WO2013094499A1 - 光学活性なα－置換－β－アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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- WO2013094499A1 WO2013094499A1 PCT/JP2012/082274 JP2012082274W WO2013094499A1 WO 2013094499 A1 WO2013094499 A1 WO 2013094499A1 JP 2012082274 W JP2012082274 W JP 2012082274W WO 2013094499 A1 WO2013094499 A1 WO 2013094499A1
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- 0 **N(*)CC(*)C(O)=O Chemical compound **N(*)CC(*)C(O)=O 0.000 description 1
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
- C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction
Definitions
- the present invention relates to a method for producing an optically active ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid.
- R 1 represents a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 10 carbon atoms, a carboxyl group or a carboxamide group.
- R 2 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a substituent.
- R 3 represents a hydrocarbon group having 1 to 20 carbon atoms which may have a substituent.
- X represents an oxygen atom or a sulfur atom
- * represents an asymmetric center. .
- the optically active ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid represented by is useful as a raw material for production or an intermediate compound for producing a drug substance compound.
- WO 00/61134 describes a method for producing an optically active ⁇ -cyclopentylmethyl- ⁇ - (N-formyl-N-hydroxy) amino acid which is a raw material for producing an antibacterial agent.
- the present invention provides a novel method for producing an optically active ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid represented by the above formula (2). That is, the present invention includes the following inventions [1] to [12].
- [1] A method for producing an optically active ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid represented by formula (2) (hereinafter sometimes referred to as “optically active ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid (2)”), Formula (1) (In the formula, R 4 represents an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
- R 1 , R 2 , R 3 and X have the same meanings as described above.
- a —CO 2 R 4 group (hereinafter referred to as “ester” in some cases) of the optical isomer mixture of the ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (hereinafter sometimes referred to as “ ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1)”)
- a process comprising the step of asymmetric hydrolysis of the optical isomer mixture using an enzyme having the ability to asymmetrically hydrolyze a portion) or a culture of microorganisms having the ability to produce the enzyme or a processed product thereof; Method.
- R 3 is an optionally substituted hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms.
- R 3 is a cyclopentylmethyl group.
- R 1 is an acyl group having 1 to 10 carbon atoms.
- R 1 is a formyl group, an acetyl group, a propionyl group, or a benzoyl group.
- R 1 is a hydrogen atom.
- the enzyme is a hydrolase derived from a microorganism of Chromobacterium chocolatum or Mucor miehei, or one of the amino acids constituting the hydrolase Or the method according to any one of [1] to [9], wherein two are mutant enzymes in which deletion, addition or substitution is performed.
- An esterase or lipase derived from Chromobacterium SC-YM-1 strain Institute of Biotechnology, Industrial Technology Depository: FERM BP-6703
- an amino acid constituting the esterase or lipase The method according to any one of [1] to [9], wherein one or two of the above are mutant enzymes in which deletion, addition, or substitution is performed.
- R in formula (1) 1 Is a hydrogen atom, an acyl group having 1 to 10 carbon atoms, a carboxyl group (—COOH) or a carboxamide group (—CONH 2 ).
- the acyl group include a formyl group, an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, a valeryl group, a pivaloyl group, and a benzoyl group, which may be linear, branched, or cyclic.
- acyl groups may be an alkylcarbonyl group having a substituent or an arylcarbonyl group having a substituent.
- substituent include an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms and an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms.
- acyl group having the substituent examples include chloroacetyl group, dichloroacetyl group, methoxyacetyl group, 3-chloropropionyl group, toluoyl group, trifluoromethylbenzoyl group, chlorobenzoyl group, fluorobenzoyl group, methoxybenzoyl group, A cyanobenzoyl group, a nitrobenzoyl group, etc. are mentioned.
- R 1 From ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester derivatives in which is a hydrogen atom or a formyl group, such as optically active ⁇ -cyclopentylmethyl- ⁇ - (N-formyl-N-hydroxy) amino acid described in WO 00/61134
- the raw material for production of the base compound or the intermediate compound can be easily obtained.
- R in formula (1) 2 May have a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, an optionally substituted aryl group having 6 to 20 carbon atoms, or a substituent.
- 20 represents an aryloxycarbonyl group having 20 carbon atoms, an aralkyloxycarbonyl group having 8 to 20 carbon atoms which may have a substituent, or a cyclic ether group having 4 to 10 carbon atoms which may have a substituent.
- alkyl group examples include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a hexyl group, an octyl group, and a decyl group, and these may be linear, branched, or cyclic.
- the alkyl group is preferably a methyl group or a tert-butyl group.
- the aryl group include a phenyl group, a naphthyl group, an anthracenyl group, and a biphenyl group. Among these, a phenyl group is preferable.
- Examples of the aralkyl group include a benzyl group, a paramethoxybenzyl group, and a naphthylmethyl group. Among these, a benzyl group is preferable.
- Examples of the acyl group include an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, a valeryl group, a pivaloyl group, and a benzoyl group. Among these, an acetyl group and a pivaloyl group are preferable.
- alkoxycarbonyl group examples include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a propoxycarbonyl group, a butoxycarbonyl group, a hexyloxycarbonyl group, an octyloxycarbonyl group, and a decyloxycarbonyl group, which are linear or branched. Or any of cyclic
- the aryloxycarbonyl group examples include a phenoxycarbonyl group, a naphthyloxycarbonyl group, an anthracenyloxycarbonyl group, and a biphenyloxycarbonyl group.
- a phenoxycarbonyl group is preferable.
- the aralkyloxycarbonyl group include a benzyloxycarbonyl group and a naphthylmethoxycarbonyl group. Among these, a benzyloxycarbonyl group is preferable.
- the cyclic ether group is a group formed by removing one hydrogen atom from a cyclic ether compound, and the hydrogen atom removed from the cyclic ether compound is particularly preferably a hydrogen atom at the 2-position of the cyclic ether compound.
- cyclic ether groups are a tetrahydro-2H-pyran-2-yl group, a tetrahydrofuran-2-yl group, and a 1,4-dioxane-2-yl group.
- tetrahydro-2H-pyran A 2-yl group is preferred.
- these alkyl group, aryl group, aralkyl group, alkoxycarbonyl group, aryloxycarbonyl group, aralkyloxycarbonyl group and cyclic ether group may have a substituent.
- an alkoxy group having 5 to 7 carbon atoms, an aralkyloxy group having 7 to 11 carbon atoms, and a halogen atom may have a substituent.
- a group having an aromatic ring such as an aryl group, an aralkyl group, an aryloxycarbonyl group, and an aralkyloxycarbonyl group includes an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and a halogen atom. May be substituted as a substituent.
- R 2 Although specific examples have been described, among these, R 2 Is preferably an aralkyl group having 7 to 20 carbon atoms, more preferably a benzyl group or a paramethoxybenzyl group, and particularly preferably a benzyl group.
- R in the formula (1) 3 Is a hydrocarbon group having 1 to 20 carbon atoms, and the hydrocarbon group may be an aliphatic hydrocarbon group, an alicyclic hydrocarbon group, an aromatic hydrocarbon group, or a combination thereof.
- the hydrocarbon group has preferably 1 to 7 carbon atoms, and more preferably 3 to 6 carbon atoms.
- the aliphatic hydrocarbon group is typically an alkyl group, for example, methyl group, ethyl group, propyl group, butyl group, pentyl group, hexyl group, octyl group, decyl group, dodecyl group, tetradecyl group, hexadecyl group.
- Octadecyl group icosyl group and the like, which may be linear or branched.
- the alicyclic hydrocarbon group include a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cyclooctyl group, a cyclodecyl group, a norbornyl group, and an adamantyl group.
- the aromatic hydrocarbon group is typically an aryl group, and specific examples of the aryl group include R 2 The same as those exemplified for the aryl group.
- the hydrocarbon group may also have a substituent, and examples of the substituent include R 2 These are the same as those exemplified as the substituents such as alkyl groups and aryl groups.
- the hydrocarbon group which may have a substituent preferably has 1 to 10 carbon atoms, and more preferably 3 to 7 carbon atoms.
- R in formula (1) 3 As described above, a combination of an aliphatic hydrocarbon group and an alicyclic hydrocarbon group, a combination of an aliphatic hydrocarbon group and an aromatic hydrocarbon group, or a combination of an alicyclic hydrocarbon group and an aromatic hydrocarbon group It can be.
- a combination of an aliphatic hydrocarbon group and an alicyclic hydrocarbon group includes a combination of a cycloalkyl group and an alkanediyl group.
- the combination of the aliphatic hydrocarbon group and the aromatic hydrocarbon group is typically an aralkyl group, and examples thereof include a benzyl group and a naphthylmethyl group.
- Examples of the combination of the alicyclic hydrocarbon group and the aromatic hydrocarbon group include a phenylcyclopentyl group, a phenylcyclohexyl group, a naphthylcyclopentyl group, and a naphthylcyclohexyl group.
- R 3 Is preferably a combination of an aliphatic hydrocarbon group and an alicyclic hydrocarbon group, more preferably a cyclopentylmethyl group or a cyclohexylmethyl group, and particularly preferably a cyclopentylmethyl group.
- R in formula (1) 4 Is an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a substituent, and the alkyl group may be linear or branched.
- specific examples of the alkyl group include those having 1 to 10 carbon atoms, R 3 This is the same as described for the alkyl group.
- R 4 The alkyl group is more preferably 1 to 4 carbon atoms, particularly preferably a methyl group or an ethyl group.
- R 4 Is optionally substituted by R 3 Are the same as those exemplified as the optional substituent.
- X in Formula (1) represents an oxygen atom or a sulfur atom, and is preferably an oxygen atom.
- R in formula (1) specific examples of suitable ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1) are represented by R in formula (1). 1 ⁇ R 4 The combinations are shown in Table 1.
- ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid esters listed in Table 1 (1-1), (1-2), (1-9), (1-10), (1-17), (1-18) ), (1-25), (1-26), (1-33), (1-34) are preferred, and (1-9), (1-10), (1-17), (1-18) ), (1-25), (1-26) are particularly preferred, and X is more preferably an oxygen atom.
- the optical isomer mixture of ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1) can be obtained by a known production method. For example, this production method is described in pages 196 to 205 of ARKICOV 2010 (iX).
- the optical isomer mixture of ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1) used in this production method may be a racemate, or an isomer mixture containing one optical isomer in excess. Good. These racemates and isomer mixtures may be newly prepared, or may be isomer mixtures prepared by optical resolution of the racemate and containing either optical isomer in excess.
- Ester moiety (-CO of the optical isomer mixture of ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1) 2 R 4 As an enzyme having the ability to asymmetrically hydrolyze a group), a hydrolase derived from a microorganism of the genus Chromobacterium or Mucor, more preferably, a chromobacterium chocolatatum ( Mention may be made of hydrolytic enzymes originating from microorganisms of Chromobacterium chocolatum) or Mucor miehei.
- Chromobacterium SC-YM-1 strain As an enzyme having the ability to asymmetrically hydrolyze the ester moiety of the optical isomer mixture of ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1), more specifically, Chromobacterium SC-YM-1 strain (Institute of Industrial Technology) Examples include esterase or lipase derived from Biotechnology Research Institute deposit number FERM BP-6703), or commercially available enzymes such as Kirazayme L-9 [derived from Mucor miehei, CHIRAZYME L-9 (trade name)].
- an enzyme having the ability to asymmetrically hydrolyze the ester moiety of the optical isomer mixture of these ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid esters (1) (hereinafter sometimes referred to as “the present enzyme”) is suddenly introduced from these microorganisms. Enzymes produced by recombinant microorganisms that have been introduced with a gene encoding the enzyme of these microorganisms, even if they are enzymes derived from mutants or mutants induced by treatment with ultraviolet radiation, etc.
- it may be a mutant enzyme in which one or two specific amino acids in the amino acid sequence of the enzyme are deleted, added or substituted by genetic engineering techniques, and ⁇ -substitution It can be used in the production method of the present invention as long as it has the ability to selectively hydrolyze the ester moiety of the optical isomer mixture of - ⁇ -amino acid ester (1).
- a method for producing a recombinant microorganism into which a gene encoding this enzyme has been introduced and transformed for example, J. Org. Sambrook, E .; F. Fritsch, T .; Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, published by Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, etc., and a method according to the usual genetic engineering method can be mentioned.
- a method according to the method described in Japanese Patent No. 3875283 can be mentioned.
- an esterase derived from Chromobacterium SC-YM-1 strain (FERM BP-6703) (Japanese Patent No. 3875283)
- Examples of a method for producing a mutant enzyme by a genetic engineering technique include the method of Oldtland et al. (Gene 96 125-128 1990). More specifically, the method according to the method of Unexamined-Japanese-Patent No. 2000-78988 or Japanese Patent No. 3486942 can be mentioned.
- mutant enzymes that can be prepared in this way include mutant esterases or lipases prepared from esterases derived from Chromobacterium SC-YM-1.
- This enzyme used in this production method is a mutant enzyme in which one or two amino acids constituting a hydrolase originating from a microorganism belonging to the genus Chromobacterium are deleted, added or substituted. May be.
- a genetic technique specifically, a site-directed mutagenesis technique of a gene is used.
- any of the following (a), (b), (c), (d), (e) or (f) An enzyme having an amino acid sequence encoded by DNA can be mentioned.
- A The base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- B In the amino acid sequence written together with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, the 160th amino acid is substituted with an amino acid selected from the following group A, and the 189th amino acid is replaced with an amino acid selected from the following group B A nucleotide sequence that encodes a substituted amino acid sequence.
- a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of. (Group A) Alanine, valine, leucine, isoleucine and serine
- Group B Alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, Phenylalanine, histidine, tyrosine and arginine
- D An amino acid sequence in which the 325th amino acid is substituted with isoleucine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
- More preferable examples of the above-mentioned enzyme derived from Chromobacterium SC-YM-1 include esterase 160A189Y363term derived from Chromobacterium SC-YM-1, strain ester 160S189F363term derived from Chromobacterium SC-YM-1, strain Chromobacterium SC- Esterase 160A189F363term derived from YM-1 strain, esterase V325I derived from Chromobacterium SC-YM-1 strain, esterase T240AV288A derived from Chromobacterium SC-YM-1 strain, esterase N43SA363term derived from Chromobacterium SC-YM-1 strain Can be mentioned. The site-directed mutagenesis technique will be briefly described.
- a gene encoding a mutant enzyme (hereinafter sometimes referred to as “gene 1”) is obtained.
- gene 1 a wild-type gene encoding a hydrolase originating from a microorganism belonging to the genus Chromobacterium (hereinafter sometimes referred to as “wild-type gene 1”) may be obtained.
- wild-type gene 1 examples include J. Sambrook, E .; F. Fritsch, T.W. According to Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, published by Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, etc., in accordance with the usual genetic engineering methods described in, for example, chromobacterium SC-YM -1 stock.
- Chromobacterium SC-YM-1 strain is cultured using, for example, LB medium (1.0% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl), and the resulting bacterial cells are subjected to ultrasonic waves. After disruption by a method such as crushing and protease treatment, genomic DNA is extracted. The obtained genomic DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and inserted into ⁇ gt11, which is a phage vector, or pUC19, which is a plasmid vector, using a ligase to prepare a genomic DNA library.
- ⁇ gt11 which is a phage vector
- pUC19 which is a plasmid vector
- Gene 1 can be prepared by introducing a site-specific mutation into wild-type gene 1. Examples of site-directed mutagenesis methods include, for example, Oldtland et al. (Gene 96 125-128 1990), Smith et al. (Genetic Engineering 31 Setlow, J. and Hollaender, A Plenum: New York), Vlask et al. Inouye, M .: Academic Press, New York), Hos. N.
- Examples include the method proposed by Hunt et al. (Gene 77 51 1989). For example, an amino acid in which a specific amino acid is substituted with another amino acid in the amino acid sequence of a hydrolase derived from a microorganism of the genus Chromobacterium, using the method of Oldtland et al. (Gene 96 125-128 1990) In order to prepare the gene 1 encoding the sequence, first, a plasmid DNA into which the wild type gene 1 has been incorporated is prepared by, for example, J. Org. Sambrook, E .; F. Fritsch, T.W.
- PCR reaction conditions are, for example, 20 cycles of heat treatment at 94 ° C. for 5 minutes, followed by heat treatment at 94 ° C. for 1 minute, then 50 ° C. for 2 minutes, and further at 75 ° C. for 3 minutes.
- a mutant enzyme can be produced and obtained in accordance with a normal genetic engineering method. Specifically, for example, a plasmid capable of expressing gene 1 in a host microorganism cell is prepared, introduced into the host microorganism cell, the host microorganism cell is transformed, and the transformant microorganism is cultured. That's fine.
- a plasmid in which gene 1 is introduced into an expression vector which can be replicated in a host microbial cell can be easily isolated and purified from the host, and has a promoter and a detectable marker.
- the expression vector various commercially available vectors can be used.
- an expression vector containing a promoter such as lac, trp, tac (available from Pharmacia Biotech) can be used.
- the host microbial cell either eukaryotic organisms or prokaryotic organisms can be used, and examples thereof include Escherichia coli.
- the host microbial cell can be transformed by introducing the plasmid into the host microbial cell by a conventional genetic engineering method. Cultivation of a microorganism having a plasmid containing gene 1 thus obtained can be performed by a usual method. For example, when the host microbial cell is Escherichia coli, culturing is performed in a medium appropriately containing an appropriate carbon source, nitrogen source, and micronutrients such as vitamins. As the culture method, either solid culture or liquid culture is possible, but an aeration and agitation culture method is preferable.
- Examples of the method for collecting the mutant enzyme from the cultured cells include the usual methods for isolating and purifying proteins, that is, the methods exemplified above for the method for purifying enzymes from the culture solution.
- the 160th amino acid is substituted with an amino acid selected from Group A above in the amino acid sequence shown in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the 189th amino acid is substituted with an amino acid other than glycine.
- a mutation primer may be prepared and amplified by the PCR method.
- a site-specific mutation may be introduced simultaneously into the 160th and 189th amino acids in the amino acid sequence shown together with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
- a mutant primer in which the 288th amino acid is substituted with alanine, or a mutant primer in which the 43rd amino acid is substituted with serine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be prepared and amplified by PCR. .
- hydrolase originating from a microorganism belonging to the genus Mucor will be described.
- hydrolases originating from the microorganism of the genus Mucor hydrolases originating from the Mucor miehei microorganism are preferred.
- a commercially available enzyme can also be used as a hydrolase derived from the microorganism of Mucor miehei. Examples of such commercially available enzymes include CHIRAZYME L-9 (manufactured by Roche Diagnostics). Since a commercially available enzyme is easily available, it is preferable at the point which can implement this manufacturing method more simply.
- a mutant enzyme in which one or two of the amino acids constituting the hydrolase is deleted, added or substituted is prepared. Then, the mutant enzyme can be used in the production method.
- the site-specific mutagenesis technique described as a method for preparing a mutant enzyme from a hydrolase originating from a microorganism belonging to the genus Chromobacterium can be used. Any microorganism producing this enzyme can be liquid-cultured by a conventional method.
- the medium various mediums appropriately containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and the like used for normal microorganism culture can be used.
- a carbon source glucose, glycerin, starch, dextrin, organic acid, molasses, etc.
- a nitrogen source fats and oils, polypeptone, yeast extract, meat extract, malt extract, soy flour, corn steep liquor, cottonseed flour , Dry yeast, casamino acid, ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium sulfate, urea, etc., inorganic substances such as potassium, sodium, magnesium, calcium, iron, manganese, cobalt, zinc, copper, etc., sulfates, acetates, carbonates And phosphates, specifically potassium chloride, sodium chloride, magnesium sulfate, ferrous sulfate, manganese sulfate, cobalt chloride, zinc sulfate, copper sulfate, sodium acetate, calcium carbonate, sodium carbonate, potassium phosphate, phosphorus Monopotassium hydrogen hydrogen, dipotassium hydrogen phosphate,
- triglyceride such as olive oil or tributyrin or ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1) is appropriately added to the medium.
- the culture is preferably performed aerobically, and shaking culture or aeration-agitation culture is suitable.
- the culture temperature is usually 20 to 40 ° C., preferably 25 to 35 ° C., and the pH is preferably 6 to 8.
- the culture time varies depending on various conditions, but is preferably 1 to 7 days.
- a solid culture method can be appropriately employed if necessary as long as it is a method capable of obtaining a microbial cell having asymmetric water-dissolving ability of the ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1).
- a method generally used for purification of general enzymes For example, the cells in the microorganism culture are first crushed by a method such as ultrasonic treatment, dynomill treatment or French press treatment.
- cation exchange column chromatography After removing insolubles from the obtained crushed liquid by centrifugation, etc., cation exchange column chromatography, anion exchange column chromatography, hydrophobic column chromatography, gel filtration column chromatography, etc., which are usually used for enzyme purification, etc.
- the target enzyme can be purified by appropriately combining one or more of these.
- carriers used in these column chromatography include DEAE-Sepharose fastflow (Amersham Pharmacia Biotech) and Butyl-Toyopearl 650S (Toyo Soda Kogyo Co., Ltd.). This enzyme can be used in various forms such as purified enzyme, crude enzyme, microbial culture, microbial cell, and processed product thereof.
- the treated product is, for example, freeze-dried microbial cells, acetone-dried microbial cells, pulverized microbial cells, self-digested microbial cells, sonicated microbial cells, microbial cell extracts, or alkaline treatment of microbial cells. It refers to things.
- the enzyme having various purity or forms as described above can be adsorbed onto an inorganic carrier such as silica gel or ceramics, cellulose, ion exchange resin, polyacrylamide method, sulfur-containing polysaccharide gel method (for example, carrageenan gel method). ), An alginate gel method, an agar gel method, or the like, may be used by immobilization.
- an enzyme selected from the group consisting of the hydrolase and its mutant enzyme, a culture of microorganisms having the ability to produce the enzyme, or a processed product thereof (hereinafter referred to as enzyme, culture solution and processed product as a whole)
- the present production method using “the present enzyme”) will be described.
- the amount of the enzyme used is appropriately selected so that the reaction time is not delayed and the selectivity of asymmetric hydrolysis is not lowered.
- the amount used is the amount of the enzyme contained in the present enzyme or the like in the optical isomer mixture of ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1).
- the amount used is the enzyme, etc.
- the weight of the enzyme contained therein it is usually 0.01 to 200 times by weight, preferably 0.1 to 50 times by weight, with respect to the optical isomer mixture of ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1).
- the water used for the asymmetric hydrolysis reaction may be a buffered aqueous solution.
- buffer aqueous solutions include inorganic acid buffer aqueous solutions such as sodium phosphate aqueous solution and potassium phosphate aqueous solution, and organic acid salts such as alkali metal acetate such as sodium acetate aqueous solution and potassium acetate aqueous solution. And buffered aqueous solutions.
- the amount of such water or aqueous buffer solution used may be usually 0.5 times or more by weight with respect to the weight of the optical isomer mixture of ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1), and in some cases, the amount of solvent used. However, it is usually 200 weight times or less.
- the asymmetric hydrolysis reaction may be performed in an organic solvent such as a hydrophobic organic solvent or a hydrophilic organic solvent.
- organic solvent such as a hydrophobic organic solvent or a hydrophilic organic solvent.
- hydrophobic organic solvent include ethers such as tert-butyl methyl ether and isopropyl ether, hydrocarbons such as toluene, hexane, cyclohexane, heptane, octane, and isooctane.
- hydrophilic organic solvent include tert-butyl ether.
- Alcohols such as butyl alcohol, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, isobutyl alcohol, n-butyl alcohol, ethers such as tetrahydrofuran, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ketones such as acetone, nitriles such as acetonitrile, N, N-dimethylformamide, etc. Examples include amides.
- These hydrophobic organic solvents and hydrophilic organic solvents are used singly or in combination of two or more, and a hydrophobic organic solvent and a hydrophilic organic solvent may be used in combination.
- water or a buffered aqueous solution, a hydrophobic organic solvent, and a hydrophilic organic solvent may be mixed and used.
- the amount used is usually 200 times or less, preferably 0.1 to 100 times the weight of the optical isomer mixture of ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1). It is.
- the asymmetric hydrolysis reaction is performed by, for example, a method of mixing water, an optical isomer mixture of ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1), the present enzyme, and the like.
- the organic solvent, ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1) optical isomer mixture and the present enzyme may be mixed.
- the pH of the reaction system is appropriately selected so that asymmetric hydrolysis by the present enzyme or the like proceeds with good selectivity, and is not particularly limited, but is usually in the range of pH 4 to 10, preferably pH 6 to 8.
- the pH may be adjusted within a suitably selected range by adding an acid or a base.
- acids include hydrogen chloride, hydrogen bromide, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid and salts thereof, organic acids such as acetic acid, citric acid, and methanesulfonic acid, and salts thereof.
- bases include hydroxylation.
- Alkali metal hydroxides such as sodium and potassium hydroxide, alkali metal and alkaline earth metal carbonates such as sodium carbonate, potassium carbonate and calcium carbonate, alkali metal bicarbonates such as sodium hydrogen carbonate and potassium hydrogen carbonate, phosphorus Phosphate such as sodium dihydrogen acid, disodium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, diethylamine, diisopropylethylamine, triethylamine, cyclohexylamine, benzylamine, phenethylamine, organic bases such as pyridine, ammonia Is used. These bases may be used alone or in combination of two or more.
- Such an acid or base is usually used as an aqueous solution, but when an organic solvent is used in the reaction, it may be used as an organic solvent or a mixed solution of an organic solvent and water. The same organic solvent as that used in the reaction can be used. Moreover, you may replace the water which melt
- the reaction temperature is appropriately selected at a temperature at which asymmetric hydrolysis by the present enzyme or the like proceeds with good selectivity, and is not particularly limited, but if it is too high, the stability of the present enzyme in the present enzyme tends to decrease, If it is too low, the reaction rate tends to decrease. On the other hand, the selectivity tends to improve as the temperature decreases.
- the reaction temperature is usually in the range of ⁇ 10 to 65 ° C., preferably in the range of ⁇ 5 to 50 ° C.
- the reaction time is usually selected from the range of 1 to 100 hours, preferably from the range of 1 to 50 hours.
- the reaction solution in the reaction system of this production method is appropriately sampled, and the degree of disappearance of the ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1) or the ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid (by an appropriate analytical means such as HPLC or GC (The reaction time can also be determined by determining the degree of generation of 2).
- an appropriate analytical means such as HPLC or GC
- the reaction time can also be determined by determining the degree of generation of 2 2).
- a solution of optically active ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid (2) is obtained, but usually further post-treatment operation is performed to separate it from the enzyme or buffer used in the reaction or carboxylic acid generated by the hydrolysis reaction. Do.
- the solvent in the reaction solution is distilled off, then silica gel chromatography is used to separate and purify the ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid (2).
- the solvent is distilled off and then distilled.
- a method for separating and purifying ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid (2) by separation a method for separating and purifying ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid (2) by a liquid separation operation, and the like.
- ⁇ -substituted ⁇ -amino acid (2) When the ⁇ -substituted ⁇ -amino acid (2) is separated and purified by a liquid separation operation, when an organic solvent that is soluble in both water and a hydrophobic organic solvent is used during the reaction, this is removed by distillation. It may be used. Moreover, when an insoluble enzyme or an immobilization carrier is present in the solution, these may be removed by filtration. In the reaction solution after completion of the reaction of this production method, ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid (2) which is a product of the asymmetric hydrolysis reaction and remaining ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1) are present. included.
- an extraction operation with water / hydrophobic organic solvent is performed, and the remaining ⁇ -substituted ⁇ -amino acid ester (1) is added to the organic layer (hydrophobic organic solvent layer) and ⁇ -substituted-
- a method is adopted in which the ⁇ -amino acid (2) is distributed to each aqueous layer, and the organic layer and the aqueous layer are separated.
- the organic layer is optically active ⁇ -substituted using a hydrophobic organic solvent.
- the ⁇ -amino acid (2) may be extracted and separated from the aqueous layer.
- the hydrophobic organic solvent include ethers such as tert-butyl methyl ether and isopropyl ether; hydrocarbons such as toluene, hexane, cyclohexane, heptane, octane and isooctane; halogens such as dichloromethane, dichloroethane, chloroform, chlorobenzene and orthodichlorobenzene. Hydrocarbons; esters such as ethyl acetate, methyl acetate, and butyl acetate.
- the separation operation can be performed as it is when the reaction liquid after completion of the reaction is separated into an organic layer and an aqueous layer. Also, when a hydrophobic organic solvent is not used during the reaction, or when the reaction solution is not easily separated into an organic layer and an aqueous layer due to the small amount of the hydrophobic organic solvent or water used, If separation is not easy because the amount used is small, separation may be performed after adding a hydrophobic organic solvent or water as appropriate.
- the amount of the hydrophobic organic solvent used is not particularly limited, but is usually 0.1 to 200 times by weight based on the weight of the optical isomer of ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1), preferably 0.2 to 100 times by weight.
- the pH at the time of extraction of the target product is usually in the range of 2 to 10, preferably in the range of 4 to 8.
- an acid or a base can also be used suitably. Specific examples of the acid or base used here are the same as those exemplified for adjusting the pH of the reaction system of this production method.
- the same extraction and liquid separation operation may be repeated a plurality of times.
- the same extraction and liquid separation operations may be repeated a plurality of times.
- the residual ester separated from the carboxylic acid which is an asymmetric hydrolyzate by the above extraction can be isolated by distilling off the organic solvent in the oil layer.
- the obtained optically active ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1) can be reused as a mixture of optical isomers of ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1) by subjecting it to a racemization treatment. .
- the unreacted ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1) isolated by distilling off the organic solvent in the oil layer may be further purified by column chromatography or the like.
- the optically active ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid (2) which is an asymmetric hydrolyzate, is contained in the aqueous layer after the liquid separation. It can be easily removed from the aqueous layer by extraction with an organic solvent after the sum treatment.
- the separated optically active ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid (2) can be isolated by distilling off the organic solvent in the oil layer.
- the optically active ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid (2) thus obtained may be further purified by a purification operation such as column chromatography, recrystallization, reprecipitation or the like.
- a purification operation such as column chromatography, recrystallization, reprecipitation or the like.
- the optically active ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid (2) is further salted with a suitable base, and then the salt is purified by recrystallization or reprecipitation.
- the obtained salt can be converted back to the optically active ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid (2) by an appropriate method.
- Specific examples of the optically active ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid (2) thus obtained are represented by R in the formula (2).
- ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid (2) in R form was obtained using an enzyme having the ability to selectively hydrolyze the ester part of R form in ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1).
- the S-form ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid ester (1) is obtained, which is separated from the R-form ⁇ -substituted- ⁇ -amino acid (2) by the above-described extraction, liquid separation operation, and isolated. can do.
- the tert-butyl methyl ether layer was analyzed for optical purity by high performance liquid chromatography [column: CHIRALPAK AD-H, 4.6 mm ⁇ ⁇ 25 cm, 5 ⁇ m (manufactured by Daicel Chemical Industries)].
- the chemical purity was analyzed by chromatography [column: Cadenza CD-18, 4.6 mm ⁇ ⁇ 15 cm, 3 ⁇ m (manufactured by Imtakt)], and the obtained optically active 2-cyclopentylmethyl-3-[(N-benzyloxy
- the conversion rate and enantiomeric excess of -N-formyl) amino] propanoic acid were determined. The results are shown in Table 4.
- Example 17 Production of optically active 2-cyclopentylmethyl-3-[(N-benzyloxy-N-formyl) amino] propanoic acid (2-5) 50.3 g of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) was placed in a container. To the mixture, 400.0 mg of a mixture of optical isomers of 2-cyclopentylmethyl-3-[(N-benzyloxy-N-formyl) amino] propanoic acid methyl ester (racemic), tert-butyl methyl ether; 4 g of an alkali-treated product of an Escherichia coli recombinant producing esterase N43SA363term derived from Chromobacterium SC-YM-1 strain was added.
- the aqueous layer was extracted twice with 8.0 g of tert-butyl methyl ether and subjected to a liquid separation operation. After removing the aqueous layer, the aqueous layer was combined with the previously obtained oil layer. The obtained mixed solution was filtered through Celite, washed twice with 2.0 g of tert-butyl methyl ether, and then separated into an oil layer and an aqueous layer by liquid separation. To the oil layer, 250.5 mg of diisopropylethylamine and 4.0 g of water were added and separated into an oil layer and an aqueous layer by liquid separation.
- Example 18 Production of optically active 2-cyclopentylmethyl-3-[(N-benzyloxy-N-formyl) amino] propanoic acid (2-5) 50.2 g of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) was placed in a container.
- the aqueous layer was combined with the previously obtained oil layer.
- the obtained mixed solution was filtered through Celite, washed twice with 2.0 g of tert-butyl methyl ether, and then separated into an oil layer and an aqueous layer by liquid separation.
- 4.0 g of 1N sodium hydroxide aqueous solution was added to the oil layer, and the oil layer and the aqueous layer were separated by liquid separation.
- the aqueous layer was washed with 4.0 g of tert-butyl methyl ether, and the oil layer was removed.
- the obtained oil was analyzed in the same manner as in Example 1, and the yield and mirror image of the obtained (R) -2-cyclopentylmethyl-3-[(N-benzyloxy-N-formyl) amino] propanoic acid.
- the yield was 35.8% and the enantiomer excess was 95.2% ee.
- Example 19 Process for producing optically active 2-cyclopentylmethyl-3-[(N-benzyloxy-N-formyl) amino] propanoic acid (2-5) 2-cyclopentylmethyl-3-[(N-benzyloxy-N-formyl) Amino] propanoic acid ethyl ester optical isomer mixture (racemic) (3.0 g) was weighed into a container, and 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.5) 14.2 g, Chromobacterium SC-YM 0.75 g of an Escherichia coli recombinant that produces esterase N43SA363term derived from -1 strain was added and stirred at 25 ° C.
- reaction solution was adjusted to pH 5.0 by adding 2.3 g of 85% phosphoric acid aqueous solution.
- 12.0 g of tert-butyl methyl ether was added and separated into an oil layer and an aqueous layer by liquid separation.
- the aqueous layer was extracted twice with 12.0 g of tert-butyl methyl ether and subjected to a liquid separation operation. After removing the aqueous layer, the aqueous layer was combined with the previously obtained oil layer.
- the obtained mixed solution was filtered through Celite, washed twice with 1.5 g of tert-butyl methyl ether, and then separated into an oil layer and an aqueous layer by liquid separation.
- To the oil layer 1.74 g of diisopropylethylamine and 15.0 g of water were added and separated into an oil layer and an aqueous layer by liquid separation.
- 6.0 g of water was added to the oil layer for extraction, and after removing the oil layer, the oil layer was combined with the previously obtained water layer.
- 0.4 g of 35% hydrochloric acid and 9.0 g of tert-butyl methyl ether were added and separated into an oil layer and an aqueous layer by liquid separation.
- Example 20 Method for producing optically active 2-cyclopentylmethyl-3-[(N-benzyloxy) amino] propanoic acid (2-1) 21.0 g of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) is weighed in a container. Thereto, 300.0 mg of a mixture of optical isomers (racemic) of 2-cyclopentylmethyl-3-[(N-benzyloxy) amino] propanoic acid ethyl ester, esterase N43SA363term derived from Chromobacterium SC-YM-1 strain 75.0 mg of an Escherichia coli recombinant to be produced was treated with alkali. The solution was stirred at 25 ° C.
- the production method of the present invention is useful for the production of a raw material for producing a drug substance compound or an intermediate compound.
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Abstract
式（２）で示される光学活性なα－置換－β－アミノ酸の製造方法であり、式（１）で示されるα－置換－β－アミノ酸エステルの光学異性体混合物のエステル部位を不斉加水分解する能力を有する酵素などを用いて、前記光学異性体混合物を不斉加水分解する工程を含む製造方法を提供する。（式中、Ｒ１はアシル基、カルボキシル基又はカルボキサミド基；Ｒ２はアルキル基、アリール基、アラルキル基、環状エーテル基などを示す。Ｒ３は置換基を有していてもよい炭素数１～２０の炭化水素基を示す。Ｒ４はアルキル基を示す。Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を示す。＊は不斉中心を示す。）
Description
本発明は、光学活性なα−置換−β−アミノ酸の製造方法に関する。
式（２）
（式中、Ｒ１は水素原子、炭素数１~１０のアシル基、カルボキシル基又はカルボキサミド基を示す。Ｒ２は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１~１０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数６~２０のアリール基、置換基を有していてもよい炭素数７~２０のアラルキル基、又は炭素数２~２０のアシル基、置換基を有していてもよい炭素数２~１５のアルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよい炭素数７~２０のアリールオキシカルボニル基、置換基を有していてもよい炭素数８~２０のアラルキルオキシカルボニル基又は置換基を有していてもよい炭素数４~１０の環状エーテル基を示す。Ｒ３は置換基を有していてもよい炭素数１~２０の炭化水素基を示す。Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を示す。＊は不斉中心を示す。）
で示される光学活性なα−置換−β−アミノ酸は、医薬原体化合物を製造するための製造用原料又は中間体化合物として有用である。
例えば、ＷＯ ００／６１１３４には、抗菌剤の製造用原料である光学活性なα−シクロペンチルメチル−β−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシ）アミノ酸の製造方法が記載されている。
で示される光学活性なα−置換−β−アミノ酸は、医薬原体化合物を製造するための製造用原料又は中間体化合物として有用である。
例えば、ＷＯ ００／６１１３４には、抗菌剤の製造用原料である光学活性なα−シクロペンチルメチル−β−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシ）アミノ酸の製造方法が記載されている。
本発明は、前記式（２）で示される光学活性なα−置換−β−アミノ酸の新規な製造方法を提供する。
即ち、本発明は以下の〔１〕~〔１２〕の発明を含む。
〔１〕式（２）で示される光学活性なα−置換−β−アミノ酸（以下、場合により「光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）」という）の製造方法であり、
式（１）
（式中、Ｒ４は置換基を有していてもよい炭素数１~１０のアルキル基を示す。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＸは上記と同じ意味である。）
で示されるα−置換−β−アミノ酸エステル（以下、場合により「α−置換−β−アミノ酸エステル（１）」という）の光学異性体混合物の−ＣＯ２Ｒ４基（以下、場合により「エステル部位」という）を不斉加水分解する能力を有する酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いて、前記光学異性体混合物を不斉加水分解する工程を含む製造方法。
〔２〕Ｒ３が置換基を有していてもよい炭素数１~１０の炭化水素基である〔１〕記載の方法。
〔３〕Ｒ３がシクロペンチルメチル基である〔１〕記載の方法。
〔４〕Ｒ１が炭素数１~１０のアシル基である〔１〕~〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕Ｒ１がホルミル基、アセチル基、プロピオニル基又はベンゾイル基である〔１〕~〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕Ｒ１が水素原子である〔１〕~〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕Ｒ２が炭素数７~２０のアラルキル基である〔１〕~〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕Ｒ２がベンジル基である〔１〕~〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕Ｒ４がメチル基又はエチル基である〔１〕~〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕酵素が、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物を起源とする加水分解酵素、或いは、該加水分解酵素を構成するアミノ酸のうちの１個ないしは２個が、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素である〔１〕~〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕酵素が、クロモバクテリウム・チョコレータム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｏｃｏｌａｔｕｍ）、又はムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）の微生物を起源とする加水分解酵素、或いは、該加水分解酵素を構成するアミノ酸のうちの１個ないしは２個が、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素であるである〔１〕~〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕酵素が、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（工業技術院 生命工学技術研究所 寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼ又はリパーゼ、或いは、該エステラーゼ又はリパーゼを構成するアミノ酸のうちの１個ないしは２個が、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素である〔１〕~〔９〕のいずれかに記載の方法。
即ち、本発明は以下の〔１〕~〔１２〕の発明を含む。
〔１〕式（２）で示される光学活性なα−置換−β−アミノ酸（以下、場合により「光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）」という）の製造方法であり、
式（１）
で示されるα−置換−β−アミノ酸エステル（以下、場合により「α−置換−β−アミノ酸エステル（１）」という）の光学異性体混合物の−ＣＯ２Ｒ４基（以下、場合により「エステル部位」という）を不斉加水分解する能力を有する酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いて、前記光学異性体混合物を不斉加水分解する工程を含む製造方法。
〔２〕Ｒ３が置換基を有していてもよい炭素数１~１０の炭化水素基である〔１〕記載の方法。
〔３〕Ｒ３がシクロペンチルメチル基である〔１〕記載の方法。
〔４〕Ｒ１が炭素数１~１０のアシル基である〔１〕~〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕Ｒ１がホルミル基、アセチル基、プロピオニル基又はベンゾイル基である〔１〕~〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕Ｒ１が水素原子である〔１〕~〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕Ｒ２が炭素数７~２０のアラルキル基である〔１〕~〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕Ｒ２がベンジル基である〔１〕~〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕Ｒ４がメチル基又はエチル基である〔１〕~〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕酵素が、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物を起源とする加水分解酵素、或いは、該加水分解酵素を構成するアミノ酸のうちの１個ないしは２個が、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素である〔１〕~〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕酵素が、クロモバクテリウム・チョコレータム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｏｃｏｌａｔｕｍ）、又はムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）の微生物を起源とする加水分解酵素、或いは、該加水分解酵素を構成するアミノ酸のうちの１個ないしは２個が、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素であるである〔１〕~〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕酵素が、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（工業技術院 生命工学技術研究所 寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼ又はリパーゼ、或いは、該エステラーゼ又はリパーゼを構成するアミノ酸のうちの１個ないしは２個が、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素である〔１〕~〔９〕のいずれかに記載の方法。
以下、本発明の製造方法を詳細に説明する。
まず、本製造方法は、前記α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物を用いる。
式（１）におけるＲ１は、水素原子、炭素数１~１０のアシル基、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）又はカルボキサミド基（−ＣＯＮＨ２）を示す。該アシル基としては例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ピバロイル基及びベンゾイル基が挙げられ、これらは直鎖、分岐鎖及び環状のいずれでもよい。これらの中でも水素原子、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基及びベンゾイル基が好ましく、ホルミル基、アセチル基及びプロピオニル基が特に好ましい。また、これらアシル基は置換基を有するアルキルカルボニル基又は置換基を有するアリールカルボニル基であってもよく、該置換基としては、炭素数１~５のアルキル基、炭素数１~５のアルコキシ基、炭素数７~９のアラルキルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基などが挙げられる。該置換基を有するアシル基としては例えば、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、メトキシアセチル基、３−クロロプロピオニル基、トルオイル基、トリフルオロメチルベンゾイル基、クロロベンゾイル基、フルオロベンゾイル基、メトキシベンゾイル基、シアノベンゾイル基、ニトロベンゾイル基などが挙げられる。Ｒ１が水素原子又はホルミル基であるα−置換−β−アミノ酸エステル誘導体からは、ＷＯ ００／６１１３４記載の光学活性なα−シクロペンチルメチル−β−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシ）アミノ酸のような医薬原体化合物の製造用原料又は中間体化合物を容易に得ることができる。
式（１）におけるＲ２は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１~１０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数６~２０のアリール基、置換基を有していてもよい炭素数７~２０のアラルキル基、炭素数２~２０のアシル基、置換基を有していてもよい炭素数２~１５のアルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよい炭素数７~２０のアリールオキシカルボニル基、置換基を有していてもよい炭素数８~２０のアラルキルオキシカルボニル基、または置換基を有していてもよい炭素数４~１０の環状エーテル基を示す。
該アルキル基としては例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基、オクチル基及びデシル基などが挙げられ、これらは直鎖、分岐鎖又は環状のいずれでもよい。これらの中でも、該アルキル基は、メチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が好ましい。
該アリール基としては例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基及びビフェニル基などが挙げられ、これらの中でも、フェニル基が好ましい。
該アラルキル基としては例えば、ベンジル基、パラメトキシベンジル基及びナフチルメチル基などが挙げられ、これらの中でも、ベンジル基が好ましい。
該アシル基としては例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ピバロイル基及びベンゾイル基などが挙げられ、これらの中でも、アセチル基及びピバロイル基が好ましい。
該アルコキシカルボニル基としては例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、ヘキシルオキシカルボニル基、オクチルオキシカルボニル基及びデシルオキシカルボニル基などが挙げられ、これらは直鎖、分岐鎖又は環状のいずれでもよい。これらの中でも、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基が好ましい。
該アリールオキシカルボニル基としては例えば、フェノキシカルボニル基、ナフチルオキシカルボニル基、アントラセニルオキシカルボニル基及びビフェニルオキシカルボニル基などが挙げられ、これらの中でも、フェノキシカルボニル基が好ましい。
該アラルキルオキシカルボニル基としては例えば、ベンジルオキシカルボニル基、ナフチルメトキシカルボニル基などが挙げられ、これらの中でも、ベンジルオキシカルボニル基が好ましい。
該環状エーテル基は環状エーテル化合物から水素原子を１個取り去ってなる基であり、環状エーテル化合物から取り去る水素原子は、環状エーテル化合物の２位にある水素原子が特に好ましい。かかる環状エーテル基の具体例は、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル基、テトラヒドロフラン−２−イル基及び１，４−ジオキサン−２−イル基であるが、これらの中でも、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル基が好ましい。
また、これらアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基及び環状エーテル基は置換基を有していてもよく、該置換基としては、炭素数１~５のアルコキシ基、炭素数７~１１のアラルキルオキシ基、ハロゲン原子などが挙げられる。また、アリール基、アラルキル基、アリールオキシカルボニル基及びアラルキルオキシカルボニル基などの芳香環を有する基は、その芳香環に炭素数１~５のアルキル基、炭素数１~５のアルコキシ基、ハロゲン原子を置換基として有することもある。
以上、Ｒ２について、その具体例を挙げて説明したが、これらの中でも、Ｒ２は炭素数７~２０のアラルキル基であると好ましく、ベンジル基又はパラメトキシベンジル基であると一層好ましく、ベンジル基であると特に好ましい。
前記式（１）におけるＲ３は、炭素数１~２０の炭化水素基であり、該炭化水素基は、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基又は芳香族炭化水素基、或いはそれらの組み合わせのいずれでもよい。Ｒ３の炭化水素基はその炭素数が１~７であると好ましく、３~６であるとより好ましい。該脂肪族炭化水素基は典型的にはアルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基及びイコシル基などが挙げられ、これらは直鎖でも分岐鎖でもよい。該脂環式炭化水素基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロオクチル基、シクロデシル基、ノルボルニル基及びアダマンチル基などが挙げられる。該芳香族炭化水素基としては典型的にはアリール基であり、該アリール基の具体例はＲ２のアリール基で例示したものと同じである。また、Ｒ３の炭化水素基も置換基を有していてもよく、該置換基としては、Ｒ２のアルキル基やアリール基などの置換基として例示したものと同じである。置換基を有していてもよい炭化水素基はその炭素数が１~１０であると好ましく、３~７であるとより好ましい。
式（１）におけるＲ３は、上述のとおり、脂肪族炭化水素基及び脂環式炭化水素基の組み合わせ、脂肪族炭化水素基及び芳香族炭化水素基の組み合わせ、又は脂環式炭化水素基及び芳香族炭化水素基の組み合わせでありうる。脂肪族炭化水素基及び脂環式炭化水素基の組み合わせとしては典型的には、シクロアルキル基とアルカンジイル基との組み合わせが挙げられる。具体的には、シクロペンチルメチル基、シクロペンチルエチル基、シクロペンチルプロピル基、シクロペンチルブチル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、シクロヘキシルプロピル基、シクロヘキシルブチル基、シクロオクチルメチル基、シクロオクチルエチル基、シクロオクチルプロピル基及びシクロオクチルブチル基などが挙げられる。脂肪族炭化水素基及び芳香族炭化水素基の組み合わせとしては典型的には、アラルキル基であり、ベンジル基及びナフチルメチル基などが挙げられる。脂環式炭化水素基及び芳香族炭化水素基の組み合わせとしては、フェニルシクロペンチル基、フェニルシクロヘキシル基、ナフチルシクロペンチル基及びナフチルシクロヘキシル基などである。
以上、Ｒ３について、その具体例を挙げて説明したが、これらの中でも、Ｒ３は脂肪族炭化水素基及び脂環式炭化水素基の組み合わせであると好ましく、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基であるとさらに好ましく、シクロペンチルメチル基であると特に好ましい。
式（１）におけるＲ４は、置換基を有していてもよい炭素数１~１０のアルキル基であり、該アルキル基は直鎖でも、分岐鎖でもよい。また、該アルキル基の具体例はその炭素数が１~１０の範囲で、Ｒ３のアルキル基で説明したものと同じである。かかるＲ４のアルキル基は、その炭素数が１~４であるとさらに好ましく、メチル基、エチル基であると特に好ましい。なお、Ｒ４が任意に有する置換基は、Ｒ３が任意に有する置換基として例示したものと同じである。
式（１）におけるＸは、酸素原子又は硫黄原子を示し、酸素原子であると好ましい。
ここで、好適なα−置換−β−アミノ酸エステル（１）の具体例を、式（１）におけるＲ１~Ｒ４の組み合わせで表１に示す。
表１に挙げたα−置換−β−アミノ酸エステルの中でも、（１−１）、（１−２）、（１−９）、（１−１０）、（１−１７）、（１−１８）、（１−２５）、（１−２６）、（１−３３）、（１−３４）が好ましく、（１−９）、（１−１０）、（１−１７）、（１−１８）、（１−２５）、（１−２６）が特に好ましく、Ｘが酸素原子であるとさらに好ましい。
α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物は公知の製造方法により得ることができる。例えば、この製造方法は、ＡＲＫＩＣＯＶ ２０１０（ｉＸ）１９６~２０５頁などに記載されている。
本製造方法に用いられるα−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物は、ラセミ体であってもよく、一方の光学異性体が過剰に含まれた異性体混合物であってもよい。これらのラセミ体や異性体混合物は新たに調製されたものでもよく、該ラセミ体を光学分割して調製される、どちらかの光学異性体が過剰に含まれている異性体混合物でもよい。
α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物のエステル部位（−ＣＯ２Ｒ４基）を不斉加水分解する能力を有する酵素としては、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物を起源とする加水分解酵素、さらに好ましくは、クロモバクテリウム・チョコレータム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｏｃｏｌａｔｕｍ）、又はムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）の微生物を起源とする加水分解酵素を挙げることができる。
α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物のエステル部位を不斉加水分解する能力を有する酵素として、さらに具体的には、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（工業技術院 生命工学技術研究所 寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼ又はリパーゼ、もしくは市販酵素としてキラザイムＬ−９［Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ由来、ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ Ｌ−９（商品名）］を挙げることができる。
これらのα−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物のエステル部位を不斉加水分解する能力を有する酵素（以下、場合により「本酵素」という）としては、これらの微生物から突然変異剤もしくは紫外線照射などの処理により誘導された突然変異体由来の酵素であっても、これらの微生物が有する本酵素をコードする遺伝子が導入され、形質転換された組換え微生物により産生される酵素であっても、あるいは遺伝子工学的手法により本酵素のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸が１個ないしは２個が、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素であってもよく、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有していれば本発明製造方法に使用することができる。
本酵素をコードする遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物を作製する方法としては、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー クローニング 第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリングハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年などに記載の通常の遺伝子工学的手法に準じた方法を挙げることができる。さらに具体的には、日本特許第３８７５２８３号に記載の方法に準じた方法を挙げることができる。このようにして作製することのできる組換え微生物によって産生される本酵素の例としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼ（日本特許第３８７５２８３号）を挙げることができる。
また、遺伝子工学的手法による変異型酵素の作製方法としては、例えば、ＯｌｆｅｒｔＬａｎｄｔら（Ｇｅｎｅ ９６ １２５−１２８ １９９０）の方法を挙げることができる。さらに具体的には、特開２０００−７８９８８号公報、又は日本特許第３４８６９４２号記載の方法に準じた方法を挙げることができる。このようにして作製することのできる変異型酵素の例としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼから作製される変異型エステラーゼ又はリパーゼなどを挙げることができる。
本製造方法に用いる本酵素は、クロモバクテリウム属の微生物を起源とする加水分解酵素を構成するアミノ酸のうちの１個ないしは２個が、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素であってもよい。該変異型酵素を作成するには、遺伝子学的手法、具体的には、遺伝子の部位特異的変異導入技術を用いる。
上述したクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の本酵素の特に好ましい例としては、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のいずれかのＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなる酵素を挙げることができる。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列。
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目のアミノ酸が下記のＡ群から選ばれるアミノ酸に置換され、且つ１８９番目のアミノ酸が下記のＢ群から選ばれるアミノ酸に置換されてなるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｃ）前記（ｂ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、且つ前記（ｂ）によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素と同等な触媒機能を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（Ａ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びセリン
（Ｂ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、
フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン及びアルギニン
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その３２５番目のアミノ酸がイソロイシンで置換されているアミノ酸配列。
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その２４０番目のアミノ酸がアラニンで置換されておりかつ２８８番目のアミノ酸がアラニンで置換されているアミノ酸配列。
（ｆ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その４３番目のアミノ酸がセリンで置換されているアミノ酸配列。
上述したＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＳＣ−ＹＭ−１由来の酵素のさらに好ましい例としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ１６０Ｓ１８９Ｆ３６３ｔｅｒｍ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ１６０Ａ１８９Ｆ３６３ｔｅｒｍ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼＶ３２５Ｉ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼＴ２４０ＡＶ２８８Ａ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍを挙げることができる。
当該部位特異的変異導入技術について簡単に説明する。まず、変異型酵素をコードする遺伝子（以下、場合により「遺伝子１」という）を取得する。この遺伝子１を取得するには、クロモバクテリウム属の微生物を起源とする加水分解酵素をコードする野生型遺伝子（以下、場合により「野生型遺伝子１」という）を取得するとよい。野生型遺伝子とは、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー クローニング 第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年などに記載された通常の遺伝子工学的手法に準じて、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株から取得することができる。即ち、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株を例えば、ＬＢ培地（トリプトン１．０％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ ０．５％）を用いて培養し、得られた菌体を超音波破砕などの方法によって破壊して、プロテアーゼ処理などを行った後、ゲノムＤＮＡを抽出する。得られたゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、例えば、ファージベクターであるλｇｔ１１、あるいはプラスミドベクターであるｐＵＣ１９などにリガーゼを用いて挿入することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。これを例えば、野生型酵素のアミノ酸配列の一部に対応する合成ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法、野生型酵素の活性を測定する方法などのスクリーニング法によりスクリーニングし、野生型遺伝子１を含有するクローンを取得することができる。
野生型遺伝子１に部位特異的変異を導入することによって、遺伝子１を調製することができる。部位特異的変異導入法としては、例えば、ＯｌｆｅｒｔＬａｎｄｔら（Ｇｅｎｅ ９６ １２５−１２８ １９９０）、Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３１ Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．ａｎｄＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ，Ａ Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｖｌａｓｕｋら（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｉｎｏｕｙｅ，Ｍ．：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｈｏｓ．Ｎ．Ｈｕｎｔら（Ｇｅｎｅ ７７ ５１ １９８９）が提案している方法などが挙げられる。例えば、Ｏｌｆｅｒｔ Ｌａｎｄｔら（Ｇｅｎｅ ９６ １２５−１２８ １９９０）の方法を用いて、クロモバクテリウム属の微生物を起源とする加水分解酵素のアミノ酸配列において、特定のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列をコードする遺伝子１を調製するには、まず、野生型遺伝子１が組み込まれたプラスミドＤＮＡを、例えばＪ．ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー クローニング 第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年などに記載された方法に準じて調製する。次いで、得られたプラスミドＤＮＡを鋳型にして、例えば、特定のアミノ酸が置換されている塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを片側のプライマーとして用い、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行うとよい。ここで、ＰＣＲ反応の条件としては、例えば、９４℃にて５分間保温した後、９４℃にて１分間、次いで５０℃にて２分間、さらに７５℃にて３分間保温する処理を２０サイクル行い、最後に７５℃で８分間保温する。このようにして増幅されたＤＮＡ断片を、例えば制限酵素ＢｓｔＰＩ及びＸｂａＩで消化し、同様の制限酵素消化を行った野生型遺伝子１を含むプラスミドＤＮＡとライゲーション反応を行うことにより、目的とする遺伝子１を得ることができる。
このようにして調製された遺伝子１を用いて、通常の遺伝子工学的方法に準じ、変異型酵素を製造し、取得することができる。具体的には、例えば、遺伝子１を宿主微生物細胞中で発現させることのできるプラスミドを調製し、これを宿主微生物細胞に導入して宿主微生物細胞を形質転換し、該形質転換体微生物を培養すればよい。上記のようなプラスミドとしては、宿主微生物細胞中で複製可能であって、宿主からの単離・精製が容易であり、プロモーターおよび検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、遺伝子１が導入されたプラスミドを好ましく挙げることができる。該発現ベクターには市販の各種ベクターを用いることができ、例えば、大腸菌での発現には、ｌａｃ，ｔｒｐ，ｔａｃなどのプロモーターを含む発現ベクター（ファルマシアバイオテクなどから購入できる）を用いることができる。
宿主微生物細胞としては、真核生物又は原核生物のいずれも用いることができ、例えば大腸菌などを挙げることができる。該宿主微生物細胞に、通常の遺伝子工学的方法により前記のプラスミドを導入し宿主微生物細胞を形質転換することができる。このようにして得られる遺伝子１を含有するプラスミドを保有する微生物の培養は通常の方法によって行うことができる。例えば、宿主微生物細胞が大腸菌である場合は、適当な炭素源、窒素源及びビタミンなどの微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれでも可能であるが、好ましくは、通気撹拌培養方法を挙げることができる。この培養菌体からの変異型酵素の採取は、蛋白質の通常の単離・精製の方法、すなわちすでに説明した培養液からの酵素の精製方法として例示した方法を挙げることができる。
本発明においては、配列番号１で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目のアミノ酸が上記Ａ群から選ばれるアミノ酸に置換され、且つ１８９番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸に置換されるように変異プライマーを調製し、ＰＣＲ法による増幅を行えばよい。好ましくは、１６０番目のアミノ酸が上記のＡ群から選ばれるアミノ酸に置換され、且つ１８９番目のアミノ酸が上記のＢ群から選ばれるアミノ酸に置換されるような特異的変異を導入することが好ましい。
尚、配列番号１で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目及び１８９番目のアミノ酸に同時に部位特異的変異を導入してもよい。
また、配列番号１で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において３２５番目のアミノ酸がイソロイシンに置換された変異プライマー、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その２４０番目のアミノ酸がアラニンで置換されかつ２８８番目のアミノ酸がアラニンで置換された変異プライマー、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その４３番目のアミノ酸がセリンで置換された変異プライマーを調製し、ＰＣＲ法による増幅を行えばよい。
次に、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物を起源とする加水分解酵素について説明する。該ムコール属の微生物を起源とする加水分解酵素の中でも、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）の微生物を起源とする加水分解酵素が好ましい。また、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）の微生物を起源とする加水分解酵素としては市販の酵素を用いることもできる。かかる市販の酵素としては、キラザイム（ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ）Ｌ−９［Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製］などがある。市販の酵素は容易に入手可能であることから、より簡便に本製造方法を実施できる点で好ましい。なお、これらムコール属の微生物を起源とする加水分解酵素においても、該加水分解酵素を構成するアミノ酸のうちの１個ないしは２個が、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素を調製してから、該変異型酵素を本製造方法に用いることもできる。この場合の変異型酵素を調製においても、クロモバクテリウム属の微生物を起源とする加水分解酵素から変異型酵素を調製する方法として説明した部位特異的変異導入技術を用いることができる。
本酵素を産生する微生物は、いずれも通常の方法によって液体培養することができる。培地としては、通常の微生物培養に使用される炭素源、窒素源、無機物等を適宜含む各種の培地を使用することができる。例えば、炭素源としては、グルコース、グリセリン、澱粉、デキストリン、有機酸、糖蜜など、窒素源としては、油脂類、ポリペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーンスティープリカー、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素など、無機物としては、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛、銅等の塩類、硫酸塩類、酢酸塩類、炭酸塩類及びリン酸塩類、具体的には、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素一カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素一ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムなどを使用することができる。また、上記微生物の有するα−置換−β−アミノ酸エステル（１）の不斉水解能を高めるために、オリーブ油またはトリブチリン等のトリグリセリドあるいはα−置換−β−アミノ酸エステル（１）を適宜培地に添加してもよい。
培養は、通常、好気的に行うのが好ましく、振とう培養又は通気撹拌培養が適する。培養温度は、通常、２０~４０℃、好ましくは、２５~３５℃で、ｐＨは６~８が好ましい。培養時間は、種々の条件によって異なるが、１~７日間が好ましい。
また、必要に応じて固体培養法も、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の不斉水解能を有する微生物菌体が得られる方法であれば適宜採用することができる。
本酵素を、上記のようにして培養された微生物培養物から精製するには、通常一般の酵素の精製において使用される方法に従って行えばよい。例えば、まず超音波処理、ダイノミル処理あるいはフレンチプレス処理などの方法により微生物培養物中の菌体の破砕を行う。得られた破砕液から遠心分離などにより不溶物を除去した後、通常酵素の精製に使用される陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーなどをひとつまたは複数適当に組み合わせることによって目的の酵素を精製することができる。これらカラムクロマトグラフィーに使用する担体の一例として、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）やＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ（東洋曹達工業株式会社製）などを挙げることができる。
本酵素は、精製酵素、粗酵素、微生物培養物、菌体、およびそれらの処理物など、種々の形態で用いることができる。ここで処理物とは、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物、または菌体のアルカリ処理物等をいう。さらに、上記のような種々の純度あるいは形態の酵素を、例えば、シリカゲルやセラミックス等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等への吸着法、ポリアクリルアミド法、含硫多糖ゲル法（例えばカラギーナンゲル法）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法などの公知方法により固定化して用いてもよい。
続いて、前記加水分解酵素及びその変異型酵素からなる群より選ばれる酵素、該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物（以下、ここでいう酵素、培養液及び処理物を総じて、「本酵素等」という）を用いる本製造方法について説明する。
かかる本酵素等の使用量は反応時間の遅延や不斉加水分解の選択性の低下が起こらないように適宜選択される。例えば精製酵素、粗酵素、または市販品酵素を用いる場合、その使用量は、本酵素等中に含まれる酵素の重量換算で、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物に対して通常は０．００１~２重量倍、好ましくは０．００２~０．５重量倍であり、微生物培養物、菌体、又はそれらの処理物を用いる場合、その使用量は、本酵素等中に含まれる酵素の重量換算で、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物に対して通常は０．０１~２００重量倍、好ましくは０．１~５０重量倍である。
不斉加水分解反応に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。緩衝水溶液としては、例えばリン酸ナトリウム水溶液、リン酸カリウム水溶液などといったリン酸アルカリ金属塩水溶液などの無機酸塩の緩衝水溶液、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液などといった酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩の緩衝水溶液などが挙げられる。かかる水又は緩衝水溶液の使用量はα−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物の重量に対して通常０．５重量倍以上であればよく、場合によっては溶媒量用いられる程度の量でもよいが、通常は２００重量倍以下である。
不斉加水分解反応は、疎水性有機溶媒、親水性有機溶媒などの有機溶媒中で行われてもよい。疎水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタンなどの炭化水素などが用いられ、親水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブチルアルコール、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、イソブチルアルコール、ｎ−ブチルアルコールなどのアルコール、テトラヒドロフランなどのエーテル、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド、アセトンなどのケトン、アセトニトリルなどのニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどのアミドなどがそれぞれ挙げられる。これらの疎水性有機溶媒や親水性有機溶媒はそれぞれ単独または２種以上を組み合わせて用いられ、疎水性有機溶媒と親水性有機溶媒とを組み合わせて用いてもよい。また、本製造方法には、水又は緩衝水溶液と、疎水性有機溶媒と、親水性有機溶媒とを混合して用いてもよい。
かかる有機溶媒を用いる場合、その使用量は通常α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物の重量に対して２００重量倍以下、好ましくは０．１~１００重量倍の範囲内である。
不斉加水分解反応は、例えば水、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物及び本酵素等を混合する方法により行われ、有機溶媒を用いる場合には該有機溶媒、水、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物および本酵素等を混合すればよい。
反応系のｐＨは本酵素等による不斉加水分解が選択性よく進行する値が適宜選択され、特に限定されないが、通常はｐＨ４~１０、好ましくはｐＨ６~８の範囲である。反応中、酸又は塩基を加えることによりｐＨを適宜選択された範囲内に調整してもよい。かかる酸としては、例えば塩化水素、臭化水素、リン酸、硫酸、硝酸及びその塩、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸などの有機酸及びその塩が挙げられ、かかる塩基としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムなどのアルカリ金属及びアルカリ土類金属の炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどのアルカリ金属重炭酸塩、リン酸２水素ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウムなどのリン酸塩、ジエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、フェネチルアミン、ピリジンなどの有機塩基、アンモニアが使用される。かかる塩基は単独もしくは２種類以上を混合して用いてもよい。これらは、本製造方法に用いた本酵素等の種類などに応じ、また、添加した酸又は塩基の作用により、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の加水分解が生じないように選ばれる。かかる酸又は塩基は通常水溶液として用いられるが、反応に有機溶媒を使用する場合は有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合溶液として用いてもよい。かかる有機溶媒は反応で使用するものと同じものを使用することができる。また、酸又は塩基を溶解する水は緩衝水溶液に置き換えてもよい。さらに、酸又塩基は固体もしくは溶液に懸濁させた状態で用いてもよい。
反応温度は、本酵素等による不斉加水分解が選択性よく進行する温度が適宜選択され、特に限定されないが、高すぎると、本酵素等中の本酵素の安定性が低下する傾向にあり、また低すぎると反応速度が低下する傾向にある。一方、温度が低いほど選択性は向上する傾向にある。反応温度は、通常−１０~６５℃の範囲内であり、好ましくは−５~５０℃の範囲内である。
反応時間は、通常１~１００時間の範囲内から選ばれ、好ましくは１~５０時間の範囲内から選ばれる。本製造方法の反応系における反応液を適宜サンプリングし、ＨＰＬＣ、ＧＣなどの適当な分析手段により、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の消失の度合い、又はα−置換−β−アミノ酸（２）の生成の度合いを求め、反応時間を定めることもできる。
かくして光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）の溶液が得られるが、通常、反応で使用した酵素や緩衝剤あるいは加水分解反応により生じたカルボン酸などと分離するためにさらに後処理操作を行う。
かかる後処理として例えば、反応溶液中の溶媒を留去した後、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて、α−置換−β−アミノ酸（２）を分離精製する方法、同様に溶媒を留去した後、蒸留によりα−置換−β−アミノ酸（２）を分離精製する方法、分液操作によりα−置換−β−アミノ酸（２）を分離精製する方法などが挙げられる。
分液操作によりα−置換−β−アミノ酸（２）を分離精製する際に、反応時に水と疎水性有機溶媒のいずれにも溶解する有機溶媒を用いた場合これを留去により除去してから用いてもよい。また、溶液に不溶酵素や固定化担体などが存在する場合はこれらをろ過により除去してもよい。
本製造方法の反応終了後の反応液には、不斉加水分解反応の生成物であるα−置換−β−アミノ酸（２）と、残存するα−置換−β−アミノ酸エステル（１）とが含まれる。この両者を分離するには、例えば、水／疎水性有機溶媒による抽出操作を行い、残存α−置換−β−アミノ酸エステル（１）を有機層（疎水性有機溶媒層）に、α−置換−β−アミノ酸（２）を水層にそれぞれ分配させ、該有機層と該水層とを分液するといった方法が採用される。
目的物である光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）と、本酵素等や緩衝剤やその他の水溶性成分と分離するには疎水性有機溶媒を用いて有機層に光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）を抽出し水層と分液すればよい。
かかる疎水性有機溶媒としては例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル；トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタンなどの炭化水素；ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、クロロベンゼン、オルトジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素；酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ブチルなどのエステルなどが挙げられる。反応時にこれらの疎水性有機溶媒を使用した場合は、反応終了後の反応液が有機層と水層とに分離するときには、そのまま分液操作を行なうこともできる。また、反応時に疎水性有機溶媒を用いなかった場合や、疎水性有機溶媒又は水の使用量が少ないために反応液が容易に有機層と水層とに分液されない場合には、あるいは水の使用量が少ないために容易には分液できない場合には、疎水性有機溶媒または水などを適宜加えた後に分液すればよい。疎水性有機溶媒の使用量は特に限定されるものではないが、通常α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体の重量を基準に対して０．１~２００重量倍、好ましくは０．２~１００重量倍である。
かかる目的物の抽出時のｐＨは通常２~１０の範囲内、好ましくは４~８の範囲内である。なお、ｐＨに調整するために酸又は塩基を適宜使用することもできる。ここで用いる酸又は塩基の具体例は、本製造方法の反応系のｐＨ調整用として例示したものと同じである。水層からの目的物の抽出が不十分な場合、同じ抽出、分液操作を複数回繰り返してもよい。また、同様に有機層からの水溶性成分の除去が不十分な場合も、同じ抽出、分液操作を複数回繰り返してもよい。
上記の抽出により、不斉加水分解物であるカルボン酸と分離された残存エステルは、油層中の有機溶媒を留去することにより単離することができる。得られた光学活性α−置換−β−アミノ酸エステル（１）は、ラセミ化の処理に供することによって、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物として再利用することができる。
上記の油層中の有機溶媒を留去することにより、単離された未反応α−置換−β−アミノ酸エステル（１）は、カラムクロマトグラフィー等によって、さらに精製されてもよい。
上記の抽出により、不斉加水分解物である光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）は、分液後の水層に含まれており、これは、水を留去すること、あるいは中和処理後に有機溶媒を用いて抽出すること等によって、容易に水層から取り出すことができる。分離された光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）は、油層中の有機溶媒を留去することにより単離することができる。
かくして得られた光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）は、さらにカラムクロマトグラフィー、再結晶、再沈殿などの精製操作によってさらに精製してもよい。また、再結晶や再沈殿などの精製操作においては、光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）をさらに適当な塩基で塩とした後、この塩を再結晶や再沈殿で精製し、精製した塩を再び適当な方法により、光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）に戻すこともできる。
かくして得られた光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）の具体例を、式（２）におけるＲ１~Ｒ３の組み合わせで表２に示す。
本発明において、本酵素として、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）のうちＲ体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素を用いれば、得られる光学活性なα−置換−β−アミノ酸（２）はＲ体に富み、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）のうちＳ体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素を用いれば、得られる光学活性なα−置換−β−アミノ酸（２）はＳ体に富む。また、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）のうちＲ体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素を用いてＲ体のα−置換−β−アミノ酸（２）を得た時には同時にＳ体のα−置換−β−アミノ酸エステル（１）が得られ、これは上述の抽出、分液操作等でＲ体のα−置換−β−アミノ酸（２）と分離し、単離することができる。
まず、本製造方法は、前記α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物を用いる。
式（１）におけるＲ１は、水素原子、炭素数１~１０のアシル基、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）又はカルボキサミド基（−ＣＯＮＨ２）を示す。該アシル基としては例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ピバロイル基及びベンゾイル基が挙げられ、これらは直鎖、分岐鎖及び環状のいずれでもよい。これらの中でも水素原子、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基及びベンゾイル基が好ましく、ホルミル基、アセチル基及びプロピオニル基が特に好ましい。また、これらアシル基は置換基を有するアルキルカルボニル基又は置換基を有するアリールカルボニル基であってもよく、該置換基としては、炭素数１~５のアルキル基、炭素数１~５のアルコキシ基、炭素数７~９のアラルキルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基などが挙げられる。該置換基を有するアシル基としては例えば、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、メトキシアセチル基、３−クロロプロピオニル基、トルオイル基、トリフルオロメチルベンゾイル基、クロロベンゾイル基、フルオロベンゾイル基、メトキシベンゾイル基、シアノベンゾイル基、ニトロベンゾイル基などが挙げられる。Ｒ１が水素原子又はホルミル基であるα−置換−β−アミノ酸エステル誘導体からは、ＷＯ ００／６１１３４記載の光学活性なα−シクロペンチルメチル−β−（Ｎ−ホルミル−Ｎ−ヒドロキシ）アミノ酸のような医薬原体化合物の製造用原料又は中間体化合物を容易に得ることができる。
式（１）におけるＲ２は、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１~１０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数６~２０のアリール基、置換基を有していてもよい炭素数７~２０のアラルキル基、炭素数２~２０のアシル基、置換基を有していてもよい炭素数２~１５のアルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよい炭素数７~２０のアリールオキシカルボニル基、置換基を有していてもよい炭素数８~２０のアラルキルオキシカルボニル基、または置換基を有していてもよい炭素数４~１０の環状エーテル基を示す。
該アルキル基としては例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基、オクチル基及びデシル基などが挙げられ、これらは直鎖、分岐鎖又は環状のいずれでもよい。これらの中でも、該アルキル基は、メチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が好ましい。
該アリール基としては例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基及びビフェニル基などが挙げられ、これらの中でも、フェニル基が好ましい。
該アラルキル基としては例えば、ベンジル基、パラメトキシベンジル基及びナフチルメチル基などが挙げられ、これらの中でも、ベンジル基が好ましい。
該アシル基としては例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ピバロイル基及びベンゾイル基などが挙げられ、これらの中でも、アセチル基及びピバロイル基が好ましい。
該アルコキシカルボニル基としては例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、ヘキシルオキシカルボニル基、オクチルオキシカルボニル基及びデシルオキシカルボニル基などが挙げられ、これらは直鎖、分岐鎖又は環状のいずれでもよい。これらの中でも、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基が好ましい。
該アリールオキシカルボニル基としては例えば、フェノキシカルボニル基、ナフチルオキシカルボニル基、アントラセニルオキシカルボニル基及びビフェニルオキシカルボニル基などが挙げられ、これらの中でも、フェノキシカルボニル基が好ましい。
該アラルキルオキシカルボニル基としては例えば、ベンジルオキシカルボニル基、ナフチルメトキシカルボニル基などが挙げられ、これらの中でも、ベンジルオキシカルボニル基が好ましい。
該環状エーテル基は環状エーテル化合物から水素原子を１個取り去ってなる基であり、環状エーテル化合物から取り去る水素原子は、環状エーテル化合物の２位にある水素原子が特に好ましい。かかる環状エーテル基の具体例は、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル基、テトラヒドロフラン−２−イル基及び１，４−ジオキサン−２−イル基であるが、これらの中でも、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル基が好ましい。
また、これらアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基及び環状エーテル基は置換基を有していてもよく、該置換基としては、炭素数１~５のアルコキシ基、炭素数７~１１のアラルキルオキシ基、ハロゲン原子などが挙げられる。また、アリール基、アラルキル基、アリールオキシカルボニル基及びアラルキルオキシカルボニル基などの芳香環を有する基は、その芳香環に炭素数１~５のアルキル基、炭素数１~５のアルコキシ基、ハロゲン原子を置換基として有することもある。
以上、Ｒ２について、その具体例を挙げて説明したが、これらの中でも、Ｒ２は炭素数７~２０のアラルキル基であると好ましく、ベンジル基又はパラメトキシベンジル基であると一層好ましく、ベンジル基であると特に好ましい。
前記式（１）におけるＲ３は、炭素数１~２０の炭化水素基であり、該炭化水素基は、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基又は芳香族炭化水素基、或いはそれらの組み合わせのいずれでもよい。Ｒ３の炭化水素基はその炭素数が１~７であると好ましく、３~６であるとより好ましい。該脂肪族炭化水素基は典型的にはアルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基及びイコシル基などが挙げられ、これらは直鎖でも分岐鎖でもよい。該脂環式炭化水素基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロオクチル基、シクロデシル基、ノルボルニル基及びアダマンチル基などが挙げられる。該芳香族炭化水素基としては典型的にはアリール基であり、該アリール基の具体例はＲ２のアリール基で例示したものと同じである。また、Ｒ３の炭化水素基も置換基を有していてもよく、該置換基としては、Ｒ２のアルキル基やアリール基などの置換基として例示したものと同じである。置換基を有していてもよい炭化水素基はその炭素数が１~１０であると好ましく、３~７であるとより好ましい。
式（１）におけるＲ３は、上述のとおり、脂肪族炭化水素基及び脂環式炭化水素基の組み合わせ、脂肪族炭化水素基及び芳香族炭化水素基の組み合わせ、又は脂環式炭化水素基及び芳香族炭化水素基の組み合わせでありうる。脂肪族炭化水素基及び脂環式炭化水素基の組み合わせとしては典型的には、シクロアルキル基とアルカンジイル基との組み合わせが挙げられる。具体的には、シクロペンチルメチル基、シクロペンチルエチル基、シクロペンチルプロピル基、シクロペンチルブチル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、シクロヘキシルプロピル基、シクロヘキシルブチル基、シクロオクチルメチル基、シクロオクチルエチル基、シクロオクチルプロピル基及びシクロオクチルブチル基などが挙げられる。脂肪族炭化水素基及び芳香族炭化水素基の組み合わせとしては典型的には、アラルキル基であり、ベンジル基及びナフチルメチル基などが挙げられる。脂環式炭化水素基及び芳香族炭化水素基の組み合わせとしては、フェニルシクロペンチル基、フェニルシクロヘキシル基、ナフチルシクロペンチル基及びナフチルシクロヘキシル基などである。
以上、Ｒ３について、その具体例を挙げて説明したが、これらの中でも、Ｒ３は脂肪族炭化水素基及び脂環式炭化水素基の組み合わせであると好ましく、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基であるとさらに好ましく、シクロペンチルメチル基であると特に好ましい。
式（１）におけるＲ４は、置換基を有していてもよい炭素数１~１０のアルキル基であり、該アルキル基は直鎖でも、分岐鎖でもよい。また、該アルキル基の具体例はその炭素数が１~１０の範囲で、Ｒ３のアルキル基で説明したものと同じである。かかるＲ４のアルキル基は、その炭素数が１~４であるとさらに好ましく、メチル基、エチル基であると特に好ましい。なお、Ｒ４が任意に有する置換基は、Ｒ３が任意に有する置換基として例示したものと同じである。
式（１）におけるＸは、酸素原子又は硫黄原子を示し、酸素原子であると好ましい。
ここで、好適なα−置換−β−アミノ酸エステル（１）の具体例を、式（１）におけるＲ１~Ｒ４の組み合わせで表１に示す。
α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物は公知の製造方法により得ることができる。例えば、この製造方法は、ＡＲＫＩＣＯＶ ２０１０（ｉＸ）１９６~２０５頁などに記載されている。
本製造方法に用いられるα−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物は、ラセミ体であってもよく、一方の光学異性体が過剰に含まれた異性体混合物であってもよい。これらのラセミ体や異性体混合物は新たに調製されたものでもよく、該ラセミ体を光学分割して調製される、どちらかの光学異性体が過剰に含まれている異性体混合物でもよい。
α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物のエステル部位（−ＣＯ２Ｒ４基）を不斉加水分解する能力を有する酵素としては、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物を起源とする加水分解酵素、さらに好ましくは、クロモバクテリウム・チョコレータム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｏｃｏｌａｔｕｍ）、又はムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）の微生物を起源とする加水分解酵素を挙げることができる。
α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物のエステル部位を不斉加水分解する能力を有する酵素として、さらに具体的には、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（工業技術院 生命工学技術研究所 寄託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼ又はリパーゼ、もしくは市販酵素としてキラザイムＬ−９［Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ由来、ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ Ｌ−９（商品名）］を挙げることができる。
これらのα−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物のエステル部位を不斉加水分解する能力を有する酵素（以下、場合により「本酵素」という）としては、これらの微生物から突然変異剤もしくは紫外線照射などの処理により誘導された突然変異体由来の酵素であっても、これらの微生物が有する本酵素をコードする遺伝子が導入され、形質転換された組換え微生物により産生される酵素であっても、あるいは遺伝子工学的手法により本酵素のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸が１個ないしは２個が、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素であってもよく、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有していれば本発明製造方法に使用することができる。
本酵素をコードする遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物を作製する方法としては、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー クローニング 第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリングハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年などに記載の通常の遺伝子工学的手法に準じた方法を挙げることができる。さらに具体的には、日本特許第３８７５２８３号に記載の方法に準じた方法を挙げることができる。このようにして作製することのできる組換え微生物によって産生される本酵素の例としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼ（日本特許第３８７５２８３号）を挙げることができる。
また、遺伝子工学的手法による変異型酵素の作製方法としては、例えば、ＯｌｆｅｒｔＬａｎｄｔら（Ｇｅｎｅ ９６ １２５−１２８ １９９０）の方法を挙げることができる。さらに具体的には、特開２０００−７８９８８号公報、又は日本特許第３４８６９４２号記載の方法に準じた方法を挙げることができる。このようにして作製することのできる変異型酵素の例としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼから作製される変異型エステラーゼ又はリパーゼなどを挙げることができる。
本製造方法に用いる本酵素は、クロモバクテリウム属の微生物を起源とする加水分解酵素を構成するアミノ酸のうちの１個ないしは２個が、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素であってもよい。該変異型酵素を作成するには、遺伝子学的手法、具体的には、遺伝子の部位特異的変異導入技術を用いる。
上述したクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来の本酵素の特に好ましい例としては、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のいずれかのＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列からなる酵素を挙げることができる。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列。
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目のアミノ酸が下記のＡ群から選ばれるアミノ酸に置換され、且つ１８９番目のアミノ酸が下記のＢ群から選ばれるアミノ酸に置換されてなるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｃ）前記（ｂ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、且つ前記（ｂ）によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素と同等な触媒機能を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（Ａ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びセリン
（Ｂ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、
フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン及びアルギニン
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その３２５番目のアミノ酸がイソロイシンで置換されているアミノ酸配列。
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その２４０番目のアミノ酸がアラニンで置換されておりかつ２８８番目のアミノ酸がアラニンで置換されているアミノ酸配列。
（ｆ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その４３番目のアミノ酸がセリンで置換されているアミノ酸配列。
上述したＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＳＣ−ＹＭ−１由来の酵素のさらに好ましい例としては、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ１６０Ｓ１８９Ｆ３６３ｔｅｒｍ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ１６０Ａ１８９Ｆ３６３ｔｅｒｍ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼＶ３２５Ｉ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼＴ２４０ＡＶ２８８Ａ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍを挙げることができる。
当該部位特異的変異導入技術について簡単に説明する。まず、変異型酵素をコードする遺伝子（以下、場合により「遺伝子１」という）を取得する。この遺伝子１を取得するには、クロモバクテリウム属の微生物を起源とする加水分解酵素をコードする野生型遺伝子（以下、場合により「野生型遺伝子１」という）を取得するとよい。野生型遺伝子とは、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー クローニング 第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年などに記載された通常の遺伝子工学的手法に準じて、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株から取得することができる。即ち、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株を例えば、ＬＢ培地（トリプトン１．０％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ ０．５％）を用いて培養し、得られた菌体を超音波破砕などの方法によって破壊して、プロテアーゼ処理などを行った後、ゲノムＤＮＡを抽出する。得られたゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、例えば、ファージベクターであるλｇｔ１１、あるいはプラスミドベクターであるｐＵＣ１９などにリガーゼを用いて挿入することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。これを例えば、野生型酵素のアミノ酸配列の一部に対応する合成ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法、野生型酵素の活性を測定する方法などのスクリーニング法によりスクリーニングし、野生型遺伝子１を含有するクローンを取得することができる。
野生型遺伝子１に部位特異的変異を導入することによって、遺伝子１を調製することができる。部位特異的変異導入法としては、例えば、ＯｌｆｅｒｔＬａｎｄｔら（Ｇｅｎｅ ９６ １２５−１２８ １９９０）、Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３１ Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．ａｎｄＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ，Ａ Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｖｌａｓｕｋら（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｉｎｏｕｙｅ，Ｍ．：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｈｏｓ．Ｎ．Ｈｕｎｔら（Ｇｅｎｅ ７７ ５１ １９８９）が提案している方法などが挙げられる。例えば、Ｏｌｆｅｒｔ Ｌａｎｄｔら（Ｇｅｎｅ ９６ １２５−１２８ １９９０）の方法を用いて、クロモバクテリウム属の微生物を起源とする加水分解酵素のアミノ酸配列において、特定のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列をコードする遺伝子１を調製するには、まず、野生型遺伝子１が組み込まれたプラスミドＤＮＡを、例えばＪ．ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー クローニング 第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年などに記載された方法に準じて調製する。次いで、得られたプラスミドＤＮＡを鋳型にして、例えば、特定のアミノ酸が置換されている塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを片側のプライマーとして用い、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行うとよい。ここで、ＰＣＲ反応の条件としては、例えば、９４℃にて５分間保温した後、９４℃にて１分間、次いで５０℃にて２分間、さらに７５℃にて３分間保温する処理を２０サイクル行い、最後に７５℃で８分間保温する。このようにして増幅されたＤＮＡ断片を、例えば制限酵素ＢｓｔＰＩ及びＸｂａＩで消化し、同様の制限酵素消化を行った野生型遺伝子１を含むプラスミドＤＮＡとライゲーション反応を行うことにより、目的とする遺伝子１を得ることができる。
このようにして調製された遺伝子１を用いて、通常の遺伝子工学的方法に準じ、変異型酵素を製造し、取得することができる。具体的には、例えば、遺伝子１を宿主微生物細胞中で発現させることのできるプラスミドを調製し、これを宿主微生物細胞に導入して宿主微生物細胞を形質転換し、該形質転換体微生物を培養すればよい。上記のようなプラスミドとしては、宿主微生物細胞中で複製可能であって、宿主からの単離・精製が容易であり、プロモーターおよび検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、遺伝子１が導入されたプラスミドを好ましく挙げることができる。該発現ベクターには市販の各種ベクターを用いることができ、例えば、大腸菌での発現には、ｌａｃ，ｔｒｐ，ｔａｃなどのプロモーターを含む発現ベクター（ファルマシアバイオテクなどから購入できる）を用いることができる。
宿主微生物細胞としては、真核生物又は原核生物のいずれも用いることができ、例えば大腸菌などを挙げることができる。該宿主微生物細胞に、通常の遺伝子工学的方法により前記のプラスミドを導入し宿主微生物細胞を形質転換することができる。このようにして得られる遺伝子１を含有するプラスミドを保有する微生物の培養は通常の方法によって行うことができる。例えば、宿主微生物細胞が大腸菌である場合は、適当な炭素源、窒素源及びビタミンなどの微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれでも可能であるが、好ましくは、通気撹拌培養方法を挙げることができる。この培養菌体からの変異型酵素の採取は、蛋白質の通常の単離・精製の方法、すなわちすでに説明した培養液からの酵素の精製方法として例示した方法を挙げることができる。
本発明においては、配列番号１で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目のアミノ酸が上記Ａ群から選ばれるアミノ酸に置換され、且つ１８９番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸に置換されるように変異プライマーを調製し、ＰＣＲ法による増幅を行えばよい。好ましくは、１６０番目のアミノ酸が上記のＡ群から選ばれるアミノ酸に置換され、且つ１８９番目のアミノ酸が上記のＢ群から選ばれるアミノ酸に置換されるような特異的変異を導入することが好ましい。
尚、配列番号１で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目及び１８９番目のアミノ酸に同時に部位特異的変異を導入してもよい。
また、配列番号１で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において３２５番目のアミノ酸がイソロイシンに置換された変異プライマー、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その２４０番目のアミノ酸がアラニンで置換されかつ２８８番目のアミノ酸がアラニンで置換された変異プライマー、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列において、その４３番目のアミノ酸がセリンで置換された変異プライマーを調製し、ＰＣＲ法による増幅を行えばよい。
次に、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物を起源とする加水分解酵素について説明する。該ムコール属の微生物を起源とする加水分解酵素の中でも、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）の微生物を起源とする加水分解酵素が好ましい。また、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）の微生物を起源とする加水分解酵素としては市販の酵素を用いることもできる。かかる市販の酵素としては、キラザイム（ＣＨＩＲＡＺＹＭＥ）Ｌ−９［Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製］などがある。市販の酵素は容易に入手可能であることから、より簡便に本製造方法を実施できる点で好ましい。なお、これらムコール属の微生物を起源とする加水分解酵素においても、該加水分解酵素を構成するアミノ酸のうちの１個ないしは２個が、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素を調製してから、該変異型酵素を本製造方法に用いることもできる。この場合の変異型酵素を調製においても、クロモバクテリウム属の微生物を起源とする加水分解酵素から変異型酵素を調製する方法として説明した部位特異的変異導入技術を用いることができる。
本酵素を産生する微生物は、いずれも通常の方法によって液体培養することができる。培地としては、通常の微生物培養に使用される炭素源、窒素源、無機物等を適宜含む各種の培地を使用することができる。例えば、炭素源としては、グルコース、グリセリン、澱粉、デキストリン、有機酸、糖蜜など、窒素源としては、油脂類、ポリペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーンスティープリカー、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素など、無機物としては、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛、銅等の塩類、硫酸塩類、酢酸塩類、炭酸塩類及びリン酸塩類、具体的には、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素一カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素一ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムなどを使用することができる。また、上記微生物の有するα−置換−β−アミノ酸エステル（１）の不斉水解能を高めるために、オリーブ油またはトリブチリン等のトリグリセリドあるいはα−置換−β−アミノ酸エステル（１）を適宜培地に添加してもよい。
培養は、通常、好気的に行うのが好ましく、振とう培養又は通気撹拌培養が適する。培養温度は、通常、２０~４０℃、好ましくは、２５~３５℃で、ｐＨは６~８が好ましい。培養時間は、種々の条件によって異なるが、１~７日間が好ましい。
また、必要に応じて固体培養法も、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の不斉水解能を有する微生物菌体が得られる方法であれば適宜採用することができる。
本酵素を、上記のようにして培養された微生物培養物から精製するには、通常一般の酵素の精製において使用される方法に従って行えばよい。例えば、まず超音波処理、ダイノミル処理あるいはフレンチプレス処理などの方法により微生物培養物中の菌体の破砕を行う。得られた破砕液から遠心分離などにより不溶物を除去した後、通常酵素の精製に使用される陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーなどをひとつまたは複数適当に組み合わせることによって目的の酵素を精製することができる。これらカラムクロマトグラフィーに使用する担体の一例として、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）やＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ（東洋曹達工業株式会社製）などを挙げることができる。
本酵素は、精製酵素、粗酵素、微生物培養物、菌体、およびそれらの処理物など、種々の形態で用いることができる。ここで処理物とは、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物、または菌体のアルカリ処理物等をいう。さらに、上記のような種々の純度あるいは形態の酵素を、例えば、シリカゲルやセラミックス等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等への吸着法、ポリアクリルアミド法、含硫多糖ゲル法（例えばカラギーナンゲル法）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法などの公知方法により固定化して用いてもよい。
続いて、前記加水分解酵素及びその変異型酵素からなる群より選ばれる酵素、該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物（以下、ここでいう酵素、培養液及び処理物を総じて、「本酵素等」という）を用いる本製造方法について説明する。
かかる本酵素等の使用量は反応時間の遅延や不斉加水分解の選択性の低下が起こらないように適宜選択される。例えば精製酵素、粗酵素、または市販品酵素を用いる場合、その使用量は、本酵素等中に含まれる酵素の重量換算で、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物に対して通常は０．００１~２重量倍、好ましくは０．００２~０．５重量倍であり、微生物培養物、菌体、又はそれらの処理物を用いる場合、その使用量は、本酵素等中に含まれる酵素の重量換算で、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物に対して通常は０．０１~２００重量倍、好ましくは０．１~５０重量倍である。
不斉加水分解反応に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。緩衝水溶液としては、例えばリン酸ナトリウム水溶液、リン酸カリウム水溶液などといったリン酸アルカリ金属塩水溶液などの無機酸塩の緩衝水溶液、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液などといった酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩の緩衝水溶液などが挙げられる。かかる水又は緩衝水溶液の使用量はα−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物の重量に対して通常０．５重量倍以上であればよく、場合によっては溶媒量用いられる程度の量でもよいが、通常は２００重量倍以下である。
不斉加水分解反応は、疎水性有機溶媒、親水性有機溶媒などの有機溶媒中で行われてもよい。疎水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタンなどの炭化水素などが用いられ、親水性有機溶媒としては、例えばｔｅｒｔ−ブチルアルコール、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、イソブチルアルコール、ｎ−ブチルアルコールなどのアルコール、テトラヒドロフランなどのエーテル、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド、アセトンなどのケトン、アセトニトリルなどのニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどのアミドなどがそれぞれ挙げられる。これらの疎水性有機溶媒や親水性有機溶媒はそれぞれ単独または２種以上を組み合わせて用いられ、疎水性有機溶媒と親水性有機溶媒とを組み合わせて用いてもよい。また、本製造方法には、水又は緩衝水溶液と、疎水性有機溶媒と、親水性有機溶媒とを混合して用いてもよい。
かかる有機溶媒を用いる場合、その使用量は通常α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物の重量に対して２００重量倍以下、好ましくは０．１~１００重量倍の範囲内である。
不斉加水分解反応は、例えば水、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物及び本酵素等を混合する方法により行われ、有機溶媒を用いる場合には該有機溶媒、水、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物および本酵素等を混合すればよい。
反応系のｐＨは本酵素等による不斉加水分解が選択性よく進行する値が適宜選択され、特に限定されないが、通常はｐＨ４~１０、好ましくはｐＨ６~８の範囲である。反応中、酸又は塩基を加えることによりｐＨを適宜選択された範囲内に調整してもよい。かかる酸としては、例えば塩化水素、臭化水素、リン酸、硫酸、硝酸及びその塩、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸などの有機酸及びその塩が挙げられ、かかる塩基としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムなどのアルカリ金属及びアルカリ土類金属の炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどのアルカリ金属重炭酸塩、リン酸２水素ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウムなどのリン酸塩、ジエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、フェネチルアミン、ピリジンなどの有機塩基、アンモニアが使用される。かかる塩基は単独もしくは２種類以上を混合して用いてもよい。これらは、本製造方法に用いた本酵素等の種類などに応じ、また、添加した酸又は塩基の作用により、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の加水分解が生じないように選ばれる。かかる酸又は塩基は通常水溶液として用いられるが、反応に有機溶媒を使用する場合は有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合溶液として用いてもよい。かかる有機溶媒は反応で使用するものと同じものを使用することができる。また、酸又は塩基を溶解する水は緩衝水溶液に置き換えてもよい。さらに、酸又塩基は固体もしくは溶液に懸濁させた状態で用いてもよい。
反応温度は、本酵素等による不斉加水分解が選択性よく進行する温度が適宜選択され、特に限定されないが、高すぎると、本酵素等中の本酵素の安定性が低下する傾向にあり、また低すぎると反応速度が低下する傾向にある。一方、温度が低いほど選択性は向上する傾向にある。反応温度は、通常−１０~６５℃の範囲内であり、好ましくは−５~５０℃の範囲内である。
反応時間は、通常１~１００時間の範囲内から選ばれ、好ましくは１~５０時間の範囲内から選ばれる。本製造方法の反応系における反応液を適宜サンプリングし、ＨＰＬＣ、ＧＣなどの適当な分析手段により、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の消失の度合い、又はα−置換−β−アミノ酸（２）の生成の度合いを求め、反応時間を定めることもできる。
かくして光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）の溶液が得られるが、通常、反応で使用した酵素や緩衝剤あるいは加水分解反応により生じたカルボン酸などと分離するためにさらに後処理操作を行う。
かかる後処理として例えば、反応溶液中の溶媒を留去した後、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて、α−置換−β−アミノ酸（２）を分離精製する方法、同様に溶媒を留去した後、蒸留によりα−置換−β−アミノ酸（２）を分離精製する方法、分液操作によりα−置換−β−アミノ酸（２）を分離精製する方法などが挙げられる。
分液操作によりα−置換−β−アミノ酸（２）を分離精製する際に、反応時に水と疎水性有機溶媒のいずれにも溶解する有機溶媒を用いた場合これを留去により除去してから用いてもよい。また、溶液に不溶酵素や固定化担体などが存在する場合はこれらをろ過により除去してもよい。
本製造方法の反応終了後の反応液には、不斉加水分解反応の生成物であるα−置換−β−アミノ酸（２）と、残存するα−置換−β−アミノ酸エステル（１）とが含まれる。この両者を分離するには、例えば、水／疎水性有機溶媒による抽出操作を行い、残存α−置換−β−アミノ酸エステル（１）を有機層（疎水性有機溶媒層）に、α−置換−β−アミノ酸（２）を水層にそれぞれ分配させ、該有機層と該水層とを分液するといった方法が採用される。
目的物である光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）と、本酵素等や緩衝剤やその他の水溶性成分と分離するには疎水性有機溶媒を用いて有機層に光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）を抽出し水層と分液すればよい。
かかる疎水性有機溶媒としては例えばｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル；トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタンなどの炭化水素；ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、クロロベンゼン、オルトジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素；酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ブチルなどのエステルなどが挙げられる。反応時にこれらの疎水性有機溶媒を使用した場合は、反応終了後の反応液が有機層と水層とに分離するときには、そのまま分液操作を行なうこともできる。また、反応時に疎水性有機溶媒を用いなかった場合や、疎水性有機溶媒又は水の使用量が少ないために反応液が容易に有機層と水層とに分液されない場合には、あるいは水の使用量が少ないために容易には分液できない場合には、疎水性有機溶媒または水などを適宜加えた後に分液すればよい。疎水性有機溶媒の使用量は特に限定されるものではないが、通常α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体の重量を基準に対して０．１~２００重量倍、好ましくは０．２~１００重量倍である。
かかる目的物の抽出時のｐＨは通常２~１０の範囲内、好ましくは４~８の範囲内である。なお、ｐＨに調整するために酸又は塩基を適宜使用することもできる。ここで用いる酸又は塩基の具体例は、本製造方法の反応系のｐＨ調整用として例示したものと同じである。水層からの目的物の抽出が不十分な場合、同じ抽出、分液操作を複数回繰り返してもよい。また、同様に有機層からの水溶性成分の除去が不十分な場合も、同じ抽出、分液操作を複数回繰り返してもよい。
上記の抽出により、不斉加水分解物であるカルボン酸と分離された残存エステルは、油層中の有機溶媒を留去することにより単離することができる。得られた光学活性α−置換−β−アミノ酸エステル（１）は、ラセミ化の処理に供することによって、α−置換−β−アミノ酸エステル（１）の光学異性体混合物として再利用することができる。
上記の油層中の有機溶媒を留去することにより、単離された未反応α−置換−β−アミノ酸エステル（１）は、カラムクロマトグラフィー等によって、さらに精製されてもよい。
上記の抽出により、不斉加水分解物である光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）は、分液後の水層に含まれており、これは、水を留去すること、あるいは中和処理後に有機溶媒を用いて抽出すること等によって、容易に水層から取り出すことができる。分離された光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）は、油層中の有機溶媒を留去することにより単離することができる。
かくして得られた光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）は、さらにカラムクロマトグラフィー、再結晶、再沈殿などの精製操作によってさらに精製してもよい。また、再結晶や再沈殿などの精製操作においては、光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）をさらに適当な塩基で塩とした後、この塩を再結晶や再沈殿で精製し、精製した塩を再び適当な方法により、光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）に戻すこともできる。
かくして得られた光学活性α−置換−β−アミノ酸（２）の具体例を、式（２）におけるＲ１~Ｒ３の組み合わせで表２に示す。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１~８
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸（２−５）の製造
表３に示した種々の酵素を生産する大腸菌組換え体可溶性画分又は酵素のそれぞれを、表４に示した量で容器中に量り取り、そこに０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬと、２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸メチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）４０．０ｍｇ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１ｍＬを加えた。この溶液を２５℃で、４８時間攪拌した後、３．４％リン酸水溶液１ｍＬ及びｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１０ｍＬを添加して混合した。静置した後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル層を高速液体クロマトグラフィー〔カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ−Ｈ、４．６ｍｍφ×２５ｃｍ、５μｍ（ダイセル化学社製）〕にて光学純度を分析し、また、高速液体クロマトグラフィー〔カラム：Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−１８、４．６ｍｍφ×１５ｃｍ、３μｍ（Ｉｍｔａｋｔ社製）〕にて化学純度を分析して、得られた光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の変換率及び鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表４に示す。
実施例９~１６
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸（２−５）の製造
表５に示した種々の酵素を生産する大腸菌組換え体可溶性画分又は酵素のそれぞれを、表６に示した量を容器中に量り取り、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬと、２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸メチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）４０．０ｍｇを加えた。この溶液を２５℃で、４８時間攪拌した後、３．４％リン酸水溶液１ｍＬとｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１０ｍＬを添加して混合した。静置した後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル層を実施例１と同様に分析して、得られた光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の変換率および鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表６に示す。
実施例１７
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸（２−５）の製造
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５０．３ｇを容器中に量り取り、そこへ２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸メチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）４００．０ｍｇ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル７．４ｇ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍを生産する大腸菌組換え体のアルカリ処理物２．０ｇを加えた。この溶液を２５℃で、１５８時間攪拌した後、実施例１と同様の方法で分析して変換率を求めたところ４４．２％（（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の鏡像異性体過剰率：１００．０％ｅｅ）であった。得られた反応液に３．４％リン酸水溶液１０．６ｇを加えてｐＨを５．０とした。この溶液にｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル８．０ｇを加えて、分液により油層と水層とに分離した。水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル８．０ｇで２回抽出、分液操作を行い、水層を除去した後、先に得られた油層と合一した。得られた混合溶液をセライトろ過して、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル２．０ｇで２回洗浄した後、分液により油層と水層とに分離した。油層にジイソプロピルエチルアミン２５０．５ｍｇ、水４．０ｇ加えて分液により油層と水層とに分離した。次いで、水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル２．０ｇで洗浄し、油層を除去した。得られた水層に１Ｎ塩酸１．９ｇ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル８．０ｇを加えて分液により油層と水層とに分離した。油層を硫酸ナトリウムで脱水乾燥後、油層の有機溶媒を減圧下に留去させ、（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸１３４．６ｍｇを油状物質として得た。得られた油状物質を実施例１と同様に分析して、得られた（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の収率および鏡像異性体過剰率を求めたところ、収率３７．６％、鏡像異性体過剰率は１００．０％ｅｅであった。
実施例１８
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸（２−５）の製造
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５０．２ｇを容器中に量り取り、そこへ２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸エチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）４００．０ｍｇ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル７．４ｇ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍを生産する大腸菌組換え体のアルカリ処理物２．０ｇを加えた。この溶液を２５℃で、１２２時間攪拌した後、実施例１と同様の方法で分析して変換率を求めたところ４９．４％（（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の鏡像異性体過剰率：９５．６％ｅｅ）であった。得られた反応液に３．４％リン酸水溶液９．７ｇを加えてｐＨを５．０とした。この溶液にｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル８．０ｇを加えて分液により油層と水層とに分離した。水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル８．０ｇで２回抽出、分液操作を行い、水層を除去した後、先に得られた油層と合一した。得られた混合溶液をセライトろ過して、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル２．０ｇで２回洗浄した後、分液により油層と水層とに分離した。油層に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液４．０ｇを加えて分液により油層と水層とに分離した。次いで、水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル４．０ｇで洗浄し、油層を除去した。得られた水層に１Ｎ塩酸３．９ｇ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル８．０ｇを加えて分液により油層と水層とに分離した。油層を１５％食塩水０．８ｇで洗浄した後、硫酸ナトリウムで脱水乾燥し、油層の有機溶媒を減圧下に留去させ、（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸１７０．６ｍｇを油状物質として得た。得られた油状物質を実施例１と同様に分析して、得られた（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の収率および鏡像異性体過剰率を求めたところ、収率３５．８％、鏡像異性体過剰率は９５．２％ｅｅであった。
実施例１９
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸（２−５）の製造法
２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸エチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）３．０ｇを容器中に量り取り、そこへ０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１４．２ｇ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍを生産する大腸菌組換え体のアルカリ処理物０．７５ｇを加えて、２５℃で、２４時間攪拌した後、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液７．２ｇ追加した。更に２５℃で、５３時間攪拌した後、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液２４．４ｇ追加した。更に２５℃で、２６時間攪拌した後、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液４５．０ｇ追加した。更に２５℃で、８０時間攪拌した後、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液１２０．０ｇ追加した。更に２５℃で、９６時間攪拌した後、実施例１と同様の方法で分析して変換率を求めたところ４６．３％（（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の鏡像異性体過剰率：９９．８％ｅｅ）であった。得られた反応液に８５％リン酸水溶液２．３ｇを加えてｐＨを５．０とした。この溶液にｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１２．０ｇを加えて分液により油層と水層とに分離した。水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１２．０ｇで２回抽出、分液操作を行い、水層を除去した後、先に得られた油層と合一した。得られた混合溶液をセライトろ過して、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１．５ｇで２回洗浄した後、分液により油層と水層とに分離した。油層にジイソプロピルエチルアミン１．７４ｇ、水１５．０ｇ加えて分液により油層と水層とに分離した。次いで、油層に水６．０ｇを加えて抽出し、油層を除去した後、先に得られた水層と合一した。得られた水層に３５％塩酸０．４ｇ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル９．０ｇを加えて分液により油層と水層とに分離した。油層の有機溶媒を減圧下に留去させ、（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸１．１２ｇを油状物質として得た。得られた油状物質を実施例１と同様に分析して、得られた（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の収率および鏡像異性体過剰率を求めたところ、収率３９．７％、鏡像異性体過剰率は９９．５％ｅｅであった。
実施例２０
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ）アミノ］プロパン酸（２−１）の製造法
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２１．０ｇを容器中に量り取り、そこへ２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ）アミノ］プロパン酸エチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）３００．０ｍｇ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍを生産する大腸菌組換え体のアルカリ処理物７５．０ｍｇを加えた。この溶液を２５℃で、９６時間攪拌した後、８５％リン酸水溶液０．２４ｇを加えてｐＨを５．０とした。この溶液にｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル６．０ｇを加えて分液により油層と水層とに分離した。水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル６．０ｇで２回抽出、分液操作を行い、水層を除去した後、先に得られた油層と合一した。得られた混合溶液をセライトろ過して、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１．５ｇで２回洗浄した後、分液により油層と水層とに分離した。油層にジイソプロピルエチルアミン１８９．９ｍｇ、水３．０ｇ加えて分液により油層と水層に分離した。次いで、水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１．５ｇで洗浄し、油層を除去した。得られた水層に１Ｎ塩酸１．６ｇ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル６．０ｇを加えて分液により油層と水層とに分離した。油層を硫酸ナトリウムで脱水乾燥後、油層の有機溶媒を減圧下に留去させ、（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ）アミノ］プロパン酸１７．７ｍｇを油状物質として得た。得られた油状物質を実施例１と同様に分析して、得られた（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ）アミノ］プロパン酸の収率および鏡像異性体過剰率を求めたところ、収率５．８％、鏡像異性体過剰率は９９．２％ｅｅであった。
実施例２１~２７
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−アセチル）アミノ］プロパン酸（２−９）の製造
表７に示した種々の酵素を生産する大腸菌組換え体可溶性画分のそれぞれを、表８に示した量を容器中に量り取り、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬと、２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−アセチル）アミノ］プロパン酸エチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）４０．０ｍｇを加えた。この溶液を２５℃で、４８時間攪拌した後、３．４％リン酸水溶液１ｍＬとｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１０ｍＬを添加して混合した。静置した後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル層を実施例１と同様に分析して、得られた光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−アセチル）アミノ］プロパン酸の変換率および鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表８に示す。
実施例２８~３４
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−プロピオニル）アミノ］プロパン酸（２−１３）の製造
表９に示した種々の酵素を生産する大腸菌組換え体可溶性画分のそれぞれを、表１０に示した量を容器中に量り取り、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬと、２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−プロピオニル）アミノ］プロパン酸エチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）４０．０ｍｇを加えた。この溶液を２５℃で、４８時間攪拌した後、３．４％リン酸水溶液１ｍＬとｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１０ｍＬを添加して混合した。静置した後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル層を実施例１と同様に分析して、得られた光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−プロピオニル）アミノ］プロパン酸の変換率および鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表１０に示す。
実施例３５~４１
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ベンゾイル）アミノ］プロパン酸（２−１７）の製造
表１１に示した種々の酵素を生産する大腸菌組換え体可溶性画分のそれぞれを、表１２に示した量を容器中に量り取り、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬと、２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ベンゾイル）アミノ］プロパン酸エチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）４０．０ｍｇを加えた。この溶液を２５℃で、４８時間攪拌した後、３．４％リン酸水溶液１ｍＬとｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１０ｍＬを添加して混合した。静置した後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル層を実施例１と同様に分析して、得られた光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ベンゾイル）アミノ］プロパン酸の変換率および鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表１２に示す。
実施例４２~４３
光学活性２−ベンジル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の製造
表１３に示した種々の酵素を生産する大腸菌組換え体可溶性画分のそれぞれを、表１４に示した量を容器中に量り取り、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬと、２−ベンジル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸エチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）４０．０ｍｇを加えた。この溶液を２５℃で、４８時間攪拌した後、３．４％リン酸水溶液１ｍＬとｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１０ｍＬを添加して混合した。静置した後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル層を実施例１と同様に分析して、得られた光学活性２−ベンジル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の変換率および鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表１４に示す。
変換率（％）＝生成物量／（基質量＋生成物量）×１００
鏡像異性体過剰率（％ｅｅ）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａ及びＢは対応する鏡像異性体量を表わし、Ａ＞Ｂである）。
実施例１~８
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸（２−５）の製造
表３に示した種々の酵素を生産する大腸菌組換え体可溶性画分又は酵素のそれぞれを、表４に示した量で容器中に量り取り、そこに０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬと、２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸メチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）４０．０ｍｇ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１ｍＬを加えた。この溶液を２５℃で、４８時間攪拌した後、３．４％リン酸水溶液１ｍＬ及びｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１０ｍＬを添加して混合した。静置した後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル層を高速液体クロマトグラフィー〔カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ−Ｈ、４．６ｍｍφ×２５ｃｍ、５μｍ（ダイセル化学社製）〕にて光学純度を分析し、また、高速液体クロマトグラフィー〔カラム：Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−１８、４．６ｍｍφ×１５ｃｍ、３μｍ（Ｉｍｔａｋｔ社製）〕にて化学純度を分析して、得られた光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の変換率及び鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表４に示す。
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸（２−５）の製造
表５に示した種々の酵素を生産する大腸菌組換え体可溶性画分又は酵素のそれぞれを、表６に示した量を容器中に量り取り、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬと、２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸メチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）４０．０ｍｇを加えた。この溶液を２５℃で、４８時間攪拌した後、３．４％リン酸水溶液１ｍＬとｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１０ｍＬを添加して混合した。静置した後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル層を実施例１と同様に分析して、得られた光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の変換率および鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表６に示す。
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸（２−５）の製造
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５０．３ｇを容器中に量り取り、そこへ２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸メチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）４００．０ｍｇ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル７．４ｇ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍを生産する大腸菌組換え体のアルカリ処理物２．０ｇを加えた。この溶液を２５℃で、１５８時間攪拌した後、実施例１と同様の方法で分析して変換率を求めたところ４４．２％（（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の鏡像異性体過剰率：１００．０％ｅｅ）であった。得られた反応液に３．４％リン酸水溶液１０．６ｇを加えてｐＨを５．０とした。この溶液にｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル８．０ｇを加えて、分液により油層と水層とに分離した。水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル８．０ｇで２回抽出、分液操作を行い、水層を除去した後、先に得られた油層と合一した。得られた混合溶液をセライトろ過して、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル２．０ｇで２回洗浄した後、分液により油層と水層とに分離した。油層にジイソプロピルエチルアミン２５０．５ｍｇ、水４．０ｇ加えて分液により油層と水層とに分離した。次いで、水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル２．０ｇで洗浄し、油層を除去した。得られた水層に１Ｎ塩酸１．９ｇ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル８．０ｇを加えて分液により油層と水層とに分離した。油層を硫酸ナトリウムで脱水乾燥後、油層の有機溶媒を減圧下に留去させ、（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸１３４．６ｍｇを油状物質として得た。得られた油状物質を実施例１と同様に分析して、得られた（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の収率および鏡像異性体過剰率を求めたところ、収率３７．６％、鏡像異性体過剰率は１００．０％ｅｅであった。
実施例１８
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸（２−５）の製造
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５０．２ｇを容器中に量り取り、そこへ２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸エチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）４００．０ｍｇ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル７．４ｇ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍを生産する大腸菌組換え体のアルカリ処理物２．０ｇを加えた。この溶液を２５℃で、１２２時間攪拌した後、実施例１と同様の方法で分析して変換率を求めたところ４９．４％（（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の鏡像異性体過剰率：９５．６％ｅｅ）であった。得られた反応液に３．４％リン酸水溶液９．７ｇを加えてｐＨを５．０とした。この溶液にｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル８．０ｇを加えて分液により油層と水層とに分離した。水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル８．０ｇで２回抽出、分液操作を行い、水層を除去した後、先に得られた油層と合一した。得られた混合溶液をセライトろ過して、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル２．０ｇで２回洗浄した後、分液により油層と水層とに分離した。油層に１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液４．０ｇを加えて分液により油層と水層とに分離した。次いで、水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル４．０ｇで洗浄し、油層を除去した。得られた水層に１Ｎ塩酸３．９ｇ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル８．０ｇを加えて分液により油層と水層とに分離した。油層を１５％食塩水０．８ｇで洗浄した後、硫酸ナトリウムで脱水乾燥し、油層の有機溶媒を減圧下に留去させ、（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸１７０．６ｍｇを油状物質として得た。得られた油状物質を実施例１と同様に分析して、得られた（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の収率および鏡像異性体過剰率を求めたところ、収率３５．８％、鏡像異性体過剰率は９５．２％ｅｅであった。
実施例１９
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸（２−５）の製造法
２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸エチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）３．０ｇを容器中に量り取り、そこへ０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１４．２ｇ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍを生産する大腸菌組換え体のアルカリ処理物０．７５ｇを加えて、２５℃で、２４時間攪拌した後、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液７．２ｇ追加した。更に２５℃で、５３時間攪拌した後、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液２４．４ｇ追加した。更に２５℃で、２６時間攪拌した後、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液４５．０ｇ追加した。更に２５℃で、８０時間攪拌した後、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液１２０．０ｇ追加した。更に２５℃で、９６時間攪拌した後、実施例１と同様の方法で分析して変換率を求めたところ４６．３％（（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の鏡像異性体過剰率：９９．８％ｅｅ）であった。得られた反応液に８５％リン酸水溶液２．３ｇを加えてｐＨを５．０とした。この溶液にｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１２．０ｇを加えて分液により油層と水層とに分離した。水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１２．０ｇで２回抽出、分液操作を行い、水層を除去した後、先に得られた油層と合一した。得られた混合溶液をセライトろ過して、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１．５ｇで２回洗浄した後、分液により油層と水層とに分離した。油層にジイソプロピルエチルアミン１．７４ｇ、水１５．０ｇ加えて分液により油層と水層とに分離した。次いで、油層に水６．０ｇを加えて抽出し、油層を除去した後、先に得られた水層と合一した。得られた水層に３５％塩酸０．４ｇ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル９．０ｇを加えて分液により油層と水層とに分離した。油層の有機溶媒を減圧下に留去させ、（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸１．１２ｇを油状物質として得た。得られた油状物質を実施例１と同様に分析して、得られた（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の収率および鏡像異性体過剰率を求めたところ、収率３９．７％、鏡像異性体過剰率は９９．５％ｅｅであった。
実施例２０
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ）アミノ］プロパン酸（２−１）の製造法
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２１．０ｇを容器中に量り取り、そこへ２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ）アミノ］プロパン酸エチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）３００．０ｍｇ、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼＮ４３ＳＡ３６３ｔｅｒｍを生産する大腸菌組換え体のアルカリ処理物７５．０ｍｇを加えた。この溶液を２５℃で、９６時間攪拌した後、８５％リン酸水溶液０．２４ｇを加えてｐＨを５．０とした。この溶液にｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル６．０ｇを加えて分液により油層と水層とに分離した。水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル６．０ｇで２回抽出、分液操作を行い、水層を除去した後、先に得られた油層と合一した。得られた混合溶液をセライトろ過して、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１．５ｇで２回洗浄した後、分液により油層と水層とに分離した。油層にジイソプロピルエチルアミン１８９．９ｍｇ、水３．０ｇ加えて分液により油層と水層に分離した。次いで、水層をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１．５ｇで洗浄し、油層を除去した。得られた水層に１Ｎ塩酸１．６ｇ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル６．０ｇを加えて分液により油層と水層とに分離した。油層を硫酸ナトリウムで脱水乾燥後、油層の有機溶媒を減圧下に留去させ、（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ）アミノ］プロパン酸１７．７ｍｇを油状物質として得た。得られた油状物質を実施例１と同様に分析して、得られた（Ｒ）−２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ）アミノ］プロパン酸の収率および鏡像異性体過剰率を求めたところ、収率５．８％、鏡像異性体過剰率は９９．２％ｅｅであった。
実施例２１~２７
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−アセチル）アミノ］プロパン酸（２−９）の製造
表７に示した種々の酵素を生産する大腸菌組換え体可溶性画分のそれぞれを、表８に示した量を容器中に量り取り、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬと、２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−アセチル）アミノ］プロパン酸エチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）４０．０ｍｇを加えた。この溶液を２５℃で、４８時間攪拌した後、３．４％リン酸水溶液１ｍＬとｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１０ｍＬを添加して混合した。静置した後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル層を実施例１と同様に分析して、得られた光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−アセチル）アミノ］プロパン酸の変換率および鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表８に示す。
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−プロピオニル）アミノ］プロパン酸（２−１３）の製造
表９に示した種々の酵素を生産する大腸菌組換え体可溶性画分のそれぞれを、表１０に示した量を容器中に量り取り、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬと、２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−プロピオニル）アミノ］プロパン酸エチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）４０．０ｍｇを加えた。この溶液を２５℃で、４８時間攪拌した後、３．４％リン酸水溶液１ｍＬとｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１０ｍＬを添加して混合した。静置した後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル層を実施例１と同様に分析して、得られた光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−プロピオニル）アミノ］プロパン酸の変換率および鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表１０に示す。
光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ベンゾイル）アミノ］プロパン酸（２−１７）の製造
表１１に示した種々の酵素を生産する大腸菌組換え体可溶性画分のそれぞれを、表１２に示した量を容器中に量り取り、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬと、２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ベンゾイル）アミノ］プロパン酸エチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）４０．０ｍｇを加えた。この溶液を２５℃で、４８時間攪拌した後、３．４％リン酸水溶液１ｍＬとｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１０ｍＬを添加して混合した。静置した後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル層を実施例１と同様に分析して、得られた光学活性２−シクロペンチルメチル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ベンゾイル）アミノ］プロパン酸の変換率および鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表１２に示す。
光学活性２−ベンジル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の製造
表１３に示した種々の酵素を生産する大腸菌組換え体可溶性画分のそれぞれを、表１４に示した量を容器中に量り取り、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬと、２−ベンジル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸エチルエステルの光学異性体混合物（ラセミ体）４０．０ｍｇを加えた。この溶液を２５℃で、４８時間攪拌した後、３．４％リン酸水溶液１ｍＬとｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル１０ｍＬを添加して混合した。静置した後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル層を実施例１と同様に分析して、得られた光学活性２−ベンジル−３−［（Ｎ−ベンジルオキシ−Ｎ−ホルミル）アミノ］プロパン酸の変換率および鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表１４に示す。
鏡像異性体過剰率（％ｅｅ）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａ及びＢは対応する鏡像異性体量を表わし、Ａ＞Ｂである）。
本発明の製造方法は、医薬原体化合物の製造用原料又は中間体化合物の製造に有用である。
Claims (12)
- 式（２）
（式中、
Ｒ１は水素原子、炭素数１~１０のアシル基、カルボキシル基又はカルボキサミド基を示す。
Ｒ２は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１~１０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数６~２０のアリール基、置換基を有していてもよい炭素数７~２０のアラルキル基、又は炭素数２~２０のアシル基、置換基を有していてもよい炭素数２~１５のアルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよい炭素数７~２０のアリールオキシカルボニル基、置換基を有していてもよい炭素数８~２０のアラルキルオキシカルボニル基又は置換基を有していてもよい炭素数４~１０の環状エーテル基を示す。
Ｒ３は置換基を有していてもよい炭素数１~２０の炭化水素基を示す。
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子を示す。
＊は不斉中心を示す。）
で示される光学活性なα−置換−β−アミノ酸の製造方法であり、
式（１）
（式中、
Ｒ４は置換基を有していてもよい炭素数１~１０のアルキル基を示す。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＸは上記と同じ意味である。）
で示されるα−置換−β−アミノ酸エステルの光学異性体混合物の−ＣＯ２Ｒ４基を不斉加水分解する能力を有する酵素、又は該酵素の産生能を有する微生物の培養物若しくはその処理物を用いて、前記光学異性体混合物を不斉加水分解する工程を含む製造方法。 - Ｒ３が置換基を有していてもよい炭素数１~１０の炭化水素基体である請求項１に記載の方法。
- Ｒ３がシクロペンチルメチル基である請求項１に記載の方法。
- Ｒ１が炭素数１~１０のアシル基である請求項１に記載の方法。
- Ｒ１がホルミル基、アセチル基、プロピオニル基又はベンゾイル基である請求項１に記載の方法。
- Ｒ１が、水素原子である請求項１に記載の製造方法。
- Ｒ２が、炭素数７~２０のアラルキル基である請求項１に記載の方法。
- Ｒ２が、ベンジル基である請求項１に記載の方法。
- Ｒ４が、メチル基又はエチル基である請求項１に記載の製造方法。
- 酵素が、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物を起源とする加水分解酵素、或いは、該加水分解酵素を構成するアミノ酸のうちの１個ないしは２個が、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素である請求項１~９のいずれかに記載の方法。
- 酵素が、クロモバクテリウム・チョコレータム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｏｃｏｌａｔｕｍ）、又はムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）の微生物を起源とする加水分解酵素、或いは、該加水分解酵素を構成するアミノ酸のうちの１個ないしは２個が、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素であるである請求項１~９のいずれかに記載の方法。
- 酵素が、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（工業技術院 生命工学技術研究所寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３）由来のエステラーゼ又はリパーゼ、或いは、該エステラーゼ又はリパーゼを構成するアミノ酸のうちの１個ないしは２個が、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素である請求項１~９のいずれかに記載の方法。
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