KR20070034619A - 인터루킨-８ 동종 폴리펩티드 및 이의 치료적 용도 - Google Patents

인터루킨-８ 동종 폴리펩티드 및 이의 치료적 용도 Download PDF

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케르스틴 엔. 슈미트
리처드 밴들렌
낸시 시앙
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Abstract

본 발명은 IL-8과 구조 동종성을 갖는 신규 폴리펩티드에 관한 것이고, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 이종성 폴리펩티드 서열과 접합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 키메릭 폴리펩티드 분자, 본 발명의 폴리펩티드와 결합되는 항체를 제공하며, 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법도 제공한다. 본원에서는 염증성 질환의 치료 및 진단을 위한 방법도 추가로 제공한다.
동종성 폴리펩티드, 염증성 질환, IL-8, PRO842

Description

인터루킨-８ 동종 폴리펩티드 및 이의 치료적 용도{INTERLEUKIN-8 HOMOLOGOUS POLYPEPTIDES AND THERAPEUTIC USES THEREOF}
본 발명은 일반적으로 신규 DNA의 동정 및 단리, 및 케모킨 인터루킨-8과 구조적 상동성을 갖는 신규 폴리펩티드의 재조합 생산에 관한 것이다.
세포외 단백질은 무엇보다도 다세포 유기체의 형성, 분화 및 유지에 중요한 역할을 한다. 많은 개별 세포의 운명(예, 증식, 이동, 분화, 또는 다른 세포와의 상호작용)은 전형적으로 다른 세포 및(또는) 즉각적 환경으로부터 접수된 정보에 의해 지배된다. 상기 정보는 종종 분비 폴리펩티드(예, 분열촉진 인자, 생존 인자, 세포독성 인자, 분화 인자, 신경펩티드 및 호르몬)에 의해 전달되고, 이것은 다시 다양한 세포 수용체 또는 막-결합 단백질에 의해 접수되고 해석된다. 상기 분비 폴리펩티드 또는 신호전달 분자는 일반적으로 세포 분비 경로를 통해 세포외 환경의 작용 부위에 도달한다.
분비 단백질은 의약품, 진단제, 생감지자, 생체반응인자를 포함하여 다양한 산업적 응용분야를 갖는다. 현재 이용가능한 대부분의 단백질 약품, 예를 들면 혈전용해제, 인터페론, 인터루킨, 에리트로포에틴, 콜로니 자극 인자 및 다양한 다른 사이토킨은 분비 단백질이다. 막 단백질인 이들의 수용체 또한 치료제 또는 진단 제로서의 잠재성을 갖는다.
막-결합 단백질 및 수용체는 무엇보다도 다세포 유기체의 형성, 분화 및 유지에 중요한 역할을 할 수 있다. 많은 개별 세포의 운명(예, 증식, 이동, 분화, 또는 다른 세포와의 상호작용)은 전형적으로 다른 세포 및(또는) 즉각적 환경으로부터 접수된 정보에 의해 지배된다. 상기 정보는 종종 분비 폴리펩티드(예, 분열촉진 인자, 생존 인자, 세포독성 인자, 분화 인자, 신경펩티드 및 호르몬)에 의해 전달되고, 이것은 다시 다양한 세포 수용체 또는 막-결합 단백질에 의해 접수되고 해석된다. 상기 막-결합 단백질 및 세포 수용체는 사이토킨 수용체, 수용체 인산화효소, 수용체 인산분해효소, 세포-세포 상호작용에 관여된 수용체, 및 셀렉틴 및 인테그린과 같은 세포 접착 분자를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 세포 성장 및 분화를 조절하는 신호 전달은 다양한 세포 단백질의 인산화에 의해 부분적으로 조절된다. 상기 과정을 촉매하는 효소인 단백질 티로신 인산화효소는 성장 인자 수용체로도 작용할 수 있다. 섬유모세포 성장 인자 수용체 및 신경 성장 인자 수용체가 예로서 포함된다.
분비 단백질과 마찬가지로, 막-결합 단백질 및 수용체 분자는 의약품 및 진단제를 포함하여 다양한 산업적 응용분야를 갖는다. 예를 들면, 수용체 이뮤노어드헤신은 수용체-리간드 상호작용을 차단하는 치료제로 사용될 수 있다. 또한, 막-결합 단백질은 관련 수용체/리간드 상호작용의 잠재적 펩티드 또는 소분자 억제제의 스크리닝에 사용될 수 있다.
신규의 천연 분비 단백질 및 천연 수용체, 또는 막-결합 단백질을 동정하기 위한 노력이 산업계 및 학계에 의해 수행되고 있다. 신규 분비 단백질의 코딩 서열을 동정하기 위한 포유류 재조합 DNA 라이브러리의 스크리닝에 많은 노력이 집중되고 있다. 스크리닝 방법 및 기술의 예가 문헌에 기술되어 있다[예, Klein et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 93:7108-7113 (1996); 미국 특허 제5,536,637호 참조].
이와 관련하여, 본 발명은 면역 매개 및 염증성 질환에 관련된 것으로 밝혀진 인터루킨-8(IL-8) 패밀리의 신규 분비 폴리펩티드의 동정에 관한 것이다. 면역 관련 및 염증성 질환은, 정상 생리학에서 충격 또는 손상에 반응하고, 충격 또는 손상으로부터의 회복을 개시하고, 외부 유기체에 대한 선천적 및 후천적 방어를 갖추는데 중요한, 매우 복합성이고 종종 다중성인 상호관련 생물학적 경로의 발현 또는 결과이다. 비정상적 조절 또는 과도한 자극의 결과로서, 자기 반응으로서, 또는 이들의 조합으로서, 상기 정상 생리학적 경로가 반응의 강도에 직접 관련된 부가의 충격 또는 손상을 일으킬 때 질병 또는 병증이 발생한다.
면역 관련 질병의 발생이 다단계 경로 및 종종 다중성인 다양한 생물학적 시스템/경로를 종종 포함하지만, 상기 경로의 하나 이상에서 중요 지점에서의 간섭이 완화 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다. 치료적 간섭은 해로운 과정/경로의 길항 또는 유익한 과정/경로의 자극에 의해 일어날 수 있다.
많은 면역 관련 질병이 공지되어 있고, 집중적으로 연구되었다. 상기 질병은 면역-매개 염증성 질환(예, 류마티스성 관절염, 면역 매개 신 질환, 간담즙성 질환, 염증성 장 질환(IBD), 건선 및 천식), 비 면역-매개 염증성 질환, 감염성 질 환, 면역결핍 질환, 신생물 등을 포함한다.
면역 관련 질병은 면역 반응을 억제함으로써 치료될 수 있다. 면역 자극 활성을 갖는 분자를 억제하는 중화 항체를 사용하는 것이 면역-매개 및 염증성 질환의 치료에 유익할 것이다. 면역 반응을 억제하여 면역 관련 질병을 완화시키기 위해, 면역 반응을 억제하는 분자를 사용할 수 있다(직접적으로는 단백질, 또는 항체 효능제의 사용에 의함).
본 발명은 인터루킨-8(IL-8)과 구조적 상동성을 갖는 신규 케모킨의 동정에 관한 것이다. 상기 2개의 단백질 사이의 아미노산 서열은 낮으나, 이들 둘다는 IL-8을 CXC 케모킨 패밀리원으로 분류하는 CXC 모티프를 가지고 있다. IL-8은 급성 염증성 반응에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 이 반응은 주로 TNF-α, IL-1 및 IL-6에 의해 매개된다. 국소 효과는 혈중 백혈구의 혈관 내피 세포에의 증가된 접착 및 이들의 조직 강으로의 일출을 포함한다. TNF-α및 IL-1은 내피 세포에서 세포-접착 분자(CAMs)의 발현의 증가를 유도한다. 상기 2개의 사이토킨은 또한 대식세포 및 내피 세포에 의한 인터루킨-8의 생성을 유도한다. IL-8은 호중구를 화학주성적으로 유인하여, 이들의 내피 세포에의 접착을 촉진한다. 특히, IL-8은 단핵구 및 수지상 세포를 화학유인한다. 이들 2개의 세포 유형은 면역 반응의 개시에 중요한 역할을 한다.
13년 전 강력한 호중구 화학주성 인자로서 인터루킨-8(IL-8)을 발견한 이래로, 많은 증거에서 이것이 호중구-의존성 급성 염증에서 중요한 매개체라는 것이 입증되었다. 실제, 백혈구 침윤은 염증의 특징이다. 다수의 관찰에서, 다양한 종 류의 세포가 다양한 자극에 반응하여, 또는 악성 형질전환 후 구조적으로 다량의 IL-8을 생성할 수 있음이 입증되었다(Mukaida, N., Internatonal Journal of Hematology, 72(4):391-398 (2000)). 다양한 세포로부터의 염증성 신호에 의해 IL-8의 유리가 촉진된다. 세포 근원의 다양성은 그의 기능의 다면성을 나타낸다. IL-8은 호중구 활성화에 대한 영향을 통해 숙주 방어 기전에 중요한 역할을 하나, 염증성 조건에 반응하여 혈중에 IL-8이 계속하여 존재하는 것은 다양한 조직 손상을 초래할 수 있다. 다양한 벙리학적 조건에서 IL-8의 존재는 그의 작용의 차단이 치료적 목적에 사용될 수 있음을 암시한다(Atta-ur-Rahman et al., Current Pharmaceutical Design , 5(4):241-253 (1999)). 최근, IL-8이 인간 난소암에 있어서 자가분비 성장 인자인 것으로 밝혀졌다. IL-8은 난소암 세포의 진행성 성장에 직접 관여하는 것으로 보인다(Xu, L. 및 Fidler, I. J., Oncology Research, 12(2):97-106 (2000)). 또한, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS) 환자의 기관지폐포 세척액(BAL)에서 IL-8 수준이 증가하는 것으로 발견되었다. ARDS 환자의 BAL 중 항-IL-8:IL-8 복합체의 존재는 ARDS의 진전 및 결과에 대한 ARDS의 중요한 예후 지시자이다(Kurdowska, A. et al,. American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine, 163(2):464-468 (2001)).
상기 논술한 바와 같이, 케모킨으로 공지된 분자 군은 구조적으로 보존된 모티프, 및 백혈구 화학주성을 매개하여 백혈구 거래에 중요한 역할을 하고 조절 기능을 갖는 것으로 특징지워지는 저 분자량(8-11 kDa)의 전구염증성 사이토킨 패밀리이다. 현재, 상기 소 사이토킨이 발달, 조혈, 알레르기, 혈관신생 및 종양발생 을 포함하여, 다양한 지혈 및 질환 과정에 관여한다는 것이 명백하다(Broxmeyer, H. E. et al., J. Exp . Med ., 170:1583 (1989); Cao, Y. et al,. J. Exp . Med ., 182:2069 (1995); 및 Strieter, R. M. et al., J. Biol . Chem ., 270:27348 (1995) 참조). 대부분의 사이토킨은 일정한 자극에 반응하여 발현되나, 몇몇은 구조적으로 발현된다(Wang, J. M. et al., J. Immunol . Methods, 220:1-17 (1998); Baggiolini, M., Annu . Rev . Immunol ., 15:675-705 (1997); 및 Gale, L. M., and McColl, S. R., Bioessays, 21:17-28 (1999)). 또한, RANTES, 대식세포 염증성 단백질(MIP)-1α 및 MIP-1β를 포함하여 몇몇 CC 사이토킨이 HIV 감염을 억제할 수 있는 것으로 발견되었다(Cocchi, F. et al., Science, 270:1811 (1995)).
케모킨 패밀리는 아미노-말단 시스테인 잔기의 위치를 기준으로 하여 4개의 주 서브패밀리로 분류될 수 있다. CXC 케모킨에서는, 첫 2개의 시스테인이 비보존 아미노산에 의해 분리되어 있는 반면, CC 케모킨 패밀리에서는, 상기 2개의 시스테인이 서로 인접해있다. 림포탁틴 (lymphotactin)의 유일한 부원을 갖는 C 케모킨 서브패밀리는 CXC 및 CC 케모킨에 보존된 제2 및 제4 시스테인이 없다. CX3C 막-결합 케모킨은 긴 뮤신형 줄기인 첫 2개의 시스테인과 짧은 막통과 영역 사이에 3개의 아미노산을 갖는다(Bazan, J. F. et al., Nature, 385:640 (1997); Pan, Y. et al., Nature, 387:611 (1997)). 일반적으로, CXC 케모킨이 주로 호중구를 유인하는 반면, CC 케모킨은 주로 단핵구를 유인하고, 림프구, 호염구 및(또는) 호산구를 다양한 선택도로 유인한다. C 케모킨인 림포탁틴은 특히 T 림프구 및 NK 세포에 작용하는 것으로 보인다(Kelner, G. S. et al., Science, 266:1395 (1994) 및 Kennedy, J. G. et al., J. Immunol ., 155:203 (1995)).
수지상 세포(DC)는 면역 반응에 관여된 유일하게 강력한 APCs이다. Ag 전달 보조자로서, 미성숙 수지상 세포는 말초의 Ags를 흡수하고, 이들을 림프 기관의 T 세포 영역으로 운반하여 면역 반응을 도모하면서, 성숙하게 된다. 따라서, 케모킨은 수지상 거래, 성숙 및 기능에 중요한 역할을 한다.
또한, 다수의 사이토킨은 지연형 과민증(DTH) 반응을 생성하는데 관여한다(Banchereau, J., and Steinman, R. M., Nature, 392:245 (1998)). DTH 반응에 관여된 사이토킨 양식은 활성화된 T 세포가 주로 Th1 서브셋으로 구성될 수 있다는 것을 암시한다. IL-2는 자가분비 방식으로 기능하여 사이토킨-생성 T 세포의 증식을 증대시킨다. 상기 세포에 의해 생성된 사이토킨 중 다수는 대식세포를 활성화시키고, 이를 Th1 활성화 부위로 유인한다. IL-3 및 GM-CSF는 과립구-단핵구 직계의 국소 조혈을 유도한다. IFN-γ 및 TNF-β(대식세포-유도 TNF-α 및 IL-1과 함께)는 내피 세포 근처에서 작용하여, 단핵수 및 다른 비특이적 염증성 세포의 일출을 촉진하는 다수의 변화를 유도한다. 유도된 변화 중에는, ICAMs, VCAMs 및 ECAMs을 포함한 세포-접착 분자의 발현의 증가; 일출을 촉진하기 위한 혈관 내피 세포 모양의 변화, 및 IL-8 및 단핵구 화학주성 인자의 분비가 있다. 혈중 호중구 및 단핵구는 혈관 내피 세포에 발현된 접착 분자에 접착하여, 조직 강으로 일출한다. 호중구는 반응의 초기에 출현하나, 단핵구 침윤은 나중에 일어난다(Immunology, Second Edition, Chapter 15, 363-364면 (1994) W. H. Freeman and Company Publishers 참조).
케모킨이 류마티스성 관절염, 면역 매개 신 질환, 간담즙 질환, 염증성 장 질환, 건선, 천식, 다발성 경화증, 죽상동맥경화증, 종양 성장 촉진 또는 퇴행성 관절 질환을 포함하는, 면역 기능에 관련된 다수의 중요한 질병에 기여할 수 있다는 것이 명백해졌기 때문에, 이 분자 패밀리에 대한 관심이 증가하였다. 케모킨 관련 분자가 면역 기능의 조절에 중요한 역할을 차지한다는 점에서, 이 패밀리의 다른 부원 및 특정 표적 세포 집단을 통해 상기 분자의 작용을 지휘하는 수용체의 동정에 관심을 보이고 있다. 이 점에서, 본 발명은 IL-8과 구조적으로 유사한 신규 단백질(본원에서 "PRO842 폴리펩티드"로 표시함), 및 이의 활성 변이체의 클로닝 및 특성화를 기술한다.
발명의 개요
A. 실시양태
본 발명은 인간을 포함한 포유동물에서 면역 관련 질환의 진단 및 치료에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 포유동물의 면역 반응을 촉진하거나 억제하는 단백질(효능제 및 길항제 항체를 포함함)의 동정에 기초한다. 면역 관련 질환은 면역 반응을 억제하거나 증진시킴으로써 치료될 수 있다. 면역 반응을 증진시키는 분자는 항원에 대한 면역 반응을 촉진하거나 강화한다. 면역 반응을 촉진하는 분자는 면역 반응의 증진이 유익한 경우에 치료적으로 사용될 수 있다. 별법으로, 항원에 대한 면역 반응을 약화시키거나 감소시키는 분자(예, 중화 항체)는 면역 반응의 약화가 유익한 경우(예, 염증)에 치료적으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 PRO842 폴리펩티드 및 이의 효능제 및 길항제는 또한 면역 관련 및 염증성 질환의 치료를 위한 의약 및 약제의 제조에 유용하다. 특정 양태에서, 상기 의약 및 약제는 치료 유효량의 PRO842 폴리펩티드, 이의 효능제 또는 길항제를 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함한다. 바람직하게는, 상기 혼합물은 무균이다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 PRO842 폴리펩티드를 후보 분자와 접촉시키고, 상기 PRO842 폴리펩티드에 의해 매개된 생물학적 활성을 모니터링하는 것을 포함하는, PRO842 폴리펩티드에 대한 효능제 또는 길항제를 동정하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, PRO842 폴리펩티드는 천연 서열 PRO842 폴리펩티드이다. 특정 양태에서, PRO842 효능제 또는 길항제는 항-PRO842 항체이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO842 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드에 결합하는 효능제 또는 길항제를 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 조성물에 관한것이다. 한 양태에서, 상기 조성물은 치료 유효량의 폴리펩티드 또는 항체를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 조성물이 면역 자극 분자를 포함하는 경우, 이 조성물은 (a) 이를 필요로 하는 포유동물의 조직으로의 염증세포의 침윤을 증가시키거나, (b) 이를 필요로 하는 포유동물의 면역 반응을 자극하거나 증진시키거나, (c) 항원에 반응하여 이를 필요로 하는 포유동물의 T-림프구의 증식을 증가시키거나, (d) T-림프구의 활성을 자극하거나, 또는 (e) 혈관 투과성을 증가시키는데 유용하다. 추가 양태에서, 상기 조성물이 면역 억제 분자를 포함하는 경우, 이 조성물은 (a) 이를 필요로 하는 포유동물의 조직으로의 염증세포의 침윤을 감소시키거나, (b) 이를 필요로 하는 포유동물의 면역 반응을 억제 또는 감소시키거나, (c) T-림프구의 활성을 감소시키거나, 또는 (d) 항원에 반응하여 이를 필요로 하는 포유동물의 T-림프구의 증식을 감소시키는데 유용하다. 다른 양태에서, 상기 조성물은 예를 들어 추가의 항체, 또는 세포독성 또는 화학요법제일 수 있는 추가의 활성 약제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 무균이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에게 치료 유효량의 PRO842 폴리펩티드, 이의 효능제 또는 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 포유동물에서 면역 관련 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 면역 관련 질환은 전신성 홍반성 낭창, 류마티스성 관절염, 골관절염, 연소성 만성 관절염, 척추관절증, 전신성 경화증, 특발성 염증성 근병증, 쇼그렌 증후군, 전신성 혈관염, 유육종증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 혈소판감소증, 갑상선염, 당뇨병, 면역 매개 신 질환, 중추 및 말초 신경계의 탈수초 질환(예, 다발성 경화증, 특발성 탈수초 다발성 신경병증 또는 길랭-바레 증후군, 및 만성 염증성 탈수초 다발성 신경병증), 간담즙성 질환(예, 감염성, 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염 및 경화성 담간염), 염증성 장 질환, 글루텐 민감성 장병증 및 휘플병, 수포성 피부 질환, 다형 홍반 및 접촉성 피부염, 건선을 포함하는 자가 면역 및 면역 매개 피부 질환, 알레르기성 질환(예, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식 과민증 및 두드러기), 면역성 폐 질환(예, 호산구성 폐렴, 특발성 원발성 섬유증 및 과민성 폐렴), 이식 거부반응 및 이식편대숙주 질환을 포함하는 이식 관련 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 또는 하기에 기술된 임의의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의로, 상기 항체는 모노클로날 항체, 인간화 항체, 항체 단편 또는 단쇄 항체이다. 한 양태에서, 본 발명은 PRO842 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체에 관한 것이다. 다른 양태에서, 상기 항체는 PRO842 폴리펩티드의 활성을 모방하거나(효능제 항체), 역으로 PRO842 폴리펩티드의 활성을 억제 또는 중화한다(길항제 항체). 다른 양태에서, 상기 항체는 바람직하게는 비인간 상보성 결정 부위(CDR) 잔기 및 인간 기본틀 부위(FR) 잔기를 갖는 모노클로날 항체이다. 상기 항체는 표지될 수 있고, 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 다른 양태에서, 상기 항체는 항체 단편, 모노클로날 항체, 단쇄 항체 또는 항-이디오타입 항체이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 항-PRO842 항체를 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 조성물을 제공한다. 한 태양에서, 상기 조성물은 치료 유효량의 항체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 무균이다. 상기 조성물은 확장된 저장 안정성을 달성하도록 보존될 수 있는 액제 형태로 투여될 수 있다. 별법으로, 상기 항체는 모노클로날 항체, 인간화 항체, 항체 단편 또는 단쇄 항체이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO842 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 효능제, 길항제 또는 항체를 포함하는 조성물, (b) 상기 조성물을 함유하는 용기, 및 (c) 상기 용기에 부착된 표지, 또는 상기 PRO842 폴리펩티드, 또는 이의 효능제 또는 길항제의 면역 관련 질환의 치료에 있어서의 용도에 관한, 상기 용기에 포함된 사용 설명서를 포함하는 의약품에 관한 것이다. 상기 조성물은 치료 유효량의 PRO842 폴리펩티드, 또는 이의 효능제 또는 길항제를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 포유동물로부터 얻어진 조직 세포의 시험 샘플 및 (b) 동일한 세포 유형의 공지의 정상 조직 세포의 대조 샘플에서, PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 관련 질환을 진단하는 방법에 관한 것으로, 대조 샘플과 비교하여 시험 샘플에서 더 높거나 더 낮은 발현 수준은 시험 조직 세포가 얻어진 포유동물에서 면역 관련 질환이 존재함을 나타낸다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 항-PRO842 항체를 포유동물로부터 얻어진 조직 세포의 시험 샘플과 접촉시키고, (b) 시험 샘플에서, 상기 항체와 PRO842 폴리펩티드 사이에서의 복합체의 형성을 검출하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 관련 질환을 진단하는 방법에 관한 것으로, 상기 복합체의 형성은 상기 질환의 존재 또는 부재를 나타낸다. 검출은 정성적이거나 정량적일 수 있고, 동일한 세포 유형의 공지의 정상 조직 세포의 대조 샘플에서 복합체의 형성을 모니터링하는 것과 비교하여 수행할 수 있다. 시험 샘플에서 형성된 더 많은 양의 복합체는 시험 조직 세포가 얻어진 포유동물에서 면역 질환의 존재 또는 부재를 나타낸다. 상기 항체는 바람직하게는 검출가능한 표지를 가진다. 예를 들면, 광학 검경, 흐름 세포계량학, 형광학 또는 당업계에 공지된 다른 방법으로 복합체 형성을 모니터링할 수 있다. 시험 샘플은 보통 면역계의 결핍 또는 이상을 가진 것으로 생각되는 객체로부터 얻어진다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO842 폴리펩티드를 함유하는 것으로 생각되는 세포의 시험 샘플을 항-PRO842 항체에 노출시키고, 상기 세포 샘플에 대한 상기 항체의 결합을 결정하는 것을 포함하는, 샘플에서 PRO842 폴리펩티드의 존재를 결정하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 샘플은 PRO842 폴리펩티드를 함유하는 것으로 생각되는 세포를 포함하고, 상기 항체는 상기 세포에 결합한다. 상기 항체는 바람직하게는 검출가능하게 표지되고(되거나) 고체 지지체에 결합된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 항-PRO842 항체 및 담체를 적당한 포장에 포함하는 면역 관련 질환 진단 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 바람직하게는 PRO842 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위한 항체의 용도에 대한 지시사항을 함유한다. 바람직하게는, 상기 담체는 제약학적으로 허용가능하다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 적당한 포장에 항-PRO842 항체를 포함하는 진단 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 바람직하게는 PRO842 폴리펩티드를 검출하기 위한 항체의 용도에 대한 지시사항을 함유한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 포유동물로부터 얻어진 조직 세포의 시험 샘플에서 PRO842 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 관련 질환을 진단하는 방법을 제공하며, 상기 시험 샘플에서 PRO842 폴리펩티드의 존재 또는 부재는 상기 포유동물에서 면역 관련 질환의 존재를 나타낸다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO842 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응의 유도에 적당한 조건 하에서, 세포 및 스크리닝할 시험 화합물을 접촉시키고, (b) 상기 세포 반응의 유도를 결정하여 시험 화합물이 유효 효능제인지를 결정하는 것을 포함하는, PRO842 폴리펩티드의 효능제를 동정하는 방법에 관한 것이며, 상기 세포 반응의 유도는 상기 시험 화합물이 유효 효능제임을 나타낸다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 후보 화합물을 PRO842 폴리펩티드와 상호작용할 수 있는 충분한 시간 및 조건 하에서 PRO842 폴리펩티드와 접촉시키고, PRO842 폴리펩티드의 활성이 억제되는지를 결정하는 것을 포함하는, PRO842 폴리펩티드의 활성을 억제할 수 있는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 특정 태양에서, 후보 화합물 또는 PRO842 폴리펩티드는 고체 지지체 상에 고정된다. 다른 태양에서, 비고정된 성분은 검출가능한 표지를 가진다. 바람직한 태양에서, 이 방법은 (a) PRO842 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응의 유도에 적당한 조건 하에서, 세포 및 스크리닝할 시험 화합물을 접촉시키고, (b) 상기 세포 반응의 유도를 결정하여 시험 화합물이 유효 길항제인지를 결정하는 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, PRO842 폴리펩티드의 발현이 억제되는지를 결정하는 것을 포함하는, PRO842 폴리펩티드를 정상적으로 발현하는 세포에서 상기 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 바람직한 태양에서, 이 방법은 (a) PRO842 폴리펩티드의 발현을 허용하는 적당한 조건 하에서, 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 접촉시키고, (b) 상기 폴리펩티드 발현의 억제를 결정하는 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO842 폴리펩티드, (b) PRO842 폴리펩티드 효능제 또는 (c) PRO842 폴리펩티드 길항제를 코딩하는 핵산 분자를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 면역 관련 질환을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 효능제 또는 길항제는 항-PRO842 항체일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 포유동물은 인간이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 핵산은 생체외 유전자 요법에 의해 투여된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 핵산은 벡터, 더 바람직하게는 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터내에 포함된다.
다른 양태에서, 본 발명은 프로모터, (a) PRO842 폴리펩티드, (b) PRO842 폴리펩티드 효능제 또는 (c) PRO842 폴리펩티드 길항제를 코딩하는 핵산, 및 상기 폴리펩티드의 세포 분비를 위한 신호 서열로 구성된 바이러스 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 입자를 제공하며, 상기 바이러스 백터는 바이러스 구조 단백질과 연관된다. 바람직하게는, 상기 신호 서열은 포유동물, 예를 들면 천연 PRO842 폴리펩티드로부터 유래한다.
다른 양태에서, 본 발명은 레트로바이러스 구조 단백질을 발현하고, 또한 프로모터, (a) PRO842 폴리펩티드, (b) PRO842 폴리펩티드 효능제 또는 (c) PRO842 폴리펩티드 길항제를 코딩하는 핵산, 및 상기 폴리펩티드의 세포 분비를 위한 신호 서열로 구성된 바이러스 벡터를 포함하는 핵산 구조물을 포함하는 세포외 프로듀서 세포에 관한 것이며, 상기 프로듀서 세포는 레트로바이러스 벡터를 구조 단백질과 함께 일괄하여 재조합 레트로바이러스 입자를 생성한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO842 폴리펩티드, (b) PRO842 폴리펩티드 효능제 또는 (c) PRO842 폴리펩티드 길항제를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 혈관으로부터 상기 포유동물의 조직으로 염증성 세포의 침윤을 증진시키는 방법을 제공하며, 포유동물에서 혈관으로부터 염증성 세포의 침윤이 증진된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO842 폴리펩티드, (b) PRO842 폴리펩티드 효능제 또는 (c) PRO842 폴리펩티드 길항제를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 혈관으로부터 상기 포유동물의 조직으로 염증성 세포의 침윤을 감소시키는 방법을 제공하며, 포유동물에서 혈관으로부터 염증성 세포의 침윤이 감소된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO842 폴리펩티드, (b) PRO842 폴리펩티드 효능제 또는 (c) PRO842 폴리펩티드 길항제를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 T-림프구의 활성을 증가시키는 방법을 제공하며, 포유동물에서 T-림프구의 활성이 증가된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO842 폴리펩티드, (b) PRO842 폴리펩티드 효능제 또는 (c) PRO842 폴리펩티드 길항제를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 T-림프구의 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 포유동물에서 T-림프구의 활성이 감소된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO842 폴리펩티드, (b) PRO842 폴리펩티드 효능제 또는 (c) PRO842 폴리펩티드 길항제를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 T-림프구의 증식을 증가시키는 방법을 제공하며, 포유동물에서 T-림프구의 증식이 증가된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO842 폴리펩티드, (b) PRO842 폴리펩티드 효능제 또는 (c) PRO842 폴리펩티드 길항제를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 T-림프구의 증식을 감소시키는 방법을 제공하며, 포유동물에서 T-림프구의 증식이 감소된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO842, 또는 이의 효능제 또는 길항제를 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 조성물; 상기 조성물을 포함하는 용기; 및 퇴행성 연골 질환의 치료에 있어서 상기 조성물의 용도에 관한, 상기 용기에 부착된 표지를 포함하는 키트에 관한 것이다.
B. 부가 실시양태
본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
한 양태에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 개시된 전-길이 아미노산 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드가 없는 아미노산 서열, 본원에 개시된, 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 막통과 단백질의 세포외 영역, 또는 본원에 개시된 전-길이 아미노산 서열의 임의의 특별히 정의된 다른 단편을 갖는 PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) (a)의 DNA 분자의 보체와 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 81% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 82% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 83% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 84% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 85% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 86% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 87% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 88% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 89% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 90% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 91% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 92% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 93% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 94% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 95% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 96% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 97% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 98% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 99% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 개시된 전-길이 PRO842 폴리펩티드 cDNA의 코딩 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드가 없는 PRO842 폴리펩티드의 코딩 서열, 본원에 개시된, 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 막통과 PRO842 폴리펩티드의 세포외 영역의 코딩 서열, 또는 본원에 개시된 전-길이 아미노산 서열의 임의의 특별히 정의된 다른 단편의 코딩 서열을 포함하는 DNA 분자, 또는 (b) (a)의 DNA 분자의 보체와 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 81% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 82% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 83% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 84% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 85% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 86% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 87% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 88% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 89% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 90% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 91% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 92% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 93% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 94% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 95% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 96% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 97% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 98% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 99% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 본원에 개시된 ATCC에 기탁된 임의의 인간 단백질 cDNAs에 의해 코딩된 동일한 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) (a)의 DNA 분자의 보체와 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 81% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 82% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 83% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 84% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 85% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 86% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 87% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 88% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 89% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 90% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 91% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 92% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 93% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 94% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 95% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 96% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 97% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 98% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 99% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 양태는 막통과 영역이 결실되거나 또는 막통과 영역이 불활성화된 PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자, 또는 상기 코딩 뉴클레오티드 서열에 상보적인 단리된 핵산 분자를 제공하며, 상기 폴리펩티드의 막통과 영역(들)은 본원에 개시되어 있다. 따라서, 본원에 기개된 PRO842 폴리펩티드의 가용성 세포외 영역이 고려된다.
다른 실시양태는 예를 들어, 임의로 항-PRO842 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 PRO842 폴리펩티드 코딩 단편을 위한 혼성화 프로브, 또는 안티센스 올리코뉴클레오티드 프로브로 유용할 수 있는 PRO842 폴리펩티드 코딩 서열 단편, 또는 이의 보체에 관한 것이다. 상기 핵산 단편은 일반적으로 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 30개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 40개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 50개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 60개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 70개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 80개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 90개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 100개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 110개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 120개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 130개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 140개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 150개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 160개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 170개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 180개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 190개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 200개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 250개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 300개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 350개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 400개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 450개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 500개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 600개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 700개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 800개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 900개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 1000개 이상의 뉴클레오티드 길이이며, 여기서 용어 "약"은 언급된 뉴클레오티드 서열 길이 ±10 %를 의미한다. PRO842 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열의 신규 단편은, 임의의 널리 공지된 많은 서열 배열 프로그램을 사용하여 PRO842 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열을 다른 공지의 뉴클레오티드 서열과 함께 배열하고, 어느 PRO842 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열 단편(들)이 신규한지를 결정하는 것에 의한 통상적인 방식으로 결정될 수 있다. 상기 모든 PRO842 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열이 본원에서 고려된다. 또한, 상기 뉴클레오티드 분자 단편에 의해 코딩된 PRO842 폴리펩티드 단편, 바람직하게는 항-PRO842 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 PRO842 폴리펩티드 단편도 고려된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 상기에서 동정된 임의의 단리된 핵산 서열에 의해 코딩된 단리된 PRO842 폴리펩티드를 제공한다.
어떤 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 전-길이 아미노산 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드가 없는 아미노산 서열, 본원에 개시된, 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 막통과 단백질의 세포외 영역, 또는 본원에 개시된 전-길이 아미노산 서열의 임의의 특별히 정의된 다른 단편을 갖는 PRO842 폴리펩티드와 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 81% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 82% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 83% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 84% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 85% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 86% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 87% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 88% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 89% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 91% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 92% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 93% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 94% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 95% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 96% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 97% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 98% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO842 폴리펩티드에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 ATCC에 기탁된 임의의 사람 단백질 cDNA에 의해 코딩된 아미노산 서열과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 81% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 82% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 83% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 84% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 85% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 86% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 87% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 88% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 89% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 91% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 92% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 93% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 94% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 95% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 96% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 97% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 98% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO842 폴리펩티드에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본원에 개시된 전-길이 아미노산 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드가 없는 아미노산 서열, 본원에 개시된, 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 막통과 단백질의 세포외 영역, 또는 본원에 개시된 전-길이 아미노산 서열의 임의의 특별히 정의된 다른 단편을 갖는 PRO842 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교시, 약 80% 이상의 포지티브, 또는 약 81% 이상의 포지티브, 또는 약 82% 이상의 포지티브, 또는 약 83% 이상의 포지티브, 또는 약 84% 이상의 포지티브, 또는 약 85% 이상의 포지티브, 또는 약 86% 이상의 포지티브, 또는 약 87% 이상의 포지티브, 또는 약 88% 이상의 포지티브, 또는 약 89% 이상의 포지티브, 또는 약 90% 이상의 포지티브, 또는 약 91% 이상의 포지티브, 또는 약 92% 이상의 포지티브, 또는 약 93% 이상의 포지티브, 또는 약 94% 이상의 포지티브, 또는 약 95% 이상의 포지티브, 또는 약 96% 이상의 포지티브, 또는 약 97% 이상의 포지티브, 또는 약 98% 이상의 포지티브, 또는 약 99% 이상의 포지티브인 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 PRO842 폴리펩티드에 관한 것이다.
특정 양태에서, 본 발명은 N-말단 신호 서열 및(또는) 개시 메티오닌을 가지지 않는 단리된 PRO842 폴리펩티드를 제공하며, 상기 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 또한, PRO842 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 적당한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 세포 배양액으로부터 PRO842 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 이의 제조 방법이 본원에서 본원에 기술된다.
본 발명의 다른 양태에서, 막통과 영역이 결실되거나 또는 막통과 영역이 불활성화된 단리된 PRO842 폴리펩티드가 제공된다. 또한, PRO842 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 적당한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 세포 배양액으로부터 PRO842 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 이의 제조 방법이 본원에서 본원에 기술된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 천연 PRO842 폴리펩티드의 효능제 및 길항제에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 효능제 또는 길항제는 항-PRO842 항체 또는 소분자이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO842 폴리펩티드를 후보 분자와 접촉시키고, 상기 PRO842 폴리펩티드에 의해 매개된 생물학적 활성을 모니터링하는 것을 포함하는, PRO842 폴리펩티드의 효능제 또는 길항제를 동정하는 방법에 관한 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO842 폴리펩티드, 또는 본원에 기술된 PRO842 폴리펩티드의 효능제 또는 길항제, 또는 항-PRO842 항체를 담체와 함께 포함하는 조성물에 관한 것이다. 임의로, 상기 담체는 제약학적으로 허용가능한 담체이다.
본 발명의 다른 실시양태는 PRO842 폴리펩티드, 또는 본원에 기술된 PRO842 폴리펩티드의 효능제 또는 길항제, 또는 항-PRO842 항체의, PRO842 폴리펩티드, 또는 본원에서 정의된 PRO842 폴리펩티드의 효능제 또는 길항제, 또는 항-PRO842 항체에 반응성인 질환의 치료에 유용한 의약품의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 임의의 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 예로써, 상기 숙주 세포는 CHO 세포, E. coli, 효모 또는 바쿨로바이러스 감염된 곤충 세포일 수 있다. 본원에 기술된 임의의 폴리펩티드를 제조하는 방법이 추가로 제공되며, 목적하는 폴리펩티드의 발현에 적당한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고, 세포 배양액으로부터 목적하는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 본원에 기술된 임의의 폴리펩티드를 포함하는 키메릭 분자를 제공한다. 상기 키메릭 분자의 예는 면역글로불린의 에피토프 표지 서열 또는 Fc 부위에 융합된 본원에 기술된 임의의 폴리펩티드를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 또는 하기에 기술된 임의의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의로, 상기 항체는 모노클로날 항체, 인간화 항체, 항체 단편 또는 단쇄 항체이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 게놈 및 cDNA 뉴클레오티드 서열의 단리 또는 안티센스 프로브로 유용한 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하며, 상기 프로브는 상기 또는 하기에 기술된 임의의 뉴클레오티드 서열로부터 유래될 수 있다.
[도면의 간단한 설명]
도 1은 천연 서열 PRO842 cDNA의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:1)을 나타내며, 서열 번호:1은 본원에서 "DNA56855-1447"로 표시된 클론이다.
도 2는 도 1에 나타낸 서열 번호:1의 코딩 서열로부터 유래된 아미노산 서열(서열 번호:2)을 나타낸다.
도 3은 인간 다조직 발현 어레이에 대한 혼성화에 의해 입증된, DNA56855(CK27)조직 발현 패턴을 나타낸다. 폐(A8), 위(B5) 및 기관(H7)에서 상당한 발현이 관찰되었다. 난소, 전립선, 대장 및 태아 폐에서는, 약한 CK27 발현이 검출되었다.
도 4는 인간 다조직 노던 블롯에 대한 150 bp 프로브의 혼성화에 의해 나타난, DNA56855(CK27)의 조직 발현 패턴을 나타낸다. 위, 갑상선, 림프절 및 기관에서 상당한 발현이 관찰되었다.
도 5는 마우스 RNA 블롯에서 CK27의 조직 발현 패턴을 나타낸다. 폐(A4), 갑상선(C2), 악하선(C4) 및 자궁(D5)에서 상당한 발현이 관찰되었다.
도 6은 PRO842에 반응한 PBMC의 트랜스웰 이동 검정을 나타낸다. 결과를 각 세포 아형의 주입 세포의 제시한 농도의 PRO842에 반응한 트랜스웰 저부 챔버로의 이동 백분율로 나타내었다. 각 그래프는 PBMC 서브세트, 즉 (A) CD14+ 단핵구, (B) CD3+ T-세포, (C) CD11c+ CD14-DC, (D) CD16+ 중성구 및 NK 세포의 이동을 나타낸다. (E)는 배지만 함께 예비인큐베이션하거나, 또는 LPS 및 SDF를 25 mg/ml로 사용하여 예비인큐베이션한지 48시간 후, PRO842 (0.5 μM)에 반응한 CD11c+ DC의 이동을 나타낸다. 결과는 (A) 내지 (D)에 대한 4개의 독립적 실험 및 (E)에 대한 2개의 독립적 실험을 대표한다.
도 7은 상이한 롯트의 PRO842(CK27)가 유사한 화학유인 활성을 나타내는 것을 나타낸다.
도 8은 PRO842(CK27)의 열 처리가 수지상 세포(CD11c+ 세포) 및 단핵구 세포(CD14+ 세포)의 PRO842(CK27)로의 화학유인을 감소시키는 것을 나타낸다.
도 9는 인간 DNA56855(CK27) 트랜스제닉 마우스에서 난소낭의 형성을 나타낸다. 위의 좌측 영상은 대조군(비트랜스제닉 마우스의 정상적인 난소)에 상응하고; 아래 좌측 영상은 CK27 트랜스제닉 마우스에서 낭 변성 및 헤모시데린을 나타내고; 위의 우측 영상은 CK27 트랜스제닉 마우스에서 인접 지방세포 조직으로 확장된 헤모시데린 변화를 갖는 난소를 나타내며; 아래 우측 고출력 영상은 안료가 적재된 대식세포의 존재를 나타낸다.
도 10(A)는 PRO842 (서열 번호 2의 염기 27-119번)의 구조적 모델과, 1ICW (IL8E38C/C50A) (서열 번호 3)과의 서열-구조 정렬을 나타낸다. 2차 구조 요소는 리본 (α-나선) 및 화살표 (β-가닥)으로 나타내었다. 시스테인 잔기는 정렬 및 3D 모델에서 밝게 표시하였으며, 그들의 각 디술파이드 다리 (C1-C3; C2-C4)는 서열 및 구조 양자 모두에서 선으로 표시하였다. IL8E38C / C50A에서, 시스테인 C4는 잔기 38번에 대응하며, IL8에서는 잔기 50번에 대응하고, 양자 모두를 정렬에서는 흰색 별로 표시하고, 3D 모델에서는 표지하였다. 도 10(B)는 인간 PRO842 (서열 번호 2의 1-43번, 44-84번 및 85-199번으로 이루어진 3개의 분절), 마우스 PRO842 (서열 번호 4의 1-43번, 44-84번 및 85-199번으로 이루어진 3개의 분절), 인간 CXCL-8 (IL8) (서열 번호 5의 1-33번, 34-70번 및 71-97번으로 이루어진 3개의 분절) 및 CXCL-14 (BRAK/MIP-2γ) (서열 번호 6의 1-35번, 36-72번 및 73-111번으로 이루어진 3개의 분절)에 대한 서열 정렬 및 보존 패턴을 나타낸다.
도 11은 20개의 상위 점수를 나타낸 단백질에 대한 쓰레딩(threading) 결과와, 구조적 및 기능적 가설의 요약을 나타낸다. 각 열은 폴딩 인식 모델을 나타내는데, 이는 PRO842 서열과 폴딩 라이브러리의 주형 폴딩과의 정렬이다. Thr. Idx. = 쓰레딩 지수 (서열 유사 점수와, 잔기-잔기 및 잔기-용매 상호작용으로부터 얻은 에너지 점수의 표준화된 조합). %Id. = 정렬의 서열 유사성 백분율. pl = 경로길이 (pathlength), 서열-구조 정렬에서 차지하는 정렬된 잔기 수. fl = 폴드길이(foldlength), 폴딩된 길이. fl/pl = 폴드길이/경로길이의 비. cl = 신뢰수준, 0.6≤fl/pl≤1.3이면 높은 신뢰수준. FP = 위(僞) 양성. HCL = 높은 신뢰수준. 폴딩 라이브러리로부터의 주형은 그들의 PBD 입력 코드로 열거되어 있다.
도 12는 (A) PBMC를 제시한 농도의 백일해 독소 (PTX)로 예비처리하는 것에 의한 수지상 세포 (DC) 및 단핵구의 PRO842-유도 이동의 억제를 나타낸다. (B) PRO842에 대한 모노클로날 Ab가 단핵구 및 수지상 세포의 PRO842로의 이동을 억제한다. 결과는 (A)에 대한 4개의 독립적 실험, 및 (B)에 대한 2개의 독립적 실험을 대표한다.
도 13은 정상 인간 조직에서 PRO842의 발현 패턴을 나타낸다. (A) 및 (B)는 성인으로부터의 전체 RNA의 노던 블롯 분석이고, (C)는 인간 태아 조직에서 PRO842를 탐지하기 위하여 프로브를 붙인 것이다.
도 14 (A) 내지 (D)는 인간 폐에서의 PRO842의 발현을 나타낸다. 풍부한 점막밑샘을 가지는 기관지의 연속적인 절단을 나타낸다. (A) H&E 염색, (B) 안티센스 33P-표지 PRO842 프로브 및 (C) 센스 프로브를 이용한 현장 혼성화 (in situ hybridization; ISH)의 암시야 이미지, (D) 항-PRO842 Ab를 이용한 면역조직화학 (IHC) 분석. BE(세기관지 상피); SMG (점막밑샘). (E) 내지 (H)는 인간 세기관지 상피 및 폐포 내벽 세포의 서브 세트에서의 PRO842의 발현을 나타낸다. 항-PRO842 Ab (E) 및 (G) 또는 이소형 대조군 Ab (F) 및 (H)로 염색한 절편의 IHC 분석을 나타낸다. ALC (폐포 내벽 세포). (A) 내지 (H)는 천식, 만성 폐쇄 폐질환 또는 정상 폐를 가진 환자로부터의 26개의 폐 샘플을 대표한다.
도 15는 간 질환에서의 PRO842 발현을 나타낸다. (A) 내지 (C)는 정상 간에서 PRO842가 발현되지 않음을 나타낸다. (A) H&E 염색, (B) 안티센스 33P-표지 PRO842 프로브를 이용한 ISH 암시야 이미지, (C) 항-PRO842 Ab를 이용한 IHC. (D) 내지 (G)는 결절 과다형성에서의 PRO842 발현을 나타낸다. (D) H&E 염색, (E) 안티센스 33P-표지 PRO842 프로브를 이용한 ISH 암시야 이미지, (F) 센스 프로브를 이용한 ISH 암시야 이미지, (G) 항-PRO842 Ab를 이용한 IHC. H (간세포); BiE (쓸개 상피 세포); (G)는 (D) 내지 (F)와는 다른 환자로부터 수득하였음; (H) 항-PRO842를 이용한 IHC는 알콜성 경화증에서 쓸개 상피 세포에서의 PRO842의 발현을 나타낸다. 이미지는 8명의 환자의 간 절편을 대표한다.
도 16은 암에서의 PRO842의 발현을 나타낸다. (A) 내지 (C)는 정상 난소에서 PRO842가 발현되지 않음을 나타낸다. (A) H&E 염색, (B) 안티센스 33P-표지 PRO842 프로브를 이용한 ISH 암시야 이미지, (C) 항-PRO842 Ab를 이용한 IHC. GE (생식 상피); S (버팀질); (D) 항-PRO842 Ab를 이용한 IHC는 샘암종의 종양성 상피 세포에서의 PRO842 발현을 나타낸다. 난소 샘암종이 있는 10명의 환자로부터의 대표적 샘플. (E) 및 (F)는 자궁에서의 PRO842 발현을 나타낸다. (E) 항-PRO842 Ab를 이용한 IHC는 정상 자궁에서 PRO842의 발현이 거의 없거나, 상피 세포에서만 매우 약하게 발현되는 것을 나타낸다. (F) 항-PRO842 Ab를 이용한 IHC는 자궁내막 암종에서 PRO842가 강하게 발현되는 것을 나타낸다. 자궁내막 샘암종을 가진 5명의 환자로부터의 대표적 샘플. (G) 및 (H)는 유방암에서 PRO842의 발현을 나타낸다. PRO842 (G) 및 항상 발현되는 유전자 (house keeping gene)인 HPRT (H)에 대한 프라이머를 사용한 자궁암 세포주 BT474, MCF7 및 SKBR3의 RT-PCT 분석. 제시한 바와 같이, 래인 1은 cDNA 없음 (-로 나타냄), 래인 2, 4 및 6은 RT 없음, 래인 3, 5, 7은 RT 함유를 나타낸다.
바람직한 실시양태의 상세한 설명
1. 정의
수 표시가 뒤따라 나오는, 본원에 사용된 용어 "PRO 폴리펩티드" 및 "PRO" 는 다양한 폴리펩티드를 지칭하며, 완전한 표시(즉, PRO/수)는 본원에 기술된 특정 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 용어 "PRO/수 폴리펩티드" 및 "PRO/수"(여기서, 용어 "수"는 본원에서 사용된 바와 같은 실제 수 표시로 제시됨)는 천연 서열 폴리펩티드 및 폴리펩티드 변이체(본원에서 추가로 정의됨)를 포괄한다. 본원에 기술된 PRO 폴리펩티드는 사람 조직 유형 또는 다른 공급원과 같은 다양한 공급원으로부터 단리되거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 용어 "PRO 폴리펩티드"는 본원에 개시된 각 PRO/수 폴리펩티드를 지칭한다. "PRO 폴리펩티드"를 언급하는 본원의 모든 기재는 각 폴리펩티드를 함께 및 개별적으로 지칭한다. 예를 들면, -의 제조, -의 정제, -의 유도, -에 대한 항체의 형성, -의 투여, -를 함유하는 조성물, -를 사용한 질병의 치료 등은 각각 본 발명의 각 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한, 용어 "PRO 폴리펩티드"는 본원에 개시된 PRO/수 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 본원에서 사용될 때, "PRO842", "DMC" 및 "CK27"은 상호교환가능하다.
"천연 서열 PRO842 폴리펩티드"는 천연 유래의 대응하는 PRO842 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 천연 서열 PRO842 폴리펩티드는 천연적으로 단리될 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성에 의해 제조될 수 있다. 용어 "천연 서열 PRO842 폴리펩티드"는 특히, 특정 PRO842 폴리펩티드의 천연 절단 또는 분비 형태(예, 세포외 도메인 서열), 상기 폴리펩티드의 천연 변이체 형태(예, 교대로 접합된 형태) 및 천연 대립 변이체를 포괄한다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 천연 서열 PRO842 폴리펩티드는 첨부된 도면에 나타낸 전-길이 아미노산 서열을 포함하는 성숙 또는 전-길이 천연 서열 폴리펩티드이다. 도면에서 출발 및 종결 코돈을 밑줄을 그은 굵은 글씨체로 나타내었다. 첨부된 도면에 개시된 PRO842 폴리펩티드는 도면에서 1번 아미노산으로 표시된 메티오닌 잔기로 시작하는 것으로 표시되었으나, 도면의 1번 아미노산의 상류 또는 하류에 위치한 또다른 메티오닌 잔기가 PRO842 폴리펩티드의 시작 아미노산 잔기로 사용될 수 있을 것이다.
PRO842 폴리펩티드 "세포외 영역" 또는 "ECD"는 본질적으로 막통과 및 세포질 영역이 없는 PRO842 폴리펩티드 형태를 지칭한다. 통상, PRO842 폴리펩티드 ECD는 1% 미만의 상기 막통과 및(또는) 세포질 영역, 바람직하게는 0.5% 미만의 상기 영역을 가질 것이다. 본 발명의 PRO842 폴리펩티드에 대해 동정된 임의의 막통과 영역은 그러한 유형의 소수성 영역을 동정하기 위해 당업계에서 통상적으로 사용되는 기준에 따라 동정된다. 막통과 영역의 정확한 경계는 달라질 수 있으나, 본원에서 처음에 동정된 영역의 양쪽에서 약 5개 이하의 아미노산 차이를 가질 것이다. 따라서, 임의로, PRO842 폴리펩티드의 세포외 영역은 실시예 또는 명세서에서 동정된 막통과 영역/세포외영역 경계의 양쪽에서 약 5개 이하의 아미노산을 함유할 수 있이며, 결합된 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 상기 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산이 본 발명에 의해 고려된다.
본원에 개시된 다양한 PRO842 폴리펩티드의 "신호 펩티드"의 대략적인 위치가 본원 명세서 및(또는) 첨부된 도면에 나타나있다. 그러나, 신호 펩티드의 C-말단 경계가 달라질 수 있으나, 본원에서 처츰에 동정된 신호 펩티드 C-말단 경계의 양쪽에서 약 5개 이하의 아미노산 차이를 가질 것이며, 신호 펩티드의 C-말단 경계는 그러한 유형의 아미노산 서열을 동정하기 위해 당업계에서 통상적으로 사용되는 기준에 따라 동정될 수 있음에 주목한다(예를 들어, Nielsen et al., Prot . Eng ., 10:1-6 (1997) 및 von Heinje et al., Nucl . Acids . Res ., 14:4683-4690 (1986)). 또한, 어떤 경우에, 분비 폴리펩티드로부터 신호 서열의 절단이 완전히 균일하지 않아, 2개 이상의 분비 종을 생성하는 것으로 생각된다. 신호 펩티드가 본원에서 동정된 신호 펩티드의 C-말단 경계의 양쪽에서 약 5개 이하의 아미노산 내에서 절단된 성숙 폴리펩티드, 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 의해 고려된다.
"PRO842 폴리펩티드 변이체"는 본원에 개시된 전-길이 천연 서열 PRO842 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드가 없는 PRO842 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된, 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 PRO842 폴리펩티드의 세포외 영역, 또는 본원에 개시된 전-길이 PRO842 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 상기 또는 하기에 정의된 활성 PRO842 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 상기 PRO842 폴리펩티드 변이체는 전-길이 천연 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 첨가되거나 결실된 PRO842 폴리펩티드를 포함한다. 통상, PRO842 폴리펩티드 변이체는 본원에 개시된 전-길이 천연 서열 PRO842 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드가 없는 PRO842 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된, 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 PRO842 폴리펩티드의 세포외 영역, 또는 본원에 개시된 전-길이 PRO842 폴리펩티드 서열의 특별히 정의된 임의의 다른 단편과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 81% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 82% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 83% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 84% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 85% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 86% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 87% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 88% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 89% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 91% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 92% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 93% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 94% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 95% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 96% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 97% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 98% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 통상, PRO842 폴리펩티드 변이체는 약 10개 이상의 아미노산, 또는 약 20개 이상의 아미노산, 또는 약 30개 이상의 아미노산, 또는 약 40개 이상의 아미노산, 또는 약 50개 이상의 아미노산, 또는 약 60개 이상의 아미노산, 또는 약 70개 이상의 아미노산, 또는 약 80개 이상의 아미노산, 또는 약 90개 이상의 아미노산, 또는 약 100개 이상의 아미노산, 또는 약 150개 이상의 아미노산, 또는 약 200개 이상의 아미노산, 또는 약 300개 이상의 아미노산, 또는 그 이상의 아미노산 길이이다.
본원에서 동정된 PRO842 폴리펩티드 서열과 관련하여 "아미노산 서열 동일성 %"는 서열을 배열하고, 최대 서열 동일성 %를 달성하기 위해 필요한 경우 갭을 도입한 후, 특정 PRO842 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 %로 정의되고, 임의의 보존적인 치환은 서열 동일성의 일부로 고려되지 않는다. 아미노산 서열 동일성 %를 결정하기 위한 배열은 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공연히 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당업자가 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 당업자는 비교할 전-길이 서열에 대한 최대 배열을 달성하는데 필요한 임의의 알고리듬을 포함하여, 배열을 측정하는데 적합한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 %값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램인 ALIGN-2를 사용하여 얻어지며, ALIGN-2 프로그램의 완전한 소스 코드(source code)가 하기 표 1에 제공된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램의 권한은 제넨테크, 인크 (Genentech, Inc.) 소유이며, 하기 표 1의 소스 코드는 미국 20559 워싱톤 디. 씨. 소재의 미국 저작권청에 사용자 보급과 함께 출원되었고, 미국 저작권 등록 번호 제TXU510087호로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재의 제넨테크, 인크를 통해 공연히 입수가능하거나, 또는 하기 표 1에 제공된 소스 코드로부터 컴파일링(compiling)할 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 시스템, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D 상에서의 사용을 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 달리지지 않는다.
아미노산 서열 비교를 위해 ALIGN-2를 사용할 경우, 당해 아미노산 서열 B에 대한 당해 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %(또는, 당해 아미노산 서열 B와 일정 아미노산 서열 동일성 %를 가지거나 또는 포함하는 당해 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)는 하기와 같이 계산된다:
100 X 분율 X/Y
(여기서, X는 서열 배열 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 배열에서, 동일한 쌍으로 계산된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 총 아미노산 잔기의 수임). 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않을 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것이라는 것을 알 것이다. 이 방법을 사용한 아미노산 서열 동일성 % 계산의 예로, 표 2 및 3은 "PRO"로 표시된 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질"로 표시된 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성 %의 계산 방법을 예시하며, 여기서 "PRO"는 관심있는 가정 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "비교 단백질"은 상기 관심있는 PRO 폴리펩티드와 비교할 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내며, "X," "Y" 및 "Z"는 각각 상이한 가정 아미노산 잔기를 나타낸다.
특별히 달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 %값은 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 위 단락에 기술된 바와 같이 얻어진다. 그러나, 아미노산 서열 동일성 %는 또한 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 하기와 같이 결정될 수도 있다(Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). WU-BLAST-2 조사 파라미터의 대부분은 불변값으로 설정된다. 불변값으로 설정되지 않은 것들, 즉, 조정가능한 파라미터들은 하기 값으로 설정된다; overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold(T) = 11, 및 scoring matrix = BLOSUM62. WU-BLAST-2가 사용될 경우, 아미노산 서열 동일성 %는 (a) 천연 PRO 폴리펩티드로부터 유래된 서열을 갖는 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관심있는 비교 아미노산 서열(즉, PRO 폴리펩티드 변이체일 수 있는, 관심있는 PRO 폴리펩티드와 비교할 서열) 사이의 동일한 아미노산 잔기의 수를 (b) 관심있는 PRO 폴리펩티드의 총 아미노산 잔기의 수로 나누는 것에 의해 결정된다. 예를 들면, "아미노산 서열 B에 대하여 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 A"라는 진술에서, 아미노산 서열 A는 관심있는 비교 아미노산 서열이고, 아미노산 서열 B는 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
핵산 서열 동일성 %는 또한 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2를 사용하여 결정될 수 있다(Altschul 등, Nucleic Acids Res . 25:3389-3402 (1997)). NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 http://www.ncbi.nim.nih.gov로부터 다운로드 받을 수 있거나, 또는 미국 메릴랜드주 베데스다 소재의 국립 위생 연구소로부터 얻을 수 있다. NCBI-BLAST2는 몇 개의 조사 파라미터를 사용하며, 이러한 조사 파라미터 모두는 예를 들면, unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0.01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 및 scoring matrix = BLOSUM62를 포함하는 불변값으로 설정된다.
NCBI-BLAST2가 아미노산 서열 비교에 사용될 경우, 당해 아미노산 서열 B에 대한 당해 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %(또는, 당해 아미노산 서열 B에 대하여 일정 아미노산 서열 동일성 %를 가지거나 포함하는 당해 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)는 하기와 같이 계산된다:
100 X 분율 X/Y
(여기서, X는 서열 배열 프로그램 NCBI-BLAST2에 의한 A 및 B 배열에서, 상기 프로그램에 의해 동일한 쌍으로 계산된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 총 아미노산 잔기의 수임). 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않을 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것이라는 것을 알 것이다.
"PRO842 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO842 변이체 핵산 서열"은 본원에 개시된 전-길이 천연 서열 PRO842 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드가 없는 전-길이 천연 서열 PRO842 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된, 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 PRO842 폴리펩티드의 세포외 영역, 또는 본원에 개시된 전-길이 PRO842 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는, 하기에 정의된 활성 PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 통상, PRO842 변이체 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 전-길이 천연 서열 PRO842 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드가 없는 전-길이 천연 서열 PRO842 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된, 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 PRO842 폴리펩티드의 세포외 영역, 또는 본원에 개시된 전-길이 PRO842 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 81% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 82% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 83% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 84% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 85% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 86% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 87% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 88% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 89% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 90% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 91% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 92% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 93% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 94% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 95% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 96% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 97% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 98% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 99% 이상의 핵산 서열 동일성을 가질 것이다.
통상, PRO842 변이체 폴리뉴클레오티드는 약 30개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 60개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 90개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 120개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 150개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 180개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 210개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 240개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 270개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 300개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 450개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 600개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 900개 이상의 뉴클레오티드, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이이다.
본원에서 동정된 PRO-코딩 핵산 서열과 관련하여 "핵산 서열 동일성 %"는 서열을 배열하고, 최대 서열 동일성 %를 달성하기 위해 필요한 경우 갭을 도입한 후, 관심있는 PRO 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열의 뉴클레오티드의 %로 정의된다. 핵산 서열 동일성 %를 결정하기 위한 배열은 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공연히 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당업자가 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 본원의 목적상, 핵산 서열 동일성 %값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램인 ALIGN-2를 사용하여 얻어지며, ALIGN-2 프로그램의 완전한 소스 코드가 하기 표 1에 제공된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램의 권한은 제넨테크, 인크 소유이며, 하기 표 1의 소스 코드는 미국 20559 워싱톤 디. 씨. 소재의 미국 저작권청에 사용자 보급과 함께 출원되었고, 미국 저작권 등록 번호 제TXU510087호로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재의 제넨테크, 인크를 통해 공연히 입수가능하거나, 또는 하기 표 1에 제공된 소스 코드로부터 컴파일링할 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 시스템, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D 상에서의 사용을 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 달리지지 않는다.
핵산 서열 비교를 위해 ALIGN-2를 사용할 경우, 당해 핵산 서열 D에 대한 당해 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 %(또는, 당해 핵산 서열 D와 일정 핵산 서열 동일성 %를 가지거나 포함하는 당해 핵산 서열 C로 표현될 수 있음)는 하기와 같이 계산된다:
100 X 분율 W/Z
(여기서, W는 서열 배열 프로그램 ALIGN-2에 의한 C 및 D의 배열에서, 동일한 쌍으로 계산된 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D의 총 뉴클레오티드의 수임). 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않을 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 %는 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것이라는 것을 알 것이다. 이 방법을 사용한 핵산 서열 동일성 % 계산의 예로, 표 4 및 5는 "PRO-DNA"로 표시된 핵산 서열에 대한 "비교 DNA"로 표시된 핵산 서열의 핵산 서열 동일성 %의 계산 방법을 예시하며, 여기서 "PRO-DNA"는 관심있는 가정 PRO-코딩 핵산 서열을 나타내고, "비교 DNA"는 관심있는 "PRO-DNA" 핵산 분자와 비교할 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, "N," "L" 및 "V"는 각각 상이한 가정 뉴클레오티드를 나타낸다.
특별히 달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 핵산 서열 동일성 %값은 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 위 단락에 기술된 바와 같이 얻어진다. 그러나, 핵산 서열 동일성 %는 또한 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 하기와 같이 결정될 수도 있다(Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). WU-BLAST-2 조사 파라미터의 대부분은 불변값으로 설정된다. 불변값으로 설정되지 않은 것들, 즉, 조정가능한 파라미터들은 하기 값으로 설정된다; overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold(T) = 11, 및 scoring matrix = BLOSUM62. WU-BLAST-2가 사용될 경우, 핵산 서열 동일성 %는 (a) WU-BLAST-2에 의해 결정된, 천연 서열 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산으로부터 유래된 서열을 갖는 관심있는 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산 분자의 핵산 서열과 관심있는 비교 핵산 분자(즉, PRO 폴리뉴클레오티드 변이체일 수 있는, 관심있는 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산 분자와 비교할 서열) 사이의 동일한 뉴클레오티드의 수를 (b) 관심있는 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산 분자의 총 뉴클레오티드의 수로 나눔으로써 결정된다. 예를 들면, "핵산 서열 B에 대하여 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 A를 포함하는 단리된 핵산 분자"라는 진술에서, 핵산 서열 A는 관심있는 비교 핵산 분자이고, 핵산 서열 B는 관심있는 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산 분자의 핵산 서열이다.
핵산 서열 동일성 %는 또한 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2를 사용하여 결정될 수 있다(Altschul 등, Nucleic Acids Res . 25:3389-3402 (1997)). NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 http://www.ncbi.nim.nih.gov로부터 다운로드 받을 수 있거나, 또는 미국 메릴랜드주 베데스다 소재의 국립 위생 연구소로부터 얻을 수 있다. NCBI-BLAST2는 몇 개의 조사 파라미터를 사용하며, 이러한 조사 파라미터 모두는 예를 들면, unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0.01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 및 scoring matrix = BLOSUM62를 포함하는 불변값으로 설정된다.
NCBI-BLAST2가 서열 비교에 사용될 경우, 당해 핵산 서열 D에 대한 당해 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 %(또는, 당해 핵산 서열 D에 대하여 일정핵산 서열 동일성 %를 가지거나 포함하는 당해 핵산 서열 C로 표현될 수 있음)는 하기와 같이 계산된다:
100 X 분율 W/Z
(여기서, W는 서열 배열 프로그램 NCBI-BLAST2에 의한 C 및 D 배열에서, 상기 프로그램에 의해 동일한 쌍으로 계산된 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D의 총 뉴클레오티드의 수임). 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않을 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 %는 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것이라는 것을 알 것이다.
다른 실시태양에서, PRO 842 변이체 폴리뉴클레오티드는 활성 PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이고, 이는 바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건하에서 전장 PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있다. PRO842 변이체 폴리펩티드는 PRO842 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것 일 수 있다.
본원에서 개시된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 이용된 “단리된”은 천연 환경의 성분으로부터 동정, 분리 및(또는) 회수된 폴리펩티드를 의미한다. 천연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드의 진단 또는 치료 용도를 통상적으로 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시 태양에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝 컵 서열분석기의 이용에 의해 N-말단 또는 중간 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제하거나, (2) 코마시(Coomassie) 블루 또는 바람직하게는 실버 균주를 이용한 비제한적 또는 제한적 조건하에서 SDS-PAGE에 의한 동종성으로 정제할 수 있다. PRO842 폴리펩티드 천연 환경의 1가지 이상의 성분이 존재하지 않기 때문에 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포내 현장에서 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, 단리된 폴리펩티드는 1개 이상의 정제 단계에 의해 제조될 수 있다.
"단리된" PRO842 폴리펩티드-코딩 핵산 또는 다른 폴리펩티드-코딩 핵산은 폴리펩티드-코딩 핵산의 천연 원료에서 원래 연관된 1개 이상의 오염 핵산 분자로부터 동정되고, 분리된 핵산 분지이다. 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는 천연에서 발견되는 폼 또는 세팅과는 구별되는 것이다. 따라서, 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는 천연 세포에서 존재하는 것과 같은 특정 폴리펩티드-코딩 핵산 분자와는 구별된다. 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는 예를 들어, 핵산 분자가 천연 세포의 것과는 다른 염색체 위치에 있는 경우 원래 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 포함된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자를 포함한다.
"조절 서열"은 특정 숙주 생물에서 작용가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 말한다. 원핵 세포에 적절한 조절 서열은 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐레이션 시그날 및 인핸서를 이용하는 것이 공지되어 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 작용적 관계에 놓여있을 때 "작용가능하게 연결된"이라고 한다. 예를 들어, 선행서열 또는 분비 리더를 위한 DNA가 폴리펩티드 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현된다면 폴리펩티드에 대한 DNA와 작용가능하게 연결되어 있는 것이고, 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열과 작용하게 연결되어 있는 것이고, 또는 리보좀 결합 부위가 번역을 용이하게 하도록 위치해 있다면 코딩 서열에 작용가능하게 연결된 것이다. 일반적으로 "작용가능하게 연결된"의 의미는 연결되어 있는 DNA 서열이 근접해 있고, 분비 리더의 경우 근접해 있고 해독 상태에 있다는 것이다. 그러나, 인핸서는 근접해 있을 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 용원(ligation)에 의해 수행된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 다면, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커는 통상적인 관행을 따라 이용된다.
"항체"라는 용어는 광의로 이용되고, 구체적으로는 예를 들어, 단일 항-PRO842 모노클로날 항체(길항제, 효능제 및 중성 항체를 포함함), 폴리에피토픽 특이성을 갖는 항-PRO842 항체 조성물, 단쇄 항-PRO842 항체 및 항-PRO842 항체 단편을 포함한다. 본원에서 이용되는 바와 같이, "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 동종성 항체의 집단을 말하고, 집단에 포함되는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 천연 돌연변이를 제외하면 동일하다.
혼성화 반응에서 "엄격성"은 당업자에 의해 쉽게 식별될 수 있고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 시간 및 염 농도에 따르는 실험적 계산치이다. 일반적으로, 더 긴 프로브는 적당한 어닐링을 위해 더 높은 온도를 필요로하는 반면, 더 짧은 프로브는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보적 스트랜드가 그의 용융 온도 이하의 환경에서 존재하는 경우 재어닐된 변성된 DNA의 능력에 의해 결정된다. 프로브 및 혼성화가능한 서열간의 요망되는 동종성의 정도가 높을수록, 이용될 수 있는 상대 온도도 높아진다. 결과적으로, 더 높은 상대 온도는 반응 조건을 더 엄격하게 하는 반면, 더 낮은 온도는 덜 엄격하게 하는 경향이 있다. 혼성화 반응의 엄격성의 추가적 상세사항 및 설명에 대해서는 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers(1995)]를 참고하라.
*본원에서 정의되는 "엄격한 조건" 또는 "고도의 엄격성 조건"은 (1) 낮은 이온 세기 및 높은 세척을 위한 온도, 예를 들어, 50℃에서 0.015 M 소듐 클로라이드/0.0015 M 소듐 시트레이트/0.1% 소듐 도데실 설페이트를 이용하고; (2) 혼성화 동안 변성제, 예를 들어, 포름아미드, 예를 들어, 42℃의 0.1% 소혈청 알부민을 갖는 50% (v/v) 포름아미드/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/750mM 소듐 클로라이드, 75mM 소듐 시트레이트를 갖는 pH 6.5의 50mM 소듐 포스페이트 완충액을 이용하거나, 또는 (3) 42℃의 50% 포름아미드, 5x SSC (0.75 M NaCl, 0.075M 소듐 시트레이트), 50mM 소듐 포스페이트(pH 6.8), 0.1% 소듐 피로포스페이트, 5 x 덴하트 용액, 소니케이트된 연어 정자 DNA(50 ㎍/ml), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트를 이용하고, 42℃에서 0.2 x SSC(소듐 클로라이드/소듐 시트레이트) 및 55℃의 50% 포름아미드 중에서 세척하고, 이어서, 55℃의 EDTA를 포함하는 0.1 SSC로 구성된 고도의 엄격성 세척을 한다.
"중간 엄격한 조건"은 문헌[Sambrook 등., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기술된 바와 같이 확인될 수 있고, 상기된 것 보다는 덜 엄격한 세척 용액 및 혼성화 조건(예를 들어, 온도, 이온 강도 및 %SDS)의 이용을 포함할 수 있다. 중간 엄격한 조건의 일례는 20% 포름아미드, 5 x SSCC(150mM NaCl, 15mM 트리소듐 시트레이트), 50mM 소듐 포스페이트(pH 7.6), 5 x 덴하르트의 용액, 10% 덱스트란 설페이트 및 20 mg/ml 변성된 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서 37℃에서 밤새 인큐베이션시키고, 이어서, 약 37 내지 50℃에서 1x SSC에서 필터를 세척한다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자에 맞는 온도, 이온 세기 등을 조절하는 방법을 인식할 수 있다.
본원에서 이용된 "표지된 에피토프"라는 용어는 "표지 폴리펩티드"와 접합된 PRO842 폴리펩티드를 포함하는 키메릭 폴리펩티드를 말한다. 표지 폴리펩티드는 항체가 제조되는데 대한 에피토프가 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만, 접합된 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로는 짧다. 표지 폴리펩티드는 바람직하게는 항체가 실질적으로 다른 에피토프와 교차 반응하지 않도록 매우 균일하다. 적절한 표지 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기 및 보통 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기(바람직하게는, 10 내지 20개의 아미노산 잔기)를 갖는다.
본원에서 이용되는 “이뮤노어드헤신”이라는 용어는 이뮤노글로불린 불변 영역의 효과기 작용을 갖는 이종의 단백질의 결합 특이성과 결합하는 항체 유사 분자("어드헤신")를 말한다. 구조적으로, 이뮤노어드헤신은 항체의 안티젠 인식 및 결합 부위와는 다른(즉, 이종성의) 요망되는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열의 접합을 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 통상적으로 수용체 또는 리간드의 1 이상의 결합부위를 포함하는 인접한 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신 중의 이뮤노글로불린 불변 영역 서열은 이뮤노글로불린, 예를 들어, IgG-1, IgG-2, IgG-3 또는 IgG-4 하부종류, IgA(IgA-1 및 IgA-2를 포함함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 얻을 수 있다.
"길항제"라는 용어는 광의로서 사용되었고, 본원의 천연 PRO842 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 전적으로 방해, 억제 또는 중화시키는 임의의 분자를 포함한다. 유사하게, "효능제"라는 용어는 광의로서 사용되었고, 본원의 천연 PRO842 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 임의의 분자를 포함한다. 적절한 효능제 또는 길항제 분자는 구체적으로 효능제 또는 길항제 항체 또는 항체 단편, 단편들 또는 천연 PRO842 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드, 작은 유기분자 등을 포함한다. PRO842 폴리펩티드의 효능제 또는 길항제를 동정하는 방법은 PRO842 폴리펩티드와 후보 효능제 또는 길항제 분자를 접촉시키고, PRO842 폴리펩티드와 일반적으로 연관된 1 이상의 생물학적 활성에서의 검측가능 변화를 측정하는 것을 포함한다.
"치료"는 치료 및 예방적 수단을 모두 말하는 것이고, 여기서 그 목적은 목적하는 병리학적 상태 또는 질환을 예방하거나 감소(감퇴)시키는 것이다. 치료를 필요로 하는 것은 이미 장애를 갖고 있는 것 뿐만아니라 장애를 갖기 쉬운 것 또는 장애를 예방해야 하는 것을 말한다.
"만성" 투여는 확장된 시간 동안 초기 치료 효과(활성)이 유지되도록 급성형에 반대되는 지속형태의 시약의 투여를 말한다. "간헐적" 투여는 중단없이 계속적인 것이 아니라 주기적인 것이다.
치료의 목적을 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 포함하는 포유동물로서 분류된 임의의 동물을 말한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
1 이상의 추가 치료제 "와 함께" 투여는 동시(병행) 및 임의의 순서로의 연속적 투여를 포함한다.
본원에서 이용되는 "캐리어"는 사용되는 복용량 및 농도로 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 제약학적으로 허용가능한 캐리어, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 자주 생리학적으로 허용가능한 캐리어는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학적으로 허용가능한 캐리어의 예는 완충액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 세럼 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 모노사카리드, 디사카라이드 및 글루코스, 마노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트 제, 예를 들어, EDTA; 당 알콜, 예를 들어, 마니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어, 나트륨; 및(또는) 비이온성 계면활성제, 예를 들어, TWEENTM, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및PLURONICS(상표명)을 포함한다.
"항체 단편"은 온전한 항체, 바람직하게는 온전한 항체의 안티젠 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체(Zapata et al., Protein Eng .,8(10):1057-1062[1995]); 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다.
항체의 파파인(papain) 분해는 각각은 1개의 안티젠-결합를 갖는 2개의 동일한 안티젠-결합 부분, 소위, "Fab" 단편 및 쉽게 결정화시키는 능력을 나타내는 명칭, "Fc" 단편을 제공한다. 펩신 처리하여 2개의 안티젠-결합 부위를 갖고, 여전히 가교결합 안티젠이 가능한 F(ab')2을 얻는다.
"Fv"는 완전한 안티젠-인식 및 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 부분은 폐쇄 비공유결합의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 영역의 다이머로 구성된다. 이 형태에서 각 가변 영역의 3개의 CDR은 VH-VL 다이머의 표면 상에 안티젠-결합 부위를 정의하도록 상호작용한다. 선택적으로, 6개의 CDR은 항체에 대한 안티젠-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 전제 결합 부위 보다 더 낮은 친화도에도 불구하고 1개의 가변 영역(또는 안티젠에 특이적인 3개의 CDR을 포함하는 Fv의 절반)은 안티젠을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 제1 불변 영역(CH1)을 포함한다. Fab 단편은 항체 힌지 부분으로부터 1 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 영역의 카르복시 말단에서 소수의 잔기의 첨가에 의한 Fab' 단편과 구별된다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 영역의 시스테인 잔기가 자유 티올기를 포함하는 Fab'에 대한 명칭이다. 본래의 F(ab')2 항체 단편은 그들 간의 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 제조된다. 항체 단편의 다른 화학적 결합은 또한 공지되었다.
척추동물의 항체(이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 2개의 명백히 구별되는 종류, 즉, 카파 및 람다, 중의 하나로서 그의 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여 정해진다.
중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 이뮤노글로불린은 다른 종류로 정해진다. IgA,IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 주요 이뮤노글로불린 종류가 있고, 이들 중 몇가지는 하위종류(동종형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 세부 분류될 수 있다.
"경쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서, 이들 도메인은 단쇄 폴리펩티드로 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항체 결합에 대한 요망되는 구조를 형성하도록 하는 VH 및 VL 영역 간의 폴리펩티드 결합을 포함한다. sFv의 고찰을 위해, 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodoes, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315(1994)]을 참고.
"디아바디"라는 용어는 2개의 안티젠-결합 분위를 갖는 작은 항체 단편을 말하고, 이 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬(VH-VL)에 경쇄 가변 영역(VL)에 연결된 중쇄 가변 영역(VH)를 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 영역 간에 짝짓기가 일어 날 수 없을 정도의 짧은 결합제를 사용함으로써 영역들은 다른 사슬의 상보적 사슬과 짝짓기를 하고, 2개의 항체-결합 부위가 생성되도록 한다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097, WO 93/11161 및 문헌[Hollinger et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448(1993)]에 더 상세히 기술되어 있다.
"단리된" 항체는 천연 환경의 성분으로부터 동정, 분리 및(또는) 회수된 것이다. 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정된 바에 따르면 항체 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 이상으로, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 이용함에 의해 N-말단 또는 중간 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분할 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 실버 균주를 이용하는 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의한 동종성으로 정제한다. 단리된 항체는 항체의 천연 환경의 1개 이상의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포내 현장에서 항체를 포함한다. 본래의 단리된 항체는 1 개 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
특정 폴리펩티디드 또는 특정 폴리펩티드의 에피토프에 "특이적으로 결합한" 또는 "특이적인" 항체는 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않고 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 것이다.
본원에서 이용된 "표지"라는 단어는 "표지된" 항체를 제공하도록 항체에 직접 또는 간접 공유 결합된 검측가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체로(예를 들어, 방사성 동위성 표지 또는 형광 표지) 검측가능하거나, 효소적 표지의 경우 검측가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매화할 수 있다.
"고상"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 말한다. 본원에 포함되는 고상의 예는 유리(예를 들어, 조절 공극 유리), 폴리사카라이드(예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘으로 부분적 또는 전적으로 형성된 것들을 포함한다. 특정 실시태양에서는 상황에 따라 고상은 분석 플레이트의 벽을 포함할 수 있고, 다른 경우에는 정제 컬럼(예를 들어, 친화성 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 분별입자의 비연속성 고상을, 예를 들어 미국 특허 제 4,275,149호에 기술된 것을 포함한다.
"리포좀"은 포유동물로의 약물(예를 들어, PRO842 폴리펩티드 또는 그에 대한 항체) 전달에 유용한 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 구성된 작은 소포이다.
본원에서 "저분자"는 약 500 달톤 미만의 분자량을 갖는 것으로 정의된다.
"조절"이라는 용어는 시그날 경로의 수준에 영향(예를 들어, 상향 조절, 하향 조절 또는 그외의 조절)을 의미하는 시그날 전사의 제어 하에 있는 세포 과정은 특정 유전자의 전사, 표준 세포 작용, 예를 들어, 신진대사, 증식, 분화, 부착, 세포자멸 및 생존 뿐만 아니라 비정상적 과정, 예를 들어, 변형, 분화의 방해 및 전이를 포함하고, 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에서 "활성있는" 또는 "활성"은 본래 또는 천연의 PRO842 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 보유한 PRO842 폴리펩티드의 형태를 말하고, 여기서, "생물학적" 활성은 본래 또는 천연의 PRO842 폴리펩티드가 갖고 있는 안티젠 에피토프에 대한 항체의 생산을 유발하는 능력이 아니라 본래 또는 천연의 PRO842 폴리펩티드에 의해 유발된 생물학적 작용(예를 들어, 억제 또는 자극적)을 말하고, "면역" 활성은 본래 또는 천연의 PRO842 폴리펩티드가 갖고 있는 안티젠 에피토프에 애한 항체의 생산을 유발하는 능력을 말한다.
"면역학적" 활성은 본래 또는 천연의 PRO842 폴리펩티드를 갖고 있는 안티젠 에피토프에 대한 항체의 생산을 유발하는 능력 만을 말한다.
"면역계 질환"은 포유 동물의 면역계의 구성 성분이 포유 동물의 이환율을 유발하거나, 매개하거나, 또는 그렇지 않으면 그 원인이 되는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 간섭이 질환의 진행에 개선된 영향을 주는 질환을 포함한다. 이 용어에는 면역계 염증성 질환, 비면역계 염증성 질환, 감염 질환, 면역 결핍 질환, 신생물 등을 포함된다.
"T 세포 매개 질환"이라는 용어는 T 세포가 포유동물의 이환율을 직접적으로 또는 간접적으로 매개하거나 또는 그렇지 않으면 원인이 되는 질환을 의미한다. T-세포 매개 질병은 세포 매개 효과, 림포킨 매개 효과 등과 관련되고, 심지어, B 세포가 예를 들어 T 세포에 의해 분비되는 림포킨에 의해 자극되는 경우라면, B 세포와 관련된 효과일 수 있다.
본원 발명에 따라 치료될 수 있는 면역계 및 염증성 질환의 예 및 면역 또는 T 세포 매개 질환을 포함하는 예는 전신성 홍반성 낭창증, 류마티스성 관절염, 유아 만성 관절염, 척추관절염, 전신성 경화증(피부경화증), 특발성 염증성 근염(피부근염, 다발성근염), 쇼그렌 증후군, 전신성 혈관염, 사르코이도증, 자가면역 용혈성 빈혈(면역 범혈구감소증, 발작성 야간혈색소뇨증), 자가면역 혈소판감소증(특발성 혈소판감소성 자반증, 면역 매개 혈소판감소증), 갑상선염(그레이브 병, 하시모토 갑상선염, 유아림프구성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 당뇨병, 면역매개 신질환(사구체신염, 세뇨관 간질성병), 중추신경계 및 말초신경계의 탈수초성 질환, 예를 들어, 다발성 경화증, 특발성 탈수초다발성신경병증 또는 구이라인-바레 증후군 및 만성 염증성 탈수초다발성신경병증, 담즙성 질환, 예를 들어, 감염성 간염(A,B,C,D,E형 간염 및 다른 비-간친화성 바이러스), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담관 경화증, 육아종 간염 및 경화성 담관염, 염증성 장질환(궤양성 장염, 크론병), 글루텐 민감성 내병증, 위플병, 수포성 피부 질환을 포함하는 자가면역 또는 면역매개 피부질환, 다형 홍반 및 접촉성 피부염, 건선, 알레르기성 질환, 예를 들어, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 식품 과민증 및 담마진, 난소의 면역학적 질환, 폐의 면역학적 질환, 예를 들어, 호상구성 폐렴, 특발성 폐섬유증, 과민성 폐렴, 이식편 거부 반응 및 이식편 대 숙주 질환을 포함하는 이식관련 질환을 포함한다. 바이러스 성 질환을 포함하는 감염성 질환, 예를 들어, AIDS(HIV 감염), A,B,C,D 및 E형 간염, 헤르페스 등, 박테리아성 감염, 진균성 감염, 원충 감염 및 기생감염.
"유효량"이라는 용어는 특정 상기 목적을 달성하도록 하는 PRO842 폴리펩티드 및(또는) 효능제/길항제의 농도 또는 양이다. PRO842 폴리펩티드 또는 그의 효능제 또는 길항제의 "유효량"은 실험적으로 측정될 수 있다. 또한, "치료 유효량"은 상기 치료 효과를 달성하는데 효과적인 PRO842 폴리펩티드 및(또는) 효능제/길항제의 농도 또는 양이다. 이 양도 또한 실험적으로 측정될 수 있다.
본원에서 이용되는 "세포독성 약제"라는 용어는 세포의 작용을 억제 또는 예방하고(예방하거나) 세포의 파괴를 유발하는 물질을 말한다. 이 용어는 방사성 동위원소(예를 들어, I131, I125, Y90 및 Re186), 화학요법제 및 독소, 예를 들어, 박테리아, 진균성, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편을 포함한다.
"화학요법제"는 암치료에서 유용한 화합물이다. 화합요법제의 예는 아드리아미신, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 시톡신, 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀(탁솔, 뉴저지주 프린스톤에 소재하는 브리스톨 마이어스 스퀴브 온콜로지의 제품) 및 독세타셀(탁소테르, 프랑스 안토니 소재의 롱쁠랑 로레르의 제품), 톡소테르, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 브레오미신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토미신 C, 미톡산트론, 빈크리스틴, 빈오렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노미신, 카르미노미신, 아미노프테린, 다크티노미신, 미토미신, 에스페라미신(미국 특허 제 4,675,187호 참고), 멜팔란 및 기타 관련 질소 무스타드를 포함한다. 이들 정의에는 타목시펜 및 오나프리스톤과 같은 종양에서 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 호르몬제를 포함한다.
본원에서 이용되는 "성장억제제"는 세포, 특히 생체내 또는 생체외에서 본원에서 동정되는 임의의 유전자를 과다발현시키는 암세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 말한다. 따라서, 성장억제제는 S 상에서 이러한 유전자의 과다 발현을 시키는 세포의 퍼센트를 현저하게 감소시키는 것이다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행(S 상 이외의 장소에서)을 방해하는 약제, 예를 들어, G1기 정체 및 M 상 정체를 유발하는 약제를 포함한다. 고전적인 M-상 억제제는 빈카스(빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔 및 토포 II 억제제, 예를 들어, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오미신을 포함한다. G1을 정체시키는 이들 약제는 S-상 정체까지 영향을 미치는 데, 예를 들어, DNA 알칼화 제, 예를 들어, 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C이다. 추가 정보는 문헌[The Molecular Basis of Cancer , Mendelsohn and Israel , eds ., Chapter I, 제목: "Cell cycle regulation, oncogen, and antineoplastic drugs ", 저자:Murakami et al.,(WB Saunders: Philadelphia, 1995), 특히, 페이지 13]에 나타난다.
"사이토킨"이라는 용어는 세포내 매개체로서 다른 세포상에 작용하는 1 세포 집단에 의해 방출된 단백질의 속명이다. 이러한 사이토카인의 예는 림포킨, 모노킨 및 전형적인 폴리펩티드 호르몬이다. 사이토킨 중에 성장 호르몬, 예를 들어, 인간성장호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 파라티로이드 호르몬; 티록시; 인슐린; 프로인슐린; 릴락신; 프로릴락신; 글리코프로테인 호르몬, 예를 들어, 여포 자극 호르몬(FSF), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체 호르몬(LH); 간 성장 인자; 섬유모세포 성장인자, 프로락틴, 플라센탈 락토겐, 종양 괴사 인자-α및 -β, 물레리안 억제 물질, 생쥐 고나도트로핀-관련 펩티드, 인히빈, 악티빈, 혈관내 성장인자, 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자, 예를 들어, NGF-β; 혈소판-성장 인자; 전환 성장 인자(TGF), 예를 들어, TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예를 들어, 인터페론-α, β 및 γ; 콜로니 자극 인자(CSF), 예를 들어, 대식세포-CSF(M-CSF); 그라뉼로시테-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 그라뉼로시테-CSF(G-CSF); 인터루킨(IL), 예를 들어, IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 또는 IL-17; 종양 괴사 인자, 예를 들어, TNF-α 또는 TNF-β; 및 백혈병 억제제 인자(LIF) 및 키트 리간드(KL)을 포함하는 기타 폴리펩티드 인자를 포함한다. 본원에서 사용된 사이토킨이라는 용어는 천연 또는 재조합 세포 배양물으로부터 얻은 단백질 또는 천연 서열 사이토킨의 생물학적 활성 균등체를 포함한다.
"케모킨"이라는 용어는 구조적으로 보존된 모티프 및 백혈구 화학주성을 매개하여 백혈구 트래피킹(trafficking)의 역할을 하고, 백혈구 조절의 역할을 하는 능력을 특징으로 하는 저분자량(8-11 kDa)의 전염증성 사이토킨의 종에 속하는 분자 종류를 말한다.
[표 1]
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Figure 112007011537468-PCT00002
Figure 112007011537468-PCT00003
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Figure 112007011537468-PCT00008
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Figure 112007011537468-PCT00012
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Figure 112007011537468-PCT00016
Figure 112007011537468-PCT00017
[표 2]
PRO XXXXXXXXXXXXXXX (길이=15 아미노산)
비교 단백질 XXXXXYYYYYYY (길이=12 아미노산)
% 아미노산 서열 동일성=
(ALIGN-2에 의해 측정되는 2개의 폴리펩티드 서열간의 아미노산 잔기의 동일 매칭의 수) 나누기 (PRO 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총 수)=
5 나누기 15 = 33.3%
[표 3]
PRO XXXXXXXXXX (길이=10 아미노산)
비교 단백질 XXXXXYYYYYYZZYZ (길이=15 아미노산)
% 아미노산 서열 동일성=
(ALIGN-2에 의해 측정되는 2개의 폴리펩티드 서열간의 아미노산 잔기의 동일 매칭의 수) 나누기 (PRO 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총 수)=
5 나누기 10 = 50 %
[표 4]
PRO-DNA NNNNNNNNNNNNNN (길이=14 뉴클레오티드)
비교 DNA NNNNNNLLLLLLLLLL (길이=16 뉴클레오티드)
% 아미노산 서열 동일성=
(ALIGN-2에 의해 측정되는 2개의 핵산 서열간의 뉴클레오티드의 동일 매칭의 수) 나누기 (PRO-DNA 핵산 서열의 뉴클레오티드의 총 수)=
6 나누기 14 = 42.9%
[표 5]
PRO-DNA NNNNNNNNNNNN (길이=12 뉴클레오티드)
비교 DNA NNNNLLLVV (길이=9 뉴클레오티드)
% 아미노산 서열 동일성=
(ALIGN-2에 의해 측정되는 2개의 핵산 서열간의 뉴클레오티드의 동일 매칭의 수) 나누기 (PRO-DNA 핵산 서열의 뉴클레오티드의 총 수)=
4 나누기 12 = 33.3%
II. 조성물 및 본 발명의 방법
A. 전장 PRO842 폴리펩티드
본 발명은 PRO842 폴리펩티드로서 본 발명에서 언급되는 폴리펩티드를 코딩하는 새로 동정되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 다양한 PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA는 하기 실시예에서 상세히 기술되는 바와 같이 동정되고 단리되었다. 구별되는 발현 라운드에서 생산되는 단백질은 주어진 다른 PRO 수일 수 있지만, UNQ 수는 임의의 주어진 DNA 및 코딩된 단백질에 대해서 유일하고, 변화되지 않는다는 것이 인식된다. 간결성을 위해 본 명세서에서는 전장 천연 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질 뿐만 아니라 모든 PRO의 하기 정의에 포함되는 천연 동종체 및 변이체를 그들의 기원 또는 제조 방법에 관계없이 "PRO/수"로서 언급한다.
하기 실시예에서 개시되는 바와 같이 cDNA 클론은 ATCC에 기탁되었다. 이들 클론의 실제 뉴클레오티드 서열은 당업계에 일반적인 방법을 이용하여 기탁된 클론의 시퀀싱에 의해 당업자는 쉽게 측정가능하다. 예견된 아미노산 서열은 보통의 기술을 이용하여 뉴클레오티드 서열로부터 측정할 수 있다. 본원에 기술된 PRO842 폴리펩티드 및 코딩 핵산에 관하여 출원인들은 당시 입수가능한 서열 정보와 가장 일치하는 리딩 프레임이라고 여겨지는 것임을 확인하였다.
B. PRO842 폴리펩티드 변이체
본원에 기술된 전장 천연 서열 PRO842 폴리펩티드 이외에, PRO842 변이체가 제조될 수 있다고 고려된다. PRO842 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 PRO842 DNA에 도입 및(또는) 목적하는 PRO842 폴리펩티드의 합성에 의해 제조될 수 있다. 당업자는 아미노산 변화가 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변화 또는 멤브레인 고정 성질을 변경하는 것과 같이 PRO842의 후번역 과정을 변경할 수 있다고 생각할 것이다.
천연 전장 서열 PRO842 또는 본원에 기술된 PRO842의 다양한 영역의 변이는 예를 들어, 보존적 및 비보존적 돌연변이에 대한 임의의 기술 또는 안내(예를 들어, 미국 특허 제 5,364,934호)를 이용하여 이루어질 수 있다. 변이는 천연 서열 PRO842에 비교하여 PRO842의 아미노산 서열에서 변화를 일으키는 PRO842를 코딩하는 1 이상의 코돈의 치환, 삭제 또는 삽입일 수 있다. 선택적으로 변이는 PRO842의 1 이상의 영역에서 1 이상의 아미노산을 임의의 다른 아미노산과 치환함에 의한 것 일 수 있다. 아미노산 잔기가 바람직한 활성에 대한 반대 작용 없이 삽입, 치환 또는 삭제될 수 있는 지를 측정하기 위한 안내는 동종성 공지된 단백질 분자의 서열과 PRO842 서열을 비교하고, 고도의 동종성 부분에서 제조되는 아미노산 서열 변화의 수를 최소함에 의해 확인될 수 있다. 아미노산 치환은 1 개의 아미노산과 유사한 구조 및(또는) 화학 성질을 갖는 다른 아미노산과의 치환, 예를 들어, 루신을 시린으로의 치환, 즉, 보존적 아미노산 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 삭제는 선택적으로 1 내지 5개의 아미노산의 범위일 수 있다. 허락된 변이는 서열내에 아미노산의 삽입, 삭제 또는 치환에 의해서, 및 전장 또는 성숙한 천연 서열로 나타나는 활성에 대한 생성되는 변이체의 시험에 의해 측정될 수 있다.
PRO842 폴리펩티드 단편은 본원에서 제공된다. 상기 단편은 N-말단 또는 C-말단에서 절단될 수 있거나, 예를 들어, 전장 천연 단백질과 비교할 때 중간 잔기가 부재할 수 있다. 특정 단편은 PRO842 폴리펩티드의 요망되는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 부재할 수 있다.
PRO842 단편은 임의의 다수의 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 요망되는 펩티드 단편은 화학적으로 합성될 수 있다. 선택적인 접근이 효소 분해, 예를 들어, 특정 아미노산 잔기에 의해 정의되는 부위에서 단백질을 절단하는 것으로 공지된 효소로 단백질을 처리함에 의해 또는 적절한 제한 효소로 DNA를 분해하고 목적하는 단편을 단리함에 의해서 PRO842 단편을 생성하는 것을 포함한다. 다른 적절한 기술은 폴리머라제 사슬 반응(PCR)에 의해 목적하는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA단편을 단리 및 증폭시킴을 포함한다. DNA 단편의 목적하는 말단을 정의하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머에서 사용된다. 바람직하게는, PRO842 폴리펩티드 단편은 1 이상의 본원에 개시된 천연 PRO842 폴리펩티드가 갖는 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 공유한다.
특정 실시태양에서 목적하는 보존적 치환은 바람직한 치환기라는 열 제목의 표 6에 제시하였다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 초래한다면, 더 실질적인 변화, 표 6 중의 명명된 예시 치환체 또는 아미노산 군에 관한 하기 기술이 도입되고, 생성물이 스크리닝된다.
[표 6]
Figure 112007011537468-PCT00018
PRO842 폴리펩티드의 작용 또는 면역학적 동정에 대한 실질적인 변형은 (a) 시트 또는 나선 형태로서 치환기의 부분에서 폴리펩티드 골격 구조, (b) 목적 부위에 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 대한 영향에서 현저하게 다른 치환기를 선택함으로써 얻어진다. 천연 잔기는 통상적인 측쇄 성질에 기초하여 군을 나눈다:
(1) 소수성: norleucin, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 체인 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비보존성 치환기는 또다른 군에 대한 이들 군 중의 하나의 구성원를 교환하는 것을 수반할 것이다. 이렇게 치환된 잔기는 보존적 치환 부위 또는 바람직하게는 남아있는(비보존적) 부위로 도입될 수 있다.
변형체는 올리고뉴클레오티드-매개(부위-지시) 돌연변이, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이와 같은 공지 기술의 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 부위 지시 돌연변이(Carter et al., Nucl . Acids Res ., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl . Acids Res ., 10: 6487 (1987)], 카세트 돌연변이(Wells et al., Gene , 34: 315 [1985]), 제한 선택 돌연변이(Wells et al., Philos . Trans . R. Soc . London SerA , 317 : 415 [1986]) 또는 기타 공지 기술은 클론된 DNA에서 수행되어 PRO842 변형 DNA를 제조할 수 있다.
스캐닝 아미노산 분석은 또한 인접한 서열을 따라 1 개 이상의 아미노산을 동정하는데 이용할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 상대적으로 작고 중성인 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 시린 및 시스테인을 포함한다. 알라닌은 베타-탄소 아래의 측쇄를 제거하고 변형체의 주쇄 형태를 잘 변경시키지 않기 때문에 이들 군 중에서 통상적으로 바람직한 스캐닝 아미노산이다(Cunningham and Wells,Science ,244:1081-1085 [1989]). 알라닌은 또한 그것이 가장 흔한 아미노산이기 때문에 통상적으로 바람직하다. 또한, 이는 매몰 위치 및 노출 위치 둘 다에서 빈번히 발견된다(Creighton, The Proteins,(W.H. Freeman & Co.,N.Y.); Chothia, J. Mol . Biol ., 150: 1 [1976]). 알라닌 치환기로 변형체의 적당량을 얻지 못한다면, 등가의 아미노산이 이용될 수 있다.
C. PRO 842의 변형
PRO 842의 공유(covalent) 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유 변형의 일종은 PRO842 폴리펩티드의 목적 아미노산 잔기와 PRO 842의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응하는 유기 유도제를 반응시키는 것을 포함한다. 이작용성 약제의 유도는 예를 들어, 항-PRO842 항체 또는 그 반대를 정제하는 방법에서 이용되는 수-불용성 지지체 매트릭스 또는 표면과 PRO842를 가교 결합하는데 유용하다. 통상적으로 사용되는 가교제는 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산을 갖는 에스테르, 디숙신이미딜 에스테르, 예를 들어, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)를 포함하는 단종의 이작용성 이미도에스테르, 이작용성 말레이미드, 예를 들어, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄 및 약제, 예를 들어, 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트를 포함한다.
다른 변형체는 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기를 대응되는 글루타밀 및 아스파틸 잔기로 각각 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록시화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화[T. E. Creighton, Proteins : Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화 및 임의의 C-말단 카르복시기의 아미드화를 포함한다.
본원의 범위에 포함되는 PRO842 폴리펩티드의 다른 종류의 공유 변형은 폴리펩티드의 천연 글리코실화를 변경하는 것을 포함한다. "천연 글리코실화 패턴의 변경"은 본원에서 천연 서열 PRO842에서 발견되는 1 이상의 카르보히드레이트 부분을 (하부 글리코실화 부위를 제거하거나 화학적 및(또는) 효소적 수단으로 글리코실화를 제거함에 의해서) 삭제하고(삭제하거나) 천연 서열 PRO842에는 존재하지 않는 1 이상의 글리코실화 부위를 추가하는 것을 의미하는 것이다. 또한, 상기 어구는 존재하는 다양한 탄수화물 부분의 성질 및 비율을 변화시키는 것에 관련된 천연 단백질의 글리코실화에서의 질적인 변화를 포함한다.
글리코실화 부위를 PRO842 폴리펩티드로 추가하는 것은 아미노산 서열의 변경에 의해 수행될 수 있다. 이 변경은 예를 들어, 천연 서열 PRO842(O-결합 글리코실화 부위)에 1 이상의 시린 또는 트레오닌 잔기를 추가 또는 치환함으로써 제공될 수 있다. PRO842 아미노산 서열은 특히 요망되는 아미노산으로 번역되는 코돈을 생성시키는 사전 선택된 염기에서 PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 돌연변이화함에 의해 DNA 단계에서의 변화를 통해 선택적으로 변경시킬 수 있다.
PRO842 폴리펩티드 상에서 탄수화물 부분의 수를 증가시키는 또다른 방법은 글리코시드와 폴리펩티드의 화학적 또는 효소적 결합에 의하는 것이다. 상기 방법은 예를 들어, 1987년 9월 11일 발행된 WO87/05330 및 문헌[Aplin and Wriston, CRC Crit . Rev . Biochem., pp. 259306 (1981)]에 기술된다.
PRO842 폴리펩티드 상에 존재하는 탄수화물 부분의 제거는 글리코실화에 대한 표적으로서 작용을 하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이성 치환에 의해 또는 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 문헌[Hakimuddin, et al., Arch . Biochem . Biophys., 259: 52 (1987)] 및 문헌[Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981)]에 기술되어 있다. 폴리펩티드 상에서 탄수화물 부분의 효소적 절단은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 이용하여 얻을 수 있다(문헌[Thotakura et al., Meth . Enzymol ., 138: 350 (1987)] 참고).
*또다른 종류의 PRO842의 공유 변형은 미국 특허 제 4,640,835호; 제 4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 제시된 방법으로 PRO842 폴리펩티드와 다양한 비단백질성 중합체 중의 하나, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 결합함을 포함한다.
본원 발명의 PRO842는 또한 다른 이종성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열과 접합된 PRO842를 포함하는 키메릭 분자를 형성하는 방식으로 변형시킬 수 있다.
한 실시태양에서, 상기 키메릭 분자는 안티-표지(anti-tag) 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 표지 폴리펩티드와 PRO842의 접합을 포함한다. 에피토프 표지는 일반적으로 PRO842의 아미노 또는 카르복실 말단에 위치한다. PRO842의 상기 에피토프-표지 형태의 존재는 표지 폴리펩티드에 대한 항체를 이용하여 검측할 수 있다. 또한, 에피토프 표지의 공급은 PRO842가 에피토프 표지에 결합된 다른 종류의 친화성 매트릭스 또는 안티-표지 항체를 이용하여 친화성 정제에 의해 쉽게 정제시킬 수 있다. 다양한 표지 폴리펩티드 및 그 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 예에는 폴리-히스티딘(폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신(폴리-his-gly) 태그; flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5[Field et al., Mol . Cell . Biol ., 8 : 2159-2165 (1988)]; c-myc 표지 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체[Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; 및 헤르페스 심플렉스(Herpes Simplex) 바이러스 글리코프로테인(gD) 표지 및 그의 항체[Paborsky et al., Protein Engineering , 3 (6):547-553(1990)]가 포함된다. 다른 태그 폴리펩티드는 플래그-펩티드(Flag-peptide)[Hopp etal.,BioTechnology , 6:1204-1210(1988)]; KT3 에피토프 펩티드[Martin et al., Science , 255: 192-194 (1992)]; α-튜블린 에피토프 펩티드[Skinner et al., J. Biol . Chem ., 266 : 15163-15166 (1991)]; 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 [Lutz Freyermuth et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87 : 6393-6397 (1990)]을 포함한다.
다른 실시태양에서, 키메릭 분자는 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린의 특정 부분과 PRO842의 접합을 포함할 수 있다. 키메릭 분자의 이가 형태를 위해("이뮤노어드헤신"으로도 언급됨), IgG 분자의 Fc 부분과의 접합이 가능할 수 있다. Ig 접합은 바람직하게는 Ig 분자내 1 이상의 가변 영역 대신 PRO842 폴리펩티드의 가용성(삭제되거나 불활성화된 투과막 영역) 형태의 치환을 포함한다. 특정 바람직한 실시태양에서는 이뮤노글로불린 접합은 IgG1 분자의 힌지(hinge), CH2 및 CH3 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 부분을 포함한다. 이뮤노글로불린 접합의 제조에 대해서는 1995년 6월 27일 등록된 미국 특허 제 5,428,130호를 참고.
또다른 실시태양에서, 본원 발명의 PRO842 폴리펩티드는 루신 지퍼와 접합된 PRO842 폴리펩티드를 포함하는 키메릭 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다. 다양한 루신 지퍼 폴리펩티드는 당업계에 개시되어 있다. 문헌[Landschulz et al., Science , 240: 1759(1988)]; WO 94/10308; 문헌[Hoppe et al., FEBS Letters . 344:1991(1994)]; 문헌[Maniatis et al., Nature , 341: 24 (1989)] 참고. PRO842 폴리펩티드에 접합된 루신 지퍼의 사용은 용액에서 가용성 PRO842 폴리펩티드의 다이머화 또는 트리머화를 보조하는데 바람직할 수 있다. 당업자라면 PRO842 분자의 C-말단에 접합하는 것을 알 수 있다.
D. PRO842 의 제조
하기 기술은 주로 PRO842 핵산를 함유하는 벡터로 트랜스팩션되거나 형질전환된 세포를 배양함에 의한 PRO842의 제조에 관한 것이다. 당업계에 공지된 별법은 PRO842를 제조하는데 사용될 수 있다고 사료된다. 예를 들어, PRO842 서열 또는 그의 부분은 고상 기술(문헌[Stewart et al., Solid - Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am . Chem . Soc., 85: 2149-2154 (1963)]을 참고)을 이용하여 직접 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 생체외 단백질 합성은 안내 기술을 이용하거나 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성은 문헌[Applied Biosystems Peptide Synthesizer(Foster City, CA)] 또는 제조자 설명서를 이용하여 수행될 수 있다. PRO842의 다양한 부분이 전장 PRO842를 제조하는 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 화학적으로 개별 합성되고 결합될 수 있다.
1. PRO842 코딩하는 DNA 의 단리
PRO842를 코딩하는 DNA는 PRO842 mRNA를 소유하고, 검측가능한 수준으로 발현된다고 여겨지는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 따라서, 인간 PRO842 DNA는 실시예에 기술된 바와 같은 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 얻을 수 있다. PRO842-코딩하는 유전자는 게놈성 라이브러리 또는 공지된 합성 과정(예를 들어, 자동화된 핵산 합성)으로부터 얻을 수 있다.
라이브러리는 그에 의해 코딩되는 단백질 또는 목적의 유전자를 동정하도록 고안된 프로브(예를 들어, 20-80개 이상의 염기의 올리고뉴클레오티드 또는 PRO842에 대한 항체)를 이용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 이용한 cDNA 또는 게놈성 라이브러리의 스크리닝은 표준 방법(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]에 기재)을 이용하여 수행될 수 있다. PRO842을 코딩하는 유전자를 단리하는 별법은 PCR 방법(문헌[Sambrook et al., 상동]; 문헌[Dieffenbach et al., PCR Primer : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)])을 이용하는 것이다.
하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 기재한다. 프로브로서 선택되는 올리고머뉴클레오티드 서열은 충분한 길이 및 오류의 긍정을 최소화하도록 충분히 명확해야한다. 표지 방법은 당업계에 공지되었고, 32P-표지된 ATP, 바이오티닐레이션(biotinylation) 또는 효소 표지와 같은 방사 표지를 이용하는 것을 포함한다. 중간 엄격성 및 고도의 엄격성의 혼성화 조건은 상기 삼브룩(Sambrook) 등의 문헌에서 제공된다.
상기 라이브러리 스크리닝 방법으로 동정된 서열은 공공 데이타베이스, 예를 들어, 젠뱅크(GenBank) 또는 기타 사적인 서열 데이타베이스에서 입수가능하고 기탁된 다른 공지의 서열과 비교하고, 배열할 수 있다. 분자의 지정 부위 내의 또는 전장 서열 맞은 편의 서열 동정(아미노산 또는 뉴클레오티드 수준 중의 하나)은 당업계에 공지된 방법을 이용하고 본원에 기술된 바와 같이 측정할 수 있다.
단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 처음 본원에 공개된 추정의 아미노산 서열을 이용하고, 필요한 경우에는 전구체를 검측하기 위해 상기 삼브룩 등의 문헌에 기술된 통상적인 프라이머 연장 과정을 이용하여 선택된 cDNA 또는 게놈성 라이브러리를 스크리닝하고, cDNA로 역전사되지 않는 mRNA의 중간체를 프로세싱에 의해 얻을 수 있다.
2. 숙주 세포의 선택 및 형질 전환
숙주 세포는 PRO842 생산에 대한 본원에 기술된 벡터를 발현 또는 클로닝함으로써 트랜스팩션되거나 또는 형질전환되고, 프로모터를 포함하고 형질전환자를 선택하거나 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기에 적절하도록 조절된 통상적인 영양 배지에서 배양된다. 배양 조건, 예를 들어, 배지, 온도, pH 등은 부적당한 실험없이 당업계의 숙련된 기술자에 의해 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포 배양의 생산성을 극대화하는 원리, 프로토콜 및 관용적인 기술은 문헌[Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) and Sambrook et al., supra.]에서 개시된다.
진핵세포 트랜스팩션 및 원핵세포 형질전환의 방법은 일반적인 숙련된 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어, CaCl2, CaPO4, 리포좀 매개 및 전기충격이다. 사용된 숙주 세포에 따라 형질전환은 상기 세포에 적절한 표준 방법을 이용하여 수행된다. 상기 삼브룩 등의 문헌에 기술된 칼슘 클로라이드를 이용한 칼슘 처리 또는 전기 충격은 일반적으로 원핵세포에 이용된다. 뿌리혹 박테리아(Agrobacterium tumefaciens)를 이용한 감염은 문헌[Shaw et al., Gene , 23: 315 (1983)] 및 1989년 6월 29일에 발행된 WO 89/05859에 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 이용된다. 상기 세포 벽없는 포유 동물에 대해서는 그라함(Graham) 및 반데르 에브의 문헌[Virology. 52: 456-457(1978)]의 칼슘 포스페이트 침전법이 이용될 수 있다. 포유 동물 세포 숙주계 트랜스팩션의 일반적인 면은 미국 특허 제 4,399,216호에 기술되었다. 이스트로의 형질전환은 문헌[Van Solingen et al., J. Bact., 130 : 946 (1977)] 및 문헌[Hsiao et al., Proc . Natl . Acad . Sci . ( USA ), 76 : 3829 (1979)]의 방법을 따라 통상적으로 수행된다. DNA를 세포로 도입시키는 다른 방법, 예를 들어, 핵 미세주입, 전기 충격, 온전한 세포와의 박테리아 프로토플라스트 접합 또는 폴리캣이온(polycation), 예를 들어, 폴리브렌, 폴리오르니틴 등을 이용할 수 있다. 포유 동물 세포의 형질 전환을 위한 다양한 기술은 문헌[Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990)] 및 문헌[Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988)]을 참조.
본원에서 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현시키는데 적절한 숙주 세포는 단핵세포, 이스트 또는 진핵 세포를 포함한다. 적절한 단핵 세포는 진세균, 예를 들어, 그람 음성균 또는 그람-양성균, 예를 들어, 엔테로박테리아세아에, 예를 들어, 이.콜리(E.coli)를 포함하고 이로 제한되는 것은 아니다. 다양한 이.콜리(E. Coli) 균주는 이.콜리K12 균주 MM294(ATCC 31, 446); 이.콜리(E.Coli) X1776(ATCC 31, 537); 이.콜리 균주 W3110(ATCC,325) 및 K5772(ATCC 53, 635)와 같이 공중 입수가능하다. 다른 적절한 단핵 세포 숙주 세포는 엔테로박테리아세아에, 예를 들어, 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어, 이.콜리, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로토스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마레스캔스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실리(Bacilli) 예를 들어, B.수브틸리스(B. subtilis) 및 B.리켄니포르미스(B. licheniformis)(예를 들어, 1989년 4월 12일 발행된 DD 266,710에 개시된 B.리케니포르미스(B. licheniformis) 41P), 수도모나스(Pseudomonas), 예를 들어, P. 애루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토미스(Streptomyces)를 포함한다. 이들 예는 제학적인 것이 아니라 예시일 뿐이다. 균주 W3110은 재조합 DNA 생성물 발효에서 흔한 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 어미 숙주 중의 하나이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 단백 분해 효소의 최소량을 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 변형되어 숙주에 내인성 단백질을 코딩하는 유전자에서의 유전적 돌연변이에 영향을 줄 수 있고, 이들 숙주의 예에는 이.콜리 W3110 균주 1A2(완전한 유전자형 tonA를 갖음); 이.콜리 W3110 균주 9E4(완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖음); 이.콜리 W3110 균주 27C7(ATCC 55,244)(완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr을 갖음); 이. 콜리 W3110 균주 37D6(완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr을 갖음); 이.콜리 W3110 균주 40B4(이는 비-카나미신 저항 degP 삭제 돌연변이를 갖는 균주 37D6임); 및 이.콜리 균주(1990년 8월 7일 등록된 미국 특허 제 4,946,783호에 개시된 돌연변이 원형질막 프로테아제를 갖음)을 포함한다. 선택적으로, 클로닝의 생체외 방법, 예를 들어, PCR 또는 기타 핵산 폴리머라제 반응 등이 적당하다.
원핵 세포 이외에, 진핵 세포 마이크로브, 예를 들어, 선상진균 또는 이스트는 PRO842 코딩하는 백터에 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)는 흔히 사용되는 저급 진핵세포 숙주 미생물이다. 이외에 쉬조사카로미스 폼브(Schizosaccharomyces pombe)[Beach and Nurse, Nature, 290: 140 (1981); EP 139,383 published 2 May 1985]; 클루이베로미스(Kluyveromyces) 숙주(U.S. Patent No.4,943,529; Fleer et al., Bio.technology,9: 968-975[1991]) 예를 들어 K.락티스(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol ., 154(2):737-742[1983]), K.프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), K.불가리쿠스(K.bulgaricus)(ATCC 16,045), K.위커라미(K.wickeramii(ATCC 24,178), K.왈티(K.waltii)(ATCC 56,500), K.드로소필라룸(K.drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technologv,8:135[1990]), K.테모토레란(K. thermotolerans), 및 K. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]); 칸디다( Candida ); 트리코데르마 레에시아 ( Trichoderma reesia )(EP 244,234); 누로스포라 크라사(Neurospora crassa)(Case et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA , 76: 5259-5263 [1979]); 쉬와니오미스(Schwanniomyces), 예를 들어, 쉬와니오미스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis)(EP 394,538 published 31 October 1990); 및 선상 진균, 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포크라듐(Tolypocladium)(WO 91/00357 published 10 January 1991), 및 아스퍼길루스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어, A.니둘란스(A. nidulans)(Ballance et al., Biochem . Biophys . Res . Commun ., 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene , 26: 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA , 81:1470-1474 [1984]) 및 A. 니거(A. niger)(Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])이 포함된다. 메틸로트로픽 이스트(Methylotropic yeast)는 본원에 적당하며, 한세눌라(Hansenula), 캔디다(Candida), 클로에케라(Kloeckera), 피키아(Pichia), 사카로미스(Saccharomyces), 토루롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 구성되는 제네라(genera)로부터 선택된 메탄올에서의 성장이 가능한 이스트를 포함하고, 이로 제한되는 것은 아니다.
글리코실화 PRO842의 발현에 위한 적절한 숙주 세포는 다중세포 유기체로부터 유래된다. 비척추동물 세포의 예는 곤충 세포, 예를 들어, 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9 또는 스포도프테라 하이 5 세포 뿐만아니라 식물 세포를 포함한다. 유용한 포유동물 숙주 세포계의 예는 중국 햄스터 난소(CHO) 및 COS 세포를 포함한다. 더 구체적인 예는 SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질 전환된 원숭이 신장 CV1 주; 인간 배아 신장 주(현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol.,36: 59 (1977)); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 77: 4216 [1980]); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol . Reprod ., 23: 243-251 [1980]); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 및 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51)을 포함한다. 적절한 숙주 세포의 선택은 당업계의 기술 내에서 정해질 것이다.
3. 복제 가능 벡터의 선택 및 사용
PRO842를 코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA 또는 게놈성 DNA)은 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제 가능 벡터로 삽입될 수 있다. 다양한 벡터가 공중 입수가능하다. 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스성 입자 또는 파지의 형태로 있을 수 있다. 적절한 핵산 서열은 다양한 과정에 의해 벡터로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA는 공지된 기술을 이용하여 적절한 제한 엔도뉴클레아세 부위로 삽입된다. 벡터 성분은 일반적으로 1 이상의 시그날 서열, 복제의 기원, 1 이상의 표지 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하고, 이로 제한되는 것은 아니다. 1 이상의 이들 성분을 포함하는 적절한 벡터의 제조는 당업자에게 공지된 표준 용원(ligation) 기술을 이용한다.
PRO842는 직접적으로 재조합될 수 잇고, 또한 시그날 서열 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특정 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드일 수 있는 이종성 폴리펩티드와의 접합 폴리펩티드로서 재조합적으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 시그날 서열은 벡터의 1 구성 성분일 수 있고, 벡터로 삽입된 PRO842-코딩하는 DNA의 일부일 수 있다. 시그날 서열은 알칼라인 포스페타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 에테로톡신 II 리더로부터 선택된 원핵 세포 시그날 서열일 수 있다. 이스트 분비를 위한 시그날 서열은 예를 들어 이스트 인버타제 리더, 알파 인자 리더(사카로미스(Saccharomyces) 및 클루이베로미스(Kluyveromyces) α-인자 리더, 후자는 미국 특허 제 5,010,182에 기재됨) 또는 산 포스파타제 리더, C. 알비칸 글루코아밀라제 리더(C. albicans glucoamylase leader)(1990년 4월 4일 발행된 EP 362,179) 또는 1990년 11월 15일 발행된 WO 90/13646에 기재된 표지일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서 포유동물 시그날 서열은 단백질의 직접 분비, 예를 들어, 동일하거나 관련 종의 분비된 폴리펩티드 시그날 서열 및 바이러스 분비 리더에 사용될 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터 모두 벡터가 1 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제가능하게 하는 핵산 서열을 포함한다. 상기 서열은 다양한 박테리아, 이스트 및 바이러스에 대해 공지되었다. 플라스미드 pBR322으로부터의 복제 기원은 대부분의 그람 음성 박테리아에 적절하고, 2 마이크로 플랏미드 기원은 이스트에 적절하고, 다양한 바이러스 기원(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)는 포유 동물 세포에서 클로닝 벡터로 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 선택 유전자(선택가능 표지라고도 함)을 포함한다. 통상적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어., 암피실린, 네오미시, 메토트렉사테이트 또는 테트라시클린에 대한 저항성을 부여하고, (b)옥소트로픽 결핍을 보충하거나, 또는 (c) 결합체 매질로부터 입수 불가능한 결정적 영양소, 예를 들어, 바실리(Bacilli)에 대한 D-알라닌 라스마세르 코딩하는 유전자를 공급하는 단백질을 코딩한다.
포유동물 세포에 적절한 선택가능 표지의 예는 PRO842 코딩하는 핵산, 예를 들어, DHFR 또는 티미딘 키나제를 흡수하는데 유능한 세포의 동정을 할 수 있게 하는 것들이다. 야생 DHFR을 사용했을 때 적절한 숙주 세포는 문헌[Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 :4216(1980)]에 기재된 바와 같이 제조되거 전파된 DHFR 활성이 결핍된 CHO 세포주이다. 이스트에 이용되는 적절한 선택 유전자는 이스트 플라스미드 YRp7중에 존재하는 trp1 유전자이다[Stinchcomb et al., Nature, 282: 39(1979); Kingsman et al., Gene,7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980)]. Trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 부족한 이스트의 돌연변이 균주를 위한 선택 표지, 예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1[Jones, Genetics, 85: 12 (1977)]를 제공한다.
발현 및 클로닝 벡터는 mRNA 합성을 지시하는 PRO842-코딩하는 핵산 서열에 작용가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 다수의 잠재적 숙주 세포에 의해 인지되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵세포 숙주에 이용되기에 적절한 프로모터는 β-락타마스 및 락토스 프로모터 시스템[Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)], 알칼라인 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); EP 36,776], 및 혼성 프로모터, 예를 들어, tac 프로모터[deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)]를 포함한다. 박테리아 계에 이용되기 위한 프로모터는 PRO842 코딩하는 DNA에 작용가능하게 연결된 신-달가노(Shine-Dalgarno)(S.D.) 서열을 포함할 수 있다.
이스트 숙주에 이용하기 위해 적절한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제[Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)] 또는 다른 글리콜리틱 효소[Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7 : 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], 예를 들어, 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나세, 헥소키나제, 피루바테 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세라테 무타제, 피루바테 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가적인 이점을 갖는 유발 프로모터인 다른 이스트 프로모터는 디히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 신진대사와 관련된 분해성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히도게나제 및 말토스 및 갈락토스 이용을 맡는 효소를 위한 프로모터 부분이다. 이스트 발현에 이용하기에 적절한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기술된다.
포유 동물 숙주 세포에서 벡터로부터 PRO842 전사는 숙주 세포계와 사용가능하다는 가정하에 바이러스, 예를 들어, 폴리오마(polyoma) 바이러스, 포울폭스(fowlpox) 바이러스(1989년 7월 5일 발행된 UK 2,211,504), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 파필로마(papilloma) 바이러스, 조류 닭 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 헵파티티스-B 바이러스 및 시미안 바이러스 40(SV40)의 게놈으로부터, 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어, 악틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터로부터 및 열-충격 프로모터로부터 얻어지는 프로모터에 의해 조절된다.
더 높은 진핵 세포에 의한 PRO842를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터로 삽입함에 의해 증가될 수 있다. 인핸서는 전사가 증가되도록 프로모터 상에서 작용하는 DNA의 시스-작용 요소, 보통 10 내지 300 bp이다. 다수의 인핸서 서열은 포유동물 유전자(글로비, 엘라스타제, 알부민, α-페토프로테인 및 인슐린)으로부터 공지되었다. 통상적으로 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 이용할 수 있다. 그 예에는 복제 기원 후 부분의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원 후 부분의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 위치 5' 또는 3' 에서 PRO842 코딩하는 서열에서 백터로 접합되지만, 바람직하게는 프로부터로부터 부위 5'에서 일어난다.
진핵 숙주 세포(이스트, 균류, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터의 유핵 세포발현)에서 이용되는 발현 벡터는 전사를 종결시키고 mRNA를 안정화시키는데 필수적인 서열을 포함할 수 있다. 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 미번역 부분, 5' 및, 종종 3'로부터 통상적으로 입수할 수 있다. 이들 부분은 PRO842를 코딩하는 mRNA의 미번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 부분을 포함한다.
재조합 척추동물 세포 배양물 중의 PRO842의 합성에 적응에 적당한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포를 문헌[Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981)]; 문헌[Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979)]; EP 117,060; 및 EP 117,058에 기술된다.
4. 유전자 증폭/발현의 탐지
유전자 증폭 및(또는) 발현은 샘플 중에서 직접적으로, 예를 들어, 본원에서 제공된 서열에 기초한, 적절하게 표지된 프로브를 사용하여 mRNA의 전사를 정량화하기 위한 통상의 서던 블롯팅, 노던 블롯팅 (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 [1980]), 도트 블롯팅 (DNA 분석), 또는 제자리 혼성화 (in situ hybridization)에 의해 측정될 수 있다. 별법으로, DNA 이중쇄, RNA 이중쇄, 및 DNA-RNA 하이브리드 이중쇄 또는 DNA-단백질 이중쇄를 포함하여 특정 이중쇄를 인지할 수 있는 항체가 사용될 수 있다. 이 때, 항체는 표지되고, 이중쇄가 표면에 형성되면, 이중쇄에 결합된 항체의 존재를 탐지할 수 있도록, 이중쇄가 표면에 결합된 곳에서 분석이 수행된다.
별법으로, 유전자 발현은 유전자 생성물의 발현을 직접적으로 정량화하기 위해서 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학 염색과 같은 면역학적 방법, 및 세포 배양물 또는 체액의 분석으로 측정될 수 있다. 면역조직화학 염색 및(또는) 샘플액의 분석에 유용한 항체는 모노클론 또는 폴리클론일 수 있으며, 임의의 포유동물 중에서 제조될 수 있다. 통상적으로, 천연 PRO842 폴리펩티드, 또는 본원에서 제공된 DNA 서열에 기초한 합성 펩티드, 또는 PRO842 DNA에 융합되고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대한 항체가 제조될 수 있다.
5. 폴리펩티드의 정제
PRO842 형태가 배양 배지 또는 숙주 세포 용해액으로부터 회수될 수 있다. 막에 결합되어 있다면, 적절한 계면활성제 용액 (예를 들어, Triton-X 100)을 사용하여, 또는 효소 절단에 의해 막으로부터 분리될 수 있다. PRO842의 발현에서 사용된 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 방법, 예를 들어, 냉동-해동 사이클링, 초음파 분해, 기계적 분해, 또는 세포 용해제를 사용하여 분해될 수 있다.
PRO842를 재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 정제하는 것이 바람직할 것이다. 하기 방법들은 적합한 정제 방법의 예이다: 이온-교환 칼럼 상에서의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 상에서 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 암모늄염 침전; 겔 여과 (예를 들어, Sephadex G-75를 사용함); IgG와 같은 오염체를 제거하기 위한 단백질 A Sepharose 칼럼; 및 PRO842의 에피토프-표지된 형태에 결합하기 위한 금속 킬레이트 칼럼. 단백질 정제의 다양한 방법이 사용될 수 있으며, 이같은 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기술되어 있다. 선택된 정제 단계(들)은 예를 들어, 사용된 생성 방법 및 생성되는 특정 PRO842의 성질에 따라 달라진다.
E. PRO842 의 용도.
PRO842를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (또는 이들의 상보체)는 염색체 및 유전자 맵핑 및 안티센스 RNA 및 DNA의 제조에서의 혼성화 프로브로서의 용도를 포함하여 분자 생물학 분야에서 다양한 응용을 가진다. 또한, PRO842 핵산은 본원에서 기술된 재조합 기술에 의한 PRO842 폴리펩티드의 제조에 유용하다.
전장 천연 서열 PRO842 유전자, 또는 이들의 일부는 전장 PRO842 cDNA를 단리하기 위해서, 또는 본원에서 개시된 천연 PRO842 서열과 소정의 서열 동일성을 갖는 기타 cDNA들을 단리하기 위해서 (예를 들어, PRO842의 자연적으로 발생하는 변이체 또는 다른 종의 PRO842를 코딩하는 것들), cDNA 라이브러리에 대한 혼성화 프로브로 사용될 수 있다. 임의로, 프로브의 길이는 약 20 내지 약 50 bp일 것이다. 혼성화 프로브는 전장 천연 뉴클로에티드 서열의 최소한 부분적으로 신규한 영역 (이들 영역은 과도한 실험없이 결정될 수 있음), 또는 천연 서열 PRO842의 프로모터, 인핸서 요소 및 인트론을 포함하는 게놈 서열로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 스크리닝 방법은 약 40 bp의 선택된 프로브를 합성화하기 위한 공지의 DNA 서열을 사용하여 PRO842 유전자의 코딩 영역을 단리하는 것을 포함할 것이다. 혼성화 프로브는 32P 또는 35S와 같은 방사능 뉴클레오티드, 아비딘/바이오틴 커플링 시스템을 통해 프로브에 커플링되는 알칼라인 포스포타아제와 같은 효소 표지를 포함하여 다양한 표지를 사용하여 표지화될 수 있다. 본 발명의 PRO842 유전자의 서열에 상보적인 서열을 갖는 표지된 프로브는 라이브러리의 구성원 중 어느 것에 프로브가 혼성화하는지 결정하기 위해 사람 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크린하는 데 사용될 수 있다. 혼성화 기술은 하기 실시예에서 추가적으로 상세히 기술된다.
본원에서 개시된 임의의 EST 서열은 본원에서 개시된 방법을 사용하여 유사하게 프로브로 사용될 것이다.
PRO842의 기타 유용한 단편은 표적 PRO842 mRNA (센스) 또는 PRO842 DNA (안티센스) 서열에 결합할 수 있는 단일 가닥 핵산 서열 (RNA 또는 DNA)을 포함하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에 따른 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 PRO842 DNA의 코딩 영역의 단편을 포함한다. 이같은 단편은 일반적으로 약 14개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 14 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 주어진 단백질을 코딩하는 cDNA에 기초해서 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 유도할 수 있음은 예를 들어, 문헌 [Stein and Cohen (Cancer Res. 48: 2659, [1988]) and van der Krol et al. (BioTechniques 6: 958, [1988])에 기술되어 있다.
안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산 서열로의 결합은 이중쇄의 분해의 증가, 전사 또는 번역의 조기 종결을 포함하는 다수의 방법 중의 하나 또는 기타 방법에 의해 표적 서열의 전사 또는 번역을 중단시키는 이중쇄의 형성을 초래한다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 PRO842 단백질의 발현을 중단시키기 위해 사용될 수 있다. 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 추가적으로 개질된 당-인산이에스테르 골격 (또는, WO 제91/06629호에 기술된 것과 같은 다른 당 결합)을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서, 이같은 당 결합은 내인성 핵산분해효소에 대해 저항성이다. 저항성 당 결합을 갖는 이같은 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 안정하지만 (즉, 효소 분해에 저항할 수 있음), 표적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 서열 특이성을 보유한다.
센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 다른 예에는 유기 잔기, 예를 들어 WO 90/10048에 개시된 잔기, 및 표적 핵산 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 증가시키는 다른 잔기, 예를 들어 폴리-(L-라이신)에 공유적으로 연결되는 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 또한, 엘립티신과 같은 중격제 (intercalating agent), 및 알킬화제 또는 금속 결합체를 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 연결하여 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 결합 특이성을 변화시킬 수 있다.
예를 들어, CaPO4-매개 DNA 형질감염, 일렉트로포레이션을 비롯한 임의의 유전자 전달 방법에 의하거나 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스와 같은 유전자 전달 벡터를 사용함으로써 표적 핵산 서열을 포함하는 세포에 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 바람직한 방법으로는, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 적합한 레트로바이러스 벡터에 삽입한다. 표적 핵산 서열을 포함하는 세포를 재조합 레트로바이러스 벡터와 생체내 또는 생체외에서 접촉시킨다. 적합한 레트로바이러스 벡터에는 쥐과 동물 레트로바이러스 M-MuLV, N2 (M-MuLV로부터 유도된 레트로바이러스)로부터 유도된 벡터, 또는 DCT5A, DCT5B 및 DCT5C (WO 90/13641을 참조한다)로 명명된 이중 카피 벡터가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
또한, WO 91/04753에 개시된 바와 같이, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 리간드 결합 분자와 결합체를 형성시킴으로써 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포에 도입할 수 있다. 적합한 리간드 결합 분자에는 세포 표면 수용체, 성장 인자, 다른 사이토킨, 또는 세포 표면 수용체와 결합하는 다른 리간드가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 리간드 결합 분자의 연결은, 리간드 결합 분자가 상응하는 분자 또는 수용체와 결합하는 능력을 실제적으로 방해하지 않거나, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 결합체 형태가 세포내에 진입하는 것을 차단하지 않는다.
또는, WO 90/10448에 개시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드-지질 결합체를 형성시킴으로써 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 표적 핵산 서열을 포함하는 세포내에 도입할 수 있다. 이러한 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드-지질 결합체는 바람직하게는 세포내에서 내생성 리파제에 의해 분리된다.
안티센스 또는 센스 RNA 또는 DNA 분자는 일반적으로 염기 약 5개 이상, 염기 약 10개 이상, 염기 약 15개 이상, 염기 약 20개 이상, 염기 약 25개 이상, 염기 약 30개 이상, 염기 약 35개 이상, 염기 약 40개 이상, 염기 약 45개 이상, 염기 약 50개 이상, 염기 약 55개 이상, 염기 약 60개 이상, 염기 약 65개 이상, 염기 약 70개 이상, 염기 약 75개 이상, 염기 약 80개 이상, 염기 약 85개 이상, 염기 약 90개 이상, 염기 약 95개 이상, 염기 약 100개 이상 또는 그 이상의 길이이다.
또한, 프로브를 PCR 기술에서 사용하여 밀접하게 관련된 PRO842 코딩 서열의 확인을 위한 일군의 서열을 생성시킬 수도 있다.
또한, PRO842를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 사용하여 PRO842를 코딩하는 유전자의 맵핑 및 유전 질환이 있는 개체의 유전적 분석을 위한 혼성화 프로브를 작제할 수 있다. 계내 혼성화, 공지의 염색체 마커에 대한 연관 분석 및 라이브러리를 사용한 혼성화 스크리닝과 같은 공지의 기술을 이용하여 본원에서 제공되는 뉴클레오티드 서열을 염색체 및 특정 염색체 영역에 맵핑시킬 수 있다.
PRO842의 코딩 서열이 다른 단백질과 결합하는 단백질을 코딩하는 경우 (예를 들어, 여기서 PRO842는 수용체임), PRO842를 이러한 결합 상호작용에 관여하는 다른 단백질 또는 분자를 확인하기 위한 분석에 사용할 수 있다. 이 방법에 의해, 수용체/리간드 결합 상호작용의 저해제도 확인할 수 있다. 또한, 상기 결합 상호작용에 관여하는 단백질을 사용하여 결합 상호작용의 펩티드 또는 소분자 저해제 또는 효능제를 스크리닝할 수 있다. 또한, 수용체 PRO842를 사용하여 유사한 리간드(들)을 단리할 수 있다. 스크리닝 분석을 설계하여 천연 PRO842 또는 PRO842에 대한 수용체의 생물학적 활성을 모방하는 리드 (lead) 화합물을 발견할 수 있다. 이러한 스크리닝 분석은 화학물질 라이브러리의 고처리 스크리닝에 의한 분석을 포함하며, 소분자 약물 후보물질을 확인하는데 특히 적합할 것이다. 고려되는 소분자는 합성 유기 또는 무기 화합물을 포함한다. 분석은 당업계에서 충분히 특성화된 단백질-단백질 결합 분석, 생화학적 스크리닝 분석, 면역분석 및 세포 기초 분석을 비롯한 다양한 포맷으로 수행될 수 있다.
또한, PRO842 또는 그의 변형된 형태를 코딩하는 핵산을 사용하여 치료적으로 유용한 시약의 개발 및 스크리닝에 유용한 트랜스제닉 (transgenic) 동물 또는 "녹 아웃 (knock out)" 동물을 생성시킬 수 있다. 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)는 트랜스진 (transgene)을 포함하는 세포를 갖는 동물인데, 트랜스진은 태아기, 예를 들어 배 단계에서 동물 또는 그의 조상에게 도입된다. 트랜스진은 세포의 게놈내에 통합되는 DNA이며, 이 세포로부터 트랜스제닉 동물이 발생한다. 한 실시태양에서, PRO842를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 PRO842를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있으며, 이 게놈 서열을 사용하여 PRO842를 코딩하는 DNA를 발현시키는 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물을 생성시킬 수 있다. 트랜스제닉 동물, 특히 마우스 또는 래트와 같은 동물을 생성시키는 방법은 당업계에서 통상적인 방법이며, 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호 및 동 제4,870,009호에 기재되어 있다. 통상적으로, 조직 특이적 인핸서를 갖춘 PRO842 트랜스진의 도입에서는 특정 세포가 표적이 된다. 배 단계에서 동물의 생식세포에 도입된, PRO842를 코딩하는 트랜스진을 한 카피 포함하는 트랜스제닉 동물을 사용하여 PRO842를 코딩하는 DNA의 발현 증가 효과를 조사할 수 있다. 이러한 동물은 예를 들어 PRO842 폴리펩티드의 과다발현과 관련된 병리학적 증상으로부터 보호할 것으로 생각되는 시약에 대한 시험 동물로서 사용할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따라, 상기 시약으로 동물을 처리하면, 트랜스진을 보유하는 미처리 동물에 비해 병리학적 증상의 발생은 저하되며, 이는 상기 병리학적 증상에 대한 잠재적인 치료적 개입을 나타낸다.
또는, PRO842의 비인간 동족체를 사용하여 PRO842를 코딩하는 내생성 유전자와 이 동물의 배간세포에 도입된, PRO842를 코딩하는 변형된 게놈 DNA 사이의 상동 재조합의 결과로서, PRO842를 코딩하는 결함 또는 변형 유전자를 갖는 PRO842 "녹 아웃" 동물을 만들 수 있다. 예를 들어, PRO842를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 PRO842를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. PRO842를 코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실되거나, 통합을 모니터하기 위해 사용될 수 있는 선택적 마커를 코딩하는 유전자와 같은 다른 유전자로 치환될 수 있다. 통상적으로, 수천개의 염기의 비변형된 플랭킹 DNA (5' 및 3' 말단 모두에서)가 벡터내에 포함된다 (예를 들어, 상동 재조합 벡터의 설명에 대해서는 문헌 (Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987))을 참조한다). 이 벡터는 (예를 들어, 일렉트로포레이션에 의해) 배간세포주에 도입되고, 도입된 DNA와 내생성 DNA가 상동 재조합된 세포가 선택된다 (예를 들어, 문헌 (Li et al., Cell, 69:915 (1992))을 참조한다). 선택된 세포는 이어서 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)의 배반포에 주입되어 응집 키메라를 형성한다 (예를 들어, 문헌 (Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152)을 참조한다). 이어서, 키메라 배를 적합한 가임신 대리모 동물에 이식하여 "녹 아웃" 동물을 생성시켰다. 생식세포내에 상동 재조합 DNA를 보유하는 자손체를 표준 기술로 확인하고, 그를 사용하여 동물의 모든 세포가 상동 재조합 DNA를 포함하는 동물을 육종할 수 있다. 녹 아웃 동물은 예를 들어 특정 병리학적 증상에 대한 방어 능력 및 PRO842 폴리펩티드의 부재로 인한 병리학적 증상의 발생을 특징으로 할 수 있다.
PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 유전자 치료법에도 사용될 수 있다. 유전자 치료법에 사용될 경우, 유전자는 치료에 효과적인 유전자 산물을 생체내에서 합성하기 위해, 예를 들면, 결함있는 유전자를 대체하기 위해 세포내로 도입된다. "유전자 치료법"은 단일 처치에 의해 지속적인 효과가 달성되는 통상의 유전자 치료법 및 치료에 효과적인 DNA 또는 mRNA의 일회 또는 반복 투여를 포함하는 유전자 치료제의 투여를 모두 포함한다. 안티센스 RNA 및 DNA는 생체내에서 특정 유전자의 발현을 차단하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 세포막을 통한 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 흡수가 제한적이어서 이러한 올리고뉴클레오티드의 세포내 농도가 낮음에도 불구하고, 이들이 세포내로 도입되면 저해제로 작용할 수 있음이 이미 밝혀져 있다 (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad., Sci. USA 83, 4143-4146 (1986)). 이러한 올리고뉴클레오티드를 변형, 예를 들어 이들의 음으로 대전된 포스포디에스테르기를 비대전 기로 치환함으로써 올리고뉴클레오티드의 흡수를 증대시킬 수 있다.
핵산을 생존 세포로 도입하는데 이용될 수 있는 다양한 기술이 있다. 이 기술은 핵산을 시험관내에서 배양된 세포로 전달하는지 또는 생체내의 목적하는 숙주 세포로 전달하는지에 따라 달라진다. 핵산을 시험관내 포유동물 세포로 전달하는데 적합한 기술은 리포좀, 일렉트로포레이션, 미세주입, 세포 융합, DEAE-덱스트란 및 인산칼슘 침전법 등을 포함한다. 생체내 유전자 운반 기술로 현재 바람직한 것으로는 바이러스 (통상적으로 레트로바이러스) 벡터를 사용한 형질감염 및 바이러스 코트 단백질-리포좀 매개 형질감염이 포함된다 (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)). 어떤 경우에는, 표적 세포를 표적화하는 효능제, 예컨대 세포 표면의 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체 및 표적 세포상의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀을 사용하는 경우에는, 세포내이입에 관련된 세포 표면의 막 단백질에 결합하는 단백질을 표적화에 사용하고(하거나) 흡수를 촉진시킬 수 있는데, 그러한 단백질의 예로는 특정 세포 유형에 향성 (向性)이 있는 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시 내부화를 경험하는 단백질에 대한 항체, 세포내 위치를 표적화하고 세포내 반감기를 증대시키는 단백질이 있다. 수용체 매개성 세포내이입 기술은 예를 들면 문헌 (Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987); 및 Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990))에 기재되어 있다. 유전자 마킹 및 유전자 치료법 프로토콜의 검토를 위해서는, 문헌 (Anderson et al., Science 256:808-813 (1992))을 참조한다.
본원에 개시된 PRO842 폴리펩티드를 단백질 전기영동을 위한 분자량 마커로 사용할 수도 있으며, 단리된 핵산 서열은 이들 마커를 재조합적으로 발현시키는데 사용할 수 있다.
본원에 개시된 PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 그의 단편은 염색체의 확인에 유용하다. 이런 점에서, 새로운 염색체 마커를 확인할 계속적인 필요가 있는데, 이는 실제 서열 데이타를 토대로 한 이용가능한 염색체 마킹 시약이 현재로서는 비교적 적기 때문이다. 본 발명의 PRO842 핵산 분자 각각은 염색체 마커로 사용할 수 있다.
본 발명의 PRO842 폴리펩티드 및 핵산 분자는 조직 유형분류 (tissue typing)에서 진단적으로 사용할 수도 있으며, 여기서 본 발명의 PRO842 폴리펩티드는 다른 조직에 비해 어떤 한 조직에서, 바람직하게는 동일한 조직 유형의 정상 조직에 비해 병에 걸린 조직에서 차별적으로 발현될 수 있다. PRO842 핵산 분자는 PCR, 노던 분석, 서던 분석 및 웨스턴 분석을 위한 프로브를 생성시키는데 사용될 것이다.
본원에 개시된 PRO842 폴리펩티드를 치료제로 사용할 수도 있다. 공지된 방법에 따라 본 발명의 PRO842 폴리펩티드를 제제화하여 제약상 유용한 조성물을 제조할 수 있는데, 여기서 이 PRO842 생성물은 제약상 허용되는 담체 비히클과 배합된다. 치료 제형은 바람직한 순도를 갖는 활성 성분을 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 동결건조 제형 또는 수용액제 형태의 보관용으로 제조된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량과 농도에서 투여 대상에게 비독성이며, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산과 같은 완충제, 아스코르브산 등의 항산화제, 저분자량 (잔기가 약 10개 미만인) 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린 등의 단백질, 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신 등의 아미노산, 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 그밖의 탄수화물, EDTA와 같은 킬레이트제, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알콜, 나트륨과 같은 염-형성 카운터이온, 및(또는) 트윈 (TWEEN, 등록상표), 플루로닉스 (PLURONICS, 등록상표) 또는 PEG와 같은 비이온성 계면활성제 등이 있다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이는 동결건조 및 재구성 이전 또는 이후에 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.
본원의 치료 조성물은 일반적으로 멸균 접근 출입구가 있는 용기, 예를 들면 정맥내 용액제 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알에 담는다.
투여 경로는 공지된 방법, 예를 들면 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내 또는 병소내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 또는 서방계에 의한 방법이 있다.
본 발명의 제약 조성물의 투여량 및 목적하는 약물 농도는 계획된 특정 용도에 따라 변할 수 있다. 적합한 투여량 및 투여 경로의 결정은 당업자라면 잘 아는 것이다. 동물 실험 결과는 인간 치료에 효과적인 투여량을 결정하는데 믿을만한 지침을 제공한다. 종 사이의 효과적인 투여량의 척도화는 문헌 (Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96)의 원리에 따라 수행될 수 있다.
PRO842 폴리펩티드 또는 그의 효능제 또는 길항제가 생체내 투여되는 경우, 일반적인 투여량은 투여 경로에 따라 다르며, 포유동물의 체중 1 kg당 약 10 ng 내지 100 mg, 또는 일당으로는 바람직하게는 약 1 ㎍/kg 내지 10 mg/kg일 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌, 예를 들어 미국 특허 제4,657,760호, 동 제5,206,344호 또는 동 제5,225,212호에 제시되어 있다. 다른 치료 화합물 및 다른 질환에 대해서는 다른 제제가 효과적일 수 있으며, 한가지 기관 또는 조직을 표적으로 하는 투여는 예를 들어 또다른 기관 또는 조직에 대한 투여와는 다른 방식으로의 전달을 필요로 할 것으로 예상된다.
PRO842 폴리펩티드의 서방성 투여가 PRO842 폴리펩티드의 투여를 필요로 하는 임의의 질병 또는 질환의 치료에 적합한 방출 특성을 갖는 제제에서 요구되는 경우, PRO842 폴리펩티드의 마이크로캡슐화가 고려된다. 느린 방출을 위한 재조합 단백질의 마이크로캡슐화는 인간 성장 호르몬 (rhGH), 인터페론 (rhIFN), 인터루킨-2 및 MN rgp120을 사용하여 성공적으로 수행되었다 (Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399 및 미국 특허 제5,654,010호).
상기 단백질의 서방성 제제는 생체적합성 및 광범위한 생분해성 특성으로 인해 폴리-락트산-co-글리콜산 (PLGA) 중합체를 써서 개발하였다. PLGA의 분해 산물인 락트산 및 글리콜산은 인체내에서 신속하게 제거될 수 있다. 또한, 상기 중합체의 분해능은 그의 분자량 및 조성에 따라 수개월 내지 몇년으로 조정될 수 있다 (Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41).
본 발명은 PRO842 폴리펩티드를 흉내내거나 (효능제) PRO842 폴리펩티드의 영향을 차단하는 (길항제) 화합물 확인하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 길항제 약물 후보에 관한 스크리닝 분석법을 설계하여 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 PRO842 폴리펩티드와 결합하거나 결합체를 이루거나, 또는 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포내 단백질의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하였다. 이러한 스크리닝 분석법은 화학물질 라이브러리의 고처리 스크리닝에 의한 분석법을 포함하며, 이는 소분자 약물 후보를 확인하는데 특히 적합할 것이다.
상기 분석법은 당업계에서 충분히 특성화된 단백질-단백질 결합 분석법, 생화학적 스크리닝 분석법, 면역분석법 및 세포 기초 분석법을 비롯한 다양한 포맷으로 수행할 수 있다.
길항제에 관한 모든 분석법의 공통점은 후보 약물을 본원에서 확인된 핵산에 의해 코딩된 PRO842 폴리펩티드와, 이들 두 성분이 상호작용하기에 충분한 조건과 시간하에 접촉시켜야 한다는 점이다.
결합 분석법에서, 상호작용은 결합하는 것이며, 형성된 결합체는 단리하거나 반응 혼합물에서 검출할 수 있다. 특정 실시태양에서, 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 PRO842 폴리펩티드 또는 약물 후보를 공유적 부착 또는 비공유적 부착에 의해 고체상, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트에 고정시킨다. 비공유적 부착은 일반적으로 고체 표면을 PRO842 폴리펩티드의 용액으로 코팅하고 건조함으로써 달성된다. 별법으로, 고정화 항체, 예를 들어 고정되는 PRO842 폴리펩티드에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 그를 고체 표면에 앵커링시킬 수 있다. 이 분석은 검출가능한 표지에 의해 표지될 수 있는 비-고정 성분을 고정 성분, 예를 들어 앵커링된 성분을 포함하는 코팅된 표면에 부가함으로써 수행된다. 반응이 종료되었을 때, 반응하지 않은 성분을 예를 들어 세척에 의해 제거하며, 고체 표면에 앵커링된 결합체를 검출한다. 본래 고정되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 포함하는 경우, 표면에 고정된 표지의 검출은 결합체 형성 반응이 일어났음을 나타낸다. 본래 고정되지 않은 성분이 표지를 포함하지 않는 경우, 예를 들어 고정된 결합체와 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 결합체 형성 반응을 검출할 수 있다.
후보 화합물이 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩된 특정 PRO842 폴리펩티드와 상호작용하지만 그와 결합하지는 않는 경우, 후보 화합물과 이 폴리펩티드의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 잘 알려진 방법에 의해 분석할 수 있다. 이러한 분석법에는 통상의 방법, 예를 들어 가교결합법, 공동면역침전법, 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 공동정제법이 포함된다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 (Fields and co-workers (Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989)); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) as disclosed by Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793 (1991))에 기재된 효모-기초 유전자 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있다. 많은 전사 활성자, 예를 들어 효모 GAL4는 물리적으로 구별되는 2개의 모듈형 도메인으로 이루어져 있는데, 한 도메인은 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 나머지 한 도메인은 전사-활성화 도메인으로 작용한다. 상기 간행물에 기재된 효모 발현계 (일반적으로, "2-하이브리드계"로 언급됨)는 이러한 특성을 이용하며, 2가지 하이브리드 단백질을 사용하는데, 이 중 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인에 융합된 것이며, 다른 하나는 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인에 융합된 것이다. GAL4-활성화된 프로모터의 조절하에서 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 따라 달라진다. 상호작용 폴리펩티드를 포함하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 발색성 기질을 사용하여 검출한다. 2-하이브리드 기술을 이용하여 2종의 특이적인 단백질들 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 완성형 키트 (MATCHMAKER, 등록상표)는 클론테크 (Clontech)사에서 구입할 수 있다. 또한, 이 시스템을 확장하여 특이적 단백질 상호작용에 관여하는 단백질 도메인을 맵핑할 수 있을뿐 아니라, 이러한 상호작용에 결정적인 아미노산 잔기의 위치를 정확하게 나타낼 수 있다.
하기의 방법으로, 본원에서 확인된 PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 방해하는 화합물을 시험할 수 있다: PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 산물과 세포내 또는 세포외 성분을 포함하는 반응 혼합물을 두 생성물의 상호작용 및 결합을 허용하는 조건 및 시간하에 제조한다. 결합을 저해하는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위해, 시험 화합물의 존재 및 부재하에 반응을 수행한다. 또한, 위약을 양성 대조군 역할을 하는 제3의 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. 시험 화합물과, 혼합물에 존재하는 세포내 또는 세포외 성분 사이의 결합 (결합체 형성)을 상기 기재된 바와 같이 모니터링한다. 대조 반응물(들)에서는 결합체가 형성되었으나 시험 화합물을 포함하는 반응 혼합물에서 결합체가 형성되지 않은 것은, 시험 화합물이 시험 화합물과 그의 반응 대응물의 상호작용을 방해한다는 사실을 암시한다.
길항제를 분석하기 위해, PRO842 폴리펩티드를 화합물과 함께 세포에 첨가하여 특정 활성을 스크리닝할 수 있으며, PRO842 폴리펩티드의 존재하에 목적 활성을 저해하는 화합물의 능력은 이 화합물이 PRO842 폴리펩티드에 대한 길항제임을 암시한다. 별법으로, 경쟁적 저해 분석을 위한 적절한 조건하에 PRO842 폴리펩티드 및 잠재적인 길항제를 막-결합 PRO842 폴리펩티드 수용체 또는 재조합 수용체와 함께 결합시킴으로써 길항제를 검출할 수 있다. PRO842 폴리펩티드를 예를 들어 방사 활성으로 표지하여, 수용체에 결합된 PRO842 폴리펩티드 분자의 수에 의해 잠재적인 길항제의 효과가 결정될 수 있도록 한다. 당업자에게 공지된 여러 방법, 예를 들어 리간드 패닝법 및 FACS 분류법 (Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991))에 의해 수용체를 코딩하는 유전자를 확인할 수 있다. 바람직하게는, 발현 클로닝법이 이용되는데, 여기서 폴리아데닐화 RNA는 PRO842 폴리펩티드에 대해 반응성인 세포로부터 제조되며, 이 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리는 푸울 (pool)로 분류되어 PRO842 폴리펩티드에 대해 비반응성인 COS 세포 또는 다른 세포를 형질감염시키는데 사용된다. 유리 슬라이드에서 배양되는 형질감염된 세포를 표지된 PRO842 폴리펩티드에 노출시킨다. 부위-특이적 단백질 키나제에 관한 인식 부위의 요오드화 또는 봉입화를 비롯한 여러 방법에 의해 PRO842 폴리펩티드를 표지할 수 있다. 고정화하고 인큐베이션한 다음, 슬라이드를 오토라디오그래피법으로 분석한다. 양성 푸울을 동정하여 서브-푸울을 제조하고, 상호작용성 서브-푸울링 및 리-스크리닝 (re-screening) 방법을 이용하여 다시 형질감염시킴으로써, 결국 추정의 수용체를 코딩하는 단일 클론을 생성시킨다.
수용체를 확인하는 다른 방법으로, 표지된 PRO842 폴리펩티드를 세포막 또는 수용체 분자를 발현시키는 추출물 시료와 함께 광친화성으로 연결할 수 있다. PAGE에 의해 가교결합 물질을 분석하고 엑스선 필름에 노출시킨다. 수용체를 포함하는 표지된 결합체를 자르고 펩티드 단편으로 분해하여 단백질 마이크로-시퀀싱처리할 수 있다. 마이크로-시퀀싱으로부터 얻어진 아미노산 서열을 사용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다의성 올리고뉴클레오티드 프로브의 한 세트를 설계함으로써 추정의 수용체를 코딩하는 유전자를 확인하게 된다.
다른 길항제 분석법으로, 수용체를 발현시키는 포유동물 세포 또는 막 샘플을 후보 화합물의 존재하에 표지된 PRO842 폴리펩티드와 함께 인큐베이션한다. 이후에, 상기 상호작용을 강화 또는 차단하는 화합물의 능력을 측정할 수 있다.
잠재적인 길항제의 보다 구체적인 예에는 이뮤노글로불린과 PRO842 폴리펩티드의 융합체와 결합하는 올리고뉴클레오티드, 특히 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 및 항체 단편, 단쇄 항체, 항-유전자형 항체, 및 이러한 항체 또는 그의 단편의 키메라 형태 또는 인간화 형태, 및 인간 항체 및 항체 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체가 포함된다. 또는, 잠재적인 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어 수용체를 인식하기는 하지만 영향을 주지는 않으면서 PRO842 폴리펩티드의 작용을 경쟁적으로 저해하는 PRO842 폴리펩티드의 돌연변이 형태일 수 있다.
또다른 잠재적인 PRO842 폴리펩티드 길항제는 안티센스 기술을 이용하여 제조한 안티센스 RNA 또는 DNA 작제물인데, 예를 들어 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적화된 mRNA와 혼성화하여 단백질 번역을 방지함으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하는 작용을 한다. 안티센스 기술을 이용하여 삼중나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 조절할 수 있는데, 이 방법들은 모두 폴리뉴클레오티드와 DNA 또는 RNA의 결합을 기초로 한다. 예를 들어, 본원에서 성숙 PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5'코딩 부분을 사용하여 염기쌍 약 10 내지 40개 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 설계한다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관여하는 유전자의 영역에 대해 상보적이도록 설계하여 (삼중나선 - 문헌 (Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al,, Science, 241:456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991))을 참조) 전사 및 PRO842 폴리펩티드의 생산을 방지한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 대응하는 mRNA와 혼성화하여 mRNA 분자가 PRO842 폴리펩티드로 번역되는 것을 차단한다 (antisense - Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)). 또한, 상기 기재된 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달하여 안티센스 RNA 또는 DNA를 생체내에서 발현시킴으로써 PRO842 폴리펩티드의 생산을 억제할 수 있다. 안티센스 DNA가 사용되는 경우, 번역-개시 부위, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10에서 +10 사이의 위치로부터 유도된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.
잠재적인 길항제에는 PRO842 폴리펩티드의 활성 부위, 수용체 결합 부위, 또는 성장 인자 또는 관련된 다른 결합 부위에 결합하여 PRO842 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는 소분자가 포함된다. 소분자의 예에는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드, 및 합성의 비-펩티딜 유기 또는 무기 화합물이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
라이보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소 RNA 분자이다. 라이보자임은 그와 상보적인 표적 RNA와 서열-특이적으로 혼성화하고, 이어서 엔도누클레아제에 의해 절단된 다음에 작용한다. 잠재적인 RNA 표적내의 특이적인 라이보자임 절단 부위를 공지 기술로 확인할 수 있다. 보다 자세한 사항은 예를 들어 문헌 (Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994) 및 PCT 공보 제WO 97/33551호 (1997년 9월 18일 공개))을 참조한다.
전사를 억제하는데 사용되는 삼중나선 형태의 핵산 분자는 단일-가닥이어야하며, 데옥시뉴클레오티드로 이루어져야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 그가 후그스틴 (Hoogsteen) 염기쌍 규칙을 통해 삼중나선의 형성을 촉진하도록 설계되는데, 삼중나선의 형성에는 일반적으로 이중나선 중 하나의 가닥에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치가 있어야 한다. 보다 자세한 사항은 예를 들어 문헌 (PCT 공보 제WO 97/33551호, 상기문헌)을 참조한다.
상기 소분자들은 상기 논의된 한가지 이상의 스크리닝 분석법 및(또는) 당업자에게 잘 알려진 임의의 다른 스크리닝 기술에 의해 확인할 수 있다.
또한, 본원에 개시된 분자의 진단 및 치료 용도는 상기 및 하기에 기재된 양성 기능 분석을 기초로 할 수도 있다.
F. 조직 분포
PRO842를 발현시키는 조직의 위치는 다양한 인간 조직에서 mRNA의 발현을 측정하여 확인할 수 있다. 이러한 유전자의 위치는 PRO842 폴리펩티드의 활성을 자극 및 억제함으로써 가장 영향받기 쉬운 조직에 대한 정보를 제공한다. 특정 조직내의 유전자의 위치는 하기 논의된 활성 차단 분석에 대해 샘플 조직을 제공한다.
상기에서 지적했듯이, 여러 조직 내에서 유전자 발현은 본원에서 제공하는 서열을 기초로 하여 적합하게 표지된 프로브를 사용하여 통상적인 서던 블롯팅, mRNA 전사를 정량하기 위한 노던 블롯팅 (Thomas, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), 도트 블롯팅 (DNA 분석) 또는 계내 혼성화에 의해 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중나선, RNA 이중나선 및 DNA-RNA 혼성 이중나선 또는 DNA-단백질 이중나선을 포함하는 특정 이중나선을 인지할 수 있는 항체를 사용할 수 있다.
별법으로, 여러 조직내의 유전자 발현은 유전자 산물의 발현을 직접적으로 정량하는 면역학적 방법, 예를 들어 조직 절편의 면역조직화학적 염색 및 세포 배양물 또는 체액의 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 시료액의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체이며 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게, 항체는 PRO842 폴리펩티드의 천연 서열, PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열 기초의 합성 펩티드, 또는 PRO842 폴리펩티드를 코딩하고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 DNA에 융합된 외생성 서열에 대하여 제조할 수 있다. 항체를 생산하기 위한 일반적 기술, 및 노던 블롯팅 및 계내 혼성화를 위한 특별한 실험방법은 본원의 하기에 제공된다.
G. 항체 결합 연구
PRO842 폴리펩티드의 활성은 조직 세포에 대한 PRO842 폴리펩티드의 효과를 억제하는 항-PRO842 항체의 능력을 각각 시험하는 항체 결합 연구에 의해 추가로 확인될 수 있다. 전형적인 항체에는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 이종융합 항체가 포함되며, 제조 방법은 하기에 기술되어 있다.
항체 결합 연구는 공지된 임의의 분석법, 예를 들어 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석법 및 면역침전 분석법에 수행할 수 있다 (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)).
경쟁적 결합 분석은 제한된 양의 항체와 결합하는데 있어서 피검 시료 분석물과 경쟁하는 표지된 표준물질의 능력에 좌우된다. 피검 시료내의 표적 단백질의 양은 항체에 결합되는 표준물질의 양에 반비례한다. 결합하게 되는 표준물질의 양을 용이하게 결정하기 위하여, 항체를 경쟁 이전 또는 이후에 불용화하여, 항체에 결합되는 표준물질과 분석물이 결합되지 않은채로 남아있는 표준물질과 분석물로부터 편리하게 분리될 수 있도록 한다.
샌드위치 분석법은 검출될 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 2가지 항체의 사용을 수반한다. 샌드위치 분석법에서, 분석될 피검 시료 분석물이 고상 지지체 상에 고정된 제1 항체와 결합하고, 이어서 제2 항체가 분석물에 결합하여 3부분으로 된 불용성 결합체를 형성하게 된다 (미국 특허 제4,376,110호 참조). 제2 항체 자체는 검출가능한 잔기로 표지될 수 있거나 (직접 샌드위치 분석) 또는 검출가능한 잔기로 표지된 항-이뮤노글로불린 항체를 사용하여 측정할 수 있다 (간접 샌드위치 분석). 예를 들어, 샌드위치 분석의 한 종류는 ELISA 분석법으로서, 이 경우 검출가능한 잔기는 효소이다. 면역조직 화학에서, 조직 시료는 신선하거나 또는 동결될 수 있으며, 또는 파라핀에 함침되어 방부제, 예를 들어 포르말린으로 고정시킬 수 있다.
H. 세포 기초 분석법
면역계 질환에 대한 세포 기초 분석법 및 동물 모델은 본원에서 동정된 유전자 및 폴리펩티드와, 면역계 질환의 발병 및 병인 사이의 관계를 더 이해하는데 이용될 수 있다.
다른 방법으로, 특정 면역계 질환에 연관되는 것으로 알려진 유형의 세포를 본원에 기재된 cDNA로 형질감염시켜, 이러한 cDNA가 면역 기능을 자극 또는 억제하는 능력을 분석한다. 적합한 세포를 목적 유전자로 형질감염시켜 면역 기능 활성에 대하여 모니터링할 수 있다. 이어서, 상기 형질감염된 세포주는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 또는 항체 조성물이 면역 기능을 억제하거나 자극하는 능력, 예를 들어 T 세포 증식 또는 염증 세포 침윤을 조절하는 능력을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본원에서 동정된 유전자의 코딩 서열로 형질감염된 세포는 면역계 질환의 치료를 위한 약물 후보를 확인하는데 사용될 수 있다.
또한, 안정한 세포주가 바람직하지만, 트랜스제닉 동물 (후술되는 바와 같음) 유래의 1차 배양물을 본원의 세포 기초 분석법에 이용할 수 있다. 트랜스제닉 동물로부터 연속 세포주를 유도하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다 (Small et al. Mol. Cell. Biol. 5, 642-648 (1985)).
적합한 세포 기초 분석법의 하나는 혼합 림프구 반응 (MLR)이다 (Current Protocols in Immunology, unit 3.12; edited by J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober, National Institutes of Health, Published by John Wiley & Sons, Inc.). 이 분석법에서, 활성화된 T 세포의 증식을 자극 또는 억제하는 시험 화합물의 능력을 분석한다. 반응 T 세포의 현탁액을 동종 자극 세포와 함께 배양하고, T 세포의 증식을 삼중수소화 티미딘의 수용에 의해 측정한다. 이 분석은 T 세포 반응성에 대한 일반적인 측정 수단이다. 대부분의 T 세포는 반응하여 활성화되는 경우 IL-2를 생산하기 때문에, 상기 분석에서 반응성의 차이는 반응 세포에 의한 IL-2 생산에 있어서의 차이를 부분적으로 반영한다. MLR 결과는 표준 림포킨 (IL-2) 검출 분석에 의해 확인할 수 있다 (Current Protocols in Immunology, above, 3.15,6.3.).
MLR 분석에서 증식성 T 세포 반응은 분석되는 분자의 직접적인 분열유발 특성 또는 외부 항원의 유도에 의한 활성화로 인한 것일 수 있다. PRO842 폴리펩티드의 T 세포 자극 활성을 확인하는 다른 방법은 동시자극 분석법에 의해 달성할 수 있다. T 세포 활성화는 T 세포 수용체 (TCR)를 통해 매개되는 항원 특이적 신호 및 제2 리간드 결합 상호작용, 예를 들어 B7 (CD80, CD86)/CD28 결합 상호작용을 통해 매개되는 동시자극 신호를 필요로 한다. CD28 가교결합은 활성화된 T 세포에 의해 림포킨 분비를 증가시킨다. T 세포 활성화는 음성 또는 양성 효과를 나타내는 리간드의 결합을 통해 음성 및 양성 조절 둘 다를 수행한다. CD28 및 CTLA-4는 B7에 결합하는, Ig 거대군의 관련된 당단백질이다. CD28의 B7로의 결합은 T 세포 활성화에 있어서 양성 동시자극 효과를 나타내는 반면, CTLA-4의 B7으로의 결합은 음성 T 세포 실활화 효과를 나타낸다 (Chambers, C. A. and Allison, J. P., Curr. Opin. Immunol., (1997) 9:396. Schwartz, R. H., Cell (1992) 71:1065; Linsley, P. S. and Ledbetter, J. A., Annu. Rev. Immunol. (1993) 11:191; June, C. H. et al., Immunol. Today (1994) 15:321; Jenkins, M. K., Immunity (1994) 1:405). 동시자극 분석에서는 PRO842 폴리펩티드를 T 세포 동시자극 또는 억제 활성에 대하여 분석한다.
본 발명의 PRO842 폴리펩티드 및 다른 화합물은 MLR 및 동시자극 분석에 의해 측정한 바로는 T 세포 증식의 자극제 (동시자극제), 및 효능제, 예를 들어 효능제 항체이며, 예를 들어 불량하거나, 최적 미만이거나 또는 부적절한 면역 기능을 특징으로 하는 면역계 질환을 치료하는데 있어서 유용하다. 이러한 질환은 포유동물에서 T 세포의 증식 및 활성화 (및 T 세포 매개 면역)을 자극하고, 자극성 화합물, 예를 들어 자극성 PRO842 폴리펩티드를 투여하여 면역 반응을 증강시켜 치료한다. 자극성 폴리펩티드는 예를 들어 PRO842 폴리펩티드 또는 그의 효능제 항체일 수 있다.
본 발명에서와 같은 자극성 화합물의 직접적인 용도는 개시된 T 세포상에서 발현되는 리간드 (4-1BBL)에 결합하며 T 세포 활성화 및 성장을 신호화하는, 종양 괴사 인자 수용체 군의 일원인 4-1BB 당단백질에 따른 실험에서 확인되었다 (Alderson, M. E. et al., J. Immunol., 24:2219 (1994)).
또한 효능제 자극성 화합물의 용도가 실험적으로 확인되었다. 효능제 항-4-1BB 항체로의 처리에 의한 4-1BB의 활성화는 종양의 제거를 증대시킨다 (Hellstrom, I. and Hellstrom, K. E., Crit. Rev. Immunol., 18:1 (1998)). 종양의 치료를 위한 면역보조 치료법은 하기에 보다 상세히 기술되어 있으며, 본 발명의 자극성 화합물을 사용하는 다른 예이다. 또한 면역 자극 또는 증강 효과는 MLR 분석에서 억제성인 것으로 밝혀진 PRO842의 활성을 길항하거나 차단하여 달성할 수도 있다. 화합물의 억제 활성을 제거하면 순 (net) 자극 효과가 나타난다. 적합한 길항제/차단성 화합물은 억제성 단백질을 인식하여 그와 결합함으로써 이 단백질과 그의 수용체와의 효과적인 상호작용을 차단하고 수용체를 통한 신호전달을 억제하는 항체 또는 그의 단편이다. 이러한 효과는 아마도 CTLA-4 결합에 의해 유발되는 억제 신호를 제거하여 T 세포 증식을 증가시키는 항-CTLA-4 항체를 사용하는 실험에서 확인되었다 (Walunas, T. L. et al., Immunity, 1:405 (1994)).
별법으로, 면역 자극 또는 증강 효과는 혈관 투과성 증가 특성을 갖는 PRO842 폴리펩티드를 투여하여 달성할 수도 있다. 증가된 공포 (vacuolar) 투과성은 면역 세포 (예, 단핵구, 호산구, PMN)의 국소적 침윤에 의해 약화될 수 있는 질환 및 염증에 대해 유리하다.
한편, T 세포 증식/활성화, 림포킨 분비 및(또는) 혈관 투과성의 직접적인 억제자인 본 발명의 PR0842 폴리펩티드 및 다른 화합물을 직접 사용하여 면역 반응을 억제할 수 있다. 이러한 화합물은 면역 반응 정도를 감소시키고, 과활성 반응, 최적 초과의 반응 또는 자가면역 반응을 특징으로 하는 면역계 질환을 치료하는데 있어서 유용하다. 본 발명 화합물의 이러한 용도는 CTLA-4가 수용체 B7에 결합하여 T 세포를 실활화하는 상기 설명된 실험에 의해 확인되었다. 본 발명의 직접 억제성 화합물은 유사한 방식으로 작용한다. 혈관 투과성을 억제하는 화합물을 사용하면 염증이 감소될 것으로 예상된다. 이러한 용도는 과다 염증과 관련된 증상을 치료하는데 있어서 유용할 것이다.
또는, 자극성 PRO842 폴리펩티드에 결합하여 분자의 자극 효과를 차단하는 항체 등의 화합물은 순 억제 효과를 나타내며, T 세포 증식/활성화 및(또는) 림포킨 분비를 억제하여 T 세포 매개 면역 반응을 억제하는데 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 자극 효과를 차단하면 포유동물의 면역 반응이 억제된다. 이러한 용도는 항-IL2 항체를 사용하는 실험에서 확인되었다. 이 실험에서, 항체는 IL2에 결합하여 IL2가 그의 수용체에 결합하는 것을 차단함으로써 T 세포 억제 효과를 달성한다.
I. 동물 모델
세포 기초 시험관내 분석의 결과는 T 세포 기능에 대한 생체내 동물 모델 및 분석을 이용하여 추가로 확인할 수 있다. 잘 알려진 다양한 동물 모델을 사용하여 면역계 질환의 발병 및 병인에 있어서 본원에서 동정된 유전자의 역할을 더 이해하고, 항체를 비롯한 후보 치료제 및 소분자 길항제를 비롯한 천연 폴리펩티드의 다른 길항제의 효능을 시험할 수 있다. 이러한 모델의 생체내 특성에 의해 사람 환자에서의 반응을 예측할 수 있다. 면역계 질환의 동물 모델로는 비-재조합 및 재조합 (트랜스제닉) 동물 모두가 포함된다. 비-재조합 동물 모델로는 예를 들어 설치류, 즉 쥐과 동물 모델을 들 수 있다. 이러한 모델은 세포를 표준 방법, 예를 들어 피하 주사, 미부 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 신장피막하 이식 등을 이용하여 동계의 마우스로 도입하여 만들 수 있다.
이식편 대 숙주 질환은 면역적격 세포가 면역억제되거나 내성 환자에 이식되는 경우에 발생한다. 공여체 세포는 숙주 항원을 인식하여 이에 대해 반응한다. 당해 반응은 생명을 위협하는 중증 염증부터 설사 및 체중 감소의 경증 경우까지 다양할 수 있다. 이식편 대 숙주 질환 모델은 MHC 항원 및 마이너 이식편 항원에 대한 T 세포 반응성을 평가하는 수단을 제공한다. 적합한 절차가 문헌[Current Protocols in Immunology, above, unit 4.3]에 상세히 기술되어 있다.
피부 동종이식 거부반응에 대한 동물 모델은 생체내 조직 파괴를 매개하는 T 세포의 능력을 시험하는 수단 및 이식 거부반응에서의 이들 역할의 척도이다. 대부분의 통상적이고 허용되는 모델은 쥐과 동물 꼬리-피부 이식편을 사용한다. 반복된 실험은 피부 동종이식 거부반응이 T 세포, 헬퍼 T 세포 및 킬러-효능제 T 세포에 의해 매개되며, 항체에 의해서는 매개되지 않음을 제시하였다[Auchincloss, H. Jr. and Sachs, D. H., Fundamental Immunology, 2nd ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY, 889-992 (1989)]. 적합한 절차가 문헌[Current Protocols in Immunology, above, unit 4.4]에 상세히 기술되어 있다. 본 발명의 화합물을 시험하는데 사용할 수 있는 다른 이식 거부반응 모델은 문헌[Tanabe, M. et al., Transplantation, 58:23 (1994) 및 Tinubu, S. A. et al., J. Immunol ., 4330-4338 (1994)]에 기술된 동종이식 심장 이식 모델이다.
지연형 과민성에 대한 동물 모델은 또한 세포 매개 면역 기능의 평가를 제공한다. 지연형 과민성 반응은 항원 챌린지 후에 시간이 경과한 후까지 피크에 도달하지 않는 염증을 특징으로 하는 생체내 면역 반응을 매개하는 T 세포이다. 이들 반응은 또한 다발성 경화증 (MS) 및 실험적 자가면역 뇌염 (EAE, MS에 대한 모델)과 같은 조직 특이적 자가면역 질환에서 발생한다. 적합한 절차가 문헌[Current Protocols in Immunology, above, unit 4.5]에 기술되어 있다.
EAE는 T 세포 및 단핵 세포 염증 및 중추 신경계에서의 축삭의 후속적인 탈수초화를 특징으로 하는 T 세포 매개 자가면역 질환이다. EAE는 일반적으로 인간에서 MS에 대해 관련된 동물 모델로 간주된다[Bolton, C., Multiple Sclerosis, 1:143 (1995)]. 급성 및 재발-완화 모델 둘 다가 개발되었다. 본 발명의 화합물을 문헌[Current Protocols in Immunology, above, units 15.1 and 15.2]에 기술된 프로토콜을 이용한 면역 매개 탈수초화 질환에 대한 T 세포 자극 또는 억제 활성에 대해 시험할 수 있다. 또한, 문헌[Duncan, I. D. et al., Molec . Med . Today, 554-561 (1997)]에 기술되어 있는 바와 같은 핍지교세포 또는 슈반 세포를 중추 신경계내로 이식한 수초 질환에 대한 모델을 참조한다.
접촉 과민성은 세포 매개 면역 기능의 단순 지연형 과민성 생체내 평가이다. 이러한 절차에 있어서, 지연형 과민성 반응을 유발하는 외인성 합텐에의 피부 노출을 측정하고 정량화시킨다. 접촉 민감성은 초기 감작화 단계, 및 이어서 유발 단계를 포함한다. 유발 단계는 T 림프구가 이들이 이전에 접촉하였던 항원과 조우할 때 발생한다. 종창 및 염증이 발생하며, 이는 인간 알레르기성 접촉 피부염의 우수한 모델로 간주된다. 적합한 절차가 문헌[Current Protocols in Immunology, Eds. J. E. Cologan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, John Wiley & Sons, Inc., unit 4.2 (1994) 및 Grabbe, S. and Schwarz, T, Immun . Today, 19 (1): 37-44 (1998)]에 상세히 기술되어 있다.
관절염에 대한 동물 모델은 콜라겐-유도 관절염이다. 이러한 모델은 인간 자가면역 류마티스 관절염의 임상적, 조직학적 및 면역학적 특성을 공유하며, 인간 자가면역 관절염에 대한 만족스러운 모델이다. 마우스 및 랫트 모델은 연골 및 연골하골의 미란인 활막염을 특징으로 한다. 본 발명의 화합물을 문헌[Current Protocols in Immunology, above, units 15.5]에 기술된 프로토콜을 이용하여 자가면역 관절염에 대한 활성에 대해 시험할 수 있다. 또한, 문헌[Issekutz, A.C. et al., Immunology, 88:569 (1996)]에 기술된 CD18 및 VLA-4 인테그린에 대한 모노클로날 항체를 사용하는 모델을 참조한다.
동물을 오브알부민으로 감작화시킨 다음, 동물을 에어로졸에 의해 전달된 동일한 단백질로 챌린지시킴으로써 항원-유도 기도 과반응성, 폐 호산구증가증 및 염증이 유발되는 천식 모델이 기술되어 있다. 수가지 동물 모델 (기니아 피그, 랫트, 비-인간 영장류)은 에어로졸 항원으로의 챌린지시 인간에서 아토피 천식과 유사한 증상을 나타낸다. 쥐과 동물 모델은 인간 천식의 다수의 특징을 갖는다. 천식 치료에서의 활성 및 효능에 대해 본 발명의 화합물을 시험하는데 적합한 절차가 문헌[Wolyniec, W. W. et al., Am . J. Respir . Cell Mol . Biol ., 18: 777 (1998)] 및 본원에 인용된 참고문헌에 기술되어 있다.
또한, 본 발명의 화합물을 건선 유사 질환에 대한 동물 모델에 대해 시험할 수 있다. 증거는 건선에 대한 T 세포 병인을 제시한다. 본 발명의 화합물을 문헌[Schon, M. P. et al., Nat . Med ., 3: 183 (1997)]에 기술된 scid/scid 마우스 모델에서 시험할 수 있으며, 여기서 마우스는 건선과 유사한 조직병리학적 피부 병변을 명시한다. 다른 적합한 모델은 문헌[Nickoloff, B. J. et al., Am . J. Path ., 146: 580 (1995)]에 기술된 바와 같이 제조된 인간 피부/scid 마우스 키메라이다.
트랜스제닉 동물을 생산하는 표준 기법을 이용하여 관심있는 동물의 게놈내로 본원에서 동정된 유전자의 코딩 부분을 도입함으로써 재조합 (트랜스제닉) 동물 모델을 조작할 수 있다. 트랜스제닉 조작을 위한 표적으로 사용할 수 있는 동물은 비제한적으로 마우스, 랫트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 개코원숭이, 침팬지 및 원숭이를 포함한다. 상기 동물에 트랜스진을 도입하는 당업계 공지의 기법은 전핵 미세주사[Hoppe and Wanger, 미국 특허 제4,873,191호]; 생식선내로의 레트로바이러스-매개 유전자 전달[참조예; Van der Putten et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 82, 6148-615 [1985]]; 배아 간세포내에서의 유전자 표적화[Thompson et al., Cell, 56, 313-321 [1989]]; 배아의 전기천공[Lo. Mol . Cell Biol ., 3, 1803-1814 [1983]]; 정자-매개 유전자 전달[Lavitrano et al., Cell, 57, 717-73 [1989]]을 포함한다. 개관을 위해, 예를 들어, 미국 특허 제4,736,866호를 참조한다.
본 발명의 목적을 위해, 트랜스제닉 동물은 이들의 세포 중 일부만이 트랜스진을 보유하는 것 ("모자이크 동물")을 포함한다. 트랜스진은 단일 트랜스진으로서, 또는 연쇄체 (concatemer), 예를 들어, 헤드-투-헤드 (head-to-head) 또는 헤드-투-테일 (head-to-tail) 탠덤으로서 통합할 수 있다. 트랜스진의 특정 세포유형내로의 선택적 도입은 또한, 예를 들어, 문헌[Lasko et al., Proc . Natl . Acad , Sci. USA, 89, 623-636 (1992)]의 기법에 의해 가능하다.
트랜스제닉 동물에서 트랜스진의 발현은 표준 기법에 의해 모니터할 수 있다. 예를 들어, 서던 블롯 분석 또는 PCR 증폭을 이용하여 트랜스진의 통합을 확증할 수 있다. 다음, mRAN 발현 수준을 동일계 혼성화, 노던 블롯 분석, PCR 또는 면역세포화학과 같은 기법을 이용하여 분석할 수 있다.
또한, 당해 동물을, 예를 들어, 조직학적 조사에 의해 면역 질환 병리학의 징후에 대해 조사하여, 면역 세포의 특이적 조직으로의 침윤을 측정할 수 있다. 트랜스제닉 동물을 본 발명의 화합물로 처리하여 당해 화합물의 T 세포 증식 자극 또는 억제 정도를 측정하는 차단 실험을 또한 수행할 수 있다. 당해 실험에 있어서, 상기한 바와 같이 제조된, PRO842 폴리펩티드에 결합하는 차단 항체를 동물에게 투여하여, 면역 기능에 미치는 영향을 측정한다.
별법으로, 본원에서 동정된 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자와 동물의 배아 세포내에 도입된 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 변형된 게놈 DNA 사이의 상동 재조합의 결과로서 상기 폴리펩티드를 코딩하는 결손 또는 변형 유전자를 보유하는 "녹아웃" 동물을 작제할 수 있다. 예를 들어, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 이용하여 확립된 기법에 따라 당해 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. 특정 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부를 결실시키거나, 통합을 모니터하는데 사용할 수 있는 선택성 마커를 코딩하는 유전자와 같은 다른 유전자로 치환할 수 있다. 전형적으로, 수 킬로베이스의 변형되지 않은 플랭킹 DNA (5' 및 3' 말단 양쪽)가 벡터내에 포함된다[상동 재조합 벡터의 기술에 대한 참조예: Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)]. 당해 벡터를 (예를 들어, 전기천공에 의해) 배아 간세포주내로 도입하고, 도입된 DNA가 내인성 DNA와 상동적으로 재조합된 세포를 선택한다[참조예: Li et al., Cell, 69:915(1992)]. 다음, 선택된 세포를 동물 (예를 들어, 미우스 또는 랫트)의 포배에 주사하여 응집 키메라를 형성한다[참조예: Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells : A Practical Approach, E. J. Robertson. ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. 다음, 키메라 배아를 적합한 가임신 암컷 양육 동물에게 이식시키고 배아를 "녹아웃" 동물을 생산하는 기간에 이르도록 한다. 생식 세포내에 상동적으로 재조합된 DNA를 보유하는 자손을 표준 기법에 의해 동정하여, 당해 동물의 모든 세포가 상동적으로 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 번식시키는데 사용할 수 있다. 녹아웃 동물을, 예를 들어, 특정 병리학적 상태에 대한 방어 능력 및 상기 폴리펩티드의 부재로 인한 병리학적 상태의 발병에 대해 특성화시킬 수 있다.
J. 면역 보조 요법
한 실시양태에 있어서, 본 발명의 면역자극 화합물을 종양 (암) 치료용 면역보조 요법에서 사용할 수 있다. T 세포가 인간 종양 특이적 항원을 인식하는 것으로 현재 충분히 확립되어 있다. 유전자의 MAGE, BAGE 및 GAGE 계열에 의해 코딩되는 종양 항원의 일군은 모든 성인 정상 조직에서는 잠재적이지만, 흑색종, 폐 종양, 두경부 종양 및 방광 암종과 같은 종양에서 상당량 발현된다[DeSmet, C. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 93:7149 (1996)]. T 세포의 공동자극이 종양 퇴행 및 시험관내 및 생체내 항종양 반응을 유도하는 것으로 제시되어 있다[Melero, I. et al., Nature Medicine , 3:682 (1997); Kwon, E. D. et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA , 94: 8099 (1997); Lynch, D. H. et al., Nature Medicine , 3: 625 (1997); Finn, O. J. and Lotze, M. T., J. Immunol ., 21: 114 (1998)]. 본 발명의 자극 화합물을 단독으로 또는 성장 조절제, 세포독성 약제 또는 화학요법제와 함께 보조제로서 투여하여, T 세포 증식/활성화 및 종양 항원에 대한 항종양 반응을 자극할 수 있다. 성장 조절제, 세포독성 약제 또는 화학요법제는 공지된 투여 요법을 이용하여 통상적인 양으로 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물에 의한 면역자극 활성은 성장 조절제, 세포독성 약제 또는 화학요법제의 감소된 양을 가능하게 하여, 이에 의해 잠재적으로 환자에 대한 독성을 약화시킬 수 있다.
K. 약물 후보물질에 대한 스크리닝 검정법
약물 후보물질에 대한 스크리닝 검정법은 본원에서 동정된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 생물학적 활성 단편에 결합하거나 그와 복합체를 형성하거나, 또는 달리 코딩되는 폴리펩티드의 다른 세포 단백질과의 상호작용을 방해하는 화합물을 동정하도록 디자인된다. 이러한 스크리닝 검정법은 화학물질 라이브러리의 고효율 스크리닝을 가능하게 하여, 이들을 저분자 약물 후보물질을 동정하는데 특히 적합하도록 만드는 검정법을 포함한다. 고려되는 저분자는 펩티드, 바람직하게는 가용성 펩티드, (폴리)펩티드-면역글로불린 융합물을 비롯한 합성 유기 또는 무기 화합물, 및 특히 비제한적으로 폴리- 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단쇄 항체, 항-이디오타입 항체, 및 상기 항체 또는 단편의 키메라 또는 인간화 변이체를 비롯한 항체를 포함한다. 검정법은 당업계에 충분히 특성화되어 있는 단백질-단백질 결합 검정법, 생화학적 스크리닝 검정법, 면역검정법 및 세포 기초한 검정법을 비롯한 다양한 형식으로 수행할 수 있다. 모든 검정법은 이들이 약물 후보물질을 본원에서 동정된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 이들 2종 성분이 상호작용할 수 있기에 충분한 조건하에 및 시간 동안 접촉시키는 것을 요구한다는 점에서 공통적이다.
결합 검정법에서, 상호작용은 결합이고, 형성된 복합체를 반응 혼합물에서 단리하고 검출할 수 있다. 특정한 실시양태에서는, 본원에서 동정된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 약물 후보물질을 공유 또는 비공유적 부착에 의해 고상, 예를 들어, 미세적정 플레이트 상에 고정화시킨다. 비공유적 부착은 일반적으로 고체 표면을 폴리펩티드의 용액으로 코팅하고 건조시킴으로써 수행한다. 별법으로, 고정시킬 폴리펩티드에 특이적인 고정화 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체를 사용하여 폴리펩티드를 고체 표면에 정착시킬 수 있다. 당해 검정법은 검출가능한 표지에 의해 표지시킬 수 있는 비-고정화 성분을 고정된 성분, 예를 들어, 정착된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 첨가함으로써 수행한다. 반응이 완료될 때, 미반응 성분들을, 예를 들어, 세척에 의해 제거하고, 고체 표면 상에 정착된 복합체를 검출한다. 원래 비-고정화 성분이 검출가능한 표지를 보유할 경우에는, 표면에 고정화된 표지의 검출은 복합체 형성이 발생하였음을 지시한다. 원래 비-고정화 성분들이 표지를 보유하지 않을 경우에는, 예를 들어, 고정화 복합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용함으로써 복합체 형성을 검출할 수 있다.
후보 화합물이 본원에서 동정된 유전자에 의해 코딩되는 특정 단백질과 상호작용하지만 결합하지는 않는 경우에, 이의 상기 단백질과의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위한 익히 공지된 방법에 의해 검정할 수 있다. 이러한 검정법은 가교결합, 공동-면역침전, 및 구배 또는 크로마토그래피 칼럼을 통한 공동-정제와 같은 통상적인 접근법을 포함한다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌[Chevray and Nathans, Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 89, 5789-5793 (1991)]에 의해 공개된 바와 같이 필드 및 공동 연구자[Fields and Song, Nature ( London ) 340, 245-246 (1989); Chien et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 88, 9578-9582 (1991)]에 의해 기술된 효모계 유전자 시스템을 이용하여 모니터할 수 있다. 효모 GAL4와 같은 다수의 전사 활성화제는 2개의 물리적으로 분리된 모듈성 도메인, 즉 DNA-결합 도메인으로서 작용하는 하나의 도메인 및 전사 활성화 도메인으로 기능하는 다른 하나의 도메인으로 이루어진다. 상기 문헌에 기술된 효모 발현 시스템 (일반적으로 "투-하이브리드 시스템 (two-hybrid system)"이라고 칭함)은 상기 특성의 이점을 취하고, 2개 하이브리드 단백질, 즉 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인과 융합되어 있는 하이브리드 단백질 및 후보 활성화제 단백질이 활성화 도메인과 융합되어 있는 하이브리드 단백질을 사용한다. GAL4-활성화 프로모터의 제어하에서의 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 의존적이다. 상호작용하는 폴리펩티드를 함유하는 콜로니를 β-갈락토시다제에 대한 발색성 기질로 검출한다. 투-하이브리드 기법을 이용하여 2개의 특정 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 동정하는 완전 키트 (매취메이커 (MATCHMAKER) (등록상표))가 클론테크(Clontech)로부터 시판되고 있다. 또한, 이러한 시스템은 특이적 단백질 상호작용에 연루된 단백질 도메인의 맵핑뿐만 아니라, 이들 상호작용에 중요한 아미노산 잔기의 위치를 정확히 지시하기 위해 사용할 수 있다.
시험할 수 있는 본원에서 동정된 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분과의 상호작용을 방해하는 화합물을 발견하기 위해, 2종의 산물의 상호작용 및 결합을 가능하게 하는 조건하에 및 시간 동안 유전자 산물 및 세포내 또는 세포외 성분을 함유하는 반응 혼합물을 통상적으로 제조한다. 결합을 억제하는 시험 화합물의 능력을 시험하기 위해, 반응을 시험 화합물의 부재 및 존재하에 수행한다. 또한, 위약을 제3의 반응 혼합물에 첨가하여, 이를 양성 대조군으로서 이용할 수 있다. 시험 화합물과 혼합물내에 존재하는 세포내 또는 세포외 성분 사이의 결합 (복합체 형성)을 상기한 바와 같이 모니터한다. 대조군 반응 (들)에서는 복합체가 형성되나 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물 중에서는 복합체가 형성되지 않는 것은 시험 화합물이 시험 화합물과 그의 반응 파트너의 상호작용을 방해한다는 것을 나타낸다.
L. 면역계 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법
면역계 질환의 치료에서 유용한 조성물은 비제한적으로 면역 기능, 예를 들어, T 세포 증식/활성화, 림포킨 방출 또는 면역 세포 침윤을 억제하거나 자극하는 단백질, 항체, 소형 유기 분자, 펩티드, 포스포펩티드, 안티센스 및 리보자임 분자, 삼중 나선 분자 등을 포함한다.
예를 들어, 안티센스 RNA 및 RNA 분자는 표적화 mRAN에 혼성화하여 단백질 해독을 억제함으로써 mRAN의 해독을 직접적으로 차단하는 작용을 한다. 안티센스 DNA가 사용될 경우, 해독 개시 부위, 예를 들어, 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 및 +10 위치로부터 유도된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적 표적 RNA에의 서열-특이적 혼성화, 및 이어서 핵소체내 분해 절단에 의해 작용한다. 잠재적인 RNA 표적내에서의 특이적 리보자임 절단 부위는 공지된 기법에 의해 동정할 수 있다. 추가의 상세한 기술에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Rossi. Current Biology, 4, 469-471 (1994) 및 PCT 공개공보 WO 97/33551 (1997년 9월 18일 공개)]을 참조한다.
전사를 억제하기 위해 사용되는 삼중 나선 형성에서의 핵산 분자는 단쇄이고 데옥시뉴클레오티드로 구성되어야 한다. 이들 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 후그스틴 염기 짝짓기 규칙을 통해 삼중 나선 형성을 촉진하도록 디자인되고, 이는 일반적으로 듀플렉스 중 하나의 쇄 상에 퓨린 또는 피리미딘의 상당한 길이의 연장부가 요구된다. 추가의 상세한 기술에 대해서는, 예를 들어, 문헌[PCT 공개공보 WO 97/33551(상기 문헌)]을 참조한다.
이들 분자는 위에서 논의된 임의의 스크리닝 검정법 또는 이들의 임의의 조합에 의해 및(또는) 당업자에게 익히 공지된 임의의 다른 스크리닝 기법에 의해 동정할 수 있다.
M. 항- PRO842 항체
본 발명은 추가로 항-PRO842 항체를 제공한다. 예시적인 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 이종접합 항체를 포함한다.
1. 폴리클로날 항체
항-PRO 842 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는, 예를 들어, 면역화제 및 필요한 경우에 보조제를 1회 이상 주사함으로써 포유동물에서 생성시킬 수 있다. 전형적으로, 면역화제 및(또는) 보조제는 다수회 피하 또는 복강내 주사에 의해 포유동물에게 주사될 것이다. 면역화제는 PRO842 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화시킬 포유동물에서 면역원성인 것으로 공지된 단백질에 면역화제를 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용할 수 있는 보조제의 예는 프로이드 완전 보조제 및 MPL-TDM 보조제 (모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다. 면역화 방법은 과도한 실험작업 없이도 당업자에 의해 선택될 수 있다.
2. 모노클로날 항체
달리, 항-PRO842 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌[Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기술된 바와 같은 하이브리도마 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 전형적으로 면역화제로 면역화시켜 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다.
면역화제는 전형적으로 PRO842 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포를 목적하는 경우에는 말초혈 림프구 ("PBL")를 사용하거나, 비-인간 포유동물 공급원을 목적하는 경우에는 비장 세포 또는 림프절 세포를 사용한다. 다음, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 림프구를 불멸화 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다[Goding, Monoclonal Antibodies : Principle and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. 불멸화 세포주는 통상적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로, 랫트 또는 마우스 골수종 세포주를 사용한다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양시킬 수 있다. 예를 들어, 모세포가 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우에, 하이브리도마용 배양 배지 ("HAT 배지")는 전형적으로 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다.
바람직한 불멸화 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 발현을 유지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 보다 바람직한 불멸화 세포주는, 예를 들어, 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재) 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 마나사스 소재)으로부터 구입할 수 있는 쥐과 동물 골수종 세포주이다. 또한, 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주가 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기술되어 있다[Kozbor, J. Immunol ., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].
하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지를 PRO842에 대해 지시된 모노클로날 항체의 존재에 대해 검정할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전에 의해, 또는 방사성면역검정법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡수 검정법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 검정법에 의해 측정한다. 이러한 기법 및 검정법은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은, 예를 들어, 스카트카르트(Scatchard) 분석[Munson and Pollard, Anal . Biochem ., 107:220 (1980)]에 의해 측정할 수 있다.
*목적하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 제한 희석 절차에 의해 클론을 서브클로닝시키고 표준 방법[Goding, 상기 문헌]에 의해 성장시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 별법으로, 하이브리도마 세포를 포유동물에서 복수로서 생체내에서 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리하거나 정제할 수 있다.
또한, 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기술된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법을 이용하여 (예를 들어, 쥐과 동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리하여 서열분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 상기한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 백터내로 유입한 다음, 이를 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포내에서 모노클로날 항체의 합성을 수행할 수 있다. 또한, DNA는, 예를 들어, 상동성 쥐과 동물 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환하거나[미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., 상기 문헌], 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다. 상기한 비-면역글로불린 폴리펩티드로 본 발명의 항체의 불변 도메인을 치환하거나, 본 발명의 항체의 특정한 항체-결합 부위의 가변 도메인을 치환하여, 키메라 2가 항체를 생성시킬 수 있다.
항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄 가교결합을 방지하도록 하기 위해 중쇄를 일반적으로 Fc 영역의 임의의 지점에서 절단한다. 별법으로, 관련 시스테인 잔기를 가교결합을 방지하도록 하기 위해 다른 아미노산 잔기로 치환하거나 결실시킨다.
또한, 시험관내 방법도 1가 항체의 제조에 적합하다. 항체 단편, 특히 Fab 단편을 제조하기 위한 항체의 분해는 당업계에 공지된 통상적인 기법을 이용하여 달성할 수 있다.
3. 인간 항체 및 인간화 항체
또한, 본 발명의 항-PRO842 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 비-인간 (예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 인간화 형태는 키메라 면역글로불린, 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 항체의 다른 항원 결합 부서열)이다. 인간화 항체는 수용체의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 수용성을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여체 항체)의 CDR로부터의 잔기로 치환한 인간 면역글로불린 (수용체 항체)을 포함한다. 특정한 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체에서도 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 전형적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다[Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr . Op . Struct . Biol . 2:593-596 (1992)].
*비인간 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 보유한다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 흔히 "이입" 잔기로 언급되며, 이는 전형적으로 "이출" 가변 도메인으로부터 취득된다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터 (Winter)와 공동 연구자의 방법[Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 상기한 "인간화" 항체는 실질적으로 보다 적은 무손상 인간 가변 도메인이 비-인간 종 유래의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기로 치환한 인간 항체이다.
또한, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯한 당업계에 공지된 각종 기법을 이용하여 제조할 수도 있다[Hoogenboom and Winter., J. Mol . Biol ., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol . Bio ., 222:581 (1991)]. 또한, 코울 (Cole) 등 및 보에르너 (Boerner) 등의 기법도 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용할 수 있다[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) 및 Boerner et al., J. Immunol ., 147(1):86-95 (1991)]. 유사하게는, 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스에 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입함으로써 인간 항체를 제조할 수 있다. 챌린지시, 인간 항체 생산이 관찰되는데, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레퍼터리를 비롯한 모든 점에서 인간에서 관찰되는 것과 밀접하게 유사하다. 이러한 접근법은, 예를 들어, 문헌[미국 특허 제5,545,807호, 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호] 및 과학 간행물[Marks et al., Bio / Technology , 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994), Morrison, Nature , 368: 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology , 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern . Rev . Immunol ., 13: 65-93 (1995)]에 기술되어 있다.
또한, 상기한 바와 같은 공지된 선택 및(또는) 돌연변이 유발 방법을 이용하여 항체를 친화성 성숙시킬 수 있다. 바람직한 친화성 성숙 항체는 성숙 항체를 제조하는 출발 항체 (일반적으로, 쥐과 동물, 인간화 또는 인간)보다 5배, 보다 바람직하게는 10배, 보다 더 바람직하게는 20배 또는 30배 높은 친화성을 보유한다.
4. 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 2종 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 당해 경우에, 결합 특이성 중의 하나는 PRO842에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 바람직하게는 세포-표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄/경쇄-중쇄 쌍의 공동-발현에 기초하며, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다[Millstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10가지 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산하며, 이중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 달성한다. 유사한 절차가 문헌[WO 93/08829 (1993년 5월 13일에 공개) 및 Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
목적하는 결합 특이성을 갖는 항체의 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킬 수 있다. 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이 바람직하다. 하나 이상의 융합물내에 존재하는 경쇄 결합에 필수적인 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 보유하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물, 및 필요한 경우에 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체내로 공동-형질감염시킨다. 이중특이적 항체를 생성시키기 위한 추가의 상세한 기술은, 예를 들어, 문헌[Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121:210(1986)]을 참조한다.
WO 96/27011에 기술된 다른 접근법에 따르면, 한쌍의 항체 분자 사이의 계면을 조작하여 재조합 세포 배양물으로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화시킬 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 당해 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 1개 이상의 소형 아미노산 측쇄를 보다 대형 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 치환한다. 대형 아미노산 측쇄를 소형 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환함으로써 대형 측쇄에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보상의 "공동"을 제2 항체 분자의 계면에 생성시킨다. 이는 이종이량체의 수율을 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물의 수율 이상으로 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조할 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기법은 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌[Brennan et al., Science , 229:81 (1985)]에는 무손상 항체를 단백질 가수분해에 의해 절단하여 F(ab')2 단편을 생성시킨는 방법이 기술되어 있다. 이들 단편을 디티올 복합체 형성제인 아비산나트륨의 존재하에 환원시켜 근처 디티올을 안정화시켜 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 다음, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 다음, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민을 사용하여 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용할 수 있다.
이. 콜라이 (E. coli)로부터 Fab' 단편을 직접 회수하여 화학적으로 연결시킴으로써 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. 문헌[Shalaby et al., J. Exp . Med., 175:217-225 (1992)]에는 완전하게 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자가 기술되어 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비되었으며, 시험관내의 지시된 화학적 커플링에 적용시켜 이중특이적 항체를 형성하였다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현시키는 세포 및 정상적인 인간 T 세포와 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방암 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 개시할 수 있었다.
또한, 재조합 세포 배양으로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하는 각종 기법이 기술되어 있다. 예를 들어, 로이신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체를 제조하였다[Kostelny et al., J. Immunol ., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 로이신신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2종의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결하였다. 항체 동종이량체의 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성한 다음, 재산화시켜 항체 이종이량체를 형성하였다. 또한, 당해 방법은 항체 동종이량체를 생산하기 위해 이용할 수도 있다. 문헌[Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 90:6444-6448 (1993)]에 기술된 "디아바디 (diabody)" 기법은 이중특이적 항체 단편을 제조하는 대안 메카니즘을 제공한다. 당해 단편은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는데, 당해 링커는 너무 짧아서 상기 두 도메인을 동일 쇄 상에서 짝지을 수 없다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보적인 VH 및 VL 도메인과 쌍을 이루게 되며, 이에 의해 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단쇄 Fv(sFv) 이량체의 사용에 의해 이중특이적 항체 단편을 제조하는 다른 전략이 또한 보고되어 있다[참조: Gruber et al., J. Immunol ., 152:5368 (1994)].
2가 이상의 결합가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다[Tutt et al., J. Immunol ., 147:60 (1991)].
예시적인 이중특이적 항체는 본원에서 제공된 PRO842 폴리펩티드 상에서 2종의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 별법으로, 특정 PRO842 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 대한 세포 방어 메카니즘에 초점을 맞추기 위해, 항-PRO842 폴리펩티드 아암을 백혈구 상 개시 분자, 예를 들어, T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2, CD3, CD28 또는 B7), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcgR), 예를 들어, FcgRI (CD64), FcgRII (CD32) 및 FcgRIII (CD16)과 결합하는 아암과 연결할 수 있다. 또한, 이중특이적 항체를 사용하여 특정 PRO842 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 세포독성 약제를 국재화시킬 수 있다. 이들 항체는 PRO842-결합 아암과 세포독성 약제 또는 방사성핵종 킬레이트제, 예를 들어, EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA와 결합하는 아암을 보유한다. 관심의 대상인 다른 이중특이적 항체는 PRO842 폴리펩티드와 결합하며, 추가로 조직 인자 (TF)와 결합한다.
5. 이종접합 항체
이종접합 항체도 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 이종접합 항체는 2개의 공유 결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는, 예를 들어, 면역계 세포를 원치 않는 세포에 표적화시키기 위해[미국 특허 제4,676,980호], 및 HIV 감염의 치료를 위해[WO 제91/00360호, 제92/200373호 및 EP 제03089호] 제안되었다. 가교결합제를 사용하는 방법을 비롯한 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 이종접합 항체를 시험관내에서 제조할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 작제할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트 및 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 시약을 포함한다.
6. 이펙터 기능 조작
예를 들어, 암 치료에 있어 항체의 효능을 증강시키도록 이펙터 기능과 관련하여 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입하여, 이에 의해 당해 영역내에 쇄간 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이와 같이 생성된 동종이량체성 항체는 내재화 능력을 향상시키고(시키거나) 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포내 세포독성 (ADCC)을 증강시킨다[참조: Caron et al., J. Exp Med ., 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)]. 또한, 문헌[Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)]에 기술된 이종 이관능성 가교를 사용하여 증강된 항-종양 활성을 보유하는 동종이량체성 항체를 제조할 수 있다. 별법으로, 이중 Fc 영역을 보유하는 항체를 조작할 수 있으며, 이에 의해 증강된 보체 용해 및 ADCC 능력을 보유할 수 있다[참조: Stevenson et al., Anti - Cancer Drug Design , 3: 219-230 (1989)].
7. 면역복합체
또한, 본 발명은 세포독성 약제, 예를 들어, 화학요법제, 독소 (예를 들어, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성복합체)에 접합된 항체를 포함하는 면역복합체에 관한 것이다.
상기 면역복합체의 생성에 유용한 화학요법제는 위에 기술되어 있다. 사용할 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 각종 방사성핵종을 방사선복합된 항체의 제조에 이용가능하다. 예로는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re이 있다.
각종 이관능성 단백질-커플링 제제, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성 약제의 복합체를 제조한다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌[Vitetta et al., Science, 23:1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오디드의 항체에의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다[참조: WO 94/11026].
다른 실시양태에 있어서, 항체를 종양 예비표적화에 이용하기 위한 "수용체" (예를 들어, 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있는데, 여기서 항체-수용체 복합체를 환자에게 투여한 다음, 킬레이트제를 사용하여 순환물로부터 미결합된 복합체를 제거하고, 세포독성 약제 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
8. 면역리포좀
본원에서 개시된 항체를 면역리포좀으로 제형화시킬 수도 있다. 당해 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 문헌[Epstein et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA , 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc . Natl Acad . Sci. USA , 77:4030 (1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호]에 기술된 방법으로 제조할 수 있다. 순환 시간이 증대된 리포좀은 문헌[미국 특허 제5,013,556호]에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 함유하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법에 의해 생성시킬 수 있다. 정해진 공극 크기의 필터를 통해 리포좀을 압출하여 목적하는 직경의 리포좀을 수득한다. 문헌[Martin et al., J. Biol . Chem ., 257:286-288 (1982)]에 기술된 바와 같이 디술피드-상호교환 반응을 통해 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 접합시킬 수 있다. 화학요법제 (예를 들어, 독소루비신 (Doxorubicin))은 임의로 리포좀내에 함유된다[참조: Gabizon et al., J. National Cancer Inst ., 81(19):1484 (1989)].
9. 항- PRO842 항체의 용도
본 발명의 항-PRO842 항체는 다양한 유용성을 보유한다. 예를 들어, 항-PRO842 항체는 PRO842에 대한 진단 검정법에서, 예를 들어, 특이적 세포, 조직 또는 혈청에서의 그의 발현 (및 일부 경우에, 특이적 발현)의 검출에 사용할 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 진단 검정 기법, 예를 들어, 이종 또는 동종 상에서 수행되는 경쟁적 결합 검정법, 직접 또는 간접 샌드위치 검정법 및 면역침전 검정법을 이용할 수 있다[Zola, Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]. 진단 검정법에 사용되는 항체는 검출가능한 잔기로 표지시킬 수 있다. 검출가능한 잔기는 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있어야 한다. 예를 들어, 검출가능한 잔기는 방사성 동위 원소, 예를 들어, 3H, 14C, 32P, 35S 또는 125I, 형광 또는 화학발광 화합물, 예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린, 또는 효소, 예를 들어, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제일 수 있다. 문헌[Hunter et al, Nature, 144:945(1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol . Meth ., 40:219 (1981); 및 Nygren, J. Histochem. and Cytochem ., 30:407 (1982)]에 기술된 방법을 비롯한 항체를 검출가능한 잔기에 접합시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다.
또한, 항-PRO842 항체는 재조합 세포 배양물 또는 천연원으로부터 PRO842의 친화성 재조합에 유용하다. 이 방법에서는, 당업계에 공지된 방법을 사용하여, PRO842에 대한 항체를 세파덱스(Sephadex) 수지 또는 필터 페이퍼와 같이 적합한 지지체상에 고정화시킨다. 이어서, 고정화 항체를 정제될 PRO842를 함유하는 샘플과 접촉시킨 다음, 샘플중, 고정화 항체에 결합된 PRO842를 제외한 모든 물질을 실질적으로 제거하는 적합한 용매로 지지체를 세척한다. 마지막으로, 항체로부터 PRO842를 방출시키는 다른 적합한 용매로 지지체를 세척한다.
하기 실시예는 오직 설명을 위한 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로도 제한하고자 함이 아니다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고 문헌은 언급됨으로써 그 전체가 본원에 도입된다.
N. 제약 조성물
면역계 질환의 치료를 위해 본 발명의 활성 PRO842 분자 (예를 들면, PRO842 폴리펩티드, 항-PRO842 항체, 및(또는) 각각의 변이체) 및 상기 기재된 스크리닝 분석법으로 밝혀진 기타의 분자들을 제약 조성물 형태로 투여할 수 있다. 활성 PRO842 분자, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체의 치료 제제는 저장을 위해, 소정의 순도를 갖는 활성 분자를 임의의 제약적으로 허용가능한 캐리어, 부형체 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하여 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조하였다. 허용가능한 캐리어, 부형제 또는 안정화제는 투여된 투여량 및 농도가 환자에 무독성이어야하며, 인산, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 방부제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 소수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 일당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터 이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및(또는) TWEEN (상표명), PLURONICS (상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제가 포함된다.
본원에 기재된 스크리닝 분석법으로 확인된 화합물들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 유사한 방식으로 제제화될 수 있다.
리포펙션 또는 리포좀을 사용하여 PRO842 분자를 세포내에 전달할 수도 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소의 저해성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열을 기초로, 표적 단백질 서열과 결합하는 능력을 지닌 펩티드 분자를 고안할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성되고(거나) 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Marasco et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:7889-7893 (1993)) 참조).
또한, 본원의 제제는 특정 증상을 치료하기 위해 필요한 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 상보적인 활성을 지닌 화합물을 포함할 수도 있다. 별법으로, 또는 추가로, 이 조성물은 세포독성 약제, 사이토킨 또는 성장억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 배합물에 존재하는 것이 적합하다.
활성 PRO842 분자는 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에서 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐에 봉입될 수도 있다. 상기 기술은 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))에 개시되어 있다.
생체내 투여용으로 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행된다.
서방형 제제 또는 PRO842 분자를 제조할 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스 (상기 매트릭스는 성형품 형태 (예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐)임)를 포함한다. 서방형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOTTM (락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 구성된 주입가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출할 수 있지만, 특정 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 오랫 동안 체내에 남아있는 경우, 이것들은 37 ℃에서 습기에 노출된 결과로 변성 또는 응집되어 생물학적 활성이 손실되고 면역원성이 변할 수 있다. 안정화를 위해 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 전략을 고안해낼 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자간의 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화를 달성할 수 있다.
O. 치료 방법
본 발명의 폴리펩티드, 항체 및 다른 활성 화합물을 사용하여 염증세포의 조직으로의 침윤, T 세포 증식 자극, T 세포 증식 억제, 혈관 침윤성의 증가 또는 감소 또는 이의 억제를 특징으로 하는 질환을 포함하는 T 세포 매개성 질환과 같은 다양한 면역계 질환 및 증상을 치료할 수 있다고 생각된다.
본 발명의 폴리펩티드, 항체 및 다른 화합물로 치료되는 증상 또는 장애의 예로는 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 유년형 만성 관절염, 골관절염, 척추관절증, 전신성 경화증 (경피증), 특발성 염증성 근장애 (피부근염, 다발성 근염), 쇼그렌증후군(Sjoegren's syndrome), 전신성 맥관염, 유육종증, 자가면역 용혈성 빈혈 (면역성 범혈구감소증, 발작성 야간혈색소뇨증), 자가면역성 혈소판감소증 (특발성 혈소판감소성자반병, 면역매개성 혈소판감소증), 갑상선염 (그레이브스병, 하시모도갑상선염, 유년형 림프종성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 진성당뇨병, 면역매개성 신장 질환 (사구체신염, 세뇨관간질성신염), 다발성 경화증, 특발성 탈수초다발성 신경염 또는 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome) 및 만성 염증성 탈수초다발성 신경염과 같은 중추 및 말초신경계의 탈수초 질환, 감염성 간염 (A,B,C,D,E형 간염바이러스 및 기타 비-간친화성 바이러스), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염 및 경화성 담관염과 같은 간담즙성 질환, 염증성 장질환 (궤양성 대장염; 크론병(Crohn's disease)), 글루텐 민감성 장질환 및 휘플병(Whipple's disease), 수포성 피부 질환, 다형홍반 및 접촉성 피부염과 같은 자가면역 또는 면역매개성 피부 질환, 건선, 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증 및 두드러기와 같은 알러지성 질환, 난소의 면역 질환, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유종 및 과민성 폐렴과 같은 폐의 면역 질환, 이식 거부 및 이식편대숙주질환 등의 이식 관련 질환 등이 있다.
전신성 홍반성 루푸스에서, 질환의 중심 매개인자는 자가 단백질/조직에 대한 자가반응성 항체의 생성 및 그 이후의 면역매개성 염증의 발생이다. 항체는 직접 또는 간접적으로 조직 손상을 매개한다. T 림프구가 조직 손상에 직접 관여하는 것으로 나타나지 않더라도, T 림프구는 자가반응성 항체 생성에 필요하다. 그러므로, 질환은 T 림프구에 의존하여 발생한다. 신장, 폐, 근골격계, 피부점막, 눈, 중추신경계, 심혈관계, 위장관, 골수 및 혈액을 포함하는 여러 조직 및 시스템이 임상적으로 영향을 받는다.
류마티스성 관절염(RA)은 관절 연골의 손상과 함께 여러 관절의 활막이 주로 관련된 만성 전신성 자가면역 염증 질환이다. 병원(病原)은 T 림프구 의존성이고, 류마티스성 인자, 자가 IgG에 대한 자가항체의 생성과 관련되어 있으며, 결과적으로 면역 복합체가 형성되어 관절액 및 혈액에 높은 수준으로 존재하게 된다. 관절내에서 이러한 복합체는 림프구 및 단핵세포를 활막으로 현저하게 침윤시키고 그후 활막의 상당한 변화를 유도할 수 있다 (수많은 호중구가 첨가되면서 유사한 세포들이 침윤하면 관절 공간/용액이 변화함). 영향을 받는 조직은 주로 관절이며, 흔히 대칭적인 패턴으로 나타난다. 그러나, 관절외 질환 또한 2가지 주요 형태로 발생한다. 한 형태는 진행성 관절 질환이 진행중인 관절외 병변 및 폐 섬유증, 맥관염 및 피부 궤양의 전형적 병변의 발생이다. 다른 한 형태는 때때로 RA 질환 과정의 후기, 때로는 관절 질환의 진행이 정지한 후에 발생하는 소위 펠티증후군(Felty's syndrome)이며, 호중구감소증, 혈소판감소증 및 비종대의 존재를 포함한다. 이는 다수의 기관에서 맥관염을 수반할 수 있으며, 경색증, 피부 궤양 및 괴저(壞疽)의 형성을 동반한다. 또한, 환자들에서는 흔히, 영향을 받은 관절 바로위의 피하 조직에서 류마티스성 결절이 일어나고, 결절 후기 단계에서는 혼합 염증세포 침윤으로 둘러싸인 괴사 중심을 갖게 된다. RA에서 발생할 수 있는 다른 증상은 다음을 포함한다: 심막염, 흉막염, 관상 동맥염, 폐섬유증을 동반한 간질성 폐렴, 건성각결막염, 및 류마티스성 결절.
유년형 만성 관절염은 흔히 16 세 미만에 시작하는 만성 특발성 염증 질환이다. 이 표현형은 RA와 몇가지 유사성이 있다: 류마티스성 인자가 양성인 몇몇 환자들은 유년형 류마티스성 관절염으로서 분류된다. 이 질환은 소수관절성(小數關節性), 다관절성, 및 전신성의 3 가지 주요 범주로 더욱 분류된다. 관절염은 중증일 수 있고 보통 파괴적이며, 관절 강직 및 성장 지연을 초래한다. 다른 증상으로는 만성 전포도막염 및 전신성 유전분증을 포함할 수 있다.
척추관절증은 HLA-B27 유전자 생성물의 발현과 일부 공통적인 임상적 특징 및 공통된 관련성을 갖는 장애군이다. 이 장애는 다음을 포함한다: 강직성 척추염, 라이터 증후군(Reiter's syndrome) (반응 관절염), 염증성 장질환과 관련된 관절염, 건선과 관련된 경화증, 유년형 척추관절증 및 비분화 척추관절증. 구별되는 특징은 척추염이 있거나 없는 천장골염; 염증성 비대칭 관절염; HLA-B27과의 관련성 (클래스 I MHC의 HLA-B 좌의 혈청학적으로 한정된 대립 형질); 안구 염증, 및 다른 류마티스성 질환과 관련된 자가항체의 부재. 질환 유도의 핵심으로 가장 많이 관련된 세포는 CD8+ T 림프구이고, 이 세포는 클래스 I MHC 분자가 제시하는 항원을 표적으로 한다. CD8+ T 세포는 클래스 I MHC 대립 형질 HLA-B27에 대해서 MHC 클래스 I 분자에 의해 발현된 외래 펩티드인 것처럼 반응할 수 있다. HLA-B27의 에피토프는 세균 또는 다른 미생물의 항원성 에피토프를 모방할 수 있어서 CD8+ T 세포 반응을 유도할 수 있음이 가설로 되어 있다.
전신성 경화증 (경피증)의 병인(病因)은 알려져있지 않다. 이 질환을 표시 (hallmark)하는 것은 피부 경화이고, 이는 활성 염증 과정에 의해 유도되기 쉽다. 경피증은 국소적 또는 전신적일 수 있다; 혈관 병변은 공통적이고, 미소혈관계에서의 내피세포 손상이 전신성 경화증의 발생의 주요한 초기 사건이며, 혈관 손상은 면역매개성일 수 있다. 피부 병변에서의 단핵세포 침윤물 존재 및 많은 환자에서의 항-핵 항체의 존재로 면역학적 근거가 암시된다. ICAM-1은 흔히 피부 병변에 있는 섬유아세포의 세포 표면상에서 상승조절되며, 이것은 이들 세포와 T 세포와의 상호작용이 질환의 병원(病原)에 역할을 할 수 있음을 시사한다. 기타의 관련 기관은 다음을 포함한다: 위장관 (비정상적인 연동운동/운동성을 초래하는 섬유증 및 평활근 위축); 신장 (소궁상동맥 (小弓狀動脈) 및 소엽간동맥(小葉間動脈)에 영향을 주어 결과적으로 신장 피질 혈류를 감소시키는 동심성 내피하층의 내막 증식은 단백뇨, 질소혈증 및 고혈압을 초래함); 골격근 (위측, 간질성 섬유증, 염증); 폐 (간질성 폐렴 및 간질성 섬유증); 및 심장 (수축 밴드 괴사, 반흔형성(班痕形成)/섬유증).
피부근염, 다발성 근염 등을 포함하는 특발성 염증성 근장애는 병인(病因)이 알려져있지 않은 만성 근육 염증 장애이며, 근육 약화를 초래한다. 근육 손상/염증은 흔히 대칭적이고 진행성이다. 자가항체는 대부분의 형태와 연관이 있다. 이러한 근염(筋炎)-특이적 자가항체는 단백질 합성과 관련된 성분, 단백질 및 RNA에 대해 지정되어 이들의 기능을 억제한다.
쇼그렌증후군은 면역매개성 염증 및 그 후의 누선 및 타액선(唾液腺)의 기능적 파괴에 기인한다. 이 질환은 염증성 결합 조직 질환과 관련되거나 그것에 수반된다. 이 질환은 Ro 및 La 항원 (이 둘 모두가 작은 RNA-단백질 복합체임)에 대한 자가항체 생성과 관련되어 있다. 병변은 담도성경변증, 말초 또는 감각 신경병증, 및 촉지성자반병을 포함하는 다른 증상 또는 관련성을 갖는, 건성각결막염, 구강건조증(口腔乾燥症)을 초래한다.
전신성 맥관염은 1차 병변이 염증이고 그 후에 혈관을 손상시켜 이런 영향을 받은 혈관에 의해 공급되는 조직에 허혈/괴사/퇴행을 초래하고, 몇몇 경우에서는 사실상의 말단 기관 기능부전을 초래하는 질환이다. 또한, 맥관염은 류마티스성 관절염, 전신 경화증 등의 다른 면역 염증 매개 질환, 특히 면역 복합체 형성과도 관련된 질환의 2차 병변 또는 후유증으로서 발생할 수도 있다. 1차 전신성 맥관염 군에 속하는 질환은 다음을 포함한다: 전신성 괴사 맥관염: 결절성 다발 동맥염, 알러지성 맥관염 및 육아종증, 다발성 맥관염; 베게너육아종증; 림프종양 육아종증; 및 거대세포 동맥염. 기타 맥관염은 다음을 포함한다: 피부점막 림프절 증후군 (MLNS 또는 가와사키병(Kawasaki's disease)), 단리된 CNS 맥관염, 베헤트병 (Behet's disease), 폐색성 혈전맥관염 (뷰르거병) 및 피부 괴사성 정맥염. 열거된 맥관염 유형 중 대부분의 병원성(病原性) 메카니즘은 주로 혈관벽에서의 면역글로불린 복합체의 침착 및 그 후에 ADCC, 보체 활성화, 또는 둘다를 통한 염증 반응의 유도에 기인하는 것으로 여겨진다.
유육종증은 체내 거의 모든 조직에서의 상피양 육아종증의 존재를 특징으로 하는, 병인(病因)이 알려져있지 않은 증상으로서, 폐가 관련된다는 점이 가장 공통적이다. 병원(病原)은 질환 부위에서 활성화된 대식세포 및 림프양세포 존속을 수반하며, 이들 세포 유형에 의해 방출된 국소적 및 전신적 활성 생성물의 방출로부터 야기되는 후행하는 만성 후유증을 갖는다.
자가면역 용혈성 빈혈, 면역성 범혈구감소증, 및 발작성 야간혈색소뇨증을 포함하는 자가면역 용혈성 빈혈은 적혈구 (및 일부 경우에는 혈소판 등의 다른 혈액 세포) 표면에 발현된 항원과 반응하는 항체가 생성되어 야기된 결과이고, 보체 매개 용균작용 및(또는) ADCC/Fc 수용체 매개 메카니즘을 통해 이러한 항체로 코팅된 세포를 제거한 결과이다.
임상 상태가 다른 면역매개성 혈소판감소증 및 혈소판감소성자반병을 포함하는 자가면역성 혈소판감소증에서, 혈소판 파괴/제거는 혈소판에 대한 항체 또는 보체 부착 및 그후의 보체 용균작용, ADCC 또는 Fc 수용체 매개 메카니즘에 의한 제거의 결과로서 발생한다.
그레이브스병, 하시모도갑상선염, 유년형 림프종성 갑상선염, 및 위축성 갑성선염을 포함하는 갑상선염은 갑상선에 존재하고 흔히 갑상선에 특이적인 단백질과 반응하는 항체의 생성으로 갑상선 항원에 대한 자가면역 반응의 결과이다. 실험 모델은 다음과 같은 모델들을 포함한다: 자연적 모델-래트 (BUF 및 BB 래트) 및 닭 (비만 닭 종류(strain)); 유도가능한 모델-티로글로불린, 갑상선 미소체 항원 (갑상선 퍼옥시다제)을 사용한 동물의 면역화.
제1 형 진성당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병은 췌장도(膵臟島) 소도 세포의 자가면역 파괴인데, 이러한 파괴는 자가항체 및 자가반응성 T 세포에 의해 매개된다. 또한, 인슐린 또는 인슐린 수용체에 대한 항체는 인슐린 비반응성의 표현형을 생산할 수 있다.
사구체신염 및 세뇨관간질성신염을 포함하는 면역매개성 신장 질환은 직접적으로 신장 항원에 대한 자가반응성 항체 또는 T 세포의 생성 결과이거나, 간접적으로 신장에서 다른, 비신장 항원에 반응성인 항체 및(또는) 면역 복합체 침착의 결과로서, 신장 조직에 대한 항체 또는 T 림프구 매개 손상의 결과이다. 그러므로, 면역 복합체의 형성을 초래하는 다른 면역매개성 질환은 간접적인 후유증으로 면역매개성 신장 질환을 유도할 수도 있다. 직접 및 간접 면역 메카니즘 모두가 신장 조직에서 병변 발생을 생성/유도하는 염증성 반응을 초래하여 기관 기능 손상 및 일부 경우에는 신부전(腎不全)으로의 진행을 초래하게 된다. 체액성 및 세포성 면역 메카니즘 모두가 병변의 병원(病原)에 관련될 수 있다.
다발성 경화증, 특발성 탈수초다발성 신경염 또는 길랑-바레 증후군, 및 만성 염증성 탈수초다발성 신경염을 포함하는 중추 및 말초신경계의 탈수초 질환은 자가면역성이며, 희소돌기아교세포 또는 마이엘린에 직접 발생되는 손상의 결과로서 신경의 탈수초를 초래한다고 여겨진다. 다발성 경화증에서, 질환 유도 및 진행은 T 림프구에 의존적임을 제안하는 증거가 있다. 다발성 경화증은 T 림프구 의존성이고 재발-이장(弛張) 과정(relapsing-remitting course) 또는 만성 진행성 과정을 갖는 탈수초 질환이다. 병인(病因)은 알려져 있지 않지만, 바이러스 감염, 유전적 소인, 환경 및 자가면역성 모두가 관여한다. 병변은 주로 T 림프구 매개성, 소교세포(小膠細胞) 및 침윤성 대식세포의 침윤물을 포함하고, CD4+T 림프구는 병변에서의 주된 세포 유형이다. 희소돌기아교세포의 사망 및 그 이후의 탈수초 메카니즘은 알려져있지 않지만, T 림프구에 의한 것으로 보인다.
호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유종, 및 과민성 폐렴을 포함하는 염증성 및 섬유성 폐 질환은 조절장애성 면역 염증 반응을 포함할 수 있다. 이러한 반응의 억제는 치료적으로 유익할 것이다.
수포성 피부 질환, 다형홍반 및 접촉성 피부염을 포함하는 자가면역 또는 면역매개성 피부 질환은 자가항체에 의해 매개되고, 이의 병원(病原)은 T 림프구 의존성이다.
건선은 T 림프구 매개성 염증 질환이다. 병변은 T 림프구, 대식세포 및 항원 프로세싱 세포, 및 몇몇 호중구의 침윤물을 포함한다.
천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증, 및 두드러기를 포함하는 알러지성 질환은 T 림프구 의존성이다. 이들 질환은 주로 T 림프구 유도성 염증, IgE 매개성 염증 또는 이 둘 모두의 조합에 의해 매개된다.
이식 거부 및 이식편대숙주질환 (GVHD)을 포함하는 이식 관련 질환은 T 림프구 의존성이고, T 림프구 기능을 억제하여 개선되었다.
면역 및(또는) 염증 반응의 개입이 유익한 다른 질환으로는 바이러스 감염 (AIDS, A형, B형, C형, D형, E형 간염 및 헤르페스 (herpes)를 포함하나 이것으로 한정되는 것은 아님), 세균 감염, 진균성 감염, 및 원생동물 감염 및 기생충 감염 (MLR을 자극하는 분자 (또는 유도체/효능제)는 감염제에 대한 면역 반응을 강화시키기 위해 치료적으로 이용될 수 있음), 면역 결핍 질환 (MLR을 자극하는 분자/유도체/효능제는 유전적, 후천적, (HIV 감염에서와 같은) 감염 유도적 상태, 또는 의원성(醫原性) (즉, 화학요법 등으로 인한) 상태에 대한 면역 반응을 강화시키기 위해 치료적으로 이용될 수 있음), 및 신생물 (neoplasia) 등을 포함하지만 이것으로 한정되지 않는 감염증이다.
몇몇 인간 암환자에서는 신생물 세포 (neoplastic cell)상에 있는 항원에 대한 항체 및(또는) T 림프구가 발생됨이 증명되었다. 또한, 면역 반응의 증가로 특정 신생물이 거부 또는 퇴행될 수 있음이 신생물 동물 모델에서 나타났다. MLR에서의 T 림프구 반응을 강화시키는 분자는 생체내에서 신생물에 대한 면역 반응을 강화시키는데 유용성을 가진다. MLR에서의 T 림프구 증식 반응을 강화시키는 분자 (또는 효능제 형태로 동일한 수용체에 영향을 주는 저분자 효능제 또는 항체)를 치료적으로 사용하여 암을 치료할 수 있다. 또한, MLR에서 림프구 반응을 억제하는 분자는 신생물 기간 동안 생체내에서 기능하여 신생물에 대한 면역 반응을 저해하는데, 이러한 분자가 신생물 세포 그 자체에 의해 발현될 수 있거나 이들의 발현이 다른 세포에 있는 신생물에 의해 유도될 수 있다. 이러한 억제 분자 (항체, 저분자 길항제 또는 다른 수단)의 길항작용은 면역매개성 종양 거부를 강화시킨다.
또한, 염증전 특성을 갖는 분자의 억제는 재관류 손상, 졸중, 심근 경색, 아테롬성 동맥경화증, 급성 폐 손상, 출혈성 쇼크, 화상, 패혈증/패혈성 쇼크, 급성 관상 괴사, 자궁내막증, 퇴행성 관절 질환 및 췌장염에서 치료적으로 유익할 수 있다. 본 발명의 화합물, 예를 들면, 폴리펩티드 또는 항체는 농축괴로서 또는 일정한 기간 동안의 연속 주입 (continuous infusion)에 의한 정맥내 투여 등의 공지된 방법에 따라, 근육내, 복강내, 뇌척수내 (intracerobrospinal), 피하, 동맥내, 활액낭내, 초내 (intrathecal), 경구, 국소, 또는 흡입 (비내, 폐내) 경로에 의해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 폴리펩티드 및 항체의 정맥내 또는 흡입 투여가 바람직하다.
면역아주반트 요법에서, 항암제 투여 등의 다른 치료 섭생(攝生)이 본 발명의 단백질, 항체 또는 화합물과 병행될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 면역아주반트로 치료되는 환자는 항암제 (화학요법제) 또는 방사선 요법도 받을 수 있다. 이러한 화학요법제를 위한 제제 및 투약 스케쥴은 제조업자의 지시에 따라 또는 당업자가 실험적으로 결정하여 사용할 수 있다. 이러한 화학 요법을 위한 제제 및 투약 스케쥴은 문헌 (Chemotherapy Service, M. C. Perry 편집, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD (1992))에도 기술되어 있다. 화학요법제는 면역아주반트 투여 이전 또는 이후에 투여되거나 이와 동시에 투여될 수 있다. 또한, 타목시펜 등의 항에스트로겐 화합물 또는 오나프리스톤 (EP 616812 참조) 등의 항프로게스테론은 상기 분자에 대해 공지된 투여량으로 제공될 수 있다.
또한, CD20, CD11a CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, 또는 혈관 내피 인자 (VEGF)에 결합하는 항체 등의, 기타 면역 질환 관련 또는 종양 관련 항원에 대한 항체를 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 다르게는, 또는 또한, 본원에 개시된 동일하거나 2 개 이상의 상이한 항원에 결합하는 2 개 이상의 항체를 환자에게 동시투여 (coadministrate)할 수 있다. 또한, 때로는 환자에게 1 개 이상의 사이토킨을 투여하는 것이 유익할 수 있다. 한 실시양태에서는, PRO842 폴리펩티드와 성장억제제를 동시투여한다. 예를 들면, 성장억제제를 먼저 투여한 후, PRO842 폴리펩티드를 투여할 수 있다. 그러나, 동시에 투여하거나 먼저 투여하는 것 또한 고려된다. 성장억제제에 적합한 투여량은 현재 사용되는 양이며, 성장억제제 및 PRO842 폴리펩티드의 병행 작용 (상승 작용)에 의해 낮춰질 수 있다. 면역 관련 질환의 치료 또는 중증도를 완화시키기 위해, 본 발명의 화합물의 적합한 투여량은 상기 정의된 바와 같이, 치료할 질환의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 상기 작용제가 예방 목적으로 투여되는지 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 요법, 환자의 임상 경력 및 상기 화합물에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 상기 화합물은 한 번에 또는 일련의 처치를 통해 환자에게 적합하게 투여된다.
예를 들면, 질환의 유형 및 중증도에 따라, 폴리펩티드 또는 항체 약 1 mg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들면, 0.1 내지 20 mg/kg)이 예를 들면, 1 회 이상의 별도의 투여에 의해, 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1 일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라, 약 1 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 상태에 따라 수일 이상에 걸친 반복 투여기간 동안, 질환의 증세가 원하는 정도로 저해될 때까지 처치를 지속한다. 그러나, 다른 투여 섭생이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행상태는 통상적인 기술 및 분석법으로 쉽게 모니터링된다.
P. 제조 용품
본 발명의 또다른 실시양태에서, 상기 기술된 장애의 진단 또는 치료에 유용한 물질 (예를 들면, PRO842 분자)을 포함하는 제조 용품이 제공된다. 제조 용품은 용기 및 지침서를 포함한다. 적합한 용기로는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 및 시험관 등이 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 용기는 상태의 진단 또는 치료에 효과적인 조성물을 보유하고 멸균 액세스 포트 (access port)를 가질 수 있다 (예를 들면 용기는 정맥내 용액 주머니 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 뚜껑이 있는 바이알일 수 있음). 조성물 중의 활성 제제는 통상적으로 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체이다. 지침서 또는 라벨이 있거나 이와 관련된 용기는 이 조성물이 선택된 상태의 진단 또는 치료에 사용됨을 지시한다. 제조 용품은 인산염완충염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액 등의 제약상 허용가능한 완충제를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 지침서가 있는 포장 삽입물을 포함하는, 상업적으로 및 사용자 입장에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
Q. 면역 관련 질환의 진단 및 예후
특정 면역 관련 질환에서 과다발현된 단백질 등의 세포 표면 단백질은 약물 후보 또는 질환 치료를 위한 훌륭한 표적이다. 면역 관련 질환 상태에서 증폭된 유전자가 코딩하는 분비 단백질과 함께 상기 단백질은 이들 질환의 진단 및 예후에 추가의 용도가 있다. 예를 들면, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 염증성 창자 질환 또는 다른 면역 관련 질환에서 증폭된 유전자의 단백질 생성물에 대한 항체를 사용하여 진단 또는 예후를 위해 사용할 수 있다.
예를 들면, 항체 단편을 포함하는 항체를 사용하여 증폭되거나 과다발현된 유전자 ("마커 유전자 생성물")가 코딩하는 단백질의 발현을 정성적 또는 정량적으로 검출할 수 있다. 항체에는 예를 들어 형광 표지 등의 검출가능한 표지를 장착하는 것이 바람직하고, 광학 현미경법, 유동세포측정법, 형광측정법, 또는 당업계에 공지된 기타의 기술로 결합을 모니터링 할 수 있다. 이들 기술은 과다발현된 유전자가 세포 표면 단백질을 코딩하는 경우 특히 적합하다. 이러한 결합 분석은 본질적으로 상기 기술된 바대로 수행된다.
마커 유전자 생성물에 대한 항체의 계내 검출을 예를 들면, 면역형광법 또는 면역전자현미경법으로 수행할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 환자로부터 조직학적 표본을 취해, 표지된 항체를 바람직하게는 생물학적 샘플 상에 그 항체를 올려놓아 적용시킨다. 또한, 이 방법으로 조사되는 조직에서의 마커 유전자 생성물의 분포를 결정할 수 있다. 당업자에게는 광범위한 조직학적 방법이 계내 검출에 쉽게 이용가능함이 명백할 것이다.
하기 실시예는 오직 설명을 위한 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로도 제한하고자 함이 아니다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고 문헌은 언급됨으로써 그 전체가 본원에 도입된다.
실시예에서 언급한 시판 시약들은 달리 지시하지 않는 한 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예와 명세서 전반에서 ATCC 기탁번호로 확인되는 세포들의 입수원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, 버지니아주 마나사스)이다.
실시예 1
인간 PRO842 를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
PRO842 폴리펩티드-코딩 핵산 서열은 공공(예, 젠뱅크) 및(또는) 사유(캘리포니아주 팔로 알토에 소재하는 인시테 (Incyte) 파마슈티칼즈 인크로부터의 LIFESEQ (등록상표)) 데이타베이스로부터의 클러스터링되고 어셈블링된 EST 단편 외에 EST에 사유의 신호서열 찾기 알고리즘 (캘리포니아 사우쓰 샌브란시스코에 소재하는 제네테크 인크에 의해 개발됨)을 적용하여 확인하였다. 신호서열 알고리즘은 고려중인 서열 또는 서열 단편의 5'-말단에서 제1 및 임의로 제2 메티오닌 코돈(들)을 둘러싸는 DNA 뉴클레오티드의 특성에 기초해 분비 신호 스코어를 산출한다. 제1 ATG에 이은 뉴클레오티드는 어떠한 정지 코돈도 없이 35 이상의 확실한 아미노산에 대해 유전암호를 지정한다(code). 만약 제1 ATG가 필요한 아미노산을 갖는다면, 제2 ATG는 조사되지 않는다. 어느 쪽도 조건을 만족사키지 않는 경우, 후보 서열을 스코어링하지 않는다. EST 서열이 인가된 신호 서열을 함유하는지의 여부를 결정하기 위해, 분비 신호와 관련되는 것으로 알려진 1세트의 7 센서(평가 파라메터)를 사용해 ATG 코돈을 둘러싸는 DNA 및 대응하는 아미노산 서열을 스코어링한다. 이 알고리즘을 사용하여 인시테 EST 클러스터 서열 번호 69572로서 본원에 디자인된 단일 인시테 EST 클러스터 서열을 확인하였다. 이 EST 클러스터 서열을 이어서 공공 EST 데이타베이스 (예컨대, 젠뱅크) 및 사유 EST DNA 데이타베이스 (LIFESEQ (등록상표), 캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 인사이트 파마슈티칼즈)를 포함하는 다수의 발현 서열 태그 (EST) 데이타베이스와 비교하여 존재하는 상동성을 확인하였다. 이어서, 존재하는 상동성을 확인하는 공공 EST 데이타베이스(예, 젠뱅크) 및 사유 EST DNA 데이타베이스(캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 인사이트 파마슈티칼즈 LIFESEQ (등록상표))를 비롯한 각종 발현서열택(EST) 데이타베이스와 상기 클러스터 서열을 비교하였다. 상동성 조사는 컴퓨터 프로그램 블라스트(BLAST) 또는 블라스트2[Altshul et al., Methods in Enzymology 266:460- 480(1996)]를 사용해 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않았던 70(또는, 일부 경우는 90) 이상의 블라스트 스코어를 초래한 비교치를 프로그램 "프랩(phrap)"(워싱톤 시애틀 워싱톤 대학 필 그린)을 사용해 일치(consensus) DNA 서열로 클러스터링하고 어셈블링하였다. 그로부터 얻어진 일치 서열을 DNA54230으로 명명하였다.
머크 EST 클론 번호 AA477092 내에 포함된 일치 서열과 EST 서열 사이에 관찰되는 서열 상동성 측면에서, 머크 EST 클론 AA477092를 구입하고 cDNA 삽입체를 얻어 시퀀싱하였다. 이 삽입체가 전장 단백질을 코딩한다는 것이 발견되었다. cDNA 삽입체의 서열은 도 98에 나타나고 본원에서는 DNA56855-1447로 지정되었다.
도 98에 나타낸 전장 클론은 153 내지 155번의 뉴클레오티드 부위의 뚜렷한 해독 개시 부위를 갖고 510 내지 512번의 뉴클레오티드 부위의 정지 코돈에서 종결하는 단일 ORF를 포함한다 (도 98; 서열 번호: 164). 예측된 폴리펩티드 전구체 (도 99, 서열 번호: 165)는 119개의 아미노산 길이이다. PRO842는 약 13,819 달톤의 예상 분자량과 약 11.16의 pI을 갖는다. PRO842의 다른 특징은 아미노산이 약 1 내지 22개인 단일 펩티드, 아미노산이 약 39 내지 41개인 잠재성 단백질 키나제 C 인산화 부위 및 아미노산이 약 27 내지 32이고 약 46 내지 51인 2개의 잠재성 N-미리스톨레이션 (myristoylation) 부위를 포함한다.
도 98 (서열 번호: 164)의 전장 서열의 WU-BLAST-2 서열 정렬 분석을 사용하는, 데이호프 (Dayhoff) 데이터베이스 (버젼 35.45 SwissProt 35)의 분석은 PR0842 아미노산 서열과 다음 데이호프 서열들 간의 일부 상동성을 증명한다: CEZK131_11, P_R80843, RAT5HT2X_1, S81882_1, A60912, MCU60315_137MC137L, U93422_1, p_P91996, U93462_1, 및 ZN18_HUMAN.
실시예 2
E. Coli 에서의 PRO842 발현
본 실시예는 E. Coli에서의 재조합 발현에 의한 PRO842의 비-글리코실화된(un-glycosylated) 형태의 제조를 예시한다.
우선 PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 프라이머는 선택 발현 벡터의 제한 효소 부위에 상응하는 제한 효소 부위를 포함하고 있어야 한다. 다수의 발현 벡터를 사용할 수 있다. 적합한 벡테의 예는 암피실린 및 테트라시클린 내성 유전자를 포함하고 있는 pBR322 (E. Coli에서 유도됨, Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977) 참조]이다. 이 벡터를 제한 효소로 절단하고 탈인산화시켰다. 그 후 PCR 증폭 서열을 벡터 내로 결합시켰다. 벡타는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, 트립(trip) 프로모터, 폴리히스(polyhis) 리더 (최초 6개의 STII 코톤, 폴리히스 서열 및 엔테로키나아제 절단 부위를 포함), PRO842 폴리펩티드 코딩 부위, 람다 전사 종결자, 및 argU 유전자에 대한 코딩 서열을 포함할 것이다.
그 후, 삼브룩 등의 상기 문헌에 기재된 방법을 사용하여, 결합 혼합물을 선택된 E. Coli 균주의 형질전환에 사용하였다. 형질전환체를 LB 플레이트에서의 생장 능력으로 동정한 후, 항생 내성 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 단리하고, 제한 분석 및 DNA 시퀀싱으로 확인할 수 있었다.
선택된 콜로니를 항생제로 보충된 LB 액체 배지와 같은 액체 배양 배지에서 밤새 생장시킬 수 있다. 밤샘 배양은 이어서 대규모의 배양을 하는 데 사용할 수 있다. 그 후 세포를 발현 프로모터가 턴-온 (turn-on)되는 동안 원하는 광학 밀도로 생장시킨다.
세포를 몇 시간 더 배양한 후에 세포를 원심분리하여 수확할 수 있다. 원심분리로 얻은 세포 펠렛을 당업계에 알려진 다양한 시약을 사용하여 용해화할 수 있고, 용해된 PRO842 단백질은 단백질을 단단하게 결합하게 하는 조건 하에서 금속 킬레이팅 칼럼을 사용하여 정제할 수 있다.
PRO842 폴리펩티드는 다음의 공정을 사용하여, 폴리-히스 태그 형태로 E. Coli에서 발현시킬 수 있다. PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 초기에 증폭하였다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 상응하는 제한 효소 부위, 및 효율적이고 신뢰성 있는 번역 개시, 금속 킬레이션 칼럼 상에서의 신속한 정제 및 엔테로키나아제로 단백질 분해 제거를 제공하는 다른 유용한 서열을 포함할 것이다. 그 후, 균주 52 (W3110 fuhA(tonA) 이온 galE rpoHts (htpRts), clpP (laclq))를 기초로 한 E. Coli 숙주를 형질전환하는 데 사용하는, PCR-증폭 폴리-히스 태그 서열을 발현 벡터 내로 결합시켰다. 우선, O.D. 600이 3 내지 5에 도달할 때까지, 30 ℃에서 교반하면서 50 mg/㎖ 카르베니실린을 함유하는 LB에서 형질전환체를 생장시켰다. 그 후, 배지를 CRAP 배지 ((NH4)2SO4 3.57 g, 구연산 나트륨 2H20 0.71g, KCl 1.07g, 디프코(Difco) 효모 추 출물 5.36 g, 물 500 ㎖ 중 쉐필드 히카제 SF 5.36 g, 이외에 100 mM MPOS, pH 7.3, 0.55%(w/v) 클루코스 및 7 mM MgSO4를 혼합하여 제조함)로 50 내지 100배 희석하고, 진탕과 함께 30℃에서 약 20 내지 30시간 동안 생장시켰다. 샘플을 제거하고, SDS-PAGE 분석으로 발현을 확인하고, 벌크 배양을 원심분리하여 세포를 펠렛으로 만들었다. 세포 펠렛을 정제 및 리폴딩 때까지 동결하였다.
0.5 내지 1 L 발효물 (6 내지 10 g 펠렛)의 E. Coli 페이스트를 7 M 구아니딘, 20 mM 트리스, pH 8 버퍼에서 10배(w/v)로 재현탁하였다. 고체 아황산 나트륨 및 소듐 테트라티오네이트를 첨가하여 각각 0.1 M 및 0.02 M의 최종 농도를 만들고, 용액을 밤새 4℃에서 교반하였다. 이 단계는 모든 시스테인 잔기들이 아황산화에 의해 블록된 변성된 단백질을 제공하였다. 이 용액을 벡크만 울트라센드리퓨즈 (Beckman Ultracentrifuge) 내에서 40,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 금속 킬레이트 칼럼 버퍼 (6M 구아니딘, 20 mM 트리스, pH 7.4)의 3 내지 5배 부피로 희석하고, 0.22 마이크론 필터로 여과하여 정화하였다. 정화된 추출물을 금속 킬레이트 칼럼 버퍼에서 평형된 5 ㎖ 퀴아겐(Qiagen) Ni-NTA 금속 킬레이트 칼럼 상에 적재하였다. 칼럼을 50 mM 이미다졸 (Calbiochem, Utrol grade), pH 7.4를 포함하는 추가 버퍼로 세척하였다. 단백질을 250 mM 이미다졸을 포함하는 버퍼로 용리하였다. 목적 단백질을 포함하는 분획을 모아서 4℃에서 저장하였다. 아미노산 서열을 기초로 하여 계산된 절멸 계수를 사용하여 280 nm에서의 흡수도로 단백질 농도를 평가하였다.
20 mM 트리스, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M 우레아, 5 mM 시스테인, 20 mM 글리신 및 1 mM EDTA를 포함하는, 새롭게 제조된 리폴딩 버퍼에 샘플을 천천히 희석시킴으로써 단백질을 리폴딩하였다. 리폴딩 부피는 최종 단백질 농도가 50 내지 100 ㎍/㎖이 되도록 선택하였다. 리폴딩 용액을 4℃에서 12 내지 38시간 동안 완만하게 교반하였다. 리폴딩 반응물을 최종 농도가 0.4% (pH 약 3)로 되도록 TFA를 첨가함으로써 급랭시켰다. 단백질을 더 정제하기에 앞서, 용액을 0.22 마이크론 필터로 여과하고, 아세토니트릴을 2 내지 10% 최종 농도가 되도록 첨가하였다. 10%에서 80%로의 아세토니트릴 구배로 용리시키며 0.1% TFA의 유동성 버퍼를 사용하여 프로스 (Pros) R1/H 역상 칼럼 상에서 리폴딩된 단백질을 크로마토그래피하였다. A280의 흡수도를 갖는 분획 부분을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석하고, 리폴딩된 상동성 단백질을 포함하는 분획을 모았다. 일반적으로, 대부분의 단백질 중 적절하게 리폴딩된 종류는 역상 수지와의 상호 반응으로부터 보호되는 소수성 내부 구조로 매우 조밀하기 때문에, 아세토니트릴의 최소 농도에서 용리되었다. 응집된 종류는 아세토니트릴 고농도에서 통상 용리되었다. 역상 단계는 목적 형태로부터 잘못 폴딩된 단백질 형태를 용해하는 것 이외에, 샘플로부터 엔도톡신도 제거하였다.
목적하는 폴딩된 PRO842 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모으고, 용액에 대한 질소의 온순한 흐름을 사용하여 아세토니트릴을 제거하였다. 배합 버퍼에서 평형화되고 무균으로 여과된 G25 슈퍼파인(Superfine) (Pharmacia) 수지를 사용하여 단백질을 투석 또는 겔 여과함으로써 0.14 M 염화 나트륨 및 4% 만니톨을 포함하는 20 mM 헤페스, pH 6.8로 배합하였다.
PRO842 폴리펩티드를 하기 방법을 사용하여 성공적으로 발현시켰다. His-태그된 PRO842 봉입체를 함유하는 이. 콜라이 박테리아 세포를 변성 조건 하에서 추출하고, 단백질을 Ni-NTA 금속-킬레이트 칼럼 상에서 정제하였다. Ni-NTA 용리액을 6M 구아니딘 HCl을 함유하는 MES (pH 6.0) 20 mM로 평형화된 하이로드(HiLoad) 16/60 수퍼덱스(Superdex) 75 겔 여과 칼럼 (Amersham Pharmacia) 상에 가하였다. 목적 단백질을 함유하는 용리된 분획을 수집하였다. 약 5 ml의 수퍼덱스 75 용리액을 pH 8.0에서 50 mM DTT로 처리한 뒤, 물 중 0.1% TFA로 평형화된 RP-HPLC 비닥 (Vydac) C4 칼럼 (1.0 x 25 cm) 상에 가한 다음, 0.1% TFA 중 아세토니트릴 (25 내지 37%) 직선 구배를 이용하여 3 ml/분의 속도로 총 30분간 용리하였다. 목적 단백질을 함유하는 분획을 수집하고 동결건조하였다. 동결건조된 단백질을 사용 전에 1 mM HCl에 용해하였다.
변성된 PRO842 단백질은 다음과 같이 리폴딩되었다. 수퍼덱스 75 용리액 약 5 mg을 20 mM 트리스 (pH 8.6), 2.5 M 우레아, 0.3 M NaCl, 20 mM 글리신, 1 mM EDPA, 1 mM 산화된 글루타티온 및 1 mM 환원된 글루타티온을 함유하는 완충액으로 최종 단백질 농도가 50 ㎍/ml이 되도록 희석하였다. 리폴딩 혼합물을 밤새 2 내지 8℃에서 인큐베이션한 뒤, 그의 pH를 빙초산을 이용하여 pH 4.0으로 조정하였다. 리폴딩 혼합물을 30% 에탄올을 함유하는 50 mM 소듐 아세테이트 (pH 5.5) (완충액 A)로 평형화된 1 ml 하이트랩(HiTrap) SP HP 양이온 교환 칼럼 (Amersham Pharmacia) 상에 로딩하였다. 칼럼을 5 칼럼 부피의 완충액 A로 세척하고, 완충액 A 중 400 mM 내지 600 mM의 NaCl 직선 구배 15 컬럼 부피로 단백질을 용리하였다. 목적 단백질을 함유하는 분획을 수집하고, 물 중 0.1% TFA의 동등 부피로 희석한 뒤, RP-HPLC 비닥 C4 칼럼 상에 로딩한 뒤, 상기 기재한 바와 같이 용리하였다. 목적 단백질을 함유하는 분획을 수집하여 동결건조하였다. 단백질을 사용 전에 1 mM HCl에 용해하였다.
실시예 3
포유동물 세포에서 PRO842 의 발현
본 실시예는 포유동물 세포에서 재조합 발현에 의한 PRO842 폴리펩티드의 효능있는 글리코실화된 형태의 제조를 설명한다.
pRK5 벡터 (1989년 3월 15일 공개된 EP 307,247을 참조)를 발현 벡터로 사용하였다. 임의로, PRO842 DNA를 상기 샘브루크 (Sambrook) 등의 문헌에 기재된 라이게이션 방법을 사용하여 선택된 제한효소로 pRK5로 라이게이션하여 PRO842 DNA를 삽입하였다. 생성된 벡터를 pRK5-PRO842라 부른다.
한가지 실시양태에서, 선택된 숙주 세포는 293 세포일 수 있다. 인간 293 세포 (ATCC CCL 1573)를 태아 소 혈청 및 임의로 영양 성분 및(또는) 항생제로 보충된 DMEM과 같은 배지 중 조직 배양 플레이트에서 전면 생장할 때까지 성장시켰다. 약 10 ㎍의 pRK5-PRO842 DNA를 VA RNA 유전자 [Thimmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982)]를 코딩하는 약 1 ㎍의 DNA와 혼합하고 500 ㎕의 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M CaCl2에 용해시켰다. 상기 혼합물에 500 ㎕의 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaP04를 적가하고, 25 ℃에서 10분 동안 침전을 형성시켰다. 침전물을 현탁하여 293 세포에 첨가하고 37 ℃에서 약 4시간 동안 방치하였다. 배양 배지를 흡입하여 제거하고 PBS 중 20％ 글리세롤 2 ㎖을 30초 동안 첨가하였다. 이어서 293 세포를 혈청 없는 배지로 세척하고, 신선한 배지를 첨가하고 세포를 약 5일 동안 인큐베이션하였다.
형질감염 시키고 약 24시간 후에, 배양 배지를 제거하고 배양 배지 (단독으로) 또는 200 μCi/㎖ 35S-시스테인 및 200 μCi/㎖ 35S-메티오닌을 함유하는 배양 배지로 교체하였다. 인큐베이션 12시간 후에, 조건화 배지를 수집하고, 스핀 필터로 농축하고, 15％ SDS 겔에 로딩하였다. 진행시킨 겔을 건조시키고 선택된 일정시간 동안 필름에 노출시켜 PRO842 폴리펩티드가 존재함을 확인하였다. 형질감염된 세포를 함유하는 배양물을 (혈청 없는 배지에서) 추가로 인큐베이션할 수 있고 배지를 선택된 생물분석으로 시험하였다.
별개의 기술에서, PRO842는 문헌 [Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981)]에 기재된 덱스트란 술페이트 방법을 사용하여 일시적으로 293 세포로 도입할 수 있다. 293 세포를 스피너(spinner) 플라스크에서 최대 밀도로 성장시켰고 700 ㎍의 pRK5-PRO842 DNA를 첨가하였다. 세포를 먼저 원심분리에 의해 스피너 플라스크에서 농축시키고 PBS로 세척하였다. DNA-덱스트란 침전물을 4시간 동안 세포 펠렛 상에 인큐베이션 하였다. 세포를 20％ 글리세롤로 90초 동 안 처리하고, 조직 배양 배지로 세척하고, 조직 배양 배지, 5 ㎍/㎖ 소 인슐린 및 0.1 ㎍/㎖ 소 트랜스페린을 함유하는 스피너 플라스크로 다시 첨가하였다. 약 4일 후에, 조건화 배지를 원심분리하고 여과하여 세포 및 잔해를 분리하였다. 이어서 발현된 PRO842 폴리펩티드를 함유하는 샘플을 농축시키고 투석 및(또는) 칼럼 크로마토그래피와 같은 임의의 선택된 방법으로 정제하였다.
다른 실시양태에서는, PRO842 폴리펩티드를 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다. pRK5-PRO842를 CaPO4 또는 DEAE-덱스트란과 같은 공지된 시약을 사용하여 CHO 세포로 형질감염시킬 수 있다. 상기 기재한 바와 같이, 세포 배양물을 인큐베이션할 수 있고, 배지를 배양 배지 (단독으로) 또는 35S-메티오닌과 같은 방사능 표지를 함유하는 배지로 교체하였다. PRO842 폴리펩티드의 존재를 측정한 후, 배양 배지를 혈청 없는 배지로 교체할 수 있다. 바람직하게는, 배양물을 약 6일 동안 인큐베이션한 후, 조건화 배지를 수확하였다. 이어서 발현된 PRO842 폴리펩티드를 함유하는 배지를 농축하고 임의의 선택된 방법으로 정제할 수 있다.
에피토프로 표지된 PRO842를 또한 숙주 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다. PRO842를 pRK5 벡터로 서브클로닝할 수 있다. 서브클론 삽입물은 PCR을 수행하여 배큘로바이러스 발현 벡터로 폴리-His 표지와 같은 선택된 에피토프 표지로 프레임에 융합시킬 수 있다. 이어서 폴리-His 표지된 PRO842 삽입물을 안정한 클론을 선택하기 위한 DHFR과 같은 선택 마커를 함유하는 SV40 구동 벡터로 서브클로닝할 수 있다. 마지막으로, CHO 세포를 SV40 구동 벡터로 (상기 기재된 바와 같이) 형질감 염시킬 수 있다. 표지를 상기 기재된 바와 같이 수행하여 발현을 확인할 수 있다. 이어서 발현된 폴리-His 표지된 PRO842를 함유하는 배양 배지를 농축하고 Ni2 +-킬레이트 친화 크로마토그래피와 같은 임의의 선택된 방법으로 정제할 수 있다.
PRO842 폴리펩티드를 또한 일시적인 발현 방법에 의해 CHO 및(또는) COS 세포에서 또는 다른 안정한 발현 방법에 의해 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다.
CHO 세포에서 적합한 발현을 하기 방법을 사용하여 수행하였다. 단백질을 각각의 단백질의 가용성 형태 (예를 들어, 세포외 도메인)에 대한 코딩 서열을 힌지, CH2 및 CH2 도메인 함유 IgGl 불변 영역 서열과 융합시키는 IgG 구조물 (이뮤노어드헤신)로서, 및(또는) 폴리-His 표지된 형태로서 발현시켰다.
PCR 증폭 후에, 각각의 DNA를 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)]에 기재된 표준 기술을 사용하여 CHO 발현 벡터에서 서브클로닝하였다. CHO 발현 벡터를 관심있는 DNA의 호환가능한 제한 부위 5' 및 3'으로 구성하여 cDNA를 용이하게 셔틀링시켰다. CHO 세포에서 발현에 사용한 벡터는 문헌 [Lucas et al., Nucl. Acids Res., 24: 9 (1774-1779 (1996)]에 기재되어 있고, SV40 초기 프로모터/인핸서를 사용하여 관심있는 cDNA 및 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 발현시켰다. DHFR 발현은 형질감염 후 플라스미드의 안정한 유지를 위해 선택된다.
원하는 플라스미드 DNA 20 마이크로그램을 상업적으로 입수가능한 형질감염 시약 수퍼팩트 (Superfect)(등록상표) (Qiagen), 도스퍼 (Dosper)(등록상표) 또는 푸젠 (Fugene)(등록상표) (Boehringer Mannheim)을 사용하여 약 천만개의 CHO 세포에 도입하였다. 세포를 상기 루카스 (Lucas) 등의 문헌에 기재된 바와 같이 성장시켰다. 약 3 × 107개의 세포를 하기 기재된 바와 같이 추가의 성장 및 제조를 위해 앰풀에서 동결시켰다.
플라스미드 DNA를 함유하는 앰풀을 수조에 넣어 해동시키고 보텍싱으로 혼합하였다. 내용물을 10 ㎖의 배지를 함유하는 원심분리 튜브로 피펫으로 첨가하고 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 현탁액을 흡입하여 제거하고 세포를 10 ㎖의 선택적 배지 (5％ 0.2 ㎛ 다이아필터로 여과된 소 태아 혈청과 0.2 ㎛ 필터로 여과된 PS20)에 재현탁시켰다. 이어서 세포를 90 ㎖의 선택적 배지를 함유하는 100 ㎖ 스피너에 분액하였다. 1 내지 2일 후, 세포를 150 ㎖의 선택적 성장 배지로 충전된 250 ㎖의 스피너로 옮기고 37 ℃에서 인큐베이션 하였다. 추가의 2 내지 3일 후, 250 ㎖, 500 ㎖ 및 2000 ㎖의 스피너에 3 × 105 세포/㎖로 시딩하였다. 세포 배지를 원심분리에 의해 신선한 배지로 교환하고 생성 배지에 재현탁하였다. 임의의 적합한 CHO 배지를 사용할 수 있지만, 1992년 6월 16일 허여된 미국 특허 제5,122,469호에 기재된 생성 배지를 실제로 사용할 수 있다. 3 ℓ 제조 스피너에 1.2 × 106 세포/㎖로 시딩하였다. 0일째에, 세포 수 pH를 측정하였다. 1일째에, 스피너를 샘플링하고 충전된 공기로의 분무를 시작하였다. 2일째에, 스피너를 샘플링하고, 온도를 33 ℃가 되게 하고, 30 ㎖의 500 g/ℓ 글루코스 및 0.6 ㎖의 10％ 거품방지제 (예를 들어, 35％ 폴리디메틸실록산 에멀젼, 다우 코닝 (Dow Corning) 365 의약 등급 에멀젼)를 첨가하였다. 생성을 통해, pH를 조절하여 약 7.2로 유지시켰다. 10일 후, 또는 생존률이 70％ 미만으로 떨어질 때, 세포 배양물을 원심분리로 수확하고 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 여액을 4 ℃에서 저장하거나 정제용 칼럼에 즉시 로딩하였다.
폴리-His 표지된 구조물에서, 단백질을 Ni-NTA 칼럼 (Qiagen)을 사용하여 정제하였다. 정제하기 전에, 이미다졸을 5 mM의 농도로 조건화 배지에 첨가하였다. 조건화 배지를 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 함유하는 pH 7.4의 20 mM 헤페스 완충용액으로 평형을 맞춘 6 ㎖ Ni-NTA 칼럼으로 4 ℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 펌핑하였다. 로딩 후, 칼럼을 추가의 평형 완충용액로 세척하고 단백질을 0.25 M 이미다졸을 함유하는 평형 완충용액으로 용출하였다. 고도로 정제된 단백질을 이어서 25 ㎖의 G25 수퍼파인 (Superfine) (Pharmacia) 칼럼을 사용하여 pH 6.8의 10 mM 헤페스, 0.14 M NaCl 및 4％ 만니톨을 함유하는 저장 완충용액으로 탈염하고 -80 ℃에서 저장하였다.
이뮤노어드헤신 (Fc-함유) 구조물을 하기와 같이 조건화 배지로 정제하였다. 조건화 배지를 pH 6.8의 20 mM Na 포스페이트 완충용액으로 평형을 이룬 5 ㎖의 프로틴 (Protein) A 칼럼 (Pharmacia)으로 펌핑하였다. 로딩한 후에, 칼럼을 평형 완충용액으로 광범위하게 세척한 후 pH 3.5의 100 mM 시트르산으로 용출하였다. 용출 단백질을 pH 9의 275 ㎕의 1 M Tirs 완충용액을 함유하는 튜브로 1 ㎖ 분율로 수집하여 즉시 중화시켰다. 이어서 고도로 정제된 단백질을 폴리-His 표지된 단백질에 대해 상기 기재된 바와 같이 저장 완충용액으로 탈염시켰다. 균질성을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 및 에드만 (Edman) 분해에 의한 N-말단 아미노산 서열분석에 의해 평가하였다.
PRO842 폴리펩티드를 상기 기재된 바와 같이 성공적으로 발현시켰다.
실시예 4
효모에서 PRO842 의 발현
하기 방법은 효모에서 PRO842 폴리펩티드의 재조합 발현을 기재한다.
먼저, 효모 발현 벡터를 ADH2/GAPDH 프로모터로부터 PRO842의 세포내 생성 또는 분비를 위해 구성하였다. PRO842 폴리펩티드를 세포내 발현 시키기 위해, PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 프로모터를 선택된 플라스미드의 적합한 제한 효소 부위로 삽입하였다. 분비를 위해, PRO842를 코딩하는 DNA를 ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 PRO842 신호 펩티드 또는 다른 포유동물 신호 펩티드, 또는 예를 들어 PRO842의 발현을 위해 (필요한 경우) 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 신호/리더 서열, 링커 서열을 코딩하는 DNA와 함께 선택된 플라스미드로 클로닝할 수 있다.
이어서 효모 균주 AB 110과 같은 효모 세포를 상기 기재된 발현 플라스미드로 형질전환시킬 수 있고 선택된 발효 배지에서 배양시킬 수 있다. 형질전환된 효모 상층액을 10％ 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE에 의해 분리한 후, 쿠마시 블루 스테인으로 겔을 스테이닝하여 분석할 수 있다.
이어서 재조합 PRO842 폴리펩티드를 단리하고 원심분리에 의해 발효 배지로부터 효모 세포를 분리한 후 선택된 카트리지 필터를 사용하여 배지를 농축하여 정 제할 수 있다. PRO842 폴리펩티드를 함유하는 농축액을 선택된 칼럼 크로마토그래피 수지를 사용하여 추가로 정제할 수 있다.
실시예 5
배큘로바이러스로 감염된 곤충 세포에서 PRO842 의 발현
하기 방법은 배큘로바이러스로 감염된 곤충 세포에서 PRO842 폴리펩티드의 재조합 발현을 기재한다.
PRO842에 대해 코딩하는 서열을 배큘로바이러스 발현 벡터 내에 함유된 에피토프 표지의 상류와 융합하였다. 상기 에피토프 표지에는 폴리-His 표지 및 (IgG의 Fc 영역과 유사한) 이뮤노글로불린 표지가 포함된다. pVL1393 (Novagen)과 같은 상업적으로 이용가능한 플라스미드로부터 유래된 플라스미드를 비롯한 다양한 플라스미드를 사용할 수 있다. 간략히, PRO842를 코딩하는 서열 또는 PRO842 코딩 서열의 원하는 부분, 예를 들어 막 통과 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열 또는 단백질이 세포외 단백질인 경우 성숙 단백질을 코딩하는 서열을 5' 및 3' 영역과 상보적인 프라이머로 PCR에 의해 증폭시켰다. 5' 프라이머는 측면의 (선택된) 제한 효소 부위를 혼입할 수 있다. 이어서 생성물을 선택된 제한 효소로 분해시키고 발현 벡터로 서브클로닝하였다.
리포펙틴 (깁코(GIBCO)-BRL로부터 상업적으로 입수가능함)을 사용하여 상기 플라스미드 및 배큘로골드 (BaculoGold)(상표명) 바이러스 DNA (Pharmingen)를 파밤나방 ("Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)로 동시 형질감염시켜 재조합 배큘로바이러스를 생성하였다. 28 ℃에서 4 내지 5일 동안 인큐베이션한 후, 방출된 바이러스를 수확하고 추가의 증폭에 사용하였다. 바이러스 감염 및 단백질 발현을 문헌 [O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]에 기재된 바와 같이 수행하였다.
이어서 발현된 폴리-His 표지된 PRO842를, 예를 들어 하기와 같이 Ni2 +-킬레이트 친화 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 추출물을 문헌 [Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993)]에 기재된 바와 같이 재조합 바이러스로 감염된 Sf9 세포로부터 제조하였다. 간략히, Sf9 세포를 초음파분해 완충용액 (25 ㎖ 헤페스, pH 7.9; 12.5 mM MgCl2 ; 0.1 mM EDTA; 10％ 글리세롤; 0.1％ NP-40; 0.4 M KCl)으로 세척하고 재현탁시키고, 얼음에서 20초 동안 2회 초음파분해하였다. 초음파분해물을 원심분리에 의해 투명하게하고 상층액을 로딩 완충용액 (50 mM 포스페이트, 300 mM NaCl, 10％ 글리세롤, pH 7.8)에 50배 희석하고 0.45 ㎛ 필터로 여과하였다. Ni2 +-NTA 아가로스 칼럼 (키아젠 (Qiagen)으로부터 상업적으로 입수가능함)을 5 ㎖의 층 부피로 제조하고, 25 ㎖의 물로 세척하고 25 ㎖의 로딩 완충용액으로 평형을 이루게 하였다. 여과된 세포 추출물을 1분 당 0.5 ㎖로 칼럼에 로딩하였다. 칼럼을 로딩 완충용액을 사용하여 기준선 A280으로 세척하고, 여기서 점 분율 수집을 시작하였다. 이어서, 칼럼을 2차 세척 완충용액 (50 mM 포스페이트; 300 mM NaCl, 10％ 글리세롤, pH 6.0)으로 세척하고, 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시켰다. A280 기준선에 다시 도달한 후, 칼럼을 2차 세척 완충용액 중 0 내 지 500 mM 이미다졸 구배로 전개하였다. 1 ㎖의 분율을 수집하고 SDS-PAGE 및 실버 스테이닝 또는 알칼린 포스파타제와 컨쥬게이션된 Ni2 +-NTA (Qiagen)로 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. 용출된 His10으로 표지된 PRO842 함유 분율을 수집하고 로딩 완충용액으로 투석하였다.
별법으로, IgG로 표지된 (또는 Fc로 표지된) PRO842를 프로틴 A 또는 프로틴 G 칼럼 크로마토그래피를 비롯한 공지된 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제할 수 있다.
PRO842 폴리펩티드를 상기 기재한 바와 같이 성공적으로 발현시켰다.
실시예 6
PRO842 에 결합하는 항체의 제조
이 실시예는 PRO842에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 제조를 예시한 것이다.
모노클로날 항체를 생산하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 문헌 [Goding, 상기 문헌]에 기재되어 있다. 이용할 수 있는 면역원으로는 정제된 PRO842 폴리펩티드, PRO842 폴리펩티드를 함유한 융합 단백질, 및 세포 표면 상에 재조합 PRO842 폴리펩티드를 발현하는 세포가 포함된다. 면역원은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 선택될 수 있다.
마우스 (예를 들어, BALB/c)를, 프로인트 완전 면역보조제 중에 유제화된 PRO842 면역원을 피하 또는 복막내에 1 내지 100 ㎍의 양으로 주사하여 면역화시켰 다. 별법으로, 상기 면역원을 MPL-TDM 보조제 (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) 중에 유제화하여 동물의 발바닥 뒤쪽에 주사하였다. 그 후, 면역화된 마우스를 10 내지 12일 후에, 선택된 보조제 중에 유제화된 추가의 면역원으로 부스팅시켰다. 그 후, 이 마우스는 수 주 동안 추가의 면역화 주사로 부스팅될 수도 있다. ELISA 분석 시험용 혈청 샘플을 후안와 (retro-orbital) 출혈에 의해 마우스로부터 주기적으로 수득하여 항-PRO842 항체를 검출할 수 있다.
적합한 항체 역가를 검출한 후, 항체에 대해 "양성"인 동물에 최종적으로 PRO842를 정맥 주사로 주입할 수 있다. 3 내지 4일 후, 상기 마우스를 희생시켜 비장 세포를 수거하였다. 그 후 비장 세포를, ATCC로부터 입수가능한 P3X63AgU.1 (ATCC 번호 CRL 1597)과 같은 선별된 뮤린 골수종 세포주와 융합시켰다. 이 융합으로 하이브리도마 세포가 생성되며, 이것을 HAT (히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지가 들어 있는 96웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하여 융합되지 않은 세포, 골수종 하이브리드 및 비장 세포 하이브리드의 증식을 억제할 수 있다.
상기 하이브리도마 세포는 PRO842에 대한 반응성에 대해 ELISA로 스크리닝될 것이다. PRO842에 대한 원하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포를 측정하는 것은 당업계의 기술로 가능하다.
양성 하이브리도마 세포는 동계 (syngeneic) BALB/c 마우스의 복강내에 주사되어 항-PRO842 모노클로날 항체를 함유한 복수 (服水)를 발생시킬 수 있다. 별법으로, 상기 하이브리도마 세포는 조직 배양 플라스크 또는 롤러 바틀 (roller bottle)에서 배양할 수 있다. 복수에서 생산된 모노클로날 항체를 정제하는 것은 암모늄 술페이트 침전법을 이용한 후 겔 배제 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 별법으로, 항체가 단백질 A 또는 단백질 G에 결합하는 것에 기초한 친화 크로마토그래피를 이용할 수 있다.
항- PRO842 항체의 제조
항-PRO842 항체를 하기 방법을 사용하여 제조하였다. BALB/c 마우스를 모노포스포릴 리피드 A/트레할로스 디코리노미콜레이트 (Ribi Immunochemical Research Inc., Hamilton, MT) 중에 재현탁된 CK-27 단백질 2.0 ㎍으로 2주 간격으로 각 뒷 발바닥에 11번 면역화하였다. 최종 부스트(boost) 3일 후, 오금 림프절 세포를 35% 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 쥐 골수종 세포 P3X63AgU.1 (ATCC CRL1597; Americal Type Culture Collection, Rockville, MD)와 융합하였다. 하이브리도마를 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘 (HAT) 배지에서 선별하였다. 융합 10일 후, 하이브리도마 배양 상등액을 고체상 ELISA에서 CK-27 단백질에 결합하는 mAb에 대하여 먼저 스크리닝하였다. 고체상 ELISA CK-27 단백질을 pH 9.6인 0.05M 탄산염 완충액 중에 1 ㎍/ml로 희석하고, 100 ㎕ 분취액을 ELISA 플레이트 (Nunc Immunoplate Maxisorb, Neptune, NY, USA)의 웰에 넣었다. 밤새 4℃에서 인큐베이션한 뒤, 플레이트를 300 ㎕/웰 세척 완충액 (PBS/0.055 트윈-20)으로 3회 세척한 뒤, 200 ㎕/웰 검정 희석액 (PBS/0.55 BAS/0.05% 트윈-20)을 가하여 실온에서 1시간 블로킹하였다. 이번, 그리고 이후의 모든 인큐베이션은 궤도 플레이트 진탕기로 실온에서 실시하였다. 하이브리도마 배양 상등액 100 ㎕를 가하고, 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 추가의 세척 단계 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합 된 염소 항-마우스 IgG Fc (ICN Immunobiologicals/Cappel, Costa Mesa, CA, USA)를가하였다. 플레이트를 추가로 1시간 인큐베이션하고 세척한 뒤, 기질 (TMB)을 가하고 실온에서 5분간 발색되도록 두고, 반응을 산으로 중지시켰다. 450 nm 파장에서 마이크로플레이트 리더를 이용하여 흡광도 값을 측정하였다.
하기 표에 제조 및 시험한 항-PRO842 항체를 제시하였다.
Ab 클론 이소형 ELISA 웨스턴 중화 IHC
1A7.8.6 Ig1/k O O O X
1F11.2.5 IgG1/k O X O X
2A8.80.2 IgG1/k O O O X
2A11.6.3 IgG1/k O X O X
2D9.24.5 IgG2a/k O O O X
2E4.7.26.4 IgG1/k O X O X
2F5.24.1 IgG2b/k O O O X
3A2.12.8 IgG2a/k O X X X
3D4.6.3 IgG1/k O X O X
3H8.6.6 IgG1/k O O O O
4B5.10.4 IgG1/k O O O X
4H10.8.9 IgG2a/k O X O X
항- PRO842 항체를 이용한 웨스턴 블롯
10-20% 아크릴아미드 겔 상에 100 ㎍의 CK27, PUR 4563을 로딩하였다. CK27 단백질을 5% 베타-메르캅토에탄올로 환원시켰다. 아크릴아미드 겔을 니트로셀룰로스 멤브레인 상으로 옮겼다. 웨스턴 블롯을 4℃에서 TBS-T (0.05% 트윈 20을 포함하는 트리스 염수 완충액) 중 5% 건조 우유에서 밤새 블로킹하였다. 그런 다음, 블롯을 실온에서 1시간 동안 5% 우유/TBS-T 중 1 ㎍의 항-CK27 항체와 함께 인큐베이션하였다. TBS-T 1배로 2회 세척하였다. 블롯을 실온에서 1시간 동안 1:10,000 비율의 칼택(Caltag) 염소항-마우스 IgG HRP와 함께 인큐베이션하였다. TBS-T 1배로 3회 세척하였다. 피어스 수퍼시그날 웨스트 듀라 탐지 키트 (Pierce's Supersignal West Dura detection kit)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 웨스 턴 블롯을 현상하였다.
실시예 7
특정 항체를 이용한 PRO842 폴리펩티드의 정제
천연 또는 재조합 PRO842 폴리펩티드는 단백질 정제 분야의 다양한 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 예를 들면, 프로-PRO842 폴리펩티드, 성숙 PRO842 폴리펩티드 또는 프리-PRO842 폴리펩티드는, 관심있는 PRO842 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체를 이용한 면역친화 크로마토그래피에 의해 정제된다. 일반적으로, 면역친화 칼럼은 항-PRO842 폴리펩티드 항체를 활성화된 크로마토그래피 수지에 공유결합으로 커플링시킴으로서 구성된다.
폴리클로날 이뮤노글로불린을 암모늄 술페이트 침전법에 의해, 또는 고정화된 단백질 A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.) 상에서 정제함으로써 면역 혈청으로부터 수득하였다. 이와 유사하게, 모노클로날 항체를 암모늄 술페이트 침전법에 의해, 또는 고정화된 단백질 A 상에서 크로마토그래피함으로써 마우스의 복수로부터 수득하였다. 부분적으로 정제된 이뮤노글로불린은 CnBr-활성화된 세파로스 (상표명) (Pharmacia LKB Biotechnology)와 같은 크로마토그래피 수지에 공유결합으로 부착된다. 항체를 수지에 커플링시키고, 이 수지를 블로킹시키고, 유도된 수지를 제조자의 지시에 따라 세척하였다.
이러한 면역친화 칼럼은 세포로부터 가용성 형태의 PRO842 폴리펩티드를 함유한 분획을 수득하여 PRO842 폴리펩티드를 정제하는 데에 이용된다. 상기 분획은 전체 세포 또는 차별 원심분리 (differential centrifugation)로 얻은 세포 분획 을, 세포용해제 (detergent)를 첨가하거나 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 용해시킴으로써 수득된다. 별법으로, 신호서열을 함유한 가용성 PRO842 폴리펩티드는 세포가 성장하는 배지 내로 유용한 양만큼 분비될 수 있다.
가용성 PRO842 폴리펩티드-함유 분획을 면역친화 칼럼에 통과시키고, PRO842 폴리펩티드가 선택적으로 흡수되는 조건 (예를 들어, 세포용해제가 들어 있는 높은 이온 강도 완충액) 하에서 상기 칼럼을 세척하였다. 그 후, 항체/PRO842 폴리펩티드 결합을 파괴하는 조건 (예를 들어, 약 pH 2 내지 3과 같은 낮은 pH 완충액, 또는 고농도의, 우레아 또는 티오시아네이트 이온과 같은 카오트로프 (chaotrope)) 하에서 상기 칼럼을 용출시켜 PRO842 폴리펩티드를 수거하였다.
실시예 8
약물 스크리닝
본 발명은 다양한 약물 스크리닝 기술에서 PRO842 폴리펩티드 또는 그의 결합 단편을 이용하여 화합물을 스크리닝하는 데에 특히 유용하다. 이러한 시험에 사용된 PRO842 폴리펩티드 또는 그의 단편은 용액 중 유리 상태이거나, 고체 지지체에 고정되거나, 세포 표면에서 발현되거나, 또는 세포 내부에 위치할 수 있다. 약물 스크리닝의 한 방법에서는, 재조합 핵산으로 안정하게 형질전환되어 PRO842 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현하는 진핵성 또는 원핵성 숙주 세포를 이용한다. 약물은 상기 형질전환된 세포에 대해 경쟁 결합 분석법으로 스크리닝된다. 이러한, 살아있거나 또는 고정된 형태의 세포는 표준 결합 분석에 이용될 수 있다. 예를 들면, PRO842 폴리펩티드 또는 그의 단편과 시험된 약제 사이의 복합체 형성을 측정할 수 있다. 별법으로, 시험된 약제에 의해 PRO842 폴리펩티드와 그의 표적 세포 또는 표적 수용체 사이의 복합체 형성이 감소되는 것을 시험할 수 있다.
따라서, 본 발명은 PRO842 폴리펩티드 관련 질환 또는 장애에 영향을 줄 수 있는 약물 또는 임의의 약제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 약제를 PRO842 폴리펩티드 또는 그의 단편과 접촉시켜 (i) 약제와 PRO842 폴리펩티드 또는 그의 단편 사이의 복합체 존재에 대해, 또는 (ii) PRO842 폴리펩티드 또는 그의 단편과 세포 사이의 복합체 존재에 대해, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 분석하는 것을 포함한다. 이러한 경쟁 결합 분석에서, PRO842 폴리펩티드 또는 그의 단편은 전형적으로 표지된다. 적합한 인큐베이션 이후, 유리 PRO842 폴리펩티드 또는 그의 단편을 결합된 형태로부터 분리시키고, 유리 표지 또는 복합화되지 않은 표지의 양으로 특정 약제가 PRO842에 결합하는 능력 또는 PRO842 폴리펩티드/세포 복합체를 방해하는 능력을 측정하였다.
약물 스크리닝의 다른 기술은 폴리펩티드에 적합한 결합 친화도를 가진 화합물에 대한 고속 처리 스크리닝을 제공하며, 이것은 1984년 9월 13일에 공개된 WO 84/03564에 자세히 기재되어 있다. 간략하게 설명하면, 다수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물들을, 플라스틱 핀 또는 기타 다른 표면과 같은 고체 기재 상에서 합성한다. 이것을 PRO842 폴리펩티드에 적용하여, 펩티드 시험 화합물을 PRO842 폴리펩티드와 반응시키고 세척하였다. 결합된 PRO842 폴리펩티드를 당업계에 공지된 방법으로 검출하였다. 또한, 정제된 PRO842 폴리펩티드를 상기한 약물 스크리닝 기술에서 이용하기 위해 플레이트 상에 직접 코팅할 수도 있다. 또한, 비-중화 항체는 펩티드를 포획하고 이것을 고체 지지체 상에 고정화하는 데에 이용될 수도 있다.
또한, 본 발명은 PRO842 폴리펩티드에 결합할 수 있는 중화항체가 PRO842 폴리펩티드 또는 그의 단편에 결합하는 시험 화합물과 특이적으로 경쟁하는 경쟁 약물 스크리닝 분석의 이용을 고려한 것이다. 이 방법에서, 상기 항체는 PRO842 폴리펩티드와 하나 이상의 항원성 결정자를 공유하는 임의의 펩티드를 검출하는 데에 이용될 수 있다.
실시예 9
합리적인 약물 디자인
합리적인 약물 디자인의 목표는 관심있는 (즉, PRO842 폴리펩티드), 또는 예를 들면 효능제, 길항제 또는 억제제와 상호작용하는 작은 분자들의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 구조적 유사체를 생산하는 것이다. 이러한 모든 예가 PRO842 폴리펩티드의 더 활성인 형태 또는 안정한 형태인 약물, 또는 생체내에서 PRO842 폴리펩티드의 기능을 증가시키거나 또는 방해하는 약물을 제조하는 데에 이용될 수 있다 (문헌 [Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)] 참조).
한 연구 방법에서, PRO842 폴리펩티드 또는 PRO842 폴리펩티드-억제제 복합체의 3차원 구조는 X-선 결정학, 컴퓨터 모델링, 또는 가장 전형적으로 상기 2방법의 조합을 이용하여 측정된다. PRO842 폴리펩티드의 모양 및 전하는, 구조를 밝혀내고 이 분자의 활성 부위(들)를 결정하기 위해 확인되어야만 한다. 간혹, PRO842 폴리펩티드의 구조에 관한 유용한 정보는 상동성 단백질의 구조에 기초한 모델링에 의해 얻을 수 있다. 상기 두 경우에 있어서, 관련된 구조적 정보는 유사한 PRO842 폴리펩티드-유사 분자를 디자인하는 데에, 또는 효율적인 억제제를 동정하는 데에 이용된다. 합리적인 약물 디자인의 유용한 예에는 문헌 [Braxton and Wells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)]에서 밝혀진 바와 같이 향상된 활성 또는 안정성을 가진 분자, 또는 문헌 [Athauda et al., J. Biochem., 113: 742-746 (1993)]에서 밝혀진 바와 같이 천연 폴리펩티드의 억제제, 효능제 또는 길항제로서 작용하는 분자가 포함될 수 있다.
또한, 상기한 바와 같이 기능성 분석에 의해 선별된 표적-특이적 항체를 단리한 후, 그의 결정 구조를 해석하는 것이 가능하다. 이 방법으로, 대체로 이후의 약물 디자인시 기초할 수 있는 파마코어 (pharmacore)를 얻는다. 약물학적으로 활성인 기능적 항체에 대한 항-유전자형 항체 (항-ids)를 발생시킴으로써 단백질 결정학을 완전히 우회할 수 있다. 거울상의 거울상으로서, 상기 항-ids의 결합 부위는 원래 수용체의 유사체로서 예상될 것이다. 그 후, 상기 항-id는 화학적으로 또는 생물학적으로 생산된 펩티드의 뱅크로부터 펩티드를 동정하고 단리하는 데에 이용될 수 있다. 그 후, 단리된 펩티드는 파마코어로서 작용할 것이다.
본 발명에 의해, 충분한 양의 PRO842 폴리펩티드는 X-선 결정학과 같은 분석연구를 수행함으로써 이용가능하게 제조될 수 있다. 또한, 본원에 제공된 PRO842 폴리펩티드 아미노산 서열의 정보는 X-선 결정학을 대신하여, 또는 이것에 추가하여 컴퓨터 모델링 기술을 도입하는 데에 길잡이를 제공할 것이다.
실시예 10
암성 종양에서 PRO842 폴리펩티드의 과발현을 검출하기 위한 마이크로어레이 분석
종종 수 천의 유전자 서열을 함유한 핵산 마이크로어레이는 정상 조직과 비교하여 질환 조직에서 상이하게 발현된 유전자를 동정하는 데에 유용하다. 핵산 마이크로어레이를 이용하여, 시험 및 대조 샘플로부터의 시험 및 대조 mRNA 샘플을 역전사시키고 표지하여 cDNA 프로브를 생산한다. 그 후, cDNA 프로브를 고체 지지체에 고정화된 핵산의 배열에 혼성화시킨다. 상기 배열은 배열 각 구성원의 알려진 서열 및 위치에 배열된다. 예를 들면, 특정 질환 상태에서 발현되는 것으로 알려진 선별 유전자들을 고체 지지체 상에 배열할 수 있다. 표지된 프로브와 특정한 배열 구성원의 혼성화는 프로브가 유래된 샘플이 그 유전자를 발현하는 것을 나타낸다. 시험 (질환 조직) 샘플로부터의 프로브 혼성화 신호가 대조 (정상 조직) 샘플로부터의 프로브 혼성화 신호보다 클 경우에, 질환 조직에서 과발현된 유전자 또는 유전자들이 동정된다. 이러한 결과는, 질환 조직에서 과발현된 단백질이 질환 증상의 존재에 대한 진단용 마커로서 뿐만 아니라 상기 질환 증상의 치료에 대한 치료 표적으로서 유용하다는 것을 암시한다.
핵산 혼성화의 방법론 및 마이크로어레이 기술은 당업계에 공지되어 있다. 본원의 실시예에서, 혼성화용 핵산 및 프로브의 구체적인 제조법, 슬라이드 및 혼성화 조건은, 이 거명을 통해 본원에 참고문헌으로 포함된 미국 가출원 번호 제60/193,767호 (2000년 3월 31일 출원)에 모두 상세히 기재되어 있다.
본원의 실시예에서, 암성 종양에서 과발현된 PRO842 폴리펩티드를 동정하기 위해 비-암성 인간 조직과 비교하여 다양한 인간 조직으로부터 유래한 암성 종양의 PRO842 폴리펩티드-코딩 유전자 발현에 대해 연구하였다. 2개 세트의 실험 데이타를 얻었다. 한 세트에서는, 암성 인간 결장 종양 조직 및 동일 환자에서의 상응하는 비-암성 인간 결장 종양 조직 ("상응하는 결장 대조군")을 얻어 상기한 마이크로어레이 기술을 이용하여 PRO842 폴리펩티드 발현에 대해 분석하였다. 제2의 데이타 세트에서는, 임의의 다양한 인간 종양으로부터의 암성 인간 종양 조직을 얻어, 간, 신장 및 폐를 포함한 상피 기원의 비-암성 인간 조직들을 모아서 준비한 "전반적인 (universal)" 상피 대조 샘플과 비교하였다. 모아진 조직들로부터 단리한 mRNA는 상기 상이한 조직들로부터의 발현된 유전자 산물들의 혼합물을 나타낸다. 모아진 대조 샘플을 이용한 마이크로어레이 혼성화 실험으로 2색 분석의 선형 플랏 (plot)을 얻었다. 그 후, 각 실험에서 시험:대조 검출값의 비율을 표준화하는 데에 상기 2색 분석에서 얻은 직선의 기울기를 이용하였다. 그 후, 다양한 실험으로부터의 표준화된 비율을 비교하고, 이것을 유전자 발현의 클러스터링 (clustering)을 동정하는 데에 이용하였다. 따라서 모아진 "전반적인 대조" 샘플로 단순 2-샘플 비교에서 상대적인 유전자 발현을 효과적으로 측정하였을 뿐만 아니라, 수 회의 실험을 거친 다중 샘플 비교도 가능하였다.
본원의 실시예에서, 본원에 기재된 PRO842 폴리펩티드-코딩 핵산 서열로부터 유래한 핵산 프로브는 마이크로어레이를 제작하는 데에 이용되었고, 상기의 종양 조직으로부터의 RNA는 그의 혼성화에 이용되었다. 표준화된 비율:실험적 비율에 기초한 값을 "컷오프 (cutoff) 비율"로 명명하였다. 상기 컷오프 비율 초과의 값만이 유의한 것으로 결정되었다. 하기 표 7은 이러한 실험들의 결과를 나타낸 것 이며, 본 발명의 다양한 PRO842 폴리펩티드가 비-암성 인간 조직 대조군과 비교하여 다양한 인간 종양 조직에서 유의하게 과발현되었다는 것을 나타낸다. 상기한 바와 같이, 이러한 데이타는 본 발명의 PRO842 폴리펩티드가 1종 이상의 암성 종양의 존재에 대한 진단용 마커로서 뿐만 아니라, 상기 종양의 치료에 대한 표적으로서 유용하다는 것을 나타낸다.
분자 과발현 위치 대조군
PRO842 결장 종양 전반적인 정상 대조군
PRO842 폐 종양 전반적인 정상 대조군
PRO842 유방 종양 전반적인 정상 대조군
실시예 11
현장 혼성화 , RT - PCT , 노던 및 면역조직화학법을 이용한 다양한 조직에서의 PRO842의 탐지
현장 혼성화는 세포 및 조직 제제 내의 핵산 서열을 검출하고 위치를 파악하기 위한 강력하고 다용도인 기술이다. 예를 들어, 이 기술은 유전자 발현 부위 확인, 전사의 조직 분포 분석, 바이러스 감염의 확인 및 위치 파악, 특정 mRNA 합성의 변화 추적, 및 염색체 지도 작성의 보조에 유용할 수 있다.
33P-표지된 인간 PRO842 리보프로브를 사용하여 인간 폐, 간 및 난소에서의 유전자 발현을 측정하였다. PCR-생성 33P-표지 리보프로브를 사용하여 문헌 [Lu and Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994)]의 최적 버전의 프로토콜에 따라 현장 혼성화를 수행하였다. 요컨대, 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 묻힌 인간 조직을 박편으로 절단하고, 파라핀을 제거한 후, 37℃에서 15분 동안 단백질 분해효소 K (20 g/ml)로 단백질을 제거하고, 루 (Lu) 및 질레트 (Gillett)의 상기 문헌에 개시된 현장 혼성화를 수행하였다. PCR 생성물로부터 [33P]-UTP로 표지된 안티센스 리보프로브를 생성하여 55℃에서 밤새 혼성화시켰다. 이 슬라이드를 코닥 (Kodak) NTB2 핵 트랙 에멀젼 (nuclear track emulsion) 중에 침지시키고 4주 동안 노출시켰다.
33 P- 리보프로브 합성
6.0 ㎕ (125 mCi)의 33P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2000 Ci/mmol)을 스피드 백 (speed vac)에서 건조시켰다. 건조된 33P-UTP를 포함하는 각 튜브에, 하기 성분들을 첨가하였다.
2.0 ㎕ 5x 전사 완충액
1.0 ㎕ DTT (100 mM)
2.0 ㎕ NTP 혼합물 (2.5mM: 10 ㎕; 각 10mM의 GTP, CTP 및 ATP + 10 ㎕ H2O)
1.0 ㎕ UTP (50 μM)
1.0 ㎕ Rnasin
1.0 ㎕ DNA 주형 (1 ㎍)
1.0 ㎕ H20
1.0㎕ RNA 중합효소 (PCR 생성물의 경우 통상 T3 = AS, T7 = S)
상기 튜브를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1.0 ㎕의 RQ1 DNase를 첨가한 후 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 90㎕의 TE (10mM Tris pH 7.6 및 1 mM EDTA pH 8.0)를 첨가하고, 이 혼합물을 DE81 페이퍼에 피펫팅하였다. 나머지 용액을 마이크로콘 (Microcon)-50 한외여과 유닛에 로딩하고 프로그램 10 (6분)을 이용하여 원심분리하였다. 여과 유닛을 제2 튜브 위에 거꾸로 세우고, 프로그램 2 (3분)를 이용하여 원심분리하였다. 최종 회수 원심분리 후에, 100 ㎕의 TE를 첨가하였다. 최종 생성물 1㎕를 DE81 페이퍼에 피펫팅하고, 6 ml의 바이오플라워 (Bioflour) Ⅱ 중에서 계수하였다.
프로브를 TBE/우레아 겔 상에서 전기영동하였다. 3 ㎕의 로딩 완충액에 1 내지 3 ㎕의 프로브 또는 5 ㎕의 RNA Mrk Ⅲ을 첨가하였다. 95℃의 가열 블록 (heat block)에서 3분 동안 가열한 후, 즉시 겔을 얼음 위에 놓았다. 겔의 웰을 세척한 후, 샘플을 로딩하고, 180 내지 250 볼트에서 45분 동안 전기영동하였다. 사란 랩으로 겔을 싸고, 이를 -70℃ 냉동고에서 1시간 내지 밤새의 시간 동안 신호 증강 스크린 상에서 XAR 필름에 노출시켰다.
33 P- 혼성화
A. 동결 박편의 전처리
냉동고로부터 슬라이드를 꺼내어 알루미늄 트레이에 놓고 상온에서 5분 동안 해동시켰다. 응축 감소를 위해, 트레이를 55℃ 인큐베이터에 5분 동안 놓았다. 발연 후드 (fume hood) 내에서, 얼음 상의 4％ 파라포름알데히드 중에서 10분 동안 슬라이드를 고정시키고, 실온에서 0.5x SSC로 5분 동안 세척 (25 ml 20x SSC + 975 ml SQ H2O)하였다. 0.5 ㎍/ml의 단백질분해효소 K (예열된 RNase-무함유 RNAse 완충액 250 ml 중의 10 mg/ml 원액 12.5 ㎕)로 37℃에서 10분 동안 단백질을 제거한 후, 실온에서 10분 동안 0.5x SSC로 박편을 세척하였다. 70％, 95％ 및 100％ 에탄올로 각각 2분씩 박편을 탈수 처리하였다.
B. 파라핀에 묻힌 박편의 전처리
슬라이드에서 파라핀을 제거하고, SQ H2O 중에 넣어, 실온에서 각 5분 동안 2x SSC로 2회 세정하였다. 인간 배아의 경우 20 ㎕/ml의 단백질분해효소 K (250 ml의 RNase-무함유 RNase 완충액 중 10 mg/ml의 농도 500 ㎕; 37℃, 15분)로, 또는 포르말린 조직의 경우 8x 단백질분해효소 K (250ml의 RNase 완충액 중의 100㎕, 37℃, 30분)로 박편에서 단백질을 제거하였다. 그 후, 상기 기재된 바와 같이 0.5x SSC로의 세정 및 탈수 처리를 수행하였다.
C. 예비혼성화
슬라이드를, 박스 (Box) 완충액 (4x SSC, 50％ 포름아미드)이 들어있는 플라스틱 박스 (포화된 여과지)에 놓았다. 이 조직에 50 ㎕의 혼성화 완충액 (3.75 g 덱스트란 술페이트 + 6 ml SQ H2O)을 넣어 볼텍싱한 후, 뚜껑을 느슨하게 한 상태로 2분 동안 극초단파로 가열하였다. 얼음에서 냉각한 후에, 18.75 ml 포름아미드, 3.75 ml 20x SSC 및 9 ml SQ H2O를 첨가하고 조직을 잘 볼텍싱한 후, 42℃에서 1 내지 4시간 동안 인큐베이션하였다. 얼음 위에서 냉각시킨 후, 18.75 ml의 포름아미드, 3.75 ml의 20x SSC 및 9 ml의 SQ H2O를 첨가하고, 조직을 잘 볼텍싱한 다음, 42℃에서 1 내지 4시간 동안 인큐베이션하였다.
D. 혼성화
슬라이드 당 1.0 x 106 cpm의 프로브 및 1.0 ㎕의 tRNA (50 mg/ml 원액)를 95℃에서 3분 동안 가열하였다. 이 슬라이드를 얼음 위에서 냉각시키고, 슬라이드 당 48 ㎕의 혼성화 완충액을 첨가하였다. 볼텍싱 후, 슬라이드 상의 예비혼성화 생성물 50 ㎕에 33P 혼합물 50 ㎕를 첨가하였다. 이 슬라이드를 55℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
E. 세척
실온에서 2x SSC, EDTA로 10분씩 2회 세척한 후 (400 ml의 20x SSC + 16 ml의 0.25M EDTA, 최종 부피 = 4 L), 37℃에서 30분 동안 RNase A를 처리하였다 (250 ml의 Rnase 완충액 중 10 mg/ml의 RNase 500 ㎕ = 20 ㎍/ml). 슬라이드를 실온에서 2x SSC, EDTA로 10분씩 2회 세척하였다. 엄격 세척 조건은 하기와 같다: 55℃에서 0.1x SSC, EDTA로 2시간 (20 ml의 20x SSC + 16ml의 EDTA, 최종 부피 = 4 L).
F. 올리고뉴클레오티드
본 명세서에 개시된 DNA59294-1381 상에서 현장 분석을 수행하였다. 이 분석에 사용된 올리고뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열로부터 유래하였으며, 일반적으로 약 40 내지 55개 뉴클레오티드 길이이다.
RT - PCR
퀴아젠 알엔이지 미디 키트 (Qiagen's Rneasy midi kit; 카탈로그 번호 75152)를 사용하여 전체 RNA를 각 세포주로부터 추출하였다. 리보그린(Ribogreen; Molecular Probe 카탈로그 번호 R1490)을 사용하여 RNA 정량화를 실시하였다. 어플라이드 바이오시스템스 (Applied Biosystems) 시약 (MgCl2, 올리고 d(T)16, RNA 분해효소 억제제, 10 mM dNTP, MulV 역전사효소)을 사용하여 42℃에서 1시간, 그후 70℃에서 10분간 cDNA를 생성하였다. BD cDNA 중합효소 키트 (카탈로그 번호 s0596)를 사용하여 제조자의 지시사항에 따라 PCR 증폭을 실시하였다. PRO842 프라이머는 5'GGCCAAGAATGTGAGTGCAA 3' (서열 번호 7) 및 5' TGTTTGGCTTTCTGTGGTGC 3' (서열 번호 8)이다. HRPT 프라이머는 5' ACTTTGCTTTCCTTGGTCAG 3' (서열 번호 9) 및 5' GCTTTGTATTTTGCTTTTCC 3' (서열 번호 10)이다. cDNA를 95℃에서 3분간 변성시킨 뒤, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃의 30 주기, 그후 72℃에서 5분간의 연장 기간으로 마무리하였다. HRPT는 증폭 25주기를 실시하였다.
면역조직화학법
면역조직화학법을 위하여, 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 내장한 인간 폐, 간, 난소 및 자궁의 조직 절편을 사용하였다. 25명의 환자로부터의 106개 코어로 구성된 난소 및 자궁내막 조직 마이크로어레이를 사용하여 다양한 정상 조직, 암종 및 생식 세포 종양을 스크리닝하였다 {Kononen, 1998 #172}.
조직 절편에서 파라핀을 제거하고 수화하였다. 항원 회수를 위하여, 슬라이드를 99℃에서 30분간 트릴로지 (Trilogy) 항원 회수 용액 (Cell Marque, Austin, TX) 중에서 2회 인큐베이션하였다. 내인성 퍼옥시다제 활성을 3% H2O2로 중지시킨 뒤, 벡터 바이오틴 아비딘 블로킹 시약 (Vector Laboratories)으로 블로킹하고, 슬라이드를 10% 말 혈청으로 블로킹하였다. 절편을 실험실에서 제조한 마우스 항-PRO842 모노클로날 Ab 10 mg/ml로 염색한 뒤, 블로킹 혈청 중 1:200으로 희석된 바이오티닐화된 말 항-마우스 항체 (Vector Laboratories, Burlingame, CA)와 함께 인큐베이션하였다. 탐지를 위하여 벡터 ABC 키트를 사용하였고, 금속 강화된 DAB (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)를 사용하였다. 절편을 메이어(Mayer)의 헤마톡실린으로 공동염색(counterstain)하였다.
다양한 발현 분석 결과는 다음과 같다.
A. 다양한 조직에서의 PRO842 의 발현
CK27의 발현 패턴을 인간 및 마우스 양자의 다수 조직에서 조사하였다. 도 3 및 4는 인간의 다수 조직 발현 어레이에 대한 혼성화로 예증된 CK27의 발현 패턴을 나타낸다. CK27은 폐, 위 및 기관에서 많이 발현되었다. 난소, 전립선, 결장 및 태아의 폐에서는, CK27의 약한 발현이 탐지되었다. 현장(in situ) 분석에 의하여 정상 폐에서 CK27이 많이 발현된다는 것을 확인하였으며, 염증성 폐 및 천식이 있는 환자의 조직 샘플에서의 발현 또한 확인하였다. 쥐 DNA56855 (CK27)의 발현 패턴은 도 5에 제시하였다. 마우스에서는, 폐, 갑상선, 악하선 및 자궁에서 상당한 수준의 발현이 관찰되었다. 절편에서는 정상 폐, 및 천식 및 간질성 폐렴 블록을 포함하는 성인의 염증성 폐에서, 기관지 상피와 연관된 강한 신호를 나타냈다. 폐 종양 멀티블록은 종양을 포함하는 상피세포 표면 샘 구조에 걸쳐 강한 신호를 나타냈다. 난소 절편에서는, 난소 버팀질에 인접한 관 상피가 양성이었다. 인간 다수 조직 블롯을 이용한 노던 블롯 분석은 PRO842가 인간 폐, 기관 및 위 (도 4A 및 B), 그리고 태아의 폐 (C)에서 발현된다는 것을 나타냈다. 폐의 어떤 세포 종류가 PRO842를 발현하는지, PRO842가 정상 폐 및 염증성 폐에서 상이하게 발현되는지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 폐 절편에 대하여 현장혼성화 (ISH) 및 면역조직화학법 (IHC)을 실시하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, ISH 분석에 의하여, PRO842가 정상 세포에서 많이 발현된다는 것을 예증한 노던 블롯 결과를 확인하였다. 만성 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환에서의 PRO842 발현은 정상 폐에서와 크게 상이하지 않았다. 도 14B는 ISH에 의하여 폐 조직의 점막밑샘에서 PRO842가 발현된다는 것을 보여주며, 이는 IHC (도 14D)에 의하여 확인되었다. 또한, IHC 분석은 PRO842가 기관지 및 세기관지 상피 (도 14E), 및 과립허파꽈리 세포와 비슷한 외형을 가지는 폐포 내피 세포의 서브세트 (도 14G)에서 항상 발현된다는 것을 보여준다. 폐에서 PRO842가 항상 발현되는 것은 비활성화된 혈액 단핵구 및 미성숙 DC를 조직으로 유인하는 것을 조절하는 항상성 (house-keeping) 케모킨으로서의 PRO842의 역할을 암시할 수 있다.
B. 간 질환에서의 PRO842 의 발현
PRO842가 병증에 기여할지도 모르는 역할을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 다양한 질환 조직에서 발현을 시험하였다. ISH에 의한 RNA 수준 (도 15B) 및 IHC에 의한 단백질 수준 (도 15C)에서 볼 수 있는 것처럼, 정상 간에서는 PRO842가 발현되지 않는 반면, 질병이 있는 간에서는 발현된다. 도 15E는 결절 과다형성이 있는 간의 간세포에서 PRO842 RNA 발현을 나타낸다. 간세포에서의 발현은 도 15G에서의 단백질 수준에서 검증된다. 도 15G는 또한 증식성 쓸개 상피 세포가 간세포보다 더 높은 수준으로 PRO842를 발현한다는 것을 나타낸다. 또한, 알콜성 경화증에서, 증식성 쓸개 상피에서 PRO842가 강하게 발현되는 것을 발견하였다 (도 15H).
C. 암에서의 PRO842 의 발현
본 발명자들은 염증성 질환뿐만 아니라, 다양한 암에서의 PRO842 발현을 조사하였다. 도 16B 및 C에 나타낸 바와 같이, 정상 난소에서는 PRO842의 발현이 탐지되지 않는다. 생식 상피에서 IHC에 의해 탐지된 매우 약한 신호의 암시가 있을 수 있으나, 버팀질에서는 신호가 탐지되지 않았다 (도 16C). 반면, 난소 샘암종 샘플의 IHC는 종양성 상피 세포에서 강한 발현을 나타낸다 (도 16 D). 암종 세포에서의 발현은 평가한 난소 샘암종 환자 10명 중 10명에서 나타난 일관된 특징이다. 난소 미분화세포종, 버팀 세포 또는 과립세포종양에서는 PRO842 발현이 관찰되지 않았다.
유사하게, 자궁의 정상 자궁내막샘 상피에서는, PRO842의 발현이 매우 약하거나 전혀 없었다 (도 16E). 정상 자궁내막샘에 비하여, 자궁내막 샘 암종은 PRO842가 매우 강하게 발현되었다 (도 16F). 전체적으로, 본 발명자들은 자궁내막 샘암종에서의 PRO842 염색강도가 난소 샘암종에서보다 더 다양한 차이를 보이지만, 평가한 전체 5명의 환자로부터의 전체 자궁내막 샘암종 샘플이 PRO842 양성이었다는 것을 주지하였다.
또한, 본 발명자들은 수종의 유방암 세포주에서 PRO842 발현을 시험하였다. 도 16G에 나타낸바와 같이, PRO842는 유방암 세포주 BT474 및 MCF7에서 발현된다. 그러나, 모든 유방암 세포주가 PRO842를 발현하는 것은 아니고, SKBR3은 음성이었던 것으로 보아, PRO842는 또한 유방암의 아집단에서 역할을 담당할 수 있다는 것을 암시한다.
실시예 12
PRO842 ( CK27 )의 쓰레딩 분석 ( threading analysis )은 인터루킨-8과의 구조적 상동성을 시사한다.
쓰레딩 방법은 신규 서열의 구조 예측에 대해 높은 민감성을 나타내는 것으로 입증되었다. 이러한 기술은, 서열 비교에 의존하지 않고 소정의 단백질 서열이 공지의 구조와 유사한지의 여부를 검출할 수 있고, 따라서 단백질들 사이의 관련성을 찾아낼 수 있으며, 또한 이들 사이의 서열 유사성이 낮은지의 여부도 검출할 수 있다. 본 연구는 쓰레딩 기술이 표준 서열 유사성 방법으로 검출할 수 있는 것보다 낮은 서열 유사성을, 특히 DNA56855-1447에 의해 코딩되는 신규 케모킨 PRO842 (CD27로 명명됨)에 대해 검출할 수 있음을 입증하였다.
폴드 (fold) 인식 프로그램인 ProCeryon을 본 분석에 이용하였다 (ProCeryon Biosciences, Inc.). 사용된 폴드 라이브러리는 단백질 데이타 뱅크 (Protein Data Bank)로부터 95％ 서열 동일성으로 필터링된 4,749개의 공지 3D 구조들로 이루어져 있었다. 폴드의 잔기들 사이의 에너지 힘, 및 폴드의 잔기들과 주변 용매 사이의 에너지 힘을 나타내는 2가지 평균 힘 전위를 이용하여 서열-구조 적합성을 계산하였다 (Doming, et al., Proteins, 37:112-120 (1999); Sippl, M. J., J. Comput Aided Mol. Des, 7:473-501 (1993); 및 Sippl, M. J., Curr Opin Struct Biol, 5:229-235 (1995)). 갭 (gap)을 제한하여 질의 서열 (query sequence) 및 폴드 라이브러리 목록에서 결실 및 삽입의 수, 크기 및 배치를 제어하였다: 폴드 및 서열 결실 패널티 300; 폴드 및 서열 패널티 15; 및 폴드 및 서열 최대 갭 길이 30. 폴드 정보를 갭 억제요인으로서 이용하였다: 갭은 2차 구조 요소 및 폴드의 코어 부분에 배치되지 않도록 하였다. 서열에서 인접 잔기들 사이의 갭은, 구조에서 이들 사이의 길이가 7 Å 미만인 경우에만 허용하였다. 서열-구조 정렬 상의 단편화를 억제하기 위해, 2개의 인접 갭 사이의 최소 단편 크기를 3개의 잔기로 하였다. BLOSUM40 아미노산 치환 매트릭스를 서열 비교 및 점수 부여 (scoring)에 이용하였다 (Henrikoff, S. and Henrikoff, J. G., Proc. Natl. Acad, Sci USA, 89:10915-10919 (1995)).
최종 점수 부여 및 순위 결정에 4가지 상이한 점수 부여 전략의 조합을 이용하였다: i) 잔기-잔기 및 잔기-용매 상호작용으로부터 유래한 조합된 에너지 점수 (pair/surf); ii) 서열 유사성 점수 (seq); iii) pair/surf와 seq 둘 다의 표준화된 조합 (쓰레딩 지수; Th Idx .); 및 iv) 폴드 길이 (foldlength)와 서열 구조 정렬에 참여한 정렬된 잔기의 수 사이의 비율 (pathlength). 결과는 그들의 쓰레딩 지수 값을 기반으로 하여 순위를 매겼으며, fl/pl 비율을 사용하여 20개의 상위 히트로부터 존재할 가능성이 있는 위 양성을 배제하였다. fl/pl이 약 1 (0.6≤fl/pl≤1.3)일 때 신뢰 수준이 높은 것으로 간주한다. IL8-유사 폴딩 일족의 모든 구성원을 포함하는 폴딩 라이브러리를 구축하고, 구조-기반 단백질 기능 가설을 생성하기 위하여 구조 분류 도식인 SCOP (Murzin et al., J. Mol. Biol., 247:536-540 (1995))을 사용하였다. 구조적 유사성을 기반으로, IL8-유사 폴딩은 PRO842 서열로 정해진다.
구조적 가설의 정확성을 평가하기 위하여, 추가의 쓰레딩 계산을 실시하였다. 제1 단계로서, IL8-유사 폴딩을 채택하는 것으로 알려진 모든 단백질 구조를 대표하는 17개 입력사항으로 구성된 IL8-유사 폴딩 라이브러리를 구축하였다. PRO842뿐만 아니라, 알려진 IL8-유사 단백질을 대조군으로서 이 폴딩 라이브러리에 대하여 연결하였다. IL8-유사 단백질의 쓰레딩 점수는 PRO842 (8% 내지 16% 범위의 서열 동일성)에 대하여 얻은 것과 동일한 범위이다. PRO842에 대하여 얻은 가장 높은 점수는 IL8의 돌연변이체 (IL8E38C/C50A; 1ICW PDB 입력 코드)에 대한 것인데, 이는 야생형 IL8보다 PRO842 서열에 더 양호하게 대응하는 시스테인 잔기의 흥미로운 패턴을 가지고 있다 (도 10A). 1ICW는 IL8-유사 단백질의 특징적인 시스테인 패턴은 없지만, IL8-유사 폴딩을 채택하며, 기능적 케모킨 특성을 지닌다. 생성된 1ICW-유사 모델 상에서의 PRO842의 잠재적 디술파이드 다리의 3D 모델링 및 그래픽 분석 (도 10A)에 의하여 본 발명자들은 PRO842 디술파이드 다리가 1ICW 및 IL8의 것과 구조적으로 유사하며, 이들이 PRO842가 IL8-유사 단백질로서 폴딩할 수 있도록 돕는다는 결론을 내렸다. PRO842는 CXC 모티프 및 6개의 시스테인 잔기를 함유하며, 이들 중 첫 3개는 CXCL-8/IL8 및 CXCL-14/BRAK/MIP-2와 정렬된다. 제4 시스테인은 서열에서 상이한 위치에 존재하지만, 3D로는 IL8-유사 폴딩을 채택하고 기능적 케모킨 특성을 가지는 CXCL-8/IL8 돌연변이체 (E38C/C50A)의 시스테인과 동등하다. 이는 제4 시스테인의 상이한 위치로 인해 PRO842가 케모킨-유사 폴딩을 하지 못하게 되지 않는다는 것을 암시한다. 이러한 발견은 CXC 케모킨의 특징으로 해석되는 것으로서, 군의 신규한 구성원을 확인하는 것을 도울 것이다.
CXCL-8/IL8은 N-말단 구역에 ELR 모티프를 함유하며, 이는 혈관생성 특성을 가지는 CXC 케모킨의 하위 군에 전형적이다. 반면, PRO842는 ELR 모티프를 함유하지 않는다.
실시예 13
신규한 시토카인 PRO842 ( CK27 )의 화학유인 프로파일
A. PRO842는 단핵구 및 수지상 세포를 화학유인한다.
(1) 방법
PRO842 (본 명세서에서 CD27로서 명명)의 쓰레딩 분석은 본 발명의 신규 케모킨이 IL-8과 유사한 작용을 지닐 수 있음을 시사하였다. 인터루킨-8은 염증성 사이토킨으로서, 그리고 호중구에 대한 화학유인물질로서 오랫동안 특성화되어 있었다. 따라서, 트랜스웰 이동성 분석 (transwell migration assay)을 수행하여 잠재적 케모킨으로서 PRO842 (CK27)의 역할을 입증하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 인간 말초 혈액으로부터 하이파크-피콜 밀도 원심분리 (Hypaque-Ficoll density centrifugation)에 의해 단리하였다. PRO842 (CK27)를 향한 PBMC의 이동을, 5 ㎛ 공극의 여과지가 들어있는 24-웰 트랜스웰 이동성 플레이트에서 시험하였다. 웰 당 106개의 PBMC를 사용하였다. 37℃ 및 5％ CO2에서 2.5시간 동안 인큐베이션한 후, 이동한 세포의 수 및 세포 군집의 수를 유동 세포계수기로 분석하였다.
SDF는 R&D 시스템스 (R&D Systems)로부터 입수하였으며, 25 mg/ml로 사용하였다. 이동한 세포의 서브세트의 분석은 Fc 수용체를 10분간 인간 IgG (Sigma, 1 g/106 개 세포)로 예비-블로킹한 뒤, CD3, CD14, CD11c 및 CD16에 대한 Ab (모든 Ab는 Pharmingen으로부터 구입함)로 염색한 뒤, FACS 스캔으로 분석하여 실시하였다. 백일해 독소 (PTX) 실험을 위하여, 세포를 37℃에서 30분간 제시한 양의 PTX의 존재하에서 C5% CO2에서 예비 인큐베이션하였다. PRO842 (CK27)에 대한 마우스 모노클로날 Ab를 실험실에서 제조하여, 이동 검정 중 10 ㎍/ml의 농도로 트랜스웰에 가하였다. 대조군으로 모노클로날 항-MCP-1 Ab (클론 24822, R&D 시스템스, Minneapolis)를 10 ㎍/ml의 농도로 사용하였다.
PRO842 (CK27)의 쓰레딩 분석 결과 CXC 모티프가 존재함을 입증한 것은 흥미로운 것이며, 이는 CK27이 CXC 케모킨 (실시예 13 참조)의 족에 속한다는 것을 시사한다. DNA39523에 대한 구조적 상동성도 밝혀졌으며, 이는 수지상 세포도 유인 (Cao et al., Journal of Immunology, 165:2588-2595 (2000))하는 신규 케모킨 (MIP2-γ로 명명)으로서 공개된 바 있다. 본원에서 확인된 케모킨 PRO842 (CK27) 이외에, MIP2-γ, 및 SDF-α로 알려진 다른 관련 케모킨만이 수지상 세포를 유인하는 CXC 케모킨이다.
(2) 결과
상기 설명한 바와 같이, CK27의 쓰레딩 분석은 PRO842 (CK27)의 화학유인물질 특성의 조사를 촉진시켰다. 트랜스웰 이동성 분석의 결과는 도 6, 7, 8 및 12에 나타나 있다. 이들 연구는 PRO842 (CK27)가 단핵구 및 수지상 세포를 특이적으로 화학유인함을 입증하였다 (도 6 참조). 상이한 로트 (lot)의 CK27도 유사한 화학유인물질 활성을 나타냈다 (도 7). 열처리는 CD11c+ (수지상 세포) 및 CD14+ (단핵구)의 화학유인성을 감소시켰다 (도 8). 이들 데이타는 CK27이 단핵구 및 수지상 세포를 특이적으로 유인함을 보여준다. 그러나, 다른 PBMC 아형, 예컨대, T-세포, 중성구, NK 세포 (도 6B 및 D) 또는 B-세포는 PRO842에 의하여 유인되지 않았다. 2가지 세포형 (단핵구 및 수지상 세포) 모두는 면역 반응의 개시에 중요한 역할을 한다. 몇몇 다른 케모킨에서 나타난 바와 같이, 이동 검정에서 PRO842로의 단핵구 및 DC 이동의 용량-반응 곡선은 종상 반응 곡선을 형성하였다 (도 6A). PRO842에 대한 최적 반응은 고농도보다는 0.5 μM의 농도에서 관찰되었는데, 이는 염증 반응보다 항상성 트래피킹 (constitutive trafficking)을 조절하는 케모킨에 대하여 더욱 전형적이다. 단핵구 및 수지상 세포는 항원에 대한 식작용 능력, 이들 세포 표면으로의 항원 제시 능력, 및 직접적인 세포-세포 상호작용 및 사이토킨 분비에 의한 T-세포 활성화 능력을 가지고 있다. 본 연구는 본 발명에서 확인된 신규 케모킨인 PRO842 (CK27)가 백혈구 수송에 중요한 역할을 하며, 또한 면역 반응의 조절에도 기능할 수 있음을 입증하였다. 또한, CK27은 발생, 조혈작용, 알레르기, 신생혈관형성 및 종양형성을 비롯한 다양한 항상성 과정 및 질환 과정에서 인터루킨-8과 유사한 작용을 할 수 있다. 하기 논의하는 바와 같이, 인간 DNA56855 트랜스제닉 마우스를 수반한 연구들은 CK27이 난소 포낭 병리의 발생에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
PRO842가 비활성화된 DC 및 단핵구의 트래피킹을 조절하는지, 또는 활성화된 DC 및 단핵구 또한 유인하는지를 추가로 조사하기 위하여, 시험관내 이동 검정에 앞서 세포 배양 중 PBMC를 LPS로 자극하였다. 도 6E에 나타낸 바와 같이, LPS와 함께 예비 인큐베이션하면 DC의 PRO842로의 이동이 억제된다. 단핵구를 자극한 후에 동일한 억제가 관찰된다. 또한, 단핵구 및 DC의 2종의 활성화제인 PGE2 및 포르스콜린은 단핵구의 PRO842에 대한 반응을 현저히 감소시켰다. 따라서, PRO42는 혈액 단핵구 및 미성숙 DC를 유인하는 기능을 할 수 있다.
단핵구 및 수지상 세포의 PRO842로의 이동은 백일해 독소 (PTX)에 의하여 억제되는데, 이는 PRO842에 대한 수용체가 7회 막투과성 (7-TM) G-단백질 커플링 수용체 (GPRP)인 것을 의미하며, 이는 케모킨 일족에 대하여 전형적이다 (도 12A 및 B). PRO842로의 이동을 완전히 차단하기 위해서는 SDF에 비하여 고농도의 PTX가 필요하다 (도 12A). 사용한 PTX 농도는 PI/아넥신 V 염색에 의해 평가한 세포 생존률에 영향을 미치지 않았다.
트랜스웰 이동 검정에서 PRO842에 대한 모노클로날 Ab는 PRO842로의 DC 및 단핵구의 이동을 특이적으로 차단하였다 (도 12B). 항체는 실시예 6에 따라 제조 및 시험하였다.
B. 인간 DNA56855 (CK27) 트랜스제닉 마우스 모델은 포낭성 난소를 발생시킨다.
인간 56855 cDNA를, 문헌 [Shani, M., Nature, 314:283-286 (1985)]에 기재된 프로토콜을 이용하여 미오신 경쇄가 뒤쪽에 위치한 pRK 스플라이스 공여자/수용자 부위의 3'에 라이게이션시켰다. 또한, 이 56855 cDNA의 뒤쪽에는 인간 성장 호르몬 유전자의 4번째와 5번째 엑손 사이에 존재하는 스플라이스 공여자/수용자 부위 (Stewart, T. A. et al., Endocrinology, 130:405-14 (1992))가 있었다. 전체 발현 단편을 오염 벡터 서열이 없도록 정제하여, FVB와 FVB의 교배로부터 유래한 1세포 마우스 난자에 주입하였다. CK27 트랜스제닉 마우스는 꼬리 생검체로부터 추출한 DNA를 PCR 분석함으로써 확인하였다. 발현은 골격근 및 생검체로부터의 전체 RNA 상에서 실시간 RT-PCR (택맨 (등록상표, TaqMan); Perkin Elmer)을 수행함으로써 측정하였다.
인간 DNA56855 (CK27)를 MLCH 프로모터의 조절 하에 트랜스진 (transgene)으로서 발현하는 마우스에서는 12주의 연령까지 포낭성 난소가 발생하였다 (도 9 참조). 현장 분석 결과 기관지 상피에서 비교적 특이적인 발현이 나타났지만 (실시예 12 참조), CK27 트랜스제닉 마우스는 조직학적으로 정상적인 폐를 가지고 있었다. 또한, 난소 (인간 조직)에 인접한 나팔관 상피에서의 발현도 현장 분석에서 관찰되었으며, 이는 CK27 트랜스제닉 마우스에서 나타난 변화와 관련된 것일 수 있다.
물질의 기탁
하기 물질들은 미국 버지니아주 20110-2209 매나사스 유니버시티 블러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁되었다:
물질 ATCC 기탁번호 기탁일
DNA56855-1447 203004 1998년 6월 23일
이들 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙 (부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정 하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30 년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크 인크와 ATCC 사이의 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시 (이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙 (37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.
본 출원의 양수인은 적합한 조건 하에 배양할 때 기탁 물질의 배양물이 사멸하거나 손실되거나 파손된 경우, 그 통지시 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
앞서 기술한 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 본 발명은 기탁된 실시양태가 본 발명의 특정 측면의 한 예시로서 의도되는 것이므로 기탁된 제작물의 범위에 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 임의의 제작물은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양태를 포함한 임의의 측면을 실시하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명에 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업자에게는 명백하고, 이는 첨부된 특허 청구의 범위 내에 있을 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. EATON, Dan L. PISABARRO, Maria Teresa SCHMIDT, Kerstin N. VANDLEN, Richard CHIANG, Nancy DIEHL, Lauri <120> INTERLEUKIN-8 HOMOLOGOUS POLYPEPTIDES AND THERAPEUTIC USES THEREOF <130> 22338-00512 <150> US 10/886,040 <151> 2004-07-08 <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 870 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (153)..(512) <400> 1 ctcgccctca aatgggaacg ctggcctggg actaaagcat agaccaccag gctgagtatc 60 ctgacctgag tcatccccag ggatcaggag cctccagcag ggaaccttcc attatattct 120 tcaagcaact tacagctgca ccgacagttg cg atg aaa gtt cta atc tct tcc 173 Met Lys Val Leu Ile Ser Ser 1 5 ctc ctc ctg ttg ctg cca cta atg ctg atg tcc atg gtc tct agc agc 221 Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Met Leu Met Ser Met Val Ser Ser Ser 10 15 20 ctg aat cca ggg gtc gcc aga ggc cac agg gac cga ggc cag gct tct 269 Leu Asn Pro Gly Val Ala Arg Gly His Arg Asp Arg Gly Gln Ala Ser 25 30 35 agg aga tgg ctc cag gaa ggc ggc caa gaa tgt gag tgc aaa gat tgg 317 Arg Arg Trp Leu Gln Glu Gly Gly Gln Glu Cys Glu Cys Lys Asp Trp 40 45 50 55 ttc ctg aga gcc ccg aga aga aaa ttc atg aca gtg tct ggg ctg cca 365 Phe Leu Arg Ala Pro Arg Arg Lys Phe Met Thr Val Ser Gly Leu Pro 60 65 70 aag aag cag tgc ccc tgt gat cat ttc aag ggc aat gtg aag aaa aca 413 Lys Lys Gln Cys Pro Cys Asp His Phe Lys Gly Asn Val Lys Lys Thr 75 80 85 aga cac caa agg cac cac aga aag cca aac aag cat tcc aga gcc tgc 461 Arg His Gln Arg His His Arg Lys Pro Asn Lys His Ser Arg Ala Cys 90 95 100 cag caa ttt ctc aaa caa tgt cag cta aga agc ttt gct ctg cct ttg 509 Gln Gln Phe Leu Lys Gln Cys Gln Leu Arg Ser Phe Ala Leu Pro Leu 105 110 115 tag gagctctgag cgcccactct tccaattaaa cattctcagc caagaagaca 562 gtgagcacac ctaccagaca ctcttcttct cccacctcac tctcccactg tacccacccc 622 taaatcattc cagtgctctc aaaaagcatg tttttcaaga tcattttgtt tgttgctctc 682 tctagtgtct tcttctctcg tcagtcttag cctgtgccct ccccttaccc aggcttaggc 742 ttaattacct gaaagattcc aggaaactgt agcttcctag ctagtgtcat ttaaccttaa 802 atgcaatcag gaaagtagca aacagaagtc aataaatatt tttaaatgtc aaaaaaaaaa 862 aaaaaaaa 870 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Val Leu Ile Ser Ser Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Met Leu 1 5 10 15 Met Ser Met Val Ser Ser Ser Leu Asn Pro Gly Val Ala Arg Gly His 20 25 30 Arg Asp Arg Gly Gln Ala Ser Arg Arg Trp Leu Gln Glu Gly Gly Gln 35 40 45 Glu Cys Glu Cys Lys Asp Trp Phe Leu Arg Ala Pro Arg Arg Lys Phe 50 55 60 Met Thr Val Ser Gly Leu Pro Lys Lys Gln Cys Pro Cys Asp His Phe 65 70 75 80 Lys Gly Asn Val Lys Lys Thr Arg His Gln Arg His His Arg Lys Pro 85 90 95 Asn Lys His Ser Arg Ala Cys Gln Gln Phe Leu Lys Gln Cys Gln Leu 100 105 110 Arg Ser Phe Ala Leu Pro Leu 115 <210> 3 <211> 72 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro 1 5 10 15 Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro 20 25 30 His Cys Ala Asn Thr Cys Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu 35 40 45 Leu Ala Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys 50 55 60 Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser 65 70 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 4 Met Lys Leu Leu Ala Ser Pro Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Met Leu 1 5 10 15 Met Ser Met Val Phe Ser Ser Pro Asn Pro Gly Val Ala Arg Ser His 20 25 30 Gly Asp Gln His Leu Ala Pro Arg Arg Trp Leu Leu Glu Gly Gly Gln 35 40 45 Glu Cys Glu Cys Lys Asp Trp Phe Leu Gln Ala Pro Lys Arg Lys Ala 50 55 60 Thr Ala Val Leu Gly Pro Pro Arg Lys Gln Cys Pro Cys Asp His Val 65 70 75 80 Lys Gly Arg Glu Lys Lys Asn Arg His Gln Lys His His Arg Lys Ser 85 90 95 Gln Arg Pro Ser Arg Ala Cys Gln Gln Phe Leu Lys Arg Cys His Leu 100 105 110 Ala Ser Phe Ala Leu Pro Leu 115 <210> 5 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu Ile Ser 1 5 10 15 Ala Ala Leu Cys Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu 20 25 30 Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe 35 40 45 Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr 50 55 60 Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro 65 70 75 80 Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala 85 90 95 Glu <210> 6 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ser Leu Leu Pro Arg Arg Ala Pro Pro Val Ser Met Arg Leu Leu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Tyr Thr Ala Arg Val 20 25 30 Asp Gly Ser Lys Cys Lys Cys Ser Arg Lys Gly Pro Lys Ile Arg Tyr 35 40 45 Ser Asp Val Lys Lys Leu Glu Met Lys Pro Lys Tyr Pro His Cys Glu 50 55 60 Glu Lys Met Val Ile Ile Thr Thr Lys Ser Val Ser Arg Tyr Arg Gly 65 70 75 80 Gln Glu His Cys Leu His Pro Lys Leu Gln Ser Thr Lys Arg Phe Ile 85 90 95 Lys Trp Tyr Asn Ala Trp Asn Glu Lys Arg Arg Val Tyr Glu Glu 100 105 110 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRO842 sense primer <400> 7 ggccaagaat gtgagtgcaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRO842 antisense primer <400> 8 tgtttggctt tctgtggtgc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HPRT sense primer <400> 9 actttgcttt ccttggtcag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HPRT antisense primer <400> 10 gctttgtatt ttgcttttcc 20

Claims (34)

  1. 서열 번호 1의 PRO842 폴리펩티드에 결합하고, 트랜스웰 이동 검정에서 PRO842 폴리펩티드에 반응한 수지상 세포 및 단핵구의 이동을 억제할 수 있는 항체.
  2. 제1항의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주.
  3. 제1항의 항체를 생산하는 세포주.
  4. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  5. 제1항에 있어서, 인간화된 항체인 항체.
  6. 제1항에 있어서, 키메릭 항체인 항체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 수지상 세포가 미성숙 수지상 세포인 항체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단핵구가 혈액 단핵구인 것인 항체.
  9. 제1항의 항체의, 수지상 제포가 인간 조직으로 이동하는 것을 억제하기 위한 유효량을 포함하는 제약 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 인간 조직이 폐 조직인 제약 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 폐 조직이 폐포 내벽 세포인 제약 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 폐 조직이 세기관지 상피인 제약 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 상기 인간 조직이 질병이 있는 간 조직인 제약 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 질병이 있는 간 조직이 결절 과다형성인 항체.
  15. 제13항에 있어서, 질병이 있는 간 조직이 알콜성 경화증인 항체.
  16. 제9항에 있어서, 상기 인간 조직이 유방암 조직인 항체.
  17. 제9항에 있어서, 상기 인간 조직이 난소 샘암종 조직인 항체.
  18. 제9항에 있어서, 상기 인간 조직이 종양 세포인 항체.
  19. 제9항에 있어서, 상기 인간 조직이 종양성 상피 조직인 항체.
  20. 제9항에 있어서, 상기 인간 조직이 자궁내막 샘암종 조직인 항체.
  21. 포유 동물로부터 간 조직 세포의 시험 샘플을 제공하고, 상기 시험 샘플에서 PRO842 폴리펩티드의 발현 수준을 탐지하고; 상기 시험 샘플에서의 발현 수준을, 알려진 정상 간 조직 세포의 대조군 샘플에서의 PRO842 폴리펩티드 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기서, 상기 샘플과 상기 대조군 사이의 PRO842 폴리펩티드 발현 수준의 차이가 상기 포유 동물에서 간 질환 존재의 지표인 것인, 포유 동물에서 질병이 있는 간의 질환을 진단하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 질병이 있는 간이 결절 과다 형성 또는 경화증인 방법.
  23. 포유 동물로부터 간 조직 세포의 시험 샘플을 제공하고, 상기 간 조직 세포 시험 샘플에서의 PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 발현 수준을, 알려진 동일한 세포 종류의 정상 간 조직의 대조군 샘플에서의 PRO842를 코딩하는 상기 유전자의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 여기서, 상기 시험 샘플에서 상기 유전자의 보다 높은 또는 보다 낮은 발현 수준이 간 질환 존재의 지표인 것인, 포유 동물 에서 질병이 있는 간의 질환을 진단하는 방법.
  24. 포유 동물로부터 간 조직 세포의 시험 샘플을 제공하고, 상기 간 조직 세포의 시험 샘플을 항-PRO842 항체와 접촉시키고, 상기 샘플에서 상기 항체와 PRO842 폴리펩티드 간의 복합체 형성의 존재 또는 부재를 탐지하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 복합체 형성이 상기 포유 동물에서의 간 질환 존재의 지표인 것인, 포유 동물에서 질병이 있는 간의 질환을 진단하는 방법.
  25. 포유 동물로부터 난소 조직 세포의 시험 샘플을 제공하고, 상기 시험 샘플에서 PRO842 폴리펩티드의 발현 수준을 탐지하고; 상기 시험 샘플에서의 발현 수준을, 알려진 정상 난소 조직 세포의 대조군 샘플에서의 PRO842 폴리펩티드 발현 수준과 비교하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 샘플과 상기 대조군 사이의 PRO842 폴리펩티드 발현 수준 차이가 상기 포유 동물에서 난소 종양 존재의 지표인 것인, 포유 동물에서 난소 종양을 진단하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 난소 종양이 샘암종인 방법.
  27. 포유 동물로부터 난소 조직 세포의 시험 샘플을 제공하고, 상기 난소 조직 세포의 시험 샘플에서의 PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을, 알려진 동일한 세포 종류의 정상 난소 조직의 대조군 샘플에서의 PRO842를 코딩하는 상기 유전자의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 시험 샘플에서 상기 유전자의 보다 높은 또는 보다 낮은 수준의 발현이 상기 포유 동물에서 난소 종양 존재의 지표인 것인, 포유 동물에서 난소 종양을 진단하는 방법.
  28. 포유 동물로부터 난소 조직 세포의 시험 샘플을 제공하고, 상기 난소 조직 세포의 시험 샘플을 항-PRO842 항체와 접촉시키고, 상기 샘플에서 상기 항체와 PRO842 폴리펩티드 간의 복합체 형성의 존재 또는 부재를 탐지하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 복합체 형성이 상기 포유 동물에서의 난소 종양 존재의 지표인 것인, 포유 동물에서 난소 종양을 진단하는 방법.
  29. 포유 동물로부터 자궁 조직 세포의 시험 샘플을 제공하고, 상기 시험 샘플에서 PRO842 폴리펩티드의 발현 수준을 탐지하고; 상기 시험 샘플에서의 발현 수준을 알려진 정상 자궁 조직 세포의 대조군 샘플에서의 PRO842 폴리펩티드 발현 수준과 비교하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 샘플과 상기 대조군 사이의 PRO842 폴리펩티드 발현 수준의 차이가 상기 포유 동물에서 자궁 종양 존재의 지표인 것인, 포유 동물에서 자궁 종양을 진단하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 자궁 종양이 자궁내막 샘암종인 방법.
  31. 포유 동물로부터 자궁 조직 세포의 시험 샘플을 제공하고, 상기 자궁 조직 세포의 시험 샘플에서의 PRO842 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을, 알려진 동일한 세포 종류의 정상 난소 조직의 대조군 샘플에서의 PRO842를 코딩하는 상기 유전자의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 시험 샘플에서 상기 유전자의 보다 높은 또는 보다 낮은 수준의 발현이 상기 포유 동물에서 자궁 종양 존재의 지표인 것인, 포유 동물에서 자궁 종양을 진단하는 방법.
  32. 포유 동물로부터 자궁 조직 세포의 시험 샘플을 제공하고, 상기 자궁 조직 세포의 시험 샘플을 항-PRO842 항체와 접촉시키고, 상기 샘플에서 상기 항체와 PRO842 폴리펩티드 간의 복합체 형성의 존재 또는 부재를 탐지하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 복합체 형성이 상기 포유 동물에서의 자궁 종양 존재의 지표인 것인, 포유 동물에서 자궁 종양을 진단하는 방법.
  33. 포유 동물로부터 유방 조직 세포의 시험 샘플을 제공하고, 상기 시험 샘플에서 PRO842 폴리펩티드의 발현 수준을 탐지하고; 상기 시험 샘플에서의 발현 수준을 알려진 정상 유방 조직 세포의 대조군 샘플에서의 PRO842 폴리펩티드 발현 수준과 비교하는 것을 포함하며, 여기서, 상기 샘플과 상기 대조군 사이의 PRO842 폴리펩티드 발현 수준의 차이가 상기 포유 동물에서 유방 종양 존재의 지표인 것인, 포유 동물에서 유방 종양을 진단하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 조직 세포 샘플이 BT474 또는 MCF7 세포인 방법.
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