일, 스피너로부터 샘플을 채취하고 온도를 33℃로 바꾸고 500 g/L 글루코스 30 ml 및 10％ 소포제 0.6 ml (예를 들어 35％ 폴리디메틸실록산 유액, 다우 코닝(Dow Corning) 365 의약품 등급 유액)를 첨가하였다. 전체 생산기 동안, 필요에 따라 pH를 조정하여 약 7.2 부근에서 유지하였다. 10일 후 또는 생존률이 70％ 미만으로 떨어질 때, 세포 배양액을 원심분리하여 수확하고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 여액을 4℃에 저장하거나, 즉시 컬럼 상에 로딩하여 정제하였다.

폴리-His 태그가 부착된 작제물의 경우, Ni-NTA 컬럼 (퀴아젠)을 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화 배지에 첨가하였다. 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 함유하는 20 mM Hepes (pH 7.4) 완충액으로 평형화된 6 mL Ni-NTA 컬럼 상에 4℃에서 4 내지 5 mL/분의 유속으로 조건화 배 지를 주입하였다. 로딩 후, 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고, 0.25 M 이미다졸을 함유하는 평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4％ 만니톨을 함유하는 보관 완충액 (pH 6.8) 중에서 25 mL의 G25 수퍼파인 (파마시아) 컬럼을 사용하여 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.

이뮤노어드헤신 (Fc를 함유함) 작제물은 다음과 같이 조건화 배지로부터 정제하였다. 조건화 배지를 20 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.8)으로 평형화된 5 mL 단백질 A 컬럼 (파마시아)에 주입하였다. 로딩 후, 컬럼을 평형화 완충액으로 철저하게 세척한 후, 100 mM 시트르산 (pH 3.5)으로 용출하였다. 1 ml의 분획을 275 ㎕의 1 M 트리스 완충액 (pH 9)이 함유된 튜브에 수집함으로써 용출된 단백질을 즉시 중화시켰다. 이어서, 폴리-His 태그가 부착된 단백질에 대해 상술한 바와 같이 보관 완충액 중에서 고도로 정제된 단백질로부터 염을 제거하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔 및 에드만(Edman) 분해법에 의한 N-말단 아미노산 서열분석으로 균질도를 평가하였다.

본원에 개시된 PRO87299 폴리펩티드 중 다수는 상기 기재한 바와 같이 성공적으로 발현되었다.

실시예 10: 효모에서의 PRO87299 의 발현

하기 방법은 효모에서 PRO87299의 재조합적 발현에 대해 설명한다.

우선, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 PRO87299를 세포내 생산 또는 분비하도록 효모 발현 벡터를 제작하였다. PRO87299를 코딩하는 DNA 및 프로모터를 PRO87299 의 세포내 발현 유도를 위해 선택된 플라스미드의 적합한 제한 효소 부위에 삽입하였다. 분비의 경우, PRO87299를 코딩하는 DNA를 PRO87299 발현을 위해 ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 PRO87299 신호 펩티드 또는 다른 포유동물 신호 펩티드, 또는 예를 들어 효모 α-인자 또는 인버타제 분비 신호/리더 서열, 및 링커 서열 (필요에 따라)을 코딩하는 DNA와 함께 선택된 플라스미드에 클로닝할 수 있다.

이어서, 효모 세포 (예컨대, 효모 균주 AB110)를 상기 기재된 발현 플라스미드로 형질전환시키고 선택된 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질전환된 효모 상층액을 10％ 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리한 후 겔을 쿠마시 블루 염로로 염색하여 분석할 수 있다.

이어서, 원심분리에 의해 발효 배지로부터 효모 세포를 제거한 후에, 선택된 카트리지 필터를 사용하여 배지를 농축시킴으로써 재조합 PRO87299를 단리하고 정제할 수 있다. PRO87299를 함유하는 농축액을 선택된 컬럼 크로마토그래피 수지를 사용해서 더 정제할 수 있다.

실시예 11: 배큘로바이러스로 감염된 곤충 세포에서의 PRO87299 의 발현

하기 방법은 배큘로바이러스로 감염된 곤충 세포에서 PRO87299의 재조합 발현에 대해 기술한다.

PRO87299를 코딩하는 서열을 배큘로바이러스 발현 벡터에 함유되어 있는 에피토프 태그의 상류에 융합시켰다. 상기 에피토프 태그는 폴리-His 태그 및 면역 글로블린 태그 (예를 들어, IgG의 Fc 영역)를 포함하고 있다. 시판되는 플라스미드, 예컨대 pVL1393 (노바젠; Novagen)에서 유래한 플라스미드를 비롯한 여러 가지 플라스미드를 사용할 수 있다. 요컨대, PRO87299를 코딩하는 서열 또는 PRO87299의 코딩 서열의 원하는 부분 (예컨대, 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열 또는 단백질이 세포외 단백질이라면 성숙한 단백질을 코딩하는 서열)을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 부위를 혼입시킬 수 있다. 이어서, 생성물을 선택된 제한 효소로 분해하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다.

재조합 배큘로바이러스는 리포펙틴 (깁코-비알엘 (GIBCO-BRL)로부터 시판됨)을 이용하여 상기 플라스미드 및 배큘로골드 (BaculoGold; 상표명) 바이러스 DNA (파밍젠 (Phamingen))를 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) ("Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)에 동시에 형질감염시켜 제조하였다. 28℃에서 4 내지 5일 동안 인큐베이션한 후에, 방출된 바이러스를 수확하여 이후의 증폭에 사용하였다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌 [O'Reilley et al., Baculovirus Expression vectors:A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]에 기재된 바와 같이 수행하였다.

이어서, 폴리-His 태그가 부착된 PRO87299 발현물을 예를 들어 Ni² ⁺-킬레이트 친화성 크로마토그래피에 의해 다음과 같이 정제할 수 있다. 문헌 [Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993)]에 기재된 바와 같이 재조합 바이러스로 감염된 Sf9 세포로부터 추출물을 제조하였다. 요컨대, Sf9 세포를 세척하여 초음파처리 완충액 (25 ml Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl₂; 0.1 mM EDTA; 10％ 글리세롤; 0.1％ NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고 빙상에서 20 초 동안 2회 초음파처리하였다. 초음파처리물을 원심분리로 제거하고 상층액을 로딩 완충액 (50 mM 인산, 300 mM NaCl, 10％ 글리세롤, pH 7.8)에 50 배 희석하여 0.45 ㎛ 필터로 여과시켰다. Ni²⁺-NTA 아가로스 컬럼 (퀴아젠으로부터 시판됨)을 5 ml 충진 부피로 준비하여 물 25 ml로 세척하고 로딩 완충액 25 ml로 평형화시켰다. 여과시킨 세포 추출물을 1분 당 0.5 ml로 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 로딩 완충액으로 A₂₈₀이 기준선에 도달할 때까지 세척하고, 점 분획 수집을 시작하였다. 다음으로, 2차 세척 완충액 (50 mM 인산; 300 mM NaCl, 10％ 글리세롤, pH 6.0)으로 컬럼을 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시켰다. A₂₈₀이 기준선에 다시 도달하면, 컬럼을 2차 세척 완충액에서 0 내지 500 mM의 이미다졸 구배로 전개시켰다. 1 ml 분획들을 수집하여 SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알칼리성 포스파타제에 접합된 Ni² ⁺-NTA (퀴아젠)로 웨스턴 블롯팅을 수행하여 분석하였다. 용출된 His₁₀ 태그가 부착된 PRO87299를 함유하는 분획을 모아 로딩 완충액으로 투석하였다.

다르게는, IgG 태그가 부착된 (또는 Fc 태그가 부착된) PRO87299의 정제는 공지된 크로마토그래피 기술 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피 포함)을 이용하여 수행할 수도 있다.

실시예 12: PRO87299에 결합하는 항체의 제조

마우스를 PRO87299-Fc 작제물로 면역화시킴으로써 PRO87299에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하였다. 상기 작제물은 PRO87299의 세포외 도메인을 코딩하는 영역 (아미노산 1 내지 155)을 인간 Fc 도메인을 함유하는 플라스미드에 라이게이션시켜 PRO87299(ECD)-Fc 키메라를 생성함으로써 제조하였다. 상기 단백질을 생성시키고, 정제하여 마우스의 발 패드에 주입하였다.

모노클로날 항체 생성 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 [Goding, 상기 문헌]에 기재되어 있다. 완전 프로인트 면역보강제에 유화시킨 PRO87299(ECD)-Fc 키메라를 1 내지 100 ㎍의 양으로 피하 또는 복강내 주사하여 Balb/c와 같은 마우스를 면역화시켰다. 다르게는, 면역원을 MPL-TDM 면역보강제 (미국 몬타나주 해밀톤 소재의 리비 이뮤노케미컬 리서치 (Ribi Immunochemical Research))에 유화시켜 동물의 뒷발 패드에 주입하였다. 면역화된 마우스를 10 내지 12일 후에 선택된 면역보강제에 유화시킨 추가의 PRO87299(ECD)-Fc 키메라를 사용하여 면역강화시켰다. 이후에, 몇 주 동안, 또한 추가의 면역화 주사를 사용하여 마우스를 면역강화시켰다. ELISA 분석으로 시험하기 위해 안구 뒷편을 출혈시킴으로써 마우스로부터 혈청 샘플을 주기적으로 수득하여 항-PRO87299 항체를 검출하였다.

적합한 항체 역가를 검출한 후에, 항체에 대해 "양성"인 동물에게 PRO87299(ECD)-Fc 키메라의 마지막 정맥내 주사를 주사하였다. 3 내지 4일 후에, 마우스를 사멸시키고, 비장 세포를 수확하였다. 이어서, 비장 세포를 (35％ 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여) P3X63AgU.1 (ATCC로부터 입수가능함, 번호 CRL 1597)과 같은 선별된 쥐과동물 골수종 세포주에 융합시켰다. 이 융합체가 하이브리도마 세포를 생성하며, 이는 이후에 융합되지 않은 세포, 골수종 하이브리드 및 비장 세포 하이브리드의 증식을 억제시키기 위해 HAT (히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 함유하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다.

하이브리도마 세포를 PRO87299에 대한 반응성에 대해 ELISA로 스크리닝하였다. PRO87299에 특이적으로 결합하는 9가지 항체를 제조하였다. 양성 하이브리도마 세포를 동계 Balb/c 마우스에 복강내 주사하여 항-PRO87299 모노클로날 항체를 함유하는 복수를 생성하였다. 다르게는, 하이브리도마 세포를 조직 배양 플라스크 또는 롤러 병에서 배양할 수 있다. 복수에서 생성된 모노클로날 항체의 정제는 황산암모늄 침전을 이용하고, 이어서 겔 추출 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 다르게는, 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 항체의 결합에 기초한 친화성 크로마토그래피를 이용할 수도 있다.

앞서 언급한 바와 같이, PRO87299에 특이적으로 결합하는 9가지 항체를 제조하였다. 이들 9가지 항체 중, 5F5.1로 지칭된 항체가 효능제 항체인 것으로 결정되었다. 효능제 활성은 CD4+ T 세포 증식의 억제에 의해 결정하였다. CD4+ T 세포를 실시예 2에서 이미 기재한 바와 같이 인간 혈액으로부터 단리하고, 교차결합된 플레이트 결합 항체와 배양하였다. 10 ㎍/ml 농도의 염소-항-마우스 IgG와 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하여 96 웰 플레이트를 준비하고, PBS로 세척하여 잉여량을 제거하였다. 항-CD3/항-CD28 항체를 항-PRO87229 항체를 갖거나 갖지 않는 IgG-코팅된 플레이트에 첨가하였다. 항-CD3 (0.1 ㎍/ml) 및 항-CD28 (0.25 ㎍/ml)의 조합은 CD4+ T 세포의 증식을 자극하며, 항-PRO87299 항체의 첨가는 티미딘 흡수에 의해 측정한 것 보다 증식을 5배 감소시켰다 (도 13). 항-CD3 항체는 단독으로 증식하지 않는 것으로 나타났으며, 대조군 항체 또한 증식하지 않는 것으로 나타났다. 5F5.1 항-PRO87299 항체의 효능제 활성은 열 실활화에 의해 없어질 수 있다. 5F5.1 하이브리도마 세포주를 부타페스트 조약 하에 ATCC에 기탁하였다 (실시예 19 참조).

가용성 항체를 사용하여 제2 실험을 수행하였다. 항-CD3 (10 ㎍/ml) 및 항-CD28 (5 ㎍/ml)은 또한 세포 배양 배지에 첨가했을 때 CD4+ T 세포의 증식을 증가시키는 것으로 나타났다. 2가지 자극성 항체를 갖는 세포 배양 배지에 첨가된 항-PRO87299 항체는 CD4+ T 세포의 증식을 50％까지 억제하는 것으로 나타났다. 사용된 항-PRO87299 항체는 5 내지 200 ㎍/ml의 범위이며, 상기 범위에서 CD4+ 세포의 증식은 투여량 의존적으로 억제되었다.

PRO87299에 특이적으로 결합하지만 효능제 효과는 없는 항체는 항체 5E10이다. 이 항체는 1차 B 세포 및 CD4+ T 세포에서 PRO87299를 인식하는 것으로 밝혀졌다. 이는 또한 FACS 분석을 이용하여 PRO87299 형질감염된 세포를 인식할 수 있다. 5E10 항체는 일관적으로 효능제 효과를 나타내지 않았다.

이에 따라, PRO87299에 특이적으로 결합하는 항체가 생성되었다. 항- PRO87299 길항제 항체는 면역결핍증의 치료 및 병원균에 의한 감염의 예방에 유용한 면역 반응을 자극시키는데 유용하다. 항-PRO87299 효능제 항체는 CD4+ T 세포의 증식을 감소시키는데 유용하며, 이에 따라 면역 반응을 감소시키는 데에도 유용하고, 자가면역 질환, 림프종 및 염증성 장 질환의 치료에 유용할 것이다.

실시예 13: 특이적 항체를 사용한 PRO87299 폴리펩티드의 정제

천연 또는 재조합 PRO87299 폴리펩티드를 단백질 정제 분야의 다양한 표준 기술을 통해 정제할 수 있다. 예를 들면, 프로(pro)-PRO87299 폴리펩티드, 성숙한 PRO87299 폴리펩티드 또는 프리(pre)-PRO87299 폴리펩티드를, 대상 PRO87299 폴리펩티드에 특이적인 항체를 이용하는 면역친화성 크로로마토그래피로 정제한다. 일반적으로, 면역친화성 컬럼은 항-PRO87299 폴리펩티드 항체를 활성화된 크로마토그래피 수지에 공유 결합에 의해 커플링시킴으로써 제작한다.

폴리클로날 이뮤노글로불린은 황산암모늄 침전법 또는 고정화 단백질 A (미국 뉴저지주 피스카타웨이에 소재하는 파마시아 LKB 바이오테크놀로지 (Pharmacia LKB Biotechnology)) 상에서의 정제법을 통해 면역 혈청으로부터 준비하였다. 이와 마찬가지로, 모노클로날 항체는 황산암모늄 침전법 또는 고정화 단백질 A 상의 크로마토그래피에 의해 마우스 복수액으로부터 준비하였다. 부분적으로 정제된 이뮤노글로불린을 CnBr-활성화 세파로스 (SEPHAROSE; 상표명, 파마시아 LKB 바이오테크놀로지)와 같은 크로마토그래피 수지에 공유 결합에 의해 부착시켰다. 항체를 수지에 커플링시키고, 수지를 차단시키고, 유도체 수지를 제조업자의 지시에 따라 세척하였다.

이러한 면역친화성 컬럼은 PRO87299 폴리펩티드를 가용성 형태로 함유하는 세포로부터 분획을 준비하여 PRO87299 폴리펩티드를 정제하는 데 사용한다. 상기 제제는 디터전트의 첨가 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 방법에 의해 온전한 세포를 용해시키거나 차등 원심분리를 통해 수득된 하위세포 분획을 용해시켜 수득하였다. 다르게는, 신호 서열을 함유하는 가용성 PRO87299 폴리펩티드는 세포가 성장하는 배지 내로 유용한 양만큼 분비될 수 있다.

가용성 PRO87299 폴리펩티드 함유 제제를 면역친화성 컬럼에 통과시키고, 컬럼을 PRO87299 폴리펩티드의 선택적인 흡수를 허용하는 조건 (예를 들어, 디터전트의 존재 하의 고이온 강도 완충액) 하에 세척하였다. 이어서, 컬럼을 항체/PRO87299 폴리펩티드 결합을 방해하는 조건 (예를 들어, 대략 pH 2 내지 3과 같은 저 pH 완충액 또는 고농도의 카오트로프 (chaotrope), 예를 들어 우레아 또는 티오시아네이트 이온) 하에 용출시키고, PRO87299 폴리펩티드를 수집하였다.

실시예 14: 약물 스크리닝

본 발명은 PRO87299 폴리펩티드 또는 그의 결합 단편을 사용하여 임의의 다양한 약물 스크리닝 기술로 화합물을 스크리닝하기에 특히 유용하다. 이러한 시험에 사용된 PRO87299 폴리펩티드 또는 단편은 용액 중에 유리되어 있거나, 고체 지지체에 부착되거나, 세포 표면에서 유지되거나, 세포내에 위치할 수 있다. 약물 스크리닝의 한 방법에서는 PRO87299 폴리펩티드 또는 단편을 발현하는 재조합 핵산으로 안정하게 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 이용한다. 약물을 경쟁적 결합 분석으로 이러한 형질전환된 세포에 대해 스크리닝한다. 생존형 또는 고정형 의 세포는 표준 결합 분석에 사용할 수 있다. 예를 들면, PRO87299 폴리펩티드 또는 단편과 시험되는 작용제 사이의 복합체 형성을 측정할 수 있다. 다르게는, 시험되는 작용제의 의해 유발된 PRO87299 폴리펩티드와 그의 표적 세포 또는 표적 수용체 사이의 복합체 형성의 감소를 검사할 수 있다.

따라서, 본 발명은 PRO87299 폴리펩티드-관련 질환 또는 장애에 영향을 끼칠 수 있는 약물 또는 임의의 다른 작용제를 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다. 이들 방법은 이러한 작용제를 PRO87299 폴리펩티드 또는 그의 단편과 접촉시키고, 당업계에 공지된 방법으로 (i) 작용제와 PRO87299 폴리펩티드 또는 단편 사이의 복합체의 존재 또는 (ii) PRO87299 폴리펩티드 또는 단편과 세포 사이의 복합체의 존재에 대해 분석하는 것을 포함한다. 이러한 경쟁적 결합 분석에서, PRO87299 폴리펩티드 또는 단편은 통상적으로 표지된다. 적합하게 인큐베이션한 후에, 유리 PRO87299 폴리펩티드 또는 단편을 결합 형태로 존재하는 것으로부터 분리시키며, 유리 또는 결합되지 않은 표지의 양은 특정 작용제가 PRO87299 폴리펩티드에 결합하는 능력 또는 PRO87299 폴리펩티드/세포 복합체를 억제하는 능력의 척도이다.

또다른 약물 스크리닝 기술은 폴리펩티드에 적합한 결합 친화도를 갖는 화합물에 대한 고처리량 스크리닝을 제공하고, WO 84/03564 (1984. 9. 13일자 공개)에 상세히 기재되어 있다. 간략하게 설명하면, 다수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물을 플라스틱 핀 또는 몇몇 다른 표면과 같은 고체 기질 상에서 합성하였다. PRO87299 폴리펩티드를 적용시켜 펩티드 시험 화합물을 PRO87299 폴리펩티드와 반응시키고, 세척하였다. 결합된 PRO87299 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법으로 검출하였다. 정제된 PRO87299 폴리펩티드는 또한 상기 언급한 약물 스크리닝 기술에 사용하기 위해 플레이트 상에 직접 코팅될 수 있다. 또한, 중화되지 않은 항체를 사용하여 펩티드를 포획하여 이를 고체 지지체 상에 고정화시킬 수 있다.

본 발명은 또한 PRO87299 폴리펩티드에 결합할 수 있는 중화 항체가 PRO87299 폴리펩티드 또는 그의 단편에 결합하는데 있어서 시험 화합물과 특이적으로 경쟁하는 경쟁적 약물 스크리닝 분석의 이용을 고려한다. 이러한 방식으로, 항체를 사용하여 PRO87299 폴리펩티드와 하나 이상의 항원 결정인자를 공유하는 임의의 펩티드의 존재를 검출할 수 있다.

실시예 15: 합리적인 약물 고안

합리적 약물 고안의 목표는 생물학적으로 활성인 대상 폴리펩티드 (즉, PRO87299 폴리펩티드) 또는 이들이 상호작용하는 소분자, 예를 들면 효능제, 길항제 또는 억제제의 구조적 유사체를 제조하는 것이다. 이들 예 중 임의의 것들을 사용하여 보다 활성적이거나 보다 안정한 형태의 PRO87299 폴리펩티드의 약물, 또는 생체내 PRO87299 폴리펩티드의 기능을 증대시키거나 억제하는 약물을 형성할 수 있다 (문헌 [Hodgson, Bio / Technology, 9: 1921 (1991)] 참조).

한 접근법에서, PRO87299 폴리펩티드 또는 PRO87299 폴리펩티드-억제제 복합체의 3차원 구조를 X-선 결정법, 컴퓨터 모델링 또는 가장 통상적으로는 상기 두 접근법의 조합에 의해 결정한다. 분자의 구조를 밝히고 활성 부위(들)을 결정하기 위해 PRO87299 폴리펩티드의 형태와 전하량 모두를 확인해야 한다. 덜 빈번하지만, PRO87299 폴리펩티드의 구조에 관한 유용한 정보는 상동성 단백질의 구조를 기 준으로 모델링함으로써 얻을 수 있다. 두 경우 모두, 관련 구조 정보를 PRO87299 폴리펩티드-유사 분자를 고안하거나 유효한 억제제를 확인하기 위해 사용하였다. 합리적 약물 고안의 유용한 예는 문헌 [Braxton and Wells, Biochemistry, 31:7796-7801 (1992)]에 나타낸 바와 같이 활성 또는 안정성을 개선시킨 분자, 또는 문헌 [Athauda et al., J. Biochem ., 113:742-746 (1993)]에 나타낸 바와 같이 천연 펩티드의 억제제, 효능제 또는 길항제로서 작용하는 분자를 포함할 수 있다.

상기 기재된 바와 같이 기능 분석에 의해 선택된 표적-특이적 항체를 단리한 다음, 그의 결정 구조를 해석할 수도 있다. 이 접근법은 원칙적으로 후속 약물 고안에 기초할 수 있는 파마코어(pharmacore)를 얻는다. 기능성 약리학상 활성 항체에 대한 항-이디오타입 항체 (항-id)를 생성함으로써 단백질 결정법을 모두 회피하는 것도 가능하다. 거울상의 거울상으로서, 항-id의 결합 부위는 본래 수용체의 유사체일 것으로 예상된다. 이어서, 항-id를 사용하여 화학적 또는 생물학적으로 생성된 펩티드의 뱅크로부터 펩티드를 확인하고 단리할 수 있을 것이다. 이어서, 단리된 펩티드는 파마코어로서 작용할 것이다.

본 발명에 의해, X-선 결정법과 같은 분석적 연구를 수행하기 위해 충분한 양의 PRO87299 폴리펩티드를 입수할 수 있다. 또한, 본원에 제공된 PRO87299 폴리펩티드 아미노산 서열 지식은 X-선 결정법 대신 또는 그에 덧붙여 컴퓨터 모델링 기술을 이용하는 안내를 제공할 것이다.

실시예 16- PRO87299 는 HVEM 에 특이적으로 결합한다

단백질 라이브러리 스크리닝은 PRO87299가 HVEM에 특이적으로 결합함을 결정 한다. PRO87299의 세포외 도메인은 인간 Fc에 융합되어 PRO87299(ECD)-Fc를 생성한다. 이 융합 단백질을 문헌 [Chen, Y. et al., J. Mol Biol 293:865-881 (1999)]에 일반적으로 기재된 바와 같이 대략 9000 반응 단위로 비아코어(Biacore; 상표명) (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.)) CM5 센서 칩에 아민 커플링시켰다. 요컨대, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어 인크.)을 공급자의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시켰다. PRO87299(ECD)-Fc를 희석시키고, 커플링된 단백질의 대략 9000의 반응 단위(RU)를 달성하는 유속으로 주입하였다. 동일한 칩 상에서의 제2 유동 세포에서, 대조군 단백질인 인간 PRO4346-Fc (진뱅크 허가 번호 AK057097)를 대략 18500 반응 유닛으로 아민 커플링시켰다. 1M 에탄올아민을 주입하여 반응하지 않은 기를 차단하였다. 이어서, 대략 2000가지 단백질로 이루어진 SPDI 단백질 라이브러리로부터의 개별 단백질을 2 ㎍/ml의 농도로 주입하고, 결합은 시간의 함수로서 반응 단위 변화로 평가하였다. HVEM은 PRO87299(ECD)-Fc에 결합하지만, 대조군 PRO4346-Fc에는 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다. 도 14에 나타낸 바와 같이, PRO87299와 HVEM의 결합은 대조군에 비해 반응 유닛을 1200까지 매우 유의하게 증가시킨다. 결합 속도 (k_on) 및 해리 속도 (k_off)는 간단한 1:1 랑뮈어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어(상표명) 산정 소프트 웨어 버젼 3.2)을 사용하여 결합 및 해리 센소그램을 동시에 보정함으로써 계산하였다. 평형 해리 상수 (Kd)는 k_off/k_on 비로 계산하였다.

도 15에 나타낸 바와 같이, PRO87299는 HVEM에 선택적으로 결합한다. 상기 실험에서, PRO87299(ECD)-Fc 및 CD28 족 구성원 hCTLA4-Fc, hPD-1-Fc, hICOS-Fc 또는 hCD28-Fc를 대략 8000 반응 유닛으로 비아코어(상표명) CM5 칩에 아민 커플링시켰다. 이어서, 이들을 각각 HVEM에 결합하는 능력에 대해 분석하였다. HVEM-Fc 단백질은 HVEM의 아미노산 1 내지 199를 코딩하는 핵산을 Fc에 라이게이션하여 HVEM-Fc 융합 단백질을 생성함으로써 제조하였다. 상기 HVEM-Fc를 CHO 세포에 안정하게 형질감염되었을 때 융합 단백질을 생성하는 발현 벡터에 클로닝하였다. 모든 Fc-태그 부착된 단백질을 단백질 A 세파로스(상표명) (아머샴; Amersham)를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 90％가 넘는 순도로 정제하였다. 이 결과는 5 ㎕/분으로 주입된 2 ㎍/ml의 HVEM-Fc가 PRO87299에 선택적으로 결합하지만, 시험된 CD28 족 구성원의 다른 구성원에는 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. CD28 족 구성원 각각의 활성은 이들의 공지된 리간드에 대한 결합 반응을 시험한 결과 양성으로 확인되었다 (데이타는 나타내지 않음) (CD28 족 구성원 및 리간드는 알앤드디 시스템즈(R＆D systems)로부터 구입함).

HVEM에 대한 PRO87299의 결합은 pH에 의존하지만, NaCl 농도에는 의존하지 않는다. 상기 기재된 바와 같은 비아코어(상표명) 분석을 이용한 결과, HVEM-Fc의 2가지 독립적인 정제물은 비아코어(상표명) CM5 칩에 아민 커플링된 PRO87299에 결합하는 것으로 나타났다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 결합은 2.5M NaCl 처리에 의해 파괴되지 않지만, PRO87299/HVEM 복합체는 pH 3.0의 10 mM 글리신으로 해리될 수 있다.

PRO87299/HVEM 상호작용은 PRO87299에 대한 항체에 의해 차단될 수 있다. 상기 실험에서, HVEM-Fc를 대략 7500 반응 유닛으로 비아코어(상표명) CM5 센서 칩에 아민 커플링시켰다. PRO87299(ECD)-Fc의 주입은 5 ㎕/분 유속으로 2분 동안 수행하였다. 반응 유닛(RU)을 주입 후 105 초 동안 기록하였다. PRO87299(ECD)-Fc (8 nM)은 100 RU로 반응하였다. 각각의 항체를 농도를 증가시키면서 PRO87299(ECD)-Fc (8 nM)와 예비혼합하고, 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 각 샘플의 결합을 무작위적인 순서로 2회 측정하고, 10 mM 글리신 (pH 2.5)을 사용하여 각각의 주입 후 결합 표면을 재생시켰다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 항-PRO87299 항체 5E10 및 3B1.9는 농도 의존적인 방식으로 HVEM에 대한 PRO87299의 결합을 차단하는 반면, 효능제 항체 5F5.1은 차단 효과를 나타내지 않았다. 항체만을 주입하면 고정화된 HVEM에 대한 결합이 관찰되지 않았다 (데이타는 나타내지 않음). PRO87299(ECD)-Fc의 명백하게 감소된 분자량 (55 kDa) 및 150 kDa의 항체 질량에 기초하여 농도를 계산하였다.

세포 기반 분석에서 PRO87299는 HVEM에 결합한다. 상기 실험에서, 인간 293 세포 (ATCC CCL 1573)를 태아 소 혈청, 및 임의로는 영양소 및/또는 항생제로 보충시킨 DMEM와 같은 배지 중 조직 배양 플레이트에서 전면성장할 때까지 배양하였다. 약 10 ㎍의 pRK5-HVEM DNA를 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA 약 1 ㎍과 혼합하고 (문헌 [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)]), 500 ㎕의 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M CaCl₂에 용해시켰다. 상기 혼합물에 500 ㎕의 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO₄를 적가하고, 25℃에서 10 분 동안 침전물을 형성시켰다. 침전물을 현탁시키고, 293 세포에 첨가하여 37℃에서 약 4 시간 동안 침강시켰다. 배양 배지를 흡인 제거하고, PBS 중 20％ 글리세롤 2 ml를 30 초 동안 첨가하였다. 이어서, 293 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 신선한 배지를 첨가하고, 세포를 약 5일 동안 인큐베이션하였다. 다르게는, pRK5-HVEM DNA 약 10 ㎍을 리포펙트아민(LipofectAMINE; 상표명) (미국 메릴랜드주 게더스버그 소재의 깁코(Gibco)/BRL) 시약과 혼합하고, 제조업자의 지시에 따라 형질감염을 수행하였다. 293 세포를 HVEM으로 형질감염시킨 후에, 이들을 I¹²⁵ 방사성 표지된 PRO87299(ECD)-Fc와 인큐베이션하고, 결합이 생성되도록 하였다. 이어서, 방사성 표지된 PRO87299를 표지되지 않은 PRO87299(ECD)-Fc와 경쟁시키고, 총 결합 부위의 수를 측정하고, 스캣차드 분석에 의해 해리 상수(Kd)를 결정하였다. 도 17(A)는 스캣차드 곡선, 도 17(B)는 변위 곡선이며, 이들은 일시적으로 형질감염된 세포에서 HVEM에 대한 PRO87299(ECD)-Fc 결합을 보여준다. 이들 데이타는 PRO87299의 Kd가 약 25 nM임을 보여준다. 모의 형질감염된 293 HEK 세포에 대한 방사성 표지된-PRO87299(ECD)-Fc의 총 결합은 HVEM 형질감염된 세포에 대한 결합의 2.5％였다 (데이타는 나타내지 않음). 상기 방법을 이용하여, HVEM/LIGHT/PRO87299 상호작용의 친화성을 결정하였다. 이를 하기 표 7에 나타내었다.

발현되는 단백질	리간드	Kd (nM)
HVEM	I-125-PRO87299-Fc	25
HVEM	I-125-LIGHT-FLAG	2.5
PRO87299	I-125-HVEM-Fc	5.5
LIGHT	I-125-HVEM-Fc	7
PRO87299/LIGHT	I-125-HVEM-Fc	0.5

본 실시예에서 이전에 논의된 바와 같이, 항-PRO87299 항체 (3B1.9)는 투여량 의존적으로 HVEM에 대한 PRO87299(ECD)-Fc 결합과 경쟁한다.

상기 데이타는 함께 PRO87299가 단백질-단백질 상호작용, 단백질-항체 차단 및 생체내 분석에 의해 결정된 바와 같이 HVEM에 특이적으로 결합함을 보여준다.

실시예 17 - PRO87299 및 LIGHT 는 HVEM 에 동시에 결합할 수 있다

공개문헌은 LIGHT (진뱅크 허가 번호 NM_172014, 서열 5, 서열 6)가 HVEM에 결합할 수 있음을 보여준다 (문헌 [Marsters, S.A. et al., Curr. Biol. 8(9), 525-528 (1998)], [Mauri D.N. et al., Immunity(8), 21-30, (1998)]). LIGHT 및 PRO87299가 HVEM에 동시에 결합할 수 있음을 확인하기 위해, 본 발명자들은 동시-결합 실험을 수행하였다. HVEM-Fc를 150 이하의 반응 유닛으로 비아코어(상표명) CM5 센서 칩에 아민 커플링시켰다. 보다 적은 양의 고정화된 HVEM-Fc가 PRO87299-Fc의 포화 결합 가까이에 도달하기 위해 중요하다. 도 19는 LIGHT (25 nM) 및 PRO87299-Fc (17 nM)가 1200초 동안 5 ㎕/분으로 개별 주사하였음을 보여준다 (각각 적색 및 청색 곡선). 이어서, 동일한 최종 농도의 LIGHT 및 PRO87299-Fc의 혼합물을 동일한 방법으로 주사하였다 (녹색 곡선). 개별 주사한 LIGHT 및 PRO87299-Fc 센소그램의 계산된 합계 (회색 곡선)는 실험 데이타와 거의 일치하였으며, 이로부터 LIGHT 및 PRO87299가 HVEM에 동시에 결합할 수 있음을 확인하였다. 농도는 25 kDa의 LIGHT 단량체의 분자량 및 PRO87299-Fc의 감소된 분자량 (55 kDa)을 기준으로 한다.

HVEM에 대한 PRO87299의 상호작용은 LIGHT에 의해 차단되지 않는다. PRO87299-Fc를 9800 이하의 반응 유닛으로 비아코어(상표명) CM5 센서 칩에 아민 커플링시켰다. LIGHT (알렉시스(Alexis; 상표명)로부터 구입함, 카달로그 번호 552-018-C010)는 농도를 증가시키면서 4 nM HVEM과 함께 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 도 20에 나타낸 바와 같이, PRO87299-Fc/HVEM 결합은 LIGHT의 농도를 최종 농도 300 nM까지 증가시켜도 차단되지 않았다. CM5 센서 칩 상에서의 고정화된 HVEM-Fc에 대한 결합에 의해 LIGHT 활성을 확인하였다 (데이타는 나타내지 않음). LIGHT는 단독으로 고정화된 PRO87299-Fc에 결합하지 않았다 (데이타는 나타내지 않음). 모든 결합 센소그램을 무작위적인 순서로 2회 수행하였다. 반응 유닛을 기준선과 5 ㎕/분에서의 2 분간 주입이 끝나기 15초 전 사이의 차이로 기록하였다. 농도는 25 kDa의 LIGHT 단량체의 분자량 및 55 kDa의 단량체 HVEM의 분자량을 기준으로 한다. 이 데이타는 LIGHT가 PRO87299에 대한 HVEM의 결합을 차단하지 않음을 보여준다.

HVEM은 초기에 허피스 단순 바이러스-1 (HSV-1)이 세포에 진입하는데 사용되는 세포 수용체로서 확인되었으며, HSV-1 당단백질 D (gD)에 결합하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Mongomery et al., Cell 87:427-436 (1996)]). HVEM은 모든 TNFR 족 구성원에 대한 공통적인 구조적 특징인 3가지 시스테인 풍부 도메인 (CRD)을 함유한다. HVEM과 복합된 gD 단백질의 결정 구조 해석 결과는 HVEM의 제1 CRD가 gD 단백질에 결합하는 한편, HVEM의 제2 CRD가 제1 CRD를 위한 구조 지지체를 제공한다는 것을 보여준다 (문헌 [Carfi et al., Mol. Cell 8:169-179 (2001)]). 이러한 결과는 PRO87299가 LIGHT와 상호작용하지만 HVEM 결합에 대해 경쟁하지 않는다는 것을 보여주며, PRO87299가 HVEM/LIGHT 복합체의 외부 표면과 상호작용한다는 가설을 유도한다. 상기 가설을 시험하기 위해, 허피스 당단백질 D (gD)에 대한 HVEM의 결합을 차단할 수 있지만 LIGHT에 대한 결합은 차단할 수 없는 파지 유래의 펩티드 (BP-2)를 제조하였다 (문헌 [Sarrias et al., Mol . Immuno. 37:665-673 (2000)]). gD 결합을 억제하는 농도에서, BP-2는 HVEM에 대한 PRO87299의 결합을 억제하였다 (도 21A). 직접적인 비교에서, 재조합 gD 단백질 (△290-299 형태; 문헌 [Milne et al., J Virology. 77:8962-8972 (2003)])은 또한 PRO87299에 대한 HVEM의 결합을 억제하였다 (도 21B). 이러한 결과는 세포 결합 분석에서도 반복되었으며, 이는 재조합 gD (△290-299)가 HVEM 또는 PRO87299를 발현하는 293 세포에 대한 가용성 PRO87299-Fc 및 HVEM-Fc의 결합을 억제함을 보여준다 (각각, 도 21C 및 21D). 이러한 결과는 PRO87299가 LIGHT 결합 부위와 별개인 부위에서 HVEM의 제1 CRD과 상호작용함을 나타낸다. PRO87299가 LIGHT 및 HVEM 둘 모두와 상호작용한다는 발견은 PRO87299/LIGHT 상호작용을 방해하지 않고 PRO87299/HVEM 상호작용을 선택적으로 억제할 수 있는 HVEM에 대한 항체 또는 소분자의 제조를 허용할 것이다. 상기 발견에 의해 고려되는 다른 유형의 항체 또는 소분자는 PRO87299/HVEM 상호작용 및 PRO87299/LIGHT 상호작용 둘 모두를 차단하는 것이다. 이들 2가지 상이한 클래스의 분자는 상이한 치료 효과를 나타낼 수 있다.

실시예 18: PRO87299 는 T-세포 활성화를 억제한다

실시예 1에 언급한 바와 같이, 추가 연구를 위해 PRO87299를 ITIM 도메인 함유 단백질에 클로닝하였다. PRO87299의 세포내 도메인은 유도가능하게 인산화되는 2가지 ITIM 도메인을 함유하고, SHP-1 및 SHP-2의 동원 및 결합을 허용하며, 이는 PRO87299의 기능이 억제 기능임을 나타낸다 (문헌 [Watanabe N., et al., Nature Immuno. 1-10 (2003)]). 이 실험에서는, 상이한 농도의 고정화된 항-CD3 항체로 1차 CD4+ T 세포를 자극한다. Fc-태그 부착된 대조군 단백질 HVEM-Fc 또는 DcR3-Fc는 또한 예비코팅된 항-Fc 항체를 사용하여 플레이트 상에 교차결합시켰다. 72 시간 동안 인큐베이션한 후에, H3 티미딘 혼입에 의해 CD4+ T 세포의 증식을 측정하였다. 이 실험은 3중 웰에서 수행하였으며, 억제는 평균값으로 나타내었다 (도 22A). HVEM은 LIGHT을 차단시킴으로써 T-세포 증식을 억제할 것으로 추정된다. 이 실험은 HVEM/LIGHT 억제가 아니라, HVEM 활성화 PRO87299가 T-세포 증식을 감소시킨다는 것을 보여준다.

PRO87299가 T 세포 증식을 억제함을 더 보여주기 위해, 억제성 항-PRO87299 항체 3B1.9를 포함하는 것을 제외하고는 상기 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. 3B1.9 항체는 HVEM에 대한 PRO87299의 결합을 차단하는 것으로 나타났다 (실시예 16 참조). CD4+ T 세포를 플레이트에 고정화시킨 항-CD3 ± HVEM으로 자극시켰다. 이어서, 3B1.9 항체 및 대조군 항체를 배지에 첨가하였다. 데이타는 3B1.9 항체가 PRO87299/HVEM의 상호작용을 방해하여 억제 신호 세포를 제거할 수 있음을 보여준다. 이러한 결과는 3B1.9 처치된 세포가 처치되지 않은 세포와 동일한 속도로 증식한다는 것을 나타내었다 (도 22B). 높은 농도의 HVEM이 사용된 경우에만 3B1.9 항체가 비효과적이었다. 이러한 데이타는 PRO87299 또는 효능제 항체가 T 세포 관련 자가면역 질환을 억제하는데 유용할 수 있거나, 또는 반대로 3B1.9와 같은 길항제 항체가 T 세포를 자극하여 병원균에 의한 감염을 예방하는데 유용할 것임을 입증한다.

실시예 19: 이식편 대 숙주 질환

이식편-대-숙주 질환은 면역억제되거나 내성이 있는 환자에게 면역적격 세포가 이식되는 경우에 발생한다. 공여자 T 세포는 숙주 항원을 인식하여 활성화되고, 사이토카인을 분비하여 이펙터 세포로 분화시킨다. 이러한 반응은 이식편-대-숙주-반응 (GVHR)으로 알려져 있다. 이 GVHR 반응은 다기관 증후군을 포함하고, 그 효과는 치명적인 중증의 염증에서부터 설사 및 체중 감소와 같은 경미한 경우까지 다양하게 나타날 수 있다. 마우스의 이식편-대-숙주 질환 모델은 골수 이식 후에 발생하는 급성 및 만성 GVHR의 임상적 장애 및 자가면역 질환을 모델링하는데 이용되어 왔다. 일반적인 절차는 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌, unit 4.3]에 상세하게 기재되어 있다. 이 경우에, 인간 PBMC는 정상적인 공여자의 류코팩으로부터 피콜 구배에 의해 정제하였다. CD8 및 NK 세포를 MACS CD8 및 NK 세포 고갈 키트를 사용하여 고갈시켰다. 40×10⁶개 세포를 제0일에 8 내지 10주령의 암컷 베이지색 면역부재 마우스에 주사하였다. 100 ㎍의 HVEM-Fc 또는 대조군 단백질을 제0일, 제2일, 제4일, 제6일, 제8일, 제10일에 정맥내 주사하였다. 도 23에 나타낸 바와 같이, GVHR 모델에서 HVEM-Fc에 의한 PRO87299의 활성화가 생존률을 유의하게 연장시킨다. HVEM-Fc로 처치하지 않은 마우스는 재구성 후 13일째에 100％ 사망하였다. HVEM-Fc로 처치한 마우스는 한 절차에서는 재구성 후 19일째까지 생존하였으며, 다른 절차에서는 재구성 후 30일째까지 생존하였다. 이러한 결과는 효능제에 의한 PRO87299의 활성화가 조직 이식에 유용할 것임을 나타내며, 여기서 PRO87299 효능제의 투여는 숙주에 의한 이식된 조직의 거부반응을 예방하거나 경감시킬 것이다.

실시예 20: 물질 기탁

하기 하이브리도마 세포주가 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (미국 20110-2209 버지니아주 매나서스 유니버시티 블레바르 10801 소재)에 기탁되어 있다:

하이브리도마 /항체 명칭 ATCC 번호 기탁일

Btig5F5.1 PTA-지정되지 않음 2004년 11월 10일

Btig3B1.9 PTA-지정되지 않음 2004년 11월 10일

상기 기탁은 특허 수속 및 조정 목적을 위한 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약(Budapest Treaty)의 지정하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 살아있는 배양물의 유지를 보장한다. 세포주는 부다페스트 조약에 의거하여 ATCC로부터 입수할 수 있으며, 제넨테크 인크.와 ATCC는 (a) 특허 출원의 계류 기간 동안에는 37 CFR §1.14 및 35 USC §122하에 상기 출원의 담당 심사관에 의해 결정된 자에게 배양물을 소유할 권리를 부여하며, (b) 이와 같이 기탁된 공공 배양물의 입수가능성에 대한 모든 규제가 특허 결정시 비소급적으로 해제될 것을 보장하는 것에 합의할 것이다.

본 출원의 양수인은 기탁 중인 배양물이 적합한 조건 하에 배양되었음에도 사멸, 손실 또는 파괴되었을 경우에 상기 배양물을 정식 통지하에 동일한 배양물의 살아있는 샘플로 즉시 교체하는 것에 동의하였다. 기탁된 세포주의 입수가능성이 임의의 정부 관청에서 특허법에 따라 수여한 권리에 저촉되는 본 발명의 실시를 허가한 것으로 해석되어서는 안 된다.

앞서 기술한 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 기탁된 실시양태는 본 발명의 특정 측면의 한 예로서 의도되는 것이므로 본 발명은 기탁된 물질의 범위에 제한되지 않으며, 기능적으로 동등한 임의의 작제물이 본 발명의 범위에 포함된다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 함유된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양식을 포함한 본 발명의 임의의 측면을 실시하기에는 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명으로 제한하려는 것으로 해석되어서는 안 된다. 실제로, 상기 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기재한 것 이외에도 본 발명의 다양한 변형이 당업자에게는 명백할 것이며, 이들은 첨부된 특허 청구의 범위 내에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. CLARK,HILARY EATON,DANIEL L. WRANIK,BERND OUYANG,WENJUN GONZALEZ,LINO LOYET,KELLY M. <120> Novel Compositions and Methods for the Treatment of Immune Related Diseases <130> P1996R1P1 <140> PCT/US04/037612 <141> 2004-11-12 <160> 10 <210> 1 <211> 1066 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cctcggttct atcgattgaa ttcatgaaga cattgcctgc catgcttgga 50 actgggaaat tattttgggt cttcttctta atcccatatc tggacatctg 100 gaacatccat gggaaagaat catgtgatgt acagctttat ataaagagac 150 aatctgaaca ctccatctta gcaggagatc cctttgaact agaatgccct 200 gtgaaatact gtgctaacag gcctcatgtg acttggtgca agctcaatgg 250 aacaacatgt gtaaaacttg aagatagaca aacaagttgg aaggaagaga 300 agaacatttc atttttcatt ctacattttg aaccagtgct tcctaatgac 350 aatgggtcat accgctgttc tgcaaatttt cagtctaatc tcattgaaag 400 ccactcaaca actctttatg tgacagatgt aaaaagtgct tcagaacgac 450 cctccaagga cgaaatggca agcagaccct ggctcctgta tagtttactt 500 cctttggggg gattgcctct actcatcact acctgtttct gcctgttctg 550 ctgcctgaga aggcaccaag gaaagcaaaa tgaactctct gacacagcag 600 gaagggaaat taacctggtt gatgctcacc ttaagagtga gcaaacagaa 650 gcaagcacca ggcaaaattc ccaagtactg ctatcagaaa ctggaattta 700 tgataatgac cctgaccttt gtttcagaat gcaggaaggg tctgaagttt 750 attctaatcc atgcctggaa gaaaacaaac caggcattgt ttatgcttcc 800 ctgaaccatt ctgtcattgg actgaactca agactggcaa gaaatgtaaa 850 agaagcacca acagaatatg catccatatg tgtgaggagt taaggatcct 900 ctagagtcga cctgcagaag cttggccgcc atggcccaac ttgtttattg 950 cagcttataa gtgttacaaa taaacaaata atatttctca atttgagaat 1000 ttttacttta gaaatgttca tgttagtgct tgggtctgaa gggtccatag 1050 gacaaatgat taaaat 1066 <210> 2 <211> 289 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp 1 5 10 15 Val Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly 20 25 30 Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu 35 40 45 His Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val 50 55 60 Lys Tyr Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn 65 70 75 Gly Thr Thr Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys 80 85 90 Glu Glu Lys Asn Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val 95 100 105 Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln 110 115 120 Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp 125 130 135 Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser Lys Asp Glu Met Ala Ser 140 145 150 Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Pro Leu Gly Gly Leu Pro 155 160 165 Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys Cys Leu Arg Arg 170 175 180 His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala Gly Arg Glu 185 190 195 Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr Glu Ala 200 205 210 Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly Ile 215 220 225 Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser 230 235 240 Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile 245 250 255 Val Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Leu Asn Ser Arg 260 265 270 Leu Ala Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile 275 280 285 Cys Val Arg Ser <210> 3 <211> 1049 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gccgcagcaa tggcgctgag ttcctctgct ggagttcatc ctgctagctg 50 ggttcccgag ctgccggtct gagcctgagg catggagcct cctggagact 100 gggggcctcc tccctggaga tccaccccca gaaccgacgt cttgaggctg 150 gtgctgtatc tcaccttcct gggagccccc tgctacgccc cagctctgcc 200 gtcctgcaag gaggacgagt acccagtggg ctccgagtgc tgccccaagt 250 gcagtccagg ttatcgtgtg aaggaggcct gcggggagct gacgggcaca 300 gtgtgtgaac cctgccctcc aggcacctac attgcccacc tcaatggcct 350 aagcaagtgt ctgcagtgcc aaatgtgtga cccagccatg ggcctgcgcg 400 cgagccggaa ctgctccagg acagagaacg ccgtgtgtgg ctgcagccca 450 ggccacttct gcatcgtcca ggacggggac cactgcgccg cgtgccgcgc 500 ttacgccacc tccagcccgg gccagagggt gcagaaggga ggcaccgaga 550 gtcaggacac cctgtgtcag aactgccccc cggggacctt ctctcccaat 600 gggaccctgg aggaatgtca gcaccagacc aagtgcagct ggctggtgac 650 gaaggccgga gctgggacca gcagctccca ctgggtatgg tggtttctct 700 cagggagcct cgtcatcgtc attgtttgct ccacagttgg cctaatcata 750 tgtgtgaaaa gaagaaagcc aaggggtgat gtagtcaagg tgatcgtctc 800 cgtccagcgg aaaagacagg aggcagaagg tgaggccaca gtcattgagg 850 ccctgcaggc ccctccggac gtcaccacgg tggccgtgga ggagacaata 900 ccctcattca cggggaggag cccaaaccac tgacccacag actctgcacc 950 ccgacgccag agatacctgg agcgacggct gctgaaagag gctgtccacc 1000 tggcgaaacc accggagccc ggaggcttgg gggctccgcc ctgggctgg 1049 <210> 4 <211> 283 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr 1 5 10 15 Pro Arg Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu 20 25 30 Gly Ala Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp 35 40 45 Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly 50 55 60 Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys 65 70 75 Glu Pro Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu 80 85 90 Ser Lys Cys Leu Gln Cys Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu 95 100 105 Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly 110 115 120 Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile Val Gln Asp Gly Asp His Cys 125 130 135 Ala Ala Cys Arg Ala Tyr Ala Thr Ser Ser Pro Gly Gln Arg Val 140 145 150 Gln Lys Gly Gly Thr Glu Ser Gln Asp Thr Leu Cys Gln Asn Cys 155 160 165 Pro Pro Gly Thr Phe Ser Pro Asn Gly Thr Leu Glu Glu Cys Gln 170 175 180 His Gln Thr Lys Cys Ser Trp Leu Val Thr Lys Ala Gly Ala Gly 185 190 195 Thr Ser Ser Ser His Trp Val Trp Trp Phe Leu Ser Gly Ser Leu 200 205 210 Val Ile Val Ile Val Cys Ser Thr Val Gly Leu Ile Ile Cys Val 215 220 225 Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val Ser 230 235 240 Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile 245 250 255 Glu Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu 260 265 270 Glu Thr Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His 275 280 <210> 5 <211> 1159 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ggtttcctct gaggttgaag gacccaggcg tgtcagccct gctccagaca 50 ccttgggcat ggaggagagt gtcgtacggc cctcagtgtt tgtggtggat 100 ggacagaccg acatcccatt cacgaggctg ggacgaagcc accggagaca 150 gtcgtgcagt gtggcccggg tgggtctggg tctcttgctg ttgctgatgg 200 gggccgggct ggccgtccaa ggctggttcc tcctgcagct gcactggcgt 250 ctaggagaga tggtcacccg cctgcctgac ggacctgcag gctcctggga 300 gcagctgata caagagcgaa ggtctcacga ggtcaaccca gcagcgcatc 350 tcacaggggc caactccagc ttgaccggca gcggggggcc gctgttatgg 400 gagactcagc tgggcctggc cttcctgagg ggcctcagct accacgatgg 450 ggcccttgtg gtcaccaaag ctggctacta ctacatctac tccaaggtgc 500 agctgggcgg tgtgggctgc ccgctgggcc tggccagcac catcacccac 550 ggcctctaca agcgcacacc ccgctacccc gaggagctgg agctgttggt 600 cagccagcag tcaccctgcg gacgggccac cagcagctcc cgggtctggt 650 gggacagcag cttcctgggt ggtgtggtac acctggaggc tggggaggag 700 gtggtcgtcc gtgtgctgga tgaacgcctg gttcgactgc gtgatggtac 750 ccggtcttac ttcggggctt tcatggtgtg aaggaaggag cgtggtgcat 800 tggacatggg tctgacacgt ggagaactca gagggtgcct caggggaaag 850 aaaactcacg aagcagaggc tgggcgtggt ggctctcgcc tgtaatccca 900 gcactttggg aggccaaggc aggcggatca cctgaggtca ggagttcgag 950 accagcctgg ctaacatggc aaaaccccat ctctactaaa aatacaaaaa 1000 ttagccggac gtggtggtgc ctgcctgtaa tccagctact caggaggctg 1050 aggcaggata attttgctta aacccgggag gcggaggttg cagtgagccg 1100 agatcacacc actgcactcc aacctgggaa acgcagtgag actgtgcctc 1150 aaaaaaaag 1159 <210> 6 <211> 240 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Glu Glu Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly 1 5 10 15 Gln Thr Asp Ile Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg 20 25 30 Gln Ser Cys Ser Val Ala Arg Val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu 35 40 45 Leu Met Gly Ala Gly Leu Ala Val Gln Gly Trp Phe Leu Leu Gln 50 55 60 Leu His Trp Arg Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly 65 70 75 Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His 80 85 90 Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu 95 100 105 Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu 110 115 120 Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Val 125 130 135 Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln Leu Gly 140 145 150 Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His Gly 155 160 165 Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu 170 175 180 Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg 185 190 195 Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu 200 205 210 Ala Gly Glu Glu Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val 215 220 225 Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val 230 235 240 <210> 7 <211> 726 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgaagacat tgcctgccat gcttggaact gggaaattat tttgggtctt 50 cttcttaatc ccatatctgg acatctggaa catccatggg aaagaatcat 100 gtgatgtaca gctttatata aagagacaat ctgaacactc catcttagca 150 ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg aaatactgtg ctaacaggcc 200 tcatgtgact tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta aaacttgaag 250 atagacaaac aagttggaag gaagagaaga acatttcatt tttcattcta 300 cattttgaac cagtgcttcc taatgacaat gggtcatacc gctgttctgc 350 aaattttcag tctaatctca ttgaaagcca ctcaacaact ctttatgtga 400 caggaaagca aaatgaactc tctgacacag caggaaggga aattaacctg 450 gttgatgctc accttaagag tgagcaaaca gaagcaagca ccaggcaaaa 500 ttcccaagta ctgctatcag aaactggaat ttatgataat gaccctgacc 550 tttgtttcag gatgcaggaa gggtctgaag 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160 165 Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly Ile Tyr Asp Asn 170 175 180 Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser Glu Val Tyr 185 190 195 Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val Tyr Ala 200 205 210 Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Leu Asn Ser Arg Leu Ala Arg 215 220 225 Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg 230 235 240 Ser <210> 9 <211> 888 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 atgaagacat tgcctgccat gcttggaact gggaaattat tttgggtctt 50 cttcttaatc ccatatctgg acatctggaa catccatggg aaagaatcat 100 gtgatgtaca gctttatata aagagacaat ctgaacactc catcttagca 150 ggagatccct ttgaactaga atgccctgtg aaatactgtg ctaacaggcc 200 tcatgtgact tggtgcaagc tcaatggaac aacatgtgta aaacttgaag 250 atagacaaac aagttggaag gaagagaaga acatttcatt tttcattcta 300 cattttgaac cagtgcttcc taatgacaat gggtcatacc gctgttctgc 350 aaattttcag tctaatctca ttgaaagcca ctcaacaact ctttatgtga 400 cagcatttac taacattcca gatgtaaaaa gtgcctcaga acgaccctcc 450 aaggacgaaa tggcaagcag accctggctc ctgtatagtt tacttccttt 500 ggggggattg cctctactca tcactacctg tttctgcctg ttctgctgcc 550 tgagaaggca ccaaggaaag caaaatgaac tctctgacac agcaggaagg 600 gaaattaacc tggttgatgc tcaccttaag agtgagcaaa cagaagcaag 650 caccaggcaa aattcccaag tactgctatc agaaactgga atttatgata 700 atgaccctga cctttgtttc aggatgcagg aagggtctga agtttattct 750 aatccatgcc tggaagaaaa caaaccaggc attgtttatg cttccctgaa 800 ccattctgtc attggactga actcaagact ggcaagaaat gtaaaagaag 850 caccaacaga atatgcatcc atatgtgtga ggagttaa 888 <210> 10 <211> 295 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp 1 5 10 15 Val Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly 20 25 30 Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu 35 40 45 His Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val 50 55 60 Lys Tyr Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn 65 70 75 Gly Thr Thr Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys 80 85 90 Glu Glu Lys Asn Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val 95 100 105 Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln 110 115 120 Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser Thr Thr Leu Tyr Val Thr Ala 125 130 135 Phe Thr Asn Ile Pro Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser 140 145 150 Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu 155 160 165 Pro Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu 170 175 180 Phe Cys Cys Leu Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser 185 190 195 Asp Thr Ala Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys 200 205 210 Ser Glu Gln Thr Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu 215 220 225 Leu Ser Glu Thr Gly Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe 230 235 240 Arg Met Gln Glu Gly Ser Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu 245 250 255 Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val 260 265 270 Ile Gly Leu Asn Ser Arg Leu Ala Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro 275 280 285 Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg Ser 290 295

Claims

서열 2의 아미노산 1 내지 155번 잔기에 특이적으로 결합하며, PRO87299와 HVEM의 상호작용을 차단하는 항체.
서열 2의 아미노산 1 내지 155번 잔기에 특이적으로 결합하며, PRO87299와 HVEM의 상호작용을 모방하는 항체.
제2항에 있어서, CD4+ T 세포 증식을 억제하는 항체.
제2항에 있어서, 림프종 세포 증식을 억제하는 항체.
제2항에 있어서, NK 세포 증식을 억제하는 항체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 항체 단편, 또는 단쇄(single-chain) 항체인 항체.
제1항에 있어서, 하이브리도마 Btig3B1.9 (PTA-6301)에 의해 제조된 단리된 항체.
제2항에 있어서, 하이브리도마 Btig5F5.1 (PTA-6302)에 의해 제조된 단리된 항체.
제2항에 있어서, 하이브리도마 Btig5F5.1 (PTA-6302)에 의해 제조된 항체의 생물학적 활성을 가지며, 상기 생물학적 활성이 CD4+ T 세포 증식을 억제하는 것인 단리된 항체.
제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체를 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는, 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 골관절염, 유년형 만성 관절염, 척추관절증, 전신성 경화증, 특발성 염증성 근장애, 쇼그렌 증후군 (Sjoegren's syndrome), 전신성 맥관염, 유육종증 (sarcoidosis), 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판감소증, 갑상선염, 진성 당뇨병, 면역-매개성 신장 질환, 중추신경계 또는 말초신경계의 탈수초 질환, 특발성 탈수초 다발성 신경염, 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome), 만성 염증성 탈수초 다발성 신경염, 간담즙성 질환, 감염성 또는 자가면역성 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염, 경화성 담관염, 염증성 장 질환, 글루텐 (gluten) 민감성 장 질환, 휘플병 (Whipple's disease), 자가면역성 또는 면역-매개성 피부 질환, 수포성 피부 질환, 다형성 홍반, 접촉성 피부염, 건선, 알레르기성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증, 두드러기, 폐의 면역 질환, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증, 과민성 폐렴, 이식 관련 질환, 이식 거부반응, 또는 이식편-대-숙주 질환인 면역 관련 질환 또는 림프종을 완화하기 위한 조성물.
용기,

상기 용기 상의 라벨, 및

상기 용기 내에 함유된, 제2항 내지 제5항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 조성물

을 포함하며, 여기서 상기 용기 상의 라벨이 상기 조성물이 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 골관절염, 유년형 만성 관절염, 척추관절증, 전신성 경화증, 특발성 염증성 근장애, 쇼그렌 증후군 (Sjoegren's syndrome), 전신성 맥관염, 유육종증 (sarcoidosis), 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판감소증, 갑상선염, 진성 당뇨병, 면역-매개성 신장 질환, 중추신경계 또는 말초신경계의 탈수초 질환, 특발성 탈수초 다발성 신경염, 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome), 만성 염증성 탈수초 다발성 신경염, 간담즙성 질환, 감염성 또는 자가면역성 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염, 경화성 담관염, 염증성 장 질환, 글루텐 (gluten) 민감성 장 질환, 휘플병 (Whipple's disease), 자가면역성 또는 면역-매개성 피부 질환, 수포성 피부 질환, 다형성 홍반, 접촉성 피부염, 건선, 알레르기성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증, 두드러기, 폐의 면역 질환, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증, 과민성 폐렴, 이식 관련 질환, 이식 거부반응, 또는 이식편-대-숙주 질환인 면역 관련 질환 또는 림프종의 치료에 사용될 수 있음을 나타내는 것인 제조 용품.
PRO87299 폴리펩티드를 함유할 것으로 예상되는 대상체로부터 분리된 샘플을

제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체에 노출시키는 단계; 및

PRO87299에 대한 상기 항체의 결합을 측정하는 단계

를 포함하는, 상기 샘플에서 PRO87299 폴리펩티드의 존재 여부를 결정하기 위한 방법.
(a) 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포유동물로부터 분리한 조직 세포의 시험 샘플과 접촉시키는 단계; 및

상기 시험 샘플 중에서 PRO87299 폴리펩티드와 상기 항체 간의 복합체 형성을 검출하는 단계

를 포함하며, 여기서 상기 복합체 형성이 시험 조직 세포를 분리한 포유동물에 면역 관련 질환이 존재함을 나타내는 것인, 복합체 형성을 검출하여 포유동물에서 면역 관련 질환을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법.
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