JP3875283B2 - エステラーゼ遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、エステル加水分解反応、エステル合成反応、エステル交換反応等に用いられるエステラーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子、該遺伝子を含有するプラスミド、該プラスミドを含有する微生物、さらには該微生物を培養し、該微生物によってエステラーゼを生産させることを特徴とするエステラーゼの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、有機合成反応、例えば加水分解反応にエステラーゼ等の酵素を利用する試みが盛んに行われている。かかる目的に使用される微生物由来のエステラーゼとしては、例えば、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ ＩＦＯ １２９５８（特開平１ー１８１７８８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ａｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ. １６０、５０４ー５１３（１９７４））、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７（６）、１４５７ー１４６４（１９７３））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８６、６４３ー６５６（１９７９））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５、１０４７ー１０５４（１９８４））等に由来するものが知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらを生産する微生物における酵素の生産性は必ずしも充分なものとは言えなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
この様な状況下で、本発明者らは、鋭意検討を行った結果、ある種の微生物由来のエステラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を見い出し、そして該ＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに組み込んだプラスミドを構築し、微生物に導入することにより、形質転換体微生物におけるエステラーゼの生産性を飛躍的に増大することに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも１番目から３６２番目で示されるアミノ酸配列をコードするエステラーゼ遺伝子（以下、本発明遺伝子と記す）、該遺伝子を含有するプラスミド（以下、本発明プラスミドと記す）、該プラスミドを含有する微生物（以下、本発明微生物と記す）および該微生物を培養し、該微生物によってエステラーゼを生産させることを特徴とするエステラーゼの製造方法（以下、本発明製造方法と記す）を提供するものである。
【０００５】
以下、さらに詳細に本発明を説明する。
本発明遺伝子は、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属に属する微生物由来のものであり、これがコードするエステラーゼは、以下の性質を有する。
分子量：３９３４８，ｐＩ：３. ９，反応至適ｐＨ：９. ０、反応至適温度：４０℃ さらに本酵素はグルタル酸ジメチル、アジピン酸ジメチル、ピメリン酸ジメチル、シス−イミダゾリシンジカルボン酸メチルエステルなどのカルボン酸エステル類，トリプロピオニンなどのトリグリセライドエステル類あるいはグルタミン酸ジエチルエステルなどのアミノ酸エステル類の化合物に対して活性を示す。なお、クロモバクテリウム属に属する微生物は、Chromobacterium SC-YM-1 （ＦＥＲＭ Ｐ−１４００９）として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【０００６】
本発明遺伝子は、例えばJ.Sambrook、 E.F.Fritsch 、 T.Maniatis著；モレキュラー クローニング 第２版(Molecular Cloning 2nd edition) 、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory) 発行、１９８９年、等に記載の通常の遺伝子工学的手法に準じて得られる。
すなわち、エステラーゼのＮ末端アミノ酸配列を決定するためには、微生物を通常の培養方法によって培養し、該微生物が産生するエステラーゼを精製する。なお、培養は、例えば、培地としてグルコース，デンプン加水分解物，糖蜜等の炭素源、酵母エキス，肉エキス，ポリペプトン，トリプトン等の窒素源、無機イオンさらに必要に応じ硫酸塩、リン酸塩等を含有する通常のものを用いて、好気条件下、適宜培地のｐＨおよび温度を調節することにより行うことができる。培養時間は培地中のエステラーゼ活性が最高になるところまで行うことが望ましいが、必ずしもその必要はない。得られた培養菌体を超音波破砕し、硫安分画した後、イオン交換，疎水，ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた通常の単離・精製の方法によりエステラーゼを精製する。得られたエステラーゼをアミノ酸配列アナライザーにかけ、Ｎ末端アミノ酸配列を決定し、そのアミノ酸配列情報から合成ＤＮＡプローブを作製する。
別に培養して得た微生物菌体を超音波破砕等の通常の方法によって破壊し、そしてプロテアーゼ処理等を行った後、ゲノムＤＮＡを抽出する。得られたゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、例えば、ファージベクターであるλgt11、あるいはプラスミドベクターであるｐＵＣ１９などにリガーゼを用いて挿入することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。それを例えば、エステラーゼに対する抗体を用いた免疫学的方法、エステラーゼの部分アミノ酸配列に対応した合成ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法、エステラーゼの活性を測定する方法等のスクリーニング法により、本発明遺伝子を取得することができる。
この様にして取得した本発明遺伝子を利用すれば、通常の遺伝子工学的方法に準じて、エステラーゼを大量に製造、取得することができる。より詳細には、本発明遺伝子が宿主微生物細胞中で発現できるようなプラスミドを作製し、これを宿主微生物細胞に導入して形質転換し、該形質転換体微生物を培養すればよい。上記のプラスミドとしては、宿主微生物細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主微生物細胞からの単離・精製が容易であり、検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、本発明遺伝子を導入したものを好ましくあげることができる。なお、発現ベクターは各種のものが既に市販されており、これに本発明遺伝子を導入するために用いられる発現ベクター切断用制限酵素も市販されている。例えば、大腸菌での発現には、ｌａｃ，ｔｒｐ，ｔａｃなどのプロモーターを含む発現ベクター（これらは、発現ベクターとしてあるいはプロモーターカートリッジとしてファルマシアＰＬ社より市販されている）を用いることができる。さらには本発明遺伝子上流にリボゾーム結合領域を連結することにより、より高発現が可能となる。リボゾーム結合領域としてはGuarente.Lら（Cell 20 p543(1980)）による報告や谷口ら（Genetics of Industrial Microorganisms p202 (1982) 講談社）による報告のものが知られているが、望ましくは、たとえば後述のＳＤ−１やＳＤ−２をあげることができる。このように、本発明遺伝子の発現に適したリボゾーム結合領域を設計し、合成してもよい。宿主微生物細胞に上記プラスミドを導入するには、通常の遺伝子工学的方法が用いられる。
宿主微生物細胞としては、真核生物および原核生物のいずれも用いることができ、好ましくは、例えば大腸菌等を挙げることができる。
前記のプラスミドを導入した宿主微生物細胞は、該微生物において通常用いられる培養方法によって培養することができる。たとえば、大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む通常の培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれでも可能であるが、好ましくは、通気攪拌された液体培養方法をあげることができる。
この様にして得られた本発明微生物の培養菌体からのエステラーゼの採取は、適宜通常の単離・精製の方法を組み合わせて実施すれば良く、例えば、培養終了後、菌体を遠心分離等で集め、破砕または溶菌せしめ、イオン交換，疎水，ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた工程を組み合わせて精製すれば良い。こうして製造したエステラーゼを産生する組換え菌体は、エステル加水分解を行うバイオリアクターとして、例えば医薬品，農薬品の中間体など有用な化合物の生産に利用することが可能である。
また、本発明微生物を培養することによってエステラーゼを大量に蓄積させた培養菌体を得て、これをそのままエンザイムリアクターとして利用することもできる。
【実施例】
以下に、実施例をあげ、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【０００７】
実施例１ （エステラーゼの分離およびＮ末端アミノ酸配列の決定）
クロモバクテリウム属に属する菌株であるChromobacterium SC-YM-1 を、５ｍｌの前培養用培地（グルコース１％(W/V) 、酵母エキス１％(W/V) 、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０. １％(W/V) 、ＭｇＳＯ4 ０. ０２％(W/V) 、ｐＨ７. ３）で、３０℃、２４時間振盪培養した後、得られた培養液を１０００ｍｌの本培養用培地（グルコース１％(W/V) 、酵母エキス１％(W/V) 、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０. １％(W/V) 、ＭｇＳＯ4 ０. ０２％(W/V) 、ｐＨ７. ３）に接種し、３０℃で培養し、ＯＤ 660 が１０に達するまで培養し、遠心分離（８０００ｇ、１０分、４℃）により菌体を回収した。回収された菌体を０. １Ｍリン酸緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭＭｇＣｌ2 、ｐＨ７. ５）８００ｍｌに懸濁し、フレンチプレス処理（２０００ｐｓｉ）により破砕した。この菌体破砕液を遠心分離（８０００ｇ、１０分、４℃）し、その上清を得た。さらにこれを超遠心分離（１１００００ｇ、６０分、４℃）して、その上清を得た。この上清液に硫安（２５％(W/V) 飽和）を加え、４℃、２時間放置した後、生じた沈澱を遠心分離（１００００ｇ、１５分、４℃）によって除去した。続いて得られた上清にさらに硫安（５５％(W/V) 飽和）を加え、４℃、２時間放置した後、生じた沈澱を遠心分離（１００００ｇ、１５分、４℃）し、沈澱物を回収した。この沈澱物を０. ０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ５）に懸濁した後、これを１５０ｍｌを陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ、ファルマシア社製）２００ｍｌを充填したカラムに通し、目的酵素を担体に吸着させた。０. １５Ｍ ＮａＣｌ＋０. ０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ５）でカラムを充分に洗浄し、非吸着分を除去した後、０. １５- ０. ３５Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配法にて目的酵素を溶出した。目的酵素であるエステラーゼの活性画分を集め、疎水性樹脂（Ｂｕｔｙｌ- Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ、東洋曹達工業社製）２００ｍｌを充填したカラムに通した。１０％(W/V) （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ＋０. ０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ５）でカラムを充分に洗浄し、非吸着分を除去した後、１０- ０％(W/V) 飽和硫酸アンモニウム直線濃度勾配法にて目的酵素を溶出した。目的酵素であるエステラーゼの活性画分を集め、ゲルろ過（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００、ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーにかけ、０. ０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ５）で溶出させた。目的酵素であるエステラーゼの活性画分を集め、精製エステラーゼを得た。
なお、エステラーゼ活性は、一般的な基質であるｐ−ニトロフェニルアセテート（ｐＮＰＡ）に対する活性を測定した。活性測定は２％(W/V) アセトンに溶解した基質４０μＭを含む０. １Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ２）に酵素液を加え、３７℃でインキュベートし、遊離するｐ−ニトロフェノール量を４０５ｎｍの吸光度の増加から測定して行った。活性は１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１ユニットとした。
精製エステラーゼ１ｎｇを蒸留水３０μｌに溶解し、気相シークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製モデル３７３Ａ）にてＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、下記の通りのアミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、２番目から３２番目で示されるもの）であった。
Thr Leu Phe Asp Gly Ile Thr Ser Arg Ile Val Asp Thr Asp Arg Leu Thr Val Asn Ile Leu Glu Arg Ala Ala Asp Asp Pro Gln Thr Pro
【０００８】
実施例２ （本発明遺伝子クローンの単離：ゲノムＤＮＡの調製）
クロモバクテリウム属に属する菌株であるChromobacterium SC-YM-1 を、５ｍｌの前培養用培地（グルコース１％(W/V) 、酵母エキス１％(W/V) 、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０. １％(W/V) 、ＭｇＳＯ4 ０. ０２％(W/V) 、ｐＨ７. ３）で、３０℃ ２４時間振盪培養した後、得られた培養液を１０００ｍｌの本培養用培地（グルコース１％(W/V) 、酵母エキス１％(W/V) 、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０. １％(W/V) 、ＭｇＳＯ4 ０. ０２％(W/V) 、ｐＨ７. ３）に接種し、３０℃で培養した。その際、ＯＤ 660 が３. ４に達した時点で、ペニシリンＧを最終濃度として２ユニット／ｍｌ培養液になるように添加し、ＯＤ 660 が１０に達するまで培養を継続した。
遠心分離（８０００ｇ、１０分、４℃）により菌体を回収し、８０ｍｌの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０）、２５％(W/V) ショ糖溶液に卵白リゾチーム（生化学工業社製）を最終濃度が５ｍｇ／ｍｌになるように添加して、３７℃で３０分間インキュベートした。次に１０ｍｌの１０％(W/V) ＳＤＳを添加し、さらにプロテアーゼＫ（ベーリンガー社製）を最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で３時間インキュベートした。その後、等量の０．１Ｍトリス飽和フェノールで３回、エーテルで２回抽出を行った後、水層に２倍容のエタノールを添加し、核酸を沈澱させ、遠心分離（１２０００ｇ、３０分、４℃）した。得られた核酸を乾燥後、２０ｍｌのトリスＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８. ３）に溶解し、ＣｓＣｌ−ＥｔＢｒ平衡密度勾配超遠心分離（２７５０００ｇ、１８時間、２５℃）し、ＤＮＡのバンドを回収し、それをトリスＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８. ３）に対し透析し、約５. ４ｍｇ のゲノムＤＮＡを得た。
【０００９】
実施例３ （本発明遺伝子クローンの単離：ゲノムＤＮＡライブラリーの作製）実施例２で得たゲノムＤＮＡ１００μｇをＸｈｏＩ（宝酒造社製制限酵素）で消化し、ゲノムＤＮＡ断片を得た。一方、λファージλＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）１μｇを同じくＸｈｏＩで消化後、前記ゲノムＤＮＡ断片と混合し、リガーゼ（宝酒造社製）を加え、１６℃一夜反応した。
つぎにこの反応液をインビトロパッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いて大腸菌ＸＬ−１ｂｌｕｅ株（キットに添付）にパッケージングし、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。
【００１０】
実施例４ （本発明遺伝子クローンの単離：ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング）
▲１▼合成ＤＮＡプローブの作製およびアイソトープ標識
実施例１で決定されたエステラーゼのＮ末端アミノ酸配列をもとに下記に示す４４ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（混合プローブ）を合成した。
オリゴヌクレオチドの合成は、ＤＮＡ自動合成機（アプライド バイオシステムズ モデル３８０Ａ）を用いて行った。
このプローブＤＮＡ５０ｐｍｏｌに３μｌの０. ５Ｍトリス塩酸（ｐＨ７.６）、０. １Ｍ ＭｇＣｌ2 、０. ０５Ｍ ＤＴＴ、０. ００１Ｍ ＥＤＴＡ、１０ｕｎｉｔｓＴ４ポリヌクレオチドカイネース（宝酒造社製）、１０μｌ［γ32Ｐ］ＡＴＰ（アマーシャム社製）を混合し、３７℃、６０分反応させた後、セファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）によるゲルろ過を行うことによりアイソトープ標識したＤＮＡプローブを調製した。
▲２▼ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング
実施例３で示したように、インビトロパッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いて、ファージで感染させた大腸菌をプレーティングし、プレートを４℃に冷やした後、表面にニトロセルロースフィルターを密着させてファージをフィルター上に移した。フィルターを１. ５Ｍ ＮａＣｌ- ０. ５Ｍ ＮａＯＨ溶液に浸し、付着したＤＮＡを変性させ、ついで１. ５Ｍ ＮａＣｌ- ０. ５Ｍトリス塩酸（ｐＨ８. ０）溶液で中和した。その後０. ３６Ｍ ＮａＣｌ- ２０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 （ｐＨ７. ５）- ２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７. ５）でフィルターを洗浄した後、乾燥させた。
次に、上記のようにして調製したエステラーゼのＮ末端アミノ酸配列に対応するアイソトープ標識したＤＮＡプローブを用いて、実施例３で作製されたゲノムＤＮＡライブラリーを以下の方法に従いプラークハイブリダイゼーションを行った。すなわち、フィルターを１）４ｘＳＳＣ，１％(W/V) ＳＤＳ、１０ｘデンハルト（０. ２％(W/V) フィコール、０. ２％(W/V) ポリビニルピロリドン、０. ２％(W/V) ウシ血清アルブミン）を含む溶液で６０℃、３０分インキュベートした後、２）５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト、１００μｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡを含む溶液で、６０℃、５時間インキュベートし、反応を行った。ハイブリダイゼーションは、プラスティックバックにフィルターと上記２）の溶液を加え、アイソトープ標識したＤＮＡプローブをフィルター１枚当たり約５ｘ１０5 ｃｐｍ 添加して、６０℃で一夜行った。
ハイブリダイゼーションを行ったフィルターは、１）２ｘＳＳＣ、０. ５％(W/V)ＳＤＳを含む溶液で６０℃、１５分 ２）２ｘＳＳＣ、０. ５％(W/V) ＳＤＳを含む溶液で２５℃、３０分 ３）２ｘＳＳＣ、０. ５％ＳＤＳ(W/V) を含む溶液で６０℃、１５分の順に洗浄した後、風乾し、Ｘ線フィルム（ＦＵＪＩ ＲＸ）と増感紙をあて、−８０℃、一夜オートラジオグラムをとった。この結果、ポジティブシグナルを与えるｐＣＣ３株を得た。
ダイデオキシ法により、塩基配列を決定した結果、得られたクローン株は、エステラーゼ遺伝子の全長をコードしてはいなかった。そこでその配列の一部をＤＮＡプローブとして再度、プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。その際ゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分消化し、同様にλファージλＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）に連結して作製したライブラリーを使用した。
その結果、ポジティブシグナルを与える本発明遺伝子クローンを９株取得した。
【００１１】
実施例５ （本発明遺伝子の制限酵素地図および全塩基配列の決定）
実施例４で得られた本発明遺伝子クローンについてインサートＤＮＡの制限酵素地図を作製した。
λＺＡＰＩＩにクローン化したインサートＤＮＡは、J.Sambrook、 E.F.Fritsch 、 T.Maniatis著；モレキュラー クローニング 第２版(Molecular Cloning 2nd edition) 、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory) 発行、１９８９年等に記載される通常の方法を用いて、ヘルパーファージＲ４０８を感染させることにより、プラスミドベクターを含む形でｉｎ ｖｉｖｏで切り出され、サブクローン化された。
この様にして得られたプラスミドｐＣＣ６（図４参照）を種々の制限酵素で切断し、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル及び５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。種々のＤＮＡ断片の鎖長を比較することにより制限酵素地図を作製した。
ベクターｐＣＣ６に存在するプローブＤＮＡと親和性のある領域を含む約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片について、ＤＥＡＺＡシークエンスキット（宝酒造社製）を用いて、塩基配列を決定した。
決定した塩基配列を図１から図３および配列番号２に示す。該塩基配列中から、オープンリーディングフレームを検索した結果、図１から図３および配列番号１に示すように、塩基番号３４３番目のＡＴＧから１４５２番目のＧＡＣまでが唯一のオープンリーディングフレームであることが判明した。
また、実施例１によって決定されたエステラーゼのＮ末端のアミノ酸配列と、上記のオープンリーディングフレームの開始コドン以下のアミノ酸配列が一致したことから、このオープンリーディングフレームがエステラーゼをコードするものであることが明かになった。その結果、エステラーゼは３７０アミノ酸残基からなる分子量３９３４８の蛋白質であることが判明した。
【００１２】
実施例６ （本発明遺伝子を含有する発現プラスミド）
発現ベクターｐＫＫ２２３−３（Boyer ら、 Prot.Natl.Acad.Sci.USA,80,21ー25(1983) 、ファルマシア社製）をBamHI により部分分解し、次にＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化し、ライゲーションを行うことによりBamHI 部位を１カ所欠失させたｐＫＫ２２３−４を作製した。
一方、本発明遺伝子の開始コドン周辺とその５’上流側の塩基配列を大腸菌での遺伝子発現に適した配列に変換するため、下記の塩基配列のＤＮＡ断片をアプライド社ＤＮＡ合成機モデル３８０Ａを用いて合成した。
ＬＰ−１ （配列番号３に示す）
ＬＰ−２ （配列番号４に示す）
ＥＳ−１ （配列番号５に示す）
ＥＳ−２ （配列番号６に示す）
ＥＳ−３ （配列番号７に示す）
ＥＳ−４ （配列番号８に示す）
ＥＳ−５ （配列番号９に示す）
ＥＳ−６ （配列番号１０に示す）
ＥＳ−７ （配列番号１１に示す）
合成したＬＰ−２，ＥＳ−１，ＥＳ−２，ＥＳ−３，ＥＳ−５，ＥＳ−６およびＥＳ−７断片の５’末端をリン酸化し、それぞれの未処理の断片とライゲーション、アニーリングを行って、下記の２種類の２本鎖ＤＮＡ断片（ＳＤ−１，ＳＤ−２）を作製した。作製した２本鎖ＤＮＡ断片（ＳＤ−１，ＳＤ−２）は、その両端をリン酸化した。
一方、ｐＣＣ６中のＳａｃＩ断片（約３. ５ｋｂｐ）をｐＵＣ１１８（宝酒造社製）へサブクローニングしたｐＣＣ３０を作製した。このｐＣＣ３０をＥｃｏ５２Ｉ、およびＳａｃＩで消化することによりエステラーゼの翻訳領域（約１. ２Ｋｂｐ）を切り出した。一方ｌａｃプロモーターを有するｐＵＣ１１８をＥｃｏＲＩとＳａｃＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩとＳａｃＩ部位の間に、前記ＤＮＡ断片（ＳＤ−１あるいはＳＤ−２）および、本発明遺伝子翻訳領域を含むＥｃｏ５２ＩーＳａｃＩ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結することにより、ｐＣＣ１００およびｐＣＣ１０１を作製した（図５参照）。続いてこのｐＣＣ１００およびｐＣＣ１０１をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、エステラーゼの翻訳領域（約１．３Ｋｂｐ）を切り出した。一方、ｔａｃプロモーターを有するｐＫＫ２２３−４をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行った。ついでこのｐＫＫ２２３−４のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に、エステラーゼ翻訳領域を含むＥｃｏＲＩーＨｉｎｄＩＩＩ断片（１.３Ｋｂｐ）をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結することにより、ｐＣＣ２００およびｐＣＣ２０１を作製した（図５参照）。この様にしてｌａｃおよびｔａｃプロモーターの下流に改変された５’末端塩基配列を有する４種類の大腸菌用発現プラスミドｐＣＣ１００（ＳＤ−１，ｐＵＣ１１８）、ｐＣＣ１０１（ＳＤ−２，ｐＵＣ１１８）、ｐＣＣ２００（ＳＤ−１，ｐＫＫ２２３−４）およびｐＣＣ２０１（ＳＤ−２，ｐＫＫ２２３−４）を得た。
【００１３】
実施例７ （本発明遺伝子を導入した形質転換体微生物によるエステラーゼ生産）
実施例６で得られた４種類の発現プラスミドをそれぞれ通常の遺伝子工学的方法に準じて、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、組換え体微生物を作製した。組換え体微生物をＬＢ培地（トリプトン１％(W/V) 、酵母エキス０. ５％(W/V) 、ＮａＣｌ０. ５％(W/V) ）に接種後、３７℃で培養し、対数増殖期にＩＰＴＧ（イソプロピルーβーＤーチオガラクトピラノシド）を終濃度１ｍＭになるように添加して、エステラーゼの発現を誘導した。
培養終了後、遠心分離（８０００ｇ、１０分、４℃）により菌体を回収し、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量約４万の位置に、エステラーゼが主バンドとして認められ、微生物内で該酵素がいずれも高発現していることが判明した。
そこで、エステラーゼの一般的な基質であるｐ−ニトロフェニルアセテート（ｐＮＰＡ）に対する、これらの形質転換体微生物のエステラーゼ生産量を測定した。生産量測定は２％(W/V) アセトンに溶解した基質４０μＭを含む０. １Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ２）に酵素液を加え、３７℃でインキュベートし、遊離するｐ−ニトロフェノール量を４０５ｎｍの吸光度の増加から測定して行った。活性は１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１ユニットとした。その結果を表１に示す。
【表１】
さらに前記の４種類の発現プラスミドをそれぞれ大腸菌ＪＭ１０５およびＪＭ１０３に形質転換し、同様にして、ＬＢ培地に接種後、３７℃で培養し、対数増殖期にＩＰＴＧ（イソプロピルーβーＤーチオガラクトシド）を終濃度１ｍＭになるように添加して、エステラーゼの発現を誘導した。
これらの形質転換体微生物体のエステラーゼ生産量を上記と同様の方法にて測定した。その結果を表２に示す。
【表２】
【００１４】
実施例８ （本発明遺伝子を導入した形質転換体微生物産生エステラーゼの精製およびその性質）
実施例７で示した方法で培養を行った組換え体微生物（ｐＣＣ１０１／ＪＭ１０５）を超音波破砕（２０ＫＨｚ、１５分、４℃）後、遠心分離（１２０００ｇ、３０分、４℃）を行い、その上清を得た。得られた上清１５０ｍｌを陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ ファルマシア社製）２００ｍｌを充填したカラムに通し、目的酵素を担体に吸着させた。０. １５Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７. ５）でカラムを充分に洗浄し、非吸着分を除去した後、０. １５ー ０. ３５ＭＮａＣｌ直線濃度勾配法にて目的酵素を溶出した。目的酵素であるエステラーゼの活性画分を集め、疎水性樹脂（Ｂｕｔｙｌー Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ、東洋曹達工業社製）２００ｍｌを充填したカラムに通した。１０％(W/V) の（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ＋１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７. ５）でカラムを充分に洗浄し、非吸着分を除去した後、１０ー ０％(W/V) 飽和硫酸アンモニウム直線濃度勾配法にて目的酵素を溶出した。目的酵素であるエステラーゼの活性画分を集め、精製エステラーゼを得た。活性測定は実施例１に記載した方法に従った。得られた精製エステラーゼをＥＳＩ（electrospry ionization）マススペクトルによる質量分析および酵素法によるＣ末端アミノ酸分析を行ったところ、分子量３９３４８の完全長エステラーゼ（以下Ｌ体と記す）と分子量３８５０８のＣ末端アミノ酸が８個欠失したエステラーゼ分解物（以下Ｓ体と記す）が検出された。
得られた完全長エステラーゼ（Ｌ体）を用い、下記の活性測定法により、各種脂肪酸エステル類、トリグリセライド類およびアミノ酸エステル類の化合物に対する基質特異性を調べた。加水分解活性測定は、それぞれの基質０.５Ｍを含む０.２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８. ０）に酵素液を加えて３５℃で反応させ、生成した脂肪酸、アミノ酸をフェノールフタレインを指示薬として、０. ０５Ｎ ＮａＯＨ溶液で滴定・定量することにより行った。活性は１分間に１μｍｏｌの脂肪酸・アミノ酸を遊離する酵素量を１ユニットとした。
その結果を表３に示す。なお表３における酵素活性は、グルタル酸ジメチルに対する活性を１００とした時の相対値（％）で示した。
また、得られたエステラーゼ分解物（Ｓ体）もほぼ同様な効果が得られた。
【表３】
【００１５】
【発明の効果】
本発明遺伝子を含有するＤＮＡ断片をベクターに組み込んだプラスミドを構築し、微生物に導入することにより、形質転換体微生物におけるエステラーゼの生産性を飛躍的に増大することに成功し、エステラーゼを効率良く製造することができるようになった。
【００１６】
【配列表】
配列番号 ：１
配列の長さ：３７０
配列の型 ：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
【００１７】
配列番号 ：２
配列の長さ：１１１０
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
起源 生物名；クロモバクテリウム（Chromobacterium ）
株名 ；ＳＣ−ＹＭ−１
配列の特徴：
特徴をあらわす記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．．１１１０
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
【００１８】
配列番号 ：３
配列の長さ：２０
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００１９】
配列番号 ：４
配列の長さ：２６
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００２０】
配列番号 ：５
配列の長さ：２９
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００２１】
配列番号 ：６
配列の長さ：３６
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００２２】
配列番号 ：７
配列の長さ：３０
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００２３】
配列番号 ：８
配列の長さ：４５
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００２４】
配列番号 ：９
配列の長さ：２９
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００２５】
配列番号 ：１０
配列の長さ：３７
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【００２６】
配列番号 ：１１
配列の長さ：３０
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【図面の簡単な説明】
【図１】ベクターｐＣＣ６のインサートＤＮＡの１番目から６４２番目の塩基配列と、それから類推されるエステラーゼのアミノ酸配列を示す図である。スクリーニングに用いたプローブＤＮＡは、塩基番号３４６から３９０番目に相当する。
【図２】ベクターｐＣＣ６のインサートＤＮＡの６４３番目から１０７４番目の塩基配列と、それから類推されるエステラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図３】ベクターｐＣＣ６のインサートＤＮＡの１０７５番目から１６３９番目の塩基配列と、それから類推されるエステラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４】プラークハイブリダイゼーションで得られたベクターｐＣＣ６の制限酵素地図を示す図である。図中白抜きは、クロモバクテリウム属に属する微生物由来の本発明遺伝子を、斜線部はエステラーゼの翻訳領域を示す。
【図５】本発明遺伝子を含有する発現プラスミドｐＣＣ１００、ｐＣＣ１０１、ｐＣＣ２００およびｐＣＣ２０１の構築ストラテジーを示す図である。図中、矢印はｌａｃあるいはｔａｃプロモーターを示す。
【産業上の利用分野】
本発明は、エステル加水分解反応、エステル合成反応、エステル交換反応等に用いられるエステラーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子、該遺伝子を含有するプラスミド、該プラスミドを含有する微生物、さらには該微生物を培養し、該微生物によってエステラーゼを生産させることを特徴とするエステラーゼの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、有機合成反応、例えば加水分解反応にエステラーゼ等の酵素を利用する試みが盛んに行われている。かかる目的に使用される微生物由来のエステラーゼとしては、例えば、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ ＩＦＯ １２９５８（特開平１ー１８１７８８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ａｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ. １６０、５０４ー５１３（１９７４））、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７（６）、１４５７ー１４６４（１９７３））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８６、６４３ー６５６（１９７９））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５、１０４７ー１０５４（１９８４））等に由来するものが知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらを生産する微生物における酵素の生産性は必ずしも充分なものとは言えなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
この様な状況下で、本発明者らは、鋭意検討を行った結果、ある種の微生物由来のエステラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を見い出し、そして該ＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに組み込んだプラスミドを構築し、微生物に導入することにより、形質転換体微生物におけるエステラーゼの生産性を飛躍的に増大することに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも１番目から３６２番目で示されるアミノ酸配列をコードするエステラーゼ遺伝子（以下、本発明遺伝子と記す）、該遺伝子を含有するプラスミド（以下、本発明プラスミドと記す）、該プラスミドを含有する微生物（以下、本発明微生物と記す）および該微生物を培養し、該微生物によってエステラーゼを生産させることを特徴とするエステラーゼの製造方法（以下、本発明製造方法と記す）を提供するものである。
【０００５】
以下、さらに詳細に本発明を説明する。
本発明遺伝子は、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属に属する微生物由来のものであり、これがコードするエステラーゼは、以下の性質を有する。
分子量：３９３４８，ｐＩ：３. ９，反応至適ｐＨ：９. ０、反応至適温度：４０℃ さらに本酵素はグルタル酸ジメチル、アジピン酸ジメチル、ピメリン酸ジメチル、シス−イミダゾリシンジカルボン酸メチルエステルなどのカルボン酸エステル類，トリプロピオニンなどのトリグリセライドエステル類あるいはグルタミン酸ジエチルエステルなどのアミノ酸エステル類の化合物に対して活性を示す。なお、クロモバクテリウム属に属する微生物は、Chromobacterium SC-YM-1 （ＦＥＲＭ Ｐ−１４００９）として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【０００６】
本発明遺伝子は、例えばJ.Sambrook、 E.F.Fritsch 、 T.Maniatis著；モレキュラー クローニング 第２版(Molecular Cloning 2nd edition) 、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory) 発行、１９８９年、等に記載の通常の遺伝子工学的手法に準じて得られる。
すなわち、エステラーゼのＮ末端アミノ酸配列を決定するためには、微生物を通常の培養方法によって培養し、該微生物が産生するエステラーゼを精製する。なお、培養は、例えば、培地としてグルコース，デンプン加水分解物，糖蜜等の炭素源、酵母エキス，肉エキス，ポリペプトン，トリプトン等の窒素源、無機イオンさらに必要に応じ硫酸塩、リン酸塩等を含有する通常のものを用いて、好気条件下、適宜培地のｐＨおよび温度を調節することにより行うことができる。培養時間は培地中のエステラーゼ活性が最高になるところまで行うことが望ましいが、必ずしもその必要はない。得られた培養菌体を超音波破砕し、硫安分画した後、イオン交換，疎水，ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた通常の単離・精製の方法によりエステラーゼを精製する。得られたエステラーゼをアミノ酸配列アナライザーにかけ、Ｎ末端アミノ酸配列を決定し、そのアミノ酸配列情報から合成ＤＮＡプローブを作製する。
別に培養して得た微生物菌体を超音波破砕等の通常の方法によって破壊し、そしてプロテアーゼ処理等を行った後、ゲノムＤＮＡを抽出する。得られたゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、例えば、ファージベクターであるλgt11、あるいはプラスミドベクターであるｐＵＣ１９などにリガーゼを用いて挿入することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。それを例えば、エステラーゼに対する抗体を用いた免疫学的方法、エステラーゼの部分アミノ酸配列に対応した合成ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法、エステラーゼの活性を測定する方法等のスクリーニング法により、本発明遺伝子を取得することができる。
この様にして取得した本発明遺伝子を利用すれば、通常の遺伝子工学的方法に準じて、エステラーゼを大量に製造、取得することができる。より詳細には、本発明遺伝子が宿主微生物細胞中で発現できるようなプラスミドを作製し、これを宿主微生物細胞に導入して形質転換し、該形質転換体微生物を培養すればよい。上記のプラスミドとしては、宿主微生物細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主微生物細胞からの単離・精製が容易であり、検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、本発明遺伝子を導入したものを好ましくあげることができる。なお、発現ベクターは各種のものが既に市販されており、これに本発明遺伝子を導入するために用いられる発現ベクター切断用制限酵素も市販されている。例えば、大腸菌での発現には、ｌａｃ，ｔｒｐ，ｔａｃなどのプロモーターを含む発現ベクター（これらは、発現ベクターとしてあるいはプロモーターカートリッジとしてファルマシアＰＬ社より市販されている）を用いることができる。さらには本発明遺伝子上流にリボゾーム結合領域を連結することにより、より高発現が可能となる。リボゾーム結合領域としてはGuarente.Lら（Cell 20 p543(1980)）による報告や谷口ら（Genetics of Industrial Microorganisms p202 (1982) 講談社）による報告のものが知られているが、望ましくは、たとえば後述のＳＤ−１やＳＤ−２をあげることができる。このように、本発明遺伝子の発現に適したリボゾーム結合領域を設計し、合成してもよい。宿主微生物細胞に上記プラスミドを導入するには、通常の遺伝子工学的方法が用いられる。
宿主微生物細胞としては、真核生物および原核生物のいずれも用いることができ、好ましくは、例えば大腸菌等を挙げることができる。
前記のプラスミドを導入した宿主微生物細胞は、該微生物において通常用いられる培養方法によって培養することができる。たとえば、大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む通常の培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれでも可能であるが、好ましくは、通気攪拌された液体培養方法をあげることができる。
この様にして得られた本発明微生物の培養菌体からのエステラーゼの採取は、適宜通常の単離・精製の方法を組み合わせて実施すれば良く、例えば、培養終了後、菌体を遠心分離等で集め、破砕または溶菌せしめ、イオン交換，疎水，ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた工程を組み合わせて精製すれば良い。こうして製造したエステラーゼを産生する組換え菌体は、エステル加水分解を行うバイオリアクターとして、例えば医薬品，農薬品の中間体など有用な化合物の生産に利用することが可能である。
また、本発明微生物を培養することによってエステラーゼを大量に蓄積させた培養菌体を得て、これをそのままエンザイムリアクターとして利用することもできる。
【実施例】
以下に、実施例をあげ、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【０００７】
実施例１ （エステラーゼの分離およびＮ末端アミノ酸配列の決定）
クロモバクテリウム属に属する菌株であるChromobacterium SC-YM-1 を、５ｍｌの前培養用培地（グルコース１％(W/V) 、酵母エキス１％(W/V) 、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０. １％(W/V) 、ＭｇＳＯ4 ０. ０２％(W/V) 、ｐＨ７. ３）で、３０℃、２４時間振盪培養した後、得られた培養液を１０００ｍｌの本培養用培地（グルコース１％(W/V) 、酵母エキス１％(W/V) 、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０. １％(W/V) 、ＭｇＳＯ4 ０. ０２％(W/V) 、ｐＨ７. ３）に接種し、３０℃で培養し、ＯＤ 660 が１０に達するまで培養し、遠心分離（８０００ｇ、１０分、４℃）により菌体を回収した。回収された菌体を０. １Ｍリン酸緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭＭｇＣｌ2 、ｐＨ７. ５）８００ｍｌに懸濁し、フレンチプレス処理（２０００ｐｓｉ）により破砕した。この菌体破砕液を遠心分離（８０００ｇ、１０分、４℃）し、その上清を得た。さらにこれを超遠心分離（１１００００ｇ、６０分、４℃）して、その上清を得た。この上清液に硫安（２５％(W/V) 飽和）を加え、４℃、２時間放置した後、生じた沈澱を遠心分離（１００００ｇ、１５分、４℃）によって除去した。続いて得られた上清にさらに硫安（５５％(W/V) 飽和）を加え、４℃、２時間放置した後、生じた沈澱を遠心分離（１００００ｇ、１５分、４℃）し、沈澱物を回収した。この沈澱物を０. ０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ５）に懸濁した後、これを１５０ｍｌを陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ、ファルマシア社製）２００ｍｌを充填したカラムに通し、目的酵素を担体に吸着させた。０. １５Ｍ ＮａＣｌ＋０. ０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ５）でカラムを充分に洗浄し、非吸着分を除去した後、０. １５- ０. ３５Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配法にて目的酵素を溶出した。目的酵素であるエステラーゼの活性画分を集め、疎水性樹脂（Ｂｕｔｙｌ- Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ、東洋曹達工業社製）２００ｍｌを充填したカラムに通した。１０％(W/V) （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ＋０. ０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ５）でカラムを充分に洗浄し、非吸着分を除去した後、１０- ０％(W/V) 飽和硫酸アンモニウム直線濃度勾配法にて目的酵素を溶出した。目的酵素であるエステラーゼの活性画分を集め、ゲルろ過（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００、ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーにかけ、０. ０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ５）で溶出させた。目的酵素であるエステラーゼの活性画分を集め、精製エステラーゼを得た。
なお、エステラーゼ活性は、一般的な基質であるｐ−ニトロフェニルアセテート（ｐＮＰＡ）に対する活性を測定した。活性測定は２％(W/V) アセトンに溶解した基質４０μＭを含む０. １Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ２）に酵素液を加え、３７℃でインキュベートし、遊離するｐ−ニトロフェノール量を４０５ｎｍの吸光度の増加から測定して行った。活性は１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１ユニットとした。
精製エステラーゼ１ｎｇを蒸留水３０μｌに溶解し、気相シークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製モデル３７３Ａ）にてＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、下記の通りのアミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、２番目から３２番目で示されるもの）であった。
Thr Leu Phe Asp Gly Ile Thr Ser Arg Ile Val Asp Thr Asp Arg Leu Thr Val Asn Ile Leu Glu Arg Ala Ala Asp Asp Pro Gln Thr Pro
【０００８】
実施例２ （本発明遺伝子クローンの単離：ゲノムＤＮＡの調製）
クロモバクテリウム属に属する菌株であるChromobacterium SC-YM-1 を、５ｍｌの前培養用培地（グルコース１％(W/V) 、酵母エキス１％(W/V) 、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０. １％(W/V) 、ＭｇＳＯ4 ０. ０２％(W/V) 、ｐＨ７. ３）で、３０℃ ２４時間振盪培養した後、得られた培養液を１０００ｍｌの本培養用培地（グルコース１％(W/V) 、酵母エキス１％(W/V) 、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０. １％(W/V) 、ＭｇＳＯ4 ０. ０２％(W/V) 、ｐＨ７. ３）に接種し、３０℃で培養した。その際、ＯＤ 660 が３. ４に達した時点で、ペニシリンＧを最終濃度として２ユニット／ｍｌ培養液になるように添加し、ＯＤ 660 が１０に達するまで培養を継続した。
遠心分離（８０００ｇ、１０分、４℃）により菌体を回収し、８０ｍｌの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０）、２５％(W/V) ショ糖溶液に卵白リゾチーム（生化学工業社製）を最終濃度が５ｍｇ／ｍｌになるように添加して、３７℃で３０分間インキュベートした。次に１０ｍｌの１０％(W/V) ＳＤＳを添加し、さらにプロテアーゼＫ（ベーリンガー社製）を最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で３時間インキュベートした。その後、等量の０．１Ｍトリス飽和フェノールで３回、エーテルで２回抽出を行った後、水層に２倍容のエタノールを添加し、核酸を沈澱させ、遠心分離（１２０００ｇ、３０分、４℃）した。得られた核酸を乾燥後、２０ｍｌのトリスＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８. ３）に溶解し、ＣｓＣｌ−ＥｔＢｒ平衡密度勾配超遠心分離（２７５０００ｇ、１８時間、２５℃）し、ＤＮＡのバンドを回収し、それをトリスＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８. ３）に対し透析し、約５. ４ｍｇ のゲノムＤＮＡを得た。
【０００９】
実施例３ （本発明遺伝子クローンの単離：ゲノムＤＮＡライブラリーの作製）実施例２で得たゲノムＤＮＡ１００μｇをＸｈｏＩ（宝酒造社製制限酵素）で消化し、ゲノムＤＮＡ断片を得た。一方、λファージλＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）１μｇを同じくＸｈｏＩで消化後、前記ゲノムＤＮＡ断片と混合し、リガーゼ（宝酒造社製）を加え、１６℃一夜反応した。
つぎにこの反応液をインビトロパッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いて大腸菌ＸＬ−１ｂｌｕｅ株（キットに添付）にパッケージングし、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。
【００１０】
実施例４ （本発明遺伝子クローンの単離：ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング）
▲１▼合成ＤＮＡプローブの作製およびアイソトープ標識
実施例１で決定されたエステラーゼのＮ末端アミノ酸配列をもとに下記に示す４４ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（混合プローブ）を合成した。
このプローブＤＮＡ５０ｐｍｏｌに３μｌの０. ５Ｍトリス塩酸（ｐＨ７.６）、０. １Ｍ ＭｇＣｌ2 、０. ０５Ｍ ＤＴＴ、０. ００１Ｍ ＥＤＴＡ、１０ｕｎｉｔｓＴ４ポリヌクレオチドカイネース（宝酒造社製）、１０μｌ［γ32Ｐ］ＡＴＰ（アマーシャム社製）を混合し、３７℃、６０分反応させた後、セファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）によるゲルろ過を行うことによりアイソトープ標識したＤＮＡプローブを調製した。
▲２▼ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング
実施例３で示したように、インビトロパッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いて、ファージで感染させた大腸菌をプレーティングし、プレートを４℃に冷やした後、表面にニトロセルロースフィルターを密着させてファージをフィルター上に移した。フィルターを１. ５Ｍ ＮａＣｌ- ０. ５Ｍ ＮａＯＨ溶液に浸し、付着したＤＮＡを変性させ、ついで１. ５Ｍ ＮａＣｌ- ０. ５Ｍトリス塩酸（ｐＨ８. ０）溶液で中和した。その後０. ３６Ｍ ＮａＣｌ- ２０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 （ｐＨ７. ５）- ２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７. ５）でフィルターを洗浄した後、乾燥させた。
次に、上記のようにして調製したエステラーゼのＮ末端アミノ酸配列に対応するアイソトープ標識したＤＮＡプローブを用いて、実施例３で作製されたゲノムＤＮＡライブラリーを以下の方法に従いプラークハイブリダイゼーションを行った。すなわち、フィルターを１）４ｘＳＳＣ，１％(W/V) ＳＤＳ、１０ｘデンハルト（０. ２％(W/V) フィコール、０. ２％(W/V) ポリビニルピロリドン、０. ２％(W/V) ウシ血清アルブミン）を含む溶液で６０℃、３０分インキュベートした後、２）５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト、１００μｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡを含む溶液で、６０℃、５時間インキュベートし、反応を行った。ハイブリダイゼーションは、プラスティックバックにフィルターと上記２）の溶液を加え、アイソトープ標識したＤＮＡプローブをフィルター１枚当たり約５ｘ１０5 ｃｐｍ 添加して、６０℃で一夜行った。
ハイブリダイゼーションを行ったフィルターは、１）２ｘＳＳＣ、０. ５％(W/V)ＳＤＳを含む溶液で６０℃、１５分 ２）２ｘＳＳＣ、０. ５％(W/V) ＳＤＳを含む溶液で２５℃、３０分 ３）２ｘＳＳＣ、０. ５％ＳＤＳ(W/V) を含む溶液で６０℃、１５分の順に洗浄した後、風乾し、Ｘ線フィルム（ＦＵＪＩ ＲＸ）と増感紙をあて、−８０℃、一夜オートラジオグラムをとった。この結果、ポジティブシグナルを与えるｐＣＣ３株を得た。
ダイデオキシ法により、塩基配列を決定した結果、得られたクローン株は、エステラーゼ遺伝子の全長をコードしてはいなかった。そこでその配列の一部をＤＮＡプローブとして再度、プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。その際ゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分消化し、同様にλファージλＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）に連結して作製したライブラリーを使用した。
その結果、ポジティブシグナルを与える本発明遺伝子クローンを９株取得した。
【００１１】
実施例５ （本発明遺伝子の制限酵素地図および全塩基配列の決定）
実施例４で得られた本発明遺伝子クローンについてインサートＤＮＡの制限酵素地図を作製した。
λＺＡＰＩＩにクローン化したインサートＤＮＡは、J.Sambrook、 E.F.Fritsch 、 T.Maniatis著；モレキュラー クローニング 第２版(Molecular Cloning 2nd edition) 、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory) 発行、１９８９年等に記載される通常の方法を用いて、ヘルパーファージＲ４０８を感染させることにより、プラスミドベクターを含む形でｉｎ ｖｉｖｏで切り出され、サブクローン化された。
この様にして得られたプラスミドｐＣＣ６（図４参照）を種々の制限酵素で切断し、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル及び５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。種々のＤＮＡ断片の鎖長を比較することにより制限酵素地図を作製した。
ベクターｐＣＣ６に存在するプローブＤＮＡと親和性のある領域を含む約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片について、ＤＥＡＺＡシークエンスキット（宝酒造社製）を用いて、塩基配列を決定した。
決定した塩基配列を図１から図３および配列番号２に示す。該塩基配列中から、オープンリーディングフレームを検索した結果、図１から図３および配列番号１に示すように、塩基番号３４３番目のＡＴＧから１４５２番目のＧＡＣまでが唯一のオープンリーディングフレームであることが判明した。
また、実施例１によって決定されたエステラーゼのＮ末端のアミノ酸配列と、上記のオープンリーディングフレームの開始コドン以下のアミノ酸配列が一致したことから、このオープンリーディングフレームがエステラーゼをコードするものであることが明かになった。その結果、エステラーゼは３７０アミノ酸残基からなる分子量３９３４８の蛋白質であることが判明した。
【００１２】
実施例６ （本発明遺伝子を含有する発現プラスミド）
発現ベクターｐＫＫ２２３−３（Boyer ら、 Prot.Natl.Acad.Sci.USA,80,21ー25(1983) 、ファルマシア社製）をBamHI により部分分解し、次にＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化し、ライゲーションを行うことによりBamHI 部位を１カ所欠失させたｐＫＫ２２３−４を作製した。
一方、本発明遺伝子の開始コドン周辺とその５’上流側の塩基配列を大腸菌での遺伝子発現に適した配列に変換するため、下記の塩基配列のＤＮＡ断片をアプライド社ＤＮＡ合成機モデル３８０Ａを用いて合成した。
ＬＰ−１ （配列番号３に示す）
ＬＰ−２ （配列番号４に示す）
ＥＳ−１ （配列番号５に示す）
ＥＳ−２ （配列番号６に示す）
ＥＳ−３ （配列番号７に示す）
ＥＳ−４ （配列番号８に示す）
ＥＳ−５ （配列番号９に示す）
ＥＳ−６ （配列番号１０に示す）
ＥＳ−７ （配列番号１１に示す）
合成したＬＰ−２，ＥＳ−１，ＥＳ−２，ＥＳ−３，ＥＳ−５，ＥＳ−６およびＥＳ−７断片の５’末端をリン酸化し、それぞれの未処理の断片とライゲーション、アニーリングを行って、下記の２種類の２本鎖ＤＮＡ断片（ＳＤ−１，ＳＤ−２）を作製した。作製した２本鎖ＤＮＡ断片（ＳＤ−１，ＳＤ−２）は、その両端をリン酸化した。
実施例７ （本発明遺伝子を導入した形質転換体微生物によるエステラーゼ生産）
実施例６で得られた４種類の発現プラスミドをそれぞれ通常の遺伝子工学的方法に準じて、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、組換え体微生物を作製した。組換え体微生物をＬＢ培地（トリプトン１％(W/V) 、酵母エキス０. ５％(W/V) 、ＮａＣｌ０. ５％(W/V) ）に接種後、３７℃で培養し、対数増殖期にＩＰＴＧ（イソプロピルーβーＤーチオガラクトピラノシド）を終濃度１ｍＭになるように添加して、エステラーゼの発現を誘導した。
培養終了後、遠心分離（８０００ｇ、１０分、４℃）により菌体を回収し、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量約４万の位置に、エステラーゼが主バンドとして認められ、微生物内で該酵素がいずれも高発現していることが判明した。
そこで、エステラーゼの一般的な基質であるｐ−ニトロフェニルアセテート（ｐＮＰＡ）に対する、これらの形質転換体微生物のエステラーゼ生産量を測定した。生産量測定は２％(W/V) アセトンに溶解した基質４０μＭを含む０. １Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７. ２）に酵素液を加え、３７℃でインキュベートし、遊離するｐ−ニトロフェノール量を４０５ｎｍの吸光度の増加から測定して行った。活性は１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１ユニットとした。その結果を表１に示す。
【表１】
これらの形質転換体微生物体のエステラーゼ生産量を上記と同様の方法にて測定した。その結果を表２に示す。
【表２】
実施例８ （本発明遺伝子を導入した形質転換体微生物産生エステラーゼの精製およびその性質）
実施例７で示した方法で培養を行った組換え体微生物（ｐＣＣ１０１／ＪＭ１０５）を超音波破砕（２０ＫＨｚ、１５分、４℃）後、遠心分離（１２０００ｇ、３０分、４℃）を行い、その上清を得た。得られた上清１５０ｍｌを陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ ファルマシア社製）２００ｍｌを充填したカラムに通し、目的酵素を担体に吸着させた。０. １５Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７. ５）でカラムを充分に洗浄し、非吸着分を除去した後、０. １５ー ０. ３５ＭＮａＣｌ直線濃度勾配法にて目的酵素を溶出した。目的酵素であるエステラーゼの活性画分を集め、疎水性樹脂（Ｂｕｔｙｌー Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ、東洋曹達工業社製）２００ｍｌを充填したカラムに通した。１０％(W/V) の（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ＋１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７. ５）でカラムを充分に洗浄し、非吸着分を除去した後、１０ー ０％(W/V) 飽和硫酸アンモニウム直線濃度勾配法にて目的酵素を溶出した。目的酵素であるエステラーゼの活性画分を集め、精製エステラーゼを得た。活性測定は実施例１に記載した方法に従った。得られた精製エステラーゼをＥＳＩ（electrospry ionization）マススペクトルによる質量分析および酵素法によるＣ末端アミノ酸分析を行ったところ、分子量３９３４８の完全長エステラーゼ（以下Ｌ体と記す）と分子量３８５０８のＣ末端アミノ酸が８個欠失したエステラーゼ分解物（以下Ｓ体と記す）が検出された。
得られた完全長エステラーゼ（Ｌ体）を用い、下記の活性測定法により、各種脂肪酸エステル類、トリグリセライド類およびアミノ酸エステル類の化合物に対する基質特異性を調べた。加水分解活性測定は、それぞれの基質０.５Ｍを含む０.２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８. ０）に酵素液を加えて３５℃で反応させ、生成した脂肪酸、アミノ酸をフェノールフタレインを指示薬として、０. ０５Ｎ ＮａＯＨ溶液で滴定・定量することにより行った。活性は１分間に１μｍｏｌの脂肪酸・アミノ酸を遊離する酵素量を１ユニットとした。
その結果を表３に示す。なお表３における酵素活性は、グルタル酸ジメチルに対する活性を１００とした時の相対値（％）で示した。
また、得られたエステラーゼ分解物（Ｓ体）もほぼ同様な効果が得られた。
【表３】
【発明の効果】
本発明遺伝子を含有するＤＮＡ断片をベクターに組み込んだプラスミドを構築し、微生物に導入することにより、形質転換体微生物におけるエステラーゼの生産性を飛躍的に増大することに成功し、エステラーゼを効率良く製造することができるようになった。
【００１６】
【配列表】
配列番号 ：１
配列の長さ：３７０
配列の型 ：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
配列番号 ：２
配列の長さ：１１１０
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
起源 生物名；クロモバクテリウム（Chromobacterium ）
株名 ；ＳＣ−ＹＭ−１
配列の特徴：
特徴をあらわす記号：ＣＤＳ
存在位置：１．．．１１１０
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
配列番号 ：３
配列の長さ：２０
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
配列番号 ：４
配列の長さ：２６
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
配列番号 ：５
配列の長さ：２９
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
配列番号 ：６
配列の長さ：３６
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
配列番号 ：７
配列の長さ：３０
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
配列番号 ：８
配列の長さ：４５
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
配列番号 ：９
配列の長さ：２９
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
配列番号 ：１０
配列の長さ：３７
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
配列番号 ：１１
配列の長さ：３０
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列
【図面の簡単な説明】
【図１】ベクターｐＣＣ６のインサートＤＮＡの１番目から６４２番目の塩基配列と、それから類推されるエステラーゼのアミノ酸配列を示す図である。スクリーニングに用いたプローブＤＮＡは、塩基番号３４６から３９０番目に相当する。
【図２】ベクターｐＣＣ６のインサートＤＮＡの６４３番目から１０７４番目の塩基配列と、それから類推されるエステラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図３】ベクターｐＣＣ６のインサートＤＮＡの１０７５番目から１６３９番目の塩基配列と、それから類推されるエステラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図４】プラークハイブリダイゼーションで得られたベクターｐＣＣ６の制限酵素地図を示す図である。図中白抜きは、クロモバクテリウム属に属する微生物由来の本発明遺伝子を、斜線部はエステラーゼの翻訳領域を示す。
【図５】本発明遺伝子を含有する発現プラスミドｐＣＣ１００、ｐＣＣ１０１、ｐＣＣ２００およびｐＣＣ２０１の構築ストラテジーを示す図である。図中、矢印はｌａｃあるいはｔａｃプロモーターを示す。
Claims (5)
- 配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも１番目から３６２番目で示されるアミノ酸配列をコードするエステラーゼ遺伝子。
- 配列番号２で示される塩基配列のうち、少なくとも１番目から１０８６番目で示される塩基配列を有する請求項１記載のエステラーゼ遺伝子。
- 請求項１または請求項２記載のエステラーゼ遺伝子を有するプラスミド。
- 請求項３記載のプラスミドを含有する微生物。
- 請求項４記載の微生物を培養し、該微生物によってエステラーゼを生産させることを特徴とするエステラーゼの製造方法。
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