KR20010110855A - 자궁경부암 항암제 및 세포사멸조절인자 검색방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자궁경부암 항암제 및 세포사멸조절인자 검색방법에 대한 것으로, 대장균 BL21/pET28a-E7(E.coli,BL21/pET28a-E7) KCTC 18016P에서 GST 및 His-융합형으로 발현되는 사람 파필로마바이러스(Human Papillomavirus;HPV) 16형 E7 재조합 단백질을 글루타치온 비드 및 니켈비드로 신속하게 정제하여, 대장균에서 생산된 사람 암 억제인자 Rb의 가용성 분획과 반응시켜 그 결합능을 웨스턴 블럿법과 엘라이자 (ELISA)법으로 확인함으로써 E7-Rbin vitro결합능 검색 방법을 제공하고, 상기 검색 방법을 통하여 항암제 및 세포사멸조절인자의 검색과 개발 및 스크리닝에 이용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

자궁경부암 항암제 및 세포사멸조절인자 검색방법{Method for screening of anti-cervical cancer agents and apoptotic modulating factors}

본 발명은 자궁경부암 항암제 및 세포사멸조절인자의 검색 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 자궁경부암을 유발하는 사람 파필로마바이러스 (human papillomavirus; HPV) 16형의 E7 단백질과 암억제유전인자 Rb의 결합능에 관한in vitro검색시스템을 수립함으로써 항암제 및 세포사멸조절인자의 검색과 개발을 위한 스크리닝방법에 관한 것이다. 본 발명은 자궁경부암을 유발하는 HPV 16형 E7과 Rb발현용 플라스미드를 제조하고 형질전환된 대장균주로부터 재조합 GST-E7단백질과 Rb 단백질을 제조, 분리 정제하여 E7단백질과 Rb 단백질의 결합능을 특이적으로 억제하는 항암제와 세포사멸조절인자를 검색하는 방법을 제공한다.

자궁경부암은 한국 여성에게 발생 및 사망 빈도가 가장 높은 악성종양이며 최근에 알려진 바에 의하면 사람 파필로마바이러스 (human papillomavirus; HPV)의 감염이 발암기전에서 가장 중요하게 작용하는 인자로 알려지게 되었다(zur Hausen, H. (1996) Papillomavirus infections-a major cause of human cancers. Biochim Biophys Acta 1288(2), F55∼78). 간이 Pap smear 법에 의해 자궁경부암의 발생비율이 상당히 낮아졌으나 개발도상국가에서는 여성 사망암의 수위를 차지하며 매년 약 50만명 정도가 사망에 이르고 있는 실정이다 (zur Hausen, H. and de Villiers, E.M. (1994) Human papillomaviruses. Annu. Rev. Microbiol 48, 427-447; zur Hausen, H. and Schneider, A. (1987) The role of papillomaviruses in humananogenital cancers. In: P.M. Howley and N.P. Salzman (Eds), The papoviridae : the paillomaviruses, pp. 245∼263. Vol. 2. Plenum, New York). 자궁경부암은 미국 국립암연구소의 Vanchieri의 보고에 의하면 현재 개발도상국의 경우 여성암 중 발생률 제 1위를 차지하고 있다 (Vanchieri, C. IARC Publishes Data on Worldwide Cancer Cases, pp 1028∼1029, Journal of the National Cancer Institute, 1993. Vol 85, No. 13, 1028∼1029). 우리나라 서울 지역에 대한 1991년 7월부터 1993년 6월까지 2년간 암 발생률을 조사한 서울대 의대 연구팀의 조사 결과 (김 진복과 안 윤옥, 1993)에 의하면 여자는 10만 명 당 123명이 연간 암에 걸리며 이 중 자궁암이 22%, 위암 18%, 유방암 12.9%로 우리 나라에서도 자궁암 발생률이 1위를 차지하고있어 후진국의 전형적인 암 발생율을 나타내고 있음을 알 수 있다. 따라서 이 수치는 어느 정도 오차가 있겠으나 전체 인구로 대략 환산하면 이는 우리나라에서 년간 약 6천명 이상의 새로운 자궁암 환자가 발생한다고 볼 수 있다. 특히 발생율을 미국자료와 비교해보면 미국에서는 여성 10만명 당 매년 8.6명으로 우리나라 경우의 약 27명에 비하면 3분의 1 정도이며 사망은 4400명 정도로 보고 되고 있다. 국내의 사망율은 발생율과 상관지어 보면 최소 4 천명이 넘을 것으로 추정되나 3천명 정도로 보고하는 자료가 있지만 실제 정확한 자료를 확보하지 못하고 있다. 더욱이 선진국의 경우 확진 시의 암이 진행 초기인데 반해 우리 나라의 경우 중기 이후인 경우가 많아 그만큼 치료가 어렵고 사망율이 더 높을 것으로 예상된다. 선진국의 경우와 비교를 하면 결국 기존의 Pap smear등 조기 진단법으로 정기검진율을 높일 수만 있어도 발생율의 3분의 2이상을 줄일 수 있는 것으로보이므로 국민보건의 향상을 위해서는 예방백신과 치료백신 등 치료제의 개발과 함께 예방의학적 차원에서 파필로마바이러스의 감염의 조기진단의 실시가 필요한 것으로 보인다. 파필로마바이러스는 이중다발의 크기가 약 8 Kb 정도되는 DNA 제놈을 갖고 있으며 E5, E6, E7 등과 같은 여러 가지 발암유전자를 지니고 있으며, 생체막을 통한 신호전달, 세포싸이클조절, 1차 세포주의 immortalization, 크로모솜의 안전성 등과 같은 다양한 기능을 한다 (Crusius, K., Kaszkin, M., Kinzel, V. and Alonso, A. (1999) The human papillomavirus type 16 E5 protein modulates phospholipase Cγ-1 activity and phosphatidyl inositol turnover in mouse fibroblasts. Oncogene 18, 6714-6718; Filatov, L., Golubovskaya, V., Hurt, J.C., Byrd, L.L., Phillips, J.M. and Kaufmann, W.K. (1998) Chromosomal instability is correlated with telomere erosion and inactivation of G2 checkpoint function in human fibroblasts expressing human papillomavirus type 16 E6 oncoprotein. Oncogene 16, 1825∼1838). E7 유전자는 2개의 CysXXCys motif를 지닌 98개의 아미노산으로 구성된 Zinc결합인산화 단백질을 만들며 (Barbosa M.S., Lowy, D.R. and Schiller, J.T. (1989) Papillomavirus polypeptides E6 and

E7 are zinc-binding proteins. J. Virol. 63, 1404∼1407), 아데노바이러스 E1A 단백질(AdE1A)과 유사한 기능을 갖고 있어서 아데노바이러스 E2 프로모터를 활성화시키고 ras발암유전자를 활성화시키는 것으로 잘 알려져 있다 (Phelps, W.C., Yee, C.L., Munger, K. and Howley, P.M. (1988) The human papillomavirus type 16 E7 gene encodes transactivation and transformation functions similar to those ofadenovirus E1A. Cell 53 (4), 539∼47). AdE1A와 마찬가지로 E7 단백질은 항암유전자산물인 Rb와 특이적인 결합을 형성하여 E2F 전사 인자(transcription factor)가 유리되도록 함으로써 세포성장 조절을 억제하여 (Dyson, N., Howley, P.M., Munger, K. and Harlow, E. (1989) The human papilloma virus-16 E7 oncoprotein is able to bind to the retinoblastoma gene product. Science 243, 934∼7), 정상세포의 형질전환과 종양발생을 유발한다. 따라서, 사람 파필로마바이러스 16형 E7단백질과 Rb와의 결합기구를 이해하는 것은 사람 파필로마바이러스에 의한 발암기작을 이해하는데 중요하며, 효과적인 항암치료제를 개발하는데 필요한 기본지식 및 시스템을 제공할수 있을 것이다.

이에 본 발명자들은 형질전환된 대장균으로부터 E7과 Rb재조합 단백질을 제조, 분리 정제하고 결합능 검색 시스템을 개발하여, 이를 이용하여 항암치료제와 세포사멸조절인자의 검색 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 형질전환된 대장균(E.coli)KCTC 18016P으로부터 자궁경부암을 유발하는 사람 파필로마바이러스 16형의 E7단백질과 암억제유전인자 Rb단백질을 획득하고, 분리 정제하여 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 E7-Rb단백질의 결합능을 웨스턴 블럿법으로 확인하고, 효소면역측정법(ELISA)통하여 분석함으로써 항암제 및 세포사멸조절인자의 검색 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 사람 파필로마바이러스 16형 E7 융합형 재조합 단백질과 항암유전인자 Rb단백질을 얻기 위하여 대장균으로부터 E7, Rb단백질 발현용 플라스미드를 제작한후, 융합형 단백질을 생산하는 대장균을 사용하여 재조합 단백질의 고발현을 확인한 후 효율적인 생산 조건을 최적화하여 상기 단백질을 획득하였다. 대장균으로부터 얻어진 재조합 단백질을 비드와 결합된 형태로 분리 정제하여 융합형 재조합 E7 단백질과 항암유전인자 Rb단백질의in vitro결합을 실시한 후, 웨스턴 블럿 방법을 통해 정성적으로 확인하였다. 상기 검색 시스템을 정량화 하기 위하여 효소면역측정법(ELISA)을 사용하였으며 최적 조건을 수립하여 항암제 및 세포사멸조절인자의 검색 방법을 제공함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 설명한다.

도 1a는 글루타치온 에스-트랜스퍼라아제 및 히스티딘-사람 파필로마바이러스 16형 E7융합 재조합 단백질 (이하 GST-E7 및 His-E7 단백질)이 상등액 및 침전물에서 불용성 및 가용성으로 발현됨을 보여주는 전기 영동 사진도이다.

도 1b는 E7항체로 E7재조합 단백질을 확인한 웨스턴 블럿 사진도이다.

도 2a는 His-Rb 융합 재조합 단백질 (이하 Rb 단백질)이 상등액 및 침전물에서 불용성 및 가용성으로 발현됨을 보여주는 전기 영동 사진도이다.

도 2b는 Rb항체로 Rb 재조합 단백질을 확인한 웨스턴 블롯 사진도이다.

도 3a는 가용성 GST-E7 단백질 및 His-E7 단백질이 존재하는 상등액을 비드에 결합시킨 후 His-Rb 상등액을 반응시킨 산물의 전기영동 사진도이다.

도 3b는 Rb항체로 Rb재조합 단백질을 확인한 웨스턴 블롯 사진도이다.

도 4는 E7과 Rb 결합반응을 이용한 효소면역반응측정법 (ELISA)의 최적화 결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 E7과 Rb결합 반응시 항암제 처리에 의한 결합반응에 미치는 효과를 이용한 엘라이자 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 사람 파필로마바이러스 16형 E7단백질 발현용 플라스미드 pET28/HisE7, pGEX/E7과 암억제유전자 Rb단백질 발현용 플라스미드 pET28/Rb를 제조하는 단계; 상기 단백질을 획득하기 위하여 재조합 대장균를 사용하여 재조합 단백질의 고발현을 확인하고 효율적인 생산 조건을 최적화하는 단계; 상기 대장균의 배양후 얻어진 세포를 초음파 파쇄한후 원심분리하여 얻은 세포 상등액을 글루타치온 세파로즈 비드를 사용하여 GST-16E7단백질을 분리 정제하는 단계; Rb단백질은 재조합 대장균을 배양후 초음파로 파쇄후 원심분리하여 세포상등액으로부터 획득하는 단계; 비드에 결합된 GST-E7단백질과 Rb가용성 분획을 사용하여in vitro결합을 시도하는 단계; 웨스턴 블럿법에 의해 E7 단백질과 Rb단백질의in vitro결합능을정성적으로 확인하는 단계; 상기의 검색 시스템을 정량화하기 위하여 효소면역반응 측정법(ELISA)법에 의해 E7단백질과 Rb단백질의in vitro결합능을 검색하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만,본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 사람 파필로마바이러스 16형 E7단백질과 암억제유전자 Rb단백질의 제조방법

제 1 공정: 사람 파필로마바이러스 16형 E7단백질의 발현벡터 제조

HPV 16E7 유전자를 증폭하기 위하여 HPV함유 자궁 경부암 세포인 CaSki의 RNA로부터 하기와 같은 프라이머를 사용하여 RT-PCR를 수행하여 증폭하였다.

5'-CACC ATG GCA TGG CAT GGA GAT ACA CCT-3'과 5'-TTA TGG TTT CTG AGA ACA-3'

상기 증폭산물을 T-vector에 연결하고 다시BamHI과SalI으로 절단하여 E7 유전자를 얻었다. 이를 같은 제한효소로 절단한 pGEX4T-1과 pET28a에 각각 연결하여 도 1a은 나타난 바와 같이 E7을 발현시켰고, 도 1b에 나타낸 바와 같이 웨스턴 블럿을 통해 E7 재조합 단백질을 확인하였다. 상기 E7 단백질은 히스티딘 결합과 글루타치온(GSH)결합 형태로 제조되었다.

제 2 공정 : 암억제유전인자 Rb단백질의 발현 벡터 제조

E7과 결합하는데 이용되는 Rb 단백질은 CaSki의 RNA로 부터 하기와 같은 프라이머를 사용하여 RT-PCR를 수행 증폭하였다.

5-GCGGATCCCGATGAGTTAGGACTGTTATGAACACTAT-3, GCTCATTTCTCTTCCTTG-3

상기 증폭산물을 T-vector(Marchuk, D., Drumm, M., Saulino, A. and Collins, F.S. (1990) Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products, Nucleic Acids Res. 19(5), 1154)에 연결하고 다시BamHI과SalI으로 절단하여 Rb유전자를 얻었다. 이를 같은 제한효소로 절단한 pET28a에 연결하여 도 2a에 나타낸 바와 같이 Rb를 발현시켰고, 2b에 나타낸 바와 같이 웨스턴 블롯을 통해 Rb 재조합 단백질을 확인하였다. Rb(1125-2790)는 발현단백질의 용해성과 안정성을 증가시키기 위해 N-말단이 제거된 pocket domain을 포함하고 있었다.

제 3공정 : 사람 파필로마바이러스 16형 E7의 GST 및 His 융합형 단백질과 Rb의 가용성 분획의 제조

pET/Rb, pGEX 발현 벡터는 대장균(DH5a)에 형질전환 시키고, pET28a 발현 벡터는 대장균(DE3)에 형질전환 시킨 후 1 mM 이소프로필-β- D-티오갈라토피라노사이드를 첨가하고 18。C에서 12 시간동안 단백질을 유도하였다. 숙주세균은 원심분리하여 얻었으며, pGEX/E7 및 pET/Rb 발현대장균은 phosphate-buffered saline (0.5 % Triton X-100, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluride (PMSF)과 10 mg/ml의aprotinin 함유)에 현탁하였고 pET28/E7 발현 대장균은 용해완충용액(50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8.0)에 현탁시킨 후 초음파 파쇄를 실시하였다. 상기파쇄된 현탁액을 원심분리하고 상등액만을 취하여 결합 반응에 사용하였다. 수용성 E7 융합 단백질을 분비하는 대장균 BL21/pET28a-E7(E.coli,BL21/pET28a-E7)은 생명공학연구소 부설 유전자은행에 2000년 5월 12일 기탁번호 KCTC 18016P로서 기탁하였다.

제 4 공정: E7융합 단백질의 분리 정제

GST-E7, His-E7의 상등액을 각각 phosphate-buffered saline(PBS)와 인산나트륨 완충용액으로 미리 평형화시킨 글루타치온 비드와 니켈 비드에 4。C에서 1시간동안 천천히 교반하면서 결합 반응시킨 다음 다시 비드에 비특이적으로 결합된 단백질을 제거하기 위해 phosphate-buffered saline 와 20 mM 이미다졸이 함유된 인산나트륨 완충용액으로 3 번 씻은 다음 Rb 상등액과의 반응에 사용한다.

실시예 2: 웨스턴 블럿법에 의한 E7 단백질과 Rb단백질의 in vitro 결합능 검색

시험관 내에서 사람파필로마 바이러스 E7 단백질과 Rb 단백질을 결합시키기 위해서, Rb 가용성 분획을 농도별로 GST-E7 단백질이 결합된 글루타치온 비드 50 ㎕에 또는 His-E7 단백질이 결합된 니켈 비드 50 ㎕에 가하여 4℃에서 1시간 동안 흔들어 주면서 반응시킨 후, 반응액을 4℃, 6000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 버리고, 세척 버퍼 (0.5% Triton- X100이 포함된 PBS)를 사용하여, 4℃, 5분간 흔들어 주면서 3번 세척을 하였다. 4℃, 6000rpm에서 5분간의 원심분리를 하여 비드를 회수하여 샘플 버퍼로 처리하여 12% SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 전개하였다. SDS 폴리아크릴아마이드 젤에서 전개시킨 단백질들은 PVDF (Millipore) 막에 옮기고, 막의 단백질이 붙지 않은 부위는 3% BSA-PBS 용액으로 4℃에서 하룻밤 반응시켜 차단하였다. 1차 항체로는 항 Rb 단일클론 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 1% BSA-PBS 용액에 1/1000으로 희석하여 실온에서 1 시간 반응시켰다. 상기 반응액을 phosphate-buffered saline(PBS) 완충액으로 3번 세척한 후 2차 항체로 alkaline phosphatase가 결합된 항 goat IgG를 1% BSA-PBS 용액에 1/1000으로 희석하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 상기 반응액을 PBS 완충액으로 3번 세척한 후 NBT/BCIP 기질 킷트 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 발색시켰다. 그 결과를 도 3a와 3b에 제시하였다. 융합 단백질이 결합되어 있지 않은 비드와 Rb 가용성 분획을 반응시킨 대조군의 결과에서는 음성반응이 확인??으며, 융합 단백질이 결합된 비드와 Rb 가용성 분획을 반응시킨 반응군에서는 양성반응이 확인되었다. 따라서, 비드에 결합된 E7 단백질과 가용성 분획에 존해하는 Rb간의 결합이 가능함이 확인되었다.

실시예 3: 효소면역반응 측정법(ELISA)법에 의한 E7단백질과 Rb단백질의 in vitro 결합능 검색 방법

웨스턴 블럿법이 가시적으로 항원의 존재 여부의 결과를 보여줄 수 있는 반면 실제 여러 종류의 항암 치료제를 스크리닝하기 위해서는 신속하고 정량적인 결과를 얻을 수 있는 엘라이자법이 더 편리하므로 실용화를 위해서 엘라이자법을 수립하였다. 사람 파필로마바이러스 16형 E7 단백질과 가용성 분획내에 존재하는 Rb와의 결합능을 엘라이자법으로 검색하기 위해서, 대장균에서 분리한 니켈 비드로 부터 용출시킨 E7 단백질과 가용성 Rb를 각각 사용하였다. E7 단백질은 1.2 ㎍/well의 농도로 희석하여 엘라이자용 플레이트에 100 ㎕/well씩 넣어서, 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 코팅된 플레이트는 phosphate-buffered saline 완충용액으로 3회 세척 후 비특이적인 결합을 차단하기위해 3% BSA로 상온에서 1시간 처리하였다. 상기 플레이트에 Rb의 가용성 분획을 농도별로 가하여 실온에서 1시간 천천히 흔들면서 결합반응을 시킨 후 PBST로 5회 세척하였다. His-E7 단백질과 결합한 Rb 단백질을 확인하기 위한 1차 항체는 항 사람 Rb단일클론 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)로 1/1000으로 희석하여 사용하였으며, 2차 항체로는 항 goat IgG-HRP 접합체를 1/1000으로 희석하여 사용하였다. 대조군으로는 벡터만을 형질변화시킨 숙주세포로부터 초음파 파쇄된 가용성 분획을 반응시켰다. 도4에 나타난 바와 같이 실험군에서는 각 항원 단백질의 농도에 의존한 흡광도값을 통해 Rb단백질이 E7단백질과 결합됨을 알 수 있었으며 일정한 양의 His-E7 단백질을 96웰 프레이트에 코팅하고 Rb단백질을 증가시키면서 반응했을 때 Rb단백질 양에 의존적으로 증가함을 나타낸 반면, 벡터를 함유한 상등액를 코팅한 웰에서는 흡광도값의 변화가 보이지 않았다. 실험 결과, 플레이트에 코팅된 E7 단백질과 Rb 단백질이 특이적으로 결합함을 알 수 있었다. 따라서 엘라이자법의 최적 조건을 수립함으로써 항암제의 스크리닝 기술로 사용가능한 검색 시스템을 수립하였다.

실시예 4: 항암제 스크리닝

본 실시예에서는 기존의 항암제를 사용하여 효소면역법에 의해 스크리닝을 실시하였다. 즉, 상기 실시에 3의 EILSA 방법에 따라 카보플라틴(carboplatin), 마이코마이신 C(mitomycin C) 및 시스플라틴(cisplatin) 세종류의 항암제를 사용하여 E7과 Rb의 결합억제능을 측정하였다. 실험결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 카보플라틴(carboplatin), 마이코마이신 C(mitomycin C) 및 시스플라틴(cisplatin) 세종류 모두 E7과 Rb의 결합을 억제함을 보임으로써 기존에 알려진 자궁경부암 항암제가 자궁경부암을 유발하는 사람 파필로마바이러스 16형의 E6, E6AP 단백질의 발현을 저해하는 것을 확인하였다.

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 자궁경부암을 유발하는 HPV 16형 E7 단백질과 암억제유전인자 Rb단백질을 형질전환된 대장균에 의해 제조하고 분리 정제하여, 웨스턴 블럿법과 엘라이자법을 통해 그 결합능을 분석하는 시스템을 개발함으로써 이를 이용하여 항암제 및 세포사멸조절인자의 검색방법을 제공하는 효과가 있으므로 생물의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (3)

1. 사람 파필로마바이러스 16형 E7의 유전자가 도입된 pET28a/E7 발현 벡터를 사용하여 대장균에 형질전환 시켜서 수용성 E7 단백질을 분비함을 특징으로 하는 재조합 대장균 BL21/pET28a-E7(E.coliBL21/pET28a-E7) KCTC 18016P.
2. 제1항 기재의 재조합 대장균 BL21/pET28a-E7을 배양하여 생산한 후 글루타치온 비드 또는 니켈비드로 정제하는 것을 특징으로 하는 수용성 GST- 및 His-E7 융합형 재조합 단백질.
3. 효소면역측정법을 이용한 융합형 재조합 단백질 GST 및 His-E7과 항암유전인자 Rb 단백질의 결합능 분석을 통하여 자궁경부암 항암제 및 세포사멸조절인자의 검색방법.