CN104136037B - 高亲和力SIRP‑α试剂 - Google Patents

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Abstract

提供了高亲和力SIRP‑α试剂，其(i)包含相对于野生型蛋白的至少一个氨基酸变化；和(ii)具有相对于野生型蛋白增加的对CD47的亲和力。提供了组合物和方法，用于通过施用治疗剂量的包含高亲和力SIRPα试剂的药物组合物来调节哺乳动物中的吞噬作用，所述高亲和力SIRPα试剂阻断SIRPα及其配体CD47之间的生理性结合相互作用。

Description

高亲和力SIRP-α试剂
政府权力
本发明是在美国国立卫生研究院资助的合同CA086017、HL058770和CA139490下由政府支持完成的。政府具有本发明的一定权利。
发明背景
细胞更替开始于凋亡程序的诱发或将它们标记以去除的其他细胞变化，以及随后标志物被包括巨噬细胞、树突细胞等的吞噬细胞识别。该过程需要特异性和选择性的去除不想要的细胞。辨别健康细胞与不想要的/衰老的/濒死的细胞，不想要的/衰老的/濒死的细胞展示称为“吃我”信号、即“改变自我”的标志物或配体，其转而可以被吞噬细胞上的受体识别。健康细胞可以展示积极抑制吞噬作用的“不要吃我”信号；这些信号在濒死细胞中被下调或者以改变的构象存在。健康细胞上细胞表面蛋白CD47及其与吞噬细胞受体SIRPα的接合构成了关键的“不要吃我”信号，其可以避开多种形式介导的吞没，包括凋亡细胞清除和FcR介导的吞噬。阻断吞噬细胞上SIRPα的CD47介导的接合，或者敲除小鼠中CD47表达的缺失，可以引起活细胞和非衰老红细胞的去除。或者，阻断SIRPα识别还允许吞没正常不被吞噬的靶标。
CD47是具有单Ig样结构域和5个跨膜区的广泛表达的跨膜糖蛋白，其作为SIRPα的细胞配体发挥作用，其中结合通过SIRPα的NH2末端V样结构域介导。SIRPα主要在髓样细胞上表达，髓样细胞包括巨噬细胞、粒细胞、髓样树突细胞(DC)、肥大细胞及其前体，包括 造血干细胞。SIRPα上介导CD47结合的结构决定子由Lee等人(2007)J.Immunol.179：7741-7750讨论；Hatherley等人(2007)J.B.C.282：14567-75；并且SIRPα顺二聚化在CD47结合中的作用由Lee等人(2010)J.B.C.285：37953-63讨论。
与CD47抑制正常的细胞吞噬的作用相一致，有证据表明：它在其迁移阶段之前和过程中在造血干细胞(HSC)和祖细胞上瞬时上调，并且这些细胞上的CD47水平决定了它们被体内吞没的可能性。CD47还在许多癌症上组成型上调。肿瘤细胞过表达CD47可以通过允许细胞逃过吞噬而增加致病性。
发明概述
提供了高亲和力SIRPα多肽及其类似物，其在本文被称为高亲和力SIRPα试剂。该试剂是天然人SIRPα蛋白的序列变体，并且具有用于阻断天然SIRPα蛋白及其受体CD47之间相互作用的体内和体外方法的效用。提供增加的亲和力的氨基酸变化定位于d1结构域，并且因此本发明的高亲和力SIRPα试剂包含人SIRPα的d1结构域，相对于d1结构域内的野生型序列具有至少一个氨基酸变化。这种高亲和力SIRPα试剂任选包含其他氨基酸序列，例如抗体Fc序列；野生型人SIRPα蛋白的不同于d1结构域的部分，包括但不限于天然蛋白的残基150至374或其片段，通常是在d1结构域内连续的片段；等。高亲和力SIRPα试剂可以是单体或多聚体的，即，二聚体、三聚体、四聚体等。
在一个实施方案中，本发明提供了可溶性高亲和力SIRPα试剂，其缺少SIRPα跨膜结构域，并且包含在d1结构域内相对于野生型人SIRPα的至少一个氨基酸变化，所述氨基酸变化增加了SIRPα多肽与CD47的结合亲和力。该高亲和力SIRPα多肽可以例如通过糖基化、聚乙二醇化等而被翻译后修饰。在一些实施方案中，高亲和力SIRPα试剂是包含Fc结构域的融合蛋白。
本发明还包括与药学可接受的赋形剂组合的高亲和力SIRPα试剂的药物制剂。这种制剂可以提供为单位剂量，例如，有效增加个体中靶向吞噬的剂量。药物制剂还包括高亲和力SIRPα试剂的冻干或其他制品，其可以复水以供使用。
在一些实施方案中，提供了操纵例如巨噬细胞或其他哺乳动物吞噬细胞对细胞的靶向吞噬的方法。在这类方法中，表达CD47的细胞与有效阻断内源性SIRPα和CD47之间相互作用的剂量的本发明高亲和力SIRPα试剂接触。阻断该相互作用允许吞没正常不被吞噬的靶。该接触可以例如为治疗目的而在体内进行，以及例如为了筛选测定等而在体外进行。为了这些目的的高亲和力SIRPα试剂可以是多聚体的；或者是单体的。单体试剂特别用于与选择性结合被靶向吞噬的细胞的抗体组合施用。
在相关实施方案中，通过使肿瘤细胞与有效阻断或掩蔽细胞表面上的CD47的剂量的高亲和力SIRPα多肽接触，允许吞没正常不被吞噬的靶，来靶向吞噬肿瘤细胞，例如实体瘤，例如癌、肉瘤、黑素瘤等；白血病；淋巴瘤等。将有效剂量的高亲和力SIRPα多肽施用给患者预防CD47和SIRPα之间的相互作用，这增加了肿瘤细胞经由吞噬的清除。为这些目的，在与被靶向吞噬的细胞结合的免疫球蛋白Fc存在下施用高亲和力SIRPα变体可能是有利的，其提供了亲吞噬信号(pro-phagocytic signal)。在这些方面，高亲和力SIRPα多肽可以与针对一种或多种其他肿瘤细胞标志物的单克隆抗体组合，该组合物与使用单一药剂相比可以协同增强肿瘤细胞的吞噬和消除。对于该目的而言，单体高亲和力SIRPα试剂是有利的，因为它们具有低的红细胞毒性。或者，可以施用包含免疫球蛋白Fc区，例如提供亲吞噬信号的免疫球蛋白Fc区的SIRPα融合构建体。
在其他实施方案中，高亲和力SIRPα试剂包含可检测标记。这种标记的试剂可用于在体外或体内的成像目的，例如肿瘤的成像。
附图简述
图1A-1E.高亲和力SIRPα变体的定向进化。A.CD47被可溶性高亲和力SIRPα阻断的示意图。(左)在基础状态下，癌细胞上的CD47表达激活巨噬细胞上的SIRPα，从而引发了经由SHP 1和2酪氨酸磷酸酶的抑制级联并防止癌细胞吞噬。(右)可溶性的高亲和力SIRPα蛋白竞争性拮抗CD47并防止与巨噬细胞上的SIRPα接合，从而抑制吞噬。B.SIRPαV组Ig结构域(结构域1，d1)的酵母表面展示的示意图。酵母克隆(灰色细胞)给出SIRPα的不同变体(着色的拐点)。插图指示SIRPα通过与Aga2融合而连接至酵母细胞表面并用生物素化的CD47选择。C.工程化的SIRPα变体的序列和SPR亲和力测量的概要。在表头指示野生型等位基因1中突变残基的位置及其相应序列。红色文本颜色指示共有序列突变，而蓝色阴影指示共有序列中的接触残基。野生型SIRPα和结合固定化CD47的高亲和力变体FD6的代表性SPR传感器图在右侧显示。RU＝响应单位。D.FD6：CD47复合物的晶体结构被描绘为含有FD6(橙色)和CD47(蓝色)的带状物的透明表面。E.野生型(深红色)和高亲和力(绿色)SIRPα：CD47复合物的叠影。插图显示SIRPαC’D环中的突变接触残基(棒状物)和CD47的结合界面(顶部，空间填充；底部，棒状物)。
图2A-2H.高亲和力SIRPα变体在体外阻断CD47并刺激吞噬。A.野生型SIRPα等位基因1(WTa1，粉色)、抗CD47克隆B6H12 Fab片段(橙色)或两个高亲和力SIRPα变体(FD6，CV1，绿色)对Raji淋巴瘤细胞上CD47拮抗作用的剂量-响应曲线。用与100nM Alexa Fluor 647-缀合的WT SIRPα四聚体竞争的滴定浓度的CD47阻断剂染色的细胞。B.使用具有媒介物对照(PBS)或与人IgG4融合的高亲和力SIRPα变体(CV1-hIgG4)的CFSE标记的Raji淋巴瘤细胞和RFP+巨噬细胞进行的吞噬测定的代表性图像。插图显示已经摄取多个癌细胞的噬菌体。比例尺＝50μm。C.显示通过流式细胞术分析的吞噬测定的代表性图。人巨噬细胞与GFP+DLD-1细胞和指示的治疗共培养。使用门将GFP+巨噬细胞(红色)评价为总巨噬细胞群体 (蓝色)的百分比。D.如通过流式细胞术评估的供体衍生的人巨噬细胞对GFP+肿瘤细胞的吞噬。所有蛋白治疗以100nM使用。GFP+巨噬细胞的百分比被标准化为每个供体针对每个细胞系的最大响应。E.具有不同浓度的SIRPα-Fc变体或同种型匹配的抗CD47抗体(克隆B6H12)的GFP+DLD-1细胞的吞噬。F.具有非特异性同种型对照(mIgG1)、非阻断性抗CD47(2D3)或抗EpCam抗体的GFP+DLD-1细胞的吞噬。所有抗体以20μg/mL使用。WT SIRPα或高亲和力SIRPα变体FD6单体以1μM使用并如所示组合。G.使用单独(红色)或与WT SIRPα单体(粉色)或高亲和力SIRPα单体(绿色)组合的不同浓度的西妥昔单抗(cetuximab)(抗EGFR)的GFP+DLD-1细胞的吞噬。所有SIRPα变体以100nM使用。H.具有单独(红色)或在WT SIRPα单体(粉色)或高亲和力SIRPα单体(绿色)存在下的不同浓度的利妥昔单抗(rituximab)(抗CD20)的GFP+Raji细胞的吞噬。所有SIRPα变体以100nM使用。D-H所有人巨噬细胞吞噬测定使用衍生自最少三个独立血液供体的巨噬细胞进行。误差条指示标准偏差。ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，相对于WT SIRPα变体(d，g，h)，相对于B6H12-hIgG4(e)，或者另外指示。
图3A-3H.高亲和力SIRPα-Fc融合蛋白作为针对癌症的单剂是有效的。A.植入腹腔、在外周肠袢中形成散布的肿瘤结节的GFP-荧光素酶+DLD-1细胞的代表性图像。B.植入了GFP-荧光素酶+DLD-1细胞的小鼠在用媒介物对照(PBS，红色)或高亲和力SIRPα-hIgG4融合蛋白(CV1-hIgG4，蓝色)治疗之后的存活。C.与来自b中受治疗动物的全血细胞表面结合的人Fc的代表性分析。D.b中受治疗动物的血液分析，显示每队四只动物随时间的平均值和标准偏差。虚线显示正常值的下限。E.NSG小鼠的背皮下组织中GFP-荧光素酶+639-V膀胱癌细胞在用所示疗法治疗之后的生长，如通过生物发光成像所评价的。条描绘中值，点显示来自个体小鼠的值。F.来自每个治疗组的639-V植入小鼠在植入后第37天的代表性生物发光图像。G.639-V植入小鼠在植入后第38天的肿瘤体积。条描绘中值， 点显示来自个体小鼠的值。H.植入有GFP-荧光素酶+639-V细胞的小鼠的存活。A-H.黑色箭头标记每日治疗的开始和停止。对于媒介物对照治疗相对于CV1-hIgG4，ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图4A-4F.高亲和力SIRPα单体在体内增强了单克隆抗体的效力。A.GFP-荧光素酶+Raji淋巴瘤肿瘤在用PBS(红色)、CV1单体(橙色)、利妥昔单抗(绿色)或利妥昔单抗加CV1单体(蓝色)每日治疗之后的生长，如通过生物发光成像所评价的。条指示中值，点指示来自个体小鼠的值。B.小鼠在植入后第29天的代表性生物发光图像。红色圆圈指示原发性肿瘤的部位，红色箭头指示转移至腋窝淋巴结的部位。C.来自A的小鼠的平均肿瘤体积测量。误差条描绘标准偏差。D.来自A的带有淋巴瘤的小鼠的存活。E.GFP-荧光素酶+Raji淋巴瘤肿瘤在用PBS(红色)、CV1单体(橙色)、阿伦单抗(alemtuzumab)(绿色)或阿伦单抗加CV1单体(蓝色)每两周治疗之后的生长，如通过肿瘤体积测量所评价的。条指示中值，点指示来自个体小鼠的值。F.来自E的带有淋巴瘤的小鼠的存活。A-F黑色箭头指示治疗的开始和停止。对于所有组相对于利妥昔单抗+CV1单体，或者单独阿伦单抗相对于阿伦单抗+CV1单体，ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图5A-5B.来自第一代选择的文库设计和序列。A.左：具有可能的氨基酸变体的‘接触残基’文库的随机位置以及所述随机位置在SIRPα内定位的表格。右：非接触‘核心残基’文库的随机位置的定位和描述。SIRPα以绿色描绘，CD47以深红色描绘，并且随机位置表示为空间填充侧链。B.在第一代选择之后获得的SIRPα变体的序列的汇总。在表头指示野生型等位基因1中突变残基的位置及其相应序列。蓝色阴影指示SIRPα：CD47界面发生的‘接触’突变。斜体指示在汇集文库中没有随机化的位置处的突变(Glu47和His56)。
图6.第二代选择的文库设计。第二代文库的随机位置和可能氨 基酸以及SIRPα结构内可变残基位置的表格。SIRPα以绿色描绘，CD47以深红色描绘，并且随机位置表示为空间填充侧链。
图7.FD6：CD47复合物的代表性电子密度图。以2.0σ画轮廓的2mFo-DFc电子密度图。模拟的氨基酸残基被描绘为棒状物，其中FD6残基为黄色并且CD47残基为绿色。CD47的焦谷氨酸残基1被指示为在相应残基和密度上方的PCA1。
图8A-8C.高亲和力SIRPα变体有效结合并阻断癌细胞上的CD47。A.结合至Jurkat白血病细胞的野生型SIRPα等位基因1单体(WTa1单体，粉色)、野生型SIRPα等位基因1四聚体(WTa1四聚体，栗色)或高亲和力SIRPα变体(FD6，FA4，绿色)的滴定曲线。误差条指示标准偏差。B.针对Jurkat细胞的CD47阻断测定。添加CD47拮抗剂，与Alexa Fluor647缀合的野生型SIRPα四聚体竞争。用作为单体的第一代SIRPα突变体(1A5单体，蓝绿色)、作为单体的第二代SIRPα突变体(FD6单体，绿色)、作为与人IgG4的Fc融合体的第二代SIRPα突变体(FD6-hIgG4，蓝色)和抗CD47克隆B6H12(橙色)测试阻断。误差条指示标准偏差。C.野生型SIRPα-Fc蛋白(WTa1-hIgG4，粉色；WTa2-hIgG4，紫色)、高亲和力SIRPα-Fc蛋白(FD-hIgG4，CV1-hIgG4，绿色)和抗CD47抗体克隆B6H12(B6H12-hIgG4，橙色)与DLD-1结肠癌细胞的结合。
图9.高亲和力SIRPα-Fc变体在体内限制DLD-1结肠癌细胞的生长。如通过治疗小鼠的腹腔的生物发光成像测量的，用媒介物(PBS，红色)或高亲和力SIRPα-hIgG4融合蛋白(CV1-hIgG4，蓝色)治疗之后的肿瘤生长曲线。点指示来自个体小鼠的值，线描绘中值。**p<0.01，通过Bonferroni事后检验的2因素ANOVA。
图10A-10D.用高亲和力SIRPα-Fc变体治疗引起巨噬细胞侵润并影响红细胞指数。A.来自CV1-hIgG4治疗小鼠的解剖的可触及皮下组织块。左＝白光，右＝GFP荧光。虚线椭圆形围绕两个表浅肿瘤 结节，星号标记巨噬细胞富集的基质侵润物。比例尺＝5mm。B.来自CV1-hIgG4治疗小鼠的可触及皮下组织块的苏木精和伊红染色，证明侵润巨噬细胞的存在。肿瘤结节在图像左上方可见，围绕它有炎性侵润物。插图显示虚线框轮廓区域中的代表性巨噬细胞。C.在来自CV1-hIgG4治疗小鼠的可触及皮下组织块中小鼠巨噬细胞标志物F4/80的免疫组织化学染色。肿瘤结节在图像右部分可见，在左侧有染色的侵润巨噬细胞。插图显示虚线框轮廓区域中的代表性巨噬细胞，具有在肿瘤细胞吞噬(黑色箭头)和成功吞没(红色箭头)过程中巨噬细胞的证据。D.携带GFP-荧光素酶+639-V膀胱肿瘤的小鼠在吞没后第34天的血液分析。CV1-hIgG4治疗导致红细胞指数的适度降低(黄色)。没有观察到对其他血谱系的毒性。
图11A-11C.用高亲和力SIRPα单体治疗没有引起红细胞毒性。A.在用所示疗法治疗期间来自小鼠的血细胞比容测量。B.在用所示疗法治疗期间来自小鼠的血红蛋白水平。C.在用所示疗法治疗期间来自小鼠的绝对红细胞计数。A-C.ns＝不显著。黑色箭头指示每日治疗的开始和停止。
图12.高亲和力SIRPα变体在非人灵长类动物中表现出安全性。食蟹猴用单次静脉注射的高亲和力SIRPα-Fc(FD6-hIgG4，红色)或一系列剂量递增的高亲和力SIRPα单体(FD6单体，蓝色)治疗。虚线描绘用上面以mg/kg计的剂量治疗的天数。观察到对红细胞的中等毒性，在用FD6-hIgG4治疗后血细胞比容下降，并且用FD6单体疗法没有观察到红细胞损失。没有观察到对其他器官系统的毒性。
图13A-13C.放射性标记的高亲和力SIRPα变体作为癌症的无创成像剂是有效的。A.NSG小鼠在右上侧腹皮下植入DLD-1人结肠癌细胞。用Cu-64标记的FD6单体注射携带肿瘤的小鼠并通过PET扫描成像。红色箭头指示肿瘤的摄取，黑色箭头指示肾脏的摄取。上图显示背部图像，并且下图显示通过肿瘤的横截面。M2、M3代表来自两只独立动物的图像。B.来自动物的信号随时间的定量。FD6在肿 瘤中持续至少24小时。C.显示肿瘤和正常组织中放射性标记的FD6的存在的表格。T：N＝肿瘤与所示组织中摄取比率。ID/g＝每克组织注射的剂量。
图14A-14F.巨噬细胞的荧光激活的细胞分选证明高亲和力SIRPα变体诱导癌细胞的吞噬。A.主要的人巨噬细胞和GFP+DLD-1结肠癌细胞在100nM CV1-hIgG4存在下共培养。吞噬被定量为变成GFP+的CD45+巨噬细胞的百分比。通过流式细胞术分选巨噬细胞群中GFP阴性(蓝色)、GFP低(红色)或GFP高(绿色)的那些。B.分选的GFP高巨噬细胞含有植入的肿瘤细胞，如通过显微镜在亮视野透射光(上图)和荧光(下图；红色＝CD45，绿色＝GFP)下看到的。C.DLD-1结肠癌细胞的Wright-Giemsa染色。D.分选的缺少植入材料的GFP阴性巨噬细胞群的Wright-Giemsa染色。E.分选的植入材料富集的GFP低巨噬细胞群的Wright-Giemsa染色。F.分选的含有植入的肿瘤细胞的GFP高巨噬细胞群的Wright-Giemsa染色。B-F比例尺代表100μm。
图15.高亲和力SIRPα变体与曲妥珠单抗(trastuzumab)协同针对Her2+乳腺癌。讲主要的人巨噬细胞与GFP+SK-BR-3乳腺癌细胞和所示疗法共培养。通过流式细胞术评价吞噬。向曲妥珠单抗添加高亲和力SIRPα单体FD6或CV1增强了吞噬。相对于对照治疗或与曲妥珠单抗组合的野生型SIRPα治疗，ns＝不显著，***p<0.001，****p<0.0001。
图16A-D：高亲和力SIRPα变体在肿瘤结合的抗体Fc链存在下诱导最大效力。A显示高亲和力SIRPα变体的示意图。B.分析凝胶过滤，显示高亲和力SIRPα-Fc融合蛋白被纯化为单一物类(洗脱体积＝13.44)，具有有限的聚集。C.使用RFP+小鼠巨噬细胞和GFP+人淋巴瘤Raji细胞的吞噬测定。用高亲和力SIRPα变体CV1单体或抗CD47 Fab片段的CD47阻断产生了吞噬的边际增加，而用高亲和力SIRPα-Fc或完整抗CD47抗体的治疗产生了提高的吞噬。D.CD47 的寡聚没有诱导吞噬。用主要人巨噬细胞和GFP+DLD-1人结肠癌细胞进行吞噬测定。用缺少亲吞噬刺激的高亲和力SIRPα二聚体的治疗没有诱导明显水平的吞噬。
图17A-17D：高亲和力SIRPα变体结合并阻断其他哺乳动物CD47直系物。A.高亲和力SIRPα变体FD6而非野生型等位基因1人SIRPα与小鼠CT26结肠癌细胞的结合。B.高亲和力SIRPα变体FD6-Fc阻断野生型小鼠SIRPα四聚体与酵母表面上展示的小鼠CD47的结合。C.高亲和力SIRPα变体CV1结合酵母表面上展示的小鼠CD47。D.100nM野生型等位基因2 SIRPα-Fc、高亲和力SIRPα-Fc或抗CD47抗体(克隆B6H12和5F9)与犬MDCK细胞的结合，如通过使用抗人IgG二抗的流式细胞术所检测。
定义
在以下描述中，利用了常规用于细胞培养领域的许多术语。为了提供对说明书和权利要求书以及给予这些术语的范围的清楚且一致的理解，提供了以下定义。
术语SIRPα与其配体CD47之间相互作用的“抑制剂”、“阻断剂”和“掩蔽剂”指防止SIRPα和CD47结合的分子。出于开发目的，结合可以在实验条件下进行，例如使用分离的蛋白质作为结合配偶体，使用蛋白质的部分作为结合配偶体，使用蛋白质或蛋白质部分的酵母展示作为结合配偶体，等。
出于生理相关目的，SIRPα与CD47的结合通常是两个细胞之间的事件，其中每个细胞表达结合配偶体之一。特别感兴趣的是SIRPα在吞噬细胞，例如巨噬细胞上的表达；以及CD47在可以是吞噬的靶标例如肿瘤细胞、循环造血细胞等上的表达。可以使用受体或配体结合或信号传导的体外和体内测定来鉴定抑制剂。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用来指氨基酸 残基的聚合物。这些术语还应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有不同于氨基酸的一般化学结构但是以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用的结构的化合物。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可互换使用指被评估治疗和/或被治疗的哺乳动物。在一个实施方案中，哺乳动物是人。术语“受试者”、“个体”和“患者”涵盖但不限于患有癌症的个体。受试者可以是人，但还包括其他哺乳动物，特别是用作人疾病的实验室模型的那些哺乳动物，例如小鼠、大鼠等。
术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”在本文可互换使用，指表现出自主上调生长的细胞，使得它们表现出特征为对细胞增殖的控制明显损失的异常生长表型。在本申请中用于检测、分析或治疗的感兴趣的细胞包括癌前期(例如，良性)、恶性、转移前、转移和非转移的细胞。几乎每一个组织的癌症是已知的。短语“癌症负荷”指受试者中癌细胞或癌体积的量。减少癌症负荷相应地指减少受试者中癌细胞数目或癌体积。如本文使用的，术语“癌细胞”指是癌细胞或者衍生自癌细胞的任何细胞，例如癌细胞的克隆。本领域技术人员已知许多类型的癌症，包括实体瘤，例如癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、黑素瘤、淋巴瘤、骨髓瘤等，以及循环癌症例如白血病。癌症的实例包括但不 限于卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、甲状腺癌、肾癌、癌、黑素瘤、头颈癌和脑癌。
癌症的“病理学”包括有损患者健康的所有现象。这包括但不限于异常或不受控制的细胞生长、转移、干扰相邻细胞的正常功能、释放异常水平的细胞因子或其他分泌产物、抑制或加剧炎性或免疫反应、瘤形成、恶性肿瘤前期、恶性肿瘤、入侵周围或远端组织或器官例如淋巴结等。
如本文使用的，术语“癌症复发”和“肿瘤复发”及其语法变型指癌症诊断之后瘤或癌细胞的进一步生长。具体地，复发可以在癌组织中发生进一步的癌细胞生长时发生。类似地，“肿瘤扩散”在肿瘤细胞散播进入局部或远端组织和器官时发生；因此，肿瘤扩散包括肿瘤转移。“肿瘤入侵”在肿瘤生长局部向外扩散以通过压制、破坏或防止正常器官功能而损害所涉组织功能时发生。
如本文使用的，术语“转移”指癌肿瘤在不与原始癌肿瘤的器官直接连接的器官或身体部分中生长。要理解，转移包括微小转移，微小转移是不可检测量的癌细胞在不与原始癌肿瘤的器官直接连接的器官或身体部分中的存在。转移还可以被定义为一个过程的几个步骤，例如癌细胞从原始肿瘤部位脱离以及癌细胞迁移和/或入侵至身体其他部分。
关于患者的术语“样品”涵盖生物来源的血液和其他液体样品，固体组织样品例如活检样本或从其衍生的组织培养物或细胞及其后代。该定义还包括在其获得之后经任何方式操作过的样品，例如通过用试剂处理；洗涤；或富集某些细胞群，例如癌细胞。该定义还包括已经富集了特定类型分子例如核酸、多肽等的样品。术语“生物样品”涵盖临床样品，并且还包括通过外科手术切除获得的组织、通过活检获得的组织、培养的细胞、细胞上清液、细胞裂解液、组织样品、器 官、骨髓、血液、血浆、血清等。“生物样品”包括获自患者癌细胞的样品，例如包括获自患者癌细胞(例如，包含多核苷酸和/或多肽的细胞裂解液或其他细胞提取物)的多核苷酸和/或多肽的样品；和包括来自患者的癌细胞的样品。包括来自患者的癌细胞的生物样品还可以包括非癌细胞。
术语“诊断”在本文用来指鉴定分子或病理状态、疾病或病症，例如鉴定乳腺癌、前列腺癌或其他类型癌症的分子亚型。
术语“预后”在本文用来指预测癌症导致的死亡或进展的可能性，包括瘤疾病例如卵巢癌的复发、转移性扩散和药物抗性。术语“预测”在本文用来指基于观察、经验或科学推理的预言或估计的行为。在一个实例中，医师可以预测患者在手术去除原发性肿瘤和/或化疗一段时间而没有癌症复发之后将存活的可能性。
如本文使用的，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等指出于获得效果的目的而施用一种药剂或者进行一个程序。效果可以是在完全或部分预防疾病或其症状方面是预防性的，和/或可以是在实现疾病和/或疾病症状的部分或完全治愈方面是治疗性的。如本文使用的，“治疗”可以包括哺乳动物、特别是人中肿瘤的治疗，并且包括：(a)防止疾病或疾病症状在可能易感该疾病但是还没有诊断患有该疾病的受试者中发生(例如，包括可能与原发性疾病相关或由其引起的疾病)；(b)抑制疾病，即，停止其发展；和(c)缓解疾病，即，使疾病退行。
治疗可以指在癌症的治疗或缓解或预防中任何成功的标记，包括任何客观或主观的参数，例如消除；减轻；减少症状或使患者更耐受疾病状态；减缓退化或衰退速率；或使退化终点更衰弱。症状的治疗或缓解可以基于客观或主观参数；包括医师检查结果。因此，术语“治疗”包括施用本发明的化合物或药剂以预防或延迟、缓解、或停止或抑制与癌症或其他疾病相关的症状或病症的发展。术语“治疗效果” 指受试者中疾病、疾病症状或疾病副作用的减轻、消除或预防。
“与…组合”、“组合疗法”和“组合产品”在某些实施方案中指给患者同时施用第一治疗剂和本文使用的化合物。当组合施用时，每种组分可以同时或以任何顺序在不同时间点依次施用。因此，每种组分可以分开但在时间上足够接近地施用以提供想要的治疗效果。
在一些实施方案中，通过施用本发明的高亲和力SIRPα试剂与细胞毒剂的组合来实现治疗。一个示例性的细胞毒剂种类是化疗剂。示例性的化疗剂包括但不限于阿地白介素、六甲蜜胺、阿米斯丁(amifostine)、天冬酰胺、博来霉素、卡培他滨(capecitabine)、卡铂、卡莫司汀(carmustine)、克拉屈滨(cladribine)、西沙必利(cisapride)、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪(DTIC)、放线菌素D、多西他赛(docetaxel)、阿霉素、屈大麻酚(dronabinol)、倍癌霉素(duocarmycin)、依托泊苷(etoposide)、非格司亭(filgrastim)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、格拉司琼(granisetron)、羟基脲、去甲氧正定霉素、异环磷酰胺、干扰素α、伊立替康(irinotecan)、兰索拉唑(lansoprazole)、左旋咪唑、甲酰四氢叶酸、甲地孕酮、美司钠(mesna)、甲氨喋呤、甲氧氯普胺(metoclopramide)、丝裂霉素、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、奥美拉唑、奥坦西隆(ondansetron)、紫杉醇(TaxolTM)、毛果芸香碱(pilocarpine)、丙氯拉嗪(prochloroperazine)、利妥昔单抗(rituximab)、saproin、泰莫西芬(tamoxifen)、紫杉酚、盐酸拓扑替康、曲妥珠单抗、长春花碱、长春新碱和酒石酸长春瑞滨。
在其他实施方案中，本发明的高亲和力SIRPα试剂的施用与有效剂量的增加患者血细胞比容的药剂、例如促红细胞生成素刺激剂(ESA)组合。这种药剂是本领域已知并使用的，包括例如(阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa))、(阿法依泊汀)、(peginesatide)、等。
其他组合疗法包括与细胞特异性抗体例如对肿瘤细胞标志物选择性的抗体、放射、手术和/或激素剥夺一起的施用(Kwon等人，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，96：15074-9，1999)。血管生成抑制剂还可以与本发明方法组合。
许多抗体目前临床用于治疗癌症，并且其他抗体处于不同的临床开发阶段。例如，有许多抗原和相应的单克隆抗体用于治疗B细胞恶性肿瘤。一个靶抗原是CD20。利妥昔单抗是针对CD20抗原的化学非缀合的单克隆抗体。CD20在B细胞活化、增殖和分化中具有重要的功能作用。CD52抗原被单克隆抗体阿伦单抗靶向，阿伦单抗指示用于治疗慢性淋巴细胞性白血病。CD22被许多抗体靶向，并且最近证明了在化疗抗性毛细胞性白血病中与毒素组合的效力。靶向CD20的两个新的单克隆抗体托西莫单抗(tositumomab)和替伊莫单抗(ibritumomab)已经提交给美国食品药品监督管理局(FDA)。这些抗体与放射性核素缀合。阿伦单抗(Campath)用于治疗慢性淋巴细胞性白血病；吉妥珠单抗(Mylotarg)用于治疗急性骨髓性白血病；替伊莫单抗(Zevalin)用于治疗非霍奇金淋巴瘤；帕尼单抗(panitumumab)(Vectibix)用于治疗结肠癌。
已经用于实体瘤的用于本发明方法的单克隆抗体包括但不限于依决洛单抗(edrecolomab)和曲妥珠单抗(赫赛汀(herceptin))。依决洛单抗靶向结肠和直肠癌中发现的17-1A抗原，并且已经在欧洲被批准用于这些适应症。曲妥珠单抗靶向HER-2/neu抗原。该抗原见于25％至35％的乳腺癌。西妥昔单抗(Erbitux)也有兴趣用于本发明方法。该抗体结合EGF受体(EGFR)，并且已经用于治疗实体瘤，包括结肠癌和头颈的鳞状细胞癌(SCCHN)。
除了癌症疗法，本发明的SIRPα试剂用于其他疗法，其中出于清除细胞的目的而施用单克隆抗体，例如，通过清除免疫细胞来治疗炎性疾病。出于此类目的，本发明的SIRPa试剂与例如以下治疗性抗体组合施用：利妥昔单抗，以清除炎性疾病和自身免疫病症中的B细胞；阿伦单抗，针对多发性硬化；OKT3，用于免疫抑制；用于骨髓移植物调理的其他治疗性抗体；等。
癌症治疗药物、ESA或肿瘤定向抗体与本发明药物组合物的“同时施用”表示在药物、ESA或抗体和本发明组合物都将具有治疗作用的时间与高亲和力SIRPα试剂的施用。这种同时施用可以包括共时(即，在相同时间)，相对于本发明化合物施用之前或之后施用药物、ESA或抗体。本领域普通技术人员将容易确定施用特定药物和本发明组合物的适当时机、顺序和剂量。
如本文使用的，短语“无疾病存活”指相对于癌症对患者寿命的影响而言，没有这种肿瘤复发和/或扩散以及患者诊断后的命运。短语“总体存活”指患者诊断后的命运，不考虑患者死因不直接归因于癌症作用的可能性。短语“无疾病存活的可能性”、“复发风险”及其变型指患者在癌症诊断之后肿瘤复发或扩散的概率，其中所述概率根据本发明方法确定。
如本文使用的，术语“相关”或“与…相关”和类似术语指两个事件的实例之间的统计关联，其中事件包括数字、数据集等。例如，当事件包括数字时，正相关(在本文还称为“直接相关”)表示当一个增加时，另一个也增加。负相关(在本文还称为“反相关”)表示当一个增加时，另一个减少。
“剂量单位”指适合作为特定的待治疗个体的单元剂量的物理上离散的单位。每个单位可以含有与要求的药物载体结合的、经计算产生所需治疗作用的预定量的活性化合物。单位剂量形式的规格可以取决于(a)活性化合物的独特特点和要实现的特定治疗作用，和(b)调剂这种活性化合物的技术中固有的限制。
“药学上可接受的赋形剂：表示可用于制备药物组合物的赋形剂，其一般是安全、无毒且令人满意的，并且包括兽医用途以及人类药物用途可接受的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体或 者在气溶胶组合物情况下为气体。
“药学可接受的盐和酯”表示药学上可接受的并且具有想要的药理性质的盐和酯。此类盐包括可以形成的盐，其中化合物中存在的酸性质子能够与无机碱或有机碱反应。适合的无机盐包括与碱金属形成的那些，所述碱金属例如钠和钾、镁、钙和铝。适合的有机盐包括与有机碱形成的那些，所述有机碱例如胺碱，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N甲基葡萄糖胺等。此类盐还包括与无机酸(例如，盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如，乙酸、柠檬酸、马来酸和烷烃和芳烃磺酸，例如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学可接受的酯包括从化合物中存在的羧基、磺酰氧基和膦酰氧基形成的酯，例如C1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时，药学可接受的盐或酯可以是单酸单盐或酯、或二盐或酯；并且类似地，当存在超过两个酸性基团时，此类基团的一些或全部可以盐化或酯化。本发明中命名的化合物可以未盐化或未酯化的形式存在，或者以盐化和/或酯化的形式存在，并且此类化合物的命名预期包括原始(未盐化和未酯化的)化合物及其药学可接受的盐和酯。而且，本发明中命名的某些化合物可以超过一种立体异构体形式存在，并且此类化合物的命名预期包括所有单一立体异构体和此类立体异构体的所有混合物(无论是外消旋的还是其他形式的)。
术语“药学可接受的”、“生理耐受的”及其语法变型在它们指组合物、载体、稀释剂和试剂时可互换使用，并且代表能够施用给人而不产生会禁止组合物施用的程度的不希望的生理作用的材料。
“治疗有效量”表示当施用给受试者以治疗疾病时足以实现对该疾病的治疗的量。
实施方案的详述
提供了高亲和力SIRPα多肽及其类似物，其一般可以被称为高亲和力SIRPα试剂。所述试剂是天然人SIRPα蛋白的变体。在一个实 施方案中，本发明提供了可溶性SIRPα变体多肽，其中所述多肽缺少SIRPα跨膜结构域并且包括相对于野生型SIRPα序列的至少一个氨基酸变化，并且其中所述氨基酸变化例如通过使解离速率降低至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或更多而增加SIRPα多肽结合CD47的亲和力。
根据本发明，氨基酸变化包括本领域已知或后来发现的任何天然存在或人为的氨基酸修饰。在一些实施方案中，氨基酸变化包括例如一个或多个氨基酸的取代、缺失、添加、插入等。在一些实施方案中，氨基酸变化包括用另一氨基酸替代现有的氨基酸。在相关实施方案中，氨基酸变化包括用非天然氨基酸一个或多个现有的氨基酸，或者插入一个或多个非天然氨基酸。氨基酸变化可以在相对于天然序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多氨基酸残基处进行。一个或多个氨基酸变化改变SIRPα的性质，例如影响稳定性、结合活性和/或特异性等。
本发明的高亲和力SIRPα试剂包括在SIRPα的d1结构域内的至少一个氨基酸修饰，所述结构域如SEQ ID NO：1所示，并且对应于天然人全长人蛋白质的残基31至149。高亲和力SIRPα试剂可以由d1结构域的全部或一部分组成；并且可以进一步包括来自SIRPα的d1结构域之外的一个或多个氨基酸；或者可以包括不同于SIRPα的氨基酸序列，其包括但不限于免疫球蛋白Fc区序列。
高亲和力SIRPα多肽的长度可以是至少约100个氨基酸，长度至少约110、至少约120、至少约150、至少约200个氨基酸，在跨膜结构域达野生型蛋白质的全长，即长度约343个氨基酸，并且任选与异源多肽、例如免疫球蛋白Fc融合。
在其他实施方案中，使用在d1结构域内并且包含本文提出的至少一个氨基酸变化的短肽，其中这种肽通常包含来自本文提出的序列的一串连续氨基酸，长度不超过10个氨基酸，长度不超过15个氨基酸，不超过20、不超过25、不超过30个氨基酸，不超过35个氨基酸、不超过40个氨基酸、不超过45个氨基酸、不超过50个氨基酸、不超过55个氨基酸、不超过60个氨基酸、不超过65个氨基酸、不超过70个氨基酸、不超过75个氨基酸、不超过80个氨基酸、不超过85个氨基酸、不超过90个氨基酸、不超过95个氨基酸、不超过100个氨基酸。
在一些实施方案中，在SIRPα的疏水核心残基组内的一个或多个氨基酸处进行高亲和力SIRPα多肽的氨基酸变化，所述疏水核心残基组包括但不限于残基(通过如SEQ IDNO：1所示的d1结构域的野生型序列来定义编号)L4、V6、V27、I36、F39、L48、I49、Y50、F57、V60、M72、F74、I76、V92、F94和F103。在可选实施方案中，对例如CV1所示的野生型等位基因2序列进行氨基酸变化。
在其他实施方案中，在与CD47相互作用的接触残基组内的一个或多个氨基酸处进行氨基酸变化，所述接触残基组包括但不限于A29、L30、I31、P32、V33、G34、P35、Q52、K53、E54、S66、T67、K68、R69、F74、K93、K96、G97、S98和D100(SEQ ID NO：1)。
在其他实施方案中，在组合的、上文定义的接触残基组和疏水核心残基组内两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个以及不超过14个氨基酸处进行氨基酸变化。
在一些实施方案中，在包括但不限于以下的组内氨基酸的一个或多个处进行氨基酸变化：残基L4、V6、A21、V27、I31、E47、K53、E54、H56、S66、V63、K68、V92、F94和F103或其组合，例如在两个或多个、三个或多个、四个或多个、五个或多个、六个或多个、七个或多个以及不超过15个残基处。
在一些实施方案中，高亲和力SIRPα试剂包含选自以下的至少一个氨基酸变化：(1)L4V；L4I；(2)V6I；V6L；(3)A21V；(4)V27I；V27L；(5)I31T；I31S；I31F；(6)E47V；E47L；(7)K53R； (8)E54Q；(9)H56P；H56R；(10)S66T；S66G；(11)K68R；(12)V92I；(13)F94L；F94V；(14)V63I；和(15)F103V。在一些实施方案中，高亲和力SIRPα多肽包含选自以下的修饰：上文(1)至(15)，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或全部15个残基；及其组合和保守等同物。
氨基酸变化组可以包括以上的组合，例如：
·V27I或V27L；K53R；S66T或S66G；K68R；和F103V。
·L4V或L4I；V27I或V27L；E47V或E47L；K53R；E54Q；S66T或S66G；K68R；V92I；和F103V。
·L4V或L4I；V6I或V6L；A21V；V27I或V27L；I31T、I31S或I31F；E47V或E47L；K53R；H56P或H56R；S66T或S66G；K68R；和F94L或F94V。
·V6I或V6L；V27I或V27L；I31T、I31S或I31F；E47V或E47L；K53R；E54Q；H56P或H56R；S66T或S66G；V92I；和F94L或F94V。
·L4V或L4I；A21V；V27I或V27L；I31T、I31S或I31F；E47V或E47L；K53R；E54Q；H56P或H56R；S66T或S66G；F94L或F94V；和F103V。
·L4V或L4I；V6I或V6L；V27I或V27L；I31T、I31S或I31F；E47V或E47L；K53R；H56P或H56R；S66T或S66G；K68R；V92I；和F94L或F94V。
·L4V或L4I；V6I或V6L；I31T、I31S或I31F；E47V或E47L；K53R；H56P或H56R；S66T或S66G；V92I；和F103V。
·V6I；V27I；I31F；E47L；K53R；E54Q；H56P；和S66T。
·L4V；V6I；V27I；I31F；E47V；K53R；E54Q；H56P；V63I； S66T；K68R；和V92I。
·V6I；V27I；I31T；E47V；K53R；E54Q；H56P；S66G；K68R；V92I；和F103V。
·V6I；V27I；I31F；E47V；K53R；E54Q；H56P；S66T；和V92I。
在一些实施方案中，高亲和力SIRPα多肽包含以下氨基酸变化组：
·例如，如(SEQ ID NO：3)所示的{V27I；K53R；S66T；S66G；K68R；F103V}；
·例如，如(SEQ ID NO：4)所示的{L4V；V27L；E47V；K53R；E54Q；S66G；K68R；V92I}；
·例如，如(SEQ ID NO：5)所示的{L4V；V6I；A21V；V27I；I31T；E47L；K53R；H56P；S66T；K68R；F94L}；
·例如，如(SEQ ID NO：6)所示的{V6I；V27I；I31S；I31F；E47V；K53R；E54Q；H56P；S66G；V92I；F94L}；
·例如，如(SEQ ID NO：7)所示的{L4I；A21V；V27I；I31F；E47V；K53R；E54Q；H56R；S66G；F94V；F103V}；
·例如，如(SEQ ID NO：8)所示的{L4V；V6I；V27I；I31F；E47V；K53R；H56R；S66G；K68R；V92I；F94L}；或
·例如，如(SEQ ID NO：9)所示的{L4V；V6L；I31F；E47V；K53R；H56P；S66G；V92I；F103V
·例如，如SEQ ID NO：37所示的{V6I；V27I；I31F；E47L；K53R；E54Q；H56P；S66T}。
·例如，如SEQ ID NO：38所示的{L4V；V6I；V27I；I31F；E47V； K53R；E54Q；H56P；V63I；S66T；K68R；V92I}。
·例如，如SEQ ID NO：39所示的{V6I；V27I；I31T；E47V；K53R；E54Q；H56P；S66G；K68R；V92I；F103V}。
·例如，如SEQ ID NO：10所示的{V6I；V27I；I31F；E47V；K53R；E54Q；H56P；S66T；V92I}。
出于本发明目的，本发明试剂包括足够以可识别的亲和力、例如高亲和力结合CD47的、正常位于信号序列与跨膜结构域之间的SIRPα的部分，或其保留结合活性的片段。高亲和力SIRPα试剂将通常至少包括具有上述修饰的氨基酸残基的SIRPα(SEQ ID NO：1)的d1结构域。高亲和力SIRPα多肽可以包括野生型SIRPαd1多肽(SEQ ID NO：1)或其等位基因变体，即野生型等位基因2的至少氨基酸1-3、7-20、32-46、69-91、95-102。高亲和力SIRPα多肽还可以包括不同于d1结构域的天然人SIRPα蛋白的部分，包括但不限于天然蛋白的残基150至374(如SEQ ID NO：2所示)，或者包括但不限于SEQ ID NO：2所示序列的至少10个连续氨基酸，至少20个连续氨基酸，至少50个连续氨基酸，至少100个连续氨基酸，至少125个连续氨基酸，至少250个连续氨基酸或更多。
出于多种目的，还可以进一步修饰本发明的高亲和力SIRPα试剂，例如结合至多种其他寡肽或蛋白质。例如，翻译后修饰，例如通过异戊烯化、乙酰化、酰胺化、羧化、糖基化、聚乙二醇化等。此类修饰还可以包括糖基化修饰，例如通过在多肽合成和加工期间或在进一步加工步骤中修饰多肽的糖基化模式而完成的那些；例如，通过将多肽暴露于影响糖基化的酶，例如哺乳动物糖基化或去糖基化酶。在一些实施方案中，本发明的SIRPα变体包括具有磷酸化氨基酸残基，例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸的SIRPα变体。
在一个实施方案中，高亲和力SIRPα试剂具有至少约1×10-8M的针对CD47的动力学KD。在另一实施方案中，高亲和力SIRPα试剂 具有至少约1×10-9M的针对CD47的动力学KD。而在另一实施方案中，高亲和力SIRPα试剂具有至少约1×10-10M的针对CD47的动力学KD。在本文描述的各个实施方案中，高亲和力SIRPα试剂表现出的针对CD47的动力学KD是SEQ IDNO：1和2中示例的天然人SIRPα多肽的动力学KD的至少约5倍。在一些实施方案中，高亲和力SIRPα试剂针对CD47的动力学KD是天然SIRPα多肽的动力学KD的至少约10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍。
可以例如通过SIRPα试剂结合以下CD47的能力来测定与CD47的结合：分析板上涂布的CD47；微生物细胞表面展示的CD47；溶液中的CD47；等。可以通过将配体，例如CD47或SIRPα变体固定至珠粒、基底、细胞等来测定本发明SIRPα变体与CD47的结合活性。可以将药剂添加在适当缓冲液中，并且在给定温度下孵育结合配偶体一段时间。在洗涤去除未结合的材料之后，可以例如使用SDS、具有高pH的缓冲液等来释放结合的蛋白并分析。
在一些实施方案中，本发明的SIRPα变体是融合蛋白，例如与第二多肽框内融合。在一些实施方案中，第二多肽能够增加融合蛋白尺寸，例如，使得融合蛋白会从循环中快速清除。在一些实施方案中，第二多肽是免疫球蛋白Fc区的部分或全部。在其他实施方案中，第二多肽是基本类似于Fc的任何适当多肽，例如，提供增加的尺寸、多聚结构域、和/或与Ig分子的额外结合或相互作用。这些融合蛋白可有利于纯化、多聚并显示增加的体内半衰期。具有二硫键连接的多聚结构的融合蛋白还可以比单体SIRPα更有效结合并中和其他分子。
在一些实施方案中，提供了高亲和力SIRPα结合结构域，即，如本文所示修饰以提供针对CD47的高亲和力结合的SIRPαd1结构域，作为多聚体蛋白，即，2、3、4或更多SIRPα结合结构域共价或非共价连接，例如作为融合蛋白；二硫键键合；通过与亲和素、链霉亲和素等结合的生物素。这种多聚体高亲和力SIRPα结合蛋白可用作单剂以增加表达CD47的细胞的吞噬；或者与其他结合剂、例如细胞特异 性单克隆抗体组合。
在一些此类实施方案中，高亲和力SIRPα结合结构域融合或以其他方式结合至免疫球蛋白序列以形成嵌合蛋白。免疫球蛋白序列优选但不一定是免疫球蛋白恒定结构域。这种嵌合体中免疫球蛋白部分可以获自任何物种、通常是人，并且包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，IgA、IgE、IgD或IgM。免疫球蛋白部分可以包括一个或多个结构域，例如CH1、CH2、CH3等。
从与适当免疫球蛋白恒定结构域序列连接的序列构建的嵌合体是本领域已知的。在这样的融合体中，编码的嵌合多肽可以至少保留功能活性铰链、免疫球蛋白重链恒定区的CH2和CH3结构域。还可以在恒定结构域的Fc部分的C端，或者刚好重链的CH1或轻链相应区域的N端进行融合。进行融合的精确位置不是关键的；特定位置是熟知的并且可以选择以优化SIRPα多肽-免疫球蛋白嵌合体的生物活性、分泌或结合特征。在一些实施方案中，将SIRPα多肽-免疫球蛋白嵌合体组装为单体，或异或同多聚体，并且特别是二聚体或四聚体。
尽管不需要存在免疫球蛋白轻链，但是可以包括免疫球蛋白轻链，与SIRPα多肽-免疫球蛋白重链融合多肽共价结合，或者与SIRPα多肽直接融合。可以使用单链构建体来提供重链和轻链恒定区。
在其他融合蛋白构建体中，第二多肽是标志物序列，例如，有利于融合多肽纯化的肽。例如，标志物氨基酸序列可以是六组氨酸肽，例如尤其是pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)中提供的标签，其中许多是商业途径可获得的。例如，如在Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824，1989中描述的，六组氨酸提供了融合蛋白的方便纯化。用于纯化的另一个肽标签，“HA”标签，对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位。Wilson等人，Cell 37：767，1984。添加肽部分以利于多肽处理是本领域熟悉且常 规的技术。
在其他实施方案中，提供了作为单体蛋白的高亲和力SIRPα结合结构域，其可以是分离的d1结构域，或者与SIRPα或嵌合序列融合的d1结构域。例如，单体SIRPα结合结构域用作佐剂，在与细胞特异性结合剂，例如抗体，特别是本文定义的肿瘤细胞特异性抗体组合时，增加表达CD47的细胞的吞噬。单体SIRPα结合结构域还用作佐剂，以增加表达SIRPα并响应于本发明SIRPα试剂阻断的许多免疫细胞的吞噬以及其他免疫功能，例如ADCC，抗原摄取以用于抗原呈递等，所述免疫细胞例如巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞、粒细胞等。例如，当与可检测标记缀合时，单体高亲和力SIRPα结合结构域还用作成像剂。
在一些其他实施方案中，本发明的高亲和力SIRPα试剂包括被进一步修饰以提高其对蛋白质降解的抗性或者优化溶解性或者使它们更适合作为治疗剂的试剂。例如，本发明变体还包括含有不同于天然存在的L氨基酸，例如D氨基酸或非天然存在的合成氨基酸的残基的类似物。D氨基酸可以取代氨基酸残基中一些或全部。
在本发明的一些实施方案中，高亲和力SIRPα试剂与一个或多个成像部分、即可检测标记偶联或缀合。如本文使用的，“细胞毒性部分”指当接近细胞或被细胞吸收时抑制细胞生长或促进细胞死亡的部分。就这点而言，适合的细胞毒性部分包括放射性同位素(放射性核素)，化学毒性剂，例如分化诱导剂和小化学毒性药物、毒素蛋白及其衍生物。
如本文使用的，“成像部分”或可检测标记指在可视化技术中可用于增加肿瘤和周围健康组织之间对比的部分，所述可视化技术例如放射显影、正电子放射断层扫描、磁共振成像、直接或间接目测。因此，适合的成像部分包括放射显影部分，例如重金属和辐射发射部分、正电子发射部分、磁共振对比部分和光学可见部分(例如，荧光或可 见光谱染料、可见粒子等。普通技术人员将理解，治疗部分和成像部分之间存在一定重叠。
一般而言，治疗剂或成像剂可以通过任何适当技术与高亲和力SIRPα试剂部分缀合，适当考虑对药代动力学稳定性和降低的对患者总体毒性的需要。当各自具有能够相互反应的官能团时，药剂和SIRPα之间的直接反应是可能的。例如，亲核基团，例如氨基或巯基，能够与含羰基的基团例如酸酐或酰基卤反应，或者与含有良好离去基团(例如卤化物)的烷基反应。可选地，可以使用适当的化学连接子基团。连接子基团可以起间隔基的作用以避免干扰结合能力。
对于本领域技术人员明显的是，可以采用许多同和异功能的双功能或多功能试剂(例如，在Pierce Chemical Co.，Rockford，III.的目录中描述的那些)作为连接子基团。例如，可以通过氨基、羧基、巯基或氧化的糖残基实现偶联。存在许多描述此类方法的参考文献。可选地，通过使用非共价结合对，例如链霉亲和素/生物素、或亲和素/生物素将SIRPα与细胞毒性部分或成像部分连接。在这些实施方案中，所述对的一个成员与SIRPα共价偶联，并且结合对的另一成员与细胞毒性部分或成像部分共价偶联。可能希望偶联超过一个细胞毒性部分和/或成像部分。通过聚衍生高亲和力SIRPα试剂，可以同时实现几种策略，可以使抗体用作几种可视化技术的对比剂，或者可以标记治疗性抗体以通过可视化技术追踪。
载体可以多种方式携带药剂，包括直接或通过连接子基团共价结合，以及非共价缔合。适合的共价结合载体包括蛋白质例如白蛋白，肽，和多糖例如氨基葡聚糖，其每一个具有多个用于连接部分的位点。载体还可以通过非共价缔合而携带药剂，例如通过非共价结合或通过包封。
对放射性核素剂特异的载体和连接子包括放射卤化的小分子和螯合化合物。可以从螯合化合物形成放射性核素螯合物，所述螯合化 合物包括含有氮和硫原子作为供体原子以结合金属或金属氧化物、放射性核素的那些螯合化合物。
本发明中用作成像部分的放射显影部分包括具有相对大的原子例如金、铱、锝、钡、铊、碘及其同位素的化合物和螯合物。优选的是，较低毒性的放射显影成像部分例如碘或碘同位素用于本发明的组合物和方法。此类部分可以通过可接受的化学连接子或螯合载体缀合至高亲和力SIRPα试剂抗体部分。用于本发明的正电子发射部分包括 18F，其可以通过氟化反应而容易地与高亲和力SIRPα试剂缀合。
磁共振对比部分包括铬(III)、锰(II)、铁(II)、镍(II)、铜(II)、镨(III)、钕(III)、钐(III)和镱(III)离子的螯合物。因为其非常强的磁矩，钆(III)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)和铁(III)离子是特别优选的。
用作成像部分的光学可见部分包括荧光染料或者可见光谱染料、可见粒子和其他可见标记部分。当可以向待目视检查部位提供足够激发能量时，荧光染料例如荧光素、香豆素、若丹明、bodipy德克莎斯红和花青染料是有用的。内窥镜可视程序可能与此类标记的使用更相容。可接受的染料包括FDA批准的非毒性的食物染料和着色剂，但是已经被批准用于内部施用的药学上可接受的染料是优选的。
待给予特定患者的成像缀合物组合物的有效量取决于许多因素，其中几个将根据患者不同而异。主管临床医师能够确定有利于肿瘤可视化的有效量。剂量将取决于肿瘤治疗、施用途径、治疗剂的性质、肿瘤对治疗剂的灵敏度等。利用普通技术，主管临床医师能够在常规临床试验期间优化特定治疗或成像组合物的剂量。
通常剂量可以是0.001至100毫克缀合物每千克受试者体重。对于具有相对非毒性成像部分的成像缀合物，可以使用相对大的剂量，范围0.1至10mg每千克患者体重。使用的量将取决于成像方法的灵敏度和成像部分的相对毒性。
可以通过本领域已知或以后发现的任何适当方法产生本发明的SIRPα变体，例如从真核或原核细胞产生，体外合成，等。当通过原核细胞产生该蛋白质时，其可以通过解折叠例如热变性、DTT还原等来进一步加工，并且可以使用本领域已知的方法进一步再折叠。
可以使用本领域已知的常规方法，通过无细胞翻译系统或者合成的体内合成来制备多肽。各种商品化的合成装置是可获得的，例如Applied Biosystems，Inc.，FosterCity，CA，Beckman的自动化合成仪，等。通过使用合成仪，可以用非天然氨基酸取代天然存在的氨基酸。制备的特定序列和方式将由方便性、经济性、所需纯度等来决定。
还可以根据重组合成的常规方法来分离和纯化多肽。可以制备表达宿主的溶胞产物并使用HPLC、排阻色谱、凝胶电泳、亲和色谱或其他纯化技术纯化溶胞产物。对于大部分，有关于与产品制备方法及其纯化有关的污染物，使用的组合物将包含按重量计至少20％的所需产物，更通常按重量计至少约75％、优选按重量计至少约95％，并且对于治疗目的通常按重量计至少约99.5％。通常，百分比基于总蛋白质。
可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有编码序列和适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/基因重组。可选地，可以化学合成能够编码感兴趣多肽的RNA。本领域技术人员可以容易地利用熟知的密码子使用表和合成方法以提供本发明多肽任何一个的适当编码序列。可以分离并获得基本纯度的核酸。通常，将获得基本不含其它非天然存在的核酸序列的作为DNA或RNA的核酸，所述核酸一般是至少约50％、通常至少约90纯，并且通常是“重组的”，例如两端具有正常不在天然存在的染色体上缔合的一个或多个核苷酸。本发明核酸可以作为线性分子或者在环状分子内提供，并且可以在自主复制分子(载体)内或没有复制序列的分子内提供。可以通过其自身的或本领域已知的其他调节序列来调节核酸的表达。可以使用本领域可获得的 许多技术将本发明的核酸引入适当的宿主细胞。
根据本发明，可以在适合治疗用途、例如用于人治疗的药物组合物中提供SIRPα变体。在一些实施方案中，本发明的药物组合物包括本发明的一种或多种治疗实体或其药学可接受的盐、酯或溶剂化物。在一些其他实施方案中，本发明的药物组合物包括与另一治疗剂、例如另一抗肿瘤剂组合的本发明的一种或多种治疗实体。
本发明的治疗实体经常作为包含活性治疗剂和其他药学可接受赋形剂的药物组合物来施用。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗应用。根据所需制剂，组合物还可以包括药学可接受的非毒性载体或稀释剂，其被定义为常用于配制供动物或人施用的药物组合物的媒介物。选择稀释剂以不影响组合的生物活性。此类稀释剂的实例是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、右旋糖溶液和汉克斯溶液(Hank’ssolution)。此外，药物组合物或制剂还可以包括其他载体、佐剂、或非毒性非治疗性非免疫原性的稳定剂等。
而在一些其他实施方案中，本发明的药物组合物还可以包含大的缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖例如壳聚糖、聚乳酸，聚乙醇酸和共聚物(例如乳胶官能化的SepharoseTM、琼脂糖、纤维素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集物(例如油滴或脂质体)。
使用方法
提供了通过抑制SIRPα与CD47之间相互作用，从而增加肿瘤细胞的体内吞噬而用于治疗、减少或预防癌症的方法，所述癌症包括但不限于作为原发性或转移性癌症的淋巴瘤、白血病、癌、黑素瘤、胶质母细胞瘤、肉瘤、骨髓瘤等。此类方法包括给需要治疗的受试者施用治疗有效量或有效剂量的本发明的高亲和力SIRPα试剂，包括但不限于所述试剂与化疗药物、肿瘤特异性抗体或ESA的组合。
本发明的治疗实体例如用于治疗癌症的有效剂量根据许多不同 因素而变化，所述因素包括施用方式、靶位点、患者生理状态、患者是人还是动物、施用的其他药物、以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但是也可以治疗非人哺乳动物，例如伴侣动物例如狗、猫、马等，实验动物例如兔、小鼠、大鼠等，等。可以滴定治疗剂量以优化安全性和效力。
在一些实施方案中，治疗剂量范围可以是约0.0001至100mg/kg和更通常0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6月一次的施用。本发明的治疗实体通常在多个时机施用。单次剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。间隔还可以是不规则的，如通过测量患者中治疗实体的血液水平所决定的。可选地，本发明治疗实体可以作为持续释放制剂来施用，在这种情况下需要较少频率的施用。剂量和频率根据多肽在患者中的半衰期而变化。
在预防性应用中，可以在长时段内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生继续接受治疗。在其他治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量，直至疾病进展减缓或中止，并且优选直至患者显示疾病症状的部分或完全缓解。之后，可以给患者施用预防方案。
而在其他实施方案中，本发明的方法包括治疗、减少或预防癌症的肿瘤生长、肿瘤转移或肿瘤入侵，所述癌症包括淋巴瘤、白血病、癌、黑素瘤、胶质瘤、肉瘤、骨髓瘤等。对于预防性应用，给易感或以其他方式处于疾病风险的患者施用足以消除或减少疾病风险、减少疾病严重性或延迟疾病发作的量的药物组合物或药剂，所述疾病包括疾病的生化、组织和/或行为症状、其并发症和在疾病发展期间出现的中间病理表型。
可以例如通过测量表达CD47的细胞、特别是表达CD47的癌细 胞的数目的增加或减少，在体外和体内使用本发明的高亲和力SIRPα多肽来监测疾病治疗的过程，其可以确定旨在缓解疾病的特定治疗方案是否有效。出于此类目的，SIRPα多肽可以被可检测地标记。
本发明高亲和力SIRPα多肽可以在体外用于结合测定，其中它们可以在液相或结合至固相载体来使用。此外，可以各种方式可检测地标记这些免疫测定中的多肽。可以利用本发明高亲和力SIRPα多肽的测定类型的实例是流式细胞术，例如FACS、MACS、组织化学、直接或间接形式的竞争和非竞争性免疫测定；等。使用高亲和力SIRPα多肽检测CD47可以与以正向、反向或同时方式进行的测定一起进行，包括对生理样品的组织化学测定。本领域技术人员将了解，或者可以在而无过度实验下容易识别其他测定形式。
高亲和力SIRPα多肽可以结合许多不同载体并且用于检测CD47表达细胞的存在。熟知载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。出于本发明目的，载体性质可以是可溶性或不溶性的。本领域技术人员将知道结合蛋白质的其他适合载体，或者能够使用常规实验确定结合蛋白质的其他适合载体。
存在本领域普通技术人员已知的许多不同的标记和标记方法。可用于本发明的标记类型的实例包括酶、放射性同位素、荧光化合物、胶体金属、化学发光化合物和生物发光化合物。本领域普通技术人员将知道用于结合本发明多肽的其他适合标记，或者能够使用常规实验确定用于结合本发明多肽的其他适合标记。而且，可以使用本领域普通技术人员常用的标准技术进行这些标记与本发明多肽的结合。
当存在于生物流体和组织中时，可以通过本发明高亲和力SIRPα多肽检测CD47。可以使用含有可检测量的CD47的任何样品。样品可以是液体，例如尿液、唾液、脑脊液、血液、血清等，或者是固体或半固体，例如组织、粪便等，或者可选地，是固体组织，例如组织 诊断中常用的那些。
可导致更大灵敏度的另一标记技术由将多肽偶联至低分子量半抗原组成。然后可以通过第二反应特异性检测这些半抗原。例如，通常使用半抗原，例如与亲和素反应的生物素，或可与特定抗半抗原抗体反应的二硝基酚、吡哆醛或荧光素。
可以将高亲和力SIRPα试剂的成像缀合物以一系列超过一次施用而施用给受试者。可以在可视化技术之前的适当时间施用成像缀合物组合物。例如，在直接目视检测之前一小时内施用可能是适当的，或者在MRI扫描之前12小时内施用可能是适当。然而，应该小心不要在施用和可视化之间经历太多时间，因为成像化合物可能最终从患者系统中清除。
可以通过胃肠外、局部、静脉内、肿瘤内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌肉内方式施用用于治疗癌症的组合物。通常的施用途径是静脉内或肿瘤内，但是其他途径可以同样有效。
通常，可以将组合物制备为注射剂，作为液体溶液或悬液；还可以制备适合在注射之前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。如上讨论的，还可以在脂质体或微小粒子例如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物中乳化或包封制剂以增强佐剂效果。Langer，Science 249：1527，1990和Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28：97-119，1997。本发明的药剂可以长效注射剂或植入制剂形式施用，其可以允许活性成分持续或脉冲释放的方式配制。药物组合物一般被配制为无菌，基本上等渗，并完全符合美国食品药品监督管理局的所有药品生产质量管理规范(Good Manufacturing Practice,GMP)规则。
可以通过标准的制药程序在细胞培养物或实验动物中测定本文描述的高亲和力SIRPα试剂的毒性，例如通过测定LD50(群体50％致死的剂量)或LD100(群体100％致死的剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比是治疗指数。获自这些细胞培养测定和动物研究的数 据可用于配制对于人使用而言非毒性的剂量范围。本文描述的蛋白质的剂量优选在包括具有很少或没有毒性的有效剂量的循环浓度范围内。根据采用的剂型和使用的施用途径，剂量可以在该范围内变化。个体医师考虑患者状况可以选择确切制剂、施用途径和剂量。
在本发明范围内还有包含本发明组合物(例如，高亲和力SIRPα试剂及其制剂)和使用说明书的试剂盒。该试剂盒可以进一步包含至少一种其他试剂，例如化疗药物、抗肿瘤抗体、ESA等。试剂盒通常包括指示试剂盒内容物预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供、或以其他方式随附试剂盒的任何书面或记录材料。
现在全面描述本发明，对于本领域普通技术人员明显的是，可以在不背离本发明精神或范围的情况下做出各种变化和修改。
实验
提出了以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且不是要限制发明人视为其发明的范围，也不是要表示以下实验是进行的所有或唯一实验。已经做出努力以保证关于所使用数值(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，份是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是处于或接近大气压。
本说明书引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个个体出版物或专利申请被明确且单独指示通过引用并入。
已经就本发明人发现或提议的特定实施方案描述了本发明，以包括实施本发明的优选方式。本领域技术人员会理解，根据本公开内容，可以在示例的特定实施方案中进行许多修改和变化而不背离本发明的预期范围。例如，由于密码子冗余，可以在基础DNA序列中进行变化而不影响蛋白质序列。而且，由于生物功能等效性考虑，可以在 蛋白质结构中进行变化而不在种类和量方面影响生物作用。所有此类修改预期包括在所附权利要求的范围内。
蛋白质表达和纯化：将人CD47的IgSF结构域(残基19-135)和人SIRPα的第一IgSF结构域(残基31-148)的变体克隆入带有C末端8x组氨酸标签的pAcGP67并使用重组杆状病毒在Hi5细胞中表达。将CD47 IgSF结构域上的自由半胱氨酸突变成甘氨酸。通过Ni-NTA色谱和经进入HBS(10mM Hepes pH 7.4，150mM NaCl)的Superdex-75柱的凝胶过滤纯化蛋白质。为了产生生物素化的蛋白质，添加C末端生物素受体肽(BAP)-LNDIFEAQKIEWHE标签并使蛋白质与BirA连接酶与过量生物素(100μM)共表达。为了结晶，用N末端麦芽糖结合蛋白(MBP)标签使SIRPα变体FD6在大肠杆菌周质中表达，所述N末端麦芽糖结合蛋白(MBP)标签通过用3C蛋白酶处理而去除。将CD47 IgSF结构域与EndoF在Hi5细胞中在kifunensine存在下共表达以去除糖基化。
为了表达与人IgG4和IgG2 Fc链融合的SIRPα变体蛋白，将SIRPα变体与IL2信号序列框内克隆进入pFUSE-hIgG4-Fc2和pFUSE-hIgG2-Fc2载体(Invivogen)。在用293fectin(Invitrogen)转染之后，在Freestyle 293-F细胞(Invitrogen)中表达SIRPα变体融合蛋白。在蛋白质表达96小时之后收集上清液并经HiTrap蛋白A柱(GE Healthcare)纯化。
FD6：CD47复合物的结晶和结构测定：将大肠杆菌衍生的FD6和去糖基化的昆虫衍生的CD47以1：1比率混合并用羧肽酶A和B处理，随后经进入HBS的Superdex-75柱凝胶过滤。将复合物浓缩至22mg/mL，并通过向等体积的2.0M硫酸铵、0.1M Tris(pH7.3)添加0.1μL蛋白质，在坐滴(sitting drop)中通过蒸汽扩散而结晶。在Advanced Light Source进行衍射研究。通过用PHASER的分子替换解析晶体结构并使用PHENIX和COOT细化。
表面等离子体共振：在25℃下在Biacore T100仪器上进行SPR实验。实验使用了Biacore SA传感器芯片(GE Healthcare)以表面密度为大约150RU捕获生物素化的CD47。将不相关的生物素化蛋白质固定作为SA传感器芯片的参考表面，其具有与实验表面相匹配的RU。使未生物素化的SIRPα变体在电泳缓冲液[1xHBS-P(GE Healthcare)]中的连续稀释液以50μL/分钟的速率流经芯片。利用三次30秒的2M MgCl2注射再生CD47。使用具有1：1Langmuir结合模型的Biacore T100评价软件版本2.0分析数据。
癌细胞系和培养条件：使Jurkat细胞(ATCC)和DLD-1细胞(ATCC)在RPMI(Invitrogen)+10％胎牛血清(Omega Scientific)+1％GlutaMax(Invitrogen)+1％青霉素/链霉素溶液(Invitrogen)中维持。使Jurkat细胞在悬液中维持，而使DLD-1细胞作为粘附单层维持。在达到汇合之前，使两种细胞系以3-4天的规律间隔传代。为了制备GFP-荧光素酶+细胞系，用表达荧光素酶2(Promega)-eGFP的慢病毒(衍生自基于pCDH-CMV-MCS-EF1-puro HIV的慢病毒载体(Systems Bioscience))转导Jurkat和DLD-1细胞。使用BDFACSAriaII流式细胞分析仪分选细胞中的GFP+细胞，并以与亲本细胞系相同的方式维持在培养物中。
与人癌细胞的结合的SIRPα变体的评价：在PBS中洗涤GFP+Jurkat细胞，然后与滴定浓度的生物素化SIRPα变体在冰上孵育30分钟。通过使4：1摩尔比的生物素化野生型SIRPα与链霉亲和素在冰上孵育15分钟来预先形成野生型SIRPα四聚体。细胞在FACS缓冲液(PBS+2％FBS)中洗涤，然后与缀合至Alexa Fluor 647的50nM链霉亲和素在冰上孵育20分钟。将细胞洗涤两次，然后使用Accuri C6流式细胞仪通过流式细胞术分析SIRPα变体结合。为了评估野生型SIRPα与cD47的阻断，使50nM野生型SIRPα四聚体与滴定浓度的CD47阻断剂在冰上孵育30分钟。使用抗CD47克隆B6H12(eBioscience)作为阻断的阳性对照。使用GraphPadPrism 5分析数据。最大的SIRPα变体结合代表针对每个变体测量的最大平均荧光强 度的百分比。
巨噬细胞衍生和培养：为了衍生人巨噬细胞，从斯坦福血液中心获得来自匿名捐赠者的白细胞减少系统室。在Ficoll-Paque Premium(GE Healthcare)上通过密度梯度离心获得了外周血单核细胞。使用CD14微珠(Miltenyi)和AutoMACS Pro分离器(Miltenyi)纯化了CD14+单核细胞。通过在IMDM+GlutaMax(Invitrogen)+10％AB人血清(Invitrogen)+1％青霉素/链霉素中培养7天而使单核细胞分化成巨噬细胞，此时它们被用于吞噬测定。
通过从C57Bl/Ka Rosa26-mRFP1转基因小鼠分离骨髓并在补充了10μg/mL鼠M-CSF(Peprotech)的RPMI(Invitrogen)+10％FBS+1％GlutaMax+1％青霉素/链霉素中培养而衍生小鼠巨噬细胞。分化7天后，收获巨噬细胞并用于吞噬测定。
体外吞噬测定：使用小鼠和人巨噬细胞进行体外吞噬测定。为了通过流式细胞术评价，在96孔组织培养板中每孔添加大约50,000个巨噬细胞。将200,000个GFP+肿瘤细胞与抗体或SIRPα变体疗法在无血清培养基中预孵育30分钟，然后添加至巨噬细胞。如所述的，使用抗CD47克隆2D3(eBioscience)和西妥昔单抗(Bristol-Myers Squibb)用于调理。使巨噬细胞和靶细胞在含有5％二氧化碳的加湿的37°孵育箱中孵育2小时。孵育之后，洗涤细胞，从板取出并准备用于流式细胞术。通过用DAPI(Invitrogen)染色而从分析中排除死亡细胞。通过用Alexa Fluor 647缀合的抗人CD14(BioLegend)染色来鉴定人巨噬细胞。使用具有高通量取样器的BD Biosciences LSRFortessa分析样品。使用FlowJo 7.6.4(Treestar)测定由GFP+巨噬细胞表示的吞噬肿瘤细胞的巨噬细胞的百分比。
为了在体外目测吞噬，将50,000个巨噬细胞铺板在24孔板中。根据生产商方案用5μM CFSE(Invitrogen)标记肿瘤细胞。用抗体或SIRPα变体处理在无血清培养基中处理200,000个CFSE+肿瘤细胞30 分钟，添加至巨噬细胞，然后在37°孵育2小时。孵育之后，充分洗涤孔以去除残余靶细胞。随后，使用倒置荧光显微镜(Leica DMI6000 B)目测孔。记录吞噬指数为靶细胞数目/巨噬细胞×100。
结果。治疗异种移植的免疫缺陷小鼠的体内实验显示，用高亲和力SIRPα-Fc试剂的治疗阻断了肿瘤生长。用可溶性SIRP试剂治疗植入了表达荧光素酶的HL60白血病细胞的小鼠。如通过从荧光素酶-HL60细胞发射的辐射测量的肿瘤负荷下降至背景水平，指示肿瘤细胞的清除，而IgG对照治疗的小鼠辐射增加，反映了增加的肿瘤生长。该结果与用hu5F9抗CD47ab观察到的结果相当。这些数据显示，高亲和力可溶性SIRPα试剂与抗CD47抗体在通过结合HL60细胞上的CD47而有效阻断“不要吃我信号”并允许细胞的吞噬和清除方面相当。
实施例2
高亲和力SIRPα降低了癌细胞的巨噬细胞吞噬的阈值。
肿瘤逃避免疫系统的能力是新兴的癌症标志，并且使免疫反应定向针对癌细胞的新治疗策略在实验和临床环境中显示了希望。巨噬细胞通常渗入肿瘤，并且最近研究已经鉴定CD47为抗吞噬的“不要吃我”信号，其在许多类型癌症上高度表达以逃避巨噬细胞介导的破坏。阻断CD47与巨噬细胞上抑制性受体SIRPα结合的抗体极大增加了癌细胞的吞噬—鉴定了与抗肿瘤免疫疗法一起操作的令人兴奋的新轴线。使用定向进化和蛋白质工程来修饰SIRPα的结合结构域，其野生型亲和力太弱以至于不能作为CD47的高亲和力竞争性拮抗剂而在治疗上有用。
我们产生了结合CD47的SIRPα变体，其相对于野生型SIRPα亲和力增加大约50,000倍。当作为多聚体高亲和力SIRPα-Fc融合蛋白产生时，该变体作为单一药剂作用以在体外诱导吞噬并在体内减少人肿瘤的生长。虽然单结构域高亲和力SIRPα单体自身不足以诱导最 大的吞噬，但是它们以组合疗法给予时极大增强了已建立的治疗性单克隆抗体的效力。因为CD47是肿瘤细胞用以逃避免疫系统的普遍机制，所以本研究中产生的分子作为单一疗法和其他靶向生物制剂的佐剂都有益于许多癌症患者。
为了产生理想的CD47拮抗剂，使用蛋白质工程来提高可溶性SIRPα对CD47的亲和力(图1A)。我们产生了与用于酵母表面展示的Aga2p缀合的SIRPα的N末端V组Ig结构域的突变体文库(图1B)。使用CD47 IgSF结构域作为选择试剂，我们进行了两‘代’体外进化。第一代需要从含有对两类SIRPα残基—接触CD47的那些或留在疏水核心的那些—随机化的汇集的突变体文库的五轮选择(图5A)。如通过表面等离子体共振测量的，得到的第一代SIRPα变体以比野生型SIRPα高20-100倍的亲和力结合CD47。为了获得甚至更高亲和力的变体，我们通过构建实现了在第一代选择子中突变的13个残基的全覆盖的文库而进行了第二代定向进化。在五轮额外选择之后，我们获得了结合CD47的变体，其具有低至34.0pM的解离常数(KD)和长达44分钟的衰变半衰期(t1/2)，相比之下，野生型SIRPα具有0.3-0.5μM的KD和1.8秒的t1/2(图1C)。有趣地，高亲和力SIRPα变体的序列集中于一组共有的突变。当我们将这九个保守取代接入占优势的野生型SIRPα等位基因(等位基因2)上时，得到的变体(称为CV1，共有变体1)以11.1pM的亲和力结合CD47(图1C)。
CV1序列相对于野生型等位基因具有以下氨基酸变化：V6I；V27I；I31F；E47V；K53R；E54Q；H56P；S66T；V92I。CV1可以包括例如如下的d1结构域氨基酸序列：
(SEQ ID NO：10)EEELQIIQPD KSVLVAAGET ATLRCTITSL FPVGPIQWFR GAGPGRVLIYNQRQGPFPRV TTVSDTTKRN NMDFSIRIGN ITPADAGTYY CIKFRKGSPD DVEFKSGAGT ELSVRAKPS
为了解高亲和力SIRPα变体是否保留了类似于野生型蛋白的CD47结合几何结构，我们测定了高亲和力变体FD6和CD47 IgSF结 构域之间复合物的晶体结构(图1D)。FD6：CD47复合物与野生型SIRPα：CD47复合物叠影的均方根差仅指示了高度的结构相似性并确认了我们保留野生型相互作用的几何结构的努力(图1E)。FD6和野生型SIRPα对CD47的重叠的结合模式指示它们将竞争相同的CD47表位，从而提供最大可能的拮抗机制。作为显著差异，FD6的C’D环含有共有序列中存在的四个接触突变中的三个(图1E)。我们推断这些突变稳定C’D环，其使Arg53的正电荷定位于CD47上的谷氨酸簇中(图1E)。FD6和CD47之间结合界面的其余部分高度类似于野生型SIRPα：CD47界面，最显著的例外是Ile31突变为Phe。这些结构研究指示高亲和力SIRPα变体可以用作有效的CD47拮抗剂。
为了测试高亲和力SIRPα变体的功能性质，我们首先检查了其结合并拮抗癌细胞表面上的CD47的能力。我们发现，具有增加的CD47亲和力的SIRPα变体在结合(图8a、c)和阻断细胞表面CD47(图2a和图8b)中表现出更大的效价。作为单结构域单体，相对于野生型SIRPα，FD6和CV1变体表现出有效的拮抗作用。重要的是，两种高亲和力变体是比从抗CD47抗体克隆B6H12产生的Fab片段更有效的CD47拮抗剂，抗CD47抗体克隆B6H12是证明了体外和体内治疗效力的充分表征的CD47拮抗剂(图8a)。
接下来，我们通过在CD47阻断剂存在下共培养巨噬细胞和肿瘤细胞来评价高亲和力SIRPα变体增加体外吞噬的能力。作为与人IgG4(hIgG4)的Fc片段的融合蛋白，如通过显微镜看到的，高亲和力SIRPα变体导致癌细胞吞噬的显著增加(图2b)。为了获得吞噬的定量测量，将主要的人巨噬细胞和GFP+肿瘤细胞与CD47阻断剂共培养，然后通过流式细胞术分析(图2c)。使用代表固体和血液恶性肿瘤的多种癌细胞系，我们发现用饱和浓度的高亲和力SIRPα-hIgG4变体的治疗产生了相对于野生型SIRPα-hIgG4对照显著增加的吞噬(图2d)。尽管高亲和力SIRPα-hIgG4变体和同种型匹配的抗CD47抗体在饱和浓度时产生了相当水平的吞噬(图2d)，但是当滴定以产生剂 量-响应曲线时，高亲和力SIRPα变体证明了明显的优势(图2e)。FD6-hIgG4和CV1-hIgG4的高亲和力对应于减少的EC50，指示更有效的吞噬诱导。
有趣的是，在用饱和浓度的高亲和力SIRPα单体治疗后没有观察到吞噬的明显增加(图2d)，表明单独阻断CD47不足以诱导最大的吞噬。结果，我们假设用高亲和力SIRPα单体治疗会降低在肿瘤特异性单克隆抗体存在下的吞噬阈值。为了考察该假设，我们使用靶向DLD-1细胞(一种人结肠癌细胞系)的抗体进行吞噬测定。当单独或与非特异性同种型对照抗体组合添加高亲和力SIRPα单体时，观察到基础水平的吞噬(图2f)。
用结合CD47但不阻断与SIRPα相互作用的抗CD47克隆2D3或抗EpCam抗体的治疗产生了适度水平的吞噬。然而，在向两种抗体治疗添加高亲和力SIRPα单体FD6后，巨噬细胞表现出显著的吞噬增加(图2f)。因此，阻断CD47降低了在其他活化刺激物、例如抗体Fc存在下的巨噬细胞吞噬阈值。
为了说明该原理的临床意义，我们考察了高亲和力SIRPα单体增强目前用作癌症疗法的建立的单克隆抗体效力的能力。首先，使用用抗EGFR抗体西妥昔单抗处理的DLD-1结肠癌细胞进行了吞噬测定。评价了响应于单独的、与野生型SIRPα单体组合的或与高亲和力SIRPα单体组合的滴定浓度的西妥昔单抗的吞噬。相对于单独或与野生型SIRPα单体组合的西妥昔单抗，西妥昔单抗加高亲和力SIRPα单体的组合产生了西妥昔单抗最大效力和效价的显著增加(图2g)。当用以滴定浓度的利妥昔单抗(一种抗CD20抗体)处理的Raji淋巴瘤细胞评价吞噬时观察到类似的效果(图2h)。同样，高亲和力SIRPα单体增加了利妥昔单抗的最大效力和效价。在临床环境下，单克隆抗体通常仅实现有限的响应，并且治疗之后常见复发。高亲和力SIRPα单体通过用作肿瘤特异性抗体的通用佐剂而提供了这些问题的解决方案。
接下来，我们使用小鼠肿瘤模型评价了高亲和力SIRPα变体的体内效力。作为晚期人结肠癌的积极模型，将GFP-荧光素酶+DLD-1细胞植入NSG小鼠的腹腔(图3a)。在通过生物发光成像证实植入之后，用媒介物对照或高亲和力SIRPα变体CV1-hIgG4作为单一疗法开始每日治疗。总通量的生物发光监测揭示了用CV1-hIgG4治疗的开始几周期间肿瘤生长速率的适度下降(图9)，这导致随时间显著的存活益处(图3b)。因为红细胞损失是用抗小鼠CD47抗体治疗后观察到的主要副作用，我们检查了CV1-hIgG4治疗小鼠血液中的类似下降。流式细胞术揭示CV1-hIgG4结合了血液中的所有细胞(图3c)并且导致血细胞比容的适度降低(图3d)。然而，如前观察到的，延长的治疗没有引起进一步的毒性。
因为CV1-hIgG4表现出作为单一药剂的抗肿瘤效力，接下来我们评价了其在人膀胱癌模型中的效力，膀胱癌是目前不存在靶向生物制剂的癌症类型。将GFP-荧光素酶+639-V膀胱癌细胞注射入NSG小鼠的背部皮下组织。通过生物发光成像证实了植入，并且将小鼠随机分成用媒介物对照或CV1-hIgG4每日治疗的组。如通过生物发光成像评价的，用CV1-hIgG4的治疗明显降低了肿瘤生长速率(图3e、f)。在第一对照治疗小鼠即将死亡之前评估了肿瘤体积，此时大的肿瘤在所有对照小鼠中是可测量的，而在CV1-hIgG4治疗小鼠中没有明显肿瘤是可触摸的(图3g)。因此，即使在所有对照小鼠死亡时就中断治疗后，观察到了明显的存活益处(图3h)。
如之前观察到的，用CV1-hIgG4的治疗导致红细胞指数降低(图10a)。CV1-hIgG4治疗的小鼠也在肿瘤植入部位周围发展了可触摸的基质组织。该组织的组织病理学检查揭示了嵌入含有巨噬细胞的广泛炎性侵润物的小肿瘤结节(图10b、c)。
接下来，我们考察高亲和力SIRPα单体在体内的辅助作用。在一个人淋巴瘤的局部模型中，将GFP-荧光素酶+Raji细胞皮下植入NSG小鼠的侧腹。在通过生物发光成像证实植入之后，将小鼠随机分组， 进行用媒介物、单独CV1单体、单独利妥昔单抗、或利妥昔单抗加CV1单体的组合的为期三周的每日治疗。用单独CV1单体或利妥昔单抗的治疗仅减少了肿瘤生长，而用组合疗法的治疗明显消除了大部分小鼠中的肿瘤(图4a、b、c)。在治疗期间，没有发现显著的红细胞减少(图11a、b、c)。将每种疗法的作用转换成各自的存活曲线趋势(图4d)。显然，将高亲和力SIRPα单体与肿瘤特异性单克隆抗体组合的协同效应导致大部分动物中的长久治愈—甚至在中断治疗之后(图4d)。
高亲和力SIRPα变体的开发代表了多学科、合理的药物设计努力，从蛋白水平的分子工程开始，到使用纯化的免疫效应细胞的体外验证，最后到动物模型中的治疗评价。虽然之前研究已经证明了靶向CD47-SIRPα相互作用作为癌症的免疫介入的价值，这里我们进一步操作该体系而产生高度有效且有力的CD47拮抗剂，其表现出作为治疗剂的最佳性质。
我们的体外和体内发现提供了对巨噬细胞抗癌症活性及其对免疫调节疗法响应的新见解。如使用高亲和力SIRPα单体观察到的，单独CD47的阻断不足以诱导最大吞噬。类似地，当CD47通过巨噬细胞上的SIRPα自由转导抑制信号时，单克隆抗体不实现其最大效力。然而，当CD47在表面结合的抗体Fc存在下被高亲和力SIRPα单体阻断时，巨噬细胞被强烈刺激。高亲和力SIRPα-Fc融合蛋白和抗CD47抗体将CD47阻断组分和亲吞噬抗体Fc组合成单一分子；因此，它们作为单一药剂表现出效力但是对脱靶毒性具有更大潜力。另一方面，高亲和力SIRPα单体与单独抗肿瘤单克隆抗体例如利妥昔单抗的组合特异性增强抗肿瘤反应。虽然该策略提供了明显益处，特别是缺少明显毒性，但是其依赖于临床上批准的单克隆抗体的可用性和效力以实现最大反应。
最近报道表明，野生型SIRPα-Fc融合蛋白可用于治疗人白血病。然而，我们的研究显示，野生型SIRPα和CD47之间的弱亲和力限制 了这种疗法的潜力。与CD47拮抗作用相反，其他人观察到的作用可能主要由Fc的亲吞噬作用介导，因为吞噬只有当巨噬细胞用内毒素和干扰素-γ预先活化时才是明显的。在体内，野生型人SIRPα和小鼠CD47之间交叉反应性的缺乏不充分地模拟人治疗和毒性，人中由于CD47在机体所有细胞上的表达而存在大的‘抗原池(antigen sink)’。
高亲和力SIRPα试剂构成了一类新的抗肿瘤生物制剂，其可进行进一步工程化。可以设计修饰以改变效力、特异性、组织穿透性、清除率和毒性。而且，因为许多肿瘤过表达CD47并且表达水平与差的患者结果相关，所以高亲和力SIRPα变体可以适应作为癌症的非侵入性成像剂。CD47通常被肿瘤细胞利用以逃避免疫系统，因此，高亲和力SIRPα变体可能是许多人癌症的有价值的治疗剂。高亲和力SIRPα-Fc融合蛋白证明了作为单一药剂的效力，并且因此可以特别用作目前不存在靶向治疗的癌症的治疗。而且，高亲和力SIRPα单体可以用作常规单克隆抗体疗法的普遍佐剂。总之，本研究加深了我们有关巨噬细胞对恶性细胞反应的知识，并且支持了高亲和力SIRPα试剂作为基于免疫的癌症疗法的用途。
方法
蛋白质表达和纯化.使用杆状病毒从粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(Hi-5)细胞分泌具有C15G突变和C末端8组氨酸标签的CD47 IgSF结构域(残基1-117)，并通过Ni-NTA和用Superdex-75柱的尺寸排阻色谱进行纯化。为了产生聚糖最小化的CD47供结晶照相，使CD47与内切糖苷酶-H(endoH)在kifunensine存在下共表达。使用含有在MBP标签和C末端8组氨酸标签之后的鼻病毒3C蛋白酶切割位点的修饰的pMal-p2X表达载体(New EnglandBiolabs)在BL-21(DE3)大肠杆菌周质中表达作为MBP-融合体的单体SIRPα变体(残基1-118)。用1mM IPTG以0.8的OD600诱导细胞并在22℃下振摇孵育24小时。通过渗透压冲击获得周质蛋白，并且使用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)色谱纯化MBP-融合蛋白。用3C蛋白酶在4℃下消化洗 脱的蛋白质12小时以去除MBP，并通过额外的Ni-NTA色谱步骤、随后通过用Superdex-S75柱的尺寸排阻色谱进一步纯化。对于体外吞噬测定和体内实验，如前所述使用TritonX-114去除内毒素，并且使用ToxinSensorChromogenic LAL内毒素测定试剂盒(Genscript)确认内毒素去除。通过将SIRPα变体克隆入具有IL-2信号序列和工程化Ser228Pro突变的修饰的pFUSE-hIgG4-Fc载体(Invivogen)而产生SIRPα-Fc融合体。通过在Freestyle 293-F细胞(Invitrogen)中瞬时转染来表达蛋白质，并经HiTrap蛋白A柱(GEHealthcare)纯化。通过在CHO细胞(Lonza)中稳定表达而重组产生嵌合的抗CD47克隆B6H12-hIgG4。
为了获得生物素化的CD47和SIRPα，表达带有羧基末端生物素受体肽标签(GLNDIFEAQKIEWHE)的蛋白质并如上所述纯化。用BirA连接酶体外生物素化纯化的蛋白质，然后通过尺寸排阻色谱从反应混合物再纯化。
B6H12的Fab片段的的制备。B6H12抗体被脱盐进入20mM柠檬酸钠(pH6.0)、25mM半胱氨酸、5mM EDTA，并稀释至4mg/mL的浓度。然后将抗体与每mL抗体250μL固定化无花果蛋白酶树脂(Thermo Scientific)混合，并在37℃下旋转孵育5小时。通过使反应混合物穿过monoQ柱(流过液中驻留的B6H12 Fab)，随后通过用Superdex-200柱的凝胶过滤来纯化消化片段。
SIRPα变体的酵母展示和文库产生。如之前所述，使用pCT302载体在酿酒酵母(S.cerevisiae)株EBY100的表面上展示作为与Aga2的C末端融合体的SIRPα的N末端V组结构域(残基1-118)。通过两个单独的组合PCR反应(其分别随机化SIRPα的CD47接触残基和疏水‘核心’残基)产生汇集的第一代文库，使用以下具有简并密码子的引物组：接触残基PCR引物组，随机化Ser29＝RST、Leu30＝NTT、Ile31＝NTT、Pro32＝CNT、Val33＝NTT、Gly34＝RST、Pro35＝CNT、Gln52＝SAW、Lys53＝ARG、Glu54＝SAW、Ser66＝RST、 Thr67＝RST、Lys68＝ARG、Arg69＝ARG、Phe74＝NTT、Lys93＝ANG、Lys96＝ANG、Gly97＝RST、Ser98＝RST和Asp100＝RAS：
(SEQ ID NO：11)5′GAGGAGGAGCTGCAGGTGATTCAGCCTGACAAGTCCGTATCAGTTGCAGCT3′；(SEQ ID NO：12)5′GGTCACAGTGCAGTGCAGAATGGCCGACTCTCCAGCTGCAACTGATACGGA3′；(SEQID NO：13)5′CTGCACTGCACTGTGACCRSTNTTNTTCNTNTTRSTCNTATCCAGTGGTTCAGAGGA3′；(SEQID NO：14)5′ATTGTAGATTAATTCCCGGGCTGGTCCAGCTCCTCTGAACCACTGGAT3′；(SEQ ID NO：15)5′CGGGAATTAATCTACAATSAWARGSAWGGCCACTTCCCCCGGGTAACAACTGTTTCAGAG3′；(SEQ ID NO：16)5′GTTACTGATGCTGATGGAAANGTCCATGTTTTCCYTCYTASYASYCTCTGAAACAGTTGTTAC3′；(SEQID NO：17)5′TCCATCAGCATCAGTAACATCACCCCAGCAGATGCCGGCACCTACTACTGTGTG3′；(SEQ IDNO：18)5′TCCAGACTTAAACTCCGTWTYAGGASYASYCNTCCGGAACNTCACACAGTAGTAGGTGCC3′；(SEQID NO：19)5′ACGGAGTTTAAGTCTGGAGCAGGCACTGAGCTGTCTGTGCGTGCCAAACCCTCT3′
‘核心’残基PCR引物，随机化Leu4、Val6、Val27、Ile36、Phe38、Leu47、Ile49、Tyr50、Phe57、Val60、Met72、Phe74、Ile76、V92、Phe94、和Phe103至NTT：
(SEQ ID NO：20)5′GGATCCGAGGAGGAGNTTCAGNTTATTCAGCCTGACAAGTCCGTATCAGTTGCAGCTGGAGAG3′；(SEQ ID NO：21)5′GGGCCCCACAGGGATCAGGGAGGTAANAGTGCAGTGCAGAATGGCCGACTCTCCAGCTGCAAC3′；(SEQ ID NO：22)5′CTGATCCCTGTGGGGCCCNTTCAGTGGNTTAGAGGAGCTGGACCAGCCCGGGAA3′；(SEQ ID NO：23)5′GTGGCCTTCTTTTTGATTAANAANAANTTCCCGGGCTGGTCCAGC3′；(SEQ ID NO：24)5′AATCAAAAAGAAGGCCACNTTCCCCGGNTTACAACTGTTTCAGAGTCCACAAAGAGAGAAAAC3′；(SEQ ID NO：25)5′GCCGGCATCTGCTGGGGTGATGTTACTGATGCTAANGGAAANGTCAANGTTTTCTCTCTTTGTGGA3′；(SEQ ID NO：26)5′ACCCCAGCAGATGCCGGCACCTACTACTGTNTTAAGNTTCGGAAAGGGAGCCCTGACACGGAG3′，(SEQ ID NO：27)5′AGAGGGTTTGGCACGCACAGACAGCTCAGTGCCTGCTCCAGACTTAANCTCCGTGTCAGGGCTCCC3′。
用含有与pCT302载体同源的引物进一步扩增PCR产物，与线性化pCT302载体DNA组合，并共同电穿孔进入EBY100酵母。得到的文库含有4.0×108个转化子。
与第一代文库相同产生并转化第二代文库，但是与以下引物组合：随机化Leu4＝NTT、Val6＝NTT、Val27＝NTT、Ile31＝WYT、Glu47＝SWA、Lys53＝ARG、Glu54＝SAK、His56＝CNT、Ser66＝RST、Lys68＝ARG、Val92＝NTT、Phe94＝NTT、Phe103＝NTT：
(SEQ ID NO：28)5′GGATCCGAGGAGGAGNTTCAGNTTATTCAGCCTGACAAGTCCGTATC3′；(SEQ ID NO：29)5′GTGCAGTGCAGAATGGCCGACTCTCCAGCTGCAACTGATACGGACTTGTCAGGCTGAA3′；(SEQ ID NO：30)5′CATTCTGCACTGCACTNTTACCTCCCTGWYTCCTGTGGGGCCCATCCAG3′；(SEQ IDNO：31)5′CGGGCTGGTCCAGCTCCTCTGAACCACTGGATGGGCCCCACAGG3′；(SEQ ID NO：32)5′GAGCTGGACCAGCCCGGSWATTAATCTACAATCAAARGSAKGGCCNTTTCCCCCGGGTAACAACTGTTTCAGAG3；(SEQ ID NO：33)5′GAAAAGTCCATGTTTTCTCTCYTTGTASYCTCTGAAACAGTTGTTAC3′；(SEQ ID NO：34)5′AGAGAAAACATGGACTTTTCCATCAGCATCAGTAACATCACCCCAGCAGATGCC GGCAC3′；(SEQ IDNO：355′CTCCGTGTCAGGGCTCCCTTTCCGAANCTTAANACAGTAGTAGGTGCCGGCATC TGCTG3′，(SEQ IDNO：36)5′GAGCCCTGACACGGAGNTTAAGTCTGGAGCAGGCACTGAGCTGTCTGTGCGTGCCAAACCCTCT3′。得到的文库含有2×108个转化子。
第一代文库的选择.在30℃下、SDCAA液体培养基中扩增转化的酵母，并在20℃下、SGCAA液体培养基中诱导。所有选择步骤在4℃下进行。对于第一轮选择，将代表文库转化子数目十倍覆盖的4·109个诱导的酵母重悬于5mL PBE(补充了0.5％牛血清白蛋白和0.5mMEDTA的磷酸盐缓冲盐水)。将酵母与用生物素化CD47预涂布的500μL顺磁链霉亲和素微珠(Miltenyi)混合，并将混合物旋转孵育1小时。通过以5,000g离心5分钟来沉淀酵母，并用10mL PBE洗涤两次。将磁性标记的酵母重悬于5mL PBE并用LS MACS柱根据生产商说明书(Miltenyi)分离。沉淀洗脱的酵母，重悬于SDCAA培养基，并扩增用于下一轮选择。与第一轮类似地进行额外四轮选择，具有以下调整：将1×108个酵母重悬于含有FITC标记的抗c-Myc抗体(Miltenyi)或从1μM至100nM依次降低的浓度的生物素化CD47蛋白的500μL PBE。孵育1小时之后，用PBE洗涤酵母并用于以CD47选择，用链霉亲和素-PE(Invitrogen)或链霉亲和素-Alexa Fluor 647(内部制备)标记15分钟。用PBE洗涤酵母另外两次，并用50μL适当的抗荧光团微珠(抗FITC、抗PE或抗Alexa Fluor647；Miltenyi)磁性标记15分钟。洗涤酵母一次，重悬于3mL PBE，并与第一轮一样用LS柱分离。
第二轮文库的选择.对于第二代文库的前两轮选择，如在第一代选择的第2至5轮一样，用单体生物素化CD47蛋白选择酵母。用20nM生物素化CD47选择第一轮，并且用1nM生物素化CD47选择第二轮，使用较大的染色体积(10mL PBE)避免配体耗尽。对于所有随 后轮次的选择，进行动力学选择。简言之，用20nM生物素化CD47染色酵母1小时，用PBE洗涤，然后重悬于含有1μM非生物素化CD47的500μL PBE。在25℃下孵育细胞90分钟(第三轮)或300分钟(第四轮和第五轮)，之后用冰冷PBE洗涤它们，并用荧光标记的链霉亲和素染色。对于第1至4轮，使用如针对第一代文库描述的MACS分离酵母。对于第五轮选择，将酵母用FITC标记的抗c-Myc和链霉亲和素-Alexa Fluor 647共同标记，并用FACSAria细胞分选器(BDBiosciences)选择。
表面等离子体共振(SPR).在25℃下用Biacore T100进行实验。通过Nanodrop2000分光计(Thermo Scientific)在280nm的吸光度定量蛋白质浓度。使用Biacore SA传感器芯片(GE Healthcare)捕获生物素化的CD47(Rmax约150RU)。将不相关的生物素化蛋白质固定，其中RU值与非特异性结合对照的参考表面相匹配。使用SIRPα变体在HBS-P+缓冲液(GEHealthcare)中的连续稀释液进行测量。通过三次60秒的2M MgCl2注射再生CD47表面。使用1：1 Langmuir结合模型用Biacore T100评价软件版本2.0分析所有数据。
FD6：CD47复合物的结晶和结构测定.将聚糖最小化的CD47和大肠杆菌衍生的FD6以1：1比率混合并用羧肽酶A和B消化以去除其C末端8x组氨酸标签。通过凝胶过滤进入具有Superdex-75柱的HEPES缓冲盐水(HBS；10mM HEPES(pH7.4)，150mM NaCl)纯化消化的FD6：CD47复合物，并浓缩至22mg/mL。通过向等体积的2.0M硫酸铵和0.1M Tris(pH7.3)添加0.1μL蛋白质而获得晶体，并在石蜡油中冷冻保护。在Advanced Light Source(Berkeley，CA，USA)以光束8-2进行衍射研究。获得各向异性数据集并用HKL-3000加工。通过用来自蛋白质数据库(Protein Data Bank)登记代码2JJS的CD47和SIRPα的个体模型分子替代来解析FD6：CD47复合物。使用PHENIX进行细化并用COOT进行模型调节。使用散装溶剂扁平化进行溶剂校正。初始细化使用刚体、协调、和现实空间细化，以及个体原子替换参数细化。之后细化重复中增加了TLS细化。
细胞系和GFP-荧光素酶+转导。在补充了10％胎牛血清(Omega Scientific)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Invitrogen)的RPMI+GlutaMax(Invitrogen)中培养DLD-1细胞(ATCC)、HT-29细胞(ATCC)、Raji细胞(ATCC)、Jurkat细胞(ATCC)和639-V细胞(DSMZ)。通过使用工程化以表达eGFP-荧光素酶2(pgl4)融合蛋白的基于pCDH-CMV-MCS-EF1puro HIV的慢病毒载体(Systems Biosciences)转导来产生GFP-荧光素酶+细胞系。通过在FACSAria II细胞分选仪(BD Biosciences)上分选GFP表达而产生稳定的细胞系。
基于细胞的CD47结合测定。将各种浓度的生物素化SIRPα单体、SIRPα-hIgG4融合蛋白或抗CD47抗体与所示癌细胞一起孵育。使用100nM Alexa Fluor 647缀合的链霉亲和素作为第二染色试剂来检测生物素化单体的结合，并在Accuri C6流式细胞仪(BDBiosciences)上分析。使用山羊抗人IgG抗体(Invitrogen)检测SIRPα-hIgG4融合蛋白或抗CD47抗体的结合，并在带有高通量取样器的LSRFortessa(BD Biosciences)上分析。数据代表针对每类试剂最大结合标准化的平均荧光强度，并且使用Prism 5(Graphpad)将点拟合至S形剂量-响应曲线。
基于细胞的CD47阻断测定。将生物素化WTa1d1 SIRPα与Alex Fluor 647缀合的链霉亲和素一起孵育以形成WTa1d1 SIRPα四聚体。将100nM WTa1d1 SIRPα四聚体与滴定浓度的CD47拮抗剂组合并同时添加至50,000个GFP-荧光素酶+Raji细胞。在4℃下孵育细胞30分钟，然后洗涤以去除未结合的四聚体。用DAPI(Sigma)染色样品以排除死亡细胞，并使用带有高通量取样器的LSRFortessa(BD Biosciences)测定荧光。数据代表使用FlowJov9.4.10(Tree Star)分析的几何平均荧光强度，标准化为最大四聚体结合，并且使用Prism 5(Graphpad)拟合至S形剂量响应曲线。
巨噬细胞衍生和吞噬测定。从斯坦福血液中心获得来自匿名捐赠者的白细胞减少系统(LRS)室，并且在Ficoll-Paque Premium(GE Healthcare)上通过密度梯度离心富集外周血单核细胞。使用抗CD14微珠(Miltenyi)在AutoMACS(Miltenyi)上纯化单核细胞，并通过在补充了10％AB人血清(Invitrogen)和100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Invitrogen)的IMDM+GlutaMax(Invitrogen)中培养7-10天而分化成巨噬细胞。通过50,000个巨噬细胞与100,000个GFP+肿瘤细胞共培养2小时来进行吞噬测定，然后使用带有高通量取样器的LSRFortessa细胞分析仪(BD Biosciences)分析。用于治疗的抗体包括：小鼠IgG1同种型对照(eBioscience)、抗CD47克隆2D3(eBioscience)、抗EpCam(BioLegend)、西妥昔单抗(Bristoll-Myers Squibb)和利妥昔单抗(Genentech)。使用抗CD14、抗CD45或抗CD206抗体(BioLegend)通过流式细胞术鉴定巨噬细胞。通过用DAPI(Sigma)染色从分析中排除死亡细胞。使用FlowJo v9.4.10(Tree Star)将吞噬评价为GFP+巨噬细胞的百分比，并标准化为每个独立供体对每个细胞系的最大反应。通过具有Bonferroni事后检验的2因素ANOVA确定统计学显著性，当指示时，使用Prism 5(Graphpad)将数据拟合至S形剂量-响应曲线。
吞噬的活细胞成像。如之前所述，产生RFP+小鼠巨噬细胞并在活细胞成像测定中评价。简言之，从C57BL/Ka Rosa26 mRFP1转基因小鼠分离骨髓细胞并在10ng/mL鼠M-CSF(Peprotech)中分化。用0.5M CFSE(Invitrogen)标记500,000个Raji细胞并与50,000个RFP+巨噬细胞共培养并使用平衡至37℃和5％二氧化碳的BioStation IMQ(Nikon)成像。
小鼠。Nod.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1wjl/SzJ(NSG)小鼠用于所有体内实验。小鼠在大约6-10周龄时被植入肿瘤，并且用8-15只小鼠的年龄和性别匹配群组进行实验。将小鼠维持在屏障设施中，由斯坦福兽医服务中心(Stanford Veterinary Services Center)护理并根据斯坦福大学管理委员会批准的有关实验动物护理的协议处理。
肿瘤模型。为了模拟人结肠癌，将1·105个GFP-荧光素酶+DLD-1 细胞注射入NSG小鼠的腹腔。在配有DFC 500相机(Leica)的M205FA荧光解剖显微镜(Leica)上观察肿瘤结节。通过将1.25·105个GFP-荧光素酶+639-V细胞在25％Matrigel(BD Biosciences)中植入NSG小鼠的背部皮下组织来模拟膀胱癌。对于人淋巴瘤的局部模型，将1·106个GFP-荧光素酶+Raji细胞皮下植入下侧腹。在所有模型中，在证实植入后开始治疗并如所示继续。对于所有治疗，通过以每日方案腹膜内注射施用200μg SIRPα变体或抗体。通过生物发光成像监测肿瘤生长，并且测量肿瘤尺寸以根据椭球公式(π/6·长度·宽度2)计算体积。通过Mann-Whitney检验或用Dunn事后检验的Kruskal-Wallis(如适用)确定统计学显著性。通过Mantel-Cox检验分析存活。
血液分析。从眶丛抽血并收集于二钾-EDTA微量管(BD Biosciences)。使用HemaTrue分析仪(Heska)评价血液参数。通过用Bonferroni事后检验的2因素ANOVA确定统计学显著性。通过流式细胞术使用Alexa Fluor 647山羊抗人IgG抗体(Invitrogen)测定SIRPα-Fc变体与小鼠全血的结合。
生物发光成像。用在无菌PBS中以16.67mg/mL复水的200μL D-荧光素(萤火虫)钾盐(Biosynth)注射麻醉的小鼠。使用IVIS光谱(Caliper Life Sciences)在20分钟内进行生物发光成像以记录最大辐射。使用Living Image 4.0(Caliper Life Sciences)评估来自感兴趣的解剖区域的总通量峰值并用于分析。
蛋白质序列.在本文描述的实施例中使用的蛋白质中，包括以下：
FD6-hIgG4(FD6加下划线，人IgG4 S228P加粗)，其包括人IgG4的CH2、CH3和铰链区以及高亲和力SIRPαFD6的d1结构域：
(SEQ ID NO：40)
EEEVQIIQPDKSVSVAAGESAILHCTITSLFPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQRQGPFPRVTTISETTRR ENMDFSISISNITPADAGTYYCIKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSAAAPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CV1-hIgG4(CV-1加下划线，人IgG4 S228P加粗)，其包括人IgG4的CH2、CH3和铰链区以及高亲和力SIRPαCV1的d1结构域。注意，CV1氨基酸取代“构建”于人野生型等位基因2：
(SEQ ID NO：41)
EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKR NNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAAAPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
FD6-hIgG2(FD6加下划线，人IgG2加粗)，其包括人IgG2的CH2、CH3和铰链区以及高亲和力SIRPαFD6的d1结构域：
(SEQ ID NO：42)
EEEVQIIQPDKSVSVAAGESAILHCTITSLFPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQRQGPFPRVTTISETTRR ENMDFSISISNITPADAGTYYCIKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSAAAVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGMEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CV1-hIgG2(CV-1加下划线，人IgG2加粗)，其包括人IgG2的CH2、CH3和铰链区以及高亲和力SIRPαCV-1的d1结构域：
(SEQ ID N0：43)
EEELQIIQPDKSVLVAAGETATLRCTITSLFPVGPIQWFRGAGPGRVLIYNQRQGPFPRVTTVSDTTKR NNMDFSIRIGNITPADAGTYYCIKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAAAVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGMEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
GCN4亮氨酸拉链融合体：
FD6-拉链(FD6加下划线，GCN4亮氨酸拉链加粗)，其包括与GCN4融合的FD6的d1结构域，并且其利用亮氨酸拉链功能以二聚化：
(SEQ ID NO：44)
EEEVQIIQPDKSVSVAAGESAILHCTITSLFPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQRQGPFPRVTTISETTRRENMDFSIS ISNITPADAGTYYCIKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSAAA
串联体(concatamer)构建体：
FD6串联体(FD6加下划线，GGGGSGGGGS连接子，FD6加下划线)
(SEQ ID NO：45)
EEEVQIIQPDKSVSVAAGESAILHCTITSLFPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQRQGPFPRVTTISETTRRENMDFSIS ISNITPADAGTYYCIKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSGGGGSGGGGS EEEVQIIQPDKSVSVAAGESAILHC TITSLFPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQRQGPFPRVTTISETTRR ENMDFSISISNITPADAGTYYCIKFRKGSPDT EFKSGAGTELSVRAKPS
选定序列的表格
SEQ ID NO：1 天然序列，d1结构域 118个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：2 天然序列，全长蛋白质 504个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：3 1D4突变体d1结构域 118个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：4 1A5突变体d1结构域 118个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：5 2D3突变体d1结构域 118个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：6 2A10突变体d1结构域 118个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：7 2B5突变体d1结构域 118个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：8 2A2突变体d1结构域 118个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：9 2F5突变体d1结构域 118个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：10 CV1突变体d1结构域 119个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：37 FB3突变体d1结构域 118个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：38 FD6突变体d1结构域 118个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：39 FA4突变体d1结构域 118个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：40 FD6-hIgG4 345个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：41 CV1-hIgG4 346个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：42 FD6-hIgG2 344个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：43 CV1-hIgG2 345个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：44 GCN4亮氨酸拉链 158个氨基酸的蛋白质
SEQ ID NO：45 FD6串联体 246个氨基酸的蛋白质

Claims (15)

1.一种高亲和力SIRPα多肽，其中所述多肽缺少SIRPα跨膜结构域，包含人SIRPα的d1结构域，所述d1结构域在相对于SEQ ID NO:1中包括选自下列组的一组氨基酸取代突变：
·V27I；K53R；S66T；K68R；F103V；
·L4V；V27L；E47V；K53R；E54Q；S66G；K68R；V92I；
·L4V；V6I；A21V；V27I；I31T；E47L；K53R；H56P；S66T；K68R；F94L；
·V6I；V27I；I31S；E47V；K53R；E54Q；H56P；S66G；V92I；F94L；
·L4I；A21V；V27I；I31F；E47V；K53R；E54Q；H56R；S66G；F94V；F103V；
·L4V；V6I；V27I；I31F；E47V；K53R；H56R；S66G；K68R；V92I；F94L；或
·L4V；V6L；I31F；E47V；K53R；H56P；S66G；V92I；F103V；
·V6I；V27I；I31F；E47L；K53R；E54Q；H56P；S66T；
·L4V；V6I；V27I；I31F；E47V；K53R；E54Q；H56P；V63I；S66T；K68R；V92I；
·V6I；V27I；I31T；E47V；K53R；E54Q；H56P；S66G；K68R；V92I；F103V；或
·V6I；V27I；I31F；E47V；K53R；E54Q；H56P；S66T；V92I，其中所述的一组氨基酸取代增加了所述高亲和力SIRPα多肽相对于野生型SIRPα多肽与CD47结合的亲和力，并且其中所述高亲和力SIRPα多肽具有等于或小于11.6nM的针对CD47的KD。
2.一种高亲和力SIRPα多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:3-10和37-39任一列出的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的多肽，其由所述SIRPαd1结构域组成。
4.如权利要求1或2所述的多肽，其还包含来自SIRPα的在所述d1结构域之外的氨基酸序列。
5.如权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:10。
6.如权利要求1、2和5中任一项所述的多肽，其与免疫球蛋白Fc序列融合。
7.如权利要求1、2和5中任一项所述的多肽，其中所述高亲和力SIRPα多肽是多聚体的。
8.如权利要求1、2和5中任一项所述的多肽，其中所述高亲和力SIRPα多肽是单体的。
9.一种治疗性制剂，其包含如权利要求1、2和5中任一项所述的多肽。
10.如权利要求1、2和5中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含可检测标记。
11.权利要求9所述的制剂用于制备治疗表达CD47的癌的药物的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其还包括使所述表达CD47的癌与肿瘤特异性抗体接触。
13.如权利要求11所述的用途，其中所述用途是体外的。
14.如权利要求11所述的用途，其中所述用途是体内的。
15.如权利要求10所述的多肽的用途，用于制备使肿瘤成像的成像剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE13746964T2 (hu) 2012-02-06 2020-01-28 Inhibrx Inc CD47 antitestek és alkalmazási eljárásaik
DK2931752T3 (da) * 2012-12-17 2019-11-18 Trillium Therapeutics Inc Behandling af cd47+ sygdomsceller med sirp-alpha-fc-fusioner
CA2903773A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for achieving therapeutically effective doses of anti-cd47 agents
CA2910466A1 (en) 2013-04-29 2014-11-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Use of anti-cd47 agents to enhance immunization
EP3046627B1 (en) * 2013-09-18 2019-10-23 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Modulation of efferocytosis pathways for treatment of atherosclerotic disease
US10040862B2 (en) 2014-04-18 2018-08-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Humanized and chimeric monoclonal antibodies to CD99
TWI759810B (zh) * 2014-08-08 2022-04-01 美商Ａｌｘ腫瘤技術股份有限公司 信號調節蛋白α(signal-regulatory proteinα, SIRP-α)變體構築物及其用途
WO2016023001A1 (en) * 2014-08-08 2016-02-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Multispecific high affinity pd-1 agents and methods of use
US9546206B2 (en) 2014-08-08 2017-01-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High affinity PD-1 agents and methods of use
US10087257B2 (en) 2014-08-08 2018-10-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University SIRP alpha-antibody fusion proteins
ES2751915T5 (es) 2014-08-15 2022-12-23 Merck Patent Gmbh Proteínas de fusión de inmunoglobulina con SIRP alfa
WO2016033201A1 (en) 2014-08-26 2016-03-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Engraftment of stem cells with a combination of an agent that targets stem cells and modulation of immunoregulatory signaling
WO2016044021A1 (en) 2014-09-15 2016-03-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Targeting aneurysm disease by modulating phagocytosis pathways
EP3012271A1 (en) 2014-10-24 2016-04-27 Effimune Method and compositions for inducing differentiation of myeloid derived suppressor cell to treat cancer and infectious diseases
EP3209769B1 (en) 2014-10-24 2020-08-05 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Compositions and methods for inducing phagocytosis of mhc class i positive cells and countering anti-cd47/sirpa resistance
SG11201704058TA (en) * 2014-11-18 2017-06-29 Janssen Pharmaceutica Nv Cd47 antibodies, methods, and uses
WO2016109415A1 (en) * 2014-12-30 2016-07-07 Celgene Corporation Anti-cd47 antibodies and uses thereof
EP3261671B1 (en) 2015-02-27 2020-10-21 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Combination therapy for treatment of atherosclerosis
CN106146670B (zh) * 2015-04-24 2019-01-15 宜明昂科生物医药技术（上海）有限公司 一种新的重组双功能融合蛋白及其制备和应用
US10358472B2 (en) 2015-05-06 2019-07-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High affinity CD47 analogs
CN114425077A (zh) * 2015-05-18 2022-05-03 起源生物医药公司 Sirp多肽组合物和使用方法
BR102016018074A2 (pt) 2015-08-07 2021-11-16 ALX Oncology Inc. Construção variante de sirp-alfa, seu método de preparação e seus usos, molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, e composição farmacêutica
CN108350048B (zh) * 2015-08-07 2024-02-09 Alx肿瘤生物技术公司 具有SIRP-α结构域或其变体的构建体
AU2016310348B2 (en) 2015-08-26 2023-01-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enhanced depletion of targeted cells with CD47 blockade and an immune costimulatory agonist
CA3005911A1 (en) * 2015-12-11 2017-06-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of cancer with dual targeting of cd47 and egfr
CN114716552B (zh) 2016-01-11 2024-05-24 四十七公司 人源化、小鼠或嵌合抗cd47单克隆抗体
UA126658C2 (uk) 2016-04-14 2023-01-11 Осе Іммьюнотерапьютікс НОВІ АНТИТІЛА ДО SIRPa ТА ВАРІАНТИ ЇХ ТЕРАПЕВТИЧНОГО ЗАСТОСУВАННЯ
AU2017250809B2 (en) 2016-04-15 2024-02-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for determining and achieving therapeutically effective doses of anti-CD47 agents in treatment of cancer
US11649284B2 (en) 2016-04-18 2023-05-16 Baylor College Of Medicine Cancer gene therapy targeting CD47
WO2017190148A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for the prevention and treatment of surgical adhesions
US11560433B2 (en) 2016-05-27 2023-01-24 Albert Einstein College Of Medicine Methods of treatment by targeting VCAM1 and MAEA
US10148939B2 (en) 2016-07-19 2018-12-04 Gopro, Inc. Mapping of spherical image data into rectangular faces for transport and decoding across networks
US10995152B2 (en) 2016-10-26 2021-05-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Modified immunoglobulin hinge regions to reduce hemagglutination
CA3042581A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Trillium Therapeutics Inc. Enhancement of cd47 blockade therapy by proteasome inhibitors
US11779631B2 (en) 2016-11-03 2023-10-10 Pfizer Inc. CD47 blockade therapy by HDAC inhibitors
KR102129067B1 (ko) * 2016-12-29 2020-07-08 한국과학기술연구원 신규 엑소좀 계열 항암제
WO2018127916A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Kahr Medical Ltd. A pd1-cd70 fusion protein and methods of use thereof
ES2916217T3 (es) 2017-01-05 2022-06-29 Kahr Medical Ltd Una proteína de fusión SIRP1 ALPHA-41BBL y métodos de uso de la misma
HRP20230937T1 (hr) 2017-01-05 2023-11-24 Kahr Medical Ltd. Pd1-41bbl fuzijski protein i metode korištenja istog
AU2018205276A1 (en) 2017-01-06 2019-07-18 Synlogic Operating Company, Inc. Microorganisms programmed to produce immune modulators and anti-cancer therapeutics in tumor cells
EP3573629A4 (en) 2017-01-30 2020-10-14 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University NON-GENOTOXIC CONDITIONING REGIME FOR STEM CELL TRANSPLANTATION
US11286301B2 (en) * 2017-02-28 2022-03-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Antifibrotic activity of CD47 blockade
WO2018165015A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of pediatric brain tumors with targeting of cd47 pathway
AU2018290248A1 (en) 2017-06-21 2019-11-28 Forty Seven, Inc. Dosing parameters for CD47 targeting therapies to hematologic malignancies
US20200149053A1 (en) 2017-07-12 2020-05-14 Synlogic Operating Company, Inc. Microorganisms programmed to produce immune modulators and anti-cancer therapeutics in tumor cells
US11401329B2 (en) 2017-08-02 2022-08-02 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-CD47 antibodies and uses thereof
CN111051350B (zh) * 2017-09-07 2022-11-01 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 包含信号调节蛋白α的免疫缀合物
WO2019061012A1 (zh) * 2017-09-26 2019-04-04 南京凯地生物科技有限公司 靶向cd47的特异性嵌合抗原受体t细胞的制备及其应用
US11713356B2 (en) 2017-10-13 2023-08-01 Ose Immunotherapeutics Modified bifunctional anti-human signal regulatory protein alpha (SIRPa) antibody and method of use thereof for treating cancer
PL3697817T3 (pl) 2017-10-18 2023-01-23 Forty Seven, Inc. Terapia nowotworu złośliwego jajnika w oparciu o środek anty-cd47
US11771764B2 (en) 2017-11-06 2023-10-03 Pfizer Inc. CD47 blockade with radiation therapy
US11180552B2 (en) * 2017-12-01 2021-11-23 Seagen Inc. CD47 antibodies and uses thereof for treating cancer
EP3722312A4 (en) * 2017-12-08 2021-07-21 Hanx Biopharmaceutics, Inc ANTI-PD-1 / CD47 BIS SPECIFIC ANTIBODY AND APPLICATION THEREOF
CN109971716B (zh) * 2017-12-28 2023-08-01 上海细胞治疗研究院 自分泌cd47抗体的egfr特异性car-t细胞及其用途
WO2019157432A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 Forty Seven, Inc. Anti-cancer regimen using anti-cd47 and anti-cd20 antibodies
CN108484774B (zh) * 2018-03-09 2021-11-05 上海高菲生物科技有限公司 一种SIRPα融合蛋白及其制备方法和用途
EP3765080A4 (en) * 2018-03-13 2022-03-16 Trillium Therapeutics Inc. IMPROVEMENTS IN THERAPY FOR CD47 BLOCKADE BY EGFR ANTIBODIES
AU2019233577A1 (en) 2018-03-13 2020-09-03 Ose Immunotherapeutics Use of anti-human SIRPa v1 antibodies and method for producing anti-SIRPa v1 antibodies
CN108872569A (zh) * 2018-06-19 2018-11-23 浠思（上海）生物技术有限公司 利用HTRF一步法筛选CD47/SIRP alpha阻断剂的方法
KR102129522B1 (ko) * 2018-07-26 2020-07-02 한국과학기술연구원 암세포 특이적 항암 단백질-형광 복합체 및 이를 포함하는 암의 진단 및 영상화용 조성물
EP3843772A2 (en) 2018-08-31 2021-07-07 ALX Oncology Inc. Decoy polypeptides
WO2020047651A1 (en) 2018-09-04 2020-03-12 Trillium Therapeutics Inc. Cd47 blockade with parp inhibition for disease treatment
CN109306017B (zh) * 2018-10-12 2021-02-09 倍而达药业（苏州）有限公司 一种基于SIRP-αD1突变体制备的重组蛋白及应用
JPWO2020095922A1 (ja) * 2018-11-07 2021-09-30 第一三共株式会社 ペプチドの血中動態改善方法
US20220023348A1 (en) 2018-11-28 2022-01-27 Forty Seven, Inc. Genetically modified hspcs resistant to ablation regime
CA3122914A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Ose Immunotherapeutics Bifunctional anti-pd-1/sirp.alpha. molecule
BR112021024003A2 (pt) 2019-05-31 2022-04-19 Alx Oncology Inc Métodos de tratamento de câncer com fusão sirp alfa-fc em combinação com um inibidor de checkpoint imunológico
EP3980747A1 (en) 2019-06-07 2022-04-13 ALX Oncology Inc. Methods and reagents for reducing the interference of drugs that bind cd47 in serological assays
WO2020257196A1 (en) * 2019-06-17 2020-12-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of treating infections by blocking pathogen mimics of cd47
WO2021011544A1 (en) 2019-07-16 2021-01-21 Gilead Sciences, Inc. Hiv vaccines and methods of making and using
JP7371243B2 (ja) 2019-10-18 2023-10-30 フォーティ セブン， インコーポレイテッド 骨髄異形成症候群及び急性骨髄性白血病を治療するための併用療法
CN114599392A (zh) 2019-10-31 2022-06-07 四十七公司 基于抗cd47和抗cd20的血癌治疗
MX2022006078A (es) 2019-11-27 2022-08-02 Alx Oncology Inc Terapias de combinacion para el tratamiento del cancer.
MX2022007930A (es) 2019-12-24 2022-08-08 Carna Biosciences Inc Compuestos moduladores de diacilglicerol quinasa.
WO2021163064A2 (en) 2020-02-14 2021-08-19 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies and fusion proteins that bind to ccr8 and uses thereof
JP2023528341A (ja) 2020-06-01 2023-07-04 エーエルエックス オンコロジー インコーポレイテッド 低メチル化剤を含むがんを治療するための併用療法
WO2022010806A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 ALX Oncology Inc. Methods for reducing the interference of drugs that bind therapeutic targets expressed on blood cells in serological assays
KR102557016B1 (ko) * 2020-09-22 2023-07-20 비피진 주식회사 암 치료를 위한 cd47 바인더 및 리포좀 복합체
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
WO2022120286A1 (en) 2020-12-06 2022-06-09 ALX Oncology Inc. Multimers for reducing the interference of drugs that bind cd47 in serological assays
CA3212351A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Mendus B.V. Methods of vaccination and use of cd47 blockade
TW202302145A (zh) 2021-04-14 2023-01-16 美商基利科學股份有限公司 ＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合及ＮＥＤＤ８活化酶Ｅ１調節次單元之共抑制以用於治療癌症
JP2024515211A (ja) 2021-04-27 2024-04-05 ファイザー・インク Ｄｈｆｒ阻害剤を用いたｃｄ４７遮断療法の増強
US20220363779A1 (en) 2021-05-13 2022-11-17 ALX Oncology Inc. Combination therapies for treating cancer
EP4359413A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
CA3222439A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
AU2022299051A1 (en) 2021-06-23 2023-12-07 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
WO2022271677A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
WO2023003331A1 (en) * 2021-07-19 2023-01-26 Yuhan Corporation Sirp-alpha variants and use thereof
AU2022375782A1 (en) 2021-10-28 2024-05-02 Gilead Sciences, Inc. Pyridizin-3(2h)-one derivatives
WO2023073580A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Pfizer Inc. Enhancement of cd47 blockade with taxanes for cd47+ cancer therapy
AU2022376954A1 (en) 2021-10-29 2024-05-02 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
TW202330631A (zh) * 2021-11-01 2023-08-01 大陸商江蘇先聲藥業有限公司 ＳＩＲＰａ突變體及其應用
WO2023079438A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Pfizer Inc. Enhancement of cd47 blockade therapy with anti-vegf agents
WO2023107956A1 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and 5t4
WO2023107954A1 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibodies targeting 5t4 and uses thereof
AU2022421675A1 (en) * 2021-12-21 2024-05-02 Fbd Biologics Limited ENGINEERED SIRPα VARIANTS AND METHODS OF USE THEREOF
AU2022417491A1 (en) 2021-12-22 2024-05-23 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
WO2023122581A2 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
WO2023121890A1 (en) * 2021-12-23 2023-06-29 Fbd Biologics Limited Cd47/4-1bb-targeting protein complex and methods of use thereof
AU2022435471A1 (en) * 2022-01-18 2024-05-30 Fbd Biologics Limited Cd47/pd-l1-targeting protein complex and methods of use thereof
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
WO2023154578A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Sana Biotechnology, Inc. Methods of treating patients exhibiting a prior failed therapy with hypoimmunogenic cells
WO2023178181A1 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
WO2023183313A1 (en) 2022-03-22 2023-09-28 Sana Biotechnology, Inc. Engineering cells with a transgene in b2m or ciita locus and associated compositions and methods
WO2023183890A1 (en) * 2022-03-24 2023-09-28 Bitterroot Bio, Inc. Multivalent sirp-alpha fusion polypeptides
WO2023183892A1 (en) 2022-03-24 2023-09-28 Bitterroot Bio, Inc. Sirp-alpha fusion polypeptides with modified fc domains
US20230355796A1 (en) 2022-03-24 2023-11-09 Gilead Sciences, Inc. Combination therapy for treating trop-2 expressing cancers
TW202345901A (zh) 2022-04-05 2023-12-01 美商基利科學股份有限公司 用於治療結腸直腸癌之組合療法
TW202400138A (zh) 2022-04-21 2024-01-01 美商基利科學股份有限公司 Ｋｒａｓ ｇ１２ｄ調節化合物
WO2023228044A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Pfizer Inc. Dosing regimens of sirp alpha fusion proteins for treatment of cancer
WO2023235754A1 (en) 2022-06-01 2023-12-07 ALX Oncology Inc. Combination therapies for treating urothelial carcinoma
WO2024006929A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
WO2024015741A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Gilead Sciences, Inc. Hiv immunogenic polypeptides and vaccines and uses thereof
WO2024040151A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Pfizer Inc. Sirp alpha fusion protein and anti-cd38 antibody combination therapies
WO2024064668A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Gilead Sciences, Inc. FOCAL IONIZING RADIATION AND CD47/SIRPα DISRUPTION ANTICANCER COMBINATION THERAPY

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102257001A (zh) * 2008-12-19 2011-11-23 诺瓦提斯公司 治疗自体免疫和炎性病症的可溶性多肽

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6541615B1 (en) * 1996-11-15 2003-04-01 Max-Planck-Gellschaft Zur Foderung Der Wissenschaften E.V. SIRP proteins and uses thereof
EP1192176A4 (en) * 1999-06-11 2003-03-05 Human Genome Sciences Inc 49 HUMAN SECRETED PROTEINS
EP1658308A1 (en) * 2003-08-25 2006-05-24 Pieris ProteoLab AG Muteins of a bilin-binding protein with affinity for a given target
US8377448B2 (en) * 2006-05-15 2013-02-19 The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University CD47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders
CA2702217A1 (en) * 2007-10-11 2009-04-16 Jayne Danska Modulation of sirp.alpha. - cd47 interaction for increasing human hematopoietic stem cell engraftment and compounds therefor
WO2010130053A1 (en) * 2009-05-15 2010-11-18 University Health Network COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HEMATOLOGIC CANCERS TARGETING THE SIRPα - CD47 INTERACTION
WO2016033201A1 (en) * 2014-08-26 2016-03-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Engraftment of stem cells with a combination of an agent that targets stem cells and modulation of immunoregulatory signaling
AU2016310348B2 (en) * 2015-08-26 2023-01-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enhanced depletion of targeted cells with CD47 blockade and an immune costimulatory agonist
KR102024554B1 (ko) * 2018-02-26 2019-09-24 엘지전자 주식회사 유도 가열 장치 및 유도 가열 장치의 제어 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102257001A (zh) * 2008-12-19 2011-11-23 诺瓦提斯公司 治疗自体免疫和炎性病症的可溶性多肽

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Structure of Signal-regulatory protein αa link to antigen receptor evolution;Hatherley D et al.;《J Biol Chem》;20090623;第284卷(第39期);第26616页右栏第2段，图3 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013209736A1 (en) 2014-08-07
LT2804617T (lt) 2020-09-10
EP2804617B9 (en) 2021-04-07
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CA2861307A1 (en) 2013-07-25
SI2804617T1 (sl) 2020-10-30
US20180195054A1 (en) 2018-07-12
JP6742279B2 (ja) 2020-08-19
EP2804617B1 (en) 2020-06-24
JP2020007329A (ja) 2020-01-16
HUE050875T2 (hu) 2021-01-28
PT2804617T (pt) 2020-09-10
EP2804617A1 (en) 2014-11-26
HK1201757A1 (zh) 2015-09-11
US9944911B2 (en) 2018-04-17
JP6918179B2 (ja) 2021-08-11
JP2018021016A (ja) 2018-02-08
WO2013109752A1 (en) 2013-07-25
JP2020143104A (ja) 2020-09-10
JP6460796B2 (ja) 2019-01-30
US11208481B2 (en) 2021-12-28
CA2861307C (en) 2021-05-25
AU2013209736C1 (en) 2017-12-14
EP3766511A1 (en) 2021-01-20
JP6783361B2 (ja) 2020-11-11
US20220064293A1 (en) 2022-03-03
JP2021176873A (ja) 2021-11-11
AU2013209736B2 (en) 2017-09-07
ES2816647T3 (es) 2021-04-05
DK2804617T3 (da) 2020-08-10
HK1253217A1 (zh) 2019-06-14
JP2015504899A (ja) 2015-02-16
CN107880100A (zh) 2018-04-06
CN104136037A (zh) 2014-11-05
US20150071905A1 (en) 2015-03-12
PL2804617T3 (pl) 2020-11-30
EP2804617A4 (en) 2015-11-25
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