JPH11276177A - スフィンゴ脂質セラミドｎ−デアシラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 スフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼ活
性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子
を導入させた形質転換体を用いるスフィンゴ脂質セラミ
ドＮ−デアシラーゼ活性を有するポリペプチドの工業的
な製造方法等を提供する。 【解決手段】 スフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラー
ゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された遺
伝子。該遺伝子を含有する組換えベクター。該組換えベ
クターを導入させた形質転換体。該形質転換体を培養す
る前記ポリペプチドの製法と組換えポリペプチド。該遺
伝子に特異的にハイブリダイズするプローブ又はプライ
マー。該ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその
断片。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はスフィンゴ脂質工学
に有用な、スフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼ活
性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に関する。
また、本発明は該遺伝子を導入させた形質転換体を用い
るスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼ活性を有す
るポリペプチドの工業的な製造方法及び組換えポリペプ
チド、前記遺伝子にハイブリダイズするプローブ又はプ
ライマー並びに前記ポリペプチドに特異的に結合する抗
体又はその断片に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、真核生物の細胞膜脂質の構成成分
として、グリセロ脂質と共にスフィンゴ脂質の持つ様々
な生理機能が注目されている。このスフィンゴ脂質に作
用して脂肪酸とリゾスフィンゴ脂質を生成するスフィン
ゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼ（SCDase）は、スフィ
ンゴ脂質のリゾ体の生理作用の解明に有用であるばかり
でなく、スフィンゴ脂質の誘導体作製や標識化といった
スフィンゴ脂質工学の分野で非常に重要な酵素である。
従来、セラミドに作用してスフィンゴシン塩基と脂肪酸
との間の結合を加水分解する酵素はセラミダーゼ（Cera
midase；EC 3.5.1.23 ）として知られている〔ジャーナ
ル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of
Biological Chemistry ）、第 241巻、第3731〜3737頁
（1966）、バイオケミストリー（Biochemistry）、第 8
巻、第1692〜1698頁（1969）、バイオキミカ エ バイ
オフィジカ アクタ（Biochimica et Biophysica Acta
）、第 176巻、第339 〜347 頁（1969）、サイエンス
（Science ）、第 178巻、第1100〜1102頁（1972）〕
が、この酵素はスフィンゴ糖脂質あるいはスフィンゴミ
エリン中のセラミド部分のスフィンゴシン塩基と脂肪酸
との結合を加水分解することはできない。一方、ノカル
ディア（Nocardia）属、ロドコッカス（Rhodococcus ）
属、又はストレプトマイセス（Streptomyces）属に属す
る微生物によって生産される酵素〔ジャーナル オブ
バイオケミストリー（Journal of Biochemistry ）、第
103巻、第１〜４頁（1988）、特開平 6-78782号公報、
特開平7-107988号公報〕は、スフィンゴ糖脂質に作用し
てスフィンゴシン塩基と脂肪酸との間の結合を加水分解
し、リゾスフィンゴ糖脂質と脂肪酸を生成することがで
きるが、いずれの酵素も基質特異性が狭く、すべてのス
フィンゴ脂質に作用することはできない。すなわち、ノ
カルディア属に属する微生物によって生産される酵素
は、GD1a、GM１、GM２、GM３等のいわゆる酸性糖脂質に
は作用するが、中性糖脂質には、ほとんどあるいは全く
作用しない。これとは逆に、ロドコッカス属に属する微
生物によって生産される酵素は、中性糖脂質には作用す
るが、酸性糖脂質には作用できない。また、ストレプト
マイセス属に属する微生物によって生産される酵素は、
GM3や中性糖脂質であるラクトシルセラミド、セレブロ
シドなどに作用しない。更に、上述した酵素はいずれも
スフィンゴミエリンには作用しない。

【０００３】これに対して、シュードモナス エスピー
TK-4（Pseudomonas sp. TK-4）株由来のSCDase〔ジャ
ーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第 270
巻、第24370 〜24374 頁（1995）、特開平 8-84587号公
報〕は、酸性糖脂質、中性糖脂質、あるいはスフィンゴ
ミエリンを含むスフィンゴ脂質全般に対して広い基質特
異性を持つことが知られている。また、このSCDaseは、
スフィンゴ脂質から対応するリゾスフィンゴ脂質と脂肪
酸を生成する加水分解反応のみならず、リゾスフィンゴ
脂質と脂肪酸からスフィンゴ脂質を合成する逆反応、更
にスフィンゴ脂質の脂肪酸部分を他の脂肪酸と交換する
反応をも触媒する（国際公開WO98/03529号公報）ため、
スフィンゴ脂質工学の分野で極めて重要なツールであ
り、産業上の利用価値が非常に高い。しかしながら、上
述したスフィンゴ脂質工学の分野で有用なSCDaseを酵素
生産生物から工業的に有利に製造しようとする場合、天
然に存在する該酵素の量が少なかったり、該酵素の生産
を誘導するために、培地にガングリオシド混合物を添加
し、酵素生産生物を培養する必要があるため、培養液中
に遊離脂肪酸が生成し、スフィンゴミエリナーゼなどの
SCDase以外の酵素も同時に生産され、これら遊離脂肪酸
や混在する酵素と目的のSCDaseを分離精製することが困
難であった。したがって、より安価に高純度な酵素を製
造する方法が求められている。従来、SCDaseを各種酵素
生産生物から精製する方法に関しては、前述のように報
告があるが、SCDaseのアミノ酸配列や遺伝子構造に関す
る報告はなく、そのアミノ酸配列や遺伝子構造は全く不
明であり、遺伝子工学的にSCDaseを製造することは困難
である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、スフ
ィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を導入させた形
質転換体を用いるスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラ
ーゼ活性を有するポリペプチドの工業的な製造方法及び
組換えポリペプチド、前記遺伝子にハイブリダイズする
プローブ又はプライマー並びに前記ポリペプチドに特異
的に結合する抗体又はその断片を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、スフィンゴ脂質セラミドＮ−デア
シラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離さ
れた遺伝子に関する。本発明の第２の発明は、上記第１
の発明の遺伝子を含有することを特徴とする組換えベク
ターに関する。本発明の第３の発明は、上記第２の発明
の組換えベクターを導入させた形質転換体に関する。本
発明の第４の発明は、上記第３の発明の形質転換体を培
養し、該培養物からスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシ
ラーゼ活性を有するポリペプチドを採取することを特徴
とするスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼ活性を
有するポリペプチドの製造方法に関する。本発明の第５
の発明は、前記第３の発明の形質転換体を培養し、該培
養物から採取された、前記第１の発明の遺伝子によりコ
ードされるスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼ活
性を有する組換えポリペプチドに関する。本発明の第６
の発明は、前記第１の発明の遺伝子に特異的にハイブリ
ダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブ又はプライ
マーに関する。本発明の第７の発明は、前記第５の発明
のポリペプチド又はその一部を用いて作製した、第５の
発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断
片に関する。

【０００６】本発明者らは、SCDase活性を有するポリペ
プチドをコードする遺伝子を取得し、その遺伝子構造を
解明するために、鋭意研究を続けた結果、遂にSCDase活
性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の完全解明
に成功し、更には遺伝子工学的手法により、高純度のSC
Daseを簡易かつ容易に製造することに成功し、本発明を
完成させた。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明について具体的に説
明する。本発明の第１の発明の遺伝子の好適な例には下
記のものが挙げられる。下記（ａ）〜（ｆ）に記載の遺
伝子から選択され、かつ、スフィンゴ脂質セラミドＮ−
デアシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするこ
とを特徴とする第１の発明の遺伝子。 （ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
その一部からなるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列、又はその
一部からなる遺伝子、（ｃ）配列表の配列番号１に記載
のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸残
基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つが
なされているアミノ酸配列からなるポリペプチドをコー
ドする遺伝子、（ｄ）配列表の配列番号２に記載の塩基
配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、付加、挿
入若しくは置換の少なくとも１つがなされている遺伝
子、（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝
子に、厳密な条件下でハイブリダイズする遺伝子、
（ｆ）上記（ａ）〜（ｅ）の少なくともいずれか１つに
記載の遺伝子を含んでなる遺伝子。

【０００８】本発明においてSCDaseとは、スフィンゴ脂
質中のスフィンゴシン塩基と脂肪酸との間のアミド結合
を特異的に加水分解し、リゾスフィンゴ脂質と脂肪酸を
生成する加水分解反応を触媒する酵素をいう。例えば、
ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第
270巻、第24370 〜24374 頁（1995）に記載の理化学的
性質を有する酵素が挙げられるが、これらに限定される
ものではなく、スフィンゴ脂質中のスフィンゴシン塩基
と脂肪酸との間のアミド結合を特異的に加水分解し、リ
ゾスフィンゴ脂質と脂肪酸を生成する加水分解反応を触
媒する酵素であれば、本発明のSCDaseに含まれる。

【０００９】本発明においてSCDase活性を有するポリペ
プチド（本明細書中、単にSCDaseと記載する場合があ
る）とは、天然型のアミノ酸配列を有するSCDaseのみな
らず、SCDase活性が認められる限り天然型のアミノ酸配
列において、アミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは
置換等によりアミノ酸配列が改変されたポリペプチドを
も本発明に含む意味である。また、ここでいう天然型の
アミノ酸配列を有するSCDaseとしては、例えばシュード
モナス属に属する微生物由来のものが挙げられるが、こ
れに限定されるものではなく、その他の細菌類はもちろ
ん、放線菌類、酵母類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類
等の微生物由来のもの、あるいは植物、動物、昆虫等の
生物体由来のものも含まれる。

【００１０】SCDase活性の測定は、ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー、第270巻、第24370 〜2
4374 頁（1995）に記載の方法に従って測定することが
できる。

【００１１】本発明において、抗体又はその断片とは、
本発明のSCDase遺伝子より製造される組換えポリペプチ
ドに特異的に結合する抗体又はその断片であれば、ポリ
クローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでも構
わない。本発明の抗体は、例えば、カレント プロトコ
ルズ イン イムノロジー〔Current Protocols inImmu
nology、ジョン Ｅ．コリガン（John E.Coligan）編
集、ジョン ワイリー＆サンズ社（John Wiley & Sons,
Inc）、1992年発行〕に記載の方法により、本発明のポ
リペプチドの全部又は一部を用いて、ウサギやマウス等
を免疫することにより、容易に作製され得る。これらの
抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することによ
り、抗体の断片が得られる。得られた抗体又はその断片
の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、
各種ライブラリー（ゲノムDNA 又はcDNA）のスクリーニ
ング、医薬・診断薬・研究用試薬等が挙げられる。

【００１２】以下にシュードモナス エスピー TK-4株
由来のSCDase遺伝子のクローニングを例として本発明を
具体的に説明する。本菌株は、Pseudomonas sp. TK-4と
命名され、G-182 と表示され、通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所に、FERM BP-5096として寄託され
ている。

【００１３】（１）まず、ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー、第 270巻、第24370 〜24374 頁
（1995）に記載の方法に従って、シュードモナス エス
ピーTK-4株あるいは、シュードモナス エスピー TK-4
株を単純に純化（例えば、プレート上で選択）したSCDa
se高生産株を培養し、該培養液からSCDaseを単離精製す
る。

【００１４】（２）次に、精製されたSCDaseの部分アミ
ノ酸配列に関する情報を得る。部分アミノ酸配列を決定
するためには、例えば、精製したSCDaseを直接常法に従
ってエドマン分解法〔ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー、第 256巻、第7990〜7997頁（198
1）〕によりアミノ酸配列分析〔プロテイン−シーケン
サ４７６Ａ、アプライド バイオシステムズ（Applied
Biosystems）社製等〕に供してもよいし、あるいはリジ
ルエンドペプチダーゼや N- トシル-L- フェニルアラニ
ルクロロメチルケトン（TPCK）−トリプシン等の特異性
の高いタンパク質加水分解酵素を作用させて限定加水分
解を行い、得られたペプチド断片を逆相系HPLCを用いて
分離精製し、得られた精製ペプチド断片についてアミノ
酸配列分析を行うのが効果的である。

【００１５】（３）こうして得られる部分アミノ酸配列
の情報を基に、SCDase遺伝子をクローニングする。一般
的に、 PCRを用いる方法あるいはハイブリダイゼーショ
ン法を利用することができる。例えば、ハイブリダイゼ
ーション法を利用する場合、以下のような方法を用いる
ことができる。 ａ）部分アミノ酸配列の情報を基に、サザンハイブリダ
イゼーション用のプローブとして合成オリゴヌクレオチ
ドをデザインする。 ｂ）一方、シュードモナス エスピー TK-4株のゲノム
DNA を適当な制限酵素で完全消化し、アガロースゲル電
気泳動で分離した後、常法に従いナイロン膜にブロッテ
ィングする。 ｃ）分離された DNA断片と、部分アミノ酸配列の情報を
基にデザインされた合成オリゴヌクレオチドプローブと
のハイブリダイゼーションは、一般的に用いられる条件
で行う。例えば、サケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダ
イゼーション溶液中でナイロン膜をブロッキングし、³²
Ｐでラベルした各合成オリゴヌクレオチドプローブを加
えて一晩保温する。このナイロン膜を洗浄した後、オー
トラジオグラフィーをとって合成オリゴヌクレオチドプ
ローブとハイブリダイズする DNA断片を検出する。検出
されたバンドに相当する DNA断片をゲルから抽出、精製
する。 ｄ）こうして得られた合成ヌクレオチドプローブとハイ
ブリダイズする DNA断片を通常用いられる方法によって
プラスミドベクターに組込む。プラスミドベクターとし
ては、例えばpUC18 、pUC19 、pUC119、pTV118N などが
好適に使用できるが、特にこれらに限定されるものでは
ない。 ｅ）次いで、組換えプラスミドを宿主に導入し、宿主を
形質転換するが、宿主として大腸菌を使用する場合、宿
主大腸菌としては形質転換能を有するものであれば野生
株、変異株いずれも使用できる。導入の方法は通常用い
られる方法、例えばモレキュラー クローニング、ア
ラボラトリー マニュアル〔MolecularCloning, A Labo
ratory Manual、T ．マニアティス（T. Maniatis ）他
著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー
（Cold Spring Harbor Laboratory）、1982年発行〕、
第 250頁に記載の方法を用いることができる。 ｆ）次に、目的の DNA断片を有する形質転換体を選別す
る。そのためには、プラスミドベクターの特性を利用す
る。例えば pUC19の場合、アンピシリンを含むプレート
上でアンピシリン耐性を有するコロニーを、あるいはア
ンピシリン、5-ブロモ-4- クロロ-3- インドリル- β-D
- ガラクトシド（X-Gal ）及びイソプロピル- β-D- チ
オガラクトピラノシド（IPTG）を含むプレート上で、ア
ンピシリン耐性を示し、かつ、白色を呈するコロニーを
選択することにより外来遺伝子が導入されたコロニーを
選別する。 ｇ）上記集団の中から、目的の DNA断片を含むベクター
を有するコロニーを選択する。選択の方法はベクターの
種類によってコロニーハイブリダイゼーション、プラー
クハイブリダイゼーションを適宜用いる。また、 PCR法
を用いることもできる。 ｈ）目的の DNA断片を含むベクターが選別できれば、こ
のベクターに挿入されている目的の DNA断片の塩基配列
を通常の方法、例えばジデオキシチェーンターミネータ
ー法〔プロシーディングズ オブ ザ ナショナル ア
カデミー オブサイエンシーズ オブ ザ USA （Proc
eedings of the National Academy ofSciences of the
USA）、第74巻、第5463〜5467頁（1977）〕により決定
する。決定された塩基配列と、SCDaseのＮ末端アミノ酸
配列分析、部分アミノ酸配列、分子量などとを比較する
ことによって、得られた DNA断片が目的のSCDase遺伝子
の全部又はその一部であるか否かを決定する。こうして
得られるSCDase遺伝子を含む DNA断片からSCDase遺伝子
の構造並びにSCDaseの全アミノ酸配列を決定する。 ｉ）目的の DNA断片を含むベクターがSCDase遺伝子の全
長を含まない場合は、得られた DNA断片又はその一部を
プローブとして用い、前述のシュードモナスエスピー
TK-4株のゲノムDNA を他の制限酵素で消化したものから
同様にしてハイブリダイゼーション法等によって、欠損
している部分を得た後、つなぎ合せれば目的のSCDase遺
伝子全長を得ることができる。

【００１６】例えば、 PCR法を利用する場合、以下のよ
うな方法を用いることができる。なお、本発明のシュー
ドモナス エスピー TK-4株由来の本発明のSCDase遺伝
子のクローニングでは、SCDaseの部分アミノ酸配列の情
報を基にデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマ
ーを用い、ゲノムDNA を鋳型とした PCR反応を行うこと
により、目的の遺伝子の一部が増幅することを見出し
た。まず、シュードモナス エスピー TK-4株のゲノム
DNA を鋳型とし、部分アミノ酸配列の情報を基にデザイ
ンした合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR
反応を行い、目的の遺伝子断片を得る。すなわち、Ｎ末
端アミノ酸配列 N（配列番号３）からデザインした合成
オリゴヌクレオチドプライマー１（配列番号４）及び合
成オリゴヌクレオチドプライマー２（配列番号５）、部
分アミノ酸配列 N-8（配列番号６）からデザインした合
成オリゴヌクレオチドプライマー３（配列番号７）をそ
れぞれ合成する。なお、ロイシンに対してはコドンの種
類が多いので２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを
デザインし合成する。また、増幅した PCR産物の塩基配
列を決定しやすいように各プライマーの５’末端側には
制限酵素認識サイトの塩基配列、例えば EcoRIサイトを
付加しておく。

【００１７】PCR 法は、PCR テクノロジー〔PCR Techno
logy、エルリッヒ（Erlich）HA編集、ストックトンプレ
ス社（Stockton press）、1989年発行〕に記載の方法に
準じて行う。例えば、GeneAmp ^TM Reagent Kit〔パーキ
ンエルマー（Perkin-Elmer）社製〕を用いて行う。反応
は、94℃：0.5 分、 50 ℃：１分、72℃：１分のサイク
ルを30サイクル行う。シュードモナス エスピー TK-4
株のゲノムDNA を鋳型とし、プライマー１（配列番号
４）、又はプライマー２（配列番号５）とプライマー３
（配列番号７）の組合せによる一回の PCR反応で、増幅
DNA 断片と思われる特異的なバンドがアガロース電気泳
動で検出される。更に、この増幅 DNA断片について通常
用いられる方法、例えば、ジデオキシチェーンターミネ
ーター法で塩基配列を決定すると、決定された配列中に
合成オリゴヌクレオチドプライマーの配列以外にSCDase
の部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、目的の
SCDase遺伝子の一部を取得することができる。もちろん
得られた遺伝子断片をプローブとして更にハイブリダイ
ゼーション法等を行うことによってSCDase全長をコード
する遺伝子をクローニングすることができる。

【００１８】以上のようにして得られる、シュードモナ
ス エスピー TK-4株由来のSCDaseをコードする遺伝子
の全塩基配列は、配列番号２に記載したものであり、こ
れによって帰納されるアミノ酸配列は配列番号１に記載
したものであると決定された。なお、配列番号１に記載
したアミノ酸配列に対応する塩基配列は配列番号２に記
載したもの以外に無数に存在するが、これらはすべて本
発明の範囲に含まれる。また、本発明のSCDase遺伝子
は、配列番号１に記載したアミノ酸配列の一部を含み、
かつ、SCDase活性を有するポリペプチドをコードする遺
伝子、配列番号２に記載した塩基配列の一部を含む遺伝
子であって、かつ、SCDase活性を有するポリペプチドを
コードする遺伝子、更に、これらの遺伝子と厳密な条件
下でハイブリダイズすることができ、かつ、SCDase活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子をも含むもの
である。

【００１９】ここでいう「厳密な条件下」とは、例えば
以下の条件をいう。すなわち 0.5％ＳＤＳ、５×デンハ
ルツ〔Denhartz's、0.１％ウシ血清アルブミン（BSA
）、0.１％ポリビニルピロリドン、0.１％フィコール4
00 〕及び 100μg/mlサケ精子DNA を含む６×SSC （１
×SSC は、0.15 M NaCl 、0.015 M クエン酸ナトリウ
ム、pH7.0 ）中で、50℃〜65℃で４時間〜一晩保温する
条件をいう。

【００２０】このようにして全塩基配列が明らかにされ
たSCDase遺伝子の全体あるいは一部分をハイブリダイゼ
ーション用のプローブとして用いて、シュードモナス
エスピー TK-4株以外の生物体から得たゲノムDNA ライ
ブラリーあるいはcDNAライブラリーから、SCDase遺伝子
と相同性の高いDNA を選別することができる。ハイブリ
ダイゼーションは、上記に示した厳密な条件下で行うこ
とができる。例えば、シュードモナス エスピー TK-4
株以外の生物体から得たゲノムDNA ライブラリーあるい
はcDNAライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、
６×SSC 、 0.5％SDS 、５×デンハルツ、100 μg/mlサ
ケ精子DNA を含むプレハイブリダイゼーション溶液中、
65℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、³²Ｐで
ラベルした各プローブを加えて、65℃で一晩保温する。
このナイロン膜を６×SSC 中、室温で10分間、0.１％ S
DSを含む２×SSC 中、室温で10分間、0.１％ SDSを含む
0.２×SSC 中、45℃で30分間洗浄した後、オートラジオ
グラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズ
するDNA を検出することができる。また、洗いなどの条
件を変えることによって様々な相同性を示す遺伝子を得
ることができる。

【００２１】一方、本発明の遺伝子の塩基配列から PCR
反応用のプライマーをデザインすることができる。この
プライマーを用いて PCR反応を行うことによって、本発
明の遺伝子と相同性の高い遺伝子断片を検出したり、更
にはその遺伝子全体を得ることもできる。得られた遺伝
子が目的のSCDase活性を有するポリペプチドをコードす
る遺伝子であるかどうかを確認するには、決定された塩
基配列を本発明のSCDaseの塩基配列又はアミノ酸配列と
比較し、その遺伝子構造及び相同性から推定することも
できる。また、下記に記載の方法を用いて、得られた遺
伝子のポリペプチドを製造し、SCDase活性を測定するこ
とにより、目的のSCDase活性を有するポリペプチドをコ
ードする遺伝子であるかどうか確認することができる。

【００２２】本発明のSCDase遺伝子を用いて、SCDase活
性を有するポリペプチドを生産するには以下の方法が便
宜である。まず、目的のSCDase遺伝子を含むベクターを
用いて宿主の形質転換を行い、次いで該形質転換体の培
養を通常用いられる条件で行うことによって、SCDase活
性を有するポリペプチドを生産させることができる。場
合によっては、該ポリペプチドが封入体（inclusion bo
dy）の形で生産されることもある。また、宿主としては
微生物、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。
発現の確認は、例えばSCDaseに対する抗体、あるいはSC
Daseを他のポリペプチドとの融合体として発現させる場
合には、そのポリペプチド部分に対する抗体等を用いて
行うことができる。

【００２３】発現産物の確認は、例えば組換体大腸菌の
細胞抽出液をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動した
後、ポリビニリデンフルオライド（PVDF）膜上に転写
し、この膜上で抗体を用いて検出することができる。あ
るいはSCDase活性を測定することにより発現の確認を行
うのが便宜である。活性測定は、例えば、組換体大腸菌
の細胞抽出液を酵素液として、ジャーナルオブ バイオ
ロジカル ケミストリー、第 270巻、第24370 〜24374
頁（1995）に記載の方法で行うことができる。目的のSC
Daseの発現が認められた場合、例えば形質転換体が大腸
菌であれば、培地組成、培地のpH、培養温度、インデュ
ーサーの使用量、使用時間、培養時間などについてSCDa
seの発現の最適な条件を決定することによって効率よく
SCDaseを生産させることができる。

【００２４】形質転換体の培養物からSCDaseを精製する
には通常の方法が用いられる。形質転換体が大腸菌の場
合、発現産物が不溶性の封入体として形成されることが
ある。この場合、培養終了後遠心分離によって菌体を集
め、これを超音波処理などによって破砕した後、遠心分
離等を行うことにより封入体を含む不溶性画分を集め
る。封入体を洗浄した後、通常用いられるタンパク質可
溶化剤、例えば尿素やグアニジン塩酸塩等で可溶化し、
必要に応じてこれをイオン交換、ゲルろ過、疎水、アフ
ィニティーなどの各種クロマトグラフィーを行うことに
より精製した後、透析法あるいは希釈法などを用いたリ
ホールディング操作を行うことによって活性を保持した
目的のSCDase活性を有するポリペプチドを得ることがで
きる。必要に応じてこの標品を更に各種クロマトグラフ
ィーによって精製すれば、高純度のSCDase活性を有する
ポリペプチドを得ることができる。用いる形質転換体に
よっては発現産物が形質転換体外に分泌される場合があ
るが、このような場合は培養上清から同様に精製を行え
ばよい。形質転換体が生産するSCDaseは、それが菌体内
に生産されるときは、菌体内の諸酵素、タンパク質が共
存するが、これらはSCDaseの量に比べて微量にすぎない
ため、精製は極めて容易である。また、SCDaseが菌対外
に分泌される場合は、培地成分などが共存するが、これ
らは通常SCDaseの精製の妨げとなるようなタンパク質成
分をほとんど含まないため、シュードモナス エスピー
TK-4株の培養物からのSCDaseの精製に必要な分離精製
操作を必要としない利点がある。

【００２５】また、本発明によりSCDaseの一次構造及び
遺伝子構造が明らかとなったことにより、本発明の遺伝
子を用いて、ランダム変異あるいは部位特異的変異を導
入し、天然のSCDaseのアミノ酸配列中に、１個又は複数
個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少
なくとも１つがなされている遺伝子が得ることが可能で
ある。これにより、SCDase活性を有するが、至適温度、
安定温度、至適pH、安定pH等の性質が少し異なったSCDa
seをコードする遺伝子を得ることが可能であり、遺伝子
工学的にこれらSCDaseを製造することが可能となる。

【００２６】ランダム変異を導入する方法としては、例
えば、 DNAを化学的に処理する方法として、亜硫酸水素
ナトリウムを作用させシトシン塩基をウラシル塩基に変
換するトランジション変異を起こさせる方法〔プロシー
ディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンシーズ オブ ザ USA、第79巻、第1408〜14
12頁（1982）〕、生化学的方法として、〔α-S〕dNTP存
在下、二本鎖を合成する過程で塩基置換を生じさせる方
法〔ジーン（Gene）、第64巻、第313 〜319 頁（198
8）〕、 PCRを用いる方法として、反応系にマンガンを
加えて PCRを行い、ヌクレオチドの取込みの正確さを低
くする方法〔アナリティカル バイオケミストリー（An
alytical Biochemistry ）、第224 巻、第347 〜353 頁
（1995）〕等を用いることができる。

【００２７】部位特異的変異を導入する方法としては、
例えば、アンバー変異を利用する方法〔ギャップド デ
ュプレックス（gapped duplex ）法、ヌクレイック ア
シッズ リサーチ（Nucleic Acids Research）、第12
巻、第24号、第9441〜9456頁（1984）〕、制限酵素の認
識部位を利用する方法〔アナリティカル バイオケミス
トリー、第 200巻、第81〜88頁（1992）、ジーン、第 1
02巻、第67〜70頁（1991）〕、dut （dUTPase ）とung
（ウラシルDNA グリコシラーゼ）変異を利用する方法
〔クンケル（Kunkel）法、プロシーディングズ オブ
ザ ナショナル オブ サイエンシーズ オブ ザ US
A、第82巻、第488 〜492 頁（1985）〕、 DNAポリメラ
ーゼ及び DNAリガーゼを用いたアンバー変異を利用する
方法〔オリゴヌクレオチド−ダイレクティッド デュア
ル アンバー（Oligonucleotide-directed Dual Amber
：ODA ）法、ジーン、第 152巻、第271 〜275 頁（199
5）、特開平7-289262号公報〕、 DNAの修復系を誘導さ
せた宿主を利用する方法（特開平 8-70874号公報）、 D
NA鎖交換反応を触媒するタンパク質を利用する方法（特
開平8-140685号公報）、制限酵素の認識部位を付加した
２種類の変異導入用プライマーを用いた PCRによる方法
（USP5,512,463）、不活化薬剤耐性遺伝子を有する二本
鎖 DNAベクターと２種類のプライマーを用いた PCRによ
る方法〔ジーン、第 103巻、第73〜77頁（1991）〕、ア
ンバー変異を利用した PCRによる方法〔国際公開WO98/0
2535号公報〕等を用いることができる。

【００２８】また、市販されているキットを使用するこ
とにより、部位特異的変異を容易に導入することができ
る。市販のキットとしては、例えば、ギャップド デュ
プレックス法を用いた Mutan（登録商標）-G（宝酒造社
製）、クンケル法を用いた Mutan（登録商標）-K（宝酒
造社製）、ODA 法を用いたMutan （登録商標）-Express
Km （宝酒造社製）、変異導入用プライマーとピロコッ
カス フリオサス（Pyrococcus furiosus ）由来 DNAポ
リメラーゼを用いたQuikChange^TM Site-Directed Mutag
enesis Kit〔ストラタジーン（STRATAGENE）社製〕等を
用いることができ、また、 PCR法を利用するキットとし
て、TaKaRa LA PCR in vitro Mutagenesis Kit（宝酒造
社製）、Mutan （登録商標）-Super Express Km （宝酒
造社製）等を用いることができる。

【００２９】このように、本発明により、SCDaseの一次
構造及び遺伝子構造が提供される。更に、SCDase活性を
有するポリペプチドの安価で高純度な遺伝子工学的な製
造が可能となる。また、本発明でSCDase遺伝子の遺伝子
構造が明らかとなったことにより、本発明のSCDase遺伝
子から作製した、SCDase遺伝子に特異的にハイブリダイ
ズする合成オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー
は、SCDase遺伝子の検索、検出又は増幅等に有用であ
る。更に、本発明の組換えポリペプチド又はその一部を
用いて作製した、本発明の組換えポリペプチドに特異的
に結合する抗体又はその断片は、SCDaseの検索、検出又
は精製において有用である。

【００３０】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではな
い。

【００３１】実施例１：SCDase構造遺伝子のクローニン
グ （１）ゲノムDNA の抽出精製 SCDaseの生産菌株であるシュードモナス エスピー TK
-4株（FERM BP-5096）をプレート上で純化して得たSCDa
se高生産菌を、シュードモナス エスピー MF202 株と
命名し、該シュードモナス エスピー MF202 株を、LB
培地（１％バクトトリプトン、0.５％酵母エキス、0.５
％ NaCl ）200 mlに接種し、25℃、24時間培養した。培
養終了後、培養液を遠心分離し、菌体を集め、10 ml の
TE緩衝液〔10mMトリス（Tris）-HCl、1 mM EDTA 、pH
8.0〕に懸濁し、これに 50 mg/ml の卵白リゾチーム0.2
mlを加えて、30℃で15分間保温した。2 mlの10％ SDS
を加えて穏やかにかくはんし、溶液が粘性を持つように
なってから即座に 10 mlのTE緩衝液飽和フェノールと1.
5 mlの5 M NaClを加えて室温で１時間穏やかにかくはん
した。これを2500 rpmで10分間遠心分離した後、上層を
回収した。これに等量のクロロホルムを加えて10分間か
くはんし、1500 rpmで10分間遠心分離した後、上層を回
収した。これを更にもう一度等量のクロロホルムで洗浄
後、遠心分離した（以下、この方法をフェノール・クロ
ロホルム処理と略す）。上層を回収して、等量のイソプ
ロピルアルコールをゆっくりと加え、界面に析出するDN
A をパスツールピペットで巻きとり、これを10 ml のTE
緩衝液に溶解した。ここに20μl のRNase A 溶液（10 m
M トリス-HCl、pH 7.5、15 mM NaClに10mg/ml となるよ
うに溶解し、100 ℃で15分間加熱して、DNase を失活さ
せた溶液）を加えて50℃で１時間保温した。更に、100
μl のプロテアーゼＫ溶液（proteinase K、20 mg/mlと
なるように蒸留水に溶解）、200 μl の5 M NaCl、400
μl の10％ SDSを加えて37℃で１時間保温した。反応後
室温に戻し、等量のTE緩衝液飽和フェノールを加えてフ
ェノール・クロロホルム処理を行った。これを２回繰り
返し、水層に等量のイソプロピルアルコールと1/10量の
3 M 酢酸ナトリウムを加えて−20℃で１時間冷却した。
その後、10000 rpm で10分間遠心分離して得られた沈殿
を70％エタノールでリンスし、適量のTE緩衝液に溶解し
て得られた溶液を、ゲノムDNA 溶液とした。以上の操作
により得られたゲノムDNA の濃度は、その吸光度から約
600 μg と算出された。

【００３２】（２）SCDase部分アミノ酸配列の決定 ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第
270巻、第24370 〜24374 頁（1995）に記載の方法で精
製したSCDaseを、逆相HPLCによって更に精製した。カラ
ムはCosmosil（登録商標） 5C4-AR-300 （ナカライテス
ク社製）を用い、溶出液は、Ａ液：0.１％トリフルオロ
酢酸（TFA ）、Ｂ液：80％アセトニトリルを含む0.１％
TFAを使用した。溶出は、流速 0.5 ml/min で、50分間
でＢ液の割合を０〜100 ％まで直線的に増加させること
によって行った。得られた精製SCDaseを、直接常法に従
って気相エドマン分解法によるアミノ酸配列分析に供し
てＮ末端アミノ酸配列N （配列番号３）を決定した。更
に、酵素タンパク質をリシルエンドペプチダーゼで消化
し、得られた消化物からペプチド断片をHPLCで分離精製
した。カラムはμBondasphare C8（ウォーターズ社製）
を用い、溶出液はＡ液： 0.1％ TFA、Ｂ液：80％アセト
ニトリルを含む0.1% TFAを使用した。溶出は流速0.5ml/
minで、50分間でＢ液の割合を０〜100 ％まで直線的に
増加させることによって行った。各ペプチド画分につい
てアミノ酸配列分析を行い、部分アミノ酸配列 N-8（配
列番号６）、N-32（配列番号８）、N-34（配列番号９）
を決定した。

【００３３】（３）SCDase遺伝子を含む DNA断片のクロ
ーニング 上記（２）で得られたアミノ酸配列の情報に基づいて、
PCR反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーをデザ
インし合成した。すなわち、Ｎ末端アミノ酸配列Ｎ（配
列番号３）からデザインしたオリゴヌクレオチドプライ
マー１（配列番号４）及びオリゴヌクレオチドプライマ
ー２（配列番号５）、部分アミノ酸配列N-8 （配列番号
６）からデザインしたオリゴヌクレオチドプライマー３
（配列番号７）をそれぞれ合成した。なお、ロイシンに
対してはコドンの種類が多いので２種類のオリゴヌクレ
オチドプライマー１及び２をデザインした。また、増幅
した産物の塩基配列を決定しやすいように各プライマー
の５’末端側には EcoRIのサイトを付加した形でデザイ
ンした。PCR はGeneAmp ^TM Reagent Kit（パーキン エ
ルマー社製）を用いて行った。反応は、94℃：0.5 分、
50℃：１分、72℃：１分のサイクルを 30 サイクル行っ
た。上記（１）で得たシュードモナス エスピー TK-4
のゲノムDNA １μg を鋳型とし、プライマー１（配列番
号４）とプライマー３（配列番号７）の組合せによる一
回の PCR反応で、増幅DNA 断片（約550 bp）と思われる
特異的なバンドがアガロース電気泳動で検出された。PC
R産物を制限酵素 EcoRI（宝酒造社製）で消化し、Sepha
glas ^TM BandPrepKit 〔ファルマシア バイオテク（Ph
armacia Biotech ）社製〕を用いてアガロースゲルから
回収した。次に、 EcoRI消化後、アルカリフォスファタ
ーゼ処理したプラスミドpGEM-3Z〔プロメガ（Promega
）社製〕に、上記回収した PCR産物をT4 DNAリガーゼ
〔ライフ テクノロジーズ（Life Technologies ）社
製〕を用いて連結した。このプラスミドをpGEM PCRと命
名した。この増幅した DNA断片について、ジデオキシチ
ェーンターミネーション法で塩基配列を決定した。決定
した PCR産物の塩基配列を配列表の配列番号10に示す。
なお、この塩基配列の5'及び3'側には、プライマー由来
の EcoRIサイトが付加されている。その結果、決定され
た塩基配列中にプライマー１及びプライマー３の配列以
外にSCDaseの部分アミノ酸配列に対応する配列が見出さ
れ、目的のSCDase遺伝子の一部を取得することに成功し
た。

【００３４】（４）SCDase遺伝子のクローニング 上記（３）で得た DNA断片（配列番号10）をプローブと
して用い、（１）で調製したゲノムDNA のスクリーニン
グを行った。まず、（１）で調製したゲノムDNA 10μg
を制限酵素EcoRI 、BamHI 、SmaI、HindIII 、PstI、Sa
cI、KpnI（すべて宝酒造社製）各100 ユニット用いて、
それぞれ37℃、16時間、完全消化した。この反応液から
フェノール抽出で得られたDNA 10μg 相当について、0.
７％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後、サザン
ブロット法（遺伝子研究法II、第218 〜221 頁、東京化
学同人）により、ナイロン膜〔Hybond-N⁺ 、アマシャム
（Amersham）社製〕に DNAを転写した。ハイブリダイゼ
ーションのプローブとしては、（３）で得た DNA断片
（配列番号10）0.１μg をReady-To-Go （登録商標）DN
A Labelling Kits（ファルマシアバイオテク社製）を用
いて、同キットのプロトコールに従って³²Ｐで標識した
ものを用いた。上記のように調製したフィルターを、0.
5 M ピペラジン-1,4- ビス（2-エタンスルホン酸）１ナ
トリウム塩（Na-PIPES、pH7.0 ）、７％ SDS、5 mM EDT
A を含むハイブリダイゼーション溶液中、65℃、１時間
以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プロ
ーブをそれぞれ0.006 pmol/ml の濃度になるように加
え、65℃、一晩ハイブリダイゼーションを行った。次に
65℃に加温しておいた洗浄液（１％ SDS、40 mM リン酸
ナトリウム緩衝液）中、65℃、15分間の洗浄を３回繰り
返した。余分な水分を除いた後、イメージングアナライ
ザーBAS 1000（富士フィルム社製）のイメージングプレ
ートに20分間感光させ、検出した。その結果、用いたプ
ローブに対して、 EcoRI消化物で約11.0 kb 、BamHI 消
化物で約 5.7 kb 、HindIII 消化物で約3.5 kb、PstI消
化物で約0.7 kbの位置に、SacI消化物で約11.0 kb の位
置に、KpnI消化物で約10.3 kb の位置に、プローブとハ
イブリダイズするバンドを認めた。

【００３５】以後の実験は、取り扱いの簡便さから約
3.5 kb のHindIII 消化物について進めた。先に制限酵
素HindIII で消化したゲノムDNA 10μg の0.７％アガロ
ースゲル電気泳動を行い、上述のハイブリダイゼーショ
ンで認められたバンドに相当する部分１cmを２mmずつ切
り出した。各画分を泳動距離の短い方からフラクション
１、２、３、４、５とした。ゲルからフェノール凍結融
解法により抽出精製を行い、回収した各 DNA断片を再度
アガロースゲル電気泳動後、上記のプローブを用いてハ
イブリダイゼーションを行った。その結果、フラクショ
ン２に最も強いシグナルが観察された。そこで、このフ
ラクション２のHindIII 消化 DNA断片をpBluescript
（登録商標） II SK（ストラタジーン社製）のHindIII
サイトに挿入した。このプラスミドで大腸菌JM109 を形
質転換して一晩培養し、アンピシリン100μg/mlを含むL
B寒天培地を流した直径8.5 cmの丸シャーレ10枚に、１
枚当り200〜1000個のコロニーを形成させ、その内65コ
ロニーを選択し、同じ培地プレート上においたナイロン
膜（Hybond-N⁺ 、アマシャム社製）上に写した。37℃、
16時間培養した後、このナイロン膜を0.5 M NaOH、1.5
M NaClの溶液に浸したろ紙上で５分間（変性）、 0.5 M
トリス-HCl緩衝液（pH7.5 ）、3 M NaClの溶液に浸した
ろ紙上で５分間中和処理した後、２×SSC でリンスし
た。このナイロン膜と（３）で得た DNA断片（配列番号
10）をプローブとして用い、前述と同じ条件でハイブリ
ダイゼーションを行ったところ、10個のポジティブシグ
ナルが得られた。それぞれのポジティブシグナルのコロ
ニーからプラスミドDNA を抽出し、 100℃、３分間熱変
性した後に、ナイロン膜（Hybond-N⁺ 、アマシャム社
製）上にプロットし、前述のプローブ（配列番号10）を
用いて、ドットハイブリダイゼーションを行ったとこ
ろ、９個のプラスミドDNA がポジティブシグナルを示し
た。

【００３６】このうちの一つをpSK 33と命名し、以下の
実験に用いた。pSK 33を数種の制限酵素で消化し、電気
泳動により切断パターンを解析した。その結果、SmaI、
PstI、SalIをはじめ計10種類の制限酵素サイトの存在を
確認した。更に、上述の HindIII消化物の塩基配列を決
定するため、pSK 33のマルチクローニングサイトに存在
するXhoIとKpnI部位を用い、常法に従って、制限酵素Xh
oI及びKpnI（宝酒造社製）、Exonuclease III （ニッポ
ンジーン社製）及びMung Bean Nuclease（ニッポンジー
ン社製）を用いて各種欠失変異体を作製した。得られた
欠失変異体の塩基配列を、ジデオキシチェーンターミネ
ーション法により決定した結果、 PCR産物の塩基配列
（配列番号10）が現われ、更にＮ末端アミノ酸配列 N
（配列番号３）、及び部分アミノ酸配列 N-8（配列番号
６）、N-32（配列番号７）、N-34（配列番号８）をコー
ドする塩基配列も含まれていることが明らかとなった。
また、pSK 33のHindIII 挿入断片に、オープンリーディ
ングフレーム（ORF ）が見いだされた。この ORFに、上
記（２）で決定したSCDaseのアミノ酸配列分析により得
られた配列がすべて見出された。

【００３７】以上の結果より、SCDase遺伝子の全塩基配
列及び一次構造が決定された。SCDaseの ORFの全塩基配
列を配列表の配列番号11に、この塩基配列がコードする
全アミノ酸配列を配列表の配列番号12に示す。また、上
記（２）で得られたSCDaseのＮ末端アミノ酸配列 N（配
列番号３）の知見より、配列表の配列番号12で示される
アミノ酸配列のアミノ酸残基番号 1〜25はシグナル様配
列であると考えられる。その結果を図１に示す。すなわ
ち図１は、pSK 33の挿入HindIII 断片の制限酵素地図と
SCDase遺伝子の位置の相関を示した図である。図中、点
線はSCDaseの翻訳開始点、及び翻訳終了点を示し、その
上に、SCDase遺伝子のコード領域を示す。また、シグナ
ル配列を除いた、SCDaseをコードする遺伝子の塩基配列
を配列表の配列番号２に、この塩基配列がコードし得る
アミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。こうして得
られたSCDase遺伝子全長を含むプラスミド、pSK 33を導
入した大腸菌JM109 は、Escherichia coli JM109/pSK 3
3 と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術研究
所にFERM P−１６７２３として寄託されている。

【００３８】実施例２：SCDaseポリペプチドを発現する
プラスミドの構築 （１）SCDase遺伝子全長を含むプラスミドの構築 SCDaseポリペプチドを発現するプラスミドを構築するた
めに、pSK 33を制限酵素PstI（宝酒造社製）で消化し、
SCDaseのＣ末端側をコードする遺伝子を含む DNA断片を
１％アガロースゲル電気泳動により精製し、pBluescrip
t （登録商標）II SK（ストラタジーン社製）のPstIサ
イトにサブクローニングし、得られたプラスミドをpSK
P4とした。このpSK P4を制限酵素ApaI（宝酒造社製）で
消化し、１％アガロースゲル電気泳動により、SCDaseの
Ｃ末端側をコードする遺伝子を含む DNA断片を抽出精製
した。更に、この DNA断片を制限酵素PstI（宝酒造社
製）で消化し、１％アガロースゲル電気泳動により、SC
DaseのＣ末端側をコードする遺伝子を含む約260 bpのDN
A 断片を抽出精製し、フラグメント１とした。次に、実
施例１−（４）で、HindIII 消化物の塩基配列を決定す
るために作製したpSK 33の欠失変異体の内、SCDaseのＮ
末端側が一部欠失している遺伝子を含むDNA 断片を有す
るプラスミドを、pSK D38 とした。この pSK D38を制限
酵素ApaI（宝酒造社製）及び SacII（宝酒造社製）で二
重消化し、１％アガロースゲル電気泳動により、SCDase
の中央部をコードする遺伝子を含む約750 bpの DNA断片
を抽出精製し、フラグメント２とした。次に、実施例１
−（３）で作製した pGEM PCR を制限酵素 EcoRI（宝酒
造社製）で消化し、フェノール処理により、 EcoRI消化
断片を精製し、更に、該 EcoRI消化断片を制限酵素 Sac
II（宝酒造社製）で消化し、１％アガロースゲル電気泳
動により、SCDaseのＮ末端側をコードする遺伝子を含む
約330 bpの DNA断片を抽出精製し、フラグメント３とし
た。

【００３９】pTV118N （宝酒造社製）を制限酵素EcoRI
（宝酒造社製）及びPstI（宝酒造社製）で二重消化し、
１％アガロースゲル電気泳動により、pTV118N の EcoRI
-PstI 消化物を抽出精製した。このpTV118N の EcoRI-P
stI 消化物と、上記調製したフラグメント１、２及び３
を混合し、DNA ligation Kit（宝酒造社製）を用いてラ
イゲーションした。その後、ライゲーション反応液 10
μl を用いて、大腸菌JM109 への形質転換に使用した。
形質転換後、一晩培養し、アンピシリン100 μg/mlを含
むLB寒天培地にまき、青色を呈したコロニーを任意に16
個選択し、それぞれのプラスミドDNA を抽出した。得ら
れたプラスミドを、各種制限酵素で消化し、挿入断片を
確認した。その結果、SCDaseをコードする遺伝子を含む
DNA断片が正しく挿入されているプラスミド、すなわ
ち、挿入断片が5'末端側からフラグメント３、２、１の
順番で正しく挿入されているプラスミドを選択し、pTV
EcoRI/PstIとした。更に、pTV EcoRI/PstIを導入した大
腸菌JM109 から調製された粗抽出液に、SCDase活性が認
められた。

【００４０】

【発明の効果】本発明によりSCDaseのアミノ酸配列及び
塩基配列が初めて明らかとなり、SCDase活性を有するポ
リペプチドをコードする遺伝子を提供することが可能と
なった。また、該遺伝子を用いるSCDase活性を有するポ
リペプチドの工業的に有利な遺伝子工学的製造方法が提
供される。更に、SCDaseの誘導生産のために培地にガン
グリオシド混合物を添加する必要が無く、スフィンゴミ
エリナーゼなどの酵素が同時に生産されることも、培地
に加えたガングリオシド混合物由来の脂肪酸の生成もな
く精製も容易となる。また、本発明により、初めてSCDa
se遺伝子が提供されたことにより、該遺伝子からコード
される組換えポリペプチド及び該ポリペプチドに特異的
に結合する抗体又はその断片、SCDase遺伝子に特異的に
ハイブリダイズするプローブやプライマーが提供され
る。

【００４１】

【配列表】

【００４２】配列番号：１ 配列の長さ：439 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Glu Leu Gly Asp Tyr Gly Ala Trp Lys Thr Leu Leu Asn Leu Thr 1 5 10 15 Ser Pro Pro Lys Ala Asp Asn Pro Val Arg Ala Glu Gln Arg Val 20 25 30 Gly Pro Tyr Pro Met Leu Ala Asn Pro Ala Gly Phe Arg Ser Gly 35 40 45 Phe Thr Pro Thr Ala Tyr Phe Ala Trp Gln Thr Val Gln Leu Ala 50 55 60 Pro Glu Thr Gly Ala Val Cys Gly Asp Gly Ser Pro Tyr Lys Phe 65 70 75 Phe Val Asn Arg Met Pro Asn Thr Ser Asn Thr Leu Ile Tyr Met 80 85 90 Glu Gly Gly Gly Ala Cys Trp Asp Tyr Ala Ser Cys Ser Gly Gln 95 100 105 Ala Gly Ile Arg Gly Ala Arg Asn Pro Asn Gly Ile Pro Asp Asp 110 115 120 Tyr Met Lys Leu Ala Asn Pro Gln Ala Ser Leu Val Ser Pro Phe 125 130 135 Val Val Arg Leu His Pro Tyr Ser Arg Val Lys Thr Gln Gly Trp 140 145 150 Asn Ile Val Tyr Ile Pro Tyr Cys Thr Gly Asp Leu Tyr Ala Gly 155 160 165 Asp Lys Val Ala Val Tyr Asp Asp Pro Ser Gly Lys Lys Pro Pro 170 175 180 Leu Val Trp His His Asn Gly Leu Arg Asn Gly Arg Ala Val Leu 185 190 195 Gly Trp Leu Lys Asp Asn Leu Glu Arg Pro Gly Gln Met Leu Ser 200 205 210 Thr Gly Cys Ser Ala Gly Gly Ala Gly Ser Leu Ile Ser His Ser 215 220 225 Val Leu Arg Gln Asp Leu Ala Pro Asp Arg Gly Phe Leu Ile Asp 230 235 240 Asp Ser Gly Pro Val Phe Ser Ala Ala Val Gly Gly Asp Ser Gln 245 250 255 Thr Tyr Pro Ser Leu Pro Leu Gln Asn Leu Ile Arg Ser Ala Trp 260 265 270 Gly Leu Asp Gln Gly Pro Leu Gln Phe Leu Gln Ser Arg Leu Pro 275 280 285 Gly Val Ser Leu Ser Asn Leu Gly Ser Leu Tyr Pro Ala Leu Ala 290 295 300 Ala Asn Phe Pro Gly Asp Arg Leu Gly His Thr His Phe Trp Gln 305 310 315 Asp Leu Asn Tyr Ser Ser Tyr Ser Tyr Glu Arg Phe Tyr Pro Glu 320 325 330 Ile Ala Asn Ala Pro Asp Lys Ala Thr Lys Glu Ala Leu Ile Lys 335 340 345 Ala Lys Trp Gln Val Asp Thr Ala Arg Leu Arg Asp Thr Leu Ala 350 355 360 Asn Leu Pro Asn Phe Gly Gly Tyr Phe Pro Gln Tyr Arg Ala Leu 365 370 375 Asn Glu Ser His Cys Thr Thr Ile Val Asp Phe Ala Asn Gly Asp 380 385 390 Ile Gln Glu Gln Gly Leu Glu Leu Ser His Phe Ile Asp Asn Val 395 400 405 Leu Asn Gly Gln Gly Pro Val Leu Asp Ala Ser Glu Leu Ser Asp 410 415 420 Ser Ala Asp Arg Ala Lys Pro Asn Asn Leu Ile Tyr Asp Ala Ile 425 430 435 Asn Lys Leu Leu

【００４３】配列番号：２ 配列の長さ：1317 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： GAACTCGGTG ACTACGGTGC CTGGAAGACA CTTCTCAACC TGACCTCTCC GCCCAAGGCT 60 GATAACCCCG TGCGGGCCGA GCAGCGCGTT GGCCCCTACC CGATGCTGGC CAACCCGGCC 120 GGATTCAGGT CCGGCTTCAC GCCGACGGCC TACTTCGCCT GGCAGACCGT CCAGCTTGCA 180 CCGGAGACCG GAGCGGTATG CGGTGACGGC TCGCCCTACA AGTTCTTCGT CAACCGGATG 240 CCGAACACCA GCAACACCCT GATCTACATG GAAGGCGGCG GCGCCTGCTG GGACTACGCC 300 AGCTGTTCCG GCCAGGCCGG CATCCGCGGC GCGCGCAACC CCAATGGCAT TCCGGATGAC 360 TACATGAAGC TGGCGAACCC CCAAGCCAGT CTGGTCAGCC CCTTCGTCGT GCGCCTCCAC 420 CCGTACTCCC GGGTGAAGAC CCAAGGCTGG AACATCGTCT ACATCCCCTA TTGCACCGGT 480 GACCTGTATG CCGGCGACAA GGTGGCGGTC TATGACGATC CGAGCGGGAA GAAGCCTCCC 540 CTGGTCTGGC ATCACAACGG CTTGCGCAAC GGTCGGGCAG TGCTCGGCTG GCTGAAGGAC 600 AACCTGGAGC GCCCCGGCCA GATGCTTTCC ACCGGCTGCA GTGCCGGCGG TGCGGGCAGC 660 CTGATCAGTC ACTCGGTGCT TCGCCAGGAC CTCGCGCCGG ATCGCGGCTT CCTGATCGAC 720 GACTCCGGGC CGGTCTTCAG CGCTGCCGTG GGCGGCGACA GCCAGACCTA CCCCTCGCTG 780 CCGCTGCAGA ACCTCATCCG CAGCGCCTGG GGGCTTGACC AGGGGCCGCT GCAGTTCCTG 840 CAGTCGCGCC TGCCGGGCGT GAGTCTCTCC AACCTGGGCA GCCTCTACCC GGCCCTGGCG 900 GCCAACTTCC CGGGGGACCG CCTGGGTCAC ACGCACTTCT GGCAGGACCT GAACTACTCG 960 TCCTATTCCT ATGAGCGGTT CTACCCGGAA ATCGCCAATG CTCCGGACAA GGCCACCAAG 1020 GAGGCGCTGA TCAAGGCCAA GTGGCAGGTG GACACCGCGC GCCTGCGCGA CACCCTGGCC 1080 AACCTGCCGA ACTTCGGGGG CTATTTCCCG CAGTACCGGG CCCTTAACGA GAGCCACTGC 1140 ACCACCATCG TCGACTTCGC CAACGGCGAT ATTCAGGAGC AGGGTCTGGA ACTCAGCCAC 1200 TTCATCGACA ACGTGCTCAA TGGCCAAGGT CCGGTGCTGG ACGCCTCCGA GCTCAGCGAT 1260 TCGGCGGACC GAGCCAAGCC CAACAACCTG ATCTACGACG CCATCAATAA ACTGCTC 1317

【００４４】配列番号：３ 配列の長さ：15 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Glu Leu Gly Asp Tyr Gly Ala Xaa Lys Tyr Leu Leu Asn Leu Thr 1 5 10 15

【００４５】配列番号：４ 配列の長さ：25 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA ） 配列： GCGAATTCGA RTTRGGNGAY TAYGG 25

【００４６】配列番号：５ 配列の長さ：25 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA ） 配列： GCGAATTCGA RCCYGGNGAY TAYGG 25

【００４７】配列番号：６ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００４８】配列番号：７ 配列の長さ：25 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 (合成 DNA) 配列： CGNCANATRC TRCTRGGCTT AAGCA 25

【００４９】配列番号：８ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００５０】配列番号：９ 配列の長さ：13 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Xaa Asn Leu Glu Arg Pro Gly Gln Met Leu Ser Thr Gly 1 5 10

【００５１】配列番号：10 配列の長さ：533 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： GAATTCGAAT TGGGTGACTA TGGTGCCTGG AAGACACTTC TCAACCTGAC CTCTCCGCCC 60 AAGGCTGATA ACCCCGTGCG GGCCGAGCAG CGCGTTGGCC CCTACCCGAT GCTGGCCAAC 120 CCGGCCGGAT TCAGGTCCGG CTTCACGCCG ACGGCCTACT TCGCCTGGCA GACCGTCCAG 180 CTTGCACCGG AGACCGGAGC GGTATGCGGT GACGGCTCGC CCTACAAGTT CTTCGTCAAC 240 CGGATGCCGA ACACCAGCAA CACCCTGATC TACATGGAAG GCGGCGGCGC CTGCTGGGAC 300 TACGCCAGCT GTTCCGGCCA GGCCGGCATC CGCGGCGCGC GCAACCCCAA TGGCATTCCG 360 GATGACTACA TGAAGCTGGC GAACCCCCAA GCCAGTCTGG TCAGCCCCTT CGTCGTGCGC 420 CTCCACCCGT ACTCCCGGGT GAAGACCCAA GGCTGGAACA TCGTCTACAT CCCCTATTGC 480 ACCGGTGACC TGTATGCCGG CGACAAGGTG GCAGTGTATG ACGATCCGAA TTC 533

【００５２】配列番号：11 配列の長さ：1392 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： ATGAGGCTCG CTACGCGCCT GCGCTGCAGC ATCATCTTGT TGTCCTGCCT GTTGCCAACC 60 TTCCAAGCCC ACGCCGAACT CGGTGACTAC GGTGCCTGGA AGACACTTCT CAACCTGACC 120 TCTCCGCCCA AGGCTGATAA CCCCGTGCGG GCCGAGCAGC GCGTTGGCCC CTACCCGATG 180 CTGGCCAACC CGGCCGGATT CAGGTCCGGC TTCACGCCGA CGGCCTACTT CGCCTGGCAG 240 ACCGTCCAGC TTGCACCGGA GACCGGAGCG GTATGCGGTG ACGGCTCGCC CTACAAGTTC 300 TTCGTCAACC GGATGCCGAA CACCAGCAAC ACCCTGATCT ACATGGAAGG CGGCGGCGCC 360 TGCTGGGACT ACGCCAGCTG TTCCGGCCAG GCCGGCATCC GCGGCGCGCG CAACCCCAAT 420 GGCATTCCGG ATGACTACAT GAAGCTGGCG AACCCCCAAG CCAGTCTGGT CAGCCCCTTC 480 GTCGTGCGCC TCCACCCGTA CTCCCGGGTG AAGACCCAAG GCTGGAACAT CGTCTACATC 540 CCCTATTGCA CCGGTGACCT GTATGCCGGC GACAAGGTGG CGGTCTATGA CGATCCGAGC 600 GGGAAGAAGC CTCCCCTGGT CTGGCATCAC AACGGCTTGC GCAACGGTCG GGCAGTGCTC 660 GGCTGGCTGA AGGACAACCT GGAGCGCCCC GGCCAGATGC TTTCCACCGG CTGCAGTGCC 720 GGCGGTGCGG GCAGCCTGAT CAGTCACTCG GTGCTTCGCC AGGACCTCGC GCCGGATCGC 780 GGCTTCCTGA TCGACGACTC CGGGCCGGTC TTCAGCGCTG CCGTGGGCGG CGACAGCCAG 840 ACCTACCCCT CGCTGCCGCT GCAGAACCTC ATCCGCAGCG CCTGGGGGCT TGACCAGGGG 900 CCGCTGCAGT TCCTGCAGTC GCGCCTGCCG GGCGTGAGTC TCTCCAACCT GGGCAGCCTC 960 TACCCGGCCC TGGCGGCCAA CTTCCCGGGG GACCGCCTGG GTCACACGCA CTTCTGGCAG 1020 GACCTGAACT ACTCGTCCTA TTCCTATGAG CGGTTCTACC CGGAAATCGC CAATGCTCCG 1080 GACAAGGCCA CCAAGGAGGC GCTGATCAAG GCCAAGTGGC AGGTGGACAC CGCGCGCCTG 1140 CGCGACACCC TGGCCAACCT GCCGAACTTC GGGGGCTATT TCCCGCAGTA CCGGGCCCTT 1200 AACGAGAGCC ACTGCACCAC CATCGTCGAC TTCGCCAACG GCGATATTCA GGAGCAGGGT 1260 CTGGAACTCA GCCACTTCAT CGACAACGTG CTCAATGGCC AAGGTCCGGT GCTGGACGCC 1320 TCCGAGCTCA GCGATTCGGC GGACCGAGCC AAGCCCAACA ACCTGATCTA CGACGCCATC 1380 AATAAACTGC TC 1392

【００５３】配列番号：12 配列の長さ：464 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Arg Leu Ala Thr Arg Leu Arg Cys Ser Ile Ile Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Pro Thr Phe Gln Ala His Ala Glu Leu Gly Asp Tyr 20 25 30 Gly Ala Trp Lys Thr Leu Leu Asn Leu Thr Ser Pro Pro Lys Ala 35 40 45 Asp Asn Pro Val Arg Ala Glu Gln Arg Val Gly Pro Tyr Pro Met 50 55 60 Leu Ala Asn Pro Ala Gly Phe Arg Ser Gly Phe Thr Pro Thr Ala 65 70 75 Tyr Phe Ala Trp Gln Thr Val Gln Leu Ala Pro Glu Thr Gly Ala 80 85 90 Val Cys Gly Asp Gly Ser Pro Tyr Lys Phe Phe Val Asn Arg Met 95 100 105 Pro Asn Thr Ser Asn Thr Leu Ile Tyr Met Glu Gly Gly Gly Ala 110 115 120 Cys Trp Asp Tyr Ala Ser Cys Ser Gly Gln Ala Gly Ile Arg Gly 125 130 135 Ala Arg Asn Pro Asn Gly Ile Pro Asp Asp Tyr Met Lys Leu Ala 140 145 150 Asn Pro Gln Ala Ser Leu Val Ser Pro Phe Val Val Arg Leu His 155 160 165 Pro Tyr Ser Arg Val Lys Thr Gln Gly Trp Asn Ile Val Tyr Ile 170 175 180 Pro Tyr Cys Thr Gly Asp Leu Tyr Ala Gly Asp Lys Val Ala Val 185 190 195 Tyr Asp Asp Pro Ser Gly Lys Lys Pro Pro Leu Val Trp His His 200 205 210 Asn Gly Leu Arg Asn Gly Arg Ala Val Leu Gly Trp Leu Lys Asp 215 220 225 Asn Leu Glu Arg Pro Gly Gln Met Leu Ser Thr Gly Cys Ser Ala 230 235 240 Gly Gly Ala Gly Ser Leu Ile Ser His Ser Val Leu Arg Gln Asp 245 250 255 Leu Ala Pro Asp Arg Gly Phe Leu Ile Asp Asp Ser Gly Pro Val 260 265 270 Phe Ser Ala Ala Val Gly Gly Asp Ser Gln Thr Tyr Pro Ser Leu 275 280 285 Pro Leu Gln Asn Leu Ile Arg Ser Ala Trp Gly Leu Asp Gln Gly 290 295 300 Pro Leu Gln Phe Leu Gln Ser Arg Leu Pro Gly Val Ser Leu Ser 305 310 315 Asn Leu Gly Ser Leu Tyr Pro Ala Leu Ala Ala Asn Phe Pro Gly 320 325 330 Asp Arg Leu Gly His Thr His Phe Trp Gln Asp Leu Asn Tyr Ser 335 340 345 Ser Tyr Ser Tyr Glu Arg Phe Tyr Pro Glu Ile Ala Asn Ala Pro 350 355 360 Asp Lys Ala Thr Lys Glu Ala Leu Ile Lys Ala Lys Trp Gln Val 365 370 375 Asp Thr Ala Arg Leu Arg Asp Thr Leu Ala Asn Leu Pro Asn Phe 380 385 390 Gly Gly Tyr Phe Pro Gln Tyr Arg Ala Leu Asn Glu Ser His Cys 395 400 405 Thr Thr Ile Val Asp Phe Ala Asn Gly Asp Ile Gln Glu Gln Gly 410 415 420 Leu Glu Leu Ser His Phe Ile Asp Asn Val Leu Asn Gly Gln Gly 425 430 435 Pro Val Leu Asp Ala Ser Glu Leu Ser Asp Ser Ala Asp Arg Ala 440 445 450 Lys Pro Asn Asn Leu Ile Tyr Asp Ala Ile Asn Lys Leu Leu 455 460

【図面の簡単な説明】

【図１】pSK 33の挿入 HindIII断片の制限酵素地図とSC
Dase遺伝子の相関を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 スフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラー
   ゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された遺
   伝子。
2. 【請求項２】 下記（ａ）〜（ｆ）に記載の遺伝子から
   選択され、かつ、スフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラ
   ーゼ活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴
   とする請求項１記載の遺伝子。 （ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は
   その一部からなるポリペプチドをコードする遺伝子、
   （ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列、又はその
   一部からなる遺伝子、（ｃ）配列表の配列番号１に記載
   のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸残
   基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つが
   なされているアミノ酸配列からなるポリペプチドをコー
   ドする遺伝子、（ｄ）配列表の配列番号２に記載の塩基
   配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、付加、挿
   入若しくは置換の少なくとも１つがなされている遺伝
   子、（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝
   子に、厳密な条件下でハイブリダイズする遺伝子、
   （ｆ）上記（ａ）〜（ｅ）の少なくともいずれか１つに
   記載の遺伝子を含んでなる遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載の遺伝子を含有す
   ることを特徴とする組換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項３記載の組換えベクターを導入さ
   せた形質転換体。
5. 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体を培養し、該
   培養物からスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼ活
   性を有するポリペプチドを採取することを特徴とするス
   フィンゴ脂質セラミドＮ−デアシラーゼ活性を有するポ
   リペプチドの製造方法。
6. 【請求項６】 請求項４記載の形質転換体を培養し、該
   培養物から採取された、請求項１又は２に記載の遺伝子
   によりコードされるスフィンゴ脂質セラミドＮ−デアシ
   ラーゼ活性を有する組換えポリペプチド。
7. 【請求項７】 請求項１又は２に記載の遺伝子に特異的
   にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブ
   又はプライマー。
8. 【請求項８】 請求項６記載のポリペプチド又はその一
   部を用いて作製した、請求項６記載のポリペプチドに特
   異的に結合する抗体又はその断片。