KR102368983B1

KR102368983B1 - 항균활성을 갖는 폴리펩타이드, 이를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물, 및 항균용 조성물

Info

Publication number: KR102368983B1
Application number: KR1020200023629A
Authority: KR
Inventors: 박영민; 김양미; 정인덕; 이승현
Original assignee: 단디바이오사이언스 주식회사
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2020-02-26
Publication date: 2022-03-03
Also published as: EP3932936A1; EP3932936A4; CA3139464A1; CN113544139A; KR20200105423A; KR102368983B9; AU2020227591B2; AU2020227591A1

Abstract

본 발명은 항균활성을 갖는 펩타이드, 이를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물, 및 항균용 조성물 등을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 펩타이드는 박테리아의 증식 억제뿐 아니라 박테리아 유래의 내독소를 제거하는 우수한 효과를 가지고 있어 뛰어난 패혈증 치료 효과를 발휘하는바 패혈증의 예방 또는 치료에 유용하게 이용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 그람 양·음성균에 대해 선택적으로 우수한 항균활성을 가지고 있어, 그람 양·음성균에 대한 항균용 조성물 또는 그람 양·음성균에 의해 유발되는 다양한 감염성 질환들의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 단백질 분해효소에 대해서 우수한 저항성을 나타내므로 높은 안정성을 가져 약학적 조성물, 화장학적 조성물, 식품 조성물, 건강식품 조성물, 사료 조성물 및 의약외품 조성물 등 다양한 형태로 활용가능할 것으로 기대된다.

Description

항균활성을 갖는 폴리펩타이드, 이를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물, 및 항균용 조성물{Polypeptide having antibacterial activity, composition for preventing or treating sepsis comprising the same, and antibacterial composition}

본 발명은 항균활성을 갖는 폴리펩타이드, 이를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물, 및 항균용 조성물 등에 관한 것이다.

패혈증(sepsis)은 병원성 그람 음성 세균이 생체에 감염된 경우 세포벽 성분인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)가 독소로 작용하여 생체의 면역체계가 과도하게 활성화됨으로써 유발되는 염증 반응으로서, 전신에 감염증을 일으키거나 증상이 심할 경우 쇼크를 동반하기도 한다. 구체적으로 패혈증은 악성종양, 백혈병, 악성림프종, 후천성면역부전증후군(AIDS), 교원병, 신부전, 간질환, 뇌혈관장해, 당뇨병 등의 기초질환을 가진 환자나 고령자, 미숙아 같은 체액성면역부전 또는 세포성면역부전을 가진 저항력이 약한 숙주가 부신스테로이드나 항종양제의 화학요법, 코발트 조사 등의 방사선치료 또는 유치카테테르, 혈액투석, 장기이식, 심장수술 등의 처치, 수술을 받은 경우에 주로 발병한다. 패혈증은 병원 중환자 병동에 입원한 환자가 사망하는 주요한 원인이 되며, 이에 의한 치사율이 보통 30% 이상인 매우 심각한 질병이다. 의학기술의 발전에도 불구하고 아직도 전 세계적으로 수술 후유증으로 감염이 되어 패혈증이 발생하는 경우가 많으며, 신생아나 노인들과 같이 체내의 면역력이 약한 사람이 감염되었을 경우 패혈증으로 진행되는 경우도 많다. 대표적으로, 신생아 패혈증의 경우 만삭아 1,000명 중 3명 정도가 발생하는 것으로 알려져 있고, 미숙아는 발병률이 3 내지 4배 증가하는 것으로 알려져 있다.

패혈증에 걸렸을 경우 대개 항생제 치료를 받게 되지만, 적절한 처치가 늦어져 균들이 많이 증식했을 경우나 항생제에 내성이 강한 균주에 의해 감염이 되었을 경우에는 항생제만으로는 효과적인 치료를 할 수 없으며, 다양한 항생제에 대한 내성을 갖는 병원균이 점차 증가하고 있어 새로운 패혈증 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

한편, 항균제 내성 세균이란 특정 항균제에 내성을 보여 약효가 듣지 않는 세균을 말한다. 예를 들어, 페니실린의 약효가 전혀 듣지 않는 페니실린 내성 황색포도상구균이 이에 해당된다. 이 외에도, 1961년 최초로 학계에 보고되었으며, 그 후로 전 세계적으로 주요 병원성 감염균이 되고 있는 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)이 보고된 바 있고, 1988년 반코마이신에 내성을 보이는 장구균(vancomycin resistant enterococcus, VRE)이 유럽에서 처음으로 발견되었고, 또한, 인체 감염의 가장 흔한 원인균인 황색포도상구균의 마지막 치료제로 알려진 반코마이신에 고도의 내성을 보이는 포도상구균(vancomycin-resistant staphylococcus aureus, VRSA)이 2002년 미국 질병 통제국(Centers for Disease Control)에서 세계 최초로 보고됨으로써 소위 슈퍼 박테리아의 확산 가능성이 매우 높아지고 있다.

대한민국 공개특허 제10-2014-0134923호, 공개일(2014.11.25)

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 요구를 충족시키기 위하여 연구를 거듭한 결과, 특정 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 박테리아의 증식 억제뿐 아니라, 죽은 박테리아로부터 분리된 내독소를 제거하는 우수한 효과를 가지고 있어 패혈증 치료에 효과적이라는 점과, 그람 양음성균에 대해 선택적으로 우수한 항균활성을 보임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 항균활성을 갖는 펩타이드, 이를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물, 항균용 조성물 등을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드를 제공한다:

[일반식]

Ln-X1-L-X2-V-X3-X4-X5-R-X6-L-X7

상기 일반식에서,

n은 0 또는 1;

L은 류신(leucine);

V는 발린(valine);

R은 아르기닌(arginine);

X1은 라이신(lysine: K) 또는 아르기닌(arginine: R);

X2는 글리신(glycine: G) 또는 아르기닌(arginine: R);

X3은 글루탐산(glutamic acid: E) 또는 라이신(lysine: K);

X4는 알라닌(alanine: A) 또는 류신(leucine: L);

X5는 라이신(lysine: K) 또는 아르기닌(arginine: R);

X6은 티로신(tyrosine: Y), 알라닌(alanine: A), 트립토판(tryptophan: W), 라이신(lysine: K) 또는 아스파탐(aspartic acid: D); 및

X7은 아스파탐(aspartic acid: D) 또는 아르기닌(arginine: R),

단, 상기 일반식에서 K-L-G-V-E-A-K-R-Y-L-D의 서열로 표시되는 폴리펩타이드는 제외함.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 하기 ⅰ 내지 ⅸ으로 이루어진 9종의 폴리펩타이드 중 어느 하나의 폴리펩타이드를 제공한다 :

ⅰ) 상기 일반식에서,

n은 0;

X1은 라이신(lysine: K);

X2는 글리신(glycine: G);

X3은 글루탐산(glutamic acid: E);

X4는 알라닌(alanine: A);

X5는 라이신(lysine: K);

X6은 티로신(tyrosine: Y), 및

X7은 아르기닌(arginine: R)인,

폴리펩타이드;

ⅱ) 상기 일반식에서,

n은 1;

X1은 아르기닌(arginine: R);

X2는 글리신(glycine: G);

X3은 글루탐산(glutamic acid: E);

X4는 알라닌(alanine: A);

X5는 라이신(lysine: K);

X6은 티로신(tyrosine: Y), 및

X7은 아르기닌(arginine: R)인,

폴리펩타이드;

ⅲ) 상기 일반식에서,

n은 1;

X1은 아르기닌(arginine: R);

X2는 글리신(glycine: G);

X3은 글루탐산(glutamic acid: E);

X4는 류신(leucine: L);

X5는 라이신(lysine: K);

X6은 티로신(tyrosine: Y), 및

X7은 아르기닌(arginine: R)인,

폴리펩타이드;

ⅳ) 상기 일반식에서,

n은 0;

X1은 라이신(lysine: K);

X2는 글리신(glycine: G);

X3은 글루탐산(glutamic acid: E);

X4는 알라닌(alanine: A);

X5는 류신(leucine: L);

X6은 티로신(tyrosine: Y), 및

X7은 아스파탐(aspartic acid: D)인,

폴리펩타이드;

ⅴ) 상기 일반식에서,

n은 0;

X1은 아르기닌(arginine: R);

X2는 아르기닌(arginine: R);

X3은 라이신(lysine: K);

X4는 류신(leucine: L);

X5는 아르기닌(arginine: R);

X6은 티로신(tyrosine: Y), 및

X7은 아르기닌(arginine: R)인,

폴리펩타이드;

ⅵ) 상기 일반식에서,

n은 0;

X1은 라이신(lysine: K);

X2는 아르기닌(arginine: R);

X3은 라이신(lysine: K);

X4는 류신(leucine: L);

X5는 아르기닌(arginine: R);

X6은 티로신(tyrosine: Y), 및

X7은 아르기닌(arginine: R)인,

폴리펩타이드;

ⅶ) 상기 일반식에서,

n은 0;

X1은 라이신(lysine: K);

X2는 아르기닌(arginine: R);

X3은 라이신(lysine: K);

X4는 류신(leucine: L);

X5는 아르기닌(arginine: R);

X6은 알라닌(alanine: A), 및

X7은 아르기닌(arginine: R)인,

폴리펩타이드;

ⅷ) 상기 일반식에서,

n은 0;

X1은 라이신(lysine: K);

X2는 아르기닌(arginine: R);

X3은 라이신(lysine: K);

X4는 류신(leucine: L);

X5는 아르기닌(arginine: R);

X6은 트립토판(tryptophan: W) , 및

X7은 아르기닌(arginine: R)인,

폴리펩타이드; 및

ⅸ) 상기 일반식에서,

n은 0;

X1은 라이신(lysine: K);

X2는 아르기닌(arginine: R);

X3은 라이신(lysine: K);

X4는 류신(leucine: L);

X5는 아르기닌(arginine: R);

X6은 라이신(lysine: K), 및

X7은 아르기닌(arginine: R)인,

폴리펩타이드.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 L형, D형 및 펩토이드(peptoid)를 포함하는 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산인, 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 폴리펩타이드의 말단을 알킬레이션(Alkylation), 페길레이션(PEGylation), 또는 아미데이션(Amidation)한 것인, 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 폴리펩타이드의 C 말단에 아민기(NH₂)가 추가된 것인, 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 하기 특징 중 하나 이상의 특징을 가지는 것인, 폴리펩타이드를 제공한다 :

그람 음성균의 리포폴리사카라이드(LPS)에의 결합능;

박테리아 세포막의 선택적 파괴능;

단백질 분해효소에 대한 저항성;

그람 양성균의 세포막 파괴능; 및

그람 양성균 유래 LTA(lipotechoic acid) 또는 LPP(lipoprotein)에의 결합능.

또한, 본 발명은 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid: TFA)의 아세테이트 염 치환물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드 또는 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물을 유효성분으로 포함하는, 패혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드 또는 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물을 유효성분으로 포함하는, 패혈증의 예방, 개선 또는 치료용 약학적/식품/건강식품/화장품/의약외품/사료 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드 또는 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드 또는 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물의 패혈증에 대한 예방, 개선 또는 치료 용도를 제공한다.

나아가, 본 발명은 패혈증의 예방, 개선 또는 치료용 제제의 제조를 위한 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드 또는 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드 또는 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물을 유효성분으로 포함하는, 항균용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드 또는 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물을 유효성분으로 포함하는, 항균용 약학적/식품/건강식품/화장품/의약외품/사료 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드 또는 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 항균방법을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드 또는 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물의 항균용도를 제공한다.

나아가, 본 발명은 항균제의 제조를 위한 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드 또는 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물의 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 항균용 조성물의 항균 대상 균은 Escherichia coli DH5α, Escherichia coli K1, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus 및 Staphylococcus epidermidis 로 이루어진 군에서 선택된 1이상인, 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 항균용 조성물의 항균 대상 균은 광범위 베타락탐계 항생제 분해효소(ESBL;Extended Spectrum Beta Lactamase) 내성 균, 카바페넴 내성 균 및 콜리스틴 내성 균으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 항생제 내성 균인, 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 항생제 내성 균은 ESBL (E. coli), Carbapenem resistant (CR)-Acinetobactor baumannii, CR-Klebsiella pneumoniae, CR-Pseudomonas aeruginosa, 및 Colistin resistant Acinetobactor baumannii 로 이루어진 군에서 선택된 1이상인, 항균용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드 또는 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물을 유효성분으로 포함하는, 감염성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드 또는 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물을 유효성분으로 포함하는, 감염성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적/식품/건강식품/화장품/의약외품/사료 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드 또는 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드 또는 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물의 감염성 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료 용도를 제공한다.

나아가, 본 발명은 감염성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 제제의 제조를 위한 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드 또는 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물의 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 감염성 질환은, 폐렴, 복막염, 뇌막염, 창상감염, 골관절염, 담낭염, 요로감염증, 뇌수막염, 심내막염, 심근염, 심외막염, 관절염, 인구염, 임질, 세균성 이질, 장염, 결막염, 위염, 중이염, 방광염, 및 림프관염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 그람 음성균에 의해 유발되는 감염성 질환인, 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 감염성 질환은, 인후염, 농가진, 류마티스열, 사구체신염, 신생아패혈증, 수막염, 인두염, 폐렴, 심내막염, 성홍열, 피부연조직감염, 심부연조직감염, 농흉 및 질염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 그람 양성균에 의해 유발되는 감염성 질환인, 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 상기 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 펩타이드는, 표준 박테리아 및 항생제 내성 박테리아의 증식 억제뿐 아니라, 박테리아 유래 내독소를 제거하는 우수한 효과를 가지고 있어 우수한 패혈증 치료 효과를 가지고 있고, 항생제와 병용할 경우 항생제에 의한 부작용을 최소화할 수 있어 패혈증의 예방 또는 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 그람 양음성균에 대해 선택적으로 우수한 항균활성을 가지고 있어, 그람 양음성균에 대한 항균용 조성물 또는 그람 양음성균에 의해 유발되는 다양한 감염성 질환들의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 인체에 안전할 뿐만 아니라, 단백질 분해효소에 대해서도 안정성을 나타내므로, 다양한 용도로 활용될 수 있다.

도 1은, 본 발명 실시예 4의 용혈활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
상단 좌측부터 우측방향으로, FP12-NH₂ (서열번호 6)/allD_FP12-NH₂(서열번호 8); 및 FP13-NH₂(서열번호 7)/allD_FP13-NH₂(서열번호 9).
하단 좌측부터 우측방향으로, allD_FP13_9A (서열번호 10)/ allD_FP13_9D (서열번호 18); 및 allD_FP13_9W (서열번호 11)/ allD_FP13_9K (서열번호 12).
도 2는, 본 발명 실시예 5의 원편광 이색성 분광기에서 펩타이드의 2차 구조를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은, 본 발명 실시예 6의 박테리아 세포막(상단)과 적혈구 세포막(하단)을 모방하는 리포좀에 대한 펩타이드의 파괴능 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는, 본 발명 실시예 8의 allD FP13-NH₂펩타이드의 항생효과를 나타낸 도면이다. 각각 (A) 표준균주 Escherichia coli K1에 대한 allD FP13-NH₂ 펩타이드의 항생효과; (B) 임상균주 Escherichia coli (ESBL)에 대한 allD FP13-NH₂펩타이드의 항생효과; 및 (C) 임상균주 Carbapenem-resistant Acinetobacter baummanii 에 대한 allD FP13-NH₂펩타이드의 항생효과를 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명 실시예 9의 allD FP13-NH₂(AcOH) 펩타이드의 항생효과, 독성효과 및 항염증 싸이토카인 억제효과 확인 결과를 나타낸 것이다.
(A) Escherichia coli (ESBL) 에 대한 항생효과 비교, AllD FP13-NH₂(TFA)(위) 및 AllD FP13-NH₂(AcOH)(아래);
(B) in vivo 독성 비교, AllD FP13-NH₂(TFA)(위) 및 AllD FP13-NH₂(AcOH)(아래); 및
(C) 항염증 싸이토카인(IL-6) 억제 효과 비교, AllD FP13-NH₂(TFA)(위) 및 AllD FP13-NH₂(AcOH)(아래).
도 6은, 본 발명 실시예 11의 그람 양성균 세포막을 모방하는 리포좀에 대한 펩타이드의 파괴능 측정 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 하기의 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드를 제공한다 :

[일반식]

Ln-X1-L-X2-V-X3-X4-X5-R-X6-L-X7

상기 일반식에서,

n은 0 또는 1;

L은 류신(leucine);

V는 발린(valine);

R은 아르기닌(arginine);

X1은 라이신(lysine: K) 또는 아르기닌(arginine: R);

X2는 글리신(glycine: G) 또는 아르기닌(arginine: R);

X3은 글루탐산(glutamic acid: E) 또는 라이신(lysine: K);

X4는 알라닌(alanine: A) 또는 류신(leucine: L);

X5는 라이신(lysine: K) 또는 아르기닌(arginine: R);

X7은 아스파탐(aspartic acid: D) 또는 아르기닌(arginine: R),

본 발명의 일 구현에에 있어서, 하기 ⅰ 내지 ⅸ으로 이루어진 9종의 폴리펩타이드 중 어느 하나 이상의 폴리펩타이드를 제공한다 :

ⅰ) 상기 일반식에서,

n은 0;

X1은 라이신(lysine: K);

X2는 글리신(glycine: G);

X3은 글루탐산(glutamic acid: E);

X4는 알라닌(alanine: A);

X5는 라이신(lysine: K);

X6은 티로신(tyrosine: Y), 및

X7은 아르기닌(arginine: R)인,

폴리펩타이드로,

즉, KLGVEAKRYLR (서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 ;

ⅱ) 상기 일반식에서,

n은 1;

X1은 아르기닌(arginine: R);

X2는 글리신(glycine: G);

X3은 글루탐산(glutamic acid: E);

X4는 알라닌(alanine: A);

X5는 라이신(lysine: K);

X6은 티로신(tyrosine: Y), 및

X7은 아르기닌(arginine: R)인,

폴리펩타이드로,

즉, LRLGVEAKRYLR (서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 ;

ⅲ) 상기 일반식에서,

n은 1;

X1은 아르기닌(arginine: R);

X2는 글리신(glycine: G);

X3은 글루탐산(glutamic acid: E);

X4는 류신(leucine: L);

X5는 라이신(lysine: K);

X6은 티로신(tyrosine: Y), 및

X7은 아르기닌(arginine: R)인,

폴리펩타이드로

즉, LRLGVELKRYLR (서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 ;

ⅳ) 상기 일반식에서,

n은 0;

X1은 라이신(lysine: K);

X2는 글리신(glycine: G);

X3은 글루탐산(glutamic acid: E);

X4는 알라닌(alanine: A);

X5는 류신(leucine: L);

X6은 티로신(tyrosine: Y), 및

X7은 아스파탐(aspartic acid: D)인,

폴리펩타이드로

즉, KLGVEALRYLD (서열번호 5)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 ;

ⅴ) 상기 일반식에서,

n은 0;

X1은 아르기닌(arginine: R);

X2는 아르기닌(arginine: R);

X3은 라이신(lysine: K);

X4는 류신(leucine: L);

X5는 아르기닌(arginine: R);

X6은 티로신(tyrosine: Y), 및

X7은 아르기닌(arginine: R)인,

폴리펩타이드로

즉, RLRVKLRRYLR (서열번호 15)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 ;

ⅵ) 상기 일반식에서,

n은 0;

X1은 라이신(lysine: K);

X2는 아르기닌(arginine: R);

X3은 라이신(lysine: K);

X4는 류신(leucine: L);

X5는 아르기닌(arginine: R);

X6은 티로신(tyrosine: Y), 및

X7은 아르기닌(arginine: R)인,

폴리펩타이드로

즉, KLRVKLRRYLR (서열번호 16)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 ;

ⅶ) 상기 일반식에서,

n은 0;

X1은 라이신(lysine: K);

X2는 아르기닌(arginine: R);

X3은 라이신(lysine: K);

X4는 류신(leucine: L);

X5는 아르기닌(arginine: R);

X6은 알라닌(alanine: A), 및

X7은 아르기닌(arginine: R)인,

폴리펩타이드로

즉, KLRVKLRRALR (서열번호 10)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 ;

ⅷ) 상기 일반식에서,

n은 0;

X1은 라이신(lysine: K);

X2는 아르기닌(arginine: R);

X3은 라이신(lysine: K);

X4는 류신(leucine: L);

X5는 아르기닌(arginine: R);

X6은 트립토판(tryptophan: W) , 및

X7은 아르기닌(arginine: R)인,

폴리펩타이드로

즉, KLRVKLRRWLR (서열번호 11)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 ; 및

ⅸ) 상기 일반식에서,

n은 0;

X1은 라이신(lysine: K);

X2는 아르기닌(arginine: R);

X3은 라이신(lysine: K);

X4는 류신(leucine: L);

X5는 아르기닌(arginine: R);

X6은 라이신(lysine: K), 및

X7은 아르기닌(arginine: R)인,

폴리펩타이드로

즉, KLRVKLRRKLR (서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드.

본 명세서에서 사용된 용어, "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형(linear)의 분자를 의미한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 분자생물학적인 방법과 함께 당업계에 공지된 화학적 합성 방법(예를 들어, 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques))에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

또한, 본 발명의 폴리펩타이드의 범위에는 본 발명의 폴리펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 갖는 생물학적 기능 균등물이 포함될 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하 및 크기 등에 기초하여 이루어질 수 있다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다. 또한, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 알려져 있다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 90%의 상동성 또는 95%의 상동성을 나타내는 서열을 의미할 수 있다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다(Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992); Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)).

또한, 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드는 L형, D형 및 펩토이드(peptoid)를 포함하는 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산일 수 있다.

상기 D형 폴리펩타이드는 L형 폴리펩타이드와 아미노산 서열이 동일한 거울상 이성질체로서 allomeric type의 폴리펩타이드를 의미한다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 예를 들어, FP12-NH₂(서열번호 6) 와 아미노산 서열이 동일한 allomeric type의 폴리펩타이드로서 allD FP12-NH₂(서열번호 8)을 제공한다.

본 명세서에서 폴리펩타이드를 명명하며 사용된 용어, "allD"는 D형 폴리펩타이드를 지칭한다.

상기 L형, D형 및 펩토이드(peptoid)를 포함하는 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산의 폴리펩타이드는 정해진 아미노산 서열에 따라 당업계 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 말단을 알킬레이션(Alkylation), 페길레이션(PEGylation) 또는 아미데이션(Amidation)한 것일 수 있다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 중 allD FP13-NH₂ (AcOH) (서열번호 13)의 N 말단을 페길레이션하여, PEG-allD FP13-NH₂ (AcOH) (서열번호 14)를 제공한다. 이에 제한되지 않지만, 상기 페길레이션을 위하여 본 발명에 따른 폴리펩타이드와 Fmoc-NH-PEG2-CH₂COOH 을 반응시킬 수 있으며, 이때 polyethylene glycol의 Mw(분자량)은 385.4Da 이다.

선택되는 폴리펩타이드에 따라 통상의 기술자가 페길레이션을 위한 조건을 조절할 수 있으며, 페길레이션하는 방법은 당업계 공지된 다양한 방법에 따를 수 있다.

알킬레이션 또는 아미데이션, 역시, 선택되는 폴리펩타이드에 따라 통상의 기술자가 알킬레이션 또는 아미데이션을 위한 조건을 조절할 수 있으며, 알킬레이션 또는 아미데이션하는 방법은 당업계 공지된 다양한 방법에 따를 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 C 말단에 아민기(NH₂)가 추가된 것일 수 있다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 중 FP12 (서열번호 15)의 C 말단에 아민기(NH₂)가 추가된 폴리펩타이드로서 FP12-NH₂ (서열번호 6)을 제공한다.

본 명세서에서 폴리펩타이드를 명명하며 사용된 용어, "-NH2"는 폴리펩타이드의 C 말단에 아민기(NH₂)가 추가된 것을 지칭한다.

폴리펩타이드의 C 말단에 아민기(NH₂)를 추가하는 것은 당업계 공지된 다양한 방법에 따를 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩타이드의 범위에는 이의 약학적으로 허용 가능한 염도 포함될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "약학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 기타 문제점이나 합병증 없이 이득/위험 비가 합리적이어서 대상체(예: 인간)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 건전한 의학적 판단의 범주 이내인 펩타이드를 의미한다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염 및 약학적으로 허용 가능한 금속염을 포함한다.

적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

상술한 폴리펩타이드의 약학적으로 허용 가능한 염의 일환으로, 본 발명은 상술한 폴리펩타이드의 아세테이트 염을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid: TFA)의 아세테이트 염 치환물을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 상술한 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드; L형, D형 및 펩토이드(peptoid)를 포함하는 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산인 폴리펩타이드; 말단이 알킬레이션(Alkylation), 페길레이션(PEGylation) 또는 아미데이션(Amidation)된 폴리펩타이드; 또는 C 말단에 아민기(NH₂)가 추가된 폴리펩타이드의 아세테이트 염을 제공한다.

본 명세서에서 폴리펩타이드를 명명하며 사용된 용어, "(AcOH)"는 폴리펩타이드의 아세테이트 염을 의미한다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드와 이의 염 치환물은 다음과 같은 특징 중 하나 이상의 특징을 가진다:

그람 음성균의 리포폴리사카라이드(LPS)에의 결합능;

박테리아 세포막의 선택적 파괴능;

단백질 분해효소에 대한 저항성;

그람 양성균의 세포막 파괴능; 및

본 발명의 구체적 실시예에서는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드와 이의 염 치환물의 후술하는 바와 같은 특징을 확인하였으나, 이들 특징에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적 실시예에서는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드와 이의 염 치환물이 리포폴리사카라이드(LPS)에 강한 결합력을 가짐을 확인하였다 (실시예 1).

또한, 본 발명의 구체적 실시예에서는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드와 이의 염 치환물이 박테리아 세포막에 대한 파괴능을 가짐을 확인하였다 (실시예 6 및 실시예 11). 특히, 적혈구 세포막에 대해서는 파괴능을 나타내지 않는바, 안전성이 입증되었다 (실시예 6).

또한, 본 발명의 구체적 실시예에서는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드와 이의 염 치환물이 단백질 분해효소에 대한 우수한 저항성을 가짐을 확인하였다 (실시예 7). 단백질 분해효소와 함께 처리하여도, 우수한 항균활성을 나타내는바, 단백질 분해효소에 대해 안정성을 확보하고 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 구체적 실시예에서는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드와 이의 염 치환물이 그람 양성균의 세포벽 성분인 LTA(lipotechoic acid) 와 LPP(lipoprotein)에 우수한 결합력을 가짐을 확인하였다 (실시예 12).

또한, 본 발명의 구체적 실시예에서는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드와 이의 염 치환물이 미미한 용혈활성을 나타내므로 매우 독성이 낮음을 확인하였다 (실시예 4).

본 명세서에서 사용된 용어, "패혈증"이란 미생물에 감염되어 전신에 심각한 염증 반응이 나타나는 상태를 말한다. 체온이 38℃이상으로 올라가는 발열 증상 혹은 36℃이하로 내려가는 저체온증, 호흡수가 분당 24회 이상으로 증가(빈호흡), 분당 90회 이상의 심박수(빈맥), 혈액 검사상 백혈구 수의 증가 혹은 현저한 감소 중 두 가지 이상의 증상을 보이는 경우, 이를 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome; SIRS)이라고 부른다. 이러한 전신성 염증 반응 증후군이 미생물의 감염에 의한 것일 때 패혈증이라고 한다. 신체의 감염병소에서 병원균이 지속적 또는 단속적으로 혈류에 들어와 여러 장기조직에 정착하여 병소를 만들고 심한 전신 증상을 보이는 것이다. 원인균으로는 포도상구균, 연쇄상구균, 대장균, 녹농균, 결핵균, 폐렴간균, 진균, 혐기성균 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항균" 또는 "항균활성"이란, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물에 대해 저항하는 성질을 의미하며, 보다 상세하게는 항생물질 등이 세균의 성장 또는 증식을 억제하는 특성을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항균용 조성물"은 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 생육을 저해하는 활성을 가진 조성물로서, 항균 효과가 요구되는 다양한 분야에 사용되는 모든 형태가 포함될 수 있으며, 예를 들어, 의약품, 화장품, 의약외품, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제 등의 형태일 수 있다. 구체적으로, 의약에 있어서는 항생제나 오염방지제와 같은 목적으로, 식품에 있어서는 방부나 항균목적으로, 농업에 있어서는 항균, 살균, 소독의 목적으로, 화장품이나 생활용품에 있어서는 비듬억제용, 무좀방지용, 겨드랑이 채취억제용, 항여드름용 등 미생물과 직접 연관된 제품에 사용되거나 청소용 세정제나 식기세척용 세정제 등에 방부나 항균 또는 살균 목적으로 사용되어질 수 있으며, 이러한 목적으로만 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항균용 조성물의 항균 대상은 그람 음성균, 그람 양성균, 항생제 내성 그람 음성균 및 항생제 내성 그람 양성균 등이 포함된다.

본 명세서에서 사용된 용어, "그람 음성균(gram negative bacteria)"은 그람염색법으로 염색했을 때 붉은색으로 염색되는 세균을 의미하는 것으로, 일반적으로 색소 저항력이 강하고, 계면활성제 내성이 강하다. 본 발명의 그람 음성균에는 엔도톡신(endotoxin)을 보유한 모든 종류의 그람 음성균이 포함되며, 예를 들어, 에스케리아(Escherichia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 아시네토박터(Acinetobacter) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 크렙시엘라(Klebsiella) 속, 나이세리아(Neisseria) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 시겔라(Shigella) 속, 모락셀라(Moraxella) 속, 헬리코박터(Helicobacter) 속, 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 속, 브델로비브리오(Bdellovibrio) 속, 레지오넬라(Legionella) 속 균주 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 그람 음성균에는 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis), 슈도모나스 퍼투시노제나(Pseudomanas pertucinogena), 슈도모나스 스투트제리(Pseudomanas stutzeri), 슈도모나스 시린개(Pseudomanas syringae), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 아시네토박터 류오피이(Acinetobacter lwoffii), 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus), 아시네토박터 헤모리티쿠스(Acinetobacter haemolyticus), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 살모넬라 봉고리(Salmonella bongori), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum), 살모넬라 엠반다카(Salmonella mbandaka), 살모넬라 콜레라에슐스(Salmonella choleraesuls), 살모넬라 톰슨(Salmonella thompson), 살모넬라 인팜티스(Salmonella infamtis), 살모넬라 더비(Salmonella derby), 크렙시엘라 뉴모이아(Klebsiella pneumonia), 크렙시엘라 그라눌로마티스(Klebsiella granulomatis), 크렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 크렙시엘라 테리게나(Klebsiella terrigena), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌자이티디스(Neisseria meningitidis), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 시겔라 보이디(Shigellaboydii), 시겔라 디센테리아에(Shigelladysenteriae), 시겔라 플렉스네리(Shigellaflexneri), 시겔라 손네이(Shigellasonnei), 모락셀라 카타할리스(Moraxellacatarrhalis), 모락셀라 라쿠나타(Moraxellalacunata), 모락셀라 보비스(Moraxellabovis), 헬리코박터 파일로리(Helicobacterpylori), 헬리코박터 헤일마니(Helicobacterheilmannii), 헬리코박터 펠리스(Helicobacterfelis), 헬리코박터 무스틸레(Helicobactermustelae), 헬리코박터 페넬리에(Helicobacterfenelliae), 헬리코박터 라피니(Helicobacterrappini), 헬리코박터 헤파티쿠스(Helicobacterhepaticus), 헬리코박터 빌리스(Helicobacterbilis), 헬리코박터 풀로룸(Helicobacterpullorum), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonasmaltophilia), 스테노트로포모나스 나이트리트리더센스(Stenotrophomonasnitritireducens), 브델로비브리오 박테리오보러스(Bdellovibriobacteriovorus), 레지오넬라 뉴모필라(Legionellapneumophila), 레지오넬라 아니사(Legionallaanisa), 레지오넬라 비르밍하멘시스(Legionallabirminghamensis), 레지오넬라 보제마니(Legionallabozemanii), 레지오넬라 신신나티엔시스(Legionallacincinnatiensis), 레지오넬라 두모피(Legionalladumoffii), 레지오넬라 필레이(Legionallafeeleii), 레지오넬라 고르마니(Legionallagormanii), 레지오넬라 하케리애(Legionallahackeliae), 레지오넬라 이스라엘렌시스(Legionallaisraelensis), 레지오넬라 조르다니스(Legionallajordanis), 레지오넬라 란신젠시스(Legionallalansingensis), 레지오넬라 롱베아채(Legionallalongbeachae), 레지오넬라 마세아체르니(Legionallamaceachernii), 레지오넬라 믹다데이(Legionallamicdadei), 레지오넬라 오크리드젠시스(Legionallaoakridgensis), 레지오넬라 사인텔렌시(Legionallasainthelensi), 레지오넬라 툭소넨시스(Legionallatucsonensis), 레지오넬라 와드스워티(Legionallawadsworthii) 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "그람 양성균(gram positive bacteria)"은 그람 염색에서 감청색 또는 보라색으로 염색이 되는 세균으로, Staphylococcus 속, Enterococcus 속, Streptococcus 속, Clostridium 속 균주 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 그람 양성균에는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis) 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항생제 내성 그람 양성균"에는 예를 들어, Methicillin 내성 그람 양성균, Carbapenem 내성 그람 양성균, Vancomycin 내성 그람 양성균, Macrolide 및 다제 내성 그람 양성균 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항생제 내성 그람 음성균"에는 예를 들어, Streptomycin 내성 그람 음성균, Colistin 내성 그람 음성균, Carbapenem 내성 그람 음성균, Chloramphenicol 내성 그람 음성균, Tetracyclines 내성 그람 음성균, Cefotaxime 내성 그람 음성균, ㄴenem 내성 그람 음성균, 광범위 베타락탐계 항생제 분해효소(ESBL;Extended Spectrum Beta Lactamase) 내성 그람 음성균, Tigecycline 내성 그람 음성균 및 다제 내성 그람 음성균 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 항균용 조성물의 항균 대상 균은 Escherichia coli DH5α, Escherichia coli K1, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus 및 Staphylococcus epidermidis 로 이루어진 군에서 선택된 1이상일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구현예에서, 상기 항균용 조성물의 항균 대상 균은 광범위 베타락탐계 항생제 분해효소(ESBL;Extended Spectrum Beta Lactamase) 내성 균, 카바페넴 내성 균 및 콜리스틴 내성 균으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 항생제 내성 균일 수 있다. 예를 들어, 상기 항생제 내성 균은 ESBL (E. coli), Carbapenem resistant (CR)-Acinetobactor baumannii, CR-Klebsiella pneumoniae, CR-Pseudomonas aeruginosa, 및 Colistin resistant Acinetobactor baumannii 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "감염성 질환"은 바이러스, 세균, 곰팡이, 기생충과 같이 질병을 일으키는 병원체가 동물이나 인간에게 전파, 침입하여 일으킨 질환을 의미하며, 본 발명의 목적상 그람 음성균 또는 그람 양성균에 의해 유발되는 모든 감염성 질환을 의미한다.

예를 들어, 상기 감염성 질환에는, 폐렴, 복막염, 뇌막염, 창상감염, 골관절염, 담낭염, 요로감염증, 뇌수막염, 심내막염, 심근염, 심외막염, 관절염, 인구염, 임질, 세균성 이질, 장염, 결막염, 위염, 중이염, 방광염, 림프관염 등의 그람 음성균에 의해 유발되는 감염성 질환이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

예를 들어, 상기 감염성 질환에는, 인후염, 농가진, 류마티스열, 사구체신염, 신생아패혈증, 수막염, 인두염, 폐렴, 심내막염, 성홍열, 피부연조직감염, 심부연조직감염, 농흉 및 질염 등의 그람 양성균에 의해 유발되는 감염성 질환이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글라이콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글라이콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 질환에 의한 증상을 차단하거나, 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "치료" 또는 "개선"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "개체"란 질병의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상을 의미한다. 예를 들어, 상기 개체는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 양 및 소를 포함하는 포유류일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 선택될 수 있다. 구체적인 예로, 상기 약학적 조성물은 0.001 내지 1000 mg/kg, 0.01 내지 100 mg/kg, 0.01 내지 10 mg/kg, 0.1 내지 10 mg/kg 또는 0.1 내지 1 mg/kg의 양을 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 패혈증 또는 패혈증성 쇼크; 항균; 감염성 질환의 개선, 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지된 물질을 하나 이상 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 기관지 확장제, 항히스타민제 또는 소염진통제를 추가로 포함할 수 있다.

예를 들어, 상기 기관지 확장제로는 β효능제, 항콜린제, 메틸잔틴 등을 사용할 수 있고, 상기 항히스타민제로는 아크리바스틴(acrivastine), 세티리진(cetirizine), 데슬로라타딘(desloratadine), 펙소페나딘(fexofenadine), 레보세티리진(levocertirizine), 로라타딘(loratadine), 미졸라스틴(mizolastine), 아일메마진(ailmemazine), 클로세티리진(chlocertirizine), 클레마스틴(clemastine), 시프로펩타딘(cypropheptadine), 하이드록시진(hydroxyzine), 케토티펜(ketotifen), 프로멘타진(promenthazine) 등을 사용할 수 있고, 상기 소염진통제로는 아스피린(aspirin), 디클로페낙(diclofenac), 페노프로펜(fenoprofen), 플루비프로펜(flurbiprofen), 이부프로펜(ibuprofen), 인도메타신(indomethacin), 케토프로펜(ketoprofen), 나프록센(naproxen), 피록시캄(piroxicam), 술린닥(sulindac), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 로페콕시브(rofecoxib) 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적 실시예에서는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드와 이의 염의 LPS와의 결합능을 측정하여, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 이의 염이 LPS와의 결합력이 높음을 확인하였다 (실시예 1).

또한, 본 발명의 구체적 실시예에서는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드와 이의 염이 우수한 항균활성을 나타냄을 확인하였다 (실시예 2, 실시예 3 및 실시예 10).

또한, 본 발명의 구체적 실시예에서는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드와 이의 염이 강한 항생효과를 나타냄을 확인하였다 (실시예 8 및 실시예 9).

또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다. 이는 당업계에 공지된 가혹 조건(stringent conditions) 하에서, 상기 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.

또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "벡터(vector)"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λλλλΔ및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

상기 재조합 벡터에서 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들면, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.

상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, SP2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.

본 발명은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주세포 내로의 삽입은, 당업계에 널리 알려진 삽입 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 형질 전환된 숙주세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : E. coli K1에 대한 ADK 유래 펩타이드 후보들의 LPS 결합능 측정

FP1 (ADK 44-54)을 WT(wild type)으로 표기하며, WT에서 다양한 부분들에 대하여 점돌연변이(point mutation)된 펩타이드를 제작하였다(FP3, FP5, FP6, 및 FP9). FP3의 잔기서열에서 LPS와의 상호작용을 높이기 위해 FP3와 LPS 결합모델을 기반하여 펩타이드를 설계하였고(FP12-NH₂ 및 FP13-NH₂), 비자연계 아미노산과 아미노산 이성질체(allomeric D형 아미노산)을 추가 도입하여 펩타이드를 설계하였다(allD FP12-NH₂, allD FP13-NH₂, allD FP-13-9a, allD FP-13-9w, allD FP-13-9k, 및 allD FP13-NH₂ (AcOH)). 또한, N-말단 페길화(pegylation)한 펩타이드(PEG-alld FP13-NH₂(AcOH))를 추가 설계하여 ㈜애니젠에서 합성 후 제공받았다. 제공받은 각각의 펩타이드들과 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS), 두 물질간의 Binding affinity (Kd)를 측정하는 Isothermal Titration Calorimeter (ITC) 를 이용하여 LPS와의 binding affinity 를 확인하였다.

구체적으로, 펩타이드와 LPS 간 결합력 (Binding affinity (Kd)) 분석 방법은 다음과 같다.

Malvern microcal peaq-itc cell 장비를 사용하여 측정하였고, LPS와의 interaction을 확인하기 위해 하기와 같은 전처리를 하였다. Cell의 샘플 양 및 모양은 300㎕, coin-shaped, fixed-in-place; 실린지 회전률은 1200 RPM; 그리고 온도는 30℃, 35℃, 25℃ 로 사용하였다.

시험전에 미리 PBS로 LPS와 peptide를 희석시켜 LPS 2mM과 peptide 0.2mM 을 만들었다. Wash가 끝난 ITC 기기의 cell 안에 peptide 300uL를 넣고 syringe에는 LPS 40uL를 넣어두었다. ITC의 측정 조건 (온도, injection 횟수)를 설정한 후 Syringe를 cell 안에 꽂고 ITC 측정을 시작하였다. 측정이 완료 되면 분석을 통해 LPS와 peptide의 Kd 값을 산출하였다.

측정 결과, FP3, FP5, FP6, FP9, FP12-NH₂, FP13-NH₂, allD FP12-NH₂, allD FP13-NH₂, allD FP-13-9a, allD FP-13-9w, 및 allD FP-13-9k, 및 allD FP13-NH₂ (AcOH)의 모든 종류의 펩타이드에서 LPS binding affinity가 있음이 확인되었으며, FP1(wild type, WT) 와 동등하거나 그 이상의 강한 LPS binding affinity를 보임을 알 수 있었다.

(상기 표 1 및 표 2에서, allD 는 D형 아미노산을 의미함.)

(상기 표 1 및 표 2에서, (AcOH)는 펩타이드의 N말단으로부터 9번째 아미노산의 말단의 Trifluoroacetic acid(TFA)을 acetate 염으로 치환한 염 치환물을 의미함.)

(상기 표 2에서, PEG는 페길화(pegylation) 를 의미함. 펩타이드 N-말단 pegylation의 정보: PEG(polyethylene glycol), Mw(분자량)=385.4Da, Fmoc-NH-PEG2-CH₂COOH)

실시예 2 : allD FP13-NH ₂ 과 시판 중인 항생제 4종의 그람 양음성 표준균주에 대한 항균활성 비교 평가

실시예 1에서 설계한 펩타이드 중 LPS에 강한 affinity를 확인한 펩타이드 1종 (allD FP13-NH₂)과 시판 중인 항생제 4종의 그람 양음성 표준균주에 대한 항균활성을 비교 확인하였다.

항생제 4종 (Ampicillin, Gentamicin, Levofloxacin, Imipenem)과 allD FP13-NH₂ (AcOH) 펩타이드의 항균활성을 비교하기 위하여, 그람 음성 및 그람 양성 표준균주 (Escherichia coli DH5α, Escherichia coli K1, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, 및 Klebsiella pneumoniae) 에 대한 최소저해농도 (Minimum Inhibitory Concentration, MIC₅₀과MIC₈₀) 측정을 통한 항균활성 실험법으로 평가하였다.

보다 구체적으로, 96-well plate의 각 well에 배지 100uL와 첫번째 열에는 배지 200uL와 항생제 및 펩타이드를 분주하였다. 첫번째 열부터 열한번째 열까지 ½씩 serial dilution하고 미리 배양한 그람 음성 및 그람 양성 박테리아를 희석하여 (희석 시 OD_600nm의 값은 약 0.0025) 각 well에 분주하였다. Plate를 37℃incubator에서 4시간 동안 배양한 후 OD_600nm에서 측정하였다. blank(배지와 균만 들어간 well) 의 OD_600nm 값으로 균 생장율을 100%로 산정하고, 생장억제율이 50%의 OD_600nm값을 가지는 항생제 및 펩타이드의 농도를 확인하여 MIC₅₀로 산출하고 생장억제율 80%는 MIC₈₀에 해당하는 농도(ug/ml) 로 산출하였다.

그 결과, allD FP13-NH₂ (AcOH) 펩타이드는 시판 중인 항생제 4종 (Ampicillin, Gentamicin, Levofloxacin, Imipenem)과 비교해, 동등하거나 더 우수한 정도로 그람 양음성 균주 7종 전체에 대해서 항균활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 3 : 펩타이드 및 항생제 3종의 항생제 내성 박테리아(ESBL 및 카바페넴 내성 박테리아)에 대한 항균활성 비교 평가

펩타이드 9종을 대상으로 항균활성을 분석하기 위하여, AMP (ampicillin), imipenem, colistin과 5종의 항생제 내성 박테리아 (ESBL-E.coli, Carbapenem resistant A. baumannii, Carbapenem resistant Klebsiella pneumonia, Carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa, Colistin resistant Acinetobactor baumannii) 에 대한 항균활성을 확인하였다.

최소저해농도 측정 (MIC₅₀, Minimum Inhibitory Concentration 50, 50%의 균을 사멸시키는 최소 농도)을 통한 항균활성 실험법으로 평가하였다.

보다 구체적으로, 96-well plate의 각 well에 배지 100uL와 첫번째 열에는 배지 200uL와 항생제 및 펩타이드를 분주하였다. 첫번째 열부터 열한번째 열까지 ½씩 serial dilution하고 미리 배양한 5종의 항생제 내성 박테리아(ESBL-E.coli, Carbapenem resistant A. baumannii, Carbapenem resistant Klebsiella pneumonia, Carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa, Colistin resistant Acinetobactor baumannii)를 희석하여(희석 시 OD_600nm의 값은 약 0.0025) 각 well에 분주하였다. Plate를 37℃ incubator에서 4시간 동안 배양한 후 OD_600nm에서 측정하였다. blank(배지와 균만 들어간 well)의 OD_600nm값으로 균 생장율을 100%로 산정하고, 생장율이 50%의 OD_600nm값을 가지는 항생제 및 펩타이드의 농도를 확인하여 MIC₅₀ 값을 산출해 냈다.

그 결과, 본 발명에 따른 펩타이드에서 비교 항생제 3종 (AMP (ampicillin), imipenem, colistin)에 비하여 항균활성이 개선되었음을 확인하였다. 특히, 이들 항생제에 대한 내성균 (특히, 카바페넴, 콜리스틴 내성 균주) 에 대하여서도 항균활성이 있음을 확인하였다.

실시예 4 : 펩타이드의 용혈활성 측정

사람의 적혈구 용혈활성 측정을 통해 펩타이드의 독성 여부를 판별하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

사람의 적혈구를 PBS로 희석한 후 10분간 원심분리 하여 3회 세척하였다. PBS로 희석한 8.0% 적혈구 용액을 96-웰 마이크로적정 플레이트에 100㎕씩 로딩한 후, 펩타이드 용액 100㎕씩 섞어 준 후, 37℃에서 1 시간동안 배양한 후, 96-웰 마이크로적정 플레이트를 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 100㎕씩 취하여 다른 96-웰 마이크로적정 플레이트에 옮긴 후, 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이때, 0.1% 트리톤 X-100로 처리하였을 경우의 값을 100% 용혈로 계산하고, 펩타이드의 용혈활성을 % hemolysis로서 하기 수학식 1에 의하여 산출하였다.

여기서, A는 펩타이드 용액에서의 405 nm의 흡광도이고, B는 0.1% 트리톤 X-100에서의 405 nm의 흡광도이며, C는 PBS 용액에서의 405 nm의 흡광도를 나타낸다.

이 때 대조군의 펩타이드로서 강한 항균활성을 가짐과 동시에 강한 용혈활성을 나타내는 항균 펩타이드인 멜리틴을 사용하였다.

[수학식 1]

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따른 펩타이드들은 100uM 고농도에서도 거의 용혈활성을 나타내지 않아 독성이 낮은 것을 알 수 있었다. 반면에, 대조군인 멜리틴은 낮은 농도에서도 100% 용혈활성을 보임으로서 독성이 매우 높음을 알 수 있었다.

실시예 5 : 원편광 이색성 분광법을 이용한 펩타이드 2차 구조 측정

FP12-NH₂와 FP13-NH₂펩타이드의 2차 구조를 측정하기 위하여 다음을 실시하였다.

생체막 유사환경에서의 펩타이드의 이차 구조를 연구하기 위해 수용액, 100mM SDS, 50mM DPC 에서 펩타이드 시료당 100uM가 되도록 용매 0.3ml에 녹였다. 1mm path length의 cell을 이용하여 Jasco J-720 원편광 이색성 분광기에서 100nm/min의 주사속도로 0.1nm 마다 흡수 값이 얻어졌으며 6번의 주사가 평균이 되어 측정값을 얻었다.

원편광 이색성 분광법은 폴리펩타이드의 주 골격의 2차 구조에 따라 특징적인 흡수형태를 보인다. FP12-NH₂ 와 FP13-NH₂펩타이드는 수용액에서는 이차구조를 가지지 않으나 생체막 유사환경인 DPC micelle에서는 α-helix구조의 특징적인 흡수형태인 208, 222nm 근처의 파장에서 두 개의 최소점을 가졌다(도 2).

상기 결과로부터 이들 펩타이드는 박테리아의 생체막에서 α-helix 구조를 형성하면서 항균활성을 나타낼 것임을 예측할 수 있다. 반면에 D-amino acid 치환을 한 all_D(FP12-NH₂), all_D(FP13-NH₂) 펩타이드들은 정확히 모체 펩타이드의 거울상을 가짐을 알 수 있었다. 모체 펩타이드의 CD spectrum이 right-handed α-helix (우선성 알파 힐릭스) 구조를 가지는 것과는 반대로 negative intensity를 가짐으로서 left-handed α-helix구조를 가짐을 확인하였다 (도 2).

실시예 6 : 그람 음성 박테리아 세포막과 적혈구 세포막을 모방하는 리포좀에 대한 펩타이드의 파괴능 측정

FP12-NH₂, FP13-NH₂, allD FP12-NH₂, allD FP13-NH₂ 펩타이드를 대상으로 작용기전을 연구하기 위해 박테리아 세포막과 적혈구 세포막을 모방하는 리포좀에 대한 펩타이드의 파괴능을 측정하였다.

펩타이드의 항균작용이 박테리아의 세포막을 표적으로 하여 세균을 죽이는 작용기전을 나타내는 것인지를 확인하기 위하여, 형광염료(fluorescent dye)인 칼세인(calcein)을 포획시킨 그람 음성 박테리아의 세포막을 모방하는 EYPC/EYPG (7:3, w/w)로 구성된 리포좀과 인간의 적혈구를 모방하는 EYPC/CH(1:10, w/w)을 제작하여 다음의 형광염료방출실험(dye leakage assay)을 행하였다.

EYPG는 egg yolk L-α-phosphatidyl-DL-glycerol의 약어이며, EYPC 는 egg yolk 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine의 약어이다. CH는 콜레스테롤의 약자이다. 각 구성성분의 함량대로 구성된 인지질을 클로로포름에 녹인 다음, rotary evaporator로 클로로포름을 제거하고, 하룻밤 동안 동결건조 시켰다. 이후, 건조된 지질필름을 트리스-완충용액에 칼세인을 녹여서 액체질소로 얼림-녹임을 반복한 후 extruder장치를 이용하여 칼세인을 포획한 리포좀을 제작하였다. 그리고 나서 Spectrofluorimeter (Shimadzu RF 5301 PC spectrofluorimeter, Japan)의 excitation wavelength을 490nm에 emission wavelength를 520nm에 맞추고, 리포좀에 펩타이드를 투여하여 100 % dye leakage는 0.01 % Triton-X₁₀₀을 넣었을 때의 형광 세기로 표시하여 상대적인 염료방출을 측정하였다.

그 결과를 도 3에 도시하였다. 도 3의 상단 도면은 펩타이드에 의한 형광염료(fluorescent dye) 칼세인(calcein)을 포획시킨, 박테리아 세포를 모방하는 EYPC/EYPG (7:3, w/w) 리포좀에 대한 % 염료방출(dye leakage)을 펩타이드 농도에 따라 나타낸 것이고, 여기서는 대조군(세포막 표적의 작용기전을 나타내는 펩타이드)으로 항균 펩타이드 melittin을 사용하였다. 도 3의 하단 도면은 펩타이드에 의한 형광염료(fluorescent dye) 칼세인(calcein)을 포획시킨 인간의 적혈구를 모방하는 중성지질인 EYPC/CH (10:1, w/w) 리포좀에 대한 % 염료방출(dye leakage)을 펩타이드 농도에 따라 나타낸 것이고, 여기서는 대조군 (세포막 표적의 작용기작을 나타내는 펩타이드)으로 항균 펩타이드 melittin을 사용하였다.

도 3에 보이듯이 대조 펩타이드인 melittin은 낮은 농도에서도 박테리아의 세포막을 모방하는 PC/PG (7:3, w/w)로 구성된 리포좀에서 칼세인을 방출시켰다. 인간의 적혈구를 모방하는 PC/CH (10:1, w/w) 리포좀에서 Melittin은 0.25μM에서 100%에 가까운 칼세인 방출을 일으켜서 전혀 박테리아 세포에 대한 선택성을 보이지 않고 독성이 매우 높을 것임을 예측할 수 있다.

반면에 FP12-NH₂, FP13-NH₂, allD FP12-NH₂, allD FP13-NH₂ 펩타이드들은 박테리아 세포막을 모방하는 PC/PG (7:3, w/w) 리포좀에 대해 큰 염료방출을 일으켜서 박테리아 세포막 파괴능이 높음을 알 수 있었다. FP12-NH₂, FP13-NH₂, allD FP12-NH₂, allD FP13-NH₂ 펩타이드들은 선택적으로 포유동물의 적혈구 세포막을 모방하는 PC/CH (1:1, w/w) 리포좀에 대해서는 거의 염료방출을 보이지 않아 낮은 용혈활성과 일치하는 결과를 보였다. 따라서 본 발명에 따른 펩타이드들은 박테리아 세포막을 선택적으로 파괴하는 작용기전을 가짐을 알 수 있었다.

실시예 7 : 펩타이드의 단백질 분해효소 저항성 측정을 통한 안정성 평가

설계된 allD FP12-NH₂, allD FP13-NH₂ 펩타이드의 단백질 분해효소 저항성을 측정을 통하여 혈액 내 안정성을 확인하였다.

보다 구체적으로, 세가지 단백질 분해효소인 trypsin, protease K, chymotrypsin에 대한 저항성을 확인하기 위해, 단백질 분해효소를 처리한 후 E. coli, A. baumannii 및 S. aureus 에 대한 펩타이드의 항균활성을 측정하였다.

그 결과, 비천연 아미노산인 D-amino acid 치환을 거쳐 설계된 allD FP12-NH₂, allD FP13-NH₂ 펩타이드들은 이들 단백질 분해효소에 대한 저항성이 매우 증진되었음을 확인할 수 있었다.

표 5에서의 E. coli, A. baumannii 에 대한 실험에서, allD FP12-NH₂, allD FP13-NH₂ 펩타이드들은 단백질 분해효소를 처리하지 않은 경우와 비교하여 비슷하거나 2-4배 정도 감소되는 것에 불과한 항균활성을 나타냄으로서 안정성이 매우 높은 고기능성 펩타이드임을 확인하였다.

또한, 표 6에서의 S. aureus 에 대한 실험에서도, allD FP12-NH₂, allD FP13-NH₂ 펩타이드들은 안정성이 매우 높은 고기능성 펩타이드임을 확인하였다.

실시예 8 : 표준균주 E. coli K1과 임상균주 2종에 대한 allD FP13-NH ₂ 의 항생효과

펩타이드의 항균활성 평가를 위해 E.coli K1 (표준균주), E.coli (ESBL)과 카바페넴 내성 박테리아(Carbapenem-resistant Acinetobacter baummanii (CRAB)) 에 대한 펩타이드의 항생효과 및 치료효과를 동물실험을 통해 검증하였다.

E.coli K1 (표준균주) 이외 E.coli (ESBL)과 카바페넴 내성 박테리아 (CRAB)는 고려대학교 감염내과에서 중증 감염증 환자로부터 채취한 항생제 내성균을 분양받았다. 실험 균은 형태학적으로 동일한 10~20개의 집락을 채취하여 적합한 액체 배지(Mueller Hinton Broth) 10 ml이 들어있는 시험관에 접종하여 37℃ 인큐베이터에서 12시간 동안 배양하였다. 배양액은 1 ml씩 멸균된 cryo tube에 담아 -80℃에서 보관하였다.

시험 균주는 37℃ 인큐베이터에서 2일 간 배양 후 [BAP (blood agar plate)] MHB (Mueller Hinton Broth) 액체 배지에 접종 균주 양 (1x10⁸ 또는 8x10⁷)에 맞추어 준비하고 6주령 마우스의 복강 내로 (1 mL) 주입하여 감염을 유도하였다. 실험 별 그룹으로 생쥐 (그룹 당 n=5 또는 6)를 구분하고 HARTMANN'S DEX solution (vehicle) 와 혼합한 allD FP13-NH₂를 마우스 복강 내로 0시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간으로 6회로 나눠 접종하고 12시간 간격으로 3일 생존율 (survival rate) 을 관찰하였다.

그 결과, Escherichia coli K1, Escherichia coli (ESBL), Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii 을 각각 감염시킨 패혈증 동물모델에 kg 당 총 3mg 이상 12mg의 농도 범위에서 생존율이 증가 (항생효과) 하는 것을 확인하였다. 실시예 1에서 설계한 펩타이드가 표준균주 및 임상균주 감염동물모델에서도 in vivo 상 항생 및 항패혈증 효과를 나타냄을 검증한 것이다.

실시예 9 : 펩타이드의 acetate 염 치환물

allD FP13-NH₂의 acetate 염 치환물의 치료 효과 및 약물학적 효과를 확인하기 위하여, Escherichia coli (표준 균주 및 ESBL) 균주를 각각 복강투여하여 유도한 패혈증 동물 모델 혹은 정상 마우스에 펩타이드 allD FP13-NH₂ (AcOH)을 처리하여, 염 치환물의 항생효과와 독성, 항염증 싸이토카인 IL-6의 억제 활성을 Trifluoroacetic acid(TFA) 말단의 동일 펩타이드와 비교하였다.

실험 방법은 다음과 같다:

6주령의 암컷 평균 체중 25g의 ICR 마우스 (SPF mouse, 샘타코)를 실험동물로 사용하였다. 실험동물은 멸균 사료와 물을 제공하고 케이지별 10 마리 미만의 동물로 사육하였고, 밤낮 주기는 12시간으로 하였다.

시험 균주는 37℃인큐베이터에서 2일 간 배양 후 [BAP (blood agar plate)] MHB (Mueller Hinton Broth) 액체 배지에 접종 균주 양(1x10⁸)에 맞추어 준비하고 6주령 생쥐의 복강 내로 (1×10⁸/200 ㎕) 주입하여 감염을 유도하였다. 실험 별 그룹으로 생쥐(그룹 당 n=5 또는 6)를 구분하고 HARTMANN'S DEX sol(vehicle)와 혼합한 allD FP13-NH₂ (TFA) 와 allD FP13-NH₂ (AcOH) 를 마우스 복강 내로 0시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간으로 6회로 나눠 접종하고 12시간 간격으로 생존율(survival rate)을 관찰하였다.

in vivo 독성 평가를 위해, 실험 별 그룹으로 생쥐 (그룹 당 n=5또는 6)를 구분하고 HARTMANN'S DEX sol(vehicle)와 혼합한 allD FP13-NH2 (TFA), allD FP13-NH2 (AcOH) 를 마우스 복강 내로 0시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간으로 6회로 나눠 접종하고 12시간 간격, 72시간 생존율(survival rate)을 관찰하였다.

또한, BMDC (골수유래 수지상세포) 에 대한 IL-6 분비 시험은 allD FP13-NH₂ (TFA), allD FP13-NH₂ (AcOH) 의 LPS 매개 면역 반응 평가를 펩타이드 처리 30분 이후 LPS에 의해 분비되는 사이토카인을 비교 분석함으로써 수행하였다.

그 결과, 패혈증 동물모델(E. coli ESBL 유발 모델)에 대한 항생효과 및 독성시험 결과 ED₅₀는 약 1mpk(mg/kg), LD₅₀는 80mpk로 원하는 반응을 나타내기 위한 약물용량에 대한 독성을 나타내는 약물 용량의 비(치료지수, therapeutic index = LD₅₀/ED₅₀)가 80을 상회하므로 충분한 안전역(safety margin)을 확보할 것으로 예상되어 우수한 항패혈증 신약 개발 가능성이 있음을 확인하였다. 또한, allD FP13-NH₂ (AcOH)이 LPS에 의해 증가된 IL-6의 분비를 현저하게 감소시킴을 확인하였다. (도 5)

실시예 10 : allD-type 펩타이드의 그람 양성 박테리아 3종 (S. aureus 2종 및 S. epidermidis) 에 대한 항균활성 평가

allD-type 펩타이드의 그람 양성균에 대한 항균활성을 분석하기 위하여, 그람 양성 박테리아 3종 (S. aureus 2종 및 S. epidermidis) 에 대한 항균활성을 확인하였다.

최소저해농도 측정 (MIC₅₀, 50%의 균을 사멸시키는 최소 농도 ; MIC₁₀₀, 균을 완전 사멸시키는 데 필요한 최소 농도)을 위하여 항균활성실험법으로 평가하였다.

보다 구체적으로, 96-well plate의 각 well에 배지 100uL와 첫번째 열에는 배지 200uL와 항생제 및 peptide를 분주하였다. 첫번째 열부터 열 한번째 열까지 ½씩 serial dilution하고 미리 배양한 3종의 그람 양성 박테리아 (S. aureus 2종 및 S. epidermidis) 을 희석하여(희석 시 OD_600nm의 값은 약 0.0025) 각 well에 분주하였다. Plate를 37℃ incubator에서 4시간 동안 배양한 후 OD_600nm에서 측정하였다. blank(배지와 균만 들어간 well) 의 OD_600nm 값으로 균 생장율을 100%로 산정하고 생장율이 50%, 혹은 100%의 OD_600nm값을 가지는 펩타이드의 농도를 확인하여 MIC₅₀ 과 MIC₁₀₀값을 산출해 냈다.

그 결과, 그람 양성 박테리아에 대한 항균활성 분석결과 비자연계 아미노산과 아미노산 이성질체 (allomeric D-type 아미노산)를 추가 도입한 3종의 펩타이드 (allD FP12-NH₂, allD FP13-NH₂, allD FP21-NH₂)이 Melittin 과 동등한 수준으로 그람 양성 박테리아에 대한 우수한 항균활성을 나타냄을 확인하였다.

실시예 11 : 그람 양성 박테리아 세포막을 모방하는 리포좀에 대한 펩타이드의 파괴능 측정

FP12-NH₂, FP13-NH₂, allD FP12-NH₂, allD FP13-NH₂ 펩타이드를 대상으로 작용기전을 연구하기 위해 박테리아 세포막을 모방하는 리포좀에 대한 펩타이드의 파괴능을 측정하였다.

펩타이드의 항균작용이 그람 양성 박테리아의 세포막을 표적으로 하여 박테리아를 죽이는 작용기전을 나타내는 것인지를 확인하는 실험을 진행하기 위해, 형광염료(fluorescent dye)인 칼세인(calcein)을 포획시킨 그람 양성 박테리아의 세포막을 모방하는 EYPG/EYPC (6:4, w/w)로 구성된 리포좀을 제작하여 형광염료방출실험(dye leakage assay)을 행하였다.

그 결과, FP12-NH₂, FP13-NH₂, allD FP12-NH₂, allD FP13-NH₂ 펩타이드들은 박테리아 세포막을 모방하는 EYPG/EYPC (6:4, w/w) 리포좀에 대해 많은 염료방출을 일으켜서 박테리아 세포막 파괴능이 우수함을 알 수 있었다. 이로써, 본 발명에 따른 FP12-NH₂, FP13-NH₂, allD FP12-NH₂, allD FP13-NH₂ 펩타이드들 그람 양성 박테리아 세포막을 파괴하는 작용기전도 가짐을 알 수 있었다 (도 6).

실시예 12 : allD FP13-NH ₂ 의 그람 양성균 유래 LTA 및 LPP 결합능 측정

펩타이드의 그람 양성균에 대한 항균활성을 확인하여 작용기전을 확인하기 위해 다음 실험을 진행하였다.

allD FP13-NH₂를 이용하여, 그람 양성균(S. aureus) 의 세포벽 성분인 LTA(lipotechoic acid) 와 LPP(lipoprotein)에 대한 결합력을 ITC 분석을 통해 확인하였다.

ITC 분석법을 이용한 결합능을 확인하는바, 실험방법은 실시예1의 방법을 준용하였다.

그 결과, allD FP13-NH₂가 그람 양성균의 세포벽 성분인 LTA와 LPP에 결합하는 것을 확인하였다. LTA에는 LPP가 포함되어 있으며, 돌연변이된 LTA를 포함하는 LPP에는 결합하지 않는 것을 확인하였으며, FP13-NH₂와 LTA의 결합에는 LPP가 더 중요한 역할을 할 것으로 예상되었다. 따라서 FP13-NH₂의 그람 양성균에 대한 항균활성 기전은 그람 양성균 세포벽 성분인 LPP(lipoprotein) 결합이 중요할 것으로 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

본 발명에 따른 펩타이드는, 표준 박테리아 및 항생제 내성 박테리아의 증식 억제뿐 아니라, 박테리아 유래 내독소를 제거하는 우수한 효과를 가지고 있어 우수한 패혈증 치료 효과를 가지고 있고, 항생제와 병용할 경우 항생제에 의한 부작용을 최소화할 수 있어 패혈증의 예방 또는 치료에 유용하게 이용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 그람 양음성균에 대해 선택적으로 우수한 항균활성을 가지고 있어, 그람 양음성균에 대한 항균용 조성물 또는 그람 양음성균에 의해 유발되는 다양한 감염성 질환들의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 인체에 안전할 뿐만 아니라, 단백질 분해효소에 대해서도 안정성을 나타내므로, 다양한 용도로 활용될 수 있다.

이하, 다음을 기재한다.
[서열번호
폴리펩타이드 명칭
아미노산 서열]

1
FP1(WT)
Lys Leu Gly Val Glu Ala Lys Arg Tyr Leu Asp
1 5 10
2
FP3
Lys Leu Gly Val Glu Ala Lys Arg Tyr Leu Arg
1 5 10
3
FP5
Leu Arg Leu Gly Val Glu Ala Lys Arg Tyr Leu Arg
1 5 10
4
FP6
Leu Arg Leu Gly Val Glu Leu Lys Arg Tyr Leu Arg
1 5 10
5
FP9
Lys Leu Gly Val Glu Ala Leu Arg Tyr Leu Asp
1 5 10
6
FP12-NH2
Arg Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg
1 5 10
7
FP13-NH2
Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg
1 5 10
8
allD FP12-NH2
Arg Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg
1 5 10
9
allD FP13-NH2
Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg
1 5 10
10
allD FP-13-9a-NH2
Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Ala Leu Arg
1 5 10
11
allD FP-13-9w-NH2
Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Trp Leu Arg
1 5 10
12
allD FP-13-9k-NH2
Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Lys Leu Arg
1 5 10
13
allD FP13-NH2 (AcOH)
Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg
1 5 10
14
PEG-allD FP13-NH2 (AcOH)
Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg
1 5 10
15
FP12
Arg Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg
1 5 10
16
FP13
Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg
1 5 10
17
allD FP21-NH2
Arg Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Trp Leu Arg
1 5 10
18
allD FP-13-9d-NH2
Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Asp Leu Arg
1 5 10

<110> DanDi Bioscience Inc <120> Polypeptide having antibacterial activity, composition for preventing or treating sepsis comprising the same, and antibacterial composition <130> MP19-307 <150> KR 10/2019/0023534 <151> 2019-02-28 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP1(WT) <400> 1 Lys Leu Gly Val Glu Ala Lys Arg Tyr Leu Asp 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP3 <400> 2 Lys Leu Gly Val Glu Ala Lys Arg Tyr Leu Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP5 <400> 3 Leu Arg Leu Gly Val Glu Ala Lys Arg Tyr Leu Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP6 <400> 4 Leu Arg Leu Gly Val Glu Leu Lys Arg Tyr Leu Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP9 <400> 5 Lys Leu Gly Val Glu Ala Leu Arg Tyr Leu Asp 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP12-NH2 <400> 6 Arg Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP13-NH2 <400> 7 Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> allD FP12-NH2 <400> 8 Arg Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> allD FP13-NH2 <400> 9 Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> allD FP-13-9a-NH2 <400> 10 Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Ala Leu Arg 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> allD FP-13-9w-NH2 <400> 11 Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Trp Leu Arg 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> allD FP-13-9k-NH2 <400> 12 Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Lys Leu Arg 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> allD FP13-NH2 (AcOH) <400> 13 Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEG-allD FP13-NH2 (AcOH) <400> 14 Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg 1 5 10 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP12 <400> 15 Arg Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP13 <400> 16 Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> allD FP21-NH2 <400> 17 Arg Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Trp Leu Arg 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> allD FP-13-9d-NH2 <400> 18 Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Asp Leu Arg 1 5 10

Claims

하기의 서열 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드에 있어서, 다음 폴리펩타이드 중 어느 하나의 폴리펩타이드:
[일반식]
Ln-X1-L-X2-V-X3-X4-X5-R-X6-L-X7
ⅰ) 상기 일반식에서,
n은 0;
X1은 라이신(lysine: K);
X2는 글리신(glycine: G);
X3은 글루탐산(glutamic acid: E);
X4는 알라닌(alanine: A);
X5는 라이신(lysine: K);
X6은 티로신(tyrosine: Y), 및
X7은 아르기닌(arginine: R)인,
폴리펩타이드;

ⅱ) 상기 일반식에서,
n은 1;
X1은 아르기닌(arginine: R);
X2는 글리신(glycine: G);
X3은 글루탐산(glutamic acid: E);
X4는 알라닌(alanine: A);
X5는 라이신(lysine: K);
X6은 티로신(tyrosine: Y), 및
X7은 아르기닌(arginine: R)인,
폴리펩타이드;

ⅲ) 상기 일반식에서,
n은 1;
X1은 아르기닌(arginine: R);
X2는 글리신(glycine: G);
X3은 글루탐산(glutamic acid: E);
X4는 류신(leucine: L);
X5는 라이신(lysine: K);
X6은 티로신(tyrosine: Y), 및
X7은 아르기닌(arginine: R)인,
폴리펩타이드;

ⅳ) 상기 일반식에서,
n은 0;
X1은 라이신(lysine: K);
X2는 글리신(glycine: G);
X3은 글루탐산(glutamic acid: E);
X4는 알라닌(alanine: A);
X5는 류신(leucine: L);
X6은 티로신(tyrosine: Y), 및
X7은 아스파탐(aspartic acid: D)인,
폴리펩타이드;

ⅴ) 상기 일반식에서,
n은 0;
X1은 아르기닌(arginine: R);
X2는 아르기닌(arginine: R);
X3은 라이신(lysine: K);
X4는 류신(leucine: L);
X5는 아르기닌(arginine: R);
X6은 티로신(tyrosine: Y), 및
X7은 아르기닌(arginine: R)인,
폴리펩타이드;

ⅵ) 상기 일반식에서,
n은 0;
X1은 라이신(lysine: K);
X2는 아르기닌(arginine: R);
X3은 라이신(lysine: K);
X4는 류신(leucine: L);
X5는 아르기닌(arginine: R);
X6은 티로신(tyrosine: Y), 및
X7은 아르기닌(arginine: R)인,
폴리펩타이드;

ⅶ) 상기 일반식에서,
n은 0;
X1은 라이신(lysine: K);
X2는 아르기닌(arginine: R);
X3은 라이신(lysine: K);
X4는 류신(leucine: L);
X5는 아르기닌(arginine: R);
X6은 알라닌(alanine: A), 및
X7은 아르기닌(arginine: R)인,
폴리펩타이드;

ⅷ) 상기 일반식에서,
n은 0;
X1은 라이신(lysine: K);
X2는 아르기닌(arginine: R);
X3은 라이신(lysine: K);
X4는 류신(leucine: L);
X5는 아르기닌(arginine: R);
X6은 트립토판(tryptophan: W) , 및
X7은 아르기닌(arginine: R)인,
폴리펩타이드;

ⅸ) 상기 일반식에서,
n은 0;
X1은 라이신(lysine: K);
X2는 아르기닌(arginine: R);
X3은 라이신(lysine: K);
X4는 류신(leucine: L);
X5는 아르기닌(arginine: R);
X6은 라이신(lysine: K), 및
X7은 아르기닌(arginine: R)인,
폴리펩타이드; 또는

ⅹ) 상기 일반식에서,
n은 0;
X1은 아르기닌(arginine: R);
X2는 아르기닌(arginine: R)
X3은 라이신(lysine: K);
X4는 류신(leucine: L);
X5는 아르기닌(arginine: R);
X6은 트립토판(tryptophan: W), 및
X7은 아르기닌(arginine: R)인,
폴리펩타이드,

여기서, ⅰ) 폴리펩타이드는 L형 아미노산만으로 이루어진 폴리펩타이드,
ⅱ) 폴리펩타이드는 L형 아미노산만으로 이루어진 폴리펩타이드,
ⅲ) 폴리펩타이드는 L형 아미노산만으로 이루어진 폴리펩타이드,
ⅳ) 폴리펩타이드는 L형 아미노산만으로 이루어진 폴리펩타이드,
ⅴ) 폴리펩타이드는 L형 아미노산만으로 이루어지거나 또는 D형 아미노산만으로 이루어진 폴리펩타이드,
ⅵ) 폴리펩타이드는 L형 아미노산만으로 이루어지거나 또는 D형 아미노산만으로 이루어진 폴리펩타이드,
ⅶ) 폴리펩타이드는 D형 아미노산만으로 이루어진 폴리펩타이드,
ⅷ) 폴리펩타이드는 D형 아미노산만으로 이루어진 폴리펩타이드,
ⅸ) 폴리펩타이드는 D형 아미노산만으로 이루어진 폴리펩타이드, 및
ⅹ) 폴리펩타이드는 D형 아미노산만으로 이루어진 폴리펩타이드.
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제1항에 있어서,
상기 폴리펩타이드의 말단을 알킬레이션(Alkylation), 페길레이션(PEGylation) 또는 아미데이션(Amidation)한 것인, 폴리펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 폴리펩타이드의 C 말단에 아민기(NH₂)가 추가된 것인, 폴리펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 폴리펩타이드는 하기 특징 중 하나 이상의 특징을 가지는 것인, 폴리펩타이드:
그람 음성균의 리포폴리사카라이드(LPS)에의 결합능;
박테리아 세포막의 선택적 파괴능;
단백질 분해효소에 대한 저항성;
그람 양성균의 세포막 파괴능; 및
그람 양성균 유래 LTA(lipotechoic acid) 또는 LPP(lipoprotein)에의 결합능
제1항에 따른 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid: TFA)의 아세테이트 염 치환물.
제1항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 제7항의 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물을 유효성분으로 포함하는, 패혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 제7항의 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물을 유효성분으로 포함하는, 항균용 조성물.
제9항에 있어서,
상기 항균용 조성물의 항균 대상 균은 Escherichia coli DH5α, Escherichia coli K1, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus 및 Staphylococcus epidermidis 로 이루어진 군에서 선택된 1이상인, 항균용 조성물.
제9항에 있어서,
상기 항균용 조성물의 항균 대상 균은 광범위 베타락탐계 항생제 분해효소(ESBL;Extended Spectrum Beta Lactamase) 내성 균, 카바페넴 내성 균 및 콜리스틴 내성 균으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 항생제 내성 균인, 항균용 조성물.
제11항에 있어서,
상기 항생제 내성 균은 ESBL (E. coli), Carbapenem resistant (CR)-Acinetobactor baumannii, CR-Klebsiella pneumoniae, CR-Pseudomonas aeruginosa, 및 Colistin resistant-Acinetobactor baumannii 로 이루어진 군에서 선택된 1이상인, 항균용 조성물.
제1항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 제7항의 폴리펩타이드의 트리플루오로아세트산의 아세테이트 염 치환물을 유효성분으로 포함하는, 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 감염성 질환은,
폐렴, 복막염, 뇌막염, 창상감염, 골관절염, 담낭염, 요로감염증, 뇌수막염, 심내막염, 심근염, 심외막염, 관절염, 인구염, 임질, 세균성 이질, 장염, 결막염, 위염, 중이염, 방광염, 및 림프관염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 그람 음성균에 의해 유발되는 감염성 질환; 또는
인후염, 농가진, 류마티스열, 사구체신염, 신생아패혈증, 수막염, 인두염, 폐렴, 심내막염, 성홍열, 피부연조직감염, 심부연조직감염, 농흉 및 질염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 그람 양성균에 의해 유발되는 감염성 질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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제1항의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제16항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
제17항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는,
제1항의 폴리펩타이드의 제조방법.
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