JPH07316196A - ｐ３３ｃｄｋ２及びｐ３４ｃｄｃ２細胞周期調節キナーゼ及びヒト乳頭腫ウィルスＥ７発癌性タンパク質のペプチド阻害物質 - Google Patents

ｐ３３ｃｄｋ２及びｐ３４ｃｄｃ２細胞周期調節キナーゼ及びヒト乳頭腫ウィルスＥ７発癌性タンパク質のペプチド阻害物質

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JPH07316196A
JPH07316196A JP7020767A JP2076795A JPH07316196A JP H07316196 A JPH07316196 A JP H07316196A JP 7020767 A JP7020767 A JP 7020767A JP 2076795 A JP2076795 A JP 2076795A JP H07316196 A JPH07316196 A JP H07316196A
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cdc2
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アール ウェブスター ケヴィン
Kevin G Coleman
ジー コールマン ケヴィン
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ｐ３４cdc2／ｐ３３cdk2キナーゼ活性を阻害
するリガンドを提供する。 【構成】 ｐ３４cdc2キナーゼ活性、ｐ３３cdk2キナー
ゼ活性及びヒト乳頭腫ウィルス形質転換タンパク質Ｅ７
の阻害物質であって、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ１０
７及びサイクリン類からなる群から選ばれるタンパク質
のｐ３４cdc2結合ドメインから誘導される阻害物質。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般的には、細胞生育
及び増殖のペプチド阻害物質に関する。具体的に述べれ
ば、本発明は、ｐ３４cdc2／ｐ３３cdk2キナーゼに結合
してそれらの活性を阻害し、そして網膜芽細胞腫腫瘍サ
プレッサータンパク質とヒト乳頭腫ウィルス形質転換タ
ンパク質Ｅ７の間の特異的相互作用を阻害するリガンド
に関する。
【０００２】
【従来の技術】癌細胞は、継続的かつ非制御的に増殖す
るそれらの能力によって特徴付けられる。今日では、一
次細胞周期調節物質が癌発生に巻き込まれているか又は
直接関与しているに違いないことが明らかになってい
る。細胞周期調節は、細胞周期の２つの主要な変転期で
あるＧ1 ／Ｓ及びＧ2 ／Ｍ期の境界で起こる。これら変
転期の鍵を握る調節物質は、ヒストンＨ１、ＤＮＡポリ
メラーゼα、ＲＮＡポリメラーゼII、網膜芽細胞腫腫瘍
サプレッサータンパク質（Ｒｂ）、ｐ５３、ヌクレオリ
ン(nucleolin) 、ｃＡｂ１、ＳＶ４０ラージＴ抗原及び
ラミンＡを含む多くのタンパク質をリン酸化することが
知られているｐ３４cdc2キナーゼである。例えば、ｐ３
４cdc2キナーゼ活性は、細胞が有糸分裂に入ること、即
ち、細胞周期がＧ2 期からＭ期に移行することを必要と
する（リー(Lee) ら (1988) Trends Genet. 4:289-90；
ダンフィ (Dunphy) ら (1988)Cell 54:423-431 ；ゴー
ティアー(Gautier) ら (1988) Cell 54:433-439 ；委細
については、クロス(Cross) ら (1989) Ann. Rev. Cell
Biol. 5:341-395；ハンター (Hunter) (1989) Curr. O
pinion Cell Biol. 1:268-274 ；ナース (Nurse)(1990)
Nature 344:503-508 を参照のこと）。ｐ３４cdc2キナ
ーゼの活性は、引き続いて、タンパク質：タンパク質相
互作用及び翻訳後修飾の両方によって調節される。従っ
て、これらメカニズムのいずれかが遮断されると、哺乳
動物細胞周期は止まる。例えば、血清刺激されたラット
線維芽細胞内にｐ３４cdc2抗体を顕微注射すると、細胞
がＧ2 期で止まり、ｐ３４cdc2抗センスオリゴデオキシ
ヌクレオチドで活性化Ｔリンパ球を処理すると、ＤＮＡ
合成が阻害される（フルカワら (1990) Science 250:80
5-808 ；リアボール (Riabowol) ら (1989) Cell 57:39
3-401)。
【０００３】ｓｕｃ１タンパク質（ｐ３４cdc2のリガン
ド）をＨｅＬａ細胞内に注射するとおそらく正常ｐ３４
cdc2タンパク質：タンパク質相互作用の崩壊によってで
あろうが細胞生育が停止する（ドラエッタ (Draetta)
(1990) TIBS 15:378-383)。加えて、特異性抗体でのｃ
ｄｃ２５ホスファターゼの阻害はｐ３４cdc2の翻訳後修
飾を遮断して、ＨｅＬａ細胞を死に至らしめる（ガラク
チオノフ(Galaktionov)ら (1991) Cell 67:1181-119
4)。Ｒｂ、ｐ１０７タンパク質及びサイクリン（ｃｙ
ｃ）タンパク質ファミリーは、ｐ３４cdc2（及びその同
族体であるｐ３３cdk2）（ピネス(Pines) ら (1990) Na
ture 346:760-763；ツァイ (Tsai) ら (1991)Nature 35
3:174-177；ジョルダーノ (Giordano) ら (1989) Cell
58:981-990)；Ｅ２Ｆ転写因子；アデノウィルスＥ１Ａ
タンパク質；及びヒト乳頭腫ウィルス形質転換タンパク
質Ｅ７（ワイト(Whyte) ら (1988) Nature 334:124-12
9；ケラパン(Chelappan) ら (1991) Cell 65:1053-1061
；バンダラ(Bandara) ら (1991)Nature 352:249-252；
ムンダリイ(Mundryj) ら (1991) Cell 65:1243-1253 ；
ピネスらの前記文献 (1990) ；ツァイらの前記文献 (19
91) ；ジョルダーノらの前記文献 (1989) ；シロドカー
(Shirodkar) ら (1992) Cell 68:157-166 ；デボトら
(Devoto) ら (1992) Cell 68:157-166 ；デカプリオ (D
eCaprio) ら (1988)Cell 54:275-283 ；ダイソン(Dyso
n) ら (1989) Science 243:934-937 ；ゲイジ(Gage) ら
(1990) J. Virol. 64:723-730）と結合することが分か
っている。ｐ３４cdc2又はｐ３３cdk2へのサイクリンの
結合は、キナーゼ活性を必要とする（ソロモン(Solomo
n) ら (1990) Cell 63:1013-1024 ；ピネスらの前記文
献 (1990) ；ツァイらの前記文献 (1991) ；ジョルダー
ノらの前記文献 (1989))。
【０００４】Ｒｂ及びｐ１０７タンパク質の機能性ドメ
インは、遺伝子的及び生化学的両手段によってマッピン
グされている（フ (Hu) ら (1990) EMBO J. 9:1147-115
5 ；ユーアン (Ewen) ら (1991) Cell 66:1155-1164 ；
ユーアンら (1992) Science255:85-87)。Ｒｂポケット
と称されるＲｂ及びｐ１０７の約４００アミノ酸断片
は、これらタンパク質とＤＮＡ腫瘍ウィルス発癌性タン
パク質及び細胞リガンドとの結合を司っている。このド
メイン内には、Ｒｂとｐ１０７との間で配列が広範囲に
わたって類似している６つの領域がある（ユーアンらの
前記文献 (1991))。同じく、サイクリン類も“サイクリ
ンボックス”と名付けられた約８７アミノ酸にわたって
配列が類似している１つの大きな領域を共有している
（ピネスら (1989) Cell 58:833-846)。このドメイン
は、タンパク質：タンパク質相互作用にある役割を果た
していると考えられ、アミノ末端からこのドメインまで
の配列の欠失はサイクリンの機能に影響を与えないこと
が分かっている（ムレイ (Murray) ら (1989) Nature 3
39:280-286；ユーアンら (1991) Cell 66:1197-1206)。
【０００５】ｐ３４cdc2タンパク質：タンパク質相互作
用は、ヒト腫瘍では変化してしまっている。例えば、共
同因子サイクリンＡをコードする遺伝子は、肝細胞癌腫
内では分裂している（ワン (Wang) ら (1990) Nature 3
43:555-557）。また、サイクリンＤ１（ＰＲＡＤ１）が
ｂｃｌ−１座内にあり、そして上皮小体腫瘍及び幾つか
のＢ細胞白血病において再配置されていることが最近の
データによって証明されている（デ・ボアー(De Boer)
ら (1993) Cancer Res. 53:4148-4152；モトクラら (19
91) Nature 350:512-515）。加えて、このｂｃｌ−１座
は肺癌腫内で頻繁に増幅し、サイクリンＤ１はマウス皮
膚癌腫内で過剰発現する（ラミー (Lammie) ら (1991)
Oncogene 6:439-444；ビアンチ(Bianchi) ら (1993) On
cogene 8:1127-1133；バクレイ(Buckley) ら (1993) On
cogene 8:2127-2133）。更に、ｃｄｋキナーゼのサブユ
ニットは、それらの正常な対応物と比較した場合に、形
質転換された細胞内に再配置されている（キシオン(Xio
ng) ら (1993) Genes andDevelopment 7:1572-1583)。
これは、正常にはｃｄｋキナーゼ活性のレプレッサーで
あり、ｐ５３腫瘍サプレッサータンパク質によって調節
されているｗａｆ１／ｃｉｐ１タンパク質が失われてい
るか又は発現が不十分であることの結果である（キシオ
ンら (1993) Nature 366:701-704；セラノ(Serrano) ら
(1993) Nature 366:704-707；グ (Gu) ら (1993) Natu
re 366:707-710；ハーパー (Harper)ら (1993) Cell 7
5:805-816 ；エル−デイリイ (El-Deiry) ら (1993) Ce
ll 75:817-825)。これらデータは、明確に、ｐ３４cdc2
キナーゼ活性の変化を発癌性に関連付けている。従っ
て、ｐ３４cdc2活性の阻害物質は、癌細胞の継続的、増
殖的生育の調節及び制御に有用であろう。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、ｐ３４cdc2キ
ナーゼ活性の阻害によりＧ1 ／Ｓ又はＧ2 ／Ｍ境界を通
過するのを阻止することによって細胞増殖の経過を阻害
するリガンドを提供する。これらリガンドは、ｐ３４
cdc2キナーゼ媒介細胞生育及び増殖の修飾物質として、
従って、癌細胞が継続的に増殖するメカニズムの研究用
物質として及び必須サイクリンをコードする遺伝子の分
裂に関係する腫瘍、例えば、肝細胞癌腫、上皮小体腫
瘍、種々のＢ細胞白血病及び肺癌腫、又はｐ５３突然変
異を含有するか又はｗａｆ１／ｃｉｐ１を失っている腫
瘍を改善する物質として有用である。
【０００７】従って、１つの態様においては、本発明
は、ｐ３４cdc2細胞周期調節キナーゼ活性の阻害物質、
又はその同族体のキナーゼ活性の阻害物質であって、Ｒ
ｂ、ｐ１０７及びサイクリン類からなる群から選ばれる
タンパク質のｐ３４cdc2結合ドメインから誘導される阻
害物質に向けられている。好ましい態様においては、こ
の阻害物質は、アミノ酸配列 Leu Cys Ala Phe Tyr Ile
Met Ala Lys（配列番号：１）を含むペプチド、アミノ
酸配列 Met Cys Ser Met Tyr Gly Ile Cys Lys（配列番
号：２）を含むペプチド、アミノ酸配列 Cys Ala Phe T
yr Ile（配列番号：３）を含むペプチド、又は阻害活性
を保持するこれら配列の置換物である。更なる態様にお
いては、本発明は、ヒト乳頭腫ウィルスＥ７タンパク質
の阻害物質であって、Ｒｂ、ｐ１０７及びサイクリン類
からなる群から選ばれるタンパク質のｐ３４cdc2結合ド
メインから誘導される阻害物質に向けられている。
【０００８】他の好ましい態様においては、本発明は、
(a) ｐ３４cdc2又はその同族体；及び(b) ｐ３４cdc2細
胞周期調節キナーゼ活性の阻害物質を含む、実質的にキ
ナーゼ活性を欠いている複合体であって、阻害物質が、
Ｒｂ、ｐ１０７及びサイクリン類からなる群から選ばれ
るタンパク質のｐ３４cdc2結合ドメインから誘導される
複合体に向けられている。他の態様においては、本発明
は、(a) ヒト乳頭腫ウィルスＥ７タンパク質；及び(b)
ヒト乳頭腫ウィルスＥ７タンパク質の阻害物質を含む複
合体であって、阻害物質が、Ｒｂ、ｐ１０７及びサイク
リン類からなる群から選ばれるタンパク質のｐ３４cdc2
結合ドメインから誘導される複合体に向けられている。
更なる態様においては、本発明は、ｐ３４cdc2細胞周期
調節キナーゼ活性、又はその同族体のキナーゼ活性を阻
害する方法であって、上記のｐ３４cdc2阻害物質を供給
すること及びｐ３４cdc2又はその同族体を阻害量のその
阻害物質と接触させることを含む方法に向けられてい
る。追加の態様においては、本発明は、ヒト乳頭腫ウィ
ルスＥ７活性を阻害する方法であって、ヒト乳頭腫ウィ
ルスＥ７阻害物質を供給すること及びヒト乳頭腫ウィル
スＥ７を阻害量のその阻害物質と接触させることを含む
方法に向けられている。当業者は、この開示内容からみ
て、本発明のこれら及び他の態様を容易に考えつくであ
ろう。
【０００９】図１〜４は、サイクリンＡ、Ｂ１、Ｃ、Ｄ
及びＥ、ｐ１０７及びＲｂ（配列番号：４、５、６、
７、８、９、１０）を含む種々のｐ３４cdc2結合タンパ
ク質のアミノ酸配列の比較を示す。空隙は、相同性を最
大に示すために挿入したものであって横線で表してい
る。アミノ酸は、一文字法で表している。ボックスで囲
んであるのは、同一アミノ酸又は保存的置換アミノ酸で
ある。点刻した円筒状のものは、α−ヘリックスII領域
を表す。図５は、ｐ１０７・９量体ペプチド濃度に対し
てｐ３４cdc2ヒストンＨ１キナーゼ活性の阻害率（％）
をプロットしたグラフである。図６〜７は、ＨＰＶ１８
−Ｅ７へのｐ１０７・３０量体ペプチドの結合をプロッ
トしたグラフ（図６：ＭＢＰ−Ｅ７（●）、ＭＢＰ単独
（△））又はＥ７−ｐ１０７・３０量体ペプチド相互作
用についてｐ１０７・９量体ペプチド（Leu Cys Ala Ph
e Tyr Ile Met Ala Lys （配列番号：１））（図７）と
の競合をプロットしたグラフである。図８〜９は、Ｒｂ
タンパク質へのＭＢＰ−Ｅ７タンパク質の結合に対する
ｐ１０７・９量体ペプチド（Leu Cys Ala Phe Tyr Ile
Met Ala Lys （配列番号：１）の作用をＥＬＩＳＡによ
り測定してプロットしたグラフ（図８：ＭＢＰ−Ｅ７
（○）；ＭＢＰ単独（△））又は結合競合法により測定
してプロットしたグラフ（図９：結合したＲｂ（●））
である。
【００１０】本発明の実施には、特に断らない限り、当
業界で知られているタンパク質化学及び生化学、分子生
物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ法の従来技術が用い
られる。かかる技術は文献に十分に説明されている。例
えば、サムブルック (Sambrook), Fritsch & Maniatis,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, SecondEdi
tion (1989)；DNA Cloning, Vols. I and II （グロバ
ー(D.N. Glover) 編,1985) ；Oligonucleotide Synthes
is （ガイト(M.J. Gait) 編, 1984）；Nucleic Acid Hy
bridization (ヘイマス(Hames) ＆ヒギンス(Higgins)
編, 1984）；Animal Cell Culture （フレッシュニイ
(R.K. Freshney) 編, 1986）；Immobilized Cells and
Enzymes (IRL press, 1986)；パーバル (Perbal, B.),
A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；Me
thods In Enzymology のシリーズ（コロウィック(S. Co
lowick) とカプラン (Kaplan) 編，Academic Press, In
c.）を参照のこと。前記及び後記の全ての引用特許、特
許出願及び刊行物は、参照によってそっくりそのまま本
明細書に組み入れられるものとする。
【００１１】Ａ．定義 本発明を説明するに際して、次の用語を用い、それらを
以下のように定義する。“ｐ３４cdc2”により、約３２
〜３４ｋｄａタンパク質である“ｐ３４cdc2キナーゼ”
又は“ｐ３４cdc2細胞周期調節キナーゼ”が意味され、
これら用語は互換的に用いられる。これは、（リーらの
前記文献 (1987) ；ダンフィらの前記文献 (1988) ；及
びゴーティアーらの前記文献 (1988) に記載されている
ように）タンパク質−セリン／スレオニンキナーゼ活性
を有するＭＰＦ（成熟期／Ｍ期促進因子又は有糸分裂促
進因子）としても知られている。この用語は、スキゾサ
ッカロミセス・ポンベ(pombe) のｃｄｃ２遺伝子の産物
及びサッカロミセス・セレビシエからのＣＤＣ２８遺伝
子の産物、及び他の種に見出される同族体（アリオン(A
rion) ら (1988) Cell 55:371-378 ；ダンフィらの前記
文献 (1988) ；ゴーティアーらの前記文献 (1988) ；及
びラベ(Labbe) ら (1988) Cell 57:253-263) を参照の
こと）を包含し、これら他の種の同族体には、これらタ
ンパク質のヒト同族体、ｐ３４cdc2が含まれる（リーら
の前記文献 (1987))。ｐ３４cdc2キナーゼ活性は、特異
性サイクリン類との結合及びＴｈｒ−１４及びＴｙｒ−
１５アミノ酸残基の翻訳後修飾に依存している。
【００１２】“ｐ３３cdk2”、“ｐ３３cdk2キナーゼ”
又は“ｐ３３cdk2細胞周期調節キナーゼ”とは、ｐ３４
cdc2キナーゼのサイクリン依存性キナーゼ同族体のこと
をいい、その活性は同じく１又は２以上のサイクリン分
子との結合に依存している（ツァイらの前記文献 (199
1) ；ローゼンブラット (Rosenblatt) ら (1992) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:2824-2828 ；エリーゲ(Elle
age) らProc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2907-2911
）。“ｐ３４cdc2結合ドメイン”により、直接又は間
接にｐ３４cdc2キナーゼと相互作用することによってそ
のキナーゼの活性化を妨げる問題の分子（即ち、Ｒｂ、
ｐ１０７又はサイクリン類）の部分が意味される。この
結合ドメインは、その分子がその天然状態にある場合に
ｐ３４cdc2キナーゼと相互作用する構造を形成する、そ
の分子の連続部分、即ち、連続するアミノ酸配列であっ
てもよく、また、コンフォメーション的部分、即ち、不
連続なアミノ酸配列を組み合わせたものであってもよ
い。
【００１３】結合ドメイン“から誘導される”により、
問題の分子（即ち、Ｒｂ、ｐ１０７又はサイクリン類）
の天然ｐ３４cdc2結合ドメインと同一の、実質的に相同
な、相補的な、又は機能的若しくは構造的に等価なあら
ゆる分子状存在物が意味される。従って、特定の結合ド
メインから誘導される分子は、天然に存在するリガンド
結合部位、その結合部位のあらゆる部分、又は結合した
リガンドに結合するよう機能する他の分子状存在物のア
ミノ酸配列を包含することができる。そのような結合ド
メインから誘導される分子は、天然の結合ドメインを模
倣するような方法でｐ３４cdc2キナーゼと直接又は間接
に相互作用するであろう。そのような分子状存在物に
は、競合的阻害物質、ペプチド擬似物質等が含まれる。
【００１４】“ｐ３４cdc2キナーゼ活性の阻害物質”又
は“ｐ３３cdk2キナーゼ活性の阻害物質”は、ｐ３４
cdc2又はｐ３３cdk2と直接又は間接に相互作用してその
キナーゼの活性化を阻害する、Ｒｂ、ｐ１０７又はサイ
クリン類のｐ３４cdc2結合ドメインから誘導されるペプ
チド又はペプチド断片を意味する。この阻害物質がサイ
クリンタンパク質である場合、その野生型分子の完全長
配列を含むことにはならないであろう。阻害物質は、ｐ
３４cdc2へのサイクリンの結合を競合的に阻害すること
によってサイクリン依存性キナーゼ活性化を妨げること
ができる。加えて、ペプチド擬似物質、つまり特定のペ
プチドの構造的特徴を擬態するように設計された物理的
構造を有する合成分子も、同じくキナーゼ活性の阻害物
質として役立ち得る。かかる阻害物質は、ＡＴＰ又は類
似するＡＴＰ類縁体の末端ホスフェート又は他のヌクレ
オチドトリホスフェートを適当な基質へ移動させるｐ３
４cd c2又はｐ３３cdk2酵素的触媒作用を低下させる。か
かる基質には、ヒストンＨ１、ＤＮＡポリメラーゼα、
ＲＮＡポリメラーゼII、Ｒｂ、ｐ５３、ヌクレオリン、
ｃＡｂ１、ＳＶ４０ラージＴ抗原及びラミンＡ等が含ま
れる。一方、かかる阻害物質は、適当な細胞周期検査法
により測定される細胞周期の進行を支援する活性化（例
えば、脱リン酸化）ｐ３４cdc2の能力を低下させること
ができる（例えば、ピネスらの前記文献 (1989) を参照
のこと）。かかる阻害は、直接の競合的メカニズムによ
るものであっても間接の非競合的若しくは不競合的メカ
ニズムによるものであってもよい。
【００１５】“ヒト乳頭腫ウィルスＥ７タンパク質の阻
害物質”は、形質転換タンパク質Ｅ７と直接又は間接に
相互作用してＲｂとの特異性複合体の形成を妨げる分子
である。ｐ３４cdc2キナーゼの阻害物質の場合のよう
に、これら阻害物質は、競合的阻害により、又は間接の
非競合的若しくは不競合的メカニズムにより、結合を妨
げることができる。加えて、この用語は、ペプチド阻害
物質だけでなくペプチド擬似物質も包含する。候補ペプ
チド又はペプチド擬似物質の阻害活性は、標的アクセプ
ター、即ち、ｐ３４cdc2、ｐ３３cdk2又はＨＰＶ Ｅ７
に結合するその候補物質の能力を評価することによって
試験することができる。例えば、適当な親和性と特異性
で標的アクセプターに結合する候補物質を、その標的ア
クセプターの活性を阻害する能力について検査すること
ができる。ｐ３４cdc2及びｐ３３cdk2については、キナ
ーゼ活性を低下させる阻害物質の能力を評価することが
できる。ＨＰＶ Ｅ７については、Ｅ７への結合につい
てＲｂと競合する候補阻害物質の能力を測定することが
できる。最後に、全細胞環境で阻害活性を評価するに
は、形質転換細胞の同調個体群の細胞周期の進行を妨げ
る候補阻害物質の能力を測定することができる。例え
ば、ＨｅＬａ細胞は、当該技術分野で周知の技術を用い
て同調させることができる（例えば、ルー(Lew) らの前
記文献 (1991))。Ｇ1 ／Ｓ境界を通過する細胞周期の進
行の阻害は、その細胞個体群内でのＤＮＡ合成の低下に
より評価される。Ｇ2 ／Ｍ境界を通過する細胞周期の進
行の阻害は、有糸分裂活性（即ち、細胞分裂）が存在し
ないことにより測定される。
【００１６】“ペプチド擬似物質”は、アクセプター分
子との相互作用においてペプチドの代用物として役立つ
構造体である（ペプチド擬似物質の委細についてはモル
ガン(Morgan) ら (1989) Ann. Reports Med. Chem. 24:
243-252を参照のこと）。ここで用いる場合、ペプチド
擬似物質には、アミノ酸及び／又はペプチド結合を含有
してもしなくてもよいがペプチドリガンドの構造的及び
機能的特徴を保持している合成構造体が含まれる。“ペ
プチド擬似物質”という用語には、Ｎ−置換アミノ酸の
ペプチド又はオリゴマーであるペプトイド及びオリゴペ
プトイドも含まれる（サイモン(Simon) ら (1972) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371)。ペプチド擬
似物質として更に含まれるものは、所与のアミノ酸長で
あるように設計されかつそれに対応する全ての考え得る
アミノ酸の配列に相当するペプチドの集団であるペプチ
ドライブラリーである。ペプチド擬似物質を作る方法は
以下により詳細に説明する。
【００１７】２つのポリペプチド配列は、ヌクレオチド
又はアミノ酸の少なくとも約８５％（好ましくは少なく
とも約８５〜９５％、最も好ましくは少なくとも約９５
％）がその分子の規定された長さにわたって一致する場
合“実質的に相同性”である。ここで用いる場合、実質
的に相同性とは、限定されたポリペプチド配列に同一性
を示す配列のこともいう。“ポリペプチド”、“ペプチ
ド”及び“タンパク質”という用語は互換的に用いら
れ、ペプチド結合で連結されたアミノ酸のあらゆるポリ
マー（ジペプチド又はそれより大きなもの）のことをい
う。従って、“ポリペプチド”、“ペプチド”及び“タ
ンパク質”という用語には、オリゴペプチド、タンパク
質断片、類縁体、突然変異タンパク質、融合タンパク質
等が含まれる。
【００１８】Ｂ．一般的方法 本発明の中心は、ｐ３４cdc2キナーゼに結合してその活
性を阻害するペプチド分子の発見である。これら分子
は、Ｒｂ、ｐ１０７又はサイクリン類のその結合ドメイ
ンから誘導される。図１〜４に示したこれらタンパク質
は、ｐ３４cdc2、その同族体のｐ３３cdk2、Ｅ２Ｆ転写
因子及びアデノウィルスＥ１Ａ形質転換タンパク質に結
合する。加えて、Ｒｂは、乳頭腫ウィルスＥ７の形質転
換タンパク質と特異性複合体を形成する。これらペプチ
ド阻害物質及びそのペプチド擬似物質は、細胞生育にお
けるｐ３４cdc2及びｐ３３cdk2キナーゼ及び形質転換因
子（例えば、Ｅ７）の正常機能及び前癌細胞や癌細胞の
増殖の分析に有用な材料を提供する。更に、ｐ３４cdc2
キナーゼの活性は、細胞周期のＧ1 ／Ｓ及びＧ2 ／Ｍ変
転期の通過に必須であるので、タンパク質阻害物質又は
その擬似物質を癌組織に投与して腫瘍成長を抑制するこ
とができる。
【００１９】実施例に示すように、ｐ３４cdc2キナー
ゼ、ｐ３３cdk2キナーゼ又はＨＰＶＥ７の特許請求した
阻害物質は、ｐ３４cdc2及び／又はＨＰＶ Ｅ７と相互
作用するタンパク質の結合ドメインから誘導されるアミ
ノ酸の配列及びその擬似物質を含む。特に、これら阻害
物質は、図１〜４に示すα−ヘリックスII領域として知
られる多くのｐ３４cdc2結合ドメイン中に見出される相
同性領域から誘導される。ｐ１０７からのα−ヘリック
スII配列を包含する３０アミノ酸ペプチド、 Phe Glu P
he Thr Leu Val His Cys Pro Asp Leu Met Lys Asp Leu
Met Lys Asp Arg His Leu Asp Trp Leu Leu Leu Cys A
la Phe Tyr Ile Met Ala Lys（配列番号：１１）がｐ３
４cdc2及びｐ３３cdk2に結合することをここに示した。
この３０アミノ酸ペプチドも、ｐ３４cdc2及びｐ３３
cdk2のヒストンＨ１キナーゼ活性を阻害する。アミノ末
端又はカルボキシ末端アミノ酸を連続的に欠失させるこ
とにより、５アミノ酸配列（Cys Ala Phe Tyr Ile （配
列番号：３））を阻害活性を保持する最小配列として同
定した。更には、この５アミノ酸ペプチドを含む９アミ
ノ酸配列（Leu Cys Ala Phe Tyr Ile Met Ala Lys （配
列番号：１））を有するペプチドが約１０μＭの親和性
でｐ３４cdc2に結合することが分かった。従って、本発
明の有用なｐ３４cdc2阻害物質は、少なくともこの５量
体から誘導され、適切な結合コンフォメーションが保持
されている限り、５０〜２００もの又はそれを超えるア
ミノ酸を含むことができる。
【００２０】上記の３０量体ペプチドは、ヒト乳頭腫ウ
ィルス（ＨＰＶ）１８−Ｅ７タンパク質にも結合する。
更には、この３０量体ペプチドは、Ｒｂから誘導された
９アミノ酸ペプチド（Met Cys Ser Met Tyr Gly Ile Cy
s Lys （配列番号：３））がそうするように、Ｅ７がＲ
ｂに結合するのを阻害する。上で説明したように、これ
ら全てのペプチド、並びにこれらペプチドと実質的に相
同な、相補的な、又は機能的若しくは構造的に等価な分
子を、本発明の目的のために用いることができる。本発
明のペプチド阻害物質は、当該技術分野で知られている
従来技術により、例えば、固相ペプチド合成法の如き化
学合成法によって合成することができる。かかる方法は
当業者に既知である。一般に、これら方法は、当該技術
分野で周知の固相又は液相合成法のいずれかを用いる。
例えば、固相ペプチド合成法については、スチュアート
(J.M. Stewart) とヤング (J.D. Young), Solid Phase
Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL (1984) 及びバラニイ(G. Barany) とメリ
フィールド (R.B. Merrifield), The Peptides: Analys
is, Synthesis, Biology, editors E. Gross and J. Me
ienhofer, Vol.2, Academic Press, New York, (1980),
pp.3-254 を；古典的な溶液合成法については、ボダン
スキイ (M. Bodansky), Principles of Peptide Synthe
sis, Springer-Verlag, Berlin (1984) 及びグロス (E.
Gross) とメイエンホッハー(J. Meienhofer) 編の前記
文献The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vo
l.1 を参照のこと。
【００２１】上で説明したように、構造的又は機能的に
上記のペプチド阻害物質を擬態するペプチド擬似物質に
もここでの用途が見出され、次の戦略及び操作を用いて
作ることができる。一般に、擬似物質は、Ｌ−アミノ酸
のＤ−アミノ酸との系統的置換、側鎖部分のメチル基又
は異なる電子特性を有する同等立体化学偽性基との置換
（ルビイ(Hruby) ら (1990) Biochem. J. 268:249-26
2)、及び上記ペプチド阻害物質中のペプチド結合のアミ
ド結合代用物との系統的置換により得られえる情報に基
づいて設計される。例えば、アミド結合代用物を含有す
る類縁体を用いて、主鎖の回転自由度、分子内及び分子
間水素結合パターン、局部的及び全体的極性及び疎水性
の修飾、及び経口生体利用性の如きペプチド構造及び機
能の側面を研究することができる。
【００２２】局部的にコンフォメーションの自由度を束
縛して、ｐ３４cdc2、ｐ３３cdk2、ＨＰＶ Ｅ７又はそ
の他のアクセプターの候補ペプチド擬似阻害物質の能力
のためのコンフォメーション要件を確認することもでき
る。例えば、β，β−二置換アミノ酸を用いて、ペプチ
ド活性へのコンフォメーションの束縛の効果を検査する
ことができる（例えば、マニング(Manning) ら (1982)
J. Med. Chem. 25:408-414；モスバーグ(Mosberg) ら
(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:506-512；ペ
ルトン (Pelton) ら (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 82:236-239)。
【００２３】これら擬似物質は、Ψ〔ＣH2Ｓ〕、Ψ〔Ｃ
H2ＮＨ〕、Ψ〔ＣＳＮH2〕、Ψ〔ＮＨＣＯ〕、Ψ〔ＣＯ
ＣH2〕及びΨ〔（Ｅ）又は（Ｚ）ＣＨ＝ＣＨ〕の如き立
体化学が同等のアミド結合を含むことができる（委細に
ついては、"Chemistry and Biochemistry of Amino Aci
ds, Peptides and Proteins", Volume VII, (Weinstei
n, ed.), Marcel Dekker, New York, 267-357 中のス
パトラ(Spatola) の報文を参照のこと）。基質結合の加
水分解に関係する四面体遷移状態を擬態する構造体も存
在することができ、ヒドロキシメチレン、フルオロケト
ン部分及びホスホラミデート遷移状態擬似物質も含むこ
とができる（ベールマイヤー(Buhlmayer)ら (1988) J.
Med. Chem. 31:1839 ；シャム (Sham) ら (1988) FEBS
Lett. 220:299；マテウス (Mattews) (1988) Acc. Che
m. Res 21:333)。これら合成分子はコンフォメーション
の反転を安定化又は促進するためにＤ−アミノ酸を含ん
で、酵素分解に対して分子を安定化するのを助けること
もできる（例えば、"Peptides: Structure and Functio
n" (Deber et al., eds.), Pierce Chem. Co., Rockfor
d, IL, 549-552 中のフレイジンガー (Freidinger) ら
(1985) の報文；ソウヤー (Sawyer) ら (1980) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 77:5754-5758 ；トーチャナ(Tor
chiana) ら (1978) Arch. Int. Pharmacol. Ther. 235:
170-176 を参照のこと）。環状アミノ酸類縁体、例え
ば、１−アミノシクロペンタンカルボン酸（シクロロイ
シン）及びβ，β−シクロペンタメチレン−β−メルカ
プトプロピオン酸の如きαα'-及びββ'-置換環状アミ
ノ酸を用いて、アミノ酸残基を特定のコンフォメーショ
ン状態に束縛してもよい（ルビイらの前記文献 (1990)
を参照のこと）。
【００２４】これら擬似物質は、フェノキサチン環系の
如きβ−ターン擬似物質及びエピンドリジオン(epindol
idione) 構造体の如きβ−シート擬似物質を含む、阻害
物質ペプチド第二構造（アミノ酸残基の三次元方向をタ
ンパク質の既知第二コンフォメーションに合わせること
ができる構造）の擬似物質も含むことができる。α−ヘ
リックス誘導用鋳型の設計、合成及びコンフォメーショ
ン解析は、文献に記載されている（ケンプ (Kemp) ら
(1988) Tetrahedron Lett. 29:4935)。
【００２５】同様に、ペプトイドに本発明における用途
を見出せるであろう。ペプトイドはＮ−置換アミノ酸の
オリゴマーであって（サイモンらの前記文献 (1972))、
正常分子の化学的に多様なライブラリーを生み出すため
のモチーフとして用い、次いでｐ３４cdc2、ｐ３
３cdk2、ＨＰＶ Ｅ７又はその他のアクセプター分子に
対する結合及び阻害活性について試験することができ
る。そのモノマーには、ｔ−ブチルを含む側鎖及び９−
フルオレニルメトキシカルボニルのα−アミン保護基が
入っていてもよい。このペプチドモノマーのオリゴマー
化は、例えば、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシト
リス（ピロリジノ）ホスホニウム・ヘキサフルオロホス
フェート又はブロモトリス（ピロリジノ）ホスホニウム
・ヘキサフルオロホスフェートのいずれかによる、in s
itu 活性化によって行うことができる。その他の工程
は、α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミ
ノ酸を用いる従来のペプチド合成法と同じである。対応
する阻害性ペプチドに匹敵する親和性を有し、かくして
ｐ３４cdc2及びｐ３３cdk2キナーゼ又はＨＰＶ Ｅ７結
合検査法に有用であるオリゴペプトイドを同定すること
ができる（サイモンらの前記文献 (1992) を参照のこ
と）。
【００２６】ｐ３４cdc2、ｐ３３cdk2、ＨＰＶ Ｅ７又
は他のタンパク質アクセプターと相互作用するペプチド
リガンドは、生物学的発現系を用いて開発することがで
きる（クリスチャン(Christian) ら (1992) J. Mol. Bi
ol. 227:711-8 ；デブリン (Devlin) ら (1990) Scienc
e 249:404-406 ；クワーラ (Cwirla) ら (1990) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382 を参照のこと）。
かかる系を使用すると、ランダムペプチド配列の大きな
ライブラリーを作ること及び特定のタンパク質に結合す
るペプチド配列についてのこれらライブラリーのスクリ
ーニングが可能になる。これらライブラリーは、ランダ
ムペプチド配列をコードする合成ＤＮＡの大腸菌発現ベ
クター内へのクローニングによって作ることができる。
繊維状ファージ系では、外来ペプチド配列を感染性ファ
ージの表面上で発現させることができる（スミス (Smit
h) (1985) Science 228:1315-1317 ；パームリイ(Parml
ey) ら (1988) Gene 73:305-318 を参照のこと）。
【００２７】例えば、適当なファージ内に変性コーディ
ング配列（ＮＮＫ）n を含有する合成ＤＮＡ断片を連結
するこによってライブラリーを作ることができる。ここ
で、Ｎは、デオキシヌクレオチドＧ、Ａ、Ｔ、及びＣの
等量混合物を表し、Ｋは、ＧとＴの等モル混合物を表
し、ｎは生成ペプチドに望まれるアミノ酸残基の数を表
す。アフェクター結合ペプチドを示すファージの親和精
製は、そのアフェクターをビオチニル化し、ファージを
このビオチニル化アフェクターとインキュベートし、そ
してそのファージをストレプトアビジン被覆プレート上
で反応させることによって行うことができる。結合した
ファージを溶出して寒天培地上で増幅して更に親和精製
を重ねる。親和精製の最終回からのファージをクローン
化して増殖させ、それらのＤＮＡを配列決定して発現ペ
プチドのアミノ酸配列を決定し、そしてｐ３４cdc2、ｐ
３３cdk2、ＨＰＶ Ｅ７又はその他のアフェクター分子
へのそれらの結合性を酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩ
ＳＡ）により評価する。異なる短ペプチド配列を発現す
る多くのクローンからなるかかるライブラリーを用いて
結合ドメインをマッピングすることができる。
【００２８】ペプチド阻害物質の大きなライブラリー
は、ゲイセン (Geysen) への米国特許第4,７０8,８７１
号に記載されている重複ペプチドの同時合成によっても
構築することができる。これら合成ペプチドは、合成に
用いた支持体に結合させたまま、アクセプター分子との
相互作用についてＥＬＩＳＡにより試験するこができ
る。この固体支持体は、一般にはポリエチレン又はポリ
プロピレン棒であって、その支持体上に高分子鎖を形成
する少なくとも１種の官能基を含有するビニルモノマー
がグラフト重合するものである。これら官能基が反応し
て１級又は２級アミノ基を提供する。引き続き、固相ペ
プチド化学の従来法を用いて、それらを適当な順番でア
ミノ酸残基と反応させて所期の合成ペプチドを築き上げ
る。
【００２９】作り終えたら、その阻害性ペプチド又はペ
プチド擬似物質を、必須サイクリンをコードする遺伝子
の分裂に関係する腫瘍、例えば、肝細胞癌腫、上皮小体
腫瘍、幾つかのＢ細胞白血病及び一定の肺癌腫又はｐ５
３機能の損失と関係する腫瘍を改善するために、医薬組
成物に用いることができる。本発明の阻害性ペプチド
は、液体の溶液剤又は懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、坐
剤、高分子マイクロカプセル剤又は微小小胞剤、リポソ
ーム剤、及び注射可能又は点滴可能な溶液剤の如き種々
の投与形態（これらに限定されない）の治療用組成物に
製剤することができる。好ましい形態は、投与様式及び
標的にされる個々の癌のタイプに依存する。これら組成
物は、好ましくは、ヒト血清アルブミン、イオン交換物
質、アルミナ、レシチン、ホスフェートの如き緩衝物
質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、及び
硫酸プロタミンの如き塩又は電解質のような当該技術分
野で周知の薬学的に許容できる賦形剤、キャリヤー又は
アジュバントも含む。適する賦形剤は、例えば、水、食
塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、又
はそれらに類したもの、及びそれらの組み合わせであ
る。かかる組成物を製造する現実の方法は、当業者にと
って既知であるか又は明らかになるであろう。例えば、
Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishi
ng Company, Easton,Pennsylvania, 18th edition, 199
0 を参照のこと。
【００３０】これら組成物は、静脈内、腹腔内、経口、
リンパ内、又は皮下投与を含むがこれらに限定されない
従来の送逹様式を用いて投与することができる。問題の
腫瘍への局所投与にも、本発明の用途を見出せるであろ
う。治療的有効量は、当業者によって容易に決められる
ものであり、疾患の重さ、疾患の経過、患者の健康及び
治療に対する反応、及び治療医の判断に依存するであろ
う。
【００３１】
【実施例】
Ｃ．実験 以下は、本発明を実施するための具体的態様の例であ
る。これら実施例は、説明のためにだけ示すものであっ
て、決して本発明の範囲を限定することを意図したもの
ではない。用いた数値（例えば、量、温度等）に関して
正確さを確保する努力を行ったが、もちろん、僅かな実
験誤差は許されるべきである。
【００３２】実験方法 ＨｅＬａ細胞溶解産物 ：ＨｅＬａ細胞抽出物をｐ３４
cdc2及びｐ３３cdk2の供給源として役立てた。これらを
次のように調製した。ＨｅＬａ細胞を２０ｍＭ Ｎ−
〔２−ヒドロキシエチル〕ピペラジン−N'−〔２−ヒド
ロキシプロパンスルホン酸〕（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ7.
０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭバナジウム酸ナト
リウム、１０ｍＭ Ｎa4P2O7、１ｍＭ ＺｎＣl2、２ｍ
Ｍエチレンジアミン・４酢酸（ＥＤＴＡ）、２ｍＭエチ
レングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−
Ｎ,N,N',N'−４酢酸（ＥＧＴＡ）、１ｍＭジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）、0.２５容量％ＮＰ−４０、１ｍＭベ
ンザミジン (Benzamidine)、１ｍＭフッ化フェニルメチ
ルスルホニル（ＰＭＳＦ）及び各２０μｇ／ｍｌのＮ2S
2O3 、ロイペプチン、アンチパン(Antipan) 及びペプス
タチン(Pepstatin) 中で溶解た後、遠心分離によって細
胞デブリを除去した。
【００３３】ｐ３４cdc2の免疫沈降：ＨｅＬａ細胞抽出
物からのｐ３４cdc2の免疫沈降を以前に報告された操作
（ハーロー (Harlow) ら (1988), Antibodies: A Labor
atory Manual, ed. Harlow and Lane, Cold Spring Har
bor: Cold Spring Harbor Laboratory, pp 421-470）及
び抗ｐ３４cdc2抗体であるＧ６（Gibco, BRL) を用いて
行った。この方法による免疫沈降で、活性化キナーゼ複
合体が生成した（ドラエッタら (1988), Cell54:17-2
6）。
【００３４】ｐ３４cdc2キナーゼ活性の検査：ヒストン
Ｈ１キナーゼ反応を、５０ｍＭトリス（ｐＨ8.０）、１
０ｍＭ ＭｇＣl2、0.５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＧＴ
Ａ＋0.１ｍＭ ＡＴＰ、１μＣｉγ−〔32Ｐ〕−ＡＴＰ
及び１０μｇヒストンＨ１（ベーリンガー・マンハイ
ム）、及び３４cdc2の供給源中で行った。反応液を３０
℃で２０分間インキュベートし、タンパク質ゲルサンプ
ル緩衝液の添加によって反応を停止した。キナーゼ反応
液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１2.５％ゲル）によって分離し
た。オートラジオグラフィーによってバンドを検出し、
アンビス (Ambis)・ラジオアナリチック・イメージング
・システムを用いて取り込まれた32Ｐを定量した。
【００３５】実施例１ ｐ３４cdc2結合タンパク質の比較 ｐ３４cdc2細胞周期調節キナーゼ活性の阻害物質を、ま
ず、既知のｐ３４cdc2関連タンパク質：ヒトサイクリン
Ａ、Ｂ１、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ｐ１０７タンパク質及び網膜芽
細胞腫腫瘍サプレッサータンパク質（Ｒｂ）（配列番
号：４、５、６、７、８、９、１０）の一次アミノ酸配
列を比較することによって特定した。ヒトサイクリンタ
ンパク質の基本的整列化はルーらの前記文献 (1991）に
より示され、そしてＲｂとｐ１０７の整列化はユーアン
らの前記文献 (1991）により行われた。続いて、これら
７つ全てのタンパク質の配列を図１に示したようにして
比較した。全７配列の第二構造分析は、チョー−ファス
マン (Chou-Fasman)（チョーら (1974) Biochemistry 1
3:211-222 ；チョーら (1974) Biochemistry 13:222-24
5 ）とロブソン−ガーニヤー (Robson-Garnier) （ガー
ニヤーら (1978) J. Mol. Biol. 120:97-120）の構造予
測プログラムの両方を用いて行った。α−ヘリックスＩ
及びα−ヘリックスIIと名付けた共通のα−ヘリックス
構造の２つの領域を７タンパク質のうちの６について両
構造予測プログラムによって予測した。１７０アミノ酸
領域の配列類似性が、Ｒｂ、ｐ１０７及びこれらヒトサ
イクリンの間に認められた。Ｒｂとｐ１０７は、サイク
リンＥと最高度の類似性を有し、それぞれ２７％及び３
４％であった。これら配列は、共通の予測α−ヘリック
ス構造の２つの領域を含有する。螺旋回転に関するＲ
ｂ、ｐ１０７及びサイクリンＥのα−ヘリックスII配列
の投影図は、保存された残基がこのα−ヘリックスの１
つの面上に現れていることが証明している。
【００３６】実施例２ ｐ１０７へのｐ３４cdc2の結合 α−ヘリックスIIドメインがＲｂ、ｐ１０７及びヒトサ
イクリンＥのｐ３４cd c2との相互作用に関与しているか
否かを試験するために、α−ヘリックスIIを包含するｐ
１０７からの３０アミノ酸ペプチド（残基６９２〜７２
１：Phe Glu Phe Thr Leu Val His Cys Pro Asp Leu Me
t Lys Asp Leu Met Lys Asp Arg His Leu Asp Trp Leu
Leu Leu Cys Ala Phe Tyr Ile Met Ala Lys （配列番
号：１１））を合成して、ｐ３４cdc2と結合するその能
力について検査した。この３０量体をＣＨ−活性化セフ
ァロース４Ｂ（ファルマシア）に次のようにして共有結
合させた。水溶液に不溶性のｐ１０７・３０アミノ酸ペ
プチドを N,N−ジメチルホルムアミド中でこのセファロ
ースに結合させた。このビーズに結合した３０量体の濃
度は、ＨＰＬＣにより測定して0.８５μモル／ｍｌであ
った。このｐ１０７・３０量体−セファロースを全Ｈｅ
Ｌａ細胞溶解産物とインキュベートして２５容量の溶解
緩衝液で洗浄した。これら結合したタンパク質をＮａＣ
ｌの濃度を増加させながら溶出させて、ドデシル硫酸ナ
トリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）（１2.５％ゲル）により分離し、そしてポリ
ビニリデン・ジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に移した。
抗ｐ３４cdc2抗体、つまりＧ６（Gibco, BRL) でこの膜
をプロービングすることによってｐ３４cdc2を検出した
（ドラエッタらの前記文献 (1988）を参照のこと）。こ
のｐ１０７・３０量体−セファロースはｐ３４cdc2に結
合し、その複合体の大多数は２Ｍ ＮａＣｌに対して安
定であった。これら結果は、α−ヘリックスII内のアミ
ノ酸配列がｐ３４cdc2との直接相互作用への十分な情報
を含んでいること示すものである。
【００３７】実施例３ ｐ１０７へのｐ３３cdk2の結合 実施例２に記載した方法を用いてｐ３３cdk2に結合する
ｐ１０７の能力を検査した。ｐ１０７・３０量体−セフ
ァロースビーズをＨｅＬａ細胞抽出物（３×１０5 細胞
／反応液）とインキュベートしてよく洗浄した。次い
で、結合複合体を１2.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離
し、ＰＶＤＦ膜上にブロットした。次いで、このブロッ
トをこのキナーゼの抗体でプロービングした。抗ｐ３３
cdk2抗体（アップステート (Upstate)・バイオテクノロ
ジー）でのこのウェスタンブロット分析の結果は、ｐ１
０７・３０アミノ酸ペプチドがこのキナーゼサブユニッ
トに結合することを示している。
【００３８】実施例４ 結合ｐ３４cdc2及び免疫沈降ｐ３４cdc2のヒストンＨ１
キナーゼ活性 ｐ１０７・３０量体−セファロースへのｐ３４cdc2の結
合のｐ３４cdc2キナーゼ活性への効果を検査するため
に、ｐ１０７・３０量体−セファロースと結合したヒス
トンＨ１キナーゼ活性体と免疫沈降ｐ３４cdc2を次のよ
うに比較した。実施例２に記載したようにして、ｐ３４
cdc2をｐ１０７・３０量体−セファロースに結合させ
た。ヒストンＨ１キナーゼ反応は、免疫沈降ｐ３４cdc2
又はｐ１０７・３０量体−セファロース結合ｐ３４cdc2
のいずれかを用いて行った。ウェスタンブロットによ
り、ｐ１０７・３０量体−セファロースに結合したｐ３
４cdc2の量をこの免疫複合体内に含まれるｐ３４cdc2の
量と比較した。キナーゼ反応に用いた免疫沈降ｐ３４
cdc2の量の２倍をブロットして検出が容易になるように
した。ｐ１０７・３０量体−セファロースに結合したｐ
３４cdc2の量は、比重分析法により測定して、免疫複合
体内に含まれる量よりも５０倍以上多かった。このデー
タは、異なるビーズに結合したキナーゼ活性体を規準化
するのに用いた。ｐ１０７・３０アミノ酸ペプチド結合
酵素について観察されたヒストンＨ１キナーゼ活性体
は、免疫複合体のものと類似している。両反応液中に存
在するｐ３４cdc2タンパク質の量を規準化して、このペ
プチド結合酵素が、免疫複合体の特異的活性の1.４％の
特異的活性しか有していないことが証明された。これ
は、ｐ１０７・３０量体が、ｐ３４cdc2へのサイクリン
結合について競合することと一致しており、サイクリン
類、Ｒｂ、及びｐ１０７では結合のメカニズムが共通し
ていることを示唆している。
【００３９】実施例５ ｐ３４cdc2ヒストンＨ１キナーゼ活性のペプチド阻害 ｐ３４cdc2とのｐ１０７の結合の更なる試験として、及
びｐ３４cdc2との相互作用に必要な最小配列を決めるた
めに、ｐ３４cdc2免疫複合体ヒストンＨ１キナーゼ活性
へのｐ１０７ペプチドの効果を評価した。アミノ末端及
びカルボキシ末端の両方で原型３０アミノ酸ペプチドに
欠失を導入した（表１を参照のこと）。これらペプチド
は、標準的方法で合成してＨＰＬＣで精製した。免疫複
合体は、実施例４に記載した通りに生成させ、キナーゼ
緩衝液＋ N,N−ジメチルホルムアミド中に溶解した５０
μＭのそれぞれのペプチド中に、又は等容量の溶媒中に
懸濁させた。これら反応液を氷上で１５分間インキュベ
ートした後、ヒストンＨ１とγ−〔32Ｐ〕−ＡＴＰを添
加して、キナーゼ分析を行い、実施例４に記載した通り
に定量した。
【００４０】ｐ１０７ペプチドの添加は、免疫複合体と
結合したヒストンＨ１キナーゼ活性を阻害する（表１を
参照のこと）。ｐ３３cdk2キナーゼ反応液へのｐ１０７
ペプチドの添加の添加も、キナーゼの活性を阻害する。
Ｃｙｓ713 までのアミノ末端配列の欠失及びＩｌｅ717
までのカルボキシ末端配列の欠失を有するペプチドは、
ｐ３４cdc2活性を阻害する能力を保持する。Ａｌａ714
又はＴｙｒ716 のいずれかまでの更なる欠失によって、
不活性ペプチドができた。無関係１９量体コントロール
ペプチドは、ヒストンＨ１活性に何の効果も有さなかっ
た。これらデータは、阻害活性を保持する最小配列が、
配列 Cys Ala Phe Tyr Ile（配列番号：３）を有するペ
ンタペプチドであったことを証明している。このペンタ
ペプチド内に非保存的アミノ酸置換を導入すると、Ｃｙ
ｓ713 におけるものを除いてｐ３４cdc2キナーゼ阻害性
が完全に無くなった。
【００４１】実施例６ ｐ１０７ペプチドのｐ３４cdc2阻害活性への１アミノ酸
置換の効果 ｐ３４cdc2及び他のリガンド（例えば、Ｅ１Ａ又はＥ２
Ｆ）の結合におけるＲｂのＣｙｓ706 及びｐ１０７のＣ
ｙｓ713 の役割を調べるために、ＣｙｓからＰｈｅへの
アミノ酸置換を位置７１３において含有するペプチドを
合成し、その阻害活性を調べた。この１突然変異は、ヒ
ストンＨ１キナーゼ活性を阻害するそのペプチドの能力
を３０％低下させた。これは、ｐ１０７ペプチド−ｐ３
４cdc2相互作用におけるＣｙｓ713 の重要性を確認する
ものである（表１の９量体と７１３ＣＦを比較のこ
と）。この残基は、サイクリンＤ及びＥにおいても保存
されているので、同じように機能しているといえる。更
に、調べた他のタンパク質の間で高度に保存されている
Ｔｙｒ716 をＡｌａに置換すると、ｐ３４cdc2キナーゼ
阻害が完全に無くなった（表１の９量体と７１６ＹＡを
比較のこと）。これらデータも、ｐ１０７ペプチドが、
ｐ３４cdc2に結合したキナーゼ活性化に要求される細胞
性因子と競合してそれを放逐することができることを示
唆しており（ピネスらの前記文献 (1989) ；ムレイらの
前記文献 (1989) ；ソロモンらの前記文献(1990) ；ド
ラエッタら (1989) Cell 56:829-838)、これは、低レベ
ルのキナーゼ活性体はｐ１０７・３０量体ペプチド−セ
ファロースと結合するという先の結果と一致している。
【００４２】
【表１】 表 Ｉ ──────────────────────────────────── 配列 p34cdc2 IC50 番号 阻害率(%) (μM) ──────────────────────────────────── 30量体 Phe Glu Phe Thr Leu Val His Cys Pro Asp 12 未測定 未測定 Leu Met Lys Asp Arg His Leu Asp Gln Leu Leu Leu Cys Ala Phe Tyr Ile Met Ala Lys 21量体 Asp 13 70 未測定 Leu Met Lys Asp Arg His Leu Asp Gln Leu Leu Leu Cys Ala Phe Tyr Ile Met Ala Lys 18量体 Lys Asp Arg His Leu Asp Gln Leu 14 80 未測定 Leu Leu Cys Ala Phe Tyr Ile Met Ala Lys 14量体 Leu Asp Gln Leu 15 80 未測定 Leu Leu Cys Ala Phe Tyr Ile Met Ala Lys 9 量体 Leu Cys Ala Phe Tyr Ile Met Ala Lys 1 90 9 N7量体 Ala Phe Tyr Ile Met Ala Lys 16 0 未測定 N5量体 Tyr Ile Met Ala Lys 17 0 >100 C7量体 Leu Cys Ala Phe Tyr Ile Met 18 70 未測定 C6量体 Leu Cys Ala Phe Tyr Ile 19 79 未測定 C5量体 Leu Cys Ala Phe Tyr 20 0 未測定 NC5 量体 Cys Ala Phe Tyr Ile 3 82 13 NC4 量体 Cys Ala Phe Tyr 21 0 未測定 ────────────────────────────────── 713CF Leu Phe Ala Phe Tyr Ile Met Ala Lys 22 60 15 714AE Leu Cys Glu Phe Tyr Ile Met Ala Lys 23 0 23 715FA Leu Cys Ala Ala Tyr Ile Met Ala Lys 24 0 >100 715FK Leu Cys Ala Lys Tyr Ile Met Ala Lys 25 0 >100 715FY Leu Cys Ala Tyr Tyr Ile Met Ala Lys 26 20 45 716YA Leu Cys Ala Phe Ala Ile Met Ala Lys 27 0 40 716YF Leu Cys Ala Phe Phe Ile Met Ala Lys 28 80 25 717IK Leu Cys Ala Phe Tyr Lys Met Ala Lys 29 0 >100 719AQ Leu Cys Ala Phe Tyr Ile Met Gln Lys 30 75 未測定 ────────────────────────────────── SV-NC Pro Lys Lys Lys Arg 31 0 未測定 5 量体 Lys Val Cys Ala Phe Tyr Ile RR-NC Arg Arg Cys Ala Phe Tyr Ile 32 0 未測定 5 量体 PKG-NC Arg 33 0 未測定 5 量体 Lys Arg Cys Ala Phe Tyr Ile SPKK-NC Ser Pro Lys 34 0 未測定 5 量体 Lys Gly Cys Ala Phe Tyr Ile NC5 量体 Cys Ala Phe Tyr Ile Gly Ser Pro 35 80 未測定 -SPKK Lys Lys ────────────────────────────────────
【００４３】実施例７ ヒストンＨ１キナーゼ活性の阻害により検査したｐ３４
cdc2に対するｐ１０７９量体の親和性 ｐ３４cdc2に対するこの９量体の結合親和性を、ヒスト
ンＨ１キナーゼ活性の阻害率（％）をペプチド濃度に相
関させることによって見積もった。実施例４に記載した
通りに反応を行った。阻害率（％）をアンビス・ラジオ
アナリチック・イメージング・システムを用いて定量し
た。阻害率（％）をペプチド濃度に対してプロットし
た。結合定数を見積もるに際して、基質とペプチドの濃
度は、この反応において限定されると仮定されるｐ３４
cdc2タンパク質の大過剰であると仮定した。図５に示す
ように、ｋd を阻害率５０％の点から見積もって約１０
μＭの値を得た。ｐ３４cdc2に対するこのペプチドの結
合親和性は、ｐ３４cdc2活性を効率的に阻害するこのペ
プチドの能力のために、その分子全体のものと類似して
いると言え、それは活性化因子と競合するその能力と直
接関係している。
【００４４】実施例８ ＥＬＩＳＡにより検査したｐ３４cdc2に対するｐ１０７
・９量体の親和性 ＥＬＩＳＡに基づく検査法を開発して、ｐ１０７ペプチ
ド及びそれらの誘導体の活性を測定した。ｐ１０７・３
０量体で被覆した９６ウェルクラスタープレートは、細
胞抽出物からのｐ３４cdc2キナーゼと結合する。この結
合は、抗ｐ３４ cdc2抗体で容易に検出でき、実施例７に
記載したキナーゼ阻害検査法に加えて、ｐ３４cdc2キナ
ーゼに対するｐ１０７野生型及び突然変異型ペプチドの
親和性を定量するのに用いることができる。原型ｐ１０
７ペプチドへの全ての修飾及び結合とキナーゼ阻害への
それらの効果を表１に纏める。ｐ３４cdc2キナーゼに対
するｐ１０７・９量体ペプチドの親和性は、ＥＬＩＳＡ
に基づく競合検査法により測定して約１０μＭである。
これは、実施例７に記載したキナーゼ阻害検査法から見
積もった結合定数と一致する。ペンタペプチド配列 Cys
Ala Phe Tyr Ile（配列番号：３）内に非保存的アミノ
酸置換を導入すると、Ｃｙｓ713 におけるものを除いて
ｐ３４cdc2阻害及びキナーゼ結合の両方が相当に低下し
た。これらデータは、ｐ１０７タンパク質がｐ３４cdc2
と結合できることを証明している。これは、Ｒｂ及びサ
イクリンタンパク質へのその相同性と一致しており、そ
してこれらタンパク質により共有される機能的類似性の
構造的基礎を提供するものである。
【００４５】実施例９ ヒト乳頭腫ウィルス−Ｅ７タンパク質の阻害 Ｒｂとｐ１０７はアデノウィルスＥ１Ａ発癌性タンパク
質と特異性複合体を形成し、ＲｂはＥ７発癌性ヒト乳頭
腫ウィルス（ＨＰＶ）と類似の複合体を形成する。ｐ１
０７・３０量体ペプチドドメインとＲｂが他の腫瘍サプ
レッサータンパク質又は他の細胞性及びウィルス性リガ
ンドと相互作用できるか否かを確認するために、細胞性
及び細菌発現ヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）−Ｅ７タン
パク質に結合するｐ１０７・３０量体ペプチドを検査し
た。実施例２に記載した通りに調製したｐ１０７・３０
アミノ酸ペプチド−セファロースを、ＣａＳｋｉ細胞
（ＨＰＶ−１６陽性子宮頸癌腫）抽出物とインキュベー
トしてＥ７タンパク質の結合性について検査した。ウェ
スタンブロットにより、このペプチドはＣａＳｋｉ細胞
からのＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質には結合しないこと
が証明された。
【００４６】細菌発現ＨＰＶ１８−Ｅ７タンパク質のｐ
１０７・３０量体ペプチドとの結合を、ＥＬＩＳＡ検査
法を用いて分析した。図６に示した実験では、９６ウェ
ルクラスタープレートをｐ１０７・３０量体ペプチドで
被覆し、ＭＢＰ−Ｅ７融合タンパク質又はコントロール
としてのＭＢＰタンパク質と、ＭＢＰ−Ｅ７融合タンパ
ク質の濃度を高めながらインキュベートした。この実験
は、ｐ１０７・３０量体ペプチドがＨＰＶ−Ｅ７タンパ
ク質に直接に結合できること及びその結合がウィルスの
タイプに依存しないことを示している。図７に示した実
験では、ＭＢＰ−Ｅ７融合タンパク質（１００ｎｇ）
を、ｐ１０７・３０量体ペプチド被覆プレートと、フリ
ーのｐ１０７・９量体ペプチドの存在下でその濃度を高
めながらインキュベートした。図６〜７に示すように、
結合は４０５ｎｍの光学密度の増加に直接比例してい
る。図７に示した競合実験の結果は、ＨＰＶ１８−Ｅ７
タンパク質に対するｐ１０７・９量体ペプチドの親和性
が約１ｎＭであることを示しており、これはｐ３４cdc2
キナーゼに対するものよりも約１0,０００倍大きい。
【００４７】実施例１０ Ｅ７−Ｒｂ複合体形成についてのｐ１０７競合のＥＬＩ
ＳＡ検査 Ｅ７−Ｒｂ相互作用へのｐ１０７ペプチド結合の効果を
調べるために、ＥＬＩＳＡ検査法を用いてＥ７−Ｒｂ複
合体形成を追跡した。９６ウェルクラスタープレートを
ＭＢＰ−Ｅ７タンパク質（○）又はコントロールとして
ＭＢＰ単独（●）で被覆した。これらプレートを、モノ
クローナル抗体αＲｂ３４９（ファルミンゲン (Pharmi
ngen) ，サンディエゴ，ＣＡ）で検出したバキュロウィ
ルス発現Ｒｂ（Ｂａｃ−Ｒｂ）とその濃度を高めながら
インキュベートした（図８）。別の実験では、９６ウェ
ルクラスタープレートをＭＢＰ−Ｅ７タンパク質で被覆
し、１００ｎｇＲｂと、ｐ１０７・９量体ペプチドの存
在下でその濃度を高めながらインキュベートした（図
９）。結合は、４０５ｎｍでの光学密度の増加として定
量される。図８に示した実験の結果は、Ｒｂに結合する
細菌発現Ｅ７−ＭＢＰ融合タンパク質の能力をはっきり
と証明している。図９に示した実験の結果は、ｐ１０７
・９量体ペプチドを反応液にその濃度を高めながら添加
すると、ＲｂとのＥ７の結合について効果的に競合する
ことを証明している。この結果は、ｐ１０７・９量体ペ
プチドが、ＨＰＶ−Ｅ７タンパク質の効果的な阻害物質
であり得ることを示唆している。Ｒｂタンパク質からの
対応するペプチド（配列Met CysSer Met Tyr Gly Ile C
ys Lys （配列番号：２））も、Ｅ７発癌性タンパク質
に結合してＥ７−Ｒｂ相互作用について競合する。
【００４８】このように、ｐ３４cdc2とｐ３３cdk2の阻
害物質、並びにヒト乳頭腫ウィルスの阻害物質を開示し
てきた。本発明の好ましい態様をある程度詳細に説明し
てきたが、特許請求の範囲により規定した本発明の範囲
から逸脱することなく自明な変更が行えることが理解さ
れるべきである。
【００４９】配 列 表 配列番号：１の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：９ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：１の配列
【００５０】
【表２】
【００５１】配列番号：２の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：９ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：２の配列
【００５２】
【表３】
【００５３】配列番号：３の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：５ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：３の配列
【００５４】
【表４】
【００５５】配列番号：４の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１７３ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：４の配列
【００５６】
【表５】
【００５７】配列番号：５の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１７１ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：５の配列
【００５８】
【表６】
【００５９】配列番号：６の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１７９ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：６の配列
【００６０】
【表７】
【００６１】配列番号：７の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１７３ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：７の配列
【００６２】
【表８】
【００６３】配列番号：８の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１７４ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：８の配列
【００６４】
【表９】
【００６５】配列番号：９の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１６８ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：９の配列
【００６６】
【表１０】
【００６７】配列番号：１０の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１７３ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：１０の配列
【００６８】
【表１１】
【００６９】配列番号：１１の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：３４ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：１１の配列
【００７０】
【表１２】
【００７１】配列番号：１２の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：３０ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：１２の配列
【００７２】
【表１３】
【００７３】配列番号：１３の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：２１ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：１３の配列
【００７４】
【表１４】
【００７５】配列番号：１４の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１８ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：１４の配列
【００７６】
【表１５】
【００７７】配列番号：１５の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１４ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：１５の配列
【００７８】
【表１６】
【００７９】配列番号：１６の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：７ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：１６の配列
【００８０】
【表１７】
【００８１】配列番号：１７の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：５ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：１７の配列
【００８２】
【表１８】
【００８３】配列番号：１８の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：７ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：１８の配列
【００８４】
【表１９】
【００８５】配列番号：１９の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：６ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：１９の配列
【００８６】
【表２０】
【００８７】配列番号：２０の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：５ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：２０の配列
【００８８】
【表２１】
【００８９】配列番号：２１の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：４ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：２１の配列
【００９０】
【表２２】
【００９１】配列番号：２２の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：９ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：２２の配列
【００９２】
【表２３】
【００９３】配列番号：２３の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：９ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：２３の配列
【００９４】
【表２４】
【００９５】配列番号：２４の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：９ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：２４の配列
【００９６】
【表２５】
【００９７】配列番号：２５の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：９ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：２５の配列
【００９８】
【表２６】
【００９９】配列番号：２６の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：９ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：２６の配列
【０１００】
【表２７】
【０１０１】配列番号：２７の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：９ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：２７の配列
【０１０２】
【表２８】
【０１０３】配列番号：２８の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：９ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：２８の配列
【０１０４】
【表２９】
【０１０５】配列番号：２９の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：９ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：２９の配列
【０１０６】
【表３０】
【０１０７】配列番号：３０の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：９ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：３０の配列
【０１０８】
【表３１】
【０１０９】配列番号：３１の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１２ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：３１の配列
【０１１０】
【表３２】
【０１１１】配列番号：３２の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：７ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：３２の配列
【０１１２】
【表３３】
【０１１３】配列番号：３３の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：８ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：３３の配列
【０１１４】
【表３４】
【０１１５】配列番号：３４の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１０ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：３４の配列
【０１１６】
【表３５】
【０１１７】配列番号：３５の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：１０ (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 分子の型：ペプチド (iii) 配列番号：３５の配列
【０１１８】
【表３６】
【図面の簡単な説明】
【図１】サイクリンＡ、Ｂ１、Ｃ、Ｄ及びＥ、ｐ１０７
及びＲｂ（配列番号：４、５、６、７、８、９、１０）
を含む種々のｐ３４cdc2結合タンパク質のアミノ酸配列
の比較の第１部分を示す。空隙は、相同性を最大に示す
ために挿入したものであって横線で表している。アミノ
酸は三文字法で表している。ボックスで囲んであるの
は、同一アミノ酸又は保存的置換アミノ酸である。矢印
部分は、α−ヘリックスII領域を表す。
【図２】サイクリンＡ、Ｂ１、Ｃ、Ｄ及びＥ、ｐ１０７
及びＲｂ（配列番号：４、５、６、７、８、９、１０）
を含む種々のｐ３４cdc2結合タンパク質のアミノ酸配列
の比較の第２部分を示す。
【図３】サイクリンＡ、Ｂ１、Ｃ、Ｄ及びＥ、ｐ１０７
及びＲｂ（配列番号：４、５、６、７、８、９、１０）
を含む種々のｐ３４cdc2結合タンパク質のアミノ酸配列
の比較の第３部分を示す。
【図４】サイクリンＡ、Ｂ１、Ｃ、Ｄ及びＥ、ｐ１０７
及びＲｂ（配列番号：４、５、６、７、８、９、１０）
を含む種々のｐ３４cdc2結合タンパク質のアミノ酸配列
の比較の第４部分を示す。
【図５】ｐ１０７・９量体ペプチド濃度に対してｐ３４
cdc2ヒストンＨ１キナーゼ活性の阻害率（％）をプロッ
トしたグラフである。
【図６】ＨＰＶ１８−Ｅ７へのｐ１０７・３０量体ペプ
チドの結合をプロットしたグラフ（ＭＢＰ−Ｅ７
（●）、ＭＢＰ単独（△））である。
【図７】Ｅ７−ｐ１０７・３０量体ペプチド相互作用に
ついて、ｐ１０７・９量体ペプチド（Leu Cys Ala Phe
Tyr Ile Met Ala Lys （配列番号：１））との競合をプ
ロットしたグラフである。
【図８】Ｒｂタンパク質へのＭＢＰ−Ｅ７タンパク質の
結合に対するｐ１０７・９量体ペプチド（Leu Cys Ala
Phe Tyr Ile Met Ala Lys （配列番号：１）の作用をＥ
ＬＩＳＡにより測定してプロットしたグラフ（ＭＢＰ−
Ｅ７（○）；ＭＢＰ単独（△））である。
【図９】Ｒｂタンパク質へのＭＢＰ−Ｅ７タンパク質の
結合に対するｐ１０７・９量体ペプチド（Leu Cys Ala
Phe Tyr Ile Met Ala Lys （配列番号：１）の作用を結
合競合法により測定してプロットしたグラフ（結合した
Ｒｂ（●））である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年４月６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】実施例に示すように、ｐ３４ｃｄｃ２キナ
ーゼ、ｐ３３ｃｄｋ２キナーゼ又はＨＰＶＥ７の特許請
求した阻害物質は、ｐ３４ｃｄｃ２及び／又はＨＰＶ
Ｅ７と相互作用するタンパク質の結合ドメインから誘導
されるアミノ酸の配列及びその擬似物質を含む。特に、
これら阻害物質は、図１〜４に示すα−ヘリックスＩＩ
領域として知られる多くのｐ３４ｃｄｃ２結合ドメイン
中に見出される相同性領域から誘導される。ｐ１０７か
らのα−ヘリックスＩＩ配列を包含する３０アミノ酸ペ
プチド、Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖ
ａｌ ＨｉｓＣｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｍｅｔ
Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｒｇ ＨｉｓＬｅｕ Ａｓｐ Ｇ
ｌｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈ
ｅＴｙｒ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｙｓ（配列番
号：１１）がｐ３４ｃｄｃ２及びｐ３３ｃｄｋ２に結合
することをここに示した。この３０アミノ酸ペプチド
も、ｐ３４ｃｄｃ２及びｐ３３ｃｄｋ２のヒストンＨ１
キナーゼ活性を阻害する。アミノ末端又はカルボキシ末
端アミノ酸を連続的に欠失させることにより、５アミノ
酸配列（Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｉｌｅ（配
列番号：３））を阻害活性を保持する最小配列として同
定した。更には、この５アミノ酸ペプチドを含む９アミ
ノ酸配列（Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔｙｒ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｙｓ（配列番号：１））を
有するペプチドが約１０μＭの親和性でｐ３４ｃｄｃ２
に結合することが分かった。従って、本発明の有用なｐ
３４ｃｄｃ２阻害物質は、少なくともこの５量体から誘
導され、適切な結合コンフォメーションが保持されてい
る限り、５０〜２００もの又はそれを超えるアミノ酸を
含むことができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３６】実施例２ ｐ１０７へのｐ３４ｃｄｃ２の結合 α−ヘリックスＩＩドメインがＲｂ、ｐ１０７及びヒト
サイクリンＥのｐ３４ｃｄｃ２との相互作用に関与して
いるか否かを試験するために、α−ヘリックスＩＩを包
含するｐ１０７からの３０アミノ酸ペプチド（残基６９
２〜７２１：Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ
Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａ
ｓｐ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ａｌ
ａ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｙｓ
（配列番号：１１））を合成して、ｐ３４ｃｄｃ２と結
合するその能力について検査した。この３０量体をＣＨ
−活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア）に次のよう
にして共有結合させた。水溶液に不溶性のｐ１０７・３
０アミノ酸ペプチドをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中
でこのセファロースに結合させた。このビーズに結合し
た３０量体の濃度は、ＨＰＬＣにより測定して０．８５
μモル／ｍｌであった。このｐ１０７・３０量体−セフ
ァロースを全ＨｅＬａ細胞溶解産物とインキュベートし
て２５容量の溶解緩衝液で洗浄した。これら結合したタ
ンパク質をＮａＣｌの濃度を増加させながら溶出させ
て、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１２．５％ゲル）によ
り分離し、そしてポリビニリデン・ジフルオライド（Ｐ
ＶＤＦ）膜に移した。抗ｐ３４ｃｄｃ２抗体、つまりＧ
６（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）でこの膜をプロービングする
ことによってｐ３４ｃｄｃ２を検出した（ドラエッタら
の前記文献（１９８８）を参照のこと）。このｐ１０７
・３０量体−セファロースはｐ３４ｃｄｃ２に結合し、
その複合体の大多数は２Ｍ ＮａＣｌに対して安定であ
った。これら結果は、α−ヘリックスＩＩ内のアミノ酸
配列がｐ３４ｃｄｃ２との直接相互作用への十分な情報
を含んでいること示すものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４２】
【表１】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６９】配列番号：１１の情報
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７０】（ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：３０ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７１】（ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ） 配列番号：１１の配列
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７２】
【表１２】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７３】配列番号：１２の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：２１ （Ｂ）型：アミノ酸 （ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）配列番号：１２の配列
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７４】
【表１３】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７５】配列番号：１３の清報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：１８ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ） 配列番号：１３の配列
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７６】
【表１４】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７７】配列番号：１４の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：１４ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ） 配列番号：１４の配列
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７８】
【表１５】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７９】配列番号：１５の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：７ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ） 配列番号：１５の配列
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８０】
【表１６】
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８１】配列番号：１６の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：５ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ） 配列番号：１６の配列
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８２】
【表１７】
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８３】配列番号：１７の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：７ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）配列番号：１７の配列
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８４】
【表１８】
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８５】配列番号：１８の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：６ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）配列番号：１８の配列
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８６】
【表１９】
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８７】配列番号：１９の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：５ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）配列番号：１９の配列
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８８】
【表２０】
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８９】配列番号：２０の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：４ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）配列番号：２０の配列
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９０】
【表２１】
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９１】配列番号：２１の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：９ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）配列番号：２１の配列
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９２】
【表２２】
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９３】配列番号：２２の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：９ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）配列番号：２２の配列
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９４】
【表２３】
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９５】配列番号：２３の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：９ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ） 配列番号：２３の配列
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９６】
【表２４】
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９７】配列番号：２４の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：９ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）配列番号：２４の配列
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９８】
【表２５】
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００９９】配列番号：２５の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：９ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）配列番号：２５の配列
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１００】
【表２６】
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０１】配列番号：２６の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：９ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ） 配列番号：２６の配列
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０２】
【表２７】
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０３】配列番号：２７の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：９ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）配列番号：２７の配列
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０４】
【表２８】
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０５】配列番号：２８の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：９ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ） 配列番号：２８の配列
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０６】
【表２９】
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０７】配列番号：２９の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：９ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）配列番号：２９の配列
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０８】
【表３０】
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０９】配列番号：３０の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：１２ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）配列番号：３０の配列
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１０】
【表３１】
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１１】配列番号：３１の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：７ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ） 配列番号：３１の配列
【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１２】
【表３２】
【手続補正４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１３】配列番号：３２の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：８ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）配列番号：３２の配列
【手続補正４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１４】
【表３３】
【手続補正５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１５】配列番号：３３の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：１０ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）配列番号：３３の配列
【手続補正５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１６】
【表３４】
【手続補正５２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１７】配列番号：３４の情報 （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：１０ （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）配列番号：３４の配列
【手続補正５３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１８】
【表３５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ケヴィン ジー コールマン アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08525ホープウェル ブラックウェル ア ベニュー 29

Claims (45)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ｐ３４cdc2細胞周期調節キナーゼ活性の
    阻害物質、又はその同族体のキナーゼ活性の阻害物質で
    あって、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ１０７及びサイク
    リン類からなる群から選ばれるタンパク質のｐ３４cdc2
    結合ドメインから誘導される阻害物質。
  2. 【請求項２】 網膜芽細胞腫タンパク質のｐ３４cdc2結
    合ドメインから誘導される、請求項１記載の阻害物質。
  3. 【請求項３】 ｐ１０７のｐ３４cdc2結合ドメインから
    誘導される、請求項１記載の阻害物質。
  4. 【請求項４】 サイクリンＥのｐ３４cdc2結合ドメイン
    から誘導される、請求項１記載の阻害物質。
  5. 【請求項５】 網膜芽細胞腫タンパク質のα−ヘリック
    スIIドメインから誘導される、請求項２記載の阻害物
    質。
  6. 【請求項６】 ｐ１０７のα−ヘリックスIIドメインか
    ら誘導される、請求項３記載の阻害物質。
  7. 【請求項７】 サイクリンＥのα−ヘリックスIIドメイ
    ンから誘導される、請求項４記載の阻害物質。
  8. 【請求項８】 アミノ酸配列 Leu Cys Ala Phe Tyr Ile
    Met Ala Lys（配列番号：１）又は阻害活性を保持する
    この配列の置換物を含むペプチドを含む、請求項５記載
    の阻害物質。
  9. 【請求項９】 アミノ酸配列 Cys Ala Phe Tyr Ile（配
    列番号：３）又は阻害活性を保持するこの配列の置換物
    を含むペプチドを含む、請求項６記載の阻害物質。
  10. 【請求項１０】 同族体がｐ３３cdk2である、請求項１
    記載の阻害物質。
  11. 【請求項１１】 同族体がｐ３３cdk2である、請求項９
    記載の阻害物質。
  12. 【請求項１２】 ペプチド擬似物質を含む、請求項１記
    載の阻害物質。
  13. 【請求項１３】 ヒト乳頭腫ウィルスＥ７タンパク質の
    阻害物質であって、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ１０７
    及びサイクリン類からなる群から選ばれるタンパク質の
    ｐ３４cdc2結合ドメインから誘導される阻害物質。
  14. 【請求項１４】 網膜芽細胞腫タンパク質のｐ３４cdc2
    結合ドメインから誘導される、請求項１３記載の阻害物
    質。
  15. 【請求項１５】 ｐ１０７のｐ３４cdc2結合ドメインか
    ら誘導される、請求項１３記載の阻害物質。
  16. 【請求項１６】 サイクリンＥのｐ３４cdc2結合ドメイ
    ンから誘導される、請求項１３記載の阻害物質。
  17. 【請求項１７】 網膜芽細胞腫タンパク質のα−ヘリッ
    クスIIドメインから誘導される、請求項１４記載の阻害
    物質。
  18. 【請求項１８】 ｐ１０７のα−ヘリックスIIドメイン
    から誘導される、請求項１５記載の阻害物質。
  19. 【請求項１９】 サイクリンＥのα−ヘリックスIIドメ
    インから誘導される、請求項１６記載の阻害物質。
  20. 【請求項２０】 アミノ酸配列 Met Cys Ser Met Tyr G
    ly Ile Cys Lys（配列番号：２）又は阻害活性を保持す
    るこの配列の置換物を含むペプチドを含む、請求項１７
    記載の阻害物質。
  21. 【請求項２１】 アミノ酸配列 Cys Ala Phe Tyr Ile
    （配列番号：３）又は阻害活性を保持するこの配列の置
    換物を含むペプチドを含む、請求項１８記載の阻害物
    質。
  22. 【請求項２２】 ペプチド擬似物質を含む、請求項１３
    記載の阻害物質。
  23. 【請求項２３】 (a) ｐ３４cdc2又はその同族体；及び
    (b) ｐ３４cdc2細胞周期調節キナーゼ活性の阻害物質を
    含む実質的にキナーゼ活性を欠いている複合体であっ
    て、該阻害物質が、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ１０７
    及びサイクリン類からなる群から選ばれるタンパク質の
    ｐ３４cdc2結合ドメインから誘導される複合体。
  24. 【請求項２４】 阻害物質が網膜芽細胞腫タンパク質の
    ｐ３４cdc2結合ドメインから誘導される、請求項２３記
    載の複合体。
  25. 【請求項２５】 阻害物質がｐ１０７のｐ３４cdc2結合
    ドメインから誘導される、請求項２３記載の複合体。
  26. 【請求項２６】 阻害物質がサイクリンＥのｐ３４cdc2
    結合ドメインから誘導される、請求項２３記載の複合
    体。
  27. 【請求項２７】 阻害物質が網膜芽細胞腫タンパク質の
    α−ヘリックスIIドメインから誘導される、請求項２４
    記載の複合体。
  28. 【請求項２８】 阻害物質がｐ１０７のα−ヘリックス
    IIドメインから誘導される、請求項２５記載の複合体。
  29. 【請求項２９】 阻害物質がサイクリンＥのα−ヘリッ
    クスIIドメインから誘導される、請求項２６記載の複合
    体。
  30. 【請求項３０】 阻害物質がアミノ酸配列 Leu Cys Ala
    Phe Tyr Ile Met Ala Lys（配列番号：１）又は阻害活
    性を保持するこの配列の置換物を含むペプチドを含む、
    請求項２７記載の複合体。
  31. 【請求項３１】 阻害物質がアミノ酸配列 Cys Ala Phe
    Tyr Ile（配列番号：３）又は阻害活性を保持するこの
    配列の置換物を含むペプチドを含む、請求項２８記載の
    複合体。
  32. 【請求項３２】 同族体がｐ３３cdk2である、請求項２
    ３記載の複合体。
  33. 【請求項３３】 同族体がｐ３３cdk2である、請求項３
    １記載の複合体。
  34. 【請求項３４】 阻害物質がペプチド擬似物質を含む、
    請求項２３記載の複合体。
  35. 【請求項３５】 (a) ヒト乳頭腫ウィルスＥ７タンパク
    質；及び(b) ヒト乳頭腫ウィルスＥ７タンパク質の阻害
    物質を含む複合体であって、該阻害物質が、網膜芽細胞
    腫タンパク質、ｐ１０７及びサイクリン類からなる群か
    ら選ばれるタンパク質のｐ３４cdc2結合ドメインから誘
    導される複合体。
  36. 【請求項３６】 阻害物質が網膜芽細胞腫タンパク質の
    ｐ３４cdc2結合ドメインから誘導される、請求項３５記
    載の複合体。
  37. 【請求項３７】 阻害物質がｐ１０７のｐ３４cdc2結合
    ドメインから誘導される、請求項３４記載の複合体。
  38. 【請求項３８】 阻害物質がサイクリンＥのｐ３４cdc2
    結合ドメインから誘導される、請求項３５記載の複合
    体。
  39. 【請求項３９】 阻害物質が網膜芽細胞腫タンパク質の
    α−ヘリックスIIドメインから誘導される、請求項３６
    記載の複合体。
  40. 【請求項４０】 阻害物質がｐ１０７のα−ヘリックス
    IIドメインから誘導される、請求項３７記載の複合体。
  41. 【請求項４１】 阻害物質がサイクリンＥのα−ヘリッ
    クスIIドメインから誘導される、請求項３８記載の複合
    体。
  42. 【請求項４２】 阻害物質がアミノ酸配列 Met Cys Ser
    Met Tyr Gly Ile Cys Lys（配列番号：２）又は阻害活
    性を保持するこの配列の置換物を含むペプチドを含む、
    請求項３９記載の複合体。
  43. 【請求項４３】 阻害物質がアミノ酸配列 Cys Ala Phe
    Tyr Ile（配列番号：３）又は阻害活性を保持するこの
    配列の置換物を含むペプチドを含む、請求項４０記載の
    複合体。
  44. 【請求項４４】 ｐ３４cdc2細胞周期調節キナーゼ活
    性、又はその同族体のキナーゼ活性を阻害する方法であ
    って、 (a) 請求項１記載の阻害物質を供給すること；及び(b)
    ｐ３４cdc2又はその同族体を阻害量のその阻害物質と接
    触させることを含む方法。
  45. 【請求項４５】 ヒト乳頭腫ウィルスＥ７活性を阻害す
    る方法であって、 (a) 請求項１３記載の阻害物質を供給すること；及び
    (b) ヒト乳頭腫ウィルスＥ７を阻害量のその阻害物質と
    接触させることを含む方法。
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