DE69533463T2

DE69533463T2 - Peptid-Inhibitoren von p33cdk2 und p34cdc2 Zellzyklus regulierenden Kinasen und humanem Papillomavirus E7 Onkoprotein

Info

Publication number: DE69533463T2
Application number: DE69533463T
Authority: DE
Inventors: Kevin R. Webster; Kevin G. Coleman
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1994-02-08
Filing date: 1995-02-07
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2015-02-08
Also published as: EP0666270A2; CA2140379A1; ATE275578T1; US5625031A; EP0666270B1; DE69533463D1; EP0666270A3; ES2227538T3; JPH07316196A

Description

Fachgebiet
Die Erfindung betrifft im Allgemeinen Peptid-Inhibitoren des Zellwachstums und der Proliferation. Insbesondere betrifft die Erfindung Liganden, welche die Kinase p34^cdc2/p33^cdk2 binden und deren Aktivität inhibieren und welche die spezifische Interaktion zwischen dem Retinoblastom-Tumor-Suppressor-Protein und dem transformierenden E7-Protein aus dem menschlichen Papillomavirus inhibieren.
Hintergrund der Erfindung
Krebszellen sind durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, sich in einer kontinuierlichen, unkontrollierten Weise zu teilen. Es ist nun klar, dass in der Onkogenese primäre Zellzyklusregulatoren umgangen werden müssen oder direkt involviert sein müssen, damit diese stattfindet.
Die Zellzyklusregulation findet an den Grenzen der G₁/S- und der G₂/M-Phasen statt, die zwei hauptsächlichen Transitionspunkte des Zellzyklus. Ein Hauptregulator dieser Transitionen ist die Kinase p34^cdc2, von der bekannt ist, dass sie eine Reihe von Proteinen phosphoryliert, die das Histon H1, die DNA-Polymerase α, die RNA-Polymerase II, das Retinoblastom-Tumor-Supressor-Protein (Rb), p53, Nucleolin, cAbl, das große T-Antigen von SV40 und Lamin A einschließen. Die Akivität der Kinase p34^cdc2 wird zum Beispiel für den Eintritt der Zellen in die Mitose benötigt, z. B. für den Durchtritt von der G₂-Phase des Zellzyklus in die M-Phase. (Lee et al. (1988) Trends Genet 4: 289–90; Dunphy et al. (1988) Cell 54: 423–431; Gautier et al. (1988) Cell 54: 433–439; für Übersichtsartikel vergl. Cross et al. (1989) Ann Rev Cell Biol 5: 341–395; Hunter (1989) Curr Opinion Cell Biol 1: 268–274; Nurse (1990) Nature 344: 503–508). Die Aktivität der Kinase p34^cdc2 wird ihrerseits sowohl durch Protein-Protein-Interaktionen und posttranslationale Modifikationen reguliert. Daher führt die Blockade von einem der beiden Mechanismen zum Arrest des Zellzyklus bei Säugern. Die Mikroinjektion von p34^cdc2-Antikörpern in Serum stimulierte Fibroblasten von Ratten verursacht zum Beispiel bei den Zellen einen Arrest in der G₂-Phase und die Behandlung von aktivierten T-Lymphocyten mit p34^cdc2-Antisense-Oligodesoxynucleotiden inhibiert die DNA-Synthese (Furukawa et al. (1990) Science 250: 805–808; Riabowol et al. (1989) Cell 57: 393–401). Die Injektion des Proteins suc1 (ein Ligand von p34^cdc2) in Hela-Zellen hält das Zellwachstum an, vermutlich durch die Unterbrechung der normalen Protein-Protein-Interaktionen von p34^cdc2 (Draetta (1990) TIBS 15: 378–383). Zusätzlich blockiert die Inhibition der Phosphatase cdc25 mit spezifischen Antikörpern die posttranslationale Modifikation von p34^cdc2 und führt zum Tod von Hela-Zellen (Galaktionov et al. (1991) Cell 67: 1181–1194). Es wurde gezeigt, dass das Rb-Protein, das p107-Protein und die Cyclin (cyc)-Proteinfamilie p34^cdc2 (und sein Homolog p33^cdk2) (Pines et al. (1990) Nature 346: 760–763; Tsai et al. (1991) Nature 353: 174–177; Giordano et al. (1989) Cell 58: 981–990); den Transkriptionsfaktor E2F; das Adenovirusprotein E1A; und das transformierende E7-Protein aus dem menschlichen Papillomavirus binden (Whyte et al. (1988) Nature 334: 124–129; Chelappan et al. (1991) Cell 65: 1053–1061; Bandara et al. (1991) Nature 352: 249–252; Mundryj et al. (1991) Cell 65: 1243–1253; Pines et al. (1990), vorstehend; Tsai et al. (1991), vorstehend; Giordano et al. (1989), vorstehend; Shirodkar et al. (1992) Cell 68: 157–166; Devoto et al. (1992) Cell 68: 157–166; DeCaprio et al. (1988) Cell 54: 275–283; Dyson et al. (1989) Science 243: 934–937; Gage et al. (1990) J Virol 64: 723–730). Die Bindung der Cycline an p34^cdc2 und p33^cdk2 wird für die Aktivität der Kinase benötigt (Solomon et al. (1990) Cell 63: 1013–1024; Pines et al. (1990), vorstehend; Tsai et al. (1991), vorstehend; Giordano et al. (1989), vorstehend).
Die funktionellen Domänen der Proteine Rb und p107 wurden mit Hilfe von genetischen und biochemischen Mitteln kartiert. (Hu et al. (1990) EMBO J 9: 1147–1155; Ewen et al. (1991) Cell 66: 1155–1164; Ewen et al. (1992) Science 255: 85–87). Ein ungefähr 400 Aminosäuren großes Fragment von Rb und p107, welches die Rb-Tasche genannt wurde, ist für die Bindung dieser Proteine an die Onkoproteine und an zellulare Liganden von DNA-Tumor-Viren verantwortlich. Innerhalb dieser Domäne sind sechs Regionen mit einer sehr weitreichenden Sequenzähnlichkeit zwischen Rb und p107. (Ewen et al. (1991), vorstehend). In ähnlicher Weise teilen die Cycline eine große Region mit Sequenzähnlichkeit, die etwa 87 Aminosäuren umspannt und die „Cyclin-Box" genannt wurde. (Pines et al. (1989) Cell 58: 833–846). Von dieser Domäne wird angenommen, dass sie eine Rolle bei den Protein-Protein-Interaktionen spielt, und es wurde gezeigt, dass Deletionen von Sequenzen auf der aminoterminalen Seite zu dieser Domäne nicht die Funktion des Cyclins beeinflusst. (Murray et al. (1989) Nature 339: 280–286; Lew et al. (1991) Cell 66: 1197–1206).
Die Protein-Protein-Interaktionen von p34^cdc2 sind in menschlichen Tumoren verändert. Das Gen, das den Co-Faktor Cyclin A codiert, ist zum Beispiel im hepatozellulären Karzinom unterbrochen (Wang et al. (1990) Nature 343: 555–557). Neuere Daten haben außerdem gezeigt, dass Cyclin D1 (PRAD1) innerhalb des bcl-1-Locus liegt und dass eine Genumlagerung in parathyroidalen Tumoren und einigen B-Zell-Leukämien vorliegt. (de Boer et al. (1993) Cancer Res 53: 4148–4152; Motokura et al. (1991) Nature 350: 512–515). Der bcl-1-Locus ist außerdem häufig im Mammakarzinom vervielfacht und Cyclin D1 ist in im Hautkarzinom der Maus überexprimiert (Lammie et al. (1991) Oncogene 6: 439–444; Bianchi et al. (1993) Oncogene 8: 1127–1133; Buckley et al. (1993) Oncogene 8: 2127–2133). Des weiteren sind die Untereinheiten der cdk-Kinasen in transformierten Zellen umgelagert, wenn man sie mit ihren normalen Gegenstücken vergleicht (Xiong et al. (1993) Genes and Development 7: 1572–1583). Dies ist das Ergebnis des Verlustes oder der Unterexpression des Proteins waf1/cip1, das normalerweise ein Repressor der cdk-Kinaseaktivitäten ist und das durch das Tumor-Suppressorprotein p53 reguliert wird (Xiong et al. (1993) Nature 366: 701–704; Serrano et al. (1993) Nature 366: 704–707; Gu et al. (1993) Nature 366: 707–710; Harper et al. (1993) Cell 75: 805–816; E1-Deiry et al. (1993) Cell 75: 817–825). Diese Daten deuten eindeutig auf die Beteiligung der Veränderung der Kinaseaktivität von p34^cdc2 in der Onkogenese.
Dementsprechend würden Inhibitoren der p34^cdc2-Aktivtät nützlich bei der Regulation und der Kontrolle des kontinuierlichen, proliferativen Wachstums von Krebszellen sein.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Liganden zur Verfügung, die den Verlauf der zellulären Proliferation durch Verhindern des Fortschreitens durch die G₁/S- oder die G₂/M-Grenzen hindurch durch die Inhibition der Aktivität der Kinase p34^cdc2 inhibieren. Die Liganden sind als Modulatoren von Zellwachstum und Proliferation nützlich, das/die von der Kinase p34^cdc2 vermittelt wird, und eignen sich daher als Mittel zur Erforschung der Mechanismen, durch welche sich die Krebszellen in einer kontinuierlichen Weise teilen, und als Mittel zur Verbesserung von Tumoren, die mit der Zerstörung von Genen einhergehen, die für essentielle Cycline codieren, wie zum Beispiel hepatozelluläre Karzinome, Nebenschilddrüsentumore, verschiedene B-Zell-Leukämien und Mammakarzinome oder Tumore, die eine p53-Mutation oder den Verlust von waf1/cip1 enthalten.
Dementsprechend ist die Erfindung in einer Ausführungsform auf einen Inhibitor der Aktivität der Zellzyklus-regulierenden Kinase p34^cdc2 oder auf einen Inhibitor der Aktivität der Kinase p33^cdk2 gerichtet, wobei der Inhibitor von der alpha-Helix II-Domäne von p107 ableitbar ist und wobei der Inhibitor außerdem aus 200 Aminosäuren besteht, einschließlich der Aminosäurensequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3) oder Austausche der Sequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3), bei welchen die inhibitorische Aktivität erhalten bleibt.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Inhibitor ein Peptid, das die Aminosäuresequenz LCAFYIMAK (SEQ ID NO: 1) einschließt, ein Peptid, das die Aminosäurensequenz MCSMYGICK (SEQ ID NO: 2) einschließt, ein Peptid, das die Aminosäurensequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3) einschließt, oder Austausche in diesen Sequenzen, bei welchen die inhibitorische Aktivität erhalten bleibt.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung auf einen Inhibitor des E7-Proteins aus dem menschlichen Papillomavirus gerichtet, wobei der Inhibitor von der Alpha-Helix II-Domäne von p107 ableitbar ist und wobei der Inhibitor außerdem aus 200 Aminosäuren besteht, einschließlich der Aminosäurensequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3) oder Austausche in der Sequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3), bei welchen die inhibitorische Aktivität erhalten bleibt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung auf einen Komplex gerichtet, umfassend:

(a) p34^cdc2 oder p33^cdk2; und
(b) einen Inhibitor der Aktivität der Zellzyklus-regulierenden Kinase p34^cdc2, wobei der Inhibitor von der Alpha-Helix II-Domäne von p107 ableitbar ist und wobei der Inhibitor außerdem aus 200 Aminosäuren besteht, einschließlich der Aminosäurensequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3) oder Austausche in der Sequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3), bei welchen die inhibitorische Aktivität erhalten bleibt, und wobei dem Komplex im Wesentlichen eine Kinaseaktivität fehlt.

In einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung auf einen Komplex gerichtet, umfassend:

(a) E7-Protein aus dem menschlichen Papillomavirus; und
(b) einen Inhibitor des E7-Proteins aus dem menschlichen Papillomavirus, wobei der Inhibitor von der Alpha-Helix II-Domäne von p107 ableitbar ist und wobei der Inhibitor außerdem aus 200 Aminosäuren besteht, einschließlich der Aminosäurensequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3) oder Austausche in der Sequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3), bei welchen die inhibitorische Aktivität erhalten bleibt.

In einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung auf ein Verfahren gerichtet, welches die Aktivität der Zellzyklus-regulierenden Kinase p34^cdc2 oder die Aktivität einer homologen Kinase hemmt und das Bereitstellen eines p34^cdc2-Inhibitors, wie vorstehend beschrieben wurde, und das Inkontaktbringen von p34^cdc2 oder einer homologen Kinase davon mit einer inhibierenden Menge davon umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung auf ein Verfahren gerichtet, welches die Aktivität des E7-Proteins aus dem menschlichen Papillomavirus hemmt und das Bereitstellen eines Inhibitors des E7-Proteins aus dem menschlichen Papillomavirus und das Inkontaktbringen des E7-Proteins aus dem menschlichen Papillomavirus mit einer inhibierenden Menge davon umfasst.
Diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden der Fachmann leicht angesichts der hierin dargelegten Offenbarung verständlich werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 veranschaulicht einen Vergleich der Aminosäuresequenzen verschiedener p34^cdc2-bindender Proteine, welche die Cycline A, B1, C, D und E, p107 und Rb (SEQ ID NO; 4–10) einschließen. Lücken wurden eingeführt, um die Homologie zu maximieren, und sind als Bindestriche dargestellt. Aminosäuren sind durch ihren Einzelbuchstabencode dargestellt. Kästchen deuten auf identische Aminosäuren oder konservative Veränderungen hin. Der gestrichelte Zylinder stellt die Region der α-Helix II dar.
2 veranschaulicht einen Graphen der prozentualen Inhibition der Histon H1-Kinaseaktivität von p34^cdc2 gegen die Konzentration des 9mer-Peptids von p107.
3 veranschaulicht Graphen der Bindung des 30mer-Peptids von p107 an HPV18-E7 (3A: MBP-E7 (•), nur MBP (Δ)) oder die Kompetition um die Interaktion des 30mer-Peptids von E7-p107 mit dem 9mer-Peptid von p107 (LCAFYIMAK [SEQ ID NO; 1]) (3B).
4 zeigt Graphen des Effekts des 9mer-Peptids von p107 (LCAFYIMAK [SEQ ID NO; 1]) auf die Bindung des Proteins MBP-E7 an das Protein Rb, wie mittels ELISA bestimmt wurde (4A: MBP-E7 (o); nur MBP (Δ)) oder durch kompetitive Bindung (4B: Rb gebunden (•)).
Ausführliche Beschreibung
Die Ausübung der vorliegenden Erfindung wird, außer es ist anders gekennzeichnet, konventionelle Techniken der Proteinchemie und der Biochemie, der Molekularbiologie, der Mikrobiologie und der rekombinanten DNA-Technologie verwenden, welche dem Fachmann bekannt sind. Solche Techniken sind vollständig in der Literatur erklärt. Vergl. z. B. Sambrook, Fritsch & Maniatis, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", zweite Ausgabe (1989); „DNA Cloning", Bd. I und II (DN Glover, Hrsg., 1985); „Oligonucleotide Synthesis" (MJ Gait, Hrsg., 1984); „Nucleic Acid Hybridization" (BD Hames & SJ Higgins, Hrsg., 1984); „Anima) Cell Culture" (RK Freshney, Hrsg., 1986); „Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press, 1986); Perbal B, „A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984); die Serie „Methods In Enzymology" (S Colowick und N Kaplan, Hrsg., Academic Press, Inc).
Alle Patente, Patentanmeldungen und Veröffentlichungen, die hierin zitiert werden, entweder vorstehend oder nachfolgend, sind hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen.
Die singulären Formen „ein", „eine" und „der/die/das" schließen, so wie sie in dieser Beschreibung und in den beigefügten Ansprüchen verwendet werden, die Bezugnahme auf den Plural ein, außer der Inhalt schreibt eindeutig etwas anderes vor.
A. Definitionen
In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Ausdrücke verwendet und es wird beabsichtigt, sie zu definieren, wie nachfolgend beschrieben wird.
Mit „p34^cdc2" und „p34^cdc2-Kinase" oder "Zellzyklus-regulierende Kinase p34^cdc2", wobei die Ausdrücke austauschbar verwendet werden, ist ein etwa 32–34 kDa großes Protein gemeint, das anderweitig auch als MPF (Maturation/M Phase promoting factor oder mitosis-promoting factor, Reifung/M-Phase fördernder Faktor oder Mitose fördernder Faktor) bekannt ist und eine Protein-Serin/Threonin-Kinaseaktivität besitzt (wie in Lee et al. (1987), vorstehend; Dunphy et al. (1988), vorstehend; und Gautier et al. (1988), vorstehend beschrieben wurde). Der Ausdruck umfasst das Produkt des Gens cdc2 von Schizosaccharomyces pombe und das Produkt des Gens cdc28 von Saccharomyces cerevisiae und homologe Produkte, die in anderen Arten gefunden wurden (vergl. Arion et al. (1988) Cell 55: 371–378; Dunphy et al. (1988), vorstehend; Gautier et al. (1988), vorstehend; und Labbé et al. (1988) Cell 57: 253–263), einschließlich des menschlichen Homologs dieser Proteine, p34^cdc2 (Lee et al. (1987), vorstehend). Die Kinaseaktivität von p34^cdc2 ist abhängig von der Bindung an spezifische Cycline und posttranslationalen Modifikationen von den Aminosäureresten Thr-14 und Tyr-15.
Der Ausdruck „p33^cdk2" und „p33^cdk2-Kinase" oder "Zellzyklus-regulierende Kinase p33^cdk2" bezieht sich auf ein Cyclin-abhängiges Kinasehomolog der Kinase p34^cdc2, deren Aktivität auf ähnlicher Weise von der Bindung mit einem oder mehreren Cyclin-Molekülen abhängig ist (Tsai et al. (1991), vorstehend; Rosenblatt et al. (1992), Proc Natl Acad Sci USA 89: 2824–2828; Elleage et al., Proc Natl Acad Sci USA 89: 2907–2911).
Mit dem Begriff „eine p34^cdc2-bindende Domäne" ist der Teil eines fraglichen Moleküls (z. B. ein Rb, p107 oder ein Cyclin) gemeint, das entweder direkt oder indirekt mit der Kinase p34^cdc2 interagiert und dabei die Aktivität der Kinase hemmt. Die Bindungsdomäne kann ein sequentieller Anteil des Moleküls sein, z. B. eine Sequenz von benachbarten Aminosäuren, oder sie kann eine Konformationsdomäne sein, z. B. eine Kombination von Sequenzen von nichtbenachbarten Aminosäuren, die, wenn das Molekül in seiner nativen Form vorliegt, eine Struktur formen, die mit der Kinase p34^cdc2 interagiert.
Mit dem Ausdruck „abgeleitet sein von" einer Bindungsdomäne ist jede molekulare Einheit gemeint, die identisch, im Wesentlichen homolog, komplementär oder auf anderer Weise funktionell oder strukturell äquivalent zu der nativen Bindungsdomäne von p34^cdc2 des fraglichen Moleküls (z. B. ein Rb, ein p107 oder ein Cyclin) ist. Daher kann ein Molekül, das von einer bestimmten Bindungsdomäne abgeleitet ist, die Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Ligandenbindungsstelle umfassen, jeden Anteil dieser Bindungsstelle oder andere molekulare Einheiten, die funktionieren, um einen assoziierten Liganden zu binden. Ein Molekül, das von einer solchen Bindungsdomäne abgeleitet ist, wird entweder direkt oder indirekt mit der Kinase p34^cdc2 in einer solchen Weise interagieren, dass es die native Bindungsdomäne nachahmt. Solche molekularen Einheiten können kompetitive Inhibitoren, nachahmende Peptide und dergleichen sein.
Mit dem Ausdruck ein „Inhibitor der Kinaseaktivität von p34^cdc2" oder ein „Inhibitor der Kinaseaktivität von p33^cdk2" wird beabsichtigt ein Peptid oder ein Peptidfragment zu bezeichnen, das von einer p34^cdc2-Bindungsdomäne von einem Rb, p107 oder einem Cyclin abgeleitet ist, das entweder direkt oder indirekt mit p34^cdc2 oder p33^cdk2 interagiert und die Aktivität der Kinase hemmt. Wenn der Inhibitor ein Cyclin-Protein ist, wird er nicht die vollständige Sequenz des Wildtyp-Moleküls einschließen. Ein Inhibitor kann die Aktivierung der Cyclin-abhängigen Kinase durch das kompetitive Inhibieren der Bindung der Cycline an p34^cdc2 verhindern. Zusätzlich können nachahmende Peptide, synthetische Moleküle mit physikalischen Strukturen, die entworfen wurden, um strukturelle Merkmale eines bestimmten Peptids nachzuahmen, auf ähnliche Weise als Inhibitoren der Kinaseaktivität dienen. Solche Inhibitoren vermindern die enzymatische Katalyse des Transfers des endständigen Phosphats von ATP oder eines ähnlichen ATP-Analogs oder von anderen Nucleotidtriphosphaten auf ein geeignetes Substrat von p34^cdc2 oder p33^cdk2. Solche Substrate schließen Histon H1, DNA-Polymerase α, RNA-Polymerase II, Rb, p53, Nucleolin, cAb1, das große T-Antigen von SV40, Lamin A und dergleichen ein. In einer anderen Ausführungsform können solche Inhibitoren die Fähigkeit von aktiviertem (z. B. dephosphoryliertem) p34^cdc2 vermindern, um das Fortschreiten durch den Zellzyklus zu unterstützen, wie mittels geeigneter Zellzyklusuntersuchungen bestimmt wurde (vergl. z. B. Pines et al. (1989), vorstehend). Eine solche Inhibition kann durch einen direkten, kompetitiven Mechanismus oder durch einen indirekten, nicht- oder unkompetitiven Mechanismus erfolgen.
Ein „Inhibitor des E7-Proteins aus dem menschlichen Papillomavirus" ist ein Molekül, das mit dem transformierenden Protein E7 interagiert, entweder direkt oder indirekt, um die Erzeugung des spezifischen Komplexes mit Rb zu verhindern. Diese Inhibitoren können wie die Inhibitoren der Kinase p34^cdc2 die Bindung durch eine kompetitive Inhibition oder durch einen indirekten, nicht- oder unkompetitiven Mechanismus verhindern. Zusätzlich umfasst dieser Begriff Peptid-Inhibitoren sowie nachahmende Peptide.
Die inhibitorische Aktivität eines zur Auswahl stehenden Peptids oder eines nachahmenden Peptids kann dadurch bestimmt werden, dass die Fähigkeit des zur Auswahl stehenden Moleküls bestimmt wird, einen Zielempfänger, d. h. p34^cdc2, p33^cdk2 oder HPV-E7, zu binden. Zum Beispiel können solche zur Auswahl stehenden Moleküle, die den Zielempfänger mit einer geeigneten Affinität und Spezifität binden, auf ihre Fähigkeit hin untersucht werden, die Aktivität des Zielempfängers zu inhibieren. Bei p34^cdc2 und p33^cdk2 kann die Fähigkeit des Inhibitors, die Kinaseaktivität zu vermindern, bestimmt werden. Bei HPV-E7 kann die Fähigkeit des zur Auswahl stehenden Inhibitors, mit Rb um die Bindung an E7 zu konkurrieren, bestimmt werden. Schließlich kann die Fähigkeit eines zur Auswahl stehenden Inhibitors, das Fortschreiten einer synchronisierten Population von transformierten Zellen durch den Zellzyklus zu verhindern, bestimmt werden, um die inhibitorische Aktivität im Rahmen vollständiger Zellen zu ermitteln. HeLa-Zellen können zum Beispiel unter Verwendung von Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, synchronisiert werden (vergl. Lew et al. (1991), vorstehend). Die Inhibition der Zellzyklusprogression durch die G₁/S-Grenze wird durch eine Verminderung der DNA-Synthese in der Zellpopulation ermittelt. Die Inhibition der Zellzyklusprogression durch die G₂/M-Grenze wird durch das Fehlen der mitotischen Aktivität bestimmt (z. B. Zellteilung).
„Nachahmende Peptide" sind Strukturen, die als Austausche für Peptide bei Interaktionen mit den Empfängermolekülen dienen (für einen Übersichtsartikel über nachahmende Peptide, vergl. Morgan et al. (1989) Ann Reports Med Chem 24: 243–252). Der Ausdruck nachahmende Peptide, wie er hierin verwendet wird, schließt synthetische Strukturen ein, die Aminosäuren und/oder Peptidbindungen enthalten können oder nicht, bei denen aber die strukturellen und funktionellen Merkmale eines Peptid-Liganden erhalten bleiben. Der Ausdruck „nachahmende Peptide" schließt ebenfalls Peptoide und Oligopeptoide ein, die Peptide oder Oligomere von N-substituierten Aminosäuren sind (Simon et al. (1972) Proc Natl Acad Sci USA 89: 9367–9371). Des weiteren sind Peptid-Banken, die Sammlungen von Peptiden sind, die so entworfen wurden, dass sie eine gegebene Anzahl von Aminosäuren besitzen und alle denkbaren Sequenzen von Aminosäuren, die diesen entsprechen, darstellen, in der Gruppe der nachahmenden Peptide eingeschlossen. Verfahren für die Herstellung von nachahmenden Peptiden sind nachfolgend vollständiger beschrieben.
Zwei Polypeptidsequenzen sind „im Wesentlichen homolog", wenn mindestens etwa 85% (vorzugsweise mindestens etwa 85% bis 90% und stärker bevorzugt mindestens etwa 95%) der Nucleotide oder Aminosäuren über eine definierte Länge des Moleküls übereinstimmen. Der Ausdruck im Wesentlichen homolog, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich ebenfalls auf Sequenzen, die identisch zu der spezifischen Polypeptidsequenz sind.
Die Begriffe „Polypeptid", „Peptid" und „Protein" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf jedes Polymer von Aminosäuren (Dipeptid oder größer), die über Peptidbindungen verbunden sind. Daher schließen die Begriffe „Polypeptid", „Peptid" und „Protein" Oligopeptide, Proteinfragmente, Analoge, Muteine, Fusionsproteine und dergleichen ein.
Die nachfolgenden Einzelbuchstabenabkürzungen für Aminosäuren werden durchgehend im Text verwendet:
B. Allgemeine Verfahren
Im Mittelpunkt der vorliegenden Erfindung steht die Entdeckung von Peptidmolekülen, die an die Kinase p34^cdc2 binden und ihre Aktivität inhibieren. Diese Moleküle sind von der Bindungsdomäne von Rb, p107 oder einem Cyclin abgeleitet. Diese Proteine, die in 1 dargestellt sind, binden p34^cdc2, sein Homolog p33^cdk2, den Transkriptionsfaktor E2F und das transformierende Protein E1A des Adenovirus. Zusätzlich bildet Rb einen spezifischen Komplex mit dem transformierenden Protein E7 des Papillomavirus. Die Peptid-Inhibitoren und nachahmende Peptide davon stellen nützliche Werkzeuge für die Analyse der normalen Funktion der Kinasen p34^cdc2 und p33^cdk2 und der transformierenden Faktoren wie z. B. E7 im Zellwachstum und bei der Proliferation von präkanzerösen und kanzerösen Zellen zur Verfügung. Da die Aktivität der Kinase p34^cdc2 essentiell für das Fortschreiten durch die G₁/S- und die G₂/M-Transitionsphasen des Zellzyklus ist, können Protein-Inhibitoren oder nachahmende Moleküle davon außerdem kanzerösem Gewebe verabreicht werden, um das Tumorwachstum zu unterdrücken.
Wie in den Beispielen gezeigt wird, schließen die in den Patentansprüchen enthaltenen Inhibitoren der Kinase p34^cdc2, der Kinase p33^cdk2 oder von HPV-E7 Sequenzen von Aminosäuren, die von den Bindungsdomänen von Proteinen abgeleitet sind, die mit p34^cdc2 und/oder HPV-E7 interagieren, und nachahmende Moleküle davon ein. Insbesondere sind die Inhibitoren von einer homologen Region abgeleitet, die in einer Reihe von p34^cdc2-bindenden Proteinen vorhanden ist und die als die α-Helix II-Region bekannt ist, wie in 1 gezeigt wird. Bei einem 30 Aminosäuren großen Peptid,
FEFTLVHCPDLMKDLMKDRHLDWLLLCAFYIMAK
(SEQ ID NO: 11), welches die α-Helix II-Sequenz von p107 umfasst, konnte hierin gezeigt werden, dass es an p34^cdc2 und p33^cdk2 bindet. Dieses 30 Aminosäuren große Peptid inhibiert ebenfalls die Histon H1-Kinaseaktivität von p34^cdc2 und p33^cdk2. Durch sequentielle Deletion von Aminosäuren am amino- oder carboxyterminalen Ende wurde eine fünf Aminosäuren große Sequenz (CAFYI (SEQ ID NrO: 3) als eine minimale Sequenz identifiziert, bei der die inhibitorische Aktivität erhalten bleibt. Des weiteren konnte bei einem Peptid gezeigt werden, das neun Aminosäuren besitzt (LCAFYIMAK (SEQ ID NrO: 1) und das fünf Aminosäuren große Peptid einschließt, dass es an p34^cdc2 mit einer Affinität von etwa 10 μM bindet. Daher werden nützliche Inhibitoren von p34^cdc2 der vorliegenden Erfindung mindestens von diesem 5mer abgeleitet und können von 50 bis zu 200 Aminosäuren einschließen, so lange eine geeignete Bindungskonformation beibehalten wird.
Das vorstehend beschriebene 30mer-Peptid bindet ebenfalls an das 18-E7-Protein des menschlichen Papillomavirus (HPV). Des weiteren inhibiert das 30mer-Peptid die Bindung von E7 an Rb, welches ein neun Aminosäuren großes Peptid ebenfalls tut, das von Rb abgeleitet ist (MCSMYGICK (SEQ ID NO: 2)).
Wie vorstehend erklärt wurde, können alle diese Peptide sowie Moleküle, die im Wesentlichen homolog, komplementär oder auf andere Weise funktionell oder strukturell äquivalent zu diesen Peptiden sind, für die Ziele der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die Peptid-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung können durch konventionelle Techniken synthetisiert werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, zum Beispiel durch eine chemische Synthese wie z. B. die Festphasen-Peptidsynthese. Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Im Allgemeinen verwenden diese Verfahren ein Syntheseverfahren entweder mit einer Fest- oder Flüssigphase, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Vergl. z. B. JM Stewart und JD Young, „Solid Phase Peptide Synthesis", 2. Auflage, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) und G Barany und RB Merrifield, „The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Herausgeber E Gross und J Meienhofer, Bd. 2, Academic Press, New York (1980), S. 3–254, für die Techniken der Festphasen-Peptid-Synthese; und M Bodansky, „Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag, Berlin (1984) und E Gross und J Meienhofer, Hrsg., „The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, vorstehend, Bd. 1, für die klassische Synthese in Lösung.
Wie vorstehend erklärt ist, werden nachahmende Peptide, die strukturell und funktionell die vorstehend beschriebenen Peptid-Inhibitoren nachahmen, hierin ebenfalls eine Verwendung finden und können erzeugt werden, wobei die nachfolgenden Strategien und Verfahren verwendet werden. Im Allgemeinen werden nachahmende Moleküle basierend auf Informationen entworfen, die durch den systematischen Austausch von L-Aminosäuren durch D-Aminosäuren, durch den Austausch von Seitenketteneinheiten durch eine Methylgruppe oder pseudoisosterischen Gruppen mit unterschiedlichen elektronischen Eigenschaften (vergl. Hruby et al. (1990), Biochem J 268: 249–262) und durch den systematischen Austausch von Peptidbindungen in den vorstehend beschriebenen Peptid-Inhibitoren durch Amidbindungen erhalten werden. Zum Beispiel können Analoge, die Surrogate mit Amidbindungen enthalten, dazu verwendet werden, um Aspekte der Peptidstruktur und -funktion wie z. B. die Drehungsfreiheit im Rückgrat, Muster der intra- und intermolekularen Wasserstoffbrücken, Modifikationen der lokalen oder der gesamten Polarität und der Hydrophobizität und die orale Bioverfügbarkeit zu untersuchen.
Zwänge in der lokalen Konformation können ebenfalls eingeführt werden, um Anforderungen an die Konformation für die Aktivität eines zur Auswahl stehenden, nachahmenden Peptid-Inhibitors von p34^cdc2, p33^cdk2, HPV-E7 oder von anderen Empfängern zu bestimmen. Zum Beispiel können β,β-disubstituierte Aminosäuren verwendet werden, um die Effekte von Konformationszwänge auf die Peptidaktivität zu untersuchen (vergl. z. B. Manning et al. (1982), J Med Chem 25: 408–414; Mosberg et al. (1983), Proc Natl Acad Sci USA 106: 506–512; Pelton et al. (1985), Proc Natl Acad Sci USA 82: 236–239).
Die nachahmenden Moleküle können isosterische Amidbindungen wie z. B. ψ[CH₂S], ψ[CH₂NH], ψ[CSNH₂], ψ[NHCO], ψ[COCH₂] und ψ[(E) oder (Z) CH=CH] einschließen (für einen Übersichtsartikel verl., Spatola (1983) in „Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptids und Proteins" Band VII (Weinstein, Hrsg.), Marcel Dekker, New York, 267–357). Strukturen, welche den tetraedrischen Transitionsstatus nachahmen, der mit der Hydrolyse einer Substratbindung assoziiert ist, können ebenfalls vorhanden sein und schließen Hydroxymethylen, Fluorketon-Einheiten und nachahmende Moleküle des Phosphoramidat-Transitionsstatus ein (Bühlmayer et al. (1988), J Med Chem 31: 1839; Sham et al. (1988), FEBS Lett 220: 299; Mathews (1988), Acc Chem Res 21: 333). Die synthetischen Moleküle können ebenfalls D-Aminosäuren einschließen, um Umkehrschleifen-Konformationen zu stabilisieren oder zu fördern und um zu helfen, die Moleküle vor der enzymatischen Degradation zu stabilisieren (vergl. z. B. Freidinger et al. (1985) in „Peptides: Structure and Function", (Deber et al., Hrsg.), Pierce Chem Co, Rockford, IL, 549–552); Sawyer et al. (1980), Proc Natl Acad Sci USA 77: 5754–5758; Torchiana et al. (1978) Arch Int Pharmacol Ther 235: 170–176). Zyklische Analoge von Aminosäuren können verwendet werden, um Aminosäurereste in einem bestimmten Konformationsstatus zu zwingen, z. B. αα'- und ββ'-substituierte, zyklische Aminosäuren wie z. B. 1-Aminocyclopentancarboxylsäure (Cycloleucin) und ββ'-Cyclopentamethylen-β-mercaptopropionsäure (vergl. Hruby et al. (1990), vorstehend).
Die nachahmenden Moleküle können ebenfalls nachahmende Moleküle der Sekundärstruktur von Peptid-Inhibitoren einschließen – Strukturen, welche die 3-dimensionale Orientierung der Aminosäurereste in den bekannten, sekundären Konformationen von Proteinen nachbilden können – einschließlich nachahmender Moleküle der β-Schleifen wie z. B. das Phenoxathin-Ringsystem und nachahmende Moleküle des β-Faltblatts wie z. B. Epindolidion-Strukturen. Das Design, die Synthese und die Konformationsanalyse einer Matrize, welche eine α-Helix einführt, wurde beschrieben (Kemp et al. (1988), Tetrahedron Lett 29: 4931; Kemp et al. (1988), Tetrahedron Lett 29: 4935).
Gleichermaßen finden Peptoide hierin ihre Verwendung. Peptoide sind Oligomere von N-substituierten Aminosäuren (Simon et al. (1972), vorstehend) und können als Motive für die Herstellung von chemisch unterschiedlichen Banken neuer Moleküle verwendet werden, die anschließend auf ihre Bindungen und ihre inhibitorische Aktivität von p34^cdc2, p33^cdk2, HPV-E7 oder anderer Empfängermoleküle getestet werden. Die Monomere können t-Butyl basierende Seitenketten und 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-α-Amin-Schutzgruppen einschließen.
Die Oligomerisierung der Peptod-Monomere kann zum Beispiel durch in situ Aktivierung entweder durch Benzotriazol-1-yloxytris(pyrrolidino)phosphoniumhexafluorphosphat oder durch Bromotris(pyrrolidino)phosphoniumhexafluorphosphat durchgeführt werden. Andere Schritte sind identisch zu der konventionellen Peptidsynthese unter Verwendung von α-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)Aminosäuren. Oligopeptoide, die Affinitäten besitzen, die vergleichbar zu den der entsprechenden inhibitorischen Peptide sind, können identifiziert werden und sind daher nützlich für Bindungsuntersuchungen mit den Kinasen p34^cdc2 und p33^cdk2 oder HPV-E7 (vergl. Simon et al. (1992), vorstehend).
Peptid-Liganden, die mit p34^cdc2 und p33^cdk2, HPV-E7 oder anderen Proteinempfängern interagieren, können unter Verwendung eines biologischen Expressionssystems entwickelt werden (vergl. Christian et al. (1992), J Mol Biol 227: 711–8; Devlin et al. (1990), Science 249: 404–406; Cwirla et al. (1990), Proc Natl Acad Sci USA 87: 6378–6382). Die Verwendung von solchen Systemen erlaubt die Herstellung von großen Banken von Peptidzufallssequenzen und das Absuchen dieser Genbanken nach Peptidsequenzen, die an bestimmte Proteine binden. Die Genbanken können durch Clonierung synthetischer DNA, welche die Peptidzufallssequenzen codiert, in Expressionsvektoren von Escherichia coli hergestellt werden. In dem filamentösen Phagensystem können fremde Peptidsequenzen auf der Oberfläche des infizierten Phagen exprimiert werden (vergl. Smith (1985), Science 228: 1315–1317; Parmley et al. (1988), Gene 73: 305–318).
Zum Beispiel kann eine Genbank durch Ligierung eines synthetischen DNA-Fragments, das eine degenerierte Codierungssequenz (NNK)_n enthält, in einen geeigneten Phagen hergestellt werden, wobei N für ein gleiches Gemisch der Desoxynucleotide G, A, T und C steht, K für ein äquimolares Gemisch von G und T steht und n für eine Anzahl von Aminosäureresten steht, die in dem Peptidprodukt erwünscht sind. Eine Affinitätsreinigung von auf Phagen gezeigten Affektorbindenden Peptiden kann durch die Biotinylierung des Affektors, Inkubation des Phagen mit dem biotinylierten Affektor und Umsetzung des Phagen auf den mit Streptavidin beschichteten Platten erfolgen. Die gebundenen Phagen werden eluiert und auf Agarmedium amplifiziert und weiteren Runden der Affinitätsreinigung unterzogen. Die Phagen der späteren Runden der Affinitätsreinigung werden cloniert und vermehrt, ihre DNAs werden sequenziert, um die Aminosäuresequenzen ihrer exprimierten Peptide zu bestimmen, und ihre Bindung an p34^cdc2, p33^cdk2, HPV-E7 oder an andere Affektormoleküle wird durch enzymverbundenen Immunadsorptionstest (ELISA) bestimmt. Solche Banken, die aus einer großen Anzahl von Clonen bestehen, die verschiedene, kurze Peptidsequenzen exprimieren, können verwendet werden, um Bindungsdomänen zu kartieren.
Große Banken von Peptid-Inhibitoren können ebenfalls durch die gleichzeitige Synthese von überlappenden Peptiden konstruiert werden, wie im U.S.-Patent Nr.4,708,871 von Geysen beschrieben wurde. Die synthetischen Peptide können auf ihre Interaktion mit den Empfängermolekülen mittels ELISA getestet werden, während sie noch an die Trägersubstanz gebunden sind, die für die Synthese verwendet wurde. Die feste Trägersubstanz ist im Allgemeinen ein Polyethylen- oder ein Polypropylenstab, auf dem ein polymerisiertes Vinylmonomer aufgepfropft ist, das mindestens eine funktionelle Gruppe enthält, um polymere Ketten auf dem Träger herzustellen. Man lässt die funktionellen Gruppen reagieren, um primäre oder sekundäre Amin-Gruppen bereitzustellen, die man sequentiell mit Aminosäureresten in einer geeigneten Reihenfolge reagieren lässt, um das gewünschte, synthetische Peptid aufzubauen, wobei konventionelle Verfahren der Festphasen-Peptidchemie verwendet wird.
Sobald sie hergestellt wurden, können die inhibitorischen Peptide oder die nachahmenden Peptide in Arzneimitteln verwendet werden, um Tumore zu verbessern, die mit der Zerstörung von Genen einhergehen, die für essentielle Cycline codieren, zum Beispiel für hepatozelluläre Karzinome, Nebenschilddrüsentumore, einige B-Zell-Leukämien und bestimmte Mammakarzinome oder Tumore, die mit dem Verlust der Funktion von p53 assoziiert sind. Die inhibitorischen Peptide der vorliegenden Erfindung können als therapeutische Zusammensetzungen in einer Vielzahl von Dosierungsformen formuliert werden, wie z. B. flüssige Lösungen oder Suspensionen, Tabletten, Pillen, Puder, Zäpfchen, polymere Mikrokapseln oder Mikrovesikel, Liposome und als Lösungen für die Injektion oder Infusion, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die bevorzugte Form ist von der Art der Verabreichung und von der bestimmten Krebsart abhängig, die behandelt werden soll. Die Zusammensetzungen schließen auch vorzugsweise pharmazeutisch verträgliche Vehikel, Träger oder Adjuvanzien ein, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, wie z. B. menschliches Serumalbumin, Ionenaustauscher, Tonerde, Lecithin, Puffersubstanzen wie Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat und Salze oder Elektrolyte wie z. B. Protaminsulfat. Geeignete Vehikel sind zum Beispiel Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dergleichen und Kombinationen davon. Aktuelle Verfahren der Herstellung solcher Zusammensetzungen sind bekannt oder werden dem Fachmann offensichtlich sein. Vergl. z. B. „Remingtons's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishiing Company, Easton, Pennsylvenia, 18. Ausgabe, 1990.
Die vorstehenden Zusammensetzungen können unter Verwendung von konventionellen Verfahren der Verabreichung verabreicht werden, einschließlich der intravenösen, intraperitonealen, oralen, intralymphatischen oder der subkutanen Verabreichung, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die lokale Verabreichung an den in Frage kommenden Tumor wird ebenfalls in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden.
Therapeutisch wirksame Dosen werden vom Fachmann leicht bestimmt werden und werden von der Schwere und dem Verlauf der Erkrankung, von der Gesundheit des Patienten und dem Ansprechen auf die Behandlung und von der Einschätzung des behandelnden Arztes abhängig sein.
C. Experimentelle Ansätze
Nachfolgend werden Beispiele von spezifischen Ausführungsformen dargestellt, mit deren Hilfe die vorliegende Erfindung durchgeführt werden kann. Die Beispiele werden ausschließlich für erläuternde Zwecke angeboten und es wird nicht beabsichtigt, den Bereich der vorliegenden Erfindung auf irgendeine Weise einzuschränken.
Anstrengungen wurden unternommen, um die Genauigkeit bezüglich der verwendeten Zahlen (z. B. Mengenangaben, Temperaturen, etc.) zu garantieren, aber einige experimentelle Fehler und Abweichungen sollten in Betracht gezogen werden.
Experimentelle Verfahren
Lysate von HeLa-Zellen: Extrakte von HeLa-Zellen dienten als Quelle von p34^cdc2 und p33^cdk2 und wurden wie nachfolgend hergestellt. HeLa-Zellen wurden in 20 mM N-[2-hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-hydroxypropansulfonsäure] (HEPES), pH-Wert 7,0, 150 mM NaCl, 5 mM Natriumvanadat, 10 mM Na₄P₂O₇, 1 mM ZnCl₂, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 2 mM Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA), 1 mM Dithiothreit (DTT), 0,25 Vol-% NP-40, 1 mM Benzamidin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und jeweils 20 μg/ml von N₂S₂O₂, Leupeptin, Antipan und Pepstatin lysiert und anschließend wurde das Lysat zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen.
Immunpräzipitation von p34^cdc2: Es wurde eine Immunpräzipitation von p34^cdc2 aus Extrakten von HeLa-Zellen durchgeführt, wobei Verfahren, von denen zuvor berichtet wurde (Harlow et al. (1988) in: „Antibodies: A Laboratory Manual", Hrsg. Harlow and Lane, Cold Spring Habor: Cold Spring Habor Laboratory, S. 421–470), und der anti-p34^cdc2-Antikörper G6 (Gibco, BRL) verwendet wurden. Die durch dieses Verfahren erfolgte Immunpräzipitation ergibt einen aktiven Kinase-Komplex (Draetta et al. (1988), Cell 54: 17–26).
Untersuchung der Kinaseaktivität von p34^cdc2: Histon H1-Kinase-Reaktionen wurden in 50 mM Tris, pH-Wert 8,0, 10 mM MgCl₂, 0,5 mM DTT, 1 mM EGTA plus 0,1 mM ATP, 1 μCi γ-[³²P]-ATP und 10 μg Histon H1 (Boeringer Mannheim) und einer Quelle von p34^cdc2 durchgeführt. Die Reaktionsansätze wurden bei 30°C für 20 Minuten inkubiert und durch die Zugabe von Probenpuffer für Proteingele gestoppt. Die Kinase-Reaktionen wurden durch SDS-PAGE (12,5% Gel) getrennt. Die Banden wurden durch Autoradiographie detektiert und die Menge des eingebauten ³²P wurde unter Verwendung eine Ambis Radioanalytic Imaging Systems quantifiziert.
Beispiel 1
Vergleich von p34^cdc2-bindenden Proteinen
Inhibitoren der Aktivität der Zellzyklus-regulierenden Kinase p34^cdc2 wurden identifiziert, indem zunächst die primäre Aminosäurensequenz von bekannten, p34^cdc2-assoziierten Proteinen: menschliches Cyclin A, B1, C, D, E, das Protein p107 und das Retinoblastom-Tumor-Suppressor-Protein (Rb) [SEQ ID NO: 4–10] verglichen wurden. Die grundsätzliche Ausrichtung der menschlichen Cyclin-Proteine wurde von Lew et al. (1991), vorstehend, gezeigt und die Ausrichtung von Rb und p107 wurde von Ewen et al. (1991), vorstehend, durchgeführt. Die Sequenzen von allen sieben Proteinen wurden anschließend verglichen, wie in 1 veranschaulicht wird. Die Analyse der Sekundärstruktur von allen sieben Sequenzen wurde durchgeführt, wobei Programme zur Strukturvorhersage sowohl von Chou-Fasman (Chou et al. (1974), Biochemistry 13: 211–222; Chou et al. (1974), Biochemistry 13: 222–245) als auch Robson-Garnier (Garnier et al. (1978), J Mol Biol 120: 97–120) verwendet wurden. Zwei Regionen einer gemeinsamen α-Helix-Struktur, die als α-Helix I und α-Helix II bezeichnet wurden, wurden für sechs der sieben Proteine durch beide Programme zur Strukturvorhersage vorhergesagt.
Eine 170 Aminosäuren große Region mit Sequenzähnlichkeit wurde zwischen Rb, p107 und den menschlichen Cyclinen beobachtet. Rb und p107 teilten sich den höchsten Grad der Ähnlichkeit mit Cyclin E von 27% beziehungsweise 34%. Diese Sequenzen enthalten zwei Regionen von allgemeiner vorhergesagter α-Helix-Struktur. Die Projektion der α-Helix II-Sequenzen von Rb, p107 und Cyclin E auf ein helikales Rad zeigt, dass die konservierten Reste auf der Oberfläche der α-Helix liegen.
Beispiel 2
Bindung von p34^cdc2 an p107
Um zu testen, ob die α-Helix II-Domäne in der Interaktion von Rb, p107 und Cyclin E mit p34^cdc2 involviert ist, wurde ein 30 Aminosäuren großes Peptid von p107 (Reste 692–721:
FEFTLVHCPDLMKDLMKDRHLDWLLLCAFYIMAK
[SEQ ID Nr.: 11]), das die α-Helix II umfasst, synthetisiert und auf seine Fähigkeit untersucht, mit p34^cdc2 zu assoziieren. Das 30mer wurde kovalent an CH-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) gebunden, wie nachfolgend beschrieben wird. Das 30 Aminosäuren große Peptid von p107, das in wässriger Lösung unlöslich war, wurde in N,N-Dimethylformamid an die Sepharose gebunden. Die Konzentration des 30mers, das an die Kugeln gebunden war, betrug 0,85 μMol/ml, was durch HPLC bestimmt wurde. Die p107-30mer-Sepharose wurde mit Gesamtzelllysat von HeLa-Zellen inkubiert und mit dem 25fachen Volumina des Lysispuffers gewaschen. Die gebundenen Proteine wurden mit steigenden Konzentrationen von NaCl eluiert, durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (12,5% Gel) getrennt und auf Polyvinyliden-Difluorid (PVDF)-Membranen transferiert. Das p34^cdc2 wurde durch die Markierung der Membran mit dem anti-p34^cdc2-Antikörper G6 (Gibco, BRL) detektiert (vergl. Draetta et al. (1988), vorstehend).
Die p107-30mer-Sepharose bindet an p34^cdc2 und die Mehrheit des Komplexes war in 2 M NaCl stabil. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aminosäuresequenz innerhalb der α-Helix II genügend Informationen enthält, um die Interaktion mit p34^cdc2 zu steuern.
Beispiel 3
Bindung von p33^cdk2 an p107
Die Fähigkeit von p107, p33^cdk2 zu binden, wurde untersucht, wobei die Verfahren verwendet wurden, die in Beispiel 2 beschrieben wurden. Die p107-30mer-Sepharosekugeln wurden mit Extrakten von HeLa-Zellen (3 × 10⁵ Zellen pro Reaktion) inkubiert und anschließend ausgiebig gewaschen. Die gebundenen Komplexe wurden anschließend auf einem 12,5%igen SDS-PAGE-Gel getrennt und auf eine PVDF-Membran geblottet. Der Blot wurde anschließend mit dem Kinase-Antikörper abgesucht. Die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse mit dem anti-p33^cdk2-Antikörper (Upstate Biotechnology) deuten darauf hin, dass das 30 Aminosäuren große Peptid von p107 diese Untereinheit der Kinase bindet.
Beispiel 4
Histon H1-Kinaseaktivität des gebundenen und immunpräzipitierten p34^cdc2
Um die Effekte der Bindung von p34^cdc2 an die p107-30mer-Sepharose auf die Kinaseaktivität von p34^cdc2 zu untersuchen, wurden die Histon H1-Kinaseaktivitäten, die mit der p107-30mer-Sepharose und dem immunpräzipitierten p34^cdc2 assoziiert waren, verglichen, wie nachfolgend beschrieben wird. Das p34^cdc2 wurde an die p107-30mer-Sepharose gebunden, wie in Beispiel 2 beschrieben wurde. Die Histon H1-Kinasereaktionen wurden durchgeführt, wobei entweder immunpräzipitiertes oder an p107-30mer-Sepharose gebundenes p34^cdc2 verwendet wurde. Die Menge von p34^cdc2, das an die p107-30mer-Sepharose gebunden war, wurde mit der in dem Immunkomplex enthaltenen durch Western-Blot verglichen. Die zweifache Menge von immunpräzipitiertem p34^cdc2, das in der Kinasereaktion verwendet wurde, wurde geblottet, um einen einfacheren Nachweis zu ermöglichen. Die Menge an p34^cdc2, das mit der p107-30mer-Sepharose assoziiert war, wurde mit Hilfe von Densitometrie auf ≥ 50fach größer als die Menge bestimmt, die in den Immunkomplexen enthalten war. Diese Daten wurden verwendet, um die Kinaseaktivität zu normalisieren, die mit den verschiedenen Kugeln assoziiert war.
Die beobachtete Histon H1-Kinaseaktivität für das Enzym, das an das 30 Aminosäuren große Peptid von p107 gebunden war, ist ähnlich zu der des Immunkomplexes. Die Normalisierung der Menge des Proteins p34^cdc2, das in beiden Reaktionen vorlag, zeigte, dass das an das Peptid gebundene Enzym eine spezifische Aktivität hat, die nur 1,4% der spezifischen Aktivität des Immunkomplexes betrug. Dies stimmt mit der Tatsache überein, dass das 30mer von p107 mit dem Cyclin um die Bindung an p34^cdc2 konkurriert, und ist ein Anzeichen dafür, dass ein gemeinsamer Mechanismus der Bindung von Cyclinen, Rb und p107 vorliegt.
Beispiel 5
Peptidinhibition der Histon H1-Kinaseaktivität von p34^cdc2
Als einen weiteren Test der Assoziation von p107 und p34^cdc2 und um die minimale Sequenz zu bestimmen, die für die Interaktion mit p34^cdc2 notwendig ist, wurde der Effekt von p107-Peptiden auf die Histon H1-Kinaseaktivität des p34^cdc2-Immunkomplexes bestimmt. Deletionen sowohl am Amino- als auch am Carboxy-Ende wurden in das ursprüngliche 30 Aminosäuren große Peptid eingebracht (vergl. Tabelle 1). Die Peptide wurden durch Standardverfahren synthetisiert und durch HPLC gereinigt. Immunkomplexe wurde hergestellt, wie in Beispiel 4 beschrieben wurde, und in Kinasepuffer plus 50 μM des jeweiligen Peptides, das in N,N-Dimethylformamid solubilisiert war, oder einem ähnlichen Volumen eines Lösungsmittel resuspendiert. Nach der Inkubation der Reaktionen für 15 Minuten auf Eis wurden Histon H1 und γ-[³²P]-ATP zugegeben und die Kinaseuntersuchungen wurden durchgeführt und quantifiziert, wie in Beispiel 4 beschrieben wurde.
Die Zugabe der p107-Peptide hemmt die Histon H1-Kinaseaktivität, die mit dem Immunkomplex assoziiert war (vergl. Tabelle 1). Die Zugabe der p107-Peptide zu einer Kinasereaktion von p33^cdk2 hemmte ebenfalls die Aktivität der Kinase.
Peptide mit Deletionen von amino-terminalen Sequenzen bis zu Cys₇₁₃ und carboxy-terminalen Sequenzen bis zu Ile₇₁₇ behielten die Fähigkeit, die Aktivität von p34^cdc2 zu hemmen. Weitere Deletionen entweder bis zu Ala₇₁₄ oder Tyr₇₁₆ resultierten in inaktiven Peptiden. Ein nicht verwandtes 19mer-Kontrollpeptid hatte keinen Effekt auf die Histon H1-Aktivität.
Diese Daten zeigen, dass die minimale Sequenz, welche die inhibitorische Aktivität behält, ein Pentapeptid mit der Sequenz CAFYI [SEQ ID NO: 3] war. Nicht konservierte Substitutionen von Aminosäuren innerhalb des Pentapeptids mit Ausnahme von Cys₇₁₃ hoben die Inhibition der Kinase p34^cdc2 vollständig auf.
Beispiel 6
Effekte von Substitutionen einzelner Aminosäuren auf die inhibitorische Akti vität von p107-Peptiden auf p34^cdc2
Um die Rolle von Cys₇₀₆ von Rb und Cys₇₁₃ von p107 bei der Bindung von p34^cdc2 und anderen Liganden wie z. B. E1A oder E2F zu untersuchen, wurde ein Peptid synthetisiert, das den Austausch der Aminosäure Cys zu Phe in Position 713 enthielt und seine inhibitorische Aktivität wurde untersucht. Diese einzelne Mutation resultierte in einer 30%igen Abnahme der Fähigkeit des Peptids, die Histon H1-Kinaseaktivität zu inhibieren, und bestätigte die Wichtigkeit von Cys₇₁₃ bei der Interaktion des Peptids p107 und p34^cdc2 (vergl. Tabelle 1, 9mer gegen 713CF). Dieser Rest ist ebenfalls in den Cyclinen D und E konserviert und könnte in einer ähnlichen Weise funktionieren. Des weiteren hebt der Austausch von Ala für Tyr₇₁₆, welches bei den anderen untersuchten Proteinen hoch konserviert ist, vollständig die Inhibition der Kinase p34^cdc2 auf (vergl. Tabelle 1, 9mer gegen 716YA). Diese Daten deuten ebenfalls darauf hin, dass die p107-Peptide dazu fähig sind, mit zellulären Faktoren, die an p34^cdc2 gebunden sind und die für die Aktivität der Kinase notwendig sind, zu konkurrieren und diese zu ersetzen (Pines et al. (1989), vorstehend; Murray et al. (1989), vorstehend; Solomon et al. (1990), vorstehend; Draetta et al. (1989), Cell 56: 829–838), und gehen mit früheren Beobachtungen einher, dass ein niedriger Spiegel an Kinaseaktivität mit der p107-30mer-Peptid-Sepharose assoziiert ist.
Beispiel 7
Affinität des p107-9mers für p34^cdc2, untersucht durch die Inhibition der Histon H1-Kinaseaktivität
Die Bindungsaffinität des 9mer-Peptids für p34^cdc2 wurde annähernd bestimmt, indem die prozentuale Inhibition der Histon H1-Kinaseaktivität und die Peptidkonzentration in Beziehung gesetzt wurden. Die Reaktionen wurden durchgeführt, wie in Beispiel 4 beschrieben wurde. Die prozentuale Inhibition wurde quantifiziert, wobei ein Ambis Radioanalytic Imaging System verwendet wurde. Die prozentuale Inhibition wurde gegen die Peptidkonzentration aufgetragen. Bei der Berechnung einer Bindungskonstanten wurde angenommen, dass die Konzentration von Substrat und Peptid in einem großen Überschuss zum Protein p34^cdc2 vorlag, von dem angenommen wurde, dass es die Reaktion limitierte.
Wie in 2 veranschaulicht wird, wurde die k_d vom Punkt der 50%igen Inhibition berechnet, wobei sich eine k_d ≈ 10 μM ergab. Die Bindungsaffinität des Peptids für p34^cdc2 könnte durch die Fähigkeit des Peptids, die Aktivität von p34^cdc2 effizient zu inhibieren, ähnlich zu der des gesamten Moleküls sein, was in direkter Beziehung zu der Fähigkeit steht, mit aktivierenden Faktoren zu konkurrieren.
Beispiel 8
Affinität des p107-9mers für p34^cdc2, gemessen durch ELISA
Ein auf ELISA basierendes Verfahren wurde entwickelt, um die Aktivität von p107-Peptiden und ihren Derivaten zu messen. Eine Sammel(„cluster")platte mit 96. Vertiefungen, die mit dem p107-30mer beschichtet war, bindet die Kinase p34^cdc2 aus Zellextrakten. Diese Bindung ist leicht mit anti-p34^cdc2-Antikörpern nachweisbar und kann verwendet werden, um die Affinität des Wildtyps p107 und von mutierten Peptiden für die Kinase p34^cdc2 zu untersuchen, zusätzlich zu der Untersuchung der Inhibition der Kinase, die in Beispiel 7 beschrieben wurde. Eine Zusammenfassung aller Modifikationen der ursprünglichen p107-Peptide und ihrer Effekte auf Bindung und Inhibition der Kinase wird in Tabelle 1 dargestellt. Die Affinität des p107-9mer-Peptids für die Kinase p34^cdc2 beträgt ungefähr 10 μM, wie mittels der auf ELISA basierenden Kompetitionsuntersuchung gemessen wurde, was mit der Bindungskonstante übereinstimmt, die von der Untersuchung der Inhibition der Kinase geschätzt wurde, wie in Beispiel 7 beschrieben wurde.
Die Einführung einer nicht konservativen Substitution einer Aminosäure innerhalb der Sequenz des Pentapeptids CAFYI [SEQ ID NO; 3] resultierte in einer starken Abnahme sowohl bei der Inhibition von p34^cdc2 als auch bei der Bindung der Kinase mit Ausnahme von Cys₇₁₃.
Diese Daten zeigen, dass das Protein p107 dazu fähig ist, mit p34^cdc2 eine Bindung einzugehen. Dies ist in Übereinstimmung mit seiner Homologie zu Rb und den Cyclin-Proteinen und zeigt eine strukturelle Basis für funktionelle Ähnlichkeiten, die von diesen Proteinen geteilt werden.
Beispiel 9
Inhibition des E7-Protein aus dem menschlichen Papillomavirus
Rb und p107 bilden spezifische Komplexe mit dem Onkoprotein E1A des Adenovirus und Rb bildet einen ähnlichen Komplex mit dem Onkoprotein E7 des menschlichen Papillomavirus (HPV). Um zu bestimmen, ob die Domäne des p107-30mer-Peptids und Rb mit anderen Tumor-Supressor-Proteinen oder anderen zellulären und viralen Liganden interagieren können, wurde die Bindung des p107-30mer-Peptids an zellulär und bakteriell exprimiertes E7-Protein des menschlichen Papillomavirus (HPV) untersucht. Das 30 Aminosäuren große, an Sepharose gebundene Peptid p107, das hergestellt wurde, wie in Beispiel 2 beschieben wurde, wurde mit Extrakt von CaSki-Zellen (HPV-16 positives zervikales Karzinom) inkubiert und auf die Bindung an das Protein E7 untersucht. Untersuchungen mittels Western-Blots zeigten, dass das Peptid tatsächlich an das Protein HPV16-E7 von CaSki-Zellen bindet.
Die Assoziation von bakteriell exprimiertem Protein HPV18-E7 mit dem p107-30mer-Peptid wurde mit Hilfe einer ELISA-Untersuchung analysiert. In dem Experiment, das in 3A veranschaulicht wird, wurde eine Sammelplatte mit 96-Vertiefungen mit dem p107-30mer-Peptid beschichtet und mit steigenden Konzentrationen des Fusionsproteins MBP-E7 oder dem Protein MBP als Kontrolle inkubiert. Dieses Experiment zeigt, dass das p107-30mer-Peptid direkt an das Protein HPV-E7 binden kann und dass die Bindung nicht von der Virusart abhängig ist. In dem in 3B veranschaulichten Experiment wurde das Fusionsprotein MBP-E7 (100 ng) in einer mit dem p107-30mer-Peptid beschichteten Platte in Gegenwart von steigenden Konzentrationen eines freien p107-9mer-Peptids inkubiert. Wie in 3 gezeigt wird, ist die Bindung direkt proportional zum Anstieg der optischen Dichte bei 405 nm. Die Ergebnisse der Kompetitionsexperimente, die in 3b gezeigt werden, deuten darauf hin, dass die Affinität des p107-9mer-Peptids für das Protein HPV18-E7 ungefähr 1 nM beträgt, was ungefähr 10.000fach größer ist als für die Kinase p34^cdc2.
Beispiel 10
ELISA-Untersuchung der Kompetition von p107 für die Erzeugung von E7-Rb-Komplexen
Um den Effekt der Bindung des Peptids p107 auf die Interaktion von E7-Rb zu untersuchen, wurde eine ELISA-Untersuchung verwendet, um die Erzeugung von E7-Rb-Komplexen zu überwachen. Sammelplatten mit 96 Vertiefungen wurden entweder mit dem Protein MBP-E7 (o) oder ausschließlich mit MBP als Kontrolle (•) beschichtet. Die Platten wurden mit steigenden Konzentrationen von in Baculoviren exprimierten Rb inkubiert, das mit dem monoclonalen Antikörper αRb349 (Pharmingen, San Diego, Ca) detektiert wurde (4A). In einem gesonderten Experiment wurden Platten mit 96 Vertiefungen mit dem Protein MBP-E7 beschichtet und mit 100 ng Rb in Gegenwart von steigenden Konzentrationen des p107-9mer-Peptids inkubiert (4B). Die Bindung wird als ein Anstieg der optischen Dichte bei 405 nm quantifiziert. Die Ergebnisse der Experimente, die in 4A veranschaulicht sind, zeigen deutlich die Fähigkeit des bakteriell exprimierten Fusionsproteins E7-MBP, an Rb zu binden. Die Ergebnisse dieses Experiments, das in 4B gezeigt ist, zeigen, dass die Zugabe von steigenden Konzentrationen des p107-9mer-Peptids zur Reaktion, effizient mit Rb um die Bindung an E7 konkurriert. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass das p107-9mer-Peptid ein effektiver Inhibitor des Proteins HPV-E7 sein kann. Ein vergleichbares Peptid des Proteins Rb (Sequenz MCSMYGICK [SEQ ID NO: 2]) bindet ebenfalls an das Onkoprotein E7 und konkurriert um die Interaktion von E7-Rb.
Deshalb wurden Inhibitoren von p34^cdc2 und p33^cdk2 sowie Inhibitoren des menschlichen Papillomavirus offenbart.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Inhibitor der Aktivität der Zellzyklus-regulierenden Kinase p34^cdc2 oder Inhibitor der Kinaseaktivität von p33^cdk2, wobei der Inhibitor aus der α-Helix II-Domäne von p107 ableitbar ist und wobei der Inhibitor außerdem aus 200 Aminosäuren besteht, einschließlich der Aminosäuresequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3) oder Austauschen in der Sequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3), bei welchen die inhibitorische Aktivität erhalten bleibt.
Inhibitor des E7-Proteins aus dem menschlichen Papillomavirus, wobei der Inhibitor aus der α-Helix II-Domäne von p107 ableitbar ist und wobei der Inhibitor außerdem aus 200 Aminosäuren besteht, einschließlich der Aminosäuresequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3) oder Austauschen in der Sequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3), bei welcher die inhibitorische Aktivität erhalten bleibt.
Inhibitor nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Inhibitor ein Peptid umfasst, das die Aminosäuresequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3) einschließt.
Inhibitor nach Anspruch 3, wobei der Inhibitor DLMKDRHLDQLLLCAFYIMAK (SEQ ID NO: 12), KDRHLDQLLLCAFYIMAK (SEQ ID NO: 13), LDQLLLCAFYIMAK (SEQ ID NO: 14), LCAFYIMAK (SEQ ID NO: 1), LCAFYIM (SEQ ID NO: 17), CAFYI (SEQ ID NO: 3), LCAFYI (SEQ ID NO: 18), LCAFYIMQK (SEQ ID NO: 29) oder CAFYIGSPKK (SEQ ID NO: 34) ist.
Inhibitor nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Inhibitor ein Peptid umfasst, das Austausche in der Sequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3) einschließt, bei welchen die inhibitorische Aktivität erhalten bleibt.
Inhibitor nach Anspruch 5, wobei der Inhibitor LFAFYIMAK (SEQ ID NO: 21), LCAYYIMAK (SEQ ID NO: 25) oder LCAFFIMAK (SEQ ID NO: 27) ist.
Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Inhibitor ein nachahmendes Peptid umfasst.
Komplex, umfassend: (a) p34^cdc2 oder p33^cdk2; und (b) einen Inhibitor der Aktivität der Zellzyklus-regulierenden Kinase p34^cdc2 nach Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 3 bis 7, falls abhängig von Anspruch 1, und wobei dem Komplex im Wesentlichen Kinaseaktivität fehlt.
Komplex, umfassend: (a) E7-Protein des menschlichen Papillomavirus; und (b) einen Inhibitor des E7-Proteins aus dem menschlichen Papillomavirus nach Anspruch 2 oder einem der Ansprüche 3 bis 7, falls abhängig von Anspruch 2.
Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung in einer Therapie.
Verwendung von einem Inhibitor der Aktivität der Zellzyklus-regulierenden Kinase p34^cdc2 oder einem Inhibitor der Kinaseaktivität von p33^cdk, wobei der Inhibitor aus der α-Helix II-Domäne von p107 ableitbar ist und wobei der Inhibitor außerdem die Aminosäuresequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3) einschließt oder Austausche der Sequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3), bei welchen die inhibitorische Aktivität erhalten bleibt, oder ein Inhibitor nach Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 3 bis 7, falls abhängig von Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Aktivität der Zellzyklus-regulierenden Kinase p34^cdc2.
Verwendung von einem Inhibitor des E7-Proteins aus menschlichem Papillomavirus, wobei der Inhibitor aus der α-Helix II-Domäne des p107 ableitbar ist und wobei der Inhibitor außerdem die Aminosäuresequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3) einschließt oder Austausche in der Sequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3), bei welchen die inhibitorische Aktivität erhalten bleibt, oder ein Inhibitor nach Anspruch 2 oder einem der Ansprüche 3 bis 7, falls abhängig von Anspruch 2, für die Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der E7-Aktivität des menschlichen Papillomavirus.
Verfahren zur Hemmung der Aktivität der Zellzyklus-regulierenden Kinase p34^cdc2 in vitro oder der Kinaseaktivität von p33^cdk2, umfassend: (a) Bereitstellen eines Inhibitors der Aktivität der Zellzyklus-regulierenden Kinase p34^cdc2 oder eines Inhibitors der Kinaseaktivität von p33^cdk2 wobei der Inhibitor aus der α-Helix II-Domäne des p107 ableitbar ist und wobei der Inhibitor außerdem die Aminosäuresequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3) einschließt oder Austausche in der Sequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3), bei welchen die inhibitorische Aktivität erhalten bleibt, oder Bereitstellen eines Inhibitors nach Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 3 bis 7, falls abhängig von Anspruch 1; und (b) Inkontaktbringen von p34^cdc2 oder p33^cdk2 mit einer inhibierenden Menge des Inhibitors.
Verfahren zur Hemmung der E7-Aktivität des menschlichen Papillomavirus in vitro, umfassend: (a) Bereitstellen eines Inhibitors des E7 Proteins von menschlichen Papillomavirus, wobei der Inhibitor aus der α-Helix II Domäne des p107 ableitbar ist und wobei der Inhibitor weiterhin die Aminosäuresequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3) einschließt oder Austausche der Sequenz CAFYI (SEQ ID NO: 3), bei welchen die inhibitorische Aktivität erhalten bleibt, oder Bereitstellen eines Inhibitors nach Anspruch 2 oder einem der Ansprüche 3 bis 7, falls abhängig von Anspruch 2; und (b) Inkontaktbringen von E7 des menschlichen Papillomavirus mit einer inhibierenden Menge des Inhibitors.
Arzneimittel, umfassend einen Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 7.